DE60117155T2 - Regulierung der menschlichen prostasin-änhlichen serine protease - Google Patents

Regulierung der menschlichen prostasin-änhlichen serine protease Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft das Gebiet der Enzymregulierung. Insbesondere betrifft die Erfindung die Regulierung der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Serinproteasen sind in zahlreiche verschiedene biologische Funktionen eingebunden, einschließlich Zell-Zell-Kommunikation, Zellmigration und Gewebeumbildung. Somit gibt es auf dem Gebiet der Erfindung einen Bedarf, zusätzliche menschliche Serinproteasen zu identifizieren, die reguliert werden können, um therapeutische Wirkungen bereitzustellen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Ziel der Erfindung ist, Reagenzien und Verfahren zur Regulation der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym bereitzustellen. Diese und andere Ziele der Erfindung werden durch eine oder mehrere der nachstehend beschriebenen Ausführungsformen bereitgestellt.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid, das die in Seq.-ID Nr. 6 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
  • Wiederum eine andere Ausführungsform ist ein Verfahren zum Screenen auf Mittel, die die Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym herabsetzen. Eine Testverbindung wird mit einem Prostasin-ähnlichem Enzympolypeptid kontaktiert, das die in Seq.-ID Nr. 6 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
  • Bindung zwischen der Testverbindung und dem Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptid wird nachgewiesen. Eine Testverbindung, die sich an das Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid bindet, wird hierdurch als ein potenzielles Mittel zur Senkung der Akti vität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym identifiziert. Das Mittel kann durch Herabsetzen der Aktivität des Prostasin-ähnlichen Enzyms funktionieren.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Mittel, die die Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym herabsetzen. Eine Testverbindung wird mit einem Polynucleotid, das für ein Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodiert, kontaktiert, worin das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 5 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst.
  • Bindung der Testverbindung an das Polynucleotid wird nachgewiesen. Eine Testverbindung, die sich an das Polynucleotid bindet, wird als ein potenzielles Mittel zur Senkung der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym identifiziert. Das Mittel kann durch das Herabsetzen der Menge an Prostasin-ähnlichem Enzym durch Wechselwirken mit mRNA von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym funktionieren.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Mittel, die Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym regulieren. Eine Testverbindung wird mit Prostasin-ähnlichem Enzympolypeptid, das die in Seq.-ID Nr. 6 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, kontaktiert.
  • Eine Prostasin-ähnliche Enzymaktivität des Polypeptids wird nachgewiesen. Eine Testverbindung, die Prostasin-ähnliche Enzymaktivität des Polypeptids in Bezug auf Prostasin-ähnliche Enzymaktivität in Abwesenheit der Testverbindung steigert, wird somit als ein potenzielles Mittel zur Steigerung der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym identifiziert. Eine Testverbindung, die Prostasin-ähnliche Enzymaktivität des Polypeptids in Bezug auf Prostasin-ähnliche Enzymaktivität in Abwesenheit der Testverbindung herabsetzt, wird somit als ein potenzielles Mittel zur Senkung der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym identifiziert.
  • Wiederum eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Mittel, die Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym herabset zen. Eine Testverbindung wird mit Prostasin-ähnlichem Enzymprodukt eines Polynucleotids, das die in Seq.-ID Nr. 5 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, kontaktiert.
  • Bindung der Testverbindung an das Prostasin-ähnliche Enzymprodukt wird nachgewiesen. Eine Testverbindung, die sich an das Prostasin-ähnliche Enzymprodukt bindet, wird somit als ein potenzielles Mittel zur Senkung der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym identifiziert.
  • Wiederum eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Senkung der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym. Eine Zelle wird mit einem Reagens kontaktiert, das sich spezifisch an ein Polynucleotid, das für ein Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodiert, oder an das Produkt, für das das Polynucleotid kodiert, bindet, worin das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 5 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst.
  • Prostasin-ähnliche Enzymaktivität in der Zelle wird dadurch herabgesetzt.
  • Die Erfindung stellt somit Reagenzien und Verfahren zur Regulierung der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym bereit, die unter anderem verwendet werden können, um metastatische Aktivität maligner Zellen zu unterdrücken.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die für ein Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodierende DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1).
  • 2 zeigt die von der in 1 gezeigten DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2).
  • 3 zeigt die Aminosäuresequenz des Proteins, identifiziert durch SwissProt-Zugriffsnummer Q16651 (Seq.-ID Nr. 3).
  • 4 zeigt die für ein Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodierende DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 4).
  • 5 zeigt die für ein Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodierende DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 5).
  • 6 zeigt die von der in 5 gezeigten DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 6).
  • 7 zeigt den Abgleich von in Seq.-ID Nr. 2 gezeigtem Prostasin-ähnlichem Enzym mit dem durch Swiss-Prot-Zugriffsnummer Q16651 identifizierten, menschlichen Protein (Seq.-ID Nr. 3).
  • 8 zeigt die PROSITE-Suchergebnisse.
  • 9 zeigt die BLOCKS-Suchergebnisse.
  • 10 zeigt den BLAST-Abgleich gegen Swiss/Q16651/PSS8_HUMAN.
  • 11 zeigt die Genvorhersage.
  • 12 zeigt die relative Expression von Prostasin-ähnlichem Enzym in verschiedenen menschlichen Geweben.
  • 13 zeigt die relative Expression von Prostasin-ähnlichem Enzym in verschiedenen menschlichen Atmungsgeweben und -zellen. Abkürzungen: HBEC = kultivierte menschliche Bronchialepithelzellen; H441 = Claraähnliche Zellen; SMC = kultivierte Glattmuskelzellen der Atemwege; SAE = kultivierte Epithelzellen der kleinen Atemwege; AII = primär kultivierte Alveolarzellen vom Typ II; PMN = polymorphonukleäre Leukozyten; Mono = Monozyten; Kult. Mono = kultivierte Monozyten (Makrophagen-ähnlich).
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polynucleotid, das für ein Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodiert und aus der aus
    • 1. einem Polynucleotid, das für ein Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodiert, das die in Seq.-ID Nr. 6 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst;
    • 2. einem die Sequenz aus Seq.-ID Nr. 5 umfassenden Polynucleotid;
    • 3. einem Polynucleotid, dessen Sequenz von den in 1 und 2 spezifizierten Polynucleotidsequenzen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes abweicht; und das die biologische Aktivität von 1 aufweist;
    bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  • Menschliches Prostasin-ähnliches Enzym, wie in Seq.-ID Nr. 2 gezeigt, ist zu 47 über 243 Aminosäuren mit dem menschlichen Protein, das durch SwissProt-Zugriffsnummer Q16651 (Seq.-ID Nr. 3) identifiziert und als ein Prostasin-Vorläufer bezeichnet wird, identisch (1). Prostasin ist eine Trypsin-ähnliche Serinprotease, die bereits aus menschlicher Samenflüssigkeit isoliert und in Epithelzellen und Gängen der Prostata sowie in Kolon, Lunge, Niere, Pankreas, Speicheldrüse, Leber und Bronchien lokalisiert wurde (Yu et al., J. Biol. Chem. 269, 11843–11848 (1994)). Menschliches Prostasin-ähnliches Enzym enthält eine Trypsin-Serin- und eine Trypsin-Histidin-Region, wie in 1 gezeigt ist. Andere Domänen, die in menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym identifiziert wurden, umfassen Fibronectin-Domänen, Kringle-Domänen und Apple-Domänen, wie in 3 gezeigt ist. Somit wird angenommen, dass menschliches Prostasin-ähnliches Enzym für dieselben Zwecke nützlich ist wie bereits identifizierte Serinproteasen, einschließlich Prostasin. Die Regulierung von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym kann beispielsweise eingesetzt werden, um Leiden wie z.B. Osteoporose, COPD, Tumormetastasenbildung und neurodegenerative Erkrankungen zu behandeln.
  • Die WO 0116290 zeigt die Protease EOS, ein Mitglied der S1-Serinprotease-Familie, die in Blutplättchen und Leukozyten und insbesondere in Eosinophilen und Makrophagen exprimiert wird. Ihre DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) ist zu 99,7% in einer 438-Basen-Überlappung mit Seq.-ID Nr. 1 identisch und zu 98,6% in einer 728-Basen-Überlappung mit Seq.-ID Nr. 5 (944 bp Länge) aus der vorliegenden Anmeldung identisch. Ihre Proteinsequenz (Seq.-ID Nr. 7) ist zu 94,2% mit Seq.-ID Nr. 2 und zu 95,6% mit Seq.-ID Nr. 6 aus der vorliegenden Anmeldung identisch.
  • Die WO 0124815 offenbart Plasminogen-ähnliche Polypeptide. Das Gen N 1 ist ein Gen, das Homologie zu menschlichem Prostasin zeigt. Das Gen wird in Eosinophilen und Epithel- und Wundheilungsgewebe sowie in T-Zellen und in primären dendritischen Zellen exprimiert. Seine DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1, 1.836 bp) ist zu 99,7% in einer 438-Basen-Überlappung mit Seq.-ID Nr. 1 (786 bp Länge) identisch und zu 100% in einer 607-Basen-Überlappung mit Seq.-ID Nr. 5 (944 bp Länge) aus der vorliegenden Anmeldung identisch. Seine Proteinsequenz (Seq.-ID Nr. 4) ist zu 93,4% mit Seq.-ID Nr. 2 identisch und zu 95,1% in einer 228-Aminosäuren-Überlappung mit Seq.-ID Nr. 6 (272 Aminosäuren lang) aus der vorliegenden Anmeldung identisch.
  • Die WO 0198468 offenbart menschliche Serinproteasen (PTRS-2), die strukturelle Eigenschaften in Bezug auf Homologie zu Mitgliedern der Trypsinfamilie zeigen. Ihre DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 23, 2.036 bp) ist zu 99,7% in einer 438-Basen-Überlappung mit Seq.-ID Nr. 1 (786 bp Länge) identisch und zu 100% in einer 607-Basen-Überlappung mit Seq.-ID Nr. 5 (944 bp Länge) identisch. Ihre Proteinsequenz (Seq.-ID Nr. 2, 365 Aminosäuren) ist zu 93,4% mit Seq.-ID Nr. 2 identisch und zu 95,1% in einer 228-Aminosäuren-Überlappung mit Seq.-ID Nr. 6 (272 Aminosäuren lang) aus der vorliegenden Anmeldung identisch.
  • Polypeptide
  • Menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide umfassen zumindest 6, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250 oder 260 zusammenhängende Aminosäuren, ausgewählt aus der in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 6 gezeigten Aminosäuresequenz oder einer biologisch aktiven Variante davon, wie nachstehend definiert wird. Ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid der Erfindung kann daher ein Teil eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzymproteins, ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzymprotein voller Länge oder ein Fusionsprotein, das das gesamte menschliche Prostasin-ähnliche Enzymprotein oder einen Teil davon umfasst, sein.
  • Biologisch aktive Varianten
  • Varianten von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzympolypeptid, die biologisch aktiv sind, z.B. eine Serinproteaseaktivität beibehalten, sind ebenfalls menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide. Vorzugsweise weisen natürlich oder nicht natürlich vorkommende Prostasin-ähnliche Enzympolypeptidvarianten Aminosäuresequenzen auf, die zu zumindest etwa 50, 55, 60, 65 oder 70%, vorzugsweise zu etwa 75, 80, 85, 90, 96, 96 oder 98%, mit der in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 6 gezeigten Sequenz oder einem Fragment davon identisch sind. Die prozentuelle Identität zwischen einer mutmaßlichen menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptidvariante und einer Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 6 wird unter Verwendung des Blast2-Abgleichungsprogramm (Blosum 62, Expect 10, genetische Standard-Codes) bestimmt.
  • Variationen der prozentuellen Identität können beispielsweise auf Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen zurückzuführen sein. Aminosäure-Substitutionen sind definiert als die Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere. Sie werden als konservativ bezeichnet, wenn die substituierte Aminosäure ähnliche strukturelle und/oder chemische Eigenschaften aufweist. Beispiele für konservative Ersetzungen sind Substitutionen von Leucin durch Isoleucin oder Valin, von Aspartat durch Glutamat oder von Threonin durch Serin.
  • Aminosäure-Insertionen oder -Deletionen sind Änderungen an oder innerhalb einer Aminosäuresequenz. Sie fallen typischerweise in den Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren. Anhaltspunkte zur Bestimmung, welche Aminosäurereste substituiert, insertiert oder deletiert werden können, ohne biologische oder immunologische Aktivität eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids aufzuheben, können unter Verwendung von Computerprogrammen, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, wie z.B. DNASTAR-Software, gefunden werden. Ob eine Aminosäureänderung zu einem biologisch aktiven, menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptid führt, kann leicht durch Testen auf Serinproteaseaktivität, wie beispielsweise in den nachstehenden, spezifischen Beispielen beschrieben, bestimmt werden.
  • Fusionsproteine
  • Fusionsproteine sind zur Bildung von Antikörpern gegen Aminosäuresequenzen von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzympolypeptid und zur Verwendung in verschiedenen Testsystemen nützlich. Fusionsproteine können beispielsweise verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, die mit Abschnitten eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids wechselwirken. Proteinaffinitätschromafographie oder Bibliotheks-basiertes Tests für Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie z.B. die Hefe-Zwei-Hybrid- oder Phagendisplay-Systeme, können zu diesem Zweck verwendet werden. Solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und können auch als Wirkstoff-Screens verwendet werden.
  • Ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid-Fusionsprotein umfasst zwei Polypeptidsegmente, die mittels einer Peptidbindung aneinander fusioniert sind. Das erste Polypeptidsegment umfasst zumindest 6, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250 oder 260 zusammenhängende Aminosäuren aus Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 6 oder aus einer biologisch aktiven Variante davon, wie aus jenen, die zuvor beschrieben wurden. Das erste Polypeptidsegment kann auch menschliches Prostasin-ähnliches Enzymprotein voller Länge umfassen.
  • Das zweite Polypeptidsegment kann ein Protein voller Länge oder ein Proteinfragment sein. Proteine, die üblicherweise zur Fusionsproteinkonstruktion verwendet werden, umfassen β-Galactosidase, β-Glucuronidase, grün fluoreszierendes Protein (GFP), autofluoreszierende Proteine, einschließlich blau fluoreszierendes Protein (BFP), Glutathion-S-Transferase (GST), Luciferase, Meerrettichperoxidase (HRP) und Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT). Darüber hinaus werden Epitop-Markierungen in Fusionsproteinkonstruktionen verwendet, einschließlich Histidin-(His-)Markierungen, FLAG-Markierungen, Influenza-Hämagglutinin-(HA-)Markierungen, Myc-Markierungen, VSV-G-Markierungen und Thioredoxin-(Trx-)Markie rungen. Andere Fusionskonstruktionen können Maltose-Bindungsprotein- (MBP), S-Markierung-, Lex-a-DNA-Bindungsdomänen-(DBD-)Fusionen, GAL4-DNA-Bindungsdomänen-Fusionen und Herpes-Simplex-Virus-(HSV-)BP16-Proteinfusionen umfassen. Ein Fusionsprotein kann auch so gebildet werden, dass es eine Spaltungsstelle, die zwischen der Kodiersequenz für das menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid und der heterologen Proteinsequenz angeordnet ist, enthalten ist, sodass das menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid gespaltet und aus der heterologen Gruppierung gereinigt werden kann.
  • Ein Fusionsprotein kann chemisch wie nach dem Stand der Technik bekannt synthetisiert werden. Vorzugsweise wird das Fusionsprotein durch kovalente Bindung zwischen zwei Polypeptidsegmenten oder mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie Standard sind, hergestellt. DNA-Rekombinationsverfahren können verwendet werden, um Fusionsproteine herzustellen, beispielsweise durch Bilden eines DNA-Konstrukts, das Kodiersequenzen, ausgewählt aus Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 5, in korrektem Leseraster mit Nucleotiden, die für das zweite Polypeptidsegment kodieren und das DNA-Konstrukt in einer Wirtszelle exprimieren, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, umfasst. Zahlreiche Sets zur Konstruktion von Fusionsproteinen sind bei Unternehmen wie Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), CLONTECH (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL International Corporation (MIC; Watertown, MA) und Quantum Biotechnologies (Montreal, Kanada; 1-888-DNA-KITS) erhältlich.
  • Identifikation von Spezies-Homologen
  • Spezies-Homologe von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzympolypeptid können unter Verwendung von menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptid-Polynucleotiden (nachstehend beschrieben) erhalten werden, um geeignete Sonden oder Primer zum Screenen von cDNA-Expressionsbibliotheken aus anderen Spezies, wie z.B. Mäusen, Affen oder Hefe, zum Identifizieren von cDNAs, die für Homologe von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzympolypeptid kodieren, und Exprimieren von cDNAs wie nach dem Stand der Technik bekannt herzustellen.
  • Polynucleotide
  • Ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolynucleotid kann einzel- oder doppelsträngig sein und umfasst eine Kodiersequenz oder das Komplement einer Kodiersequenz für ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid. Eine Kodiersequenz voller Länge für menschliches Prostasin-ähnliches Enzym ist in Seq.-ID Nr. 1 und Seq.-ID Nr. 5 gezeigt.
  • Degenerierte Nucleotidsequenzen, die für menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide kodieren, sowie homologe Nucleotidsequenzen, die zu zumindest etwa 50%, vorzugsweise etwa 75, 90, 96 oder 98%, identisch mit der in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 5 gezeigten Nucleotidsequenz sind, sind ebenfalls menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolynucleotide. Prozentuelle Sequenzidentität zwischen den Sequenzen von zwei Polynucleotiden wird unter Verwendung von Computerprogrammen wie z.B. ALIGN, die den FASTA-Algorithmus verwenden, unter Verwendung einer Suche nach affinem Raum ("affine gap search") mit einem "gap open penalty" von –12 und einem "gap extension penalty" von –2 bestimmt. Komplementäre DNA-(cDNA-)Moleküle, Spezies-Homologe und Varianten von menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptiden sind ebenfalls menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolynucleotide.
  • Identifikation von Polynucleotid-Varianten und -Homologen
  • Varianten und Homologe der zuvor beschriebenen menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotide sind ebenfalls menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolynucleotide. Typischerweise können homologe menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolynucleotidsequenzen durch Hybridisierung von vermutlichen Polynucleotiden an bekannte menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolynucleotide unter stringenten Bedingungen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, identifiziert werden. Beispielsweise unter Verwendung der folgenden Waschbedingungen – 2 × SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat, pH 7,0), 0,1% SDS, bei Raumtemperatur zweimal, 30 min jeweils; dann 2 × SSC, 0,1% SDS; 50°C einmal, 30 min lang; dann 2 × SSC, bei Raumtemperatur zweimal, 10 min jeweils – können homologe Sequenzen identifiziert werden, die höchstens etwa 25–30% Basenpaar-Fehlpaarungen enthalten. Noch bevorzugter enthalten homologe Nucleinsäurestränge 15–25% Basenpaar-Fehlpaarungen, und noch bevorzugter 5–15% Basenpaar-Fehlpaarungen.
  • Spezies-Homologe der menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotide, die hierin offenbart sind, können auch durch Herstellen geeigneter Sonden oder Primer und durch Screenen von cDNA-Expressionsbibliotheken aus anderen Spezies, wie z.B. Mäusen, Affen oder Hefe, identifiziert werden. Menschliche Varianten von menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotiden können beispielsweise durch Screenen von menschlichen cDNA-Expressionsbibliotheken identifiziert werden. Es ist durchwegs bekannt, dass die Tm einer doppelsträngigen DNA mit jedem 1% geringerer Homologie um 1–1,5°C sinkt (Bonner et al., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973)). Varianten von menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotiden oder menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotiden von anderen Spezies können daher durch Hybridisierung eines vermutlichen homologen menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotids an ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 5 oder das Komplement davon, um ein Testhybrid zu bilden, identifiziert werden., Die Schmelztemperatur des Testhybrids wird mit der Schmelztemperatur eines Hybrids, das Polynucleotide mit perfekt komplementären Nucleotidsequenzen umfasst, verglichen, und die Anzahl oder der Prozentsatz an Basenpaar-Fehlpaarungen innerhalb des Testhybrids wird berechnet.
  • Nucleotidsequenzen, die an menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolynucleotide oder ihre Komplement nach stringenten Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen hybridisieren, sind ebenfalls menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolynucleotide. Stringente Waschbedingungen sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt und beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, 9.50–9.51 (1989), offenbart.
  • Typischerweise sollte für stringente Hybridisierungsbedingungen eine Kombination von Temperatur und Salzkonzentration gewählt werden, die etwa 12–20°C unter der berechneten Tm des zu untersuchenden Hybrids liegt. Die Tm eines Hybrids zwischen einem menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotid mit einer in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 5 gezeigten Nucleotidsequenz oder dem Komplement davon und einer Polynucleotidsequenz, die zumindest etwa 50%, vorzugsweise etwa 75, 90, 96 oder 98%, Identität mit einer jener Nucleotidsequenzen aufweist, kann beispielsweise unter Verwendung der Gleichung von Bolton & McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48, 1390 (1962), berechnet werden. Tm = 81,5°C – 16,6(log10[Na+]) + 0,41(%G + C) – 0,63 (%Formamid) – 600/I),worin I = Länge des Hybrids in Basenpaaren.
  • Stringente Waschbedingungen umfassen beispielsweise 4 × SSC bei 65°C oder 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C oder 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C. Hochstringente Waschbedingungen umfassen beispielsweise 0,2 × SSC bei 65°C.
  • Herstellung von Polynucleotiden
  • Ein natürlich vorkommendes menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolynucleotid kann frei von anderen Zellkomponenten wie beispielsweise Membrankomponenten, Proteinen und Lipiden isoliert werden. Polynucleotide können aus einer Zelle hergestellt und unter Verwendung herkömmlicher Nucleinsäure-Reinigungsverfahren isoliert werden oder unter Verwendung eines Amplifikationsverfahrens, wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion (PCR), oder unter Verwendung eines automatisierten Synthesegerätes synthetisiert werden. Verfahren zum Isolieren von Polynucleotiden sind Routineverfahren und auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Jedes beliebige dieser Verfahren zur Gewinnung eines Polynucleotids kann verwendet werden, um isolierte menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolynucleotide zu erhalten. Restriktionsenzyme und Sonden können beispielsweise verwendet werden, um Polynucleotidfragmente zu isolieren, die menschliche Prostasin-ähnliche Enzymnucleotidsequenzen umfassen. Isolierte Polynucleotide liegen in Präparaten vor, die frei oder zumindest zu 70, 80 oder 90% frei von anderen Molekülen sind.
  • Menschliche Prostasin-ähnliche Enzym-cDNA-Moleküle können mittels herkömmlicher molekularbiologischer Verfahren unter Verwendung von menschlicher Prostasin-ähnlicher Enzym-mRNA als Matrix gebildet werden. Menschliche Prostasin-ähnliche Enzym-cDNA-Moleküle können hiernach unter Verwendung molekularbiologischer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und in Nachschlagewerken wie z.B. Sambrook et al. (1989) offenbart sind, repliziert werden. Ein Amplifikationsverfahren, wie z.B. PCR, kann verwendet werden, um zusätzliche Kopien von Polynucleotiden der Erfindung unter Verwendung von entweder genomischer DNA oder cDNA als Matrix zu erhalten.
  • Alternativ dazu können chemische Syntheseverfahren verwendet werden, um menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolynucleotide zu synthetisieren. Die Degeneration des genetischen Codes ermöglicht die Synthese wechselnder Nucleotidsequenzen, die für ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid mit beispielsweise einer in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 6 gezeigten Aminosäuresequenz oder für eine biologisch aktive Variante davon kodieren.
  • Extension von Polynucleotiden
  • Verschiedene PCR-basierte Verfahren können verwendet werden, um die hierin offenbarten Nucleinsäuresequenzen zu verlängern, um Stromauf-Sequenzen wie z.B. Promotoren und Regulationselemente nachzuweisen. Restriktionsstellen-PCR beispielsweise verwendet Universalprimer, um eine unbekannte Sequenz, die zu einem bekannten Locus benachbart ist, zu finden (Sarkar, PCR Methods Applic. 2, 318–322 (1993)). Genomische DNA wird zuerst in Gegenwart eines Primers für eine Linker-Sequenz und eines für die bekannte Region spezifischen Primers amplifiziert. Die amplifizierten Sequenzen werden dann einem zweiten PCR-Durchgang mit demselben Linker-Primer und einem anderen spezifischen Primer, der innerhalb des ersten angeordnet ist, unterzogen. Die Produkte aus jedem PCR-Durchgang werden mit einer geeigneten RNA-Polymerase transkribiert und unter Verwendung von Umkehrtranskriptase sequenziert.
  • Inverse PCR kann auch verwendet werden, um Sequenzen unter Verwendung divergierender Primer auf der Basis einer bekannten Region zu amplifizieren oder zu verlängern (Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16, 8186 (1988)). Primer können unter Verwendung von im Handel erhältlicher Software, wie z.B. der Software OLIGO 4.06 Primer Analysis (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), so entworfen werden, dass sie 22–30 Nucleotide lang sind, einen GC-Gehalt von 50% oder mehr aufweisen und an die Target-Sequenz bei Temperaturen von etwa 68–72°C anellieren. Das Verfahren verwendet mehrere Restriktionsenzyme, um ein geeignetes Fragment in der bekannten Region eines Gens zu bilden. Das Fragment wird dann durch intramolekulare Ligation zirkularisiert und als PCR-Matrix verwendet.
