WO2004029248A1 - 腫瘍抗原タンパク質及びその利用 - Google Patents

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WO2004029248A1
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amino acid
seq
peptide
protein
acid sequence
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PCT/JP2003/012037
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Noriyuki Sato
Tomohide Tsukahara
Yuki Nabeta
Satoshi Kawaguchi
Hideyuki Ikeda
Takuro Wada
Toshihiko Yamashita
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Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd.
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • Tumor antigen protein and its use
  • the present invention relates to tumor antigen proteins. More specifically, the present invention relates to the use of the tumor antigen protein PBF and its gene in the field of cancer immunity. Background art
  • CTLs cytotoxic T cells
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • Tumor antigen peptides are produced by synthesizing a tumor-specific protein, that is, a tumor antigen protein in a cell, and then decomposing it in a cell by a protease.
  • the generated tumor antigen peptide binds to MHC class I antigen (HLA antigen) in the endoplasmic reticulum to form a complex, which is transported to the cell surface and presented as an antigen.
  • This antigen-presented complex is recognized by tumor-specific CTL, and exerts an antitumor effect through the production of cytotoxic ⁇ lymphoforce.
  • cancer immunotherapy agents cancer vaccines
  • tumor antigen proteins include those described in table 1 of Immunity, vol. 10: 281, 1999. Specifically, melanocyte tissue-specific proteins gpi 00 (J. Exp. Med., 179: 1005, 1994) and MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3515, 1994) And tyrosinase (J. Exp. Med., 178: 489, 1993) such as HER2 / neu (J. Exp. Med., 181: 2109, 1995) and CE as tumor antigen proteins other than melanoma. A (J. Natl. Cancer. Inst., 87: 982, 1995), and tumor antigen proteins such as PSA (J. Natl. Cancer. Inst., 89: 293, 1997). Quality. However, a tumor antigen protein widely applicable to cancer (tumor) including sarcoma such as osteosarcoma has not been found yet.
  • a papillomavirus binding factor (PBF, GenBank data accession No. AF263928) has been identified (Virology 293, 103-117, 2002).
  • An object of the present invention is to provide, for example, the use of the tumor antigen protein PBF and its gene in the field of cancer immunity.
  • the present inventors have established an osteosarcoma cell line 0S2000 derived from an osteosarcoma patient, and also established a CTL strain TcOS2000cl-303 having cytotoxic activity against the 0S2000.
  • HLA-B5502 gene a type of HLA-B55
  • 293-EBNA cells were transformed into HLA-A2402 gene
  • HLA-A24-1 293-EBNA-A24 cells were prepared.
  • a cDNA clone pool of one of the cDNA libraries prepared from 0S2000 was transfected, and Tc0S2000cl-303 was allowed to act on the transfectants. Whether or not 303 was reacted was examined by measuring the amount of LDH released by the cytotoxic activity of TcOS2000cl-303.
  • PBF contains a tumor antigen peptide region that binds to HLA antigen.
  • HLA antigen a tumor antigen peptide region that binds to HLA antigen.
  • the PBF was widely expressed in sarcomas and renal carcinomas.
  • the tumor antigen protein PBF or the tumor antigen peptide or the gene thereof, which is found in the present invention, is an in vivo or in vitro CTL inducer, It can be used as a cancer vaccine, and has a therapeutic or ameliorating effect on tumors such as osteosarcoma and renal cancer. Further, the PBF is useful as a tumor marker for tumors such as sarcoma and renal carcinoma.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • An CTL inducer comprising, as an active ingredient, a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.
  • Item 2. The amino acid described in SEQ ID NO: 2 Proteins containing an amino acid sequence that is identical or substantially identical to the sequence are as follows:
  • a protein containing an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a cell in which the protein is expressed is CTL
  • C a protein containing an amino acid sequence having 70% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and expressing the protein A protein whose cells have characteristics recognized by CTL;
  • Item 3 A partial peptide of a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and a peptide which binds to an HLA antigen and is recognized by CTL,
  • a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is represented by the following (a) to (d):
  • Item 5 The peptide according to Item 3 or 4, wherein the HLA antigen is HLA—A24 or HLA—B55.
  • Item 6 The peptide according to Item 5, comprising the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 55,
  • Item 7 The amino acid at the second position in the amino acid sequence described in any of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 45 is replaced with tyrosine, phenylalanine, methionine or tryptophan, and the Z- or C-terminal amino acid.
  • the peptide according to item 5 which comprises an amino acid sequence obtained by substituting phenylalanine, leucine, isoleucine, tributofan or methionine with
  • Item 8 An epitope peptide containing the peptide of any one of Items 3 to 7, Item 9. A CTL inducer containing the peptide of any one of Items 3 to 8 as an active ingredient,
  • a CTL inducer comprising a nucleic acid containing a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2,
  • a polynucleotide encoding a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 comprises the following (a) to (g): (a) SEQ ID NO: A polynucleotide comprising the nucleotide sequence according to 1, (b) a polynucleotide containing positions 337 to 1878 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
  • the polynucleotide is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, position 337 to position 187 of SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 3, wherein: 0 or 11 CTL inducer,
  • Item 13 A nucleic acid containing a polynucleotide encoding the peptide according to any of Items 3 to 8,
  • a CTL inducer comprising the nucleic acid according to Item 13;
  • Item 18 CTLs induced by the induction method described in Item 17;
  • Item 1 9. An antibody that specifically binds to the peptide of any one of Items 3 to 7, Item 20.
  • Item 2 The nucleotide sequence according to Item 20, which comprises a polynucleotide having at least 15 consecutive nucleotides and Z or a polynucleotide complementary to the polynucleotide in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • Tumor markers a polynucleotide having at least 15 consecutive nucleotides and Z or a polynucleotide complementary to the polynucleotide in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • a tumor marker comprising a continuous polypeptide containing at least 8 amino acids
  • Item 23 The tumor marker according to Item 22, which is a polypeptide comprising at least 8 contiguous amino acids in the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2.
  • Item 24 An antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a tumor marker consisting of the antibody of Item 19,
  • Item 25 The tumor marker according to Item 24, which comprises an antibody against a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • Item 26 An HLA tetramer containing the peptide according to any one of Items 3 to 7 and an HLA antigen,
  • Item 27 A tumor marker comprising the HLA tetramer according to Item 26,
  • Item 28 The tumor marker according to any one of Items 20 to 25 and 27, wherein the tumor is sarcoma or kidney cancer.
  • Item 29 A diagnostic agent for a tumor comprising the tumor marker according to any one of Items 20 to 25, Item 27 and Item 28,
  • Item 30 The agent for inducing CTL according to Item 1, 2, 9, 10, 11, 12, or 14 used as a cancer vaccine.
  • Figure 1 shows the reactivity of CTL (TcOS2000cl-303) when 1B9.1H4 cDNA was introduced into 293-EBNA-B55 or 293-EBNA-A24 and expressed by LDH release assay. It is the graph which showed the result. In the figure, the horizontal axis indicates the absorbance at 490 nm.
  • Figure 2 shows the results of the cDNA of 1B9.1H4, was determined by 293-EBNA-B55 or 293- EBNA- A24 in the reactivity of Tc0S2000cl-303 when expressed by introducing 51 Cr release mediation Si It is the graph which did.
  • (A) shows the results when 293-EBNA-A24 cells were used, and
  • (B) shows the results when 293-EBNA-B55 cells were used.
  • the horizontal axis shows the E / T ratio
  • the vertical axis shows the cytotoxic activity.
  • Figure 3 shows the CT when the 1B9.1H4 or PBF gene was introduced into 293-EBNA-A24 and expressed.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of measuring the reactivity of L (TcOS2000cl-303) by LDH release assay.
  • the horizontal axis indicates the absorbance at 490 nm.
  • Figure 4 shows the results of measuring the reactivity of CTL (TcOS2000cl-303) when the 1B9.1H4 or PBF gene was introduced into 293-EBNA-B55 and expressed using LDH release assay.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the reactivity of CTL (TcOS2000cl-303) to 293-EBNA-B55 pulsed with the peptide of SEQ ID NO: 46 by LDH release assay.
  • the horizontal axis shows the absorbance at 490 ntn.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of RT-PCR analysis of the expression of the gene encoding the tumor antigen protein PBF in various cells.
  • 0S2000 is an osteosarcoma cell line
  • PBL is a normal peripheral blood lymphocyte
  • EB-B is an EBV transform B cell
  • K562 is a chronic myeloid leukemia cell line
  • 293EBNA is an adenovirus transform.
  • SaOS, HOS, KIKU, Huo9 and NY indicate osteosarcoma cell lines.
  • HS-SY II, SW982 and Fuji indicate synovial sarcoma cell lines.
  • # 080 indicates a fibrosarcoma cell line.
  • HS729T, A204 and RD indicate rhabdomyosarcoma cell lines.
  • A673, W-ES, NCR-EW2, SCCH196, SK-ESI and RD-ESl indicate Ewing sarcoma cell lines.
  • the expression results of the PBF gene are shown in the upper row, and the expression results of the G3PDH gene as a positive control are shown in the lower row.
  • the protein contained in the CTL inducer of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the protein of the present invention) has an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.
  • the protein of the present invention may be a protein derived from a natural product (eg, an osteosarcoma cell line) or a recombinant protein.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is registered as Accession No. AF263928 in the GenBank database, and is also disclosed in Virology 293, 103-117 (2002). factor: The amino acid sequence of PBF).
  • a protein containing the same amino acid sequence as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2)” is specifically described in SEQ ID NO: 2.
  • the “protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence according to 2” specifically includes the following proteins (a) to ():
  • a protein consisting of an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is used.
  • the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 include the following proteins (a to (c ′):
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a cell expressing the protein is recognized by CTL.
  • (b ') a protein consisting of an amino acid sequence showing 70% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein cells expressing the protein are recognized by CTL A protein having
  • a protein containing an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is a so-called artificially produced protein. Or a protein such as an allelic variant present in a living body.
  • the number of amino acid mutations and mutation sites in the protein are not limited as long as the activity of the protein of the present invention is maintained. Indices for determining how many amino acid residues should be deleted, substituted and / or added without losing the activity can be obtained by computer programs well known to those skilled in the art, for example, DNA Star software. Can be found using For example, the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, and preferably within 5% of all amino acids.
  • the amino acid to be substituted should be an amino acid having similar properties to the amino acid before substitution, such as the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and amphiphilicity of the residue, from the viewpoint of maintaining the structure of the protein. Is preferred.
  • Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe and Trp are amino acids classified as non-polar amino acids, and Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn and Gin are non-chargeable with each other.
  • Asp and Glu are amino acids classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
  • the “protein containing an amino acid sequence exhibiting 70% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2” in the above (b) is, for example, a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • Specific examples include a protein consisting of a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • sequence identity refers to sequence identity and homology between two proteins.
  • the “sequence identity” is optimal over the region of the sequence being compared. It is determined by comparing the two aligned sequences.
  • the protein to be compared may have an addition or deletion (for example, a gap or the like) in the optimal alignment of the two sequences.
  • an alignment should be prepared using the ClustalW algorithm (Nucleic Acid Res., 22 (22): 467 3-4680 (1994)) using Vector NTI. It can be calculated by The sequence identity is measured using sequence analysis software, specifically, analysis tools provided by Vector NTI, GENETYX-MAC, and public databases.
  • the public database is generally available, for example, at a homepage address http: //www.ddbj.nig.ac.jp.
  • polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 includes, for example, the amino acid of SEQ ID NO: 2 About 40% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with the polynucleotide encoding the sequence. And a polynucleotide containing a base sequence having the same sequence identity as described above.
  • Hybridization can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in a basic book such as Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • “stringent conditions” means Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular loning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) ⁇ myself Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Labor as described in atory Press (1989). It can be determined based on the melting temperature (Tm).
  • Hybridization conditions include, for example, 4 ⁇ SSC (20 ⁇ SS ((i, 333 mM sodium citrate, 333 mM NaCl)), 0.5% SDS and 50% formamide in a solution containing 4%. Examples include conditions for hybridization at 2 ° C, and conditions for hybridization at 65 ° C in a solution containing 6X SSC (not containing 50% formamide).
  • the washing conditions after hybridization may be about 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, about 37 ° C.
  • the complementary strand preferably maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions. Is not particularly limited, '0. 5 X SSC, 0. 1% SDS, 42 ° C "as a more stringent Haiburidizu condition about" 0. 1 X SSC as more stringent Haiburidizu conditions, 0. 1% SDS N 6 5 ° C ”.
  • the protein of the present invention has substantially the same activity as the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the substantially equivalent activity means that a cell expressing the protein of the present invention is recognized by CTL, that is, the cell shows reactivity to CTL, in other words, the protein of the present invention or the protein of the present invention. It shows that the antigen peptide derived from E. coli activates CTL or induces CTL.
  • the cell is preferably a cell that expresses an HLA antigen. Therefore, the substantially equivalent activity is more specifically, for example, by expressing the protein of the present invention in a cell that expresses an HLA antigen such as HLA-A24 or HLA-B55, the antigen derived from the protein of the present invention.
  • HLA antigen such as HLA-A24 or HLA-B55
  • Such properties of the protein of the present invention is a method known per se or how modifications thereof (e.g. 5 1 Cr release mediation Si (J. I negation unol, 159:. 4753, 1997 ), LDH release ⁇ Ssi (LDH Cytotoxicity Detection Kit (TAKARA BIO), measurement of the amount of site force, etc.)
  • the specific Atsey method is exemplified below.
  • host cells such as 293-EBNA cells (Invitrogen) are used.
  • Examples of the DNA encoding the HLA antigen used herein include a DNA encoding the HLA-A24 antigen and a DNA encoding the HLA-B55 antigen.
  • Examples of the DNA encoding the HLA-A24 antigen include HLA-A2402 cDNA (Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995), Genbank Accession No. M64740).
  • Examples of the DNA encoding the HLA-B55 antigen include HLA-B5502 cDNA (GenBank Acc. No. M77777, J. Immunol., 148 (4), 1155-1162 (1992)).
  • the transfection can be performed, for example, by a lipofectin method using a ribofectamine reagent (manufactured by GIBCO BRL). Thereafter, the HLA antigen used is added with restrictive CTL and allowed to act, and the amount of various site forces, such as IFN- ⁇ , produced by the reaction (activation) of the CTL is measured by, for example, the ELIS method. It can be determined by measuring.
  • CTL CTL prepared by stimulating human peripheral blood lymphocytes with the protein of the present invention described in SEQ ID NO: 2 or Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N CTLs established by the method described in Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995 and the like can be used.
  • the protein of the present invention can be obtained, for example, by using Atsushi (W002 / 47) using a human model animal.
  • the protein of the present invention can be produced from a natural product (eg, an osteosarcoma cell line, a renal cancer cell line, etc.) by a method of purifying the protein known per se, or a polynucleotide encoding the protein of the present invention described later.
  • a natural product eg, an osteosarcoma cell line, a renal cancer cell line, etc.
  • the peptide contained in the CTL inducer of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the peptide of the present invention) is a partial peptide of the protein of the present invention, and binds to the HLA antigen to form a CTL. It is a recognized tumor antigen peptide. That is, if the peptide is a peptide consisting of a part of the amino acid sequence of the protein of the present invention described above, and if the binding complex between the peptide and the HLA antigen is a peptide recognized by CTL, May be a peptide of any length at any position in the amino acid sequence of the protein.
  • Such a peptide of the present invention synthesizes a candidate peptide consisting of a part of the protein of the present invention, and determines whether or not a complex of the candidate peptide and the HLA antigen is recognized by CTL, that is, the candidate peptide. Identification can be performed by assessing whether a peptide has activity as a tumor antigen peptide.
  • the peptide can be synthesized according to a method used in ordinary peptide chemistry.
  • the known methods include those described in the literature (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maru Zen, Ltd., 1975; Basics and experiments of peptide synthesis, Maruzen, 1985; Continued development of pharmaceuticals, Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991).
  • the regularity (motif) of the sequence of the antigenic peptide presented by binding to the HLA has been known (see, for example, I Hidden Unogenetics, 41: pl78, 1995).
  • the HLA-A24 motif is that the second amino acid of the peptide consisting of 8 to 11 amino acids is thicin, phenylalanine, methionine or tryptophan, and the amino acid at the C-terminal is phenylalanine.
  • Leucine, isoleucine, tryptophan or methionine J. Immunol., 152, p3913, 1994; Immunogenetics, 41: pl78, 1995; J. Immunol., 155: p4307, 1994.
  • the motif of HLA-A2 the motifs shown in Table 1 below are known (Immunogenetics, 41, pl78, 1995; J. Immunol., 155: p4749, 1995). Five
  • peptides involved in these motifs from the amino acid sequence of the protein of the present invention.
  • a sequence expected to be capable of binding to the HLA antigen can be easily selected by a search using the BIMAS software.
  • the selected candidate peptide is synthesized by the method described above, and whether or not the candidate peptide is recognized by CTL by binding to the HLA antigen, that is, the activity of the candidate peptide as a tumor antigen peptide
  • the peptide of the present invention can be identified by measuring whether or not it has the same.
  • Specific examples of the method for identifying the tumor antigen peptide of the present invention include the method described in J. Immunol., 154, P2257, 1995. That is, when peripheral blood lymphocytes were isolated from humans positive for an HLA antigen of a type considered to present a candidate peptide, and stimulated by adding the candidate peptide in vitro, the candidate peptide was pulsed. Induction of CTL that specifically recognizes HLA antigen-positive cells indicates that the candidate peptide can be a tumor antigen peptide.
  • the presence / absence of CTL induction is determined by, for example, various site force in (eg, IFN- ⁇ ) produced by CTL in response to antigen peptide-presenting cells.
  • the amount can be determined by measuring, for example, by ELISA. Also 5 1 Cr-labeled antigen peptide presenting cells Methods for measuring the cytotoxicity of CTL against (5 1 C r release Atsu Si, Int J. Cancer, 58:. P317, 1994) can be further examined by The candidate peptide was pulsed into cells that had been transfected into, for example, 293-EBNA cells (Invitrogen), which had been transduced with an expression plasmid that expresses a cDNA encoding a type of HLA antigen that is thought to present the candidate peptide.
  • 293-EBNA cells Invitrogen
  • examples of the HLA antigen include HLA-A24 antigen and HLA-B55 antigen.
  • the cDNA encoding the HLA antigen is HLA-A2402 cDNA (Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995), Genbank Accession). No. M64740) can be used.
  • the HLA-B5502 gene GenBank Acc.No.M77777, J. Immunol., 148 (4), 1155- 1162 (1992)
  • HLA-B5502 gene GenBank Acc.No.M77777, J. Immunol., 148 (4), 1155- 1162 (1992)
  • the CTL is prepared by stimulating human peripheral blood lymphocytes with a peptide
  • Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333, 1038- CTLs established by the method described in 1044, 1995, etc. can be used.
  • the activity of the peptide of the present invention is examined in vivo by subjecting it to, for example, Atsusei (W002 / 7474, Int J. Cancer: 100, 565-570 (2002)) using a human model animal. be able to.
  • the tumor antigen peptide of the present invention can be identified, for example, according to W097 / 46676 or the method described in Example 3 described later.
  • peptide of the present invention as described above include the amino acid represented by SEQ ID NO: 2.
  • Peptides which are partial peptides of the protein of the present invention comprising an acid sequence and which are recognized by CTL by binding to an HLA antigen From the viewpoint of the HLA antigen to which the peptide of the present invention binds, the peptide of the present invention that binds to the HLA-A24 antigen or HLA-B55 antigen can be mentioned.
  • HLA-A24 binding tumor antigen peptides are identified in a search using BIMAS software and are described in Table 2 (9 amino acids) and Table 3 (10 amino acids) below. Or a peptide having an amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 6 to 45, wherein the peptide binds to the HLA-A24 antigen and is recognized by CTL. No.
  • HLA-B55-binding tumor antigen peptide examples include a peptide having an amino acid sequence of Cys Thr Ala Cys Arg Trp Lys Ala Cys Gin Arg (SEQ ID NO: 46). Furthermore, a peptide consisting of 9, 10 or 11 amino acid portions of the peptide,
  • peptide consisting of a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as described above, but also the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is contained.
  • a peptide consisting of a part of the protein of the present invention is also included in the category of the peptide of the present invention as long as it has a property of binding to an HLA antigen and being recognized by CTL.
  • modified peptide consisting of a part of a protein obtained by modifying (deleting, substituting and / or adding) a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (hereinafter, the peptide according to the modification is referred to as “modified peptide” )
  • modified peptide are included in the category of the peptide of the present invention as long as they have the property of binding to the HLA antigen and being recognized by CTU.
  • amino acid sequence of the protein of the present invention more specifically, one or more amino acid sequences of the peptide of the present invention comprising a part of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2
  • Modified peptides having the following amino acid residues and having activity as a tumor antigen peptide that is recognized by CTLs by binding to HLA antigens are included in the scope of the peptides of the present invention. It is.
  • the “modification” of an amino acid residue means substitution, deletion, and / or addition of an amino acid residue (including addition of an amino acid to the N-terminal or C-terminal of a peptide), and preferably an amino acid residue. Substitution.
  • the number and position of amino acid residues to be substituted are arbitrary as long as the activity as a tumor antigen peptide is maintained. Since the length of the peptide is about 8 to 14 amino acids, the range of one to several is preferred.
  • the length of the modified peptide of the present invention is preferably about 8 to 14 amino acids (however, HLA-DR, -DP, and -DQ may have a length of 14 amino acids or more.)
  • ⁇ LA such as, -Cw0401, -Cw0602, etc.
  • the regularity (motif) of the sequence of the antigen peptide presented by binding to the HLA has been known.
  • a peptide sequence that is expected to be capable of binding to the HLA antigen can be searched on the Internet (http: @ bimas.dcrt.nih.gov / molbio / hla_bind /). Therefore, it is possible to prepare the modified peptide based on the motif and the like.
  • the second amino acid of the peptide consisting of 8 to 11 amino acids is tyrosine, phenylalanine, methionine, or tryptophan. It is known that the C-terminal amino acid is phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine (J. Immunol., 152: p3913, 1994; Immunogenetics, 41: pl 78, 1995; J Immunol., 155: p4307, 1994). In the case of HLA-A2, the motifs shown in Table 1 above are known.
  • peptide sequences that are expected to be able to bind to HLA antigens are shown on the Internet (http: ⁇ bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/), for example, properties similar to amino acids that can be taken on the motif. Amino acids with are acceptable. Therefore, the amino acid at a position where amino acid substitution on these motifs is possible (in HLA-A24 and HLA-A2, the second position and the C-terminus of the peptide) can be combined with another amino acid (preferably on the Internet). (Predicted amino acids) and modified peptides having an activity of binding to the HLA antigen and being recognized by CTLs.
  • a modified peptide having the above-mentioned activity which is a peptide containing an amino acid sequence obtained by substituting any of the amino acid residues known on the motif at the position
  • the amino acid at the second position is replaced with tyrosine, phenylalanine, methionine or tryptophan, and / or Amino acid was replaced with phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine Modified peptides, which have the above-mentioned activity.
  • a peptide in which the second amino acid is substituted with tyrosine is more preferable.
  • the peptide of the present invention further includes an epitope peptide containing the peptide of the present invention.
  • a peptide (epitope peptide) 1 in which a plurality of CTL epitopes (antigen peptides) are linked has been shown to have efficient CTL inducing activity.
  • Journal of Immunology 1998, 161: 3186-3194 states that an approximately 30-mer peptide linked to HLA-A2, -A3, -All, B53-restricted CTL epitope derived from the cancer antigen protein PSA is in vivo. Induction of CTLs specific to CTL epitopes was reported. It has also been shown that CTLs can be efficiently induced by a peptide (epitope peptide) in which CTL and helper epitopes are linked.
  • helper peptide refers to a peptide having an action of activating CD4-positive T cells (Immunity., 1: 751, 1994).
  • CD4-positive T cells Immunity., 1: 751, 1994.
  • HBV c128_ derived from hepatitis B virus 140 and TT 947-966 derived from tetanus toxin are known.
  • CD4 + T cells activated by the helper epitope are considered to be important for the anti-tumor immune response because they exert effects such as induction and maintenance of CTL differentiation and activation of macrophages and other effectors. ing.
  • CTL epitope a cancer antigen peptide consisting of positions 280 to 288 of the melanoma antigen gplOO
  • helper epitope T helper epitope with tetanus toxin
  • a peptide having a CTL inducing activity which is a peptide in which a plurality of peptides including the peptide of the present invention are linked (epitope peptide), can also be exemplified as a specific example of the peptide of the present invention.
  • the epitope peptide is: 1 multiple CTL epitopes (tumor antigen peptide ) Or a peptide linking CTL peptide and helper peptide, which is processed in antigen-presenting cells and the resulting tumor antigen peptide is presented to the antigen-presenting cells. Defined as peptides that induce inducing activity.
  • the CTL peptide used is HLA-Al, -A0201, -A0204, -A0205, derived from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.
  • CTL epitopes derived from other tumor antigen proteins are included.
  • a plurality of these CTL epitopes can be ligated, and the length of one CTL epitope is determined by analyzing antigen peptides bound to various HLA molecules (Immunogenetics, 41: 178, 1995). About 14 amino acids can be mentioned.
  • the helper peptide used may be HBV c128_140 derived from hepatitis B virus or tetanus toxin derived from hepatitis B virus as described above. TT 9 4 7—9 6 7 and the like.
  • the length of the helper peptide is about 13 to 30 amino acids, preferably about 13 to 17 amino acids.
  • Such a peptide in which a plurality of peptides are linked can be produced by a general peptide synthesis method as described above.
  • it can also be produced using ordinary DNA synthesis and genetic engineering techniques based on the sequence information of a polynucleotide encoding an epitope peptide in which a plurality of these epitopes are linked. That is, the polynucleotide is introduced into a well-known expression vector, a transformant produced by transforming a host cell with the obtained recombinant expression vector is cultured, and a plurality of desired epitopes are obtained from the culture. It can be produced by recovering the linked epitope peptide.
