WO2010047310A1 - 腫瘍抗原ペプチド及びその利用 - Google Patents

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tumor
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昇志 佐藤
智英 塚原
哲 川口
卓郎 和田
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大日本住友製薬株式会社
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    • G01N2333/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules

Definitions

  • the present invention relates to a tumor antigen peptide. More specifically, the present invention relates to the use of a partial peptide of tumor antigen protein [Papillomavirus binding factor (PBF)] and its gene in the field of cancer immunity.
  • PPF tumor antigen protein
  • CTLs cytotoxic T cells
  • CTLs cytotoxic T cells
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • HLA antigen a complex of an antigen peptide (tumor antigen peptide) on a tumor cell and an MHC (Major Histocompatibility Complex) class I antigen (referred to as HLA antigen in humans), and attacks and destroys the tumor cell.
  • Tumor antigen peptides are produced by synthesizing tumor-specific proteins, ie, tumor antigen proteins, in cells and then being degraded in the cells by proteases.
  • tumor antigen peptide binds to the MHC class I antigen (HLA antigen) in the endoplasmic reticulum to form a complex, and is transported to the cell surface to present the antigen.
  • HLA antigen MHC class I antigen
  • Tumor-specific CTL recognizes this antigen-presented complex, and exhibits antitumor effects through cytotoxicity and lymphokine production.
  • cancer immunotherapeutic agent cancer vaccine
  • tumor antigen protein applicable to cancer including sarcoma such as osteosarcoma, Papillomavirus binding factor (PBF, GenBank database Accession No. AF263928) that recognizes the E2 binding site of papillomavirus.
  • PPF Papillomavirus binding factor
  • SEQ ID NO: 2 has been reported (Patent Document 1), and tumor antigen peptides that bind to HLA-A24 or HLA-B55 antigen are mentioned.
  • a tumor antigen peptide derived from PBF that binds to the HLA-A2 antigen has not yet been found.
  • An object of the present invention is to provide use of a partial peptide of tumor antigen protein PBF that binds to HLA-A2 antigen and its gene in the field of cancer immunity.
  • the inventors of the present invention are partial peptides of papillomavirus binding factor (PBF) (SEQ ID NO: 2) registered as GenBank Accession No. AF263928, which are HLA-A2 antigens.
  • PPF papillomavirus binding factor
  • the tumor antigen peptide that binds to was found. It was clarified that the tumor antigen peptide can be used as an inducer of CTL in vivo or in vitro, that is, as a cancer vaccine, and exerts a therapeutic or improving effect on tumors such as osteosarcoma and renal cancer.
  • the tumor antigen peptide is also useful as a tumor marker for tumors such as sarcoma and renal cancer.
  • the present invention is as follows.
  • a peptide consisting of an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and binding to an HLA antigen to cytotoxic T cells (hereinafter referred to as “CTL”).
  • CTL cytotoxic T cells
  • Peptides recognized by [2] The peptide according to [1] above, wherein the HLA antigen is HLA-A2.
  • a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding the peptide according to any one of [1] to [4] above.
  • a CTL inducer comprising the nucleic acid according to [8] above.
  • [12] The following (a) or (b): (A) the peptide according to any one of [1] to [3] above, (B) a nucleic acid containing a polynucleotide encoding the peptide according to (a) above, A method for inducing CTL, comprising contacting any of the above and peripheral blood lymphocytes in vitro. [13] CTL induced by the induction method described in [12] above. [14] An antibody that specifically binds to the peptide of any one of [1] to [4] above.
  • a tumor marker comprising a polynucleotide encoding a peptide comprising the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 4, or a polynucleotide complementary to the polynucleotide.
  • a tumor marker comprising a polypeptide comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the tumor marker according to [17] above comprising the same polypeptide as the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the tumor marker according to [19] above comprising an antibody against the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • a tumor diagnostic agent comprising the tumor marker according to any one of [15] to [20], [22] and [24] above.
  • the present invention provides a tumor antigen peptide useful as an inducer of CTL, its gene, and the like.
  • the CTL inducer of the present invention is useful as a therapeutic agent for sarcoma, renal cancer and the like.
  • FIG. 5 It is a figure which shows the peptide specific cytotoxic activity of CTL5A9.
  • the vertical axis represents the cytotoxic activity, and the horizontal axis represents the ratio of the number of CTL5A9 cells (effector) to the number of target cells (target).
  • the presence or absence of PBF expression, HLA-A0201 expression, and IFN- ⁇ treatment in each cell line is indicated by + and-.
  • the cytotoxic activity of CTL5A9 against each cell line was evaluated by changing the effector: target ratio.
  • the peptide of the present invention contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • a partial peptide of the PBF protein which is a tumor antigen peptide that binds to an HLA antigen, preferably an HLA-A2 antigen and is recognized by CTL.
  • the “substantially identical amino acid sequence” is not particularly limited as long as it has the same activity as the tumor antigen peptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4, and specifically, described in SEQ ID NO: 4.
  • the peptide of the present invention may be a peptide derived from a natural product (for example, the PBF protein), or may be a synthetic peptide.
  • the length of the peptide is preferably 11 or less amino acids, more preferably 9 amino acids.
  • the synthesis of the peptide of the present invention can be carried out according to a method used in ordinary peptide chemistry.
  • the known methods include literature (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; peptide synthesis, Maruzen (stock) ), 1975; Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985; Development of Drugs, Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991, these references are incorporated by reference) The methods described are mentioned.
  • Whether the peptide of the present invention has activity as a tumor antigen peptide can be confirmed by assaying whether a complex with the HLA-A2 antigen is recognized by CTL.
  • Specific examples include the method described in J. Immunol., 154, p2257, 1995 (this document constitutes a part of this application by reference). That is, when peripheral blood lymphocytes were isolated from a human positive for HLA-A2 antigen and stimulated by adding the candidate peptide in vitro, HLA-A2 antigen positive cells pulsed with the candidate peptide were specifically identified. What is necessary is just to confirm that CTL to recognize is induced.
  • the presence or absence of CTL induction can be examined, for example, by measuring the amount of various cytokines (for example, IFN- ⁇ ) produced by CTL in response to antigen peptide-presenting cells, for example, by ELISA. .
  • the 51 method of measuring the cytotoxicity of CTL against labeled antigen peptide presenting cells by Cr (51 Cr release assay, Int.J.Cancer, 58: p317,1994, this reference is incorporated herein by reference) Can also be examined.
  • Examples of the CTL include those prepared by peptide stimulation of human peripheral blood lymphocytes, Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995.
  • CTL established by the method described in, for example, can be used.
  • the peptide of the present invention can be used, for example, in assays using human model animals (WO 02/47474, Int J. Cancer: 100,565-570 (2002), which are incorporated herein by reference). By providing, the in vivo activity can be confirmed.
  • the peptide of the present invention further includes a peptide (polyepitope peptide) obtained by linking a plurality of epitopes containing the peptide of the present invention. Accordingly, the polyepitope peptide that has CTL-inducing activity can also be exemplified as a specific example of the peptide of the present invention.
  • the polyepitope peptide is (i) specifically, a peptide obtained by linking a peptide of the present invention and any other PBF-derived CTL epitopes (tumor antigen peptides), (ii) a peptide of the present invention A peptide in which a helper epitope is linked, or (iii) a peptide in which a helper epitope is further linked to any of a plurality of CTL epitopes (tumor antigen peptides) derived from the peptide of the present invention and other PBF,
  • the resulting tumor antigen peptide is presented to antigen-presenting cells and is defined as a peptide that induces CTL-inducing activity.
  • the epitope to be linked to the peptide of the present invention is a helper epitope
  • examples of the helper epitope to be used include HBVc128-140 derived from hepatitis B virus and TT947-967 derived from tetanus toxin as described above.
  • the length of the helper epitope can be about 13 to 30 amino acids, preferably about 13 to 17 amino acids.
  • Such a peptide in which a plurality of epitopes are linked can be produced by a general peptide synthesis method as described above. Moreover, based on the sequence information of the polynucleotide which codes the polyepitope peptide which connected these several epitope, it can also manufacture using normal DNA synthesis and a genetic engineering technique. That is, by inserting the polynucleotide into a well-known expression vector, transforming the host cell with the obtained recombinant expression vector, culturing a transformant, and ligating a plurality of target epitopes from the culture. It can be produced by recovering the polyepitope peptide.
  • nucleic acid of the present invention contains a polynucleotide encoding the peptide of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention may be any of cDNA, mRNA, cRNA, or synthetic DNA of various cells and tissues, for example, cells and tissues derived from osteosarcoma and kidney cancer. Further, it may be either single-stranded or double-stranded.
  • nucleic acid containing the polynucleotide of the present invention can be in either single-stranded or double-stranded form.
  • a recombinant expression vector for expressing the peptide of the present invention can be prepared by inserting the polynucleotide of the present invention into an expression vector. That is, the category of the nucleic acid of the present invention includes a recombinant expression vector prepared by inserting the double-stranded polynucleotide of the present invention into an expression vector.
  • the expression vector used here can be appropriately selected according to the host to be used, the purpose, etc., and includes plasmids, phage vectors, virus vectors and the like.
  • examples of the vector include plasmid vectors such as pUC118, pUC119, pBR322, and pCR3, and phage vectors such as ⁇ ZAPII and ⁇ gt11.
  • examples of the vector include pYES2, pYEUra3 and the like.
  • the host is an insect cell, pAcSGHisNT-A and the like can be mentioned.
  • plasmid vectors such as pCEP4, pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc / RSV, pRc / CMV, and viral vectors such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, and adeno-associated virus vectors Is mentioned.
  • the vector may appropriately have factors such as a promoter capable of inducing expression, a gene encoding a signal sequence, a selection marker gene, and a terminator. Further, a sequence expressed as a fusion protein with thioredoxin, His tag, GST (glutathione S-transferase) or the like may be added so that isolation and purification can be facilitated.
  • a GST fusion protein vector such as pGEX4T
  • an appropriate promoter such as lac, tac, trc, trp, CMV, or SV40 early promoter
  • a vector that has a tag sequence such as Myc or His. (PcDNA3.1 / Myc-His, etc.)
  • a vector (pET32a) that expresses a fusion protein with thioredoxin and His tag can be used.
  • a transformed cell containing the expression vector By transforming the host with the expression vector prepared above, a transformed cell containing the expression vector can be prepared.
  • the host used here include Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells and the like.
  • E. coli include HB101 strain, C600 strain, JM109 strain, DH5 ⁇ strain, AD494 (DE3) strain and the like of E. coli K-12 strain.
  • yeast include Saccharomyces cerevisiae.
  • animal cells include L929 cells, BALB / c3T3 cells, C127 cells, CHO cells, COS cells, Vero cells, Hela cells, and 293-EBNA cells. Insect cells include sf9.
  • a normal method suitable for the host cell may be used. Specific examples include a calcium phosphate method, a DEAE-dextran method, an electroporation method, and a method using a lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL).
  • a transformed cell in which the expression vector is introduced into the host cell can be selected by culturing in a normal medium containing a selection marker.
  • the peptide of the present invention can be produced by continuing to culture the transformed cells obtained as described above under suitable conditions.
  • the obtained peptide can be further isolated and purified by general biochemical purification means.
  • the purification means include salting out, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography and the like.
  • the peptide of the present invention when expressed as a fusion protein with the aforementioned thioredoxin, His tag, GST or the like, it can be isolated and purified by a purification method utilizing the properties of these fusion protein and tag.