  • Ein anderes Verfahren, das verwendet werden kann, ist Einfang-PCR, das PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten, die zu einer bekannten Sequenz in künstlicher menschlicher und Hefe-Chromosomen-DNA benachbart liegen, einbindet (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1, 111–119 (1991)). In diesem Verfahren können auch Mehrfach-Restriktionsenzymverdaue und -Ligationen verwendet werden, um eine genetisch veränderte, doppelsträngige Sequenz in ein unbekanntes Fragment des DNA-Moleküls zu platzieren, bevor PCR durchgeführt wird.
  • Ein anderes Verfahren, das verwendet werden kann, um unbekannte Sequenzen herauszufinden, ist jenes von Parker et al., Nucleic Acids Res. 19, 3055–3060 (1991). Darüber hinaus können PCR, verschachtelte Primer und PROMOTERFINDER-Bibliotheken (CLONTECH, Palo Alto, Kalifornien) verwendet werden, um Walking von genomischer DNA durchzuführen (CLONTECH, Palo Alto, Kalifornien). Dieses Verfahren umgeht den Bedarf, Bibliotheken zu screenen, und ist für das Finden von Intron/Exon-Verbindungen nützlich.
  • Zum Screenen auf cDNAs voller Länge werden vorzugsweise Bibliotheken vervendet, die nach dem Kriterium Größe selektiert wurden, sodass sie größere cDNAs umfassen. Nach dem Zufallsprinzip geprimte Bibliotheken werden bevorzugt, da sie mehrere Sequenzen enthalten, die die 5'-Regionen von Genen enthalten. Die Verwendung von zufällig geprimter Bibliothek kann in Situationen, in denen eine Oligo- d(T)-Bibliothek keine cDNA voller Länge ergibt, besonders bevorzugt werden. Genomische Bibliotheken können zur Sequenzverlängerung in 5'-nichttranskribierte Regulationsregionen nützlich sein.
  • Im Handel erhältliche Kapillarelektrophoresesysteme können verwendet werden, um die Größe zu analysieren oder um die Nucleotidsequenz von PCR oder Sequenzierungsprodukten zu bestätigen. Kapillarsequenzieren kann beispielsweise fließfähige Polymere für Elektrophoresetrennung, vier verschiedene Fluoreszenz-Farbstoffe (eines für jedes Nucleotid), die Laser-aktiviert werden, und die Detektion der emittierten Wellenlängen durch eine Ladungs-gekoppelte Kamera einsetzen. Output/Lichtintensität kann unter Verwendung von geeigneter Software (z.B. GENOTYPER und Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer) in ein elektrisches Signal umgewandelt werden, und das gesamte Verfahren, vom Laden der Proben bis hin zur Computeranalyse und der Präsentation elektronischer Daten, kann computergesteuert sein. Kapillarelektrophorese ist besonders zum Sequenzieren kleiner DNA-Stücke, die in geringfügigen Mengen in einer bestimmten Probe vorhanden sein können, zu bevorzugen.
  • Gewinnen von Polypeptiden
  • Menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide können beispielsweise durch Reinigung aus menschlichen Zellen, durch Expression von menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotiden oder durch direkte chemische Synthese gewonnen werden.
  • Proteinreinigung
  • Menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide können aus jeder beliebigen Zelle, die das Enzym exprimiert, einschließlich Wirtszellen, die mit menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzymexpressionskonstrukten transfiziert wurden, gereinigt werden. Menschliches fötales Herz stellt eine besonders nützliche Quelle für menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide dar. Ein gereinigtes menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid wird von anderen Verbindungen, die sich nor malerweise mit dem menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptid in der Zelle assoziieren, wie beispielsweise bestimmten Proteinen, Kohlenhydraten oder Lipiden, unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren getrennt. Solche Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Größenausschlusschromatographie, Ammoniumsulfatfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und präparative Gelelektrophorese. Ein Präparat aus gereinigten menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptiden ist zumindest zu 80% rein; vorzugsweise sind die Präparate zu 90%, 95% oder 99% rein. Reinheit der Präparate kann mithilfe jedes beliebigen bekannten Verfahrens, wie z.B. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, getestet werden.
  • Expression von Polynucleotiden
  • Um ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolynucleotid zu exprimieren, kann das Polynucleotid in einen Expressionsvektor insertiert werden, der die für Transkription und Translation der insertierten Kodiersequenz erforderlichen Elemente enthält. Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die Sequenzen, die für menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide kodieren, und geeignete Transkriptions- und Translations-Steuerungselemente enthalten. Diese Verfahren umfassen In-vitro-DNA-Rekombinationsverfahren, Syntheseverfahren und genetische In-vivo-Rekombination. Solche Verfahren werden beispielsweise in Sambrook et al. (1989) und in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1989), beschrieben.
  • Zahlreiche verschiedene Expressionsvektor/Wirtsysteme können verwendet werden, die Sequenzen enthalten und exprimieren, die für ein menschliches Prostasinähnliches Enzympolypeptid kodieren. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Mikroorganismen wie z.B. Bakterien, transformiert mit rekombinantem Bakteriophagen, Plasmid oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren; Hefe, transformiert mit Hefe-Expressionsvektoren, Insektenzellsystemen, infiziert mit Virus-Expressionsvektoren (z.B. Baculovirus), Pflanzenzellsysteme, transformiert mit Virus-Expres sionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (z.B. Ti oder pBR322-Plasmiden), oder Tierzellsysteme.
  • Die Kontrollelemente oder Regulationssequenzen sind jene nicht-translatierten Regionen des Vektors – Enhancer, Promotoren, 5'- und 3'-untranslatierte Regionen -, die mit Wirtszellproteinen wechselwirken, um Transkription und Translation durchzuführen. Solche Elemente können in ihrer Stärke und Spezifität variieren. Je nach dem verwendeten Vektorsystem und Wirt kann jede beliebige Anzahl an geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, verwendet werden. Wird beispielsweise in bakteriellen Systemen kloniert, so können induzierbare Promotoren wie z.B. der Hybrid-lacZ-Promotor des BLUESCRIPT-Phagemiden (Stratagene, LaJolla, Kalif.) oder pSPORT1-Plasmid (Life Technologies) und dergleichen verwendet werden. Der Baculovirus-Polyhedrin-Promotor kann in Insektenzellen verwendet werden. Promotoren oder Enhancer, die von den Genomen von Pflanzenzellen (z.B. Hitzeschock-, RUBISCO- und Speicherproteingene) oder von Pflanzenviren (z.B. virale Promotoren oder Leadersequenzen) abstammen, können in den Vektor kloniert werden. In Säugetierzellsystemen sind Promotoren aus Säugetiergenen oder aus Säugetierviren zu bevorzugen. Sofern es erforderlich ist, eine Zelllinie zu bilden, die Mehrfachkopien einer Nucleotidsequenz enthält, die für ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodiert, können auf SV40 oder EBV basierende Vektoren mit einem geeigneten selektierbaren Marker verwendet werden.
  • Bakterielle und Hefe-Expressionssysteme
  • In bakteriellen Systemen können zahlreiche Expressionsvektoren je nach der für das menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid beabsichtigten Verwendung ausgewählt werden. Besteht beispielsweise Bedarf an einer großen Menge an einem menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptid für die Induktion von Antikörpern, so können Vektoren verwendet werden, die hochgradige Expression von leicht zu reinigenden Fusionsproteinen steuern. Solche Vektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, multifunktionelle E.-coli-Klonier- und -Expressionsvektoren wie z.B. BLUESCRIPT (Stratagene). In einem BLUESCRIPT-Vektor kann eine Sequenz, die für das menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid kodiert, in den Vektor in Raster mit Sequenzen für das Amino-terminale Met und die darauf folgenden 7 Reste von β-Galactosidase ligiert werden, sodass das Hybridprotein produziert wird. pIN-Vektoren (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503–5509 (1989)) oder pGEX-Vektoren (Promega, Madison, Wis.) können auch verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können leicht aus lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Perlen, gefolgt von Elution in Gegenwart von freiem Glutathion, gereinigt werden. Proteine, die in solchen Systemen hergestellt werden, können so entworfen werden, dass sie Heparin-, Thrombin- oder Faktor-Xa-Protease-Spaltungsstellen umfassen, sodass das klonierte Polypeptid von Interesse aus der GST-Gruppierung beliebig freigesetzt werden kann.
  • In der Hefe Saccharomyces cerevisiae können zahlreiche Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren wie beispielsweise α-Faktor, Alkohol-Oxidase und PGH enthalten, verwendet werden. Berichte hierzu sind in Ausubel et al. (1989) und Grant et al., Methods Enzymol. 153, 516–544 (1987), zu finden.
  • Pflanzen- und Insekten-Expressionssysteme
  • Werden Pflanzen-Expressionsvektoren verwendet, so kann die Expression von Sequenzen, die für menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide kodieren, durch jegliche Anzahl an Promotoren gesteuert werden. Virale Promotoren wie z.B. 35S- und 19S-Promotoren von CaMV können alleine oder in Kombination mit der omega-Leadersequenz aus TMV verwendet werden (Takamatsu, EMBO J. 6, 307–311 (1987)). Alternativ dazu können Pflanzenpromotoren, wie z.B. kleine Untereinheiten von RUBISCO- oder Hitzeschock-Promotoren, verwendet werden (Coruzzi et al., EMBO J. 3, 1671–1680 (1984); Broglie et al., Science 224, 838–843 (1984); Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17, 85–105 (1991)). Diese Konstrukte können in Pflanzenzellen durch direkte DNA-Transformation oder durch Pathogen-vermittelte Transfektion eingeführt werden. Solche Verfahren werden in zahlreichen, allgemein erhältlichen Berichten beschrieben (z.B. Hobbs oder Murray, in: MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York, N.Y., 191–196 (1992)).
  • Eine Insektenzelle kann auch verwendet werden, um ein menschliches Prostasinähnliches Enzympolypeptid zu exprimieren. In einem solchen System wird beispielsweise "Autographa californica nuclear polyhedrosis virus" (AcNPV) als ein Vektor verwendet, um fremde Gene in Spodoptera-frugiperda-Zellen oder in Trichoplusia-Larven zu exprimieren. Sequenzen, die für menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide kodieren, können in eine nichtessentielle Region des Virus, z.B. in das Polyhedrin-Gen, kloniert und unter die Steuerung des Polyhedrin-Promotors gestellt werden. Erfolgreiche Insertion von menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptiden inaktiviert das Polyhedrin-Gen und produziert rekombinantes Virus, das kein Hüllprotein aufweist. Die rekombinanten Viren können dann verwendet werden, um S.-frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven zu infizieren, in denen menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide exprimiert werden können (Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 3224–3227 (1994)).
  • Säugetier-Expressionssysteme
  • Zahlreiche virusbasierte Expressionssysteme können verwendet werden, um menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide in Säugetierzellen zu exprimieren. Wird beispielsweise ein Adenovirus als ein Expressionsvektor verwendet, so können Sequenzen, die für menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide kodieren, in einen Adenovirus/Translationskomplex, der den späten, Promotor und dreiteilige Leadersequenz umfasst, ligiert werden. Insertion in eine nichtessentielle E1- oder E3-Region des viralen Genoms kann verwendet werden, um ein lebensfähiges Virus zu erhalten, das in der Lage ist, ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid in infizierten Wirtszellen zu exprimieren (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655–3659 (1984)). Sofern erwünscht, können Transkriptions-Enhancer wie z.B. der Rous-Sarkom-Virus-(RSV-)Enhancer verwendet werden, um Expression in Säugetierzellen zu steigern.
  • Menschliche künstliche Chromosome (HACs) können auch verwendet werden, um größere DNA-Fragmente zu liefern, die in einem Plasmid enthalten und exprimiert werden können. HACs von 6 M bis 10 M werden konstruiert und über herkömmliche Zuführungsverfahren (z.B. Liposomen, polykationische Aminopolymere oder Vesikel) zu Zellen zugeführt.
  • Spezifische Initiationssignale können auch verwendet werden, um wirksamere Translation von Sequenzen, die für menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide kodieren, zu erreichen. Solche Signale umfassen das ATG-Startcodon und benachbarte Sequenzen. In Fällen, in denen Sequenzen, die für ein menschliches Prostasinähnliches Enzympolypeptid kodieren, ihr Startcodon und Stromauf-Sequenzen in den geeigneten Expressionsvektor insertiert werden, können gegebenenfalls keine zusätzlichen Transkriptions- oder Translations-Kontrollsignale mehr erforderlich sein. In Fällen jedoch, in denen nur Kodiersequenz oder ein Fragment davon insertiert wird, sollten exogene Translations-Kontrollsignale (einschließlich des ATG-Startcodons) bereitgestellt werden. Das Startcodon sollte sich im korrekten Leseraster befinden, um Translation des gesamten Inserts sicherzustellen. Exogene Translationselemente und Startcodons können verschiedenen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, Ursprungs sein. Die Wirksamkeit von Expression kann durch die Einbindung von Enhancern, die für das bestimmte verwendete Zellsystem geeignet sind, gesteigert werden (siehe Schart et al., Results Probl. Cell Differ. 20, 125–162 (1994)).
  • Wirtszellen
  • Ein Wirtszellenstamm kann aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt werden, die Expression der insertierten Sequenzen zu modulieren oder das exprimierte menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid in erwünschter Weise zu verarbeiten. Solche Modifikationen des Polypeptids umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Ace tylierung, Carboxylierung, Glykosylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung. Post-translationales Verarbeiten, das eine "Präpro"-Form des Polypeptids spaltet, kann auch verwendet werden, um korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion zu erleichtern. Verschiedene Wirtszellen, die spezifische zelluläre Mechanismen und charakteristische Mechanismen für post-translationale Aktivitäten aufweisen (z.B. CHO, HeLa, MDCK, HEK293 und WI38), sind bei der American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) erhältlich und können ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und Verarbeitung des fremden Proteins sicherzustellen.
  • Stabile Expression wird für langfristige Produktion mit hohen Ausbeuten an rekombinanten Proteinen bevorzugt. Zelllinien beispielsweise, die menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide stabil exprimieren, können unter Verwendung von Expressionsvektoren transformiert werden, die virale Replikationsursprünge und/oder endogene Expressionselemente und ein selektierbares Markergen am selben oder an einem separaten Vektor enthalten. Nach der Einführung des Vektors können Zellen 1–2 Tage lang in einem angereicherten Medium wachsen gelassen werden, bevor sie in ein selektives Medium übertragen werden. Der Zweck des selektierbaren Markers ist, Resistenz gegenüber Selektion zu verleihen, und seine Gegenwart ermöglicht Wachstum und Gewinnung von Zellen, die die eingeführten menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzymsequenzen erfolgreich exprimieren. Resistente Klone von stabil transformierten Zellen können unter Verwendung von Gewebekulturverfahren, die für den Zelltyp geeignet sind, vermehrt werden. Siehe beispielsweise ANIMAL CELL CULTURE, R. I. Freshney (Hrsg.) (1986).
  • Jegliche Anzahl an Selektionssystemen kann verwendet werden, um transformierte Zelllinien zu gewinnen. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Herpes-Simplex-Virus-Thyimidinkinase- (Wigler et al., Cell 11, 223–232 (1977)) und Adenin-Phosphoribosyltransferase- (Lowy et al., Cell 22, 817–823 (1980)) Gene, die in tk–- bzw. aprt–-Zellen verwendet werden können. Auch kann Antimetabolit-, Antibiotika- oder Herbizid-Resistenz als Kriterium für die Selektion verwendet werden. dhfr beispielsweise verleiht Resistenz gegen Methotrexat (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567–3570 (1980)), npt verleiht Resistenz gegen Aminoglycoside, Neomycin und G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1–14 (1981)), und als und pat verleihen Resistenz gegen Chlorsulfuron bzw. Phosphinotricin-Acetyltransferase (Murray (1992), s.o.). Weitere selektierbare Gene wurden bereits beschrieben. trpB beispielsweise ermöglicht es Zellen, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden, oder hisD ermöglicht es Zellen, Histinol anstelle von Histidin zu verwenden (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047–8051 (1988)). Sichtbare Marker wie Anthocyanine, β-Glucuronidase und ihr Substrat GUS und Luciferase und ihr Substrat Luciferin können verwendet werden, um Transformanten zu identifizieren und um die Menge an vorübergehender oder stabiler Proteinexpression, die einem spezifischen Vektorsystem zuzuschreiben ist, zu quantifizieren (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55, 121–131 (1995)).
  • Nachweisen von Expression
  • Obwohl die Gegenwart von Markergenexpression darauf schließen lässt, dass das menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolynucleotid auch vorhanden ist, kann seine Gegenwart und Expression dennoch bestätigt werden müssen. Wird beispielsweise eine Sequenz, die für ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodiert, innerhalb einer Markergensequenz insertiert, so können transformierte Zellen, die Sequenzen enthalten, die für ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodieren, durch die Abwesenheit von Markergenfunktion identifiziert werden. Alternativ dazu kann ein Markergen in Tandem mit einer Sequenz, die für ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodiert, unter der Steuerung eines einzelnen Promotors angeordnet werden. Expression des Markergens als Reaktion auf Induktion oder Selektion weist üblicherweise auf Expression des menschlichen Prostasin ähnlichen Enzympolynucleotids hin.
  • Alternativ dazu können Wirtszellen, die ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolynucleotid enthalten und die ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid exprimieren, durch zahlreiche verschiedene Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, identifiziert werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht be schränkt auf, DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierungen und Protein-Biotest- oder -Immuntestverfahren, die Membran-, Lösungs- oder Chip-basierte Techniken zum Nachweisen und/oder zur Quantifizierung von Nucleinsäure oder Protein umfassen. Die Gegenwart einer Polynucleotidsequenz, die für ein menschliches Prostasinähnliches Enzympolypeptid kodiert, kann beispielsweise durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder -Amplifikation unter Verwendung von Sonden oder Fragmenten oder Fragmenten von Polynucleotiden, die für ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodieren, nachgewiesen werden. Auf Nucleinsäureamplifikation basierende Tests umfassen die Verwendung von Oligonucleotiden, die aus Sequenzen ausgewählt sind, die für ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodieren, um Transformanten nachzuweisen, die ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolynucleotid enthalten.
  • Zahlreiche verschiedene Arbeitsvorschriften zur Detektion und Messung der Expression eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids unter Verwendung entweder von polyklonalen oder von monoklonalen Antikörpern, die für das Polypeptid spezifisch sind, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), Radioimmuntest (RIA) und Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren (FACS). Ein monoklonal-basierter Zweistellen-Immuntest unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die mit zwei nicht-störenden Epitopen an einem menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptid reaktiv sind, kann verwendet werden, oder ein kompetitiver Bindungstest kann verwendet werden. Diese und andere Tests werden in Hampton et al., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minn. (1990), und in Maddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211–1216 (1983), beschrieben.
  • Zahlreiche verschiedene Markierungen und Konjugationsverfahren sind Fachleuten bekannt und können in verschiedenen Nucleinsäure- und Aminosäuretests verwendet werden. Mittel zur Herstellung von markierten Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zum Nachweisen von Sequenzen, die mit Polynucleotiden verwandt sind, die für menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide kodieren, umfassen Oligomarkierung, Nick-Translation, End-Markierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids. Alternativ dazu können Sequenzen, die für ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodieren, in einen Vektor zur Herstellung einer mRNA-Sonde kloniert werden. Solche Vektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, sind im Handel erhältlich und können verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro durch Zusetzen von markierten Nucleotiden und einer geeigneten RNA-Polymerase wie z.B. T7, T3 oder SP6 zu synthetisieren. Diese Verfahren können unter Verwendung einer Vielzahl von handelsüblichen Sets (Amersham Pharmacia Biotech, Promega, und US Biochemical) durchgeführt werden. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen, die für die leichtere Durchführung der Detektion verwendet werden können, umfassen Radionuclide, Enzyme und fluoreszierende, chemilumineszierende oder chromogene-Mittel sowie Substrate, Co-Faktoren, Inhibitoren, magnetische Teilchen und dergleichen.
  • Expression und Reinigung von Polypeptiden
  • Wirtszellen, die mit Nucleotidsequenzen transformiert sind, die für ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodieren, können unter Bedingungen kultiviert werden, die zur Expression und Gewinnung des Proteins aus der Zellkultur geeignet sind. Das von einer transformierten Zelle produzierte Polypeptid kann, je nach verwendeter Sequenz und/oder verwendetem Vektor, sekretiert werden oder intrazellulär enthalten sein. Fachleuten wird ersichtlich sein, dass Expressionsvektoren, die Polynucleotide enthalten, die für menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide kodieren, entworfen werden können, um Signalsequenzen zu enthalten, welche Sekretion von löslichen menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptiden durch eine prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran steuern oder die Membraninsertion von membrangebundenem menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzympolypeptid steuern.
  • Wie zuvor erläutert können andere Konstruktionen verwendet werden, um eine Sequenz, die für ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodiert, an eine Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptiddomäne kodiert, die die Reinigung von löslichen Proteinen erleichtert, zu binden. Solche die Reinigung erleichternde Domä nen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, metallchelatbildende Peptide wie z.B. Histidin-Tryptophan-Module, die Reinigung an immobilisierten Metallen ermöglichen, Protein-A-Domänen, die Reinigung an immobilisiertem Immunglobulin ermöglichen, und die Domäne, die im FLAGS-Extension/Affinität-Reinigungssystem (Immunex Corp., Seattle, Wash.) verwendet wird. Einbindung spaltbarer Linker-Sequenzen wie beispielsweise jener, die für Factor Xa oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA) spezifisch sind, zwischen Reinigungsdomäne und dem menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptid kann ebenfalls verwendet werden, um Reinigung zu erleichtern. Ein solcher Expressionsvektor sorgt für die Expression eines Fusionsproteins, das ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid und 6 Histidinreste, die einer Thioredoxin- oder einer Enterokinase-Spaltungsstelle vorangehen, enthält. Die Histidinreste erleichtern Reinigung durch IMAC (Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Metallion, wie in Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3, 263–281 (1992), beschrieben), während die Enterokinase-Spaltungsstelle ein Mittel zur Reinigung des menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids aus dem Fusionsprotein bereitstellt. Vektoren, die Fusionsproteine enthalten, sind in Kroll et al., DNA Cell Biol. 12, 441–453 (1993), offenbart.
  • Chemische Synthese
  • Sequenzen, die für ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodieren, können als Ganzes oder teilweise unter Verwendung chemischer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, synthetisiert werden (siehe Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215–223 (1980); Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225–232 (1980)). Alternativ dazu kann ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid selbst unter Verwendung chemischer Verfahren produziert werden, um seine Aminosäuresequenz zu synthetisieren, beispielsweise durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963); Roberge et al., Science 269, 202–204 (1995)). Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller Verfahren oder durch Automation durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung von Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer) erfolgen.
  • Gegebenenfalls können Fragmente von menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptiden separat synthetisiert und unter Verwendung chemischer Verfahren, um ein Molekül voller Länge zu bilden, kombiniert werden.
  • Das neu synthetisierte Peptid kann durch präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (z.B. Creighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman & Co., New York, N.Y. (1983)) im Wesentlichen gereinigt werden. Die Zusammensetzung eines synthetischen menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids kann durch Aminosäureanalyse oder durch Sequenzieren (z.B. durch das Edman-Abbauverfahren; siehe Creighton, s.o.) bestätigt werden. Darüber hinaus kann jeder beliebige Abschnitt der Aminosäuresequenz des menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids während der direkten Synthese verändert und/oder unter Verwendung chemischer Verfahren mit Sequenzen aus anderen Proteinen kombiniert werden, um eine Polypeptidvariante oder ein Fusionsprotein zu bilden.
  • Herstellung von veränderten Polypeptiden
  • Fachleuten wird ersichtlich sein, dass es von Vorteil sein kann, Nucleotidsequenzen, die für menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodieren, herzustellen, die nicht in der Natur vorkommende Codons aufweisen. Codons beispielsweise, die von einem bestimmten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt bevorzugt werden, können ausgewählt werden, um das Protein-Expressionsniveau zu steigern oder um ein RNA-Transkript zu bilden, das wünschenswerte Eigenschaften aufweist, wie beispielsweise eine Halbwertszeit, die länger ist als jene eines Transkripts, das aus der natürlich vorkommenden Sequenz gebildet wird.
  • Die hierin offenbarten Nucleotidsequenzen können unter Verwendung von im Allgemeinen auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren zur Änderung von Kodiersequenzen für menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid für zahlreiche verschiedene Zwecke gentechnisch verändert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Änderungen, die das Klonieren, das Verarbeiten und/oder die Ex pression des Polypeptids oder des mRNA-Produkts modifizieren. DNA-Neukombination durch Zufallsfragmentierung und PCR-Neuanordnung von Genfragmenten und synthetischen Oligonucleotiden können verwendet werden, um die Nucleotidsequenzen gentechnisch zu verändern. Ortsgerichtete Mutagenese beispielsweise kann verwendet werden, um neue Restriktionsstellen zu insertieren, Glykosylierungsmuster zu ändern, Codonpräferenz zu modifizieren, Spleißvarianten zu bilden, Mutationen einzuführen und dergleichen.
  • Antikörper
  • Jeder beliebige Typ von Antikörper der nach dem Stand der Technik bekannt ist, kann gebildet werden, sodass er sich dann spezifisch an ein Epitop eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids bindet. "Antikörper" wie hierin verwendet umfasst intakte Immunglobulinmoleküle sowie Fragmente davon, wie z.B. Fab, F(ab')2 und Fv, die in der Lage sind, sich an ein Epitop eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids zu binden. Typischerweise sind zumindest 6, 8, 10 oder 12 zusammenhängende Aminosäuren erforderlich, um ein Epitop zu bilden. Epitope jedoch, die nicht-zusammenhängende Aminosäuren einbinden, können mehr, z.B. zumindest 15, 25 oder 50, Aminosäuren erfordern.
