ES2328114T3 - Regulacion de la serina/treonina proteina quinasa humana de tipo wee1. - Google Patents

Regulacion de la serina/treonina proteina quinasa humana de tipo wee1. Download PDF

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ES2328114T3 ES02704675T ES02704675T ES2328114T3 ES 2328114 T3 ES2328114 T3 ES 2328114T3 ES 02704675 T ES02704675 T ES 02704675T ES 02704675 T ES02704675 T ES 02704675T ES 2328114 T3 ES2328114 T3 ES 2328114T3
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Abstract

Un polinucleótido aislado que se selecciona del grupo constituido por: a) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID Nº: 2 o SEQ ID Nº: 6. b) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID Nº: 1 o la SEQ ID Nº: 5; y c) un polinucleótido, cuya secuencia se desvía de las secuencias de polinucleótidos especificadas en (a) debido a la degeneración del código genético y que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.

Description

Regulación de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1.
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Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a la regulación de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1.
Antecedentes de la invención
Las proteínas tirosina quinasas catalizan la siguiente reacción: ATP + proteína tirosina = ADP + proteína tirosina fosfatada. Debido a la importancia de esta reacción, existe una necesidad en la materia de identificar proteínas quinasas, que se puedan regular para proporcionar efectos terapéuticos.
Una entrada en la base de datos (TrEMBL, Número de acceso 095017) divulga la secuencia de aminoácidos de un miembro putativo de la familia Ser/Thr proteína quinasa, que tiene una identidad del 96,8% con la SEQ ID Nº: 2 sobre la longitud completa, sin identificar ninguna función biológica o posible uso como marcador tumoral.
Resumen de la invención
La invención divulga reactivos y procedimientos de regulación de una serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1. Éste y otros objetos de la invención son proporcionados por una o más de las formas de realización descritas a continuación.
Una forma de realización de la invención es un polipéptido de serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2
y
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 6.
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Se divulga un procedimiento para la selección de agentes que reducen la degradación de la matriz extracelular. Un compuesto de prueba se pone en contacto con un polipéptido de serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
secuencias de aminoácidos que son, al menos, un 54% idénticas aproximadamente a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2;
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2;
secuencias de aminoácidos que son, al menos, un 54% idénticas aproximadamente a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 6; y
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 6.
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Se detecta la unión entre el compuesto de prueba y el polipéptido de serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Un compuesto de prueba que se une al polipéptido de serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se identifica de esta forma como agente potencial para reducir la degradación de la matriz extracelular. El agente puede actuar reduciendo la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
Se divulga un procedimiento para la selección de agentes que reducen la degradación de la matriz extracelular. Un compuesto de prueba se pone en contacto con un polinucleótido que codifica un polipéptido de serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por:
secuencias de nucleótidos que son, al menos, un 50% idénticas aproximadamente a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 1;
la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 1;
secuencias de nucleótidos que son, al menos, un 50% idénticas aproximadamente a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 5; y
la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 5.
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Se detecta la unión del compuesto de prueba al polinucleótido. Un compuesto de prueba que se une al polinucleótido se identifica de esta forma como agente potencial para reducir la degradación de la matriz extracelular. El agente puede funcionar reduciendo la cantidad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 a través de la interacción con el ARNm de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
Se divulga un procedimiento para la selección de agentes que regulan la degradación de la matriz extracelular. Un compuesto de prueba se pone en contacto con un polipéptido de serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
secuencias de aminoácidos que son, al menos, un 54% idénticas aproximadamente a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2;
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2;
secuencias de aminoácidos que son, al menos, un 54% idénticas aproximadamente a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 6; y
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 6.
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Se detecta una actividad serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 del polipéptido. Un compuesto de prueba que incrementa la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 del polipéptido en relación a la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en ausencia del compuesto de prueba se identifica de esta forma como agente potencial para incrementar la degradación de la matriz extracelular. Un compuesto de prueba que reduce la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 del polipéptido en relación a la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en ausencia del compuesto de prueba se identifica de esta forma como agente potencial para reducir la degradación de la matriz extracelular.
Se divulga adicionalmente un procedimiento para la selección de agentes que reducen la degradación de la matriz extracelular. Un compuesto de prueba se pone en contacto con un producto de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por:
secuencias de nucleótidos que son, al menos, un 50% idénticas aproximadamente a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 1;
la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 1;
secuencias de nucleótidos que son, al menos, un 50% idénticas aproximadamente a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 5; y
la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 5.
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Se detecta la unión del compuesto de prueba al producto de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Un compuesto de prueba que se une al producto de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se identifica de esta forma como agente potencial para reducir la degradación de la matriz extracelular.
Otra descripción es un procedimiento para la reducción de la degradación de la matriz extracelular. Una célula se pone en contacto con un reactivo que se une específicamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 o el producto codificado por el polinucleótido, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por:
secuencias de nucleótidos que son, al menos, un 50% idénticas aproximadamente a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 1;
la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 1;
secuencias de nucleótidos que son, al menos, un 50% idénticas aproximadamente a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 5; y
la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 5.
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La invención proporciona de esta forma una serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 que se puede usar para identificar compuestos de prueba que pueden actuar, por ejemplo, como activadores o inhibidores en el sitio activo de la enzima. La serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 y sus fragmentos también son útiles en el crecimiento de anticuerpos específicos que pueden bloquear la enzima y que reducen eficazmente su actividad.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 (SEQ ID Nº: 1).
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de ADN de la Figura 1 (SEQ ID Nº: 2).
La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína identificada por el número de acceso de Swissnew P47817|WEE1_XENLA WEE1-LIKE PROTEIN KINASE (EC 2.7.1.112) (SEQ ID Nº: 3).
La Figura 4 muestra la secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 (SEQ ID Nº: 4).
La Figura 5 muestra la secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 (SEQ ID Nº: 5).
La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de ADN de la Figura 5 (SEQ ID Nº: 6).
La Figura 7 muestra el alineamiento BLASTP de 276_protd (SEQ ID Nº: 2) frente a swissnew|P47817|WEE1_
XENLA WEE1-LIKE PROTEIN KINASE (EC 2.7.1.112) (SEQ ID Nº: 3).
La Figura 8 muestra el alineamiento HMMPFAM de 276_prod (SEQ ID Nº: 2) frente a pfam|hmm|pkinase.
La Figura 9 muestra los resultados del perfil de expresión de ARNm de la proteína quinasa de tipo WEE1 en tejidos humanos.
La Figura 10 muestra los resultados del perfil de expresión de ARNm de la proteína quinasa de tipo WEE1 en tejidos humanos.
La Figura 11 muestra los resultados del perfil de expresión de ARNm de la proteína quinasa de tipo WEE1 en tejidos humanos.
La Figura 12 muestra los resultados del perfil de expresión de ARNm de la proteína quinasa de tipo WEE1 en tejidos humanos relevante para la diabetes y la obesidad patofisiológica.
Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a un polinucleótido aislado del grupo constituido por:
a) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID Nº: 2 o SEQ ID Nº: 6.
b) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID Nº: 1 o la SEQ ID Nº: 5; y
c) un polinucleótido, cuya secuencia se desvía de las secuencias de polinucleótidos especificadas en (a) debido a la degeneración del código genético y que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
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Además, el presente solicitante ha descubierto que una nueva serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, particularmente una serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1, se puede usar en procedimientos terapéuticos para tratar el cáncer, un trastorno del sistema nervioso central y periférico, un trastorno genitourinario, un trastorno cardiovascular o COPD.
La serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2 ó 6. Las secuencias codificantes para la SEQ ID Nº: 2 y 6 se muestran en la SEQ ID Nº: 1 y 5, respectivamente. El gen de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 está localizado en el cromosoma 7. Un EST relacionado (SEQ ID Nº: 4) se expresa en tejido agrupado que comprende pulmón, testículos, y células B.
La serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 es un 53% idéntica sobre 531 aminoácidos a swissnew
|P47817|WEE1_XENLA WEE1-LIKE PROTEIN KINASE (EC 2.7.1.112) (SEQ ID Nº: 3) con un nivel de confianza de 5e-143. (Fig. 7). La serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 también es un 50% idéntica a una proteína "Weel Hu" humana, con un nivel de confianza de 53-122. La función de la SEQ ID Nº: 2 como proteína quinasa eucariota específica para serina/treonina está apoyada por la presencia de una región con un dominio proteína quinasa eucariota identificado por la homología pfam (valor e- de 6,4e-45), y una región proteína quinasa ST y proteína quinasa de ATP identificada por homología de prositio.
El motivo consenso: [LIV]-G-{P}-G-{P}-[FYWMGSTNH]-[SGA]-{PW}-[L1VCAT]-{PD}-x-[GSTACLIV
MFY]-x(5,18)-[LIVMFYWCSTAR]-[AIVP]-LIVMFAGCKR]-K [K se une al ATP] está presente en la SEQ ID Nº: 2. Este motivo está presente en la mayoría de proteína quinasas conocidas, pero falla para identificar una serie de ellas, especialmente quinasas víricas, que son bastante divergentes en esta región y fallan completamente para ese motivo.
El motivo consenso: [LIVMFYC]-x-[HY]-x-D-[LIVMFY]-K-x(2)-N-[LIVMFYCT](3) [D es un residuo del sitio activo] también está presente en la SEQ ID Nº: 2. Este motivo detecta la mayoría de proteína quinasas específicas de serina/treonina, con 10 excepciones (la mitad de ellas quinasas víricas) y también BGLF4 del virus de Epstein-Barr y ninaC de Drosophila, que tienen, respectivamente, Ser y Arg en lugar de la Lys conservada y que por tanto son detectadas por el motivo específico de tirosina quinasas descrito a continuación.
Para proteínas que tienen estas dos firmas proteína quinasa, la probabilidad de ser una proteína quinasa está próxima al 100%.
El motivo consenso: [LIVMFYC]-x-[HY]-x-D-[LIVMFY]-[RSTAC]-x(2)-N-[LWMFYC](3) [D es un residuo del sitio activo] está presente en todas las proteína quinasas específicas de tirosina, con la excepción de la ERBB3 humana y la blk de ratón. Este motivo también detectará la mayoría de aminoglicósido fosfotransferasas bacterianas y las quinasas ganciclovir de herpesvirus, que son proteínas estructural y evolutivamente relacionadas a las proteína quinasas.
Se ha demostrado que las proteína quinasas de tipo WEE1 tienen una actividad quinasa específica para tirosina. Una secuencia anotada como "similar a la proteína quinasa de tipo wee" está presente en bases de datos públicas. Comparada con esta secuencia, la SEQ ID Nº: 2 contiene una inserción de 18 aminoácidos que mejora su identidad a otras proteína quinasas de tipo wee.
La serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 de la invención se espera que sea útil para los mismos fines que los identificados previamente para las enzimas serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Se cree que la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 es útil en procedimientos terapéuticos para tratar trastornos tales como cáncer, trastornos del sistema nervioso central y periférico, trastornos genitourinarios, trastornos cardiovasculares, y COPD. La serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 también se puede usar para seleccionar activadores e inhibidores de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1.
Polipéptidos
Los polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 según la invención comprenden al menos 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, ó 559 aminoácidos contiguos seleccionados de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2, al menos 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, ó 785 aminoácidos contiguos seleccionados de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 6, o procedentes de sus variantes biológicamente activas, como se define a continuación. Un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 de la invención puede ser por tanto una fracción de una proteína serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, una proteína serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 de longitud completa, o una proteína de fusión que comprende toda o una fracción de una proteína serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
Variantes biológicamente activas
Las variantes de polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 que son biológicamente activas, por ejemplo, que retienen la actividad enzimática, también son polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1. Se divulgan variantes de polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 de origen natural o no natural que tienen secuencias de aminoácidos que son, al menos, un 54, 55, 60, 65, ó 70, aproximadamente, preferentemente un 75, 80, 85, 90, 96, 96, 98, ó 99% aproximadamente idénticas a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2 ó 6. El porcentaje de identidad entre una variante de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 putativa y una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2 se determina mediante procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul y col., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986), y Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10915 (1992). Resumiendo, se alinean dos secuencias de aminoácidos para optimizar las puntuaciones de los alineamientos usando una penalización de apertura de hueco de 10, una penalización de extensión de hueco de 1, y la matriz de puntuación "BLOSUM62" de Henikoff & Henikoff, 1992.
Aquellos expertos en la materia apreciarán que hay muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson & Lipman es un procedimiento de alineamiento de proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento y la secuencia de aminoácidos de una variante putativa. El algoritmo FASTA es descrito por Pearson & Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444(1988), y por Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990). Resumiendo, FASTA primero caracteriza la similitud de secuencia identificando regiones compartidas por la secuencia a investigar (por ejemplo, SEQ ID Nº: 2) y una secuencia de prueba que tiene la densidad de identidades más alta (si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup=2), sin considerar sustituciones, inserciones, o deleciones de aminoácidos conservativas. Las diez regiones con la densidad de identidad más alta a continuación se vuelven a puntuar comparando la similitud de todos los aminoácidos emparejados usando una matriz de sustitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones se "recortan" para incluir sólo aquellos residuos que contribuyen a la puntuación más alta. Si hay varias regiones con puntuaciones superiores al valor "límite" (calculado mediante una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia, el valor ktup), entonces las regiones iniciales recortadas se examinan para determinar si las regiones se pueden unir para formar un alineamiento aproximado con huecos. Finalmente, las regiones con la puntuación más alta de las dos secuencias de aminoácidos se alinean usando una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol.48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math.26:787 (1974)), que permite las inserciones y deleciones de aminoácidos. Parámetros preferidos para el análisis FASTA son: ktup = 1, penalización de apertura de hueco = 10, penalización de extensión de hueco = 1, y matriz de sustitución = BLOSUM62. Estos parámetros se pueden introducir en un programa FASTA modificando el archivo de la matriz de puntuación ("SMATRIX"), como se explica en el Apéndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).
El FASTA también se puede usar para determinar la identidad de secuencia de moléculas de aminoácidos usando una relación como la descrita anteriormente. Para comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor ktup puede abarcar entre uno y seis, preferentemente entre tres y seis, más preferentemente tres, con los otros parámetros ajustados por defecto.
Las variaciones en el porcentaje de la identidad pueden ser debidas, por ejemplo, a sustituciones, inserciones, o deleciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se definen como reemplazos de aminoácidos uno por uno. Son conservativas en la naturaleza cuando el aminoácidos sustituido tiene propiedades estructurales y/o químicas similares. Ejemplos de reemplazos conservativos son la sustitución de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato o una treonina con una serina.
Las inserciones o deleciones de aminoácidos son cambios de o dentro de una secuencia de aminoácidos. Normalmente caen en el intervalo de 1 a 5 aminoácidos aproximadamente. La orientación en la determinación de qué residuos aminoácidos se pueden sustituir, insertar, o suprimir sin eliminar la actividad biológica o inmunológica de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 se puede encontrar usando programas de ordenador muy conocidos en la materia, tales como el software DNASTAR.
La invención engloba adicionalmente polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que se modifican diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas incluyendo, pero no limitado a, escisión química específica mediante bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH_{4}, acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc.
Modificaciones post-traduccionales adicionales comprendidas por la invención incluyen, por ejemplo, cadenas de carbohidratos N-unidas u O-unidas, procesamiento de extremos N-terminales o C-terminales, unión de restos químicos al esqueleto de aminoácidos, modificaciones químicas de cadenas de carbohidratos N-unidas u O-unidas, y adición o deleción de un residuo metionina N-terminal como resultado de la expresión en una célula hospedadora procariota. Los polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 también se pueden modificar con un marcador detectable, tal como un marcador enzimático, fluorescente, isotópico o de afinidad para permitir la detección y el aislamiento de la proteína.
La invención también divulga derivados químicamente modificados de los polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que pueden proporcionar ventajas adicionales tales como una solubilidad, una estabilidad y un tiempo en circulación del polipéptido incrementados, o una inmunogenicidad reducida (véase patente de EE.UU. Nº 4.179.337). Los restos químicos para la derivación se pueden seleccionar entre polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, y similares. Los polipéptidos se pueden modificar en posiciones aleatorias o predeterminadas dentro de la molécula y puede incluir uno, dos, tres, o más restos químicos unidos.
Si un cambio de aminoácidos o una modificación del polipéptido da como resultado un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 biológicamente activo se puede determinar fácilmente sometiendo a ensayo para la actividad enzimática, como se divulga, por ejemplo, en Nakanishi y col., Genes Cells 2000 Oct; 5(10):839-47;
Fattaey & Booher, Prog Cell Cycle Res 1997; 3:233-40; o Den Haese y col., Mol Biol Cell 1995 Abr; 6(4):371-85.
Proteínas de fusión
Las proteínas de fusión son útiles para generar anticuerpos contra secuencias de aminoácidos del polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y para su uso en diversos sistemas de ensayo. Por ejemplo, las proteínas de fusión se pueden usar para identificar proteínas que interaccionan con porciones de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Para este propósito se puede usar cromatografía de afinidad de proteínas o ensayos basados en librerías para las interacciones de proteína-proteína, tales como los sistemas de dos híbridos de levadura y de presentación en fagos. Esos procedimientos son muy conocidos en la materia y también se pueden usar como sistema de selección de fármacos.
Una proteína de fusión de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 comprende dos segmentos polipeptídicos fusionados juntos por medio de un enlace peptídico. El primer segmento polipeptídico comprende al menos 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, ó 559 aminoácidos contiguos seleccionados de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2, al menos 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, ó 785 aminoácidos contiguos seleccionados de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 6, o procedente de sus variantes biológicamente activas, tales como aquéllas descritas anteriormente. El primer segmento polipeptídico también comprende la proteína serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 de longitud completa.
El segundo segmento polipeptídico puede ser una proteína de longitud completa o un fragmento de la proteína. Las proteínas usadas habitualmente en la construcción de proteínas de fusión incluyen \beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa, proteína fluorescente verde (GFP), proteínas autofluorescentes, incluyendo la proteína fluorescente azul (BFP), glutatión-S-transferasa (GST), luciferasa, peroxidasa de rábano (HRP), y cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Adicionalmente, en las construcciones de las proteínas de fusión se usan marcas de epítopos, incluyendo marcas de histidina (His), marcas FLAG, marcas de hemaglutinina del virus de la gripe (HA), marcas Myc, marcas VSV-G, y marcas de tiorredoxina (Trx). Otras construcciones de fusión pueden incluir proteína de unión a maltosa (MBP), S-tag, fusiones de un dominio de unión de ADN Lex (DBD), fusiones de un dominio de unión de ADN GAL4, y fusiones de la proteína BP16 de herpesvirus simple (HSV). Una proteína de fusión también se puede modificar por ingeniería genética para que contenga un sitio de escisión localizado entre la secuencia que codifica el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y la secuencia de la proteína heteróloga, de manera que el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pueda escindir y purificarse del resto heterólogo.
Una proteína de fusión se puede sintetizar químicamente, como es muy conocido en la materia. Preferentemente, una proteína de fusión se produce uniendo covalentemente dos segmentos polipeptídicos o mediante procedimientos normales en materia de biología molecular. Se pueden usar procedimientos de ADN recombinante para preparar proteínas de fusión, por ejemplo, haciendo una construcción de ADN que comprende secuencias codificantes seleccionadas de la SEQ ID Nº: 1 en el marco de lectura apropiado con nucleótidos que codifican el segundo segmento polipeptídico y la expresión de la construcción de ADN en una célula hospedadora, como es sabido en la materia. Están disponibles numerosos kits para la construcción de proteínas de fusión en compañías tales como Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), CLONTECH (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL International Corporation (MIC; Watertown, MA), y Quantum Biotechnologies (Montreal, Canadá; 1-888-DNA-KITS).
Identificación de homólogos de especie
Los homólogos de especie del polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 se pueden obtener usando polinucleótidos del polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 (descritos a continuación) para preparar sondas o cebadores adecuados para la selección de librerías de expresión de ADNc de otras especies, tales como ratones, monos, o levaduras, identificando ADNc que codifican homólogos de los polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, y expresando los ADNc como es sabido en la técnica.
Polinucleótidos
Un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 puede ser de cadena sencilla o de doble cadena y comprende una secuencia codificante o el complemento de una secuencia codificante para un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Se divulgan secuencias de nucleótidos degeneradas que codifican polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1, así como secuencias de nucleótidos homólogas que son al menos un 50, 55, 60, 65, 70 aproximadamente, preferentemente un 75, 90, 96, 98, ó 99% idénticas aproximadamente a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 1 ó 5 o sus complementos también son polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. El porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de dos polinucleótidos se determina usando programas de ordenador tales como ALIGN que emplea el algoritmo FASTA, usando una búsqueda de huecos afinada con una penalización de apertura de hueco de -12 y una penalización de extensión de hueco de -2. Se divulga adicionalmente que moléculas de ADN complementario (ADNc), homólogos de especie, y las variantes de los polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que codifican polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 biológicamente activos también son polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Fragmentos de polinucleótidos que comprenden al menos 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, ó 25 nucleótidos contiguos de la SEQ ID Nº: 1 ó 5 o sus complementos también son polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Estos fragmentos se pueden usar, por ejemplo, como sondas de hibridación o como oligonucleótidos antisentido.
Identificación de variantes y homólogos de polinucleótidos
Se divulgan variantes y homólogos de los polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Normalmente, las secuencias de polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 homólogas se pueden identificar mediante hibridación de polinucleótidos candidatos a polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 conocidos en condiciones restrictivas, como es conocido en la materia. Por ejemplo, usando las siguientes condiciones de lavado - 2x SSC (NaCl 0,3 M, citrato sódico 0,03 M, pH 7,0), SDS al 0,1%, dos veces a temperatura ambiente, 30 minutos cada una; y a continuación 2x SSC, SDS al 0,1%, una vez a 50ºC, 30 minutos; y a continuación 2x SSC, dos veces a temperatura ambiente, 10 minutos cada una - se pueden identificar secuencias homólogas que contienen un máximo del 25-30% de pares de bases desapareadas aproximadamente. Más preferentemente, las cadenas de ácidos nucleicos homólogos contienen un 15-25% de pares de bases desapareadas, incluso más preferentemente un 5-15% de pares de bases desapareadas.