  • the polynucleotide encoding the peptide of the present invention may be in the form of DNA or RNA.
  • polynucleotides of the present invention can be easily produced based on the amino acid sequence information of the peptide of the present invention and the sequence information of the DNA encoded thereby. Specifically, it can be produced by ordinary DNA synthesis or PCR amplification.
  • the polynucleotide encoding the peptide of the present invention includes the polynucleotide encoding the epitope peptide.
  • the nucleic acid containing the polynucleotide encoding the peptide of the present invention can take either a single-stranded or double-stranded form.
  • a recombinant expression vector for expressing the peptide of the present invention can be prepared by inserting the polynucleotide of the present invention into an expression vector.
  • the expression vector, host cell, host cell transformation method, and the like used here are the same as described above.
  • Inducing agent of CTL comprising the peptide of the present invention as an active ingredient
  • the peptide of the present invention can be an inducing agent of CTL having CTL inducing activity. Induced CTL can exert an antitumor effect through cytotoxicity or lymphokine production. Therefore, the peptide of the present invention can be used as an active ingredient of a medicament for treating or preventing tumors.
  • a CTL inducer containing the peptide of the present invention as an active ingredient is administered to a tumor patient, the peptide of the present invention is presented to the HLA-A2 antigen of the antigen-presenting cell, and the binding between the HLA-A2 antigen and the presented peptide Complex-specific CTL can proliferate and destroy tumor cells, so that the patient's tumor can be treated or prevented.
  • the CTL inducer comprising the peptide of the present invention as an active ingredient can also be used for PBF protein-positive and HLA-A2 antigen-positive tumor patients described in SEQ ID NO: 2. Specifically, it can be used for the prevention or treatment of general sarcomas such as osteosarcoma or cancer (tumor) such as renal cancer.
  • the CTL inducer comprising the peptide of the present invention as an active ingredient may be a single CTL epitope (the peptide of the present invention) as an active ingredient or linked to other peptides (CTL epitope or helper epitope).
  • CTL epitope or helper epitope peptides
  • a polyepitope peptide prepared as an active ingredient may be used. In recent years, it has been shown that polyepitope peptides in which a plurality of CTL epitopes (antigen peptides) are linked have CTL-inducing activity efficiently in vivo.
  • HLA-A2, -A3, -A11, B53-restricted CTL epitopes derived from cancer antigen protein PSA It is described that an approximately 30-mer polyepitope peptide linked with an antigen peptide) induced CTL specific for each CTL epitope in vivo. It has also been shown that CTL is efficiently induced by a polyepitope peptide in which a CTL epitope and a helper epitope are linked.
  • the CTL inducer comprising the peptide of the present invention as an active ingredient is administered in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, for example, an appropriate adjuvant, or in combination so that cellular immunity is effectively established. be able to.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, an appropriate adjuvant, or in combination so that cellular immunity is effectively established. be able to.
  • a liposome preparation a particulate preparation bound to beads having a diameter of several ⁇ m, a preparation bound to a lipid, a microsphere preparation, a microcapsule preparation, and the like are also conceivable.
  • the administration method include intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration and the like.
  • the dosage of the peptide of the present invention in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, but is usually 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.001 mg to 1000 mg, more preferably 0.1 mg. ⁇ 10 mg, which is preferably administered once every few days to several months.
  • CTL inducer comprising nucleic acid of the present invention as an active ingredient
  • a cell expressing the nucleic acid of the present invention is characterized by being recognized by CTL. That is, the nucleic acid of the present invention is an inducer of CTL. Induced CTL can exert an antitumor effect through cytotoxicity or lymphokine production. Therefore, the nucleic acid of the present invention can be used as an active ingredient of a medicament for treating or preventing tumors.
  • the inducer of CTL containing the nucleic acid of the present invention as an active ingredient is capable of treating or preventing a tumor, for example, by administering and expressing the nucleic acid of the present invention to a tumor patient.
  • the tumor antigen peptide when the nucleic acid of the present invention incorporated into an expression vector is administered to a tumor patient by the following method, the tumor antigen peptide is highly expressed in the antigen-presenting cells. Thereafter, the resulting tumor antigen peptide binds to the HLA-A2 antigen to form a complex, and the complex is presented at a high density on the surface of the antigen-presenting cell. Proliferates and destroys tumor cells. As described above, treatment or prevention of a tumor is achieved.
  • the CTL inducer comprising the nucleic acid of the present invention as an active ingredient is also used for tumor patients who are positive for the PBF gene described in SEQ ID NO: 1 and PBF protein-positive HLA-A2 antigen, which is an expression product of the gene. be able to. Specifically, it can be used for the prevention or treatment of general sarcomas such as osteosarcoma or cancer such as renal cancer.
  • a viral vector method and other methods (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine Extra Number, 12 (15), (1994), and these cited references, etc., which are incorporated herein by reference).
  • the DNA of the present invention is incorporated into a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a poxvirus, a poliovirus, a simbisvirus, or the like, and the DNA of the present invention is introduced.
  • a method is mentioned. Of these, methods using retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses and the like are particularly preferred.
  • Examples of other methods include a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and the like. The method is preferred.
  • nucleic acid of the present invention In order for the nucleic acid of the present invention to actually act as a medicine, an in vivo method in which the nucleic acid is directly introduced into the body, and certain cells from human beings are collected and the nucleic acid is introduced into the cells outside the body, and the cells are brought into the body.
  • ex vivo methods Nekkei Science, April 1994, 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine Extra Number, 12 (15), (1994), and These references, such as these references, form part of this application by reference). In vivo methods are more preferred.
  • the in vivo method When administered by an in vivo method, it can be administered by an appropriate administration route according to the disease, symptom or the like for the purpose of treatment. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, intradermally, intramuscularly. When administered by an in vivo method, for example, it can take a pharmaceutical form such as a liquid, but is generally an injection containing the nucleic acid of the present invention which is an active ingredient, and is pharmaceutically acceptable if necessary. Added carriers may be added.
  • the liposome or membrane-fused liposome (Sendai virus (HVJ) -liposome etc.) containing the nucleic acid of the present invention can be in the form of a liposome preparation such as a suspension, a freezing agent, or a centrifugal concentrated freezing agent.
  • the content of the nucleic acid of the present invention in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, but usually the polynucleotide content in the nucleic acid is 0.0001 mg to 100 mg, preferably 0.001.
  • mg to 10 mg of the nucleic acid of the invention is administered once every few days to several months.
  • a polynucleotide encoding a polyepitope peptide in which a plurality of CTL epitopes (tumor antigen peptides) are linked, or a polynucleotide encoding a polyepitope peptide in which a CTL epitope and a helper epitope are linked has been efficiently used in vivo. Has been shown to have CTL-inducing activity.
  • Journal of Immunology 1999, 162: 3915-3925 (this document constitutes part of the present application by reference) includes 6 types of HLA-derived HLA-A2 restricted antigen peptides, 3 types of HLA-A11 restricted antigen peptides,
  • DNA (minigene) encoding an epitope peptide linked to a helper epitope effectively induced CTL for each epitope in vivo.
  • a polynucleotide produced by ligating one or more polynucleotides encoding the peptide of the present invention and, optionally, also linking a polynucleotide encoding another peptide may be appropriately expressed.
  • a CTL inducer By incorporating into a vector, it can be used as an active ingredient of a CTL inducer.
  • Such an inducer of CTL can take the same administration method and administration form as described above.
  • Antigen-presenting cells of the present invention can be used in vitro as follows in the treatment of tumor patients. That is, antigen-presenting cells can be produced by contacting either the peptide or nucleic acid of the present invention with cells having antigen-presenting ability in vitro. Specifically, the present invention provides an in vitro contact between an isolated antigen-presenting cell derived from a tumor patient and any of the peptides or nucleic acids of the present invention, thereby causing HLA on the cell surface of the cell. An antigen-presenting cell on which a complex of the A2 antigen and the peptide of the present invention is presented, and a method for producing the same are provided.
  • the “cell having antigen-presenting ability” is not particularly limited as long as it is a cell that expresses the HLA-A2 antigen capable of presenting the peptide of the present invention on the cell surface. Dendritic cells are preferred.
  • the substance added to prepare the antigen-presenting cell of the present invention from the cell having the antigen-presenting ability may be either the peptide or the nucleic acid of the present invention.
  • the antigen-presenting cell of the present invention is a complex of an HLA-A2 antigen and a peptide of the present invention, wherein a cell having antigen-presenting ability is isolated from a tumor patient, and the peptide of the present invention is pulsed in vitro to the cell. (Cancer Immunol.Immunother., 46: 82,1998, J.Immunol., 158, p1796,1997, Cancer Res., 59, p1184,1999, these references are incorporated herein by reference. Part).
  • dendritic cells for example, lymphocytes are isolated from the peripheral blood of tumor patients by Ficoll method, then non-adherent cells are removed, and adherent cells are cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 to form dendritic cells.
  • the antigen-presenting cell of the present invention can be prepared by inducing cells, culturing the dendritic cell with the peptide of the present invention, and pulsing.
  • the antigen-presenting cell of the present invention is prepared by introducing the nucleic acid of the present invention into a cell having the antigen-presenting ability, the nucleic acid may be in the form of DNA or RNA. good.
  • the antigen-presenting cell can be an active ingredient of a CTL inducer.
  • the CTL inducer containing the antigen-presenting cells as an active ingredient preferably contains physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), a medium, or the like in order to stably maintain the antigen-presenting cells.
  • the administration method include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration.
  • CTL of the present invention can be used in vitro as follows in the treatment of tumor patients. That is, CTL can be induced by contacting any of the peptides and nucleic acids of the present invention with peripheral blood lymphocytes in vitro. Specifically, the present invention provides a CTL induced by contacting a peripheral blood lymphocyte derived from a tumor patient with either the peptide or nucleic acid of the present invention in vitro, and a method for inducing the CTL. is there.
  • melanoma a therapeutic effect has been observed in adoptive immunotherapy in which a patient's own tumor-infiltrating T cells are cultured in large quantities outside the body and then returned to the patient (J. Natl. Cancer. Inst., 86: 1159, 1994, which is hereby incorporated by reference).
  • spleen cells were stimulated with tumor antigen peptide TRP-2 in vitro, CTL specific for tumor antigen peptide was propagated, and the CTL was administered to melanoma transplanted mice to suppress metastasis. Is recognized (J. Exp. Med., 185: 453, 1997).
  • the CTL can be used as an active ingredient of a therapeutic or prophylactic agent for tumors.
  • the therapeutic agent or prophylactic agent preferably contains physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), a medium, or the like in order to stably maintain CTL.
  • the administration method include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration.
  • the CTLs By returning a therapeutic or prophylactic agent for tumors containing such CTLs as an active ingredient to the body of the patient, the CTLs promote the toxic effects of the tumor cells in the body of the PBF positive patient of the present invention. Tumors can be treated by destroying.
  • the present invention provides an antibody that specifically binds to the peptide of the present invention.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody using the peptide of the present invention as an immunizing antigen or a monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it specifically binds to the peptide of the present invention as described above.
  • the antibody of the present invention is specifically specific to a tumor antigen peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. Mention may be made of antibodies that bind.
  • a non-human animal such as a rabbit is immunized, and the serum from the immunized animal is always used. It is possible to obtain according to the law.
