CN110770585A - 快速按需的肝素诱导血小板减少症功能测定 - Google Patents
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Abstract
测定患者血清或血浆样品中肝素诱导的血小板减少症(HIT)的方法，该方法包括：在低浓度肝素或高浓度肝素存在下，将血小板与患者血清或血浆样品的混合物孵育；在存在或不存在血小板活化剂的情况下孵育血小板混合物；将混合物中的血小板和活化血小板进行定量；计算每种混合物中血小板内活化血小板的百分比；用计算的百分比计算肝素血小板活化(HEPLA)指数；测量和计算未患HIT的供体血清或血浆样品的HEPLA指数；根据未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数来计算截止值，并通过比较患者的HEPLA指数和截止值来确定患者是否患有HIT。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月29日提交的美国临时专利申请No.62/478,105的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本主题涉及诊断测定。更具体地，本主题涉及肝素诱导的血小板减少症测定。
背景技术
肝素诱导的血小板减少症，也称为HIT，是一种促血栓形成和潜在致命的医源性疾病，大约5-10％的患者接触肝素而发生这种病症(Bell WR，T.P.，1976，Thrombocytopeniaoccuring during the administration of heparin:A prospective study in 52patients(肝素给药期间发生血小板减少症：一项在52名患者中的前瞻性研究)，Annals ofInternal Medicine(内科医学年鉴)，155-160；King DJ，K.J.，1984，Heparin associatedthrombocytopenia(肝素相关的血小板减少症)，Annals of Internal Medicine(内科医学年鉴)，535；Dryjski M，D.H.，1996，Heparin induced thrombocytopenia(肝素诱导的血小板减少症)，European journal of vascular and endovascular surgery(欧洲血管和血管内外科杂志，260-269)。HIT涉及由于抗凝血剂肝素的给药而引起的血小板减少症，即低血小板计数。HIT倾向于血栓形成，即血管内血栓的异常形成，因为血小板释放激活凝血酶的微粒，从而导致血栓形成。当确定血栓形成时，该病症被称为“肝素诱导的血小板减少症和血栓形成，也称为HITT。HIT是由激活血小板的抗体的形成引起的，例如针对肝素与血小板因子4(PF4)的复合物的抗体。接受肝素治疗的患有HIT的患者可能会出现新的血栓形成，或者该患者已经存在的血栓形成可能会恶化，或者患者的血小板计数可能会下降。因为患者患血栓形成事件的风险很高，约有30-50％的患者在HIT诊断时发生静脉和/或动脉血栓形成(Kelton JG，1986，Heparin-induced Thrombocytopenia.Haemostasis，173-186)，停止给予肝素，并且在诊断证实之前推测患者转为替代抗凝治疗。
II型HIT是HIT的最严重形式，其通过循环免疫球蛋白G(IgG)抗体介导，所述抗体在药理学浓度下靶向PF4和肝素(H)的复合物。IgG：PF4：H复合物通过FcΥRII受体结合并激活血小板，导致凝血酶生成和血小板聚集(Visentin GP，F.S.，1994，Antibodies fromPatients with Heparin-induced Thrombocytopenia/Thrombosis Are Specific forPlatelet Factor 4Complexed with Heparin or Bound to Endothelial Cells.Journalof clinical investigation，81-88)。由于血栓形成事件在HIT患者中很常见，因此快速可靠的诊断，允许立即转换为替代抗凝血剂是至关重要的。
目前推荐的HIT诊断算法用于血小板计数在肝素给药后5-14天内下降超过50％(<50,000/mm3)的患者，其使用通过使用敏感免疫测定支持的4Ts评分估计临床概率，用于初步筛查HIT患者，以指导HIT阳性患者的初始治疗。
用于初始检测HIT患者的示例性筛选免疫测定是肝素-PF4-ELISA，即肝素-PF4-酶联免疫吸附测定。该筛选免疫测定旨在检测针对肝素-PF4复合物的抗体。然而，肝素-PF4-ELISA检测到所有与肝素-PF4复合物结合的循环抗体，并且还可能错误地检测到不会引起HIT的抗体。因此，即使免疫测定是高度敏感的，它也缺乏特异性。因此，在筛选免疫测定中发现阳性的那些进一步用确认更具体的功能测定进行测试。