Los homólogos de especie de los polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 descritos en el presente documento también se pueden identificar preparando sondas o cebadores adecuados y seleccionando librerías de expresión de ADNc de otras especies, tales como ratones, monos, o levadura. Las variantes humanas de los polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pueden identificar, por ejemplo, seleccionando librerías de expresión de ADNc humano. Es bien sabido que la T_{m} de un ADN de doble cadena se reduce en 1-1,5ºC cada 1% de reducción en la homología (Bonner y col., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973). Las variantes de los polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 o los polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 de otras especies se pueden identificar, por tanto, hibridando un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 putativo homólogo con un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº: 1 ó 6 o su complemento para formar un híbrido de prueba. La temperatura de fusión del híbrido de prueba se compara con la temperatura de fusión de un híbrido que comprende polinucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos perfectamente complementarias, y se calcula el número o el porcentaje de pares de bases desapareadas dentro del híbrido de prueba.
Se divulga que las secuencias de nucleótidos que se hibridan a los polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 o sus complementos siguiendo condiciones de hibridación y/o lavado restrictivas también son polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Las condiciones de lavado restrictivas son muy conocidas y se entienden en la materia y se divulgan, por ejemplo, en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., 1989, páginas 9.50-9.51.
Normalmente, para condiciones de hibridación restrictivas se debe seleccionar una combinación de temperatura y concentración salina que esté aproximadamente 12-20ºC por debajo de la T_{m} calculada del híbrido en estudio. La T_{m} de un híbrido entre un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que tiene una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 1 ó 6 o su complemento y una secuencia de polinucleótidos que es, al menos, un 50 aproximadamente, preferentemente un 75, 90, 96, ó 98% idéntica aproximadamente a una de esas secuencias de nucleótidos se puede calcular, por ejemplo, usando la ecuación de Bolton y McCarthy, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 48, 1390 (1962): T_{m} = 8,5ºC - 16,6(log_{10} [Na^{+}]) + 0,41(% de G + C) - 0,63 (% de formamida) - 600/l), en la que l = longitud del híbrido en pares de bases.
Las condiciones de lavado restrictivas incluyen, por ejemplo, 4X SSC a 65ºC, o 50% de formamida, 4X SSC a 42ºC, o 0,5X SSC, 0,1% de SDS a 65ºC. Condiciones de lavado muy restrictivas incluyen, por ejemplo, 0,2X SSC a 65ºC.
Preparación de los polinucleótidos
Un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede aislar libre de otros componentes celulares tales como componentes de membrana, proteínas, y lípidos. Los polinucleótidos se pueden preparar con una célula y se pueden aislar usando técnicas de purificación de ácidos nucleicos estándar, o se pueden sintetizar usando una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o usando un sintetizador automático. Los procedimientos para el aislamiento de polinucleótidos son rutinarios y son muy conocidos en la materia. Se puede usar cualquiera de esas técnicas para la obtención de un polinucleótido para obtener polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 aislados. Por ejemplo, se pueden usar enzimas de restricción y sondas para aislar fragmentos de polinucleótidos, que comprenden secuencias de nucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Los polinucleótidos aislados están en preparaciones que están exentas, o al menos en un 70, 80, ó 90% libres, de otras moléculas.
Las moléculas de ADNc de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 se pueden preparar mediante técnicas de biología molecular habituales, usando como molde ARNm de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Las moléculas de ADNc de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 se pueden replicar posteriormente usando técnicas de biología molecular conocidas en la materia y descritas en manuales tales como Sambrook y col. (1989). Se puede usar una técnica de amplificación, tal como PCR, para obtener copias adicionales de los polinucleótidos de la invención, usando ADN genómico humano o ADNc como molde.
Alternativamente, se pueden usar técnicas de química sintética para sintetizar los polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. La degeneración del código genético permite sintetizar secuencias de nucleótidos alternativas que codificarán un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que tiene, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2 ó 6 o una de sus variantes biológicamente activas.
Extensión de los polinucleótidos
Las secuencias parciales descritas en el presente documento se pueden usar para identificar el gen correspondiente de longitud completa del que proceden. Las secuencias parciales se pueden traducir por muescas o se pueden marcar en su extremo con ^{32}P usando una polinucleótido quinasa con procedimientos de marcaje conocidos por aquellos expertos en la materia (BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis y col., eds., Elsevier Press, N.Y., 1986). Se puede seleccionar directamente una librería lambda preparada a partir de tejido humano con las secuencias de interés marcadas o la librería se puede convertir en masa a pBluescript (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Calif. 92037) para facilitar la selección de colonias bacterianas (véase Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989, pg. 1.20).
Ambos procedimientos son muy conocidos en la materia. Resumiendo, filtros con colonias bacterianas que contienen la librería en pBluescript o céspedes bacterianos que contienen placas lambda se desnaturalizan, y el ADN se fija a los filtros. Los filtros se hibridan con la sonda marcada usando condiciones de hibridación descritas por Davis y col., 1986. Las secuencias parciales, clonadas en lambda o pBluescript, se pueden usar como controles positivos para valorar la unión de fondo y ajustar las condiciones restrictivas de hibridación y lavado necesarias para una identificación precisa del clon. Los autorradiogramas resultantes se comparan con placas de colonias o placas duplicadas; cada punto expuesto corresponde a una colonia o placa positiva. Las colonias o las placas se seleccionan, se expanden y el ADN se aísla de las colonias para su análisis posterior y su secuenciación.
Los clones de ADNc positivo se analizan para determinar la cantidad de secuencia adicional que contienen usando PCR con un cebador de la secuencia parcial y el otro cebador del vector. Los clones con un producto de la PCR insertado en el vector más grande que la secuencia parcial original se analizan por digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN para determinar si contienen un inserto del mismo tamaño o de un tamaño similar que el tamaño del ARNm determinado en el análisis de transferencia Northern.
Una vez identificados uno o más clones de ADNc que se solapan, la secuencia completa de los clones se puede determinar, por ejemplo, después de digerir con exonucleasa III (McCombie y col., Methods 3, 33-40, 1991). Se generan una serie de clones de deleción, cada uno de los cuales se secuencia. Las secuencias resultantes que se solapan se ensamblan en una única secuencia contigua de alta redundancia (normalmente de tres a cinco secuencias que se solapan en cada posición del nucleótido), dando como resultado una secuencia final muy exacta.
Se pueden usar diversos procedimientos basados en la PCR para extender las secuencias de ácidos nucleicos descritas en el presente documento para detectar secuencias corriente arriba, tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, la PCR del sitio de restricción usa cebadores universales para recuperar una secuencia desconocida adyacente a un locus conocido (Sarkar, PCR Methods Applic. 2, 318-322, 1993). El ADN genómico primero se amplifica en presencia de un cebador para una secuencia enlazadora y un cebador específico para la región conocida. A continuación las secuencias amplificadas se someten a una segunda ronda de PCR con el mismo cebador enlazador y otro cebador interno específico para el primero. Los productos de cada ronda de la PCR se transcriben con una ARN polimerasa apropiada y se secuencian usando la transcriptasa inversa.
También se puede usar PCR inversa para amplificar o extender las secuencias usando cebadores divergentes basados en una región conocida (Triglia y col., Nucleic Acids Res. 16, 8186, 1988). Los cebadores se pueden diseñar usando software disponible comercialmente, tal como OLIGO 4.06 Primer Analysis software (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), para que tengan una longitud de 22-30 nucleótidos, para que tengan un contenido en GC del 50% o superior, y para que se hibriden a la secuencia diana a temperaturas de 68-72ºC aproximadamente. El procedimiento usa varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en la región conocida de un gen. A continuación el fragmento se circulariza por ligación intramolecular y se usa como molde de la PCR.
Otro procedimiento que se puede usar es PCR de captura, que supone la amplificación por PCR de fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida en ADN del cromosoma humano y artificial de levadura (Lagerstrom y col., PCR Methods Applic. 1, 111-119, 1991). En este procedimiento, también se pueden usar múltiples digestiones y ligaciones con enzimas de restricción para situar una secuencia de doble cadena fabricada por ingeniería genética en un fragmento desconocido de la molécula de ADN antes de llevar a cabo la PCR.
Otro procedimiento que se puede usar para recuperar secuencias desconocidas es el de Parker y col., Nucleic Acids Res. 19, 3055-3060, 1991). Adicionalmente, se puede usar PCR, cebadores anidados, y librerías PROMOTERFINDER (CLONTECH, Palo Alto, Calif.) para paseos de ADN genómico (DNA walk) (CLONTECH, Palo Alto, Calif.). Este proceso evita la necesidad de seleccionar librerías y es útil para encontrar uniones de intrones/exones.
Cuando se seleccionan ADNc de longitud completa, es preferible usar librerías que hayan sido seleccionadas por tamaño para incluir ADNc más grandes. Son preferibles librerías cebadas aleatoriamente, puesto que contendrán más secuencias que contienen las regiones 5' de los genes. El uso de una librería cebada aleatoriamente puede ser especialmente preferible para situaciones en las que una librería de oligo d(T) no produce un ADNc de longitud completa. Las librerías genómicas pueden ser útiles para la extensión de la secuencia en regiones reguladoras en 5' no transcritas.
Se pueden usar sistemas de electroforesis capilar disponibles comercialmente para analizar el tamaño o confirmar la secuencia de nucleótidos de la PCR o los productos de secuenciación. Por ejemplo, se puede emplear secuenciación capilar con polímeros fluidos para una separación electroforética, cuatro colorantes fluorescentes diferentes (uno para cada nucleótido) que se activan con láser, y la detección de las longitudes de onda emitidas mediante un dispositivo de carga acoplado a una cámara. La intensidad de salida/luz se puede convertir en una señal eléctrica usando el software apropiado (por ejemplo, GENOTYPER y Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer), y todo el proceso desde la carga de muestras hasta el análisis por ordenador y la presentación de los datos electrónicos se pueden controlar por ordenador. La electroforesis capilar es especialmente preferible para la secuenciación de trozos pequeños de ADN que podrían estar presentes en cantidades limitadas en una muestra particular.
Obtención de los polipéptidos
Los polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 se pueden obtener, por ejemplo, mediante purificación a partir de células humanas, mediante expresión de polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, o mediante síntesis química directa.
Purificación de la proteína
Los polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 se pueden purificar a partir de cualquier célula que exprese el polipéptido, incluyendo células hospedadoras que hayan sido transfectadas con construcciones de expresión de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 purificado se separa de otros compuestos que normalmente están asociados con el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en la célula, tales como ciertas proteínas, carbohidratos, o líquidos, usando procedimientos muy conocidos en la materia. Esos procedimientos incluyen, pero no están limitados a, cromatografía de exclusión molecular, fraccionamiento con sulfato amónico, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y electroforesis preparativa en gel. Una preparación de polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 purificada es, al menos, un 80% pura; preferentemente, las preparaciones son un 90%, 95%, ó 99% puras. La pureza de las preparaciones se puede valorar mediante cualquiera de los medios conocidos en la materia, tales como electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
Expresión de los polinucleótidos
Para expresar un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, el polinucleótido se puede insertar en un vector de expresión que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Se pueden usar procedimientos que son muy conocidos por aquellos expertos en la materia para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes de los polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y los elementos de control transcripcionales y traduccionales apropiados. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Estas técnicas se divulgan, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989) y en Ausubel y col., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., 1989.
Se pueden utilizar una variedad de sistemas vectores de expresión/hospedadores para contener y expresar secuencias que codifican un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Éstos incluyen, pero no están limitados a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con bacteriófagos, plásmidos, o vectores de expresión de ADN cósmidos recombinantes; levaduras transformadas con vectores de expresión en levaduras, sistemas celulares de insecto infectados con vectores de expresión víricos (por ejemplo, baculovirus), sistemas celulares de plantas transformados con vectores de expresión víricos (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322), o sistemas celulares de animales.
Los elementos de control o las secuencias reguladoras son aquellas regiones del vector no traducidas - potenciadores, promotores, regiones sin traducir en 5' y 3' - que interaccionan con las proteínas celulares del hospedador para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Estos elementos pueden variar en su potencia y su especificidad. Dependiendo del sistema vector y del hospedador utilizados, se puede usar cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles tales como el promotor lacZ híbrido del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.) o del plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y similares. Se puede usar el promotor de la polihedrina de baculovirus en células de insecto. En el vector se pueden clonar los promotores y potenciadores procedentes de los genomas de células de planta (por ejemplo, genes de choque térmico, RUBISCO, y genes de proteínas de almacenamiento) o de virus de plantas (por ejemplo, secuencias promotoras o líder víricas). En sistemas celulares de mamífero, se prefieren los promotores de genes de mamífero o de virus de mamífero. Si fuera necesario generar una célula que contenga múltiples copias de una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, se pueden usar vectores basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado.
Sistemas de expresión en bacterias y levaduras
En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar una serie de vectores de expresión dependiendo del uso previsto para el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Por ejemplo, cuando se necesita una gran cantidad de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 para la introducción de anticuerpos, se pueden usar vectores que dirigen la expresión de altos niveles de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Esos vectores incluyen, pero no están limitados a, vectores de clonación y expresión en E. coli multifuncionales tales como BLUESCRIPT (Stratagene). En un vector BLUESCRIPT, una secuencia que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede ligar al vector en fase de lectura con secuencias para la Met amino-terminal y los 7 residuos siguientes de la \beta-galactosidasa de manera que se produce una proteína híbrida. También se pueden usar vectores pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509, 1989) o vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) Para expresar polipéptidos exógenos en forma de proteínas de fusión con glutatión-S-transferasa (GST). En general, esas proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante absorción a cuentas de glutatión-agarosa seguido por elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas preparadas en estos sistemas se pueden diseñar para incluir heparina, trombina, o sitios de escisión de proteasas del factor Xa de manera que el polipéptido de interés clonado se puede liberar del resto GST a voluntad.
En la levadura Saccharomyces cerevisiae, se pueden usar una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como el factor alfa, alcohol oxidasa, y PGH. Para unas revisiones, véase Ausubel y col. (1989) y Grant y col., Methods Enzymol. 153, 516-544, 1987.
Sistemas de expresión en plantas e insectos
Si se usan vectores de expresión en plantas, la expresión de secuencias que codifican los polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede llevar a cabo mediante cualquiera de una serie de promotores. Por ejemplo, se pueden usar promotores víricos tales como los promotores 35S y 19S de CaMV solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6, 307-311, 1987). Alternativamente, se pueden usar promotores de plantas tales como la subunidad pequeña de los promotores de RUBISCO o de las proteínas de choque térmico (Coruzzi y col., EMBO J. 3, 1671-1680, 1984; Broglie y col., Science 224, 838-843, 1984; Winter y col., Results Probl. Cell Differ. 17, 85-105, 1991). Estas construcciones se pueden introducir en células de plantas mediante transformación directa de ADN o mediante transfección mediada por patógenos. Esas técnicas se divulgan en una serie de revisiones disponibles públicamente (por ejemplo, Hobbs o Murray, en McGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, Nueva York, N.Y., pp. 191-196, 1992).
También se puede usar un sistema de insecto para expresar un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Por ejemplo, en uno de esos sistemas se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes exógenos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pueden clonar en una región no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y se pueden poner bajo el control del promotor de la polihedrina. La inserción con éxito de polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 inactivará el gen de la polihedrina y producirá un virus recombinante que carece de la proteína de cubierta. A continuación los virus recombinantes se pueden usar para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se pueden expresar polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 (Engelhard y col., Proc. Nat. Acad Sci. 91, 3224-3227, 1994).
Sistemas de expresión en mamíferos
Se pueden usar una serie de sistemas de expresión basados en virus para expresar polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en células hospedadoras de mamífero. Por ejemplo, si se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican los polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pueden ligar en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que comprende el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Se puede usar la inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma del virus para obtener un virus viable que sea capaz de expresar un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en las células hospedadoras infectadas (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad Sci. 81, 3655-3659, 1984). Si se desea, se pueden usar potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para incrementar la expresión en células hospedadoras de mamífero.
También se pueden usar cromosomas artificiales humanos (HACs) para introducir fragmentos de ADN más grandes que pueden estar contenidos y se pueden expresar en un plásmido. Los HACs de 6M a 10M se construyen y se introducen en células mediante procedimientos de introducción convencionales (por ejemplo, liposomas, polímeros aminopolicatiónicos, o vesículas).
También se pueden usar señales de iniciación específicas para conseguir una traducción más eficiente de las secuencias codificantes de los polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Esas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos en los que se insertan las secuencias que codifican un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, su codón de iniciación, y sus secuencias aguas arriba en el vector de expresión apropiado, pueden no ser necesarias señales adicionales para el control transcripcional y traduccional. No obstante, en los casos en los que sólo se inserta la secuencia codificante, o un fragmento de la misma, se deben proporcionar señales exógenas para el control traduccional (incluyendo el codón de iniciación ATG). El codón de iniciación debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción de todo el inserto. Los elementos traduccionales y los codones de iniciación exógenos pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión se puede mejorar mediante la inclusión de potenciadores que sean apropiados para el sistema celular particular usado (véase Scharf y col., Results Probl. Cell Differ. 20, 125-162, 1994).
Células hospedadoras
Una cepa de células hospedadoras se puede seleccionar por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 expresado de la forma deseada. Esas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no están limitadas a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. También se puede usar el procesamiento post-traduccional que escinde una forma "prepro" del polipéptido para facilitar la inserción, el plegamiento y/o la función correctas. Diferentes células hospedadoras que tienen una maquinaria celular específica y unos mecanismos característicos para actividades post-traduccionales (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38), están disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) y se pueden seleccionar para asegurar la purificación y el procesamiento correctos de la proteína exógena.
Se prefiere la expresión estable para la producción a largo plazo y con rendimientos elevados de las proteínas recombinantes. Por ejemplo, líneas celulares que expresan de manera estable los polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pueden transformar usando vectores de expresión que pueden contener orígenes de replicación víricos y/o elementos de expresión endógenos y un gen de un marcador seleccionable en el mismo vector o en un vector aparte. Después de la introducción del vector, se puede dejar crecer las células durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan con éxito las secuencias de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 introducidas. Los clones resistentes de células transformadas de manera estable se pueden hacer proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas al tipo celular. Véase, por ejemplo, ANIMAL CELL CULTURE, R.I. Freshney, ed., 1986.
Se puede usar cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas.
Éstos incluyen, pero no están limitados a, la timidina quinasa del herpesvirus simple (Wigler y col., Cell 11, 223-32, 1977) y la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22, 817-23, 1980), cuyos genes se pueden emplear en células tk- o aprt-, respectivamente. Además, como base para la selección se pueden usar genes de resistencia a antimetabolitos, antibióticos, o herbicidas. Por ejemplo, el dhfr confiere resistencia al metotrexato (Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567-70, 1980), el npt confiere resistencia a los aminoglicósidos, la neomicina y el G-418 (Colbere-Garapin y col., J. Mol. Biol. 150, 1-14, 1981), y el als y el pat confieren resistencia al clorsulfurón y a la fosfinotricinacetiltransferasa, respectivamente (Murray, 1992, supra). Se han descrito genes seleccionables adicionales. Por ejemplo, el trpB permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano, o el hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad Sci. 85, 8047-51, 1988). Se pueden usar marcadores visibles tales como antocianinas, \beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y la luciferasa y su sustrato la luciferina, para identificar transformantes y para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria o estable atribuible a un sistema vector específico (Rhodes y col., Methods Mol. Biol. 55, 121-131, 1995).
Detección de la expresión
Aunque la presencia de la expresión del gen marcador sugiera que también está presente el polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, puede ser necesario confirmar su presencia y su expresión. Por ejemplo, si una secuencia que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se inserta dentro de una secuencia de un gen marcador, las células transformadas que contienen las secuencias que codifican un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pueden identificar por la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, se puede poner un gen marcador en tándem con una secuencia que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 bajo el control de un solo promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o la selección normalmente indica la expresión del polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
Alternativamente, las células hospedadoras que contienen un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y que expresan un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pueden identificar mediante una variedad de procedimientos conocidos por aquellos expertos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero no están limitados a, hibridaciones de ADN-ADN o ADN-ARN y técnicas de bioensayo o inmunoensayo de proteínas que incluyen tecnologías basadas en membranas, disolución, o chips para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o la proteína. Por ejemplo, la presencia de una secuencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede detectar mediante hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN o amplificación usando sondas o fragmentos, o fragmentos de polinucleótidos que codifican un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Los ensayos basados en la amplificación de ácidos nucleicos suponen el uso de oligonucleótidos seleccionados entre secuencias que codifican un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 para detectar transformantes que contienen un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
En la materia se conocen una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, usando anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para polipéptido. Los ejemplos incluyen ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se puede usar un inmunoensayo basado en anticuerpos monoclonales de dos sitios, que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopos que no interfieren sobre un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, o se puede emplear un ensayo de unión competitivo. Éstos y otros ensayos se divulgan en Hampton y col., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minn., 1990) y Maddox y col., J. Exp. Med 158, 1211-1216, 1983).
Aquellos expertos en la materia conocen una amplia variedad de marcajes y técnicas de conjugación, y se pueden usar en diversos ensayos con ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir la hibridación con marcaje o sondas de PCR para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos que codifican polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 incluyen el oligomarcaje, la traducción por muescas, el marcaje terminal, o la amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Alternativamente, las secuencias que codifican un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pueden clonar en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Estos vectores son conocidos en la materia, están disponibles comercialmente, y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de nucleótidos marcados y una ARN-polimerasa apropiada tal como T7, T3, o SP6. Estos procedimientos se pueden llevar a cabo usando una variedad de kits disponibles comercialmente (Amersham Pharmacia Biotech, Promega, y US Biochemical). Moléculas informadoras o marcadores adecuados que se pueden usar para comodidad de la detección incluyen radionúclidos, enzimas, y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, o cromógenos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares.
