DE60220388T2 - Regulation eines menschlichen proteinkinase-ähnlichen proteins - Google Patents

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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung eines menschlicher Proteinkinase ähnlichen Proteins beim Screenen auf Mittel, die bei der Behandlung von Diabetes zweckdienlich sind.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Proteinkinasen spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von biochemischen und morphologischen Veränderungen in Zusammenhang mit Zellwachstum und -teilung. D'Urso et al., Science 250, 786-91 (1990); Birchmeier et al., Bioessays 15, 185-89 (1993); US-Patent 6.200.770 . Sie dienen als Wachstumsfaktorrezeptoren und Signaltransduktoren und wurden mit Zelttransformation und Malignität in Verbindung gebracht. Hunter et al., Cell 70, 375-87 (1991); Posada et al., Mol. Biol. Cell 3, 583-92 (1992); Hunter et al., Cell 79, 573-82 (1994). Beispielsweise wurde gezeigt, dass Proteinkinasen an der Übertragung von Signalen von Wachstumsfaktorrezeptoren (Sturgill et al., Nature 344, 715-18 (1988); Gomez et al., Nature 353, 179-73 (1991), an der Steuerung des Eintritts von Zellen in die Mitose (Nurse et al., Nature 344, 503-08 (1990); Maller, Curr. Opin. Cell Biol. 3, 269-75 (1991) sowie an der Regulierung von Actin-Bündelung (Husain-Chisthti et al., Nature 334, 718-21 (1988) beteiligt sind.
  • Proteinkinasen können auf der Grundlage von entweder Aminosäuresequenzähnlichkeit oder Spezifität für Serin/Threonin- oder Tyrosinreste in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden. Eine kleine Anzahl von Kinasen mit Doppelspezifität sind der Serin/Threonin-spezifischen Gruppe strukturell ähnlich. Innerhalb der allgemeinen Klassifikation können Kinasen außerdem in Familien unterteilt werden, deren Mitglieder einen höheren Grad an Aminosäureidentität der katalytischen Domänen und auch ähnliche biochemische Eigenschaften aufweisen. Die meisten Proteinkinase-Fami lienmitglieder weisen auch außerhalb der Kinasedomäne gemeinsame Strukturmerkmale auf, die Ausdruck ihrer jeweiligen Zellfunktionen sind. Dazu zählen Regulationsdomänen, die die Kinase-Aktivität oder Wechselwirkung mit anderen Proteinen steuern. Hanks et al., Science 241, 42-52 (1988).
  • Auf dem Gebiet der Erfindung besteht Bedarf an der Identifikation von Proteinkinaseähnlichen Proteinen, die so reguliert werden können, dass eine therapeutische Wirkung erzielt wird.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Geoffenbart werden Reagenzien und Verfahren zur Regulierung eines menschlicher Proteinkinase ähnlichen Proteins.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Mittel, die zur Behandlung von Diabetes zweckdienlich sind. Eine Testverbindung wird mit einem Proteinkinase-ähnlichen Proteinpolypeptid kontaktiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, wie sie durch die in Seq.-ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz definiert ist.
  • Bindung zwischen der Testverbindung und dem Proteinkinase-ähnlichen Protein-Polypeptid wird detektiert. Ein Mittel, das eine Verringerung der Aktivität des Proteinkinase-ähnlichen Proteins bewirkt, wird als Mittel ausgewählt, das möglicherweise zur Behandlung von Diabetes zweckdienlich ist.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Mittel, die zur Behandlung von Diabetes zweckdienlich sind. Eine Testverbindung wird mit einem Proteinkinase-ähnlichen Proteinpolypeptid kontaktiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, wie sie durch die in Seq.-ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz definiert ist.
  • Proteinkinase-ähnliche Proteinaktivität des Polypeptids wird detektiert. Eine Testverbindung, die Proteinkinase-ähnliche Proteinaktivität des Polypeptids relativ zu Proteinkinase-ähnlicher Proteinaktivität in Abwesenheit der Testverbindung verringert, wird so als mögliches Mittel zur Behandlung von Diabetes identifiziert.
  • Geoffenbart wird ein menschlicher Proteinkinase ähnliches Protein, das zur Identifizierung von Testverbindungen geeignet ist, die beispielsweise als Inhibitoren an der aktiven Stelle des Enzyms wirken können.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodierende DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1).
  • 2 zeigt die von der in 1 gezeigten DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2).
  • 3 zeigt die Aminosäuresequenz des durch swiss |P80192|M3K9_HUMAN identifizierten Proteins (Seq.-ID Nr. 3).
  • 4 zeigt die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodierende DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 4).
  • 5 zeigt die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodierende DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 5).
  • 6 zeigt die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodierende DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 6).
  • 7 zeigt die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodierende DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 7).
  • 8 zeigt die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodierende DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 8).
  • 9 zeigt die von der in 8 gezeigten DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 9).
  • 10 zeigt die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodierende DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 10).
  • 11 zeigt den BLAST-Abgleich von 423 (Seq.-ID Nr. 2) mit swiss/P80192/M3K9_HUMAN (Seq.-ID Nr. 3).
  • 12 zeigt den HMMPFAM-Abgleich von 423 (Seq.-ID Nr. 2) mit pfam|hmm| pkinase.
  • 13 zeigt die relative Expression von mRNA von menschlicher Proteinkinase ähnlichem Protein in Krebszellen und -gewebe.
  • 14 zeigt die relative Expression von mRNA von Proteinkinase-ähnlichem Protein in Gewebe, das für Obesität und Diabetes relevant ist.
  • 15 zeigt die Kopienzahl von mRNA von Proteinkinase-ähnlichem Protein in Gewebe, das für Obesität und Diabetes relevant ist.
  • 16 zeigt das relative Expressionsprofil von mRNA von Proteinkinase-ähnlichem Protein in verschiedenen menschlichen Geweben (Bodymap).
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung eines menschlicher Proteinkinase ähnlichen Proteins, das die in Seq.-ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst. Eine für das menschlicher Proteinkinase ähnliche Protein kodierende Sequenz wird in Seq.-ID Nr. 1, 8 und 10 gezeigt. Diese Sequenz befindet sich auf Chromosom 15. Verwandte ESTs (Seq.-ID Nr. 4–7) werden in Lymphom- und Keimzentrum-B-Zellen exprimiert.
  • Menschlicher Proteinkinase ähnliches Protein ist über 287 Aminosäuren zu 31 % mit swiss|P80192|M3K9_HUMAN identisch (1). Die Ergebnisse einer Pfam-Homologiesuche stützen die Identifikation dieses Proteins als eukaryotische Proteinkinase. Seine wahrscheinliche Funktion als Tyrosinkinase-Klasse-III-Protein wird außerdem durch die Ergebnisse einer BLOCKS-Datenbanksuche gestützt. Consensus-Muster sind in 1 unterstrichen; der Asp-Rest der aktiven Stelle und der ATP-bindende Lys-Rest sind fettgedruckt hervorgehoben.
  • Menschlicher Proteinkinase ähnliches Protein kann auch zum Screenen auf Inhibitoren von menschlicher Proteinkinase ähnlichem Protein eingesetzt werden.
  • Polypeptide
  • Menschlicher Proteinkinase ähnliche Polypeptide gemäß der Erfindung umfassen zumindest 6, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 oder 286 zusammenhängende Aminosäuren, ausgewählt aus der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz oder einer biologisch aktiven Variante davon, wie sie nachstehend definiert ist. Menschlicher Proteinkinase ähnliche Polypeptide gemäß der Erfindung umfassen zumindest 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375 oder 1394 zusammenhänge Aminosäuren, ausgewählt aus der in Seq.-ID Nr. 9 gezeigten Aminosäuresequenz oder einer biologisch aktiven Variante davon, wie sie nachstehend definiert ist. Ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid der Erfindung kann daher ein Teil eines Proteinkinase-ähnlichen Proteins, ein Proteinkinase-ähnliches Protein voller Länge oder ein Fusionsprotein, welches das gesamte Proteinkinaseähnliche Protein oder einen Teil davon umfasst, sein.
  • Biologisch aktive Varianten
  • Varianten von menschlicher Proteinkinase ähnlichen Polypeptiden, die biologisch aktiv sind, z.B. enzymatische Aktivität beibehalten, sind ebenfalls menschlicher Proteinkinase ähnliche Polypeptide. Vorzugsweise weisen natürlich oder nicht natürlich vorkommende Proteinkinase-ähnliche Polypeptidvarianten Aminosäuresequenzen auf, die zu zumindest etwa 32, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oder 70, vorzugsweise etwa 75, 80, 85, 90, 96, 96, 98 oder 99 % mit der in Seq.-ID Nr. 2 und 9 gezeigten Sequenz oder einem Fragment davon identisch sind. Die prozentuelle Identität zwischen einer mutmaßlichen, menschlicher Proteinkinase ähnlichen Polypeptidvariante und einer Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 2 oder 9 wird durch herkömmliche Verfahren bestimmt. Siehe beispielsweise Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48, 603 (1986) und Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1992). Kurz gesagt werden zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung eines "gap opening penalty" von 10, eines „gap extension penalty" von 1 und der „BLOSUM62"-Bewertungsmatrix von Henikoff & Henikoff (1992) so angeordnet, dass die Anordnungspunkte optimiert werden.
  • Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden erkennen, dass viele etablierte Algorithmen zur Verfügung stehen, um zwei Aminosäuresequenzen abzugleichen. Der „FASTA"-Ähnlichkeitssuchalgorithmus von Pearson & Lipman ist ein geeignetes Proteinabgleichverfahren zur Untersuchung der Identität zwischen einer hierin geoffenbarten Aminosäuresequenz und der Aminosäuresequenz einer vermeintlichen Variante. Der FASTA-Algorithmus wurden von Pearson & Lipman, Proc. Nat'I. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988) und von Pearson, Meth. Enzymol 183, 63 (1990) beschrieben. Kurz gesagt charakterisierte FASTA zuerst Sequenzähnlichkeit durch die Identifikation von Regionen, die eine Untersuchungssequenz (z.B. Seq.-ID Nr. 2 oder 9) und eine Testsequenz gemeinsam haben, welche entweder die höchste Dichte von Identitäten (wenn die ktup-Variable = 1 ist) oder Paare von Identitäten (wenn ktup = 2 ist) aufweisen, ohne dass konservative Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen berücksichtigt werden. Die zehn Regionen mit der höchsten Dichte von Identitäten werden dann erneut bewertet, indem die Ähnlichkeit aller gepaarten Aminosäuren mithilfe einer Aminosäure-Substitutionsmatrix verglichen wird, wobei die Enden der Regionen „gestutzt" werden, um nur jene Reste einzuschließen, die zum höchsten Wert beitragen. Wenn verschiedene Regionen mit Werten über dem „Cutoff"-Wert (berechnet durch eine vorgegebenen Formel, die auf der Länge der Sequenz des ktup-Werts basiert) vorhanden sind, dann werden die gestutzten Anfangsregionen untersucht, um zu bestimmen, ob die Regionen verbunden werden können, um einen ungefähren Abgleich mit Lücken zu bilden. Schließlich werden die Regionen der Aminosäuresequenzen mit den höchsten Punkten mithilfe einer Modifikation des Needleman-Wunsch-Sellers-Algorithmus (Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26, 787 (1974)) abgeglichen, die Aminosäureinsertionen und -deletionen erlaubt. Bevorzugte Parameter für die FASTA-Analyse sind: ktup = 1, gap opening penalty = 10, gap extension penalty = 1 und Substitutionsmatrix = BLOSUM62. Diese Parameter können in ein FASTA-Programm eingegeben werden, indem die Bewertungsmatrixdatei ("SMATRIX") wie in Anhang 2 von Pearson, Meth. Enzymol. 183, 63 (1990) beschrieben geändert wird.
  • FASTA kann auch eingesetzt werden, um die Sequenzidentität von Nucleinsäuremolekülen mithilfe eines Verhältnisses, wie es oben geoffenbart ist, zu bestimmen. Für Nucleotidsequenzvergleiche kann der ktup-Wert im Bereich von 1 bis 6, vorzugswiese von 3 bis 6, noch bevorzugter bei 3, liegen, während andere Parameter auf Standardwerte eingestellt sind.
  • Variationen der prozentuellen Identität können beispielsweise auf Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen zurückzuführen sein. Aminosäuresubstitutionen sind definiert als die Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere. Sie werden als konservativ bezeichnet, wenn die substituierte Aminosäure ähnliche strukturelle und/oder chemische Eigenschaften aufweist. Beispiele für konservative Ersetzungen sind Substitutionen von Leucin durch Isoleucin oder Valin, von Aspartat durch Glutamat oder von Threonin durch Serin.
  • Aminosäureinsertionen oder -deletionen sind Änderungen an oder innerhalb einer Aminosäuresequenz. Sie fallen typischerweise in den Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren. Anhaltspunkte zur Bestimmung, welche Aminosäurereste substituiert, insertiert oder deletiert werden können, ohne biologische oder immunologische Aktivität eines menschlichen Proteinkinase-ähnlichen Polypeptids aufzuheben, können unter Verwendung von Computerprogrammen, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, wie z.B. DNASTAR-Software, gefunden werden.
  • Die Erfindung umfasst weiteres Proteinkinase-ähnliche Polypeptide, die während oder nach der Translation, beispielsweise durch Glykosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Derivatisierung mit bekannten Schutz-/Blockergruppen, proteolytische Spaltung, Bindung an ein Antikörpermolekül oder einen anderen zellulären Liganden usw., unterschiedlich modifiziert werden. Jede beliebige von zahlrei chen chemischen Modifikationen kann mithilfe bekannter Verfahren durchgeführt werden, einschließlich, nicht jedoch beschränkt auf spezifische chemische Spaltung mit Bromcyan, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, V8-Protease, NaBH4, Acetylierung, Formylierung, Oxidierung, Reduktion, metabolische Synthese in Gegenwart von Tunicamycin usw.
  • Weitere posttranslationale Modifikationen, die in der Erfindung enthalten sind, umfassen beispielsweise N-gebundene oder O-gebundene Kohlenhydratketten, Verarbeitung des N-terminalen oder C-terminalen Endes, Bindung von chemischen Gruppierungen an das Aminosäure-Rückgrat, chemische Modifikationen von N-gebundenen oder O-gebundenen Kohlenhydratketten und Addition oder Deletion eines N-terminalen Methioninrests als Ergebnis prokaryotische Wirtszellexpression. Die Proteinkinase-ähnlichen Polypeptide können auch mit einer nachweisbaren Markierung, wie z.B. einer enzymatischen, Fluoreszenz-, Isotopen- oder Affinitätsmarkierung, versehen werden, um die Detektion und Isolierung des Proteins zu ermöglichen.
  • Weiters stellt die Erfindung chemisch modifizierte Derivate von Proteinkinase-ähnlichen Polypeptiden bereit, die weitere Vorteile, wie z.B. verbesserte Löslichkeit, Stabilität und Kreislaufzeit des Polypeptids oder verringerte Immunogenität, bereitstellen können (siehe US-Patent Nr. 4.179.337 ). Die chemischen Gruppierungen zur Derivatisierung können aus wasserlöslichen Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol, Ethylenglykol/Propylenglykol-Copolymeren, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol und dergleichen ausgewählt sein. Die Polypeptide können zufällig oder an vorbestimmten Positionen innerhalb des Moleküls modifiziert werden und ein, zwei, drei oder mehr angebundene chemische Gruppierungen enthalten.
  • Ob eine Aminosäureänderung oder eine Polypeptidmodifikation zu einem biologisch aktiven Proteinkinase-ähnlichen Polypeptid führt, kann leicht bestimmt werden, indem auf Enzymaktivität getestet wird, wie beispielsweise im US-Patent 6.194.186 beschrieben ist.
  • Fusionsproteine
  • Fusionsproteine sind zur Bildung von Antikörpern gegen Proteinkinase-ähnliche Polypeptid-Aminosäuresequenzen und zur Verwendung in verschiedenen Testsystemen nützlich. Fusionsproteine können beispielsweise verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, die mit Abschnitten eines Proteinkinase-ähnlichen Polypeptids Wechselwirken. Proteinaffinitätschromatographie oder bibliotheksbasierte Tests auf Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie z.B. die Hefe-Doppelhybrid- oder Phagendisplay-Systeme, können für diesen Zweck eingesetzt werden. Solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und können auch als Wirkstoff-Screens verwendet werden.
  • Ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid-Fusionsprotein umfasst zwei Polypeptidsegmente, die über eine Peptidbindung aneinander fusioniert sind. Das erste Polypeptidsegment umfasst zumindest 6, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 oder 286 zusammenhängende Aminosäuren von Seq.-ID Nr. 2 oder einer biologisch aktiven Variante davon, wie etwa den zuvor beschriebenen. Das erste Polypeptidsegment umfasst zumindest 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375 oder 1394 zusammenhänge Aminosäuren, ausgewählt aus der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz oder einer biologisch aktiven Variante davon, wie sie oben beschrieben wurde. Das erste Proteinkinase-ähnliche Polypeptid kann auch ein Proteinkinase-ähnliches Protein voller Länge umfassen.
  • Das zweite Polypeptidsegment kann ein Protein voller Länge oder ein Proteinfragment sein. Proteine, die üblicherweise zur Fusionsproteinkonstruktion verwendet werden, umfassen β-Galactosidase, β-Glucuronidase, grün fluoreszierendes Protein (GFP), autofluoreszierende Proteine, einschließlich blau fluoreszierendes Protein (BFP), Glutathion-S-Transferase (GST), Luciferase, Meerrettichperoxidase (HRP) und Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT). Darüber hinaus werden Epitop-Markierungen in Fusionsproteinkonstruktionen verwendet, einschließlich Histidin-(His-) Markierungen, FLAG-Markierungen, Influenza-Hämagglutinin-(HA-) Markierungen, Myc-Markierungen, VSV-G-Markierungen und Thioredoxin-(Trx-) Markierungen. Andere Fusionskonstruktionen können Maltose-Bindungsprotein-(MBP), S-Markierungs-, Lex-a-DNA-Bindungsdomänen-(DBD-) Fusionen, GAL4-DNA-Bindungsdomänen-Fusionen und Herpes-Simplex-Virus-(HSV-) BP16-Proteinfusionen umfassen. Ein Fusionsprotein kann auch so gebildet werden, dass eine Spaltungsstelle enthalten ist, die zwischen der kodierenden Sequenz für das Proteinkinase-ähnliche Polypeptid und der heterologen Proteinsequenz liegt, sodass das Proteinkinaseähnliche Polypeptid von der heterologen Gruppierung abgespalten und gereinigt werden kann.
  • Ein Fusionsprotein kann auf nach dem Stand der Technik bekannte Weise chemisch synthetisiert werden. Vorzugsweise wird das Fusionsprotein durch kovalente Bindung zwischen zwei Polypeptidsegmenten oder mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie Standard sind, hergestellt. DNA-Rekombinationsverfahren können verwendet werden, um Fusionsproteine zu erzeugen, beispielsweise durch Bilden eines DNA-Konstrukts, das kodierende Sequenzen, ausgewählt aus Seq.-ID Nr. 1, 8 und 10, im richtigen Leseraster mit Nucleotiden umfasst, die für das zweite Polypeptidsegment kodieren, und Exprimieren des DNA-Konstrukts in einer Wirtszelle, wie dies auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Zahlreiche Sets zur Konstruktion von Fusionsproteinen sind bei Unternehmen wie Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), CLONTECH (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL International Corporation (MIC; Watertown, MA) und Quantum Biotechnologies (Montreal, Kanada; 1-888-DNA-KITS) erhältlich.
  • Identifikation von Spezies-Homologen
  • Spezies-Homologe von menschlicher Proteinkinase ähnlichem Polypeptid können unter Verwendung von Proteinkinase-ähnlichen Polypeptid-Polynucleotiden (nachstehend beschrieben) erhalten werden, um geeignete Sonden oder Primer zum Screenen von cDNA-Expressionsbibliotheken aus anderen Spezies, wie z.B. Mäusen, Affen oder Hefe, zum Identifizieren von cDNAs, die für Homologe von Protein kinase-ähnlichem Polypeptid kodieren, und Exprimieren von cDNAs wie nach dem Stand der Technik bekannt herzustellen.
  • Polynucleotide
  • Ein Proteinkinase-ähnliches Polynucleotid kann einzel- oder doppelsträngig sein und umfasst eine kodierende Sequenz oder das Komplement einer kodierenden Sequenz für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid. Eine kodierende Sequenz für menschlicher Proteinkinase ähnliches Protein wird in Seq.-ID Nr. 1, 8 und 10 gezeigt.
  • Degenerierte Nucleotidsequenzen, die für menschlicher Proteinkinase ähnliche Polypeptide kodieren, sowie homologe Nucleotidsequenzen, die zu zumindest etwa 50, 55, 60, 65, 70, vorzugsweise etwa 75, 90, 96, 98 oder 99 % identisch mit der in Seq.-ID Nr. 1, 8 und 10 gezeigten Nucleotidsequenz oder einem Komplement davon sind, sind ebenfalls Proteinkinase-ähnliche Polynucleotide. Prozentuelle Sequenzidentität zwischen den Sequenzen zweier Polynucleotide wird unter Verwendung von Computerprogrammen wie ALIGN, die den FASTA-Algorithmus verwenden, unter Verwendung einer Suche nach affinem Raum („affine gap search") mit einem „gap open penalty" von –12 und einem „gap extension penalty" von –2 bestimmt. Komplementäre DNA-(cDNA-) Moleküle, Spezies-Homologe und Varianten von Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotiden, die für biologisch aktive, Proteinkinase-ähnliche Polypeptide kodieren, sind ebenfalls Proteinkinase-ähnliche Polynucleotide. Polynucleotidfragmente, die zumindest 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20 oder 25 zusammenhängende Nucleotide von Seq.-ID Nr. 1, 8 und 10 oder Komplementen davon enthalten, sind ebenfalls Proteinkinase-ähnliche Polynucleotide. Diese Fragmente können beispielsweise als Hybridisierungssonden oder als Antisense-Oligonucleotide eingesetzt werden.