其他功能性HIT测定法测试患者的血清或血浆样品在肝素存在下引起血小板聚集的能力。此类测定的实例是：光透射聚集测定法(LTA)，肝素诱导的多电极聚集测定法(HIMEA)和肝素诱导的血小板活化(HIPA)。例如，在HIPA中，在肝素存在下，将来自受试患者的血清与来自供体的血小板混合。供体血小板的凝集表明在受试患者的血清中存在针对PF4-肝素的抗体。
可获得几种功能性HIT测定，例如金标准14C-血清素释放测定(SRA)。该测试使用来自几个供体的血小板和来自受试患者的血清。将血小板加载14C-血清素，洗涤并与血清和肝素混合。然后测试样品中血清素的释放，血清素的释放是血小板活化的标志。如果SRA显示高血清素释放，则确认HIT的诊断。
由于它们的复杂性，上述用于诊断HIT的测试在远程参考实验室进行。它们非常耗时，因为它们需要批量处理。换句话说，不可能按需对个体患者进行这些测试。结果，这些现有技术测试定期进行，例如每月进行。这种情况的结果是测试结果可以延迟几周。因此，当需要快速回答重症护理决策时，例如在心脏外科手术期间，或在体外膜氧合(ECMO)过程期间，用于诊断HIT的现有技术测试不适用于紧急情况。这种情况的一个结果是，在获得测试结果之前，患者可能已经得到错误的治疗，这可能是有害的，甚至是致命的。此外，由于在医生检查时缺乏检测结果，可疑的HP患者可能会接受比肝素贵100-200倍的替代抗凝剂，或者比肝素更难处理，或与出血事件有关。
现有技术HIT测定的另一个缺点是它们需要使用供体血小板与所检查患者的血浆或血清样品一起孵育。其原因是由于患者出血和测试本身之间的长时间段而不能使用患者自己的血小板。
此外，现有技术的HIT测定与HIT的生理病理学不完全一致。在HIT中，血小板活化是由抗肝素-PF4复合物抗体的恒定片段(Fc)与血小板膜Fc受体(FcγRIIa)-免疫球蛋白G(IgG)的Fc的低亲和力受体结合引起的，也见于中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。然而，存在Fc受体的多态性，并且受体结构甚至可能比肝素诱导的血小板活化的抗体浓度更重要。因此，如果供体的血小板具有与患者的血小板不同的态射，则可能潜在地产生诊断偏差，从而导致较低的准确性和相应的误诊。
现有技术HIT测定的另一个缺点涉及测定中使用的血小板。基于这些血小板被抗肝素-PF4抗体充分活化的知识，一些现有技术的HIT测定是用从供体收集的血小板进行的。通常，血小板供体是实验室工作人员。这引发了道德问题和方法问题。关于道德问题，在一些国家，例如比利时，禁止从实验室人员抽血用于实验室进行诊断测定的做法。方法问题涉及实验室工作人员不能定期反复捐献血小板的事实。此外，它们在任何时候都不可用，例如在实验室人员的工作时间之后需要进行紧急检测时。另一种方法是，在某些测定中，例如SRA，需要洗涤供体的血小板。这在测定过程中增加了一个步骤，并且添加可能在它们暴露于受试患者的血清或血浆样品之前无意中活化血小板。
此外，由于获得现有技术测定的结果之前要经过很长时间，例如SRA和HIPA，几乎不可能重复这些测定。本领域技术人员可以认识到在需要时不能重复测定的临床意义。
如上所述，由于它们的复杂性和在远程参考实验室中进行这些测定的需要，现有技术的HIT测定，例如SRA和HIPA，仅在抗肝素-PF4抗体筛选免疫测定(例如肝素-PF4-ELISA)给出阳性结果时进行。
现有技术HIT测定的另一个缺点是在其中一些例如HIPA中，结果基于微量滴定板的视觉检查。这需要由经验丰富的实验室从业者进行测定。此外，由于视觉检查是主观的，现有技术测定的准确性和再现性是有问题的。
另外，现有技术的HIT测定不是标准化的。例如，SRA根据每个实验室中的不同方案进行。其他现有技术方法，例如阻抗聚集测定法，例如，
分析，要求执行该测定的每个实验室将定义其自身的临床截止值，区分HIT+和HIT-患者。这种限制转化为增加的实验室间测定性能的可变性和比较不同实验室获得的结果的能力有限，例如在临床研究或临床实践的背景下，例如当需要比较从不同实验室获得的相同患者的测定结果时。因此，如果没有复杂的统计元分析，不能轻易编制不同实验室的结果。
总之，HIT测试中的两个主要问题是免疫测定在特异性方面的有限性能，以及周转时间以及功能测定的其他上述缺点。这些问题引起了过度诊断和过度治疗HIT的担忧，这使得大量血小板减少症患者暴露于昂贵的替代抗凝剂，并伴随着10-20％的大出血风险，临床和经济影响可能很大。目前，HIT诊断仍然需要快速和标准化的测试，可以直接进入止血实验室并具有高度特异性。
发明概述
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本主题的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。如有冲突，将包括定义在内专利说明书为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
根据本发明主题的一个方面，提供了测定患者血清或血浆样品中肝素诱导的血小板减少症(HIT)的方法，该方法包括：
在低浓度肝素(患者低肝素混合物)或高浓度肝素(患者高肝素混合物)存在的情况下，将血小板与患者的血清或血浆样品一起孵育；