Expresión y purificación de polipéptidos
Las células hospedadoras transformadas con secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pueden cultivar en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. El polipéptido producido mediante una célula transformada se puede secretar o puede estar contenido intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usados. Como entenderán aquellos expertos en la materia, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pueden diseñar para contener secuencias señal que dirigen la secreción de polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 solubles a través de la membrana celular procariota o eucariota o que dirigen la inserción en membrana del polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 unido a membrana.
Como se ha descrito anteriormente, se pueden usar otras construcciones para unir una secuencia que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio polipeptídico que facilitará la purificación de las proteínas solubles. Esos dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no están limitados a, péptidos quelantes de metales tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de la proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación por extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Para facilitar la purificación también se puede usar la inclusión de secuencias enlazadoras escindibles tales como aquéllas específicas para el Factor Xa o la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Uno de esos vectores de expresión proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y 6 residuos histidina que preceden a un sitio de escisión tiorredoxina o enteroquinasa. Los residuos histidina facilitan la purificación mediante IMAC (cromatografía de afinidad iónica con metales inmovilizados como se divulga en Porath y col., Prot. Exp. Purif. 3, 263-281, 1992), mientras que el sitio de escisión enteroquinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 de la proteína de fusión. Vectores que contienen proteínas de fusión se divulgan en Kroll y col., DNA Cell Biol. 12, 441-453, 1993.
Síntesis química
Las secuencias que codifican un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pueden sintetizar, completas o en parte, usando procedimientos químicos muy conocidos en la materia (véase Caruthers y col., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Horn y col. Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980). Alternativamente, el propio polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede producir usando procedimientos químicos para sintetizar su secuencia de aminoácidos, tales como mediante síntesis directa del péptido usando técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge y col., Science 269, 202-204, 1995). La síntesis de proteínas se puede llevar a cabo usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede conseguir, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Opcionalmente, se pueden sintetizar por separado fragmentos de polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y combinarse usando procedimientos químicos para producir una molécula de longitud completa.
El péptido recién sintetizado se puede purificar sustancialmente mediante cromatografía preparativa de líquidos de alto rendimiento (por ejemplo, Creighton, PROTEINS: STRICTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co., Nueva York, N.Y., 1983). La composición de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 sintético se puede confirmar mediante análisis o secuenciación de aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; véase Creighton, supra). Adicionalmente, se puede alterar cualquier porción de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 durante la síntesis directa y/o se pueden combinar usando procedimientos químicos con secuencias procedentes de otras proteínas para producir una variante del polipéptido o una proteína de fusión.
Producción de polipéptidos alterados
Como entenderán los expertos en la materia, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que posean codones que no son de origen natural. Por ejemplo, se pueden seleccionar codones preferidos por un hospedador procariota o eucariota particular para incrementar la tasa de expresión de proteína o para producir un transcrito de ARN con propiedades deseables, tales como una semi-vida más prolongada que la de un transcrito generado a partir de la secuencia de origen natural.
Las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento se pueden preparar por ingeniería genética usando procedimientos conocidos de forma general en la materia para alterar secuencias que codifican el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 por una variedad de razones, incluyendo, pero no limitado a, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento, y/o expresión del polipéptido o del producto del ARNm. Se puede usar la mezcla aleatoria del ADN por fragmentación aleatoria o el reensamblaje por PCR de fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos para preparar las secuencias de nucleótidos por ingeniería genética. Por ejemplo, se puede usar mutagénesis dirigida de sitio para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glicosilación, cambiar la preferencia de los codones, producir variantes de corte y empalme, introducir mutaciones, etc.
Anticuerpos
Se puede generar cualquier tipo de anticuerpo conocido en la materia para unirse específicamente a un epítopo de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. "Anticuerpo" como se usa en el presente documento incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como sus fragmentos, tales como Fab, F(ab')_{2}, y Fv, que son capaces de unirse a un epítopo de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Normalmente, son necesarios al menos 6, 8, 10, ó 12 aminoácidos contiguos para formar un epítopo. No obstante, epítopos que incluyen aminoácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo, al menos 15, 25, ó 50 aminoácidos.
Un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede usar terapéuticamente, así como en ensayos inmunoquímicos, tales como transferencias de Western, ELISAs, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos, inmunoprecipitaciones, u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en la materia. Se pueden usar diversos inmunoensayos para identificar anticuerpos con la especificidad deseada. Son muy conocidos en la materia numerosos protocolos para ensayos de unión competitivos o ensayos inmunorradiométricos. Esos inmunoensayos normalmente implican la medición de la formación del complejo entre un inmunógeno y un anticuerpo que se une específicamente al inmunógeno.
Normalmente, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 proporciona una señal de detección de al menos 5, 10, ó 20 veces superior a una señal de detección proporcionada con otras proteínas cuando se usa un ensayo inmunoquímico. Preferentemente, anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en disolución.
Los polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 se pueden usar para inmunizar a un mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, cobaya, mono, o ser humano, para producir anticuerpos policlonales. Si se desea, un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede conjugar a una proteína transportadora, tal como seroalbúmina bovina, tiroglobulina, y hemocianina de lapa californiana. Dependiendo de las especies hospedadoras, se pueden usar diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica. Esos adyuvantes incluyen, pero no están limitados a, adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio), y sustancias de superficie activa (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana, y dinitrofenol). Entre los adyuvantes usados en humanos, son especialmente útiles el BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pueden preparar usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, pero no están limitadas a, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas, la técnica del hibridoma del EBV (Kohler y col., Nature 256, 495-497, 1985; Kozbor y col., J. Immunol. Methods 81, 31-42, 1985; Cote y col., Proc. Natl. Acad Sci. 80, 2026-2030, 1983; Cole y col., Mol. Cell Biol. 62, 109-120, 1984).
Además, se pueden usar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el procesamiento alternativo de genes de anticuerpos de ratón a genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con la especificidad antigénica y la actividad biológica apropiadas (Morrison y col., Proc. Natl. Acad Sci. 81, 6851-6855, 1984; Neuberger y col., Nature 312, 604-608, 1984; Takeda y col., Nature 314, 452-454, 1985). También se pueden "humanizar" anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos para evitar que el paciente genere una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo cuando se usa terapéuticamente. Estos anticuerpos pueden ser suficientemente similares en secuencia a anticuerpos humanos para ser usados directamente en terapia o pueden requerir la alteración de unos pocos residuos clave. Diferencias de secuencia entre anticuerpos de roedor y secuencias humanas se pueden minimizar sustituyendo residuos que difieren de aquéllos en las secuencias humanas mediante mutagénesis dirigida de sitio de residuos individuales o injertando todas las regiones determinantes de complementaridad. Alternativamente, se pueden producir anticuerpos humanizados usando procedimientos recombinantes, como se divulga en el documento GB2188638B. Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 pueden contener sitios de unión al antígeno que están parcial o completamente humanizados, como se divulga en el documento de EE.UU. 5.565.332.
Alternativamente, se pueden adaptar técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla usando procedimientos conocidos en la materia para producir anticuerpos de cadena sencilla que se unen específicamente a polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Anticuerpos con especificidad relacionada, pero de diferente composición ideotípica, se pueden generar mediante mezcla aleatoria de la cadena de librerías de inmunoglobulinas combinatorias aleatorias (Burton, Proc. Natl. Acad Sci. 88,11120-23, 1991).
También se pueden construir anticuerpos de cadena sencilla usando un procedimiento de amplificación de ADN, tal como PCR, usando ADNc de hibridoma como molde (Thirion y col., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11). Los anticuerpos de cadena sencilla pueden ser mono- o biespecíficos, y pueden ser bivalentes o tetravalentes. La construcción de anticuerpos biespecíficos tetravalentes de cadena sencilla se enseña, por ejemplo, en Coloma & Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159-63. La construcción de anticuerpos biespecíficos bivalentes de cadena sencilla se enseña en Mallender & Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199-206.
Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de cadena sencilla se puede construir usando síntesis de nucleótidos manual o automatizada, se puede clonar en una construcción de expresión usando procedimientos de ADN recombinante habituales, y se puede introducir en una célula para expresar la secuencia codificante, como se divulga a continuación. Alternativamente, los anticuerpos de cadena sencilla se pueden producir directamente usando, por ejemplo, tecnología de fagos filamentosos (Verhaar y col., 1995, Int. J. Cancer 61, 497-501; Nicholls y col., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91).
Los anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 también se pueden producir induciendo la producción in vivo en la población linfocítica o seleccionando librerías de inmunoglobulinas o paneles de reactivos de unión altamente específicos como se divulga en la bibliografía (Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833-3837, 1989; Winter y col., Nature 349, 293-299, 1991).
Se pueden construir otros tipos de anticuerpos y se pueden usar terapéuticamente en procedimientos de la invención. Por ejemplo, se pueden construir anticuerpos quiméricos como se divulga en el documento WO 93/03151. También se pueden preparar proteínas de unión que proceden de inmunoglobulinas y que son multivalentes y multiespecíficas, tales como los "diacuerpos" descritos en el documento WO 94/13804.
Los anticuerpos descritos se pueden purificar mediante procedimientos muy conocidos en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden purificar por afinidad mediante el paso a través de una columna a la que está unida el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. A continuación los anticuerpos unidos se pueden eluir de la columna usando un tampón con una concentración salina elevada.
Oligonucleótidos antisentido
Los oligonucleótidos antisentido descritos son secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de ADN o ARN específica. Una vez introducida en una célula, los nucleótidos complementarios se combinan con secuencias naturales producidas por la célula para formar complejos y bloquear la transcripción o la traducción. Preferentemente, un oligonucleótido antisentido tiene una longitud de al menos 11 nucleótidos, pero puede tener una longitud de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ó 50 o más nucleótidos. También se pueden usar secuencias más largas. Se pueden proporcionar moléculas de oligonucleótidos antisentido en una construcción de ADN y se pueden introducir en una célula como se ha descrito anteriormente para reducir el nivel de productos génicos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en la célula.
Los oligonucleótidos antisentido pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, o una combinación de ambos. Los oligonucleótidos se pueden sintetizar manualmente o mediante un sintetizador automatizado, uniendo covalentemente el extremo 5' de un nucleótido con el extremo 3' de otro nucleótido con enlaces internucleótidos no fosfodiéster tales como alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, ésteres fosfato, carbamatos, acetamida, carboximetil ésteres, carbonatos, y triésteres fosfato. Véase, Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 1-8, 1994; Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1-72, 1994; Uhlmann y col., Chem. Rev. 90, 543-583, 1990.
Se pueden obtener modificaciones de la expresión del gen de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 diseñando oligonucleótidos antisentido que formarán dúplex con el control, 5', o las regiones reguladoras del gen de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Se prefieren los oligonucleótidos procedentes del sitio de iniciación de la transcripción, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 del sitio de inicio. De manera similar, se puede conseguir la inhibición usando la metodología de apareamiento de bases de "triple hélice". El apareamiento de triple hélice es útil debido a que provoca la inhibición de la capacidad de la doble hélice para abrirse suficientemente para la unión de polimerasas, factores de transcripción, o chaperonas. Avances terapéuticos usando ADN de triple hélice han sido descritos en la bibliografía (por ejemplo, Gee y col., en Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC
APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., 1994). También se puede diseñar un oligonucleótido antisentido para bloquear la traducción del ARNm evitando que el transcrito se una a los ribosomas.
No es necesaria una complementaridad exacta para la formación con éxito del complejo entre un oligonucleótido antisentido y la secuencia complementaria de un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Oligonucleótidos antisentido que comprenden, por ejemplo, 2, 3, 4, ó 5 o más tramos de nucleótidos contiguos que son complementarios de forma exacta a un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, cada uno separado por un tramo de nucleótidos contiguos que no son complementarios a nucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 adyacentes, pueden proporcionar una especificidad de localización suficiente para el ARNm de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Preferentemente, cada tramo de nucleótidos contiguos complementarios tiene una longitud de al menos 4, 5, 6, 7, ó 8 o más nucleótidos. Las secuencias implicadas no complementarias tienen una longitud de 1, 2, 3, ó 4 nucleótidos preferentemente. Alguien experto en la materia puede usar fácilmente el punto de fusión calculado de un par antisentido-sentido para determinar el grado de desapareamiento que será tolerable entre un oligonucleótido antisentido particular y una secuencia de un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 particular.
Los oligonucleótidos antisentido se pueden modificar sin afectar a su capacidad para hibridarse a un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Estas modificaciones pueden ser internas o en uno o ambos extremos de la molécula antisentido. Por ejemplo, los enlaces fosfato internucleósidos se pueden modificar añadiendo restos colesterilo o diamina con números variables de residuos carbono entre los grupos amino y la ribosa terminal. También se pueden emplear bases y/o azúcares modificados, tales como arabinosa en lugar de ribosa, o un oligonucleótido sustituido en 3' ó 5', en el que el grupo hidroxilo en 3' o el grupo fosfato en 5' se sustituyen, en un oligonucleótido antisentido modificado. Estos oligonucleótidos modificados se pueden preparar mediante procedimientos muy conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Agrawal y col., Trends Biotechnol. 10, 152-158, 1992; Uhlmann y col., Chem. Rev. 90, 543-584, 1990; Uhlmann y col., Tetrahedron. Lett. 215, 3539-3542, 1987.
Ribozimas
Las ribozimas son moléculas de ARN con actividad catalítica. Véase, por ejemplo, Cech, Science 236, 1532-1539; 1987; Cech, Ann. Rev. Biochem. 59, 543-568; 1990, Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 605-609; 1992, Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510-515, 1996. Las ribozimas se pueden usar para inhibir la función de un gen escindiendo una secuencia de ARN, como es conocido en la materia (por ejemplo, Haseloff y col., patente de EE.UU. 5.641.673). El mecanismo de acción de la ribozima supone una hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima al ARN diana complementario, seguido por una escisión endonucleolítica. Ejemplos incluyen moléculas de ribozimas con el motivo de cabeza de martillo preparado por ingeniería genética que catalizan específica y eficazmente la escisión endonucleolítica de secuencias de nucleótidos específicas.
Se puede usar la secuencia codificante de un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 para generar ribozimas que se unen específicamente a ARNm transcrito del polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Se han desarrollado procedimientos de diseño y construcción de ribozimas que pueden escindir otras moléculas de ARN en trans de una forma altamente específica de secuencia y se han descrito en la materia (véase, Haseloff y col. Nature 334, 585-591, 1988). Por ejemplo, la actividad de escisión de las ribozimas se puede dirigir a ARNs específicos modificando por ingeniería genética una región de "hibridación" discreta en la ribozima. La región de hibridación contiene una secuencia complementaria al ARN diana y así se hibrida específicamente con la diana (véase, por ejemplo, Gerlach y col., EP 321.201).
Los sitios de escisión específicos de ribozimas dentro de un ARN diana de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pueden identificar escaneando la molécula diana para sitios de escisión de ribozimas que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU, y GUC. Una vez identificados, se pueden evaluar secuencias cortas de ARN de entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del ARN diana que contiene el sitio de escisión para características estructurales secundarias que puedan hacer la diana inoperable. La conveniencia de ARN dianas candidatos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 también se puede evaluar probando la accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios usando ensayos de protección de ribonucleasas. Se pueden usar secuencias complementarias más largas para incrementar la afinidad de la secuencia de hibridación por la diana. Las regiones de hibridación y escisión de la ribozima pueden estar relacionadas integralmente de manera que tras la hibridación al ARN diana a través de las regiones complementarias, la región catalítica de la ribozima puede escindir la diana.
Las ribozimas se pueden introducir en células como parte de una construcción de ADN. Se pueden usar procedimientos mecánicos, tales como microinyección, transfección mediada por liposomas, electroporación, o precipitación con fosfato de calcio, para introducir una construcción de ADN que contiene ribozimas en células en las que se desea reducir la expresión de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Alternativamente, si se desea que las células retengan de manera estable la construcción de ADN, la construcción se puede suministrar en un plásmido y se puede mantener como un elemento separado o integrado en el genoma de las células, como es conocido en la materia. Una construcción de ADN que codifica ribozimas puede incluir elementos reguladores transcripcionales, tales como un elemento promotor, un elemento potenciador o un elemento UAS, y una señal terminadora de la transcripción, para controlar la transcripción de ribozimas en las células.
Como se enseña en Haseloff y col., patente de EE.UU. 5.641.673, las ribozimas se pueden modificar por ingeniería genética de manera que la expresión de ribozimas ocurrirá en respuesta a factores que inducen la expresión de un gen diana. Las ribozimas también se pueden modificar por ingeniería genética para proporcionar un nivel de regulación adicional, de manera que la destrucción del ARNm sólo se produce cuando se inducen en las células tanto la ribozima como un gen diana.
Genes expresados de manera diferencial
En el presente documento se divulgan procedimientos para la identificación de genes cuyos productos interaccionan con la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1. Tales genes pueden representar genes que se expresan de manera diferencial en trastornos incluyendo, pero no limitado a, cáncer, trastornos del sistema nervioso central y periférico, trastornos genitourinarios, trastornos cardiovasculares, y COPD. Además, estos genes pueden representar genes que se regulan de manera diferencial en respuesta a manipulaciones pertinentes a la progresión o el tratamiento de estas enfermedades. Adicionalmente, estos genes pueden tener una expresión modulada temporalmente, incrementada o reducida en fases diferentes del desarrollo del tejido o del organismo. Un gen expresado de manera diferencial también puede tener su expresión modulada en condiciones de control frente a condiciones experimentales. Además, el propio gen o el producto génico de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede probar para la expresión diferencial.
El grado en el que la expresión difiere en un estado normal frente a un estado patológico sólo requiere ser suficientemente grande para ser visualizado mediante técnicas de caracterización habituales tales como técnicas de presentación diferencial. Otras de esas técnicas de caracterización habituales mediante las que se pueden visualizar diferencias en la expresión incluyen, pero no están limitadas a, RT cuantitativa (transcriptasa inversa), PCR, y análisis de transferencia de Northern.
Identificación de genes expresados de manera diferencial
Para identificar genes expresados de manera diferencial se aísla el ARN total o, preferentemente, el ARNm de los tejidos de interés. Por ejemplo, se obtienen muestras de ARN de tejidos de sujetos experimentales y de los tejidos correspondientes de sujetos control. Para la purificación de esas muestras de ARN se puede utilizar cualquier técnica de aislamiento de ARN que no seleccione contra el aislamiento de ARN. Véase, por ejemplo, Ausubel y col., ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, 1987-1993. Se puede procesar fácilmente un gran número de muestras de tejido usando técnicas muy conocidas por aquellos expertos en la materia, tales como, por ejemplo, el procedimiento de aislamiento de ARN en una sola etapa de Chomczynski, patente de EE.UU. 4.843.155.
Los transcritos dentro de las muestras de ARN recogidas que representan ARN producido por genes expresados de manera diferencial se identifican mediante procedimientos muy conocidos por aquellos expertos en la materia. Éstos incluyen, por ejemplo, selección diferencial (Tedder y col., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 85, 208-12, 1988), hibridación sustractiva (Hedrick y col., Nature 308, 149-53; Lee y col., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 88, 2825, 1984), y, preferentemente, presentación diferencial (Liang & Pardee, Science 257, 967-71, 1992; patente de EE.UU. 5.262.311).
La información de la expresión diferencial puede, por sí misma, sugerir procedimientos relevantes para el tratamiento de trastornos que implican a la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1. Por ejemplo, el tratamiento puede incluir una modulación de la expresión de los genes expresados de manera diferencial y/o del gen que codifica la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1. La información de la expresión diferencial puede indicar si la expresión o la actividad del gen o del producto génico expresado de manera diferencial o el gen o el producto génico de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 son regulados hacia arriba o regulados hacia abajo.
Procedimientos de selección
Se divulgan ensayos para la selección de compuestos de prueba que se unen a o modulan la actividad de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 o un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Un compuesto de prueba preferentemente se une a un polipéptido o un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Más preferentemente, un compuesto de prueba reduce o incrementa la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en al menos un 10 aproximadamente, preferentemente un 50 aproximadamente, más preferentemente un 75, 90, ó 100% aproximadamente en relación a la ausencia del compuesto de prueba.
Compuestos de prueba
Los compuestos de prueba pueden ser agentes farmacológicos ya conocidos en la materia o pueden ser compuestos que se desconoce previamente que tienen alguna actividad farmacológica. Los compuestos pueden ser de origen natural o estar diseñados en laboratorio. Se pueden aislar de microorganismos, animales, o plantas, y se pueden producir de manera recombinante, o se pueden sintetizar mediante procedimientos químicos conocidos en la materia. Si se desea, los compuestos de prueba se pueden obtener usando cualquiera de los numerosos procedimientos combinatorios de librerías conocidos en la materia, incluyendo, pero no limitado a, librerías biológicas, librerías en fase líquida o en fase sólida paralelas direccionales espacialmente, procedimientos de librerías sintéticas que requieren desconvolución, el procedimiento de la librería "una cuenta-un compuesto", y procedimientos de librerías sintéticas que usan la selección por cromatografía de afinidad. La aproximación de librerías biológicas está limitada a librerías de polipéptidos, mientras que las otras cuatro aproximaciones son aplicables a polipéptidos, oligómeros no peptídicos, o librerías de compuestos de moléculas pequeñas. Véase, Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997.
Los procedimientos para la síntesis de librerías moleculares son muy conocidos en la materia (véase, por ejemplo, DeWitt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb y col. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann y col., J. Med Chem. 37, 2678, 1994; Cho y col., Science 261, 1303, 1993; Carell y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell y col., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 33, 2061; Gallop y col., J. Med Chem. 37, 1233, 1994). Las librerías de compuestos se pueden presentar en disolución (véase, por ejemplo, Houghten, BioTechniques 13, 412-421, 1992), o en cuentas (Lam, Nature 354, 82-84, 1991), chips (Fodor, Nature 364, 555-556, 1993), bacterias o esporas (Ladner, patente de EE.UU. 5.223.409), plásmidos (Cull y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1865-1869, 1992), o fagos (Scott & Smith, Science 249, 386-390, 1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990); Cwirla y col., Proc. Natl. Acad Sci. 97, 6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; y Ladner, patente de EE.UU. 5.223.409).