  • Identifizierung von Polynucleotid-Varianten und -Homologen
  • Varianten und Homologe der zuvor beschriebenen Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotide sind ebenfalls Proteinkinase-ähnliche Polynucleotide. Typischerweise können homologe Proteinkinase-ähnliche Polynucleotidsequenzen durch Hybridisierung von vermutlichen Polynucleotiden an bekannte Proteinkinase-ähnliche Polynucleotide unter stringenten Bedingungen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, identifiziert werden. Beispielsweise können unter Anwendung der folgenden Waschbedingungen -- 2x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat, pH 7,0), 0,1 % SDS, bei Raumtemperatur zweimal, 30 min jeweils; dann 2x SSC, 0,1 % SDS, 50 °C einmal, 30 min lang; dann 2x SSC, bei Raumtemperatur zweimal, 10 min jeweils -homologe Sequenzen identifiziert werden, die höchstens etwa 25–30 % Basenpaar-Fehlpaarungen enthalten. Noch bevorzugter enthalten homologe Nucleinsäurestränge 15–25 % Basenpaar-Fehlpaarungen, und noch bevorzugter 5–15 % Basenpaar-Fehlpaarungen.
  • Spezies-Homologe der Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotide, die hierin offenbart sind, können auch durch Herstellen geeigneter Sonden oder Primer und durch Screenen von cDNA-Expressionsbibliotheken aus anderen Spezies, wie z.B. Mäusen, Affen oder Hefe, identifiziert werden. Menschliche Varianten von Proteinkinaseähnlichen Polynucleotiden können beispielsweise durch Screenen von menschlichen cDNA-Expressionsbibliotheken identifiziert werden. Es ist durchwegs bekannt, dass die Tm einer doppelsträngigen DNA mit jeweils 1 % geringerer Homologie um 1–1,5°C sinkt (Bonner et al., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973)). Varianten von menschlicher Proteinkinase ähnlichen Polynucleotiden oder Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotiden von anderen Spezies können daher durch Hybridisierung eines vermutlichen homologen Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotids an ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1, 8 oder 10 oder ein Komplement davon zur Bildung eines Testhybrids identifiziert werden. Die Schmelztemperatur des Testhybrids wird mit der Schmelztemperatur eines Hybrids, das Polynucleotide mit perfekt komplementären Nucleotidsequenzen umfasst, verglichen, und die Anzahl oder der Prozentsatz an Basenpaar-Fehlpaarungen innerhalb des Testhybrids wird berechnet.
  • Nucleotidsequenzen, die nach stringenten Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen an Proteinkinase-ähnliche Polynucleotide oder Komplemente davon hybridisieren, sind ebenfalls Proteinkinase-ähnliche Polynucleotide. Stringente Waschbedingungen sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt und werden beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage, 9.50–9.51 (1989), offenbart.
  • Typischerweise sollte für stringente Hybridisierungsbedingungen eine Kombination von Temperatur und Salzkonzentration gewählt werden, die etwa 12–20 °C unter der berechneten Tm des zu untersuchenden Hybrids liegt. Die Tm eines Hybrids zwischen einem Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotid mit einer in Seq.-ID Nr. 1, 8 und 10 gezeigten Nucleotidsequenz oder dem Komplement davon und einer Polynucleotidsequenz, die zumindest etwa 50 %, vorzugsweise etwa 75, 90, 96 oder 98 %, Identität mit einer jener Nucleotidsequenzen aufweist, kann beispielsweise unter Verwendung der Gleichung von Bolton & McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48, 1390 (1962), berechnet werden.
  • Tm = 81,5 °C – 16,6(log10[Na+]) + 0,41 (%G + C) – 0,63 (% Formamid) – 600/l), worin 1 die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist.
  • Stringente Waschbedingungen umfassen beispielsweise 4x SSC bei 65 °C oder 50 % Formamid, 4x SSC bei 42 °C oder 0,5x SSC, 0,1 % SDS bei 65 °C. Hochstringente Waschbedingungen umfassen beispielsweise 0,2 × SSC bei 65 °C.
  • Herstellung von Polynucleotiden
  • Ein Proteinkinase-ähnliches Polynucleotid kann frei von anderen Zellkomponenten wie beispielsweise Membrankomponenten, Proteinen und Lipiden isoliert werden. Polynucleotide können von einer Zelle produziert und unter Anwendung herkömmlicher Nucleinsäure-Reinigungsverfahren isoliert werden oder unter Einsatz eines Amplifikationsverfahrens, wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion (PCR), oder unter Verwendung eines automatisierten Synthesegerätes synthetisiert werden. Ver fahren zum Isolieren von Polynucleotiden sind Routineverfahren und auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Jedes beliebige dieser Verfahren zur Gewinnung eines Polynucleotids kann eingesetzt werden, um isolierte Proteinkinase-ähnliche Polynucleotide zu erhalten. Restriktionsenzyme und Sonden können beispielsweise verwendet werden, um Polynucleotidfragmente zu isolieren, die Proteinkinase-ähnliche Nucleotidsequenzen umfassen. Isolierte Polynucleotide liegen in Präparaten vor, die frei oder zumindest zu 70, 80 oder 90 % frei von anderen Molekülen sind.
  • Menschlicher Proteinkinase ähnliche cDNA-Moleküle können mittels herkömmlicher molekularbiologischer Verfahren unter Verwendung von Proteinkinase-ähnlicher mRNA als Matrix gebildet werden. Menschlicher Proteinkinase ähnliche cDNA-Moleküle können hiernach unter Anwendung molekularbiologischer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und in Nachschlagewerken wie z.B. Sambrook et al. (1989) offenbart sind, repliziert werden. Ein Amplifikationsverfahren, wie z.B. PCR, kann eingesetzt werden, um zusätzliche Kopien von Polynucleotiden der Erfindung unter Verwendung von entweder genomischer DNA oder cDNA als Matrix zu erhalten.
  • Alternativ dazu können chemische Syntheseverfahren angewandt werden, um Proteinkinase-ähnliche Polynucleotide zu synthetisieren. Die Degeneration des genetischen Codes ermöglicht die Synthese wechselnder Nucleotidsequenzen, die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid mit beispielsweise einer in Seq.-ID Nr. 2 oder 9 gezeigten Aminosäuresequenz oder für eine biologisch aktive Variante davon kodieren.
  • Extension von Polynucleotiden
  • Die hierin offenbarte Teilsequenz kann verwendet werden, um das entsprechende Gen voller Länge, von dem sie herrührt, zu identifizieren. Die Teilsequenz kann nicktranslatiert oder mit 32P unter Verwendung von Polynucleotidkinase mittels dem Fachmann bekannter Markierungsverfahren (BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al. (Hrsg.), Elsevier Press, N.Y. (1986)) endmarkiert werden.
  • Eine aus menschlichem Gewebe erstellte lambda-Bibliothek beispielsweise kann direkt mit den markierten Sequenzen von Interesse gescreent werden, oder die Bibliothek kann als Ganzes in pBluescript übergeführt werden (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornien 92037), um Bakterienkolonie-Screening zu ermöglichen (siehe Sambrook et al., 1.20 (1989)).
  • Beide Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt. Kurz zusammengefasst werden Filter mit Bakterienkolonien, die die Bibliothek in pBluescript enthalten, oder mit Bakterienrasen, die lambda-Plaques enthalten, denaturiert, und die DNA wird an den Filtern fixiert. Die Filter werden mit der markierten Sonde unter Anwendung von Hybridisierungsbedingungen, die von Davis et al. (1986) beschrieben werden, hybridisiert. Die Teilsequenzen, kloniert in lambda oder pBluescript, können als positive Kontrollen verwendet werden, um Hintergrundbindung zu bestimmen und um die Hybridisierungs- und Waschstringenzen, die für exakte Klonidentifizierung erforderlich sind, einzustellen. Die resultierenden Autoradiogramme werden mit doppelt ausgeführten Platten von Kolonien oder Plaques verglichen; jeder belichtete Fleck entspricht einer positiven Kolonie oder einem positiven Plaque. Die Kolonien oder Plaques werden selektiert und vermehrt, und DNA wird aus den Kolonien zur weiteren Analyse und Sequenzierung isoliert.
  • Positive cDNA-Klone werden analysiert, um das Anusmaß an zusätzlicher Sequenz, die sie enthalten, unter Verwendung von PCR mit einem Primer aus der Teilsequenz und dem anderen Primer aus dem Vektor zu bestimmen. Klone mit einem größeren Vektor-Insert-PCR-Produkt als die ursprüngliche Teilsequenz werden durch Restriktionsverdau und DNA-Sequenzierung analysiert, um zu bestimmen, ob sie ein Insert derselben Größe oder einer ähnlichen Größe wie die mRNA-Größe, die mittels Northern-Blot-Analyse bestimmt wurde, enthalten.
  • Nachdem ein oder mehrere überlappende cDNA-Klone identifiziert wurden, kann die vollständige Sequenz der Klone bestimmt werden, beispielsweise nach Exonuclease-III-Verdau (McCombie et al., Methods 3, 33–40 (1991)). Es wird eine Reihe von Deletionsklonen gebildet, von denen jeder sequenziert wird. Die resultierenden über lappenden Sequenzen werden zu einer einzigen zusammenhängenden Sequenz mit hoher Redundanz (üblicherweise drei bis fünf überlappende Sequenzen an jeder Nucleotidposition) assembliert, was zu einer äußerst exakten Endsequenz führt.
  • Verschiedene PCR-basierte Verfahren können verwendet werden, um die hierin offenbarten Nucleinsäuresequenzen zu erweitern, um Stromauf-Sequenzen wie Promotoren und Regulationselemente zu detektieren. Beispielsweise verwendet Restriktionsstellen-PCR universelle Primer, um unbekannte Sequenzen zu finden, die benachbart zu einem bekannten Locus liegen (Sarkar, PCR Methods Applic. 2, 318–322 (1993)). Genomische DNA wird zunächst in Gegenwart eines Primers zu einer Linkersequenz und eines Primers, der für die bekannte Region spezifisch ist, amplifiziert. Die amplifizierten Sequenzen werden dann mit demselben Linkerprimer und einem anderen spezifischen Primer, der innerhalb des ersten liegt, einem zweiten PCR-Durchgang unterzogen. Die Produkte aus jedem PCR-Durchgang werden mit einer geeigneten RNA-Polymerase transkribiert und mittels reverser Transkriptase sequenziert.
  • Inverse PCR kann auch verwendet werden, um Sequenzen unter Verwendung divergierender Primer basierend auf einer bekannten Region zu amplifizieren oder zu erweitern (Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16, 8186 (1988)). Primer können unter Verwendung von handelsüblicher Software, wie z.B. „OLIGO 4.06 Primer Analysis Software" (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), so entworfen werden, dass sie eine Länge von 22–30 Nucleotiden aufweisen, einen GC-Gehalt von 50 % oder mehr haben und bei Temperaturen von etwa 68–72 °C an die Targetsequenz anellieren. Das Verfahren verwendet mehrere Restriktionsenzyme, um ein geeignetes Fragment in der bekannten Region eines Gens zu bilden. Das Fragment wird dann durch intramolekulare Ligation ringgeschlossen und als PCR-Matrix verwendet.
  • Ein anderes Verfahren, das angewandt werden kann, ist Einfang-PCR, das PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten umfasst, die benachbart zu einer bekannten Sequenz in menschlicher und von Hefe stammender, künstlicher chromosomaler DNA liegt (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1, 111–119 (1991)). In diesem Verfah ren können auch Mehrfach-Restriktionsenzymverdau und -Ligation verwendet werden, um eine gentechnisch veränderte doppelsträngige Sequenz in einem unbekannten Fragment des DNA-Moleküls anzuordnen, bevor PCR durchgeführt wird.
  • Ein anderes Verfahren, das angewandt werden kann, um unbekannte Sequenzen zu finden, ist jenes von Parker et al., Nucleic Acids Res. 19, 3055–3060 (1991). Darüber hinaus können PCR, verschachtelte Primer und PROMOTERFINDER-Bibliotheken (CLONTECH, Palo Alto, CA) verwendet werden, um Walking an genomischer DNA durchzuführen (CLONTECH, Palo Alto, Kalif.). Dieses Verfahren umgeht das Erfordernis, Bibliotheken zu screenen, und ist bei der Suche von Intron/Exon-Übergangsstellen nützlich.
  • Wird auf cDNA voller Länge gescreent, sind vorzugsweise Bibliotheken zu verwenden, die so größenselektiert wurden, dass sie größere cDNA enthalten. Zufällig geprimte Bibliotheken sind daher vorzuziehen, da sie mehr Sequenzen enthalten, die die 5'-Regionen von Genen enthalten. Die Verwendung einer zufällig geprimten Bibliothek kann insbesondere in Situationen vorzuziehen sein, in denen eine Oligo-d(T)-Bibliothek keine cDNA voller Länge ergibt. Genomische Bibliotheken können zur Extension einer Sequenz in nichttranskribierte 5'-Regulationsregionen nützlich sein.
  • Im Handel erhältliche Kapillarelektrophoresesysteme können verwendet werden, um die Größe der Nucleotidsequenz aus PCR oder der Sequenzierungsprodukte zu analysieren oder um diese Sequenz oder Produkte zu bestätigen. Beispielsweise kann Kapillarsequenzierung lauffähige Polymere zur Elektrophoresetrennung, vier verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe (einen für jedes Nucleotid), die laseraktiviert werden, und Detektion der emittierten Wellenlängen mit einer ladungsgekoppelten Kamera verwenden. Unter Verwendung von geeigneter Software (z.B. GENOTYPER und Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer) kann die Leistung/Lichtintensität in ein elektrisches Signal umgewandelt werden, und der gesamte Prozess vom Laden der Proben bis hin zur Computeranalyse und zur elektronischen Datenpräsentation kann computergestützt erfolgen. Kapillarelektrophorese ist insbesondere zum Sequenzie ren kleiner Teile von DNA zu bevorzugen, die in einer bestimmten Probe möglicherweise in begrenzter Menge vorhanden sind.
  • Gewinnen von Polypeptiden
  • Menschlicher Proteinkinase ähnliche Polypeptide können beispielsweise durch Reinigung aus menschlichen oder anderen Zellen, durch Expression von Proteinkinaseähnlichen Polynucleotiden oder durch direkte chemische Synthese gewonnen werden.
  • Proteinreinigung
  • Menschlicher Proteinkinase ähnliche Polypeptide können aus jeder beliebigen Zelle, die das Polypeptid exprimiert, einschließlich Wirtszellen, die mit Proteinkinase-ähnlichen Proteinexpressionskonstrukten transfiziert wurden, gereinigt werden. Ein gereinigtes Proteinkinase-ähnliches Polypeptid wird unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren von anderen Verbindungen, die sich normalerweise mit dem Proteinkinase-ähnlichen Polypeptid in der Zelle assoziieren, wie beispielsweise bestimmten Proteinen, Kohlenhydraten oder Lipiden, getrennt. Solche Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Größenausschlusschromatographie, Ammoniumsulfatfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und präparative Gelelektrophorese. Ein Präparat aus gereinigten Proteinkinase-ähnlichen Polypeptiden ist zumindest zu 80 % rein; vorzugsweise sind die Präparate zu 90 %, 95 % oder 99 % rein. Reinheit der Präparate kann mithilfe jedes beliebigen bekannten Verfahrens, wie z.B. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, getestet werden.
  • Expression von Polynucleotiden
  • Um ein Proteinkinase-ähnliches Polynucleotid zu exprimieren, kann das Polynucleotid in einen Expressionsvektor insertiert werden, der die für Transkription und Translation der insertierten kodierenden Sequenz erforderlichen Elemente enthält. Verfah ren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, können eingesetzt werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die Sequenzen, die für Proteinkinase-ähnliche Polypeptide kodieren, und geeignete Transkriptions- und Translations-Steuerungselemente enthalten. Diese Verfahren umfassen In-vitro-DNA-Rekombinationsverfahren, Syntheseverfahren und genetische In-vivo-Rekombination. Solche Verfahren werden beispielsweise in Sambrook et al. (1989) und in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1989), beschrieben.
  • Zahlreiche verschiedene Expressionsvektor/Wirt-Systeme können verwendet werden, die Sequenzen enthalten und exprimieren, die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodieren. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Mikroorganismen wie z.B. Bakterien, transformiert mit rekombinantem Bakteriophagen, Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren; Hefe, transformiert mit Hefe-Expressionsvektoren, Insektenzellsysteme, infiziert mit Virus-Expressionsvektoren (z.B. Baculovirus), Pflanzenzellsysteme, transformiert mit Virus-Expressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (z.B. Ti oder pBR322-Plasmiden), oder Tierzellsysteme.
  • Die Kontrollelemente oder Regulationssequenzen sind jene nichttranslatierten Regionen des Vektors -- Enhancer, Promotoren, untranslatierte 5'- und 3'-Regionen --, die mit Wirtszellproteinen Wechselwirken, um Transkription und Translation durchzuführen. Solche Elemente können in ihrer Stärke und Spezifität variieren. Je nach verwendetem Vektorsystem und Wirt kann jede beliebige Anzahl an geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, verwendet werden. Wird beispielsweise in bakteriellen Systemen kloniert, so können induzierbare Promotoren, wie z.B. der Hybrid-lacZ-Promotor des BLUESCRIPT-Phagemids (Stratagene, LaJolla, CA) oder pSPORT1-Plasmids (Life Technologies) und dergleichen verwendet werden. Der Baculovirus-Polyhedrin-Promotor kann in Insektenzellen verwendet werden. Promotoren oder Enhancer, die von den Genomen von Pflanzenzellen (z.B. Hitzeschock-, RUBISCO- und Speicherproteingene) oder von Pflanzenviren (z.B. virale Promotoren oder Leadersequenzen) abstammen, können in den Vektor kloniert werden. In Säugetierzellsystemen sind Promotoren aus Säugetiergenen oder aus Säugetierviren zu bevorzugen. Sofern es erforderlich ist, eine Zelllinie zu bilden, die Mehrfachkopien einer Nucleotidsequenz enthält, die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodiert, können auf SV40 oder EBV basierende Vektoren mit einem geeigneten selektierbaren Marker verwendet werden.
  • Bakterielle und Hefe-Expressionssysteme
  • In bakteriellen Systemen können zahlreiche Expressionsvektoren je nach der für das Proteinkinase-ähnliche Polypeptid beabsichtigten Verwendung ausgewählt werden. Besteht beispielsweise Bedarf an einer großen Menge an einem Proteinkinase-ähnlichen Polypeptid zur Induktion von Antikörpern, so können Vektoren verwendet werden, die hochgradige Expression von leicht zu reinigenden Fusionsproteinen steuern. Solche Vektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf multifunktionelle E.-coli-Klonier- und –Expressionsvektoren, wie z.B. BLUESCRIPT (Stratagene). In einem BLUESCRIPT-Vektor kann eine Sequenz, die für das Proteinkinase-ähnliche Polypeptid kodiert, in den Vektor im Raster mit Sequenzen für das Amino-terminale Met und die darauf folgenden 7 Reste von β-Galactosidase ligiert werden, sodass das Hybridprotein produziert wird. pIN-Vektoren (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503–5509 (1989)) oder pGEX-Vektoren (Promega, Madison, Wis.) können auch verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können leicht aus lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Perlen, gefolgt von Elution in Gegenwart von freiem Glutathion gereinigt werden. Proteine, die in solchen Systemen hergestellt werden, können so entworfen werden, dass sie Heparin-, Thrombin- oder Faktor-Xa-Protease-Spaltungsstellen umfassen, sodass das klonierte Polypeptid von Interesse auf Wunsch aus der GST-Gruppierung freigesetzt werden kann.
  • in der Hefe Saccharomyces cerevisiae können zahlreiche Vektoren verwendet werden, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, wie beispielsweise α-Faktor, Alkohol-Oxidase und PGH. Berichte hierzu sind in Ausubel et al. (1989) und Grant et al., Methods Enzymol. 153, 516–544 (1987), zu finden.
  • Pflanzen- und Insekten-Expressionssysteme
  • Werden Pflanzen-Expressionsvektoren verwendet, so kann die Expression von Sequenzen, die für Proteinkinase-ähnliche Polypeptide kodieren, durch eine beliebige Anzahl an Promotoren gesteuert werden. Virale Promotoren, wie z.B. 35S- und 19S-Promotoren von CaMV, können alleine oder in Kombination mit der omega-Leadersequenz aus TMV verwendet werden (Takamatsu, EMBO J. 6, 307–311 (1987)). Alternativ dazu können Pflanzenpromotoren, wie z.B. kleine Untereinheiten von RUBISCO- oder Hitzeschock-Promotoren, verwendet werden (Coruzzi et al., EMBO J. 3, 1671–1680 (1984); Broglie et al., Science 224, 838–843 (1984); Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17, 85–105 (1991)). Diese Konstrukte können durch direkte DNA-Transformation oder durch Pathogen-vermittelte Transfektion in Pflanzenzellen eingeführt werden. Solche Verfahren werden in zahlreichen, allgemein zugänglichen Berichten beschrieben (z.B. Hobbs oder Murray, in: MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York, N.Y., 191–196 (1992)).
  • Eine Insektenzelle kann auch verwendet werden, um ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid zu exprimieren. In einem solchen System wird beispielsweise "Autographe californica nuclear polyhedrosis virus" (AcNPV) als Vektor verwendet, um fremde Gene in Spodoptera-frugiperda-Zellen oder in Trichoplusia-Larven zu exprimieren. Sequenzen, die für Proteinkinase-ähnliche Polypeptide kodieren, können in eine nichtessentielle Region des Virus, z.B. in das Polyhedrin-Gen, kloniert und unter die Steuerung des Polyhedrin-Promotors gestellt werden. Erfolgreiche Insertion von Proteinkinase-ähnlichen Polypeptiden inaktiviert das Polyhedrin-Gen und erzeugt ein rekombinantes Virus, das kein Hüllprotein aufweist. Die rekombinanten Viren können dann verwendet werden, um S.-frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven zu infizie ren, in denen Proteinkinase-ähnliche Polypeptide exprimiert werden können (Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 3224–3227 (1994)).
