CN1621839A - 氯菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法 - Google Patents

氯菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氯菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法，利用合成的氯菊酯免疫抗原免疫健康白兔得到多克隆抗体，筛选后以氯菊酯为标准品，以氯菊酯半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立土壤和食品中氯菊酯农药的间接竞争酶联免疫法。本发明建立了土壤和食品中氯菊酯农药的间接ELISA法，为氯菊酯在土壤和食品中的残留检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。灵敏度为0.1ppb，线性范围为10～800ppb。免疫反应的高特异性和高亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏性，样本前处理过程简单。

Description

氯菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法
一、技术领域
本发明涉及一种农药残留检测方法，更具体地说是用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测土壤和食品中氯菊酯的残留。
二、背景技术
随着一度占主导地位的有机磷农药从市场的逐渐退出，菊酯类农药应用越来越广泛。其中氯菊酯占53％以上。一般认为拟除虫菊酯类农药对哺乳类动物是安全的，但是氯菊酯对无位点的无脊椎动物及鱼类有较强的毒性并在某些水生动物中具有较高的生物富集浓度。人们食用了被污染的水以及水生食品，具有潜在的危险。据报道人体接触氯菊酯后会出现免疫系统毒性和抑制性可逆症状，一些菊酯类农药还会造成淋巴节以及脾脏损害甚至致癌。由于菊酯类农药使用得当具有农业生态学上的显著优点，但又对环境存在潜在的危险。所以需要一种灵敏、快速、选择性的残留检测方法。
                                  氯菊酯(Permethrin)
目前对氯菊酯残留的检测方法较多，有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱—电子捕获法(GC-ECD)以及气相色谱—质谱(GC-MS)。尽管这些方法灵敏度较高，但样品的前处理步骤较多，相对费时且检测费用较高，特别是不适用于大量样品的筛选。
酶联免疫吸附测定法(ELISA)提供了一种痕量氯菊酯的快速、灵敏、选择性检测方法。科学家们先后建立了几种测定氯菊酯的ELISA检测方法。1989年，Stanker，L.H.，等在Journal of Agriculture Food Chemistry发表《Animmunoassay for Pyrethroids：detection of permethrin in meat》(Vol.37，834-839)中以含有苯氧基苄基和环丙烷环的免疫原，免疫得到单克隆抗体。建立了肉类中氯菊酯的残留ELISA分析法。1992年，John H.等人在Journal ofAgriculture Food Chemistry发表《Analysis of the syntheticpyrethroids，permethrin and 1(R)-phenothrin，in grain using a monoclonalantibody-based test》(Vol.40，1287-1292)中以单克隆抗体建立了对合成菊酯，氯菊酯和1-(R)苯醚菊酯在谷物和面粉中的残留ELISA检测法。I50为10μg/L。2000年，Guomin Shan等在Journal of Agriculture Food Chemistry发表《Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Pyrethroid Permethrin》(Vol.48，4032-4040)中利用不同构型的氯菊酯半抗原同甲状腺球蛋白偶联免疫得到单克隆抗体，建立了一种高灵敏度的氯菊酯ELISA法并用GC-MS证实。I50为2.5μg/L。