  • Ein Antikörper, der sich spezifisch an ein Epitop eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids bindet, kann therapeutisch sowie in immunchemischen Tests, wie z.B. Western-Blots, ELISAs, Radioimmuntests, immunhistochemischen Tests, Immunfällungen oder anderen immunchemischen Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verwendet werden. Verschiedene Immuntests können verwendet werden, um Antikörper zu identifizieren, die die erwünschte Spezifität aufweisen. Zahlreiche Arbeitsvorschriften für kompetitive Bindung oder immunoradiometrische Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt. Solche Immuntests umfassen typischerweise die Messung von Komplexbildung zwischen einem Immunogen und einem Antikörper, der sich spezifisch an das Immunogen bindet.
  • Typischerweise liefert ein Antikörper, der sich spezifisch an ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid bindet, ein Detektionssignal, das zumindest 5-, 10- oder 20-mal höher ist als ein Detektionssignal, das mit anderen Proteinen erreicht wird, wenn sie in einem immunchemischen Test verwendet werden. Vorzugsweise detektieren Antikörper, die sich spezifisch an menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide binden, keine anderen Proteine in immunchemischen Tests und können ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid aus Lösung Immunfällen.
  • Menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide können verwendet werden, um ein Säugetier wie z.B. eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Meerschweinchen, einen Affen oder einen Menschen zu immunisieren, um polyklonale Antikörper zu bilden. Sofern erwünscht, kann ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid an ein Trägerprotein, wie beispielsweise Rinderserumalbumin, Thyroglobulin und Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, konjugiert sein. Je nach der Wirtsspezies können verschiedene Adjuvanzien verwendet werden, um die immunologische Antwort zu steigern. Solche Adjuvanzien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Freundsches Adjuvans, Mineralgele (z.B. Aluminiumhydroxid) und oberflächenaktive Substanzen (z.B. Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin und Dinitrophenol). Unter den bei Menschen eingesetzten Adjuvanzien sind BCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum besonders zweckdienlich.
  • Monoklonale Antikörper, die sich spezifisch an ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid binden, können unter Verwendung jedes beliebigen Verfahrens hergestellt werden, das für die Bildung von Antikörpermolekülen durch zusammenhängende Zelllinien in Kultur sorgt. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, das Hybridomverfahren, das menschliche B-Zellen-Hybridomverfahren und das EBV-Hybridomverfahren (Kohler et al., Nature 256, 495–497 (1985); Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31–42 (1985); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026–2030 (1983); Cole et al., Mol. Cell Biol. 62, 109–120 (1984)).
  • Darüber hinaus können Verfahren verwendet werden, die zur Herstellung von "chimären Antikörpern", zum Spleißen von Maus-Antikörper-Genen an menschliche Antikörpergene, um ein Molekül mit geeigneter Antigen-Spezifität und biologischer Aktivität zu erhalten, entwickelt wurden (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851–6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312, 604–608 (1984); Takeda et al., Nature 314, 452–454 (1985)). Monoklonale und andere Antikörper können auch "humanisiert" werden, um einen Patienten davor zu schützen, eine Immunantwort gegen den Antikörper zu entwickeln, wenn dieser therapeutisch eingesetzt wird. Solche Antikörper können auf Sequenzniveau menschlichen Antikörpern ausreichend ähnlich sein, um direkt in Therapien verwendet zu werden, oder können der Änderung einiger weniger maßgeblicher Reste bedürfen. Sequenzunterschiede zwischen NagetierAntikörpern und menschlichen Sequenzen können durch Ersetzen von Resten, die sich von jenen in den menschlichen Sequenzen unterscheiden, durch ortsgerichtete Mutagenese einzelner Reste oder durch Rasterbildung gesamter komplementaritäts-bestimmender Regionen minimiert werden. Alternativ dazu können humanisierte Antikörper unter Verwendung von Rekombinationsverfahren wie in der GB2188638B beschrieben gebildet werden. Antikörper, die sich spezifisch an ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid binden, können Antigen-Bindungsstellen enthalten, die entweder teilweise oder vollständig humanisiert sind, wie in der US 5.565.332 offenbart ist.
  • Alternativ dazu können Verfahren, die für die Bildung von einkettigen Antikörpern beschrieben wurden, unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren adaptiert werden, um einkettige Antikörper zu bilden, die sich spezifisch an menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide binden. Antikörper mit verwandter Spezifität, jedoch mit eigener idiotypischer Zusammensetzung, können durch Ketten-Neukombination aus Zufallskombinations-Immunglobulinbibliotheken gebildet werden (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120–11123 (1991)).
  • Einkettige Antikörper können auch mittels eines DNA-Amplifikationsverfahrens wie beispielsweise PCR unter Verwendung von Hybridom-cDNA als Matrix (Thirion et al., Eur. J. Cancer Prev. 5, 507–511 (1996)) konstruiert werden. Einkettige Antikörper können mono- oder bispezifisch sein und können zweiwertig oder vierwertig sein. Die Konstruktion von vierwertigen bispezifischen einkettigen Antikörpern wird beispielsweise in Coloma & Morrison, Nat. Biotechnol. 15, 159–163 (1997), gelehrt. Die Konstruktion von zweiwertigen bispezifischen einkettigen Antikörpern wird in Mallender & Voss, J. Biol. Chem. 269, 199–206 (1994), gelehrt.
  • Eine Nucleotidsequenz, die für einen einkettigen Antikörper kodiert, kann unter Verwendung von manueller oder automatisierter Nucleotidsynthese konstruiert, unter Verwendung von Standard-DNA-Rekombinationsverfahren in ein Expressionskonstrukt kloniert und in eine Zelle eingeführt werden, um die Kodiersequenz zu exprimieren, wie nachstehend beschrieben. Alternativ dazu können einkettige Antikörperdirekt unter Verwendung von beispielsweise Verfahren mit filamentösen Phagen gebildet werden (Verhaar et al., Int. J. Cancer 61, 497–501 (1995); Nicholls et al., J. Immunol. Meth. 165, 81–91 (1993)).
  • Antikörper, die sich spezifisch an menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide binden, können auch durch Induktion von In-vivo-Produktion in der Lymphozytenpopulation oder durch Screenen von Immunglobulinbibliotheken oder Gruppen von hoch-spezifischen Bindungsreagenzien, wie in der Literatur offenbart, gebildet werden (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833–3837 (1989); Winter et al., Nature 349, 293–299 (1991)).
  • Auch andere Typen von Antikörpern können konstruiert und therapeutisch verwendet werden. Chimäre Antikörper beispielsweise können wie in der WO 93/03151 offenbart konstruiert werden. Bindungsproteine, die von Immunglobulinen abgeleitet sind und die mehrwertig und multispezifisch sind, wie z.B. die in der WO 94/13804 beschriebenen "Diabodies", können ebenfalls hergestellt werden.
  • Antikörper können mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, gereinigt werden. Antikörper können beispielsweise durch Leiten über eine Säule, an die ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid gebunden ist, affinitäts gereinigt werden. Die gebundenen Antikörper können dann aus der Säule unter Verwendung eines Puffers mit hoher Salzkonzentration eluiert werden.
  • Antisense-Oligonucleotide
  • Antisense-Oligonucleotide sind Nucleotidsequenzen, die komplementär zu einer spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz sind. Nachdem sie in eine Zelle eingeführt wurden, kombinieren sich die komplementären Nucleotide mit natürlichen Sequenzen, die durch die Zelle produziert wurden, um Komplexe zu bilden und entweder Transkription oder Translation zu blockieren. Vorzugsweise ist ein Antisense-Oligonucleotid zumindest 11 Nueleotide lang, kann jedoch zumindest 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 oder mehr Nucleotide lang sein. Längere Sequenzen können auch verwendet werden. Antisense-Oligonucleotidmoleküle können in einem DNA-Konstrukt bereitgestellt und in eine Zelle eingeführt werden, wie zuvor beschrieben, um die Konzentration an menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzym-Gen-Produkten in der Zelle zu reduzieren.
  • Antisense-Oligonucleotide können Desoxyribonucleotide, Ribonucleotide oder eine Kombination dieser beiden sein. Oligonucleotide können manuell oder durch ein automatisiertes Synthesegerät synthetisiert werden, durch kovalentes Binden des 5'-Endes eines Nucleotids an das 3'-Ende eines anderen Nucleotids mit Nicht-Phosphodiester-Internucleotidbindungen wie z.B. Alkylphosphonaten, Thiophosphaten, Dithiophosphaten, Alkylthiophosphaten, Alkylphosphonaten, Phosphoramidaten, Phosphatestern, Carbamaten, Acetamidat, Carboxymethylestern, Carbonaten und Phosphattriestern. Siehe Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 1–8 (1994); Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1–72 (1994); Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543–583 (1990).
  • Modifikationen der Expression von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzymgen kann durch Entwerfen von Antisense-Oligonucleotiden erreicht werden, die Duplices mit Kontroll-, 5'- oder Regulationsregionen des menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzymgens bilden. Oligonucleotide, die aus der Transkriptionsinitiationsstelle, z.B. zwischen den Positionen –10 und +10 von der Startstelle aus, stammen, werden be vorzugt. Auf ähnliche Weise kann Inhibition unter Verwendung der "Tripelhelix"-Basenpaarungs-Methode erreicht werden. Tripelhelix-Paarung ist nützlich, da sie Inhibition der Fähigkeit der Doppelhelix, sich ausreichend für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder Chaperonen zu öffnen, verursacht. Therapeutische Ansätze unter Verwendung von Triplex-DNA wurden bereits in der Literatur beschrieben (z.B. Gee et al., in: Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y. (1994)). Ein Antisense-Oligonucleotid kann auch entworfen werden, um Translation von mRNA durch das Unterbinden von Bindung des Transkripts an Ribosomen zu blockieren.
  • Präzise Komplementarität ist für erfolgreiche Komplexbildung zwischen einem Antisense-Oligonucleotid und der komplementären Sequenz eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotids nicht erforderlich. Antisense-Oligonucleotide, die beispielsweise 2, 3, 4 oder 5 oder mehr Abschnitte zusammenhängender Nucleotide umfassen, die präzise komplementär zu einem menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotid sind, wobei jeder durch einen Abschnitt zusammenhängender Nucleotide, die zu benachbarten menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzymnucleotiden nicht komplementär sind, getrennt ist, können ausreichende Targeting-Spezifität für menschliche Prostasin-ähnliche Enzym-mRNA bereitstellen. Vorzugsweise weist jeder Abschnitt zusammenhängender komplementärer Nucleotide eine Länge von zumindest 4, 5, 6, 7 oder 8 oder mehr Nucleotiden auf. Nicht-komplementäre, dazwischenliegende Sequenzen sind vorzugsweise 1, 2, 3 oder 4 Nucleotide lang. Fachleute können den berechneten Schmelzpunkt eines Antisense-Sense-Paars problemlos verwenden, um den Grad an Fehlpaarungen, der zwischen einem bestimmten Antisense-Oligonucleotid und einer bestimmten Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotidsequenz toleriert wird, zu bestimmen.
  • Antisense-Oligonucleotide können ohne Beeinflussung ihrer Fähigkeit, an ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolynucleotid zu hybridisieren, modifiziert werden. Diese Modifikationen können innerhalb oder an einem oder beiden Enden des Antisense-Moleküls erfolgen. Internucleosidphosphatbindungen können durch Hinzufügen von Cholesterin- oder Diamingruppierungen mit variierender Anzahl an Kohlenstoffresten zwischen den Aminogruppen und der terminalen Ribose modifiziert werden. Modifizierte Basen und/oder Zucker, wie z.B. Arabinose anstelle von Ribose, oder ein 3',5'-substituiertes Oligonucleotid, in dem die 3'-Hydroxylgruppe oder die 5'-Phosphatgruppe substituiert ist, können ebenfalls in einem modifizierten Antisense-Oligonucleotid verwendet werden. Diese modifizierten Oligonucleotide können durch Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, hergestellt werden. Siehe z.B. Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10, 152–158 (1992); Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543–584 (1990); Uhlmann et al., Tetrahedron Lett. 215, 3539–3542 (1987).
  • Ribozyme
  • Ribozyme sind RNA-Moleküle mit katalytischer Aktivität. Siehe z.B. Cech, Science 236, 1532–1539 (1987); Cech, Ann. Rev. Biochem. 59, 543–568 (1990); Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 605–609 (1992); Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510–515 (1996). Ribozyme können verwendet werden, um Genfunktion durch Spalten einer RNA-Sequenz zu inhibieren, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist (z.B. Haseloff et al., US-Patent 5.641.673). Der Mechanismus von Ribozymwirkung umfasst sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an komplementäre Target-RNA, gefolgt von endonukleolytischer Spaltung. Beispiele umfassen gentechnisch veränderte Hammerkopfmotivribozym-Moleküle, die endonukleolytische Spaltung von spezifischen Nucleotidsequenzen spezifisch und wirksam katalysieren können.
  • Die Kodiersequenz eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotids kann verwendet werden, um Ribozyme zu bilden, die sich spezifisch an mRNA, die aus dem menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotid transkribiert ist, binden. Verfahren zum Entwerfen und Konstruieren von Ribozymen, die andere RNA-Moleküle in trans auf eine hoch-sequenzspezifischen Weise spalten können, wurden auf dem Gebiet der Erfindung bereits entwickelt und beschrieben (siehe Haseloff et al., Nature 334, 585–591 (1988)). Die Spaltungsaktivität von Ribozymen kann beispielsweise durch gentechnisches Verändern einer einzelnen "Hybridisierungs"- Region in das Ribozym auf spezifische RNAs gerichtet werden. Die Hybridisierungsregion enthält eine Sequenz, die komplementär zur Target-RNA ist und somit spezifisch mit dem Target hybridisiert (siehe beispielsweise Gerlach et al., Enzympolypeptid 321.201).
  • Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen innerhalb eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzym-RNA-Targets können durch Scannen des Target-Moleküls auf Ribozym-Spaltungsstellen, die die folgenden Sequenzen umfassen, identifiziert werden: GUA, GUU und GUC. Nachdem sie identifiziert wurden, können kurze RNA-Sequenzen mit zwischen 15 und 20 Ribonucleotiden, die der Region der Target-RNA entsprechen, die die Spaltungsstelle enthält, bezüglich sekundärer struktureller Eigenschaften bewertet werden, die das Target funktionsunfähig machen können. Die Eignung vermutlicher menschlicher Prostasin-ähnlicher Enzym-RNA-Targets kann auch durch Testen der Verfügbarkeit für Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden unter Verwendung von Ribonucleaseschutztests bewertet werden. Längere komplementäre Sequenzen können verwendet werden, um die Affinität der Hybridisierungssequenz für das Target zu erhöhen. Die Hybridisierungs- und Spaltungsregionen des Ribozyms können vollständig verbunden werden, sodass bei Hybridisierung an die Target-RNA durch die komplementären Regionen die katalytische Region des Ribozyms das Target spalten kann.
  • Ribozyme können in Zellen als Teil eines DNA-Konstrukts eingeführt werden. Mechanische Verfahren, wie beispielsweise Mikroinjektion, Liposomen-vermittelte Transfektion, Elektroporation oder Calciumphosphatfällung können verwendet werden, um ein Ribozym-hältiges DNA-Konstrukt in Zellen einzuführen, in denen erwünscht wird, die Expression von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym zu verringern. Alternativ dazu, sofern erwünscht wird, dass die Zellen das DNA-Konstrukt stabil beibehalten, kann das Konstrukt auf einem Plasmid bereitgestellt und als ein separates Element oder integriert in das Genom der Zellen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, gehalten werden. Ein für Ribozym kodierendes DNA-Konstrukt kann Transkriptionsregulationselemente, wie z.B. ein Promotorelement, ein Enhan cer- oder UAS-Element und ein Transkriptionsterminationssignal, zur Steuerung von Transkription von Ribozymen in den Zellen umfassen.
  • Wie in Haseloff et al., US-Patent 5.641.673, gelehrt wird, können Ribozyme so gentechnisch verändert werden, dass Ribozymexpression als Reaktion auf Faktoren eintritt, die Expression eines Target-Gens induzieren. Ribozyme können auch gentechnisch verändert werden, um eine zusätzliche Regulationsebene bereitzustellen, sodass Zerstörung von mRNA nur eintritt, wenn sowohl ein Ribozym als auch ein Target-Gen in den Zellen induziert werden.
  • Differentiell exprimierte Gene
  • Hierin beschrieben sind Verfahren zur Identifikation von Genen, deren Produkte mit menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym wechselwirken. Solche Gene können Gene darstellen, die bei Störungen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, COPD, ZNS-Störungen und Krebs, differentiell exprimiert werden. Weiters können solche Gene Gene darstellen, die als Reaktion auf Manipulationen, die für den Fortschritt oder die Behandlung solcher Krankheiten relevant sind, differentiell reguliert werden. Darüber hinaus können solche Gene eine zeitlich modulierte Expression, die in verschiedenen Stadien der Gewebe- oder Organismusentwicklung erhöht oder reduziert ist, aufweisen. Die Expression eines differentiell exprimierten Gens kann auch unter Kontrollbedingungen im Vergleich zu Versuchsbedingungen moduliert werden. Weiters kann das menschliche Prostasin-ähnliche Enzymgen oder -Genprodukt selbst auf differentielle Expression getestet werden.
  • Der Grad des Expressionsunterschiedes zwischen einem normalen und einem erkrankten Zustand muss nur groß genug sein, dass er mittels herkömmlicher Charakterisierungsverfahren wie beispielsweise differentieller Display-Verfahren sichtbar gemacht werden kann. Andere solche Standard-Charakterisierungsverfahren, durch die Expressionsunterschiede sichtbar gemacht werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, quantitative RT (Reverse-Transkriptase), PCR und Northern-Analyse.
  • Identifikation von differentiell exprimierten Genen
  • Um differentiell exprimierte Gene zu identifizieren, wird Gesamt-RNA oder, vorzugsweise, mRNA aus Geweben von Interesse isoliert. RNA-Proben werden beispielsweise aus Geweben von Versuchsobjekten und aus entsprechenden Geweben aus Kontrollobjekten entnommen. Jegliches RNA-Isolationsverfahren, das nicht gegen die Isolierung von mRNA selektiert, kann zur Reinigung solcher RNA-Proben verwendet werden. Siehe beispielsweise Ausubel et al. (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1987–1993. Zahlreiche Gewebeproben können unter Verwendung bekannter Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, beispielsweise mittels des Einschritt-RNA-Isolationsverfahrens von Chomczynski, US-Patent Nr. 4.843.155, leicht verarbeitet werden.
  • Transkripte innerhalb der gesammelten RNA-Proben, die von differentiell exprimierten Genen produzierte RNA darstellen, werden mittels Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, identifiziert. Sie umfassen beispielsweise differentielles Screenen (Tedder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 208–212 (1988)), Subtraktionshybridisierung (Hedrick et al., Nature 308, 149–153; Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2825 (1984)) und differentielles Display (Liang & Pardee, Science 257, 967–971 (1992); US-Patent 5.262.311) und Mikrotests.
  • Informationen aus der differentiellen Expression können selbst auf relevante Verfahren für die Behandlung von Störungen, die das menschliche Prostasin-ähnliche Enzym einbinden, schließen lassen. Die Behandlung kann beispielsweise eine Modulation von Expression der differentiell exprimierten Gene und/oder des für das menschliche Prostasin-ähnliche Enzym kodierenden Gens umfassen. Die Information aus der differentiellen Expression kann anzeigen, ob die Expression oder Aktivität des differentiell exprimierten Gens oder Genprodukts oder des menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzymgens oder -Genprodukts hochreguliert oder herabreguliert ist.
  • Screening-Verfahren
  • Die Erfindung stellt Tests zum Screenen von Testverbindungen bereit, die sich an ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid oder ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolynucleotid binden oder deren Aktivität modulieren. Eine Testverbindung bindet sich vorzugsweise an ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid oder Enzympolynucleotid. Noch bevorzugter reduziert oder erhöht eine Testverbindung menschliches Prostasin-ähnliches um zumindest etwa 10%, vorzugsweise etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100%, im Vergleich zu Werten in Abwesenheit der Testverbindung.
  • Testverbindungen
  • Testverbindungen können Pharmazeutika sein, die auf dem Gebiet der Erfindung bereits bekannt sind, oder können Verbindungen sein, für die bisher noch nicht bekannt ist, dass sie pharmakologische Aktivität aufweisen. Die Verbindungen können in der Natur vorkommen oder im Labor entworfen werden. Sie können aus Mikroorganismen, Tieren oder Pflanzen isoliert sein und können rekombinant gebildet oder mittels chemischer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, synthetisiert werden. Sofern erwünscht, können Testverbindungen unter Verwendung eines beliebigen der zahlreichen Kombinationsbibliotheksverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, biologische Bibliotheken, räumlich adressierbare parallele Festphasen- oder Lösungsphasen-Bibliotheken, synthetische Bibliotheksverfahren, die Dekonvolution erfordern, das "One-Bead-One-Compound"-Bibliotheksverfahren und synthetische Bibliotheksverfahren unter Verwendung von Affinitätschromatographieselektion, gewonnen werden. Der biologische Bibliotheksansatz ist auf Polypeptidbibliotheken limitiert, während die anderen vier Ansätze für Polypeptid-, Nicht-Peptid-Oligomer-Bibliotheken oder Bibliotheken kleiner Moleküle von Verbindungen einsetzbar sind. Siehe Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145 (1997).
  • Verfahren zur Synthese molekularer Bibliotheken sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (siehe beispielsweise DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678 (1994); Cho et al., Science 261, 1303 (1993); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233 (1994)). Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung (siehe z.B. Houghten, BioTechniques 13, 412–421 (1992)) oder auf Perlen (Lam, Nature 354, 82–84 (1991)), Plättchen (Fodor, Nature 364, 555–556 (1993)), Bakterien oder Sporen (Ladner, US-Patent Nr. 5.223.409), Plasmiden (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1865–1869 (1992)) oder Phagen (Scott & Smith; Science 249, 386–390 (1990); Devlin, Science 249, 404–406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378–6382 (1990); Felici, J. Mol. Biol. 222, 301–310 (1991); und Ladner, US-Patent Nr. 5.223.409) vorhanden sein.
  • Screening mit hohem Durchsatz
  • Testverbindungen können unter Verwendung von Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz auf ihre Fähigkeit gescreent werden, sich an menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide oder Enzympolynucleotide zu binden oder Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym oder Expression von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzymgen zu beeinflussen. Unter Verwendung von Screening mit hohem Durchsatz können viele einzelne Verbindungen gleichzeitig getestet werden, sodass zahlreiche Testverbindungen rasch gescreent werden können. Die am häufigsten eingesetzten Verfahren verwenden 96-Well-Mikrotiterplatten. Die Wells der Mikrotiterplatten erfordern typischerweise Testvolumina in einem Bereich von 50 bis 500 μl. Zusätzlich zu den Platten sind zahlreiche Instrumente, Materialien, Pipetten, Robotertechniken, Plattenwäscher und Plattenleser im Handel erhältlich, die für das 96-Well-Format geeignet sind.
  • Alternativ dazu können "Tests mit freien Formaten" oder Tests, die keine physikalische Barriere zwischen den Proben aufweisen, verwendet werden. Ein Test beispielsweise, der Pigmentzellen (Melanozyten) in einem einfachen homogenen Test für kombinatorische Peptidbibliotheken verwendet, wird von Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19, 1614–1618 (1994), beschrieben. Die Zellen werden in Petri-Schalen unter Agarose gegeben, dann werden Perlen, die kombinatorische Verbindungen tragen, auf die Oberfläche der Agarose gegeben. Die kombinatorischen Verbindungen werden teilweise von der Perlen freigesetzt. Aktive Verbindungen können als dunkle Pigmentflecken sichtbar gemacht werden, da, weil die Verbindungen lokal in die Gelmatrix diffundieren, die aktiven Verbindungen eine Farbveränderung der Zellen verursachen.
  • Ein anderes Beispiel für einen Test mit freien Formaten wird von Chelsky in "Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches", vorgetragen in der First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Philadelphia, Pa. (7.–10. November 1995), beschrieben. Chelsky platzierte einen einfachen homogenen Enzymtest für Carbonatdehydrase in ein Agarosegel hinein, sodass das Enzym im Gel eine Farbveränderung über das gesamte Gel hinweg verursachen würde. Hiernach wurden Perlen, die kombinatorische Verbindungen über einen Photolinker trugen, in das Gel platziert, und die Verbindungen wurden durch UV-Licht teilweise freigesetzt. Verbindungen, die das Enzym inhibierten, wurden als lokale Inhibitionszonen mit geringerer Farbveränderung beobachtet.
  • Wiederum ein anderes Beispiel wird von Salmon et al., Molecular Diversity 2, 57–63 (1996), beschrieben. In diesem Beispiel wurden kombinatorische Bibliotheken auf Verbindungen gescreent, die zytotoxische Wirkungen auf Krebszellen, die in Agar wuchsen, zeigten.
  • Ein anderes Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz wird in Beutel et al., US-Patent Nr. 5.976.813, beschrieben. In diesem Verfahren werden Testproben in eine poröse Matrix gegeben. Eine oder mehrere Testkomponenten werden dann innerhalb von einer oder oben auf eine oder an das untere Ende einer Matrix wie z.B. einem Gel, einer Kunststofffolie, einem Filter oder einer anderen Form eines leicht manipulierbaren festen Trägers platziert. Wenn die Proben in die poröse Matrix einge führt werden, diffundieren sie ausreichend langsam, sodass die Tests durchgeführt werden können, ohne dass die Testproben zusammenlaufen.