  • Säugetier-Expressionssysteme
  • Zahlreiche virusbasierte Expressionssysteme können verwendet werden, um Proteinkinase-ähnliche Polypeptide in Säugetierzellen zu exprimieren. Wird beispielswiese ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet, so können Sequenzen, die für Proteinkinase-ähnliche Polypeptide kodieren, in einen Adenovirus-Transkriptions/Translationskomplex ligiert werden, der den späten Promotor und dreiteilige Leadersequenz umfasst. Insertion in eine nichtessentielle E1- oder E3-Region des viralen Genoms kann eingesetzt werden, um ein lebensfähiges Virus zu erhalten, das in der Lage ist, ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid in infizierten Wirtszellen zu exprimieren (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655–3659 (1984)). Falls gewünscht können Transkriptions-Enhancer, wie z.B. der Rous-Sarkom-Virus-(RSV-) Enhancer, verwendet werden, um die Expression in Säugetierzellen zu steigern.
  • Menschliche künstliche Chromosomen (HACs) können auch verwendet werden, um größere DNA-Fragmente zu liefern, die in einem Plasmid enthalten sein und exprimiert werden können. HACs von 6 M bis 10 M werden konstruiert und über herkömmliche Zufuhrverfahren (z.B. Liposomen, polykationische Aminopolymere oder Vesikel) Zellen zugeführt.
  • Spezifische Initiationssignale können auch verwendet werden, um eine wirksamere Translation von für Proteinkinase-ähnliche Polypeptide kodierende Sequenzen zu erzielen. Solche Signale umfassen das ATG-Startcodon und benachbarte Sequenzen. In Fällen, in denen Sequenzen, die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodieren, ihr Startcodon und Stromauf-Sequenzen in den geeigneten Expressionsvektor insertiert werden, können gegebenenfalls keine zusätzlichen Transkriptions- oder Translations-Kontrollsignale mehr erforderlich sein. In Fällen jedoch, in denen nur eine kodierende Sequenz oder ein Fragment davon insertiert wird, sollten exogene Translations-Kontrollsignale (einschließlich des ATG-Startcodons) bereitgestellt wer den. Das Startcodon sollte im richtigen Leseraster liegen, um die Translation des gesamten Inserts sicherzustellen. Exogene Translationselemente und Startcodons können verschiedenen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, Ursprungs sein. Die Wirksamkeit der Expression kann durch die Einbindung von Enhancern, die für das jeweils verwendete Zellsystem geeignet sind, gesteigert werden (siehe Scharf et al., Results Probt. Cell Differ. 20, 125–162 (1994)).
  • Wirtszellen
  • Ein Wirtszellenstamm kann anhand seiner Fähigkeit ausgewählt werden, die Expression der insertierten Sequenzen zu modulieren oder das exprimierte Proteinkinaseähnliche Polypeptid in gewünschter Weise zu prozessieren. Solche Modifikationen des Polypeptids umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Acetylierung, Carboxylierung, Glykosylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung. Posttranslationale Prozessierung, die eine "Präpro"-Form des Polypeptids spaltet, kann auch verwendet werden, um korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion zu erleichtern. Verschiedene Wirtszellen, die spezifische Zellmechanismen und charakteristische Mechanismen für posttranslationale Aktivitäten aufweisen (z.B. CHO, HeLa, MDCK, HEK293 und WI38), sind bei der American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) erhältlich und können so gewählt werden, dass die korrekte Modifikation und Prozessierung des fremden Proteins sichergestellt ist.
  • Stabile Expression wird für die langfristige Produktion mit hohen Ausbeuten an rekombinanten Proteinen bevorzugt. Zelllinien beispielsweise, die Proteinkinase-ähnliche Polypeptide stabil exprimieren, können unter Verwendung von Expressionsvektoren transformiert werden, die virale Replikationsursprünge und/oder endogene Expressionselemente und ein selektierbares Markergen auf demselben oder einem separaten Vektor enthalten. Nach der Einführung des Vektors können Zellen 1–2 Tage lang in einem angereicherten Medium vermehren gelassen werden, bevor sie in ein selektives Medium übertragen werden. Der Zweck des selektierbaren Markers ist, Resistenz gegenüber Selektion zu verleihen, und seine Gegenwart ermöglicht Wachstum und Gewinnung von Zellen, die die eingeführten Proteinkinase-ähnlichen Proteinsequenzen erfolgreich exprimieren. Resistente Klone von stabil transformierten Zellen können unter Verwendung von Gewebekulturverfahren, die für den Zelltyp geeignet sind, vermehrt werden. Siehe beispielsweise ANIMAL CELL CULTURE, R.I. Freshney (Hrsg.) (1986).
  • Jegliche Anzahl an Selektionssystemen kann verwendet werden, um transformierte Zelllinien zu gewinnen.
  • Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf das Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-(Wigler et al., Cell 11, 223–232 (1977)) und das Adenin-Phosphoribosyltransferase-(Lowy et al., Cell 22, 817–823 (1980)) Gen, die in tk–- bzw. aprt–-Zellen verwendet werden können. Auch kann Antimetaboliten-, Antibiotika- oder Herbizid-Resistenz als Kriterium für die Selektion verwendet werden. dhfr beispielsweise verleiht Resistenz gegen Methotrexat (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567–3570 (1980)), npt verleiht Resistenz gegen Aminoglykoside, Neomycin und G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1–14 (1981)), und als und pat verleihen Resistenz gegen Chlorsulfuron bzw. Phosphinotricin-Acetyltransferase (Murray (1992), s.o.). Weitere selektierbare Gene wurden bereits beschrieben. trpB beispielsweise ermöglicht es Zellen, Indol anstelle von Tryptophan zu verwerten, und hisD ermöglicht es Zellen, Histinol anstelle von Histidin zu verwerten (Harturan & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047–8051 (1988)). Sichtbare Marker wie Anthocyanine, β-Glucuronidase und ihr Substrat GUS sowie Luciferase und ihr Substrat Luciferin können verwendet werden, um Transformanten zu identifizieren und um das Ausmaß an vorübergehender oder stabiler Proteinexpression, die einem spezifischen Vektorsystem zuzuschreiben ist, zu quantifizieren (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55, 121–131 (1995)).
  • Detektion von Expression
  • Obwohl das Vorliegen von Markergenexpression darauf schließen lässt, dass das Proteinkinase-ähnliche Polynucleotid auch vorhanden ist, kann seine Gegenwart und Expression dennoch bestätigt werden müssen. Wird beispielsweise eine Sequenz, die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodiert, innerhalb einer Markergensequenz insertiert, so können transformierte Zellen, die Sequenzen enthalten, die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodieren, durch die Abwesenheit der Markergenfunktion identifiziert werden. Alternativ dazu kann ein Markergen hinter einer Sequenz, die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodiert, unter der Steuerung eines einzigen Promotors angeordnet werden. Expression des Markergens als Reaktion auf Induktion oder Selektion zeigt üblicherweise die Expression des Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotids an.
  • Alternativ dazu können Wirtszellen, die ein Proteinkinase-ähnliches Polynucleotid enthalten und ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid exprimieren, durch zahlreiche verschiedene Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, identifiziert werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierungen und Protein-Biotest- oder -Immuntestverfahren, die Membran-, Lösungs- oder Chip-basierte Techniken zur Detektion und/oder Quantifizierung von Nucleinsäure oder Protein umfassen. Die Gegenwart einer Polynucleotidsequenz, die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodiert, kann beispielsweise durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder -Amplifikation unter Verwendung von Sonden oder Fragmenten oder Fragmenten von Polynucleotiden, die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodieren, nachgewiesen werden. Auf Nucleinsäureamplifikation basierende Tests umfassen die Verwendung von Oligonucleotiden, die aus Sequenzen ausgewählt sind, die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodieren, um Transformanten nachzuweisen, die ein Proteinkinase-ähnliches Polynucleotid enthalten.
  • Zahlreiche verschiedene Vorschriften zur Detektion und Messung der Expression eines Proteinkinase-ähnlichen Polypeptids unter Verwendung von entweder polyklo nalen oder monoklonalen Antikörpern, die für das Polypeptid spezifisch sind, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), Radioimmuntest (RIA) und Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren (FACS). Ein monoklonal-basierter Zweistellen-Immuntest unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die mit zwei nichtstörenden Epitopen an einem Proteinkinase-ähnlichen Polypeptid reagieren, kann verwendet werden, oder es kann ein kompetitiver Bindungstest verwendet werden. Diese und andere Tests werden in Hampton et al., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minn. (1990), und in Maddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211–1216 (1983), beschrieben.
  • Zahlreiche verschiedene Markierungen und Konjugationsverfahren sind Fachleuten bekannt und können in verschiedenen Nucleinsäure- und Aminosäuretests verwendet werden. Mittel zur Herstellung von markierten Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zur Detektion von Sequenzen, die mit für Proteinkinase-ähnliche Polypeptide kodierenden Polynucleotiden in Verbindung stehen, umfassen Oligomarkierung, Nick-Translation, End-Markierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids. Alternativ dazu können Sequenzen, die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodieren, in einen Vektor zur Herstellung einer mRNA-Sonde kloniert werden. Solche Vektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, sind im Handel erhältlich und können verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro durch Zusatz von markierten Nucleotiden und einer geeigneten RNA-Polymerase, wie z.B. T7, T3 oder SP6, zu synthetisieren. Diese Verfahren können unter Einsatz einer Vielzahl handelsüblicher Sets (Amersham Pharmacia Biotech, Promega, und US Biochemical) durchgeführt werden. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen, die für die leichtere Durchführung der Detektion verwendet werden können, umfassen Radionuclide, Enzyme und fluoreszierende, chemilumineszierende oder chromogene Mittel sowie Substrate, Co-Faktoren, Inhibitoren, magnetische Teilchen und dergleichen.
  • Expression und Reinigung von Polypeptiden
  • Wirtszellen, die mit Nucleotidsequenzen transformiert sind, die für ein Proteinkinaseähnliches Polypeptid kodieren, können unter Bedingungen kultiviert werden, die zur Expression und Gewinnung des Proteins aus der Zellkultur geeignet sind. Das von einer transformierten Zelle produzierte Polypeptid kann, je nach verwendeter Sequenz und/oder verwendetem Vektor, sekretiert werden oder intrazellulär enthalten sein. Dem Fachmann ist klar, dass Expressionsvektoren entworfen werden können, die Polynucleotide enthalten, die für Proteinkinase-ähnliche Polypeptide kodieren, um Signalsequenzen zu enthalten, welche die Sekretion von löslichen Proteinkinaseähnlichen Polypeptiden durch eine prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran steuern oder die Membraninsertion von membrangebundenem Proteinkinase-ähnlichem Polypeptid steuern.
  • Wie zuvor erläutert können andere Konstruktionen verwendet werden, um eine Sequenz, die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodiert, an eine Nucleotidsequenz zu binden, die für eine Polypeptiddomäne kodiert, die die Reinigung von löslichen Proteinen erleichtert. Solche die Reinigung erleichternde Domänen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf metallchelatbildende Peptide, wie z.B. Histidin-Tryptophan-Module, die eine Reinigung an immobilisierten Metallen ermöglichen, Protein-A-Domänen, die eine Reinigung an immobilisiertem Immunglobulin ermöglichen, und die im FLAGS-Extensions/Affinitäts-Reinigungssystem eingesetzte Domäne (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Einbindung spaltbarer Linker-Sequenzen wie beispielsweise jener, die für Factor Xa oder Enterokinase spezifisch sind (Invitrogen, San Diego, CA), zwischen Reinigungsdomäne und dem Proteinkinase-ähnlichen Polypeptid kann ebenfalls genutzt werden, um die Reinigung zu erleichtern. Ein solcher Expressionsvektor sorgt für die Expression eines Fusionsproteins, das ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid und 6 Histidinreste enthält, die einer Thioredoxin- oder einer Enterokinase-Spaltungsstelle vorangehen. Die Histidinreste erleichtern eine Reinigung durch IMAC (Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Metallion, wie von Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3, 263–281 (1992), beschrieben), während die Enterokinase-Spaltungsstelle ein Mittel zur Reinigung des Proteinkinase-ähnlichen Polypeptids aus dem Fusionsprotein bereitstellt. Vektoren, die Fusionsproteine enthalten, werden von Kroll et al., DNA Cell Biol. 12, 441–453 (1993), offenbart.
  • Chemische Synthese
  • Sequenzen, die für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodieren, können als Ganzes oder teilweise unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten chemischen Verfahren synthetisiert werden (siehe Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215–223 (1980); Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225–232 (1980)). Alternativ dazu kann ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid selbst unter Anwendung chemischer Verfahren zur Synthese der Aminosäuresequenz desselben hergestellt werden, beispielsweise durch direkte Peptidsynthese unter Anwendung von Festphasenverfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963); Roberge et al., Science 269, 202–204 (1995)). Proteinsynthese kann unter Anwendung manueller Verfahren oder durch Automation durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung des Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizers (Perkin Elmer) erfolgen. Gegebenenfalls können Fragmente von Proteinkinase-ähnlichen Polypeptiden separat synthetisiert und unter Anwendung chemischer Verfahren zur Bildung eines Moleküls voller Länge kombiniert werden.
  • Das neu synthetisierte Peptid kann durch präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (z.B. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, WH Freeman & Co., New York, N.Y. (1983)) im Wesentlichen gereinigt werden. Die Zusammensetzung eines synthetischen Proteinkinase-ähnlichen Polypeptids kann durch Aminosäureanalyse oder durch Sequenzierung (z.B. durch das Edman-Abbauverfahren; siehe Creighton, s.o.) bestätigt werden. Darüber hinaus kann jeder beliebige Abschnitt der Aminosäuresequenz des Proteinkinase-ähnlichen Polypeptids während der direkten Synthese verändert und/oder unter Anwendung chemischer Verfahren mit Sequenzen aus anderen Proteinen kombiniert werden, um eine Polypeptidvariante oder ein Fusionsprotein zu bilden.
  • Herstellung von veränderten Polypeptiden
  • Dem Fachmann ist klar, dass es von Vorteil sein kann, Nucleotidsequenzen, die für Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodieren, herzustellen, die nicht in der Natur vorkommende Codons aufweisen. Codons beispielsweise, die von einem bestimmten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt bevorzugt werden, können ausgewählt werden, um das Protein-Expressionslevel zu steigern oder um ein RNA-Transkript zu bilden, das wünschenswerte Eigenschaften aufweist, wie beispielsweise eine Halbwertszeit, die länger ist als jene eines Transkripts, das aus der natürlich vorkommenden Sequenz gebildet wird.
  • Die hierin offenbarten Nucleotidsequenzen können unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannten Verfahren zur Änderung von kodierenden Sequenzen für Proteinkinase-ähnliches Polypeptid für zahlreiche verschiedene Zwecke gentechnisch verändert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Änderungen, die das Klonieren, die Prozessierung und/oder die Expression des Polypeptids oder des mRNA-Produkts modifizieren. DNA-Neukombination durch Zufallsfragmentierung und PCR-Neuanordnung von Genfragmenten und synthetischen Oligonucleotiden können verwendet werden, um die Nucleotidsequenzen gentechnisch zu verändern. Ortsgerichtete Mutagenese beispielsweise kann verwendet werden, um neue Restriktionsstellen zu insertieren, Glykosylierungsmuster zu ändern, Codonpräferenz zu modifizieren, Spleißvarianten zu bilden, Mutationen einzuführen und dergleichen.
  • Antikörper
  • Jeder beliebige Typ von Antikörper, der nach dem Stand der Technik bekannt ist, kann gebildet werden, sodass er sich dann spezifisch an ein Epitop eines Proteinkinase-ähnlichen Polypeptids bindet. "Antikörper", wie hierin verwendet, umfasst intakte Immunglobulinmoleküle sowie Fragmente davon, wie z.B. Fab, F(ab')2 und Fv, die in der Lage sind, sich an ein Epitop eines Proteinkinase-ähnlichen Polypeptids zu binden. Typischerweise sind zumindest 6, 8, 10 oder 12 zusammenhängende Aminosäuren erforderlich, um ein Epitop zu bilden. Epitope jedoch, die nicht zusammenhängende Aminosäuren einbinden, können mehr, z.B. zumindest 15, 25 oder 50, Aminosäuren erfordern.
  • Ein Antikörper, der sich spezifisch an ein Epitop eines Proteinkinase-ähnlichen Polypeptids bindet, kann therapeutisch sowie in immunchemischen Tests, wie z.B. Western-Blots, ELISAs, Radioimmuntests, immunhistochemischen Tests, Immunfällungen oder anderen immunchemischen Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verwendet werden. Verschiedene Immuntests können verwendet werden, um Antikörper zu identifizieren, die die gewünschte Spezifität aufweisen. Zahlreiche Vorschriften für kompetitive Bindung oder immunoradiometrische Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt. Solche Immuntests umfassen typischerwiese die Messung von Komplexbildung zwischen einem Immunogen und einem Antikörper, der sich spezifisch an das Immunogen bindet.
  • Typischerweise liefert ein Antikörper, der sich spezifisch an ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid bindet, ein Detektionssignal, das zumindest 5-, 10- oder 20-mal stärker ist als ein Detektionssignal, das mit anderen Proteinen erzielt wird, wenn sie in einem immunchemischen Test verwendet werden. Vorzugsweise detektieren Antikörper, die sich spezifisch an Proteinkinase-ähnliche Polypeptide binden, keine anderen Proteine in immunchemischen Tests und können ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid aus einer Lösung immunfällen.
  • Menschlicher Proteinkinase ähnliche Polypeptide können verwendet werden, um ein Säugetier, wie z.B. eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Meerschweinchen, einen Affen oder einen Menschen, zu immunisieren, um polyklonale Antikörper zu bilden. Falls gewünscht, kann ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid an ein Trägerprotein, wie beispielsweise Rinderserumalbumin, Thyroglobulin und Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, konjugiert werden. Je nach Wirtsspezies können verschiedene Adjuvanzien verwendet werden, um die immunologische Antwort zu verstärken. Solche Adjuvanzien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Freundsches Adjuvans, Mineralgele (z.B. Aluminiumhydroxid) und oberflächenaktive Sub stanzen (z.B. Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin und Dinitrophenol). Unter den bei Menschen eingesetzten Adjuvanzien sind BCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum besonders zweckdienlich.
  • Monoklonale Antikörper, die sich spezifisch an ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid binden, können unter Verwendung jedes beliebigen Verfahrens hergestellt werden, das für die Bildung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur sorgt. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf das Hybridomverfahren, das menschliche B-Zellen-Hybridomverfahren und das EBV-Hybridomverfahren (Kohler et al., Nature 256, 495–497 (1985); Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31–42 (1985); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026–2030 (1983); Cole et al., Mol. Cell Biol. 62, 109–120 (1984)).
  • Darüber hinaus können Verfahren eingesetzt werden, die zur Herstellung von "chimären Antikörpern", zum Spleißen von Maus-Antikörper-Genen an menschliche Antikörpergene, um ein Molekül mit geeigneter Antigen-Spezifität und biologischer Aktivität zu erhalten, entwickelt wurden (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851–6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312, 604–608 (1984); Takeda et al., Nature 314, 452–454 (1985)). Monoklonale und andere Antikörper können auch "humanisiert" werden, um einen Patienten davor zu schützen, eine Immunantwort gegen den Antikörper zu entwickeln, wenn dieser therapeutisch eingesetzt wird. Solche Antikörper können auf Sequenzebene menschlichen Antikörpern ausreichend ähnlich sein, um direkt in Therapien verwendet zu werden, oder können der Änderung einiger weniger maßgeblicher Reste bedürfen. Sequenzunterschiede zwischen Nagetier-Antikörpern und menschlichen Sequenzen können durch Ersetzen von Resten, die sich von jenen in den menschlichen Sequenzen unterscheiden, durch ortsgerichtete Mutagenese einzelner Reste oder durch Rasterung ganzer komplementaritätsbestimmender Regionen minimiert werden. Alternativ dazu können humanisierte Antikörper unter Verwendung von Rekombinationsverfahren wie in der GB-6-2.188.638 beschrieben gebildet werden. Antikörper, die sich spezifisch an ein Proteinkinase-ähnli ches Polypeptid binden, können Antigen-Bindungsstellen enthalten, die entweder teilweise oder vollständig humanisiert sind, wie in der US 5.565.332 offenbart ist.
  • Alternativ dazu können Techniken, die für die Bildung von einkettigen Antikörpern beschrieben wurden, unter Einsatz von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren adaptiert werden, um einkettige Antikörper zu bilden, die sich spezifisch an Proteinkinase-ähnliche Polypeptide binden. Antikörper mit verwandter Spezifität, jedoch mit eigener idiotypischer Zusammensetzung, können durch Ketten-Neukombination aus Zufallskombinations-Immunglobulinbibliotheken gebildet werden (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120–11123 (1991)).
  • Einkettige Antikörper können auch mittels eines DNA-Amplifikationsverfahrens wie beispielsweise PCR unter Verwendung von Hybridom-cDNA als Matrix (Thirion et al., Eur. J. Cancer Prev. 5, 507–511 (1996)) konstruiert werden. Einkettige Antikörper können mono- oder bispezifisch sein und können zweiwertig oder vierwertig sein. Die Konstruktion von vierwertigen, bispezifischen, einkettigen Antikörpern wird beispielsweise von Coloma & Morrison, Nat. Biotechnol. 15, 159–163 (1997), gelehrt. Die Konstruktion von zweiwertigen, bispezifischen, einkettigen Antikörpern wird von Mallender & Voss, J. Biol. Chem. 269, 199–206 (1994), gelehrt.
  • Eine Nucleotidsequenz, die für einen einkettigen Antikörper kodiert, kann unter Anwendung von manueller oder automatisierter Nucleotidsynthese konstruiert, unter Anwendung von Standard-DNA-Rekombinationsverfahren in ein Expressionskonstrukt kloniert und in eine Zelle eingeführt werden, um die kodierende Sequenz zu exprimieren, wie nachstehend beschrieben. Alternativ dazu können einkettige Antikörper direkt, beispielsweise unter Einsatz von filamentösen Phagen gebildet werden (Verhaar et al., Int. J. Cancer 61, 497–501 (1995); Nicholls et al., J. Immunöl. Meth. 165, 81–91 (1993)).
  • Antikörper, die sich spezifisch an Proteinkinase-ähnliche Polypeptide binden, können auch durch Induktion von In-vivo-Produktion in der Lymphozytenpopulation oder durch Screenen von Immunglobulinbibliotheken oder Gruppen von hochspezifischen Bindungsreagenzien, wie in der Literatur offenbart, gebildet werden (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833–3837 (1989); Winter et al., Nature 349, 293–299 (1991)).