Selección de alto rendimiento
Los compuestos de prueba se pueden seleccionar por la capacidad para unirse a los polipéptidos o los polinucleótidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 o la expresión del gen de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 usando selección de alto rendimiento. Usando selección de alto rendimiento, se pueden probar en paralelo muchos compuestos discretos de manera que se puede seleccionar rápidamente un gran número de compuestos de prueba. Las técnicas establecidas de manera generalizada utilizan placas de microtitulación de 96 pocillos. Los pocillos de las placas de microtitulación normalmente requieren volúmenes de ensayo que abarcan entre 50 y 500 \mul. Además de las placas, están disponibles comercialmente muchos instrumentos, materiales, pipetas, elementos robóticos, lavadores de placas y lectores de placas que se ajustan al formato de 96 pocillos.
Alternativamente, se pueden usar "ensayos de formato libre", o ensayos que no presentan barreras físicas entre las muestras. Por ejemplo, un ensayo que usa células de pigmento (melanocitos) en un ensayo simple homogéneo para librerías peptídicas combinatorias es el descrito por Jayawickreme y col., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 19, 1614-18 (1994). Las células se ponen en placas Petri con agarosa, y a continuación se ponen sobre la superficie de agarosa cuentas que llevan los compuestos combinatorios. Los compuestos combinatorios son parcialmente liberados de las cuentas. Los compuestos activos se pueden visualizar en forma de áreas de pigmento oscuras debido a que, puesto que los com-
puestos se difunden localmente en la matriz del gel, los compuestos activos provocan que las células cambien de color.
Otro ejemplo de ensayo en formato libre es el descrito por Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches", presentado en la First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening en Philadelphia, Pa. (7-10 Nov., 1995). Chelsky puso un ensayo enzimático homogéneo simple para anhidrasa carbónica en el interior de un gel de agarosa de manera que la enzima en el gel provocaría un cambio de color en todo el gel. Después de eso, cuentas que llevan compuestos combinatorios a través de un fotoenlazador se colocaron dentro del gel y los compuestos fueron parcialmente liberados mediante luz UV. Los compuestos que inhibían la enzima se observaban como zonas de inhibición locales con menos cambio de color.
Otro ejemplo más es el descrito por Salmon y col., Molecular Diversity 2, 57-63 (1996). En este ejemplo, se seleccionaron librerías combinatorias para compuestos que tenían efectos citotóxicos sobre células cancerígenas que crecen en agar.
Otro procedimiento de selección de alto rendimiento es el descrito en Beutel y col., patente de EE.UU. 5.976.813. En este procedimiento, las muestras de prueba se pusieron en una matriz porosa. A continuación se pusieron uno o más componentes de ensayo dentro, en la parte superior, o en la parte inferior de una matriz, tal como un gel, una lámina de plástico, un filtro, u otra forma de soporte sólido fácilmente manipulable. Cuando las muestras se introducen en la matriz porosa difunden suficientemente despacio, de manera que los ensayos se pueden realizar sin correr juntas las muestras de prueba.
Ensayos de unión
Para los ensayos de unión, el compuesto de prueba preferentemente es una molécula pequeña que se une y ocupa, por ejemplo, el sitio activo del polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, de manera que se evita la actividad biológica normal. Ejemplos de esas moléculas pequeñas incluyen, pero no están limitadas a, péptidos o moléculas de tipo peptídico pequeñas.
En los ensayos de unión, el compuesto de prueba o el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 pueden comprender un marcaje detectable, tal como un marcaje fluorescente, radioisotópico, quimioluminiscente, o enzimático, tal como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, o luciferasa. La detección de un compuesto de prueba que está unido a un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede conseguir a continuación, por ejemplo, mediante contaje directo de la radioemisión, contaje de centelleo, o determinando la conversión de un sustrato apropiado a un producto detectable.
Alternativamente, la unión de un compuesto de prueba a un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede determinar sin el marcaje de ninguno de los implicados. Por ejemplo, se puede usar un microfisiómetro para detectar la unión de un compuesto de prueba con un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Un microfisiómetro (por ejemplo, Cytosensor^{TM}) es un instrumento analítico que mide la velocidad a la que una célula acidifica su entorno usando un sensor potenciómetro direccionable por luz (LAPS). Los cambios en esta velocidad de acidificación se pueden usar como indicador de la interacción entre un compuesto de prueba y un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 (McConnell y col., Science 257, 1906-1912, 1992).
La determinación de la capacidad de un compuesto de prueba para unirse a un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 también se puede conseguir usando una tecnología tal como análisis de interacción bimolecular (BIA) en tiempo real (Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338-2345, 1991, y Szabo y col., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705, 1995). El BIA es una tecnología para el estudio de interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin el marcaje de los implicados (por ejemplo, BIAcore^{TM}). Se pueden usar los cambios en el fenómeno óptico de la resonancia de plasmón superficial (SPR) como indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.
Se puede usar un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 como "proteína cebo" en un ensayo de dos híbridos o en un ensayo de tres híbridos (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.283.317; Zervos y col., Cell 72, 223-232,1993; Madura y col., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel y col., BioTechniques 14, 920-924, 1993; Iwabuchi y col., Oncogene 8, 1693-1696, 1993; y Brent, documento W094/10300), para identificar otras proteínas que se unen o interaccionan con el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y modulan su actividad.
El sistema de dos híbridos se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que constan de dominios de unión de ADN y de activación separables. Resumiendo, el ensayo utiliza dos construcciones de ADN diferentes. Por ejemplo, en una construcción, el polinucleótido que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede fusionar a un polinucleótido que codifica el dominio de unión de ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En la otra construcción, una secuencia de ADN que codifica una proteína sin identificar ("presa" o "muestra") se puede fusionar a un polinucleótido que codifica el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas "cebo" y "presa" son capaces de interaccionar in vivo para formar un complejo que depende de la proteína, los dominios de unión de ADN y de activación del factor de transcripción se ponen muy próximos. Esta proximidad permite la transcripción de un gen informador (por ejemplo, LacZ), que está unido de manera operable a un sitio regulador de la transcripción sensible al factor de transcripción. La expresión del gen informador se puede detectar, y las colonias celulares que contienen el factor de transcripción funcional se pueden aislar y se pueden usar para obtener la secuencia de ADN que codifica la proteína que interacciona con el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
Puede ser deseable inmovilizar el polipéptido (o el polinucleótido) de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 o el compuesto de prueba para facilitar la separación de las formas unidas de las no unidas de uno o de ambos implicados, así como para acomodar la automatización del ensayo. Así, el polipéptido (o el polinucleótido) de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 o el compuesto de prueba pueden estar unidos a un soporte sólido. Los soportes sólidos adecuados incluyen, pero no están limitados a, portaobjetos de vidrio o de plástico, placas de cultivos tisulares, pocillos de microtitulación, tubos, chips de silicio, o partículas tales como cuentas (incluyendo, pero no limitado a, cuentas de látex, poliestireno, o vidrio). Se puede usar cualquier procedimiento conocido en la materia para unir el polipéptido (o el polinucleótido) enzimático o el compuesto de prueba a un soporte sólido, incluyendo el uso de enlaces covalentes y no covalentes, absorción pasiva, o pares de restos de unión unidos respectivamente al polipéptido (o al polinucleótido) o al compuesto de prueba y el soporte sólido. Los compuestos de prueba preferentemente están unidos al soporte sólido en un biochip, de manera que se puede rastrear la localización de los compuestos de prueba individuales. La unión de un compuesto de prueba a un polipéptido (o un polinucleótido) de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede conseguir en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de estos recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga.
Se divulga que, el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 es una proteína de fusión que comprende un dominio que permite que el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 esté unido a un soporte sólido. Por ejemplo, proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa se pueden adsorber sobre cuentas de glutatión-sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) o placas de microtitulación derivadas con glutatión, que a continuación se combina con el compuesto de prueba o con el compuesto de prueba y el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 no adsorbido; a continuación la mezcla se incuba en condiciones que conducen a la formación del complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para la sal y el pH). Después de la incubación, las cuentas o los pocillos de la placa de microtitulación se lavan para retirar cualquier componente no unido. La unión de los implicados se puede determinar directa o indirectamente, como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, los complejos se pueden disociar del soporte sólido antes de que se determine la unión.
También se pueden usar otras técnicas para la inmovilización de proteínas o polinucleótidos sobre un soporte sólido en los ensayos de selección de la invención. Por ejemplo, un polipéptido (o un polinucleótido) de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 o un compuesto de prueba se puede inmovilizar utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. Se pueden preparar polipéptidos (o polinucleótidos) de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 o compuestos de prueba biotinilados a partir de biotina-NHS (N-hidroxisuccinimida) usando técnicas muy conocidas en la materia (por ejemplo, un kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, III.) y se pueden inmovilizar en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, se pueden derivar anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido o un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 o un compuesto de prueba, pero que no interfieren con un sitio de unión deseado, tal como el sitio activo del polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, a los pocillos de la placa. La diana o la proteína sin unir se pueden atrapar en los pocillos mediante conjugación con anticuerpos.
Los procedimientos para la detección de esos complejos, además de aquellos descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen la inmunodetección de complejos usando anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 o al compuesto de prueba, ensayos ligados a enzimas que dependen de la detección de una actividad del polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, y electroforesis en gel de SDS en condiciones no reductoras.
La selección para compuestos de prueba que se unen a un polipéptido o un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 también se puede llevar a cabo en una célula intacta. En un sistema de ensayo basado en células se puede usar cualquier célula que comprenda un polipéptido o un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede producir de forma natural en la célula o se puede introducir usando técnicas tales como aquellas descritas anteriormente. La unión del compuesto de prueba a un polipéptido o un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se determina como se ha descrito anteriormente.
Ensayos enzimáticos
Los compuestos de prueba se pueden probar por su capacidad para incrementar o reducir la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1. La actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede medir, por ejemplo, como se divulga en Nakanishi y col., Genes Cells 2000 Oct.; 5(10):839-47; Fattaey & Booher, Prog Cell Cycle Res 1997; 3:233-40; o Den Haese y col., Mol Biol Cell 1995 Abr., 6(4):371-85.
Los ensayos enzimáticos se pueden llevar a cabo después de poner en contacto un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 purificado, una preparación de membrana celular, o una célula intacta con un compuesto de prueba. Un compuesto de prueba que reduce la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en al menos el 10% aproximadamente, preferentemente el 50% aproximadamente, más preferentemente el 75, 90, ó 100% aproximadamente se identifica como agente terapéutico potencial para reducir la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Un compuesto de prueba que incrementa la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en al menos el 10% aproximadamente, preferentemente el 50% aproximadamente, más preferentemente el 75, 90, ó 100% aproximadamente se identifica como agente terapéutico potencial para incrementar la actividad de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1.
Expresión génica
Se divulgan compuestos de prueba que incrementan o reducen la expresión génica de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se pone en contacto con un compuesto de prueba, y se determina la expresión de ARN o un producto polipeptídico del polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. El nivel de expresión de ARNm o del polipéptido apropiado en presencia del compuesto de prueba se compara con el nivel de expresión de ARNm o del polipéptido en ausencia del compuesto de prueba. A continuación el compuesto de prueba se puede identificar como modulador de la expresión basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de ARNm o del polipéptido es superior en presencia del compuesto de prueba que en su ausencia, el compuesto de prueba se identifica como estimulador o potenciador de la expresión de ARNm o del polipéptido. Alternativamente, cuando la expresión de ARNm o del polipéptido es inferior en presencia del compuesto de prueba que en su ausencia, el compuesto de prueba se identifica como inhibidor de la expresión de ARNm o del polipéptido.
El nivel de expresión de ARNm o del polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en las células se puede determinar mediante procedimientos muy conocidos en la materia para la detección de ARNm o del polipéptido. Se puede usar cualquiera de los dos procedimientos cualitativos o cuantitativos. La presencia de productos polipeptídicos de un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede determinar, por ejemplo, usando una variedad de técnicas conocidas en la materia, incluyendo procedimientos inmunoquímicos tales como radioinmunoensayo, transferencia de Western, e inmunohistoquímica. Alternativamente, la síntesis del polipéptido se puede determinar in vivo, en un cultivo celular, o en un sistema de traducción in vitro detectando la incorporación de aminoácidos marcados a un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
Esa selección se puede llevar a cabo en un sistema de ensayo libre de células o en una célula intacta. En un sistema de ensayo basado en células se puede usar cualquier célula que exprese un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. El polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede producir de manera natural en la célula o se puede introducir usando técnicas tales como aquellas descritas anteriormente. Se pueden usar cualquiera de los dos de un cultivo primario o de una línea celular establecida, tal como CHO o células 293 de riñón embrionario humano.
Composiciones farmacéuticas
Se divulgan composiciones farmacéuticas que se pueden administrar a un paciente para conseguir un efecto terapéutico. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, un polinucleótido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, ribozimas u oligonucleótidos antisentido, anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, o compuestos miméticos, activadores, o inhibidores de la actividad de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. Las composiciones se pueden administrar solas o en combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, que se puede administrar en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible estéril, incluyendo, pero no limitado a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, y agua. Las composiciones se pueden administrar a un paciente solas, o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.
Además de los principios activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y agentes auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante cualquiera de una serie de vías incluyendo, pero no limitado a, vía oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, parenteral, tópica, sublingual, o rectal. Las composiciones farmacéuticas para la administración por vía oral se pueden formular usando vehículos farmacéuticamente aceptables muy conocidos en la materia en dosificaciones adecuadas para la administración por vía oral. Esos vehículos permiten formular las composiciones farmacéuticas en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, mezclas, suspensiones, y similares, para la ingestión por parte del paciente.
Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener mediante la combinación de compuestos activos con excipientes sólidos, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir agentes auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son carbohidratos o agentes de relleno de proteínas, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; fécula de maíz, trigo, arroz, patata, u otras plantas; celulosa, tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o carboximetilcelulosa sódica; gomas incluyendo goma arábiga y tragacanto; y proteínas tales como gelatina y colágeno. Si se desea, se pueden añadir agentes desagregantes o solubilizantes, tales como polivinilpirrolidona entrecruzada, agar, ácido algínico, o una de sus sales, tal como alginato sódico.
Los núcleos de grageas se pueden usar junto con recubrimientos adecuados, tales como disoluciones concentradas de azúcares, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, disoluciones lacadas, y disolventes orgánicos o mezclas disolventes adecuadas. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los recubrimientos de los comprimidos o las grageas para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, la dosificación.
Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar oralmente incluyen cápsulas encajadas por presión hechas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un recubrimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener principios activos mezclados con un agente de relleno o aglutinantes, tales como lactosa o féculas, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como ácidos grasos, líquidos, o polietilenglicol líquido con o sin estabilizantes.
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración por vía parenteral se pueden formular en disoluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hank, disolución de Ringer, o solución salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones para inyección acuosa pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos en forma de suspensiones oleosas para inyección apropiadas. Disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen ácidos grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. También se pueden usar para la administración aminopolímeros policatiónicos no lipídicos. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones muy concentradas. Para la administración por vía tópica o nasal, en la formulación se usan agentes penetrantes apropiados para la barrera particular a permear. Esos agentes penetrantes se conocen de manera general en la materia.
Las composiciones farmacéuticas se pueden fabricar de una manera conocida en la materia, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, formación de grageas, molienda en seco, emulsión, encapsulación, atrapamiento, o liofilización. La composición farmacéutica se puede suministrar en forma de sal o se puede formar con muchos ácidos, incluyendo pero no limitado a, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros disolventes orgánicos de lo que lo son las formas de base libre correspondientes. En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado que puede contener algunos o todos de lo siguiente: histidina 1-50 mM, sacarosa al 0,1%-2%, y manitol al 2-7%, a un intervalo de pH de 4,5 a 5,5, que se combina con un tampón antes de su uso.
Detalles adicionales sobre técnicas para la formulación y administración se pueden encontrar en la última edición de REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack Publishing Co., Easton, Pa.). Después de preparar las composiciones farmacéuticas, se pueden poner en un contenedor apropiado y se pueden etiquetar para el tratamiento de una dolencia indicada. Ese etiquetado incluirá la cantidad, frecuencia, y modo de administración.
Indicaciones y procedimientos terapéuticos
La serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 se puede regular para tratar el cáncer, trastornos del sistema nervioso central y periférico, trastornos genitourinarios, trastornos cardiovasculares y COPD.
Cáncer
El cáncer es una enfermedad causada fundamentalmente por la transformación celular oncogénica. Existen varias marcas de contraste de células transformadas que las distinguen de sus homólogas normales y que son la causa subyacente de la patofisiología del cáncer. Éstas incluyen la proliferación celular incontrolada, la falta de respuesta a señales de inducción de muerte celular normal (inmortalización), movilidad y capacidad de invasión celular incrementadas, capacidad incrementada para reclutar el suministro de sangre mediante la inducción de formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis), inestabilidad genética, y expresión génica desregulada. Diversas combinaciones de estas fisiologías aberrantes, junto con la adquisición de resistencia a fármacos frecuentemente conducen a un estado de enfermedad intratable en el que se produce el fallo orgánico y en último término la muerte del paciente.
La mayoría de terapias habituales contra el cáncer se centran en la proliferación celular y dependen para su eficacia de las capacidades proliferativas diferenciales entre células transformadas y células normales. Esta aproximación está dificultada por los hechos de que varios tipos celulares normales importantes también son altamente proliferativos y que las células cancerígenas frecuentemente se vuelven resistentes a estos agentes. Así, los índices terapéuticos para las terapias anticancerígenas tradicionales raramente superan el 2,0.
La llegada de la identificación de dianas moleculares por medio de la genómica ha abierto la posibilidad de identificar nuevas dianas específicas para el cáncer para una intervención terapéutica que proporcionará tratamientos más seguros y más eficaces a pacientes con cáncer. Así, genes asociados a tumores recién descubiertos y sus productos se pueden someter a pruebas para su papel(es) en la enfermedad y se pueden usar como herramientas para descubrir y desarrollar terapias innovadoras. Los genes desempeñan papeles importantes en cualquiera de los procesos fisiológicos apuntados anteriormente que se pueden caracterizar como dianas para el cáncer.
Los genes o fragmentos génicos identificados mediante la genómica se pueden expresar fácilmente en uno o más sistemas de expresión heterólogos para producir proteínas recombinantes funcionales. Estas proteínas se caracterizan in vitro a sus propiedades bioquímicas y a continuación se usan como herramientas en programas de selección molecular de alto rendimiento para identificar moduladores químicos de sus actividades bioquímicas. De esta forma se pueden identificar agonistas y/o antagonistas de la actividad de la proteína diana y posteriormente se pueden probar en modelos de enfermedad celular e in vivo para la actividad anticancerígena. La actividad de compuestos principales con el ensayo iterativo en modelos biológicos y los análisis farmacocinéticos y toxicológicos detallados forman la base para el desarrollo de fármacos y su posterior ensayo en humanos.
COPD
La enfermedad pulmonar (o de las vías aéreas) obstructiva crónica (COPD) es una dolencia definida fisiológicamente como una obstrucción de las vías aéreas que generalmente da como resultado una mezcla de enfisema y obstrucción de las vías aéreas periféricas debido a bronquitis crónica (Senior & Shapiro, Pulmonary Diseases and Disorders, 3d ed., Nueva York, McGraw-Hill, 1998, pp. 659-681, 1998; Barnes, Chest 117, 10S-14S, 2000). El enfisema se caracteriza por la destrucción de las paredes alveolares que da lugar a un agrandamiento anormal de los espacios aéreos del pulmón. La bronquitis crónica se define clínicamente como la presencia de tos productiva crónica durante tres meses en cada uno de dos años consecutivos. En la COPD, la obstrucción del flujo de aire normalmente es progresiva y sólo parcialmente reversible. El factor de riesgo más importante, de lejos, para el desarrollo de la COPD es fumar tabaco, aunque la enfermedad también se produce en no fumadores.
La inflamación crónica de las vías aéreas es una característica patología clave de la COPD (Senior & Shapiro, 1998). La población celular inflamatoria comprende un número incrementado de macrófagos, neutrófilos, y linfocitos CD8^{+}. Los irritantes inhalados, tales como el humo del tabaco, activan los macrófagos que residen en el tracto respiratorio, así como las células epiteliales que da lugar a la liberación de quimiocinas (por ejemplo, interleucina-8) y otros factores quimiotácticos. Estos factores quimiotácticos actúan para incrementar el tráfico de neutrófilos/monocitos desde la sangre al tejido pulmonar y a las vías aéreas. Los neutrófilos y monocitos reclutados en las vías aéreas pueden liberar una variedad de mediadores potencialmente dañinos tales como enzimas proteolíticas y especies de oxígeno reactivas. La degradación de la matriz y el enfisema, junto con el ensanchamiento de la pared de las vías aéreas, la disfunción tensioactiva, y la hipersecreción de moco, son todas secuelas potenciales de esta respuesta inflamatoria que dan lugar a un flujo de aire y un intercambio de gases dificultado.
Trastornos del sistema nervioso central y periférico
Los trastornos del sistema nervioso central y periférico que se pueden tratar incluyen lesiones cerebrales, enfermedades cerebrovasculares y sus consecuencias, enfermedad de Parkinson, degeneración córtico-basal, enfermedad de las neuronas motoras, demencia, incluyendo ELA, esclerosis múltiple, lesión cerebral traumática, ictus, post-ictus, lesión cerebral postraumática, y enfermedad cerebrovascular de los vasos pequeños. También se pueden tratar demencias, tales como la enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, o demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal y parkinsonismo ligado al cromosoma 17, demencias frontotemporales, incluyendo enfermedad de Pick, parálisis nuclear progresiva, degeneración córtico-basal, enfermedad de Huntington, degeneración talámica, demencia de Creutzfeldt-Jakob, demencia por VIH, esquizofrenia con demencia, y psicosis de Korsakoff. De forma similar, es posible tratar trastornos de tipo cognitivo, tales como deterioro cognitivo suave, deterioro de la memoria asociado a la edad, declive cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo vascular, trastorno de déficit de atención, trastornos de hiperactividad con déficit de atención, y alteraciones de la memoria en niños con discapacidades para el aprendizaje, regulando la actividad de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1.