在血小板活化剂存在下(阳性对照混合物)或不存在(阴性对照混合物)的情况下孵育血小板；
对患者低肝素混合物、患者高肝素混合物、阳性对照混合物和阴性对照混合物中的血小板和活化血小板进行定量；
计算每种上述混合物中血小板内活化血小板的百分比，并获得以下值：
患者低肝素混合物中活化血小板的百分比[％R(低)]；
患者高肝素混合物中活化血小板的百分比[％R(高)]；
阳性对照混合物中活化血小板的百分比[％R(Ct+)]，以及
阴性对照混合物中活化血小板的百分比[％R(Ct-)]；
通过将％R(低)和％R(高)之间的差值除以％R(Ct+)和％R(Ct-)之间的差值并将得到的商乘以100来计算肝素血小板活化(HEPLA)指数；
测量和计算来自未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数；
根据来自未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数来计算截止值，并且
通过比较患者的HEPLA指数和截止值来确定患者是否患有HIT。
根据一个实施方案，所述血小板的孵育和所述血小板和活化的血小板的定量是一步孵育，其中
所述患者低肝素混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品；
低剂量的肝素
血小板的标记检测元件；
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂；
所述患者高肝素混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品
高剂量的肝素；
血小板的标记检测元件，
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂；
所述阳性对照混合物包括：
含有血小板的样品；
血小板活化剂；
血小板的标记检测元件；
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂，
并且
所述阴性对照混合物包括：
含有血小板的样品；
血小板的标记检测元件；
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂。
根据另一个实施方案，所述血小板的定量是根据从所述血小板的标记检测元件获得的信号的水平，并且所述活化的血小板的定量是根据从活化血小板的标记检测元件获得的信号的水平。
根据另一个实施方案，所述血小板的孵育和所述血小板和活化血小板的定量是两步孵育，包括第一次孵育和第二次孵育，
其中第一次孵育是：
患者低肝素首次混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品，和
低剂量的肝素；
患者高肝素首次混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品，和
高剂量的肝素；
阳性对照首次混合物包包括：
含有血小板的样品；
血小板活化剂，和
稀释剂；
并且
阴性对照首次混合物包括：
含有血小板的样品，和
稀释剂，
并且所述第二次孵化是：
患者低肝素二次混合物包括：
孵育后等份的患者低肝素首次混合物；
血小板的标记检测元件，和
活化血小板的标记检测元件；
患者高肝素二次混合物包括：
孵育后的等份的患者高肝素首次混合物；
血小板的标记检测元件，和
活化血小板的标记检测元件；
阳性对照二次混合物包括：
等份的阳性对照首次混合物；
血小板的标记检测元件，和
活化血小板的标记检测元件。
根据另一个实施方案，代替将含有血小板的样品加入患者低肝素首次混合物和患者高肝素首次混合物中，将含有血小板的样品加入患者低肝素二次混合物和患者高肝素二次混合物中。
根据进一步的实施方案，计算截止值包括：
测量和计算来自未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数；
计算从未患有ΗTT的供体获得的样品的HEPLA指数值的平均值和标准偏差(SD)值，以及
通过将SD值乘三倍(3SD)和两倍(2SD)并将获得的乘积加到平均值来计算所述截止值，而平均值加3SD(3SD截止值)包括99％未患HIT的供体，并且平均值加2SD(2SD截止值)包括95％未患HIT的供体。
根据又一实施方案，通过将患者的HEPLA指数与截止值进行比较来确定患者是否患有HIT包括以下决定：
如果患者的HEPLA指数高于3SD截止值，则患者患有HIT；
如果患者的HEPLA指数在2SD截止值和3SD截止值之间，则患者可能患有或可能未患有HIT，并且任选地建议用含有血小板的新鲜样品重复测定，并且
如果患者的HEPLA指数低于2SD截止值，患者未患有HIT。
发明详述
在详细解释至少一个实施方案之前，应理解，本主题的应用不限于以下描述中阐述的构造细节和部件布置。该主题能够具有其他实施方案或者能够以各种方式实践或实施。而且，应该理解，这里采用的措辞和术语是为了描述的目的，不应该被认为是限制性的。
为清楚起见，从一些附图中省略了非必要元件。