  • Auch andere Typen von Antikörpern können konstruiert und therapeutisch eingesetzt werden. Chimäre Antikörper beispielsweise können wie in der WO 93/03151 offenbart konstruiert werden. Bindungsproteine, die von Immunglobulinen abgeleitet sind und die mehrwertig und multispezifisch sind, wie z.B. die in der WO 94/13804 beschriebenen "Diabodies", können ebenfalls hergestellt werden.
  • Antikörper können mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, gereinigt werden. Antikörper können beispielsweise durch Leiten über eine Säule, an die ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid gebunden ist, affinitätsgereinigt werden. Die gebundenen Antikörper können dann unter Verwendung eines Puffers mit hoher Salzkonzentration aus der Säule eluiert werden.
  • Antisense-Oligonucleotide
  • Antisense-Oligonucleotide sind Nucleotidsequenzen, die zu einer spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz komplementär sind. Nachdem sie in eine Zelle eingeführt wurden, kombinieren sich die komplementären Nucleotide mit natürlichen Sequenzen, die von der Zelle produziert wurden, um Komplexe zu bilden und entweder Transkription oder Translation zu blockieren. Vorzugsweise ist ein Antisense-Oligonucleotid zumindest 11 Nucleotide lang, kann jedoch zumindest 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 oder mehr Nucleotide lang sein. Längere Sequenzen können auch verwendet werden. Antisense-Oligonucleotidmoleküle können in einem DNA-Konstrukt bereitgestellt und in eine Zelle eingeführt werden, wie zuvor beschrieben, um die Konzentration an Proteinkinase-ähnlichen Gen-Produkten in der Zelle zu reduzieren.
  • Antisense-Oligonucleotide können Desoxyribonucleotide, Ribonucleotide oder eine Kombination dieser beiden sein. Oligonucleotide können manuell oder mit einem automatisierten Synthesegerät synthetisiert werden, durch kovalentes Binden des 5'- Endes eines Nucleotids an das 3'-Ende eines anderen Nucleotids über Nicht-Phosphodiester-Internucleotidbindungen, wie z.B. Alkylphosphonate, Thiophosphate, Dithiophosphate, Alkylthiophosphate, Alkylphosphonate, Phosphoramidate, Phosphatester, Carbamate, Acetamidat, Carboxymethylester, Carbonate und Phosphorsäuretriester. Siehe Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 1–8 (1994); Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1–72 (1994); Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543–583 (1990).
  • Modifikationen der Expression von Proteinkinase-ähnlichem Gen kann durch Entwerfen von Antisense-Oligonucleotiden erreicht werden, die Duplices mit Kontroll-, 5'- oder Regulationsregionen des Proteinkinase-ähnlichen Gens bilden. Oligonucleotide, die aus der Transkriptionsinitiationsstelle, z.B. zwischen den Positionen –10 und +10 von der Startstelle aus, stammen, werden bevorzugt. Auf ähnliche Weise kann Inhibition unter Verwendung der "Tripelhelix"-Basenpaarungs-Methode erreicht werden. Tripelhelix-Paarung ist nützlich, da sie eine Hemmung der Fähigkeit der Doppelhelix, sich ausreichend für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder Chaperonen zu öffnen, bewirkt. Therapeutische Ansätze unter Verwendung von Triplex-DNA wurden bereits in der Literatur beschrieben (z.B. Gee et al., in: Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y. (1994)). Ein Antisense-Oligonucleotid kann auch entworfen werden, um Translation von mRNA durch das Unterbinden von Bindung des Transkripts an Ribosomen zu blockieren.
  • Exakte Komplementarität ist für erfolgreiche Komplexbildung zwischen einem Antisense-Oligonucleotid und der komplementären Sequenz eines Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotids nicht erforderlich. Antisense-Oligonucleotide, die beispielsweise 2, 3, 4 oder 5 oder mehr Abschnitte aus zusammenhängenden Nucleotiden, die genau komplementär zu einem Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotid sind, jeweils getrennt durch einen Abschnitt zusammenhängender, zu benachbarten Proteinkinaseähnlichen Proteinnucleotiden nicht komplementärer Nucleotide umfassen, können für ausreichende Targeting-Spezifität für Proteinkinase-ähnliche mRNA sorgen. Vorzugsweise weist jeder Abschnitt zusammenhängender komplementärer Nucleotide eine Länge von zumindest 4, 5, 6, 7 oder 8 oder mehr Nucleotiden auf. Nichtkomple mentäre, dazwischenliegende Sequenzen sind vorzugsweise 1, 2, 3 oder 4 Nucleotide lang. Fachleute können den berechneten Schmelzpunkt eines Antisense-Sense-Paars problemlos nutzen, um den Grad an Fehlpaarungen, der zwischen einem bestimmten Antisense-Oligonucleotid und einer bestimmten Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotidsequenz toleriert wird, zu bestimmen.
  • Antisense-Oligonucleotide können ohne Beeinflussung ihrer Fähigkeit, an ein Proteinkinase-ähnliches Polynucleotid zu hybridisieren, modifiziert werden. Diese Modifikationen können innerhalb oder an einem oder beiden Enden des Antisense-Moleküls erfolgen. Internucleosidphosphatbindungen können durch Hinzufügen von Cholesterin- oder Diamingruppierungen mit variierender Anzahl an Kohlenstoffresten zwischen den Aminogruppen und der terminalen Ribose modifiziert werden. Modifizierte Basen und/oder Zucker, wie z.B. Arabinose anstelle von Ribose, oder ein 3',5'-substituiertes Oligonucleotid, in dem die 3'-Hydroxylgruppe oder die 5'-Phosphatgruppe substituiert ist, können ebenfalls in einem modifizierten Antisense-Oligonucleotid verwendet werden. Diese modifizierten Oligonucleotide können durch Verfahren hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind. Siehe z.B. Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10, 152–158 (1992); Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543–584 (1990); Uhlmann et al., Tetrahedron Lett. 215, 3539–3542 (1987).
  • Ribozyme
  • Ribozyme sind RNA-Moleküle mit katalytischer Aktivität. Siehe z.B. Cech, Science 236, 1532–1539 (1987); Cech, Ann. Rev. Biochem. 59, 543–568 (1990); Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 605–609 (1992); Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510–515 (1996). Ribozyme können verwendet werden, um Genfunktion durch Spalten einer RNA-Sequenz zu inhibieren, wie dies auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist (z.B. Haseloff et al., US-Patent 5.641.673 ). Der Mechanismus von Ribozymwirkung umfasst sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an komplementäre Target-RNA, gefolgt von endonukleolytischer Spaltung. Beispiele umfassen gentechnisch veränderte Hammerkopfmotiv-Ribozymmoleküle, die endonukleolytische Spaltung von spezifischen Nucleotidsequenzen spezifisch und wirksam katalysieren können.
  • Die kodierende Sequenz eines Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotids kann verwendet werden, um Ribozyme zu bilden, die sich spezifisch an mRNA binden, die vom Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotid transkribiert wird. Verfahren zum Entwerfen und Konstruieren von Ribozymen, die andere RNA-Moleküle in trans auf sehr sequenzspezifische Weise spalten können, wurden auf dem Gebiet der Erfindung bereits entwickelt und beschrieben (siehe Haseloff et al., Nature 334, 585–591 (1988)). Die Spaltungsaktivität von Ribozymen kann beispielsweise durch gentechnisches Verändern einer einzelnen "Hybridisierungs"-Region in das Ribozym auf spezifische RNAs abgezielt werden. Die Hybridisierungsregion enthält eine Sequenz, die komplementär zur Target-RNA ist und somit spezifisch mit dem Target hybridisiert (siehe beispielsweise Gerlach et al., Polypeptid 321.201).
  • Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen innerhalb eines Proteinkinase-ähnlichen Protein-RNA-Targets können durch Scannen des Target-Moleküls auf Ribozym-Spaltungsstellen identifiziert werden, die die folgenden Sequenzen umfassen: GUA, GUU und GUC. Nachdem sie identifiziert wurden, können kurze RNA-Sequenzen mit zwischen 15 und 20 Ribonucleotiden, die der Region der Target-RNA entsprechen, die die Spaltungsstelle enthält, bezüglich sekundärer struktureller Eigenschaften bewertet werden, die das Target funktionsunfähig machen können. Die Eignung vermutlicher Proteinkinase-ähnlicher Protein-RNA-Targets kann auch durch Testen der Verfügbarkeit für Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden unter Verwendung von Ribonucleaseschutztests bewertet werden. Längere komplementäre Sequenzen können verwendet werden, um die Affinität der Hybridisierungssequenz für das Target zu erhöhen. Die Hybridisierungs- und Spaltungsregionen des Ribozyms können fix verbunden werden, sodass bei Hybridisierung an die Target-RNA durch die komplementären Regionen die katalytische Region des Ribozyms das Target spalten kann.
  • Ribozyme können als Teil eines DNA-Konstrukts in Zellen eingeführt werden. Mechanische Verfahren, wie beispielsweise Mikroinjektion, Liposomen-vermittelte Transfektion, Elektroporation oder Calciumphosphatfällung, können verwendet werden, um ein Ribozym-hältiges DNA-Konstrukt in Zellen einzuführen, in denen die Expression von Proteinkinase-ähnlichem Protein verringert werden soll. Alternativ dazu, sofern gewünscht wird, dass die Zellen das DNA-Konstrukt stabil beibehalten, kann das Konstrukt auf einem Plasmid bereitgestellt und als separates Element oder in das Genom der Zellen integriert gehalten werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Ein für Ribozym kodierendes DNA-Konstrukt kann Transkriptionsregulationselemente, wie z.B. ein Promotorelement, ein Enhancer- oder UAS-Element und ein Transkriptionsterminationssignal, zur Steuerung der Transkription von Ribozymen in den Zellen umfassen.
  • Wie von Haseloff et al., US-Patent 5.641.673 , gelehrt wird, können Ribozyme gentechnisch so verändert werden, dass Ribozymexpression als Reaktion auf Faktoren erfolgt, welche die Expression eines Target-Gens induzieren. Ribozyme können auch gentechnisch verändert werden, um eine zusätzliche Regulationsebene bereitzustellen, sodass Zerstörung von mRNA nur eintritt, wenn sowohl ein Ribozym als auch ein Target-Gen in den Zellen induziert werden.
  • Differentiell exprimierte Gene
  • Hierin werden Verfahren zur Identifikation von Genen beschrieben, deren Produkte mit menschlicher Proteinkinase ähnlichem Protein Wechselwirken.
  • Weiters können solche Gene Gene darstellen, die als Reaktion auf Manipulationen, die für den Fortschritt oder die Behandlung solcher Krankheiten relevant sind, differentiell reguliert werden. Darüber hinaus können solche Gene eine zeitlich modulierte Expression aufweisen, die in verschiedenen Stadien der Gewebe- oder Organismusentwicklung erhöht oder reduziert ist. Die Expression eines differentiell exprimierten Gens kann auch unter Kontrollbedingungen im Vergleich zu Versuchsbedingungen moduliert werden. Weiters kann das Gen für menschlicher Proteinkinase ähnliches Protein oder das Genprodukt selbst auf differentielle Expression getestet werden.
  • Der Grad des Expressionsunterschiedes zwischen einem normalen und einem erkrankten Zustand muss nur groß genug sein, dass er mittels herkömmlicher Charakterisierungsverfahren wie beispielsweise differentieller Display-Verfahren sichtbar gemacht werden kann. Andere solche Standard-Charakterisierungsverfahren, durch die Expressionsunterschiede sichtbar gemacht werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf quantitative RT-(reverse-Transkriptase-), PCR- und Northern-Analyse.
  • Identifizierung von differentiell exprimierten Genen
  • Um differentiell exprimierte Gene zu identifizieren, wird Gesamt-RNA oder vorzugswiese mRNA aus Geweben von Interesse isoliert. RNA-Proben werden beispielswiese aus Geweben von Versuchsobjekten und aus entsprechenden Geweben aus Kontrollobjekten entnommen. Jegliches RNA-Isolierungsverfahren, das nicht gegen die Isolierung von mRNA selektiert, kann zur Reinigung solcher RNA-Proben eingesetzt werden. Siehe beispielsweise Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1987–1993. Zahlreiche Gewebeproben können unter Anwendung von Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, beispielsweise mittels des RNA-Einstufen-Isolierungsverfahrens von Chomczynski, US-Patent Nr. 4.843.155 , leicht prozessiert werden.
  • Transkripte innerhalb der erhaltenen RNA-Proben, die von differentiell exprimierten Genen produzierte RNA darstellen, werden mittels Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, identifiziert. Sie umfassen beispielsweise differentielles Screenen (Tedder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 208–212 (1988)), Subtraktionshybridisierung (Hedrick et al., Nature 308, 149–153; Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2825 (1984)) und vorzugsweise differentielles Display (Lang & Pardee, Science 257, 967–971 (1992); US-Patent 5.262.311 ).
  • Informationen aus der differentiellen Expression können selbst auf relevante Verfahren zur Behandlung von Störungen, die das menschlicher Proteinkinase ähnliche Protein einbinden, schließen lassen. Die Behandlung kann beispielsweise eine Modulierung der Expression der differentiell exprimierten Gene und/oder des für das menschlicher Proteinkinase ähnliche Protein kodierenden Gens umfassen. Die Informationen aus der differentiellen Expression können anzeigen, ob die Expression oder Aktivität des differentiell exprimierten Gens oder Genprodukts oder des Gens für menschlicher Proteinkinase ähnliches Proteins oder dessen Genprodukts hochreguliert oder herabreguliert ist.
  • Screening-Verfahren
  • Die Erfindung stellt Tests zum Screenen von Testverbindungen bereit, die sich an ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid oder ein Proteinkinase-ähnliches Polynucleotid binden oder deren Aktivität modulieren. Eine Testverbindung bindet sich vorzugswiese an ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid oder Polynucleotid. Noch bevorzugter reduziert oder erhöht eine Testverbindung die Enzymaktivität im Vergleich zu Werten in Abwesenheit der Testverbindung um zumindest etwa 10 %, vorzugsweise etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100 %.
  • Testverbindungen
  • Testverbindungen können Pharmazeutika sein, die auf dem Gebiet der Erfindung bereits bekannt sind, oder können Verbindungen sein, für die bisher noch nicht bekannt ist, dass sie pharmakologische Aktivität aufweisen. Die Verbindungen können in der Natur vorkommen oder im Labor entworfen werden. Sie können aus Mikroorganismen, Tieren oder Pflanzen isoliert sein und können rekombinant produziert oder mittels chemischer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, synthetisiert werden. Falls gewünscht können Testverbindungen unter Anwendung eines beliebigen der zahlreichen Kombinationsbibliotheksverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf biologische Bibliotheken, räumlich adressierbare parallele Festphasen- oder Lösungsphasen- Bibliotheken, synthetische Bibliotheksverfahren, die Dekonvolution erfordern, das "One-Bead-One-Compound"-Bibliotheksverfahren und synthetische Bibliotheksverfahren unter Verwendung von Affinitätschromatographieselektion, gewonnen werden. Der biologische Bibliotheksansatz ist auf Polypeptidbibliotheken limitiert, während die anderen vier Ansätze für Polypeptid-, Nichtpeptid-Oligomer-Bibliotheken oder Bibliotheken kleiner Moleküle von Verbindungen einsetzbar sind. Siehe Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145 (1997).
  • Verfahren zur Synthese molekularer Bibliotheken sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (siehe beispielsweise DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678 (1994); Cho et al., Science 261, 1303 (1993); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233 (1994)). Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung (siehe z.B. Houghten, BioTechniques 13, 412–421 (1992)) oder auf Perlen (Lam, Nature 354, 82–84 (1991)), Plättchen (Fodor, Nature 364, 555–556 (1993)), Bakterien oder Sporen (Ladner, US-Patent Nr. 5.223.409 ), Plasmiden (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1865–1869 (1992)) oder Phagen (Scott & Smith, Science 249, 386–390 (1990); Devlin, Science 249, 404–406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378–6382 (1990); Felici, J. Mol. Biol. 222, 301–310 (1991); und Ladner, US-Patent Nr. 5.223.409 ) vorhanden sein.
  • Screening mit hohem Durchsatz
  • Testverbindungen können unter Anwendung von Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz auf ihre Fähigkeit gescreent werden, sich an Proteinkinase-ähnliche Polypeptide oder Polynucleotide zu binden oder die Aktivität von Proteinkinase-ähnlichem Protein oder die Expression von Proteinkinase-ähnlichem Gen zu beeinflussen. Unter Einsatz von Screening mit hohem Durchsatz können viele einzelne Verbindungen gleichzeitig getestet werden, sodass zahlreiche Testverbindungen rasch gescreent werden können. Die am häufigsten eingesetzten Verfahren verwenden 96-Well-Mikrotiterplatten. Die Wells der Mikrotiterplatten erfordern typischerweise Test volumina in einem Bereich von 50 bis 500 μl. Zusätzlich zu den Platten sind zahlreiche Instrumente, Materialien, Pipetten, Robotertechniken, Plattenwäscher und Plattenleser im Handel erhältlich, die für das 96-Well-Format geeignet sind.
  • Alternativ dazu können "Tests mit freiem Format" oder Tests, die keine physikalische Barriere zwischen den Proben aufweisen, verwendet werden. Ein Test beispielswiese, der Pigmentzellen (Melanozyten) in einem einfachen homogenen Test für kombinatorische Peptidbibliotheken verwendet, wird von Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19, 1614–1618 (1994), beschrieben. Die Zellen werden in Petrischalen unter Agarose gegeben, dann werden Perlen, die kombinatorische Verbindungen tragen, auf die Oberfläche der Agarose aufgebracht. Die kombinatorischen Verbindungen werden teilweise von der Perlen freigesetzt. Aktive Verbindungen können als dunkle Pigmentflecken sichtbar gemacht werden, da, weil die Verbindungen lokal in die Gelmatrix diffundieren, die aktiven Verbindungen eine Farbänderung der Zellen verursachen.
  • Ein anderes Beispiel für einen Test mit freiem Format wird von Chelsky in "Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches", vorgetragen in der First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Philadelphia, Pa. (7.–10. November 1995), beschrieben. Chelsky platzierte einen einfachen homogenen Enzymtest auf Carbonatdehydrase in einem Agarosegel, sodass das Enzym im Gel über das gesamte Gel hinweg eine Farbänderung verursachen würde. Hiernach wurden Perlen, die kombinatorische Verbindungen über einen Photolinker trugen, im Gel platziert, und die Verbindungen wurden durch UV-Licht teilwiese freigesetzt. Verbindungen, die das Enzym inhibierten, wurden als lokale Inhibitionszonen mit geringerer Farbänderung beobachtet.
  • Wiederum ein anderes Beispiel wird von Salmon et al., Molecular Diversity 2, 57–63 (1996), beschrieben. In diesem Beispiel wurden kombinatorische Bibliotheken auf Verbindungen gescreent, die zytotoxische Wirkung auf Krebszellen zeigten, die in Agar wuchsen.
  • Ein anderes Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz wird von Beutel et al., US-Patent Nr. 5.976.813 , beschrieben. In diesem Verfahren werden Testproben in eine poröse Matrix eingebracht. Eine oder mehrere Testkomponenten werden dann inner-, ober- oder unterhalb einer Matrix, wie z.B. eines Gels, einer Kunststofffolie, eines Filters oder einer anderen Form eines leicht manipulierbaren festen Trägers, platziert. Wenn die Proben in die poröse Matrix eingeführt werden, diffundieren sie ausreichend langsam, sodass die Tests durchgeführt werden können, ohne dass die Testproben zusammenlaufen.
  • Bindungstests
  • Für Bindungstests ist die Testverbindung vorzugsweise ein kleines Molekül, das sich an die aktive Stelle des Proteinkinase-ähnlichen Polypeptids bindet und diese besetzt, sodass normale biologische Aktivität unterbunden wird. Beispiele für solche kleine Moleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf kleine Peptide oder peptidartige Moleküle.
  • In Bindungstests kann entweder die Testverbindung oder das Proteinkinase-ähnliche Polypeptid eine nachweisbare Markierung, wie z.B. eine Fluoreszenz-, Radioisotopen-, Chemilumineszenz- oder Enzymmarkierung, wie z.B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase oder Luciferase, umfassen. Die Detektion einer Testverbindung, die an das Proteinkinase-ähnliche Polypeptid gebunden ist, kann dann beispielsweise durch direktes Zählen von Radioemission, durch Szintillationszählung oder durch Bestimmen des Umsatzes eines geeigneten Substrats zu einem detektierbaren Produkt erfolgen.
  • Alternativ dazu kann Bindung einer Testverbindung an ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid ohne Markierung eines der Wechselwirkungspartner bestimmt werden. Beispielsweise kann ein Mikrophysiometer verwendet werden, um Bindung einer Testverbindung mit einem Proteinkinase-ähnlichen Polypeptid nachzuweisen. Ein Mikrophysiometer (z.B. CytosensorTM) ist ein Analyseninstrument, das unter Verwendung eines lichtempfindlichen potentiometrischen Sensors (LAPS) die Geschwindig keit misst, mit der eine Zelle ihre Umgebung ansäuert. Änderungen dieser Ansäuerungsrate können als Indikator der Wechselwirkung zwischen einer Testverbindung und einem Proteinkinase-ähnlichen Polypeptid dienen (McConnell et al., Science 257, 1906–1912 (1992)).
  • Die Bestimmung der Fähigkeit einer Testverbindung, sich an ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid zu binden, kann auch unter Einsatz einer Technik wie beispielsweise Echtzeit-"Bimolecular-Interaction-Analysis" (BIA) (Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338–2345 (1991), und Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699–705 (1995)) erfolgen. BIA ist eine Technik zur Untersuchung biospezifischer Wechselwirkungen in Echtzeit ohne Markierung der Wechselwirkungspartner (z.B. BIAcoreTM) Änderungen des optischen Phänomens der Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR) können als Hinweis auf Echtzeitreaktionen zwischen biologischen Molekülen verwendet werden.
