JP2004502432A

JP2004502432A - ヒト１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１様酵素の調節

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Publication number: JP2004502432A
Application number: JP2002508037A
Authority: JP
Inventors: シャイアム・ラマクリシュナン
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-07-05
Filing date: 2001-07-04
Publication date: 2004-01-29
Also published as: WO2002002797A3; AU2001276378A1; EP1309697A2; WO2002002797A2

Abstract

ヒト１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１様酵素を調節する試薬、及びヒト１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１様酵素遺伝子産物と結合する試薬は、ＣＮＳ障害、骨粗鬆症、肝疾患、肥満症、血圧異常または胎児発育異常、及び糖尿病（これらに制限されるわけではない）を含む機能障害又は疾患を予防し、回復し、または癒す役割を果たすことができる。

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、ヒト１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１様酵素の調節に関する。
【０００２】
（背景技術）
グルココルチコイドの組織内レベルは、酵素１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによって調整されている。この酵素の２つのイソ型が単離されている。タイプＩ酵素（１１β−ＨＳＤ１）は、不活性な１１−ケト代謝物であるコルチゾン及び１１−デヒドロコルチコステロンから、それぞれ活性なグルココルチコイドであるコルチゾール（ヒトにおいて）またはコルチコステロン（げっ歯類において）を形成させるオキソレダクターゼとして主に作用する二機能性酵素である（Ａｇｕｒｗａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６４，１８９３９−４６，１９８９）。タイプＩＩイソ型（１１β−ＨＳＤ２）は非間接的に（ｕｎｉｎｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ）作用し、不活性な１１−ケト代謝物を産する。これはＮＡＤを利用してグルココルチコイドを、グルココルチコイドおよびミネラルコルチコイド受容体に対して親和性の低い１１−ケト化合物に代謝する（Ａｌｂｉｓｔｏｎら、Ｍｏｌｅｃ．ＣｅｌｌＥｎｄｏｃｒ１０５，Ｒ１１−１７，１９９４；Ｆｕｎｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２，５８３−８５，１９８８；Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｌａｎｃｅｔ２，９８６−８９，１９８８）。
【０００３】
マウスの遺伝子欠失実験は、この酵素が正常な血清グルココルチコイドレベルを維持するのに重要であり、かつ鍵となる肝臓糖新生酵素の活性化に関与することを示している。他の重要な作用部分としては、網脂肪（ｏｍｅｎｔａｌｆａｔ）、卵巣、腎臓、脳および脈管構造が挙げられる（Ｋｏｏｚｏｗｓｋｙら、Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９，３９１−４０１，１９９９）。１１β−ＨＳＤ１活性は、主要な血管や心臓の全てに見られ、抵抗血管ではその活性はより高い、このことは１１β−ＨＳＤ１が血圧を調整する働きがあることを意味している（Ｗａｌｋｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２９，３３０５−１２，１９９１）。１１β−ＨＳＤ１ｍＲＮＡおよび１１β−ＨＳＤ２ｍＲＮＡは、１１β−ＨＳＤ１イソ型が優位な状態で、ラットの大動脈内皮細胞に併存している（Ｂｒｅｍら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ３１，４５９−６２，１９９８）。１１β−ＨＳＤ１活性を選択的に阻害することで、大動脈環（リング）におけるフェニレフリンおよびアンジオテンシンＩＩの収縮効果が減弱される（Ｂｒｅｍら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ３０，４４９−５４，１９９７）。
【０００４】
１１β−ＨＳＤ１酵素は肝臓において最も濃度が高い。ヒト肝臓における免疫組織化学研究は、１１β−ＨＳＤ１が中心静脈付近で濃縮されていることを示している（Ｒｉｃｋｅｔｔｓら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５６，１５９−６８，１９９８）。肝臓１１β−ＨＳＤ１は解毒機構に関与する（Ｏｐｐｅｒｍａｎら、Ｅｕｒ．ＪＢｉｏｃｈｅｍ．２２７，２０２−０８，１９９５）。２つの１１β−ＨＳＤ１イソ型のレベルは、胎児脳の発育過程で異なり、そして変化する。１１β−ＨＳＤ１は、ラット腎臓およびヒト胎盤に大量に存在するが、経口避妊薬を接種している女性では低レベルである（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１０１，１２１−２７，１９９９のＫｏｚｏｗｓｋｙによる総括を参照のこと）。
【０００５】
ラット肝臓における１１β−ＨＳＤ１ｍＲＮＡは、新生仔では低レベルで存在し、８週齢では増加してプラトーに達する（Ｋｒｏｚｏｗｓｋｉら、１９９０）。雄は、雌よりも約２０倍以上の１１β−ＨＳＤ１ｍＲＮＡを有しており、雌のそのレベルはエストラジオールおよび成長ホルモンによって抑制されている（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４３，５４１−４８，１９９４；Ａｌｂｉｓｔｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０９，１８３−８８，１９９５）。
【０００６】
１１β−ＨＳＤ１発現に影響を及ぼす因子は知られている。肝癌細胞系２ＳＦＡＺＡにおける１１β−ＨＳＤ１活性およびｍＲＮＡ発現は、デキサメタゾンにより増大し、フォルスコリンやインスリン様成長因子１によって低下する（Ｖｏｉｃｅら、ＢｉｏｃｈｅｍＪ．３１７，６２１−２５，１９９６）。ラット肝細胞やヒト肝細胞における研究では、甲状腺ホルモンおよびプロゲステロンが１１β−ＨＳＤ１活性に対して種特異的効果を発揮するが、メッセージレベルでは効果がないことが示された（Ｒｉｃｋｅｔｔｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８３，１３２５−３５，１９９８）。晩期妊娠のラットをデキサメタゾンに曝す結果、子孫の成体の１１β−ＨＳＤ１が変化することなく、グルココルチコイド受容体およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼが有意に増加する（Ｎｙｉｒｅｎｄａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１，２１７４−８１，１９９８）。
【０００７】
１１β−ＨＳＤ１発現やその調節が、微妙な均衡状態にあり、組織および発育段階に特異的であることは、明らかである。例えば、発育段階特異的または組織特異的アゴニスト／アンタゴニストを介して、治療効果を発揮するように調節できる類似の酵素をさらに同定する必要性がある。
【０００８】
（発明の概要）
本発明の目的は、ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素を調節する試薬および方法を提供することである。本発明のこの目的および他の目的は、以下に記載の１つまたはそれ以上の実施例により提供される。
【０００９】
本発明の１つの態様は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および、配列番号２に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドである。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、細胞外基質（マトリックス）分解を低下させる物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および、配列番号２に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドと接触させる。
【００１１】
被験化合物と１１β−ＨＳＤ様酵素ポリペプチドとの間の結合を検出する。それにより、１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドと結合する被験化合物を、細胞外マトリックス分解を低下させる可能性のある物質として同定する。この物質は１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を低下させることによって作用できる。
【００１２】
本発明の別の態様は、細胞外マトリックス分解を低下させる物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；および、配列番号１に示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、と接触させる。
【００１３】
該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する。該ポリヌクレオチドと結合する被験化合物を、細胞外マトリックス分解を低下させる可能性のある物質として同定する。該物質は、１１β−ＨＳＤ１様酵素ｍＲＮＡとの相互作用を通じて１１β−ＨＳＤ１様酵素の量を低下させることによって作用できる。
【００１４】
本発明の別の態様は、細胞外マトリックス分解を調節する物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および、配列番号２に示すアミノ酸配列から成る郡より選択されるアミノ酸配列を含む１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチド、と接触させる。
【００１５】
該ポリペプチドの１１β−ＨＳＤ１様酵素活性を検出する。それにより、被験化合物の非存在下における１１β−ＨＳＤ１様酵素活性と比較して、該ポリペプチドの１１β−ＨＳＤ１様酵素活性を増大させる被験化合物を、細胞外マトリックス分解を増大させる可能性のある物質として同定する。それにより、被験化合物の非存在下における１１β−ＨＳＤ１様酵素活性と比較して、該ポリペプチドの１１β−ＨＳＤ１様酵素活性を低下させる被験化合物を、細胞外マトリックス分解を低下させる可能性のある物質として同定する。
【００１６】
本発明のさらなる別の態様は、細胞外マトリックス分解を低下させる物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；および、配列番号１に示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの１１β−ＨＳＤ１様酵素産物、と接触させる。
【００１７】
該１１β−ＨＳＤ１様酵素産物に対する被験化合物の結合を検出する。それにより、１１β−ＨＳＤ１様酵素産物と結合する被験化合物を、細胞外マトリックス分解を低下させる可能性のある物質として同定する。
【００１８】
本発明のもっと別の態様は、細胞外マトリックス分解を減少させる方法である。細胞を、
１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合する試薬、または、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；および、配列番号１に示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされている産物、
と接触させる。
【００１９】
それにより、細胞における１１β−ＨＳＤ１様酵素活性を低下させる。
【００２０】
従って、本発明は、ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素の作用部位で例えばアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る被験化合物を同定するのに用いることができる、ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素を提供する。ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素およびその断片もまた、該酵素をブロックし、その活性を効果的に減少させ得る特異的な抗体を産生せるのに有用である。
【００２１】
（発明の詳しい説明）
本発明は、１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および、配列番号２に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）配列番号１に記載の配列を含むポリヌクレオチド、
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）〜（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱しているポリヌクレオチド、並びに
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に明記するポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異体を表すポリヌクレオチド、
から成る群より選択されるポリヌクレオチド、に関する。
【００２２】
さらに、本出願人は、新規１１β−ＨＳＤ１様酵素、特にヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素が本発明の発見であることを、本出願により見出した。ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素には、配列番号２に示すアミノ酸配列（ジーンバンクアクセッションナンバーＡＷ１６３６８４）が含まれる。ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素はヒト配列を検索することで、ラット副腎皮質（コルチコ）ステロイド１１βデヒドロゲナーゼ（配列番号３、スイスプロットアクセッションナンバーＰ１６２３２）と同定した。ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素は、スイスプロットアクセッションナンバーＰ１６２３２（図７）と同一のラットタンパク質と、８６アミノ酸にわたって４３％一致する。従って、本発明のヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素は、以前に同定されたヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼと同じ目的、例えば種々の組織および胎児発育期間のステロイドレベルを慎重に均衡を保たせるのに有用であると期待される。さらに、ステロイド調節は、骨粗鬆症に重要な働きをすると期待される。このように、ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素は、ＣＮＳ障害、骨粗鬆症、血圧障害または胎児発育障害、および糖尿病などの障害を処置するための治療法に用いることができる。また、ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素は、ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素アゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするのに用いることができ、そして診断方法に用いることができる。
【００２３】
ポリペプチド
本発明に係る１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドには、配列番号２に示すアミノ酸配列、または以下定義による生物学的に活性なその変異体より選択される、少なくとも１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１２５、２００または２２０個の連続アミノ酸が含まれる。したがって、本発明の１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドは、１１β−ＨＳＤ１様酵素タンパク質の一部、完全長の１１β−ＨＳＤ１様酵素タンパク質、または１１β−ＨＳＤ１様酵素タンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。
【００２４】
生物学的に活性な変異体
生物学的活性がある、即ちコルチゾールとコルチゾンを相互交換する能力を保持している１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド変異体のもまた、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドである。天然または非天然１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド変異体は、配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約４４、５０、５５、６０、６５または７０％、好ましくは、約７５、８０、８５、９０、９６、９６または９８％一致するアミノ酸配列またはその断片を有することが好ましい。推定される１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド変異体と配列番号２に記載のアミノ酸配列との間の一致パーセントは、Ｂｌａｓｔ２整列（アライメント）プログラム（Ｂｌｏｓｕｍ６２，Ｅｘｐｅｃｔ１０，ｓｔａｎｄａｒｄｇｅｎｅｔｉｃｃｏｄｅｓ）を用いて決定される。
【００２５】
一致パーセントの変異は、例えばアミノ酸置換、挿入または欠失に起因し得る。アミノ酸置換は１対１のアミノ酸の置き換えとして定義される。置換されたアミノ酸が類似の構造的および／または化学的性質を有する場合、置換は事実上保存的である。保存的置換の例は、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グルタメートによるアスパルテートの置換、またはセリンによるスレオニンの置換である。
【００２６】
アミノ酸挿入または欠失はアミノ酸配列への、またはその内部での変化である。これらは典型的には約１〜５アミノ酸の範囲で起こる。１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を破壊することなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失できるかを決定する際の指針は、当分野で周知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いて見出すことができる。あるアミノ酸変化が生物学的に活性な１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに影響するか否かは、例えば以下の具体的実施例に記載のように、コルチゾンからコルチゾールへの変換を検定することにより容易に決定できる。
【００２７】
融合タンパク質
融合タンパク質は、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体の作製に、そして様々な検定系での使用に有用である。例えば、融合タンパク質は、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの一部と相互作用するタンパク質の同定に使用できる。タンパク質親和クロマトグラフィーまたはタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーに基づく検定、例えば酵母２−ハイブリッドまたはファージディスプレイ系をこの目的のために使用できる。このような方法は当分野で周知であり、薬物スクリーニングとしても使用できる。
【００２８】
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合により互いに融合した二つのポリペプチドセグメントを含んでいる。第一のポリペプチドセグメントは、配列番号２または上記のような生物学的に活性な変異体の少なくとも１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１２５、２００または２５０個の連続アミノ酸を含む。第一のポリペプチドセグメントはまた、完全長１１β−ＨＳＤ１様酵素タンパク質を含み得る。
【００２９】
第二のポリペプチドセグメントは完全長タンパク質またはタンパク質断片であってよい。融合タンパク質の構築に一般的に使用するタンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を包含する）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。さらに、融合タンパク質の構築には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）標識、ＦＬＡＧ標識、インフルエンザへマグルチニン（ＨＡ）標識、Ｍｙｃ標識、ＶＳＶ−Ｇ標識、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）標識を包含するエピトープ標識を使用する。その他の融合構築は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、ＬｅｘａＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を包含する。また、融合タンパク質はさらに、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドコード配列と非相同タンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むよう組み立てることができ、その結果、この１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドは、開裂され、非相同部分を無くすように精製できる。
【００３０】