2001年，Takaho Watqanabe等在Analytica Chimica Acta上发表文章《Development of a class-specific immunoassay for the type Ipyrethroid insecticides》(第444卷119-129)中利用氯菊酯半抗原2，2-二甲基-3-(5’-羰基-五-1’烯基环丙烷羧酸-(3-苯氧基苄基酯)与OVA(卵白蛋白)偶联后免疫获得的多克隆抗体建立了对I类菊酯的特异性ELISA检测法。主要用于区分I类和II类菊酯。I50为30μg/L。目前国内还没有人建立氯菊酯的ELISA残留检测法。
这些方法均能很好地检测出食品及植物中的氯菊酯残留量，为食品安全以及环境保护提供了检测工具和手段。但是上述方法要求环境样品必须经过提纯或浓缩，否则不具有痕量分析的灵敏度。而且大多使用单克隆抗体，单克隆抗体制备过程复杂，价格昂贵，不宜普及。目前还缺少切实可行的土壤基体中氯菊酯残留的检测方法。
三、发明内容
1、发明目的
本发明的目的在于提供一种快速检测土壤和食品中氯菊酯农药残留的酶免疫学方法，使样品无须经过繁琐的提纯或浓缩步骤，并且保证较高的敏感性及特异性。
2、技术方案
本发明的技术方案如下：利用张进琪、邹惠仙(酶联拟除虫菊酯前体物的合成[J]有机化学，2003(23)专刊：163)等合成的氯菊酯免疫抗原免疫健康白兔得到多克隆抗体，筛选后以氯菊酯为标准品，以氯菊酯半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立土壤和食品中氯菊酯农药的间接竞争酶联免疫法。
本发明通过以下步骤实现：
(1)以碳酸盐缓冲液稀释OVA-Py1∶1000～1∶3000，加入酶标板中，每孔100μL。4℃孵育过夜或37℃2～4h。按照常规ELISA法封闭洗涤；
(2)将抗血清稀释1000～4000倍后，每孔50μL加入酶标板中，同时加入一系列浓度的氯菊酯标准品，每孔50μL。温育1h后以PBST洗涤3～5次；
(3)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(GAR-HRP)，以0.1％BSA/PBS稀释为1∶1000～1∶3000。每孔100μL。37℃作用1h后以PBST洗涤3～5次；
(4)配制底物溶液：
A：3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶解于无水乙醇中，再定容至1000mL；
B：磷酸氢二钠，柠檬酸及0.5~0.75％H2O2溶解于1000mL蒸馏水中。使用前把A、B等体积混合；
(5)加入底物混合液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M H2SO4，酶标仪450nm测吸光度(OD)值。
更详细的步骤为：
1)配制磷酸盐(PBS)缓冲液：磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钠0.296g，氯化钠8.5g，加蒸馏水稀释至1000mL，pH7.4。
2)配制碳酸盐(CBS)缓冲液：碳酸钠0.315g，碳酸氢钠0.588g，加蒸馏水稀释至100mL，pH9.6。
3)合成OVA-Py(氯菊酯半抗原Py与卵白蛋白OVA偶联物)
4)以碳酸盐缓冲液稀释OVA-Py1∶1000～3000，加入酶标板中，每孔100μL。4℃孵育过夜或37℃2～4h。
5)配制BSA/PBS封闭液：称取1gBSA溶解于200mLPBS配制成0.5％的BSA/PBS封闭液。
6)甩去包被抗原液后，以PBST洗涤2遍，加入BSA/PBS封闭液，每孔200μL，37℃温育2h。
7)取PBS液500mL，加入50μL的吐温-20(Tween-20)，配成1/1000Tween-20/PBS的洗涤液(PBST)。
8)甩去酶标板中的封闭液，用PBST洗涤两遍，每次2～3分钟。
9)将抗血清稀释1000～4000倍后，每孔50μL加入酶标板中，同时加入一系列浓度的氯菊酯标准品，每孔50μL。温育1h后以PBST洗涤3～5次。
10)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(GAR-HRP)，以0.1％BSA/PBS稀释为1∶1000～1∶3000。每孔100μL。37℃作用1h后以PBST洗涤3～5次。