  • a monoclonal antibody spleen cells and myeloma cells obtained by immunizing a non-human animal such as a mouse with the peptide of the present invention (eg, a tumor antigen peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4).
  • Preparation of an antibody against the peptide of the present invention can also be performed by enhancing the immunological reaction using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surface active substances such as lysolecithin, pluronic polyol, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol, BCG ( And human adjuvants such as Calumet-Guerin and Corynebacterium parvum.
  • an antibody that recognizes a peptide and further an antibody that neutralizes its activity can be easily prepared by appropriately immunizing an animal with the peptide of the present invention by a conventional method.
  • Examples of the use of the antibody include affinity chromatography and immunological diagnosis.
  • the immunological diagnosis can be appropriately selected from immunoblotting, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), fluorescence or luminescence assay.
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immunoassay
  • fluorescence or luminescence assay Such immunological diagnosis is effective in diagnosing cancers in which the PBF gene of the present invention is expressed, such as sarcomas and renal cancers.
  • Tumor marker related to the polynucleotide of the present invention
  • the tumor marker of the present invention encodes a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as that of the polynucleotide of the present invention (SEQ ID NO: 4). Polynucleotide) and / or a polynucleotide complementary thereto.
  • examples of the tumor marker of the present invention include a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and / or a polynucleotide complementary thereto.
  • the complementary polynucleotide (complementary strand, reverse strand) is a polynucleotide sequence comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 (herein, these are also referred to as “normal strand” for convenience).
  • A: T and G: C which are polynucleotides that are in a base complementary relationship.
  • the polynucleotide on the positive strand side includes not only the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 but also a strand consisting of a nucleotide sequence that is more complementary to the nucleotide sequence of the complementary strand. Can be included.
  • the above-mentioned normal and complementary (reverse) polynucleotides may each be used as a tumor marker in a single-stranded form, or may be used as a tumor marker in a double-stranded form.
  • the tumor marker of the present invention may be a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or a polynucleotide comprising the complementary sequence thereof.
  • the tumor marker of the present invention is, for example, based on the base sequence described in SEQ ID NO: 3, for example, primer 3 (HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi ) Or vector NTI (manufactured by Infomax).
  • primer 3 HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi
  • vector NTI manufactured by Infomax
  • a primer or probe candidate sequence obtained by applying the nucleotide sequence of the gene of the present invention to primer 3 or vector NTI software, or at least a sequence partially containing the sequence may be used as a primer or probe. it can.
  • the length of the tumor marker of the present invention can be appropriately selected and set according to the use of the marker.
  • the detection (diagnosis) of the tumor is to evaluate the presence / absence or expression level (expression level) of the peptide gene of the present invention in the biological tissue of the subject, particularly the test tissue suspected of having a tumor (sarcoma or renal cancer). Is done by.
  • the tumor marker of the present invention is used as a primer for specifically recognizing and amplifying the RNA produced by the expression of the peptide gene of the present invention or a polynucleotide derived therefrom, or the polynucleotide derived therefrom. Can be used as a probe for specifically detecting.
  • the tumor marker of the present invention When used as a primer in the detection of a tumor, it preferably includes those containing a base length of 15 to 30 bp. When used as a detection probe, one containing a base length of preferably 15 bp to 27 bp can be exemplified.
  • the tumor marker of the present invention can be used as a primer or a probe according to a conventional method in a known method for specifically detecting a specific gene such as Northern blotting, RT-PCR, in situ hybridization, etc. .
  • the tumor marker of the present invention is useful for diagnosis and detection of a tumor (diagnosis of presence or absence and degree of morbidity).
  • tumor diagnosis using the tumor marker is to determine a difference in gene expression level of the peptide gene of the present invention in a living tissue (tissue suspected of tumor) in a subject and a similar tissue in a normal subject Can be done by.
  • the difference in gene expression level is not only the difference between the presence and absence of expression, but also the difference in the expression level between the two even when both the subject tissue and the normal tissue are expressed.
  • the case of 3 times or more is included.
  • the peptide gene of the present invention exhibits expression induction in a tumor, it is expressed in the tissue of a subject, and the expression level is 2 times or more, preferably 3 times that of the normal tissue. If there is more, the subject is suspected of having a tumor.
  • Tumor marker relating to the antibody of the present invention provides an antibody capable of specifically recognizing the peptide of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the antibody of the present invention) as a tumor marker. More specifically, the present invention provides a tumor marker comprising an antibody that specifically recognizes the peptide of the present invention consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. It has been found that the PBF gene is specifically and highly expressed in various sarcomas and renal cancers. Therefore, by detecting the presence or absence and expression level of these gene expression products (peptides), the presence or absence of the tumor (sarcoma, renal cancer, etc.) and its degree can be specifically detected, and the disease is diagnosed. be able to. Therefore, the above antibody is a tool (tumor marker) capable of diagnosing whether or not the subject suffers from a tumor or the extent of the disease by detecting the presence or absence or the extent of the expression of the peptide in the subject. Useful as.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and it may be a polyclonal antibody using the peptide of the present invention (specifically, a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4) as an immunizing antigen, or a monoclonal antibody thereof. It may be an antibody.
  • Methods for producing these antibodies are already well known, and the antibody of the present invention can also be produced according to these conventional methods (Current Protocol, Molecular Molecular Biology, Chapter 11.12-11.13 (2000), which is incorporated herein by reference. Part of it).
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody
  • the non-human animal can be immunized and obtained from the serum of the immunized animal according to a conventional method.
  • a monoclonal antibody a non-human animal such as a mouse was immunized with the peptide of the present invention expressed and purified in accordance with a conventional method, and the resulting spleen cells and myeloma cells were prepared by cell fusion.
  • the peptide of the present invention (specifically, the peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4) used as an immunizing antigen for the production of an antibody is included in the sequence information (SEQ ID NO: 3) of the gene provided by the present invention. Based on this, DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into the host, culture of the transformant and recovery of the peptide from the culture can be obtained. These procedures are known to those skilled in the art or described in literature (Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985), these documents Which constitutes part of the present application by reference).
  • the peptide of the present invention can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) according to the amino acid sequence information (SEQ ID NO: 4) provided by the present invention. For details, see the sections 1) and 2) above.
  • Tumor marker relating to the peptide of the present invention provides a peptide capable of specifically recognizing an antibody against the peptide of the present invention as a tumor marker. More specifically, the present invention provides a tumor marker comprising the peptide of the present invention consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. Diagnosing a tumor by using the peptide (polypeptide) of the present invention as a diagnostic agent and detecting the presence of an antibody in a sample obtained from a patient suspected of having a tumor (eg, blood, tissue suspected of a tumor, etc.) Is possible. The method for producing the peptide of the present invention used here is as described in the above section 1).
  • a test tissue suspected of having a tumor is collected with a biopsy or the like, and a peptide is prepared therefrom according to a conventional method.
  • a known detection method such as Western blotting or ELISA
  • an antibody against PBF can be detected by using the peptide of the present invention as a probe according to a conventional method.
  • tumor diagnosis the difference between the amount of antibody against the peptide of the present invention in the subject tissue and the amount of antibody against F peptide of the present invention in a normal corresponding tissue may be determined.
  • the difference in peptide amount includes the presence / absence of peptide, or the case where the difference in peptide amount is 2 times or more, preferably 3 times or more.
  • the peptide gene of the present invention induces expression in tumors (sarcoma, renal cancer)
  • an antibody against the expression product of the gene exists in the subject tissue. If it is determined that the amount of antibody against the peptide is 2 times or more, preferably 3 times or more compared to the amount of antibody against the peptide of the present invention in normal tissues, tumor suspicion is suspected.
  • the present invention also provides an HLA tetramer containing the peptide of the present invention and an HLA-A2 antigen, and a tumor marker comprising the HLA tetramer.
  • the HLA tetramer refers to a tetramer obtained by biotinylating a complex (HLA monomer) in which an ⁇ chain of an HLA antigen and ⁇ 2 microglobulin are associated with a peptide (antigen peptide) and binding it to avidin. (Science 279: 2103-2106 (1998), Science 274: 94-96 (1996), which are incorporated herein by reference).
  • HLA tetramers containing various antigen peptides are commercially available (for example, Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.), and HLA tetramers containing the peptide of the present invention and HLA-A2 antigen can be easily prepared. it can.
  • an HLA tetramer containing a tumor antigen peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and an HLA-A2 antigen can be mentioned.
  • the HLA tetramer is preferably fluorescently labeled so that CTLs bound thereto can be easily selected or detected by known detection means such as flow cytometry and fluorescence microscope.
  • detection means such as flow cytometry and fluorescence microscope.
  • Specific examples include HLA tetramers labeled with phycoerythrin (PE), fluorescein isothiocyanate (FITC), peridinin chlorophyll protein (PerCP), and the like.
  • HLA-A2 ⁇ chain expression vector and a ⁇ 2 microglobulin expression vector are introduced into E. coli or mammalian cells capable of expressing the protein for expression.
  • Escherichia coli for example, BL21
  • the obtained monomer HLA-A2 complex and the peptide of the present invention are mixed to form a soluble HLA-peptide complex.
  • the sequence of the C-terminal part of the HLA-A24 ⁇ chain in the HLA-peptide complex is biotinylated with a BirA enzyme.
  • An HLA tetramer can be prepared by mixing this biotinylated HLA-peptide complex and fluorescently labeled avidin at a molar ratio of 4: 1.
  • protein purification by gel filtration or the like is preferably performed.
  • the present invention provides a tumor detection method (diagnostic method) using the above-described tumor marker of the present invention.
  • the detection method (diagnostic method) of the present invention the blood of a subject is collected, or a part of a test tissue suspected of having a tumor is collected with a biopsy or the like, and a PBF-derived tumor antigen contained therein By detecting and measuring the amount of CTL that recognizes the complex of peptide and HLA antigen, the presence or absence of a tumor such as sarcoma or renal cancer is diagnosed.
  • the detection (diagnostic) method of the present invention can also detect (diagnose) the presence or absence or improvement of the disease when a therapeutic agent is administered to improve the tumor, for example. Furthermore, the detection (diagnostic) method of the present invention can also be used for selection of a tumor patient to whom a drug containing the peptide or nucleic acid of the present invention as an active ingredient can be applied, and determination of the therapeutic effect of the drug.
  • the detection method of the present invention includes the following steps (a), (b) and (c): (a) contacting the biological sample of the subject with the tumor marker of the present invention, (b) a step of measuring the amount of CTL that recognizes a complex of a PBF-derived tumor antigen peptide and an HLA antigen in a biological sample using the tumor marker as an index, (c) A step of determining tumor morbidity based on the result of (b).
  • the biological sample used here include a sample prepared from a biological tissue of a subject (a tissue suspected to be a tumor and its surrounding tissue, blood, or the like).
  • RNA-containing sample prepared from the tissue or a sample containing a polynucleotide further prepared therefrom, or a sample containing a peptide or antibody prepared from the tissue, or peripheral blood prepared from the tissue Mention may be made of samples containing lymphocytes.
  • the diagnostic method of the present invention is specifically performed as follows according to the type of biological sample used as a measurement target.
  • RNA When RNA is used as a biological sample to be measured
  • tumor detection is specifically performed by the following steps (a), (b) and (c) Can be carried out by a method comprising: (a) RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom, and the tumor marker of the present invention (the polynucleotide of the present invention and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide).
  • RNA is used as the measurement object
  • the detection method (diagnostic method) of the present invention is carried out by detecting and measuring the expression level of the gene of the present invention in the RNA.