  • Bindungstests
  • Für Bindungstests ist die Testverbindung vorzugsweise ein kleines Molekül, das sich an die ATP/GTP-Bindungsstelle des Enzyms oder die aktive Stelle des menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids bindet oder eine dieser Stellen besetzt, sodass normale biologische Aktivität unterbunden wird. Beispiele für solche kleinen Moleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, kleine Peptide oder Peptid-artige Moleküle.
  • In Bindungstests kann entweder die Testverbindung oder das menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid eine nachweisbare Markierung, wie z.B. eine fluoreszierende, radioisotope, chemilumineszierende oder enzymatische Markierung, wie z.B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase oder Luciferase, umfassen. Das Nachweisen einer Testverbindung, die an das menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid gebunden ist, kann dann beispielsweise durch direktes Zählen von Radioemission, durch Szintillationszählung oder durch Bestimmen der Umsetzung eines geeigneten Substrats zu einem nachweisbaren Produkt erfolgen.
  • Alternativ dazu kann Bindung einer Testverbindung an ein menschliches Prostasinähnliches Enzympolypeptid ohne Markieren eines der Wechselwirkungspartner bestimmt werden. Beispielsweise kann ein Microphysiometer verwendet werden, um Bindung einer Testverbindung mit einem menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptid nachzuweisen. Ein Microphysiometer (z.B. CytosensorTM) ist ein analytisches Instrument, das unter Verwendung eines lichtadressierbaren potentiometrischen Sensors (LAPS) die Geschwindigkeit misst, mit der eine Zelle ihre Umgebung ansäuert. Änderungen dieser Ansäuerungsrate können als ein Indikator der Wechselwirkung zwischen einer Testverbindung und einem menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptid verwendet werden (McConnell et al., Science 257, 1906–1912 (1992)).
  • Die Bestimmung der Fähigkeit einer Testverbindung, sich an ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid zu binden, kann auch unter Verwendung eines Verfahrens wie beispielsweise Echtzeit-"Bimolecular-Interaction-Analysis" (BIA) (Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338–2345 (1991), und Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699–705 (1995)) erfolgen. BIA ist ein Verfahren zur Untersuchung biospezifischer Wechselwirkungen in Echtzeit ohne Markierung der Wechselwirkungspartner (z.B. BIAcoreTM). Änderungen des optischen Phänomens der Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR) kann als ein Hinweis auf Echtzeitreaktionen zwischen biologischen Molekülen verwendet werden.
  • Ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kann als ein "Köderprotein" in einem Zwei-Hybrid-Test oder Drei-Hybrid-Test verwendet werden (siehe z.B. das US-Patent Nr. 5.283.317; Zervos et al., Cell 72, 223–232 (1993); Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 12046–12054 (1993); Bartel et al., BioTechniques 14, 920–924 (1993); Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693–1696 (1993); und Brent WO94/10300), um andere Proteine zu identifizieren, die sich an das menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid binden oder damit wechselwirken und seine Aktivität modulieren.
  • Das Zwei-Hybrid-System basiert auf der modularen Natur der meisten Transkriptionsfaktoren, die aus trennbaren DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdomänen bestehen. Kurz zusammengefasst verwendet der Test zwei verschiedene DNA-Konstrukte. In einem Konstrukt beispielsweise kann das für ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid kodierende Polynucleotid an ein für die DNA-Bindungsdomäne eines bekannten Transkriptionsfaktors (z.B. GAL-4) kodierendes Polynucleotid fusioniert werden. Im anderen Konstrukt kann eine DNA-Sequenz, die für ein nicht-identifiziertes Protein ("Beute" oder "Probe") kodiert, an ein Polynucleotid, das für die Aktivierungsdomäne des bekannten Transkriptionsfaktors kodiert, fusioniert werden. Sind die "Köder"- und die "Beute"-Proteine in der Lage, in vivo wechselzuwirken, um einen Protein-abhängigen Komplex zu bilden, so werden die DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdomänen des Transkriptionsfaktors in große Nähe gebracht. Diese Nähe ermöglicht Transkription eines Reportergens (z.B. LacZ), das operabel an eine Transkriptions-Regulationsstelle gebunden ist, die auf den Transkriptionsfaktor reagiert. Expression des Reportergens kann nachgewiesen werden, und Zellkolonien, die den funktionellen Transkriptionsfaktor enthalten, können isoliert und verwendet werden, um die DNA-Sequenz zu erhalten, die für das Protein kodiert, das mit dem menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptid wechselwirkt.
  • Es kann wünschenswert sein, entweder das menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid (oder -polynucleotid) oder die Testverbindung zu immobilisieren, um die Trennung von gebundenen und ungebundenen Formen von einem oder beiden Wechselwirkungspartnern zu erleichtern sowie um Automatisierung des Tests anzupassen. Somit kann entweder das menschliche Prostasin-ähnliche. Enzympolypeptid (oder -polynucleotid) oder die Testverbindung an einen festen Träger gebunden werden. Geeignete feste Träger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Glas- oder Kunststoffobjektträger, Gewebekulturplatten, Mikrotiterwells, Röhrchen, Siliciumplättchen oder Teilchen wie Perlen (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Latex-, Polystyrol- oder Glasperlen). Jegliches Verfahren, das auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, kann verwendet werden, um das menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid (oder -polynucleotid) oder die Testverbindung an einen festen Träger zu binden, einschließlich der Verwendung von kovalenten und nicht-kovalenten Bindungen, passiver Absorption oder Paaren an Bindungsgruppierungen, die an das Polypeptid (oder Polynucleotid) oder die Testverbindung bzw. an den festen Träger gebunden sind. Testverbindungen sind vorzugsweise an den festen Träger in einer Anordnung gebunden, sodass die Position einzelner Testverbindungen nachvollzogen werden kann. Bindung einer Testverbindung an ein menschliches Prostasinähnliches Enzympolypeptid (oder -polynucleotid) kann in einem Behältnis erfolgen, das für die Aufnahme der Reaktionspartner geeignet ist. Beispiele für solche Behältnisse umfassen Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Mikrozentrifugenröhrchen.
  • Das menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid kann ein Fusionsprotein sein, das eine Domäne umfasst, die es dem menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptid ermöglicht, an einen festen Träger gebunden zu sein. Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteine beispielsweise können an Glutathionsepharose-Perlen (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) oder an mit Glutathion derivatisierten Mikrotiterplatten adsorbiert werden, die dann mit der Testverbindung oder der Testverbindung und dem nicht-adsorbierten menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptid kombiniert werden; das Gemisch wird dann unter Bedingungen inkubiert, die zu Komplexbildung führen (z.B. bei physiologischen Bedingungen bezüglich Salz und pH). Nach der Inkubation werden die Perlen oder Mikrotiterplatten-Wells gewaschen, um jegliche ungebundenen Komponenten zu entfernen. Bindung der Wechselwirkungspartner kann entweder direkt oder indirekt bestimmt werden, wie zuvor beschrieben. Alternativ dazu können die Komplexe vom festen Träger dissoziiert werden, bevor Bindung bestimmt wird.
  • Andere Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen oder Polynucleotiden an einem festen Träger können auch in den Screening-Tests der Erfindung verwendet werden. Entweder ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid (oder -polynucleotid) oder eine Testverbindung kann beispielsweise unter Verwendung von Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Biotinylierte menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide (oder -polynucleotide) oder Testverbindungen können aus Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid) unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind (z.B. Biotinylierungsset, Pierce Chemicals, Rockford, III.) hergestellt und in den Wells von Streptavidin-beschichteten 96-Well-Platten (Pierce Chemical) immobilisiert werden. Alternativ dazu können Antikörper, die sich spezifisch an ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid, Enzympolynucleotid oder eine Testverbindung binden, die jedoch eine erwünschte Bindungsstelle, wie z.B. die ATP/GTP-Bindungsstelle oder die aktive Stelle des menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids, nicht stören, an die Wells der Platte derivatisiert werden. Ungebundenes Target oder Protein kann in den Wells durch Antikörper-Konjugation eingefangen werden.
  • Verfahren zum Nachweisen solcher Komplexe, zusätzlich zu jenen, die zuvor für die GST-immobilisierten Komplexe beschrieben wurden, umfassen Immundetektion von Komplexen unter Verwendung von Antikörpern, die sich spezifisch an das menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid oder die Testverbindung binden, enzymge koppelte Tests, die auf der Detektion einer Aktivität des menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids basieren, und SDS-Gelelektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen.
  • Screening auf Testverbindungen, die sich an ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid oder -polynucleotid binden, kann auch in einer intakten Zelle durchgeführt werden. Jegliche Zelle, die ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid oder -polynucleotid umfasst, kann in einem zellbasierten Testsystem verwendet werden. Ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolynucleotid kann natürlich in der Zelle vorkommen oder kann unter Verwendung von Verfahren wie jenen, die zuvor beschrieben wurden, eingeführt werden. Bindung der Testverbindung an ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid oder -polynucleotid wird wie zuvor beschrieben bestimmt.
  • Enzymtests
  • Testverbindungen können auf die Fähigkeit, die menschliche Prostasin-ähnliche Aktivität eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids zu erhöhen oder zu reduzieren, getestet werden. Aktivität eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzyms kann beispielsweise wie in Yu et al., J. Biol. Chem. 269, 18843–18848 (1994), beschrieben gemessen werden.
  • Enzymtests können nach dem Kontaktieren entweder eines gereinigten menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids, eines Zellmembranpräparats oder einer intakten Zelle mit einer Testverbindung durchgeführt werden. Eine Testverbindung, die Serinprotease-Aktivität eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids um zumindest etwa 10%, vorzugsweise etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100%, reduziert, wird als ein potenzielles therapeutisches Mittel zur Reduktion der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym identifiziert. Eine Testverbindung, die Serinprotease-Aktivität eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids um zumindest etwa 10%, vorzugsweise 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100%, erhöht, wird als ein potenzielles therapeutisches Mittel zur Steigerung der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym identifiziert.
  • Genexpression
  • Testverbindungen, die menschliche Prostasin-ähnliche Enzymgenexpression steigern oder senken, werden identifiziert. Ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolynucleotid wird mit einer Testverbindung kontaktiert, und die Expression eines RNA- oder Polypeptidprodukts des menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotids wird bestimmt. Das Expressionsniveau von geeigneter mRNA oder geeignetem Polypeptid in Gegenwart der Testverbindung wird mit dem Expressionsniveau von mRNA oder Polypeptid in Abwesenheit der Testverbindung verglichen. Die Testverbindung kann dann als ein Expressionsmodulator basierend auf diesem Vergleich identifiziert werden. Ist beispielsweise Expression von mRNA oder Polypeptid höher in Gegenwart der Testverbindung als in Abwesenheit dieser, so wird die Testverbindung als ein Stimulator oder Enhancer der mRNA- oder Polypeptidexpression identifiziert. Fällt dahingegen Expression der mRNA oder des Polypeptids in Gegenwart der Testverbindung geringer aus als in ihrer Abwesenheit, so wird die Testverbindung als ein Inhibitor der mRNA- oder Polypeptidexpression identifiziert.
  • Das Expressionsniveau von menschlicher Prostasin-ähnlicher Enzym-mRNA oder von menschlichem Prostasin-ähnlichem Polypeptid in den Zellen kann durch Verfahren, die auf dem Gebiet der Detektion von mRNA oder Polypeptid durchwegs bekannt sind, bestimmt werden. Es können entweder qualitative oder quantitative Verfahren verwendet werden. Die Gegenwart von Polypeptidprodukten eines menschlichen Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotids kann beispielsweise unter Verwendung zahlreicher verschiedener Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, bestimmt werden, einschließlich immunchemischer Verfahren wie Radioimmuntest, Western-Blotting und Immunhistochemie. Alternativ dazu kann Polypeptidsynthese in vivo, in einer Zellkultur oder in einem In-vitro-Translationssystem durch Detektion von Inkorporation markierter Aminosäuren in ein menschliches Prostasinähnliches Enzympolypeptid bestimmt werden.
  • Solche Screening-Verfahren können entweder in einem zellfreien Testsystem oder in einer intakten Zelle durchgeführt werden. Jegliche Zelle, die ein menschliches Prostasin-ähnliches Enzympolynucleotid exprimiert, kann in einem zellbasierten Testsystem verwendet werden. Das menschliche Prostasin-ähnliche Enzympolynucleotid kann natürlich in der Zelle vorkommen oder kann unter Verwendung beispielsweise eines der oben beschriebenen Verfahren eingeführt werden. Entweder eine primäre Kultur oder eine etablierte Zelllinie, wie z.B. CHO- oder menschliche embryonale Nieren-293-Zellen, können verwendet werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die einem Patienten verabreicht werden können, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen, können ein Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid, Prostasin-ähnliches Enzympolynucleotid, Antikörper, die sich spezifisch an ein Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid binden, oder Mimetika, Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren eines Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids umfassen. Die Zusammensetzungen können alleine oder in Kombination mit zumindest einem anderen Mittel, wie beispielsweise einer stabilisierenden Verbindung, verabreicht werden und können in jeglichem sterilen, biokompatiblen pharmazeutischen Träger, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Kochsalzlösung, gepufferter Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser, verabreicht werden. Die Zusammensetzungen können einem Patienten alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln, Wirkstoffen oder Hormonen verabreicht werden.
  • Zusätzlich zu den Wirkstoffen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger umfassend Arzneimittelträger und Hilfsmittel enthalten, die das Verarbeiten der Wirkstoffe zu Präparaten, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Pharmazeutische Zusammensetzungen können auf zahlreiche verschiedene Weisen verabreicht werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, oraler, intravenöser, intramuskulärer, intraarterieller, intramedullärer, intrathekaler, intraventrikulärer, transdermaler, subkutaner, intraperitonealer, intranasaler, parenteraler, topischer, sublingualer oder rektaler Verab reichung. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können unter Verwendung pharmazeutisch annehmbarer Träger, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, in für orale Verabreichung geeigneten Dosierungen formuliert werden. Solche Träger ermöglichen, dass die pharmazeutischen Zusammensetzungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Aufschlämmungen, Suspensionen und dergleichen zur Ingestion durch den Patienten formuliert werden.
  • Pharmazeutische Präparate zur oralen Verwendung können durch Kombination von Wirkstoffen mit festen Arzneimittelträgern, gegebenenfalls durch Mahlen eines resultierenden Gemischs, und durch Verarbeiten des Granulatgemischs, nach dem Zusatz geeigneter Hilfsmittel, sofern erwünscht, erhalten werden, um Tabletten oder Dragee-Kerne zu gewinnen. Geeignete Arzneimittelträger sind Kohlenhydrat- oder Proteinfüllstoffe, wie z.B. Zucker, einschließlich Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit; Stärke aus Mais, Weizen, Reis, Kartoffel oder anderen Pflanzen; Zellulose, wie z.B. Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Natriumcarboxymethylcellulose; Gummiarten einschließlich Gummi arabicum und Tragantgummi; und Proteine, wie z.B. Gelatine und Collagen. Sofern erwünscht können Auflösungsmittel oder löslich machende Mittel zugesetzt werden, wie z.B. das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon, wie z.B. Natriumalginat.
  • Dragee-Kerne können in Verbindung mit geeigneten Beschichtungen wie z.B. konzentrierten Zuckerlösungen verwendet werden, die auch Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten können. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten- oder Dragee-Beschichtungen zur Produktidentifikation oder um die Menge an Wirkstoff, d.h. die Dosierung, zu kennzeichnen zugesetzt werden.
  • Pharmazeutische Präparate, die oral verwendet werden können, umfassen Gelatine-Steckkapslen sowie versiegelte Weichkapseln, die aus Gelatine und einer Beschichtung, wie z.B. Glycerin oder Sorbit, hergestellt werden. Steckkapseln enthalten Wirk stoffe vermischt mit einem Füllstoff oder Bindemittel, wie z.B. Lactose oder Stärken, Gleitmitteln, wie z.B. Talk oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls Stabilisatoren. In Weichkapseln können die Wirkstoffe in geeigneten Flüssigkeiten, wie z.B. fetten Ölen, Flüssigkeiten oder flüssigem Polyethylenglykol mit oder ohne Stabilisatoren, aufgelöst oder suspendiert sein.
  • Pharmazeutische Formulierungen, die für parenterale Verabreichung geeignet sind, können in wässrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern wie z.B. Hank-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologisch gepufferter Kochsalzlösung, formuliert werden. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Darüber hinaus können Suspensionen der Wirkstoffe als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen fette Öle wie z.B. Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, wie z.B. Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposomen. Polykationische Aminopolymere, die keine Lipide sind, können auch zur Verabreichung verwendet werden. Gegebenenfalls kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, die die Löslichkeit der Verbindungen steigern, um die Herstellung hochkonzentrierter Lösungen zu ermöglichen. Zur topischen oder nasalen Verabreichung werden Durchdringungsmittel, die für die bestimmte zu durchdringende Barriere geeignet sind, in der Formulierung verwendet. Solche Durchdringungsmittel sind im Allgemeinen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf eine Weise hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, z.B. mittels herkömmlicher Vermischungs-, Auflösungs-, Granulations-, Dragee-Bildungs-, Aufschlämmungs-, Emulgations-, Verkapselungs-, Einfang- oder Lyophilisierungsverfahren. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann als ein Salz bereitgestellt werden und kann mit zahlreichen Säuren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure usw., gebildet werden. Salze neigen dazu, in wässrigen oder anderen protischen Lösungsmitteln stärker löslich zu sein als die entsprechenden freien Basenformen. In anderen Fällen kann das bevorzugte Präparat ein lyophilisiertes Pulver sein, das jedes beliebige oder alle der folgenden Elemente enthalten kann: 1–50 mM Histidin, 0,1%–2% Saccharose und 2–7% Mannit, in einem pH-Bereich von 4,5 bis 5,5, und das vor der Verwendung mit Puffer kombiniert wird.
  • Nähere Details in Bezug auf Verfahren zur Formulierung und Verabreichung sind in der neuesten Ausgabe von REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack Publishing Co., Easton, Pa.) zu finden. Nachdem pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt wurden, können sie in ein geeignetes Behältnis gegeben und für die Behandlung eines indizierten Leidens beschriftet werden. Eine solche Beschriftung umfasst Menge, Häufigkeit und Art der Verabreichung.
  • Therapeutische Indikationen und Verfahren
    • 1. Tumorzellinvasion und Metastase. Das menschliche Prostasin-ähnliche Enzymgen stellt ein therapeutisches Mittel zur Senkung der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym bereit, insbesondere zur Behandlung oder Prävention von metastatischem Krebs. Krebs ist eine Erkrankung, die im Grunde durch onkogene Zelltransformation verursacht wird. Es gibt mehrere Kennzeichen für transformierte Zellen, die sich von ihren normalen Gegenstücken unterscheiden und der Pathophysiologie von Krebs unterliegen. Diese umfassen unkontrollierte Zellproliferation, die auf normale todesinduzierende Signale nicht reaktiv ist (Immortalisierung), erhöhte zelluläre Motilität und Invasivität, erhöhte Fähigkeit, Blutzufuhr durch Induktion von neuer Blutgefäßbildung bereitzustellen (Angiogenese), genetische Instabilität und fehlregulierte Genexpression. Verschiedene Kombinationen dieser abartigen Physiologien führen gemeinsam mit der Erlangung von Wirkstoffresistenz häufig zu einem Erkrankungszustand, der schwer zu handhaben ist und dem schließlich Organversagen und der Tod des Patienten folgen.
  • Die meisten herkömmlichen Krebstherapien sind auf zelluläre Proliferation gerichtet und beruhen bezüglich ihrer Wirksamkeit auf den unterschiedlichen Proliferationsfähigkeiten zwischen transformierten und normalen Zellen. Dieser Ansatz sieht sich durch die Tatsache eingeschränkt, dass mehrere wichtige normale Zelltypen ebenfalls hochproliferativ sind und die Krebszellen häufig resistent gegen diese Mittel werden. Somit übersteigen die therapeutischen Indices bei herkömmlichen krebsbekämpfenden Therapien selten einen Wert von 2,0.
  • Das Aufkommen von auf Genomik beruhender Molekültarget-Identifikation eröffnete nun die Möglichkeit, neue Krebs-spezifische Targets für therapeutische Eingriffe zu identifizieren, die sicherere und wirksamere Behandlungen für Krebspatienten bieten. Somit können neu entdeckte Tumor-assoziierte Gene und ihre Produkte auf ihre Rolle(n) in der Erkrankung getestet und als Hilfsmittel verwendet werden, um innovative Therapien zu entdecken und entwickeln. Gene, die in jedem beliebigen der oben genanten physiologischen Abläufe wichtige Rollen spielen, können als Krebs-Targets charakterisiert werden.
  • Gene oder Genfragmente, die mittels Genomforschung identifiziert wurden, können leicht in einem oder mehreren heterologen Expressionssystemen exprimiert werden, um funktionelle rekombinante Proteine herzustellen. Diese Proteine werden in vitro auf ihre biochemischen Eigenschaften charakterisiert und dann als Hilfsmittel in molekularen Screening-Programmen mit hohem Durchsatz verwendet, um chemische Modulatoren ihrer biochemischen Aktivitäten zu identifizieren. Agonisten und/oder Antagonisten von Targetprotein-Aktivität können auf diese Weise identifiziert und daraufhin in zellulären und in In-vivo-Erkrankungsmodellen auf Anti-Krebs-Aktivität getestet werden. Optimierung von Leitverbindungen mittels wiederholten Testens in biologischen Modellen sowie detaillierte Pharmakokinetik und toxikologische Analysen bilden die Grundlage für Wirkstoffentwicklung und darauf folgende Tests am Menschen.
  • Das Blockieren einer Fibronectin-Domäne von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym kann beispielsweise Migration oder Metastasenbildung von Tumorzellen in Reaktion auf Fibronectin unterdrücken (9, 10). Krebserkrankungen, deren Metastase unterdrückt werden kann, umfassen Adenokarzinom, Melanom, Krebserkrankungen der Nebenniere, Blase, von Knochen, der Brust, Zervix, Gallenblase, Leber, Lunge, der Ovarien, Bauchspeicheldrüse, Prostata, der Hoden und des Uterus. Zirkulierende Tumorzellen, die im Kapillarsystem verschiedener Organe festgehalten sind, müssen die Endothelzellauskleidung befallen und die darunter liegende Basalmembran (BM) zerstören, um in extravaskuläre(s) Gewebe einzudringen, wo sie Metastasen bilden (1, 2). Metastatische Tumorzellen binden sich oft an interzelluläre Bindungen zwischen benachbarten Endothelzellen oder in der Nähe dieser. Solchen Bindungen der metastatischen Zellen folgt der Aufbruch der Verbindungen, das Zurückziehen der Endothelzellwände und die Migration durch die Lücke im Endothel in Richtung der freigelegten, darunter liegenden BM (1, 11).
  • Nach dem sie sich zwischen Endothelzellen und der BM niedergelassen haben, müssen die eindringenden Zellen die subendothelialen Glykoproteine und Proteoglykane der BM zerstören, um aus dem vaskulären Kompartiment auszutreten. Von mehreren zellulären Enzymen (z.B. Collagenase IV, Plasminogenaktivator, Cathepsin B, Elastase) wird angenommen, dass sie in den Abbau von BM eingebunden sind (2, 11). Die Unterdrückung der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym kann daher verwendet werden, um Tumorzellinvasion und -metastase zu unterdrücken.
    • 2. Tumor-Angiogenese. Basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) wurde aus der subendothelialen extrazellulären Matrix, die in vitro hergestellt wurde (3), und aus Basalmembranen der Hornhaut (4) extrahiert, was darauf schließen lässt, dass extrazelluläre Matrix als ein Speicherort für bFGF dienen kann. Immunhistochemisches Färben zeigte die Anordnung von bFGF in Basalmembranen verschiedener Gewebe und Blutgefäße auf (5). Trotz der Allgegenwärtigkeit von bFGF in normalen Geweben ist Endothelzellproliferation in diesen Geweben üblicherweise sehr gering, was darauf schließen lässt, dass bFGF in gewisser Weise von seiner Wirkungsstelle abgesondert ist. Daher ist es möglich, dass Unterdrückung der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym die Freisetzung von aktivem bFGF aus extrazellulärer Matrix und Basalmembranen unterdrücken kann. Darüber hinaus kann Verdrängung von bFGF aus seinem Speicherort innerhalb von Basalmembranen und extrazellulärer Matrix daher einen neuen Mechanismus zur Induktion von Neovaskularisation unter normalen und pathologischen Umständen bereitstel len. Die Einschränkung von Endothelzellwachstumsfaktoren in der extrazellulären Matrix kann ihre systemische Wirkung auf das Gefäßendothel unterbinden, wodurch ein sehr geringes Maß an Endothelzellumsatz und Gefäßwachstum aufrechterhalten wird. Andererseits kann die Freisetzung von bFGF aus dem Speicher in der extrazellulären Matrix lokalisierte Endothelzellproliferation und Neovaskularisation in Vorgängen wie z.B. Wundheilung, Entzündungsprozessen und Tumorentwicklung hervorrufen (6, 7).
    • 3. Entzündung und zelluläre Immunität. Aktivität von Prostasin-ähnlichem Enzym kann in die Fähigkeit von aktivierten Zellen des Immunsystems eingebunden werden, den Blutkreislauf zu verlassen und sowohl Entzündungs- als auch -Autoimmunreaktionen hervorzurufen. Somit können Entzündung und zelluläre Immunität durch Regulieren der Aktivität von Prostasin-ähnlichem Enzym reguliert werden.
    • 4. Virusinfektion. Das Entfernen von Zelloberflächenkomponenten durch Prostasin-ähnliches Enzym kann die Fähigkeit von Viren beeinflussen, sich an die Zelloberfläche zu binden. Die Regulierung von Prostasin-ähnlichem Enzym kann daher zur Behandlung von Virusinfektionen verwendet werden.