11)配制底物溶液：A：3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)200mg溶解于无水乙醇100mL中，再加蒸馏水稀释至1000mL。B：磷酸氢二钠14.6g，柠檬酸9.33g，0.75％H2O2溶解于1000mL蒸馏水中。使用前A、B等体积混合。
12)加入底物混合液100μL，37℃显色15min。
13)加入终止液2M H2SO4，酶标仪450nm测吸光度(OD)值。
土壤的提取方法为氯菊酯溶于乙醚或丙酮或甲醇或二氯甲烷等有机溶剂，再分别加至一定量的阴性土样中，使氯菊酯在土样中的终浓度为1.25ng/g，100ng/g，1250ng/g暗处自然挥发；再分别加入1∶1～1∶5丙酮/正己烷混合溶剂，超声萃取，过滤，滤液氮气吹干，再以10～70％的甲醇/PBS溶解后ELISA检测；由于氯菊酯的高度疏水性及非极性，极易吸附于玻璃器皿壁上，溶解时要充分振荡。
3、有益效果
本发明建立了土壤和食品中氯菊酯农药的间接ELISA法，为氯菊酯在土壤和食品中的残留检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。灵敏度为0.1ppb，线性范围为10～800ppb。I50为232.2μg/L，回收率为71.4％。与其它菊酯类农药几乎无交叉反应。免疫反应的高特异性和高亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏性，样本前处理过程简单。
四、说明书附图
图1为抗原检测标准曲线
五、具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明
一、仪器：
酶标仪(MK3，Labsystem，芬兰)
双波长紫外可见分光光度仪(Shimadzu，UV-190，日本)
冷冻干燥机(Labconco，4.5L，美国)
高速冷冻离心机(HITACHI，日本)
磁力搅拌器(Werke，IKA，德国)
漩涡混匀器(MS2，IKA，德国)
微型摇床(KSI30，IKA，德国)
二、试剂：
辣根过氧化物酶(上海雪满生物科技有限公司，BR)
1-乙基-3，(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)(上海丽珠东风生物制剂有限公司，BR)
N-羟基丁二酰亚胺(中国医药集团上海化学试剂公司，BR)
1，4二氧六环(上海凌峰化学试剂有限公司，CR)
DMF(上海试剂一厂，CR)
酶标记羊抗兔GAR-HRP(华美生物工程公司，BR)
BSA(上海实生细胞生物技术有限公司，BR)
OVA(上海实生细胞生物技术有限公司，BR)
卡介苗冻干制剂
三、佐剂：
费氏不完全佐剂：取10mL液体石蜡至研钵中，加入6mL羊毛脂，研磨混匀，2mL分装，高压灭菌后20℃存放。
费氏完全佐剂：在不完全佐剂中加入3mg/mL卡介苗，混匀。
四、步骤
1.免疫原和包被原的合成
1)合成BSA-Py(氯菊酯半抗原Py与牛血清白蛋白BSA偶联物)
用EDC法偶联，具体步骤如下：
(1)取10mg半抗原溶于1ml 1，4二氧六环中，加入6mgEDC.HCL。
(2)滴加50mgBSA溶于3mLPH7.4(0.01M)的PBS溶液。
(3)搅拌反应30min，再加入6mgEDC.HCL，4℃搅拌反应24h，过滤。
(4)反应完成后装入透析袋，PBS透析72h。分装冻干保存于-20℃冰箱中。
2)合成OVA-Py(氯菊酯半抗原Py与卵白蛋白OVA偶联物)
用活泼酯法偶联，具体步骤如下：
(1)取10mg半抗原溶于2mLDMF中，加入6mgEDC.HCl和6mg N-羟基丁二酰亚胺，室温搅拌反应过夜。
(2)50mgOVA溶于8mLpH7.4(0.01M)的PBS溶液，向溶液中缓慢地滴加上述得到的活泼酯。
(3)搅拌反应30min后再加入6mgEDC.HCl，4℃搅拌反应24h，过滤。
(4)装入透析袋，PBS透析72h。UV检测(252.5nm，405nm)。
2.抗血清的制备
(1)实验动物：新西兰大白兔2只，体重在1.75kg左右。
(2)抗原配制：用1.08mL生理盐水将10.8mgPy-BSA偶联物溶解，配制成10mg/mL的抗原，-20℃保存。