  • Northern blot method, RT-PCR method, DNA using the tumor marker of the present invention comprising the aforementioned polynucleotide (polynucleotide of the present invention and / or its complementary polynucleotide) as a primer or probe. It can be carried out by performing a known method such as a chip analysis method or an in situ hybridization analysis method.
  • the presence or absence of expression of the gene of the present invention in RNA and its expression level can be detected and measured by using the tumor marker of the present invention as a probe.
  • the tumor markers of the present invention complementary strand radioisotopes (such as 32 P, 33 P: RI) or a fluorescent substance labeled with a, it, of the subject and transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method
  • the formed tumor marker (DNA) and RNA duplex is detected using a radiation detector (BAS) from the signal derived from the tumor marker label (RI or fluorescent substance).
  • a tumor marker (probe DNA) is labeled according to the protocol, hybridized with RNA derived from the biological tissue of the subject, and then labeled with the tumor marker. It is also possible to use a method in which a signal derived from a product is detected and measured with a multi-bioimager STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).
  • the presence or absence and expression level of the gene of the present invention in RNA can be detected and measured by using the tumor marker of the present invention as a primer.
  • a pair of primers prepared from the tumor marker of the present invention (the above-mentioned cDNA) is prepared so that a cDNA of the present invention can be amplified using RNA derived from a biological tissue of a subject according to a conventional method and using this as a template.
  • a method for detecting the amplified double-stranded DNA obtained by hybridizing the positive strand that binds to (-strand) and the reverse strand that binds to + strand) and performing PCR according to a conventional method. Can do.
  • the detection of the amplified double-stranded DNA was performed by a method for detecting the labeled double-stranded DNA produced by performing the PCR using a primer previously labeled with RI or a fluorescent substance.
  • a method may be used in which double-stranded DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and a labeled tumor marker is used as a probe and hybridized with this to detect it.
  • the produced labeled double-stranded DNA product can be measured with an Agilent 2100 Bioanalyzer (manufactured by Yokogawa Analytical Systems).
  • a DNA chip to which the above-described tumor marker of the present invention is attached as a DNA probe (single-stranded or double-stranded), and use it from RNA derived from the biological tissue of a subject by a conventional method.
  • a method of detecting a double strand of DNA and cRNA formed by hybridization with the prepared cRNA by binding with a labeled probe prepared from the tumor marker of the present invention can be mentioned.
  • the tumor detection method (diagnostic method) of the present invention detects the peptide of the present invention in the biological sample. And by measuring the amount. Specifically, it can be carried out by a method comprising the following steps (a), (b) and (c): (a) a step of binding a peptide prepared from a biological sample of a subject and the tumor marker of the present invention relating to an antibody (an antibody recognizing PBF); (b) measuring a peptide derived from a biological sample bound to the tumor marker using the tumor marker as an index, (c) A step of determining tumor morbidity based on the measurement result of (b). More specifically, a method for detecting and quantifying the peptide of the present invention by a known method such as Western blotting using an antibody (an antibody recognizing the peptide of the present invention) as the tumor marker of the present invention can be mentioned. .
  • Western blotting uses a tumor marker of the present invention as a primary antibody, and then a labeled antibody (primary antibody) labeled with a radioisotope such as 125 I as a secondary antibody, a fluorescent substance, an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), or the like.
  • a radioisotope such as 125 I as a secondary antibody
  • a fluorescent substance such as an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), or the like.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the signal derived from the radioisotope, fluorescent substance, etc. of the obtained labeled compound is detected and measured with a radiation measuring instrument (BAS-1800II: manufactured by Fuji Film Co., Ltd.), a fluorescence detector, etc. Can be implemented.
  • the tumor marker of the present invention was detected according to the protocol using ECL Plus Western Blotting Detction System (Amersham Pharmacia Biotech) and measured with a multi-bioimager STORM860 (Amersham Pharmacia Biotech) You can also
  • the tumor detection method (diagnostic method) of the present invention is the This is done by detecting an antibody against the peptide of the invention and measuring its amount. Specifically, using the tumor marker of the present invention relating to a peptide, it can be performed by the same method as in the above ((v) -2).
  • the tumor detection method of the present invention is performed by detecting the peptide-specific CTL of the present invention in a biological sample and measuring the amount thereof.
  • HLA tetramer a body (HLA tetramer) is prepared, and this can be used to quantify antigen peptide-specific CTL in peripheral blood lymphocytes of patients suspected of having a tumor using a flow cytometer.
  • Tumor diagnosis is performed, for example, by expressing the gene expression level of the peptide gene of the present invention in the subject's blood or a test tissue suspected of having a tumor, the peptide of the present invention which is the expression product of these genes.
  • the amount of the antibody against the peptide of the present invention, or the amount of the peptide-specific CTL of the present invention can be measured. In that case, it can carry out by comparing with the said gene expression level or the said peptide level, etc. in a normal corresponding
  • comparison of the amount (level) of the gene, peptide, antibody, or CTL between the test tissue of the subject and the normal corresponding tissue is performed in parallel with the measurement of the test subject's biological sample and the normal subject's biological sample.
  • the gene of the peptide gene of the present invention obtained by measurement under a uniform measurement condition using a plurality of (at least 2, preferably 3 or more, more preferably 5 or more) normal tissues
  • the average or statistical intermediate value of the expression level, the amount of the peptide of the present invention, the amount of the antibody against the peptide of the present invention, or the amount of the peptide-specific CTL of the present invention can be used as a normal value for comparison. it can.
  • Whether a subject is a tumor is determined by, for example, the gene expression level of the peptide gene of the present invention, the amount of the peptide of the present invention, the amount of an antibody against the peptide of the present invention, or the peptide specific of the present invention. It can be performed using as an indicator that the amount of target CTL is 2 times or more, preferably 3 times or more higher than those of normal subjects.
  • the peptide of SEQ ID NO: 4 was synthesized by the Fmoc method.
  • the binding affinity of the peptides for HLA-A0201 was measured by an HLA class I stabilization assay (J Immunol 2004, 173: 1436, which is hereby incorporated by reference).
  • a peptide derived from influenza matrix protein (RYLRDQQLLGI, SEQ ID NO: 5) was used as a positive control for the assay, and a mouse H-2Kb-binding peptide VSV8 (RGYVYQGL, SEQ ID NO: 6) was used as a negative control.
  • the assay was performed in triplicate.
  • the binding affinity of the measured peptide to HLA-A0201 was determined by staining with FITC-labeled anti-HLA-A2 monoclonal antibody BB7.2 (purchased from ATCC) and increasing the% mean fluorescence intensity measured by a flow cytometer (percent mean fluorescence intensity intensity;% MFI increase) was determined from the following equation and detected.
  • % MFI increase [(MFI with the given peptide-MFI without peptide) / (MFI without peptide)] x 100.
  • Peptide derived from influenza matrix protein of positive control (SEQ ID NO: 5), H-2Kb binding peptide VSV8 (SEQ ID NO: 6) of negative control,% MFI increase ⁇ standard deviation (SD) of peptide of SEQ ID NO: 4 is 44.9 ⁇ 6.8, 5.6 ⁇ 8.2, and 74.5 ⁇ 6.6, respectively, indicating that the peptide of SEQ ID NO: 4 binds to HLA-A0201.
  • PBMCs pulsed with this peptide were prepared 2X using an AIM-V medium containing 10% human serum, 20 U / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 in a U-bottom 96-well microplate.
  • the cells were seeded and cultured at 10 5 cells / 200 ⁇ l / well. Seven days after the start of the culture, half of the culture solution in each well was exchanged with an AIM-V culture solution containing IL-2, IL-7 and the peptide of SEQ ID NO: 2, and the second stimulation was performed. Cells from 14 to 21 days after the start of culture were used for tetramer frequency analysis. For three patients, patient No. 3, patient No. 4, and patient No.
  • CD8 positive cells were isolated from PBMC using magnetic anti-CD8 microbeads (Miltenyi Biotec). CD8 positive cells were pulsed with the peptide of SEQ ID NO: 4 for 60 minutes and inactivated by irradiation.
  • 1.0 ⁇ 10 5 to 2.1 ⁇ 10 5 / well of CD8 positive cells, AIM-V culture medium containing 10% human serum, 20 U / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 in a 48-well microplate was cultured with peptide-pulsed irradiated CD8 positive cells at 2 ⁇ 10 5 to 5 ⁇ 10 5 cells / well.
  • lymphocytes cultured by the LD / MLPC method was stained with PE-labeled HLA-A0201 / PBF tetramer and FITC-labeled HLA-A0201 / HIV tetramer (10 nM each in 25 ⁇ l of PBS) for 15 minutes at room temperature. Further, PE-Cy5-labeled anti-CD8 antibody (eBioscience) was added and incubated for 15 minutes for staining. Thereafter, the cells were washed twice with PBS, fixed with 0.5% formalin, and analyzed with a FACScan on a flow cytometer.
  • Viable cells stained with both PE-Cy5-labeled anti-CD8 antibody and PE-labeled HLA-A0201 / PBF tetramer were defined as tetramer-positive peptide-specific CTLs.
  • Example 2 4 wells that were tetramer positive in Example 2 were seeded at 1 cell per well in a 96-well microplate, each well was irradiated and pulsed with the peptide of SEQ ID NO: 4 2 ⁇ 10 4 EBV-B cells and 8 ⁇ 10 4 irradiated allogeneic PBMCs were added, containing 10% human serum, 200 U / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 The cells were cultured in 200 ⁇ l of AIM-V medium.
  • the culture solution 100 ⁇ l irradiated after 21 days SEQ ID NO: 4 of the NS-EBV-B 1 ⁇ 10 4 cells pulsed with peptide, LCL-OS 2000 1 ⁇ 10 4 cells and irradiated allo Genomic PBMC were replaced with fresh culture medium containing 8 ⁇ 10 4 cells. 35 days after the start of culture, some cells in all wells were analyzed with HLA-A0201 / PBF tetramer.
  • Collect cells from tetramer positive wells and irradiate 2 ⁇ 10 3 cells per well in a round bottom 96-well microplate with 10% human serum, 200 U / ml along with 1 ⁇ 10 3 allogenic PBMC The culture was started with 100 ⁇ l of AIM-V culture medium containing IL-2 and 7.5 ⁇ g / ml phytohemagglutinin P. Seven days later, 100 ⁇ l of AIM-V culture solution containing 10% human serum and IL-2 was added to each well. All cells grown after 14 days were collected and added to a 48-well microplate with 0.5-1 ⁇ 10 6 cells per well and cultured in AIM-V medium containing 10% human serum and IL-2. .
  • the cell line thus established was named CTL5A9. Cytotoxic activity by CTL was measured by a 51 Cr release assay (J Immunol 2002. 169: 1611-1618. This document constitutes a part of this application by reference). Osteosarcoma cell lines U2OS (U2OS in FIG. 2) and OS2000 (OS2000 in FIG. 2), erythroleukemia cell line K562 (K562 in FIGS. 1 and 2) and lymphoblast cell line T2 cells (in FIG. 1) , T2) were used as target cells.
  • U2OS is HLA-A0201 positive and PBF positive
  • OS2000 is HLA-A0201 negative and PBF positive
  • K562 is HLA-A0201 negative and PBF positive
  • T2 is HLA-A0201 positive and PBF negative.
  • Target cells were labeled with 100 ⁇ Ci of 51 Cr for 1 hour.