  • the epitope peptide obtained by linking a plurality of epitopes produced as described above can be used in the above-mentioned in vitro assay, WO 02/47474 and Int J. Cancer: 100, 5 CTL inducing activity can be measured by subjecting it to an in vivo assay using a human model animal described in 65-570 (2002).
  • examples of the modifying group of the amino group of the N-terminal amino acid include 1 to 3 alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, phenyl group, cycloalkyl group, and acyl group.
  • Specific examples of the acyl group Is an alkanoyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkynoyl group having 1 to 6 carbon atoms substituted with a fuunyl group, a carbonyl group substituted with a cycloalkyl group having 5 to 7 carbon atoms, and 1 to 6 carbon atoms Alkylsulfonyl group, phenylsulfonyl group, alkoxycarbonyl group having 2 to 6 carbon atoms, alkoxycarbonyl group substituted by phenyl group, carbonyl group substituted by cycloalkoxy having 5 to 7 carbon atoms, phenoxycarbonyl group And the like.
  • Examples of the peptide in which the carboxyl group of the C-terminal amino acid is modified include an ester form and an amide form.
  • Specific examples of the ester form are alkyl esters having 1 to 6 carbon atoms and substituted with a phenyl group. Examples thereof include an alkyl ester having 0 to 6 carbon atoms and a cycloalkyl ester having 5 to 7 carbon atoms.
  • Specific examples of the amide form include one or two of an amide and an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • Amides that form azacycloalkanes are exemplified.
  • the nucleic acid contained in the CTL inducer of the present invention is a polynucleotide encoding the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the polynucleotide of the present invention). ).
  • the polynucleotide of the present invention may be any of cDNA, mRNA, cRNA, genomic DNA, or synthetic DNA of various cells and tissues, for example, cells and tissues derived from osteosarcoma and renal cancer. Further, it may be a single-stranded or double-stranded form. Specifically, (a) a polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, (b) SEQ ID NO: polynucleotide containing # 337 ⁇ positions first 87 8 of the base sequence set forth in 1,
  • polynucleotide containing a base sequence substantially identical to the polynucleotides (a) to (d) may be mentioned.
  • nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 has been registered in the GenBank database as Accession No. AF263928, and has been disclosed in Virology 293, 103-117 (2002).
  • lomavirus binding factor: PBF a nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 2), in which positions 337 to 1878 correspond to the open reading frame.
  • the polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is a similar polynucleotide containing the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 3 a portion of positions 1 to 1469 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 3 and a portion of positions 704 to 1878 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 are represented by SEQ ID NO: It has 100% sequence identity except for 294 bp which is present only in 3.
  • polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 (b) a polynucleotide containing positions 337 to 1878 of the base sequence of SEQ ID NO: 1, (c) Polynucleotides containing the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or (d) polynucleotides containing the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 3 are, more specifically, these sequences. No.
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 337 to 18778, or SEQ ID NO: 3, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 And a polynucleotide comprising a base sequence to be used.
  • the polynucleotide is a protein encoded by the polynucleotide. It has substantially the same activity as the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the term “substantially the same activity” as used herein refers to the property that cells expressing the protein encoded by the polynucleotide of the present invention are recognized by CTL. The activity and the method for measuring the activity are as described in the above “1) Protein of the present invention”.
  • the polynucleotide containing the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is disclosed in GenBank Accession No. AF263928, or disclosed in SEQ ID NO: 1 or 3 in the sequence listing of this specification.
  • the appropriate portion of the base sequence is used as a hybridization probe or PCR primer, and cloned, for example, by screening a cDNA library derived from an osteosarcoma cell line (eg, SaOS-2). be able to.
  • the cloning can be easily performed by those skilled in the art, for example, according to a basic book such as Molecular Cloning 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
  • a polynucleotide having a nucleotide sequence substantially the same as any of the polynucleotides (a) to () is used.
  • examples of the polynucleotide having the same base sequence include the following polynucleotides listed in (e to (g ′):
  • a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence showing 70% or more sequence identity with any of the polynucleotides (a) to (d) above, and expressing a protein encoded by the polynucleotide A polynucleotide having a characteristic that allows the cell to be recognized by CTL,
  • (g ′) a protein encoded by the polynucleotide of any one of the above (a) to (d), wherein the protein comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted and / or added.
  • the “polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide of any of the above (a) to (d)” includes, for example, the above (a) to (d) About 40% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, most preferably A polynucleotide containing a base sequence having about 95% or more sequence identity is exemplified. Specific examples include a polynucleotide comprising a partial sequence of the polynucleotide of any one of the above (a) to (d).
  • Hybridization is performed by a method known per se or a method similar thereto, for example,
  • stringent conditions refer to Berger and Kernel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)- ⁇ BiJ SdMolecular Cloning 2nd Edt. Binds a complex or probe as taught in Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). It can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid.
  • Hybridization conditions include, for example, 6 ⁇ SSC (20 ⁇ SS ( ⁇ i, 333 mM sodium citrate, 333 mM NaCl), 0.5% SDS and 50% formamide in a solution containing 4%). Conditions for hybridization at 2 ° C, or conditions for hybridization at 65 ° C in a solution containing 6X SSC (V, not containing 50% formamide), and the like can be mentioned.
  • the washing conditions after the hybridization are about 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, about 37 ° C.
  • the complementary strand is preferably one that maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions.
  • the more stringent hybridization conditions are about 0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C, and the more stringent hybridization conditions are 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C ”level cleaning conditions.
  • the “polynucleotide containing a base sequence showing 70% or more sequence identity with any of the above polynucleotides (a) to ()” includes, for example, any one of the above (a) to (d) Polynucleotides containing a base sequence showing about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more sequence identity with the base sequence of the polynucleotide. Specific examples include a polynucleotide comprising a partial sequence of the polynucleotide of any one of the above (a) to ().
  • sequence identity refers to sequence identity and homology between two polynucleotides.
  • sequence identity is determined by comparing two sequences that are optimally aligned over the region of the sequence to be compared.
  • the polynucleotide to be compared may have an addition or deletion (for example, a gap or the like) in the optimal alignment of the two sequences.
  • sequence identity can be determined, for example, by creating an alignment using the ClustalW algorithm (Nucleic Acid Res., 22 (22): 4673-4680 (1994)) using Vector NTI. It can be calculated.
  • sequence identity was determined by using sequence analysis software, specifically, Vector NTI, GE Measured using analysis tools provided by NETYX-MAC and public databases.
  • the public database mentioned above is generally available, for example, at the website address http: ⁇ www.ddbj.nig.ac.jp.
  • Polynucleotides having such sequence identity can be produced by the above-mentioned hybridization reaction or ordinary PCR reaction, or by the below-described polynucleotide modification (deletion, addition, substitution) reaction.
  • a protein containing an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in a protein encoded by the polynucleotide of any one of the above (a) to (d) It means a nucleic acid encoding a protein such as an artificially produced modified protein or an allelic variant present in a living body.
  • the number of amino acid mutations and mutation sites in the protein are not limited as long as the activity of the protein of the present invention is maintained.
  • Indicators for determining how and how many amino acid residues should be deleted, substituted and Z or added without loss of activity in this way are computer programs well known to those skilled in the art, for example, DNA Star. can be found using software.
  • the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, and preferably 5% or less of all amino acids.
  • the amino acid to be substituted is an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution, such as residue polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and amphiphilicity, from the viewpoint of maintaining the structure of the protein. Is preferred.
  • Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe and Trp are amino acids classified as non-polar amino acids, and Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn and Gin are non-charged amino acids.
  • Asp and Glu are amino acids classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
  • Polynucleotides encoding this modified protein can be obtained by various methods described in a basic book such as Molecular Cloning 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), for example, site-directed mutagenesis, PCR and the like. Can be manufactured. In addition, using a commercially available kit, a known method such as the gapped duplex method or the Kunkel method is used. Can also be manufactured.
  • the polynucleotide of the present invention as described above is a protein in which the protein encoded by the polynucleotide has substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • substantially the same activity refers to the property that cells expressing the protein encoded by the polynucleotide of the present invention are recognized by CTL.
  • the activity and the method for measuring the activity are as described in the above “1) Protein of the present invention”.
  • the nucleic acid containing the polynucleotide of the present invention can be in any of single-stranded and double-stranded forms.
  • a recombinant expression vector for expressing the protein of the present invention can be prepared by inserting the polynucleotide of the present invention into an expression vector. That is, the category of the nucleic acid of the present invention also includes a recombinant expression vector prepared by inserting the double-stranded polynucleotide of the present invention into an expression vector.
  • the expression vector used here can be appropriately selected depending on the host used, the purpose, and the like, and examples include a plasmid, a phage vector, and a virus vector.
  • examples of the vector include a plasmid vector such as pUC118, pUC119, pBR322, and pCR3, and a phage vector such as ⁇ and Lgtll.
  • yeast vectors include pYES2, pYEUra3, and the like.
  • examples include pAcSGHisNT-A.
  • the host is an animal cell, pCEP4, pKCR, pCDM8, pGL2 N pcDNA3. 1, pRc / RSV, and plasmid vectors such as pRc / CMV, retroviral vectors, adenovirus vectors of all, adeno-associated virus vector, etc.
  • Virus vectors include a virus vector.
  • the vector may appropriately have factors such as a promoter capable of inducing expression, a gene encoding a signal sequence, a marker gene for selection, and a terminator.
  • a sequence expressed as a fusion protein with thioredoxin, His tag, GST (glutathione S-transferase), or the like may be added.
  • suitable promoters one that functions in the host cell la c, tac, trc, trp, CMV, such as the SV40 early promoter) (such as P GEX4T) GST fusion Tanpakube Kuta one with and, Myc, such as His vector one (pcDNA 3 having the tag sequence.
  • a vector (pET32a) that expresses a fusion protein with thioredoxin and a His tag can be used.
  • a transformed cell containing the expression vector By transforming a host with the expression vector prepared above, a transformed cell containing the expression vector can be prepared.
  • the host used herein includes Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
  • Escherichia coli include E. coli K-12 strain HB101, C600, JM109, DH5a, and AD494 (DE3).
  • yeast include Saccharomyces cerevisiae.
  • Animal cells include L929 cells, BALB 3T3 cells, C127 cells, CH0 cells, COS cells, Vero cells, Hela cells, 293-EBNA cells and the like. Insect cells include sf9.
  • a normal introduction method suitable for the host cell may be used. Specific examples include a calcium phosphate method, a DEAE-dextran method, an electroporation method, and a method using a lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL).
  • the cells are cultured in a usual medium containing a selectable marker, whereby transformed cells in which the expression vector has been introduced into host cells can be selected.
  • the protein of the present invention can be produced by continuously culturing the transformed cells obtained as described above under suitable conditions.
  • the obtained protein can be further isolated and purified by general biochemical purification means.
  • the purification means include salting out, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography, and gel filtration chromatography.
  • the category of the nucleic acid of the present invention also includes a nucleic acid containing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention.
  • the polynucleotide encoding the peptide of the present invention may be in the form of DNA or RNA. These polynucleotides of the present invention can be easily produced based on the amino acid sequence information of the peptide of the present invention and the sequence information of the DNA encoded thereby. can do. Specifically, it can be produced by ordinary DNA synthesis or amplification by PCR.
  • polynucleotide encoding the peptide of the present invention include a polynucleotide encoding the above-mentioned peptide.
  • the nucleic acid containing the polynucleotide encoding the peptide of the present invention can take any of single-stranded and double-stranded forms.
  • a recombinant expression vector for expressing the peptide (epitope peptide) of the present invention is produced by inserting the polynucleotide of the present invention into an expression vector. be able to.
  • the expression vector, the host cell, the method of transforming the host cell, and the like used herein are the same as those described above.
  • Cells containing the protein of the present invention are characterized by being recognized by CTL. That is, the protein of the present invention is an inducer of CTL.
  • the induced CTL can exert an antitumor effect through cytotoxic effects and lymphokine production. Therefore, the protein of the present invention can be used as an active ingredient of a drug (cancer vaccine) for treating or preventing a tumor.
  • the CTL inducer containing the protein of the present invention as an active ingredient is capable of treating or preventing a tumor by administering the protein of the present invention to a tumor patient.
  • the protein When the protein is administered to a tumor patient, it is taken up into antigen-presenting cells, and then the tumor antigen peptide produced by cytolysis binds to the HLA antigen to form a complex, and the complex presents the antigen CTLs, which are displayed on the cell surface and specific for this complex, grow efficiently in the body and destroy tumor cells. As described above, the treatment or prevention of tumor is achieved.
  • the CTL inducer comprising the protein of the present invention as an active ingredient can be used for any PBF-positive tumor patient described in SEQ ID NO: 2. Specifically, it can be used, for example, for the prevention or treatment of all sarcomas such as osteosarcoma, or cancers (tumors) such as renal cancer.
  • the CTL inducer containing the protein of the present invention as an active ingredient is a pharmaceutically acceptable carrier such as an appropriate adjuvant so that cellular immunity can be effectively established. It can be administered as a mixture with an injection, or in combination.
  • a cell-derived component or a derivative thereof a site force-in
  • Component derived from plant or its derivative component derived from marine organism or its derivative
  • mineral gel such as aluminum hydroxide
  • surfactant such as lysolecithin
  • pull mouth nick polyol polyanion, peptide, or oil emulsion (emulsion formulation)
  • ribosome preparations, particulate preparations bonded to beads having a diameter of several ⁇ preparations bonded to lipids, microsphere preparations, microcapsule preparations, etc. are also conceivable.
  • the cell-derived components or derivatives thereof include, specifically, (1) dead bacteria of bacteria, (2) cell wall skeleton (abbreviated as Cell Wall Skeleton, CWS) derived from bacteria, (3) specific components derived from bacterial cells or It is classified into its derivatives and the like.
  • 1 killed bacteria include, for example, streptococcus powder (for example, Picibanil; Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.), a dead cell suspension cocktail (for example, Broncasma Berna; Sanwa Chemical Research Laboratories), or death of Mycobacterium tuberculosis. Bacteria and the like.
  • CWS derived from bacteria examples include CWS derived from Mycobacteria (for example, CWS of BCG strain which is Mycobacterium spp. Type B. tuberculosis), CWS derived from Nocardia (for example, CWS of Nocardia Novra), or coryneform. CWS derived from the genus Bacteria etc.
  • Specific components derived from bacterial cells or derivatives thereof include, for example, polysaccharide components derived from Mycobacterium tuberculosis, which are polysaccharides derived from bacterial cells (eg Answer: Zeria Shinyaku Kogyo Co., Ltd.) And basidiomycetes-derived polysaccharides (eg, lentinan; Ajinomoto, Krestin; Sankyo Co., Ltd., Basidiomycetes kawatake), muramyl dipeptide (MDP) -related compounds, lipopolysaccharide (LPS), lipid A-related compounds (MPL), sugar Lipid trehalose dimycolate (TDM), bacterial DNA (eg, CpG oligonucleotide), or derivatives thereof It is below.
  • polysaccharide components derived from Mycobacterium tuberculosis which are polysaccharides derived from bacterial cells (eg Answer: Zeria Shinyaku Kogyo Co., Ltd.
  • cell-derived components and their derivatives may be obtained from commercially available sources, or may be obtained from known literature (eg, Cancer Res., 33, 2187-2195 (1973), J. Natl. Cancer Inst. , 48, 831-835 (1972), J. Bacteriol., 94, 1736-1745 (1967), Gann, 69, 619-6. 26 (1978), J. Bacteriol., 92, 869-879 (1966), J. Natl. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974)) and the like. .
  • cytokine includes, for example, IFN-H, IL-12, GM-CSF, IL-2, IFN-y, IL-18, IL-15 and the like. These sites may be natural products or genetically modified products. These site power-ins can be obtained and used if they are already commercially available.
  • a genetically modified product a desired gene is cloned by a conventional method based on each nucleotide sequence registered in a database such as GenBank, EMBL, or DDBJ and ligated to an appropriate expression vector. Expression and production can be achieved by transforming host cells with the recombinant expression vector.
  • plant-derived component or derivative thereof refers to, for example, Quil A (Accurate Chemical & Scientific Corp), QS-21 (Aquia Biopharmaceuticals inc.), Or glycyrrhizin (SIGMA-ALDRICH) containing saponin-derived components And so on.
  • the “marine-derived component or derivative thereof” includes, for example, galactosylceramide, which is a saccharide and fat derived from sponge.
  • the oil emulsion is, for example, a water-in-oil (wZo) emulsion formulation, an oil-in-water (oZw) emulsion formulation, a water-in-oil-in-water (w / o / w) emulsion formulation And the like.
  • the water-in-oil (w / o) emulsion preparation takes a form in which an active ingredient is dispersed in a water dispersed phase.
  • Oil-in-water (o / w) emulsions take the form in which the active ingredient is dispersed in a water dispersion medium.
  • the water-in-oil-in-water (wZo / w) emulsion formulation takes a form in which the active ingredient is dispersed in the innermost water dispersion phase.
  • the preparation of such an emulsion preparation can be carried out with reference to, for example, JP-A Nos. 8-985 and 9-1122476.
  • the ribosome preparation is a fine particle in which the active ingredient is wrapped in an aqueous phase or a membrane by ribosomes having a lipid bilayer structure.
  • the main lipids used to make liposomes include phosphatidylcholine, sphingomyelin, etc., to which dicetyl phosphate, phosphatidic acid, phosphatidylserine, etc. Charge and stabilize the room.
  • Examples of a method for preparing ribosome include an ultrasonic method, an ethanol injection method, an ether injection method, a reverse phase evaporation method, a French pre-extraction method and the like.
  • the microsphere preparation is a fine particle composed of a homogeneous polymer matrix, in which an active ingredient is dispersed in the matrix.
  • Materials for the matrix include biodegradable polymers such as albumin, gelatin, chitin, chitosan, starch, polylactic acid, and polyalkylcyanoacrylate.
  • biodegradable polymers such as albumin, gelatin, chitin, chitosan, starch, polylactic acid, and polyalkylcyanoacrylate.
  • Known methods for preparing microsphere preparations (Eur. J. Pharm. Biopharm. 50: 129-146, 2000, Dev. Biol. Stand. 92: 63-78, 1998, Pharm. Biotechnol. 10: 1) —43, 199 7), etc., and there is no particular limitation.
  • the microcapsule preparation is fine particles in a form in which the active ingredient is covered with a coating substance as a core substance.
  • Coating materials used for the coating substance include carboxyl methylcellulose, cenorellose acetate phthalate, ethynolecellulose, gelatin, gelatin 'Gum arabic, nitrosenorelose, polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose, etc. Functional polymers. Examples of the method for preparing the microcapsule preparation include a coacervation method and an interfacial polymerization method.
  • Administration methods include intradermal, subcutaneous, intramuscular, and intravenous administration.
  • the dosage of the protein of the present invention in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age of the patient, body weight, etc., but is usually 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.011 mg to 100 mg, It is preferably 0.01 mg to 10 mg, which is preferably administered once every several days to several months.
  • the peptide of the present invention is a CTL inducer having CTL inducing activity.
  • the induced CTL can exert an antitumor effect through the production of cytotoxic action lymphoforce. Therefore, the peptide of the present invention can be used as an active ingredient of a medicament for treating or preventing a tumor.
  • a CTL inducer containing the peptide of the present invention as an active ingredient is administered to a tumor patient, the peptide of the present invention is presented on the HLA antigen of antigen presenting cells, and the binding between the presented HLA antigen and the peptide is achieved.
  • the complex-specific CTL can proliferate and destroy tumor cells, and thus treat or prevent a patient's tumor.
  • the CTL inducer of the present invention comprising the peptide as an active ingredient can be used for any PBF protein-positive tumor patient described in SEQ ID NO: 2. Specifically, it can be used, for example, for the prevention or treatment of general sarcomas such as osteosarcoma or cancers (tumors) such as renal cancer.
  • the CTL inducer containing the peptide of the present invention as an active ingredient may be a single CTL epitope (the peptide of the present invention) as an active ingredient, or may be composed of another peptide (CTL epitope ⁇ helper).
  • the active ingredient may be an epitope peptide linked to a pitope.
  • an epitope peptide in which a plurality of CTL epitopes (antigen peptides) are linked has a CTL-inducing activity efficiently in vivo.
  • the CTL inducer comprising the peptide of the present invention as an active ingredient is administered in a mixture with a pharmaceutically acceptable carrier, for example, an appropriate adjuvant, or in combination with an appropriate adjuvant so that cellular immunity is effectively established. can do.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, an appropriate adjuvant, or in combination with an appropriate adjuvant so that cellular immunity is effectively established. can do.
  • the adjuvant those described in the literature (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) and the like can be applied, and specifically, components derived from bacterial cells or derivatives thereof, cytodynamics, plants, and the like.
  • Ingredients or their derivatives, marine organism-derived components or their derivatives, mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, pull-mouth nick polyols, polyadiones, peptides, or oil emulsions (emulsions) Can be listed.
  • Administration methods include intradermal, subcutaneous, intramuscular, and intravenous administration.
  • CTL inducer comprising the nucleic acid of the present invention as an active ingredient
  • Cells expressing the nucleic acid of the present invention are characterized by being recognized by CTL. That is, the nucleic acid of the present invention is an inducer of CTL.
  • the induced CTL can exert an antitumor effect through cytotoxicity and lymphokine production. Therefore, the nucleic acid of the present invention can be used as an active ingredient of a medicament for treating or preventing a tumor.
  • the CTL inducer containing the nucleic acid of the present invention as an active ingredient is capable of treating or preventing a tumor by, for example, administering and expressing the nucleic acid of the present invention to a tumor patient.
  • the tumor antigen protein is highly expressed in the antigen-presenting cells ⁇ . Thereafter, the tumor antigen peptide generated by intracellular degradation binds to the HLA antigen to form a complex, and the complex is presented at a high density on the surface of the antigen-presenting cell, whereby tumor-specific CT is performed. Grows efficiently in the body and destroys tumor cells. In this way, the treatment or prevention of the tumor is achieved.
  • the CTL inducer comprising the nucleic acid of the present invention as an active ingredient can be used for any PBF-positive tumor patient, which is a PBF gene represented by SEQ ID NO: 1 and an expression product of the gene. Specifically, it can be used, for example, for the prevention or treatment of general sarcomas such as osteosarcoma or cancers such as renal cancer.
  • Methods for administering the nucleic acid of the present invention and introducing it into cells include a method using a viral vector and other methods (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, (1), 23-48). (1994), Experimental Medicine Special Edition, 12 (15), (1994), and references cited therein) can be applied.
  • Methods using viral vectors include, for example, retrovirus, adenovirus , Adeno-associated vinoles, henore virus, vaccinia virus, box vinores, polio virus, shinbis virus, and other DNA viruses or RNA viruses.
  • retrovirus for example, retrovirus, adenovirus , Adeno-associated vinoles, henore virus, vaccinia virus, box vinores, polio virus, shinbis virus, and other DNA viruses or RNA viruses.
  • DNA vaccine method direct injection of the expression plasmid into the muscle
  • ribosome method lipofectin method
  • microinjection method phosphoric acid phosphate method
  • electoral poration method particularly, the DNA vaccine method and the ribosome method are preferred.
  • nucleic acid of the present invention In order for the nucleic acid of the present invention to actually act as a medicine, an in vivo method in which the nucleic acid is directly introduced into the body, or a method in which certain cells are collected from humans, and the nucleic acid is introduced into the cells outside the body, and the cells are treated There is an ex vivo method for returning to the body (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), extra edition of experimental medicine, 12 (15), (1994) , And their references). In vivo methods are more preferred.
  • the in vivo method When administered by the in vivo method, it can be administered by an appropriate route depending on the disease, symptom and the like for the purpose of treatment. For example, it can be administered intravenously, intraarterially, subcutaneously, intradermally, intramuscularly, and the like. When administered by the in vivo method, for example, it can be in the form of a liquid preparation or the like. However, it is generally an injection containing the nucleic acid of the present invention as an active ingredient. An acceptable carrier (carrier) may be added.
  • carrier carrier
  • the ribosome or membrane-fused ribosome containing the nucleic acid of the present invention may be in the form of a liposome preparation such as a suspending agent, a freezing agent, or a centrifugal concentrated cryoprotectant. Can be.
  • the content of the nucleic acid of the present invention in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the patient's age, body weight, etc.
  • the content of the polynucleotide in the nucleic acid is 0.0001 mg to 100 mg, Preferably, 0.001 mg to 10 mg of the nucleic acid of the present invention is administered once every several days to several months.
  • a polynucleotide produced by linking one or more polynucleotides encoding the peptide of the present invention, and in some cases by linking polynucleotides encoding other peptides can be used.
  • it When incorporated into an appropriate expression vector, it can be used as an active ingredient of a CTL inducer.
  • Such an agent for inducing CTL can also take the same administration method and administration form as described above. 7) the antigen-presenting cell of the present invention
  • antigen-presenting cells can be prepared by bringing any of the proteins, peptides and nucleic acids of the present invention into contact with cells capable of presenting antigen in vitro.
  • the present invention provides a method for bringing a cell, which is an antigen-presenting ability, isolated from a tumor patient into contact with any one of the protein, peptide, and nucleic acid of the present invention in vitro, thereby producing the cell. It is intended to provide an antigen-presenting cell in which a complex of an HLA antigen and the peptide of the present invention is presented on the cell surface of the present invention, and a method for producing the same.
  • the term "cells having antigen-presenting ability” is not particularly limited as long as they express an HLA antigen capable of presenting the peptide of the present invention on the cell surface. Dendritic cells are preferred.
  • the substance to be added for preparing the antigen-presenting cells of the present invention from the cells having the antigen-presenting ability may be any of the proteins, peptides and nucleic acids of the present invention.
