CN101470120A

CN101470120A - 检测人血型的电化学方法及系统

Info

Publication number: CN101470120A
Application number: CNA2007103053621A
Authority: CN
Inventors: 汪大明; 杨文�; 肖江群; 王保丹
Original assignee: Intec Products Inc Xiamen
Current assignee: Intec Products Inc Xiamen
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2009-07-01

Abstract

本发明涉及检测人类血型的方法，特别是涉及使用电化学手段检测人类ABO血型的方法及所使用的检测系统。该系统由电极系统、电流阻抗检测系统组成。将待测血样滴加在预先修饰好的电极上后，根据血样中红细胞与固定在电极表面的血型抗体反应后所带来的交流阻抗的改变达到对血型的判断。本方法操作简单，结果明了，可以有效避免操作者的主观影响等。

Description

检测人血型的电化学方法及系统

发明领域

本发明涉及检测人类血型的方法及系统，特别是涉及使用电化学手段检测人类ABO血型所使用的电化学检测方法和系统。

发明背景

血液分型是将人血液分成A、B、AB和O四种不同类型的常规方法。目前，血液分型方法都是根据红血细胞悬液的细胞聚集完成的。该方法是首先从病人血清中分离红细胞。将适量的红细胞与引入试管中或玻片上的试验溶液(含有抗A血清、抗B血清)或其稀释液混和，可以再加入利于免疫反应进行的试剂并保温、离心和搅拌。然后在显微镜下肉眼观察，确定细胞是否发生了聚集。

如果样品在抗A试剂存在下发生细胞聚集，而在抗B存在下不发生集聚即鉴定为A型血。样品在抗B试剂存在下发生细胞聚集，但在抗A存在下不发生聚集则鉴定为B型血。样品与抗A和抗B试剂均有聚集，样品为AB型血。样品与抗A和B血清均不发生反应则定为O型血。

目前检测ABO血型的技术可以分为两类，一类为检测细胞膜上结合血型抗原的技术，包括红细胞盐水凝集法、中和实验、吸收实验、解离实验和混合凝集反应等。另一类直接检测游离血型抗原，包括协同凝集反应、放射免疫反应等。

红细胞盐水凝集法是通过已知的IgM型抗体结合新鲜红细胞表面的血型抗原，导致红细胞凝集，来判断被检血液的血型。此方法广泛用于临床输血前的血型检验(配型)，但只能用于检测新鲜红细胞的血型，而且试剂均需低温保存。

其他血型检测方法也都存在各自的缺点，例如中和实验费时较长，而且灵敏度比较低。解离实验和混合凝集反应操作要求高，每次实验需要反复摸索条件，其灵敏度也不高；协同凝结反应是用IgG型抗体致敏SPA蛋白，通过葡萄球菌的凝集是否判断血型，但对试剂保存要求较高，使其应用受到一定限制；放射免疫和酶联免疫方法虽然灵敏度高，但是不适合单人份检测，也无法实现现场检测。

上述这些血型分析和判断方法需要由有经验的技术人员手工完成的，所以常常受到技术人员经验和工作疲劳程度等因素影响，导致结果判断错误。另外，传统方法需要使用载玻片、盖玻片和吸管等物件及抗人球蛋白抗体。如果使用不慎，在实验过程中很可能对人员或环境造成严重污染。可见，目前常用的临床血型鉴定方法存在检定时间长、手工劳动强度大，以及结果受主观偏差影响较大和存在污染的可能等问题。因此，有必要对传统的血型检测方法做出实质性的改进。

发明内容

本发明提供了利用电化学阻抗分析技术检测人ABO血型的检测系统，该系统是以化学交联法在电极表面固定的红细胞ABO血型抗体，与待检红细胞发生免疫结合反应，引起工作电极的交流阻抗的改变来达到对血型的鉴定，所说的检测系统包括：(1)检测电极：为丝网印刷的三电极，其中包括石墨工作电极、石墨对电极和银/氯化银参比电极，其中工作电极表面固定有ABO血型抗体；(2)交流阻抗分析装置：为能够检测由于红细胞与其抗体的结合所导致的工作电极交流阻抗的变化，从而借以判断红细胞表面抗原的类型。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的交流阻抗法血型检测系统是利用电极表面固定的红细胞ABO血型抗体与红细胞发生免疫结合反应，引起电极之间交流阻抗的改变来达到对血型的鉴定。