  • T2 was prepared by labeling with 51 Cr and then pulsing with 50 ⁇ g / ml of the peptide of SEQ ID NO: 4 for 1 hour and cells not pulsing the peptide.
  • For U2OS cells treated with 100 U / ml interferon ⁇ for 48 hours and untreated cells were prepared.
  • FIG. 1 shows the cytotoxic activity of CTL5A9 against T2 cells pulsed with peptide, T2 cells not pulsed with peptide, and K562.
  • CTL5A9 showed cytotoxic activity only against cells pulsed with the peptide.
  • FIG. 2 shows the cytotoxic activity of CTL5A9 against U2SO and OS2000 of myeloma cell lines.
  • CTLA5A9 injured PBF-positive and HLA-A0201-positive U2OS cells, but even PBF-positive did not injure HLA-A0201-negative OS2000 cells and K562.
  • the expression level of HLA-A0201 in U2SO cells was increased by IFN- ⁇ treatment, CTL5A9 was easily damaged.
  • the present invention provides the use of tumor antigen protein PBF and its gene as a CTL inducer.
  • the inducer of CTL of the present invention can treat patients such as sarcoma and renal cancer.
  • amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 3 to 6 are synthetic peptides.

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Abstract

　配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつHLA抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチドを提供する。本願発明のペプチドはin vivoまたはin vitroにおいてCTLの誘導剤、すなわち癌ワクチンとして用いることができ、骨肉腫や腎癌等の腫瘍に対して治療または改善効果を発揮する。本発明のペプチドは肉腫や腎癌等の腫瘍に対する腫瘍マーカーとしても有用である。

Description

腫瘍抗原ペプチド及びその利用
　本発明は、腫瘍抗原ペプチドに関する。さらに詳しくは、本発明は、腫瘍抗原タンパク質〔パピローマウイルス結合因子（Papillomavirus binding factor：PBF）〕の部分ペプチドおよびその遺伝子の、癌免疫分野における利用に関する。
　生体による腫瘍細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（CTLと称する）が重要な働きをしている。CTLは、腫瘍細胞上の抗原ペプチド（腫瘍抗原ペプチド）とＭＨＣ（Major Histocompatibility Complex）クラスＩ抗原（ヒトの場合はHLA抗原と称する）との複合体を認識し、腫瘍細胞を攻撃・破壊する。
　腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特有のタンパク質、すなわち腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアーゼにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原（HLA抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示された複合体を腫瘍特異的なCTLが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を示す。このような一連の作用の解明に伴い、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドをいわゆる癌免疫療法剤（癌ワクチン）として利用することにより、腫瘍患者の体内の腫瘍特異的CTLを増強させる治療法が可能となった。
　腫瘍抗原タンパク質としては、（非特許文献１）のtable 1に記載のものが代表例として挙げられる。また、骨肉腫等の肉腫を含む癌（腫瘍）に対して適用可能な腫瘍抗原タンパク質として、パピローマウイルスのE2結合部位を認識するパピローマウイルス結合因子(Papillomavirus binding factor：PBF、 GenBank データベース Accession No. AF263928、配列番号：２)が報告され（特許文献１）、HLA-A24又はHLA-B55抗原と結合する腫瘍抗原ペプチドが挙げられている。しかしながら、HLA-A2抗原と結合するPBF由来の腫瘍抗原ペプチドは未だ見出されていない。
Immunity, vol.10:281, 1999 国際公開第04/029248号パンフレット　上記文献は引用により本願の一部を構成する。
　本発明の目的は、HLA-A2抗原と結合する腫瘍抗原タンパク質ＰＢＦの部分ペプチドおよびその遺伝子の、癌免疫分野における利用などを提供することにある。
　本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、GenBank Accession No. AF263928として登録されているパピローマウイルス結合因子(Papillomavirus binding factor：PBF)（配列番号：２）の部分ペプチドであってHLA-A2抗原に結合する腫瘍抗原ペプチドを見出した。
　当該腫瘍抗原ペプチドが、in vivoまたはin vitroにおいてCTLの誘導剤、すなわち癌ワクチンとして用いることができ、骨肉腫や腎癌等の腫瘍に対して治療または改善効果を発揮することを明らかにした。また当該腫瘍抗原ペプチドは肉腫や腎癌等の腫瘍に対する腫瘍マーカーとしても有用である。
　　すなわち本発明は下記に掲げるものである。
〔1〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつHLA抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞（以下、「CTL」という。）により認識されるペプチド。
〔2〕HLA抗原がHLA-A2である、上記〔1〕に記載のペプチド。
〔3〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列又は、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸のメチオニン、バリン、イソロイシン若しくはグルタミンへの置換又はＣ末端のアミノ酸のロイシンへの置換を含むアミノ酸配列からなる、上記〔2〕に記載のペプチド。
〔4〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
〔5〕上記〔1〕～〔4〕のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有してなるCTLの誘導剤。
〔6〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする核酸を含有してなる、CTLの誘導剤。
〔7〕ポリヌクレオチドが配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、上記〔6〕に記載のCTLの誘導剤。
〔8〕上記〔1〕～〔4〕のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる核酸。
〔9〕上記〔8〕に記載の核酸を含有してなるCTLの誘導剤。
〔10〕以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）上記〔1〕～〔4〕のいずれかに記載のペプチド、
（ｂ）上記（ａ）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、抗原提示能を有する細胞とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、抗原提示細胞の製造方法。
〔11〕上記〔10〕に記載の製造方法により製造される抗原提示細胞。
〔12〕以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）上記〔1〕～〔3〕のいずれかに記載のペプチド、
（ｂ）上記（ａ）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、CTLの誘導方法。
〔13〕上記〔12〕に記載の誘導方法により誘導されるCTL。
〔14〕上記〔1〕～〔4〕のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
〔15〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む腫瘍マーカー。
〔16〕配列番号：３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む、上記〔15〕記載の腫瘍マーカー。
〔17〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる腫瘍マーカー。
〔18〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一のポリペプチドからなる、上記〔17〕に記載の腫瘍マーカー。
〔19〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体、あるいは上記〔14〕に記載の抗体からなる腫瘍マーカー。
〔20〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体からなる、上記〔19〕に記載の腫瘍マーカー。
〔21〕上記〔1〕～〔4〕のいずれかに記載のペプチドとHLA抗原とを含有するHLAテトラマー。
〔22〕上記〔21〕に記載のHLAテトラマーからなる腫瘍マーカー。
〔23〕腫瘍が肉腫または腎癌である、上記〔15〕～〔20〕および上記〔22〕のいずれかに記載の腫瘍マーカー。
〔24〕上記〔15〕～〔20〕、上記〔22〕および上記〔24〕のいずれかに記載の腫瘍マーカーを含有してなる腫瘍の診断薬。
　本発明により、CTLの誘導剤として有用な腫瘍抗原ペプチドおよびその遺伝子などが提供される。本発明のCTLの誘導剤は、肉腫や腎癌等の治療剤等として有用である。
CTL5A9のペプチド特異的細胞傷害活性を示す図である。　縦軸は、細胞傷害活性、横軸は、CTL5A9の細胞数（effector）と標的細胞（target）の細胞数の比を表す。 癌細胞株に対するCTL5A9の細胞傷害を示す図である。　各細胞株のPBF発現、HLA-A0201発現、IFN-γ処理の有無を＋と－で示した。また各細胞株に対するCTL5A9の細胞傷害活性をeffector：targetの比を変えて評価した。
1)本発明のペプチド
　本発明のペプチド（以下、「本発明のペプチド」と称する場合がある）とは、配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、前記ＰＢＦタンパク質の部分ペプチドであって、HLA抗原、好ましくはHLA-A2抗原と結合してCTLにより認識されるという活性を有する腫瘍抗原ペプチドである。
　ここにおいて、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の腫瘍抗原ペプチドと同様の活性があれば特に限定はなく、具体的には配列番号：４に記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸をメチオニン、バリン、イソロイシンまたはグルタミンへの置換又はＣ末端のアミノ酸をロイシンへの置換を含むアミノ酸配列を挙げることができる。すなわち、HLA-A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207などのHLA-A2型のHLAについては、提示される抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）が以下の表１に示すように知られている（Immunogenetics,41,p178,1995、 J.Immunol.,155:p4749,1995、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また本発明のペプチドは、天然物（例えば前記ＰＢＦタンパク質）に由来するペプチドであってもよく、また合成ペプチドであってもよい。ペプチドの長さとしては、好ましくは11以下のアミノ酸であり、より好ましくは９アミノ酸である。
　本発明のペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該公知方法としては文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発　続　第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）などに記載されている方法が挙げられる。
　本発明のペプチドが腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するか否は、HLA-A2抗原との複合体がCTLにより認識されるか否かをアッセイすることにより、確認することができる。
　具体的な方法としては、例えば J.Immunol.,154,p2257,1995（本文献は引用により本願の一部を構成する）に記載の方法が挙げられる。すなわち、HLA-A2抗原が陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、in vitroで該候補ペプチドを添加して刺激した場合に、該候補ペプチドをパルスしたHLA-A2抗原陽性細胞を特異的に認識するCTLが誘導されることを確認すればよい。ここでCTLの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してCTLが産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γ）の量を、例えばELISA法などによって測定することにより、調べることができる。また51Crで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するCTLの傷害性を測定する方法（51Crリリースアッセイ、Int.J.Cancer,58:p317,1994、本文献は引用により本願の一部を構成する）によっても調べることができる。
　前記CTLとしては、ヒトの末梢血リンパ球のペプチド刺激により調製されるものの他、Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）等に記載の方法により樹立したCTLを用いることができる。
　また本発明のペプチドは、例えばヒトモデル動物を用いたアッセイ（WO 02/47474 号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）に供することにより、in vivoでの活性を確認することができる。
　本発明のペプチドには、さらに、前記本発明のペプチドを含む複数のエピトープを連結したペプチド（ポリエピトープペプチド）も含まれる。
　従って、該ポリエピトープペプチドであって、CTL誘導活性を有するペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
　ここに、ポリエピトープペプチドとは、(i)具体的には本発明のペプチドと他のPBF由来の任意の複数のCTLエピトープ（腫瘍抗原ペプチド）を連結したペプチド、 (ii) 本発明のペプチドとヘルパーエピトープとを連結したペプチド、若しくは(iii) 本発明のペプチドと他のPBF由来の任意の複数のCTLエピトープ（腫瘍抗原ペプチド）にさらにヘルパーエピトープを連結したペプチドであって、抗原提示細胞内にてプロセッシングを受け、生じた腫瘍抗原ペプチドが抗原提示細胞に提示され、CTL誘導活性を導くペプチドとして定義される。
　ここで、本発明のペプチドに連結させるエピトープがヘルパーエピトープの場合、用いるヘルパーエピトープとしては、前述のようなＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８－１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７－９６７などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープの長さとしては、13～30アミノ酸程度、好ましくは13～17アミノ酸程度を挙げることができる。
　このような複数のエピトープを連結させたペプチド（ポリエピトープペプチド）は、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープを連結させたポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のDNA合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献(Molecular Cloning, T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985)、これらの文献は引用により本願の一部を構成する)に記載の方法などに準じて行うことができる。
　以上のようにして製造された複数のエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを、前述のin vitroアッセイや、WO 02/47474 号公報および Int J. Cancer:100,565-570 (2002)（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）に記述のヒトモデル動物を用いたin vivoアッセイに供すること等によりCTL誘導活性を測定することができる。
2)本発明の核酸
　本発明の核酸（以下、「本発明の核酸」と称する場合がある）は、前記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する。
　本発明のポリヌクレオチドは、種々の細胞や組織、例えば骨肉種や腎癌等に由来する細胞や組織の cDNAやmRNA、cRNA、または合成DNAのいずれであっても良い。また1本鎖、2本鎖のいずれの形態であっても良い。具体的には、