  • the antigen-presenting cell of the present invention is obtained by isolating cells having an antigen-presenting ability from a tumor patient, pulsing the cell with the protein or peptide of the present invention in vitro, and allowing the HLA antigen to bind to the peptide of the present invention. Obtained by presenting the complex (Cancer Immunol. Immunother., 46:82, 1998, III. Immunol., 158, ⁇ 1796, 1997, Cancer Res., 59, pi 184, 1). 999).
  • dendritic cells for example, lymphocytes are separated from peripheral blood of tumor patients by the Ficoll method, non-adherent cells are removed, and adherent cells are cultured in the presence of GM-CSF and IL-4.
  • the antigen-presenting cells of the present invention can be prepared by inducing dendritic cells, culturing the dendritic cells with the protein or peptide of the present invention, and pulsing the cells.
  • the nucleic acid may be in the form of DNA or RNA. good. Specifically, DNA can be performed with reference to Cancer Res., 56: p5672, 1996 and J. Immunol., 161: ⁇ 5607, 1998. In the case of RNA, Exp. Med. , 184: p465, 1996.
  • the antigen presenting cell can be used as an active ingredient of a CTL inducer.
  • the CTL inducer containing the antigen presenting cell as an active ingredient preferably contains physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), a medium, etc., in order to stably maintain the antigen presenting cell. Les ,.
  • Administration methods include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration.
  • the proteins, peptides and nucleic acids of the present invention can be used in vitro in the treatment of tumor patients as follows. That is, CTLs can be induced by bringing any of the proteins, peptides and nucleic acids of the present invention into contact with peripheral blood lymphocytes in vitro. Specifically, the present invention provides CTLs induced by bringing peripheral blood lymphocytes derived from a tumor patient into contact with any of the proteins, peptides and nucleic acids of the present invention in vivo, and a method for inducing the same. Is what you do.
  • melanoma adoptive immunotherapy in which a patient's own tumor-infiltrating T cells are cultured in large quantities outside the body and returned to the patient has been shown to have therapeutic effects (J. Natl. Cancer Inst. , 86: 1159, 1994).
  • mouse melanoma spleen cells are stimulated at the in vitro opening with the tumor antigen peptide TRP_2, and the tumor antigen-specific CT Metastasis suppression has been observed by proliferating L and administering the CTL to melanoma-transplanted mice (J. Exp. Med., 185: 453, 1997).
  • the CTL can be used as an active ingredient of a therapeutic or prophylactic agent for tumor.
  • the therapeutic or prophylactic agent preferably contains physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), a medium and the like in order to stably maintain CTL.
  • Administration methods include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration.
  • the present invention provides an antibody that specifically binds to the peptide of the present invention.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody using the peptide of the present invention as an immunizing antigen, or a monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it specifically binds to the peptide of the present invention as described above.
  • the antibody of the present invention comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 6 to 55.
  • An antibody that specifically binds to a tumor antigen peptide can be mentioned.
  • Methods for producing these antibodies are already well known, and the antibodies of the present invention can also be produced according to these conventional methods. (Current protocols in Molecular Biology edit. A usubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11. 12-11.13, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. et al., Cold. Spring Harber Labora tory Press, New York 1989).
  • a non-human animal such as a rabbit is immunized using the peptide of the present invention (for example, a tumor antigen peptide comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 6 to 55) as an immunogen. It can be obtained from serum of the immunized animal according to a conventional method.
  • the peptide of the present invention for example, a tumor antigen peptide comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 6 to 55
  • the peptide of the present invention (for example, any of SEQ ID NOS: 6 to 55)
  • a non-human animal such as a mouse
  • a tumor antigen peptide consisting of the amino acid sequence described in any one of (1) to (4) above
  • the resulting spleen cells and myeloma cells are subjected to cell fusion.
  • getting force s Current protocols in Molecular Biology edit . Ausubel et al. (1987) Publ ish. John Wiley and Sons. Section 11. 4 ⁇ 11. 11) 0
  • an antibody against the peptide of the present invention can also be carried out by increasing the immunological reaction using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, as well as lysolecithin, pull-mouthed polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, and the emulsions of quinocyanine and dinitrophenol.
  • surfactants include human adjuvants such as BCG (Bacillus Calmette-Guerin) and Corynebacterium-Panorevum.
  • an antibody that recognizes the peptide and an antibody that neutralizes the activity can be easily produced.
  • Uses of the antibody include affinity chromatography, immunological diagnosis and the like. Immunological diagnosis can be appropriately selected from an immunoblot method, a radioimmunoassay method (RIA), an enzyme immunoassay method (ELISA), a fluorescence or luminescence measurement method, or the like.
  • RIA radioimmunoassay method
  • ELISA enzyme immunoassay method
  • fluorescence or luminescence measurement method or the like.
  • Such an immunological diagnosis is effective in diagnosing a cancer in which the PBF gene of the present invention is expressed, such as sarcoma / renal cancer.
  • Tumor markers related to the polynucleotide of the present invention are tumor markers related to the polynucleotide of the present invention.
  • the PBF gene of SEQ ID NO: 1 is specifically highly expressed in sarcomas and renal cancers as compared to normal cells. Therefore, by detecting the presence or absence and the degree of expression of the gene, the presence or absence and the degree of tumor, particularly sarcoma / renal cancer, can be specifically detected, and the disease can be diagnosed.
  • the polynucleotide of the present invention can be used as a tool for diagnosing whether or not a subject has a tumor or the degree of the disease by detecting the presence or absence or the degree of the expression of the PBF gene in the subject. It is useful as a (tumor marker).
  • the tumor marker of the present invention is a continuous nucleotide sequence of the polynucleotide of the present invention (polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2).
  • a polynucleotide comprising at least 15 bases and / or a polynucleotide complementary thereto.
  • the tumor marker of the present invention comprises a polynucleotide containing at least 15 consecutive nucleotides and a polynucleotide complementary thereto in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3. Things can be mentioned.
  • the complementary polynucleotide refers to the full-length sequence of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, or at least 15 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence. Based on base pairs such as A: T and G: C, it is base-complementary to its partial sequence containing a base sequence of base length (for convenience, these are also referred to as “positive strands”). It means a polynucleotide having a specific relationship.
  • such a complementary strand is not limited to the case where it forms a completely complementary sequence with the base sequence of the target positive strand, but has a complementary relationship with the target positive strand that can hybridize under stringent conditions. You may have it.
  • the stringent condition here is that the complex or probe is bound as taught by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). It can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid to be formed. For example, as washing conditions after hybridization, conditions of about “IX SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be usually mentioned.
  • the complementary strand maintain a hybridized state with the target positive strand even after washing under such conditions.
  • the more severe hybridization conditions are about 0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C, and the more severe hybridization conditions are 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C ”Cleaning conditions.
  • a complementary strand consisting of a nucleotide sequence completely complementary to the nucleotide sequence of the target positive strand, and at least 90%, preferably 95% homology with the strand.
  • a chain consisting of a base sequence having a property can be exemplified.
  • the polynucleotide on the positive strand side includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3. Or a strand comprising a base sequence having a complementary relationship to the base sequence of the above-mentioned complementary strand, as well as those containing a partial sequence thereof.
  • the above-mentioned positive-chain polynucleotide and complementary-strand (reverse-strand) polynucleotide can be used as a single-stranded form as a tumor marker or as a double-stranded form as a tumor marker. Is also good.
  • the tumor marker of the present invention may be a polynucleotide consisting of the base sequence (full length sequence) of SEQ ID NO: 1 or 3, or a polynucleotide consisting of its complementary sequence.
  • a polynucleotide comprising a partial sequence of the above-described full-length sequence or its complementary sequence may be used as long as it selectively (specifically) recognizes the gene of the present invention or a polynucleotide derived from the gene.
  • examples of the partial sequence include a polynucleotide containing at least 15 contiguous bases arbitrarily selected from the base sequence of the above-described full-length sequence or its complementary sequence.
  • “selectively (specifically) recognize” means, for example, that the PBF gene of the present invention or a polynucleotide derived therefrom can be specifically detected in the Northern blotting method. In the method, it means that the PBF gene of the present invention or a polynucleotide derived therefrom is specifically produced, but is not limited thereto. Anything can be used as long as it can be determined to be derived from.
  • the tumor marker of the present invention is, for example, primer 3 (HYPERLINK http: //www.genome.wi.mit.edu/cgi_bin/prinier/primer3) based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, for example. cgi) or Vector NTI (made by Infomax).
  • primer 3 HYPERLINK http: //www.genome.wi.mit.edu/cgi_bin/prinier/primer3
  • a candidate sequence of a primer or probe obtained by applying the base sequence of the gene of the present invention to the software of primer 3 or vector NTI, or a sequence containing at least a part of the sequence is used as a primer or probe.
  • Specific examples of such a tumor marker of the present invention include, for example, the primers of SEQ ID NO: 4 or 5.
  • the tumor marker of the present invention has a length of at least 15 consecutive nucleotides as described above, the length may be appropriately selected according to the use of the marker. And can be set.
  • the detection (diagnosis) of a tumor is performed by evaluating the presence or absence or expression level (expression level) of the PBF gene in a living tissue of a subject, particularly, a test tissue in which a tumor (sarcoma / renal cancer) is suspected.
  • the tumor marker of the present invention may be used as a primer for specifically recognizing and amplifying RNA generated by expression of the PBF gene or a polynucleotide derived therefrom, or as a primer for the RNA or a polynucleotide derived therefrom. It can be used as a probe for detection.
  • the tumor marker of the present invention when used as a primer in the detection of a tumor, examples thereof include those having a base length of usually 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 50 bp, more preferably 15 bp to 35 bp.
  • a detection probe those having a base length of usually 15 bp to the entire sequence, preferably 15 bp to lkb, and more preferably 100 bp to lkb can be exemplified.
  • the tumor marker of the present invention can be used as a primer or a probe according to a conventional method in a known method for specifically detecting a specific gene, such as a Northern blot method, an RT-PCR method, an in situ hybridization method, and the like. .
  • the tumor marker of the present invention is useful for diagnosing and detecting a tumor (diagnosis of presence / absence and degree of morbidity). Specifically, the diagnosis of a tumor using the tumor marker is performed by judging a difference in the gene expression level of a PBF gene between a living tissue (a tissue suspected of a tumor) in a subject and a similar tissue in a normal subject. This can be done by: In this case, the difference in gene expression level is not only the difference between expression and non-expression, but even if both the subject's tissue and the normal person's tissue have expression, the difference in the expression level between them is doubled. Above, preferably includes a case of three times or more.
  • the PBF gene since the PBF gene is induced to be expressed in tumors, it is expressed in the tissue of the subject, and the expression level is at least twice, preferably at least three times as large as that of the corresponding tissue of normal subjects. If so, the subject is suspected of having a tumor.
  • the present invention provides an antibody capable of specifically recognizing the protein of the present invention or its partial peptide (including the peptide of the present invention) as a tumor marker (hereinafter referred to as the antibody of the present invention). ). More specifically, the present invention relates to a tumor comprising an antibody that specifically recognizes the protein of the present invention consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a partial peptide thereof (including the peptide of the present invention). Provide markers.
  • the finding that the PBF gene of the present invention is specifically highly expressed in various sarcomas and kidney cancers was obtained. Therefore, by detecting the presence or absence of the expression products (proteins) of these genes and the extent of their expression, the presence or absence and the extent of the above-mentioned tumors (sarcoma, renal cancer, etc.) can be specifically detected, and the diagnosis of the disease can be made. It can be performed.
  • the antibody is a tool (tumor marker) capable of diagnosing whether or not the subject has a tumor or the extent of the disease by detecting the presence or absence or the degree of the expression of the protein in the subject. ) Is useful as
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited. Even if it is a polyclonal antibody using the protein of the present invention (specifically, a PBF protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2) as an immunogen, Alternatively, the monoclonal antibody may be used. Further, an antibody having an antigen-binding property to a polypeptide consisting of at least consecutive amino acids, usually 8 amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of the protein of the present invention is also included in the antibody of the present invention. included.
  • an antibody of the present invention also can be force s is thus produced in these conventional methods (Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11. 12 ⁇ 11. 13 (2000)).
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody
  • the protein of the present invention expressed and purified in Escherichia coli or the like according to a conventional method, or a partial amino acid of the protein of the present invention is used according to a conventional method.
  • a non-human animal such as a rabbit can be immunized by synthesizing an oligopeptide containing the sequence, and can be obtained from serum of the immunized animal according to a conventional method.
  • a non-human animal such as a mouse is immunized with the protein of the present invention, which is expressed and purified in Escherichia coli or the like according to a conventional method, or an oligopeptide containing a partial amino acid sequence of these proteins.
  • the protein of the present invention used as an immunizing antigen for the production of an antibody (specifically, SEQ ID NO: : A PBF protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2), DNA cloning, construction of each plasmid, transfection to a host, based on the sequence information of the gene provided by the present invention (SEQ ID NOS: 1 and 3). It can be obtained by an operation of culturing an exciton, a transformant, and recovering a protein from the culture. These procedures can be performed by methods known to those skilled in the art, or methods described in the literature (Molecular Cloning, T.
  • the partial peptide of the protein of the present invention can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) according to the amino acid sequence information (SEQ ID NO: 2) provided by the present invention. For details, refer to the above-mentioned items 1) to 3).
  • the antibody of the present invention may be prepared using an oligonucleotide containing a partial amino acid sequence of the protein of the present invention.
  • the oligo (poly) peptide used for producing such an antibody does not need to have a functional biological activity, but desirably has the same immunogenic properties as the protein of the present invention.
  • An oligo (poly) peptide preferably having this immunogenic property and comprising at least 8 amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of the protein of the present invention can be exemplified. .
  • oligo (poly) peptides can also be carried out by increasing the immunological response using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, as well as lysolecithin, pull-mouth nicked polio, polyanions, peptides, oil emulsions, and keyhole limpets.
  • Surfactants such as mocyanine and dinitrophenol, and human adjuvants such as BCG (Bacillus Calmette-Guerin) and corynepacteridium-panolevum.
  • the antibody of the present invention has a property of specifically binding to the PBF protein, the use of the antibody makes it possible to specifically detect the protein expressed in the tissue of the subject. That is, the antibody is useful as a probe for detecting the presence or absence of PBF expression in the tissue of a subject.
  • a test tissue or blood with a suspected tumor is collected by biopsy, etc.
  • PBF can be detected by preparing a protein according to a conventional method and using the above antibody as a probe according to a conventional method in a known detection method such as a Western blot method or an ELISA method.
  • the difference between the amount of PBF protein in the tissue of the subject and the amount of PBF protein in the normal corresponding tissue may be determined.
  • the difference in protein amount includes the presence / absence of protein, or the case where the difference in protein amount is twice or more, preferably three times or more.
  • the expression product (PBF) of the gene is present in the subject's tissue, and the amount of expression of the gene is normal to that of normal tissues. If it is determined that the number is twice or more, preferably three times or more, the tumor is suspected to be affected.
  • the present invention provides a protein or a peptide capable of specifically recognizing an antibody against the protein of the present invention or a partial peptide thereof as a tumor marker. More specifically, the present invention provides a tumor marker comprising the protein of the present invention comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a partial peptide thereof.
  • the partial peptide of the protein of the present invention which is a component of the tumor marker, includes at least consecutive amino acids, usually 8 amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of the protein of the present invention.
  • Other polypeptides include at least consecutive amino acids, usually 8 amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of the protein of the present invention.
  • samples eg, blood, tissue suspected of tumor, etc.
  • the method for producing the protein and the peptide of the present invention used here is as described in the above sections 1) and 2).
  • a patient's blood is collected, or a test tissue suspected of having a tumor is collected by biopsy or the like, and a protein is prepared therefrom according to a conventional method.
  • an antibody against PBF can be detected by using the above-mentioned protein or peptide of the present invention as a probe according to a conventional method.
  • the difference between the amount of the anti-PBF antibody in the tissue of the subject and the amount of the anti-PBF antibody in the normal corresponding tissue may be determined.
  • the difference in protein amount includes the presence / absence of protein, or the case where the difference in protein amount is twice or more, preferably three times or more.
  • an antibody against the expression product (PBF) of the gene is present in the subject tissue, and the amount of the anti-PBF antibody is normal. If it is determined that the amount of the anti-PBF antibody in the tissue is twice or more, preferably three times or more, the tumor is suspected to be affected.
  • the present invention also provides an HLA tetramer containing the peptide of the present invention and an HLA antigen, and a tumor marker comprising the HLA tetramer.
  • the HLA tetramer is a product obtained by biotinizing a complex (HLA monomer) obtained by associating the ⁇ -chain of HLA antigen with a] 32 microglobulin with a peptide (antigen peptide) and binding it to avidin to form a tetramer (Science 279: 2103-2106 (1998), Science 274: 94-96 (1996)).
  • HLA tetramers containing various antigenic peptides are commercially available (for example, Institute of Medical Biology), and HLA tetramers containing the peptide of the present invention and an HLA antigen can be easily prepared. .
  • an HLA tetramer containing a tumor antigen peptide comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 6 to 45 and an HLA-A24 antigen, or any of SEQ ID NOs: 46 to 55
  • An HLA tetramer containing a tumor antigen peptide comprising the described amino acid sequence and an HLA-B55 antigen is exemplified.
  • the HLA tetramer is preferably fluorescently labeled so that the bound CTL can be easily selected or detected by known detection means such as flow cytometry and fluorescence microscopy.
  • detection means such as flow cytometry and fluorescence microscopy.
  • HLA tetramers labeled with phycoerythrin (PE), fluorescein isothiocyanate (FITC), peridinin chlorophyll protein (PerCP) and the like can be mentioned.
  • HLA-A2 4 antigen HLA-A24 alpha chain of antigen
  • the DNA can be easily digested by a conventional method such as PCR.
  • the HLA-B55 antigen the HLA-B5502 gene (GenBan k. Acc. No. 77777, J. Immunol., 148 (4), 1155-1162 (1992)).
  • HLA tetramer component 02 microglobulin is preferably human-derived / 32 microglobulin.
  • the human] 32 microglobulin can be easily cloned by a conventional method such as PCR based on the known nucleotide sequence information of human / 32 microglobulin disclosed in GenBank Acc. No. AB021288.
  • an HLA- ⁇ 24 ⁇ chain expression vector and a) 32 microglobulin expression vector are introduced into Escherichia coli or mammalian cells capable of expressing a protein and expressed.
  • E. coli eg, BL21
  • the obtained monomeric HLA-A24 complex and the peptide of the present invention are mixed to form a soluble HLA-peptide complex.
  • the sequence of the C-terminal portion of the HLA- ⁇ 24 ⁇ chain in the HLA-peptide complex is biotinylated with a BirA enzyme.
  • the HLA tetramer can be prepared by mixing the biotinylated HLA-peptide complex and the fluorescently labeled avidin at a molar ratio of 4: 1. In each of the above steps, protein purification by gel filtration or the like is preferably performed. 5Tumor detection method (diagnosis method)
  • the present invention provides a method for detecting (diagnosing) a tumor using the above-described tumor marker of the present invention.
  • the detection method (diagnosis method) of the present invention is to collect the blood of a subject or to collect a part of a test tissue suspected of a tumor by biopsy or the like, and to include the PBF gene contained therein. Gene expression level, the amount of PBF protein derived from these genes, the amount of antibody against the PBF, or the amount of CTL that recognizes the complex of PBF-derived tumor antigen peptide and HLA antigen In this way, the presence or absence of tumors such as sarcoma and renal carcinoma and the extent of the disease are diagnosed.
  • the detection (diagnosis) method of the present invention can also detect (diagnose) the presence or absence or the extent of improvement of the disease, for example, when a therapeutic agent is administered for the improvement of the tumor in a tumor patient.
  • the detection (diagnosis) method of the present invention comprises using the protein, peptide or nucleic acid of the present invention as an active ingredient. It can also be used for the selection of tumor patients to which a drug can be applied and for the evaluation of the therapeutic effect of the drug.
  • the detection method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
  • Examples of the biological sample used herein include a sample prepared from a subject's biological tissue (a tissue suspected of having a tumor and its surrounding tissue, or blood). Specifically, an RNA-containing sample prepared from the tissue, or a sample containing a polynucleotide further prepared therefrom, or a sample containing a protein or antibody prepared from the tissue, or a peripheral sample prepared from the tissue Examples include a sample containing blood lymphocytes.
  • the diagnostic method of the present invention is implemented as follows, depending on the type of biological sample used as a measurement target.
  • RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom, and a tumor marker of the present invention polynucleotide containing at least 15 contiguous bases in the nucleotide sequence of the polynucleotide of the present invention
  • a nucleotide and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide A nucleotide and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide).
  • RNA derived from a biological sample bound to the tumor marker or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA using the tumor marker as an index
  • the detection method (diagnosis method) of the present invention is carried out by detecting and measuring the expression level of the PBF gene in the RNA.
  • the tumor marker of the present invention comprising the aforementioned polynucleotide (the polynucleotide of the present invention) A polynucleotide containing at least 15 contiguous bases in the nucleotide sequence and / or a polynucleotide complementary thereto) as a primer or a probe, using Northern blotting, RT-PCR, DNA chip analysis, It can be carried out by performing a known method such as an in situ hybridization analysis method.
  • the presence or absence and the expression level of the PBF gene in RNA can be detected and measured by using the tumor marker of the present invention as a probe.
  • the tumor markers of the present invention complementary strand radioactive isotopes (3 2 P, 3 3 P etc.: RI) or a fluorescent substance labeled with a, transfer it to the nylon membrane or the like according to a conventional method
  • the formed duplex between the tumor marker (DNA) and RNA was converted to a signal derived from the label (RI or fluorescent substance) of the swelling marker.
  • Examples of methods for detecting and measuring with a radiation detector (BAS-1800 II, manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) or a fluorescence detector can be given.
  • a radiation detector BAS-1800 II, manufactured by Fuji Film Co., Ltd.
  • a fluorescence detector using the AlkPhos Direct Labeling and Detection System (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech)
  • a tumor marker probe DNA
  • a method of detecting and measuring a signal derived from one label with a multi-bioimager ST0RM860 manufactured by Amersham Pharmacia Biotech can also be used.
  • the presence or absence and expression level of the PBF gene in RNA can be detected and measured by using the above-mentioned tumor marker of the present invention as a primer.
  • a pair of cDNAs prepared from a tumor marker of the present invention was prepared from a RA derived from a living tissue of a subject according to a conventional method, and used as a type II to amplify the target PBF gene region.
  • the primers positive strand that binds to the above-mentioned cDNA (-strand) and reverse strand that binds to the + strand
  • PCR is performed according to a conventional method to detect the resulting amplified double-stranded DNA.
  • the method can be illustrated.
  • the amplified double-stranded DNA was detected by a method for detecting labeled double-stranded DNA produced by performing the above PCR using primers that had been labeled with RI or a fluorescent substance in advance.
  • a method in which double-stranded DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and a method in which a labeled tumor marker is used as a probe, hybridized with the probe, and detected, can be used.
  • the generated labeled double-stranded D NA products can be measured using an Agilent 2100 Bioanalyzer (manufactured by Yokogawa Analytical Systems).
  • RT-PCR reaction solution using SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems) according to the protocol, and react with ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosysteras) to detect the reaction. You can also.
  • DNA chip # analysis prepare a DNA chip on which the above-mentioned tumor marker of the present invention is attached as a DNA probe (single-stranded or double-stranded).
  • the tumor detection method (diagnosis method) of the present invention is performed by detecting PBF in a biological sample and measuring the amount. Specifically, it can be carried out by a method comprising the following steps (a), (b) and (c):
  • a tumor marker as a primary antibody and labeled with 1 radioisotope such as 2 5 I, a fluorescent substance, an enzyme, such as horseradish peroxide O key Shitaze (HRP) or the like as a secondary antibody
  • 1 radioisotope such as 2 5 I
  • a fluorescent substance such as an enzyme, such as horseradish peroxide O key Shitaze (HRP) or the like
  • HRP horseradish peroxide O key Shitaze
  • the signal derived from the radioisotope, fluorescent substance, etc. of the obtained labeled compound can be measured with a radiometer (BAS-1800II: manufactured by Fuji Film Co., Ltd.), a fluorescence detector, etc. This can be done by detecting and measuring.
  • the tumor marker of the present invention was used as a primary antibody.
  • detection is performed using ECL Plus Western Blotting Detction System (manufactured by Amersham Pharmaceutical Biotech) according to the protocol, and measurement can be performed using a multi-bioimager ST0RM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).
  • the method for detecting a tumor (diagnosis method) of the present invention is performed by detecting an anti-PBF antibody in a biological sample and measuring the amount thereof. .
  • it can be carried out using the tumor marker of the present invention relating to a protein or peptide and in the same manner as in the above (5-2).
  • the method for detecting a tumor (diagnosis method) of the present invention comprises detecting PBF-specific CTL in a biological sample and determining the amount thereof.
  • a tetramer (HLA tetramer) of a complex of a fluorescently labeled HLA antigen and the peptide of the present invention was prepared according to the method described in the literature (Science, 274: p94, 1996), and this was prepared. It can be performed by quantifying the antigen-peptide-specific CTL in peripheral blood lymphocytes of a patient suspected of having a tumor using a flow cytometer.
  • Tumors can be diagnosed, for example, by determining the gene expression levels of PBF genes in the subject's blood or test tissues where a tumor is suspected, the amount of PBF protein that is the product of expression of these genes, the amount of anti-PBF antibodies, or PBF-specific It can be performed by measuring the amount of CTL. At that time, in some cases, it can be performed by comparing the gene expression level or the protein level in a normal corresponding tissue and determining the difference between the two.
  • the comparison of the amount (level) of the gene, protein, antibody, or CTL between the test tissue of the subject and the normal counterpart tissue is performed in parallel with the measurement of the biological sample of the subject and the biological sample of a normal subject. Can be implemented. If not performed in parallel, the gene expression level of the PBF gene obtained by measuring multiple (at least two, preferably three or more, more preferably five or more) normal tissues under uniform measurement conditions Anti-PBF, anti-PBF amount The mean or statistical mean of the body mass or the amount of PBF-specific CTL can be used for comparison as a normal person value.