与现有技术的HIT测定相反，本发明主题的HIT测定可以按需进行，甚至对于一个样品，而对于现有技术，如SRA和HIPA的功能性测定分批进行。另外，本主题的HIT测定在短时间内提供结果并且可以在紧急情况下进行。与现有技术的功能性HIT测定相反，本发明主题的HIT测定可以用来自任何类型的来源的可用的健康血小板进行，例如在血库中，甚至包括受试患者的血小板。这些血小板可以在PRP悬浮液中分离或直接从全血中使用。此外，本主题的HIT测定可以仅包括一个或两个步骤，并且它可以重复使用先前建立的测量装置的设置。该特征使得本受试者的HIT测定用户友好，因为它不需要专门的细胞计量实践者的参与。由于其上述特征，特别是方法的简单性，获得结果所需的短时间和血小板的高可用性，本主题的HIT测定容易重复，即可在需要时立即再次进行测定。这在需要立即知道患者是否具有可能激活血小板的抗肝素-PF4抗体的情况下是重要的。与现有技术的HIT测定相反，本主题的HIT测定可以容易且快速地提供这样的答案。换言之，与现有技术的HIT测定相反，本主题的HIT测定提供了用于确认患者关于其对肝素给药的反应的临床状态的即时且快速的测试。与现有技术的功能性HIT测定相比，本发明主题的HIT测定的另一个优点是本发明主题的HIT测定可以在筛选免疫测定之前进行，或代替筛选免疫测定进行或与筛选免疫测定平行进行，而现有技术功能性HIT测定仅在筛选免疫测定后进行，并且仅用于在筛选免疫测定中获得阳性结果的患者。因此，本主题的HIT测定允许以增加的置信度确定患者中HIT反应的状态，尤其是因为一些HP事件可能由与筛选免疫测定检测到的抗体不同的抗体引起。换句话说，本主题的HIT测定允许HIT的诊断比现有技术的HIT测定具有更大的确定性。本主题的HIT测定的另一个益处是其与现有技术HIT测定相比的简单性，在紧凑的自动台式流式细胞仪上进行测定的能力，不需要特定的实验室基础设施，并且需要经验丰富的实验室医生来进行测定。与现有技术的HP测定相比，该益处在很大程度上拓宽了对患者的HIT测定的可用性。本主题的HIT测定的另一个益处是与现有技术的HIT测定相比，它是标准化的。这允许比较在不同设置中获得的结果，而在现有技术的HIT测定中，这是不可能的。这允许汇编，例如将在不同实验室中获得的结果数字汇编成中央数据库，从而实现大型多中心观察研究，或为实验室实践提供基准。更不用说这种能力的医疗和经济效益。
本主题提供HIT测定。本主题还提供了用于诊断HIT的方法。该测定和/或方法可包括：
在低浓度肝素或高浓度肝素存在下，将血小板与患者血清或血浆样品一起孵育；
在血小板活化剂的存在(阳性对照)或不存在(阴性对照)下孵育血小板；
在上述四次孵育中将血小板和活化的血小板定量；
计算上述四次孵育中每一次孵育的血小板内活化血小板的百分比，并获得下列值：
用低浓度肝素孵育的血清或血浆中活化血小板的百分比[％R(低)]；
用高浓度肝素孵育的血清或血浆中活化血小板的百分比[％R(高)]；
阳性对照中活化血小板的百分比[％R(Ct+)]，以及
阴性对照中活化血小板的百分比[％R(Ct-)]；
通过将％R(低)和％R(高)之间的差值除以％R(Ct+)和％R(Ct-)之间的差值并将得到的商乘以100来计算肝素血小板活化(HEPLA)指数；
测量和计算来自未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数；
根据未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数来计算截止值，并且
通过比较患者的HEPLA指数和截止值来确定患者是否患有HIT。
测定和/或方法可包括提供从患者获得的血清或血浆样品的步骤。根据一个实施方案，从患者获得的血清或血浆样品是血清样品。根据另一个实施方案，从患者获得的血清或血浆样品是血浆样品。血清或血浆样品可以从从患者体内取出的全血样品制备。为了获得血浆样品，将全血收集在含有非肝素抗凝剂(例如柠檬酸盐)的试管中。为了获得血清样品，将全血收集在不含抗凝血剂的试管中。可以通过在基本上25℃下离心全血，例如基本上10分钟内基本上2,000g，来从血细胞中分离血浆或血清。离心后获得的血浆或血清可以在HIT测定中制备后直接使用，即新鲜样品。可替代地，血浆或血清样品可以在基本上-80℃下储存并在后期使用。在使用之前，可以将冷冻的血浆或血清样品解冻，例如通过使它们达到环境温度，或基本上37℃等。根据一个实施方案，可以在HIT测试之前过滤血浆或血清样品，例如使用0.2μm过滤器，以避免血浆或血清样品中可能存在的污染物对血小板的人工活化。总之，HIT测定包括：提供来自患者的血清或血浆样品。
测定和/或方法还可包括制备含有血小板的样品的步骤。根据一个实施方案，含有血小板的样品是富含血小板的血浆，也称为PRP。根据另一个实施方案，含有血小板的样品是全血。