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung kann ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid als "Köderprotein" in einem Zwei-Hybrid-Test oder Drei-Hybrid-Test verwendet werden (siehe z.B. das US-Patent Nr. 5.283.317 ; Zervos et al., Cell 72, 223–232 (1993); Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 12046–12054 (1993); Bartel et al., BioTechniques 14, 920–924 (1993); Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693–1696 (1993); und Brent WO 94/10300 ), um andere Proteine zu identifizieren, die sich an das Proteinkinaseähnliche Polypeptid binden oder damit Wechselwirken und seine Aktivität modulieren.
  • Das Zwei-Hybrid-System basiert auf der modularen Natur der meisten Transkriptionsfaktoren, die aus trennbaren DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdomänen bestehen. Kurz zusammengefasst verwendet der Test zwei verschiedene DNA-Konstrukte. In einem Konstrukt beispielsweise kann das für ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid kodierende Polynucleotid an ein für die DNA-Bindungsdomäne eines bekannten Transkriptionsfaktors (z.B. GAL-4) kodierendes Polynucleotid fusioniert werden. Im anderen Konstrukt kann eine DNA-Sequenz, die für ein nichtidentifiziertes Protein ("Beute" oder "Probe") kodiert, an ein Polynucleotid, das für die Aktivierungsdomäne des bekannten Transkriptionsfaktors kodiert, fusioniert werden. Sind die "Köder"- und die "Beute"-Proteine in der Lage, in vivo wechselzuwirken, um einen Protein-abhängigen Komplex zu bilden, so werden die DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdomänen des Transkriptionsfaktors in große Nähe gebracht. Diese Nähe ermöglicht die Transkription eines Reportergens (z.B. LacZ), das operabel an eine Transkriptionsregulationsstelle gebunden ist, die auf den Transkriptionsfaktor reagiert. Expression des Reportergens kann nachgewiesen werden, und Zellkolonien, die den funktionellen Transkriptionsfaktor enthalten, können isoliert und verwendet werden, um die DNA-Sequenz zu erhalten, die für das Protein kodiert, das mit dem Proteinkinase-ähnlichen Polypeptid wechselwirkt.
  • Es kann wünschenswert sein, entweder das Proteinkinase-ähnliche Polypeptid (oder Polynucleotid) oder die Testverbindung zu immobilisieren, um die Trennung von gebundenen und ungebundenen Formen eines oder beider der Wechselwirkungspartner zu erleichtern sowie um eine Automatisierung des Tests zu vereinfachen. Somit kann entweder das Proteinkinase-ähnliche Polypeptid (oder Polynucleotid) oder die Testverbindung an einen festen Träger gebunden werden. Geeignete feste Träger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Glas- oder Kunststoffobjektträger, Gewebekulturplatten, Mikrotiterwells, Röhrchen, Siliciumplättchen oder Teilchen wie Perlen (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Latex-, Polystyrol- oder Glasperlen). Jegliches Verfahren, das auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, kann eingesetzt werden, um das Polypeptid (oder Polynucleotid) oder die Testverbindung an einen festen Träger zu binden, einschließlich der Verwendung von kovalenter und nichtkovalenter Bindung, passiver Absorption oder Paaren von Bindungsgruppierungen, die jeweils an das Polypeptid (oder Polynucleotid) oder die Testverbindung und an den festen Träger gebunden werden. Testverbindungen werden vorzugsweise in einer solchen Anordnung an den festen Träger gebunden, dass die Position einzelner Testverbindungen nachvollzogen werden kann. Die Bindung einer Testverbindung an ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid (oder Polynucleotid) kann in einem Behältnis erfolgen, das für die Aufnahme der Reaktionspartner geeignet ist. Beispiele für solche Behältnisse umfassen Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Mikrozentrifugenröhrchen.
  • In einer Ausführungsform ist das Proteinkinase-ähnliche Polypeptid ein Fusionsprotein, das eine Domäne umfasst, die es dem Proteinkinase-ähnlichen Polypeptid ermöglicht, an einen festen Träger gebunden zu werden. Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteine beispielsweise können an Glutathion-Sepharose-Perlen (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) oder an mit Glutathion derivatisierte Mikrotiterplatten adsorbiert werden, die dann mit der Testverbindung oder der Testverbindung und dem nichtadsorbierten Proteinkinase-ähnlichen Polypeptid kombiniert werden; das Gemisch wird dann unter Bedingungen inkubiert, die zu Komplexbildung führen (z.B. bei physiologischen Bedingungen bezüglich Salz und pH). Nach der Inkubation werden die Perlen oder Mikrotiterplatten-Wells gewaschen, um jegliche ungebundene Komponenten zu entfernen. Die Bindung der Wechselwirkungspartner kann entweder direkt oder indirekt bestimmt werden, wie zuvor beschrieben. Alternativ dazu können die Komplexe vom festen Träger dissoziiert werden, bevor die Bindung bestimmt wird.
  • Andere Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen oder Polynucleotiden an einem festen Träger können auch in den Screening-Tests der Erfindung verwendet werden. Entweder ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid (oder Polynucleotid) oder eine Testverbindung kann beispielsweise unter Verwendung einer Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Biotinylierte Proteinkinase-ähnliche Polypeptide (oder Polynucleotide) oder Testverbindungen können aus Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid) unter Einsatz von Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind (z.B. Biotinylierungsset, Pierce Chemicals, Rockford, III.) hergestellt und in den Wells von Streptavidin-beschichteten 96-Well-Platten (Pierce Chemical) immobilisiert werden. Alternativ dazu können Antikörper, die sich spezifisch an ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid, Polynucleotid oder eine Testverbindung binden, die jedoch eine gewünschte Bindungsstelle, wie z.B. die aktive Stelle des Proteinkinaseähnlichen Polypeptids, nicht stören, an die Wells der Platte derivatisiert werden. Ungebundenes Target oder Protein kann in den Wells durch Antikörper-Konjugation eingefangen werden.
  • Verfahren zur Detektion solcher Komplexe, zusätzlich zu jenen, die zuvor für die GST-immobilisierten Komplexe beschrieben wurden, umfassen Immundetektion von Komplexen unter Verwendung von Antikörpern, die sich spezifisch an das Proteinkinase-ähnliche Polypeptid oder die Testverbindung binden, enzymgekoppelte Tests, die auf der Detektion einer Aktivität des Proteinkinase-ähnlichen Polypeptids basieren, und SDS-Gelelektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen.
  • Screening auf Testverbindungen, die sich an ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid oder Polynucleotid binden, kann auch in einer intakten Zelle durchgeführt werden. Jegliche Zelle, die ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid oder Polynucleotid umfasst, kann in einem zellbasierten Testsystem verwendet werden. Ein Proteinkinaseähnliches Polynucleotid kann natürlich in der Zelle vorkommen oder kann unter Anwendung von Verfahren wie jenen, die zuvor beschrieben wurden, eingeführt werden. Die Bindung der Testverbindung an ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid oder Polynucleotid wird wie zuvor beschrieben bestimmt.
  • Enzymtests
  • Testverbindungen können auf die Fähigkeit, die Proteinkinaseaktivität eines menschlicher Proteinkinase ähnlichen Polypeptids zu erhöhen oder zu reduzieren, getestet werden. Proteinkinaseaktivität kann beispielsweise wie im US-Patent 6.194.186 beschrieben gemessen werden.
  • Enzymtests können nach dem Kontaktieren entweder eines gereinigten Proteinkinase-ähnlichen Polypeptids, eines Zellmembranpräparats oder einer intakten Zelle mit einer Testverbindung durchgeführt werden. Eine Testverbindung, die eine Proteinkinaseaktivität eines Proteinkinase-ähnlichen Polypeptids um zumindest etwa 10 %, vorzugsweise etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100 %, reduziert, wird als potenzielles therapeutisches Mittel zur Reduktion der Aktivität von Proteinkinaseähnlichem Protein identifiziert. Eine Testverbindung, die Proteinkinaseaktivität eines menschlicher Proteinkinase ähnlichen Polypeptids um zumindest etwa 10 %, vorzugsweise 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100 %, erhöht, wird als potenzielles therapeutisches Mittel zur Steigerung der Aktivität von menschlicher Proteinkinase ähnlichem Protein identifiziert.
  • Genexpression
  • Testverbindungen, die Proteinkinase-ähnliche Genexpression steigern oder senken, werden identifiziert. Ein Proteinkinase-ähnliches Polynucleotid wird mit einer Testverbindung kontaktiert, und die Expression eines RNA- oder Polypeptidprodukts des Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotids wird bestimmt. Das Expressionsniveau von geeigneter mRNA oder geeignetem Polypeptid in Gegenwart der Testverbindung wird mit dem Expressionsniveau von mRNA oder Polypeptid in Abwesenheit der Testverbindung verglichen. Die Testverbindung kann dann basierend auf diesem Vergleich als Expressionsmodulator identifiziert werden. Ist beispielsweise die Expression von mRNA oder Polypeptid in Gegenwart der Testverbindung höher als in Abwesenheit derselben, so wird die Testverbindung als Stimulator oder Enhancer der mRNA- oder Polypeptidexpression identifiziert. Fällt dahingegen Expression der mRNA oder des Polypeptids in Gegenwart der Testverbindung geringer aus als in ihrer Abwesenheit, so wird die Testverbindung als Inhibitor der mRNA- oder Polypeptidexpression identifiziert.
  • Das Expressionsniveau von Proteinkinase-ähnlicher mRNA oder von Proteinkinaseähnlichem Polypeptid in den Zellen kann durch Verfahren, die auf dem Gebiet der Detektion von mRNA oder Polypeptid durchwegs bekannt sind, bestimmt werden. Es können entweder qualitative oder quantitative Verfahren eingesetzt werden. Die Gegenwart von Polypeptidprodukten eines Proteinkinase-ähnlichen Polynucleotids kann beispielsweise unter Anwendung zahlreicher verschiedener Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, bestimmt werden, einschließlich immunchemischer Verfahren wie Radioimmuntest, Western-Blotting und Immunhistochemie. Alternativ dazu kann Polypeptidsynthese in vivo, in einer Zellkultur oder in einem Invitro-Translationssystem durch Detektion des Einbaus markierter Aminosäuren in ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid bestimmt werden.
  • Solche Screening-Verfahren können entweder in einem zellfreien Testsystem oder in einer intakten Zelle durchgeführt werden. Jegliche Zelle, die ein Proteinkinase-ähnliches Polynucleotid exprimiert, kann in einem zellbasierten Testsystem verwendet werden. Das Proteinkinase-ähnliche Polynucleotid kann natürlich in der Zelle vorkommen oder kann unter Anwendung beispielsweise eines der oben beschriebenen Verfahren eingeführt werden. Entweder eine primäre Kultur oder eine etablierte Zelllinie, wie z.B. CHO- oder menschliche embryonale Nieren-293-Zellen, können verwendet werden.
  • Therapeutische Indikationen und Verfahren
  • Menschlicher Proteinkinase ähnliches Protein kann reguliert werden, um Diabetes zu behandeln.
  • Diabetes
  • Diabetes mellitus ist eine häufige Stoffwechselstörung, die durch eine anomale Erhöhung des Blutzuckers, Lipidveränderungen und Anomalien (Komplikationen) im Herz-Kreislauf-System, in den Augen, in der Niere und im Nervensystem charakterisiert ist. Diabetes wird in zwei separate Krankheiten unterteilt: Typ-1-Diabetes (Ausbruch im Kindes- oder Jugendalter), der aus dem Verschwinden von Zellen resultiert, die Insulin produzieren und sekretieren, und Typ-2-Diabetes (Ausbruch im Erwachsenenalter), der durch eine Störung in der Insulinsekretion und eine Störung in der Insulinwirkung ausgelöst wird.
  • Typ-1-Diabetes wird durch eine Autoimmunreaktion ausgelöst, welche die Insulin sekretierenden Zellen (Betazellen) in den Langerhansschen Inseln angreifen. Mittel, die verhindern, dass diese Reaktion auftritt, oder die Reaktion stoppen, bevor die Betazellen vollständig zerstört sind, stellen potenzielle Therapien für diese Erkrankung dar. Andere Mittel, die eine Betazellen-Proliferation und -Regeneration bewirken, sind ebenfalls potenzielle Therapien.
  • Typ-II-Diabetes ist das häufigere der beiden Diabetes-Leiden (6 % der Bevölkerung). Die Störung in der Insulinsekretion ist eine wichtige Ursache des Diabetes-Leidens und resultiert aus der Unfähigkeit der Betazellen, Erhöhungen des Blutzuckerwerts richtig zu detektieren und mit Insulinfreisetzung darauf zu reagieren. Therapien, welche die Antwort der Betazellen auf Glucose steigern, würden eine bedeutende neue Behandlungsmöglichkeit für diese Krankheit darstellen.
  • Die Störung der Insulinwirkung bei Personen mit Typ-II-Diabetes ist ein weiteres Ziel therapeutischer Eingriffe. Mittel, welche die Aktivität des Insulinrezeptors in Muskeln, in der Leber und im Fett steigern, führen zu einer Senkung des Blutzuckerwerts und einer Normalisierung der Plasmalipide. Die Rezeptoraktivität kann durch Mittel erhöht werden, die den Rezeptor direkt stimulieren oder die intrazelluläre Signale vom Rezeptor steigern. Andere Therapien können den zellulären Endprozess, d.h. Glucosetransport oder verschiedene Enzymsysteme, direkt aktivieren, um eine insulinähnliche Wirkung zu erzeugen und so ein vorteilhaftes Ergebnis zu erzielen. Da übergewichtige Individuen höhere Anfälligkeit für Typ-II-Diabetes aufweisen, stellt jedes Mittel, welches das Körpergewicht reduziert, eine mögliche Therapie dar.
  • Sowohl Typ-I- als auch Typ-II-Diabetes können mit Mitteln behandelt werden, die Insulinwirkung nachahmen oder diabetische Komplikationen durch Senkung der Blutzuckerwerte behandeln. Gleichermaßen können Mittel, welche die Bildung neuer Blutgefäße verringern, zur Behandlung der Augenkomplikationen eingesetzt werden, die bei beiden Krankheiten auftreten.
  • BEISPIEL 1
  • Detektion der Aktivität von Proteinkinase-ähnlichem Protein
  • Das Polynucleotid von Seq.-ID Nr. 1 wird in den Expressionsvektor pCEV4 insertiert, und das erhaltene Expressionsvektor-pCEV4-Proteinkinase-ähnliches-Protein-Polypeptid wird in menschliche embryonale Nieren-293-Zellen transfiziert. Aus diesen Zellen werden Extrakte gewonnen, und die Aktivität des Proteinkinase-ähnlichen Proteins wird durch Messung der Aufnahme von 32P in Kälberthymus-H1-Histon aus [γ-32P]ATP bestimmt. Zellextrakte werden in einem Reaktionsgemisch inkubiert, das 20 mM Tris-HCl mit pH 7,5, 10 mM MgC12, 20 μM ATP, 15–50 kBq [γ-32P]ATP und 00 μg/ml H1-Histon enthält. Die Inkubation wird 5 min lang bei 30 °C durchgeführt, und die phosphorylierten Proteine werden durch SDS/PAGE aufgetrennt und sichtbar gemacht, und durch Messung der Intensität von photostimulierter Luminenszenz (PSL) unter Einsatz eines Bio-Imaging-Analyzers quantifiziert. Es zeigt sich, dass das Polypeptid von Seq.-ID Nr. 2 Proteinkinase-ähnliche Proteinaktivität aufweist.
  • BEISPIEL 2
  • Expression von rekombinantem, menschlicher Proteinkinase ähnlichem Protein
  • Der Pichia-pastoris-Expressionsvektor pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) wird verwendet, um große Mengen an rekombinanten, menschlicher Proteinkinase ähnlichen Polypeptiden in Hefe zu produzieren. Die für Proteinkinase-ähnliches Protein kodierende DNA-Sequenz ist von Seq.-ID Nr. 1, 8 und 10 abgeleitet. Vor der Insertion in den Vektor pPICZB wird die DNA-Sequenz mittels bekannter Verfahren auf solche Wiese modifiziert, dass sie an ihrem 5'-Ende ein Startcodon und an ihrem 3'-Ende eine Enterokinase-Spaltungsstelle, eine His6-Reportermarkierung und ein Stoppcodon aufweist. Weiters werden an beiden Termini Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen hinzugefügt, und nach Verdau der Mehrfach-Klonierungsstelle von pPICZB mit den entsprechenden Restriktionsenzymen wird die modifizierte DNA-Sequenz in pPICZB ligiert. Dieser Expressionsvektor ist für induzierbare Expression in Pichia pastoris, gesteuert durch einen Hefe-Promotor, konzipiert. Der resultierende pPICZ/md-His6-Vektor wird verwendet, um die Hefe zu transformieren.
  • Die Hefe wird unter üblichen Bedingungen in 5-I-Schüttelkolben kultiviert, und das rekombinant produzierte Protein wird durch Affinitätschromatographie (Ni-NTA-Harz) in Gegenwart von 8 M Harnstoff aus der Kultur isoliert. Das gebundene Polypeptid wird mit Puffer, pH 3,5, eluiert und neutralisiert. Trennung des Polypeptids von der His6-Reportermarkierung erfolgt durch ortsgerichtete Proteolyse unter Verwendung von nterokinase (Invitrogen, San Diego, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Gereinigtes, menschlicher Proteinkinase ähnliches Polypeptid wird erhalten.
  • BEISPIEL 3
  • Identifizierung von sich an Proteinkinase-ähnliche Polypeptide bindenden Testverbindungen
  • Gereinigte Proteinkinase-ähnliche Polypeptide, die ein Glutathion-S-Transferase-Protein umfassen und an Glutathion-derivatisierten Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten absorbiert wurden, werden mit Testverbindungen aus einer Bibliothek kleiner Moleküle bei einem pH von 7,0 in einer physiologischen Pufferlösung kontaktiert. Menschlicher Proteinkinase ähnliche Polypeptide umfassen die in Seq.-ID Nr. 2 und 9 gezeigte Aminosäuresequenz. Die Testverbindungen umfassen eine Fluoreszenzmarkierung. Die Proben werden 5 min bis 1 h lang inkubiert. Kontrollproben werden in Abwesenheit einer Testverbindung inkubiert.
  • Die die Testverbindungen enthaltende Pufferlösung wird aus den Wells gewaschen. Bindung einer Testverbindung an ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid wird durch Fluoreszenzmessungen des Inhalts der Wells detektiert. Eine Testverbindung, die die Fluoreszenz in einem Well im Vergleich zur Fluoreszenz eines Wells, in dem keine Testverbindung inkubiert wurde, um zumindest 15 % erhöht, wird als Verbindung identifiziert, die sich an ein Proteinkinase-ähnliches Polypeptid bindet.
  • BEISPIEL 4
  • Identifizierung einer die Expression von Proteinkinase-ähnlichem Gen reduzierenden Testverbindung
  • Eine Testverbindung wird zu einer Kultur von menschlichen Zellen, die mit einem Expressionskonstrukt für Proteinkinase-ähnliches Protein transfiziert wurden, zugesetzt und bei 37 °C 10 bis 45 min lang inkubiert. Eine Kultur desselben Zelltyps, die über dieselbe Zeitspanne hinweg ohne die Testverbindung inkubiert wurde, liefert eine negative Kontrolle.
  • RNA wird aus den zwei Kulturen wie von Chirgwin et al., Biochem. 18, 5294–5299 (1979), beschrieben isoliert. Northern-Blots werden unter Verwendung von 20 bis 30 μg Gesamt-RNA hergestellt und mit einer 32P-markierten, für Proteinkinase-ähnliches Protein spezifischen Sonde bei 65 °C in Express-hyb (CLONTECH) hybridisiert. Die Sonde umfasst zumindest 11 zusammenhängende Nucleotide, ausgewählt aus dem Komplement von Seq.-ID Nr. 1, 8 und 10. Eine Testverbindung, die das für Proteinkinase-ähnliches Protein spezifische Signal im Vergleich zum Signal, das in Abwesenheit der Testverbindung erhalten wird, verringert, wird als Inhibitor der Expression von Proteinkinase-ähnlichem Gen identifiziert.
  • BEISPIEL 5
  • Identifizierung einer die Aktivität von Proteinkinase-ähnlichem Protein reduzierenden Testverbindung
  • Eine Testverbindung wird zu einer Kultur von menschlichen Zellen, die mit einem Expressionskonstrukt für Proteinkinase-ähnliches Protein transfiziert wurden, zugesetzt und bei 37 °C 10 bis 45 min lang inkubiert. Eine Kultur desselben Zelltyps, die über dieselbe Zeitspanne hinweg ohne die Testverbindung inkubiert wurde, liefert eine negative Kontrolle. Die Aktivität des Proteinkinase-ähnlichen Proteins wird gemäß dem Verfahren aus US-Patent 6.194.186 gemessen.
  • Eine Testverbindung, welche die Proteinkinase-ähnliche Proteinaktivität des Proteinkinase-ähnlichen Proteins im Vergleich zur Proteinkinase-ähnlichen Proteinaktivität in Abwesenheit der Testverbindung verringert, wird als Inhibitor der Aktivität von Proteinkinase-ähnlichem Protein identifiziert.
  • BEISPIEL 6
  • Gewebespezifische Expression von Proteinkinase-ähnlichem Protein
  • Das qualitative Expressionsmuster von Proteinkinase-ähnlichem Protein in verschiedenen Geweben wird anhand von Reverstranskriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) bestimmt.
  • Um zu zeigen, dass Proteinkinase-ähnliches Protein bei Krebs involviert ist, wird die Expression in folgenden Geweben bestimmt: Nebenniere, Knochenmark, Hirn, Kleinhirn, Kolon, fötales Hirn, fötale Leber, Herz, Niere, Leber, Lunge, Brustdrüse, Bauchspeicheldrüse, Plazenta, Prostata, Speicheldrüse, Skelettmuskel, Dünndarm, Rückenmark, Milz, Magen, Hoden, Thymus, Schilddrüse, Luftröhre, Uterus und Peripherblut-Lymphozyten. Expression in den folgenden Krebszelllinien wird ebenfalls bestimmt: DU-145 (Prostata), NCl-H125 (Lunge), HT-29 (Kolon), COLO-205 (Kolon), A-549 (Lunge), NCl-H460 (Lunge), HT-116 (Kolon), DLD-1 (Kolon), MDA-MD-231 (Brust), LS174T (Kolon), ZF-75 (Brust), MDA-MN-435 (Brust), HT-1080, MCF-7 (Brust) und U87. Übereingestimmte Paare von malignem und normalem Gewebe von demselben Patienten werden ebenfalls getestet.