También se puede tratar el dolor que está asociado a los trastornos del sistema nervioso central y periférico regulando la actividad de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1. El dolor que se puede tratar incluye el dolor asociado a trastornos del sistema nervioso central, tal como la esclerosis múltiple, lesión de médula espinal, ciática, síndrome de fracaso en la cirugía espinal lumbar, lesión cerebral traumática, epilepsia, enfermedad de Parkinson, post-ictus, y lesiones vasculares en el cerebro y la médula espinal (por ejemplo, infarto, hemorragia, malformación vascular). El dolor neuropático no central incluye aquel asociado con dolor post-mastectomía, distrofia simpática refleja (RSD), neuralgia trigeminal, radiculopatía, dolor post-quirúrgico, dolor relacionado con VIH/sida, dolor por cáncer, neuropatías metabólicas (por ejemplo, neuropatía diabética, neuropatía vasculítica secundaria a la enfermedad del tejido conectivo), polineuropatía paraneoplástica asociada, por ejemplo, a carcinoma de pulmón, o leucemia, o linfoma, o carcinoma de próstata, colon o estómago, neuralgia trigeminal, neuralgias craneales, o neuralgia postherpética. También se puede tratar el dolor asociado a cáncer y al tratamiento del cáncer, como también se puede tratar el dolor de cabeza (por ejemplo, migraña con aura, migraña sin aura, y otros trastornos con migraña), dolor de cabeza de tipo tensión episódico y crónico, dolor de cabeza similar al tipo de tensión, cefalea en racimos, y hemicrania paroximal crónica.
Trastornos cardiovasculares
Las enfermedades cardiovasculares incluyen los siguientes trastornos del corazón y del sistema vascular: fallo cardiaco congestivo, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, todos los tipos de arritmias atriales y ventriculares, enfermedades vasculares hipertensivas, y enfermedades vasculares periféricas.
El fallo cardiaco se define como un estado patofisiológico en el que una anormalidad de la función cardíaca es responsable del fallo del corazón para bombear sangre a una velocidad proporcionada a los requerimientos del tejido metabolizante. Incluye todas las formas de fallo de bombeo, tales como de alta frecuencia y baja frecuencia, agudo y crónico, de la parte derecha o de la parte izquierda, sistólico o diastólico, independiente de la causa subyacente.
El infarto de miocardio (IM) generalmente está causado por una reducción abrupta en el flujo sanguíneo coronario que sigue a una oclusión trombótica de una arteria coronaria estrechada previamente por la arterioesclerosis. Se incluye la profilaxis del IM (prevención primaria y secundaria), así como el tratamiento agudo del IM y la prevención de complicaciones.
Las enfermedades isquémicas son dolencias en las que el flujo coronario está restringido, que da como resultado una perfusión que es inadecuada para cumplir los requerimientos de oxígeno del miocardio. Este grupo de enfermedades incluye angina estable, angina inestable, e isquemia asintomática.
Las arritmias incluyen todas las formas de taquiarritmias ventriculares (taquicardia atrial, palpitación atrial, fibrilación atrial, taquicardia reentrante atrio-ventricular, síndrome de preexcitación, taquicardia ventricular, palpitación ventricular, y fibrilación ventricular), así como formas bradicárdicas de arritmias.
Las enfermedades vasculares incluyen hipertensión arterial primaria así como todos los tipos de hipertensión arterial secundaria (renal, endocrina, neurogénica, otras). El gen descrito y su producto se pueden usar como dianas para fármacos para el tratamiento de la hipertensión así como para la prevención de todas sus complicaciones. Las enfermedades vasculares periféricas se definen como enfermedades vasculares en las que se reduce el flujo arterial y/o venoso que da como resultado un desequilibrio entre el suministro de sangre y la demanda de oxígeno en el tejido. Incluye enfermedades oclusivas arteriales periféricas crónicas (PAOD), trombosis y embolias arteriales agudas, trastornos vasculares inflamatorios, fenómeno de Raynaud, y trastornos venosos.
Trastornos genitourinarios Incontinencia urinaria
La incontinencia urinaria (IU) es una pérdida involuntaria de orina. La incontinencia urinaria urgente (IUU) es uno de los tipos de IU más habituales junto con la incontinencia urinaria por tensión (IUT), que normalmente está causada por un defecto en el mecanismo de cierre de la uretra. La IUU a menudo está asociada a trastornos o enfermedades neurológicas que provocan daños neuronales, tales como demencia, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, ictus, y diabetes, aunque también se produce en individuos sin esos trastornos. Una de las causas habituales de la IUU es la vejiga súperactiva (OAB), que es una dolencia médica que se refiere a los síntomas de frecuencia y urgencia derivados de contracciones anormales e inestabilidad del músculo detrusor.
Actualmente existen en el mercado varias medicaciones para la incontinencia urinaria, principalmente para ayudar a tratar la IUU. La terapia para la OB se centra en fármacos que afectan a los mecanismos de control neurales periféricos o aquéllos que actúan directamente sobre la contracción del músculo liso detrusor de la vejiga, con un énfasis importante en el desarrollo de agentes anticolinérgicos. Estos agentes pueden inhibir los nervios parasimpáticos, que controlan el vaciado de la vejiga, o pueden ejercer un efecto espasmolítico directo sobre el músculo detrusor de la vejiga. Esto da como resultado una reducción en la presión intravesicular, un incremento en la capacidad, y una reducción en la frecuencia de contracción de la vejiga. Fármacos anticolinérgicos oralmente activos, tales como la propantelina (ProBanthine), tartrato de tolterodina (Detrol), y el oxibutinin (Ditropan), son los fármacos prescritos de manera más habitual. No obstante, sus inconvenientes más importantes son efectos secundarios inaceptables, tales como boca seca, visiones anormales, estreñimiento, y alteraciones del sistema nervioso central. Estos efectos secundarios dan lugar a un bajo cumplimiento de las dosificaciones. Los síntomas de boca seca, solos, son responsables del 70% de la tasa de no cumplimiento con oxibutinin. Las insuficiencias de las presentes terapias resalta la necesidad de nuevos fármacos eficaces y seguros disponibles comercialmente, que presenten menos efectos secundarios.
Hiperplasia prostática benigna
La hiperplasia prostática benigna (HPB) es la hiperplasia nodular benigna de la glándula prostática periuretral observada habitualmente en hombres de más de 50 años. El exceso de crecimiento se produce en el área central de la próstata denominada zona de transición, que envuelve la uretra. La HPB provoca grados variables de obstrucción de la salida de la vejiga, que da como resultado síndromes progresivos del tracto urinario inferior (LUTS) caracterizados por frecuencia urinaria, urgencia, y nocturia debido a un vaciado incompleto y un rellenado rápido de la vejiga. Se desconoce la causa real de la HPB, pero puede implicar alteraciones relacionadas con la edad en el equilibrio de las hormonas sexuales esteroides.
Se usan antagonistas selectivos del adrenoceptor \alpha1, tales como prazosin, indoramin, y tamsulosin, como adjunto en el tratamiento sintomático de la obstrucción urinaria provocada por la HPB, aunque no afectan a la causa subyacente de la HPB. En la HPB, el tono simpático incrementado exacerba el grado de obstrucción de la uretra a través de la contracción del músculo liso prostático y uretral. Estos compuestos inhiben la actividad simpática, relajando así el músculo liso del tracto urinario. Para el tratamiento se deberían desarrollar antagonistas \alpha1 uroselectivos y antagonistas alfa1 con una alta selectividad tisular por el músculo liso del tracto urinario inferior que no provoquen efectos secundarios hipotensivos.
Se han usado fármacos que bloquean la dihidrotestosterona para reducir el tamaño de la próstata. Para la HPB se han prescrito inhibidores de la 5\alpha-reductasa, tales como la finasterida. Estos agentes que inhiben selectivamente la 5alfa-reductasa que media en la conversión de testosterona a dihidrotestosterona, reduciendo así los niveles de dihidrotestosterona en plasma y, de esa forma, el crecimiento prostático. Los inhibidores de la 5\alpha-reductasa no se unen a receptores de andrógenos y no afectan a los niveles de testosterona, ni poseen efectos secundarios feminizantes.
Para el tratamiento de la hiperplasia prostática se usan antagonistas del receptor de andrógeno debido a la acción o producción excesiva de testosterona. Diversos anti-andrógenos están en investigación para la BPH, incluyendo derivados de clormadiona sin actividad estrogénica, inhibidores aromatasa oralmente activos, y análogos de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH).
Se divulga el uso de nuevos agentes identificados mediante los ensayos de selección descritos anteriormente. Por consiguiente, está dentro del alcance de esta invención usar un compuesto de prueba identificado como se divulga en el presente documento en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, se puede usar un agente identificado como se divulga en el presente documento (por ejemplo, un agente modulador, una molécula de ácido nucleico antisentido, un anticuerpo específico, una ribozima, o una molécula que se une a un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1) en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad, o efectos secundarios del tratamiento con ese agente. Alternativamente, se puede usar un agente identificado como se divulga en el presente documento en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de ese agente.
Además, se divulga el uso de los agentes identificados mediante los ensayos de selección descritos anteriormente para tratamientos como los descritos en el presente documento.
Un reactivo que afecta a la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede administrar a una célula humana, in vitro o in vivo, para reducir la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1. El reactivo se une preferentemente a un producto de expresión de un gen de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1. Si el producto de expresión es una proteína, el reactivo es preferentemente un anticuerpo. Para el tratamiento de células humanas ex vivo, se puede añadir un anticuerpo a una preparación de células madre que se hayan extraído del cuerpo. A continuación las células se pueden volver a colocar en el mismo cuerpo o en otro cuerpo humano, con o sin propagación clonal, como es sabido en la materia.
Se divulga que el reactivo se administra usando un liposoma. Preferentemente, el liposoma es estable en el animal al que se le ha administrado durante, al menos, 30 minutos aproximadamente, más preferentemente durante, al menos, 1 hora aproximadamente, e incluso más preferentemente durante, al menos, 24 horas aproximadamente. Un liposoma comprende una composición lipídica que es capaz de dirigir un reactivo, particularmente un polinucleótido, a un sitio particular en un animal, tal como un humano. Preferentemente, la composición lipídica del liposoma es capaz de dirigirse a un órgano específico de un animal, tal como el pulmón, hígado, bazo, corazón, cerebro, nodos linfáticos, y piel.
Un liposoma comprende una composición lipídica que es capaz de fusionarse con la membrana plasmática de la célula diana para introducir su contenido en la célula. Preferentemente, la eficacia de transfección de un liposoma es de 0,5 \mug de ADN aproximadamente por 16 nmol de liposoma administrado a 10^{6} células aproximadamente, más preferentemente de 1,0 \mug de ADN aproximadamente por 16 nmol de liposoma administrado a 10^{6} células aproximadamente, e incluso más preferentemente de 2,0 \mug de ADN aproximadamente por 16 nmol de liposoma administrado a 10^{6} células aproximadamente. Preferentemente, un liposoma tiene un diámetro de entre 100 y 500 nm aproximadamente, más preferentemente entre 150 y 450 nm aproximadamente, e incluso más preferentemente entre 200 y 400 nm aproximadamente.
Los liposomas adecuados incluyen aquellos liposomas usados de manera habitual en, por ejemplo, procedimientos de introducción de genes conocidos por aquellos expertos en la materia. Liposomas más preferidos incluyen liposomas con una composición lipídica policatiónica y/o liposomas con un esqueleto colesterol conjugado a polietilenglicol. Opcionalmente, un liposoma comprende un compuesto capaz de dirigir el liposoma a un tipo celular particular, tal como un ligando específico de un tipo celular expuesto en la superficie externa del liposoma.
La complejación de un liposoma con un reactivo tal como un oligonucleótido antisentido o una ribozima se puede conseguir usando procedimientos que son habituales en la materia (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. 5.705.151). Preferentemente, entre 0,1 \mug aproximadamente y 10 \mug aproximadamente de polinucleótidos se combinan con 8 nmol de liposomas aproximadamente, más preferentemente entre 0,5 \mug aproximadamente y 5 \mug aproximadamente de polinucleótidos se combinan con 8 nmol de liposomas aproximadamente, e incluso más preferentemente entre 1,0 \mug aproximadamente de polinucleótidos se combinan con 8 nmol de liposomas aproximadamente.
Los anticuerpos se pueden administrar en tejidos específicos in vivo usando la administración dirigida mediada por receptores. Las técnicas de administración de ADN mediada por receptores se enseñan en, por ejemplo, Findeis y col. Trends in Biotechnol. 11, 202-05 (1993); Chiou y col., GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 263, 621-24 (1988); Wu y col., J. Biol. Chem. 269, 542-46 (1994); Zenke y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 3655-59 (1990); Wu y col., J. Biol. Chem. 266, 338-42 (1991).
Determinación de una dosis terapéuticamente eficaz
La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de aquellos expertos en la materia. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad de principio activo que incrementa o reduce la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en relación a la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que se produce en ausencia de la dosis terapéuticamente eficaz.
Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente en ensayos de cultivos celulares o en modelos animales, normalmente ratones, conejos, perros, o cerdos. También se puede usar el modelo animal para determinar el intervalo de concentraciones y la vía de administración apropiados. A continuación esta información se puede usar para determinar dosis y vías de administración útiles en humanos.
La eficacia terapéutica y la toxicidad, por ejemplo, DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y la DL_{50} (la dosis letal en el 50% de la población), se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos habituales en cultivos celulares o animales experimentales. La relación de la dosis de efectos tóxicos a terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación DL_{50}/DE_{50}.
Se prefieren composiciones farmacéuticas que presentan índices terapéuticos grandes. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y de los estudios en animales se usan en la formulación de un intervalo de dosificaciones para uso humano. La dosificación contenida en esas composiciones preferentemente está dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente, y la vía de administración.
La dosificación exacta será determinada por el facultativo, en vista de factores relacionados con el sujeto que requiere el tratamiento. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes de principio activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tener en cuenta incluyen la gravedad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, peso, y género del sujeto, la dieta, el tiempo y frecuencia de administración, la combinación(es) de fármacos, las sensibilidades de reacción, y la tolerancia/respuesta a la terapia. Se pueden administrar composiciones farmacéuticas de acción prolongada cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la semi-vida y la tasa de aclaramiento de la formulación particular.
Las cantidades de dosificación normales pueden variar entre 0,1 y 100.000 \mug, hasta una dosis total de 1 g aproximadamente, dependiendo de la vía de administración. En la bibliografía se proporciona orientación para dosificaciones y procedimientos de administración particulares y está disponible de manera general para los facultativos de la técnica. Aquellos expertos en la materia emplearán formulaciones diferentes para nucleótidos que para proteínas o sus inhibidores. De manera similar, la administración de polinucleótidos o polipéptidos será específica para células, dolencias, localizaciones particulares, etc.
Si el reactivo es un anticuerpo de cadena sencilla, se pueden construir polinucleótidos que codifican el anticuerpo y se pueden introducir en una célula ex vivo o in vivo usando técnicas bien establecidas que incluyen, pero no están limitadas a, transferencia de ADN mediada por transferrina policatiónica, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, fusión celular mediada por liposomas, transporte intracelular de cuentas de látex recubiertas con ADN, fusión de protoplastos, infección vírica, electroporación, "pistola génica", y transfección mediada por DEAE o por fosfato cálcico.
Las dosificaciones eficaces in vivo de un anticuerpo están en el intervalo de 5 \mug aproximadamente a 50 \mug/kg aproximadamente, de 50 \mug aproximadamente a 5 mg/kg aproximadamente, de 100 \mug aproximadamente a 500 \mug/kg de peso corporal del paciente aproximadamente, y de 200 \mug aproximadamente a 250 \mug/kg de peso corporal del paciente aproximadamente. Para la administración de polinucleótidos que codifican anticuerpos de cadena sencilla, las dosificaciones eficaces in vivo están en el intervalo de 100 ng aproximadamente a 200 ng aproximadamente, de 500 ng a 50 mg aproximadamente, de 1 \mug aproximadamente a 2 mg aproximadamente, de 5 \mug aproximadamente a 500 \mug aproximadamente, y de 20 \mug aproximadamente a 100 \mug de ADN aproximadamente.
Si el producto de expresión es ARNm, el reactivo es preferentemente un oligonucleótido antisentido o una ribozima. Los polinucleótidos que expresan oligonucleótidos antisentido o ribozimas se pueden introducir en células mediante una variedad de procedimientos, como se ha descrito anteriormente.
Preferentemente, un reactivo reduce la expresión de un gen de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 o la actividad de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en al menos el 10% aproximadamente, preferentemente el 50% aproximadamente, más preferentemente el 75, 90, ó 100% aproximadamente en relación a la ausencia del reactivo. La eficacia del mecanismo seleccionado para reducir el nivel de expresión de un gen de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 o la actividad de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se puede valorar usando procedimientos muy conocidos en la materia, tales como hibridación de sondas de nucleótidos a ARNm específico de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, RT-PCR cuantitativa, detección inmunológica de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, o medición de actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
Cualquiera de las composiciones farmacéuticas se puede administrar en combinación con otros agentes terapéuticos apropiados. La selección de los agentes apropiados para su uso en terapia de combinación se puede realizar por alguien con conocimientos ordinarios en la materia, según principios farmacéuticos convencionales. La combinación de agentes terapéuticos puede actuar sinérgicamente para llevar a cabo el tratamiento o la prevención de los diversos trastornos descritos anteriormente. Usando esta aproximación, uno puede ser capaz de conseguir la eficacia terapéutica con menores dosificaciones de cada agente, reduciendo así los potenciales efectos secundarios adversos.
Cualquiera de los procedimientos terapéuticos descritos anteriormente se puede aplicar a cualquier sujeto que necesite de esa terapia, incluyendo, por ejemplo, mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos, y más preferentemente, seres humanos.
Procedimientos diagnósticos
La serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 también se puede usar en ensayos diagnósticos para la detección de enfermedades y anormalidades o susceptibilidad a enfermedades y anormalidades relacionadas con la presencia de mutaciones en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la enzima. Por ejemplo, se pueden determinar diferencias entre el ADNc o la secuencia genómica que codifica la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en individuos afectados con una enfermedad y en individuos normales. Si se observa una mutación en alguno o en todos los individuos afectados pero no en los individuos normales, entonces es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad.
Se pueden revelar diferencias de secuencia entre un gen de referencia y un gen con mutaciones mediante el procedimiento de secuenciación directa de ADN. Además, se pueden emplear segmentos de ADN clonados como sondas para detectar segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de este procedimiento se mejora enormemente cuando se combina con la PCR. Por ejemplo, se puede usar un cebador de secuenciación con un producto de la PCR de doble cadena o con una molécula molde de cadena sencilla generada mediante una PCR modificada. La determinación de la secuencia se lleva a cabo mediante procedimientos convencionales usando nucleótidos radiomarcados o mediante procedimientos de secuenciación automáticos usando marcadores fluorescentes.
Se pueden llevar a cabo pruebas genéticas basadas en diferencias en la secuencia de ADN mediante la detección de alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Se pueden visualizar pequeñas deleciones e inserciones de secuencia, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de alta resolución. Los fragmentos de ADN de diferentes secuencias se pueden distinguir en geles desnaturalizantes con gradiente de formamida en los que las movilidades de diferentes fragmentos de ADN se retrasan en el gel en diferentes posiciones según sus temperaturas de fusión específicas o temperaturas de fusión parciales (véase, por ejemplo, Myers y col., Science 230, 1242, 1985). También se pueden revelar cambios de secuencia en localizaciones específicas mediante ensayos de protección contra nucleasas, tales como RNasa y protección S 1 o el procedimiento de escisión química (por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 85, 4397-4401, 1985). Así, la detección de una secuencia específica de ADN se puede llevar a cabo mediante procedimientos tales como hibridación, protección contra RNasas, escisión química, secuenciación directa de ADN o el uso de enzimas de restricción y transferencia de Southern de ADN genómico. Además de los procedimientos directos tales como electroforesis en gel y secuenciación de ADN, las mutaciones también se pueden detectar mediante análisis in situ.
También se pueden detectar niveles alterados de serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en diversos tejidos. Los ensayos usados para detectar niveles de los polipéptidos receptores en una muestra corporal, tal como sangre o una biopsia del tejido, procedentes de un hospedador son muy conocidos por aquellos expertos en la materia e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitivos, análisis de transferencia de Western, y ensayos de ELISA.
La descripción anterior divulga de manera general la presente invención. Se puede obtener una comprensión más completa en referencia a los siguientes ejemplos específicos, que se proporcionan sólo con fines ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la invención.
Ejemplo 1 Detección de la actividad serina/treonina proteína quinasa
Para un nivel elevado de expresión de un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa marcada con FLAG, se transfectaron células COS-1 con el vector de expresión del polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa (que expresa la secuencia de ADN de la SEQ ID Nº: 1) usando el procedimiento del fosfato de calcio. Después de 5 h, las células se infectan con vacuna del virus recombinante vTF7-3 (10 unidades formadoras de placas/célula). Las células se recogieron 20 h después de la infección y se lisaron en Tris 50 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 5 mM, 0,1% de Nonidet P-40, ditiotreitol 0,5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 10 \mug/ml de aprotinina. El polipéptido de serina/treonina proteína quinasa se inmunoprecipitó del lisado usando anticuerpos anti-FLAG. El ensayo de la quinasa y el análisis de fosfoaminoácidos in vitro se realizaron en un volumen de 40 \mul con polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa marcado con FLAG inmunoprecipitado en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 5 mM, ditiotreitol 1 mM. La reacción se inició mediante la adición de 4 ml de ATP 1 mM suplementado con 5 \muCi de (^{32}P)ATP y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Después de eso, las muestras se sometieron a SDS-PAGE y las proteínas fosforiladas se detectaron mediante autorradiografía. Como sustratos se usaron la histona de tipo III-S, caseína, seroalbúmina bovina, o proteínas básicas de mielina. Se demuestra que el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2 tiene actividad serina/treonina proteína quinasa.