  • the determination of whether or not the subject has a tumor can be determined, for example, by determining the gene expression level of the PBF gene, the amount of PBF, the amount of the anti-PBF antibody, or the amount of the PBF-specific CTL in the tissue of the subject. It can be performed as an indicator that the number is twice or more, preferably three times or more as compared with the level of the above.
  • An osteosarcoma cell line was established from osteosarcoma tissue obtained by biopsy from an osteosarcoma patient and named OS2000.
  • Peripheral blood mononuclear cells were collected from blood collected from the same osteosarcoma patient by specific gravity centrifugation using Lymphoprep (Nycomed), and OS2000, which had been irradiated and inactivated, was added 6 times every 10 days. The cells were cultured with stimulation. Thereafter, CD8-positive cells were enriched using magnetic beads (Macs, Miltenyi) conjugated with anti-CD8 antibody, and a CTL line was established using the limiting dilution method (Int. J. Cancer, 39). , 390-396, 1987, N. Eng. J.
  • MRNA was prepared from OS2000 using First track (Invitrogen). Next to this mR A based, Superscript Choice System for cDNA Synthesis - a c DNA library to prepare c DNA, incorporated into an expression vector P CEP4 (Invitrogen Corp.) using (Gibco BRL Co.) Prepared.
  • the HLA-B * 5502 gene (GenBank Acc. No. M77777, J. Immunol., 148 (4), 1155-1162 (1992)) isolated from OS2000 cells by PCR was transformed into 293-EBNA cells (Invitrogen). 293-EBNA-B55, which had been introduced into the cell, was prepared.
  • the following operation was performed as the first screening. 293-EBNA-B55 cells were added to a 96-well microplate at 8 ⁇ 10 4 cells / well, and about 100 cDNA clones / plate (100-200 ⁇ g) were subjected to the Lipofection method (Lipofectamine 2000, Invitrogen). ) The gene was introduced from here. The pool of cDNA clones used for gene transfer was kept separately. After 24 hours, add 8 ⁇ 10 4 TcOS2000cl-303 cells, collect the culture supernatant after 24 hours, and quantify the LDH released by cytotoxicity using the LDH Cytotoxicity Detection Kit (Takara Bio). Was tested for reactivity.
  • a well 1B9 that gave the strongest CTL reactivity was selected from 1000 wells.
  • a pool of 80 cDNA clones (including 8 to 12 cDNA clones per pool) was prepared from the 400 cDNAs prepared from the cDNA clone pool used for the gene transfer of 1B9.
  • a cDNA clone pool was transfected into 293-EBNA-B55 cells, and the second screening was performed using the reactivity of TcOS2000cl-303 cells as an index. As a result, reactivity was observed at 20 ml.
  • a cDNA clone was transfected into 293-EBNA-B55 cells as described above from the 20-well cDNA clone pool as one clone per cDNA, and the third screening was performed using the reactivity of Tc0S2000cl-303 cells as an index. Was done. As a result, reactivity was observed at 4 mm. Analysis of the base sequence of the 4-well cDNA revealed that it contained the same cDNA. This cDNA clone was designated as 1B9.1H4.
  • HLA-A * 2402 gene (Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995), GenBank Accession No. 64740) was transferred to 293-EBNA cells (Invitrogen) in the same manner as in the case of the HLA-B * 5502 gene.
  • 293-EBNA-A24 which was introduced into the cell, was prepared. Screening was carried out in the same manner as in the screening using 293-EBNA-B55 cells. From the 2E4 selected in the first screening, 22 reactive cells were obtained in the second screening. In the third screening, 4 ⁇ L was selected. Analysis of the base sequence of the 4-well cDNA revealed that it contained the same cDNA as the cDNA clone 1B9.1 1H4 selected for HLA-B * 5502. 3) Analysis of cDNA clone 1 ⁇ 9 ⁇ 1H4
  • TcOS2000cl-303 Reactivity of TcOS2000cl-303 when 1H4 cDNA was introduced into 293-EBNA-B55 or 293-EBNA-A24 and expressed was measured by the LDH release assay described above (quantification of free LDH).
  • Figure 1 shows the results.
  • the Tc0S2000cl- 303 of a reactive 5 1 Cr release mediation Si J. Immunol, 159:. 4753 , 1997) the results of measurement by FIG 2 (A, B).
  • Nos. 1-303 recognized cells expressing the introduced cDNA clone 1B9.1H4 and showed specific damage activity. This demonstrated that cDNA clone 1B9.1H4 encodes a tumor antigen protein gene recognized by TcOS2000cl-303.
  • nucleotide sequence was determined using BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems). The determined base sequence is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. The total length of the cDNA was 1901 base pairs.
  • the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 3 was compared with a known sequence using a public database. Most had the same nucleotide sequence as binding factor: PBF, and also Papilloma virus regulatory factor: PRF-1 (Virology 293, 103-117 (2002)).
  • the nucleotide sequence of the PBF is shown in SEQ ID NO: 1, and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • cDNA was prepared from RA extracted from 0S2000 cells, and PCR was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 to amplify the cDNA of PBF.
  • the PBF gene expression vector prepared by incorporating the amplified fragment into the expression vector pCEP4 was introduced into 293-68-855 or 293- £ 8 ⁇ -824 and expressed as 1 (: 0520 OOcl
  • the reactivity of -303 was measured by LDH release assay and the results are shown in Fig. 3 and Fig. 4.
  • Tc0S2000cl-303 was expressed in cells transfected with the PBF gene expression vector. From this, it was revealed that PBF is a tumor antigen protein recognized by TC0S2000 cl-303.
  • FIG. 5 shows the results. TcOS2000cl-303 cells did not react with 293_EBNA_B55 cells without pulsed peptide, but did react with 293-EBNA-B55 cells pulsed with the peptide of SEQ ID NO: 46. Therefore, it was revealed that the peptide of SEQ ID NO: 46 contained an antigen peptide region that binds to HLA-B * 5502.
  • the expression of the gene encoding the tumor antigen protein PBF in various cells and tissues was analyzed by the RT-PCR method. Based on RNA extracted from each cell using Isogen ragent (Nippon Gene), cDNA was prepared using oligo dT primers, and PCR was performed using primers shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5. Then, the cDNA of PBF was amplified. Then, the amplified gene was separated by electrophoresis and analyzed. As a positive control, the expression of the GPDH gene was confirmed by RT-PCR as described above. Fig. 6 shows the results. The PBF gene was not expressed in 293-EBNA cells used for normal peripheral blood lymphocyte screening, but was confirmed in many sarcoma-derived cells including OS2000.
  • TcOS2000cl-303 The amino acid sequence of tumor antigen protein PBF (SEQ ID NO: 2), HLA-A2 4 binding model Peptides consisting of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 10, 26, 27, 28, 29, 30, and 32, which are peptides having a chief structure, were synthesized.
  • TcOS2000cl-303 reactivity was examined by LDH release assay in the same manner as described in Example 2.
  • Antigen peptides that bind to HLA-A * 2402 can be identified.
  • the present invention provides the use of the tumor antigen protein PBF and its gene as a CTL inducer.
  • the CTL inducer of the present invention can treat patients with sarcoma / renal cancer and the like.

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Abstract

配列番号：２に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を有効成分として含有してなるＣＴＬの誘導剤、または前記タンパク質由来の腫瘍抗原ペプチド等を提供する。

Description

明細書
腫瘍抗原タンパク質及びその利用 技術分野
本発明は、 腫瘍抗原タンパク質に関する。 さらに詳しくは、 本発明は、 腫瘍抗原 タンパク質 PBFおよぴその遺伝子の、 癌免疫分野における利用に関する。 背景技術
生体による腫瘍細胞やウィルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、 とりわけ細胞 傷害性 T細胞 （CTLと称する） が重要な働きをしている。 CTLは、 腫瘍細胞上 の抗原ペプチド （fl重瘍抗原ペプチド） と MHC (Major Histocompatibility Compl ex) クラス I抗原 （ヒ トの場合は HLA抗原と称する） との複合体を認識し、 腫瘍 細胞を攻撃 ·破壊する。
腫瘍抗原ペプチドは、 腫瘍に特有のタンパク質、 すなわち腫瘍抗原タンパク質が 細胞内で合成された後、 プロテアーゼにより細胞内で分解されることによって生成 される。 生成された腫瘍抗原ペプチドは、 小胞体内で MHCクラス I抗原 （HLA 抗原） と結合して複合体を形成し、 細胞表面に運ばれて抗原提示される。 この抗原 提示された複合体を腫瘍特異的な CTLが認識し、 細胞傷害作用ゃリンフォ力イン の産生を介して抗腫瘍効果を示す。 このような一連の作用の解明に伴い、 腫瘍抗原 タンパク質または腫瘍抗原ペプチドをいわゆる癌免疫療法剤 （癌ワクチン） として 利用することにより、 腫瘍患者の体内の腫瘍特異的 C T Lを増強させる治療法が可 能となった。
腫瘍抗原タンパク質は、 Immunity, vol.10:281, 1999 の tablelに記載のものが 代表例として挙げられる。 具体的にはメラノサイ ト組織特異的タンパク質である g p i 00 (J. Exp. Med. , 179:1005, 1994) 、 MART- 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. U SA, 91:3515, 1994) 、 およびチロシナーゼ （J. Exp. Med. , 178： 489, 1993) などの メラノソーム抗原、 メラノーマ以外の腫瘍抗原タンパク質としては HER 2/n e u (J. Exp. Med. , 181:2109， 1995) 、 CE A (J. Natl. Cancer. Inst., 87:982， 199 5) 、 および P SA (J. Natl. Cancer. Inst. , 89 :293, 1997) などの腫瘍抗原タンパ ク質が挙げられる。 しかしながら、 骨肉腫等の肉腫を含む癌 （腫瘍） に対して幅広 く適用可能な腫瘍抗原タンパク質は、 未だ見出されていない。
パピローマウィルスの E2結合部位を認識する因子として、 パピローマウィルス結 合因子 (Papillomavirus binding factor： PBF、 GenBank テータへース Accession No. AF263928)が同定されている （Virology 293, 103-117, 2002 ) 。 しかしながら
、 該 PBFと腫瘍との関係は何も知られていない。 発明の開示
本発明の目的は、 腫瘍抗原タンパク質 P B Fおよびその遺伝子の、 癌免疫分野に おける利用などを提供することにある。
本発明者らは、 骨肉腫患者由来の骨肉種細胞株 0S2000を樹立し、 また該 0S2000 に対して細胞傷害活性を有する CTL株 TcOS2000cl- 303を樹立した。
続いてアツセィ用細胞として、 293-EBNA細胞に HLA-B5502遺伝子 （HLA-B55の 1種 ) を導入した 293-EBNA-B55細胞、 および 293- EBNA細胞に HLA-A2402遺伝子 （HLA- A24 の 1種） を導入した 293-EBNA-A24細胞を作製した。 これら 293-EBNA-B55細胞または 2 93- EBNA-A24細胞に対して、 0S2000から調製した cDNAライブラリ一の cDNAクローン プールをトランスフエタ トし、 そのトランスフエクタントに Tc0S2000cl-303を作用 させ、 Tc0S2000cl- 303が反応したか否かを、 TcOS2000cl- 303が有する細胞傷害活性 により遊離した LDH量を測定することにより検討した。 膨大なスクリーニングを繰 り返した結果、 最終的に、 GenBank Accession No. AF263928として登録されている ノヽ0ピロ一マウィルス結合因子（Papillomavirus binding factor： PBF) (配列番号： 1及び 2) 1K CTL誘導活性を有する新規な腫瘍抗原タンパク質であることを見出し た。 当該 PBFが腫瘍抗原タンパク質としての機能を有することは従来全く知られて おらず、 また予想もされていなかつた新規な知見である。
さらに本発明者らは、 PBFが、 HLA抗原に結合する腫瘍抗原ペプチド領域を含んで いることを確認した。 また当該 PBFは、 肉腫および腎癌において幅広く高発現して いることも明らかにした。
本発明において見出された腫瘍抗原タンパク質 PBF又はその腫瘍抗原べプチド、 若しくはそれらの遺伝子は、 in vivoまたは in vitroにおいて CTLの誘導剤、 すなわ ち癌ワクチンとして用いることができ、 骨肉腫ゃ腎癌等の腫瘍に対して治療または 改善効果を発揮する。 また当該 PBFは肉腫ゃ腎癌等の腫瘍に対する腫瘍マーカーと して有用である。
本発明は、 以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明は下記に掲げるものである。
項 1 . 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質を有効成分として含有してなる C T Lの誘導剤、 項 2 . 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質が、 以下の（a)〜（ ：
(a) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列を含有するタンパク質、
(b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失 、 置換及び/又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質であって、 かつ当 該タンパク質を発現させた細胞が C T Lにより認識される特徴を有するタンパク質 (c) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列と 7 0 %以上の配列同一性を示すァミノ酸 配列を含有するタンパク質であって、 かつ当該タンパク質を発現させた細胞が C T Lにより認識される特徴を有するタンパク質、 および
(d) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に 対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドによりコ ードされるタンパク質であって、 かつ当該タンパク質を発現させた細胞が C Tしに より認、識される特徴を有するタンパク質、
のいずれかである、 項 1に記載の C T Lの誘導剤、
項 3 . 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質の部分べプチドであって、 かつ H L A抗原と結合して C T Lにより認識されるペプチド、
項 4 . 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質が、 以下の（a)〜（d) ：
(a) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列を含有するタンパク質、
(b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失 、 置換及び 又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質であって、 かつ当 該タンパク質を発現させた細胞が C T Lにより認識される特徴を有するタンパク質
(c) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列と 7 0 %以上の配列同一性を示すァミノ酸 配列を含有するタンパク質であって、 かつ当該タンパク質を発現させた細胞が C T Lにより認識される特徴を有するタンパク質、 および
(d) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖 に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにより コードされるタンパク質であって、 かつ当該タンパク質を発現させた細胞が C T L により認識される特徴を有するタンパク質、
のいずれかである、 項 3に記載のペプチド、
項 5 . H L A抗原が H L A— A 2 4または H L A—B 5 5である、 項 3または 4 に記載のぺプチド、
項 6 . 配列番号： 6〜配列番号： 5 5のいずれかに記載のァミノ酸配列を含有す る、 項 5に記載のペプチド、
項 7 . 配列番号： 6〜配列番号： 4 5のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2位 のアミノ酸をチロシン、 フエ二ルァラニン、 メチォニンまたはトリプトファンに置 換し、 及び Z又は C末端のアミノ酸をフエ-ルァラニン、 ロイシン、 イソロイシン 、 トリブトファンまたはメチォニンに置換したアミノ酸配列を含有する、 項 5に記 載のぺプチド、
項 8 . 項 3〜 7のいずれかに記載のペプチドを含有するェピトープペプチド、 項 9 . 項 3〜8のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有してなる C T Lの誘導剤、
項 1 0 . 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸を含有 してなる、 C T Lの誘導剤、
項 1 1 . 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、 以下の（a)〜（g) ： (a) 配列番号： 1に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、 (b) 配列番号： 1に記載の塩基配列の第 337位〜第 1878位を含有するポリヌクレオ チド、
(c) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を含有するポリヌク レオチド、
(d) 配列番号： 3に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
(e) 上記（a)〜（d)のいずれかのポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェン トな条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチドであって、 かつ当該ポリヌクレ ォチドによりコードされるタンパク質を発現させた細胞が C T Lに認識される特徴 を有するポリヌクレオチド、
(f) 上記 (a)〜（d)のいずれかのポリヌクレオチドと 7 0 %以上の配列同一性を示す 塩基配列を含有するポリヌクレオチドであって、 かつ当該ポリヌクレオチドにより コードされるタンパク質を発現させた細胞が C T Lに認識される特徴を有するポリ ヌクレオチド、
(g) 上記（a)〜（d)のいずれかのポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質に おいて 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換及び/又は付加されたアミノ酸配列 を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、 かつ当該ポリヌク レオチドによりコードされるタンパク質を発現させた細胞が C T Lに認識される特 徴を有するポリヌクレオチド、
のいずれかである、 項 1 0に記載の C T Lの誘導剤、
項 1 2 . ポリヌクレオチドが配列番号： 1、 配列番号： 1の第 3 3 7位〜第 1 8 7 8位、 または配列番号： 3に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドである 、 項 1 0または 1 1に記載の C T Lの誘導剤、
項 1 3 . 項 3〜 8のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを 含有する核酸、
項 1 4 . 項 1 3に記載の核酸を含有してなる C T Lの誘導剤、
項 1 5 . 以下の （a ) 〜 （d ) ：
( a ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するタンパク質、
( b ) 上記 （a ) 記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸 (c) 項 3〜8のいずれかに記載のペプチド、 および
(d) 上記 （c) 記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、 のいずれかと、 抗原提示能を有する細胞とをイン · ビトロで接触させることを特徴 とする、 抗原提示細胞の製造方法、
項 1 6. 項 1 5記載の製造方法により製造される抗原提示細胞、
項 1 7. 以下の （a) 〜 （d) ：
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するタンパク質、
(b) 上記 （a) 記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸
(c) 項 3〜 8のいずれかに記載のペプチド、 および
(d) 上記 （c) 記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、 のいずれかと、 末梢血リンパ球とをイン ' ビトロで接触させることを特徴とする、 CTLの誘導方法、
項 1 8. 項 1 7に記載の誘導方法により誘導される CTL、
項 1 9. 項 3〜 7のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体、 項 20. 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列において、 連続する少なくとも 1 5塩基を含有するポリヌクレオチド及びノまたは該ポリヌク レオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる重瘍マーカー、
項 2 1. 配列番号： 1または配列番号： 3に記載の塩基配列において、 連続する 少なくとも 1 5塩基を含有するポリヌクレオチド及び Zまたは該ポリヌクレオチド に相補的なポリヌクレオチドからなる、 項 20に記載の腫瘍マーカー、
項 22. 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質のアミノ酸配列において、 連続する少なくとも 8アミ ノ酸を含有するポリペプチドからなる腫瘍マーカー、
項 23. 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列において、 連続する少なくとも 8ァ ミノ酸を含有するポリペプチドからなる、 項 22に記載の腫瘍マーカー、 項 24. 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質に対する抗体、 若しくは項 1 9に記載の抗体からなる 腫瘍マーカー、
項 25. 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体か らなる、 項 24に記載の腫瘍マーカー、
項 26. 項 3〜 7のいずれかに記載のペプチドと HL A抗原とを含有する HL A テトラマー、
項 27. 項 26に記載の HLAテトラマーからなる腫瘍マーカー、
項 28. 腫瘍が肉腫または腎癌である、 項 20〜 25および項 27のいずれかに 記載の腫瘍マーカー、
項 29. 項 20~25、 項 27および項 28のいずれかに記載の腫瘍マーカーを 含有してなる腫瘍の診断薬、
項 30. 癌ワクチンとして使用される、 項 1、 2、 9、 10、 1 1、 1 2または 14に記載の CTLの誘導剤。 図面の簡単な説明
図 1は、 1B9.1H4の cDNAを、 293- EBNA- B55または 293-EBNA-A24に導入して発現さ せた時の CTL (TcOS2000cl-303) の反応性を、 LDHリリースアツセィにより測定した 結果を示したグラフである。 図中、 横軸は 490nmの吸光度を示す。
図 2は、 1B9.1H4の cDNAを、 293-EBNA-B55または 293- EBNA- A24に導入して発現さ せた時の Tc0S2000cl-303の反応性を51 Crリリースアツセィにより測定した結果を示 したグラフである。 （A)は 293- EBNA- A24細胞を用いた時の結果を、 また（B)は 293-EB NA-B55細胞を用いた時の結果を示す。 図中、 横軸は E/T比を、 また縦軸は細胞傷害 性活性を示す。