    • 5. Neurodegenerative Erkrankungen. Auch ist es möglich, dass die Aktivität von Prostasin-ähnlichem Enzym verwendet wird, um beispielsweise Prionproteinaymloidplättchen von Gerstmann-Straussler-Syndrom, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit und Scrapie abzubauen.
    • 6. Restenose und Atherosklerose. Proliferation von arteriellen Glattmuskelzellen (SMCs) in Reaktion auf Endothelverletzung und Ansammlung von Cholesterin-reichen Lipoproteinen sind grundlegende Ereignisse der Pathogenese von Atherosklerose und Restenose (8). Es ist möglich, dass Prostasin-ähnliches Enzym in den katabolen Stoffwechselweg eingebunden ist, der eventuell wesentliche zelluläre und interstitielle Ansammlung von Cholesterin-reichen Lipoproteinen ermöglicht. Von diesem letzteren Stoffwechselweg wird angenommen, dass er durch Fördern der Ansammlung von apoB- und apoE-reichen Lipoproteinen (d.h. LDL, VLDL, Chylomikro ne) hoch-atherogen ist, unabhängig von der Feedback-Hemmung durch den zellulären Steringehalt. Geänderte Niveaus der Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym können sowohl SMC-Proliferation als auch Lipidansammlung inhibieren und können somit den Fortschritt von Restenose und Atherosklerose aufhalten.
    • 7. Osteoporose. Osteoporose ist eine Erkrankung, die durch geringe Knochenmasse und Verschlechterung des feinen Knochengewebeaufbaus gekennzeichnet ist, was zu erhöhter Knochenbrüchigkeit und einem sich daraus ergebenden Anstieg des Risikos eines Knochenbruchs führt. Osteoporose ist die häufigste menschliche Knochenerkrankung in Verbilidung mit Stoffwechsel. Fortgeschrittene Osteoporose umfasst das Vorhandensein von Brüchen.
  • Knochenumsetzung tritt durch die Wirkung von zwei Haupt-Effektorzelltypen innerhalb des Knochens ein: dem Osteoklasten, der für Knochenresorption verantwortlich ist, und dem Osteoblasten, der Knochenmatrix synthetisiert und mineralisiert. Die Wirkungen von Osteoklasten und Osteoblasten sind äußerst stark koordiniert. Osteoklasten-Vorläufer werden zur Stelle der Umsetzung herangezogen, sie differenzieren sich und fusionieren, um reife Osteoklasten zu bilden, die dann den Knochen resorbieren. Gebunden an die Knochenoberfläche produzieren Osteoklasten eine saure Mikroumgebung in einer exakt definierten Verbindung zwischen der spezialisierten Osteoklasten-Grenzmembran und der Knochenmatrix, wodurch die lokalisierte Solubilisierung von Knochenmatrix ermöglicht wird. Dies wiederum erleichtert die Proteolyse von entmineralisiertem Knochenkollagen. Es wird angenommen, dass durch Matrixabbau mit der Matrix assoziierter Wachstumsfaktor und Cytokine freigesetzt werden, die Osteoblasten auf zeitlich und räumlich kontrollierte Weise anziehen. Osteoblasten synthetisieren und sekretieren neue Knochenmatrixproteine und mineralisieren daraufhin diese neue Matrix. Im normalen Skelett ist dies ein physiologischer Vorgang, der nicht zu keiner Netto-Veränderung der Knochenmasse führt. In Erkrankungszuständen wie beispielsweise Osteoporose ist das Gleichgewicht zwischen Resorption und Bildung so verändert, dass Knochenverlust eintritt. Siehe die WO 99/45923.
  • Der Osteoklast selbst ist das direkte oder indirekte Target für alle zur Zeit erhältlichen Mittel zur Behandlung von Osteoporose, mit der möglichen Ausnahme von Fluorid. Antiresorptionstherapien vermeiden bei behandelten Personen weiteren Knochenverlust. Osteoblasten sind von multipotenten Stammzellen abgeleitet, die in Knochenmark vorhanden sind und auch Adipozyten, Chondrozyten, Fibroblasten und Muskelzellen entstehen lassen. Selektive Förderung von Osteoblastenaktivität ist ein äußerst wünschenswertes Ziel für Osteoporosetherapie, da dies zu einem Anwachsen der Knochenmasse führen und nicht weiteren Knochenverlust unterbinden würde. Von einer wirksamen anabolen Therapie wird erwartet, dass sie zu einer signifikant größeren Reduktion des Bruchrisikos als gegenwärtig verfügbare Behandlungen führt.
  • Die Agonisten oder Antagonisten der neu entdeckten Polypeptide können durch direktes Verändern der Osteoklasten-Differenzierung, Osteoklasten-Adhäsion an die Knochenmatrix oder Osteoklasten-Funktion der Zerstörung von Knochenmatrix als Antiresorptionsmittel wirken. Die Agonisten oder Antagonisten könnten die Osteoklasten-Funktion indirekt durch Stören der Synthese und/oder Modifikation von Effektormolekülen von Osteoklasten-Differenzierung oder -Funktion, wie z.B. Cytokinen, Peptid- oder Steroidhormonen, Proteasen usw., verändern.
  • Die Agonisten oder Antagonisten der neu entdeckten Polypeptide können durch direktes Steigern der Osteoblasten-Differenzierung und/oder ihrer Knochenmatrix-Bildungsfunktion als Anabolika wirken. Die Agonisten oder Antagonisten könnten die Osteoblasten-Funktion durch Steigern der Synthese von Wachstumsfaktoren, Peptid- oder Steroidhormonen oder durch Reduzieren der Synthese von Inhibitionsmolekülen auch indirekt verändern.
  • Die Agonisten und Antagonisten können verwendet werden, um die Wirkung der neu entdeckten Polypeptide nachzuahmen, zu erhöhen oder zu inhibieren, die nützlich sein können, um Osteoporose, Paget-Krankheit, Abbau von Knochenimplantaten, insbesondere Zahnimplantaten, zu behandeln.
    • 8. COPD. Chronische obstruktive Lungen- (oder Atemwegs-) Erkrankung (COPD) ist ein Leiden, das physiologisch als Luftstrom-Obstruktion definiert ist, die im Allgemeinen aus einem Zusammenspiel von Emphysem und Obstruktion peripherer Luftwege aufgrund von chronischer Bronchitis resultiert (Senior & Shapiro, Pulmonary Diseases and Disorders, 3. Auflage, New York, McGraw-Hill, 659–681 (1998); Barnes, Chest 117, 10S–14S (2000)). Ein Emphysem ist gekennzeichnet durch die Zerstörung von Alveolarwänden, die zu anormaler Vergrößerung der Lufträume der Lunge führt. Chronische Bronchitis ist klinisch als die Gegenwart von chronischem produktivem Husten über drei Monate von beiden von zwei aufeinander folgenden Jahren hinweg definiert. Bei COPD ist die Luftstrom-Obstruktion üblicherweise progressiv und nur teilweise reversibel. Bei weitem der größte Risikofaktor für die Entwicklung von COPD ist Zigarettenrauchen, obwohl die Erkrankung auch bei Nichtrauchern auftritt.
  • Chronische Entzündung der Atemwege ist eine zentrale pathologische Eigenschaft von COPD (Senior & Shapiro (1998)). Die Entzündungs-Zellpopulation umfasst eine erhöhte Anzahl an Makrophagen, Neutrophilen und CD8+-Lymphozyten. Eingeatmete Reizstoffe, wie beispielsweise Zigarettenrauch, aktivieren Makrophagen, die in den Atemwegen vorhanden sind, sowie Epithelzellen, was zur Freisetzung von Chemokinen (z.B. Interleukin-8) und anderen chemotaktischen Faktoren führt. Diese chemotaktischen Faktoren bewirken eine Steigerung des Neutrophilen/Monozyten-Transports aus dem Blut in das Lungengewebe und die Atemwege. Neutrophile und Monozyten, die in die Atemwege transportiert werden, können zahlreiche verschiedene potenzielle Zerstörungsmediatoren wie z.B. proteolytische Enzyme und reaktive Sauerstoffspezies freisetzen. Matrixabbau und Emphysem, zusammen mit Verdickung der Atemwegswände, Tensiddysfunktion und übermäßige Schleimsekretion sind alles mögliche Folgeerscheinungen dieser Entzündungsreaktion, die zu behindertem Luftstrom und Gasaustausch führt.
  • COPD ist gekennzeichnet durch die Zerstörung der extrazellulären Matrix der Lunge, und Emphysembildung kann als der pathologische Prozess betrachtet werden, der das Lungenparenchym beeinträchtigt. Dieser Prozess führt schließlich zur Zerstö rung der Atemwegswände, was in einer permanenten Luftraumvergrößerung resultiert (Senior and Shapiro, in: PULMONARY DISEASES AND DISORDERS, 3. Auflage, New York, McGraw-Hill, 659–681 (1998)). Die Beobachtung, dass vererbte Defizienz von a1-Antitrypsin (a1-AT), des primären Inhibitors von neutrophiler Elastase, zu einer Prädisposition von früh auftretendem Emphysem bei Menschen führt und dass intrapulmonale Instillation von elastolytischen Enzymen bei Versuchstieren Emphysem verursacht, führte zu der Elastase:Antielastase-Hypothese für die Pathogenese von Emphysem (Eriksson, Acta Med. Scand. 177 (Beilage), 432 (1965), Gross, J. Occup. Med. 6, 481–484 (1964)). Dies wiederum führte zur Idee, dass Zerstörung von Elastin im Lungenparenchym die Grundlage für die Entwicklung von Emphysemen darstellt.
  • Zahlreiche Immun- und Entzündungszellen, umfassend Neutrophile, Makrophagen, T-Lymphozyten und Eosinophile, enthalten proteolytische Enzyme, die zur Zerstörung von pulmonaler extrazellulärer Matrix beitragen (Shapiro (1999)). Darüber hinaus wurden zahlreiche verschiedene Klassen an Proteasen identifiziert, die über das Potenzial verfügen, zu Lungenmatrixzerstörung beizutragen. Diese umfassen Serinproteasen, Matrix-Metalloproteinasen und Cysteinproteasen. Von diesen Enzymklassen können zahlreiche Elastin hydrolysieren, und für diese wurde gezeigt, dass sie in COPD-Patienten in erhöhten Konzentrationen vorhanden sind (Neutrophil-Elastase, MMP-2, 9, 12) (Culpitt et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160, 1635–1639 (1999); Shapiro, Am. J. Crit. Care Med. 160(5), S29–S32 (1999)).
  • Es wird angenommen, dass in Zukunft neue Mitglieder der bestehenden Proteaseklassen und neue Proteaseklassen identifiziert werden, die bei der Zerstörung der extrazellulären Lungenmatrix, einschließlich Elastinproteolyse, eine signifikante Rolle spielen. Neue Protease-Targets bleiben daher sehr attraktive therapeutische Targets.
    • 9. Andere therapeutische und diagnostische Indikationen. Antikörper gegen menschliches Prostasin-ähnliches Enzym können zur Immundetektion und zur Diagnose von Mikrometastasen, Autoimmunläsionen und Nierenversagen in Biopsiemus tern, Plasmaproben und Körperflüssigkeiten eingesetzt werden. Alternativ dazu kann, sofern erwünscht, einer Zelle durch Einführen eines für ein Prostasin-ähnliches Enzym kodierenden Polynucleotids in die Zelle eine Prostasin-ähnliche Enzymfunktion verliehen werden.
  • Ein Mittel, das wie hierin beschrieben identifiziert wird (z.B. ein modulierendes Mittel, ein Antisense-Nucleinsäuremolekül, ein spezifischer Antikörper, Ribozym oder ein Polypeptid-Bindungspartner), kann beispielsweise in einem Tiermodell verwendet werden, um die Wirksamkeit, Toxizität oder die Nebenwirkungen von Behandlung mit solch einem Mittel verwendet werden. Alternativ dazu kann ein Mittel, das wie hierin beschrieben identifiziert wird, in einem Tiermodell verwendet werden, um den Wirkungsmechanismus eines solchen Mittels zu bestimmen.
  • Ein Reagens, das Prostasin-ähnliche Enzymaktivität beeinflusst, kann einer menschlichen Zelle, entweder in vitro oder in vivo, verabreicht werden, um Prostasin-ähnliche Enzymaktivität zu reduzieren. Das Reagens bindet sich vorzugsweise an ein Expressionsprodukt eines menschliche Prostasin-ähnlichen Enzymgens. Ist das Expressionsprodukt ein Polypeptid, so ist das Reagens vorzugsweise ein Antikörper. Zur Behandlung von menschlichen Zellen ex vivo kann ein Antikörper zu einem Präparat aus Stammzellen zugesetzt werden, die aus dem Körper entfernt wurden. Die Zellen können dann in denselben oder in einen anderen menschlichen Körper, mit oder ohne klonale Vermehrung, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, eingesetzt werden.
  • Das Reagens wird unter Verwendung eines Liposoms zugeführt. Vorzugsweise ist das Liposom im Tier, dem es verabreicht wurde, zumindest etwa 30 min lang, noch bevorzugter zumindest etwa 1 h lang, und noch bevorzugter zumindest etwa 24 h lang, stabil. Ein Liposom umfasst eine Lipidzusammensetzung, die in der Lage ist, ein Reagens, insbesondere ein Polynucleotid, auf eine bestimmte Stelle in einem Tier wie beispielsweise einem Menschen zu richten. Vorzugsweise ist die Lipidzusammensetzung des Liposoms in der Lage, sich gegen ein spezifisches Organ eines Tiers, wie z.B. die Lunge oder die Leber, zu richten.
  • Ein nützliches Liposom umfasst eine Lipidzusammensetzung, die in der Lage ist, mit der Plasmamembran der Target-Zelle zu fusionieren, um ihre Inhalte der Zelle zuzuführen. Vorzugsweise beträgt die Transfektionswirksamkeit eines Liposoms etwa 0,5 μg DNA pro 16 nmol Liposom, die etwa 106 Zellen zugeführt wurden, bevorzugter etwa 1,0 μg DNA pro 16 nmol Liposom, das etwa 106 Zellen zugeführt wurde, und noch bevorzugter etwa 2,0 μg DNA pro 16 nmol Liposom, die etwa 106 Zellen zugeführt wurden. Vorzugsweise beträgt der Durchmesser eines Liposoms zwischen etwa 100 und 500 nm, noch bevorzugter zwischen etwa 150 und 450 nm, und sogar noch bevorzugter zwischen etwa 200 und 400 nm.
  • Geeignete Liposomen zur Verwendung umfassen jene Liposomen, die standardmäßig in beispielsweise Verfahren zur Genzufuhr, die Fachleuten bekannt sind, verwendet werden. Noch bevorzugtere Liposomen umfassen Liposomen, die eine polykationische Lipidzusammensetzung aufweisen, und/oder Liposomen, die eine Cholesterin-Hauptkette, konjugiert an Polyethylenglykol, aufweisen. Gegebenenfalls umfasst ein Liposom eine Verbindung, die in der Lage ist, sich gegen das Liposom einer Tumorzelle zu richten, wie beispielsweise gegen einen Tumorzell-Liganden, der an der äußeren Oberfläche des Liposoms frei liegt.
  • Komplexbildung eines Liposoms mit einem Reagens wie beispielsweise einem Antisense-Oligonucleotid oder einem Ribozym kann unter Verwendung von Verfahren erreicht werden, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind (siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 5.705.151). Vorzugsweise werden etwa 0,1 μg bis etwa 10 μg Polynucleotid mit etwa 8 nmol Liposomen kombiniert, noch bevorzugter werden etwa 0,5 μg bis etwa 5 μg Polynucleotide mit etwa 8 nmol Liposomen kombiniert, und noch bevorzugter werden etwa 1,0 μg Polynucleotide mit etwa 8 nmol Liposomen kombiniert.
  • Antikörper können spezifischen Geweben in vivo unter Verwendung von Rezeptor-vermittelter Target-Zufuhr zugeführt werden. Rezeptor-vermittelte DNA-Zufuhrverfahren werden beispielsweise in Findeis et al., Trends in Biotechnol. 11, 202–205 (1993); Chiou et al., GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J. A. Wolff, Hrsg.) (1994); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 263, 621–624 (1988); Wu et al., J. Biol. Chem. 269, 542–546 (1994); Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655–3659 (1990); Wu et al., J. Biol. Chem. 266, 338–342 (1991), gelehrt.
  • Ist das Reagens ein einkettiger Antikörper, so können Polynucleotide, die für den Antikörper kodieren, konstruiert und in eine Zelle entweder ex vivo oder in vivo unter Verwendung von gut entwickelten Verfahren, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Transferrin-Polykation-vermittelten DNA-Transfer, Transfektion mit nackten oder eingekapselten Nucleinsäuren, Liposomen-vermittelte Zellfusion, intrazellulären Transport von DNA-beschichteten Latexperlen, Protoplasten-Fusion, viraler Infektion, Elektroporation, "Genkanone" und DEAE- oder Calciumphosphat-vermittelter Transfektion, eingeführt werden.
  • Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis
  • Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis liegt durchwegs im Kompetenzbereich von Fachleuten. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf jene Menge eines Wirkstoffs, die die Aktivität von menschlichem Prostasin-ähnlichem Enzym in Bezug auf jene Aktivität, die ohne therapeutisch wirksame Dosis auftritt, erhöht oder reduziert.
  • Für jede beliebige Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich entweder in Zellkulturtests oder in Tiermodellen, üblicherweise in Mäusen, Kaninchen, Hunden oder Schweinen, bewertet werden. Das Tiermodell kann auch verwendet werden, um den geeigneten Konzentrationsbereich und die Art der Verabreichung zu bestimmen. Solche Informationen können verwendet werden, um nützliche Dosierungen und Verabreichungswege für Menschen zu bestimmen.
  • Therapeutische Wirksamkeit und Toxizität, z.B. ED50 (die Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist) und LD50 (die Dosis, die für 50% der Population letal ist), können durch herkömmliche pharmazeutische Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden. Das Dosisverhältnis von toxischen zu therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und kann als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die große therapeutische Indices aufweisen, werden bevorzugt. Daten, die aus Zellkulturtests und Tierstudien gewonnen wurden, werden zur Formulierung eines Dosierungsbereichs für die Anwendung bei Menschen verwendet. Die in solchen Zusammensetzungen enthaltene Dosierung liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von Konzentrationen im Blutkreislauf, die die ED50 mit geringer oder keiner Toxizität umfassen. Die Dosierung variiert innerhalb dieses Bereich je nach der verwendeten Dosierungsform, der Empfindlichkeit des Patienten und der Art der Verabreichung.
  • Die exakte Dosierung wird vom Arzt unter Berücksichtigung von Faktoren, die vom zu behandelnden Patienten abhängen, bestimmt. Dosierung und Verabreichung werden so angepasst, dass ausreichende Konzentrationen des Wirkstoffs zugeführt werden oder dass die erwünschte Wirkung aufrechterhalten wird. Faktoren, die berücksichtigt werden können, umfassen die Schwere des Erkrankungszustandes, den allgemeinen Gesundheitszustand des Behandelten, Alter, Gewicht und Geschlecht des Behandelten, Ernährung, Dauer und Häufigkeit der Verabreichung, Wirkstoffkombination(en), Reaktionsempfindlichkeiten und Toleranz/Reaktion auf die Therapie. Langfristig wirkende pharmazeutische Zusammensetzungen können, je nach der Halbwertszeit und Clearance der bestimmten Formulierung, alle 3 bis 4 Tage, jede Woche oder einmal alle zwei Wochen verabreicht werden.
  • Normale Dosierungsmengen können von 0,1 bis 100.000 μg, bis hin zu einer Gesamtdosis von etwa 1 g, je nach Art der Verabreichung, variieren. Richtlinien zu bestimmten Dosierungen und Verabreichungsverfahren sind in der Literatur vorhanden und im Allgemeinen Fachleuten zugänglich. Fachleute setzen für Nucleotide andere Formulierungen ein als für Proteine oder ihre Inhibitoren. In ähnlicher Weise ist die Zufuhr von Polynucleotiden oder Polypeptiden für bestimmte Zellen, Bedingungen, Stellen usw. spezifisch.
  • Wirksame In-vivo-Dosierungen eines Antikörpers liegen im Bereich von etwa 5 μg bis etwa 50 μg/kg, etwa 50 μg bis etwa 5 mg/kg, etwa 100 μg bis etwa 500 μg/kg Patientenkörpergewicht und etwa 200 μg bis etwa 250 μg/kg Patientenkörpergewicht. Zur Verabreichung von Polynucleotiden, die für einkettige Antikörper kodieren, liegen wirksame In-vivo-Dosierungen im Bereich von etwa 100 ng bis etwa 200 ng, 500 ng bis etwa 50 mg, etwa 1 μg bis etwa 2 mg, etwa 5 μg bis etwa 500 μg und etwa 20 μg bis etwa 100 μg DNA.
  • Ist das Expressionsprodukt mRNA, so ist das Reagens vorzugsweise ein Antisense-Oligonucleotid oder ein Ribozym. Polynucleotide, die Antisense-Oligonucleotide oder Ribozyme exprimieren, können in Zellen mittels zahlreicher verschiedener Verfahren eingeführt werden, die bereits oben beschrieben wurden.
  • Vorzugsweise reduziert ein Reagens die Expression eines Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotids oder die Aktivität eines Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids um zumindest etwa 10%, vorzugsweise etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100%, im Vergleich zu Werten in Abwesenheit des Reagens. Die Wirksamkeit des zur Reduktion des Expressionsniveaus eines Prostasin-ähnlichen Enzympolynucleotids oder der Aktivität eines Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids ausgewählten Mechanismus kann unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. Hybridisierung von Nucleotidsonden an für Prostasin-ähnliches Enzym spezifische mRNA, quantitative RT-PCR, immunologische Detektion eines Prostasin-ähnlichen Enzympolypeptids oder Messung von Aktivität von Prostasin-ähnlichem Enzym, bewertet werden.
  • Jede beliebige der pharmazeutischen Zusammensetzungen kann in Kombination mit anderen geeigneten therapeutischen Mitteln verabreicht werden. Die Selektion. der geeigneten Mittel zur Verwendung in Kombinationstherapie können Fachleute gemäß herkömmlicher pharmazeutischer Grundsätze vornehmen. Die Kombination therapeutischer Mittel kann synergistisch wirken, um die Behandlung oder Prävention der verschiedenen zuvor beschriebenen Leiden zu bewirken. Unter Verwendung dieses Ansatzes kann man in der Lage sein, therapeutische Wirksamkeit mit geringen Dosierungen für jedes Reagens zu erzielen und somit mögliche negative Nebenwirkungen zu reduzieren.
  • Jedes beliebige der zuvor beschriebenen therapeutischen Verfahren kann bei jedem Individuum, das einer solchen Therapie bedarf, eingesetzt werden, einschließlich Säugetiere wie Hunde, Katzen, Kühe, Pferde, Kaninchen, Affen und, am meisten bevorzugt, Menschen.
  • BEISPIEL 1
  • Detektion von Aktivität von Prostasin-ähnlichem Enzym
  • Das Polynucleotid von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 5 wird in den Expressionsvektor pCEV4 insertiert, und das erhaltene Expressionsvektor-pCEV4-Prostasin-ähnliche Enzympolypeptid wird in menschliche embryonale Nieren-293-Zellen transfiziert. Aus diesen Zellen werden Extrakte gewonnen, und Proteaseaktivität wird unter Verwendung von Thiobenzylester-Substraten, wie im US-Patent Nr. 5.500.344 beschrieben, gemessen. Zur Überwachung von Enzymaktivitäten aus Granulaten und Säulenfraktionen werden Tests bei Raumtemperatur unter Verwendung von 0,5 mM 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) (Sigma) durchgeführt, um die HSBzl-Abgangsgruppe nachzuweisen (410 = 13.600 M–1 cm–1).
  • BLT-Esterase-Aktivität wird unter Verwendung eines Mikrotitertests (Green & Shaw, Anal. Biochem. 93, 223–226 (1979)) bestimmt. Kurz zusammengefasst werden 50 μl Probe zu 100 μl von 1 mM DTNB, hergestellt in 10 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,2, zugesetzt. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 50 μl BLT (Sigma) initiiert und ergibt eine Endkonzentration von 500 μM. Für Metase-Bestimmungen werden 50 μl von Verdünnungen der Probe in 0,1 M HEPES, 0,05 M CaCl2, pH 7,5, zu 100 μl von 1 mM DTNB zugesetzt, und die Reaktion wird durch den Zusatz von 50 μl Boc-Ala-Ala-Met-S-Benzyl (Bzl) initiiert und ergibt eine Endkonzentration von 150 μM. Die Dauer des Tests hängt von der Farbentwicklung ab, deren Geschwindigkeit (O.D.410) an einem Mikroplattenleser Dynatech MR 5000 gemessen wird. Kontrollen von Probe und DTNB alleine oder DTNB und Substrat alleine werden ebenfalls durchgeführt.