(a) 配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド及び、
(c) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、が挙げられる。
　本発明のポリヌクレオチドを含有する核酸は、１本鎖および２本鎖のいずれの形態もとることができる。本発明のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。すなわち本発明の核酸の範疇には、本発明の２本鎖型ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して作製された組換え発現ベクターも含まれる。
　ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
　例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、pUC118、pUC119、pBR322、pCR3等のプラスミドベクター、λZAPII、λgt11などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、pYES2、pYEUra3などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMVなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
　前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
　また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Hisタグ、あるいはGST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（lac、tac、trc、trp、CMV、SV40初期プロモーターなど）を有するGST融合タンパク質ベクター（pGEX4Tなど）や、Myc、Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3.1/Myc-Hisなど）、さらにはチオレドキシンおよびHisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（pET32a）などを用いることができる。
　前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
　ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E.coli K-12系統のHB101株、C600株、JM109株、DH5α株、AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、L929細胞、BALB/c3T3細胞、C127細胞、CHO細胞、COS細胞、Vero細胞、Hela細胞、293-EBNA細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはsf9などが挙げられる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
　以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のペプチドを、前述のチオレドキシンやHisタグ、GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
　本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、DNAの形態であってもRNAの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるDNAの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常のDNA合成やPCRによる増幅などによって、製造することができる。
　本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
　本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸は、１本鎖および２本鎖のいずれの形態もとることができる。本発明のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。
　ここで用いる発現ベクターや宿主細胞、宿主細胞の形質転換方法等については、前述の記載と同様である。
3)本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤
　本発明のペプチドはCTL誘導活性を有するCTLの誘導剤となりうる。誘導されたCTLは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用を発揮することができる。従って本発明のペプチドは、腫瘍の治療または予防のための医薬の有効成分とすることができる。本発明のペプチドを有効成分として含有するCTLの誘導剤を腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞のHLA-A2抗原に本発明のペプチドが提示され、HLA-A2抗原と提示されたペプチドとの結合複合体特異的CTLが増殖して腫瘍細胞を破壊することができ、その結果、患者の腫瘍を治療又は予防することができる。
　本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、配列番号：２に記載のPBFタンパク質陽性かつHLA-A2抗原陽性の腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば骨肉腫などの肉腫全般または腎癌などの癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
　本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、単一のCTLエピトープ（本発明のペプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（CTLエピトープやヘルパーエピトープ）と連結したポリエピトープペプチドを有効成分とするものであっても良い。近年、複数のCTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結したポリエピトープペプチドが、in vivoで効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1998, 161: 3186-3194（本文献は引用により本願の一部を構成する）には、癌抗原タンパク質PSA由来のHLA-A2, -A3, -A11, B53拘束性CTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結した約30merのポリエピトープペプチドが、in vivoでそれぞれのCTLエピトープに特異的なCTLを誘導したことが記載されている。またCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたポリエピトープペプチドにより、効率的にCTLが誘導されることも示されている。このようなポリエピトープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがHLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なCTLが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。このようにして腫瘍の治療または予防が達成される。
　本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントと混合して投与、又は併用して投与することができる。
　アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994、本文献は引用により本願の一部を構成する)に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分又はその誘導体、サイトカイン、植物由来成分又はその誘導体、海洋生物由来成分又はその誘導体、水酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルション製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェアー製剤、マイクロカプセル製剤なども考えられる。
　投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg～1000mg、好ましくは 0.001mg～1000mg、より好ましくは0.1mg ～10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
4)本発明の核酸を有効成分とするCTLの誘導剤
　本発明の核酸を発現させた細胞は、CTLに認識されるという特徴を有する。すなわち本発明の核酸はCTLの誘導剤である。誘導されたCTLは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用を発揮することができる。従って本発明の核酸は、腫瘍の治療または予防のための医薬の有効成分とすることができる。本発明の核酸を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、例えば、本発明の核酸を腫瘍患者に投与し発現させることで、腫瘍を治療または予防し得るものである。
　例えば発現ベクターに組み込まれた本発明の核酸を以下の方法により腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞内で腫瘍抗原ペプチドが高発現する。その後、生じた腫瘍抗原ペプチドがHLA-A2抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示されることにより、腫瘍特異的CTLが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療または予防が達成される。
　本発明の核酸を有効成分とするCTLの誘導剤は、配列番号：１に記載のPBF遺伝子および当該遺伝子の発現産物であるPBFタンパク質陽性かつHLA-A2抗原陽性の腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば骨肉腫などの肉腫全般または腎癌などの癌の予防または治療のために使用することができる。
　本発明の核酸を投与し細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）のいずれの方法も適用することができる。
　ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のDNAウイルス又はRNAウイルスに本発明のDNAを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
　その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（DNAワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチン法、リポソーム法が好ましい。
　本発明の核酸を実際に医薬として作用させるには、当該核酸を直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で核酸を該細胞に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）。in vivo法がより好ましい。
　in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明の核酸を含有する注射剤等とされ、必要に応じて、医薬上許容されるキャリアー（担体）を加えてもよい。また、本発明の核酸を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）－リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
　製剤中の本発明の核酸の含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、核酸中のポリヌクレオチドの含量として、0.0001mg～100mg、好ましくは0.001mg～10mgの本発明の核酸を、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
　また近年、複数のCTLエピトープ（腫瘍抗原ペプチド）を連結したポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、in vivoで効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1999, 162: 3915-3925（本文献は引用により本願の一部を構成する）には、HBV由来HLA-A2拘束性抗原ペプチド６種類、HLA-A11拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするDNA（ミニジーン）が、in vivoでそれぞれのエピトープに対するCTLを効果的に誘導したことが記載されている。
　従って、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことにより、CTLの誘導剤の有効成分とすることができる。このようなCTLの誘導剤も、前記と同様の投与方法および投与形態をとることができる。
5)本発明の抗原提示細胞
　前記した本発明のペプチドおよび核酸は、腫瘍患者の治療において、以下のようにイン・ビトロで利用することができる。すなわち本発明のペプチド又は核酸のいずれかと抗原提示能を有する細胞とをイン・ビトロで接触させることにより、抗原提示細胞を作製することができる。具体的には本発明は、腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞と、本発明のペプチドまたは核酸のいずれかとをイン・ビトロで接触させることにより、当該細胞の細胞表面にHLA-A2抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞、およびその製造方法を提供するものである。
　ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示することの可能なHLA-A2抗原を細胞表面に発現する細胞であれば特に限定されないが、特に抗原提示能が高いとされる樹状細胞が好ましい。
　また、前記抗原提示能を有する細胞から本発明の抗原提示細胞を調製するために添加される物質としては、本発明のペプチド又は核酸のいずれであっても良い。
　本発明の抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のペプチドをイン・ビトロでパルスして、HLA-A2抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させることにより得られる(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、Ｊ.Immunol.,158,p1796,1997、Cancer Res.,59,p1184,1999、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM-CSFおよびIL-4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
　また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明の核酸を導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該核酸は、DNAの形態であっても、RNAの形態であっても良い。具体的には、DNAの場合は Cancer Res.,56:p5672,1996や J.Immunol.,161: p5607,1998（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）などを参考にして行うことができ、またRNAの場合は J.Exp.Med., 184: p465,1996（本文献は引用により本願の一部を構成する）などを参考にして行うことができる。
　前記抗原提示細胞はCTLの誘導剤の有効成分とすることができる。当該抗原提示細胞を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。このような抗原提示細胞を有効成分として含有してなるCTLの誘導剤を患者の体内に戻すことにより、本発明のPBF陽性の患者の体内で効率良く特異的なCTLが誘導され、腫瘍を治療することができる。
6)本発明のCTL
　本発明のペプチドおよび核酸は、腫瘍患者の治療において、以下のようにイン・ビトロで利用することができる。すなわち本発明のペプチドおよび核酸のいずれかと末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることにより、CTLを誘導することができる。具体的には本発明は、腫瘍患者由来の末梢血リンパ球と、本発明のペプチド又は核酸のいずれかとをイン・ビトロで接触させることにより誘導されたCTL、およびその誘導方法を提供するものである。
　例えばメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159 、1994、本文献は引用により本願の一部を構成する）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン・ビトロで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ－２で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なCTLを増殖させ、該CTLをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J.Exp.Med.,185:453,1997 ）。これは、抗原提示細胞のHLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するCTLをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のペプチドまたは核酸を用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的CTLを増やした後、このCTLを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