(3)免疫方法：第1周给家兔肌肉注射卡介苗0.2mL/只(约15mg)，采耳血，备用。首次免疫用完全佐剂0.5mL+抗原Py-BSA100μL，充分混匀，背部皮内多点注射。2周后进行加强免疫，不完全佐剂0.5mL+抗原Py-BSA50μL，充分混匀，背部皮内多点注射。4周后进行二次加强免疫，不完全佐剂0.5mL+抗原Py-BSA50μL，充分混匀，背部皮内多点注射。每次免疫间隔4周。
(4)采血：首次免疫后第5周，第7周，第11周采耳血1次，血清鉴定，并于第11周静脉取血，分离血清。
(5)抗体的纯化和保存：饱和硫酸铵沉淀法纯化，用50％和33％饱和硫酸铵沉淀，依次进行3次。纯化后的抗体用0.01mol/LPBS(pH7.4)4℃冰箱中透析，浓缩，分装小瓶，冷冻干燥，放-20℃冰箱保存备用。
3.配制磷酸盐(PBS)缓冲液：磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钠0.296g，氯化钠8.5g，加蒸馏水稀释至1000mL，pH7.4。
4.配制碳酸盐(CBS)缓冲液：碳酸钠0.315g，碳酸氢钠0.588g，加蒸馏水稀释至100mL，pH9.6。
5.ELISA反应过程：
1)以碳酸盐缓冲液稀释OVA-Py1∶2500，加入酶标板中，每孔100μL。4℃孵育过夜或37℃2～4h。
2)配制BSA/PBS封闭液：称取BSAlg溶液100mLPBS缓冲液中得到1％的BSA/PBS封闭液。
3)甩去包被抗原液后，以PBST洗涤2遍，加入BSA/PBS封闭液，每孔200μL，37℃温育2h。
4)取PBS液500mL，加入50μL的吐温-20(Tween-20)，配成1/1000Tween-20/PBS的洗涤液(PBST)。
5)甩去酶标板中的封闭液，用PBST洗涤两遍，每次2～3分钟。
6)将抗血清稀释2500倍后，每孔50μL加入酶标板中，同时加入一系列浓度的氯菊酯标准品，每孔50μL。温育1h后以PBST洗涤3～5次。
7)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(GAR-HRP)，以0.1％BSA/PBS稀释为1∶3000或1∶1000。每孔100μL。37℃作用1h后以PBST洗涤3～5次。
8)配制底物溶液：
A：3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)200mg溶解于无水乙醇100mL中，再加蒸馏水稀释至1000mL。
B：磷酸氢二钠14.6g，柠檬酸9.33g，0.75％H2O2溶解于1000mL蒸馏水中。使用前把A、B等体积混合。
9)加入底物混合液100μL，37℃显色15min。
10)加入终止液2M H2SO4，酶标仪450nm测吸光度(OD)值。
6回收率测定及土壤样品提取方法确定
氯菊酯溶于乙醚乙醚或丙酮或甲醇或二氯甲烷等有机溶剂，再分别加至一定量的阴性土样中，使氯菊酯在土样中的终浓度为1.25ng/g，100ng/g，1250ng/g。暗处自然挥发。再分别加入1∶1～1∶5丙酮/正己烷混合溶剂，超声萃取20min～4h，过滤，滤液氮气吹干，再以10～40％的甲醇/PBS溶解后ELISA检测。由于氯菊酯的高度疏水性及非极性，极易吸附于玻璃器皿壁上，溶解时要充分振荡。氯菊酯含量＝ELISA检测浓度×样品提取液体积/样品重量。
实验结果如下
1.标准曲线
本试验所获得的抗原检测线性范围为10～800μg/L。超过800μg/L即为水平线。I50为232.2μg/L。具体请见说明书附图1。
2：灵敏度
灵敏度是与阴性孔吸光度值差值等于0.2的标准品浓度。确定方法为[(A阴性-Ax)/A阴性]×100％＝20％，本发明灵敏度为0.1μg/L。
               表1  灵敏度测试结果
 1  2  3  4  标准品(μg/L)
 A  1.228  1.252  1.236  1.326  0
 B  1.184  1.044  1.188  1.179  0.01
 C  0.950  0.993  0.998  0.982  0.1
 D  0.862  0.910  0.873  1.051  1
3：交叉反应率(Cross Reactive，C.R％)
利用氯菊酯标准品和类似结的相关化合物进行交叉反应研究。CR＝氯菊酯I50/其它农药I50(I50是抑制率为50％的吸光度时的氯菊酯标准品浓度)。从下表数据可知其它类似结构农药交叉反应率很低，说明本系统抗体具有较好的特异性。