融合タンパク質は当分野で周知のように化学合成できる。好ましくは、融合タンパク質は二つのポリペプチドセグメントを共有結合で連結することにより、または分子生物学分野で標準的な方法により調製する。例えば、当分野で知られているように、第二のポリペプチドセグメントをコードしているヌクレオチドを有する適切なリーディングフレームに配列番号１、４、５、または６より選ばれるコード配列を含むＤＮＡ構築物を作製し、このＤＮＡ構築物を宿主細胞で発現させることによる組換えＤＮＡ法を用いて、融合タンパク質を調製できる。融合タンパク質構築用の多くのキットが、ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ）、ＭＢＬｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ；１−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）といった企業から入手できる。
【００３１】
種相同体の同定
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドのポリヌクレオチド（下記）を使用して他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために好適なプローブまたはプライマーを作製し、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの相同体をコードしているｃＤＮＡを同定し、そして当分野で周知のようにこのｃＤＮＡを発現させて、ヒト１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの種相同体を得ることができる。
【００３２】
ポリヌクレオチド
ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素アクセッションＮｏ．のコード配列は、ジーンバンクアクセッションＮｏ．ＡＷ１６３６８４（配列番号１）、ＡＷ１６２７８２（配列番号４）、ＡＩ５５４７２５（配列番号５）およびＡＩ４３６３３０（配列番号６）によって同定されるヒトクローンに見出される。
【００３３】
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドは、一本鎖または二本鎖であってよく、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドのコード配列またはそのコード配列の相補物を包含する。ヒト１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている縮重ヌクレオチド配列、および、配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、好ましくは約７５、９０、９６または９８％一致するホモローガスなヌクレオチド配列もまた、１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドである。二つのポリヌクレオチド配列間の配列一致パーセントは、ＡＬＩＧＮのようなコンピュータープログラムを用いて決定するが、これは、ギャップオープンペナルティー−１２およびギャップエクステンションペナルティー−２によるアフィンギャップ検索を用いるＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用するものである。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体および生物学的に活性な１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドの変異体もやはり１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドである。
【００３４】
ポリヌクレオチド変異体および相同体の同定
上記の１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチド変異体および相同体もまた１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドである。典型的には、相同１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチド配列は、当分野で周知のように、ストリンジェントな条件下で候補ポリヌクレオチドを既知の１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせることにより同定できる。例えば、以下の洗浄条件 −− ２ＸＳＳＣ（０．３ＭＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温２回、各々３０分間；次いで２× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ １回、３０分間；次いで２× ＳＳＣ、室温２回、各々１０分間 −− を使用して、最大約２５−３０％の塩基対ミスマッチ（不対合）を含む相同配列を同定できる。より好ましくは、相同核酸鎖は１５−２５％の塩基対ミスマッチを、さらに好ましくは５−１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００３５】
本明細書に開示する１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドの種相同体はさらに、適当なプローブまたはプライマーを作製し、他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドのヒト変異体は、例えばヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。二本鎖ＤＮＡのＴ_ｍは相同性が１％低下する毎に１−１．５℃低下することがよく知られている（Ｂｏｎｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１，１２３（１９７３））。故にヒト１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドの変異体または他の種の１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドは、推定の相同１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドを、配列番号１、４、５または６に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズさせて被験ハイブリッドを作製することによって同定できる。被験ハイブリッドの融解温度を完全に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比較し、被験ハイブリッドの中の塩基対ミスマッチの数またはパーセントを算出する。
【００３６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従い１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は当分野で周知且つ理解されており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，２ｄｅｄ．，１９８９，９．５０−９．５１頁に開示されている。
【００３７】
典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためには、温度と塩濃度の組み合わせを、検討中のハイブリッドの理論的Ｔ_ｍよりおよそ１２−２０℃低くなるよう選択すべきである。配列番号１、４、５、または６に示すヌクレオチド配列を有する１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドまたはその相同体と、それらのヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも約５０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％一致するポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴ_ｍは、例えばＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４８，１３９０（１９６２）の式：
Ｔ_ｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ）、
［式中、ｌ＝塩基対で表したハイブリッドの長さ］
を用いて算出できる。
ストリンジェントな洗浄条件としては例えば、４× ＳＳＣ（６５℃）、または５０％ホルムアミド、４× ＳＳＣ（４２℃）、または０．５× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（６５℃）が挙げられる。高度ストリンジェントな洗浄条件は、例えば０．２× ＳＳＣ（６５℃）などである。
【００３８】
ポリヌクレオチドの調製
１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドは、膜構成成分、タンパク質および脂質といった他の細胞成分を含まないよう単離できる。ポリヌクレオチドは細胞から調製でき、標準的核酸精製技術を用いて単離、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を用いて合成、もしくは自動合成機を用いることによって調製できる。ポリヌクレオチドを単離する方法は機械的であり、当分野で知られている。ポリヌクレオチドを取得するためこのような任意の技術を用いて、単離された１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドを得ることができる。例えば、制限酵素およびプローブを用いて１１β−ＨＳＤ１様酵素ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離できる。単離したポリヌクレオチドは他の分子を含まないか、あるいは少なくとも７０、８０、または９０％含まない調製物である。
【００３９】
１１β−ＨＳＤ１様酵素ｃＤＮＡ分子は、１１β−ＨＳＤ１様酵素ｍＲＮＡを鋳型に用いて標準的分子生物学技術にて調製できる。その後１１β−ＨＳＤ１様酵素ｃＤＮＡ分子は、当分野で周知でありＳａｍｂｒｏｏｋら．（１９８９）のようなマニュアルに開示される分子生物学技術を用いて複製できる。ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを鋳型として使用して本発明に係るポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るため、ＰＣＲのような増幅技術を用いることができる。
【００４０】
別法として、合成化学技術を用いて１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドを合成することもできる。遺伝コードの縮重により、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドまたはその生物学的に活性な変異体をコードする別のヌクレオチド配列の合成を可能にする。
【００４１】
ポリヌクレオチド伸長
本明細書に開示する部分配列を用いて、それを導いた対応する完全長の遺伝子を同定することができる。当業者には周知の標識化法を使用して、この部分配列を、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて^３２Ｐでニックトランスレーションまたは末端標識化することができる（ＢＡＳＩＣＭＥＴＨＯＤＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，Ｄａｖｉｓら、ｅｄｓ．，ＥｌｓｅｖｉｅｒＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）。ヒト組織から調製したλライブラリーを、標識化目的配列を用いて直接スクリーニングすることができ、あるいは細菌コロニースクリーニングを容易にするため、そのライブラリーを一括してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．９２０３７）に変換することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９，ｐｇ．１．２０）を参照のこと）。
【００４２】
両方の方法は当分野で周知である。簡単には、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのライブラリーを含む細菌コロニーを適したフィルターまたはλプラークを含む細菌ラウン（ｌａｗｎ）を変性させ、そのＤＮＡをフィルターに固定する。そのフィルターを、Ｄａｖｉｓら、１９８６により表されたハイブリダイゼーション条件を用いて、標識化プローブでハイブリダイズさせる。λまたはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローニングした部分配列を陽性対照（ポジティブコントロール）として用いることで、バックグラウンド結合を評価し、正確なクローン同定に必要なハイブリダイゼーションと洗浄のストリンジェンシー（厳格性）を調整することができる。得られたオートラジオグラムを、コロニーまたはプラークの複製プレートと比較する；各々の曝露スポットが、陽性コロニーまたはプラークに相当する。そのコロニーまたはプラークを選び出して増殖させ、さらに分析およびシークエンシングを行なうために、コロニーからＤＮＡを単離する。
【００４３】
一方が部分配列由来のプライマー、もう一方がベクター由来のプライマーを用いたＰＣＲを使用して、陽性ｃＤＮＡクローンを分析し、それが含むさらなる配列含量を決定する。当初の部分配列よりも大きいベクター−挿入ＰＣＲ産物を有するクローンを、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングして分析し、それらがノーザンブロット分析から決定されたｍＲＮＡサイズと同じサイズか、または類似の挿入物を含むか否かを決定する。
【００４４】
一度、１つまたはそれ以上のオーバーラップｃＤＮＡクローンを同定すれば、そのクローンの完全配列を決定することができる。複、オーバーラップクローン（通常、それぞれのヌクレオチド部位にて３〜５のオーバーラップ配列）の配列分析から、ｃＤＮＡ配列を決定する結果、非常に正確な最終配列を得る。
【００４５】
ＰＣＲに基づく様々な方法を用いて、本明細書中に開示した核酸配列を伸長させ、プロモーターおよび調節要素といった上流配列を検出することができる。例えば制限部位ＰＣＲは、既知の座に隣接する未知配列を検索するため、ユニバーサルプライマーを使用する（Ｓａｒｋａｒ，ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌｉｃ．２，３１８−３２２，１９９３）。まず、ゲノムＤＮＡを、リンカー配列に対するプライマーと既知領域に特異的なプライマーの存在下で増幅する。次に、増幅させた配列を、同じリンカープライマーと最初のものの内部にある別の特異的プライマーを用いて、第二回目のＰＣＲを行なう。各回のＰＣＲ産物を適当なＲＮＡポリメラーゼで転写し、かつ逆転写酵素を行いて配列決定する。
【００４６】
既知領域に基づく異なる（ディバージェント）プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために、逆ＰＣＲを使用することもできる（Ｔｒｉｇｌｉａら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６，８１８６，１９８８）。ＯＬＩＧＯ４．０６ＰｒｉｍｅｒＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，Ｍｉｎｎ）のような市販ソフトウェアを用いて、長さ２２−３０ヌクレオチド長、５０％またはそれ以上のＧＣ含有量を持ち、約６８−７２℃の温度で標的配列とアニーリングするプライマーを設計できる。この方法は、幾つかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域に適当な断片を作り出せる。次いでこの断片を分子内ライゲーションにより環化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。
【００４７】
使用できるもう一つの方法は、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む、捕捉ＰＣＲである（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら、ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌｉｃ．１，１１１−１１９，１９９１）。この方法では、作製した二本鎖配列を、ＰＣＲの実施前に当該ＤＮＡ分子の未知断片中に入れるため、さらに複数の制限酵素消化とライゲーションを行うことができる。
【００４８】
未知配列を回収するために使用できるもう一つの方法はＰａｒｋｅｒら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９，３０５５−３０６０，１９９１の方法である。さらに、ＰＣＲ、ネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）を用いてゲノムＤＮＡ歩行を行なうことができる（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要性を排除し、イントロン／エクソン接合点の発見に有用である。
【００４９】
スクリーニングで完全長ｃＤＮＡを求める場合、より大きなｃＤＮＡを含むようサイズ選択したライブラリーを使用するのが望ましい。遺伝子の５’領域を含む配列をより多く含んでいるという点で、無作為プライミングしたライブラリーが好ましい。無作為プライミングしたライブラリーの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況で特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは、配列を５’非転写調節領域へと伸長させるのに有用な場合がある。
【００５０】
市販品が入手可能な毛細管電気泳動系を用いて、ＰＣＲまたは配列決定産物のサイズを分析、またはヌクレオチド配列を確認することができる。例えば、毛細管配列決定は、電気泳動分離用の流動性ポリマー、レーザー励起する４種の異なる蛍光色素（各ヌクレオチドにつき１種ずつ）、および電荷結合素子カメラによる放射された波長の検出を利用することができる。出力／光強度は適当なソフトウェア（例えばＧＥＮＯＴＹＰＥＲおよびＳｅｑｕｅｎｃｅＮＡＶＩＧＡＴＯＲ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて電気信号に変換でき、試料のロードからコンピューター分析および電子的データ表示に至る全プロセスをコンピューター管理することができる。毛細管電気泳動は、特定の試料中に限られた量で存在するかも知れないＤＮＡの小片を配列決定するのに特に好ましい。
【００５１】
ポリペプチドの取得
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドは、例えばヒト細胞からの精製によって、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの発現によって、または直接的化学合成によって取得できる。
【００５２】
タンパク質精製
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを、その酵素を発現する任意の細胞（１１β−ＨＳＤ１様酵素発現構築物でトランスフェクトした宿主細胞を含む）から精製することができる。ジーンバンクアクセッションＮｏ．ＡＷ１６３６３４、ＡＷ１６２７８２、ＡＩ５５４７２５およびＡＩ４３６３３０を有するヒト配列の発現部位に拠れば、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドは胎児脳、成人脳の前頭葉、および未分化乏突起膠腫で発現すると予想される。精製１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドは、当分野で周知の方法を用いて、細胞内で１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドと通常、会合している他の化合物、例えば特定のタンパク質、炭水化物または脂質から分離される。そのような方法には、サイズ排除クロマトフラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび調製用ゲル電気泳動が挙げられるが、これらに制限されない。精製１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの調製は、少なくとも８０％純粋；９０％、９５％または９９％純粋な調製であることが好ましい。調製物の純度は当分野で周知の任意の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価できる。
【００５３】
ポリヌクレオチドの発現
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを発現させるため、挿入されたコード配列の転写と発現に必要な要素を含む発現ベクター中にそのポリヌクレオチドを挿入することができる。当業者に周知の方法を利用して、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列および適当な転写および翻訳調節要素を含む発現ベクターを構築できる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えがある。このような技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ．，１９８９に記載されている。
【００５４】
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列を含み、そして発現する様々な発現ベクター／宿主系が利用できる。これらには、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）により感染を受けた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、もしくは細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が包含されるがこれらに限定される訳ではない。
【００５５】