  • Für einen empfindlicheren Vergleich von enzymatischen Aktivitäten werden Peptid-Thiobenzylester-Substrate verwendet, um Proteaseaktivitäten zu messen. Das Chymase-Substrat Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl wird bei BACHEM Bioscience Inc., Philadelphia, Pa., erworben. Z-Arg-SBzl (das Tryptase-Substrat, Kam et al., J. Biol. Chem. 262, 3444–3451 (1987)); Boc-Ala-Ala-AA-SBzl (AA = Asp, Met, Leu, Nle oder Ser) und Suc-Ala-Ala-Met-SBzl (Odake et al., Biochemistry 30, 2217–2227 (1991); Harper et al., Biochemistry 23, 2995–3002 (1984)) werden davor synthetisiert. Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl ist das Substrat für Asp-ase, und Peptidthiobenzylester, die Met, Leu oder Nle enthalten, sind Substrate für Met-ase SP. Tests werden bei Raumtemperatur in 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,5, der 0,01 M CaCl2 und 8% Me2O enthält, unter Verwendung von 0,34 mM 4,4'-Dithiodipyridin (Aldrithiol-4, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.) durchgeführt, um HSBzl-Abgangsgruppe nachzuweisen, die mit 4,4'-Dithiodipyridin reagiert und dadurch Thiopyridon freisetzt (324 = 19.800 M–1 cm–1, Grasetti & Murray, Arch. Biochem. Biophys. 119, 41–49 (1967)). Die anfänglichen Geschwindigkeiten werden bei 324 nm unter Verwendung eines Beckman-35-Spektralphotometers gemessen, wenn 10–25 μl einer Enzym-Ausgangslösung zu einer Küvette, die 2,0 ml Puffer, 150 μl 4,4'-Dithiodipyridin und 25 μl Substrat enthält, zugesetzt werden. Dasselbe Volumen an Substrat und 4,4'-Dithiodipyridin werden zur Vergleichszelle zugesetzt, um die Geschwindigkeit der Hintergrundhydrolyse der Substrate zu kompensieren. Anfangsgeschwindigkeiten werden in zweifacher Ausführung für jede Substratkonzentration gemessen, und in jedem Fall wird der Mittelwert berechnet. Die Substratkonzentrationen betragen 100–133 μM. Es wird gezeigt, dass die Polypeptide aus Seq.-ID Nr. 2 und/oder Seq.-ID Nr. 6 Prostasin-ähnliche Enzymaktivität aufweisen.
  • BEISPIEL 2
  • Identifikation einer Testverbindung, die sich an ein Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid bindet
  • Gereinigte Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide, die ein Glutathion-S-Transferaseprotein umfassen und an Glutathion-derivatisierten Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten absorbiert sind, werden mit Testverbindungen aus einer Bibliothek kleiner Moleküle bei einem pH von 7,0 in einer physiologischen Pufferlösung kontaktiert. Prostasin-ähnliche Enzympolypeptide umfassen die in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 6 gezeigte Aminosäuresequenz. Die Testverbindungen umfassen eine fluoreszierende Markierung. Die Proben werden 5 min bis 1 h lang inkubiert. Kontrollproben werden in Abwesenheit einer Testverbindung inkubiert.
  • Die die Testverbindungen enthaltende Pufferlösung wird aus den Wells gewaschen. Bindung einer Testverbindung an ein Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid wird durch Fluoreszenzmessungen der Inhalte der Wells detektiert. Eine Testverbindung, die die Fluoreszenz in einem Well, verglichen zur Fluoreszenz eines Wells, in dem eine Testverbindung nicht inkubiert wurde, um zumindest 15% steigert, wird als eine Verbindung identifiziert, die sich an ein Prostasin-ähnliches Enzympolypeptid bindet.
  • BEISPIEL 3
  • Identifikation einer Testverbindung, die Aktivität von Prostasin-ähnlichem Enzym reduziert
  • Zellextrakte aus der menschlichen Kolonkrebs-Zelllinie HCT116, werden mit Testverbindungen aus einer Bibliothek kleiner Moleküle kontaktiert und auf Prostasin-ähnliche Enzymaktivität getestet. Kontrollextrakte werden in Abwesenheit von Testverbindung ebenfalls getestet. Proteaseaktivität kann unter Verwendung von Thiobenzylester-Substraten, wie im US-Patent Nr. 5.500.344 beschrieben, gemessen werden. Zur Beobachtung von Enzymaktivitäten von Granulaten und Säulenfraktio nen werden Tests bei Raumtemperatur unter Verwendung von 0,5 mM 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) (Sigma) durchgeführt, um die HSBzl-Abgangsgruppe nachzuweisen (410 = 13.600 M–1 cm–1).
  • BLT-Esterase-Aktivität wird unter Verwendung eines Mikrotitertests (Green & Shaw, Anal. Biochem. 93, 223–226 (1979)) berechnet. Kurz zusammengefasst werden 50 μl Probe zu 100 μl von 1 mM DTNB, hergestellt in 10 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,2, zugesetzt. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 50 μl BLT (Sigma) initiiert und ergibt eine Endkonzentration von 500 μM. Für Metase-Bestimmungen werden 50 μl von Verdünnungen der Probe in 0,1 M HEPES, 0,05 M CaCl2, pH 7,5, zu 100 μl von 1 mM DTNB zugesetzt, und die Reaktion wird durch den Zusatz von 50 μl Boc-Ala-Ala-Met-S-Benzyl (Bzl) initiiert und ergibt eine Endkonzentration von 150 μM. Die Dauer des Tests hängt von der Farbentwicklung ab, deren Geschwindigkeit (O.D.410) an einem Mikroplattenleser Dynatech MR 5000 gemessen wird. Kontrollen von Probe und DTNB alleine oder DTNB und Substrat alleine werden ebenfalls durchgeführt.
  • Für einen empfindlicheren Vergleich von enzymatischen Aktivitäten werden Peptid-Thiobenzylester-Substrate verwendet, um Proteaseaktivitäten zu messen. Das Chymase-Substrat Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl wird bei BACHEM Bioscience Inc., Philadelphia, Pa., erworben. Z-Arg-SBzl (das Tryptase-Substrat, Kam et al., J. Biol. Chem. 262, 3444–3451 (1987)); Boc-Ala-Ala-AA-SBzl (AA=Asp, Met, Leu, Nle oder Ser) und Suc-Ala-Ala-Met-SBzl (Odake et al., Biochemistry 30, 2217–2227 (1991); Harper et al., Biochemistry 23, 2995–3002 (1984)) werden davor synthetisiert. Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl ist das Substrat für Asp-ase, und Peptidthiobenzylester, die Met, Leu oder Nle enthalten, sind Substrate für Met-ase SP. Tests werden bei Raumtemperatur in 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,5, der 0,01 M CaCl2 und 8% Me2O enthält, unter Verwendung von 0,34 mM 4,4'-Dithiodipyridin (Aldrithiol-4, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.) durchgeführt, um HSBzl-Abgangsgruppe nachzuweisen, die mit 4,4'-Dithiodipyridin reagiert und dadurch Thiopyridon freisetzen (324 = 19.800 M–1 cm–1, Grasetti & Murray, Arch. Biochem. Biophys. 119, 41–49 (1967)). Die anfänglichen Geschwindigkeiten werden bei 324 nm unter Verwendung eines Beckman-35- Spektralphotometers gemessen, wenn 10–25 μl einer Enzym-Ausgangslösung zu einer Küvette, die 2,0 ml Puffer, 150 μl 4,4'-Dithiodipyridin und 25 μl Substrat enthält, zugesetzt werden. Dasselbe Volumen an Substrat und 4,4'-Dithiodipyridin werden zur Vergleichszelle zugesetzt, um die Geschwindigkeit der Hintergrundhydrolyse der Substrate zu kompensieren. Anfangsgeschwindigkeiten werden in zweifacher Ausführung für jede Substratkonzentration gemessen, und in jedem Fall wird der Mittelwert berechnet. Die Substratkonzentrationen betragen 100–133 μM.
  • Alternativ dazu kann Prostasin-Aktivität wie in Yu et al., J. Biol. Chem. 269, 11843–11848 (1994), beschrieben gemessen werden.
  • Eine Testverbindung, die Aktivität von Prostasin-ähnlichem Enzym des Extrakts im Vergleich zum Kontrollextrakt um zumindest 20% reduziert, wird als ein Inhibitor von Prostasin-ähnlichem Enzym identifiziert.
  • BEISPIEL 4
  • Identifikation einer Testverbindung, die Expression von Prostasin-ähnlichem Enzymgen reduziert
  • Eine Testverbindung wird einer Kultur der Brusttumor-Zelllinie MDA-468 verabreicht und bei 37°C 10 bis 45 min lang inkubiert. Eine Kultur desselben Zelltyps, die über dieselbe Zeitspanne hinweg ohne die Testverbindung inkubiert wurde, liefert eine negative Kontrolle.
  • RNA wird aus den zwei Kulturen wie in Chirgwin et al., Biochem. 18, 5294–5299 (1979), beschrieben isoliert. Northern-Blots werden unter Verwendung von 20 bis 30 μg Gesamt-RNA hergestellt und mit einer 32P-markierten, für Prostasin-ähnliches Enzym spezifischen Sonde bei 65°C in Express-hyb (CLONTECH) hybridisiert. Die Sonde umfasst zumindest 11 zusammenhängende Nucleotide, ausgewählt aus dem Komplement von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 5. Eine Testverbindung, die das für Prostasin-ähnliches Enzym spezifische Signal im Vergleich zum Signal, das in Ab wesenheit der Testverbindung erhalten wird, reduziert, wird als ein Inhibitor der Expression von Prostasin-ähnlichem Enzymgen identifiziert.
  • BEISPIEL 5
  • Behandlung von Brusttumor mit einem Reagens, das sich spezifisch an ein Prostasin-ähnliches Enzymgenprodukt bindet
  • Synthese von Prostasin-ähnlichen Antisense-Enzymoligonucleotiden, die zumindest 11 zusammenhängende Nucleotide, ausgewählt aus dem Komplement von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 5, umfassen, wird an einem Syntheseautomaten der Serie Pharmacia Gene Assembler unter Verwendung des Phosphoramiditverfahrens durchgeführt (Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 534–583 (1990)). Nach Assemblierung und Entschützung werden die Oligonucleotide zweimal Ethanol-gefällt, getrocknet und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei der erwünschten Konzentration suspendiert. Reinheit dieser Oligonucleotide wird durch Kapillar-Gelelektrophoresen und Ionenaustausch-HPLC getestet. Endotoxin-Konzentrationen im Oligonucleotidpräparat werden unter Verwendung des "Limulus Amebocyte Assay" (Bang, Biol. Bull. (Woods Hole, Mass.) 105, 361–362 (1953)) bestimmt.
  • Eine wässrige Zusammensetzung, die die Antisense-Oligonucleotide in einer Konzentration von 0,1–100 μM enthält, wird mit einer Nadel direkt in einen Brusttumor injiziert. Die Nadel wird in die Tumoren eingeführt und bei gleichzeitiger Abgabe der wässrigen Zusammensetzung innerhalb des Tumors zurückgezogen.
  • Der Brusttumor wird über eine Zeitspanne von Tagen oder Wochen beobachtet. Zusätzliche Injektionen der Antisense-Oligonucleotide können während dieser Zeit verabreicht werden. Metastase des Brusttumors wird aufgrund der reduzierten Aktivität von Prostasin-ähnlichem Enzym der Brusttumorzellen unterdrückt.
  • BEISPIEL 6
  • Expression von rekombinanter menschlicher Prostasin-ähnlicher Serinprotease
  • Der Pichia-pastoris-Expressionsvektor pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) wird verwendet, um große Mengen an rekombinanten menschlichen Prostasin-ähnlichen Serinprotease-Polypeptiden in Hefe herzustellen. Die für Prostasin-ähnliche Serinprotease kodierende DNA-Sequenz ist von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 5 abgeleitet. Vor der Insertion in den Vektor pPICZB wird die DNA-Sequenz mittels bekannter Verfahren auf solche Weise modifiziert, dass sie an ihrem 5'-Ende ein Startcodon und an ihrem 3'-Ende eine Enterokinase-Spaltungsstelle, eine His6-Reportermarkierung und ein Stoppcodon aufweist. Weiters werden an beiden Termini Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen hinzugefügt, und nach Verdau der Mehrfach-Klonierungsstelle von pPICZB mit den entsprechenden Restriktionsenzymen wird die modifizierte DNA-Sequenz in pPICZB ligiert. Dieser Expressionsvektor ist für induzierbare Expression in Pichia pastoris, gesteuert durch einen Hefe-Promotor, konzipiert. Der resultierende pPICZ/md-His6-Vektor wird verwendet, um die Hefe zu transformieren.
  • Die Hefe wird unter üblichen Bedingungen in 5-l-Schüttelkolben kultiviert, und das rekombinant produzierte Protein wird aus der Kultur durch Affinitätschromatographie (Ni-NTA-Harz) in Gegenwart von 8 M Harnstoff isoliert. Das gebundene Polypeptid wird mit Puffer, pH 3,5, eluiert und neutralisiert. Trennung des Polypeptids von der His6-Reportermarkierung erfolgt durch ortsgerichtete Proteolyse unter Verwendung von Enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Gereinigtes menschliches Prostasin-ähnliches Serinprotease-Polypeptid wird erhalten.
  • BEISPIEL 7
  • In-vivo-Testen von Verbindungen/Target-Validierung
  • 1. Akute mechanistische Tests
  • 1.1. Reduktion der Konzentrationen von mitogenem Plasmahormon
  • Dieser Nicht-Tumor-Test misst die Fähigkeit einer Verbindung, entweder die endogene Konzentration eines im Blutkreislauf zirkulierenden Hormons oder die Konzentration von Hormon, das in Reaktion auf einen biologischen Stimulus produziert wird, zu reduzieren. Nagetieren wird Testverbindung (p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k.) verabreicht. Nach einer bestimmten Dauer nach der Verabreichung von Testverbindung wird Blutplasma abgenommen. Das Plasma wird auf Konzentrationen des Hormons von Interesse getestet. Sind die normalen Konzentrationen des Hormons im Blutkreislauf zu gering und/oder zu unterschiedlich, um zuverlässige Resultate zu liefern, so kann die Konzentration des Hormons durch eine Vorbehandlung mit einem biologischen Stimulus erhöht werden (d.h. LHRH kann Mäusen i.m. bei einer Dosierung von 30 ng/Maus injiziert werden, um einen Burst von Testosteronsynthese zu induzieren). Der Zeitpunkt der Plasma-Abnahme wird so festgelegt, dass er mit dem Peak der induzierten Hormonreaktion zusammenfällt. Verbindungswirkungen werden mit einer Kontrollgruppe verglichen, die mit Vehikel behandelt wurde. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, und hierauf folgt ein Student-t-Test. Die Signifikanz ist ein p-Wert ≤ 0,05, verglichen mit der Vehikel-Kontrollgruppe.
  • 1.2. Hohlfasermechanismus von Aktionstest
  • Hohlfasern werden mit erwünschter/n Zelllinie(n) hergestellt und Nagetieren intraperitoneal und/oder subkutan implantiert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. verabreicht. Fasern werden gemäß einer spezifischen Arbeitsvorschrift für Ablesungstests geerntet, die Tests für Genexpression (bDNA, PCR oder Taqman) oder für eine spezifische biochemische Aktivität (d.h. cAMP-Konzentrationen) umfassen können. Resultate werden mittels Student-t-Test oder Rank-Sum-Test analysiert, nachdem die Varianz zwischen Gruppen mittels eines F-Tests verglichen wurde, mit einer Signifikanz von p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe.
  • 2. Subakute In-vivo-Funktionstests
  • 2.1. Reduktion der Masse von Hormon-abhängigen Geweben
  • Dies ist ein anderer Nicht-Tumor-Test, der die Fähigkeit einer Verbindung misst, die Masse eines Hormon-abhängigen Gewebes (d.h. Samenbläschen bei männlichen und Uteri bei weiblichen Tieren) zu reduzieren. Nagetieren wird Testverbindung (p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k.) gemäß einem vorbestimmten Plan und eine vorbestimmte Zeit lang (d.h. 1 Woche) verabreicht. Am Ende der Studie werden die Tiere gewogen, das Target-Organ wird herausgeschnitten, sämtliche Flüssigkeit wird ausgepresst, und das Gewicht des Organs wird aufgezeichnet. Blutplasma kann auch gesammelt werden. Plasma kann auf Konzentrationen eines Hormons von Interesse oder auf Konzentrationen von Testmittel getestet werden. Organgewichte können direkt verglichen oder können in Bezug auf das Körpergewicht des Tiers normalisiert werden. Verbindungswirkungen werden mit einer mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe verglichen. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, und hierauf folgt ein Student-t-Test. Die Signifikanz ist ein p-Wert ≤ 0,05, verglichen mit der Vehikel-Kontrollgruppe.
  • 2.2. Hohlfasern-Proliferationstest
  • Hohlfasern werden mit erwünschter/n Zelllinie(n) hergestellt und Nagetieren intraperitoneal und/oder subkutan implantiert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. verabreicht. Fasern werden gemäß einer spezifischen Ablesungstest-Arbeitsvorschrift geerntet. Zellproliferation wird durch Messen eines Zellzahl-Markers (d.h. MTT oder LDH) bestimmt. Die Zellzahl und Veränderung der Zellzahl im Ver gleich zum Ausgangs-Inokulums werden durch Student-t-Test oder Rank-Sum-Test analysiert, nachdem die Varianz zwischen Gruppen mittels eines F-Tests verglichen wurde, mit einer Signifikanz von p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe.
  • 2.3. Anti-Angiogenese-Modelle
  • 2.3.1. Angiogenese der Kornea
  • Hydron-Pellets mit oder ohne Wachstumsfaktor oder Zellen werden in einen Mikrohohlraum, der chirurgisch in der Kornea des Nagetiers geschaffen wurde, implantiert. Die Verabreichung der Verbindung kann systemisch oder lokal erfolgen (Verbindung, vermischt mit Wachstumsfaktoren im Hydron-Pellet). Die Korneae werden 7 Tage nach der Implantation, unverzüglich nach intrakardialer Infusion von kolloidalem Kohlenstoff, geerntet und in 10% Formalin fixiert. Die Ablesung erfolgt in Form einer qualitativen Auswertung und/oder einer Bildanalyse. Qualitative Ergebnisse werden mittels Rank-Sum-Test verglichen. Bildanalyse-Daten werden durch Messen des Bereichs der Neovaskularisation (in Pixeln) bewertet, und Mittelwerte für Gruppen werden mittels Student-t-Test verglichen (2-seitig). Signifikanz ist p > 0,05 im Vergleich mit der Gruppe mit nur Wachstumsfaktor oder nur Zellen.
  • 2.3.2. Matrigel-Angiogenese
  • Matrigel, das Zellen oder Wachstumsfaktoren enthält, wird subkutan injiziert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. verabreicht. Matrigel-Pfropfen werden zu (einem) vorbestimmten Zeitpunkten) geerntet und zur Ablesung vorbereitet. Die Ablesung ist ein auf ELISA basierender Test für Hämoglobinkonzentration und/oder eine histologische Untersuchung (d.h. Blutgefäßzählungen, spezielles Färben von Endothel-Oberflächenmarkern: CD31, Faktor-8). Ablesungen werden mittels Student-t-Test analysiert, mit einer bei p < 0,05 bestimmten Signifikanz im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe.
  • 3. Anti-Tumor-Wirksamkeit gegen Primärtumoren
  • 3.1. Modelle früher Therapie
  • 3.1.1. Subkutaner Tumor
  • Tumorzellen oder -fragmente werden an Tag 0 subkutan implantiert. Vehikel und/oder Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht, der an einem Zeitpunkt, üblicherweise an Tag 1, bevor die Möglichkeit besteht, die Tumorbelastung zu messen, beginnt. Körpergewichte und Tumormessungen werden zwei- bis dreimal wöchentlich aufgezeichnet. Die mittleren Netto-Körpergewichte- und -Tumorgewichte werden für jeden Datensammlungstag berechnet. Anti-Tumor-Wirksamkeit kann anfänglich durch Vergleichen der Größe von behandelten (T) und Kontroll-(C)Tumoren an einem bestimmten Tag mittels des Student-t-Tests bestimmt werden, nachdem die Varianz zwischen den Gruppen mittels eines F-Tests, mit einer bei p ≤ 0,05 bestimmten Signifikanz, verglichen wurde. Der Versuch kann auch nach dem Ende der Dosierung fortgesetzt werden, wobei Tumormessungen weiterhin aufgezeichnet werden würden, um Tumorwachstumsverzögerungen zu beobachten. Tumorwachstumsverzögerungen werden ausgedrückt als die Differenz der mittleren Dauer für die behandelten und Kontrollgruppen, eine vorbestimmte Größe zu erreichen, dividiert durch die mittlere Dauer für die Kontrollgruppe, diese Größe zu erreichen. Wachstumsverzögerungen werden mittels der Erstellung von Kaplan-Meier-Kurven für die Zeit, die die einzelnen Tumoren benötigen, um die Bewertungsgröße zu erreichen, verglichen. Signifikanz ist p ≤ 0,05.
  • 3.1.2. Intraperitoneale/Intrakranielle Tumormodelle
  • Tumorzellen werden intraperitoneal oder intrakraniell an Tag 0 injiziert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan, beginnend an Tag 1, verabreicht. Beobachtungen von Morbidität und/oder Mortalität werden zwei mal täglich aufgezeichnet. Körpergewichte werden gemessen und zweimal wöchentlich aufgezeichnet. Daten zu Morbidität/Mortalität werden als mittlere Überlebensdauer angegeben, und die Anzahl von langfristig überlebenden Individuen wird separat angegeben. Überlebensdauern werden verwendet, um Kaplan-Meier-Kurven zu erstellen. Signifikanz ist p < 0,05, ermittelt durch Log-Rank-Test, verglichen mit der Kontrollgruppe im Versuch.
  • 3.2. Erstellte Erkrankungsmodelle
  • Tumorzellen oder -fragmente werden subkutan implantiert und bis zur erwünschten Größe, um die Behandlung zu beginnen, wachsen gelassen. Nachdem der Bereich der vorbestimmten Größe erreicht wurde, werden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in Behandlungsgruppen eingeteilt. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht. Tumor- und Körpergewichte werden gemessen und zwei- bis dreimal wöchentlich aufgezeichnet. Mittlere Tumorgewichte von allen Gruppen werden über die Tage nach der Inokulation hinweg zu Vergleichszwecken graphisch dargestellt. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, gefolgt von einem Student-t-Test, um Tumorgrößen in den behandelten und Kontrollgruppen am Ende der Behandlung zu vergleichen. Signifikanz ist p ≤ 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Tumormessungen können nach Abschluss der Dosierung aufgezeichnet werden, um Tumorwachstumsverzögerung zu beobachten. Tumorwachstumsverzögerungen werden ausgedrückt als die Differenz der mittleren Dauer für die behandelten und Kontrollgruppen, eine vorbestimmte Größe zu erreichen, dividiert durch die mittlere Dauer für die Kontrollgruppe, diese Größe zu erreichen. Wachstumsverzögerungen werden mittels der Erstellung von Kaplan-Meier-Kurven für die Zeiten, die die einzelnen Tumoren benötigen, um die Bewertungsgröße zu erreichen, verglichen. Signifikanz ist p ≤ 0,05, verglichen mit der Vehikel-Kontrollgruppe.
  • 3.3. Orthotopische Erkrankungsmodelle
  • 3.3.1. Brustfettpolster-Test
  • Tumorzellen oder -fragmente, abstammend aus Brust-Adenokarzinom, werden direkt in einen chirurgisch freigelegten und zurückgebogenen Brustfettpolster in Nagetieren implantiert. Der Fettpolster wird zurück in seine ursprüngliche Position gebracht und die chirurgische Schnittstelle geschlossen. Hormone können den Nagetieren ebenfalls verabreicht werden, um das Wachstum der Tumoren zu unterstützen. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht. Tumor- und Körpergewichte werden gemessen und zwei- bis dreimal wöchentlich aufgezeichnet. Mittlere Tumorgewichte von allen Gruppen über die Tage nach der Inokulation hinweg werden zu Vergleichszwecken graphisch dargestellt. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, gefolgt von einem Student-t-Test, um Tumorgrößen in den behandelten und Kontrollgruppen am Ende der Behandlung zu vergleichen. Signifikanz ist p ≤ 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe.
  • Tumormessungen können nach Abschluss der Dosierung aufgezeichnet werden, um Tumorwachstumsverzögerung zu beobachten. Tumorwachstumsverzögerungen werden ausgedrückt als die Differenz der mittleren Dauer für die behandelten und Kontrollgruppen, eine vorbestimmte Größe zu erreichen, dividiert durch die mittlere Dauer für die Kontrollgruppe, diese Größe zu erreichen. Wachstumsverzögerungen werden mittels der Erstellung von Kaplan-Meier-Kurven für die Zeiten, die die einzelnen Tumoren benötigen, um die Bewertungsgröße zu erreichen, verglichen. Signifikanz ist der Wert p ≤ 0,05, verglichen mit der Vehikel-Kontrollgruppe. Zusätzlich stellt dieses Modell eine Gelegenheit dar, die Geschwindigkeit spontaner Metastasenbildung von diesem Tumortyp zu erhöhen. Metastasenbildung kann am Ende der Studie durch Zählen der Anzahl sichtbarer Herde pro Target-Organ oder durch Messen des Gewichts des Target-Organs bewertet werden. Die Mittelwerte dieser Endpunkte werden mittels Student-t-Test nach der Durchführung eines F-Tests, mit einer bei p ≤ 0,05 bestimmten Signifikanz verglichen mit der Kontrollgruppe des Versuchs, verglichen.