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Ejemplo 2 Expresión de serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 recombinante
Se usó el vector de expresión pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) de Pichia pastoris para producir grandes cantidades de polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 recombinante de levadura. La secuencia de ADN que codifica la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 procede de la SEQ ID Nº: 1. Antes de la inserción en el vector pPICZB, la secuencia de ADN se modificó mediante procedimientos muy conocidos de tal forma que contiene en su extremo 5' un codón de iniciación y en su extremo 3' un sitio de escisión de enteroquinasa, un marcador informador His6 y un codón de terminación. Además, se añadieron en ambos extremos secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restricción y después de la digestión de los múltiples sitios de clonación del pPICZB con las correspondientes enzimas de restricción, la secuencia de ADN modificada se ligó en pPICZB. Este vector de expresión está diseñado para la expresión inducible en Pichia pastoris, conducida por un promotor de levadura. El vector pPICZ/md-His6 resultante se usó para transformar la levadura.
La levadura se cultivó bajo las condiciones habituales en matraces agitados de 5 l y la proteína producida de manera recombinante se aisló del cultivo mediante cromatografía de afinidad (Ni-NTA-Resin) en presencia de urea 8 M. El polipéptido unido se eluyó con tampón, pH 3,5, y se neutralizó. La separación del polipéptido del marcador informador His6 se consiguió mediante proteolisis específica de sitio usando enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. Se obtiene el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 purificada.
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Ejemplo 3 Identificación de compuestos de prueba que se unen a polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1
Polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 purificados que comprenden una proteína glutatión-S-transferasa y absorbidos sobre pocillos derivados con glutatión de placas de microtitulación de 96 pocillos se pusieron en contacto con compuestos de prueba de una librería de moléculas pequeñas a pH 7,0 en una disolución tampón fisiológica. Los polipéptidos de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2. Los compuestos de prueba comprenden un marcador fluorescente. Las muestras se incuban durante 5 minutos a 1 h. Las muestras control se incuban en ausencia de compuesto de prueba.
La disolución tampón que contiene los compuestos de prueba se lava de los pocillos. La unión de un compuesto de prueba a un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se detecta mediante mediciones de fluorescencia del contenido de los pocillos. Un compuesto de prueba que incrementa la fluorescencia en un pocillo en, al menos, el 15% en relación a la fluorescencia de un pocillo en el que no se ha incubado un compuesto de prueba, se identifica como un compuesto que se une a un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
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Ejemplo 4 Identificación de un compuesto de prueba que reduce la expresión génica de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1
Se administró un compuesto de prueba a un cultivo de células humanas transfectadas con una construcción de expresión de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y se incubó a 37ºC durante 10 a 45 minutos. Un cultivo del mismo tipo de células que no había sido transfectado se incubó durante el mismo tiempo sin el compuesto de prueba para proporcionar un control negativo.
Se aisló el ARN de los dos cultivos como se divulga en Chirgwin y col., (Biochem. 18, 5294-99, 1979). Se prepararon transferencias de Northern usando de 20 a 30 \mug de ARN total y se hibridó con una sonda específica para la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 marcada con ^{32}P a 65ºC en Express-hyb (CLONTECH). La sonda comprende al menos 11 nucleótidos contiguos seleccionados del complemento de la SEQ ID Nº: 1. Un compuesto de prueba que reduce la señal específica de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en relación a la señal obtenida en ausencia del compuesto de prueba se identifica como un inhibidor de la expresión génica de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
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Ejemplo 5 Identificación de un compuesto de prueba que reduce la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1
Se administró un compuesto de prueba a un cultivo de células humanas transfectadas con una construcción de expresión de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y se incubó a 37ºC durante 10 a 45 minutos. Un cultivo del mismo tipo de células que no había sido transfectado se incubó durante el mismo tiempo sin el compuesto de prueba para proporcionar un control negativo. La actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se mide usando el procedimiento de Nakanishi y col., Genes Cells 2000 Oct; 5(10):839-47; Fattaey & Booher, Prog Cell Cycle Res 1997; 3: 233-40; o Den Haese y col., Mol Biol Cell 1995 Abr; 6(4):371-85.
Un compuesto de prueba que reduce la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en relación a la actividad de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en ausencia del compuesto de prueba se identifica como inhibidor de la actividad serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
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Ejemplo 6 Expresión específica de tejido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1
Se determinó el perfil de expresión cualitativo de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en diversos tejidos mediante reacción en cadena de la polimerasa por transcripción inversa (RT-PCR).
Para demostrar que la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 está involucrada en el proceso patológico de la COPD, el panel de expresión inicial consta de muestras de ARN de tejidos respiratorios y células inflamatorias relevantes para la COPD: pulmón (adulto y fetal), tráquea, células alveolares de tipo II recién aisladas, células epiteliales bronquiales humanas cultivadas, células epiteliales de las vías aéreas pequeñas cultivadas, células de músculo liso bronquial cultivados, células H441 cultivadas (de tipo Clara), neutrófilos y monocitos recién aislados, y monocitos cultivados (de tipo macrófago). También se llevó a cabo el perfil del mapa del cuerpo, usando paneles de ARN total adquiridos en Clontech. Los tejidos son glándula adrenal, médula ósea, cerebro, colon, corazón, riñón, hígado, pulmón, glándula mamaria, páncreas, próstata, glándula salivar, músculo esquelético, intestino delgado, bazo, estómago, testículo, timo, tráquea, tiroides, y útero.
Para demostrar que la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 está involucrada en trastornos del sistema nervioso central y periférico, se sometieron a ensayo los siguientes tejidos: cerebro fetal y adulto, músculo, corazón, pulmón, riñón, hígado, timo, testículo, colon, placenta, tráquea, páncreas, riñón, mucosa gástrica, colon, hígado, cerebelo, piel, córtex (de Alzheimer y normal), hipotálamo, córtex, amígdala, cerebelo, hipocampo, coroides, plexo, tálamo, y médula espinal.
Para demostrar que la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 está involucrada en el cáncer, se determinó su expresión en los siguientes tejidos: glándula adrenal, médula ósea, cerebro, cerebelo, colon, cerebro fetal, hígado fetal, corazón, riñón, hígado, pulmón, glándula mamaria, páncreas, placenta, próstata, glándula salivar, músculo esquelético, intestino delgado, médula espinal, bazo, estómago, testículo, timo, tiroides, tráquea, útero, y linfocitos de sangre periférica. También se determinó la expresión en las siguientes líneas celulares de cáncer: DU-145 (próstata), NCI-H125 (pulmón), HT-29 (colon), COLO-205 (colon), A-549 (pulmón), NCI-H460 (pulmón), HT-116 (colon), DLD-1 (colon), MDA-MD-231 (mama), LS174T (colon), ZF-75 (mama), MDA-MN-435 (mama), HT-1080, MCF-7 (mama), y U87. También se probaron los pares apareados de tejido normal y maligno procedentes del mismo paciente.
Perfil de la expresión cuantitativa
El perfil de la expresión cuantitativa se llevó a cabo en forma de análisis de PCR cuantitativa denominado "análisis cinético" descrito por primera vez en Higuchi y col., BioTechnology 10, 413-17, 1992, y Higuchi y col., BioTechnology 11, 1026-30, 1993. El principio es que en cualquier ciclo dado dentro de la fase exponencial de la PCR, la cantidad de producto es proporcional al número inicial de copias molde.
Si la amplificación se realiza en presencia de un oligonucleótido fluorescente inactivado internamente (sonda TaqMan) complementario a la secuencia diana, la sonda es escindida por la actividad endonucleasa 5'-3' de la ADN polimerasa Taq y el colorante fluorescente es liberado al medio (Holland y col., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 88, 7276-80, 1991). Debido a que la emisión de fluorescencia se incrementará en proporción directa a la cantidad del producto específico amplificado, se puede detectar la fase de crecimiento exponencial del producto de la PCR y se puede usar para determinar la concentración de molde inicial (Heid y col., Genome Res. 6, 986-94, 1996, y Gibson y col., Genome Res. 6, 995-1001, 1996).
Se puede realizar la amplificación de un control endógeno para estandarizar la cantidad de ARN de muestra añadido a una reacción. En este tipo de experimento, el control elegido es el ARN ribosómico 18S. Debido a que están disponibles colorantes informadores con diferentes espectros de emisión, la diana y el control endógeno se pueden cuantificar independientemente en el mismo tubo si se usan sondas marcadas con colorantes diferentes.
Todas las mediciones de fluorescencia de la "PCR en tiempo real" se llevaron a cabo en el ABI Prism 7700.
Extracción de ARN y preparación de ADNc
El ARN total de los tejidos listados anteriormente se usó para la cuantificación de la expresión. Los ARNs etiquetados como "procedentes de autopsia" se extrajeron de tejidos autópticos con el reactivo TRIzol (Life Technologies, MD) según el protocolo del fabricante.
50 \mug de cada ARN se trataron con DNasa I durante 1 hora a 37ºC en la siguiente mezcla de reacción: 0,2 U/\mul de DNasa I libre de RNasa (Roche Diagnostics, Alemania); 0,4 U/\mul de inhibidor de RNasa (PE Applied Biosystems, CA); Tris-HCl 10 mM pH 7,9; MgCl_{2} 10 mM; NaCl 50 mM; y DTT 1 mM.
Después de la incubación, el ARN se extrajo una vez con un volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (24:24:1) y una vez con cloroformo, y se precipitó con 1/10 volúmenes de acetato sódico 3 M, pH 5,2, y 2 volúmenes de etanol.
50 \mug de cada ARN de los tejidos autópticos se trataron con DNasa con el kit exento de ADN adquirido en Ambion (Ambion, TX). Después de la resuspensión y la cuantificación espectrofotométrica, cada muestra se sometió a trascripción inversa con los reactivos TaqMan Reverse Transcription Reagents (PE Applied Biosystems, CA) según el protocolo del fabricante. La concentración final de ARN en la mezcla de reacción es de 200 ng/\mul. La transcripción inversa se llevó a cabo con 2,5 \muM de cebadores hexámeros aleatorios.
Análisis cuantitativo TaqMan
Se diseñaron cebadores y una sonda específicos según las recomendaciones de PE Applied Biosystems; la sonda también se puede marcar en el extremo 5' con FAM (6-carboxi-fluoresceína) y en el extremo 3' con TAMRA (6-carboxi-tetrametil-rodamina). Los experimentos de cuantificación se realizaron sobre 10 ng de ARN transcrito inversamente de cada muestra. Cada determinación se realiza por triplicado.
El contenido de ADNc total se normaliza con la cuantificación simultánea (PCR multiplex) del ARN ribosómico 18S usando el kit de control Pre-Developed TaqMan Assay Reagents (PDAR) (PE Applied Biosystems, CA).
La mezcla de reacción del ensayo es la siguiente: mezcla 1X final de TaqMan Universal PCR Master Mix (de una disolución madre 2X) (PE Applied Biosystems, CA); control 1X PDAR - 18S RNA (de una disolución madre 20X); cebador directo 300 nM; cebador inverso 900 nM; sonda 200 nM; ADNc 10 ng; y agua hasta 25 \mul.
Cada una de las siguientes etapas se llevó a cabo una vez: pre PCR, 2 minutos a 50ºC, y 10 minutos a 95ºC. Las siguientes etapas se llevaron a cabo 40 veces: desnaturalización, 15 segundos a 95ºC, hibridación/extensión, 1 minuto a 60ºC.
El experimento se realiza en un detector de secuencias ABI Prism 7700 Sequence Detector (PE Applied Biosystems, CA). Al final de la carrera, los datos de florescencia adquiridos durante la PCR se procesan como se divulga en el manual del usuario del ABI Prism 7700 para conseguir una mejor eliminación del ruido así como una linealidad de la señal con la cantidad diana de partida.
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Ejemplo 7 Ensayo de inhibición de la proliferación: Los oligonucleótidos antisentido suprimen el crecimiento de líneas celulares de cáncer
La línea celular usada para la prueba es la línea celular de cáncer de colon humana HCT116. Las células se cultivaron en RPMI-1640 con suero fetal bovino al 10-15% a una concentración de 10.000 células por mililitro en un volumen de 0,5 ml y se mantuvieron a 37ºC en atmósfera de aire al 95%/CO_{2} al 5%.
Se sintetizaron oligorribonucleótidos de fosforotioato en un sintetizador Applied Biosystems Model 380B DNA usando la química de la fosforoamidita. Como oligonucleótido de prueba se usa una secuencia de 24 bases complementarias a los nucleótidos en la posición 1 a 24 de la SEQ ID Nº: 1. Como control, se usa otra secuencia (aleatoria): 5'-TCA ACT GAC TAG ATG TAC ATG GAC-3'. Después del ensamblaje y la desprotección, los oligonucleótidos se precipitaron dos veces en etanol, se secaron, y se suspendieron en tampón fosfato salino a la concentración deseada. La pureza de los oligonucleótidos se probó mediante electroforesis capilar en gel y HPLC de intercambio iónico. Los oligonucleótidos purificados se añadieron al medio de cultivo a una concentración de 10 \muM una vez al día durante siete días.
La adición del oligonucleótido de prueba durante siete días dio como resultado una expresión de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 significativamente reducida según se determina mediante transferencia de Western. Este efecto no se observó con el oligonucleótido control. Después de 3 a 7 días, se contó el número de células en los cultivos usando un contador de células automático. El número de células en los cultivos tratados con el oligonucleótido de prueba (expresadas como el 100%) se compara con el número de células en los cultivos tratados con el oligonucleótido control. El número de células en los cultivos tratados con el oligonucleótido de prueba no es superior al 30% del control, que indica que la inhibición de la serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 tiene un efecto antiproliferativo sobre células de cáncer.
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Ejemplo 8 Prueba in vivo de los compuestos/validación de la diana 1. Ensayos para mecánicas agudas 1.1. Reducción en los niveles de hormona plasmática mitógena
Este ensayo no tumoral mide la capacidad de un compuesto para reducir el nivel endógeno de un hormona circulante o el nivel de hormona producida en respuesta a un estímulo biológico. Se administró el compuesto de prueba a los roedores (p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c.). En un momento predeterminado después de la administración del compuesto de prueba, se recogió plasma sanguíneo. El plasma se sometió a ensayo para niveles de la hormona de interés. Si los niveles circulantes normales de la hormona son demasiado bajos y/o variables para proporcionar resultados consistentes, el nivel de la hormona se puede elevar mediante un tratamiento previo con un estímulo biológico (es decir, se puede inyectar LHRH i.m. a los ratones a una dosificación de 30 ng/ratón para inducir una síntesis brusca de testosterona). El momento de recogida del plasma se ajusta para coincidir con el pico de la respuesta hormonal inducida. Los efectos del compuesto se comparan con un grupo control tratado con el vehículo. Se realiza una prueba F para determinar si la variación es igual o no es igual, seguida de una prueba t de Student. La significación es un valor de p \leq 0,05 comparado con el grupo control del vehículo.
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1.2. Mecanismo de fibra hueca del ensayo de acción
Se prepararon fibras huecas con la línea(s) celular deseada y se implantaron intraperitoneal y/o subcutáneamente en roedores. Los compuestos se administraron p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. Las fibras se recogieron de acuerdo con el protocolo del ensayo de lectura específico, éstos pueden incluir ensayos para la expresión de genes (ADNb, PCR, o Taqman), o una actividad bioquímica específica (es decir, niveles de AMPc). Los resultados se analizaron mediante la prueba t de Student o la prueba de suma de rangos después de comparar la varianza entre los grupos mediante una prueba F, con una significación a p \leq 0,05 comparada con el grupo control del vehículo.
2. Ensayos funcionales subagudos in vivo 2.1. Reducción en masa de los tejidos que dependen de la hormona
Éste es otro ensayo no tumoral que mide la capacidad de un compuesto para reducir la masa de un tejido dependiente de una hormona (es decir, vesículas seminales en machos y útero en hembras). Se administró el compuesto de prueba (p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c.) a los roedores según un calendario predeterminado y durante una duración predeterminada (es decir, 1 semana). A la finalización del estudio, los animales se pesaron, el órgano diana se extrajo, se eliminó todo el fluido, y se registró el peso del órgano. También se puede recoger el plasma sanguíneo. El plasma se puede someter a ensayo para los niveles de una hormona de interés o para los niveles de un agente de prueba. Los pesos de los órganos se pueden comparar directamente o se pueden normalizar para el peso corporal del animal. Los efectos del compuesto se comparan con un grupo control tratado con el vehículo. Se realiza previamente una prueba F para determinar si la varianza es igual o no es igual, seguida de una prueba t de Student. La significación es un valor de p \leq 0,05 comparado con el grupo control del vehículo.
2.2. Ensayo de proliferación de fibras huecas
Se prepararon fibras huecas con la línea(s) celular deseada y se implantaron intraperitoneal y/o subcutáneamente en roedores. Los compuestos se administraron p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. Las fibras se recogieron de acuerdo con el protocolo del ensayo de lectura específico. Se determina la proliferación celular midiendo un marcador del número de células (es decir, MTT o LDH). El número de células y el cambio en el número de células desde el inóculo de partida se analizaron mediante la prueba t de Student o la prueba de suma de rangos después de comparar la varianza entre los grupos mediante una prueba F, con una significación a p \leq 0,05 comparada con el grupo control del vehículo.
2.3. Modelos anti-angiogénesis 2.3.1. Angiogénesis corneal
Pellas de Hydron con o sin factores de crecimiento o células se implantaron en un microbolsillo creado quirúrgicamente en la córnea del roedor. Las córneas se recogieron 7 días después del implante inmediatamente después de la infusión intracardiaca de carbón coloidal y se fijaron en formalina al 10%. La lectura es una puntuación cualitativa y/o un análisis de imagen. Las puntuaciones cualitativas se comparan mediante la prueba de suma de rangos. Los datos del análisis de imágenes se evaluaron midiendo el área de neovascularización (en píxeles) y las medias del grupo se compararon mediante la prueba t de Student (2 colas). La significación es p \leq 0,05 comparada con el factor de crecimiento o el grupo sólo de células.
2.3.2. Angiogénesis de Matrigel
Se inyectó subcutáneamente Matrigel, que contiene células o factores de crecimiento. Los compuestos se administraron p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. Los tapones de Matrigel se recogieron en puntos temporales predeterminados y se prepararon para la lectura. La lectura es un ensayo basado en ELISA para la concentración de hemoglobina y/o un examen histológico (es decir, recuento de vasos, tinción especial para marcadores de superficie endoteliales: CD31, factor-8). Las lecturas se analizaron mediante la prueba t de Student, después de comparar la varianza entre los grupos mediante una prueba F, con una significación determinada a p \leq 0,05 comparada con el grupo control del
vehículo.
3. Eficacia antitumoral primaria 3.1. Modelos de terapia temprana 3.1.1. Tumor subcutáneo
El día 0 se implantó subcutáneamente células o fragmentos de tumor. El vehículo y/o los compuestos se administraron p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. según un calendario predeterminado comenzando en un momento, normalmente el día 1, antes de dificultar la capacidad para medir el tumor. Los pesos corporales y las mediciones del tumor se registraron 2-3 veces semanalmente. Se calcularon los pesos medios netos corporales y del tumor para cada día de recolección de datos. La eficacia antitumoral se puede determinar inicialmente comparando el tamaño de los tumores tratados (T) y control (C) un día dado mediante una prueba t de Student, después de comparar la varianza entre los grupos mediante una prueba F, con una significación determinada a p \leq 0,05. El experimento también se puede continuar una vez terminada la dosificación, en cuyo caso se seguiría registrando las mediciones del tumor para controlar el retraso del crecimiento tumoral. Los retrasos en el crecimiento tumoral se expresan como diferencia en el tiempo medio para los grupos tratados y control en alcanzar un tamaño predeterminado dividido por el tiempo medio para el grupo control en alcanzar ese tamaño. Los retrasos en el crecimiento se comparan generando curvas de Kaplan-Meier a partir de los tiempos para que los tumores individuales alcancen el tamaño de evaluación. La significación es p \leq 0,05.
3.1.2. Modelos de tumor intraperitoneal/intracraneal
Se inyectó intraperitoneal o intracranealmente células tumorales el día 0. Los compuestos se administraron p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. según un calendario predeterminado comenzando el día 1. Las observaciones de morbilidad y/o mortalidad se registraron dos veces al día. Los pesos corporales se midieron y se registraron dos veces a la semana. Los datos de morbilidad/mortalidad se expresan en términos de tiempo de supervivencia medio y el número de supervivientes a largo plazo se indica por separado. Los tiempos de supervivencia se usaron para generar curvas de Kaplan-Meier. La significación es p \leq 0,05 mediante una prueba de Mantel-Cox comparada con el grupo control en el experimento.
3.2. Modelo de enfermedad establecido
Se implantó subcutáneamente células o fragmentos tumorales y se crecieron hasta el tamaño deseado para comenzar el tratamiento. Una vez en el rango de tamaños predeterminado, los ratones se separaron aleatoriamente en grupos de tratamiento. Los compuestos se administraron p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. según un calendario predeterminado. Los pesos de los tumores y los pesos corporales se midieron y se registraron 2-3 veces a la semana. Los pesos medios de los tumores de todos los grupos a lo largo de los días posteriores a la inoculación se representaron para su comparación. Se realiza previamente una prueba F para determinar si la varianza es igual o no es igual, seguida de una prueba t de Student para comparar los tamaños de los tumores en los grupos tratados y control al final del tratamiento. La significación es p \leq 0,05 comparado con el grupo control. Las mediciones de los tumores se pueden registrar después de que se haya detenido la dosificación para controlar el retraso del crecimiento tumoral. Los retrasos en el crecimiento tumoral se expresan como diferencia en el tiempo medio para los grupos tratados y control en alcanzar un tamaño predeterminado dividido por el tiempo medio para el grupo control en alcanzar ese tamaño. Los retrasos en el crecimiento se comparan generando curvas de Kaplan-Meier a partir de los tiempos para que tumores individuales alcancen el tamaño de evaluación. La significación es de un valor p \leq 0,05 comparada con el grupo control del vehículo.