調節要素または調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写と翻訳を実行するベクターの非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域−である。かかる要素はその強さと特異性において異なっている。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導的プロモーターを包含する、多数の好適な転写および翻訳要素を使用できる。例えば、細菌系でクローニングを行う場合、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のハイブリッドｌａｃＺプロモーターのような誘導的プロモーターを使用できる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞に使用できる。植物細胞のゲノムから誘導したプロモーターまたはエンハンサー（例えば熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および貯蔵タンパク質遺伝子）、または植物ウイルスから誘導したプロモーターまたはエンハンサー（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）を該ベクター中にクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来の、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を複数コピー含む細胞系を作製する必要がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に使用することができる。
【００５６】
細菌および酵母発現系
細菌系では、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに対して意図する用途に応じて幾つかの発現ベクターを選択できる。例えば、抗体の誘導のため、大量の１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドが必要である場合は、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターが使用できる。このようなベクターは、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクターを包含するが、これに限定される訳ではない。ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクターにおいては、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列を、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔとこれに続く７残基の配列と共にフレーム内で該ベクター中にライゲーションすることができ、その結果ハイブリッドタンパク質が産生される。ｐＩＮベクター（ＶａｎＨｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，５５０３−５５０９，１９８９）またはｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を伴う融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、その後遊離グルタチオンの存在下で溶離することにより、溶菌させた細胞から容易に精製できる。このような系で調製したタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むよう設計でき、その結果、目的とするクローンポリペプチドをＧＳＴ部分から随意に解放することができる。
【００５７】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨのような構成的または誘導的プロモーターを含む幾つかのベクターが使用できる。総説としてＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８９）およびＧｒａｎｔら、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５３，５１６−５４４，１９８７を参照されたい。
【００５８】
植物および昆虫発現系
植物発現ベクターを使用する場合、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列の発現は、幾つかのプロモーターのうち任意のものにより駆動できる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーターを、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用できる（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，ＥＭＢＯＪ．６，３０７−３１１，１９８７）。別法として、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することもできる（Ｃｏｒｕｚｚｉら、ＥＭＢＯＪ．３，１６７１−１６８０，１９８４；Ｂｒｏｇｌｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４，８３８−８４３，１９８４；Ｗｉｎｔｅｒら、ＲｅｓｕｌｔｓＰｒｏｂｌ．ＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒ．１７，８５−１０５，１９９１）。これらの構築物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞中に導入できる。このような技術は、幾つかの一般に入手可能な総説に記載されている（例えば、ＨｏｂｂｓまたはＭｕｒｒａｙ、ＭＣＧＲＡＷＨＩＬＬＹＥＡＲＢＯＯＫＯＦＳＣＩＥＮＣＥＡＮＤＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ１９１−１９６，１９９２）。
【００５９】
昆虫系もまた１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの発現に使用できる。例えば、かかる系の１つＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫で外来遺伝子を発現させるベクターとして使用する。１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列を、ポリヘドリン遺伝子のような該ウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置くことができる。１１β−ＨＳＤ１様酵素コード配列をうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性化し、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生成する。次いでこの組換えウイルスをＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫への感染に使用し、そこで１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを発現させることができる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１，３２２４−３２２７，１９９４）。
【００６０】
哺乳動物発現系
ウイルスに基づく多くの発現系を用いて哺乳動物宿主細胞で１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを発現させることができる。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列は、後期プロモーターおよび３部に分かれたリーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションできる。該ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を用いて、感染宿主細胞において１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを発現できる生存ウイルスを取得できる（Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，３６５５−３６５９，１９８４）。所望によりラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
【００６１】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドが内包し発現するＤＮＡ断片よりも大きなＤＮＡ断片の運搬に使用できる。６Ｍから１０ＭのＨＡＣを組み立て、常套的送達法により細胞に到達させる（例えば、リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または小胞）。
【００６２】
さらに、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列のより効率的な翻訳を達成するために、特異的開始シグナルを使用できる。かかるシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび連続配列を包含する。１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクター中に挿入した場合、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要ないであろう。しかしながら、コード配列またはその断片のみを挿入した場合は、外因性の翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを包含する）を供給すべきである。開始コドンは挿入物全体を確実に翻訳させるために、正しいリーディングフレームになければならない。外因性翻訳要素および開始コドンは天然および合成両者の様々な起源であってよい。発現の効率は、使用する特定の細胞系に対し適切なエンハンサーを存在させることにより増強できる（Ｓｃｈａｒｆら、ＲｅｓｕｌｔｓＰｒｏｂｌ．ＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒ．２０，１２５−１６２，１９９４）。
【００６３】
宿主細胞
宿主細胞菌株は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現された１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを所望の方法で処理できる能力を目的として選択できる。該ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシ化、グリコシル化、燐酸化、脂質化、およびアシル化が包含されるがこれらに限定されない。該ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳み、および／または機能を促進するために使用できる。翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的メカニズムを持つ異なる宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）が、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９）から入手でき、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実とするために選択できる。
【００６４】
組換えタンパク質の長期高収量産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを安定に発現する細胞系を、ウイルス複製起点および／または内因性発現要素、および同じまたは別のベクター上にある選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。該ベクターの導入に続いて、細胞を強化培地で１−２日間生育させた後、培地を選択培地に交換することができる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在が、導入された１１β−ＨＳＤ１様酵素配列をうまく発現する細胞の生育と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型にとって適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。例えば、ＡＮＩＭＡＬＣＥＬＬＣＵＬＴＵＲＥ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６を参照されたい。
【００６５】
幾つかの選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収できる。これらには、それぞれｔｋ⁻またはａｐｒｔ⁻細胞で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ１１，２２３−３２，１９７７）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ２２，８１７−２３，１９８０）遺伝子が包含されるが、これらに限定される訳ではない。さらに、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基準に用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメソトレキサートに対する耐性を付与し（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７，３５６７−７０，１９８０）ｎｐｔはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０，１０１４，１９８１）、そしてａｌｓおよびｐａｔはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Ｍｕｒｒａｙ，１９９２，上記）。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するようにさせ、ｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するようにさせる（Ｈａｒｔｍａｎ＆Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５，８０４７−５１，１９８８）。アントシアニンのような可視マーカー、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンは、形質転換体を同定し、特異的ベクター系に帰すことのできる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するために使用できる（Ｒｈｏｄｅｓら、ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５，１２１−１３１，１９９５）。
【００６６】
発現の検出
マーカー遺伝子発現の存在は１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドが存在することも示唆しているが、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの存在と発現は確認する必要がある。例えば、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列がマーカー遺伝子配列内部に挿入されている場合、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定できる。これとは別に、単一のプロモーターの調節下に１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列と、マーカー遺伝子が直列（タンデム）に位置する場合がある。誘導または選択に応答してこのマーカー遺伝子は発現し、通常、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの発現を示す。
【００６７】
これとは別に、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを含み、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られる様々な方法によって同定できる。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質生検またはイムノアッセイ技術（核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップに基づく技術を包含する）が包含されるがこれらに限定されない。例えば、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の存在は、プローブまたは断片または１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出できる。核酸増幅に基づく検定は、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを含む形質転換体を検出するための、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列から選択されるオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００６８】
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに対し特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを使用して該ポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコルが当分野で知られている。例として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）がある。１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド上の２個の非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる、２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイが使用でき、または、競合的結合検定を使用することができる。これらのおよびその他の検定はＨａｍｐｔｏｍら、ＳＥＲＯＬＯＧＩＣＡＬＭＥＴＨＯＤＳ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，ＡＰＳＰｒｅｓｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．，１９９０およびＭａｄｄｏｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８，１２１１−１２１６，１９８３に記載されている。
【００６９】
多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られており、様々な核酸およびアミノ酸検定に使用できる。１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを調製する手段は、標識したヌクレオチドを使用する、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化、またはＰＣＲ増幅を包含する。これとは別に、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列を、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中にクローニングすることもできる。このようなベクターは当分野で既知であり、市販品が入手でき、標識化ヌクレオチドおよび適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６を添加することによりインビトロでのＲＮＡプローブの合成に使用することができる。これらの方法は、市販の様々なキットを用いて実施できる（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ、およびＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）。検出を容易にするために使用できる適当なリポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、および蛍光、化学ルミネセント、または色素生成物質、ならびに基質、補助因子、インヒビター、磁性粒子などが包含される。
【００７０】
ポリペプチドの発現および精製
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列で形質転換させた宿主細胞は、発現と、細胞培養からのタンパク質の回収に適した条件下で培養できる。形質転換細胞により生産されたポリペプチドは、その配列および／または使用したベクターに応じて分泌されまたは細胞内に貯留され得る。当業者には理解できるであろうが、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通った可溶性１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの分泌を指令する、または膜結合１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの、膜挿入を指令する、シグナル配列を含むよう設計できる。
【００７１】
上に論じたように、他の組み立て物を用いて、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードしているヌクレオチド配列と結合させることができる。このような精製促進ドメインは、金属キレート化ペプチド、例えば固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和精製系で利用するドメインが包含されるが、これらに限定されない（ＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）。精製ドメインと１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドとの間に開裂可能リンカー配列、例えば第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼに特異的なリンカー配列を入れること（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）もまた、精製を促進するために利用できる。このような発現ベクターの１つは、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドと、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位に先立つ６個のヒスチジン残基とを含む融合タンパク質の発現を提供する。このヒスチジン残基はＩＭＡＣ（Ｐｏｒａｔｈら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３，２６３−２８１，１９９２に記載の固定化金属イオン親和クロマトグラフィー）による精製を促進し、一方エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からの１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの精製手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターはＫｒｏｌｌら、ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２，４４１−４５３，１９９３に開示されている。