　当該CTLは腫瘍の治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。該治療剤または予防剤は、CTLを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。このようなCTLを有効成分として含有してなる腫瘍の治療または予防剤を患者の体内に戻すことにより、本発明のPBF陽性の患者の体内でCTLによる腫瘍細胞の傷害作用が促進され、腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療することができる。
7)本発明のペプチドに対する抗体
　本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明のペプチドを免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良い。
　本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば特に制限されないが、具体的には、配列番号：４記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチドに特異的に結合する抗体を挙げることができる。
　これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12～11.13、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989）（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）。
　具体的には、本発明のペプチド（例えば配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド）を免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明のペプチド（例えば配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド）をマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4～11.11、本文献は引用により本願の一部を構成する）。
　本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット－ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
　以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は、本発明のPBF遺伝子が発現している癌、例えば肉腫や腎癌等の診断において有効である。
8)腫瘍マーカー
(i)本発明のポリヌクレオチドに関する腫瘍マーカー
　本発明の腫瘍マーカーは、前記本発明ポリヌクレオチド（配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド）及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とするものである。
　具体的には、本発明の腫瘍マーカーは、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなるものを挙げることができる。
　ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、前記配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。
　ここで、正鎖側のポリヌクレオチドには、配列番号：３に記載の塩基配列からなるものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
　さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で腫瘍マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で腫瘍マーカーとして使用されてもよい。
　本発明の腫瘍マーカーは、具体的には、前記配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。
　本発明の腫瘍マーカーは、例えば配列番号：３に記載の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。具体的には前記本発明遺伝子の塩基配列を primer 3またはベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
　本発明の腫瘍マーカーは、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
　本発明において腫瘍の検出（診断）は、被験者の生体組織、特に腫瘍（肉腫や腎癌）が疑われる被験組織における本発明のペプチド遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。この場合、上記本発明の腫瘍マーカーは、本発明のペプチド遺伝子の発現によって生じたRNAまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該RNAまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
　本発明腫瘍マーカーを腫瘍の検出においてプライマーとして用いる場合には、好ましくは15bp～30bpの塩基長を含有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、好ましくは15bp～27bpの塩基長を含有するものが例示できる。
　本発明の腫瘍マーカーは、ノーザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。
　本発明の腫瘍マーカーは、腫瘍の診断、検出（罹患の有無や罹患の程度の診断）に有用である。具体的には、該腫瘍マーカーを利用した腫瘍の診断は、被験者における生体組織（腫瘍が疑われる組織）と正常者における同様の組織における本発明のペプチド遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。この場合、遺伝子発現レベルの違いには、発現のある／なしの違いだけでなく、被験者の組織と正常者の組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量の格差が2倍以上、好ましくは3倍以上の場合が含まれる。具体的には本発明のペプチド遺伝子は腫瘍で発現誘導を示すので、被験者の組織で発現しており、該発現量が正常者の対応組織の発現量と比べて2倍以上、好ましくは3倍以上多ければ、被験者について腫瘍の罹患が疑われる。
(ii)本発明の抗体に関する腫瘍マーカー
　本発明は腫瘍マーカーとして、本発明のペプチドを特異的に認識することのできる抗体（以下、本発明の抗体と称する場合がある）を提供する。より具体的には、本発明は、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる本発明ペプチドを特異的に認識する抗体からなる腫瘍マーカーを提供する。
　種々の肉腫および腎癌において、PBF遺伝子が特異的に高発現しているという知見が得られている。よってこれらの遺伝子の発現産物（ペプチド）の有無やその発現の程度を検出することによって、上記腫瘍（肉腫、腎癌等）の有無やその程度が特異的に検出でき、該疾患の診断を行うことができる。
　上記抗体は、従って、被験者における上記ペプチドの発現の有無またはその程度を検出することによって、該被験者が腫瘍に罹患しているか否かまたはその疾患の程度を診断することのできるツール（腫瘍マーカー）として有用である。
　本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明ペプチド（具体的には配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド）を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。　これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12～11.13(2000)、本文献は引用により本願の一部を構成する）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明ペプチドを用いて、あるいは常法に従ってこれら本発明ペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明ペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4～11.11、本文献は引用により本願の一部を構成する）。
　抗体の作製に免疫抗原として使用される本発明ペプチド（具体的には配列番号：４に記載のアミノ酸配列よりなるペプチド）は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号：３）に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのペプチドの回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）などに準じて行うことができる。また本発明ペプチドは、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号：４）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。詳しくは前述の1)及び2)の項を参照されたい。
(iii)本発明のペプチドに関する腫瘍マーカー
　本発明は腫瘍マーカーとして、本発明ペプチドに対する抗体を特異的に認識することのできるペプチドを提供する。より具体的には、本発明は、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる本発明ペプチドからなる腫瘍マーカーを提供する。
　本発明のペプチド（ポリペプチド）を診断薬として用い、腫瘍が疑われる患者から得た試料（例えば血液、腫瘍が疑われる組織など）中の抗体の存在を検出することにより、腫瘍を診断することが可能である。ここで用いる本発明ペプチドの製造法については、前記1)の項で述べたとおりである。
　具体的には、患者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従ってペプチドを調製して、例えばウェスタンブロット法、ELISA法など公知の検出方法において、上記本発明ペプチドを常法に従ってプローブとして使用することによって、PBFに対する抗体を検出することができる。
　腫瘍の診断に際しては、被験者組織における本発明のペプチドに対する抗体の量と正常な対応組織におけるF本発明のペプチドに対する抗体の量の違いを判定すればよい。この場合、ペプチド量の違いには、ペプチドのある／なし、あるいはペプチド量の違いが2倍以上、好ましくは3倍以上の場合が含まれる。具体的には本発明のペプチド遺伝子は腫瘍(肉腫、腎癌）で発現誘導を示すので、被験者組織で該遺伝子の発現産物（本発明のペプチド）に対する抗体が存在しており、この本発明のペプチドに対する抗体の量が正常な組織での本発明のペプチドに対する抗体量と比べて2倍以上、好ましくは3倍以上多いことが判定されれば、腫瘍の罹患が疑われる。
(iv)HLAテトラマーに関する腫瘍マーカー
　本発明はまた、本発明のペプチドとHLA-A2抗原とを含有するHLAテトラマー、および当該HLAテトラマーからなる腫瘍マーカーを提供する。
　ここでHLAテトラマーとは、HLA抗原のα鎖とβ2ミクログロブリンをペプチド（抗原ペプチド）と会合させた複合体（HLAモノマー）をビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したものを指す（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996)、これらの文献は引用により本願の一部を構成する)。現在では種々の抗原ペプチドを含有するHLAテトラマーが市販されており（例えば(株)医学生物学研究所）、本発明のペプチドとHLA-A2抗原とを含有するHLAテトラマーを容易に作製することができる。
　具体的には、例えば配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチドとHLA-A2抗原とを含有するHLAテトラマーが挙げられる。
　当該HLAテトラマーは、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の公知の検出手段により結合したCTLを容易に選別または検出することが出来るように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン（PE）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ペリジニンクロロフィルプロテイン（PerCP）などにより標識されたHLAテトラマーが挙げられる。
　HLAテトラマーの作製法については、文献（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996)等、本文献は引用により本願の一部を構成する）により周知であるが、簡単に述べると以下のようになる。
　まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、HLA-A2α鎖発現ベクターおよびβ2ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例えばBL21）を用いることが好ましい。得られた単量体HLA-A2複合体と本発明ペプチドとを混合し、可溶性のHLA-ペプチド複合体を形成させる。次にHLA-ペプチド複合体におけるHLA-A24α鎖のC末端部位の配列をBirA酵素によりビオチン化する。このビオチン化されたHLA-ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを4：1のモル比で混合することにより、HLAテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
(v)腫瘍の検出方法（診断方法）
　本発明は、前述した本発明腫瘍マーカーを利用した腫瘍の検出方法（診断方法）を提供するものである。
　具体的には、本発明の検出方法（診断方法）は、被験者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこに含まれるPBF由来の腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原との複合体を認識するCTLの量を、検出・測定することにより、肉腫や腎癌等の腫瘍の罹患の有無またはその程度を診断するものである。また本発明の検出（診断）方法は、例えば腫瘍患者において、該腫瘍の改善のために治療薬を投与した場合における、該疾患の改善の有無またはその程度を検出（診断）することもできる。さらに本発明の検出（診断)方法は、本発明のペプチドまたは核酸を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択や、当該医薬による治療効果の判定などにも利用できる。
　本発明の検出方法は次の(a)、(b)及び(c)の工程を含むものである：
(a) 被験者の生体試料と本発明の腫瘍マーカーを接触させる工程、
(b) 生体試料中のPBF由来の腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原との複合体を認識するCTLの量を、上記腫瘍マーカーを指標として測定する工程、
(c) (b)の結果をもとに、腫瘍の罹患を判断する工程。
　ここで用いられる生体試料としては、被験者の生体組織（腫瘍が疑われる組織及びその周辺組織、または血液など）から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から調製されるRNA含有試料、若しくはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料、または上記組織から調製されるペプチド、抗体を含む試料、あるいは上記組織から調製される末梢血リンパ球を含む試料を挙げることができる。
　本発明の診断方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。
　((v)-1) 測定対象の生体試料としてRNAを利用する場合
　測定対象物としてRNAを利用する場合、腫瘍の検出は、具体的に下記の工程(a)、(b)及び(c)を含む方法によって実施することができる：
(a)被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、前記本発明の腫瘍マーカー（本発明のポリヌクレオチド及び/又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド）とを結合させる工程、
(b)該腫瘍マーカーに結合した生体試料由来のRNAまたは該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記腫瘍マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記(b)の測定結果に基づいて、腫瘍の罹患を判断する工程。
　測定対象物としてRNAを利用する場合は、本発明の検出方法（診断方法）は、該RNA中の本発明の遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。具体的には、前述のポリヌクレオチドからなる本発明の腫瘍マーカー（本発明のポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチド）をプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法、DNAチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
　ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記腫瘍マーカーをプローブとして用いることによって、RNA中の本発明の遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の腫瘍マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された腫瘍マーカー（DNA）とRNAとの二重鎖を、腫瘍マーカーの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、該プロトコールに従って腫瘍マーカー（プローブDNA）を標識し、被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、腫瘍マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