               表2  交叉反应率测定结果
Figure A20041006616300101
4：稳定性与重复性实验
取高、中、低三个标准品浓度，在酶标板上重复5个数据测定其可重复性。测定A值基本一致，阴性孔变异系数(CV％)为11％，阳性孔CV％＜20％，均在允许范围内。由此可见本系统稳定性和重复性较好。
                表3  氯菊酯重复性测定结果
  1   2   3   4   5   标准品(ppb)
  A   1.228   1.252   1.236   1.326   1.180   0
  B   0.950   0.993   0.998   0.982   1.001   0.1
  C   0.788   0.720   0.870   0.779   0.763   50
  D   0.159   0.199   0.172   0.196   0.194   1000
5：回收率测定
加标土壤样品回收后进行ELISA检测，结果见下表。平均回收率为71.4％。
             表5  ELISA检测掺合样品结果X±S
氯菊酯掺合量(ng/g)                     检出量(ng/g)
1.25                                   0.2
50                                     98.9
750                                    1241

Claims (4)

1.一种氯菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法，其特征在于利用合成的氯菊酯免疫抗原免疫健康白兔得到多克隆抗体，筛选后以氯菊酯为标准品，以氯菊酯半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立土壤和食品中氯菊酯农药的间接竞争酶联免疫法。
2.根据权利要求1所述的氯菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)以碳酸盐缓冲液稀释OVA-Py1∶1000～1∶3000，加入酶标板中，每孔100μL。4℃孵育过夜或37℃2～4h。按照常规ELISA法封闭洗涤；
(2)将抗血清稀释1000～4000倍后，每孔50μL加入酶标板中，同时加入一系列浓度的氯菊酯标准品，每孔50μL。温育1h后以PBST洗涤3～5次；
(3)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(GAR-HRP)，以0.1％BSA/PBS稀释为1∶1000～1∶3000。每孔100μL。37℃作用1h后以PBST洗涤3～5次；
(4)配制底物溶液：
A：3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶解于无水乙醇中，再定容至1000mL；
B：磷酸氢二钠，柠檬酸及0.5-0.75％H2O2溶解于1000mL蒸馏水中。使用前把A、B等体积混合；
(5)加入底物混合液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M H2SO4，酶标仪450nm测吸光度(0D)值。
3.根据权利要求2所述的氯菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法，其特征在于土壤的提取方法为氯菊酯溶于乙醚或丙酮或甲醇或二氯甲烷等有机溶剂，再分别加至一定量的阴性土样中，使氯菊酯在土样中的终浓度为1.25ng/g，100ng/g，1250ng/g暗处自然挥发；再分别加入1∶1～1∶5丙酮/正己烷混合溶剂，超声萃取，过滤，滤液氮气吹干，再以10～70％的甲醇/PBS溶解后ELISA检测；由于氯菊酯的高度疏水性及非极性，极易吸附于玻璃器皿壁上，溶解时要充分振荡。
4.根据权利要求2所述的氯菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法，其特征在于抗原抗体反应的pH值必须在中性或弱酸性条件下进行。
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