【００７２】
化学合成
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしている配列は、その全体または一部を、当分野で周知の化学的方法を用いて合成できる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５−２２３，１９８０；Ｈｏｒｎら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５−２３２，１９８０）。これとは別に、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド自身を、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法、例えば固相技術を用いる直接ペプチド合成を用いて調製できる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９−２１５４，１９６３；Ｒｏｂｅｒｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９，２０２−２０４，１９９５）。タンパク質合成は手動技術またはオートメーションを用いて実施できる。自動化合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１Ａペプチド合成機（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて達成できる。所望により、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの断片を別々に合成し、化学的方法を用いて合して完全長の分子を調製することもできる。
【００７３】
新たに合成したペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフイー（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ，ＷＨＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８３）により実質的に精製できる。合成１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定により確認できる（例えばエドマン分解法；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記を参照されたい）。さらに、直接合成中に１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を改変させ、そして／または化学的方法を用いて他のタンパク質由来の配列と合して、変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質を調製することができる。
【００７４】
改変ポリペプチドの調製
当業者には理解できるであろうが、天然に存在しないコドンを有する１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドコード化ヌクレオチドを調製することは有利であり得る。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、タンパク質発現の速度を増大させ、または所望の性質、例えば天然に存在する配列から産み出される転写物の半減期より長い半減期を持つＲＮＡ転写物を調製することができる。
【００７５】
本明細書に開示するヌクレオチド配列は、当分野で一般的に知られる方法を用いて、該ポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する改変を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）様々な理由で、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドコード配列を改変させるように設計できる。無作為断片化によるＤＮＡシャフリングと遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再集合を用いてヌクレオチド配列を設計できる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変え、コドンの優先性を変え、スプライス変異体を調製し、突然変異を導入する等を実施できる。
【００７６】
抗体
当分野で知られているいかなる型の抗体も、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドのエピトープに特異的に結合するよう作製できる。本明細書で使用する「抗体」とは、無傷の免疫グロブリン分子、およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖを包含し、これらは１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドのエピトープに結合できる。典型的には、エピトープを形成するためには少なくとも６、８、１０、または１２の連続するアミノ酸が必要である。しかしながら、非連続アミノ酸を含むエピトープはより多くの、例えば少なくとも１５、２５、または５０のアミノ酸を必要とするかも知れない。
【００７７】
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体は治療に使用でき、そして免疫化学検定、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学検定、免疫沈降、またはその他の当分野で既知の免疫化学的検定に使用できる。所望の特異性を有する抗体の同定のため、様々なイムノアッセイが使用できる。競合的結合または免疫放射検定のための多数のプロトコルが当分野でよく知られている。このようなイムノアッセイは典型的には、免疫原と、その免疫原に特異結合する抗体との間の複合体形成の測定を含んでいる。
【００７８】
典型的には、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学検定に使用する時、他のタンパク質が提供する検出シグナルより少なくとも５、１０、または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに特異結合する抗体は、免疫化学検定で他のタンパク質を検出せず、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを溶液から免疫沈降させることができる。
【００７９】
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトを免疫してポリクローナル抗体を産生させるのに使用できる。所望により、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドは、担体タンパク質、例えば牛血清アルブミン、チログロブリン、およびスカシガイヘモシアニンとコンジュゲートさせることができる。宿主の種に応じて、免疫学的反応を増大させるために種々のアジュバントを使用できる。このようなアジュバントは、フロイントアジュバント、鉱物性ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノール）を包含するがこれらに限定されない。ヒトに使用するアジュバントの中ではＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍが特に有用である。
【００８０】
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養中の連続的細胞系により抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製できる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術があるがこれらに限定されない（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ２５６，４９５−４９７，１９８５；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ８１，３１−４２，１９８５；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０，２０２６−２０３０，１９８３；Ｃｏｌｅら、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．６２，１０９−１２０，１９８４）。
【００８１】
さらに、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして適当な抗原特異性と生物活性を持つ分子を得る、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術が利用できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，６８５１−６８５５，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３１２，６０４−６０８，１９８４；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ３１４，４５２−４５４，１９８５）。モノクローナルおよびその他の抗体はまた、これを治療に使用した場合に患者が該抗体に対する免疫反応を起こすのを防ぐため、「ヒト化」することができる。このような抗体は、治療に直接使用できるほど配列が充分ヒトに類似しているかも知れず、または幾つかの重要残基の変更を必要とするかも知れない。齧歯類の抗体とヒト配列の間の配列相違は、個々の残基の位置指定突然変異誘発により、または相補性決定領域全体の格子により、ヒト配列内の残基と相違する残基を置き換えることによって最小化することができる。別法として、ヒト化抗体はＧＢ２１８８６３８Ｂに記載のように組換え法を用いて調製できる。１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、Ｕ．Ｓ．５５６５３３２に開示のように、部分的または完全にヒト化した抗原結合部位を含むことができる。
【００８２】
これに代わり、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の調製のために記載した技術を適合させ、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに特異結合する一本鎖抗体を調製することができる。関連する特異性を持つが別個のイディオタイプ組成を有する抗体を、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャフリングによって調製することができる（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，１１１２０−２３，１９９１）。
【００８３】
一本鎖抗体はまた、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲのようなＤＮＡ増幅法を用いて組み立てることができる（Ｔｈｉｒｉｏｎら、１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＰｒｅｖ．５，５０７−１１）。一本鎖抗体は単一または二重特異性であり得、また、二価または四価であり得る。四価二重特異性一本鎖抗体の組み立ては例えばＣｏｌｏｍａ＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，１５９−６３に教示されている。二価二重特異性一本鎖抗体の組み立てはＭａｌｌｅｎｄｅｒ＆Ｖｏｓｓ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１９９−２０６に教示されている。
【００８４】
下記のように、一本鎖抗体をコードしているヌクレオチド配列を手動または自動ヌクレオチド合成を用いて組み立て、標準的組換えＤＮＡ法を用いて発現組み立て物中にクローニングし、そして細胞中に導入してコード配列を発現させることができる。別法として、一本鎖抗体を、例えば糸状ファージ技術を用いて直接調製することもできる（Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６１，４９７−５０１；Ｎｉｃｈｏｌｌａら、１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６５，８１−９１）。
【００８５】
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに特異結合する抗体はまた、リンパ球集団においてインビボ産生を誘導することによって、または、文献に開示されている極めて特異的な結合試薬のパネルまたは免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることによって調製することもできる（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，３８３３−３８３７，１９８９；Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３４９，２９３−２９９，１９９１）。
【００８６】
その他の型の抗体を、本発明方法において組み立て、治療に使用することができる。例えば、ＷＯ９３／０３１５１に開示のように、キメラ抗体を組み立てることができる。免疫グロブリンから誘導され多価且つ多重特異的である結合タンパク質、例えばＷＯ９４／１３８０４に記載の「ｄｉａｂｏｄｉｅｓ」もまた調製できる。
【００８７】
本発明に係る抗体は当分野で周知の方法により精製できる。例えば、抗体は、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドが結合しているカラムを通過させることにより親和精製できる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出することができる。
【００８８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対し相補的なヌクレオチド配列である。いったん細胞中に導入されるとこの相補的ヌクレオチドは、該細胞が産生した天然配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳のいずれかを遮断する。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。より長い配列もまた使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子をＤＮＡ構築物に提供し、上記のように細胞中に導入して、その細胞における１１β−ＨＳＤ１様酵素遺伝子産物のレベルを低下させることができる。
【００８９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこの両者の組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの５’末端を、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロアミデート、燐酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カルボネート、および燐酸トリエステルといった非ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する別のヌクレオチドの３’末端と共有結合させることにより、手動で、または自動合成機によって合成できる。Ｂｒｏｗｎ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０，１−８，１９９４；Ｓｏｎｖｅａｕｘ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６，１−７２，１９９４；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０，５４３−５８３，１９９０を参照されたい。
【００９０】
１１β−ＨＳＤ１様酵素遺伝子の制御、５’、または調節領域と二本鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することにより、１１β−ＨＳＤ１様酵素遺伝子発現の修飾が得られる。転写開始部位、例えば開始部位から−１０および＋１０位の間から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重らせん」塩基対合法を用いて阻害を達成できる。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子またはシャペロンの結合に対して十分に開くという能力の阻害を引き起こすため、有用である。三本鎖ＤＮＡを用いる治療上の進歩が文献に記載されている（例えばＧｅｅら、Ｈｕｂｅｒ＆Ｃａｒｒ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＡＮＤＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ，ＦｕｔｕｒａＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ，Ｎ．Ｙ．，１９９４）。転写物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた設計できる。
【００９１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドと１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドの相補配列との間に好結果の複合体を形成させるためには、正確な相補性は必要ない。例えば１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドに対し正確に相補的である２、３、４、もしくは５またはそれ以上の長さの連続するヌクレオチドを含み、その各々が、隣接する１１β−ＨＳＤ１様酵素ヌクレオチドとは相補的ではない連続するある長さのヌクレオチドによって隔てられているアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１１β−ＨＳＤ１様酵素ｍＲＮＡに対して充分な標的化特異性を提供できる。好ましくは、相補的な連続ヌクレオチドの長さはそれぞれ少なくとも４、５、６、７もしくは８またはそれ以上のヌクレオチド長である。非相補的な介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチド長である。当業者は、アンチセンス−センスの対の算出融点を容易に使用して、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定の１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチド配列間で寛容されるミスマッチの程度を決定できるであろう。
【００９２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力に影響を及ぼすことなく修飾できる。これらの修飾は該アンチセンス分子の内部、または一端もしくは両端である。例えば、ヌクレオシド間の燐酸結合は、アミノ基と末端リボースの間にいろいろな数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン部分を加えることによって修飾できる。修飾された塩基および／または糖、例えばリボースの代わりのアラビノース、または３’ヒドロキシ基または５’燐酸基が置換されている３’，５’−置換オリゴヌクレオチドもまた修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに使用できる。これらの修飾オリゴヌクレオチドは当分野で周知の方法により調製できる。例えば、Ａｇｒａｗａｌら、ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，１５２−１５８，１９９２；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０，５４３−５８４，１９９０；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ．２１５，３５３９−３５４２，１９８７を参照されたい。
【００９３】
リボザイム
リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Ｃｅｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６，１５３２−１５３９；１９８７；Ｃｅｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，５４３−５６８；１９９０，Ｃｅｃｈ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２，６０５−６０９；１９９２，Ｃｏｕｔｕｒｅ＆Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１２，５１０−５１５，１９９６を参照されたい。当分野で知られるように、リボザイムは、ＲＮＡ配列を開裂することにより遺伝子機能を阻害するのに使用できる（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許５６４１６７３）。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のエンドヌクレオ分解的な（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）開裂を含む。例には、特異的ヌクレオチド配列のエンドヌクレオ分解的な開裂を特異的且つ効果的に触媒できる、設計されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子がある。