PRP的制备包括提供来自健康供体(即未患有HIT的供体)或受试患者的全血样品。将全血样品收集在含有例如柠檬酸盐的非肝素抗凝剂的试管中。根据一个实施方案，体积比是1体积抗凝血剂和来自健康供体的9体积全血样品。根据另一个实施方案，在从健康供体收集全血样品之前，在单独的试管中从健康供体收集全血样品，例如基本上3-4ml全血，并丢弃。从患者收集全血，同时使剪切应力最小化，例如通过使用21G大小的针，使用止血带等。在收集全血样品后，其在环境温度下静置，例如在基本上20-25℃的温度范围内静置至少基本上30分钟。然后，在环境温度下，例如在基本上20-25℃的范围内，将全血样品例如以基本上200g离心基本上5分钟。根据一个实施方案，离心是没有制动的。离心后，将上清液(来自健康供体的PRP)精细转移到新的试管(例如聚丙烯试管)中，并保持在环境温度下，例如在基本上20-25℃的温度范围内，连续缓慢搅拌中，例如10rpm。根据一个实施方案，离心开始和通过细胞计数读取测定结果之间的优选时间段基本上为3小时。根据另一个实施方案，用于在全血中储存血小板的推荐时间段基本上是6小时而没有摇动。根据另一个实施方案，为了防止PRP中血小板的人工活化，PRP被温和地处理，例如，PRP的操作量最小，PRP不通过涡旋混合，并且在每次使用之前手指之间微妙地摇动PRP，以便在PRP中轻柔地重悬血小板。
测定和/或方法可以进一步包括一步孵育或两步孵育。
一步孵化
一步孵育包括制备患者低肝素混合物和患者高肝素混合物的步骤。
患者低肝素混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品；
低剂量的肝素
血小板的标记检测元件；
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂。
患者高肝素混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品
高剂量的肝素；
血小板的标记检测元件，
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂。
根据一个实施方案，低剂量的肝素是这样的肝素：其终浓度范围基本上为0.3至1IU/ml，优选基本上为0.3IU/ml。根据另一个实施方案，高剂量肝素是这样的肝素：其终浓度范围基本上为30至500IU/ml，优选100IU/ml。本领域已知的任何类型的肝素都在本主题的范围内，例如标准猪肝素钠，更特别是标准猪肝素钠5,000IU/ml(Sanofi，France)。
根据一个实施方案，患者低肝素混合物和患者高肝素混合物的总体积为50μl，其中从患者获得的血清或血浆样品的体积为10μL，含有血小板的样品的体积为10μl，并且对于低剂量肝素或高剂量肝素，肝素原液的体积为5μl。
根据优选的实施方案，含有血小板的样品在加入混合物时是新鲜的。根据另一个实施方案，在制备含有血小板的样品后约3小时内将含有血小板的样品加入混合物中。
一步孵育可以进一步包括孵育步骤，包括：
孵育患者低肝素混合物和患者高肝素混合物，以通过来自患者的血清或血浆样品中存在的特异性抗体激活血小板。
根据一个实施方案，孵育大约30分钟，在黑暗中轻轻摇动。根据另一个实施方案，孵育在环境温度下进行。根据又一个实施方案，温度基本上为20-25℃。
一步孵育可以进一步包括制备阳性对照混合物和阴性对照混合物的步骤。
阳性对照混合物包括：
含有血小板的样品；
血小板活化剂；
血小板的标记检测元件；
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂。
阴性对照混合物包括：
含有血小板的样品；
标记的血小板的检测元件；
活化血小板的标记检测元件，以及
稀释剂。
本领域已知的任何血小板活化剂都在本发明的范围内，例如但不限于凝血酶受体活化肽(TRAP)，钙离子载体，花生四烯酸，二磷酸腺苷(ADP)，凝血酶等。
阳性对照混合物旨在通过血小板活化剂获得活化的血小板，并且阴性对照混合物旨在获得未活化的血小板，因为阴性对照混合物中不存在血小板活化剂。根据一个实施方案，为了激活阳性对照混合物中的血小板，将阳性对照混合物孵育适合于用血小板活化剂激活血小板的一段时间。根据另一个实施方案，阳性对照在温和摇动下孵育基本上30分钟。根据另一个实施方案，阳性对照混合物在黑暗中孵育。根据进一步的实施方案，阴性对照混合物与阳性对照混合物类似地孵育。
根据一个实施方案，阳性对照混合物和阴性对照混合物的总体积基本上为50μl，其中含有血小板的样品的体积基本上为10μl。根据另一个实施方案，阳性对照混合物中的血小板活化剂处于饱和浓度。例如，当血小板活化剂是TRAP时，TRAP的浓度基本上为50μM。
血小板的标记检测元件是本领域已知的任何元件，其被配置为检测血小板并用配置成用于流式细胞术的标记物标记。标记可以是本领域已知的任何发光分子，或本领域已知的任何荧光染料。血小板的标记检测元件可以是与血小板特异性结合的任何标记或分子，优选是针对血小板特异性的抗原的标记抗体，例如针对血小板糖蛋白IIb/IIIa的标记抗体，例如标记的抗CD41抗体，标记的抗CD41a抗体等。根据另外的实施方案，抗体是本领域已知的任何类型的抗体。抗体可以是多克隆抗体，或优选是单克隆抗体。
活化血小板的标记检测元件是本领域已知的任何元件，其配置成检测活化的血小板并用配置成用于流式细胞术的标记物标记。标记可以是本领域已知的任何发光分子，或本领域已知的任何荧光染料。活化血小板的标记检测元件可以是与活化血小板特异性结合的任何标记或分子，优选是针对对活化血小板特异的抗原的标记抗体，例如针对活化血小板p-选择蛋白的标记抗体，例如标记的抗-CD62p抗体等。根据另外的实施方案，抗体是本领域已知的任何类型的抗体。抗体可以是多克隆抗体，或优选是单克隆抗体。