  • 3.3.2. Intraprostatischer Test
  • Tumorzellen oder -fragmente, abstammend von prostatischem Adenokarzinom, werden direkt in einen chirurgisch freigelegten dorsalen Lappen der Prostata in Nagetieren implantiert. Die Prostata wird durch eine abdominale Inzision so nach außen freigelegt, dass der Tumor spezifisch in den dorsalen Lappen implantiert werden kann, während sichergestellt ist, dass das Implantat nicht in die Samenbläschen eindringt. Die erfolgreich inokulierte Prostata wird zurück in das Abdomen platziert, und die Schnitte durch Abdomen und Haut werden geschlossen. Hormone können den Nagetieren ebenfalls verabreicht werden, um das Wachstum der Tumoren zu unterstützen. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht. Körpergewichte werden gemessen und zwei- bis dreimal wöchentlich aufgezeichnet. Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt wird der Versuch abgeschlossen und das Tier seziert. Die Größe des Primärtumors wird unter Verwendung eines Messschiebers oder eines Okularmikrometers, das an einem Präpariermikroskop angebracht ist, dreidimensional gemessen. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, gefolgt von einem Student-t-Test, um Tumorgrößen in den behandelten und Kontrollgruppen am Ende der Behandlung zu vergleichen. Signifikanz ist p ≤ 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe.
  • Dieses Modell bietet eine Gelegenheit, die Geschwindigkeit spontaner Metastasenbildung von diesem Tumortyp zu erhöhen. Metastasenbildung kann am Ende der Studie durch Zählen der Anzahl sichtbarer Herde pro Target-Organ (d.h. der Lungen) oder durch Messen des Gewichts des Target-Organs (d.h. der Lymphknoten dieses Bereichs) bewertet werden. Die Mittelwerte dieser Endpunkte werden mittels Student-t-Test nach der Durchführung eines F-Tests, mit einer bei p ≤ 0,05 bestimmten Signifikanz verglichen mit der Kontrollgruppe des Versuchs, verglichen.
  • 3.3.3. Intrabronchialer Test
  • Tumorzellen pulmonalen Ursprungs können intrabronchial durch Ansetzen eines Schnitts durch die Haut und Freilegen der Trachea implantiert werden. Die Trachea wird mit dem abgeschrägten Ende einer 25-Gauge-Nadel durchstochen, und die Tumorzellen werden unter Verwendung einer planendigen 27-Gauge-Nadel mit einer 90°-Krümmung in den Hauptbronchus inokuliert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht. Körpergewichte werden gemessen und zwei- bis dreimal wöchentlich aufgezeichnet. Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt wird der Versuch abgeschlossen und das Tier seziert. Die Größe des Primärtumors wird unter Verwendung eines Messschiebers oder eines Okularmikrometers, das an einem Präpariermikroskop angebracht ist, dreidimensional gemessen. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, gefolgt von einem Student-t-Test, um Tumorgrößen in den behandelten und Kontrollgruppen am Ende der Behandlung zu vergleichen. Signifikanz ist p ≤ 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieses Modell bietet eine Gelegenheit, die Geschwindigkeit spontaner Metastasenbildung von diesem Tumortyp zu erhöhen. Metastasenbildung kann am Ende der Studie durch Zählen der Anzahl sichtbarer Herde pro Target-Organ (d.h. der kontralateralen Lunge) oder durch Messen des Gewichts des Target-Organs bewertet werden. Die Mittelwerte dieser Endpunkte werden mittels Student-t-Test nach der Durchführung eines F-Tests, mit einer bei p ≤ 0,05 bestimmten Signifikanz, verglichen mit der Kontrollgruppe des Versuchs, verglichen.
  • 3.3.4. Intrazäkaler Test
  • Tumorzellen aus dem Magen-Darm-Trakt können intrazäkal durch Ansetzen eines abdominalen Schnitts durch die Haut und Freilegen des Darms implantiert werden. Tumorzellen werden unter Verwendung einer 27- oder 30-Gauge-Nadel in die Wand des Caecums inokuliert, ohne das Lumen des Darms zu durchdringen. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht. Körpergewichte werden gemessen und zwei- bis dreimal wöchentlich aufgezeichnet.
  • Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt wird der Versuch abgeschlossen und das Tier seziert. Die Größe des Primärtumors wird unter Verwendung eines Messschiebers oder eines Okularmikrometers, das an einem Präpariermikroskop angebracht ist, dreidimensional gemessen. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, gefolgt von einem Student-t-Test, um Tumorgrößen in den behandelten und Kontrollgruppen am Ende der Behandlung zu vergleichen. Signifikanz ist p ≤ 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieses Modell bietet eine Gelegenheit, die Geschwindigkeit spontaner Metastasenbildung von diesem Tumortyp zu erhöhen. Metastasenbildung kann am Ende der Studie durch Zählen der Anzahl sichtbarer Herde pro Target-Organ (d.h. der Leber) oder durch Messen des Gewichts des Target-Organs bewertet werden. Die Mittelwerte dieser Endpunkte werden mittels Student-t-Test nach der Durchführung eines F-Tests, mit einer bei p ≤ 0,05 bestimmten Signifikanz verglichen mit der Kontrollgruppe des Versuchs, verglichen.
  • 4. Antitumor-Wirksamkeit gegen sekundäre Tumoren (Metastasen)
  • 4.1. Spontane Metastasen
  • Tumorzellen werden s.k. inokuliert, und die Tumoren werden bis zu einem vorbestimmten Bereich für Studien zu spontanen Metastasen bezüglich der Lunge oder Leber wachsen gelassen. Diese primären Tumoren werden dann exzidiert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht, der die Zeitspanne bis zur Exzision des Primärtumors einbinden kann, um Therapien zu bewerten, die darauf abzielen, die frühen Stadien von Tumormetastasenbildung zu inhibieren. Beobachtungen von Morbidität und/oder Mortalität werden täglich aufgezeichnet. Körpergewichte werden gemessen und zweimal wöchentlich aufgezeichnet. Mögliche Endpunkte umfassen Überlebensdauer, Anzahl sichtbarer Herde pro Target-Organ oder Gewicht des Target-Organs. Wird die Überlebensdauer als Endpunkt verwendet, so werden die anderen Werte nicht bestimmt. Überlebensdaten werden verwendet, um Kaplan-Meier-Kurven zu erstellen. Signifikanz ist p ≤ 0,05, ermittelt durch Log-Rank-Test, verglichen mit der Kontrollgruppe im Versuch. Die mittlere Anzahl an sichtbaren Tumorherden, bestimmt unter einem Präpariermikroskop, und die mittleren Gewichte des Target-Organs werden mittels Student-t-Test nach Durchführung eines F-Tests verglichen, mit einer bei p ≤ 0,05 festgelegten Signifikanz im Vergleich zur Kontrollgruppe im Versuch für beide dieser Endpunkte.
  • 4.2. Erzwungene Metastase
  • Tumorzellen werden in Studien zu experimenteller (erzwungener) Lungen-, Leber- und Knochenmetastase in die Schwanzvene, Pfortader bzw. den linken Ventrikel des Herzens injiziert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht. Beobachtungen von Morbidität und/oder Mortalität werden täglich aufgezeichnet. Körpergewichte werden gemessen und zweimal wöchentlich aufgezeichnet. Mögliche Endpunkte umfassen Überlebensdauer, Anzahl sichtbarer Herde pro Target-Organ oder Gewicht des Target-Organs. Wird die Überlebensdauer als Endpunkt verwendet, so werden die anderen Werte nicht bestimmt. Überlebensdaten werden verwendet, um Kaplan-Meier-Kurven zu erstellen. Signifikanz ist p ≤ 0,05, ermittelt durch Log-Rank-Test, verglichen mit der Kontrollgruppe im Versuch. Die mittlere Anzahl an sichtbaren Tumorherden, bestimmt unter einem Präpariermikroskop, und die mittleren Gewichte des Target-Organs werden mittels Student-t-Test nach Durchführung eines F-Tests verglichen, mit einer Signifikanz bei p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe im Versuch für beide Endpunkte.
  • BEISPIEL 8
  • Proliferationsinhibitions-Test: Antisense-Oligonucleotide unterdrücken das Wachstum von Krebszelllinien
  • Die für die Tests verwendete Zelllinie ist die menschliche Kolonkrebs-Zelllinie HCT116. Zellen werden in RPMI-1640 mit 10–15% fötalem Kälberserum bei einer Konzentration von 10.000 Zellen pro ml in einem Volumen von 0,5 ml kultiviert und bei 37°C in einer Atmosphäre aus 95% Luft und 5% CO2 gehalten.
  • Thiophosphatoligoribonucleotide werden an einem DNA-Syntheseautomaten Applied Biosystems Modell 380B unter Verwendung von Phosphoramidit-Chemie synthetisiert. Eine Sequenz von 24 Basen, die komplementär zu den Nucleotiden an Position 1 bis 24 aus Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 5 sind, wird als das Test-Oligonucleotid verwendet. Als eine Kontrolle wird eine andere (randomisierte) Sequenz verwendet: 5'-TCA ACT GAC TAG ATG TAC ATG GAC-3'. Nach Assemblierung und Entschützung werden Oligonucleotide zweimal Ethanol-gefällt, getrocknet und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in den erwünschten Konzentrationen suspendiert. Die Reinheit der Oligonucleotide wird durch Kapillar-Gelelektrophorese und Ionenaustausch-HPLC getestet. Die gereinigten Oligonucleotide werden zum Kulturmedium in einer Konzentration von 10 μM einmal pro Tag sieben Tage lang zugesetzt.
  • Der Zusatz des Test-Oligonucleotids über sieben Tage hinweg resultiert in signifikant reduzierter Expression von menschlicher Prostasin-ähnlicher Serinprotease, wie durch Western-Blotting bestimmt wird. Diese Wirkung wird mit dem Kontroll-Oligonucleotid nicht beobachtet. Nach 3 bis 7 Tagen wird die Anzahl an Zellen in den Kulturen unter Verwendung eines automatischen Zellzählers gezählt. Die Anzahl an Zellen in Kulturen, die mit dem Test-Oligonucleotid behandelt wurden (als 100% ausgedrückt), wird mit der Anzahl an Zellen in Kulturen verglichen, die mit dem Kontroll-Oligonucleotid behandelt wurden. Die Anzahl an Zellen in Kulturen, die mit dem Test-Oligonucleotid behandelt wurden, ist nicht mehr als 30% der Kontrolle, was darauf hinweist, dass die Inhibition von menschlicher Prostasin-ähnlicher Serinprotease eine anti-proliferative Wirkung auf Krebszellen hat.
  • BEISPIEL 9
  • In-vivo-Tests von Verbindungen/Target-Validierung
  • 1. Schmerz:
  • Akuter Schmerz
  • Akuter Schmerz wird an einer heißen Platte, hauptsächlich mit Ratten, gemessen. Zwei Varianten von Tests mit heißer Platte werden verwendet: In der klassischen Variante werden die Tiere auf eine heiße Oberfläche (52 bis 56°C) gesetzt, und die Latenzdauer wird gemessen, bis die Tiere nozifensives Verhalten, wie beispielsweise Hin- und Hertreten oder Fußlecken, zeigen. Die andere Variante ist eine heiße Platte mit steigender Temperatur, bei der die Versuchstiere auf eine Oberfläche mit neutraler Temperatur gesetzt werden. Daraufhin wird diese Oberfläche langsam, aber konstant erhitzt, bis die Tiere beginnen, eine Hinterpfote zu lecken. Die Temperatur, die erreicht wurde, wenn dieses Lecken der Hinterpfote beginnt, ist ein Maß für die Schmerzschwelle.
  • Verbindungen werden wiederum im Vergleich zu einer mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe getestet. Substanzanwendung erfolgt zu drei unterschiedlichen Zeitpunkten über unterschiedliche Wege der Verabreichung (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.k., intradermal, transdermal) vor den Schmerztests.
  • Beständiger Schmerz
  • Beständiger Schmerz wird mit dem Formalin- oder Capsaicin-Test, hauptsächlich bei Ratten, gemessen. Eine Lösung von 1 bis 5% Formalin oder 10 bis 100 μg Capsaicin wird in eine Hinterpfote des Versuchstiers injiziert. Nach der Formalin- oder Capsaicin-Anwendung zeigen die Tiere nozifensive Reaktionen wie Zucken mit, Lecken und Beißen der beeinträchtigten Pfote. Die Anzahl an nozifensiven Reaktionen innerhalb einer Zeitspanne von 90 min ist ein Maß für Schmerzintensität.
  • Verbindungen werden im Vergleich mit einer mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe getestet. Substanzanwendung erfolgt zu unterschiedlichen Zeitpunkten über unterschiedliche Wege der Verabreichung (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.k., intradermal, transdermal) vor der Verabreichung von Formalin oder Capsaicin.
  • Neuropathischer Schmerz
  • Neuropathischer Schmerz wird durch verschiedene Varianten von einseitiger Verletzung des Ischiasnervs, hauptsächlich bei Ratten, induziert. Die Operation erfolgt unter Anästhesie. Die erste Variante von Ischiasnervverletzung wird durch Anbringen locker zusammenschnürender Abbindungen rund um den Nervus ischiadicus communis (Ischiasnerv) hervorgerufen. Die zweite Variante ist die enge Abbindung von etwa dem halben Durchmesser des gewöhnlichen Ischiasnervs. In der nächsten Variante wird eine Gruppe von Modellen verwendet, in denen enge Abbindungen oder Durchtrennungen entweder der L5- und L6-Spinalnerven oder nur des L5-Spinalnervs angebracht bzw. durchgeführt wurden. Die vierte Variante umfasst eine Axotomie von zwei der drei terminalen Äste des Ischiasnervs (des Nervus tibialis und des Nervus peroneus communis), wobei der verbleibende Nervus suralis intakt bleibt, während die letzte Variante nur die Axotomie des Tibialis-Astes umfasst und sowohl Nervus suralis als auch Nervus peroneus communis unverletzt belässt. Kontrolltiere werden mit einer Simulationsoperation behandelt.
  • Postoperativ entwickeln die nervenverletzten Tiere eine chronische mechanische Allodynie, Kälte-Allodynie sowie eine thermische Hyperalgesie. Mechanische Allodynie wird mittels eines Druckwandlers (Elektronik von Frey Anesthesiometer, IITC Inc. Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA; Elektronik von Frey System, Somedic Sales AB, Hörby, Schweden) gemessen. Thermische Hyperalgesie wird mittels einer Strahlungswärmequelle (Plantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italien) oder mittels einer kalten Platte von 5 bis 10°C gemessen, wobei die nozifensiven Reaktionen der beeinträchtigen Hinterpfote als ein Maß von Schmerzempfindlichkeit gemessen werden. Ein weiterer Test für kälteinduzierten Schmerz ist das Zählen von nozifensiven Reaktionen oder der Dauer von nozifensiven Reaktionen, nachdem der beeinträch tigten Hinterpfote plantar Aceton verabreicht wurde. Chronischer Schmerz wird im Allgemeinen durch Aufzeichnen der zirkadianen Rhythmen im Wachzustand (Surjo & Arndt, Universität zu Köln, Köln, Deutschland) und durch Bewertungsunterschiede der Gangart (Fußabdruckmuster; FOOTPRINTS-Programm, Klapdor et al., Ein kostengünstiges Verfahren zur Analyse von Fußabdruckmustern, J. Neurosci. Methods 75, 49–54 (1997)) bewertet.
  • Verbindungen werden im Vergleich zu scheinoperierten und mit Vehikel behandelten Kontrollgruppen getestet. Substanzanwendung erfolgt zu unterschiedlichen Zeitpunkten über unterschiedliche Wege der Verabreichung (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.k., intradermal, transdermal) vor den Schmerztests.
  • Entzündungsschmerz
  • Entzündungsschmerz wird hauptsächlich bei Ratten durch Injektion von 0,75 mg Carrageenan oder komplettem Freundschem Adjuvans in eine Hinterpfote induziert. Die Tiere entwickeln ein Ödem mit mechanischer Allodynie sowie thermischer Hyperalgesie. Mechanische Allodynie wird mittels eines Druckwandlers (Elektronik von Frey Anesthesiometer, IITC Inc. Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA) gemessen. Thermische Hyperalgesie wird mittels einer Strahlungswärmequelle (Plantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italien; Paw thermal stimulator, G. Ozaki, University of California, USA) gemessen. Für Ödemmessungen werden zwei Verfahren eingesetzt. Beim ersten Verfahren werden die Tiere getötet und die beeinträchtigten Hinterpfoten abgetrennt und gewogen. Das zweite Verfahren arbeitet mit Unterschieden des Pfotenvolumens durch Messen von Wasserverschiebung in einem Plethysmometer (Ugo Basile, Comerio, Italien).
  • Verbindungen werden im Vergleich zu entzündungsfreien sowie mit Vehikel behandelten Kontrollgruppen getestet. Substanzanwendung erfolgt zu unterschiedlichen Zeitpunkten über unterschiedliche Wege der Verabreichung (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.k., intradermal, transdermal) vor den Schmerztests.
  • Diabetischer neuropathischer Schmerz
  • Ratten, die mit einer einfachen intraperitonealen Injektion von 50 bis 80 mg/kg Streptozotocin behandelt wurden, entwickeln eine schwere Hyperglykämie und mechanische Allodynie binnen 1 bis 3 Wochen. Mechanische Allodynie wird mittels eines Druckwandlers (Elektronik von Frey Anesthesiometer, IITC Inc., Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA) gemessen.
  • Verbindungen werden im Vergleich zu diabetischen und nicht-diabetischen mit Vehikel behandelten Kontrollgruppen getestet. Substanzanwendung erfolgt zu unterschiedlichen Zeitpunkten über unterschiedliche Wege der Verabreichung (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.k., intradermal, transdermal) vor den Schmerztests.
  • 2. Parkinson-Krankheit
  • 6-Hydroxydopamin-(6-OH-DA)Läsion
  • Degeneration der dopaminergen nigrostriatalen und striatopallidalen Stoffwechselwege ist das zentrale pathologische Ereignis bei Parkinson-Krankheit. Diese Störung wurde in Versuchen an Ratten unter Verwendung von einfachen/aufeinander folgenden einseitigen stereotaktischen Injektionen von 6-OH-DA in das mediale Vorderhirnbündel (MFB) nachgeahmt.
  • Männliche Wistar-Ratten (Harlan Winkelmann, Deutschland), die 200 ± 250 g zu Beginn des Versuchs wiegen, werden verwendet. Die Ratten werden in einer Temperatur- und Feuchtigkeits-kontrollierten Umgebung unter einem 12-h-Licht/Dunkelheit-Zyklus bei freiem Zugang zu Nahrung und Wasser außerhalb der Versuchseinheiten gehalten. Die folgenden In-vivo-Arbeitsvorschriften sind von den Regierungsbehörden genehmigt. Es wird bestmöglich darauf geachtet, das Leiden der Tiere zu minimieren, die Anzahl an verwendeten Tieren zu reduzieren und Alternativen zu In-vivo-Verfahren zu verwenden.
  • Den Tieren wird Pargylin am Tag der Operation verabreicht (Sigma, St. Louis, MO, USA; 50 mg/kg i.p.), um den Stoffwechsel von 6-OH-DA durch Monoaminoxidase zu inhibieren, und Desmethylimipramin-HCl (Sigma; 25 mg/kg i.p.), um die Aufnahme von 6-OH-DA durch noradrenerge Termini zu unterbinden. Dreißig Minuten später werden die Ratten mit Natriumpentobarbital (50 mg/kg) anästhesiert und in einen stereotaktischen Rahmen gespannt. Um den DA-nigrostriatalen Stoffwechselweg zu verletzen, werden 4 μl von 0,01%iger Ascorbinsäure-Kochsalzlösung, die 8 μg 6-OH-DA-HBr (Sigma) enthält, mit einer Geschwindigkeit von 1 μl/min in das linke mediale Vorderhirnbündel (2,4 mm anterior, 1,49 mm lateral, –2,7 mm ventral zu Bregma und der Schädeloberfläche) injiziert. Die Nadel wird weitere 5 min lang an der Injektionsstelle belassen, um das Eintreten von Diffusion zu ermöglichen.
  • Schritttests
  • Vorderpfoten-Akinesie wird drei Wochen nach Verursachung der Läsion unter Verwendung einer modifizierten Schritttest-Arbeitsvorschrift bewertet. Kurz zusammengefasst werden die Tiere vom Versuchsleiter mit einer Hand gehalten, die die Hinterextremitäten fixiert und das Hinterteil leicht über der Tischfläche aufhebt. Eine Pfote berührt den Tisch und wird dann langsam zur Seite (5 s für 1 m) bewegt, zuerst in die Vorhandrichtung (Sohle nach unten) und dann in die Rückhandrichtung (Rist nach unten). Die Anzahl an ausgleichenden Schritten wird für beide Pfoten in den beiden Bewegungsrichtungen gezählt. Die Testabfolge lautet zuerst Vorhand- und Rückhand-Ausgleichsschritte mit der rechten Pfote und anschließend Vorhand- und Rückhand-Richtungen mit der linken Pfote. Der Test wird dreimal an drei aufeinander folgenden Tagen wiederholt, wobei vor dem ersten Testdurchgang eine anfängliche Trainingsphase von drei Tagen eingehalten wird. Vorhand-Ausgleichsschritte zeigen keine übereinstimmenden vorhandenen Unterschiede zwischen verletzten Tieren und gesunden Kontrolltieren. Die Analyse ist daher auf Rückhand-Ausgleichsschritte beschränkt.
  • Gleichgewichtstest
  • Gleichgewichts-Ausgleich nach Beeinträchtigung der Körperstellung wird ebenfalls während der Schritttesteinheiten gemessen. Die Ratten werden in derselben Position gehalten, wie zuvor für den Schritttest beschrieben wurde, und werden, anstelle der Seitbewegung, vom Versuchsleiter in Richtung jener Seite, an der die Pfote den Tisch berührt, geneigt. Dieses Manöver führt zu einem Gleichgewichtsverlust, und die Fähigkeit der Ratten, das Gleichgewicht durch Bewegungen der Vorderpfote wieder zu gewinnen, wird auf einer Skala von 0 bis 3 aufgezeichnet. Bewertung 0 wird für eine normale Vorderpfotenbewegung verliehen. Ist die Bewegung der Vorderpfote verzögert, kann jedoch das Wiedergewinnen des Körpergleichgewichts nachgewiesen werden, so wird die Bewertung 1 vergeben. Bewertung 2 steht für eine eindeutige, jedoch unzulängliche Vorderpfotenreaktion, die durch Muskelkontraktion erkannt werden kann, die jedoch zu keiner erfolgreichen Wiedererlangung des Gleichgewichts führt, und die Bewertung 3 wird für keine Bewegungsreaktion vergeben. Der Test wird dreimal täglich auf jeder Seite an drei aufeinander folgenden Tagen wiederholt, wobei vor dem ersten Testdurchgang eine anfängliche Trainingsphase von drei Tagen eingehalten wird.
  • Treppen-Test (Pfotengriff)
  • Eine modifizierte Ausführung des Treppen-Tests wird zur Bewertung des Verhaltens des Pfotengriffs drei Wochen nach Zufügung der primären und sekundären Läsion verwendet. Plexiglas-Testboxen mit einer zentralen Platte und einer entfernbaren Treppe an jeder Seite werden verwendet. Die Vorrichtung ist so konzipiert, dass nur die Pfote auf der jeweiligen Seite der Treppe auch auf dieser Treppe verwendet werden kann, wodurch ein Maß für unabhängige Vorderpfotenverwendung bereitgestellt wird. Bei jedem Test werden die Tiere 15 min lang in den Boxen gelassen. Die Doppel-Treppe ist an jeder Seite mit 7 × 3 Futterpellets (Präzisions-Futterpellets, Formel: P, gereinigte Nagetiernahrung, Größe: 45 mg; Sandown Scientific) versehen. Nach jedem Test werden die Anzahl an gefressenen Pellets (erfolgreich erreichten Pellets) und die Anzahl an genommenen Pellets (berührt, jedoch fallen gelassen) für jede Pfote sowie die Erfolgsrate (gefressene Pellets/genommene Pellets) separat gezählt. Nach drei Tagen Nahrungsentzug (12 g pro Tier pro Tag) werden die Tiere 11 Tage lang getestet. Eine vollständige Analyse wird nur die letzten fünf Tage durchgeführt.
  • MPTP-Behandlung
  • Das Neurotoxin 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) verursacht Degeneration von dopaminergen (DAergen) Neuronen des Mesencephalons bei Nagetieren, nicht-menschlichen Primaten und Menschen und produziert dadurch zahlreiche Symptome der Parkinson-Krankheit. MPTP führt zu einer ausgeprägten Reduktion der Konzentration von Dopamin und seiner Stoffwechselprodukte und der Anzahl an dopaminergen Termini im Striatum sowie zu einem schwerwiegenden Verlust der Tyrosinhydroxylase-(TH-)immunoreaktiven Zellkörpern in der Substantia nigra, Pars compacta.
  • Um schwerwiegende und langanhaltende Läsionen zu erreichen und um Mortalität zu reduzieren, erhalten Tiere MPTP-Injektionen und werden 7 bis 10 Tage später auf Schwere der Läsion getestet. Aufeinander folgende MPTP-Injektionen werden an den Tagen 1, 2 und 3 verabreicht. Tiere erhalten einmal täglich eine Dosierung von 4 mg/kg MPTP-Hydrochlorid (Sigma) in Kochsalzlösung. Alle Injektionen erfolgen intraperitoneal (i.p.), und die MPTP-Ausgangslösung wird zwischen den Injektionen eingefroren. Die Tiere werden an Tag 11 enthauptet.