【００９４】
１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドのコード配列を用いて、１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡに特異結合するリボザイムを作製できる。他のトランスのＲＮＡ分子を極めて配列特異的に開裂できるリボザイムを設計し組み立てる方法が開発され、当分野で記載されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ３３４，５８５−５９１，１９８８）。例えば、リボザイムの開裂活性は、別個の「ハイブリダイゼーション」領域を該リボザイム中に組み入れることによって、特定のＲＮＡを標的とさせることができる。このハイブリダイゼーション領域は標的ＲＮＡに対し相補的な配列を含んでおり、したがってその標的と特異的にハイブリダイズする（例えばＧｅｒｌａｃｈら、ＥＰ３２１２０１を参照されたい）。
【００９５】
１１β−ＨＳＤ１様酵素ＲＮＡ標的内部の特異的リボザイム開裂部位は、この標的分子を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを包含するリボザイム開裂部位についてスキャンすることにより同定できる。同定できたならば、該開裂部位を含む標的ＲＮＡの領域に対応する、１５および２０の間のリボヌクレオチドを有する短いＲＮＡ配列を、標的を非機能的にし得る二次構造の特徴について評価できる。さらに、候補の１１β−ＨＳＤ１様酵素ＲＮＡ標的の適合性を、リボヌクレアーゼ防護検定を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する利用可能性を試験することによって評価できる。より長い相補配列を用いて、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大させることができる。リボザイムのハイブリダイズおよび開裂する領域は、相補領域を介して標的ＲＮＡにハイブリダイズする時、リボザイムの触媒領域が標的を開裂し得るといったように、完全に相関している。
【００９６】
リボザイムはＤＮＡ組み立て物の一部として細胞内に導入できる。マイクロ注入、リポソーム媒介トランスフェクション、電気穿孔、または燐酸カルシウム沈殿といった機械的方法を用いて、１１β−ＨＳＤ１様酵素発現の低下が望まれる細胞中にリボザイム含有ＤＮＡ組み立て物を導入することができる。これとは別に、細胞がＤＮＡ組み立て物を安定的に保持することが望まれる場合は、該組み立て物をプラスミド上で供給し、当分野で知られるように、別個の要素として維持するか、または細胞のゲノム中に組み込むことができる。リボザイムコード化ＤＮＡ組み立て物は、細胞中のリボザイムの転写を調節するために、プロモーター要素、エンハンサーまたはＵＡＳ要素、および転写ターミネーターシグナルといった転写調節要素を含み得る。
【００９７】
Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許５６４１６７３に教示のように、リボザイムは、標的遺伝子の発現を誘導する因子に応答してリボザイムの発現が起こるように設計することができる。リボザイムはまた、追加レベルの調節を提供するよう設計でき、その結果、ｍＲＮＡの破壊はリボザイムと標的遺伝子の両者が細胞に誘導された時にのみ起こる。
【００９８】
区別的に発現される遺伝子
遺伝子産物がヒト１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１様酵素と相互作用する遺伝子の同定方法をここに記載する。このような遺伝子は、ＣＮＳ障害、骨粗鬆症、肝疾患、肥満症、血圧異常または胎児発育異常、および糖尿病を包含する（但しこれらに限定されない）疾患において区別して（区別的に）発現される遺伝子を表し得る。さらに、係る遺伝子は、このような疾患の進行または治療に関連する操作に応答して区別的に調節される遺伝子を表し得る。加えて、このような遺伝子は、組織または生物の発生の異なる段階で増大または低下する、一時的に調節される発現を示すことができる。区別的に発現される遺伝子はまた、その発現を、対照対実験条件の下で調節させることができる。さらに、ヒト１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１様遺伝子または遺伝子産物は、これ自体区別的発現について試験できる。
【００９９】
発現が正常対疾病状態で相違する程度は、標準的特性決定技術、例えば区別的ディスプレイ技術によって視覚化されるに充分大きいというだけでよい。発現の相違を視覚化することのできる、その他のこのような標準的特性決定技術は、定量的ＲＴ（逆転写酵素）、ＰＣＲ、およびノーザン分析を包含するが、これらに限定されない。
【０１００】
区別的に発現される遺伝子の同定
区別的に発現される遺伝子を同定するためには、目的とする組織から全ＲＮＡ、または好ましくはｍＲＮＡを単離する。例えば、ＲＮＡ試料は、実験対象の組織から、そして対照となる対象の対応組織から取得する。ｍＲＮＡの単離に対して不利に選択しない任意のＲＮＡ単離技術を、係るＲＮＡ試料の精製に利用できる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄ．，ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７−１９９３を参照されたい。当業者に周知の技術、例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、米国特許４８４３１５５の一段階ＲＮＡ単離プロセスを用いて多数の組織試料を容易に処理することができる。
【０１０１】
区別的に発現される遺伝子が産生したＲＮＡを表す、集められたＲＮＡ試料内部の転写物は、当業者に周知の方法により同定する。これらには、例えば、ディファレンシャルスクリーニング（Ｔｅｄｄｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５，２０８−１２，１９８８）、差引きハイブリダイゼーション（Ｈｅｄｒｉｃｋｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３０８，１４９−５３；Ｌｅｅｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，２８２５，１９８４）、および好ましくはディファレンシャルディスプレイ（Ｌｉａｎｇ＆Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，９６７−７１，１９９２；米国特許５２６２３１１）が包含される。
【０１０２】
区別的発現の情報はこれ自体、ヒト１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１様酵素の関与する疾病の治療のための関連法を示唆している。例えば、治療は、区別的に発現される遺伝子および／またはヒト１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１様酵素をコードしている遺伝子の発現の調節を包含し得る。区別的発現の情報は、区別的に発現される遺伝子もしくは遺伝子産物またはヒト１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１様遺伝子もしくは遺伝子産物の活性または発現が、アップレギュレーションであるかダウンレギュレーションであるかを示すことができる。
【０１０３】
スクリーニング方法
本発明は、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドまたは１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドに結合する、またはその活性を調節する、被験化合物をスクリーニングするための検定を提供する。好ましくは、被験化合物は１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する。より好ましくは、被験化合物は、１１β−ＨＳＤ１活性を、被験化合物の不在時に比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下または増大させる。
【０１０４】
被験化合物
被験化合物は当分野で既知の薬理学的物質であってよく、または薬理活性を持っていることが前もって分かっていない化合物であってよい。この化合物は天然に存在する、または実験室で設計されたものであってよい。これらは、微生物、動物、または植物から単離されたものであってよく、そして組換え的に調製され、または当分野で既知の化学的方法により合成されたものであってよい。所望により被験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス特定可能な並行固相または液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、および親和クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）当分野で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて取得できる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが、他の４種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。Ｌａｍ，ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓ．１２，１４５，１９９７を参照されたい。
【０１０５】
分子ライブラリーの合成法は当分野でよく知られている（例えば、ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，６９０９，１９９３；Ｅｒｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，１１４２２，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６７８，１９９４；Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１，１３０３，１９９３；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０５９，１９９４；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０６１；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３，１９９４を参照されたい）。化合物のライブラリーは溶液で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３，４１２−４２１，１９９２）、またはビーズ（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ３５４，８２−８４，１９９１）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ３６４，５５５−５５６，１９９３）、細菌または胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許５２２３４０９）プラスミド（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，１８６５−１８６９，１９９２）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ＆Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９，３８６−３９０，１９９０；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９，４０４−４０６，１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７，６３７８−６３８２，１９９０；Ｆｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，３０１−３１０，１９９１；およびＬａｄｎｅｒ、米国特許５２２３４０９）上に提供できる。
【０１０６】
ハイスループットスクリーニング
被験化合物は、高（ハイ）スループットスクリーニングを用いて、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する能力、または１１β−ＨＳＤ１様酵素活性もしくは１１β−ＨＳＤ１様酵素遺伝子発現に影響を及ぼす能力についてスクリーニングできる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多くの個別的化合物を並行して試験でき、その結果多数の被験化合物を迅速にスクリーニングできる。最も広範に確立されている技術は９６ウェル微量定量プレートを利用するものである。この微量定量プレートのウェルは、典型的には５０から５００μｌの範囲の検定容量を必要とする。このプレートに加えて、９６ウェルフォーマットに適合させた多くの機器、材料、ピペット、ロボット、プレート洗浄機、およびプレート読み取り機が市販されている。
【０１０７】
別法として、「自由フォーマット検定」、または試料間に物理的障壁を持たない検定が使用できる。例えば、組み合わせペプチドライブラリーのための、単純な均質検定で色素細胞（メラノサイト）を用いる検定が、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９，１６１４−１８（１９９４）に記載されている。ペトリ皿中のアガロースの下にこの細胞を入れ、次いで組み合わせ化合物を伴っているビーズをアガロースの表面に載せる。組み合わせ化合物はこのビーズから化合物を部分的に放出する。化合物がゲルマトリックス中へと局所的に拡散するにつれて活性化合物が細胞の色の変化を惹起するため、活性化合物を暗色色素領域として視覚化することができる。
【０１０８】
自由フォーマット検定のもう一つの例は、生体分子スクリーニング学会第１回年次総会（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．、１９９５年１１月７−１０日）で報告されたＣｈｅｌｓｋｙ、「組み合わせライブラリーのスクリーニングのための戦略：新規な、そして伝統的なアプローチ」により記載されている。Ｃｈｅｌｓｋｙは、カルボニックアンヒドラーゼのための単純な均質酵素検定をアガロースゲルの内部に入れ、その結果ゲル中の酵素がゲル全体に色の変化を惹起するようにさせた。その後、光リンカーを介して組み合わせ化合物を持つビーズをゲル内部に入れ、すると該化合物はＵＶ光により部分的に放出された。酵素を阻害する化合物は、色の変化がより少ない局所阻害領域として観察された。
【０１０９】
さらに別の例がＳａｌｍｏｎら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉｖｅｒｓｉｔｙ２，５７−６３（１９９６）に記載されている。この例では、組み合わせライブラリーを、寒天中で生育する癌細胞への細胞毒性効果を有する化合物についてスクリーニングした。
【０１１０】
もう一つのハイスループットスクリーニング法がＢｅｕｔｅｌら、米国特許５９７６８１３に記載されている。この方法では、被験試料を多孔性マトリックスに入れる。次に１またはそれ以上の検定成分を、マトリックス、例えばゲル、プラスチックシート、フィルター、またはその他の形の容易に操作できる固体担体の内部、上、または底に入れる。試料がこの多孔性マトリックスに導入されるとこれらは充分ゆっくりと拡散し、その結果、被験試料が混ざらずに検定が遂行できる。
【０１１１】
結合検定
結合検定について、被験化合物は、本酵素のＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位である１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの活性部位に結合してこれを占有する結果、正常な生物活性を妨げるような、小分子であることが好ましい。このような小分子の例は、小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定される訳ではない。
【０１１２】
結合検定では、被験化合物または１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドのいずれかが検出可能な標識、例えば蛍光、放射性同位元素、化学ルミネセント、または酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ）を含むことができる。そこで、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに結合している被験化合物の検出は、例えば放射能の放出を直接計数することにより、またはシンチレーション計数により、または検出可能産物への適当な基質の変換を測定することにより、達成できる。
【０１１３】
別法として、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドへの被験化合物の結合を、反応体のいずれをも標識せずに測定することができる。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、被験化合物と１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドとの結合を検出できる。マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサー^ＴＭ）とは、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレッサブル電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、被験化合物と１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの相互作用の指標として使用できる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，１９０６−１９１２，１９９２）。
【０１１４】
被験化合物が１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに結合する能力の測定はまた、実時間ＢｉｍｏｌｅｃｕｌａｒＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）のような技術を用いて達成できる（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ＆Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３，２３３８−２３４５，１９９１、およびＳｚａｂｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５，６９９−７０５，１９９５）。ＢＩＡは、いかなる反応体をも標識せずに、生体特異的相互作用を実時間で研究するための技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））。光学的現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を、生体分子間の実時間反応の指標に使用できる。
【０１１５】
本発明のさらに別の態様では、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを二ハイブリッド検定または三ハイブリッド検定（例えば、米国特許５２８３３１７；Ｚｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ７２，２２３−２３２，１９９３；Ｍａｄｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１２０４６−１２０５４，１９９３；Ｂａｒｔｅｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１４，９２０−９２４，１９９３；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８，１６９３−１６９６，１９９３；およびＢｒｅｎｔＷＯ９４／１０３００）における「おとりタンパク質」として使用し、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに結合またはこれと相互作用してその活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。
【０１１６】
二ハイブリッド系は殆どの転写因子のモジュール的性格に基づくものであり、それは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成っている。簡潔に述べると、この検定は二種の異なるＤＮＡ組み立て物を利用する。例えば、一方の組み立て物においては、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、既知の転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる（例えばＧＡＬ−４）。別の組み立て物においては、未同定タンパク質（「餌」または「試料」）をコードしているＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる。もし「おとり」および「餌」タンパク質がインビボで相互作用してタンパク質依存複合体を形成できたならば、該転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは極めて近位に招来される。この近位性が、転写因子に応答する転写調節部位と機能的に結合しているリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現が検出でき、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードしているＤＮＡ配列取得に使用することができる。
【０１１７】