根据一个实施方案，血小板的检测元件和活化血小板的检测元件各自用荧光标记或任何发光分子标记。根据另一个实施方案，血小板检测元件的荧光标记的激发和发射光谱不同于活化血小板的检测元件的荧光标记的激发和发射光谱。当在混合物中一起存在时，激发和发射光谱的这种差异允许同时进行标记的荧光发射的不同的激发和检测。允许标记的同时激发和发射检测的任何标记组合都在本主题的范围内。示例性组合是异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)。因此，检测元件之一可以用FITC标记而另一个用PE标记。此外，如上所述，本领域已知的任何类型的抗体都在本主题的范围内。因此，例如，混合物可包含PE缀合的抗CD41a单克隆抗体和FITC缀合的抗CD62p单克隆抗体。
根据一个实施方案，患者低肝素激活检测混合物、患者高肝素激活检测混合物、阳性对照检测混合物和阴性对照检测混合物的总体积基本为50μl，其体积为孵育后相应的患者低肝素混合物、孵育后患者高肝素混合物、阳性对照混合物和阴性对照混合物基本上为5μl。
一步孵育可以进一步包括用生物相容性缓冲液稀释孵育的患者低肝素激活检测混合物、孵育的患者高肝素激活检测混合物、孵育的阳性对照检测混合物和孵育的阴性对照检测混合物。根据另一个实施方案，生物相容性缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)，如本领域已知的。该实施方案涉及本文提到的任何稀释剂。例如，当孵育的患者低肝素激活检测混合物、孵育的患者高肝素激活检测混合物、孵育的阳性对照检测混合物和孵育的阴性对照检测混合物的体积基本上为50μL的体积时，生物相容的体积缓冲液基本上为450μl，产生500μl的总体积。
两步孵化
两步孵育可包括制备患者低肝素首次混合物和患者高肝素首次混合物的步骤。
患者低肝素首次混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品，以及
低剂量肝素。
患者高肝素首次混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品，以及
高剂量肝素。
与低剂量肝素和高剂量肝素相关的实施方案类似于一步孵育中描述的相应实施方案。
根据一个实施方案，如上所述，可以将含有血小板的样品加入患者低肝素首次混合物和患者高肝素首次混合物中。
根据另一个实施方案，含有血小板的样品可以添加到患者低肝素二次混合物和患者高肝素二次混合物中。
根据一个实施方案，患者低肝素首次混合物和患者高肝素首次混合物的总体积为50μl，其中从患者获得的血清或血浆样品的体积为10μl，含有血小板的样品的体积为10μl，对于低剂量肝素或高剂量肝素，肝素原液的体积为5μl。
两步孵育可以进一步包括第一次孵育的步骤，包括：孵育患者低肝素首次混合物和患者高肝素首次混合物，用于通过来自患者的血清或血浆样品中存在的特异性抗体激活血小板。
根据一个实施方案，第一次孵育大约一小时。根据另一个实施方案，孵育在环境温度下进行。根据又一个实施方案，温度基本上为20-25℃。
两步孵育可以进一步包括制备阳性对照首次混合物和阴性对照首次混合物的步骤。
阳性对照首次混合物包含：
含有血小板的样品；
血小板活化剂，以及
稀释剂。
阴性对照首次混合物包含：
含有血小板的样品，以及
稀释剂。
与血小板活化剂相关的实施方案类似于一步孵育中描述的相应实施方案。
此外，在两步孵育中，阳性对照首次混合物旨在通过血小板活化剂获得活化的血小板，并且阴性对照首次混合物旨在获得未活化的血小板，因为血小板活化剂在阴性对照首次混合物中不存在。
根据一个实施方案，为了激活阳性对照首次混合物中的血小板，将阳性对照首次混合物孵育适合于用血小板活化剂激活血小板的一段时间。根据另一个实施方案，将阳性对照首次混合物孵育基本上15分钟。根据另一个实施方案，阳性对照首次混合物在黑暗中孵育。根据进一步的实施方案，阴性对照首次混合物与阳性对照混合物类似地孵育。
根据一个实施方案，阳性对照首次混合物和阴性对照首次混合物的总体积基本为50μl，其中含有血小板的样品体积基本上为10μl。根据另一个实施方案，阳性对照首次混合物中的血小板活化剂处于饱和浓度。例如，当血小板活化剂是TRAP时，TRAP的浓度基本上为50μM。
两步孵育可以进一步包括制备患者低肝素二次混合物和患者高肝素二次混合物、阳性对照二次混合物和阴性对照二次混合物的步骤。
患者低肝素二次混合物包括：
等份的孵育后患者低肝素首次混合物；
血小板的标记检测元件，和
活化血小板的标记检测元件。
患者高肝素二次混合物包括：
等份的孵育后患者高肝素首次混合物；
血小板的标记检测元件，和
活化血小板的标记检测元件。
阳性对照二次混合物包括：
等份的阳性对照首次混合物；
血小板的标记检测元件，和
活化血小板的标记检测元件。
阴性对照二次混合物包括：
等份的阴性对照首次混合物；
血小板的标记检测元件，和
活化血小板的标记检测元件。
与血小板的标记检测元件和活化血小板的标记检测元件相关的实施方案类似于在一步孵育中描述的相应实施方案。