図 3は、 1B9.1H4または PBF遺伝子を、 293- EBNA-A24に導入して発現させた時の CT
L (TcOS2000cl-303) の反応性を、 LDHリリースアツセィにより測定した結果を示し たグラフである。 図中、 横軸は 490nmの吸光度を示す。
図 4は、 1B9.1H4または PBF遺伝子を、 293- EBNA- B55に導入して発現させた時の CT L (TcOS2000cl-303) の反応性を、 LDHリリースアツセィにより測定した結果を示し たグラフである。 図中、 横軸は 490nmの吸光度を示す。
図 5は、 配列番号： 46に記載のぺプチドをパルスした 293- EBNA- B55に対する CTL (TcOS2000cl-303) の反応性を、 LDHリリースアツセィにより測定した結果を示し たグラフである。 図中、 横軸は 490ntnの吸光度を示す。
図 6は、 腫瘍抗原タンパク質 PBFをコードする遺伝子の各種細胞での発現を、 RT - PCRにより解析した結果を示す写真である。 図中、 0S2000は骨肉種細胞株を、 PBLは 正常末梢血リンパ球を、 EB-Bは EBVトランスフォーム B細胞を、 K562は慢性骨髄性白 血病細胞株を、 293EBNAはアデノウイルスでトランスフォームしたヒ ト腎細胞株を 指す。 図中、 SaOS、 H0S、 KIKU、 Huo9および NYは骨肉腫細胞株を指す。 図中、 HS-SY II、 SW982および Fujiは滑膜肉腫細胞株を指す。 図中、 ΗΠ080は線維肉腫細胞株を 指す。 図中、 HS729T、 A204および RDは横紋筋肉腫細胞株を指す。 また図中、 A673、 W- ES、 NCR-EW2、 SCCH196、 SK- ESIおよび RD-ESlはユーイング肉腫細胞株を指す。 PB F遺伝子の発現結果を上段に、 また陽性コントロールである G3PDH遺伝子の発現結果 を下段に、 それぞれ示す。 発明を実施するための最良の形態
1)本発明のタンパク質
本発明の C T Lの誘導剤に含有されるタンパク質 （以下、 本発明のタンパク質と 称する場合がある） は、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する。 本発明のタンパク質は、 天然物 （例えば骨肉種細 胞株） に由来するタンパク質であってもよく、 また組換えタンパク質であっても良 レ、。
ここで配列番号： 2に記載のアミノ酸配列は、 GenBank データベースにおいて A ccession No. AF263928として登録されており、 また Virology 293, 103-117 (2002) に開示されたヒ トパピローマウィルス結合因子（Papillomavirus binding factor ： PBF)のァミノ配列である。
前記において 「配列番号 2に記載のァミノ酸配列と同一のァミノ酸配列を含有 するタンパク質 （配列番号 2に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質） 」 と は、 具体的には、 配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質、 または 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列を含有し、 その N末端側及び/又は C末端側に 他のアミノ酸配列の付加されたァミノ酸配列からなるタンパク質などが挙げられる また前記において 「配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質」 とは、 具体的には以下の（a)〜（ に挙げるタンパク 質が挙げられる ：
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失 、 置換及び /又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質であって、 かつ当 該タンパク質を発現させた細胞が C T Lにより認識される特徴を有するタンパク質
(b) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列と 7 0 %以上の配列同一性を示すァミノ酸 配列を含有するタンパク質であって、 かつ当該タンパク質を発現させた細胞が C T Lにより認識される特徴を有するタンパク質、
(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に 対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコ 一ドされるタンパク質であって、 かつ当該タンパク質を発現させた細胞が C T乙に より認識される特徴を有するタンパク質。
好ましくは、 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列 からなるタンパク質が挙げられる。 当該配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質としては、 以下の（a 〜（c')に挙げる タンパク質が挙げられる ：
( 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠 失、 置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、 かつ当 該タンパク質を発現させた細胞が C T Lにより認識される特徴を有するタンパク質
(b') 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列と 7 0 %以上の配列同一性を示すァミノ 酸配列からなるタンパク質であって、 かつ当該タンパク質を発現させた細胞が C T Lにより認識される特徴を有するタンパク質、
(c，) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖 に対してストリンジェントな条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチドにより コードされるタンパク質であって、 かつ当該タンパク質を発現させた細胞が C T L により認識される特徴を有するタンパク質。
前記 (a)における 「配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数 のアミノ酸が欠失、 置換及びノ又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質 」 とは、 人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、 生体内に存在するアレル変 異体等のタンパク質を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、 本発明タンパク質の 活性が保持される限り制限はない。 このように活性を喪失することなくアミノ酸残 基が、 どのように、 何個欠失、 置換及び 又は付加されればよいかを決定する指標 は、 当業者に周知のコンピュータプログラム、 例えば DNA Star softwareを用いて 見出すことができる。 例えば変異数は、 典型的には、 全アミノ酸の 10%以内であり 、 好ましくは全アミノ酸の 5%以内である。 また置換されるアミノ酸は、 タンパク 質の構造保持の観点から、 残基の極性、 電荷、 可溶性、 疎水性、 親水性並びに両親 媒性など、 置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。 例えば、 Ala, Val、 Leu、 I le、 Pro, Met、 Phe及び Trpは互いに非極性アミノ酸に分 類されるアミノ酸であり、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn及び Ginは互いに非荷電 性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Asp及び Gluは互いに酸性アミノ酸に分類 されるアミノ酸であり、 また Lys、 Arg及び Hisは互いに塩基性アミノ酸に分類され るアミノ酸である。 ゆえに、 これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択 することができる。
前記 (b)における 「配列番号： 2に記載のァミノ酸配列と 70%以上の配列同一性 を示すァミノ酸配列を含有するタンパク質」 とは、 例えば配列番号： 2に記載のァ ミノ酸配列と約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 さらに好ましくは約 90%以 上、 最も好ましくは約 95%以上の配列同一性を示すァミノ酸配列を含有するタンパ ク質が挙げられる。 具体的には、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列の部分配列か らなるタンパク質などが挙げられる。
ここで 「配列同一性」 とは、 2つのタンパク質間の、 配列の同一性及び相同性を いう。 当該 「配列同一性」 は、 比較対象の配列の領域にわたって、 最適な状態にァ ラインメントされた 2つの配列を比較することにより決定される。 ここで、 比較対 象のタンパク質は、 2つの配列の最適なアラインメントにおいて、 付加又は欠失 （ 例えばギャップ等） を有していてもよい。 このような配列同一性に関しては、 例え ば、 Vector NTIを用いて、 ClustalWアルゴリズム（Nucleic Acid Res.， 22 (22) : 467 3 - 4680 (1994) )を利用してァラインメントを作成することにより算出することがで きる。 尚、 配列同一性は、 配列解析ソフト、 具体的には Vector NTI、 GENETYX-MAC や公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。 前記公共デー タべースは、 例えば、 ホームページアドレス http : //www. ddbj. nig. ac. jpにおいて 、 一般的に利用可能である。
前記 (c)における 「配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレ ォチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイプリダイズするポリヌク レオチド」 とは、 例えば配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌク レオチドと約 40%以上、 好ましくは約 60%以上、 より好ましくは約 70%以上、 より 好ましくは約 80%以上、 さらに好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上 の配列同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。 具体的 には、 配列番号： 1、 配列番号： 1の第 337位〜第 1878位、 または配列番号： 3に記載 の塩基配列と、 約 40%以上、 好ましくは約 60%以上、 より好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 さらに好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95% 以上の配列同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。 よ り具体的には、 配列番号： 1、 配列番号： 1の第 337位〜第 1878位、 または配列番号 ： 3に記載の塩基配列の部分配列からなる核酸などが挙げられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の 基本書に記載の方法に従って行うことができる。 また市販のライブラリーを使用す る場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ここで 「ストリンジェントな条件」 とは、 Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular し loning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Pre ss, San Diego CA)ゃ 己 Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Labor atory Press (1989)に教示されるように、 複合体或いはプローブを結合する核酸の 融解温度（Tm)に基づいて決定することができる。
ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、 例えば、 6 X SSC (20 X SS(^i、 333mM Sod ium citrate, 333mM NaClを示す）、 0. 5%SDSおよび 50% ホルムアミ ドを含む溶液中で 4 2°Cにてハイブリダイズさせる条件、または 6 X SSCを含む（50%ホルムァミ ドは含まな い）溶液中で 65°Cにてハイブリダィズさせる条件などが挙げられる。
またハイプリダイゼーシヨン後の洗浄の条件としては、 「 1 X SSC、 0. 1%SDS、 37 °C」 程度の条件を挙げることができる。 相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とす る正鎖とハイプリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。 特に制限され ないが、 より厳しいハイブリダィズ条件として 「0. 5 X SSC、 0. 1%SDS、 42°C」 程度 、 さらに厳しいハイブリダィズ条件として 「0. 1 X SSC、 0. 1%SDSN 65°C」 程度の洗 浄条件を挙げることができる。
本発明のタンパク質は、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質 と実質的に同質の活性を有する。 ここで実質的に同質の活性とは、 本発明のタンパ ク質を発現させた細胞が CTLにより認識される、 すなわち当該細胞が CTLに反応性を 示す、 換言すれば本発明のタンパク質若しくは該タンパク質に由来する抗原べプチ ドが CTLを活性化する若しくは CTLを誘導するという性質を示す。
前記において細胞とは、 HLA抗原を発現する細胞であることが好ましい。 従って 前記実質的に同質の活性とは、 より具体的には、 例えば HLA- A24や HLA-B55等の HLA 抗原を発現する細胞において本発明のタンパク質を発現させることにより、 本発明 タンパク質由来の抗原ペプチドと HLA抗原との複合体が細胞表面に提示され、 その 結果、 当該細胞が CTLに認識される、 すなわち CTLが活性化される （CTLが誘導され る） という性質を指す。
このような本発明タンパク質の性質は、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方 法 （例えば5 1 Crリリースアツセィ （J. I匪 unol. , 159 : 4753, 1997) 、 LDHリリースァ ッセィ （LDH Cytotoxicity Detection Kit (タカラバイオ） 、 サイト力イン量の測 定等） により容易に測定することができる。 以下に具体的なアツセィ法を例示する まず、 293-EBNA細胞 （Invitrogen社） 等の宿主細胞に対し、 本発明タンパク質を コードする DNAを含有する発現ベクターと、 HLA抗原をコードする DNAを含有する発 現ベクターとをトランスフエク トする。 ここで用いる HLA抗原をコードする DNAとし ては、 例えば HLA-A24抗原をコードする DNA若しくは HLA-B55抗原をコードする DNAが 挙げられる。 HLA-A24抗原をコードする DNAとしては HLA- A2402の cDNA (Cancer Res. , 55 : 4248-4252 (1995)、 Genbank Accession No. M64740) が挙げられる。 また HL A- B55抗原をコードする DNAとしては HLA- B5502の cDNA (GenBank Acc. No. M77777, J. Immunol. , 148 (4) , 1155-1162 (1992) ) が挙げられる。
前記トランスフエク トは、 例えばリボフェク トァミン試薬 （GIBCO BRL社製） を 用いたリポフエクチン法などにより行うことができる。 その後、 用いた HLA抗原に 拘束性の CTLを加えて作用させ、 該 CTLが反応 （活性化） して産生する種々のサイ ト 力イン、 例えば IFN- γの量を、 例えば E L I S Α法などで測定することにより調べ ることができる。 ここで CTLとしては、 ヒ トの末梢血リンパ球を配列番号： 2に記載 の本発明タンパク質で刺激することにより調製された CTLや、 Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333， 1038-1044, 1995等に記載の方法により樹 立した CTLを用いることができる。
また本発明のタンパク質は、 例えばヒ トモデル動物を用いたアツセィ （W0 02/47
474 号公報、 Int J. Cancer: 100, 565-570 (2002) ) に供することにより、 in vivo での CTL誘導活性を調べることができる。
本発明のタンパク質は、 天然物 （例えば骨肉種細胞株、 腎癌細胞株など） から自 体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、 また後述する本 発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸を含有する形質転 換体を培養することによっても製造することができる。
2)本発明のぺプチド
本発明の CTLの誘導剤に含有されるペプチド （以下、 本発明のペプチドと称する 場合がある） とは、 前記本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、 かつ HLA抗 原と結合して CTLにより認識される腫瘍抗原ペプチドである。 すなわち、 前記した 本発明のタンパク質のアミノ酸配列の一部よりなるペプチドであって、 かつ、 該ぺ プチドと H L A抗原との結合複合体が CTLにより認識されるようなぺプチドであれ ば、 本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の如何なる位置に存する如何なる長さの ペプチドであっても良い。 このような本発明のぺプチドは、 本発明のタンパク質の一部よりなる候補べプチ ドを合成し、 該候補べプチドと H L A抗原との複合体が CTLにより認識されるか否 力 すなわち候補べプチドが腫瘍抗原べプチドとしての活性を有するか否かをァッ セィすることにより、 同定することができる。
ここで、 ペプチドの合成については、 通常のペプチド化学において用いられる方 法に準じて行うことができる。 該公知方法としては文献 （ぺプタイド ·シンセシス (Peptide Synthesis) , Interscience, New York, 1966；ザ -プロテインズ (The Proteins) , Vol 2, Academic Press Inc. , New York, 1976；ぺプチド合成， 丸 善 （株） ， 1975 ;ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 （株） ， 1985 ;医薬品の開発 続 第 1 4卷 'ペプチド合成， 広川書店， 1991) などに記載されている方法が挙げ られる。
次に、 本発明の腫瘍抗原ペプチドの同定方法につき、 以下に記述する。
HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, - A0207, -Al l, - A24, -A31, - A6801 , -B7, - B8, -B2705, - B37, -Cw0401, _Cw0602などの H L Aの型については、 該 H L Aに結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性 （モチーフ） が判明してい る （例えば I隱 unogenetics， 41 : pl78， 1995などを参照のこと） 。 例えば HLA-A24のモ チーフとしては、 8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第 2位のアミノ酸がチ 口シン、 フエ二ルァラニン、 メチォニンまたはトリプトファンであり、 C末端のァ ミノ酸がフエ二ルァラニン、 ロイシン、 イソロイシン、 トリプトファンまたはメチ ォニンとなることが知られている （J. Immunol.， 152， p3913, 1994、 Immunogenetics, 41 : pl78, 1995、 J. Immunol. , 155 : p4307, 1994) 。 また HLA-A2のモチーフについては 、 以下の表 1に示したモチーフが知られている （Immunogenetics, 41, pl78, 1995、 J. Immunol. ， 155 : p4749, 1995) 。 5
HLA-A2のタイプ N末端から 2番目のアミノ¾ 端のアミノ酸
HLA-A0201 L , Μ V , L
HLA-A0204 L L
HLA-A0205 V， L , I , Μ L
HLA-A0206 V , Q V, L
HLA-A0207 L し
(ぺプチドの長さは 8〜11アミノ酸） さらに近年、 H L Α抗原に結合可能と予想されるペプチド配列を、 インタ一ネッ ト上、 NIHの BIMASのソフトを使用することにより検索することができる （http：〃 b imas. dcrt. nih. gov/molbio/hla_bind/ ) 。
ぺプチドの長さとしては、 各種 HLA分子に結合している抗原べプチドの解析によ り （Immunogenetics, 41 : 178， 1995) 、 通常 8から 1 4アミノ酸程度であることが明 らかにされている （ただし HLA - DR、 - DP、 - DQについては、 14アミノ酸以上の長 さの抗原ペプチドも認められる） 。
これらのモチーフに関わるぺプチド部分を本発明のタンパク質のアミノ酸配列中 から選び出すのは容易である。 例えば、 前記 BIMASソフトでの検索により、 H L A 抗原に結合可能と予想される配列を容易に選び出すことができる。 選び出された候 補べプチドを前述の方法にて合成し、 該候補べプチドが H L A抗原と結合して C T Lにより認識されるか否か、 すなわち候補べプチドが腫瘍抗原べプチドとしての活 性を有するか否かを測定することにより、 本発明のぺプチドを同定することができ る。
本発明の腫瘍抗原べプチドの具体的な同定法としては、 例えば J. Immunol.， 154, P2257, 1995に記載の方法が挙げられる。 すなわち、 候補ペプチドを提示すると考え られるタイプの H L A抗原が陽性のヒ トから末梢血リンパ球を単離し、 in vitroで 該候補べプチドを添加して刺激した場合に、 該候補べプチドをパルスした HLA抗原 陽性細胞を特異的に認識する CTLが誘導された場合は、 該候補べプチドが腫瘍抗原 ペプチドに成り得ることが示される。 ここで CTLの誘導の有無は、 例えば、 抗原べ プチド提示細胞に反応して CTLが産生する種々のサイ ト力イン （例えば IFN- γ ) の 量を、 例えば ELISA法などによって測定することにより、 調べることができる。 ま た5 1 Crで標識した抗原ぺプチド提示細胞に対する CTLの傷害性を測定する方法 （5 1 C rリリースアツセィ、 Int. J. Cancer, 58 : p317， 1994) によっても調べることができる さらに、 候補ペプチドを提示すると考えられるタイプの H L A抗原をコードする c D NAを発現する発現プラスミ ドを、 例えば 293- EBNA細胞 （Invitrogen社） に 導入した細胞に対して候補ペプチドをパルスし、 この細胞に対して、 前記候補ぺプ チドを提示すると考えられるタイプの H L A抗原に拘束性の CTLを反応させ、 該 CTL が産生する種々のサイト力イン （例えば IFN- の量を測定することによつても、 調べることができる （J. Exp. Med. , 187 : 277, 1998) 。
ここで HLA抗原としては、 HLA-A24抗原若しくは HLA-B55抗原が挙げられる。 HLA-A 24拘束性の腫瘍抗原べプチドを選択する場合には、 前記 HLA抗原をコードする c D N Aとしては HLA-A2402の cD N A (Cancer Res. , 55： 4248-4252 (1995)、 Genbank Accession No. M64740) を用いることができる。 また HLA- B55拘束性の腫瘍抗原ぺ プチドを選択する場合は、 前記 HLA抗原をコードする cDNAとしては HLA- B5502遺伝子 (GenBank Acc. No. M77777, J. Immunol. , 148 (4) , 1155-1162 (1992) ) を用いること ができる。
また前記 CTLとしては、 ヒ トの末梢血リンパ球のペプチド刺激により調製される 場合の他、 Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987， N. Eng. J. Med, 333, 1038-104 4， 1995等に記載の方法により樹立した CTLを用いることができる。
また本発明のペプチドは、 例えばヒ トモデル動物を用いたアツセィ （W0 02/4747 4 号公報、 Int J. Cancer : 100， 565-570 (2002) ) に供することにより、 in vivoで の活性を調べることができる。
前記のように腫瘍抗原ペプチドの配列の規則性 （モチーフ） が判明している場合 と異なり、 例えば HLA-B55のようにそのペプチドのモチーフが明らかでない場合は 、 該 HLA-B55と腫瘍抗原べプチドとの複合体を認識する CTL株が存在する場合には、 例えば W097/46676や後述の実施例 3に記載の方法に準じて本発明の腫瘍抗原べプチ ドを同定することができる。
以上のような本発明のぺプチドの具体例としては、 配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列からなる本発明タンパク質の部分ぺプチドであって、 かつ HLA抗原と結合し て CTLにより認識されるペプチドが挙げられる。 また、 本発明のペプチドが結合す る HLA抗原の観点からは、 HLA-A24抗原または HLA- B55抗原に結合する本発明のぺプ チドを挙げることができる。
より具体的には、 例えば HLA- A24結合性の腫瘍抗原ペプチドとしては、 BIMASソフ トを用いた検索により同定される、 以下の表 2 (9アミノ酸） および表 3 (10アミ ノ酸） に記載のいずれかのアミノ酸配列からなるぺプチド （配列番号： 6〜45のい ずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド） であって、 HLA- A24抗原に結合し て CTLに認識されるべプチドが挙げられる。
表 2 位置 アミノ酸配列 配列番号
145-153 Ala Tyr Arg Pro Val Ser Arg Asn lie 配列番号 6
320-328 Asp Phe Tyr Tyr Thr Glu Val Gin Leu 配列番号 7
254-262 Gly Phe Glu Thr Asp Pro Asp Pro Phe 配列番号 8
240-248 Lys Tyr Leu Gly Asp Ala Phe Gly Ser 配列番号 9
12-20 Arg Ser Leu Leu Gly Ala Arg Val Leu 配列番号 10
30-38 Ala Ala Pro Pro Ser Glu Pro Leu Leu 配列番号 11
424-432 lie Tyr Thr Ser Val Ser Trp Ala Ala 配列番号 12
105-113 Thr Va丄 ήτρ Leu Leu Glu Gin Lys Leu 配列番号 13
234-242 His Pro Gin Ala Ser Pro Lys Tyr Leu 配列番号 14
440-448 Leu Ser Pro Val Arg Ser Arg Ser Leu 配列番号 15
279-287 Met Tyr Lys Cys Leu Trp Pro Asn Cys 配列番号 16
283-291 Leu Trp Pro Asn Cys Gly Lys Val Leu 配列番号 17
54-62 Cys Gin Glu Gin Pro Lys Glu Val Leu 配列番号 18
432-440 Ala Ala Pro Ser Ala Ala Cys Ser Leu 配列番号 19
101-109 Glu Gly Gin Val Thr Val Trp Leu Leu 配列番号 20
169-177 Met Ala Ala Met Val Leu Thr Ser Leu 配列番号 21
12 & -137 Gly Pro Cys Pro Gin Ala Pro Pro Leu 配列番号 22
354-362 Ala Pro Thr Pro Ser Met Thr Gly Leu 配列番号 23
503-511 Arg Trp Lys Lys Ala Cys Gin Arg Phe 配列番号 24
29-37 Ser Ala Ala Pro Pro Ser Glu Pro Leu 配列番号 25 8
表 3 位置 アミノ酸配列 配列番号
84-93 Trp Tyr Gly Gly Gin Glu Cys Thr Gly Leu 配列番号 26
409- -418 Ala Tyr Gin Ala Leu Pro Ser Phe Gin l ie 配列番号 27
254- -263 Gly Phe Glu Thr Asp Pro Asp Pro Phe Leu 酉己列番号 28
118- -127 Arg Val Glu Glu Val Trp Leu Ala Glu Leu 配列番号 29
415- -424 Ser Phe Gin l ie Pro Val Ser Pro His lie 配列番号 30
81-90 Val Tyr Val Trp Tyr Gly Gly Gin Glu Cys 配列番号 31
104- -113 Val Thr Val rrp Leu Leu Glu Gin Lys Leu 配列番号 32
99- 108 Trp Met Glu Gly Gin Val Thr Val Trp Leu 配列番号 33
503- -512 Arg Trp Lys Lys Ala Cys Gin Arg Phe Leu 配列番号 34
362- -371 Leu Pro Leu Ser Ala Leu Pro Pro Pro Leu 配列番号 35
295- -304 Val Gly l ie Lys Arg His Val Lys Ala Leu 配列番号 36
274- - 283 Asn Ser Val Lys Val Met Tyr Lys Cys Leu 配列番号 37
128- -137 Gin Gly Pro Cys Pro Gin Ala Pro Proし eu 配列番号 38
404- -413 l ie Gin Ala Asp His Ala Tyr Gin Ala Leu 配列番号 39
168- -177 Met Met Ala Ala Met Val Leu Thr Ser Leu 配列番号 40
424- -433 lie Tyr Thr Ser Val Ser Trp Ala Ala Ala 配列番号 41
489- -498 Val Tyr Gly l ie Glu His Arg Asp Gin Trp 配列番号 42
439- -448 Ser Leu Ser Pro Val Arg Ser Arg Ser Leu 配列番号 43
431- -440 Ala Ala Ala Pro Ser Ala Ala Cys Ser Leu 配列番号 44
455- -464 Gin Pro Ala Pro Ala Met Lys Ser His Leu 配列番号 - 45
また、 HLA- B55結合性の腫瘍抗原ペプチドとしては、 Cys Thr Ala Cys Arg Trp L ys Lys Ala Cys Gin Arg (配列番号: 46) のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げ られる。 さらに、 前記ペプチドの 9、 10若しくは 11アミノ酸部分からなるペプチド 、 すなわち、
Cys Thr Ala Cys Arg Trp Lys Lys Ala (配列番号： 47) 、 Thr Ala Cys Arg Trp Lys Lys Ala Cys (配列番号： 48) 、
Ala Cys Arg Trp Lys Lys Ala Cys Gin (配列番号： 49) 、
Cys Arg Trp Lys Lys Ala Cys Gin Arg (配列番号： 50) 、
Cys Thr Ala Cys Arg Trp Lys Lys Ala Cys (配列番号： 51) 、
Thr Ala Cys Arg Trp Lys Lys Ala Cys Gin (配列番号： 52) 、
Ala Cys Arg Trp Lys Lys Ala Cys Gin Arg (配列番号： 53) 、
Cys Thr Ala Cys Arg Trp Lys Lys Ala Cys Gin (配列番号： 54) 、 および Thr Ala Cys Arg Trp Lys Lys Ala Cys Gin Arg (配列番号： 55) 、
のいずれかに記載のアミノ酸からなるぺプチドであって、 HLA-B55抗原に結合して C TLに認識されるペプチドが挙げられる。