反応体の一方または両方の非結合型からの結合型の分離を促進するため、そして検定の自動化の便宜を図るため、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固定化することが望ましいかも知れない。したがって、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固体支持体に結合させることができる。好適な固体支持体は、ガラスまたはプラスチックスライド、組織培養プレート、微量定量ウェル、管、シリコンチップ、またはビーズ（ラテックス、ポリスチレン、またはガラスビーズを包含するがこれらに限定されない）のような粒子を包含するがこれらに限定されない。共有および非共有結合、受動吸収、またはそれぞれポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物に付着させた結合部分と固体支持体の対、の使用を包含する、当分野で既知の任意の方法を用いて１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物を固体支持体に付着させることができる。被験化合物は好ましくは整列して固体支持体に結合させ、その結果個々の被験化合物の位置を追跡することができる。１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）への被験化合物の結合は、反応体を入れるのに適した任意の容器で達成できる。かかる容器の例には微量定量プレート、試験管、および微量遠沈管がある。
【０１１８】
一つの態様において、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドは、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを固体支持体に結合させるドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）上またはグルタチオン誘導体化微量定量プレート上に吸着させ、次いでこれを被験化合物または被験化合物および非吸着１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに合し；次にこの混合物を複合体形成が行われる条件下でインキュベートする（例えば、塩およびｐＨに関して生理的条件）。インキュベーションの後、ビーズまたは微量定量プレートのウェルを洗浄して未結合成分を除去する。反応体の結合は上記のように直接的または間接的に測定できる。別法として、複合体を固体支持体から解離させた後に結合を測定することもできる。
【０１１９】
本発明に係るスクリーニング検定には、タンパク質またはポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化するためのその他の技術を使用することもできる。例えば、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化できる。当分野で周知の技術（例えばビオチニル化キット、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を用いて、ビオチニル化した１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化できる。別法として、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または被験化合物に特異的に結合するが、所望の結合部位、例えば１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの活性部位に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができる。未結合の標的またはタンパク質が抗体コンジュゲーションによりウェル中に捕捉できる。
【０１２０】
ＧＳＴ−固定化複合体について上に記載した方法に加え、このような複合体を検出する方法には、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドまたは被験化合物に特異結合する抗体を用いる、複合体の免疫検出、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの活性検出へと引き継がれる酵素結合検定、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動がある。
【０１２１】
１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する被験化合物を求めるスクリーニングは、無傷の細胞で実施することもできる。１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む任意の細胞が、細胞に基づく検定系で使用できる。１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドは細胞中に天然に存在し、または上記のような技術を用いて導入できる。１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合は、上記のように測定する。
【０１２２】
酵素検定
ヒト１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの１１β−ＨＳＤ１活性を増大または低下させる能力について、被験化合物を試験できる。１１β−ＨＳＤ１活性は、例えばＤｉａｚら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：２５７０−２５８０（１９８８）；Ｒａｊａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：６５−７０（１９９６）；およびＬｌｏｙｄ−ＭａｃＧｉｌｐら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，３４：１１２３−１１２８（１９９９）に記載のように測定できる。
【０１２３】
酵素検定は、精製１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド、細胞膜調製物または無傷の細胞と、被験化合物とを接触させた後に実施できる。１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドのトランスケトラーゼ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０または１００％低下させる被験化合物を、１１β−ＨＳＤ１様酵素活性を低下させる可能性のある治療物質として同定する。ヒト１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドのトランスケトラーゼ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０または１００％増大させる被験化合物を、ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素活性を増大させる可能性のある治療物質として同定する。
【０１２４】
遺伝子発現
別の態様では、１１β−ＨＳＤ１様酵素遺伝子の発現を増大または減少させる被験化合物を同定する。１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドを被験化合物と接触させ、ＲＮＡまたは１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドのポリペプチド産物の発現を測定する。被験化合物存在下での適当なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを、該被験化合物不在下でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。すると被験化合物が、この比較に基づく発現のモジュレーターとして同定できる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により大きい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質または増強物質と同定する。そうではなく、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により小さい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のインヒビターと同定する。
【０１２５】
細胞における１１β−ＨＳＤ１様酵素ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための当分野で周知の方法により決定できる。定性または定量的方法のいずれかが使用できる。１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えばラジオイムノアッセイのような免疫化学的方法、ウエスタンブロッティング、および免疫組織化学を包含する、当分野で周知の様々な技術を用いて決定できる。別法として、ポリペプチド合成は、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド内への標識アミノ酸の取り込みを検出することにより、インビボで、細胞培養で、またはインビトロ翻訳系で決定できる。
【０１２６】
このようなスクリーニングは、無細胞検定系または無傷の細胞のいずれかで実施できる。１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドを発現するいかなる細胞も細胞に基づく検定系で使用できる。１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチドは細胞内に天然に存在するか、または上記のような技術を用いて導入することができる。一次培養または確立された細胞系、例えばＣＨＯまたはヒト胚性腎２９３細胞のいずれかを使用できる。
【０１２７】
医薬組成物
本発明はさらに、治療効果を達成するために患者に投与できる医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えば１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド、１１β−ＨＳＤ１様ポリヌクレオチド、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドに特異的に結合する抗体、または類似体、アゴニスト、アンタゴニスト、または１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド活性のインヒビターを含み得る。この組成物は単独で、または少なくとも１種類の他の物質、例えば安定化化合物と組み合わせて投与でき、これは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、および水を包含する（但しこれらに限定されない）任意の無菌で生物学的適合性のある製薬的担体中で投与できる。この組成物は単独で、または他の物質、薬物またはホルモンと組み合わせて患者に投与できる。
【０１２８】
活性成分に加えてこれらの医薬組成物は、賦形剤および補助物質を含む適当な製薬的に許容し得る担体を含有でき、これらは、製薬的に使用できる調製物への活性化合物の処理を促進する。本発明に係る医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸手段を包含する（但しこれらに限定されない）多くの経路により投与できる。経口投与用医薬組成物は、当分野で既知の製薬的に許容し得る担体を用いて経口投与に適した用量に調合できる。このような担体により、該医薬組成物を、患者が内服するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに調合できる。
【０１２９】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を、固体賦形剤と合し、得られた混合物を所望により粉砕し、そしてこの顆粒混合物を、所望ならば適当な補助物質を加えた後に処理して錠剤または糖衣剤核を得る。好適な賦形剤は炭水化物またはタンパク質増量剤、例えば乳糖、シュクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖；トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯、またはその他の植物由来の澱粉；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを包含するゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加できる。
【０１３０】
糖衣剤核は、濃縮糖溶液のような適当な被覆剤と共に使用でき、これはさらに、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ｃａｒｂｏｐｏｌゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。製品の同定のためまたは活性化合物の量、即ち用量をあらわすために染料または色素を錠剤または糖衣被覆剤に添加できる。
【０１３１】
経口的に使用できる医薬調合物は、ゼラチン製の押してはめ込むカプセル剤、ならびに、ゼラチンおよび被覆剤、例えばグリセロールまたはソルビトールでできた軟封入カプセル剤を包含する。押してはめ込むカプセル剤は、活性成分を、乳糖または澱粉のような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定剤と混合して含有できる。軟カプセル剤では、活性化合物を、安定剤を加えたまたは加えない適当な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁できる。
【０１３２】
非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理学的適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝化した食塩水中で調合できる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有できる。さらに、活性化合物の懸濁剤は適当な油性注射用懸濁剤として調製できる。好適な親油性溶媒または媒質は、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。非脂質ポリカチオンアミノポリマーもまた送達に使用できる。所望により懸濁剤は、化合物の溶解性を増し高濃縮溶液の調製を可能にするような適当な安定剤または物質を含むことができる。局所または鼻腔投与のためには、透過すべき特定の障壁に対し適当な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は当分野で一般に知られている。
【０１３３】
本発明に係る医薬組成物は当分野で既知の方法で、例えば常套的混合、溶解、顆粒化、糖衣剤製造、すりつぶし、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥プロセスによって製造できる。この医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、琥珀酸などを包含する（但しこれらに限定されない）多くの酸を用いて調製できる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒において、対応する遊離塩基型よりもより可溶性の傾向がある。別の場合には、好ましい調製物は、ｐＨ範囲４．５から５．５において以下のもの：１−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％シュクロース、および２−７％マンニトール、の全てまたは任意のものを含有できる凍結乾燥粉末であってよく、これを使用前に緩衝液と合する。
【０１３４】
調合と投与のための技術のさらなる詳細は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’ＳＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥＳ（ＭａａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ）の最新版に見出すことができる。医薬組成物を製造した後、これらを適当な容器に入れ、適応状態の治療のためにラベルを貼る。このようなラベル表示は、投与の量、頻度、および投与方法を包含する。
【０１３５】
治療上の適応および方法
ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素活性を調節し、ＣＮＳ障害、骨粗鬆症、肝疾患および肥満症、並びに血圧異常、胎児発育異常および糖尿病などの疾患を処置することができる。
【０１３６】
ＣＮＳ障害
処置できるＣＮＳ障害には、脳損傷、脳血管疾患及びこれらの予後、パーキンソン病、皮質基底核変性症、運動ニューロン疾患、痴呆（ＡＬＳ、多発性硬化症、外傷性脳損傷、脳卒中、脳卒中後、外傷後脳損傷および小血管性脳血管疾患を含む）が挙げられる。また、痴呆症、例えばアルツハイマー病、血管性痴呆、レビ小体痴呆、前頭側頭骨痴呆、及び第１７染色体に関連したパーキンソニズム、前頭側頭骨痴呆症（ピック病、進行性核麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｎｕｃｌｅａｒｐａｌｓｙ）、皮質基底核変性症、ハンチントン病、視床退縮（ｔｈａｌａｍｉｃｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、クロイツフェルト−ヤコブ病、ＨＩＶ性痴呆症、痴呆症を伴う統合失調症、及びコルサコフ精神病を含む）を処置できる。同様に、認知関連障害、例えば穏和な認知障害、加齢関連性記憶障害、加齢関係性認知減退、血管性認知障害、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害、及び学習障害を患った子供の記憶障害を、ヒトマトリプターゼ（ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ）様タンパク質の活性を調節することによって処置できる。
【０１３７】
骨粗鬆症
骨粗鬆症は、低骨量や骨組織の微細構造劣化によって特徴付けられ、骨脆弱性を高め、骨折の危険性を増大させる結果となる疾患である。これは、最も一般的なヒト代謝性骨障害である。確立された骨粗鬆症には、骨折が存在する。
【０１３８】
骨代謝回転は、骨内部の２種の主な効果細胞：骨再吸収に関係する破骨細胞と、骨基質を合成し且つミネラル化する骨芽細胞、との作用によって生じる。破骨細胞と骨芽細胞との作用は、非常に協調的である。破骨細胞前駆型は、代謝回転部位に補充される；それらは分化して融合し、後に骨を再吸収する成熟破骨細胞を形成する。骨表面に付着した場合、破骨細胞は特殊化した破骨細胞周辺膜と骨基質との間の強固に規定された連結部にて、酸性の微小環境を作り出し、骨基質の局所的可溶化を引き起こす。これにより、続く脱ミネラル化骨コラーゲンのタンパク質分解を容易にする。基質分解により、基質関連成長因子およびサイトカインが放出されると考えられており、それにより、時間的および空間的に調節された様式で骨芽細胞が補充される。骨芽細胞は、新たな骨基質タンパク質を合成し、かつ分泌し、引き続いてこの新たな基質をミネラル化する。このことは、正常な骨格においては、正味の骨量変化にはならない生理学的プロセスである。骨粗鬆症などの病理学的状態においては、再吸収と形成との間の均衡が変化する結果、骨喪失が生じる。ＷＯ９９／４５９２３を参照のこと。
【０１３９】
破骨細胞自身が、現在利用できる全ての骨粗鬆症物質（フッ化物を除く場合がある）の直接的または間接的な標的である。抗再吸収治療は、処置個体の更なる骨喪失を予防する。骨髄に存在し、さらに脂肪細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞および筋細胞となる多能性幹細胞から、骨芽細胞は誘導される。骨芽細胞活性の選択的増進は、骨粗鬆症治療の非常に望ましい目的である、というのはさらなる骨喪失を予防するよりも、骨量を増大させることになるからである。効果的な同化治療は、現在利用可能な処置よりも骨折の危険性をかなり減少させると期待されている。
【０１４０】
新たに発見したポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストは、破骨細胞分化、骨基質に対する破骨細胞吸着、または骨基質を分解する破骨細胞機能を直接変化させることによって、抗再吸収として作用し得る。アゴニストまたはアンタゴニストは、破骨細胞の分化または機能の効果分子（例えばサイトカイン、ペプチドまたはステロイドホルモン、プロテアーゼなど）の合成および／または修飾を妨げることによって、破骨細胞機能を間接的に変化させ得るであろう。
【０１４１】
新たに発見されたポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストは、骨芽細胞分化および／またはその骨基質形成機能を直接増進することにより、同化として作用することができる。さらに、このアゴニストまたはアンタゴニストは、増殖因子、ペプチドまたはステロイドホルモンの合成を増進すること、または阻害分子の合成を低下させることによって、骨芽細胞機能を間接的に変化させ得る。
【０１４２】
このアゴニストおよびアンタゴニストは、新たに発見されたポリペプチドの作用を模倣し、増強し又は阻害するのに用いることができ、それらは骨粗鬆症、パジェット病、骨移植および特に歯移植の分解を処置するのに有用であり得る。
【０１４３】
肝疾患
全ての慢性肝疾患は、肝臓における繊維症の発症を引き起こす。繊維症は、プログラムされた均一性創傷治癒応答である。最も重大な慢性肝疾患は、ウイルス性肝炎ＢおよびＣと、アルコール誘導型肝疾患である。１０〜３０％の間の罹患患者に、後期合併症として肝硬変が発症する。肝硬変の５生率は５０％である。肝硬変による死亡は、平均年齢わずか６０歳で起こる。アメリカでは９番目に多い死因である。
【０１４４】
外来タンパク質によって引き起こされる有毒なダメージまたは損傷が、細胞外基質、例えばコラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンなどの析出を引き起こす。その共通のメカニズムは、筋線維芽細胞を産生する基質中へのビタミンＡ貯蔵性肝星細胞（Ｉｔｏ細胞）の活性化及び形質転換である。これらは増殖し、ディッセ（Ｄｉｓｓｅ）の細胞外空間を細胞外基質で埋める。このプロセスはパラ活性化工程と自己分泌活性化工程とから成り、損傷プロセスが長期に渡って持続すると、自己不死化（ａｕｔｏ−ｐｅｒｐｅｔｕａｔｅｄ）する。これにより遅延型の進行性シャントが生じ、門脈血および動脈血の肝臓パーフュージョン（灌流）が減少する。この結果、肝機能が喪失する。類洞（ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ）内皮における窓形成（ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎ）の喪失によって増大化拡散障壁が増強される。これにより機能の喪失が実証される。食道性出血の頻繁合併症を伴う門脈高血圧症。肝疾患死の原因には、肝性昏睡（３０％）、食道性出血（３０％）および原発性肝癌腫（３０％）が含まれる。
【０１４５】