根据一个实施方案，患者低肝素二次混合物、患者高肝素二次混合物、阳性对照二次混合物和阴性对照二次混合物的总体积基本上为50μl，其中相应的孵育后患者低浓度肝素首次混合物、孵育后患者高肝素首次混合物、阳性对照首次混合物和阴性对照首次混合物的体积约5μl。
两步孵育可以进一步包括第二次孵育的步骤，包括孵育患者低肝素二次混合物，患者高肝素二次混合物，阳性对照二次混合物和阴性对照二次混合物，以允许结合每个标记的检测元件与其靶标相结合，例如当标记的检测元件是抗体时，第二次孵育的目的是使抗体与其特异性抗原结合。根据一个实施方案，第二次孵育进行基本上为15分钟。根据另一个实施方案，第二次孵育是在环境温度下进行的。根据另一个实施方案，第二次孵育的温度范围基本上为20-25℃。根据又一个实施方案，第二次孵育在本领域已知的任何条件下都不会损害荧光标记，例如在黑暗中不会损害荧光标记。
测定和/或方法可以进一步包括用稀释剂稀释孵育的患者低肝素二次混合物、孵育的患者高肝素二次混合物、孵育的阳性对照二次混合物和孵育的阴性对照二次混合物。与稀释剂和稀释剂的二次混合物的稀释相关的实施方案类似于在一步孵育中描述的相应实施方案。
计算和解释
在一步孵育或两步孵育之后，测定和/或方法可以进一步包括根据以下中的每一个中的总血小板计算活化血小板百分比的步骤：稀释的孵育的患者低肝素激活检测混合物，以下称为“％R(低)”；稀释的孵育患者高肝素激活检测混合物，“％R(高)”；稀释的孵育阳性对照检测混合物，下文称为“％R(Ct+)”，以及稀释的孵育阴性对照检测混合物，下文称为“％R(Ct-)”。计算可以由读取样品的装置执行。
根据一个实施方案，计算来自总血小板的活化血小板的百分比，所述计算包括：
根据从血小板的标记检测元件获得的信号水平确定总血小板的量；
根据从总血小板量内的活化血小板的标记检测元件获得的信号水平确定活化血小板的量。
所述测定和/或方法可以进一步包括计算肝素活化血小板与潜在可活化血小板的比率的步骤，在下文中称为“HEPLA指数”。通过将％R(低)和％R(高)之间的差值除以％R(Ct+)和％R(Ct-)之间的差值并将获得的商乘以100来计算HEPLA指数。下面的公式总结了计算HEPLA指数：％HEPLA指数＝100*[％R(低)-％R(高)]/[％R(Ct+)-％R(Ct-)]
所述测定和/或方法可以进一步包括基于与通过计算截止值的方法获得的计算的截止值的比较来解释HEPLA指数的步骤，包括：
测量和计算来自未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数；
计算从未患有HIT的供体获得的样品的HEPLA指数值的平均值和标准偏差(SD)值，并且
通过将SD值乘三倍(3SD)和两倍(2SD)并将获得的乘积加到平均值来计算所述截止值，而平均值加3SD(3SD截止值)包括99％未患HIT的供体，并且平均值加2SD(2SD截止值)包括95％未患HIT的供体。
根据一个实施方案，HEPLA指数的2SD截止值可以基本上为9.6％，3SD截止值可以基本上为13％。应当注意，上述截止值仅是示例性的，并且截止值可以是所使用的一步或两步方法的不同函数。应当注意，对于从未患有HIT的供体获得的样品获得的HEPLA指数的任何截止值都在本主题的范围内。
所述测定和/或方法可以进一步包括确定患者是否患有HIT的步骤，包括：
将患者的HEPLA指数与截止值进行比较；
如果患者的HEPLA指数高于在3SD截止值时，患者患有HIT；
如果患者的HEPLA指数在2SD截止值和3SD截止值之间，则患者可能患有或可能未患有HIT，并且任选地建议重复用含有血小板的新鲜样品进行测定；
如果患者的HEPLA指数低于2SD截止值，则患者未患有HIT。
根据一个实施方案，测定和/或方法中使用的试剂在使用前在环境温度下平衡。根据另一个实施方案，环境温度基本上为20-25℃。
应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方案的上下文中描述的主题的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的主题的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。
尽管已经结合本发明的具体实施方案描述了本主题，但显然许多替代、修改和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些替代、修改和变化。
Claims (8)
1.测定患者血清或血浆样品中肝素诱导的血小板减少症(HIT)的方法，该方法包括：
在低浓度肝素(患者低肝素混合物)或高浓度肝素(患者高肝素混合物)存在的情况下，将血小板与患者的血清或血浆样品一起孵育；
在血小板活化剂存在下(阳性对照混合物)或不存在(阴性对照混合物)的情况下孵育血小板；
对患者低肝素混合物、患者高肝素混合物、阳性对照混合物和阴性对照混合物中的血小板和活化血小板进行定量；
计算每种上述混合物中血小板内活化血小板的百分比，并获得以下值：
患者低肝素混合物中活化血小板的百分比[％R(低)]；