  • Um zu zeigen, dass Proteinkinase-ähnliches Protein bei ZNS-Störungen involviert ist, werden folgende Gewebe gescreent: fötales und erwachsenes Hirn, Muskel, Herz, Lunge, Niere, Leber, Thymus, Hoden, Kolon, Plazenta, Luftröhre, Bauchspeicheldrüse, Niere, Magenschleimhaut, Kolon, Leber, Kleinhirn, Haut, Cortex (Alzheimer und normal), Hypothalamus, Cortex, Mandel, Kleinhirn, Hippokampus, Chorioidea, Plexus, Thalamus und Rückenmark.
  • Um zu zeigen, dass Proteinkinase-ähnliches Protein im Krankheitsverlauf von COPD involviert ist, besteht das anfängliche Expressionspanel aus RNA-Proben von Gewebe der Atmungsorgane und Entzündungszellen, die für COPD relevant sind: Lunge (erwachsen und fatal), Luftröhre, frisch isolierte Typ-II-Pneumozyten, kultivierte menschliche Bronchialepithelzellen, kultivierte Epithelzellen der kleinen Atemwege, kultivierte Bronchial-Glattmuskelzellen, kultivierte H441-Zellen (Clara-artig), frisch isolierte Neutrophilen und Monozyten und kultivierte Monozyten (Makrophagen-artig). Eine Bodymap-Profilerstellung wird ebenfalls durchgeführt, wobei Gesamt-RNA-Panels von Clontech eingesetzt werden. Die Gewebe sind Nebenniere, Knochenmark, Hirn, Kolon, Herz, Niere, Leber, Lunge, Brustdrüse, Bauchspeicheldrüse, Prostata, Speicheldrüse, Skelettmuskel, Dünndarm, Milz, Magen, Hoden, Thymus, Luftröhre, Schilddrüse und Uterus.
  • Um zu zeigen, dass Proteinkinase-ähnliches Protein im Krankheitsverlauf von Obesität involviert ist, wird die Expression in folgenden Geweben bestimmt: subkutanes Fettgewebe, Mesenterialfettgewebe, Nebenniere, Knochenmark, Hirn (Kleinhirn, Rückenmark, Großhirnrinde, Nucleus caudatus, Mark, Substantia nigra und Putamen), Kolon, fötales Hirn, Herz, Niere, Leber, Lunge, Brustdrüse, Bauchspeicheldrüse, Plazenta, Prostata, Speicheldrüse, Skelettmuskel, Dünndarm, Milz, Magen, Hoden, Thymus, Schilddrüse, Luftröhre und Uterus. Die Neuroblastom-Zelllinien SK-Nm-Be (2), Hr, Sk-N-As, HTB-10, IMR-32, SNSY-SY, T3, SK-N-D2, D283, DAOY, CHP-2, U87MG, BE (2) C, T986, KANTS, M059K, CHP234, C6 (rat), SK-N-F1, SK-PU-DW, PFSK1, BE (2)M17 und MCIXC werden ebenfalls auf die Expression von Proteinkinase-ähnlichem Protein getestet. Als letzten Schritt wird die Expression von Proteinkinase-ähnlichem Protein in Zellen, die von normalen Individuen stammen, mit der Expression von Zellen verglichen, die von adipösen Individuen stammt.
  • Um zu zeigen, dass Proteinkinase-ähnliches Protein im Krankheitsverlauf von Diabetes involviert ist, wird das folgende Ganzkörperpanel gescreent, um vorherrschende oder relativ hohe Expression aufzuzeigen: subkutanes und Mesenterial-Fettgewebe, Nebenniere, Knochenmark, Hirn, Kolon, fötales Hirn, Herz, Hypothalamus, Niere, Leber, Lunge, Brustdrüse, Bauchspeicheldrüse, Plazenta, Prostata, Speicheldrüse, Skelettmuskel, Dünndarm, Milz, Magen, Hoden, Thymus, Schilddrüse, Luftröhre und Gebärmuter. Menschliche Inselzellen und eine Inselzellen-Bibliothek werden ebenfalls getestet. Als letzter Schritt wird die Expression von Proteinkinase-ähnlichem Protein in Zellen von normalen Individuen mit der Expression von Zellen, die von Individuen mit Diabetes stammen, verglichen.
  • Quantitatives Expressions-Profiling. Quantitatives Expressions-Profiling wird durch die Art quantitativer PCR-Analyse, die sich "kinetische Analyse" nennt, durchgeführt, die als erstes von Higuchi et al., Bio Technology 10, 413-17 (1992) und Higuchi et al., Bio Technology 11, 1026-30 (1993) beschrieben wurde. Das Prinzip ist, dass in jedem beliebigen Zyklus innerhalb der exponentiellen Phase von PCR die Menge des Produkts proportional zur anfänglichen Anzahl der Matrizenkopien ist.
  • Sofern die Amplifikation in Gegenwart eines intern gequenchten fluoreszierenden Oligonucleotids (TaqMan-Sonde), das komplementär zur Zielsequenz ist, durchgeführt wird, wird die Sonde durch 5'-3'-Endonucleaseaktivität von Taq-DNA-Polymerase gespalten und ein fluoreszierender Farbstoff in das Medium freigesetzt (Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7276-80 (1991)). Da die Fluoreszenzemission in direktem Verhältnis zur Menge des spezifischen amplifizierten Produkts steigt, kann die exponentielle Wachstumsphase des PCR-Produkts nachgewiesen und verwendet werden, um die anfängliche Matrizenkonzentration zu bestimmen (Neid et al., Genome Res. 6, 986-94 (1996) und Gibson et al., Genome Res. 6, 995–1001 (1996)).
  • Amplifikation einer endogenen Kontrolle kann durchgeführt werden, um die Menge von Proben-RNA, die einem Reaktionsgemisch zugesetzt wird, zu standardisieren. Bei dieser Art von Experimenten ist die ausgewählte Kontrolle die 18S-Ribosom-DNA. Da Reporter-Farbstoffe mit verschiedenen Emissionsspektren erhältlich sind, können das Target und die endogene Kontrolle unabhängig voneinander im selben Röhrchen quantifiziert werden, sofern Sonden verwendet werden, die mit verschiedenen Farbstoffen markiert sind.
  • Alle "Echtzeit-PCR"-Messungen von Fluoreszenz werden im ABI Prism 7700 durchgeführt.
  • RNA-Extraktion und cDNA-Präparierung. Gesamt-RNA aus den oben aufgelisteten Geweben wird zur Expressionsquantifizierung verwendet. RNA, die mit „von einer Autopsie" gekennzeichnet ist, wurde mit dem TRIzol-Reagens (Life Technologies, MD) gemäß der Vorschrift des Herstellers aus Autopsiegeweben extrahiert.
  • 50 μg jeder RNA wurden 1 Stunde lang bei 37 o C im folgenden Reaktionsgemisch mit DNase I behandelt: 0,2 U/μl RNase-freie DNase I (Roche Diagnostics, Deutschland); 0,4 U/μl RNase-Inhibitor (PE Applied Biosystems, CA); 10 mM Tris-HCl pH 7,9; 10 mM MgC12; 50 mM NaCl; und 1 mM DTT.
  • Nach der Inkubation wird RNA einmal mit 1 Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (24:24:1) und einmal mit Chloroform extrahiert und dann mit 1/10 Volumen 3 M NaAcetat, pH 5,2 und 2 Volumina Ethanol gefällt.
  • 50 μg jeder RNA aus den Autopsiegeweben werden mithilfe des DNA-freien Sets von Ambion (Ambion, TX) DNase-behandelt. Nach einer Resuspension und spektralphotometrischen Quantifizierung wird jede Probe mit den TaqMan Reverse Transcription Reagens (PE Applied Biosystems, CA) gemäß der Vorschrift des Herstellers revers transkribiert. Die Endkonzentration von RNA im Reaktionsgemisch beträgt 200 ng/μl. Die reverse Transkription wird mit 2,5 μM Zufallshexamerprimern durchgeführt.
  • Quantitative TaqMan-Analyse. Spezifische Primer und Sonden werden gemäß den Empfehlungen von PE Applied Biosystems entworfen; die Sonde kann am 5'-Ende mit FAM (6-Carboxyfluorescein) und am 3'-Ende mit TAMRA (6-Carboxytetramethylrhodamin) markiert sein. Quantifizierungsversuche werden auf 10 ng revers transkribierter RNA von jeder Probe durchgeführt. Jede Bestimmung erfolgt dreifach.
  • Der Gesamt-cDNA-Gehalt wird mit der gleichzeitigen Quantifizierung (Multiplex-PCR) der 18S-ribosomalen RNA unter Verwendung des Pre-Developed TaqMan Assay Reagents (PDAE) Control Kit (PE Applied Biosystems, CA) normalisiert.
  • Das Testreaktionsgemisch ist wie folgt zusammengesetzt: 1 x endgültiges TaqMan Universal PCR Master Mix (aus 2x Ausgangslösung) (PE Applied Biosystems, CA); 1x PDAR-Kontrolle – 18S-RNA (aus 20x Ausgangslösung); 300 nM Vorwärts-Primer; 900 nM Rückwärts-Primer; 200 nM Sonde; 10 ng cDNA; und Wasser auf 25 μl.
  • Jeder der folgenden Schritte wird einmal durchgeführt: Prä-PCR, 2 min lang bei 50 °C, und 10 min lang bei 95 °C. Die folgenden Schritte werden 40-mal durchgeführt: Denaturierung, 15 s bei 95 °C, Anellierung/Extension, 1 min bei 60 °C.
  • Der Versuch erfolgt auf einem ABI Prism 7700 Sequence Detector (PE Applied Biosystems, CA). Am Ende jedes Durchgangs werden die während der PCR gewonnenen Daten wie im Handbuch zum ABI Prism 7700 beschrieben verarbeitet, um eine bessere Hintergrundsubtraktion sowie Signallinearität mit der Ausgangstargetmenge zu erreichen.
  • BEISPIEL 7
  • Proliferationsinhibitions-Test: Antisense-Oligonucleotide unterdrücken das Wachstum von Krebszelllinien
  • Die für die Tests verwendete Zelllinie ist die menschliche Kolonkrebszelllinie HCT116. Zellen werden in RPMI-1640 mit 10–15 % fötalem Kälberserum in einer Konzentration von 10.000 Zellen pro ml in einem Volumen von 0,5 ml kultiviert und bei 37 °C in einer Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % CO2 gehalten.
  • Thiophosphat-Oligoribonucleotide werden an einem DNA-Syntheseautomaten von Applied Biosystems, Modell 380B unter Einsatz von Phosphoramidit-Chemie synthetisiert. Eine Sequenz von 24 Basen, die komplementär zu den Nucleotiden an Position 1 bis 24 aus Seq.-ID Nr. 1, 8 und 10 sind, wird als Test-Oligonucleotid verwendet. Als Kontrolle wird eine andere (randomisierte) Sequenz verwendet: 5'-TCA ACT GAC TAG ATG TAC ATG GAC-3'. Nach Assemblierung und Entschützung werden Oligonucleotide zweimal Ethanol-gefällt, getrocknet und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in den gewünschten Konzentrationen suspendiert. Die Reinheit der Oligonucleotide wird durch Kapillar-Gelelektrophorese und Ionenaustausch-HPLC getestet. Die gereinigten Oligonucleotide werden zum Kulturmedium in einer Konzentration von 10 μM einmal pro Tag sieben Tage lang zugesetzt.
  • Der Zusatz des Test-Oligonucleotids über sieben Tage hinweg führt zu signifikant verringerter Expression von menschlicher Proteinkinase ähnlichem Protein, wie durch Western-Blotting bestimmt wird. Diese Wirkung wird mit dem Kontroll-Oligonucleotid nicht beobachtet. Nach 3 bis 7 Tagen wird die Anzahl an Zellen in den Kulturen unter Verwendung eines automatischen Zellzählers gezählt. Die Anzahl an Zellen in Kulturen, die mit dem Test-Oligonucleotid behandelt wurden (als 100 % ausgedrückt), wird mit der Anzahl an Zellen in Kulturen verglichen, die mit dem Kontroll-Oligonucleotid behandelt wurden. Die Anzahl an Zellen in Kulturen, die mit dem Test-Oligonucleotid behandelt wurden, beträgt nicht mehr als 30 % der Kontrolle, was zeigt, dass die Inhibition von menschlicher Proteinkinase ähnlichem Protein eine antiproliferative Wirkung auf Krebszellen hat.
  • BEISPIEL 8
  • In-vivo-Testen von Verbindungen/Target-Validierung
  • 1. Akute mechanistische Tests
  • 1.1. Verringerung der Konzentrationen von mitogenem Plasmahormon
  • Dieser Nicht-Tumor-Test misst die Fähigkeit einer Verbindung, entweder die endogene Konzentration eines im Blutkreislauf zirkulierenden Hormons oder die Konzentration von Hormon, das als Reaktion auf einen biologischen Stimulus produziert wird, zu verringern. Nagetieren wird Testverbindung (p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k.) verabreicht. Nach einer bestimmten Zeit nach der Verabreichung der Testverbindung wird Blutplasma abgenommen. Das Plasma wird auf Konzentrationen des Hormons von Interesse getestet. Sind die normalen Konzentrationen des Hormons im Blutkreislauf zu gering und/oder zu unterschiedlich, um zuverlässige Resultate zu liefern, so kann die Konzentration des Hormons durch eine Vorbehandlung mit einem biologischen Stimulus erhöht werden (d.h. LHRH kann Mäusen i.m. in einer Dosierung von 30 ng/Maus injiziert werden, um einen Burst von Testosteronsynthese zu induzieren). Der Zeitpunkt der Plasma-Abnahme wird so festgelegt, dass er mit dem Maximum der induzierten Hormonreaktion zusammenfällt. Verbindungswirkungen werden mit einer Kontrollgruppe verglichen, die mit Vehikel behandelt wurde. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, und hierauf folgt ein Student-t-Test. Signifikant ist ein p-Wert ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe.
  • 1.2. Hohlfasermechanismus des Aktionstests
  • Hohlfasern werden mit einer oder mehreren gewünschten Zelllinien präpariert und Nagetieren intraperitoneal und/oder subkutan implantiert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. verabreicht. Fasern werden gemäß einer spezifischen Vorschrift für Ablesungstests geerntet, die Tests für Genexpression (bDNA, PCR oder Taqman) oder für eine spezifische biochemische Aktivität (d.h. cAMP-Konzentrationen) umfassen können. Resultate werden mittels Student-t-Test oder Rangsummen-Test analysiert, nachdem die Varianz zwischen Gruppen mittels eines F-Tests verglichen wurde, mit einer Signifikanz von p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe.
  • 2. Subakute In-vivo-Funktionstests
  • 2.1. Verringerung der Masse von Hormon-abhängigen Geweben
  • Dies ist ein anderer Nicht-Tumor-Test, der die Fähigkeit einer Verbindung misst, die Masse eines Hormon-abhängigen Gewebes (d.h. Samenbläschen bei männlichen und Uteri bei weiblichen Tieren) zu verringern. Nagetieren wird Testverbindung (p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k.) gemäß einem vorbestimmten Plan und eine vorbestimmte Zeit lang (d.h. 1 Woche) verabreicht. Am Ende der Studie werden die Tiere gewogen, das Target-Organ wird exzidiert, sämtliche Flüssigkeit wird ausgepresst, und das Gewicht des Organs wird aufgezeichnet. Blutplasma kann auch gesammelt werden. Plasma kann auf Konzentrationen eines Hormons von Interesse oder auf Konzentrationen von Testmittel getestet werden. Organgewichte können direkt verglichen oder können in Bezug auf das Körpergewicht des Tiers normalisiert werden. Verbindungswirkungen werden mit einer mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe verglichen. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, und hierauf folgt ein Student-t-Test. Signifikant ist ein p-Wert ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe.
  • 2.2. Hohlfasern-Proliferationstest
  • Hohlfasern werden mit einer oder mehreren gewünschten Zelllinien präpariert und Nagetieren intraperitoneal und/oder subkutan implantiert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. verabreicht. Fasern werden gemäß einer spezifischen Ablesungstestvorschrift geerntet. Zellproliferation wird durch Messen eines Zellzahl-Markers (d.h. MTT oder LDH) bestimmt. Die Zellzahl und Veränderung der Zellzahl im Vergleich zum Ausgangsinokulum werden durch Student-t-Test oder Rangsummen-Test analysiert, nachdem die Varianz zwischen Gruppen mittels eines F-Tests verglichen wurde, mit einer Signifikanz von p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe.
  • 2.3. Anti-Anglogenese-Modelle
  • 2.3.1. Angiogenese der Kornea
  • Hydron-Pellets mit oder ohne Wachstumsfaktor oder Zellen werden in einen Mikrohohlraum, der chirurgisch in der Kornea des Nagetiers geschaffen wurde, implantiert. Die Verabreichung der Verbindung kann systemisch oder lokal erfolgen (Verbindung, vermischt mit Wachstumsfaktoren im Hydron-Pellet). Die Korneae werden 7 Tage nach der Implantation, unverzüglich nach intrakardialer Infusion von kolloidalem Kohlenstoff, geerntet und in 10 % Formalin fixiert. Die Ablesung erfolgt in Form einer qualitativen Auswertung und/oder einer Bildanalyse. Qualitative Ergebnisse werden mittels Rangsummen-Test verglichen. Bildanalyse-Daten werden durch Messen des Bereichs der Neovaskularisation (in Pixeln) bewertet, und Mittelwerte für Gruppen werden mittels Student-t-Test verglichen (2-seitig). Signifikant ist p > 0,05 im Vergleich zur Gruppe mit nur Wachstumsfaktor oder nur Zellen.
  • 2.3.2 Matrigel-Angiogenese
  • Matrigel, das Zellen oder Wachstumsfaktoren enthält, wird subkutan injiziert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. verabreicht. Matrigel-Pfropfen werden zu einem oder mehreren vorbestimmten Zeitpunkten geerntet und zur Ablesung vorbereitet. Die Ablesung ist ein auf ELISA basierender Test auf Hämoglobinkonzentration und/oder eine histologische Untersuchung (d.h. Blutgefäßzählungen, spezielles Färben von Endothel-Oberflächenmarkern: CD31, Faktor-8). Ablesungen werden mittels Student-t-Test analysiert, mit bei p < 0,05 festgelegter Signifikanz im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe.
  • 3. Anti-Tumor-Wirksamkeit gegen Primärtumoren
  • 3.1. Modelle früher Therapie
  • 3.1.1 Subkutaner Tumor
  • Tumorzellen oder -fragmente werden an Tag 0 subkutan implantiert. Vehikel und/oder Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht, der an einem Zeitpunkt, üblicherweise an Tag 1, bevor die Möglichkeit besteht, die Tumorbelastung zu messen, beginnt. Körpergewichte und Tumormessungen werden zwei- bis dreimal wöchentlich aufgezeichnet. Die mittleren Netto-Körpergewichte und -Tumorgewichte werden für jeden Datensammlungstag berech net. Anti-Tumor-Wirksamkeit kann anfänglich durch Vergleichen der Größe von behandelten (T) und Kontroll- (C) Tumoren an einem bestimmten Tag mittels des Student-t-Tests bestimmt werden, nachdem die Varianz zwischen den Gruppen mittels eines F-Tests, mit bei p ≤ 0,05 festgelegter Signifikanz, verglichen wurde. Der Versuch kann auch nach dem Ende der Dosierung fortgesetzt werden, wobei Tumormessungen weiterhin aufgezeichnet werden würden, um Tumorwachstumsverzögerungen zu beobachten. Tumorwachstumsverzögerungen werden ausgedrückt als die Differenz der mittleren Zeit für die behandelten und Kontrollgruppen, eine vorbestimmte Größe zu erreichen, dividiert durch die mittlere Zeit für die Kontrollgruppe, diese Größe zu erreichen. Wachstumsverzögerungen werden mittels der Erstellung von Kaplan-Meier-Kurven für die Zeit, die die einzelnen Tumoren benötigen, um die Bewertungsgröße zu erreichen, verglichen. Signifikant ist p ≤ 0,05.
  • 3.1.2 Intraperitoneale/Intrakranielle Tumormodelle
  • Tumorzellen werden intraperitoneal oder intrakraniell an Tag 0 injiziert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan, beginnend an Tag 1, verabreicht. Beobachtungen von Morbidität und/oder Mortalität werden zweimal täglich aufgezeichnet. Körpergewichte werden zweimal wöchentlich gemessen und aufgezeichnet. Daten zu Morbidität/Mortalität werden als mittlere Überlebensdauer angegeben, und die Anzahl von langfristig überlebenden Individuen wird separat angegeben. Überlebensdauern werden verwendet, um Kaplan-Meier-Kurven zu erstellen. Signifikant ist p < 0,05, ermittelt durch Log-Rank-Test, im Vergleich zur Kontrollgruppe im Versuch.
  • 3.2. Erstellte Erkrankungsmodelle
  • Tumorzellen oder -fragmente werden subkutan implantiert und bis zur gewünschten Größe, um die Behandlung zu beginnen, wachsen gelassen. Nachdem der Bereich der vorbestimmten Größe erreicht wurde, werden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in Behandlungsgruppen eingeteilt. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht. Tumor- und Körpergewichte werden zwei- bis dreimal wöchentlich gemessen und aufgezeichnet. Mittlere Tumorgewichte von allen Gruppen werden über die Tage nach der Inokulation hinweg zu Vergleichszwecken graphisch dargestellt. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, gefolgt von einem Student-t-Test, um Tumorgrößen in den behandelten und Kontrollgruppen am Ende der Behandlung zu vergleichen. Signifikant ist p ≤ 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Tumormessungen können nach Abschluss der Dosierung aufgezeichnet werden, um Tumorwachstumsverzögerung zu beobachten. Tumorwachstumsverzögerungen werden ausgedrückt als die Differenz der mittleren Zeit für die behandelten und Kontrollgruppen, eine vorbestimmte Größe zu erreichen, dividiert durch die mittlere Zeit für die Kontrollgruppe, diese Größe zu erreichen. Wachstumsverzögerungen werden mittels der Erstellung von Kaplan-Meier-Kurven für die Zeiten, die die einzelnen Tumoren benötigen, um die Bewertungsgröße zu erreichen, verglichen. Signifikant ist p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe.