このタンパク質の調節が有効であり得る指標は、肝臓の慢性変性疾患（例えばウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、自己免疫肝炎、原発性胆汁性肝硬変、嚢胞性線維症、血色素症、ウィルソン病、非アルコール性脂肪肝、その他）によって引き起こされる肝臓線維症および肝硬変である。可能な他の指標は、全身硬化症、肺線維症、膵臓線維症、心筋線維症及び前立腺線維症の処置である。
【０１４６】
肥満症
肥満症および過体重は、除脂肪体重と比較した体脂肪の過剰として規定される。カロリー摂取の増加またはエネルギー支出の減少、あるいはその両方が、脂肪として貯えられる余剰エネルギーを導く不均衡を生じさせ得る。肥満症は、重大な医療上の罹患率および死亡率の増加と関連している。肥満症の病因は十分に理解されておらず、遺伝的要因、環境要因またはその２つの組み合わせのために、正方向のエネルギーバランスが引き起され得る。対照的に、食欲不振症および悪液質は、エネルギー支出に対するエネルギー取り込みの不均衡によって特徴付けられ、負方向のエネルギーバランスを引き起こし、体重が減少する。エネルギー支出を増大させるか、および／またはエネルギー取り込み、吸収若しくは貯蔵を減少させる物質は、肥満症、過体重、および関連する同時羅患率を処置するのに有用であろう。エネルギー取り込みを増大させる、および／またはエネルギー支出を減少させる、あるいは痩せた組織（ｌｅａｎｔｉｓｓｕｅ）の量を増大させる物質は、悪液質、食欲不振症および萎縮病を処置するのに有用であろう。
【０１４７】
この遺伝子、翻訳されたタンパク質、及びこの遺伝子若しくはその遺伝子の一部又はその産物を調整する物質は、肥満症、過体重、食欲不振症、悪液質、萎縮病、食欲抑制、食欲増進、満腹感の増大若しくは減少、体重の調整、および／または過食症などの他の摂食障害を処置するのに有用である。また、この遺伝子、翻訳されたタンパク質、およびこの遺伝子またはその遺伝子産物若しくはその産物を調整する物質は、肥満症／高血圧症、糖尿病ＩＩ型、環動脈疾患、高脂血症、脳卒中、胆嚢疾患、痛風、変形関節炎、睡眠時無呼吸および呼吸問題を含む過体重関連同時羅患率、幾つかのタイプの癌（子宮体癌、乳癌、前立腺癌および大腸癌を含む）、塞栓疾患、多嚢胞性卵巣症候群、減弱化受胎能、妊娠の合併症、月経不順、多毛症、ストレス尿失禁、及びうつ病、を処置するのに有用である。
【０１４８】
糖尿病
糖尿病は、血糖の異常上昇、脂質の変質、心血管系、目、腎臓および神経系における異常（合併症）によって特徴付けられる一般的な代謝障害である。糖尿病は、２つの別々の疾患：インスリンを産生し、かつ分泌する細胞の喪失が原因の糖尿病Ｉ型（若年発症）と、インスリン分泌の欠乏およびインスリン作用の欠乏によって引き起こされる糖尿病ＩＩ型（成人発症）とに分けられる。
【０１４９】
糖尿病Ｉ型は、膵島におけるインスリン分泌細胞（β細胞）を攻撃する自己免疫反応によって引き起こされる。この反応の発症を予防するか、またはベータ細胞の破壊が完了する前にこの反応を停止させる物質が、この疾患の可能性のある治療である。β細胞の増殖および再生を誘導する別の物質もまた、可能性のある治療である。
【０１５０】
糖尿病ＩＩ型は、２つの糖尿病性状態の中で最も一般的である（人口の６％）。インスリン分泌不足が、有力な糖尿病状態の病因であり、適切に検出し、かつ応答してインスリンを放出させ血糖レベルを上昇させるβ細胞の不能性の結果である。β細胞によるグルコースに対する応答を増大させる治療が、これらの疾患の有力な新しい治療を提供するであろう。
【０１５１】
糖尿病ＩＩ型被験者におけるインスリン作用の欠損症は、治療処置の別の標的である。筋肉、肝臓および脂肪におけるインスリン受容体の活性を増大させる物質は、血糖の減少および血漿脂質の正常化を生じさせるであろう。受容体活性は、受容体を直接刺激するか、または受容体由来の細胞内シグナルを増大させる物質によって増大させることができる。他の治療は、細胞端（ｃｅｌｌｕｌａｒｅｎｄ）プロセス、即ちグルコース輸送または種々の酵素系を直接活性し、非インスリン様効果を生じさせ、そしてさらに有益な結果を産することができる。過体重被験者は糖尿病ＩＩ型の罹患率が高く、体重を減少させる任意の物質が可能性のある治療である。
【０１５２】
糖尿病Ｉ型およびＩＩ型の両方は、インスリン活性を模倣し、かつ血糖レベルを減少させることによって糖尿病性合併症を処置する物質を用いて処置できる。同様に、新しい血管成長を低下させる物質を、両方の疾患に発症する目の合併症を処置するのに用いることができる。
【０１５３】
さらに、本発明は上記のスクリーニング検定によって同定される新規物質の使用に関する。従って、本明細書に記載のように同定される被験化合物を適当な動物モデルにおいて使用することも、本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載のように同定される物質（例えば、調整物質、アンチセンス核酸分子、特定の抗体、リボザイムまたは１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチド結合分子）を用いた処置の有効性、毒性または副作用を決定するために、該物質を動物モデルに用いることができる。別法としては、本明細書に記載のように同定される物質の作用メカニズムを決定するために、該物質を動物モデルに用いることができる。さらに、本発明は、本明細書に記載のような治療のための、上記スクリーニング検定によって同定される新規物質に使用に関する。
【０１５４】
１１β−ＨＳＤ１様酵素活性に影響を及ぼす試薬を、インビトロまたはインビボにてヒト細胞に投与し、１１β−ＨＳＤ１様酵素活性を低下させることができる。試薬は、ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素遺伝子の発現産物と結合することが好ましい。その発現産物がタンパク質である場合、その試薬は抗体であることが好ましい。エックスビボにおけるヒト細胞の処置について、抗体を、体から取り出しておいた幹細胞の調製物に加えることができる。その後、当分野で知られるように、その細胞を同じまたは別の人体に、クローン増殖させるか、又はさせずに移しかえることができる。
【０１５５】
１つの態様について、リポソームを用いて試薬を送達する。リポソームは、投与した動物中にて、少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも約１時間、さらにより好ましくは少なくとも約２４時間安定であることが好ましい。リポソームは、試薬、特にポリヌクレオチドを、動物（例えばヒト）の特定の部位に標的化することができる脂質組成物を含む。リポソームの脂質組成物は、動物の特有の器官、例えば肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節及び皮膚を標的化できることが好ましい。
【０１５６】
本発明に有用なリポソームは、標的化した細胞の原形質膜と融合でき、その内容物を細胞に送達できる脂質組成物を含む。好ましくは、リポソームのトランスフェクション効率は約１０^６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約０．５μｇであり、より好ましくは約１０^６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約１．０μｇであり、さらにより好ましくは約１０^６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約２．０μｇである。好ましくは、リポソームは直径が、約１００〜５００ｎｍであり、より好ましくは約１５０〜４５０ｎｍであり、さらにより好ましくは約２００〜４００ｎｍである。
【０１５７】
本発明に用いるに適したリポソームは、例えば当業者に知られる遺伝子送達法に標準的に用いられるリポソームを含む。より好ましいリポソームは、ポリカチオン脂質組成物を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールと連結されたコレステロールバックボーン（骨格鎖）を有するリポソームを含む。あるいは、リポソームは特定の細胞タイプを標的化できる化合物、例えばリポソームの外側表面に曝される細胞特異的リガンドを包含する。
【０１５８】
リポソームを、試薬、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムと複合化させることは、当分野で標準的な方法（例えば、米国特許５，７０５，１５１を参照のこと）を用いて達成することができる。好ましくは、ポリヌクレオチド約０．１μｇ〜約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する、より好ましくはポリヌクレオチド約０．５μｇ〜約５μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する、さらにより好ましくはポリヌクレオチド約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する。
【０１５９】
別の態様においては、抗体を、受容体媒介性標的化送達を用いて、インビボにて特定の組織に送達することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技術は、例えばＦｉｎｄｅｉｓら、ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１，２０２−０５（１９９３）；Ｃｈｉｏｕら、ＧＥＮＥＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ：ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳＯＦＤＩＲＥＣＴＧＥＮＥＴＲＡＮＳＦＥＲ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら、）（１９９４）；Ｗｕ＆Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６２１−２４（１９８８）；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，５４２−４６（１９９４）；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，３６５５−５９（１９９０）；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，３３８−４２（１９９１）にて教示されている。
【０１６０】
治療的有効量の決定
治療的有効量の決定は、充分当業者の能力の範囲内にある。治療的有効量とは、治療的有効量の不在下で起こる１１β−ＨＳＤ１様酵素活性に比較して１１β−ＨＳＤ１様酵素活性を増大させまたは低下させる活性成分の量を指す。
【０１６１】
いかなる化合物に関しても、治療的有効量は最初に細胞培養検定で、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタで見積もることができる。動物モデルは適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。次にこのような情報を用いて人間での有用な用量と投与経路を決定できる。
【０１６２】
治療的有効性および毒性、例えばＥＤ_５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ_５０（集団の５０％で致死的な用量）は、細胞培養または実験動物における標準的薬学的方法により決定できる。治療効果に対する毒性効果の用量比が治療指数であり、比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０で表すことができる。
【０１６３】
大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物研究から得られるデータを、人間への使用のための用量範囲を処方する際に使用する。かかる組成物に含まれる用量は、好ましくは殆どまたは全く毒性を持たないＥＤ_５０を包含する循環濃度の範囲内である。この用量は、使用する用量型、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変わる。
【０１６４】
正確な用量は、治療を必要とする対象に関連する因子に照らして医師が決定する。用量および投与は、充分なレベルの活性成分を提供するよう、または所望の効果を維持するよう、調節する。考慮できる因子は、疾病状態の重篤度、対象の全身健康状態、年齢、体重、および対象の性別、食餌、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応の感受性、および療法に対する寛容／応答を包含する。長時間作用性医薬組成物は、その製剤の半減期およびクリアランス率に応じて３から４日毎、毎週、または２週間に１回投与することができる。
【０１６５】
標準的な用量は投与経路に応じて０．１から１０００００マイクログラムまで変えることができ、約１ｇまでの総用量とすることができる。特定の用量および送達方法についての指針は文献に提供されており、一般に当分野の医師が入手できる。当業者は、ヌクレオチド用にはタンパク質またはそれらのインヒビター用のものとは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、状態、場所などに特異的である。
【０１６６】
この試薬が一本鎖抗体である場合、この抗体をコードしているポリヌクレオチドを組み立て、トランスフェリン−ポリカチオン−媒介ＤＮＡ転移、裸のまたはカプセル内核酸を用いるトランスフェクション、リポソームの媒介する細胞融合、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔、「遺伝子銃」、およびＤＥＡＥ−または燐酸カルシウム−媒介トランスフェクションを包含する（但しこれらに限定される訳ではない）充分確立した技術を用いて、ｅｘｖｉｖｏまたはインビボで細胞内に導入できる。
【０１６７】
抗体の有効なインビボ用量は、約５μｇから約５０μｇ／ｋｇ、約５０μｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇから約５００μｇ／ｋｇ（患者の体重）、および約２００から約２５０μｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲である。一本鎖抗体をコードしているポリヌクレオチドの投与のためには、有効なインビボ用量は、約１００ｎｇから約２００ｎｇ、５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、および約２０μｇから約１００μｇのＤＮＡの範囲である。
【０１６８】
発現産物がｍＲＮＡである場合、試薬は好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドは、上記のように多岐にわたる方法によって細胞中に導入できる。
【０１６９】
好ましくは、試薬は、１１β−ＨＳＤ１様酵素遺伝子の発現または１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの活性を、該試薬の不在時と比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる。１１β−ＨＳＤ１様酵素遺伝子の発現レベルまたは１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの活性を低下させるよう選択した機構の有効性は、当分野で周知の方法、例えば１１β−ＨＳＤ１様酵素特異的ｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドの免疫学的検出、または１１β−ＨＳＤ１様酵素活性の測定を用いて評価できる。
【０１７０】
上記のいずれの態様においても、本発明に係る任意の医薬組成物は他の適当な治療薬と組み合わせて投与できる。併用療法に使用するための適当な物質の選択は、常套的製薬原理に従い、当業者により実施することができる。治療薬の組み合わせは、相乗的に働いて、上記の様々な疾患の治療または予防を奏効させる。このアプローチを用いて、より低い各物質の用量で治療効果を達成することができ、したがって有害な副作用の可能性を低減することができる。
【０１７１】
上記の治療方法のいずれも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトといった哺乳動物を包含する、このような治療を必要とする任意の対象に適用することができる。
【０１７２】
診断方法
ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素はさらに、この酵素をコードしている核酸配列における突然変異の存在に関連する疾病および異常、または疾病および異常に対する感受性を検出する診断検定に使用できる。例えば、疾患に罹患している個体と正常な個体とにおける１１β−ＨＳＤ１様酵素をコードするｃＤＮＡまたはゲノム配列の間の差異を決定できる。もし、罹患している個体の幾つかまたは全てに突然変異が観察され、正常な個体で観察されないならば、その突然変異がその疾患の原因物質である可能性がある。
【０１７３】
レファレンス遺伝子および突然変異を有する遺伝子の間の配列相違は、直接ＤＮＡ配列決定法によって明らかにできる。加えて、クローニングしたＤＮＡセグメントを、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして使用できる。この方法の感受性はＰＣＲと組み合わせる時極めて増強される。例えば、二本鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲにより調製された一本鎖テンプレート分子と共に、配列決定プライマーを使用することができる。配列決定は、放射標識したヌクレオチドを用いる常套的方法によって、または蛍光標識を使用する自動配列決定法によって実施する。
【０１７４】
ＤＮＡ配列相違に基づく遺伝子試験は、変性させる物質を含むまたは含まないゲル中のＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化を検出することにより実施できる。小配列の欠失および挿入は、例えば高分解能ゲル電気泳動によって視覚化できる。異なる配列のＤＮＡ断片は変性させるホルムアミド勾配ゲル上で識別でき、ここでは、異なるＤＮＡ断片の移動度が、それらの特異的融解温度または部分的融解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０，１２４２，１９８５を参照されたい）。特定の位置での配列改変もまたヌクレアーゼ保護検定、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂法によって明らかにすることができる（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５，４３９７−４４０１，１９８５）。即ち特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定といった方法によって、または制限酵素とゲノムＤＮＡのサザンブロッティングを使用することによって実施できる。ゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定のような直接法に加えて、突然変異はｉｎｓｉｔｕ分析により検出することもできる。
【０１７５】
１１β−ＨＳＤ１様酵素レベルの変化もまた種々の組織で検出できる。血液または組織生検のように、宿主から誘導した身体試料中のタンパク質ポリペプチドのレベルを検出するために用いる検定は、当業者に周知であり、ラジオイムノアッセイ、競合的結合検定、ウェスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡ検定を包含する。
【０１７６】
本明細書に引用する全ての特許および特許出願は、引用により特に本明細書の一部とする。上記の内容は本発明を一般的に記載するものである。より完全な理解は以下の具体的実施例を参照することによって得られ、それらの実施例は例示のみの目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定する意図は無い。
【０１７７】
実施例１
１１β−ＨＳＤ１様酵素活性の検出
配列番号１のポリヌクレオチドを発現ベクターｐＣＥＶ４中に挿入し、得られた発現ベクターｐＣＥＶ４−１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドを、ヒト胚性腎臓２９３細胞中にトランスフェクトする。この細胞から抽出物を得て、１１β−ＨＳＤ１活性を、濃度範囲（０〜１０μｍｏｌ／Ｌ）の冷コルチコステロンとＮＡＤＰまたはＮＡＤのいずれかの補因子（０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）の存在下にて、１２ｍｍｏｌ／ＬＨ−コルチコステロン（１，２，６，７Ｈ−コルチコステロン、特異的活性８６Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＬｔｄ．）から放射能１１−デヒドロコルチコステロンへの変換を測定することによって決定する。ステロイドを酢酸エチル中に抽出し、高性能液体クロマトグラフィーにより分離する。最高速度（Ｖ_ｍａｘ）とＫ_ｍ値とを、種々の冷コルチコステロン濃度を用いて、Ｈ−コルチコステロンから１１−デヒドロコルチコステロンへの変換％を用いて評価する。配列番号２が１１β−ＨＳＤ１様酵素活性を有することが示される。
【０１７８】
実施例２
組換えヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素
ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクターｐＰＩＣＺＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、大量の組換えヒト１１β−ＨＳＤ１ポリペプチドを酵母中に生産させる。１１β−ＨＳＤ１様酵素コード化ＤＮＡ配列には配列番号１が含まれる。ベクターｐＰＩＣＺＢ中に挿入する前に、ＤＮＡ配列を、５’端に開始コドン、及び３’端にエンテロキナーゼ開列部位、Ｈｉｓ６レポータータグや終止コドンを含ませるといった周知の方法によって修飾する。さらに、両末端に、制限エンドヌクレアーゼの認識配列を加え、対応する制限酵素を用いてｐＰＩＣＺＢのマルチクローニングサイトを消化した後、修飾したＤＮＡ配列をｐＰＩＣＺＢ中にライゲートする。この発現ベクターを、ピキアパストリスにて酵母プロモーターによって誘導される誘導性発現用に設計する。得られたｐＰＩＣＺ／ｍｄ−Ｈｉｓ６ベクターを用いて、酵母を形質転換する。
【０１７９】