本発明においては、 前記の如き配列番号： 2に記載のアミノ酸配列の一部からな るペプチドのみならず、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する本発明タンパク質の一部からなるぺプチドも、 HLA抗原と結合 して CTLにより認識されるという性質を有する限り、 本発明のぺプチドの範疇に含 まれる。 すなわち、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列の一部を改変 （欠失、 置換 及び/又は付加） したタンパク質の一部からなる改変ペプチド （以下、 当該改変に 係るペプチドを 「改変ペプチド」 と称する場合がある） であっても、 HLA抗原と結 合して CTUこより認識されるという性質を有する限り、 本発明のペプチドの範疇に 含まれる。 具体的には、 本発明タンパク質のアミノ酸配列、 より具体的には配列番 号： 2に記載のァミノ酸配列の一部からなる本発明のぺプチドのアミノ酸配列に対 して、 1又はそれ以上のアミノ酸残基の改変を施した改変ペプチドであって、 かつ H L A抗原と結合して C T Lにより認識されるという腫瘍抗原べプチドとしての活 性を有するものは、 本発明のぺプチドの範疇に含まれる。
ここで、 アミノ酸残基の 「改変」 とは、 アミノ酸残基の置換、 欠失、 及び 又は 付加 （ペプチドの N末端、 C末端へのアミノ酸の付加も含む） を意味し、 好ましく はアミノ酸残基の置換が挙げられる。 アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、 置換 されるァミノ酸残基の数および位置は、 腫瘍抗原べプチドとしての活性が維持され る限り、 任意であるが、 前記したように通常、 腫瘍抗原ペプチドの長さが 8〜1 4 ァミノ酸程度であることから、 1個から数個の範囲が好ましい。 本発明の改変ペプチドの長さとしては、 8〜1 4アミノ酸程度が好ましい （ただ し HLA- DR、 - DP、 - DQについては、 14アミノ酸以上の長さの場合もある。 ）
先に記載したように、 HLA- Al， -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -Al l , -Α24, - A31, -A6801, - Β7， -Β8, -Β2705, - Β37, -Cw0401, - Cw0602などの Η L A の型については、 該 H L Aに結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性 （モ チーフ） が判明している。 また前記したように、 HLA抗原に結合可能と予想される ペプチド配列をインターネット上検索することができる （http：〃 bimas. dcrt. nih. gov/molbio/hla_bind/ ) 。 従って、 該モチーフ等に基づき、 前記改変ペプチドを 作製することが可能である。
例えば HLA-A24に結合して提示される抗原ペプチドのモチーフとしては、 前記し たように、 8〜11アミノ酸よりなるぺプチドのうちの第 2位のアミノ酸がチロシン 、 フエ二ルァラニン、 メチォニンまたはトリプトファンであり、 C末端のアミノ酸 がフエ二ルァラニン、 ロイシン、 イソロイシン、 トリプトファンまたはメチォニン であること力知られてレヽる (J. Immunol. , 152 :p3913， 1994、 Immunogenetics, 41 :pl 78, 1995、 J. Immunol.， 155 : p4307， 1994) 。 また HLA-A2の場合は、 前記の表 1に記載 のモチーフが知られている。 またインターネット上で HLA抗原に結合可能と予想さ れるぺプチド配列が示されており （http：〃 bimas. dcrt. nih. gov/molbio/hla_bind/ ) 、 例えば前記モチーフ上とり得るアミノ酸に類似の性質を持つアミノ酸が許容さ れる。 従って、 これらモチーフ上アミノ酸の置換が可能な位置 （HLA- A24、 HLA-A2 においてはペプチドの第 2位と C末端） にあるアミノ酸を他のアミノ酸 （好ましく は前記インタ一ネット上で結合可能と予想されているアミノ酸） に置換したァミノ 酸配列を含むものであって、 かつ H L A抗原と結合して C T Lにより認識されると いう活性を持つ改変べプチドを挙げることができる。
より好ましくは、 該位置において、 前記モチーフ上知られたアミノ酸残基のいず れかに置換したアミノ酸配列を含有するペプチドであって、 かつ前記活性を有する 改変ぺプチドが挙げられる。 すなわち配列番号： 6〜45に示されるような HLA-A24結 合性のペプチドの場合、 その第 2位のアミノ酸をチロシン、 フエ-ルァラニン、 メ チォニンまたはトリプトファンに置換し、 及び/又は C末端のァミノ酸をフエニル ァラニン、 ロイシン、 イソロイシン、 トリプトファンまたはメチォニンに置換した 改変ペプチドであって、 かつ前記活性を有する改変ペプチドが挙げられる。 このう ち第 2位のァミノ酸をチロシンに置換したぺプチドがより好ましい。
本発明のペプチドには、 さらに、 前記本発明のペプチドを含有するェピトープぺ プチドも含まれる。
近年、 複数の CTLェピトープ （抗原ペプチド） を連結したペプチド （ェピトープ ペプチド） 1 効率的に CTL誘導活性を有することが示されている。 例えば Journal of Immunology 1998, 161 : 3186-3194には、 癌抗原タンパク質 PSA由来の HLA-A2, - A3, -All, B53拘束性 CTLェピトープを連結した約 30merのペプチドが、 イン ' ビ ボでそれぞれの CTLェピトープに特異的な CTLを誘導したことが記載されている。 また CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結させたペプチド （ェピトープ ペプチド） により、 効率的に CTLが誘導されることも示されている。 ここでへルパ ーェピトープとは C D 4陽性 T細胞を活性化させる作用を有するぺプチドを指すも のであり （Immunity. , 1 : 751， 1994) 、 例えば B型肝炎ウィルス由来の H B V c 1 2 8 _ 1 4 0や破傷風毒素由来の T T 9 4 7—9 6 7などが知られている。 当該へ ルパーェピトープにより活性化された C D 4陽性 T細胞は、 C T Lの分化の誘導や 維持、 およびマクロファージなどのェフエクタ一活性化などの作用を発揮するため 、 抗腫瘍免疫応答に重要であると考えられている。 このようなヘルパーェピトープ と CTLェピトープとを連列したペプチドの具体例として、 例えば Journal of Immuno logy 1999， 162： 3915- 3925には、 HBV由来 HLA- A2拘束性抗原ペプチド 6種類、 HLA- Al l拘束性抗原ペプチド 3種類、 およびヘルパーェピトープより構成されるぺプチ ドをコードする DNA (ミニジーン） 力 イン ' ビボでそれぞれのェピトープに対す る CTLを効果的に誘導したことが記載されている。 また実際に、 CTLェピトープ （メ ラノ一マ抗原 gplOOの第 280位〜 288位からなる癌抗原べプチド） とヘルパーェピト ープ （破傷風毒素由来 Tヘルパーェピトープ） とを連結したぺプチドが臨床試験に 供されている （Clinical Cancer Res. , 2001, 7 : 3012-3024) 。
従って、 前記本発明のペプチドを含む複数のェピトープを連結したペプチド （ェ ピトープペプチド） であって、 CTL誘導活性を有するペプチドも、 本発明のぺプチ ドの具体例として例示することができる。
ここに、 ェピトープペプチドとは、 ①複数の CTLェピトープ （腫瘍抗原ペプチド ) を連結したペプチド、 若しくは② CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結 したペプチドであって、 抗原提示細胞内にてプロセッシングを受け、 生じた腫瘍抗 原べプチドが抗原提示細胞に提示され、 CTL誘導活性を導くぺプチドとして定義さ れる。
ここで、 本発明のペプチドに連結させるェピトープが CTLェピトープの場合、 用 いる CTLェピトープとしては、 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列由来の HLA- Al, -A 0201, -A0204, -A0205, - A0206, - A0207, -Al l, -A24, -A31, - A6801, - B7， 一 B8, -B2705, -B37, -B55, - Cw0401， -Cw0602などに拘束性の CTLェピトープが挙げられ る。 また、 他の腫瘍抗原タンパク質由来の CTLェピトープも挙げられる。 これら CTL ェピトープは複数個連結することが可能であり、 1つの CTLェピトープの長さとし ては、 各種 HLA分子に結合している抗原ペプチドの解析により （Immunogenetics, 4 1 : 178， 1995) 、 8~14アミノ酸程度を挙げることができる。
また本発明のぺプチドに連結させるェピトープがヘルパーェピトープの場合、 用 いるヘルパーェピトープとしては、 前述のような B型肝炎ウィルス由来の H B V c 1 2 8 _ 1 4 0や破傷風毒素由来の T T 9 4 7— 9 6 7などが挙げられる。 また当 該ヘルパーェピトープの長さとしては、 13〜30アミノ酸程度、 好ましくは 13〜17ァ ミノ酸程度を挙げることができる。
このような複数のェピト一プを連結させたペプチド （ェピトープペプチド） は、 前述のように一般的なぺプチド合成法によつて製造することができる。 またこれら 複数のェピトープを連結させたェピトープぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド の配列情報に基づいて、 通常の DNA合成および遺伝子工学的手法を用いて製造する こともできる。 すなわち、 当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに揷入し、 得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培 養し、 培養物より目的の複数のェピトープを連結させたェピトープペプチドを回収 することにより製造することができる。 これらの手法は、 前述のように文献 (Molec ular Cloning, T. Maniatis et al. , CSH Laboratory (1983) , DNA Cloning, DM. Glov er, IRL PRESS (1985) )に記載の方法などに準じて行うことができる。
以上のようにして製造された複数のェピトープを連結させたェピトープぺプチド を、 前述の in vitroアツセィや、 W0 02/47474 号公報および Int J. Cancer: 100, 5 65-570 (2002)に記述のヒ トモデル動物を用いた in vivoアツセィに供すること等に より CTL誘導活性を測定することができる。
さらに、 前記本発明のペプチドの N末端アミノ酸のアミノ基、 または C末端アミ ノ酸のカルボキシル基を修飾することも可能であり、 このような修飾に係るぺプチ ドも本発明のペプチドの範疇に含まれる。
ここで N末端アミノ酸のァミノ基の修飾基としては、 例えば 1〜 3個の炭素数 1 から 6のアルキル基、 フエニル基、 シクロアルキル基、 ァシル基が挙げられ、 ァシ ル基の具体例としては炭素数 1から 6のアルカノィル基、 フユニル基で置換された 炭素数 1カゝら 6のアル力ノィル基、 炭素数 5から 7のシクロアルキル基で置換され たカルボニル基、 炭素数 1から 6のアルキルスルホニル基、 フエニルスルホニル基 、 炭素数 2から 6のアルコキシカルボニル基、 フエニル基で置換されたアルコキシ カルボニル基、 炭素数 5から 7のシクロアルコキシで置換されたカルボニル基、 フ エノキシカルボニル基等が挙げられる。
C末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したぺプチドとしては、 例えばエステル 体およびァミ ド体が挙げられ、 エステル体の具体例としては、 炭素数 1から 6のァ ルキルエステル、 フエニル基で置換された炭素数 0から 6のアルキルエステル、 炭 素数 5から 7のシクロアルキルエステル等が挙げられ、 アミ ド体の具体例としては 、 アミ ド、 炭素数 1から 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換されたアミ ド、 フ ェニル基で置換された炭素数 0から 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換された アミ ド、 アミ ド基の窒素原子を含んで 5から 7員環のァザシクロアルカンを形成す るアミ ド等が挙げられる。
3)本発明のポリヌクレオチド及びそれを含有する核酸
本発明の C T Lの誘導剤に含有される核酸 （以下、 本発明の核酸と称する場合が ある） は、 前記本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド （以下、 本発明 のポリヌクレオチドと称する場合がある） を含有する。
本発明のポリヌクレオチドは、 種々の細胞や組織、 例えば骨肉種ゃ腎癌等に由来 する細胞や組織の cDNAや mRNA、 cRNA、 ゲノム DNA、 または合成 DNAのいずれであつ ても良い。 また 1本鎖、 2本鎖のいずれの形態であっても良い。 具体的には、 (a) 配列番号： 1に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、 (b) 配列番号： 1に記載の塩基配列の第 337位〜第 1878位を含有するポリヌクレオ チド、
(c) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌク レオチド、
(d) 配列番号： 3に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
またはこれら （a) 〜（d)のポリヌクレオチドと実質的に同一の塩基配列を含有する ポリヌクレオチドが挙げられる。
ここで配列番号： 1に記載の塩基配列は、 GenBank データベースにおいて Acces sion No. AF263928として登録されており、 また Virology 293, 103- 117 (2002)に開 示されたヒ トパピローマウィルス結合因子（Papi l lomavirus binding factor： PBF 、 配列番号： 2)をコードする塩基配列であり、 その第 337位〜第 1878位がオープン リーディングフレームに該当する。 また配列番号： 3に記載の塩基配列を含有する ポリヌクレオチドは、 配列番号： 1に記載の塩基配列と同一の塩基配列部分を含有 する類似のポリヌクレオチドである。 具体的には、 配列番号： 3に記載の塩基配列 の第 1位〜第 1469位の部分と、 配列番号： 1に記載の塩基配列の第 704位〜 1878位の 部分とは、 配列番号： 3にのみ存在する 294bpを除けば 100%の配列同一性を有して いる。
前記において （a)配列番号： 1に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、 (b)配列番号： 1に記載の塩基配列の第 337位〜第 1878位を含有するポリヌクレオチ ド、 （c) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリ ヌクレオチド、 若しくは (d) 配列番号： 3に記載の塩基配列を含有するポリヌクレ ォチドとは、 より具体的には、 これら配列番号： 1、 配列番号： 1の第 337位〜第 187 8位、 若しくは配列番号： 3のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド 、 または配列番号： 2に記載のァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列からなるポリヌ クレオチドが例示される。 さらに、 これら配列番号： 1、 配列番号： 1の第 337位〜 第 1878位、 若しくは配列番号： 3のいずれかに記載の塩基配列、 または配列番号： 2 に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の 5'末端側及び/又は 3'末端側に他の塩 基配列の付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドが例示される。
当該ポリヌクレオチドは、 当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質 力 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性 を有する。 ここで実質的に同質の活性とは、 本発明のポリヌクレオチドによりコー ドされるタンパク質を発現させた細胞が CTLにより認識されるという性質を指す。 当該活性およびその測定法については、 前記 「1)本発明のタンパク質」 において 記載したとおりである。
配列番号： 1または配列番号： 3に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは 、 GenBank Accession No. AF263928において開示されている塩基配列、 あるいは本 明細書の配列表の配列番号： 1または 3に開示されている塩基配列の適当な部分をハ イブリダィゼーシヨンのプローブあるいは PCRのプライマーに用いて、 例えば骨肉 腫細胞株 （例えば SaOS-2) 由来の cDNAライブラリーをスクリーニングすることなど によりクローニングすることができる。 該クローニングは、 例えば Molecular Clon ing 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い、 当業者ならば容易に行うことができる。
また前記 (a)〜（d)のいずれかのポリヌクレオチドと実質的に同一の塩基配列を含 有するポリヌクレオチドとは、 具体的には、
(e) 前記 ( 〜（d)のいずれかのポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェン トな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、 かつ当該ポリヌクレ ォチドによりコードされるタンパク質を発現させた細胞が C T Lに認識される特徴 を有するポリヌクレオチド、
(f) 上記 (a)〜（d)のいずれかのポリヌクレオチドと 7 0 %以上の配列同一性を示す 塩基配列を含有するポリヌクレオチドであって、 かつ当該ポリヌクレオチドにより コードされるタンパク質を発現させた細胞が C T Lに認識される特徴を有するポリ ヌクレオチド、
(g) 上記 (a)〜（d)のいずれかのポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質に おいて 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換及びノ又は付加されたアミノ酸配列 を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、 力 当該ポリヌク レオチドによりコードされるタンパク質を発現させた細胞が C T Lに認識される特 徴を有するポリヌクレオチド、
が挙げられる。 好ましくは、 前記 (a)〜（ のいずれかのポリヌクレオチドと実質的に同一の塩基 配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。 前記（a)〜（d)のレ、ずれかのポリヌク レオチドと実質的に同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドとしては、 以下の（e 〜（g')に挙げるポリヌクレオチドが挙げられる ：
(e 前記 (a)〜（ のいずれかのポリヌクレオチドの相補鎖に対してス トリンジェ ントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、 かつ当該ポリヌク レオチドによりコードされるタンパク質を発現させた細胞が C T Lに認識される特 徴を有するポリヌクレオチド、
(f) 上記 (a)〜（d)のいずれかのポリヌクレオチドと 7 0 %以上の配列同一性を示 す塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、 かつ当該ポリヌクレオチドにより コードされるタンパク質を発現させた細胞が C T Lに認識される特徴を有するポリ ヌクレオチド、
(g') 上記 (a)〜（d)のいずれかのポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質 において 1若しくは複数のァミノ酸が欠失、 置換及び/又は付加されたァミノ酸配 列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、 かつ当該ポリヌク レオチドによりコードされるタンパク質を発現させた細胞が C T Lに認識される特 徴を有するポリヌクレオチド。
前記において 「前記 (a)〜（d)のいずれかのポリヌクレオチドの相補鎖に対してス トリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」 とは、 例えば前 記 (a)〜（d)のいずれかのポリヌクレオチドの塩基配列と約 40%以上、 好ましくは約 60%以上、 より好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 さらに好まし くは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の配列同一性を有する塩基配列を含有 するポリヌクレオチドが挙げられる。 具体的には、 前記 (a)〜（d)のいずれかのポリ ヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。
ハイプリダイゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば
Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の 基本書に記載の方法に従って行うことができる。 また市販のライブラリーを使用す る場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ここで 「ストリンジェントな条件」 とは、 Berger and Kernel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Pre ss， San Diego CA) -^BiJ SdMolecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Labor atory Press (1989)に教示されるように、 複合体或いはプローブを結合する核酸の 融解温度（Tm)に基づいて決定することができる。
ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、 例えば、 6 X SSC (20 X SS(^i、333mM Sod ium citrate, 333mM NaClを示す）、 0. 5%SDSおよび 50% ホルムアミ ドを含む溶液中で 4 2°Cにてハイブリダィズさせる条件、または 6 X SSCを含む（50%ホルムアミ ドは含まな V、）溶液中で 65°Cにてハイブリダィズさせる条件などが挙げられる。
またハイプリダイゼーション後の洗浄の条件としては、 「 1 X SSC、 0. 1%SDS、 37 °C」 程度の条件を挙げることができる。 相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とす る正鎖とハイブリダィズ状態を維持するものであることが好ましレ、。 特に制限され ないが、 より厳しいハイブリダィズ条件として 「0. 5 X SSC、 0. 1%SDS、 42°C」 程度 、 さらに厳しいハイブリダィズ条件として 「0. 1 X SSC、 0. 1%SDS、 65°C」 程度の洗 浄条件を挙げることができる。
前記において 「上記 (a)〜（ のいずれかのポリヌクレオチドと 7 0 %以上の配列 同一性を示す塩基配列を含有するポリヌクレオチド」 とは、 例えば前記 (a)〜 (d)の いずれかのポリヌクレオチドの塩基配列と約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上 、 さらに好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の配列同一性を示す塩 基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。 具体的には、 前記 (a)〜 （ の いずれかのポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられ る。
ここで 「配列同一性」 とは、 2つのポリヌクレオチド間の、 配列の同一性及び相 同性をいう。 当該 「配列同一性」 は、 比較対象の配列の領域にわたって、 最適な状 態にァラインメントされた 2つの配列を比較することにより決定される。 ここで、 比較対象のポリヌクレオチドは、 2つの配列の最適なアラインメントにおいて、 付 加又は欠失 （例えばギャップ等） を有していてもよレ、。 このような配列同一性に関 しては、 例えば、 Vector NTIを用いて、 ClustalWアルゴリズム（Nucleic Acid Res. , 22 (22)： 4673-4680 (1994) )を利用してアラインメントを作成することにより算出す ることができる。 尚、 配列同一性は、 配列解析ソフト、 具体的には Vector NTI、 GE NETYX- MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。 前 記公共データベースは、 例えば、 ホームページアドレス http：〃 www. ddbj. nig. ac. j pにおいて、 一般的に利用可能である。
このような配列同一性を有するポリヌクレオチドは、 前述のハイブリダイゼーシ ヨン反応や通常の P C R反応により、 または後述するポリヌクレオチドの改変 （欠 失、 付加、 置換） 反応により作製することができる。
前記において 「上記（a)〜（d)のいずれかのポリヌクレオチドによりコードされる タンパク質において 1若しくは複数のァミノ酸が欠失、 置換及び/又は付加された アミノ酸配列を含有するタンパク質」 とは、 人為的に作製したいわゆる改変タンパ ク質や、 生体内に存在するアレル変異体等のタンパク質をコードする核酸を意味す る。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、 本発明タンパク質の 活性が保持される限り制限はない。 このように活性を喪失することなくアミノ酸残 基が、 どのように、 何個欠失、 置換及び Z又は付加されればよいかを決定する指標 は、 当業者に周知のコンピュータプログラム、 例えば DNA Star softwareを用いて 見出すことができる。 例えば変異数は、 典型的には、 全アミノ酸の 10%以内であり 、 好ましくは全アミノ酸の 5%以內である。 また置換されるアミノ酸は、 タンパク 質の構造保持の観点から、 残基の極性、 電荷、 可溶性、 疎水性、 親水性並びに両親 媒性など、 置換前のァミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。 例えば、 Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro, Met、 Phe及び Trpは互いに非極性アミノ酸に分 類されるアミノ酸であり、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn及び Ginは互いに非荷電 性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Asp及び Gluは互いに酸性アミノ酸に分類 されるアミノ酸であり、 また Lys、 Arg及び Hisは互いに塩基性アミノ酸に分類され るアミノ酸である。 ゆえに、 これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択 することができる。
この改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、 例えば、 Molecular Clon ing 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に記載の 種々の方法、 例えば部位特異的変異誘発や PCR法等によつて製造することができる 。 また市販のキットを用いて、 Gapped duplex法や Kunkel法などの公知の方法に従 つて製造することもできる。
以上のような本発明のポリヌクレオチドは、 当該ポリヌクレオチドによりコード されるタンパク質が、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と実 質的に同質の活性を有するタンパク質である。 ここで実質的に同質の活性とは、 本 発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を発現させた細胞が CTLに より認識されるという性質を指す。 当該活性およびその測定法については、 前記 「1)本発明のタンパク質」 において記載したとおりである。
本発明のポリヌクレオチドを含有する核酸は、 1本鎖および 2本鎖のいずれの形 態もとることができる。 本発明のポリヌクレオチドが 2本鎖の場合、 前記本発明の ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、 本発明のタンパク質を発 現するための組換え発現べクタ一を作製することができる。 すなわち本発明の核酸 の範疇には、 本発明の 2本鎖型ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して作製さ れた組換え発現ベクターも含まれる。
ここで用いる発現ベクターとしては、 用いる宿主や目的等に応じて適宜選択する ことができ、 プラスミ ド、 ファージベクター、 ウィルスベクター等が挙げられる。 例えば、 宿主が大腸菌の場合、 ベクターとしては、 pUC118、 pUC119、 pBR322、 pC R3等のプラスミ ドベクター、 λ ΖΑΡΠ、 L gtllなどのファージベクターが挙げられ る。 宿主が酵母の場合、 ベクターとしては、 pYES2、 pYEUra3などが挙げられる。 宿 主が昆虫細胞の場合には、 pAcSGHisNT- Aなどが挙げられる。 宿主が動物細胞の場合 には、 pCEP4、 pKCR、 pCDM8、 pGL2N pcDNA3. 1、 pRc/RSV、 pRc/CMVなどのプラスミ ド ベクターや、 レトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクタ一、 アデノ関連ウイ ルスベクターなどのウィルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、 発現誘導可能なプロモーター、 シグナル配列をコードする遺伝 子、 選択用マーカー遺伝子、 ターミネータ一などの因子を適宜有していても良い。 また、 単離精製が容易になるように、 チォレドキシン、 Hisタグ、 あるいは GST ( グルタチオン S -トランスフェラーゼ） 等との融合タンパク質として発現する配列が 付加されていても良い。 この場合、 宿主細胞内で機能する適切なプロモータ一 （la c、 tac、 trc、 trp、 CMV、 SV40初期プロモーターなど） を有する GST融合タンパクべ クタ一 （PGEX4Tなど） や、 Myc、 Hisなどのタグ配列を有するベクタ一 （pcDNA3. 1/M yc- Hisなど） 、 さらにはチォレドキシンおよび Hisタグとの融合タンパク質を発現 するベクター （pET32a) などを用いることができる。
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、 当該発現べク ターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、 大腸菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが挙げ られる。 大腸菌としては、 E. coli K- 12系統の HB101株、 C600株、 JM109株、 DH5 a株 、 AD494 (DE3)株などが挙げられる。 また酵母としては、 サッカロミセス .セルビジ ェなどが挙げられる。 動物細胞としては、 L929細胞、 BALBん 3T3細胞、 C127細胞、 C H0細胞、 COS細胞、 Vero細胞、 Hela細胞、 293- EBNA細胞などが挙げられる。 昆虫細 胞としては sf9などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、 前記宿主細胞に適合した通常の 導入方法を用いれば良い。 具体的にはリン酸カルシウム法、 DEAE-デキス トラン法 、 エレクトロポレーシヨン法、 遺伝子導入用リピッド （Lipofectamine、 Lipofecti n ; Gibco-BRL社） を用いる方法などが挙げられる。 導入後、 選択マーカーを含む通 常の培地にて培養することにより、 前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形 質転換細胞を選択することができる。
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることによ り、 本発明のタンパク質を製造することができる。 得られたタンパク質は、 一般的 な生化学的精製手段により、 さらに単離 ·精製することができる。 ここで精製手段 としては、 塩析、 イオン交換クロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー、 ァフ ィニティークロマトグラフィー、 ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。 ま た本発明のタンパク質を、 前述のチォレドキシンや Hisタグ、 GST等との融合タンパ ク質として発現させた場合は、 これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製 法により単離 ·精製することができる。