患者高肝素混合物中活化血小板的百分比[％R(高)]；
阳性对照混合物中活化血小板的百分比[％R(Ct+)]，以及
阴性对照混合物中活化血小板的百分比[％R(Ct-)]；
通过将％R(低)和％R(高)之间的差值除以％R(Ct+)和％R(Ct-)之间的差值并将得到的商乘以100来计算肝素血小板活化(HEPLA)指数；
测量和计算来自未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数；
根据来自未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数来计算截止值，并且
通过比较患者的HEPLA指数和截止值来确定患者是否患有HIT。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述血小板的孵育和所述血小板和活化的血小板的定量是一步孵育，其中
所述患者低肝素混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品；
低剂量的肝素
血小板的标记检测元件；
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂；
所述患者高肝素混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品
高剂量的肝素；
血小板的标记检测元件，
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂；
所述阳性对照混合物包括：
含有血小板的样品；
血小板活化剂；
血小板的标记检测元件；
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂，
并且
所述阴性对照混合物包括：
含有血小板的样品；
血小板的标记检测元件；
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述血小板的定量是根据从所述血小板的标记检测元件获得的信号的水平，并且所述活化的血小板的定量是根据从活化血小板的标记检测元件获得的信号的水平。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述血小板的孵育和所述血小板和活化血小板的定量是两步孵育，包括第一次孵育和第二次孵育，
其中第一次孵育是：
患者低肝素首次混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品，和
低剂量的肝素；
患者高肝素首次混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品，和
高剂量的肝素；
阳性对照首次混合物包包括：
含有血小板的样品；
血小板活化剂，和
稀释剂；
并且
阴性对照首次混合物包括：
含有血小板的样品，和
稀释剂，
并且所述第二次孵化是：
患者低肝素二次混合物包括：
孵育后等份的患者低肝素首次混合物；
血小板的标记检测元件，和
活化血小板的标记检测元件；
患者高肝素二次混合物包括：
孵育后的等份的患者高肝素首次混合物；
血小板的标记检测元件，和
活化血小板的标记检测元件；
阳性对照二次混合物包括：
等份的阳性对照首次混合物；
血小板的标记检测元件，和
活化血小板的标记检测元件。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述血小板的定量是根据从血小板的标记检测元件获得的信号的水平，并且活化血小板的定量是根据从活化血小板的标记检测元件获得的信号的水平。
6.根据权利要求4所述的方法，其中代替将含有血小板的样品加入患者低肝素首次混合物和患者高肝素首次混合物中，将含有血小板的样品加入患者低肝素二次混合物和患者高肝素二次混合物中。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，计算截止值包括：
测量和计算来自未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数；
计算从未患有ΗΤT的供体获得的样品的HEPLA指数值的平均值和标准偏差(SD)值，以及
通过将SD值乘三倍(3SD)和两倍(2SD)并将获得的乘积加到平均值来计算所述截止值，而平均值加3SD(3SD截止值)包括99％未患HIT的供体，并且平均值加2SD(2SD截止值)包括95％未患HIT的供体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，通过将患者的HEPLA指数与截止值进行比较来确定患者是否患有HIT包括以下决定：
如果患者的HEPLA指数高于3SD截止值，则患者患有HIT；
如果患者的HEPLA指数在2SD截止值和3SD截止值之间，则患者可能患有或可能未患有HIT，并且任选地建议用含有血小板的新鲜样品重复测定，并且
如果患者的HEPLA指数低于2SD截止值，患者未患有HIT。
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