3.3. Modelos de enfermedad ortotópicos 3.3.1. Ensayo de almohadilla adiposa mamaria
Células o fragmentos tumorales, con origen en adenocarcinoma mamario, se implantaron directamente en almohadilla adiposa mamaria expuestas y reflejadas quirúrgicamente en roedores. La almohadilla adiposa se volvió a colocar en su posición original y se cerró el sitio quirúrgico. También se pueden administrar hormonas a los roedores para ayudar al crecimiento de los tumores. Los compuestos se administraron p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. según un calendario predeterminado. Los pesos de los tumores y los pesos corporales se midieron y se registraron 2-3 veces a la semana. Los pesos medios de los tumores de todos los grupos a lo largo de los días posteriores a la inoculación se representaron para su comparación. Se realiza previamente una prueba F para determinar si la varianza es igual o no es igual, seguida de una prueba t de Student para comparar los tamaños de los tumores en los grupos tratados y control al final del tratamiento. La significación es p \leq 0,05 comparado con el grupo control.
Las mediciones de los tumores se pueden registrar después de que se haya detenido la dosificación para controlar el retraso del crecimiento tumoral. Los retrasos en el crecimiento tumoral se expresan como diferencia en el tiempo medio para los grupos tratados y control en alcanzar un tamaño predeterminado dividido por el tiempo medio para el grupo control en alcanzar ese tamaño. Los retrasos en el crecimiento se comparan generando curvas de Kaplan-Meier a partir de los tiempos para que tumores individuales alcancen el tamaño de evaluación. La significación es de un valor p \leq 0,05 comparada con el grupo control del vehículo. Además, este modelo proporciona una oportunidad para incrementar la tasa de metástasis espontánea de este tipo de tumor. La metástasis se puede valorar al final del estudio contando el número de focos visibles por órgano diana, o midiendo el peso del órgano diana. La media de estos puntos finales se compara mediante la prueba t de Student, después de llevar a cabo una prueba F, con una significación determinada a p \leq 0,05 comparada con el grupo control en el experimento.
3.3.2. Ensayo intraprostático
Células o fragmentos tumorales, con origen en adenocarcinoma prostático, se implantaron directamente en lóbulo dorsal de la próstata expuesto quirúrgicamente en roedores. La próstata se externalizó a través de una incisión abdominal de manera que el tumor se pudo implantar específicamente en el lóbulo dorsal mientras se verificaba que el implante no entra en las vesículas seminales. La próstata inoculada con éxito se volvió a colocar en el abdomen y las incisiones del abdomen y la piel se cerraron. También se pueden administrar hormonas a los roedores para ayudar al crecimiento de los tumores. Los compuestos se administraron p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. según un calendario predeterminado. Los pesos corporales se midieron y se registraron 2-3 veces a la semana. En un momento predeterminado, se detuvo el experimento y se diseccionó el animal. El tamaño del tumor primario se midió en las tres dimensiones usando un calibrador o un micrómetro ocular adosado a un microscopio de disección. Se realiza previamente una prueba F para determinar si la varianza es igual o no es igual, seguida de una prueba t de Student para comparar los tamaños de los tumores en los grupos tratados y control al final del tratamiento. La significación es p \leq 0,05 comparado con el grupo control. Este modelo proporciona una oportunidad para incrementar la tasa de metástasis espontánea de este tipo de tumor. La metástasis se puede valorar al final del estudio contando el número de focos visibles por órgano diana (es decir, pulmones), o midiendo el peso del órgano diana (es decir, los nódulos linfáticos regionales). La media de estos puntos finales se compara mediante la prueba t de Student, después de llevar a cabo una prueba F, con una significación determinada a p \leq 0,05 comparada con el grupo control en el experimento.
3.3.3. Ensayo intrabronquial
Células tumorales de origen pulmonar se pueden implantar intrabronquialmente haciendo una incisión a través de la piel y exponiendo la tráquea. La tráquea se punciona con el extremo biselado de una aguja de calibre 25 y las células tumorales se inoculan en el bronquio principal usando una aguja de calibre 27 de extremo plano con una curvatura de 90º. Los compuestos se administraron p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. según un calendario predeterminado. Los pesos corporales se midieron y se registraron 2-3 veces a la semana. En un momento predeterminado, se detuvo el experimento y se diseccionó el animal. El tamaño del tumor primario se midió en las tres dimensiones usando un calibrador o un micrómetro ocular adosado a un microscopio de disección. Se realiza previamente una prueba F para determinar si la varianza es igual o no es igual, seguida de una prueba t de Student para comparar los tamaños de los tumores en los grupos tratados y control al final del tratamiento. La significación es p \leq 0,05 comparado con el grupo control. Este modelo proporciona una oportunidad para incrementar la tasa de metástasis espontánea de este tipo de tumor. La metástasis se puede valorar al final del estudio contando el número de focos visibles por órgano diana (es decir, el pulmón contralateral), o midiendo el peso del órgano diana. La media de estos puntos finales se compara mediante la prueba t de Student, después de llevar a cabo una prueba F, con una significación determinada a p \leq 0,05 comparada con el grupo control en el experimento.
3.3.4. Ensayo intracecal
Células tumorales de origen gastrointestinal se pueden implantar intracecalmente haciendo una incisión abdominal a través de la piel y externalizando el intestino. Se inocularon células tumorales en la pared cecal sin penetrar el lumen del intestino usando una aguja de calibre 27 ó 30. Los compuestos se administraron p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. según un calendario predeterminado. Los pesos corporales se midieron y se registraron 2-3 veces a la semana. En un momento predeterminado, se detuvo el experimento y se diseccionó el animal. El tamaño del tumor primario se midió en las tres dimensiones usando un calibrador o un micrómetro ocular adosado a un microscopio de disección. Se realiza previamente una prueba F para determinar si la varianza es igual o no es igual, seguida de una prueba t de Student para comparar los tamaños de los tumores en los grupos tratados y control al final del tratamiento. La significación es p \leq 0,05 comparado con el grupo control. Este modelo proporciona una oportunidad para incrementar la tasa de metástasis espontánea de este tipo de tumor. La metástasis se puede valorar al final del estudio contando el número de focos visibles por órgano diana (es decir, el hígado), o midiendo el peso del órgano diana. La media de estos puntos finales se compara mediante la prueba t de Student, después de llevar a cabo una prueba F, con una significación determinada a p \leq 0,05 comparada con el grupo control en el experimento.
4. Eficacia antitumoral (metastásica) secundaria 4.1. Metástasis espontánea
Células tumorales se inocularon subcutáneamente y se dejó crecer los tumores hasta un tamaño predeterminado para estudios de metástasis espontánea al pulmón o hígado. A continuación se extirparon estos tumores primarios. Los compuestos se administraron p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. según un calendario predeterminado que puede incluir un periodo que da lugar a la extirpación del tumor primario para evaluar terapias dirigidas a inhibir las fases tempranas de la metástasis tumoral. Las observaciones de la morbilidad y/o mortalidad se registraron diariamente. Los pesos corporales se midieron y se registraron 2 veces a la semana. Los puntos finales potenciales incluyen el tiempo de supervivencia, el número de focos visibles por órgano diana, o el peso del órgano diana. Cuando se usa el tiempo de supervivencia como punto final, no se determinan los otros valores. Los datos de supervivencia se usaron para generar curvas de Kaplan-Meier. La significación es p \leq 0,05 mediante una prueba de Mantel-Cox comparada con el grupo control en el experimento. El número medio de focos tumorales visibles, según se determina bajo un microscopio de disección, y los pesos medios de los órganos diana se comparan mediante una prueba t de Student después de realizar una prueba F, con una significación determinada a p \leq 0,05 comparada con el grupo control en el experimento para estos dos puntos finales.
4.2. Metástasis forzada
Se inyectaron células tumorales en la vena de la cola, la vena porta, o el ventrículo izquierdo del corazón en estudios de metástasis experimentales (forzada) en pulmón, hígado, y hueso, respectivamente. Los compuestos se administraron p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. según un calendario predeterminado. Las observaciones de la morbilidad y/o mortalidad se registraron diariamente. Los pesos corporales se midieron y se registraron 2 veces a la semana. Los puntos finales potenciales incluyen el tiempo de supervivencia, el número de focos visibles por órgano diana, o el peso del órgano diana. Cuando se usa el tiempo de supervivencia como punto final, no se determinan los otros valores. Los datos de supervivencia se usaron para generar curvas de Kaplan-Meier. La significación es p \leq 0,05 mediante una prueba de Mantel-Cox comparada con el grupo control en el experimento. El número medio de focos tumorales visibles, según se determina bajo un microscopio de disección, y los pesos medios de los órganos diana se comparan mediante una prueba t de Student después de realizar una prueba F, con una significación determinada a p \leq 0,05 comparada con el grupo control en el experimento para estos dos puntos finales.
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Ejemplo 9 Prueba in vivo de los compuestos/validación de la diana 1. Dolor Dolor agudo
Se midió el dolor agudo sobre una placa caliente principalmente en ratas. Se usaron dos variantes de la prueba sobre la placa caliente: En la variante clásica los animales se pusieron sobre una superficie caliente (52 a 56ºC) y se midió el tiempo de latencia hasta que los animales mostraron comportamiento nocifensivo, tal como caminar o lamerse las patas. La otra variante es una placa caliente con temperatura creciente en la que los animales experimentales se ponen sobre una superficie de temperatura neutra. Posteriormente esta superficie se calienta de manera lenta y constante hasta que los animales comienzan a lamerse las patas. La temperatura que se alcanza cuando comienzan a lamerse las patas es una medida para el umbral del dolor.
Los compuestos se probaron frente a un grupo control tratado con vehículo. La aplicación de la sustancia se llevó a cabo en diferentes puntos temporales mediante diferentes vías de aplicación (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.c., intradérmica, transdérmica) antes de la prueba del dolor.
Dolor persistente
El dolor persistente se midió con la prueba de la formalina o la capsaicina, principalmente en ratas. Una disolución de formalina del 1 al 5% o de 10 a 100 \mug de capsaicina se inyectó en una de las patas del animal experimental. Después de la aplicación de la formalina o la capsaicina los animales mostraron reacciones nocifensivas como retirar, lamer o morder la pata afectada. El número de reacciones nocifensivas dentro de un marco temporal de hasta 90 minutos es una medida de la intensidad del dolor.
Los compuestos se probaron frente a un grupo control tratado con vehículo. La aplicación de la sustancia se llevó a cabo en diferentes puntos temporales mediante diferentes vías de aplicación (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.c., intradérmica, transdérmica) antes de la prueba del dolor.
Dolor neuropático
El dolor neuropático se indujo mediante diferentes variantes de lesión del nervio ciático unilateral principalmente en ratas. La operación se realizó con anestesia. La primera variante de lesión del nervio ciático se produjo poniendo ligaduras compresivas sueltas alrededor del nervio ciático común. La segunda variante es la ligación compresiva de aproximadamente la mitad del diámetro del nervio ciático común. En la siguiente variante, se usó un grupo de modelos en los que se realizaron ligaciones o transecciones compresivas de los nervios espinales L5 o L6, o sólo el nervio espinal L5. La cuarta variante supone la axotomía de dos de las tres ramas terminales del nervio ciático (nervios peroneal tibial y común) dejando el nervio sural restante intacto mientras que la última variante comprende la axotomía sólo de la rama tibial, dejando los nervios sural y común sin lesionar. Los animales control se trataron con operación simulada.
En la fase posoperatoria, los animales con el nervio lesionado desarrollaron una alodinia mecánica crónica, alodinia al frío, así como hiperalgesia térmica. La alodinia mecánica se mide por medio de un transductor de presión (Electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc.-Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA; Electronic von Frey System, Somedic Sales AB, Hörby, Suecia). La hiperalgesia térmica se mide por medio de una fuente de calor radiante (Plantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italia), o por medio de una placa fría de 5 a 10ºC en la que las reacciones nocifensivas de la pata afectada se cuentan como una medida de la intensidad del dolor. Una prueba más para el dolor inducido por frío es el recuento de reacciones nocifensivas, o la duración de las respuestas nocifensivas después de la administración plantar de acetona al miembro afectado. El dolor crónico en general se valora registrando los ritmos circadianos en actividad (Surjo y Arndt, Universität zu Köln, Colonia, Alemania), y puntuando diferencias en la marcha (patrón de huellas; FOOTPRINTS program, Klapdor y col., 1997. A low cost method to analyze footprint patterns. J. Neurosci. Methods 75, 49-54).
Los compuestos se probaron frente a grupos control operados de forma simulada y tratados con vehículo. La aplicación de la sustancia se llevó a cabo en diferentes puntos temporales mediante diferentes vías de aplicación (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.c., intradérmica, transdérmica) antes de la prueba del dolor.
Dolor inflamatorio
Se indujo dolor inflamatorio principalmente en ratas mediante la inyección de 0,75 mg de carragenano o adyuvante completo de Freund en una de las patas. Los animales desarrollaron un edema con alodinia mecánica así como hiperalgesia térmica. La alodinia mecánica se midió por medio de un transductor de presión (Electronic von Frey Anesthesiometer, ITTC Inc.-Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA). La hiperalgesia térmica se midió por medio de una fuente de calor radiante (Plantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italia, Paw thermal stimulator, G. Ozaki, University of California, USA). Para la medición del edema se han usado dos procedimientos. En el primer procedimiento, los animales se sacrificaron y las patas afectadas se seccionaron y se pesaron. El segundo procedimiento comprende diferencias en el volumen de la pata midiendo el desplazamiento de agua en un pletismómetro (Ugo Basile, Comerio, Italia).
Los compuestos se probaron frente a grupos control sin inflamación así como grupos control tratados con vehículo. La aplicación de la sustancia se llevó a cabo en diferentes puntos temporales mediante diferentes vías de aplicación (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.c., intradérmica, transdérmica) antes de la prueba del dolor.
Dolor neuropático diabético
Ratas tratadas con una sola inyección intraperitoneal de 50 a 80 mg/kg de estreptozotocina desarrollaron una hiperglicemia profunda y alodinia mecánica en 1 a 3 semanas. La alodinia mecánica se midió por medio de un transductor de presión (Electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc.-Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA).
Los compuestos se probaron frente a grupos control tratados con vehículo diabéticos y no diabéticos. La aplicación de la sustancia se llevó a cabo en diferentes puntos temporales mediante diferentes vías de aplicación (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.c., intradérmica, transdérmica) antes de la prueba del dolor.
2. Enfermedad de Parkinson Lesión por 6-Hidroxidopamina (6-OH-DA)
La degeneración de las vías dopaminérgicas nigrostriatal y estriatopalidal es el suceso patológico central en la enfermedad de Parkinson. Este trastorno se ha mimetizado experimentalmente en ratas usando inyecciones estereotáxicas unilaterales únicas/secuenciales de 6-OH-DA en el fascículo prosencefalico medial (MFB).
Se usaron ratas Wistar macho (Harlan Winkelmann, Alemania), con un peso de 200 \pm 250 g al comienzo del experimento. Las ratas se mantuvieron en un entorno con una temperatura y una humedad controladas en ciclos de luz/oscuridad de 12 h con acceso a voluntad a comida y agua cuando no estaban en las sesiones experimentales. Los siguientes protocolos in vivo están aprobados por las autoridades gubernamentales. Se realizan todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales, para reducir el número de animales usados, y utilizar alternativas a las técnicas in vivo.
Se administró a los animales pargilina el día de la operación (Sigma, St. Louis, MO, USA; 50 mg/kg i.p.) para inhibir el metabolismo de la 6-OHDA mediante la monoamino oxidasa y el HCl de desmetilimipramina (Sigma; 25 mg/kg i.p.) para prevenir la recaptación de 6-OHDA por los terminales noradrenérgicos. 30 minutos más tarde se anestesió a las ratas con pentobarbital sódico (50 mg/kg) y se pusieron en un chasis estereotáxico. Para lesionar la vía nigrostriatal DA se inyectaron 4 \mul de solución salina con ácido ascórbico al 0,01% que contiene 8 \mug de 6-OHDA HBr (Sigma) en el fascículo prosencefalico medial izquierdo a una velocidad de 1 \mul/minuto (2,4 mm anterior, 1,49 mm lateral, -2.7 mm ventral a Bregma y a la superficie del cráneo). La aguja se dejó en el lugar 5 minutos más para permitir que se produjese la difusión.
Prueba de marcha
Se valoró la aquinesia de los miembros delanteros tres semanas después de la colocación de la lesión usando un protocolo modificado de la prueba de marcha. Resumiendo, el experimentador sostiene a los animales con una mano fijando los miembros traseros y levantando ligeramente la parte trasera por encima de la superficie. Una garra está tocando la tabla, y a continuación se mueve lentamente hacia los lados (5 s por 1 min), primero en dirección hacia adelante y a continuación en dirección hacia atrás. Se cuenta el número de pasos de ajuste para ambas garras en dirección hacia adelante y hacia atrás del movimiento. La secuencia de prueba es de pasos de ajuste hacia adelante y hacia atrás de la garra derecha, seguida por direcciones hacia adelante y hacia atrás de la garra izquierda. La prueba se repitió tres veces en tres días consecutivos, después de un periodo de entrenamiento inicial de tres días antes de la primera prueba. La marcha ajustada hacia adelante revela diferencias no consistentes entre animales lesionados y animales sanos control. Por tanto el análisis se restringió a marcha ajustada hacia atrás.
Prueba de equilibrio
También se midieron los ajustes de equilibrio después de un desafío postural durante las sesiones de prueba de la marcha. Las ratas se mantuvieron en la misma posición que la descrita en la prueba de marcha y, en lugar de moverse hacia los lados, el experimentador las inclinó hacia el lado de la garra que toca la tabla. Esta maniobra da como resultado una pérdida del equilibrio y se puntuó la capacidad de las ratas para recuperar el equilibrio mediante movimientos de los miembros delanteros en una escala que va de 0 a 3. Se da una puntuación de 0 para una colocación normal del miembro delantero. Cuando se retrasa el movimiento del miembro delantero pero se detecta una recuperación del equilibrio postural, se da una puntuación de 1. Una puntuación de 2 representa una reacción clara, aunque insuficiente, del miembro delantero, como se pone en evidencia por la contracción muscular, pero no tiene éxito en la recuperación del equilibrio, y la puntuación de 3 será para la ausencia de reacción de movimiento. La prueba se repitió tres veces al día sobre cada uno de los lados durante tres días consecutivos después de un periodo de entrenamiento inicial de tres días antes de la primera prueba.
Prueba de escalera (alcance de la garra)
Se usó una versión modificada de la prueba de escalera para la evaluación del comportamiento del alcance de la garra tres semanas después de producir la lesión primaria y secundaria. Se usaron cajas de prueba de plexiglás con una plataforma central y una escalera extraíble a cada lado. El aparato estaba diseñado de manera que sólo se puede usar la garra del mismo lado de cada escalera, proporcionando así una medición del uso independiente de los miembros delanteros. Para cada prueba los animales se dejaron en las cajas de prueba durante 15 minutos. La escalera doble se lleno con 7 x 3 bolitas de comida (bolitas de comida Precision, fórmula: P, dieta de roedor purificada, tamaño 45 mg; Sandown Scientific) a cada lado. Después de cada prueba se contó por separado el número de bolitas comidas (bolitas recuperadas con éxito) y el número de bolitas tomadas (tocadas pero no tiradas) para cada garra y la tasa de éxito (bolitas comidas/bolitas tomadas). Después de tres días de privación de comida (12 g por animal y día) los animales se sometieron a pruebas durante 11 días. El análisis completo sólo se realizó durante los últimos cinco días.
Tratamiento con MPTP
La neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidro-piridina (MPTP) provoca la degeneración de las neuronas dopaminérgicas (DAérgicas) mesencefálicas en roedores, primates no humanos, y humanos y, al hacerlo, reproduce muchos de los síntomas de la enfermedad de Parkinson. La MPTP da lugar a una notable reducción de los niveles de dopamina y de sus metabolitos, y del número de terminales dopaminérgicos en el cuerpo estriado así como una pérdida severa de los cuerpos celulares tiroxina hidrolasa (TH) inmunorreactivos en la sustancia negra, pars compacta.
Para obtener lesiones graves y duraderas, y reducir la mortalidad, los animales recibieron inyecciones únicas de MPTP, y a continuación se probaron para la gravedad de la lesión 7-10 días más tarde. Se administraron inyecciones sucesivas de MPTP los días 1, 2 y 3. Los animales recibieron la aplicación de 4 mg/kg de clorhidrato de MPTP (Sigma) en solución salina una vez al día. Todas las inyecciones fueron intraperitoneales (i.p.) y la disolución madre de MPTP se congeló entre inyecciones. Los animales fueron decapitados el día 11.
Inmunohistología
Tras la finalización de los experimentos de comportamiento, todos los animales fueron anestesiadas con 3 ml de tiopental (1 g/40 ml i.p., Tyrol Parma). Los ratones fueron perfundidos transcardialmente con PBS 0,01 M (pH 7,4) durante 2 min, seguido de paraformaldehído al 4% (Merck) en PBS durante 15 min. Los cerebros se extrajeron y se pusieron en paraformaldehído al 4% durante 24 h a 4ºC. Para la deshidratación a continuación se transfirieron a una disolución de sacarosa al 20% (Merck) en PBS 0,1 M a 4ºC hasta que estuvieron sumergidos. Los cerebros se congelaron en metilbutano a -20ºC durante 2 min y se almacenaron a -70ºC. Usando un cuchilla de microtomo (mod. 3800-Frigocut, Leica), se tomaron secciones de 25 \mum de la rodilla del cuerpo calloso (AP 1,7 mm) al hipocampo (AP 21,8 mm) y del AP 24,16 al AP 26,72. Se cortaron 46 secciones y se almacenaron en clasificadores en tampón Tris 0,25 M (pH 7,4) para la inmunohistoquímica.