　RT-PCR法を利用する場合は、本発明の上記腫瘍マーカーをプライマーとして用いることによって、RNA中の本発明の遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として本発明の遺伝子が増幅できるように、本発明の腫瘍マーカーから調製した一対のプライマー（上記cDNA（－鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖DNAの検出は、上記ＰＣＲを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖DNAを検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した腫瘍マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖DNA産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
　DNAチップ解析を利用する場合は、本発明の上記腫瘍マーカーをDNAプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたDNAチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明の腫瘍マーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。
　((v)-2) 測定対象の生体試料としてペプチドを用いる場合
　測定対象物としてペプチドを用いる場合は、本発明の腫瘍の検出方法（診断方法）は、生体試料中の本発明のペプチドを検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には下記の工程(a)、(b)及び(c)を含む方法によって実施することができる：
(a)被験者の生体試料から調製されたペプチドと抗体に関する本発明の腫瘍マーカー（PBFを認識する抗体）とを結合させる工程、
(b)該腫瘍マーカーに結合した生体試料由来のペプチドを、上記腫瘍マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記(b)の測定結果に基づいて、腫瘍の罹患を判断する工程。
　より具体的には、本発明の腫瘍マーカーとして抗体（本発明のペプチドを認識する抗体）を用いて、ウエスタンブロット法などの公知方法で本発明のペプチドを検出、定量する方法を挙げることができる。
　ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明腫瘍マーカーを用いた後、二次抗体として125Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した標識抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明腫瘍マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detction System (アマシャム　ファルマシアバイオテク社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(アマシャム　ファルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。
　((v)-3) 測定対象の生体試料として抗体を用いる場合
　測定対象物としてペプチド中に存在する抗体を用いる場合は、本発明の腫瘍の検出方法（診断方法）は、生体試料中の本発明のペプチドに対する抗体を検出し、その量を測定することによって実施される。具体的にはペプチドに関する本発明の腫瘍マーカーを用い、前記（(v)-2）と同様の手法にて行うことができる。
　((v)-4) 測定対象の生体試料として腫瘍抗原特異的CTLを用いる場合
　測定対象物として末梢血リンパ球中に存在する腫瘍抗原特異的CTLを用いる場合は、本発明の腫瘍の検出方法（診断方法）は、生体試料中の本発明のペプチド特異的CTLを検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には、文献（Science,274:p94,1996、本文献は引用により本願の一部を構成する）に記載の方法に従って蛍光標識したHLA抗原と本発明のペプチドとの複合体の4量体（HLAテトラマー）を作製し、これを用いて腫瘍が疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的CTLをフローサイトメーターにより定量することにより行うことができる。
　((v)-5)腫瘍の診断
　腫瘍の診断は、例えば、被験者の血液や腫瘍が疑われる被験組織における本発明のペプチド遺伝子の遺伝子発現レベル、これらの遺伝子の発現産物である本発明のペプチドの量、本発明のペプチドに対する抗体の量、または本発明のペプチド特異的CTLの量を測定することにより行うことができる。その際、場合によっては正常な対応組織における当該遺伝子発現レベルまたは当該ペプチドレベル等と比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
　ここで被験者の被験組織と正常な対応組織との遺伝子、ペプチド、抗体、またはCTLの量（レベル）の比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な組織を用いて均一な測定条件で測定して得られた本発明のペプチド遺伝子の遺伝子発現レベル、本発明のペプチドの量、本発明のペプチドに対する抗体の量、または本発明のペプチド特異的CTLの量の平均値または統計的中間値を、正常者の値として、比較に用いることができる。
　被験者が、腫瘍であるかどうかの判断は、例えば該被験者の組織における本発明のペプチド遺伝子の遺伝子発現レベル、本発明のペプチドの量、本発明のペプチドに対する抗体の量、または本発明のペプチド特異的CTLの量が、正常者のそれらのレベルと比較して２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として行うことができる。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
ペプチドの合成とHLA-A0201への結合親和性の測定
配列番号：４のペプチドをFmoc法により合成した。ペプチドのHLA-A0201に対する結合親和性は、HLAクラスI安定化アッセイ（J Immunol 2004, 173:1436、本文献は引用により本願の一部を構成する）により測定した。アッセイの陽性対照としてインフルエンザマトリックス蛋白質由来のペプチド（RYLRDQQLLGI、配列番号：５）、陰性対照としてマウスのH-2Kb結合性ペプチドVSV8（RGYVYQGL、配列番号：６）を用いた。アッセイはトリプリケートで行った。測定したペプチドのHLA-A0201への結合親和性は、FITC標識した抗HLA-A2モノクローナル抗体BB7.2（ATCCより購入）で染色し、フローサイトメーターで測定した％平均蛍光強度の増加(percent mean fluorescence Intensity increase; %MFI increase)を次式より求めて検出した。%MFI increase＝[(MFI with the given peptide - MFI without peptide)/(MFI without peptide)] x 100。陽性対照のインフルエンザマトリックス蛋白質由来のペプチド（配列番号：５）、陰性対照のH-2Kb結合性ペプチドVSV8（配列番号：６）、配列番号：４のペプチドの%MFI increase ± 標準偏差(SD)は、それぞれ44.9±6.8、5.6±8.2、74.5±6.6であり、配列番号：４のペプチドがHLA-A0201に結合することが示された。
抗原ペプチド特異的CTLの頻度解析
　5名のPBF陽性の骨肉種患者のリンパ球を用いて、限界希釈の条件下での混合リンパ球ペプチド培養法（limiting dilution/mixed lymphocyte peptide culture; LD/MLPC）を行い、ペプチド特異的なCTLの誘導を行った（Cancer Sci. 2008. 99: 368-375.、本文献は引用により本願の一部を構成する）。患者No. 1、患者No. 2の2名については、末梢血50ml採取し、末梢血単核球（PBMC）を分離した。PBMCは、50μg/mlの配列番号：４のペプチドを添加した1％ヒト血清含有AIM-V培養液(Invitrogen社)で室温、60分間培養した。このペプチドをパルスしたPBMCは、U底の96ウェルマイクロプレートに10％ヒト血清、20U/mlのIL-2、10ng/mlのIL-7を含んだAIM-V培養液を用いて、2×105細胞/200μl/ウェルで播種して培養した。培養開始7日後にIL-2、IL-7、配列番号：２のペプチドを含んだAIM-V培養液で各ウェル中の培養液の半量を交換して２回目の刺激を行った。培養開始14から21日後の細胞をテトラマーによる頻度解析に用いた。
　患者No. 3、患者No. 4、患者No. 5の3名については、PBMCからマグネティック抗CD8マイクロビーズ（Miltenyi Biotec社）を用いてCD8陽性細胞を分離した。CD8陽性細胞は配列番号：４のペプチドで60分間パルスし、放射線照射して不活化した。1.0×105～2.1×105/ウェルのCD8陽性細胞は、48ウェルマイクロプレートに10％ヒト血清、20U/mlのIL-2、10ng/mlのIL-7を含んだAIM-V培養液を用いて、2×105～5×105細胞/ウェルのペプチドパルスした放射線照射CD8陽性細胞と一緒に培養した。培養7日後に前回と同様にペプチドパルスした放射腺照射CD8陽性細胞を添加して、2回目の刺激を行った。培養開始13から23日の細胞をテトラマーによる頻度解析に用いた。配列番号：４のペプチドを用いて作製したPE標識HLA-A0201/PBFテトラマー（MBL社）を解析に用いた。
　また、陰性対照として、HIV由来のペプチドを用いて作製したFITC標識HLA-A0201/HIVテトラマー（MBL社）を用いた。LD/MLPC法で培養したリンパ球の一部をPE標識HLA-A0201/PBFテトラマーとFITC標識HLA-A0201/HIVテトラマー（25μlのPBS中に各10ｎM）で室温15分間インキュベートして染色した。さらにPE-Cy5標識抗CD8抗体(eBioscience社)を添加して15分間インキュベートして染色した。その後、PBSで2回洗浄し、0.5%のフォルマリンで固定して、フローサイトメーターのFACScanで解析した。PE-Cy5標識抗CD8抗体とPE標識HLA-A0201/PBFテトラマーの両方に染色された生細胞をテトラマー陽性のペプチド特異的CTLとした。配列番号：２のペプチドに特異的なCTLの頻度は、次式で求めた。頻度＝テトラマー陽性のウェル数/（試験した全ウェル数×LD/MLPC開始時のウェル当たりのCD8陽性細胞数）。5名の患者のCTL頻度の結果を表３に示した。5名中患者No. 2、3、4の3名の頻度はそれぞれ5×10-6、2×10-7、5×10-7であり、配列番号：４のペプチドに特異的なCTLの誘導が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
抗原ペプチド特異的CTL株の樹立
　T細胞の培養には、HLA-A0201陽性の健常人のB細胞をEBウイルスでトランスフォームしたB細胞株NS-EBV-B細胞、HLA-A0201陰性の骨肉種患者のB細胞をEBウイルスでトランスフォームしたB細胞株LCL-S2000細胞（J Orthop Sci. 2003. 8: 554-559.、本文献は引用により本願の一部を構成する）を用いた。実施例２でテトラマー陽性であった患者No.4のウェルのT細胞を96ウェルマイクロプレートにウェル当たり1個細胞で播種し、各ウェルに放射線照射し配列番号：４のペプチドをパルスしたNS-EBV-B細胞を2×104個及び放射線照射したアロジェニックのPBMCを8×104個を加え、10％ヒト血清、200U/mlのIL-2、10ng/mlのIL-7を含んだ200μlのAIM-V培養液で培養した。培養開始14日後、21日後に培養液100μlを放射線照射し配列番号：４のペプチドをパルスしたNS-EBV-B細胞1×104個、LCL-OS2000細胞1×104個及び放射線照射したアロジェニックのPBMCを8×104個を含んだ新しい培養液と交換した。培養開始35日後に全ウェルの一部の細胞をHLA-A0201/PBFテトラマーで解析した。
　テトラマー陽性のウェルの細胞を集め、丸底の96ウェルマイクロプレートにウェル当たり2×103個の細胞を放射線照射したアロジェニックのPBMC1×103個と一緒に10％ヒト血清、200U/mlのIL-2及び7.5μg/mlのフィトヘマグルチニンPを含むAIM-V培養液100μlで培養を開始した。7日後に各ウェルに10％ヒト血清とIL-2を含むAIM-V培養液100μlを加えた。14日後に増殖した全ての細胞を集め、48ウェルマイクロプレートにウェル当たり0.5～１×106個の細胞を添加して、10％ヒト血清とIL-2を含むAIM-V培養液で培養した。このようにして樹立された細胞株をCTL5A9と名付けた。CTLによる細胞傷害活性は、51Crリリースアッセイ（J Immunol 2002. 169: 1611-1618.、本文献は引用により本願の一部を構成する）で測定した。
　骨肉腫細胞株のU2OS（図２中、U2OS）とOS2000（図２中、OS2000）、赤白血病由来細胞株K562（図１及び２中、K562）及びリンパ芽球細胞株T2細胞（図１中、T2）を標的細胞として用いた。U2OSはHLA-A0201陽性、PBF陽性、OS2000はHLA-A0201陰性、PBF陽性、K562はHLA-A0201陰性、PBF陽性、T2はHLA-A0201陽性、PBF陰性である。標的細胞は、100μCiの51Crで1時間ラベルした。T2は、51Cr でラベル後に50μg/mlの配列番号：４のペプチドで1時間パルスした細胞とペプチドをパルスしない細胞を用意した。U2OSは、100U/mlのインターフェロンγで48時間処理した細胞と無処理の細胞を用意した。図１にペプチドをパルスしたT2細胞、ペプチドをパルスしていないT２細胞及びK562に対するCTL5A9の傷害活性を示した。CTL5A9は、ペプチドをパルスした細胞に対してのみ細胞傷害活性をしめした。
　図2に骨髄腫細胞株のU2SO、OS2000に対するCTL5A９の傷害活性を示した。CTLA5A9は、PBF陽性、HLA-A0201陽性のU2OS細胞を傷害したが、PBF陽性であってもHLA-A0201陰性のOS2000細胞、K562を傷害しなかった。また、IFN－γ処理によりU2SO細胞のHLA-A0201の発現量を増加させるとCTL5A9に対して傷害を受けやすくなった。これらのことより、CTL5A9は癌細胞内で産生されたPBF由来の抗原ペプチドとHLA-0201の複合体を認識して傷害活性を示すことが明らかとなった。
　本発明により、腫瘍抗原タンパク質PBFおよびその遺伝子の、CTLの誘導剤としての用途などが提供される。本発明のCTLの誘導剤は、肉腫や腎癌等の患者を処置することができる。
　配列番号：３～６に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

Claims (24)

  1. 　配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつHLA抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞（以下、「CTL」という。）により認識されるペプチド。
  2. 　HLA抗原がHLA-A2である、請求項１記載のペプチド。
  3. 　配列番号：４に記載のアミノ酸配列又は、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸のメチオニン、バリン、イソロイシン若しくはグルタミンへの置換又はＣ末端のアミノ酸のロイシンへの置換を含むアミノ酸配列からなる、請求項２記載のペプチド。
  4. 　配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
  5. 　請求項１～４のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有してなるCTLの誘導剤。
  6. 　配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする核酸を含有してなる、CTLの誘導剤。
  7. 　ポリヌクレオチドが配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項６記載のCTLの誘導剤。
  8. 　請求項１～４のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる核酸。
  9. 　請求項８記載の核酸を含有してなるCTLの誘導剤。
  10. 　以下の（ａ）または（ｂ）：
    （ａ）請求項１～４のいずれかに記載のペプチド、
    （ｂ）上記（ａ）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
    のいずれかと、抗原提示能を有する細胞とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、抗原提示細胞の製造方法。
  11. 　請求項１０記載の製造方法により製造される抗原提示細胞。
  12. 　以下の（ａ）または（ｂ）：
    （ａ）請求項１～４のいずれかに記載のペプチド、
    （ｂ）上記（ａ）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
    のいずれかと、末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、CTLの誘導方法。
  13. 　請求項１２記載の誘導方法により誘導されるCTL。
  14. 　請求項１～４のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
  15. 　配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む腫瘍マーカー。
  16. 　配列番号：３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む、請求項１５記載の腫瘍マーカー。
  17. 　配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる腫瘍マーカー。
  18. 　配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一のポリペプチドからなる、請求項１７記載の腫瘍マーカー。
  19. 　配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体、あるいは請求項１４に記載の抗体からなる腫瘍マーカー。
  20. 　配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体からなる、請求項１９記載の腫瘍マーカー。
  21. 　請求項１～４のいずれかに記載のペプチドとHLA抗原とを含有するHLAテトラマー。
  22. 　請求項２１記載のHLAテトラマーからなる腫瘍マーカー。
  23. 　腫瘍が肉腫または腎癌である、請求項１５～２０および請求項２２のいずれかに記載の腫瘍マーカー。
  24. 　請求項１５～２０、請求項２２および請求項２３のいずれかに記載の腫瘍マーカーを含有してなる腫瘍の診断薬。
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