本発明の核酸の範疇には、 本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含 有する核酸も含まれる。
本発明のぺプチドをコードするポリヌクレオチドは、 DNAの形態であっても RNAの 形態であっても良い。 これら本発明のポリヌクレオチドは、 本発明のペプチドのァ ミノ酸配列情報およびそれによりコ一ドされる DNAの配列情報に基づき容易に製造 することができる。 具体的には、 通常の DNA合成や PCRによる増幅などによって、 製 造することができる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、 具体的には、 前記ェピトー プぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸は、 1本鎖およ び 2本鎖のいずれの形態もとることができる。 本発明のポリヌクレオチドが 2本鎖 の場合、 前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、 本 発明のペプチド （ェピトープペプチド） を発現するための組換え発現ベクターを作 製することができる。
ここで用いる発現ベクターや宿主細胞、 宿主細胞の形質転換方法等については、 前述の記載と同様である。
4)本 明のタンパク質を有効成分とする CTLの誘導剤
本発明のタンパク質を含有する細胞は CTLに認識されるという特徴を有する。 す なわち本発明のタンパク質は CTLの誘導剤である。 誘導された CTLは、 細胞傷害作用 やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用を発揮することができる。 従って本発 明のタンパク質は、 腫瘍の治療または予防のための医薬 （癌ワクチン） の有効成分 とすることができる。 本発明のタンパク質を有効成分として含有する CTLの誘導剤 は、 本発明のタンパク質を腫瘍患者に投与することで、 腫瘍を治療または予防し得 るものである。 当該タンパク質を腫瘍患者に投与すると、 抗原提示細胞内に取り込 まれ、 その後、 細胞內分解を受けて生じた腫瘍抗原ペプチドが H L A抗原と結合し て複合体を形成し、 該複合体が抗原提示細胞表面に提示され、 この複合体に特異的 な C T Lが体内で効率的に増殖し、 腫瘍細胞を破壊する。 以上のようにして、 腫瘍 の治療又は予防が達成される。
本発明のタンパク質を有効成分とする CTLの誘導剤は、 配列番号： 2に記載の PBF 陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。 具体的には、 例えば骨 肉腫などの肉腫全般、 又は腎癌などの癌 （腫瘍） の予防または治療のために使用す ることができる。
本発明のタンパク質を有効成分として含有する CTLの誘導剤は、 細胞性免疫が効 果的に成立するように、 医薬として許容されるキャリア一、 例えば適当なアジュバ ン卜と混合して投与、 又は併用して投与することができる。
アジュバントとしては、 文献 (Clin. Microbiol. Rev. , 7 : 277-289, 1994)に記載 のものなどが応用可能であり、 具体的には、 菌体由来成分又はその誘導体、 サイ ト 力イン、 植物由来成分又はその誘導体、 海洋生物由来成分又はその誘導体、 水酸化 アルミニウムの如き鉱物ゲル、 リソレシチン、 プル口ニックポリオールの如き界面 活性剤、 ポリア二オン、 ペプチド、 または油乳濁液 （エマルシヨン製剤） などを挙 げることができる。 また、 リボソーム製剤、 直径数 μ ιτι のビーズに結合させた粒子 状の製剤、 リピッドを結合させた製剤、 マイクロスフェアー製剤、 マイクロカプセ ル製剤なども考えられる。
前記において菌体由来成分又はその誘導体とは、 具体的には、 例えば①細菌の死 菌、 ②細菌由来の細胞壁骨格 （Cell Wall Skeleton, CWSと略する） 、 ③菌体由来 の特定の成分又はその誘導体等に分類される。 ここで①細菌の死菌としては、 例え ば溶連菌粉末 （例えばピシバニール；中外製薬株式会社） 、 死菌浮遊物カクテル （ 例えばブロンカスマ .ベルナ；三和化学研究所） 、 あるいはヒ ト型結核菌の死菌等 が挙げられる。
②細菌由来の CWSとしては、 マイクバクテリア属由来の CWS (例えばマイコバクテ リア属ゥシ型結核菌である BCG株の CWS) 、 ノカルディア属由来の CWS (例えばノカ ルディァ ·ノブラの CWS) 、 あるいはコリネバクテリア属由来の CWS等が挙げられる ③菌体由来の特定の成分又はその誘導体としては、 例えば菌体由来多糖類である ヒ ト型結核菌由来多糖類成分 （例えばアンサー ；ゼリア新薬工業株式会社） や担子 菌由来多糖類 （例えばレンチナン；味の素、 クレスチン；三共株式会社、 担子菌カ ワラタケ） 、 またムラミルジペプチド （MD P ) 関連化合物、 リポ多糖 （L P S ) 、 リピド A関連化合物 （M P L ) 、 糖脂質トレハロースジマイコレート （T DM) 、 細菌由来の D N A (例えば C p Gオリゴヌクレオチド） 、 あるいはこれらの誘導 体などが挙げられる。
これら菌体由来成分及びその誘導体は、 既に市販されているものであればそれを 入手するか、 又は公知文献 (例えば Cancer Res. , 33, 2187— 2195 (1973)、 J. Natl. Can cer Inst. , 48, 831- 835 (1972)、 J. Bacteriol.， 94, 1736- 1745 (1967)、 Gann, 69, 619-6 26 (1978)、 J. Bacteriol. , 92, 869-879 (1966)、 J. Natl. Cancer Inst. , 52, 95-101 (197 4) ) 等に基き単離又は製造することが可能である。
前記において 「サイ トカイン」 とは、 例えば IFN -ひ、 IL-12、 GM- CSF、 IL-2、 IF N- y , IL- 18、 あるいは IL-15などが挙げられる。 これらのサイト力インは、 天然品 であっても遺伝子組換え品であっても良い。 これらのサイ ト力インは、 既に市販さ れていればそれを入手して使用することができる。 また遺伝子組換え品であれば、 例えば GenBank、 EMBL、 あるいは DDBJ等のデータベースにおいて登録されている各 塩基配列に基き、 常法により所望の遺伝子をクローニングし、 適当な発現ベクター に連結して作製された組換え発現べクターで宿主細胞を形質転換することにより、 発現 ·生産することができる。
前記において 「植物由来成分又はその誘導体」 とは、 例えばサポニン由来成分で める Quil A (Accurate Chemical&Scientif ic Corp) 、 QS-21 (Aqui丄 a Biopharmac euticals inc. ) 、 あるいはグリチルリチン （SIGMA- ALDRICHなど） などが挙げられ る。
前記において 「海洋生物由来成分又はその誘導体」 とは、 例えば海綿由来の糖脂 質である ガラクトシルセラミ ドなどが挙げられる。
前記において油乳濁液 （エマルシヨン製剤） とは、 例えば油中水型 （wZ o ) ェ マルシヨン製剤、 水中油型 （o Zw ) エマルシヨン製剤、 水中油中水型 （w/ o / w) エマルシヨン製剤などが挙げられる。
ここで油中水型 （w/ o ) エマルシヨン製剤は、 有効成分を水の分散相に分散さ せた形態をとる。 水中油型 （o /w) エマルシヨン製剤は、 有効成分を水の分散媒 に分散させた形態をとる。 また水中油中水型 （wZ o /w) エマルシヨン製剤は、 有効成分を最内相の水の分散相に分散させた形態をとる。 このようなエマルション 製剤の調製は、 例えば、 特開平 8— 9 8 5号公報、 特開平 9一 1 2 2 4 7 6号公報 等を参考にして行うことができる。
前記においてリボソーム製剤とは、 有効成分を脂質二重膜構造のリボソームで水 相内または膜内に包み込んだ形の微粒子である。 リポソームを作るための主要な脂 質としては、 ホスファチジルコリン、 スフインゴミエリン等が挙げられ、 これにジ セチルホスフェート、 ホスファチジン酸、 ホスファチジルセリン等を加えてリポソ ームに荷電を与えて安定化させる。 リボソームの調製方法としては、 超音波法、 ェ タノール注入法、 エーテル注入法、 逆相蒸発法、 フレンチプレスェクス トラクショ ン法等が挙げられる。
前記においてマイクロスフエアー製剤は、 均質な高分子マトリックスから構成さ れ、 該マトリックス中に有効成分が分散された形の微粒子である。 マトリ ックスの 材料としては、 アルブミン、 ゼラチン、 キチン、 キトサン、 デンプン、 ポリ乳酸、 ポリアルキルシアノアクリレート等の生分解性高分子が挙げられる。 マイクロスフ エアー製剤の調製方法としては公知の方法 （Eur. J. Pharm. Biopharm. 50 : 129-14 6, 2000、 Dev. Biol. Stand. 92 : 63—78， 1998、 Pharm. Biotechnol. 10 : 1—43， 199 7) 等に従えばよく特に限定されない。
前記においてマイクロカプセル製剤は、 有効成分を芯物質として被膜物質で覆つ た形の微粒子である。 被膜物質に用いられるコーティング材料としては、 カルボキ シメチルセルロース、 セノレロースアセテートフタレート、 ェチノレセルロース、 ゼラ チン、 ゼラチン 'アラビアゴム、 ニトロセノレロース、 ポリビュルアルコーノレ、 ヒ ド ロキシプロピルセルロース等の膜形成性高分子が挙げられる。 マイクロカプセル製 剤の調製方法は、 コアセルべーシヨン法、 界面重合法等が挙げられる。
投与方法としては、 皮内投与、 皮下投与、 筋肉内投与、 静脈内投与などが挙げら れる。 製剤中の本発明のタンパク質の投与量は、 治療目的の疾患、 患者の年齢、 体 重等により適宜調整することができるが、 通常 0. 0001mg〜1000mg、 好ましくは 0. 0 01mg〜100mg、 より好ましくは 0. 01mg〜10mgであり、 これを数日ないし数月に 1回 投与するのが好ましい。
5)本発明のペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤
本発明のぺプチドは CTL誘導活性を有する CTLの誘導剤である。 誘導された CTLは 、 細胞傷害作用ゃリンフォ力インの産生を介して抗腫瘍作用を発揮することができ る。 従って本発明のペプチドは、 腫瘍の治療または予防のための医薬の有効成分と することができる。 本宪明のペプチドを有効成分として含有する CTLの誘導剤を腫 瘍患者に投与すると、 抗原提示細胞の H L A抗原に本発明のぺプチドが提示され、 提示された H L A抗原とぺプチドとの結合複合体特異的 C T Lが増殖して腫瘍細胞 を破壊することができ、 従って、 患者の腫瘍を治療又は予防することができる。 本発明のぺプチドを有効成分とする CTLの誘導剤は、 配列番号： 2に記載の PBFタ ンパク陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。 具体的には、 例 えば骨肉腫などの肉腫全般または腎癌などの癌 （腫瘍） の予防または治療のために 使用することができる。
本発明のペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤は、 単一の CTLェピトープ （本発 明のペプチド） を有効成分とするものであっても、 また他のペプチド （CTLェピト ープゃヘルパーェピトープ） と連結したェピトープぺプチドを有効成分とするもの であっても良い。 近年、 複数の CTLェピトープ （抗原ペプチド） を連結したェピト ープペプチドが、 イン ' ビボで効率的に CTL誘導活性を有することが示されている 。 例えば Journal of I画 unology 1998， 161 : 3186-3194には、 癌抗原タンパク質 PS A由来の HLA- A2, -A3, -All, B53拘束性 CTLェピトープ （抗原ペプチド） を連結した 約 30merのェピトープぺプチドが、 ィン · ビボでそれぞれの CTLェピトープに特異的 な CTLを誘導したことが記載されている。 また CTLェピトープとヘルパーェピトープ とを連結させたェピトープぺプチドにより、 効率的に CTLが誘導されることも示さ れている。 このようなェピトープペプチドの形態で投与した場合、 抗原提示細胞内 に取り込まれ、 その後、 細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドが HLA抗原 と結合して複合体を形成し、 該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、 こ の複合体に特異的な CTLが体内で効率的に増殖し、 腫瘍細胞を破壊する。 このよう にして腫瘍の治療または予防が達成される。
本発明のぺプチドを有効成分とする CTLの誘導剤は、 細胞性免疫が効果的に成立 するように、 医薬として許容されるキャリアー、 例えば適当なアジュバントと混合 して投与、 又は併用して投与することができる。
アジュバントとしては、 文献 （Clin. Microbiol. Rev. , 7： 277-289, 1994)に記載 のものなどが応用可能であり、 具体的には、 菌体由来成分又はその誘導体、 サイト 力イン、 植物由来成分又はその誘導体、 海洋生物由来成分又はその誘導体、 水酸化 アルミニウムの如き鉱物ゲル、 リソレシチン、 プル口ニックポリオールの如き界面 活性剤、 ポリア二オン、 ペプチド、 または油乳濁液 （エマルシヨン製剤） などを挙 げることができる。 また、 リボソーム製剤、 直径数/ tn のビーズに結合させた粒子 状の製剤、 リピッドを結合させた製剤、 マイクロスフェアー製剤、 マイクロカプセ ル製剤なども考えられる。 これらアジュバントの具体例については、 前記 「4)本発 明のタンパク質を有効成分とする CTLの誘導剤」 の項を参照されたい。
投与方法としては、 皮内投与、 皮下投与、 筋肉内投与、 静脈内投与などが挙げら れる。 製剤中の本発明のペプチドの投与量は、 治療目的の疾患、 患者の年齢、 体重 等により適宜調整することができるが、 通常 0. 0001mg〜1000mg、 好ましくは 0. 001 mg〜1000mg、 より好ましくは O. lmg 〜10mgであり、 これを数日ないし数月に 1回投 与するのが好ましい。
6)本発明の核酸を有効成分とする CTLの誘導剤
本発明の核酸を発現させた細胞は、 CTLに認識されるという特徴を有する。 すな わち本発明の核酸は CTLの誘導剤である。 誘導された CTLは、 細胞傷害作用やリンフ ォカインの産生を介して抗腫瘍作用を発揮することができる。 従って本発明の核酸 は、 腫瘍の治療または予防のための医薬の有効成分とすることができる。 本発明の 核酸を有効成分として含有する CTLの誘導剤は、 例えば、 本発明の核酸を腫瘍患者 に投与し発現させることで、 腫瘍を治療または予防し得るものである。
例えば発現ベクターに組み込まれた本発明の核酸を以下の方法により腫瘍患者に 投与すると、 抗原提示細胞內で腫瘍抗原タンパク質が高発現する。 その後、 細胞内 分解を受けて生じた腫瘍抗原ぺプチドが H L A抗原と結合して複合体を形成し、 該 複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示されることにより、 腫瘍特異的 C Tしが 体内で効率的に増殖し、 腫瘍細胞を破壊する。 以上のようにして、 腫瘍の治療また は予防が達成される。
本発明の核酸を有効成分とする CTLの誘導剤は、 配列番号： 1に記載の PBF遺伝子 および当該遺伝子の発現産物である PBF陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用す ることができる。 具体的には、 例えば骨肉腫などの肉腫全般または腎癌などの癌の 予防または治療のために使用することができる。
本発明の核酸を投与し細胞内に導入する方法としては、 ウィルスベクタ一による 方法およびその他の方法 （日経サイエンス， 1994年 4月号， 20- 45頁、 月刊薬事， (1)， 23-48 (1994)、 実験医学増刊， 12 (15) , (1994)、 およびこれらの引用文献等） のいずれの方法も適用することができる。
ウィルスベクターによる方法としては、 例えばレトロウイルス、 アデノウイルス 、 アデノ関連ウイノレス、 へノレぺスウィルス、 ワクシニアウィルス、 ボックスウイノレ ス、 ポリオウイルス、 シンビスウィルス等の D N Aウィルス又は R N Aウィルスに 本発明の D N Aを組み込んで導入する方法が挙げられる。 この中で、 レ トロウイノレ ス、 アデノウイルス、 アデノ関連ウィルス、 ワクシニアウィルス等を用いた方法が 特に好ましい。
その他の方法としては、 発現プラスミ ドを直接筋肉内に投与する方法 （D N Aヮ クチン法） 、 リボソーム法、 リポフエクチン法、 マイクロインジェクション法、 リ ン酸カノレシゥム法、 エレク ト口ポレーシヨン法等が挙げられ、 特に D N Aワクチン 法、 リボソーム法が好ましい。
本発明の核酸を実際に医薬として作用させるには、 当該核酸を直接体内に導入す る in vivo法、 およびヒ トからある種の細胞を採集し体外で核酸を該細胞に導入し その細胞を体内に戻す ex vivo法がある （日経サイエンス， 1994年 4月号， 20- 45頁 、 月刊薬事， 36 (1) , 23 - 48 (1994)、 実験医学増刊， 12 (15) , (1994)、 およびこれら の引用文献等） 。 in vivo法がより好ましい。
in vivo法により投与する場合は、 治療目的の疾患、 症状等に応じた適当な投与 経路により投与され得る。 例えば、 静脈、 動脈、 皮下、 皮内、 筋肉内等に投与する ことができる。 in vivo法により投与する場合は、 例えば、 液剤等の製剤形態をと りうるが、 一般的には有効成分である本発明の核酸を含有する注射剤等とされ、 必 要に応じて、 医薬上許容されるキャリアー （担体） を加えてもよい。 また、 本発明 の核酸を含有するリボソームまたは膜融合リボソーム （センダイウィルス （H V J ) 一リボソーム等） においては、 懸濁剤、 凍結剤、 遠心分離濃縮凍結剤等のリポソ ーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明の核酸の含量は、 治療目的の疾患、 患者の年齢、 体重等により適 宜調整することができるが、 通常、 核酸中のポリヌクレオチドの含量として、 0. 00 01mg〜100mg、 好ましくは 0. 001mg〜10mgの本発明の核酸を、 数日ないし数月に 1回 投与するのが好ましい。
また近年、 複数の CTLェピトープ （腫瘍抗原ペプチド） を連結したェピトープぺ プチドをコードするポリヌクレオチド、 あるいは CTLェピトープとヘルパーェピト 一プとを連結させたェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、 in viv oで効率的に CTL誘導活性を有することが示されている。 例えば Journal of Immunol ogy 1999, 162： 3915-3925には、 HBV由来 HLA-A2拘束性抗原ペプチド 6種類、 HLA- A 11拘束性抗原ぺプチド 3種類、 およびヘルパーェピトープを連結したェピトープぺ プチドをコードする DNA (ミニジーン） 力 イン . ビボでそれぞれのェピトープに 対する CTLを効果的に誘導したことが記載されている。
従って、 本発明のぺプチドをコードするポリヌクレオチドを 1種または 2種以上 連結させることにより、 また場合によっては他のぺプチドをコ一ドするポリヌクレ ォチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、 適当な発現べクタ 一に組み込むことにより、 CTLの誘導剤の有効成分とすることができる。 このよう な CTLの誘導剤も、 前記と同様の投与方法および投与形態をとることができる。 7)本発明の抗原提示細胞
前記した本発明のタンパク質、 ペプチドおよび核酸は、 腫瘍患者の治療において 、 以下のようにイン · ビトロで利用することができる。 すなわち本発明のタンパク 質、 ペプチドおよび核酸のいずれかと抗原提示能を有する細胞とをイン · ビトロで 接触させることにより、 抗原提示細胞を作製することができる。 具体的には本発明 は、 腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞と、 本発明のタンパク質、 ぺプチドぉよび核酸のいずれかとをイン · ビトロで接触させることにより、 当該細 胞の細胞表面に H L A抗原と本発明のぺプチドとの複合体を提示させた抗原提示細 胞、 およびその製造方法を提供するものである。
ここで 「抗原提示能を有する細胞」 とは、 本発明のペプチドを提示することの可 能な H L A抗原を細胞表面に発現する細胞であれば特に限定されないが、 特に抗原 提示能が高いとされる樹状細胞が好ましい。
また、 前記抗原提示能を有する細胞から本発明の抗原提示細胞を調製するために 添加される物質としては、 本発明のタンパク質、 ペプチドおよび核酸のいずれであ つても良い。
本発明の抗原提示細胞は、 腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、 該細 胞に本発明のタンパク質またはペプチドをイン . ビトロでパルスして、 H L A抗原 と本発明のぺプチドとの複合体を提示させることにより得られる（Cancer Immunol. Immunother. , 46 : 82， 1998、 Τ . Immunol.， 158, ρ1796, 1997、 Cancer Res.， 59, pi 184， 1 999) 。 樹状細胞を用いる場合は、 例えば、 腫瘍患者の末梢血からフイコール法に よりリンパ球を分離し、 その後非付着細胞を除き、 付着細胞を GM- CSFおよび IL- 4存 在下で培養して樹状細胞を誘導し、 当該樹状細胞を本発明のタンパク質またはぺプ チドと共に培養してパルスすることなどにより、 本発明の抗原提示細胞を調製する ことができる。
また、 前記抗原提示能を有する細胞に本発明の核酸を導入することにより本発明 の抗原提示細胞を調製する場合は、 当該核酸は、 D N Aの形態であっても、 R N A の形態であっても良い。 具体的には、 D NAの場合は Cancer Res.， 56 :p5672, 1996 や J. Immunol. , 161 : ρ5607, 1998などを参考にして行うことができ、 また R NAの 場合は Exp. Med. , 184 : p465, 1996などを参考にして行うことができる。
前記抗原提示細胞は CTLの誘導剤の有効成分とすることができる。 当該抗原提示 細胞を有効成分として含有する CTLの誘導剤は、 抗原提示細胞を安定に維持するた めに、 生理食塩水、 リン酸緩衝生理食塩水 （P B S ) 、 培地等を含むことが好まし レ、。 投与方法としては、 静脈内投与、 皮下投与、 皮内投与が挙げられる。 このよう な抗原提示細胞を有効成分として含有してなる CTLの誘導剤を患者の体内に戻すこ とにより、 本発明の PBF陽性の患者の体内で効率良く特異的な C T Lが誘導され、 腫瘍を治療することができる。
8)本発明の CTL
本発明のタンパク質、 ペプチドおよび核酸は、 腫瘍患者の治療において、 以下の ようにイン · ビトロで利用することができる。 すなわち本発明のタンパク質、 ぺプ チドおよび核酸のいずれかと末梢血リンパ球とをイン · ビトロで接触させることに より、 CTLを誘導することができる。 具体的には本発明は、 腫瘍患者由来の末梢血 リンパ球と、 本発明のタンパク質、 ペプチドおよび核酸のいずれかとをイン ' ビト 口で接触させることにより誘導された C T L、 およびその誘導方法を提供するもの である。
例えばメラノ一マにおいては、 患者本人の腫瘍内浸潤 T細胞を体外で大量に培養 して、 これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている （J. Natl. Cance r. Inst. , 86： 1159、 1994) 。 またマウスのメラノーマにおいては、 脾細胞をイン ' ビト口で腫瘍抗原べプチド T R P _ 2で刺激し、 腫瘍抗原べプチドに特異的な C T Lを増殖させ、 該 C T Lをメラノーマ移植マウスに投与することにより、 転移抑制 が認められている （J. Exp. Med. , 185 : 453, 1997 ) 。 これは、 抗原提示細胞の H L A 抗原と腫瘍抗原べプチドとの複合体を特異的に認識する C T Lをィン · ビトロで増 殖させた結果に基づくものである。 従って、 本発明のタンパク質、 ペプチドまたは 核酸を用いて、 イン · ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的 C T Lを 増やした後、 この C T Lを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
当該 C T Lは腫瘍の治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。 該治療 剤または予防剤は、 C T Lを安定に維持するために、 生理食塩水、 リン酸緩衝生理 食塩水 （P B S ) 、 培地等を含むことが好ましい。 投与方法としては、 静脈内投与 、 皮下投与、 皮内投与が挙げられる。 このような C T Lを有効成分として含有して なる腫瘍の治療または予防剤を患者の体内に戻すことにより、 本発明の PBF陽性の 患者の体内で C T Lによる腫瘍細胞の傷害作用が促進され、 腫瘍細胞を破壊するこ とにより、 腫瘍を治療することができる。
9)本発明のぺプチドに対する抗体
本発明は、 本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。 本発明の抗体 は、 その形態に特に制限はなく、 本発明のぺプチドを免疫抗原とするポリクローナ ル抗体であっても、 またモノクローナル抗体であっても良い。
本発明の抗体は前記のように本発明のぺプチドに特異的に結合するものであれば 特に制限されないが、 具体的には、 配列番号： 6〜55のいずれかに記載のアミノ酸 配列からなる腫瘍抗原ペプチドに特異的に結合する抗体を挙げることができる。 これらの抗体の製造方法は、 すでに周知であり、 本発明の抗体もこれらの常法に 従って製造す Oこと でさ。 (Current protocols in Molecular Biology edit. A usubel et al. (1987) Publ ish. John Wiley and Sons. Section 11. 12〜11· 13、 A ntibodies ; A Laboratory Manual, Lane, H， D.ら編， Cold Spring Harber Labora tory Press 出版 New York 1989) 。
具体的には、 本発明のペプチド （例えば配列番号： 6〜55のいずれかに記載のァ ミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド） を免疫原として用い、 家兎等の非ヒ ト動物 を免疫し、 該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。 一方、 モノ クローナル抗体の場合には、 本発明のぺプチド （例えば配列番号： 6〜55のいずれ かに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド） をマウス等の非ヒ ト動物に免 疫し、 得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイプリ ドーマ 糸田包の中力 ら得ること力 sできる (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publ ish. John Wiley and Sons. Section 11. 4~ 11. 11) 0
本発明のペプチドに対する抗体の作製は、 宿主に応じて種々のアジュバントを用 いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。 そのようなアジュバン トには、 フロイントアジュバント、 水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、 並 びにリゾレシチン、 プル口ニックポリオル、 ポリア二オン、 ペプチド、 油乳剤、 キ 一ホールリンぺットへモシァニンおよびジニトロフエノールのような表面活性物質 、 B C G (カルメット一ゲラン桿菌） やコリネバクテリウム-パノレヴムなどのヒ ト アジュバントなどがある。
以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することによ り、 ペプチドを認識する抗体、 さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製でき る。 抗体の用途としては、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 免疫学的診断等が 挙げられる。 免疫学的診断は、 ィムノブロット法、 放射免疫測定法 （R I A) 、 酵 素免疫測定法 （E L I S A) 、 蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。 こ のような免疫学的診断は、 本発明の PBF遺伝子が発現している癌、 例えば肉腫ゃ腎 癌等の診断において有効である。
10)腫瘍マ一カー
①本発明のポリヌクレオチドに関する腫瘍マーカー
本発明においては、 配列番号： 1に記載の PBF遺伝子が、 正常細胞に比して肉腫お よび腎癌において特異的に高発現しているという知見を得た。 よって、 当該遺伝子 発現の有無や発現の程度を検出することによって、 腫瘍、 特に肉腫ゃ腎癌の有無や 程度が特異的に検出でき、 該疾患の診断を行うことができる。
本発明のポリヌクレオチドは、 従って、 被験者における PBF遺伝子の発現の有無 またはその程度を検出することによって、 該被験者が腫瘍に罹患しているか否かま たはその罹患の程度を診断することのできるツール （腫瘍マーカー） として有用で ある。 本発明の腫瘍マーカーは、 前記本発明ポリヌクレオチド （配列番号： 2に記載の アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコ ードするポリヌクレオチド） の塩基配列において、 連続する少なくとも 15塩基を含 有するポリヌクレオチド及び/またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなるこ とを特徴とするものである。
具体的には、 本発明の腫瘍マーカ一は、 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列に おいて、 連続する少なくとも 15塩基を含有するポリヌクレオチド及びノまたはそれ に相補的なポリヌクレオチドからなるものを挙げることができる。
ここで相補的なポリヌクレオチド （相補鎖、 逆鎖） とは、 前記配列番号： 1また は 3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、 または該塩基配列に おいて少なくとも連続した 1 5塩基長の塩基配列を含有するその部分配列 （ここで は便宜上、 これらを 「正鎖」 ともいう） に対して、 A : Tおよび G : Cといった塩基対関 係に基づいて、 塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものであ る。 ただし、 かかる相補鎖は、 対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成 する場合に限らず、 対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダィズす ることができる程度の相補関係を有するものであってもよレ、。 なお、 ここでストリ ンジェントな条件は、 Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Te chniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に 教示されるように、 複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度 (Tm)に基づい て決定することができる。 例えばハイブリダィズ後の洗浄条件として、 通常 「I X SSC、 0. 1%SDS、 37°C」 程度の条件を挙げることができる。 相補鎖はかかる条件で洗 浄しても対象とする正鎖とハイプリダイズ状態を維持するものであることが好まし い。 特に制限されないが、 より厳しいハイブリダィズ条件として 「0. 5 X SSC、 0. 1% SDS、 42°C」 程度、 さらに厳しいハイブリダィズ条件として 「0. 1 X SSC、 0. 1%SDS、 65°C」 程度の洗浄条件を挙げることができる。 具体的には、 このような相補鎖とし て、 対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、 並び に該鎖と少なくとも 90%、 好ましくは 95%の相同性を有する塩基配列からなる鎖を 例示することができる。