Una serie de secciones se procesaron para la inmunohistoquímica de tirosina hidrolasa (TH) libre. Después de tres enjuagues en PBS 0,1 M, la actividad peroxidasa endógena se inactivó durante 10 minutos en H_{2}O_{2} al 0,3% \pmPBS. Después de enjuagar en PBS, las secciones se preincubaron en suero normal bovino al 10% (Sigma) durante 5 min como agente de bloqueo y se transfirieron a antisuero TH de conejo anti-rata primario (dilución 1:2000).
Después de la incubación durante toda la noche a temperatura ambiente, las secciones para la inmunorreactividad TH se enjuagaron en PBS (2 x 10 min) y se incubaron en inmunoglobulina G anti-conejo biotinilada crecida en cabra (dilución 1:200) (Vector) durante 90 min, se enjuagaron repetidamente y se transfirieron a disolución Vectastain ABC (Vector) durante 1 h. El tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobencidina (DAB; Sigma) en PBS 0,1 M, suplementado con H_{2}O_{2} al 0,005%, sirve como cromógeno en la posterior reacción de visualización. Las secciones se montaron sobre portaobjetos recubiertos de gelatina, se dejaron secar durante toda la noche, se contra-tiñeron con hematoxilina deshidratada en concentraciones de alcohol crecientes y se aclararon en acetato de butilo. Los cubreobjetos están montados sobre Entellan.
Prueba de la rueda giratoria
Usamos una modificación del procedimiento descrito por Rozas y Labandeira-Crarcia (1997), con un sistema CR-1 Rotamex (Columbus Instruments, Columbus, OH) que comprende un ordenador personal compatible con IBM, una tarjeta de toma de datos CIO-24, una unidad de control, y una unidad de rueda giratoria de cuatro carriles. La unidad de rueda giratoria consta de un eje rotatorio (diámetro 7,3 cm) y compartimentos individuales para cada ratón. El software del sistema permite la programación previa de protocolos de sesión con velocidades de rotación variables (0-80 rpm). Se usaron rayos infrarrojos para detectar cuándo un ratón había caído sobre la rejilla base por debajo de la rueda giratoria. El sistema registra la caída como el final del experimento para ese ratón, y se registró el tiempo total sobre la rueda giratoria, así como el momento de la caída y todos los parámetros de ajuste. Este sistema también permite el paso de una corriente débil a través de la rejilla base, para ayudar en el entrenamiento.
3. Demencia La tarea de reconocimiento del objeto
La tarea de reconocimiento del objeto se ha diseñado para valorar los efectos de las manipulaciones experimentales sobre el comportamiento cognitivo de los roedores. Una rata se pone en campo abierto, en el que están presentes dos objetos idénticos. Las ratas inspeccionan ambos objetos durante la primera prueba de la tarea de reconocimiento del objeto. En una segunda prueba, después de un intervalo de retención de, por ejemplo 24 horas, uno de los dos objetos usados en la primera prueba, el objeto "familiar", y un nuevo objeto se colocan en el campo abierto. Se registra el tiempo de inspección de cada uno de los objetos. Las mediciones básicas en la tarea de RO es el tiempo empleado por una rata en explorar los dos objetos en la segunda prueba. Una buena retención está reflejada por tiempos de exploración más altos hacia el nuevo objeto que hacia el objeto "familiar".
La administración del potenciador de reconocimiento putativo antes de la primera prueba permite la valoración de manera predominante de los efectos sobre los procesos de adquisición, y eventualmente, sobre los procesos de consolidación. La administración del compuesto de prueba después de la primera prueba permite valorar los efectos sobre los procesos de consolidación, mientras que la administración antes de la segunda prueba permite medir los efectos sobre los procesos de recuperación.
La tarea de evitación pasiva
La tarea de evitación pasiva valora el comportamiento de la memoria en ratas y ratones. El aparato de evitación inhibitorio consta de una caja con dos compartimentos con un compartimento iluminado y un compartimento oscuro. Los dos compartimentos están separados por una puerta de que puede ser accionada por el experimentador. Un umbral de 2 cm separa los dos compartimentos cuando la puerta de guillotina está levantada. Cuando la puerta está abierta, la iluminación en el compartimento oscuro es de 2 lux aproximadamente. La intensidad de luz es de 500 lux aproximadamente en el centro del suelo del compartimento iluminado.
Se dan dos sesiones de habituación, una sesión de choque, y una sesión de retención, separadas por intervalos entre sesiones de 24 horas. En las sesiones de habituación y en la sesión de retención se deja a la rata explorar el aparato durante 300 segundos. La rata se pone en el compartimento de luz, de cara a la pared opuesta a la puerta de guillotina. Después de un periodo de acomodación de 15 segundos, la puerta de guillotina se abre de manera que todas las partes del aparato se pueden visitar libremente. Las ratas normalmente evitan áreas con iluminación muy brillante y entrarán en el compartimento oscuro a los pocos segundos.
En la sesión de choque, la puerta de guillotina entre los compartimentos se baja tan pronto como la rata haya entrado con sus cuatro patas en el compartimento oscuro, y se administra una descarga de 1 mA durante 2 segundos. La rata se saca del aparato y se vuelve a poner en su jaula. El procedimiento durante la sesión de retención es idéntico al de las sesiones de habituación.
La latencia de paso, que es la primera latencia en entrar en el compartimento oscuro (en segundos) durante la sesión de retención es un índice del comportamiento de la memoria del animal; cuanto mayor es la latencia para entrar en el compartimento oscuro, mejor es la retención. Se administra un compuesto de prueba media hora antes de la sesión de choque, junto con 1 mg/kg de escopolamina. La escopolamina afecta al comportamiento de la memoria durante la sesión de retención 24 horas más tarde. Si el compuesto de prueba incrementa la latencia de entrada comparada con los controles tratados con escopolamina, es probable que presente potencial como mejorador de la cognición.
La tarea de escape del agua de Morris
La tarea de escape del agua de Morris mide el aprendizaje de la orientación espacial en roedores. Es un sistema de prueba que se ha usado ampliamente para investigar los efectos de compuestos terapéuticos putativos sobre las funciones cognitivas de ratas y ratones. El comportamiento de un animal se valoró en un tanque circular de agua con una plataforma de escape que está sumergida 1 cm aproximadamente por debajo de la superficie del agua. La plataforma de escape no es visible para un animal que nada en el tanque de agua. Se proporcionan indicaciones abundantes que aumentan la confusión con el mobiliario de la sala, incluyendo escritorios, equipos informáticos, un segundo tanque de agua, la presencia del experimentador, y con una radio sobre una balda que suena de fondo.
Los animales recibieron cuatro pruebas durante cinco sesiones de adquisición diarias. Una prueba se comenzó colocando un animal en la piscina, de cara a la pared del tanque. Se usó una vez cada una de las cuatro posiciones de partida en los cuadrantes Norte, Este, Sur, y Oeste en una serie de cuatro pruebas; su orden es aleatorio. La plataforma de escape está siempre en la misma posición. La prueba termina en cuanto el animal haya trepado a la plataforma de escape o cuando hayan pasado 90 segundos, cualquiera de los sucesos que se produzca primero. Se permite al animal permanecer sobre la plataforma durante 30 segundos. A continuación se toma de la plataforma y se inicia la prueba siguiente. Si un animal no encuentra la plataforma en 90 segundos, es puesto sobre la plataforma por el experimentador y se le permite permanecer allí durante 30 segundos. Después de la cuarta prueba de la quinta sesión diaria, se lleva a cabo una prueba adicional como prueba de exploración: se retira la plataforma, y se mide el tiempo que el animal pasa en los cuatro cuadrantes durante 30 ó 60 segundos. En la prueba de exploración, todos los animales parten de la misma
posición de partida, opuesta al cuadrante en la que se había posicionado la plataforma de escape durante la adquisición.
Se toman cuatro medidas diferentes para evaluar el comportamiento de un animal durante el entrenamiento de adquisición: latencia de escape, distancia recorrida, distancia hasta la plataforma, y velocidad de nado. Se evalúan las siguientes mediciones para la prueba de exploración: tiempo (s) en los cuadrantes y distancia recorrida (cm) en los cuatro cuadrantes. La prueba de exploración proporciona información adicional sobre lo bien que un animal aprende la posición de la plataforma de escape. Si un animal pasa más tiempo y nada una distancia más larga en el cuadrante en el que se había colocado la plataforma durante las sesiones de adquisición que cualquiera de los otros cuadrantes, se concluye que la posición de la plataforma se había aprendido bien.
Para valorar los efectos de los compuestos que mejoran la cognición putativa, se usaron ratones o ratas con lesiones cerebrales específicas que deterioran las funciones cognitivas, o los animales se trataron con compuestos tales como escopolamina o MK-801, que interfieren con el aprendizaje normal, o animales mayores que padecen de déficits cognitivos.
La tarea de alternancia espontánea del laberinto en T
La tarea de alternancia espontánea del laberinto en T (TeMCAT) valora el comportamiento de la memoria espacial en ratones. El brazo de partida y los dos brazos de llegada del laberinto en T se proporcionan con puertas de guillotina que pueden ser accionadas manualmente por el experimentador. Se pone un ratón en el brazo de partida al comienzo del entrenamiento. La puerta de guillotina se cierra. En la primera prueba, la "prueba forzada", el brazo de llegada izquierdo o derecho se bloquea bajando la puerta de guillotina. Después de que el ratón haya sido liberado del brazo de partida, recorrerá el laberinto, eventualmente entrará en el brazo de llegada abierto, y volverá a la posición de partida, en la que será confinado durante 5 segundos, bajando la puerta de guillotina. A continuación, el animal puede elegir libremente entre el brazo de llegada izquierdo y derecho (todas las puertas de guillotina abiertas) durante 14 pruebas de "elección libre". Tan pronto como el ratón haya entrado en un brazo de llegada, el otro se cierra. El ratón eventualmente regresa al brazo de partida y es libre de visitar cualquier brazo de llegada que quiera después de haber sido confinado en el brazo de partida durante 5 segundos. Después de completar las 14 pruebas de libre elección en una sesión, el animal se saca del laberinto. Durante el entrenamiento, el animal nunca es manipulado.
Se calcula el porcentaje de alternancias de las 14 pruebas. Se analiza este porcentaje y el tiempo total necesario para completar la primera prueba forzada y las siguientes 14 pruebas de libre elección (en segundos). Los déficits cognitivos normalmente se inducen con una inyección de escopolamina, 30 minutos antes del comienzo de la sesión de entrenamiento. La escopolamina redujo el porcentaje de alternaciones hasta el nivel de probabilidad, o inferior. Un mejorador de la cognición, que siempre se administra antes de la sesión de entrenamiento, antagonizará, al menos parcialmente, la reducción inducida por escopolamina en la tasa de alternación espontánea.
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Ejemplo 10 Perfil de expresión en tejidos humanos
El ARN celular total se aisló a partir de células mediante uno de los dos procedimientos habituales: (1) centrifugación en gradiente de densidad de isotiocianato de guanidina/cloruro de cesio o (2) el protocolo del Tri-Reagent según las especificaciones del fabricante (Molecular Research Center, Inc., Cincinatti, Ohio). El ARN total preparado mediante el protocolo del Tri-Reagent se trató con DNasa I para eliminar la contaminación de ADN genómico.
Para la cuantificación relativa de la distribución del ARNm de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, primero se sometió a la transcriptasa inversa el ARN total procedente de cada fuente de células o de tejido. 85 \mug de ARN total se sometieron a transcriptasa inversa usando 1 \mumol de cebadores hexámeros aleatorios, 0,5 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP (Qiagen, Hilden, Alemania), 3000 U de RnaseQut (Invitrogen, Groningen, Holanda) en un volumen final de 680 \mul. El tampón de síntesis de la primera cadena y la transcriptasa inversa Omniscript (2 u/\mul) eran de Qiagen, Hilden, Alemania. La reacción se incubó a 37ºC durante 90 minutos y se enfrió en hielo. El volumen se ajustó a 6800 \mul con agua, dando una concentración final de 12,5 ng/\mul de ARN de partida.
Para la cuantificación relativa de la distribución del ARNm de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en células y tejidos se usó el sistema de detección de secuencias Perkin Elmer ABI Prism® 7700 Sequence Detection o el iCycler de Biorad según las especificaciones del fabricante y los protocolos de las reacciones de PCR se ajustaron para cuantificar la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y los genes domésticos HPRT, GAPDH, \beta-actina, y otros. Los cebadores directos e inversos y la sonda para la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 se diseñaron usando el software Perkin Elmer ABI Primer Express^{TM} y se sintetizaron en TibMolBiol (Berlín, Alemania). La secuencia del cebador directo de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 era: CAGGATTCAGAGGCAAAGGG. La secuencia del cebador inverso de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 era: ACCACCTTGGACTCCCCT
TAGCAACG. La sonda fluorogénica, marcada con FAM como colorante informador y TAMRA como inactivador, es CGAAGATGTGTCGAGCTCATG.
Se prepararon las siguientes reacciones en un volumen final de 25 \mul: tampón A 1X TaqMan, MgCl_{2} 5,5 mM, 200 nM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dUTP, 0,025 U/\mul de AmpliTaq Gold^{TM}, 0,01 U/\mul de AmpErase UNG® y sonda 1X, cebadores directo e inverso de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 cada uno a 200 nM, sonda marcada con FAM/TAMRA de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 200 nM, y 5 \mul de ADNc molde. Los parámetros de ciclación térmicos fueron 2 minutos mantenidos a 50ºC, 10 minutos mantenidos a 95ºC, seguido de fusión a 95ºC durante 15 segundos e hibridación/extensión a 60ºC durante 1 min para cada uno de los 40 ciclos.
Cálculo de los valores de CT correctos
El valor de CT se calcula como se ha descrito anteriormente. El valor de CT se calcula como sigue:
1. Las reacciones de PCR se ajustaron para cuantificar los genes domésticos (HKG) para cada muestra de ADNc.
2. Los valores de CTHKG se calcularon como se ha descrito anteriormente.
3. Se calcularon los valores medios de CT de todos los HKG para cada ADNc (n = número de HKG):
(CT_{HKG1}-valor + CT_{HKG2}-valor + CT_{HKG}-X-valor)/n = CT_{ADNc}-X-valores medios
(n = número de HKG)
(CT_{ADNc}-1- valor medio + CT_{ADNc} -X-valor medio)/y=CT_{panel}-valor medio
(y = número de ADNc)
CT_{panel}- valor medio-CT_{ADNc-X}-valor medio =CF_{ADNc}-X
CT_{cDNA-X}+CF_{cDNA-X}=CT_{cor-cDNA-X}
Cálculo de la expresión relativa
Definición: CT_{cor-ADNc-X} \neq 40 más alta se define como CT_{cor-ADNc-X} [alta]
Expresión relativa = 2e(CT_{cor-ADNc-X} [alta] - CT_{cor-ADNc}
Los resultados de la cuantificación de ARNm (perfil de expresión) se muestran en las Figuras 9-11. La serina/treonina proteína quinasa humana de tipo WEE1 se expresa en diferentes tejidos humanos. La serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 está muy expresada en el cerebelo, giro post-central, meninges cerebrales, tálamo, retina, ganglios de la raíz dorsal, aorta, corazón, eritrocitos, trombocitos, nódulos linfáticos, tumor pulmonar, COPD pulmonar, cérvix, BPH prostática, tumor cerebral, pene.
La serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 está muy expresada en diferentes tejidos cerebrales como el cerebelo, giro post-central, meninges cerebrales, tálamo, retina, ganglios de la raíz dorsal. La expresión en los tejidos anteriormente mencionados sugiere una asociación entre la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y las enfermedades del sistema nervioso central y periférico.
La serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 está muy expresada en tumor pulmonar y tumor de mama. La expresión de los tejidos anteriormente mencionados sugiere una asociación entre la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y el cáncer.
La serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 está muy expresada en BPH prostática y pene. La expresión en los tejidos anteriormente mencionados sugiere una asociación entre la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y enfermedades genitourinarias.
La serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 está muy expresada en corazón, aorta. La expresión en los tejidos anteriormente mencionados sugiere una asociación entre la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y las enfermedades cardiovasculares.
La serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 está muy expresada en pulmón y COPD pulmonar. La expresión en los tejidos anteriormente mencionados sugiere una asociación entre la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 y las enfermedades respiratorias.
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Ejemplo 11 Perfil de expresión en tejidos humanos relevantes para la patofisiología de la diabetes y la obesidad Extracción de ARN y preparación de ADNc
El ARN total para los análisis cuantitativos Taqman se adquirió en (Clontech, CA) o se extrajo de tejidos usando el reactivo TRIzol (Life Technologies, MD) según un protocolo modificado del vendedor que utiliza el protocolo Rneasy (Qiagen, CA).
100 \mug de cada ARN se trataron con DNasa I usando DNasa libre de RNasa (Qiagen, CA) para su uso con columnas RNeasy o QiaAmp.
Después de la elución y la cuantificación con Ribogreen (Molecular Probes Inc., OR) cada muestra se sometió a transcriptasa inversa usando el sistema GibcoBRL Superscript II First Strand Synthesis System para RT-PCR según el protocolo del vendedor (Life Technologies, MD). La concentración final de ARN en la mezcla de reacción fue de 50 ng/\mul. La transcripción inversa se realizó con 50 ng de hexámeros aleatorios
Análisis cuantitativo TaqMan
Los cebadores específicos y la sonda se diseñaron según las recomendaciones del programa PE Applied Biosystems' Primer Express y se listan a continuación:
*cebador directo: 5'-(TCCAGTGTCACACCCTCTCAAA)-3'
*cebador inverso: 5'-(TGTCACTGGGCAGCAGCTT)-3'
*sonda: SYBR Green
La longitud esperada del producto de la PCR era de -76 pb.
Los experimentos de cuantificación se realizaron sobre 25 ng de ARN transcrito inversamente a partir de cada muestra. Se midió ARN ribosómico 18S como control usando el Pre-Developed TaqMan Assay Reagents (PDAR) (PE Applied Biosystems, CA). La mezcla de reacción del ensayo fue la siguiente:
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones de la PCR:
Una vez:
2' minutos a 50ºC
10 minutos a 95ºC
40 ciclos:
15 segundos a 95ºC
1 minuto a 60ºC
\newpage
El experimento se realizó en un ABI Prism 7700 Sequence Detector (PE Applied Biosystems, CA). Al final de la carrera, los datos de fluorescencia adquiridos durante la PCR se procesaron como se divulga en el manual de usuario del ABI Prism 7700. Se calculó el cambio múltiplo usando el procedimiento delta-delta CT con normalización a los valores de 18S. Se calculó la expresión relativa normalizando a 18S (D Ct), y a continuación haciendo la expresión tisular más alta igual a 100 y todo lo demás en relación a ella. Se realizó la conversión del número de copias sin normalización usando la fórmula Cn=10^{(Ct-40,007)/-3,623}. Los resultados de la cuantificación del ARNm (perfil de expresión) se muestran en la Fig. 12
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Bayer AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> REGULACIÓN DE LA SERINA/TREONINA PROTEÍNA QUINASA HUMANA DE TIPO WEE1
\vskip0.400000\baselineskip
<130> LIO283 Países extranjeros
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/265.352
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-02-01
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/324.051
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-09-24
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/334.974
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-12-04
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1677
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1677)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
2
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 559
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
5
6
7 
\hskip1.2cm
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 555
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Xenopus laevis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
9
10
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2358
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 785
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
15
16
17
18
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda fluorogénica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
24

Claims (9)

1. Un polinucleótido aislado que se selecciona del grupo constituido por:
a) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID Nº: 2 o SEQ ID Nº: 6.
b) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID Nº: 1 o la SEQ ID Nº: 5; y
c) un polinucleótido, cuya secuencia se desvía de las secuencias de polinucleótidos especificadas en (a) debido a la degeneración del código genético y que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un vector de expresión que contiene cualquier polinucleótido de la reivindicación 1.
3. Una célula hospedadora que contiene el vector de expresión de la reivindicación 2.
4. Un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 sustancialmente purificado codificado por un polinucleótido de la reivindicación 1.
5. Un procedimiento para producir un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas:
a) cultivo de la célula hospedadora de la reivindicación 3 en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1; y
b) recuperación del polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 del cultivo de la célula hospedadora.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Un procedimiento para la detección de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 en una muestra biológica que comprende las siguientes etapas:
a) hibridación de cualquier polinucleótido seleccionado del grupo constituido por
i)
un polinucleótido que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
secuencias de aminoácidos que son al menos un 90% idénticas a
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2;
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2;
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2;
secuencias de aminoácidos que son al menos un 90% idénticas a
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 6; y
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 6.
ii)
un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID Nº: 1 o la SEQ ID Nº: 5;
iii)
un polinucleótido que se híbrida en condiciones restrictivas para un polinucleótido especificado en (i) y (ii) y que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1; y
iv)
un polinucleótido, cuya secuencia se desvía de las secuencias de polinucleótidos especificadas en (i) a (iii) debido a la degeneración del código genético y que codifica un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1; y
b) la detección de dicho complejo de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que antes de la hibridación, se amplifica el material del ácido nucleico de la muestra biológica.
\newpage
8. Un procedimiento para la detección de un polinucleótido como se define en la reivindicación 6 o un polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1 que codifica para ese polinucleótido que comprende las etapas de:
puesta en contacto de una muestra biológica con un reactivo que interacciona específicamente con el polinucleótido o con el polipéptido de la serina/treonina proteína quinasa de tipo WEE1.
9. Un kit diagnóstico para llevar a cabo el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.
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PT118269A (pt) * 2022-10-20 2024-04-22 Univ Aveiro Pkmyt1 for use in regenerative medicine

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US6020194A (en) * 1996-10-04 2000-02-01 California Institute Of Technology DNA encoding a Myt1 polypeptide

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