本发明的交流阻抗法血型检测系统包括：(1)检测电极：为丝网印刷的三电极。三电极包括石墨工作电极、石墨对电极和银/氯化银参比电极，其中工作电极表面固定有ABO血型抗体；(2)检测装置：为具有检测交流阻抗功能的电化学分析装置，在红细胞与相应抗体反应后，其能够检测出由于特定血型红细胞的存在所导致的工作电极交流阻抗的改变，从而可借以判断红细胞表面血型抗原的类型。

本发明是利用红细胞与红细胞ABO血型抗体发生免疫反应前后电极表面显著变化，导致的工作电极的交流阻抗发生变化的这一特性，达到对血型的指示。

根据本发明的优选实施方案，其特征在于所说的检测电极是丝网印刷的三电极，其中包括石墨工作电极，银/氯化银参比电极以及石墨对电极。检测时，该检测电极被插入在检测装置前端的凹槽内。

根据本发明的优选实施方案，特征是采用化学交联法将抗A抗体或抗B抗体固定在工作电极表面，并使所说的抗体直接在电极表面上与待检红细胞发生免疫反应。

根据本发明的优选实施方案，其特征是利用交流阻抗的电化学分析装置直接测量丝网印刷电极的交流阻抗变化，并分析所说变化的幅度。

可以将经过稀释的待检血液样品加至电极表面并覆盖整个电极的工作区域，静置一段时间(5分钟左右)，待发生免疫结合反应后，用5mM磷酸盐缓冲液(PBS)进行冲洗，然后利用具有交流阻抗检测功能的电化学分析装置检测电极的交流阻抗。由于红细胞的存在而显著地改变了工作电极的交流阻抗，所以可根据工作电极的交流阻抗的改变判断红细胞表面抗原的类型。

本发明电化学免疫分析检测ABO血型，是用已知特异性抗体与血型抗原反应，利用血型物质在电极表面发生免疫反应前后的电化学信号改变来判断血型类型，故具有较高的灵敏度。同时，本发明的方法操作简单方便、可避免现有普通交叉配血实验的各种缺陷。传统的凝集法则通常需要加入抗人球蛋白抗体使红细胞凝集以便用肉眼观察。本发明方法的检测原理利用的是免疫结合反应，即利用红细胞的电化学特性，而无需使其凝集，所以不需要加入抗人球蛋白抗体。仪器操作软件具有数据处理及识别分析功能，可以避免人为的主观干扰。特别适合采血现场ABO血型的快速检测以及血型的家庭自检，也适用于血站系统对批量血液样品的ABO血型快速鉴定。

附图说明

图1显示本发明血型检测方法中使用的整体反应检测系统模式图。其中1为检测装置，2为固定了血型抗体的电极系统。电极系统2被插入在检测装置1上显示的凹槽3内。

图2显示本发明血型检测方法中使用的三电极工作电极区域免疫反应后的模式图。其中1为免疫反应的红细胞；2为电极上固定的ABO血型抗体；3为工作电极。

图3显示本发明血型检测方法中最后的结果判读原理图。其中1为B型血样和固定有抗B抗体的电极反应的检测结果阻抗图；2为A型血样和固定有抗A抗体的电极反应的检测结果阻抗图；3为B型血样和固定有抗A抗体的电极反应的检测结果阻抗图；4为A型血样与固定有抗B抗体的电极反应的检测阻抗图。即曲线1和曲线2为未凝集的结果，曲线3和曲线4为发生凝集的结果。

具体实施方式

实施例1：交流阻抗法检测血型：

(1)在电极上固定血型抗体(抗A和抗B抗体)：

称取壳聚糖固体0.01g，以0.2M醋酸溶液稀释到1ml，终浓度为1％。以微量移液器吸取1μl上述壳聚糖溶液，滴加在4.5mm²的石墨工作电极上，室温自然晾干。

在处理好的工作电极表面滴加0.05％的戊二醛溶液过夜，5mM磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后泡入浓度为5mg/ml的血型抗体(抗A、抗B抗体)溶液中，交联24小时。取出，用5mM PBS洗去游离的血型抗体(抗A、抗B抗体)，最后用浓度为5％的牛血清白蛋白(BSA)封闭2小时。最后干燥后密封保存。