  • 3.3. Orthotopische Erkrankungsmodelle
  • 3.3.1 Brustfettpolster-Test
  • Tumorzellen oder -fragmente, abstammend aus Brust-Adenokarzinom, werden direkt in einen chirurgisch freigelegten und zurückgebogenen Brustfettpolster in Nagetieren implantiert. Der Fettpolster wird in seine ursprüngliche Position zurück gebracht und die chirurgische Schnittstelle geschlossen. Hormone können den Nagetieren ebenfalls verabreicht werden, um das Wachstum der Tumoren zu unterstützen. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht. Tumor- und Körpergewichte werden zwei- bis dreimal wöchentlich gemessen und aufgezeichnet. Mittlere Tumorgewichte von allen Gruppen über die Tage nach der Inokulation hinweg werden zu Vergleichszwecken graphisch dargestellt. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, gefolgt von einem Student-t-Test, um Tumorgrößen in den behandelten und Kontroll gruppen am Ende der Behandlung zu vergleichen. Signifikant ist p ≤ 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe.
  • Tumormessungen können nach Abschluss der Dosierung aufgezeichnet werden, um Tumorwachstumsverzögerung zu beobachten. Tumorwachstumsverzögerungen werden ausgedrückt als die Differenz der mittleren Zeit für die behandelten und Kontrollgruppen, eine vorbestimmte Größe zu erreichen, dividiert durch die mittlere Zeit für die Kontrollgruppe, diese Größe zu erreichen. Wachstumsverzögerungen werden mittels Erstellung von Kaplan-Meier-Kurven für die Zeiten, die die einzelnen Tumoren benötigen, um die Bewertungsgröße zu erreichen, verglichen. Signifikant ist p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe. Zusätzlich stellt dieses Modell eine Gelegenheit dar, die Geschwindigkeit spontaner Metastasenbildung von diesem Tumortyp zu erhöhen. Metastasenbildung kann am Ende der Studie durch Zählen der Anzahl sichtbarer Herde pro Target-Organ oder durch Messen des Gewichts des Target-Organs bewertet werden. Die Mittelwerte dieser Endpunkte werden mittels Student-t-Test nach der Durchführung eines F-Tests, mit bei p ≤ 0,05 festgelegter Signifikanz im Vergleich zur Kontrollgruppe des Versuchs, verglichen.
  • 3.3.2 Intraprostatischer Test
  • Tumorzellen oder -fragmente, abstammend von prostatischem Adenokarzinom, werden direkt in einen chirurgisch freigelegten dorsalen Lappen der Prostata in Nagetieren implantiert. Die Prostata wird durch eine Abdomeninzision so nach außen freigelegt, dass der Tumor spezifisch in den dorsalen Lappen implantiert werden kann, während sichergestellt ist, dass das Implantat nicht in die Samenbläschen eindringt. Die erfolgreich inokulierte Prostata wird zurück in das Abdomen platziert, und die Schnitte durch Abdomen und Haut werden geschlossen. Hormone können den Nagetieren ebenfalls verabreicht werden, um das Wachstum der Tumoren zu unterstützen. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht. Körpergewichte werden zwei- bis dreimal wöchentlich gemessen und aufgezeichnet. Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt wird der Versuch abgeschlos sen und das Tier seziert. Die Größe des Primärtumors wird unter Verwendung eines Messschiebers oder eines Okularmikrometers, das an einem Präpariermikroskop angebracht ist, dreidimensional gemessen. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, gefolgt von einem Student-t-Test, um Tumorgrößen in den behandelten und Kontrollgruppen am Ende der Behandlung zu vergleichen. Signifikant ist p ≤ 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieses Modell bietet eine Gelegenheit, die Geschwindigkeit spontaner Metastasenbildung dieses Tumortyps zu erhöhen. Metastasenbildung kann am Ende der Studie durch Zählen der Anzahl sichtbarer Herde pro Target-Organ (d.h. der Lungen) oder durch Messen des Gewichts des Target-Organs (d.h. der Lymphknoten dieses Bereichs) bewertet werden. Die Mittelwerte dieser Endpunkte werden mittels Student-t-Test nach der Durchführung eines F-Tests, mit bei p ≤ 0,05 festgelegter Signifikanz im Vergleich zur Kontrollgruppe des Versuchs, verglichen.
  • 3.3.3 Intrabronchialer Test
  • Tumorzellen pulmonalen Ursprungs können intrabronchial durch Ansetzen eines Schnitts durch die Haut und Freilegen der Trachea implantiert werden. Die Trachea wird mit dem abgeschrägten Ende einer 25-Gauge-Nadel durchstochen, und die Tumorzellen werden unter Verwendung einer planendigen 27-Gauge-Nadel mit 90°
  • Krümmung in den Hauptbronchus inokuliert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht. Körpergewichte werden zwei- bis dreimal wöchentlich gemessen und aufgezeichnet. Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt wird der Versuch abgeschlossen und das Tier seziert. Die Größe des Primärtumors wird unter Verwendung eines Messschiebers oder eines Okularmikrometers, das an einem Präpariermikroskop angebracht ist, dreidimensional gemessen. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, gefolgt von einem Student-t-Test, um Tumorgrößen in den behandelten und Kontrollgruppen am Ende der Behandlung zu vergleichen. Signifikant ist p ≤ 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieses Modell bietet eine Gelegenheit, die Geschwindigkeit spontaner Metastasenbildung dieses Tumortyps zu erhöhen. Meta stasenbildung kann am Ende der Studie durch Zählen der Anzahl sichtbarer Herde pro Target-Organ (d.h. der kontralateralen Lunge) oder durch Messen des Gewichts des Target-Organs bewertet werden. Die Mittelwerte dieser Endpunkte werden mittels Student-t-Test nach der Durchführung eines F-Tests, mit bei p ≤ 0,05 festgelegter Signifikanz im Vergleich zur Kontrollgruppe des Versuchs, verglichen.
  • 3.3.4 Intrazäkaler Test
  • Tumorzellen aus dem Magen-Darm-Trakt können intrazäkal durch Ansetzen eines Abdomenschnitts durch die Haut und Freilegen des Darms implantiert werden. Tumorzellen werden unter Verwendung einer 27- oder 30-Gauge-Nadel in die Wand des Caecums inokuliert, ohne das Lumen des Darms zu durchdringen. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht. Körpergewichte werden zwei- bis dreimal wöchentlich gemessen und aufgezeichnet. Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt wird der Versuch abgeschlossen und das Tier seziert. Die Größe des Primärtumors wird unter Verwendung eines Messschiebers oder eines Okularmikrometers, das an einem Präpariermikroskop angebracht ist, dreidimensional gemessen. Ein F-Test wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Varianz gleich oder ungleich ist, gefolgt von einem Student-t-Test, um Tumorgrößen in den behandelten und Kontrollgruppen am Ende der Behandlung zu vergleichen. Signifikant ist p ≤ 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieses Modell bietet eine Gelegenheit, die Geschwindigkeit spontaner Metastasenbildung dieses Tumortyps zu erhöhen. Metastasenbildung kann am Ende der Studie durch Zählen der Anzahl sichtbarer Herde pro Target-Organ (d.h. der Leber) oder durch Messen des Gewichts des Target-Organs bewertet werden. Die Mittelwerte dieser Endpunkte werden mittels Student-t-Test nach der Durchführung eines F-Tests, mit bei p ≤ 0,05 festgelegter Signifikanz im Vergleich zur Kontrollgruppe des Versuchs, verglichen.
  • 4. Antitumor-Wirksamkeit gegen Sekundärtumoren (Metastasen)
  • 4.1. Spontane Metastasen
  • Tumorzellen werden s.k. inokuliert, und die Tumoren werden bis zu einem vorbestimmten Bereich für Studien zu spontanen Metastasen bezüglich der Lunge oder Leber wachsen gelassen. Diese Primärtumoren werden dann exzidiert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht, der die Zeitspanne bis zur Exzision des Primärtumors einbinden kann, um Therapien zu bewerten, die darauf abzielen, die frühen Stadien von Tumormetastasenbildung zu inhibieren. Beobachtungen von Morbidität und/oder Mortalität werden täglich aufgezeichnet. Körpergewichte werden zweimal wöchentlich gemessen und aufgezeichnet. Mögliche Endpunkte umfassen Überlebensdauer, Anzahl sichtbarer Herde pro Target-Organ oder Gewicht des Target-Organs. Wird die Überlebensdauer als Endpunkt verwendet, so werden die anderen Werte nicht bestimmt. Überlebensdaten werden verwendet, um Kaplan-Meier-Kurven zu erstellen. Signifikant ist p ≤ 0,05, ermittelt durch Log-Rank-Test, im Vergleich zur Kontrollgruppe im Versuch. Die mittlere Anzahl an sichtbaren Tumorherden, bestimmt unter einem Präpariermikroskop, und die mittleren Gewichte des Target-Organs werden mittels Student-t-Test nach Durchführung eines F-Tests verglichen, mit bei p ≤ 0,05 festgelegter Signifikanz im Vergleich zur Kontrollgruppe im Versuch für beide dieser Endpunkte.
  • 4.2. Erzwungene Metastase
  • Tumorzellen werden in Studien zu experimenteller (erzwungener) Lungen-, Leber- und Knochenmetastase in die Schwanzvene, Pfortader bzw. den linken Ventrikel des Herzens injiziert. Verbindungen werden p.o., i.p., i.v., i.m. oder s.k. gemäß einem vorbestimmten Plan verabreicht. Beobachtungen von Morbidität und/oder Mortalität werden täglich aufgezeichnet. Körpergewichte werden zweimal wöchentlich gemessen und aufgezeichnet. Mögliche Endpunkte umfassen Überlebensdauer, Anzahl sichtbarer Herde pro Target-Organ oder Gewicht des Target-Organs. Wird die Über lebensdauer als Endpunkt verwendet, so werden die anderen Werte nicht bestimmt. Überlebensdaten werden verwendet, um Kaplan-Meier-Kurven zu erstellen. Signifikant ist p ≤ 0,05, ermittelt durch Log-Rank-Test, im Vergleich zur Kontrollgruppe im Versuch. Die mittlere Anzahl an sichtbaren Tumorherden, bestimmt unter einem Präpariermikroskop, und die mittleren Gewichte des Target-Organs werden mittels Student-t-Test nach Durchführung eines F-Tests verglichen, mit Signifikanz bei p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe im Versuch für beide Endpunkte.
  • BEISPIEL 9
  • In-vivo-Tests von Verbindungen/Target-Validierung
  • 1. Schmerz
  • Akuter Schmerz
  • Akuter Schmerz wird an einer heißen Platte, hauptsächlich mit Ratten, gemessen. Zwei Varianten von Tests mit heißer Platte werden verwendet: In der klassischen Variante werden die Tiere auf eine heiße Oberfläche (52 bis 56 °C) gesetzt, und die Latenzzeit wird gemessen, bis die Tiere nozifensives Verhalten, wie beispielsweise Hin- und Hertreten oder Fußlecken, zeigen. Die andere Variante ist eine heiße Platte mit steigender Temperatur, bei der die Versuchstiere auf eine Oberfläche mit neutraler Temperatur gesetzt werden. Daraufhin wird diese Oberfläche langsam, aber konstant erhitzt, bis die Tiere beginnen, eine Hinterpfote zu lecken. Die Temperatur, die erreicht wurde, wenn dieses Lecken der Hinterpfote beginnt, ist ein Maß für die Schmerzschwelle.
  • Verbindungen werden wiederum im Vergleich zu einer mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe getestet. Substanzanwendung erfolgt zu drei unterschiedlichen Zeitpunkten über unterschiedliche Wege der Verabreichung (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.k., intradermal, transdermal) vor den Schmerztests.
  • Beständiger Schmerz
  • Beständiger Schmerz wird mit dem Formalin- oder Capsaicin-Test, hauptsächlich bei Ratten, gemessen. Eine Lösung von 1 bis 5 % Formalin oder 10 bis 100 μg Capsaicin wird in eine Hinterpfote des Versuchstiers injiziert. Nach der Formalin- oder Capsaicin-Anwendung zeigen die Tiere nozifensive Reaktionen wie Zucken mit, Lecken und Beißen der beeinträchtigten Pfote. Die Anzahl an nozifensiven Reaktionen innerhalb einer Zeitspanne von 90 min ist ein Maß für Schmerzintensität.
  • Verbindungen werden im Vergleich zu einer mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe getestet. Substanzanwendung erfolgt zu unterschiedlichen Zeitpunkten über unterschiedliche Wege der Verabreichung (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.k., intradermal, transdermal) vor der Verabreichung von Formalin oder Capsaicin.
  • Neuropathischer Schmerz
  • Neuropathischer Schmerz wird durch verschiedene Varianten von einseitiger Verletzung des Ischiasnervs, hauptsächlich bei Ratten, induziert. Die Operation erfolgt unter Anästhesie. Die erste Variante von Ischiasnervverletzung wird durch Anbringen locker zusammenschnürender Abbindungen rund um den Nervus ischiadicus communis (Ischiasnerv) hervorgerufen. Die zweite Variante ist die enge Abbindung von etwa dem halben Durchmesser des gewöhnlichen Ischiasnervs. In der nächsten Variante wird eine Gruppe von Modellen verwendet, in denen enge Abbindungen oder Durchtrennungen entweder der L5- und L6-Spinalnerven oder nur des L5-Spinalnervs angebracht bzw. durchgeführt wurden. Die vierte Variante umfasst eine Axotomie von zwei der drei terminalen Äste des Ischiasnervs (des Nervus tibialis und des Nervus peroneus communis), wobei der verbleibende Nervus suralis intakt bleibt, während die letzte Variante nur die Axotomie des Tibialis-Astes umfasst und sowohl Nervus suralis als auch Nervus peroneus communis unverletzt belässt. Kontrolltiere werden mit einer Simulationsoperation behandelt.
  • Postoperativ entwickeln die nervenverletzten Tiere eine chronische mechanische Allodynie, Kälte-Allodynie sowie eine thermische Hyperalgesie. Mechanische Allodynie wird mittels eines Druckwandlers (Elektronik von Frey Anesthesiometer, IITC Inc. Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA; Elektronik von Frey System, Somedic Sales AB, Hörby, Schweden) gemessen. Thermische Hyperalgesie wird mittels einer Strahlungswärmequelle (Plantar Test, Ugo Basile, Comerin, Italien) oder mittels einer kalten Platte von 5 bis 10 °C gemessen, wobei die nozifensiven Reaktionen der beeinträchtigen Hinterpfote als ein Maß von Schmerzempfindlichkeit gemessen werden. Ein weiterer Test für kälteinduzierten Schmerz ist das Zählen von nozifensiven Reaktionen oder der Dauer von nozifensiven Reaktionen, nachdem der beeinträchtigten Hinterpfote plantar Aceton verabreicht wurde. Chronischer Schmerz wird im Allgemeinen durch Aufzeichnen der zirkadianen Rhythmen im Wachzustand (Surjo & Arndt, Universität zu Köln, Köln, Deutschland) und durch Bewertungsunterschiede der Gangart (Fußabdruckmuster; FOOTPRINTS-Programm, Klapdor et al., Ein kostengünstiges Verfahren zur Analyse von Fußabdruckmustern, J. Neurosci. Methods 75, 49–54 (1997)) bewertet.
  • Verbindungen werden im Vergleich zu scheinoperierten und mit Vehikel behandelten Kontrollgruppen getestet. Substanzanwendung erfolgt zu unterschiedlichen Zeitpunkten über unterschiedliche Wege der Verabreichung (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.k., intradermal, transdermal) vor den Schmerztests.
  • Entzündungsschmerz
  • Entzündungsschmerz wird hauptsächlich bei Ratten durch Injektion von 0,75 mg Carrageenan oder komplettem Freundschem Adjuvans in eine Hinterpfote induziert. Die Tiere entwickeln ein Ödem mit mechanischer Allodynie sowie thermischer Hyperalgesie. Mechanische Allodynie wird mittels eines Druckwandlers (Elektronik von Frey Anesthesiometer, IITC Inc. Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA) gemessen. Thermische Hyperalgesie wird mittels einer Strahlungswärmequelle (Plantar Test, Ugo Basile, Comerin, Italien; Paw thermal stimulator, G. Ozaki, University of California, USA) gemessen. Für Ödemmessungen werden zwei Verfahren ein gesetzt. Beim ersten Verfahren werden die Tiere getötet und die beeinträchtigten Hinterpfoten abgetrennt und gewogen. Das zweite Verfahren arbeitet mit Unterschieden des Pfotenvolumens durch Messen von Wasserverschiebung in einem Plethysmometer (Ugo Basile, Comerin, Italien).
  • Verbindungen werden im Vergleich zu entzündungsfreien sowie mit Vehikel behandelten Kontrollgruppen getestet. Substanzanwendung erfolgt zu unterschiedlichen Zeitpunkten über unterschiedliche Wege der Verabreichung (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.k., intradermal, transdermal) vor den Schmerztests.
  • Diabetischer neuropathischer Schmerz
  • Ratten, die mit einer einfachen intraperitonealen Injektion von 50 bis 80 mg/kg Streptozotocin behandelt wurden, entwickeln eine schwere Hyperglykämie und mechanische Allodynie binnen 1 bis 3 Wochen. Mechanische Allodynie wird mittels eines Druckwandlers (Elektronik von Frey Anesthesiometer, IITC Inc., Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA) gemessen.
  • Verbindungen werden im Vergleich zu diabetischen und nicht-diabetischen mit Vehikel behandelten Kontrollgruppen getestet. Substanzanwendung erfolgt zu unterschiedlichen Zeitpunkten über unterschiedliche Wege der Verabreichung (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.k., intradermal, transdermal) vor den Schmerztests.
  • 2. Parkinson-Krankheit
  • 6-Hydroxydopamin-(6-OH-DA) Läsion
  • Degeneration der dopaminergen nigrostriatalen und striatopallidalen Stoffwechselwege ist das zentrale pathologische Ereignis bei Parkinson-Krankheit. Diese Störung wurde in Versuchen an Ratten unter Verwendung von einfachen/aufeinander folgen den einseitigen stereotaktischen Injektionen von 6-OH-DA in das mediale Vorderhirnbündel (MFB) nachgeahmt.
  • Männliche Wistar-Ratten (Harlan Winkelmann, Deutschland), die 200 ± 250 g zu Beginn des Versuchs wiegen, werden verwendet. Die Ratten werden in einer Temperatur- und Feuchtigkeitskontrollierten Umgebung unter einem 12-h-Licht/Dunkelheit-Zyklus bei freiem Zugang zu Nahrung und Wasser außerhalb der Versuchseinheiten gehalten. Die folgenden In-vivo-Vorschriften sind von den Regierungsbehörden genehmigt. Es wird bestmöglich darauf geachtet, das Leiden der Tiere zu minimieren, die Anzahl an verwendeten Tieren zu reduzieren und Alternativen zu In-vivo-Verfahren zu verwenden.
  • Den Tieren wird Pargylin am Tag der Operation verabreicht (Sigma, St. Louis, MO, USA; 50 mg/kg i.p.), um den Stoffwechsel von 6-OH-DA durch Monoaminoxidase zu inhibieren, und Desmethylimipramin-HCl (Sigma; 25 mg/kg i.p.), um die Aufnahme von 6-OH-DA durch noradrenerge Termini zu unterbinden. Dreißig Minuten später werden die Ratten mit Natriumpentobarbital (50 mg/kg) anästhesiert und in einen stereotaktischen Rahmen gespannt. Um den DA-nigrostriatalen Stoffwechselweg zu verletzen, werden 4 μl von 0,01 %iger Ascorbinsäure-Kochsalzlösung, die 8 μg 6-OH-DA-HBr (Sigma) enthält, mit einer Rate von 1 μl/min in das linke mediale Vorderhirnbündel (2,4 mm anterior, 1,49 mm lateral, –2,7 mm ventral zu Bregma und der Schädeloberfläche) injiziert. Die Nadel wird weitere 5 min lang an der Injektionsstelle belassen, um das Eintreten von Diffusion zu ermöglichen.
  • Schritttest
  • Vorderpfoten-Akinesie wird drei Wochen nach Verursachung der Läsion unter Verwendung einer modifizierten Schritttestvorschrift bewertet. Kurz zusammengefasst werden die Tiere vom Versuchsleiter mit einer Hand gehalten, die die Hinterextremitäten fixiert und das Hinterteil leicht über der Tischfläche aufhebt. Eine Pfote berührt den Tisch und wird dann langsam zur Seite (5 s für 1 m) bewegt, zuerst in die Vorhandrichtung (Sohle nach unten) und dann in die Rückhandrichtung (Rist nach un ten). Die Anzahl an ausgleichenden Schritten wird für beide Pfoten in den beiden Bewegungsrichtungen gezählt. Die Testabfolge lautet zuerst Vorhand- und Rückhand-Ausgleichsschritte mit der rechten Pfote und anschließend Vorhand- und Rückhand-Richtungen mit der linken Pfote. Der Test wird dreimal an drei aufeinander folgenden Tagen wiederholt, wobei vor dem ersten Testdurchgang eine anfängliche Trainingsphase von drei Tagen eingehalten wird. Vorhand-Ausgleichsschritte zeigen keine übereinstimmenden vorhandenen Unterschiede zwischen verletzten Tieren und gesunden Kontrolltieren. Die Analyse ist daher auf Rückhand-Ausgleichsschritte beschränkt.
  • Gleichgewichtstest
  • Gleichgewichts-Ausgleich nach Beeinträchtigung der Körperstellung wird ebenfalls während der Schritttesteinheiten gemessen. Die Ratten werden in derselben Position gehalten, wie zuvor für den Schritttest beschrieben wurde, und werden, anstelle der Seitbewegung, vom Versuchsleiter in Richtung jener Seite, an der die Pfote den Tisch berührt, geneigt. Dieses Manöver führt zu einem Gleichgewichtsverlust, und die Fähigkeit der Ratten, das Gleichgewicht durch Bewegungen der Vorderpfote wiederzugewinnen, wird auf einer Skala von 0 bis 3 aufgezeichnet. Bewertung 0 wird für eine normale Vorderpfotenbewegung verliehen. Ist die Bewegung der Vorderpfote verzögert, kann jedoch das Wiedergewinnen des Körpergleichgewichts detektiert werden, so wird die Bewertung 1 vergeben. Bewertung 2 steht für eine eindeutige, jedoch unzulängliche Vorderpfotenreaktion, die durch Muskelkontraktion erkannt werden kann, die jedoch zu keiner erfolgreichen Wiedererlangung des Gleichgewichts führt, und die Bewertung 3 wird für keine Bewegungsreaktion vergeben. Der Test wird dreimal täglich auf jeder Seite an drei aufeinander folgenden Tagen wiederholt, wobei vor dem ersten Testdurchgang eine anfängliche Trainingsphase von drei Tagen eingehalten wird.