  • Immunhistologie
  • Am Ende der Verhaltenstests werden alle Tiere mit 3 ml Thiopental (1 g/40 ml i.p., Tyrol Pharma) anästhesiert. Die Mäuse werden transkardial mit 0,01 M PBS (pH 7,4) 2 min lang perfundiert, gefolgt von 4% Paraformaldehyd (Merck) in PBS 15 min lang. Die Hirne werden entfernt und in 4% Paraformaldehyd 24 h lang bei 4°C eingelegt. Zur Dehydrierung werden sie anschließend in eine 20%ige Saccharose-Lösung (Merck) in 0,1 M PBS bei 4°C transferiert, bis sie absinken. Die Hirne werden in Methylbutan bei –20°C 2 min lang gefroren und bei –70°C gelagert. Unter Verwendung eines Schlittenmikrotoms (Modell 3800-Frigocut, Leica) werden 25-μm-Schnitte vom Genu des Corpus callosum (AP 1,7 mm) hin zum Hippocampus (AP 21,8 mm) und von AP 24,16 bis AP 26,72 genommen. Sechsundvierzig Schnitte werden geschnitten und in Sortiereinheiten in 0,25 M Tris-Puffer (pH 7,4) für immunhistochemische Untersuchungen gelagert.
  • Eine Reihe von Schnitten wird für freiflotierende Tyrosinhydroxylase-(TH-)Immunhistochemie verarbeitet. Nach drei Waschschritten in 0,1 M PBS wird endogene Peroxidaseaktivität 10 min lang in 0,3% H2O2 ± PBS gequencht. Nach Spülen in PBS werden die Schnitte in 10% normalem Rinderserum (Sigma) als Blockierungsmittel 5 min lang vorinkubiert und jeweils in primäres Anti-Ratten-TH-Kaninchen-Antiserum (Verdünnung 1:2.000) transferiert.
  • Nach Übernacht-Inkubation bei Raumtemperatur werden Schnitte für TH-Immunreaktivität in PBS (2 × 10 min) gespült und in biotinyliertem Anti-Kaninchen-Immunglobulin G, gezüchtet in Ziege (Verdünnung 1:200) (Vector), 90 min lang inkubiert, wiederholt gespült und 1 h lang in Vectastain-ABC-Lösung (Vector) transferiert. 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB; Sigma) in 0,1 M PBS, ergänzt mit 0,005% Η2Ο2, dient als Chromogen in der nachfolgenden Reaktion zur Sichtbarmachung. Die Schnitte werden auf Gelatine-beschichtete Objektträger gegeben, über Nacht zum Trocknen darauf gelassen, mit in steigenden Alkoholkonzentrationen dehydratisiertem Hämatoxylin gegengefärbt und in Butylacetat geklärt. Deckgläser werden auf Entellan platziert.
  • Rotarod-Test
  • Die Erfinder verwenden eine Modifikation des von Rozas & Labandeira-Garcia (1997) beschriebenen Verfahrens mit einem CR-1-Rotamex-System (Columbus Instruments, Columbus, OH), das einen ΙBM-kompatiblen PC, eine CIO-24-Datenerfassungskarte, eine Steuereinheit und eine vierspurige Rotarod-Einheit umfasst. Die Rotarod-Einheit besteht aus einer rotierenden Spindel (Durchmesser 7,3 cm) und einzelnen Abteilen für jede Maus. Die System-Software ermöglicht das Vorprogrammieren von Bedingungen für Versuchsabschnitte mit verschiedenen Rotationsgeschwindigkeiten (0 bis 80 U/min). Infrarot-Strahlen werden verwendet, um zu erkennen, wann eine Maus auf den Grundraster unter dem Rotarod gefallen ist. Das System registriert dieses Fallen als das Ende des Versuchs für diese Maus, und die Gesamtzeit am Rotarod sowie die Zeit des Fallens und alle Einstellungsparameter werden aufgezeichnet. Das System ermöglicht auch das Anlegen einer schwachen Stromspannung am Grundraster, um das Training zu unterstützen.
  • 3. Demenz
  • Die Aufgabe der Obiekterkennung
  • Die Aufgabe der Objekterkennung (OE) wurde entworfen, um die Wirkungen experimenteller Manipulationen auf das Erkennungsvermögen von Nagetieren zu bewerten. Eine Ratte wird in eine unbekannte Umgebung gesetzt, in der zwei identische Objekte vorhanden sind. Die Ratte besichtigt während des ersten Versuchs der Objekterkennungsaufgabe beide Objekte. In einem zweiten Versuch wird nach einem Speicherintervall von beispielsweise 24 h eines der zwei im ersten Versuch verwendeten Objekte, also ein "vertrautes" Objekt, entfernt, und ein neues Objekt wird in die unbekannte Umgebung gegeben. Die Besichtigungsdauer bei jedem der Objekte wird aufgezeichnet. Die grundlegenden Maße bei der OE-Aufgabe ist die Zeit, die eine Ratte zur Erkundung der zwei Objekte beim zweiten Versuch braucht. Gutes Gedächtnis zeigt sich in höheren Erkundungszeiten für das neue Objekt im Vergleich zum "vertrauten" Objekt.
  • Die Verabreichung des mutmaßlichen Enhancers von Erkennungsvermögen vor dem ersten Versuch ermöglicht überwiegend die Bewertung der Wirkungen auf das Erfassungsvermögen und schließlich auf Festigungsprozesse. Die Verabreichung der Testverbindung nach dem ersten Versuch ermöglicht eine Bewertung der Wirkungen auf Festigungsprozesse, während die Verabreichung vor dem zweiten Versuch eine Messung der Wirkungen auf Erinnerungsprozesse ermöglicht.
  • Die Aufgabe passiver Vermeidung
  • Die Aufgabe passiver Vermeidung bewertet die Gedächtnisleistung bei Ratten und Mäusen. Die Hemmungs-Vermeidungs-Vorrichtung besteht aus einer Box mit zwei Unterteilungen mit einem hellen Raum und einem dunklen Raum. Die zwei Räume werden durch eine Falltür getrennt, die vom Versuchsleiter betätigt werden kann. Eine Schwelle von 2 cm trennt die zwei Räume, wenn die Falltür hochgezogen ist. Ist die Tür geöffnet, so beträgt die Beleuchtungsstärke des dunklen Raums etwa 2 Lux. Die Lichtintensität beträgt etwa 500 Lux in der Mitte des Bodens des hellen Raums.
  • Zwei Gewöhnungsphasen, eine Schockphase und eine Speicherphase werden durchgeführt, die durch Zwischenintervalle von 24 h voneinander getrennt sind. Während der Gewöhnungsphase und der Speicherphase darf die Ratte die Vorrichtung 300 s lang erkunden. Die Ratte wird in den hellen Raum gesetzt, mit Blick auf die Wand gegenüber der Falltür. Nach einer Anpassungsphase von 15 s wird die Falltüre geöffnet, sodass alle Teile der Vorrichtung frei begangen werden können. Ratten vermeiden normalerweise hell erleuchtete Bereiche und gehen innerhalb weniger Sekunden in den dunklen Raum.
  • Während der Schockphase wird die Falltür zwischen den zwei Räumen gesenkt, sobald die Ratte den dunklen Raum mit ihren vier Pfoten betreten hat, und ein ungeordneter Fußelektroschock (1 mA) wird 2 s lang zugefügt. Die Ratte wird aus der Vorrichtung genommen und in ihren Heimkäfig zurückgegeben. Das Verfahren während der Speicherphase ist mit jenem der Gewöhnungsphasen identisch.
  • Die Wartezeit vor dem Durchschreiten, das heißt die erste Wartezeit vor dem Betreten des dunklen Raums (in s) während der Speicherphase, ist ein Index für die Gedächtnisleistung des Tiers; je länger die Wartezeit vor dem Betreten des dunkeln Raumes, desto besser ist die Gedächtnisleistung. Eine Testverbindung wird eine halbe Stunde für der Schockphase zusammen mit 1 mg·kg–1 Scopolamin verabreicht. Scopolamin behindert die Gedächtnisleistung während der Speicherphase 24 h später. Erhöht die Testverbindung die Wartezeit vor dem Betreten im Vergleich mit den mit Scopolamin behandelten Kontrollen, so verfügt sie wahrscheinlich über Erinnerungsvermögen-förderndes Potenzial.
  • Die Morris-Wasserflucht-Aufgabe
  • Die Morris-Wasserflucht-Aufgabe misst das Raumorientierungslernen bei Nagetieren. Es ist ein Testsystem, das bereits ausführlich eingesetzt wurde, um die Wirkungen mutmaßlicher Therapeutika auf die kognitiven Funktionen von Ratten und Mäusen zu untersuchen. Die Leistung eines Tiers wird in einem kreisförmigen Wasserbehälter mit einer Fluchtplatte, die etwa 1 cm unter der Wasseroberfläche angebracht ist, bewertet. Die Fluchtplatte ist für ein Tier, das im Wasserbehälter schwimmt, nicht sichtbar. Zahlreiche zusätzliche Anhaltspunkte in diesem "Labyrinth" sind durch die Einrichtung im Raum, einschließlich der Tische, der Computerausstattung und eines zweiten Wasserbehälters, durch die Gegenwart des Versuchsleiters und durch ein Radio auf einem Regal, das leise spielt, bereitgestellt.
  • Die Tiere bekommen vier Versuche im Rahmen von fünf täglichen Einheiten zur Informationssammlung. Ein Versuch wird durch Setzen eines Tiers in den Wasserbehälter mit Blick auf die Wand des Behälters begonnen. Jede der vier Ausgangspositionen in den Nord-, Ost-, Süd- und West-Quadranten wird einmal in einer Reihe von vier Versuchen verwendet; ihre Reihenfolge wird mittels Zufall bestimmt. Die Fluchtplatte befindet sich stets in derselben Position. Ein Versuch wird beendet, sobald das Tier auf die Fluchtplatte geklettert ist oder wenn 90 s vergangen sind, je nachdem, welches dieser beiden Ereignisse zuerst eintritt. Das Tier wird auf der Plattform 30 s lang sitzen gelassen. Dann wird es von der Platte genommen, und der nächste Versuch wird gestartet. Konnte das Tier die Platte innerhalb von 90 s nicht finden, so wird es vom Versuchsleiter auf die Platte gesetzt und wird dort 30 s lang sitzen gelassen. Nach dem vierten Versuch der fünf täglichen Einheiten wird ein zusätzlicher Versuch als ein Probelauf gewährt: die Platte wird entfernt, und die Zeit, die das Tier in den vier Quadranten verbringt, wird innerhalb von 30 oder 60 s gemessen. Im Probelauf starten alle Tiere von derselben Position aus, gegenüber dem Quadranten, in dem die Fluchtplatte während der Erfassungsphase angeordnet war.
  • Vier verschiedene Messungen werden vorgenommen, um die Leistung eines Tiers während des Erfassungstrainings zu bewerten: Fluchtwartezeit, geschwommene Distanz, Distanz zur Platte und Schwimmgeschwindigkeit. Die folgenden Messungen werden für den Probelauf bewertet: Verweilzeit (s) in den Quadranten und durchschwommene Distanz (cm) in den vier Quadranten. Der Probelauf liefert zusätzliche Information in Bezug darauf, wie gut sich ein Tier die Position der Fluchtplatte merken konnte. Verbringt ein Tier im Vergleich zu jedem beliebigen anderen Quadraten mehr Zeit und schwimmt eine längere Distanz in jenem Quadranten, in dem die Platte während der Erfassungsphasen angeordnet war, so kann daraus geschlossen werden, dass die Position der Platte gut gespeichert wurde.
  • Um die Wirkungen mutmaßlicher Erinnerungsvermögen-fördernder Verbindungen zu bewerten, werden Ratten oder Mäuse mit spezifischen Hirnläsionen, die kognitive Funktionen behindern, oder Tiere, die mit Verbindungen wie beispielsweise Scopolamin oder MK-801 behandelt wurden, die normales Lernen stören, oder ältere Tiere, die an Defiziten im Erkennungsvermögen leiden, eingesetzt.
  • Die Aufgabe mit spontanem Wechsel im T-Labyrinth
  • Die Aufgabe mit spontanem Wechsel im T-Labyrinth (TeMCAT) bewertet die räumliche Erinnerungsleistung von Mäusen. Der Startarm und die zwei Zielarme des T-Labyrinths sind mit Falltüren versehen, die manuell vom Versuchsleiter betätigt werden können. Eine Maus wird zu Beginn des Trainings in den Startarm gesetzt. Die Falltür wird geschlossen. Im ersten Versuch, dem "vorgegebenen Versuch", wird entweder der linke oder der rechte Zielarm durch Senken der Falltür blockiert. Nachdem die Maus im Startarm freigelassen wurde, wird sie in das Labyrinth gehen, schließlich den offenen Zielarm betreten und zur Startposition zurückkehren, wo sie 5 s lang durch Absenken der Falltüre festgehalten wird. Dann kann das Tier im Laufe von 14 Versuchen mit "freier Wahl" frei zwischen dem linken und dem rechten Zielarm wählen (alle Falltüren sind offen). Sobald die Maus einen Zielarm betritt, wird der andere Zielarm geschlossen. Die Maus kehrt schließlich zum Startarm zurück und kann frei entscheiden, welchen Zielarm sie nun betreten will, nachdem sie 5 s lang im Startarm eingesperrt gehalten wurde. Nach Abschluss von 14 Versuchen mit freier Auswahl in einem Testdurchlauf wird das Tier aus dem Labyrinth genommen. Während des Trainings wird das Tier nie angegriffen.
  • Die Wechsel werden für die 14 Versuche prozentuell berechnet. Dieser Prozentsatz und die Gesamtdauer, die erforderlich ist, um den ersten vorgegebenen Versuch und die darauf folgenden 14 Versuche mit freier Auswahl durchzuführen, (in s) wird analysiert. Defizite des Erkennungsvermögens werden üblicherweise durch eine Injektion von Scopolamin, 30 min vor Beginn der Trainingsphase, induziert. Scopolamin reduzierte die prozentuellen Wechsel auf Zufallsniveau oder darunter. Ein Enhancer des Erkennungsvermögens, der stets vor der Trainingsphase verabreicht wird, wirkt der Scopolamin-induzierten Reduktion der spontanen Wechselrate zumindest teilweise entgegen.
  • BEISPIEL 10
  • Gewebe-spezifische Expression von Prostasin-ähnlicher Serinprotease
  • In einem ersten Schritt, eine Rolle für Prostasin-ähnliche Serinprotease in der Pathogenese von COPD zu definieren, erfolgte Expressions-Fingerprinting des Gens unter Verwendung von quantitativer Echtzeit-PCR (TagMan) mit RNA-Proben, die aus einer großen Auswahl an menschlichen Zellen und Geweben isoliert wurden. Gesamt-RNA-Proben wurden entweder bei kommerziellen Lieferanten erworben oder eigens (von den Erfindern) gereinigt. Zwei Gruppen von RNAs wurden für das Fingerprinting verwendet: eine Ganzkörperorgan-Gruppe (Tabelle 1) und eine Atemweg-spezifische Gruppe (Tabelle 2).
  • Quantitative Echtzeit-PCR. Dieses Verfahren ist eine Weiterentwicklung der kinetischen Analyse von PCR, die als erstes von Higuchi et al. (BioTechnology 10, 413–417 (1992); BioTechnology 11, 1026–1030 (1993)) beschrieben wurde. Das Prinzip ist, dass in jedem bestimmten Zyklus innerhalb der exponentiellen PCR-Phase die Menge an Produkt proportional zur anfänglichen Anzahl der Matrixkopien ist. PCR-Amplifikation erfolgt in Gegenwart einer Oligonucleotidsonde (TagMan-Sonde), die komplementär zur Target-Sequenz und mit einem fluoreszierenden Reporter-Farbstoff und einem Quencher-Farbstoff markiert ist. Während der Extensionsphase der PCR wird die Sonde durch die 5'-3'-Endonucleaseaktivität von Taq-DNA-Polymerase gespaltet, wobei das Fluorophor durch die Wirkung des Quencher-Farbstoffes freigesetzt wird (Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7276–7280 (1991)). Da die Fluoreszenzemission direkt proportional zur Menge des spezifischen amplifizierten Produkts steigt, kann die exponentielle Wachstumsphase des PCR-Produkts nachgewiesen und verwendet werden, um die anfängliche Matrix-Konzentration zu bestimmen (Heid et al., Genome Res. 6, 986–994 (1996); und Gibson et al., Genome Res. 6, 995–1001 (1996)).
  • RNA-Extraktion und cDNA-Herstellung. Gesamt-RNA aus jeder der "eigenen" Proben, die in Tabelle 2 aufgelistet sind, wurde unter Verwendung des RNeasy-Systems von Qiagen (Crawley, West Sussex, UK) gemäß der Arbeitsvorschrift des Herstellers isoliert. Die Konzentration von gereinigter RNA wurde unter Verwendung des RiboGreen-RNA-Quantifizierungssets (Molecular Probes Europe, Niederlande) bestimmt. Die RNA-Konzentrationen der von kommerziellen Anbietern erworbenen Proben wurden ebenfalls unter Verwendung von RiboGreen bestimmt. Für die Herstellung von cDNA wurde 1 μg von Gesamt-RNA unter Verwendung von 200 Einheiten von SUPERSCRIPTTM RNaseH Reverse Transcriptase (Life Technologies, Paisley, UK), 10 mM Dithiothreit, 0,5 mM von jedem dNTP und 5 μM zufällig ausgewählten Hexameren (PE Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, UK) in einem Endvolumen von 20 μl gemäß der Arbeitsvorschrift des Herstellers rückwärts transkribiert.
  • Quantitative TaqMan-Analyse. Spezifische Primer und Sonden wurden gemäß den Empfehlungen von PE Applied Biosystems entworfen und sind nachstehend genannt:
    Vorwärts-Primer: 5'-AGAGTGGCGACCGCTACAAG-3'
    Rückwärts-Primer: 5'-TGGTAGAGGCCGTCGCAG-3'
    Sonde: 5'-(FAM)-CGAGTCCAGCAGCGGCACCCTTACT-3' worin FAM = 6-Carboxyfluorescein.
  • Quantifizierungs-PCR wurde mit 10 ng von rückwärts transkribierter RNA aus jeder Probe durchgeführt. Jede Bestimmung erfolgte in zweifacher Ausführung.
  • Das Testreaktionsgemisch lautete wie folgt: 1× komplette TagMan Universal PCR Master Mix (aus 2× Ausgangslösung) (PE Applied Biosystems, CA); 900 nM Vorwärts-Primer; 900 nM Rückwärts-Primer; 200 nM Sonde; 10 ng cDNA; und Wasser auf 25 μl.
  • Jeder der folgenden Schritte wurde einmal durchgeführt: Prä-PCR, 2 min lang bei 50°C, und 10 min lang bei 95°C.
  • Die folgenden Schritte wurden 40-mal durchgeführt: Denaturierung, 15 s bei 95°C, Anellierung/Extension, 1 min bei 60°C.
  • Quantitative Echtzeit-PCR erfolgte unter Verwendung eines "ABI Prism 7700 Sequence Detector".
  • Der in jeder Reaktion entstandene CT-Wert wurde verwendet, um die anfängliche Matrixkonzentration (Kopienzahl) durch Interpolation ausgehend von einer universellen Standardkurve zu bestimmen. Das Expressionsniveau des Target-Gens in jeder Probe wurde in Bezug auf die Probe mit der geringsten Expression des Gens berechnet.
  • Die Expression von Prostasin-ähnlichem Enzym in verschiedenen menschlichen Geweben ist in 12 gezeigt. Die höchsten Konzentrationen von mRNA wurden in Hoden, Knochenmark, Milz und Lunge nachgewiesen. Interessanterweise wurde Expression des Enzyms nicht in Prostata oder Leber nachgewiesen, die Gewebe sind, die selbst hohe Expression von Prostasin aufweisen (Yu et al., J. Biol. Chem. 270, 13483–13489). Darüber hinaus wird Prostasin im Gegensatz zum Prostasin-ähnlichen Enzym in Hoden nicht exprimiert.
  • Expression von Prostasin-ähnlichem Enzym in der Lunge wurde mittels einer Analyse der Expression des Gens in manchen der die Lunge bildenden Zelltypen näher analysiert. Dies zeigte beständige und reichliche Expression von Prostasin-ähnlichem Enzym in polymorphkernigen Leukozyten (13). Obwohl relativ hohe Expression des Gens in zirkulierenden Monozyten von einem Spender beobachtet wurde, wurde in Monozyten von zwei anderen Spendern keine Expression nachgewiesen. Expression in der Tracliea und in Alveolarzellen vom Typ II war auch eindeutig.
  • Die Funktion von Prostasin ist unbekannt, obwohl seine weitverbreitete Expression auf seine Einbindung in wichtige biologische Prozesse schließen lässt. Es ist wahrscheinlich ein Membran-gebundenes Enzym, worauf die Gegenwart eines mutmaßlichen C-terminalen Membranankers hinweist, und als solches kann es in die Verarbeitung von Peptiden und Proteinen an Epithelzelloberflächen eingebunden sein. Das Expressionsprofil von Prostasin-ähnlichem Enzym unterscheidet sich recht stark von jenem von Prostasin, was eventuell darauf hinweist, dass diese zwei Proteasen über unterschiedliche physiologische Funktionen verfügen. Die relativ hohe Expression des Enzyms in polymorphkernigen Leukozyten, einer der zentralen Entzündungszelltypen der Lunge, lässt darauf schließen, dass Prostasin-ähnliches Enzym in Entzündungsprozesse eingebunden sein kann und dass eine Regulationsstörung der Protease eine signifikante Rolle bei der Zerstörung der Lungenmatrix bei Erkrankungen wie COPD spielen kann. Prostasin-ähnliches Enzym stellt daher ein potenzielles therapeutisches Mittel zur Behandlung von COPD dar.
  • Tabelle 1: Gruppe von RNA aus menschlichen Organen, die für quantitative Echtzeit-PCR verwendet wurde
    Figure 00960001
  • Alle Proben wurden von Clontech UK Ltd., Basingstoke, UK, erhalten.
  • Tabelle 2: Gruppe von für menschliche Atemwege spezifische RNA, verwendet für quantitative Echtzeit-PCR
    Figure 00970001
  • VERWEISE
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    • 10. Van Muijen et al. (1995) Properties of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells. Recent Results in Cancer Research 139, 104–22.
    • 11. Price et al. (1997) The Biochemistry of Cancer Dissemination, in Critical Reviews in Biochemistry and Mol. Biol. 32, 175–253.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 01000001
  • Figure 01010001
  • Figure 01020001
  • Figure 01030001
  • Figure 01040001
  • Figure 01050001

Claims (12)

  1. Isoliertes Polynucleotid, das aus der aus: a) einem Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine in Seq.-ID Nr. 6 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst; b) einem Polynucleotid, das die Sequenz aus Seq.-ID Nr. 5 umfasst; c) einem Polynucleotid, dessen Sequenz von den in (a) und (b) spezifizierten Polynucleotidsequenzen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes abweicht und das die biologische Aktivität von (a) aufweist; bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  2. Expressionsvektor, der jedes beliebige Polynucleotid nach Anspruch 1 enthält.
  3. Wirtszelle, die den Expressionsvektor nach Anspruch 2 enthält.
  4. Im Wesentlichen gereinigtes Polypeptid, für das ein Polynucleotid nach Anspruch 1 kodiert.
  5. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 3 unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids geeignet sind; und b) das Gewinnen des Polypeptids aus der Wirtszellenkultur.
  6. Verfahren zur Detektion eines Polynucleotids, das für ein Polypeptid kodiert, in einer biologischen Probe, die folgenden Schritte umfassend: a) das Hybridisieren eines der Polynucleotide nach Anspruch 1 an ein Nucleinsäurematerial einer biologischen Probe, wodurch ein Hybridisierungskomplex gebildet wird; und b) das Nachweisen dieses Hybridisierungskomplexes.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin vor der Hybridisierung das Nucleinsäurematerial der biologischen Probe amplifiziert wird.
  8. Verfahren zur Detektion eines Polynucleotids nach Anspruch 1 oder eines Polypeptids nach Anspruch 4, die folgenden Schritte umfassend: a) das Kontaktieren einer biologischen Probe mit einem Reagens, das spezifisch mit dem Polynucleotid oder dem Polypeptid wechselwirkt; und b) das Nachweisen der Wechselwirkung.
  9. Diagnose-Set zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 6 bis 8.
  10. Verfahren zum Screenen auf Mittel, die die Aktivität eines Polypeptids herabsetzen, die folgenden Schritt umfassend: a) das Kontaktieren einer Testverbindung mit jedem beliebigen Polypeptid, für das jedes beliebige Polynucleotid nach Anspruch 1 kodiert; und b) das Nachweisen von Bindung der Testverbindung an das Polypeptid, worin eine Testverbindung, die sich an das Polypeptid bindet, als ein potenzielles therapeutisches Mittel zum Herabsetzen der Aktivität des Polypeptids identifiziert wird.
  11. Verfahren zum Screenen auf Mittel, die die Aktivität eines Polypeptids regulieren, die folgenden Schritte umfassend: a) das Kontaktieren einer Testverbindung mit einem Polypeptid, für das jedes beliebige Polynucleotid nach Anspruch 1 kodiert; und b) das Nachweisen einer Aktivität des Polypeptids, worin eine Testverbindung, die die Aktivität steigert, als ein potenzielles therapeutisches Mittel zur Steigerung der Aktivität des Polypeptids identifiziert wird und worin eine Testverbindung, die die Aktivität des Polypeptids herabsetzt, als ein potenzielles therapeutisches Mittel zur Senkung der Aktivität des Polypeptids identifiziert wird.
  12. Verfahren zum Screenen auf Mittel, die die Aktivität eines Polypeptids herabsetzen, die folgenden Schritte umfassend: a) das Kontaktieren einer Testverbindung mit jedem beliebigen Polynucleotid nach Anspruch 1; und b) das Nachweisen von Bindung der Testverbindung an das Polynucleotid, worin eine Testverbindung, die sich an das Polynucleotid bindet, als ein potenzielles therapeutisches Mittel zur Senkung der Aktivität des Polypeptids identifiziert wird.
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