(2)加入红细胞待检样品进行免疫反应：

血样用生理盐水或其它等张稀释液稀释到2％—5％浓度，移取20μl至电极表面，室温反应5分钟左右，用10mM PBS冲洗除去未结合在电极表面的红细胞。

(3)检测电极交流阻抗信号：

在滴加待检血样之前先在电极表面加入20μl生理盐水，将电极插入检测仪器前端电极插槽内检测电极表面溶液的交流阻抗值；滴加待检血样免疫反应后，用生理盐水冲洗除去未结合在电极表面的红细胞，在电极表面加入20μl生理盐水，相同参数下检测电极表面溶液的交流阻抗值。根据反应前后交流阻抗大小的差值，判断是否有红细胞结合到电极表面。

结果如图3所示。其中横坐标表示交流阻抗检测时的溶液电阻，纵坐标表示交流阻抗检测时的电容电阻。简而言之，交流阻抗的大小可以根据阻抗弧度的大小来直观表示。结合本检测结果，阻抗弧半径小的表示红细胞和相应的血型抗体没有发生免疫结合反应，弧半径大的表示红细胞和相应的血型抗体发生了免疫结合反应。图3中，曲线1为A型血液样本与固定有抗B抗体的电极反应的检测曲线；曲线2为B型血液样本和固定有抗A抗体的电极反应的检测曲线；曲线3为A型血液样本和固定有抗A抗体的电极反应的检测曲线；曲线4为B型血液样本和固定有抗B抗体的电极反应的检测曲线。通过多个样品检测，目前可以判定溶液阻抗不大于250欧的即可以确定为没有发生免疫结合反应。

溶液阻抗大于250欧则发生了免疫结合，反之则未发生免疫结合。和固定有抗A抗体以及抗B抗体都发生结合的为AB型血；和抗A抗体以及抗B抗体都未发生结合的为O型血；和抗A抗体发生结合但是和抗B抗体未结合的为A血型；和抗A抗体未结合但是和抗B抗体结合的为B血型。

实施例2：本发明血型检测方法的实际应用

三电极交流阻抗法检测血型检测系统适合街头采血以及家庭ABO血型自检等。通过预先修饰的电极，达到对血型快速简单的鉴定。该方法操作简单快速，不需要额外添加抗人球蛋白等试剂，全部检测过程不超过10分钟即可完成，而且易于普及。我们使用传统的血型检测方法和本发明的电化学血型检测方法，对普通人群100例个体(献血员)同时进行血型检测。结果显示，本方法的检测结果和与已知的血球凝集方法相比较，符合率达到100％。同时本发明的电化学检测方法避免了目前常用的临床血型鉴定方法存在检定时间长、手工劳动强度大，以及结果受操作者主观偏差影响较大和存在污染的可能等各种问题。

Claims

1、一种利用电化学阻抗分析技术检测人ABO血型的检测系统，该系统是以化学交联法在电极表面固定的红细胞ABO血型抗体，与待检红细胞发生免疫结合反应，引起工作电极的交流阻抗的改变来达到对血型的鉴定，所说的检测系统包括：(1)检测电极：为丝网印刷的三电极，其中包括石墨工作电极、石墨对电极和银/氯化银参比电极，其中工作电极表面固定有ABO血型抗体；(2)交流阻抗分析装置：为能够检测由于红细胞与其抗体的结合所导致的工作电极交流阻抗的变化，从而借以判断红细胞表面抗原的类型。

2、根据权利要求1的系统，其中检测电极被插入到检测装置前端的电极插槽内。

3、根据权利要求1的系统，其特征是利用化学交联法在丝网印刷电极的工作电极表面固定红细胞ABO血型抗体。

4、根据权利要求1的系统，其中所说的检测装置是交流阻抗分析装置，利用具有检测交流阻抗功能的交流阻抗分析装置检测丝网印刷电极发生免疫结合反应前后的交流阻抗变化。