  • Treppen-Test (Pfotengriff)
  • Eine modifizierte Ausführung des Treppen-Tests wird zur Bewertung des Verhaltens des Pfotengriffs drei Wochen nach Zufügung der primären und sekundären Läsion verwendet. Plexiglas-Testboxen mit einer zentralen Platte und einer entfernbaren Treppe an jeder Seite werden verwendet. Die Vorrichtung ist so konzipiert, dass nur die Pfote auf der jeweiligen Seite der Treppe auch auf dieser Treppe verwendet werden kann, wodurch ein Maß für unabhängige Vorderpfotenverwendung bereitgestellt wird. Bei jedem Test werden die Tiere 15 min lang in den Boxen gelassen. Die Doppel-Treppe ist an jeder Seite mit 7x3 Futterpellets (Präzisions-Futterpellets, Formel: P, gereinigte Nagetiernahrung, Größe: 45 mg; Sandown Scientific) versehen. Nach jedem Test werden die Anzahl an gefressenen Pellets (erfolgreich erreichten Pellets) und die Anzahl an genommenen Pellets (berührt, jedoch fallen gelassen) für jede Pfote sowie die Erfolgsrate (gefressene Pellets/genommene Pellets) separat gezählt. Nach drei Tagen Nahrungsentzug (12 g pro Tier pro Tag) werden die Tiere 11 Tage lang getestet. Eine vollständige Analyse wird nur die letzten fünf Tage durchgeführt.
  • MPTP-Behandlung
  • Das Neurotoxin 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) verursacht eine Degeneration von dopaminergen (DAergen) Neuronen des Mesencephalons bei Nagetieren, nichtmenschlichen Primaten und Menschen und produziert dadurch zahlreiche Symptome der Parkinson-Krankheit. MPTP führt zu einer ausgeprägten Reduktion der Konzentration von Dopamin und seiner Stoffwechselprodukte und der Anzahl an dopaminergen Termini im Striatum sowie zu einem schwerwiegenden Verlust der Tyrosinhydroxylase-(TH-) immunoreaktiven Zellkörpern in der Substantia nigra, Pars compacta.
  • Um schwerwiegende und langanhaltende Läsionen zu erreichen und um Mortalität zu reduzieren, erhalten Tiere MPTP-Injektionen und werden 7 bis 10 Tage später auf Schwere der Läsion getestet. Aufeinander folgende MPTP-Injektionen werden an den Tagen 1, 2 und 3 verabreicht. Tiere erhalten einmal täglich eine Dosierung von 4 mg/kg MPTP-Hydrochlorid (Sigma) in Kochsalzlösung. Alle Injektionen erfolgen intraperitoneal (i.p.), und die MPTP-Ausgangslösung wird zwischen den Injektionen eingefroren. Die Tiere werden an Tag 11 enthauptet.
  • Immunhistologie
  • Am Ende der Verhaltenstests werden alle Tiere mit 3 ml Thiopental (1 g/40 ml i.p., Tyrol Pharma) anästhesiert. Die Mäuse werden transkardial mit 0,01 M PBS (pH 7,4) 2 min lang perfundiert, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd (Merck) in PBS 15 min lang. Die Hirne werden entfernt und in 4 % Paraformaldehyd 24 h lang bei 4 °C eingelegt. Zur Dehydratation werden sie anschließend in eine 20%ige Saccharose-Lösung (Merck) in 0,1 M PBS bei 4 °C transferiert, bis sie absinken. Die Hirne werden in Methylbutan bei –20 °C 2 min lang gefroren und bei –70 °C gelagert. Unter Verwendung eines Schlittenmikrotoms (Modell 3800-Frigocut, Leica) werden 25-μm-Schnitte vom Genu des Corpus callosum (AP 1,7 mm) hin zum Hippocampus (AP 21,8 mm) und von AP 24,16 bis AP 26,72 genommen. Sechsundvierzig Schnitte werden geschnitten und in Sortiereinheiten in 0,25 M Tris-Puffer (pH 7,4) für immunhistochemische Untersuchungen gelagert.
  • Eine Reihe von Schnitten wird für freiflotierende Tyrosinhydroxylase-(TH-) Immunhistochemie verarbeitet. Nach drei Waschschritten in 0,1 M PBS wird endogene Peroxidaseaktivität 10 min lang in 0,3 % H2O2 ± PBS gequencht. Nach Spülen in PBS werden die Schnitte in 10 % normalem Rinderserum (Sigma) als Blockierungsmittel 5 min lang vorinkubiert und jeweils in primäres Anti-Ratten-TH-Kaninchen-Antiserum (Verdünnung 1:2.000) transferiert.
  • Nach Übernacht-Inkubation bei Raumtemperatur werden Schnitte für TH-Immunreaktivität in PBS (2 × 10 min) gespült und in biotinyliertem Anti-Kaninchen-Immunglobulin G, gezüchtet in Ziege (Verdünnung 1:200) (Vector), 90 min lang inkubiert, wiederholt gespült und 1 h lang in Vectastain-ABC-Lösung (Vector) transferiert. 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB; Sigma) in 0,1 M PBS, ergänzt mit 0,005 % H2O2, dient als Chromogen in der nachfolgenden Reaktion zur Sichtbarmachung. Die Schnitte werden auf Gelatine-beschichtete Objektträger gegeben, über Nacht zum Trocknen darauf gelassen, mit in steigenden Alkoholkonzentrationen dehydratisiertem Hämatoxylin gegengefärbt und in Butylacetat geklärt. Deckgläser werden auf Entellan platziert.
  • Rotarod-Test
  • Die Erfinder verwenden eine Modifikation des von Rozas & Labandeira-Garcia (1997) beschriebenen Verfahrens mit einem CR-1-Rotamex-System (Columbus Instruments, Columbus, OH), das einen IBM-kompatiblen PC, eine CIO-24-Datenerfassungskarte, eine Steuereinheit und eine vierspurige Rotarod-Einheit umfasst. Die Rotarod-Einheit besteht aus einer rotierenden Spindel (Durchmesser 7,3 cm) und einzelnen Abteilen für jede Maus. Die System-Software ermöglicht das Vorprogrammieren von Bedingungen für Versuchsabschnitte mit verschiedenen Rotationsgeschwindigkeiten (0 bis 80 U/min). Infrarot-Strahlen werden verwendet, um zu erkennen, wann eine Maus auf den Grundraster unter dem Rotarod gefallen ist. Das System registriert dieses Fallen als das Ende des Versuchs für diese Maus, und die Gesamtzeit am Rotarod sowie die Zeit des Fallens und alle Einstellungsparameter werden aufgezeichnet. Das System ermöglicht auch das Anlegen einer schwachen Stromspannung am Grundraster, um das Training zu unterstützen.
  • 3. Demenz
  • Die Aufgabe der Objekterkennung
  • Die Aufgabe der Objekterkennung (OE) wurde entworfen, um die Wirkungen experimenteller Manipulationen auf das Erkennungsvermögen von Nagetieren zu bewerten. Eine Ratte wird in eine unbekannte Umgebung gesetzt, in der zwei identische Objekte vorhanden sind. Die Ratte besichtigt während des ersten Versuchs der Objekterkennungsaufgabe beide Objekte. In einem zweiten Versuch wird nach einem Speicherintervall von beispielsweise 24 h eines der zwei im ersten Versuch verwen deten Objekte, also ein "vertrautes" Objekt, entfernt, und ein neues Objekt wird in die unbekannte Umgebung gegeben. Die Besichtigungsdauer bei jedem der Objekte wird aufgezeichnet. Die grundlegenden Maße bei der OE-Aufgabe ist die Zeit, die eine Ratte zur Erkundung der zwei Objekte beim zweiten Versuch braucht. Gutes Gedächtnis zeigt sich in höheren Erkundungszeiten für das neue Objekt im Vergleich zum "vertrauten" Objekt.
  • Die Verabreichung des mutmaßlichen Enhancers von Erkennungsvermögen vor dem ersten Versuch ermöglicht überwiegend die Bewertung der Wirkungen auf das Erfassungsvermögen und schließlich auf Festigungsprozesse. Die Verabreichung der Testverbindung nach dem ersten Versuch ermöglicht eine Bewertung der Wirkungen auf Festigungsprozesse, während die Verabreichung vor dem zweiten Versuch eine Messung der Wirkungen auf Erinnerungsprozesse ermöglicht.
  • Die Aufgabe passiver Vermeidung
  • Die Aufgabe passiver Vermeidung bewertet die Gedächtnisleistung bei Ratten und Mäusen. Die Hemmungs-Vermeidungs-Vorrichtung besteht aus einer Box mit zwei Unterteilungen mit einem hellen Raum und einem dunklen Raum. Die zwei Räume werden durch eine Falltür getrennt, die vom Versuchsleiter betätigt werden kann. Eine Schwelle von 2 cm trennt die zwei Räume, wenn die Falltür hochgezogen ist. Ist die Tür geöffnet, so beträgt die Beleuchtungsstärke des dunklen Raums etwa 2 Lux. Die Lichtintensität beträgt etwa 500 Lux in der Mitte des Bodens des hellen Raums.
  • Zwei Gewöhnungsphasen, eine Schockphase und eine Speicherphase werden durchgeführt, die durch Zwischenintervalle von 24 h voneinander getrennt sind. Während der Gewöhnungsphase und der Speicherphase darf die Ratte die Vorrichtung 300 s lang erkunden. Die Ratte wird in den hellen Raum gesetzt, mit Blick auf die Wand gegenüber der Falltür. Nach einer Anpassungsphase von 15 s wird die Falltüre geöffnet, sodass alle Teile der Vorrichtung frei begangen werden können. Ratten vermeiden normalerweise hell erleuchtete Bereiche und gehen innerhalb weniger Sekunden in den dunklen Raum.
  • Während der Schockphase wird die Falltür zwischen den zwei Räumen gesenkt, sobald die Ratte den dunklen Raum mit ihren vier Pfoten betreten hat, und ein ungeordneter Fußelektroschock (1 mA) wird 2 s lang zugefügt. Die Ratte wird aus der Vorrichtung genommen und in ihren Heimkäfig zurückgegeben. Das Verfahren während der Speicherphase ist mit jenem der Gewöhnungsphasen identisch.
  • Die Wartezeit vor dem Durchschreiten, das heißt die erste Wartezeit vor dem Betreten des dunklen Raums (in s) während der Speicherphase, ist ein Index für die Gedächtnisleistung des Tiers; je länger die Wartezeit vor dem Betreten des dunkeln Raums, desto besser ist die Gedächtnisleistung. Eine Testverbindung wird eine halbe Stunde für der Schockphase zusammen mit 1 mg/kg Scopolamin verabreicht. Scopolamin behindert die Gedächtnisleistung während der Speicherphase 24 h später. Erhöht die Testverbindung die Wartezeit vor dem Betreten im Vergleich zu den mit Scopolamin behandelten Kontrollen, so verfügt sie wahrscheinlich über das Erinnerungsvermögen förderndes Potenzial.
  • Die Morris-Wasserflucht-Aufgabe
  • Die Morris-Wasserflucht-Aufgabe misst das Raumorientierungslernen bei Nagetieren. Es ist ein Testsystem, das bereits ausführlich eingesetzt wurde, um die Wirkungen mutmaßlicher Therapeutika auf die kognitiven Funktionen von Ratten und Mäusen zu untersuchen. Die Leistung eines Tiers wird in einem kreisförmigen Wasserbehälter mit einer Fluchtplatte, die etwa 1 cm unter der Wasseroberfläche angebracht ist, bewertet. Die Fluchtplatte ist für ein Tier, das im Wasserbehälter schwimmt, nicht sichtbar. Zahlreiche zusätzliche Anhaltspunkte in diesem "Labyrinth" sind durch die Einrichtung im Raum, einschließlich der Tische, der Computerausstattung und eines zweiten Wasserbehälters, durch die Gegenwart des Versuchsleiters und durch ein Radio auf einem Regal, das leise spielt, bereitgestellt.
  • Die Tiere bekommen vier Versuche im Rahmen von fünf täglichen Einheiten zur Informationssammlung. Ein Versuch wird durch Setzen eines Tiers in den Wasserbehälter mit Blick auf die Wand des Behälters begonnen. Jede der vier Ausgangs positionen in den Nord-, Ost-, Süd- und West-Quadranten wird einmal in einer Reihe von vier Versuchen verwendet; ihre Reihenfolge wird mittels Zufall bestimmt. Die Fluchtplatte befindet sich stets in derselben Position. Ein Versuch wird beendet, sobald das Tier auf die Fluchtplatte geklettert ist oder wenn 90 s vergangen sind, je nachdem, welches dieser beiden Ereignisse zuerst eintritt. Das Tier wird auf der Plattform 30 s lang sitzen gelassen. Dann wird es von der Platte genommen, und der nächste Versuch wird gestartet. Konnte das Tier die Platte innerhalb von 90 s nicht finden, so wird es vom Versuchsleiter auf die Platte gesetzt und wird dort 30 s lang sitzen gelassen. Nach dem vierten Versuch der fünf täglichen Einheiten wird ein zusätzlicher Versuch als ein Probelauf gewährt: die Platte wird entfernt, und die Zeit, die das Tier in den vier Quadranten verbringt, wird innerhalb von 30 oder 60 s gemessen. Im Probelauf starten alle Tiere von derselben Position aus, gegenüber dem Quadranten, in dem die Fluchtplatte während der Erfassungsphase angeordnet war.
  • Vier verschiedene Messungen werden vorgenommen, um die Leistung eines Tiers während des Erfassungstrainings zu bewerten: Fluchtwartezeit, geschwommene Distanz, Distanz zur Platte und Schwimmgeschwindigkeit. Die folgenden Messungen werden für den Probelauf bewertet: Verweilzeit (s) in den Quadranten und durchschwommene Distanz (cm) in den vier Quadranten. Der Probelauf liefert zusätzliche Information in Bezug darauf, wie gut sich ein Tier die Position der Fluchtplatte merken konnte. Verbringt ein Tier im Vergleich zu jedem beliebigen anderen Quadraten mehr Zeit und schwimmt eine längere Distanz in jenem Quadranten, in dem die Platte während der Erfassungsphasen angeordnet war, so kann daraus geschlossen werden, dass die Position der Platte gut gespeichert wurde.
  • Um die Wirkungen mutmaßlicher Erinnerungsvermögen-fördernder Verbindungen zu bewerten, werden Ratten oder Mäuse mit spezifischen Hirnläsionen, die kognitive Funktionen behindern, oder Tiere, die mit Verbindungen wie beispielsweise Scopolamin oder MK-801 behandelt wurden, die normales Lernen stören, oder ältere Tiere, die an Defiziten im Erkennungsvermögen leiden, eingesetzt.
  • Die Aufgabe mit spontanem Wechsel im T-Labyrinth
  • Die Aufgabe mit spontanem Wechsel im T-Labyrinth (TeMCAT) bewertet die räumliche Erinnerungsleistung von Mäusen. Der Startarm und die zwei Zielarme des T-Labyrinths sind mit Falltüren versehen, die manuell vom Versuchsleiter betätigt werden können. Eine Maus wird zu Beginn des Trainings in den Startarm gesetzt. Die Falltür wird geschlossen. Im ersten Versuch, dem "vorgegebenen Versuch", wird entweder der linke oder der rechte Zielarm durch Senken der Falltür blockiert. Nachdem die Maus im Startarm freigelassen wurde, wird sie in das Labyrinth gehen, schließlich den offenen Zielarm betreten und zur Startposition zurückkehren, wo sie 5 s lang durch Absenken der Falltüre festgehalten wird. Dann kann das Tier im Laufe von 14 Versuchen mit "freier Wahl" frei zwischen dem linken und dem rechten Zielarm wählen (alle Falltüren sind offen). Sobald die Maus einen Zielarm betritt, wird der andere Zielarm geschlossen. Die Maus kehrt schließlich zum Startarm zurück und kann frei entscheiden, welchen Zielarm sie nun betreten will, nachdem sie 5 s lang im Startarm eingesperrt gehalten wurde. Nach Abschluss von 14 Versuchen mit freier Auswahl in einem Testdurchlauf wird das Tier aus dem Labyrinth genommen. Während des Trainings wird das Tier nie berührt.
  • Die Wechsel werden für die 14 Versuche prozentuell berechnet. Dieser Prozentsatz und die Gesamtdauer, die erforderlich ist, um den ersten vorgegebenen Versuch und die darauf folgenden 14 Versuche mit freier Auswahl durchzuführen, (in s) wird analysiert. Defizite des Erkennungsvermögens werden üblicherweise durch eine Injektion von Scopolamin, 30 min vor Beginn der Trainingsphase, induziert. Scopolamin reduzierte die prozentuellen Wechsel auf Zufallsniveau oder darunter. Ein Enhancer des Erkennungsvermögens, der stets vor der Trainingsphase verabreicht wird, wirkt der Scopolamin-induzierten Reduktion der spontanen Wechselrate zumindest teilwiese entgegen.
  • BEISPIEL 10
  • Expression von Proteinkinase-ähnlichem Protein
  • Gesamt-RNA für eine quantitative Taqman-Analyse wurde entweder gekauft (Clontech, CA) oder mithilfe des TRIzol-Reagens (Life Technologies, MD) gemäß einer modifizierten Form der Vorschrift des Lieferanten, die auf der RNeasy-Vorschrift (Qiagen, CA) basierte, aus Geweben extrahiert.
  • 100 μg jeder RNA wurden mit DNase I unter Verwendung von RNase-freier DNase (Qiagen, CA) zur Verwendung mit RNeasy- oder QiaAmp-Säulen behandelt.
  • Nach einer Elution und Quantifizierung mit Ribogreen (Molecular Probes Inc., OR) wurde jede Probe unter Verwendung des GibcoBRL Superscript II First Strand Synthesis System für RT-PCR gemäß der Vorschrift des Lieferanten (Life Technologies, MD) revers transkribiert. Die Endkonzentration von RNA im Reaktionsgemisch betrug 50 ng/μl. Reverse Transkription erfolgte mit 50 ng zufällig ausgewählten Hexameren.
  • Spezifische Primer und eine Sonde wurden gemäß den Empfehlungen von PE Applied Biosystems entworfen und werden nachstehend genannt:
    Vorwärts-Primer: 5'-(CTGTGACCTGAAGTCGGACAAC)-3'
    Rückwärts-Primer: 5'-(GGAATGACTGCCTCGAAATCC)-3'
    Sonde: SYBR-Grün
  • Quantifizierungsversuche wurden auf 5 ng revers transkribierter RNA aus jeder Probe durchgeführt. 18S-ribosomale RNA wurde unter Verwendung der Pre-Developed TaqMan Assay Reagents (PDAR) (PE Applied Biosystems, CA) als Kontrolle gemessen. Das Reaktionsgemisch war wie folgt zusammengesetzt:
    Endgehalt
    TaqMan SYBR Green PCR Master Mix (2x) 1x
    (PE Applied Biosystems, CA)
    Vorwärts-Primer 300 mM
    Rückwärts-Primer 300 nM
    cDNA 25 ng
    Wasser auf 25 μl
    PCR-Bedingungen:
    Einmal: 2 Minuten bei 50 °C
    10 Minuten bei 95 °C
    40 Durchgänge: 15 s bei 95 °C
    1 min bei 60 °C
  • Der Versuch erfolgt auf einem ABI Prism 7700 Sequence Detector (PE Applied Biosystems, CA). Am Ende jedes Durchgangs wurden die während der PCR gewonnenen Fluoreszenzdaten wie im Handbuch zum ABI Prism 7700 beschrieben verarbeitet. Die x-fachen Änderungen wurden mithilfe des Delta-Delta-CT-Verfahrens unter Normalisierung auf die 18S-Werte berechnet. Die relative Expression wurde durch Normalisierung auf 18s (D Ct) berechnet, wonach das am stärksten exprimierende Gewebe mit 100 bewertet wurde und alle anderen Werte dazu relativiert wurden. Die Kopienzahlumrechnung erfolgte ohne Normalisierung unter Einsatz der Formel Cn = 10(Ct-40,007)/-3,623.
  • Die Ergebnisse sind in den 13, 14, 15 und 16 zu sehen.
  • Die Expression von Proteinkinase-ähnlichem Potein in Fett und Skelettmuskel konnte reguliert werden, um die Insulinempfindlichkeit zu erhöhen.
  • LITERATURVERZEICHNIS
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    • 2. Protein kinase catalytic domain sequence database: identification of conserved features of primary structure and classification of family members, Methods Enzymol. 200, 38–62 (1991).
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00840001
  • Figure 00850001
  • Figure 00860001
  • Figure 00870001
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Claims (1)

  1. Verfahren zum Screenen auf Mittel, die zur Behandlung von Diabetes zweckdienlich sind und die Aktivität eines Proteinkinase-ähnlichen Proteins verringern, folgende Schritte umfassend: (a) das Kontaktieren einer Testverbindung mit einem Proteinkinase-ähnlichen Protein, das eine durch Seq.-ID Nr. 9 definierte Polypeptidsequenz umfasst; und (b) das Detektieren einer Proteinkinase-ähnlichen Proteinaktivität des Polypeptids, worin eine Testverbindung, welche die Proteinkinase-ähnliche Proteinaktivität des Polypeptids verringert, als mögliches Therapeutikum zur Verringerung der Aktivität des Proteinkinase-ähnlichen Proteins identifiziert wird.
DE60220388T 2001-03-16 2002-03-15 Regulation eines menschlichen proteinkinase-ähnlichen proteins Expired - Lifetime DE60220388T2 (de)

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US326458P 2001-10-03
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US337124P 2001-12-10
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