この酵母を、５リッター攪拌フラスコ中で通常の条件下にて培養し、組換え産物化したタンパク質を、８Ｍウレアの存在下にて親和性クロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ−樹脂）により培養物から単離する。結合したポリペプチドを、ｐＨ３．５の緩衝液を用いて溶出し、中性化する。Ｈｉｓ６レポータータグからのポリペプチドの分離は、製造元の指示に従い、エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いる部位特異的タンパク質分解によって達成される。精製ヒト１１β−ＨＳＤ１様ポリペプチドを得る。
【０１８０】
実施例３
腎細胞における１１β−ＨＳＤ１活性の決定；１１β−ＨＳＤ１活性を変化させる化合物の同定
１１β−ＨＳＤ１活性を上記Ｌｌｏｙｄ−ＭａｃＧｉｌｐのように実質的に測定する。腎臓を冷却Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ溶液（０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、２．５ｍｍｏｌ／ＬＫＣＩ、２．５ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ_２、１．２ｍｍｏｌ／ＬＫＨ_２ＰＯ_４、１．２ｍｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ_４及び２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＨＣＯ_３）中にて区分化し、皮膚組織を髄質内部組織から切り出す。それぞれの領域を別々に処理する。４倍量リンガー（Ｒｉｎｇｅｒ）溶液にホモジネートした後、そのホモジナートを２０分間、１６，０００×ｇで遠心分離し、その上清を４℃、１０，６００×ｇで１時間、遠心分離し、ミクロソーマルフラクションを調製する。
【０１８１】
反応物の一部を小分子ライブラリー由来の被験化合物と接触させる。コントロール試料を被験化合物の非存在化にてインキュベートする。３７℃で１０分間、インキュベートした後、酢酸エチル２ｍｌを添加し、その反応を停止させる。
【０１８２】
ミクロソームにおけるデヒドロゲナーゼ活性を、濃度範囲（０〜１０μｍｏｌ／Ｌ）の冷コルチコステロンとＮＡＤＰまたはＮＡＤのいずれかの補因子（０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）の存在下にて１２ｍｍｏｌ／ＬＨ−コルチコステロン（１，２，６，７Ｈ−コルチコステロン、特異的活性８６Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＬｔｄ．）から放射能１１−デヒドロコルチコステロンへの変換について測定することによって決定する。ステロイドを酢酸エチル中に抽出し、高性能液体クロマトグラフィーによって分離する。最高速度（Ｖ_ｍａｘ）とＫ_ｍ値とを、種々のコルチコステロン濃度を用いて、Ｈ−コルチコステロンから１１−デヒドロコルチコステロンへの変換％を用いて評価する。Ｖ_ｍａｘまたはＫ_ｍ値を２０％まで増大または低下させる被験化合物を、１１β−ＨＳＤ１様酵素を調節する可能性のある治療物質として同定する。
【０１８３】
実施例４
１１β−ＨＳＤ１様酵素遺伝子発現を低下させる被験化合物の同定
被験化合物を、１１β−ＨＳＤ１様酵素発現構築物でトランスフェクトしたヒト細胞培養に投与し、３７℃で１０〜４５分間、インキュベートする。トランスフェクトしていない同じタイプの細胞培養を、被験化合物を加えず、同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。
【０１８４】
ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８，５２９４−９９，１９７９に記載のように２つの培養物から単離する。ノーザンブロットを全ＲＮＡ２０〜３０μｇを用いて調製し、エクスプレスハイブ（Ｅｘｐｒｅｓｓｈｙｂ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）にて、^３２Ｐ−標識化１１β−ＨＳＤ１様酵素特異的プローブを用いてハイブリダイズさせる。このプローブは配列番号１の相補物より選ばれる少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを包含する。被験化合物の非存在下にて得られるシグナルと比較して、１１β−ＨＳＤ１様酵素特異的シグナルを低下させる被験化合物を、１１β−ＨＳＤ１様酵素遺伝子発現のインヒビターとして同定する。
【０１８５】
実施例５
１１β−ＨＳＤ１遺伝子産物と特異的に結合する試薬を用いる中枢神経系障害の処置
配列番号１の相補物より選択される少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンス１１β−ＨＳＤ１オリゴヌクレオチドの合成は、ホスホラミダイト手順を用いて、ファルマシアジーンアセンブリーシリーズシンセサイザー（ＰｈａｒｍａｃｉａＧｅｎｅＡｓｓｅｍｂｌｅｒｓｅｒｉｅｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）にて実施する。上記、Ｕｈｌｍａｎｎらを参照のこと。アセンブリーおよび脱保護に続き、ヌクレオチドを、２度エタノール沈殿させ、乾燥させ、そしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に所望の濃度に懸濁する。これらのオリゴヌクレオチドの純度を、キャピラリーゲル電気泳動と、イオン交換ＨＰＬＣにより試験する。オリゴヌクレオチド調製のエンドトキシンレベルを、ＬｉｍｕｌｕｓＡｍｅｂｏｃｙｔｅＡｓｓａｙ．Ｂａｎｇ，Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．（ＷｏｏｄｓＨｏｌｅ，Ｍａｓｓ．）１０５，３６１−３６２（１９５３）を用いて決定する。
【０１８６】
濃度０．１〜１００μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む水性組成物を、ＣＭＳ疾患に苦しむ患者に注射により投与する。それにより、疾患の重症度を低下させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列（配列番号１）。
【図２】図１に記載のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号２）。
【図３】スイスプロットアクセッションナンバーＰ１６２３２と同一であるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）。
【図４】１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列（配列番号４）。
【図５】１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列（配列番号５）。
【図６】１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列（配列番号６）。
【図７】スイスプロットアクセッションナンバーＰ１６２３２（配列番号３）と同一であるタンパク質と、１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチド（配列番号２）のＢＬＡＳＴＸアライメント。

Claims

１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号２に示すアミノ酸配列、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）配列番号１に記載の配列を含むポリヌクレオチド、
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）〜（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱しているポリヌクレオチド、並びに
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に明記するポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異体を表すポリヌクレオチド、
から成る群より選択されるポリヌクレオチド。
請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされている、実質上精製された１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチド。
ａ）請求項３に記載の宿主細胞を、１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養する工程；および、
ｂ）該宿主細胞培養から１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドを回収する工程、
を含む、１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドを生産する方法。
ａ）請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを生物試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させる工程；および、
ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程、
を含む、生物試料中の１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するための方法。
ハイブリダイゼーション前に、生物試料の核酸材料を増幅させる、請求項６に記載の方法。
生物試料を、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドと特異的に相互作用する試薬と接触させる工程を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドを検出するための方法。
請求項６〜８のいずれかに記載の方法を実施するための診断キット。
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによってコードされている任意の１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドと接触させる工程；
該１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドと結合する被験化合物を、１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を低下させる可能性のある治療物質として同定する方法。
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによってコードされる１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドと接触させる工程；および、
該ポリペプチドの１１β−ＨＳＤ１様酵素活性を検出する工程、
を含む１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、１１β−ＨＳＤ１様酵素活性を増大させる被験化合物を１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を増大させる可能性のある治療物質として同定し、そして該ポリペプチドの１１β−ＨＳＤ１様酵素活性を減少させる被験化合物を１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を減少させる可能性のある治療物質として同定する方法。
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドと接触させ、該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する工程を含む、１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を減少させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリヌクレオチドに結合する被験化合物を１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を減少させる可能性のある治療物質として同定する方法。
細胞を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドと特異的に結合する試薬と接触させ、それにより１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を減少させる工程を含む、１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を減少させる方法。
請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法によって同定される、１１β−ＨＳＤ１様酵素ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調整する試薬。
請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
疾患において１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を調整する、請求項１５に記載の医薬組成物の使用。
該疾患が、ＣＮＳ障害、骨粗鬆症、肝疾患、肥満症、血圧異常または胎児発育異常、および糖尿病である、請求項１６に記載の使用。
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
配列番号１を含む、請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
配列番号１から成る、請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
該ポリヌクレオチドが配列番号１から成る、請求項２１に記載の発現ベクター。
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞。
該ポリヌクレオチドが配列番号１から成る、請求項２３に記載の宿主細胞。
配列番号２に示すアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
配列番号２に示すアミノ酸配列から成る、請求項２５に記載の精製されたポリペプチド。
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む融合タンパク質。
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下で培養し；そして該ポリペプチドを単離する工程を含む、該ポリペプチドを生産する方法。
該発現ベクターが配列番号１を含む、請求項２８に記載の方法。
配列番号１に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、生物試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ；そして、該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含む、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出する方法。
ハイブリダイズさせる工程の前に、該核酸材料を増幅させる工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
配列番号１に記載の１１個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、
請求項３０に記載の方法についての説明書、
を含む、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出するためのキット。
生物試料を、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する試薬と接触させて、試薬−ポリペプチド複合体を形成させる工程；および、
該試薬−ポリペプチド複合体を検出する工程、
を含む、該ポリペプチドを検出するための方法。
該試薬が抗体である、請求項３３に記載の方法。
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体；および
請求項３３に記載の方法についての説明書、
を含む、該ポリペプチドを検出するためのキット。
被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号２に示すアミノ酸配列、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程；および
該ポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を調整することができる物質をスクリーニングするための方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物をヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を調節する可能性のある物質として規定する方法。
接触させる工程が細胞においてである、請求項３６に記載の方法。
インビトロにおける細胞である、請求項３６に記載の方法。
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項３６に記載の方法。
該ポリペプチドが検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
被験化合物が検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
被験化合物が該ポリペプチドと結合している標識化リガンドに取って代わる、請求項３６に記載の方法。
該ポリペプチドが固体支持体と結合している、請求項３６に記載の方法。
被験化合物が固体支持体と結合している、請求項３６に記載の方法。
被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列、および、（２）配列番号２に示すアミノ酸配列、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程；および
該ポリペプチドの活性を検出する工程、
を含むヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を調整する物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドの活性を増大させる被験化合物を、ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を増大させる可能性のある物質として同定し、該ポリペプチドの活性を減少させる被験化合物を、ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を減少させる可能性のある物質として同定する方法。
接触させる工程が細胞においてである、請求項４５に記載の方法。
インビトロにおける細胞である、請求項４５に記載の方法。
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項４５に記載の方法。
被験化合物を、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる産物と接触させる工程；および
該産物に対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を調整する物質をスクリーニングする方法であって、該産物に結合する被験化合物をヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を調節する可能性のある物質として同定する方法。
該産物がポリペプチドである、請求項４９に記載の方法。
該産物がＲＮＡである、請求項４９に記載の方法。
細胞を、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる産物と特異的に結合する試薬と接触させ、それによりヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を減少させる工程を含む、ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素の活性を減少させる方法。
該産物がポリペプチドである、請求項５２に記載の方法。
該産物が抗体である、請求項５３に記載の方法。
該産物がＲＮＡである、請求項５２に記載の方法。
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５５に記載の方法。
該試薬がリボザイムである、請求項５６に記載の方法。
インビトロにおける細胞である、請求項５２に記載の方法。
該細胞がインビボにおいてである、請求項５２に記載の方法。
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する試薬；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
該試薬が抗体である、請求項６０に記載の医薬組成物。
配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの産物と特異的に結合する試薬；および製薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
該試薬がリボザイムである、請求項６２に記載の医薬組成物。
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６２に記載の医薬組成物。
該試薬が抗体である、請求項６２に記載の医薬組成物。
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクター；および製薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
該発現ベクターが配列番号１を含む、請求項６６に記載の医薬組成物。
ＣＮＳ障害、骨粗鬆症、肝疾患、肥満症、血圧異常または胎児発育異常、および糖尿病より選択される１１β−ＨＳＤ１様酵素機能障害関連疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、ヒト１１β−ＨＳＤ１様酵素の機能を調整する試薬の治療的有効量を投与し、それにより１１β−ＨＳＤ１様酵素機能障害関連疾患の症状を回復させる方法。
該試薬が請求項３６に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
該試薬が請求項４５に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
該試薬が請求項４９に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。