ここで、 正鎖側のポリヌクレオチドには、 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列 、 またはその部分配列を含有するものだけでなく、 上記相補鎖の塩基配列に対して さらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖 （逆鎖） のポリヌクレオチドは、 各々一本鎖の形態で腫瘍マーカーとして使用されても、 また二本鎖の形態で腫瘍マ 一力一として使用されてもよい。
本発明の腫瘍マーカーは、 具体的には、 前記配列番号： 1または 3に記載の塩基配 列 （全長配列） からなるポリヌクレオチドであってもよいし、 その相補配列からな るポリヌクレオチドであってもよレ、。 またこれら本発明遺伝子もしくは該遺伝子に 由来するポリヌクレオチドを選択的に （特異的に） 認識するものであれば、 上記全 長配列またはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。 この場合、 部分配列としては、 上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任 意に選択される少なくとも 15個の連続した塩基長を含有するポリヌクレオチドを挙 げることができる。
なお、 ここで 「選択的に （特異的に） 認識する」 とは、 例えばノーザンプロット 法においては、 本発明の PBF遺伝子、 またはこれらに由来するポリヌクレオチドが 特異的に検出できること、 また RT-PCR法においては、 本発明の PBF遺伝子、 または これらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、 それ に限定されることなく、 当業者が上記検出物または生成物が PBF遺伝子に由来する ものであると判断できるものであればよい。
本発明の腫瘍マーカーは、 例えば配列番号 1又は 3に記載の塩基配列をもとに、 例 Iば primer 3 ( HYPERLINK http: //www. genome. wi. mit. edu/cgi_bin/prinier/pri mer3. cgi) あるいはベクター NTI (Infomax社製） を利用して設計することができる 。 具体的には前記本発明遺伝子の塩基配列を primer 3またはベクター NTIのソフト ウェアにかけて得られる、 プライマーまたはプローブの候補配列、 若しくは少なく とも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することがで きる。 このような本発明の腫瘍マーカーの具体例としては、 例えば配列番号： 4ま たは 5に記載のプライマーを挙げることができる。
本発明の腫瘍マーカーは、 上述するように連続する少なくとも 15塩基の長さを含 有するものであればよいが、 具体的にはマーカーの用途に応じて、 長さを適宜選択 し設定することができる。
本発明において腫瘍の検出 （診断） は、 被験者の生体組織、 特に腫瘍 （肉腫ゃ腎 癌） が疑われる被験組織における PBF遺伝子の発現の有無または発現レベル （発現 量） を評価することによって行われる。 この場合、 上記本発明の腫瘍マーカーは、 PBF遺伝子の発現によって生じた R N Aまたはそれに由来するポリヌクレオチドを 特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、 または該 R N Aまたはそれに由 来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することが できる。
本発明腫瘍マーカーを腫瘍の検出においてプライマーとして用いる場合には、 通 常 15bp〜100bp、 好ましくは 15bp〜50bp、 より好ましくは 15bp〜35bpの塩基長を含 有するものが例示できる。 また検出プローブとして用いる場合には、 通常 15bp〜全 配列の塩基数、 好ましくは 15bp〜lkb、 より好ましくは 100bp〜lkbの塩基長を含有 するものが例示できる。
本発明の腫瘍マーカーは、 ノーザンブロット法、 RT- PCR法、 in situハイブリダ 一ゼーシヨン法などといった、 特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において 、 常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。
本発明の腫瘍マーカーは、 腫瘍の診断、 検出 （罹患の有無や罹患の程度の診断） に有用である。 具体的には、 該腫瘍マーカーを利用した腫瘍の診断は、 被験者にお ける生体組織 （腫瘍が疑われる組織） と正常者における同様の組織における PBF遺 伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。 この場 合、 遺伝子発現レベルの違いには、 発現のあるノなしの違いだけでなく、 被験者の 組織と正常者の組織の両者ともに発現がある場合でも、 両者間の発現量の格差が 2 倍以上、 好ましくは 3倍以上の場合が含まれる。 具体的には PBF遺伝子は腫瘍で発現 誘導を示すので、 被験者の組織で発現しており、 該発現量が正常者の対応組織の発 現量と比べて 2倍以上、 好ましくは 3倍以上多ければ、 被験者について腫瘍の罹患が 疑われる。
②本発明の抗体に関する腫瘍マーカー
本発明は腫瘍マーカーとして、 本発明のタンパク質又はその部分ペプチド （本発 明のペプチドを含む） を特異的に認識することのできる抗体 （以下、 本発明の抗体 と称する場合がある） を提供する。 より具体的には、 本発明は、 配列番号： 2に記 載のアミノ酸配列からなる本発明のタンパク質またはその部分ぺプチド （本発明の ぺプチドを含む） を特異的に認識する抗体からなる腫瘍マーカーを提供する。
本発明においては、 種々の肉腫および腎癌において、 本発明の PBF遺伝子が特異 的に高発現しているという知見を得た。 よってこれらの遺伝子の発現産物 （タンパ ク質） の有無やその発現の程度を検出することによって、 上記腫瘍 （肉腫、 腎癌等 ) の有無やその程度が特異的に検出でき、 該疾患の診断を行うことができる。
上記抗体は、 従って、 被験者における上記タンパク質の発現の有無またはその程 度を検出することによって、 該被験者が腫瘍に罹患しているか否かまたはその疾患 の程度を診断することのできるツール （腫瘍マーカー） として有用である。
本発明の抗体は、 その形態に特に制限はなく、 本発明タンパク質 （具体的には配 列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる PBFタンパク質） を免疫抗原とするポリク ローナル抗体であっても、 またそのモノクローナル抗体であってもよい。 さらにこ れら本発明タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、 通常 8アミノ酸 、 好ましくは 15アミノ酸、 より好ましくは 20アミノ酸からなるポリペプチドに対し て抗原結合性を有する抗体も、 本発明の抗体に含まれる。
これらの抗体の製造方法は、 すでに周知であり、 本発明の抗体もこれらの常法に 従って製造すること力 sできる (Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11. 12〜11. 13 (2000) ) 。 具体的には、 本発明の抗体がポリクロ一ナル抗体の場合 には、 常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明タンパク質を用いて、 あるい は常法に従ってこれら本発明タンパク質の部分ァミノ酸配列を含有するォリゴぺプ チドを合成して、 家兎等の非ヒ ト動物に免疫し、 該免疫動物の血清から常法に従つ て得ることが可能である。 一方、 モノクローナル抗体の場合には、 常法に従って大 腸菌等で発現し精製した本発明タンパク質、 あるいはこれらタンパク質の部分ァミ ノ酸配列を含有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒ ト動物に免疫し、 得られた脾 臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリ ドーマ細胞の中から得る こと力 Sできる (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11. 4〜11. 11) 。
抗体の作製に免疫抗原として使用される本発明タンパク質 （具体的には配列番号 : 2に記載のアミノ酸配列よりなる PBFタンパク質） は、 本発明により提供される遺 伝子の配列情報 （配列番号 1, 3) に基づいて、 D N Aクローニング、 各プラスミ ド の構築、 宿主へのトランスフエクシヨン、 形質転換体の培養および培養物からのタ ンパク質の回収の操作により得ることができる。 これらの操作は、 当業者に既知の 方法、 あるいは文献記載の方法 （Molecular Cloning, T. Maniatis et al. , CSH La boratory (1983) , DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985) ) などに準じて行 うことができる。 また本発明タンパク質の部分ペプチドは、 本宪明により提供され るアミノ酸配列の情報 （配列番号： 2) に従って、 一般的な化学合成法 （ペプチド 合成） によって製造することもできる。 詳しくは前述の 1)〜3)の項を参照されたい 本発明の抗体は、 また、 本発明タンパク質の部分アミノ酸配列を含有するオリゴ ぺプチドを用いて調製されるものであってよい。 かかる抗体の製造のために用いら れるオリゴ （ポリ） ペプチドは、 機能的な生物活性を有することは要しないが、 本 発明タンパク質と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。 好ましく はこの免疫原特性を有し、 且つ本発明タンパク質のアミノ酸配列において少なくと も連続する 8アミノ酸、 好ましくは 15アミノ酸、 より好ましくは 20アミノ酸からな るオリゴ （ポリ） ペプチドを例示することができる。
かかるオリゴ （ポリ） ペプチドに対する抗体の製造は、 宿主に応じて種々のアジ ュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。 限定はさ れないが、 そのようなアジュバントには、 フロイントアジュバント、 水酸化アルミ ニゥムのようなミネラルゲル、 並びにリゾレシチン、 プル口ニックポリオノレ、 ポリ ァニオン、 ペプチド、 油乳剤、 キーホールリンペッ トへモシァニン及びジニトロフ ヱノールのような表面活性物質、 B C G (カルメッ ト一ゲラン桿菌） やコリネパク テリゥム-パノレヴムなどのヒ トアジュバントが含まれる。
本発明の抗体は、 PBFタンパクに特異的に結合する性質を有することから、 該抗 体を利用することによって、 被験者の組織内に発現した上記タンパク質を特異的に 検出することができる。 すなわち、 当該抗体は被験者の組織内における PBF発現の 有無を検出するためのプローブとして有用である。
具体的には、 腫瘍が疑われる被験組織や血液をバイオプシ等で採取し、 そこから 常法に従ってタンパク質を調製して、 例えばウェスタンプロット法、 ELISA法など 公知の検出方法において、 上記抗体を常法に従ってプローブとして使用することに よって PBFを検出することができる。
腫瘍の診断に際しては、 被験者組織における PBFタンパクの量と正常な対応組織 における PBFタンパク量の違いを判定すればよい。 この場合、 タンパク量の違いに は、 タンパクのある/なし、 あるいはタンパク量の違いが 2倍以上、 好ましくは 3倍 以上の場合が含まれる。 具体的には PBF遺伝子は腫瘍（肉腫、 腎癌） で発現誘導を示 すので、 被験者組織で該遺伝子の発現産物 （PBF) が存在しており、 該量が正常な 組織の発現産物量と比べて 2倍以上、 好ましくは 3倍以上多いことが判定されれば、 腫瘍の罹患が疑われる。
③本発明のタンパク質またはペプチドに関する腫瘍マーカー
本発明は腫瘍マーカーとして、 本発明のタンパク質又はその部分ペプチドに対す る抗体を特異的に認識することのできるタンパク質またはぺプチドを提供する。 よ り具体的には、 本発明は、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる本発明のタ ンパク質またはその部分ぺプチドからなる腫瘍マーカーを提供する。
ここで腫瘍マーカーの成分とされる本発明タンパク質の部分べプチドとしては、 本発明タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、 通常 8アミノ酸、 好 ましくは 15ァミノ酸、 より好ましくは 20ァミノ酸からなるポリぺプチドを挙げるこ とができる。
本発明のタンパク質やペプチド （ポリペプチド） を診断薬として用い、 腫瘍が疑 われる患者から得た試料 （例えば血液、 腫瘍が疑われる組織など） 中の抗体の存在 を検出することにより、 腫瘍を診断することが可能である。 ここで用いる本発明タ ンパク質およびべプチドの製造法については、 前記 1)および 2)の項で述べたとおり である。
具体的には、 患者の血液を採取するか、 若しくは腫瘍が疑われる被験組織をバイ ォプシ等で採取し、 そこから常法に従ってタンパク質を調製して、 例えばゥエスタ ンブロット法、 ELISA法など公知の検出方法において、 上記本発明タンパク質また はペプチドを常法に従ってプローブとして使用することによって、 PBFに対する抗 体を検出することができる。 腫瘍の診断に際しては、 被験者組織における抗 PBF抗体の量と正常な対応組織に おける抗 PBF抗体の量の違いを判定すればよい。 この場合、 タンパク量の違いには 、 タンパクのある/なし、 あるいはタンパク量の違いが 2倍以上、 好ましくは 3倍以 上の場合が含まれる。 具体的には PBF遺伝子は腫瘍（肉腫、 腎癌） で発現誘導を示す ので、 被験者組織で該遺伝子の発現産物 （PBF) に対する抗体が存在しており、 こ の抗 PBF抗体の量が正常な組織での抗 PBF抗体量と比べて 2倍以上、 好ましくは 3倍以 上多いことが判定されれば、 腫瘍の罹患が疑われる。
④ HLAテトラマーに関する腫瘍マーカー
本発明はまた、 本発明のペプチドと HLA抗原とを含有する HLAテトラマー、 および 当該 HLAテトラマーからなる腫瘍マーカーを提供する。
ここで HLAテトラマーとは、 HLA抗原の α鎖と ]3 2ミクログロブリンをペプチド （ 抗原ペプチド） と会合させた複合体 （HLAモノマー） をビォチン化し、 アビジンに 結合させることにより 4量体化したものを指す （Science 279： 2103-2106 (1998)、 Science 274： 94-96 (1996) )。 現在では種々の抗原ペプチドを含有する HLAテトラ マーが市販されており （例えば (株）医学生物学研究所） 、 本発明のペプチドと HLA 抗原とを含有する HLAテトラマーを容易に作製することができる。
具体的には、 例えば配列番号： 6〜45のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる 腫瘍抗原べプチドと HLA-A24抗原とを含有する HLAテトラマー、 または、 配列番号： 46〜55のいずれかに記載のァミノ酸配列からなる腫瘍抗原ぺプチドと HLA-B55抗原 とを含有する HLAテトラマーが挙げられる。
当該 HLAテトラマーは、 フローサイ トメ トリー、 蛍光顕微鏡等の公知の検出手段 により結合した CTLを容易に選別または検出することが出来るように蛍光標識され ていることが好ましい。 具体的には、 例えばフィコエリスリン （PE) 、 フルォレセ インイソチオシァネート （FITC) 、 ペリジニンクロロフィルプロテイン （PerCP) などにより標識された HLAテトラマーが挙げられる。
HLAテトラマーの成分である HLA- A24抗原 （HLA- A24抗原の α鎖） は、 Cancer Res. ， 55 : 4248-4252 (1995)および Genbank Accession No. M64740に開示されている HL A- A2402遺伝子の公知の塩基配列の情報に基づき、 PCR法等の常法により容易にク口 一二ングすることができる。 また HLA- B55抗原の場合も、 HLA- B5502遺伝子 （GenBan k Acc. No. 77777, J. Immunol. , 148 (4) , 1155-1162 (1992) ) の公知の塩基配列の情 報に基づきクローニングすることができる。
HLAテトラマーの成分である 0 2ミクログロブリンは、 ヒ ト由来の /3 2ミクログロ ブリンが好ましレ、。 当該ヒト ]3 2ミクログロブリンは GenBank Acc. No. AB021288 に開示されているヒ ト /3 2ミクログロブリンの公知の塩基配列情報に基づき、 PCR法 等の常法により容易にクローニングすることができる。
以上の HLAテトラマーの成分を含有する HLAテトラマーの作製法については、 文献 (Science 279 : 2103-2106 (1998)、 Science 274： 94-96 (1996)等） により周知で あるが、 HLA - A24抗原を例にとり簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、 HLA- Α24 α鎖発現べクタ 一および) 3 2ミクログロプリン発現ベクターを導入し発現させる。 ここでは大腸菌 (例えば BL21) を用いることが好ましい。 得られた単量体 HLA-A24複合体と本発明 ペプチドとを混合し、 可溶性の HLA-ペプチド複合体を形成させる。 次に HLA-ぺプチ ド複合体における HLA- Α24 α鎖の C末端部位の配列を BirA酵素によりピオチン化する 。 このピオチン化された HLA-ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを 4： 1の モル比で混合することにより、 HLAテトラマーを調製することができる。 なお、 前 記各ステップにおいて、 ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。 ⑤腫瘍の検出方法 （診断方法）
本発明は、 前述した本発明腫瘍マーカーを利用した腫瘍の検出方法 （診断方法） を提供するものである。
具体的には、 本発明の検出方法 （診断方法） は、 被験者の血液を採取するか、 若 しくは腫瘍が疑われる被験組織の一部をバイォプシ等で採取し、 そこに含まれる PB F遺伝子の遺伝子発現レベル、 これらの遺伝子に由来する PBFタンパク質の量、 当該 PBFに対する抗体の量、 若しくは PBF由来の腫瘍抗原べプチドと HLA抗原との複合体 を認識する CTLの量を、 検出 ·測定することにより、 肉腫ゃ腎癌等の腫瘍の罹患の 有無またはその程度を診断するものである。 また本発明の検出 （診断） 方法は、 例 えば腫瘍患者において、 該腫瘍の改善のために治療薬を投与した場合における、 該 疾患の改善の有無またはその程度を検出 （診断） することもできる。 さらに本発明 の検出 （診断)方法は、 本発明のタンパク質、 ペプチドまたは核酸を有効成分とす る医薬の適応可能な腫瘍患者の選択や、 当該医薬による治療効果の判定などにも利 用できる。
本発明の検出方法は次の（a)、 （b)及び (c)の工程を含むものである ：
(a) 被験者の生体試料と本発明の腫瘍マーカーを接触させる工程、
(b) 生体試料中の PBF遺伝子発現レベル、 PBFタンパク質量、 抗 PBF抗体量、 または!3 BF由来の腫瘍抗原べプチドと HLA抗原との複合体を認識する CTLの量を、 上記腫瘍マ 一力一を指標として測定する工程、
(c) (b)の結果をもとに、 腫瘍の罹患を判断する工程。
ここで用いられる生体試料としては、 被験者の生体組織 （腫瘍が疑われる組織及 びその周辺組織、 または血液など） から調製される試料を挙げることができる。 具 体的には、 該組織から調製される RNA含有試料、 若しくはそれからさらに調製され るポリヌクレオチドを含む試料、 または上記組織から調製されるタンパク質、 抗体 を含む試料、 あるいは上記組織から調製される末梢血リンパ球を含む試料を挙げる ことができる。
本発明の診断方法は、 測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、 具体的に は下記のようにして実施される。
(©-1) 測定対象の生体試料として RNAを利用する場合
測定対象物として R Aを利用する場合、 腫瘍の検出は、 具体的に下記の工程 (a)、
(b)及び (c)を含む方法によつて実施することができる ：
(a)被験者の生体試料から調製された RNAまたはそれから転写された相補的ポリヌク レオチドと、 前記本発明の腫瘍マーカー （本発明のポリヌクレオチドの塩基配列に おいて連続する少なくとも 15塩基を含有するポリヌクレオチド及び/又は該ポリヌ クレオチドに相補的なポリヌクレオチド） とを結合させる工程、
(b)該腫瘍マーカーに結合した生体試料由来の RNAまたは該 RNAから転写された相補 的ポリヌクレオチドを、 上記腫瘍マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、 腫瘍の罹患を判断する工程。
測定対象物として R Aを利用する場合は、 本発明の検出方法 （診断方法） は、 該 R NA中の PBF遺伝子の発現レベルを検出し、 測定することによって実施される。 具体 的には、 前述のポリヌクレオチドからなる本発明の腫瘍マーカー （本発明のポリヌ クレオチドの塩基配列において連続する少なくとも 15塩基を含有するポリヌクレオ チド及び/又はその相補的なポリヌクレオチド） をプライマーまたはプローブとし て用いて、 ノーザンブロット法、 R T- P C R法、 D N Aチップ解析法、 in situハ イブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
ノーザンプロット法を利用する場合は、 本発明の上記腫瘍マーカーをプローブと して用いることによって、 RNA中の PBF遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出 、 測定することができる。 具体的には、 本発明の腫瘍マーカー （相補鎖） を放射性 同位元素 （3 2 P、 3 3 Pなど： RI) や蛍光物質などで標識し、 それを、 常法に従ってナ イロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来の RNAとハイブリ ダイズさせた後、 形成された腫瘍マーカー （DNA) と RNAとの二重鎖を、 重瘍マーカ 一の標識物 （RI若しくは蛍光物質） に由来するシグナルを放射線検出器 （BAS- 1800 II、 富士フィルム社製） または蛍光検出器で検出、 測定する方法を例示することが でさる。 また、 AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham Phar macia Biotech社製）を用いて、 該プロ トコールに従って腫瘍マーカー （プローブ DN A) を標識し、 被験者の生体組織由来の RNAとハイブリダィズさせた後、 腫瘍マーカ 一の標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージヤー ST0RM860 (Amersham P harmacia Biotech社製） で検出、 測定する方法を使用することもできる。
RT-PCR法を利用する場合は、 本発明の上記腫瘍マーカーをプライマーとして用い ることによって、 RNA中の PBF遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、 測定するこ とができる。 具体的には、 被験者の生体組織由来の R Aから常法に従って cDNAを調 製して、 これを铸型として標的の PBF遺伝子の領域が増幅できるように、 本発明の 腫瘍マーカーから調製した一対のプライマー （上記 c D NA (—鎖） に結合する正 鎖、 +鎖に結合する逆鎖） をこれとハイブリダィズさせて、 常法に従って P C R法 を行い、 得られた増幅二本鎖 D N Aを検出する方法を例示することができる。 なお 、 増幅された二本鎖 D N Aの検出は、 上記 P C Rを予め RIや蛍光物質で標識してお いたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖 D N Aを検出する 方法、 産生された二本鎖 D NAを常法に従ってナイロンメンプレン等にトランスフ ァーさせて、 標識した腫瘍マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダィ ズさせて検出する方法などを用いることができる。 なお、 生成された標識二本鎖 D N A産物はアジレント 2100バイオアナライザ （横河アナリティカルシステムズ社製 ) などで測定することができる。 また、 SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Bi osystems 社製）で該プロトコールに従って RT- PCR反応液を調製し、 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosysteras 社製)で反応させて、 該反 物 を検出することもできる。
D N Aチップ #析を利用する場合は、 本発明の上記腫瘍マーカーを D N Aプロ一 ブ （1本鎖または 2本鎖） として貼り付けた D N Aチップを用意し、 これに被験者 の生体組織由来の RNAから常法によつて調製された cRNAとハイブリダイズさせて、 形成された DNAと cRNAとの二本鎖を、 本発明の腫瘍マ一カーから調製される標識プ ローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。
(⑤ -2) 測定対象の生体試料としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合は、 本発明の腫瘍の検出方法 （診断方 法） は、 生体試料中の PBFを検出し、 その量を測定することによって実施される。 具体的には下記の工程 (a)、 （b)及び (c)を含む方法によつて実施することができる ：
(a)被験者の生体試料から調製されたタンパク質と抗体に関する本発明の腫瘍マー カー （PBFを認識する抗体） とを結合させる工程、
(b)該腫瘍マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、 上記腫瘍マーカーを 指標として測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、 腫瘍の罹患を判断する工程。
より具体的には、 本発明の腫瘍マーカーとして抗体 （PBFを認識する抗体） を用 いて、 ウェスタンプロット法などの公知方法で PBFを検出、 定量する方法を挙げる ことができる。
ウェスタンプロット法は、 一次抗体として本発明腫瘍マーカーを用いた後、 二次 抗体として1 2 5 Iなどの放射性同位元素、 蛍光物質、 ホースラディッシュペルォキ シターゼ （HRP) などの酵素等で標識した標識抗体 （一次抗体に結合する抗体） を 用い、 得られる標識化合物の放射性同位元素、 蛍光物質などに由来するシグナルを 放射線測定器 （BAS-1800II：富士フィルム社製など） 、 蛍光検出器などで検出し、 測定することによって実施できる。 また、 一次抗体として本発明腫瘍マーカーを用 いすこ後、 ECL Plus Western Blotting Detction System (アマシャム ファノレマシ ァバイオテク社製）を用いて、 該プロトコールに従って検出し、 マルチバイオィメ ージャ一 ST0RM860 (アマシャム フアルマシアバイオテク社製）で測定することもで さる。
(⑤ -3) 測定対象の生体試料として抗体を用いる場合
測定対象物としてタンパク質中に存在する抗体を用いる場合は、 本発明の腫瘍の 検出方法 （診断方法） は、 生体試料中の抗 PBF抗体を検出し、 その量を測定するこ とによって実施される。 具体的にはタンパク質またはペプチドに関する本発明の腫 瘍マーカーを用い、 前記 （⑤- 2) と同様の手法にて行うことができる。
(⑤- 4) 測定対象の生体試料として腫瘍抗原特異的 CTLを用いる場合
測定対象物として末梢血リンパ球中に存在する腫瘍抗原特異的 CTLを用いる場合 は、 本発明の腫瘍の検出方法 （診断方法） は、 生体試料中の PBF特異的 CTLを検出し 、 その量を測定することによって実施される。 具体的には、 文献 （Science, 274: p9 4, 1996) に記載の方法に従って蛍光標識した HLA抗原と本発明のぺプチドとの複合 体の 4量体 （HLAテトラマー） を作製し、 これを用いて腫瘍が疑われる患者の末梢血 リンパ球中の抗原べプチド特異的 CTLをフローサイ トメ一ターにより定量すること により行うことができる。
(⑤- 5)腫瘍の診断
腫瘍の診断は、 例えば、 被験者の血液や腫瘍が疑われる被験組織における PBF遺 伝子の遺伝子発現レベル、 これらの遺伝子の発現産物である PBFタンパク質の量、 抗 PBF抗体の量、 または PBF特異的 CTLの量を測定することにより行うことができる 。 その際、 場合によっては正常な対応組織における当該遺伝子発現レベルまたは当 該タンパク質レベル等と比較し、 両者の違いを判定することによって行うことがで きる。
ここで被験者の被験組織と正常な対応組織との遺伝子、 タンパク質、 抗体、 また は CTLの量 （レベル） の比較は、 被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とし た測定を並行して行うことで実施できる。 並行して行わない場合は、 複数 （少なく とも 2つ、 好ましくは 3以上、 より好ましくは 5以上） の正常な組織を用いて均一 な測定条件で測定して得られた PBF遺伝子の遺伝子発現レベル、 PBFの量、 抗 PBF抗 体の量、 または PBF特異的 CTLの量の平均値または統計的中間値を、 正常者の値とし て、 比較に用いることができる。
被験者が、 腫瘍であるかどうかの判断は、 例えば該被験者の組織における PBF遺 伝子の遺伝子発現レベル、 PBFの量、 抗 PBF抗体の量、 または PBF特異的 CTLの量が、 正常者のそれらのレベルと比較して 2倍以上、 好ましくは 3倍以上多いことを指標 として行うことができる。 実施例
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例によ りなんら限定されるものではない。
実施例 1
骨肉腫細胞株とそれに対する細胞傷害性 T細胞 （CTL) の樹立
骨肉腫患者より生検で取り出された骨肉腫組織から、 骨肉腫細胞株を樹立し、 OS 2000と命名した。 同じ骨肉腫患者より採取した血液から、 Lymphoprep (Nycomed社） を用いた比重遠心法により末梢血単核球を回収し、 放射線照射して不活化した OS20 00を 10日おきに 6回添加して、 刺激を加えながら培養した。 その後、 抗 CD8抗体を結 合した磁気ビーズ （Macs, Miltenyi社） を用いて CD8陽性の細胞を濃縮し、 限界希 釈法を用いて CTL株の樹立を行った （Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng . J. Med, 333, 1038-1044, 1995) 。 OS2000に対する細胞傷害活性を指標に選別を 行い、 3種類の CTLを得た。 その中から TcOS2000cl-303と命名された CTLを用いてそ の後の実験を行った。 0S2000の HLAクラス I分子のタイプは、 HLA- A* 2402、 -B* 5502 、 _B40、 Cwlであることを確認した。
実施例 2
新規な腫瘍抗原タンパク質遺伝子のスクリーニング
1) HLA- B55遺伝子導入細胞を用いたスクリーニング
OS2000から First track (Invitrogen社）を用いて mR Aを調製した。 次にこの mR Aをもとにして、 Superscript Choice System for cDNA Synthesis (Gibco - BRL社) を用いて c DNAを作製し、 これを発現ベクター PCEP4 (Invitrogen社）に組み込んで c DNAライブラリーを調製した。 また、 OS2000細胞から PCRにより単離した HLA- B* 5502遺伝子 （GenBank Acc. No. M7 7777、 J. Immunol. , 148 (4) , 1155-1162 (1992) ) を 293- EBNA細胞（Invitrogen社）に導 入した細胞 293- EBNA-B55を準備した。
第 1回目のスクリーニングとして以下の操作を行った。 293-EBNA- B55細胞を 96ゥ エルマイクロプレートにゥエル当たり 8 X 104個加え、 約 100個の cDNAクローンのプ 一/レ（100〜200 μ g)を、 Lipofection法 (Lipofectamine 2000, Invitrogen社） tこよ り遺伝子導入した。 遺伝子導入に用いた c DNAクローンのプールは別に保存してお いた。 24時間後に TcOS2000cl-303細胞を 8 X 104個加えてさらに 24時間後に培養上清 を回収し、 LDH Cytotoxicity Detection Kit (タカラバイオ） を用い、 細胞傷害に より遊離した LDHを定量して、 CTLの反応性を調べた。 1000個のゥエルから最も強い CTL反応性が得られたゥエル 1B9を選択した。 次に 1B9の遺伝子導入に用いた c DNAク ローンプールから調製した 400個の cDNAから 80個の c DNAクローンプール （プール当 たり 8〜12の c DNAクローンを含む） を用意し、 上記と同様に 293-EBNA-B55細胞に c DNAクローンプールを遺伝子導入し、 TcOS2000cl-303細胞の反応性を指標に第 2 回目のスクリーニングを行った。 その結果、 20ゥエルに反応性が認められた。 さら に 20ゥェノレの cDNAクローンプールからゥエル当たり 1クローンの cDNAとして上記と 同様に 293- EBNA-B55細胞に c DNAクローンを遺伝子導入し、 Tc0S2000cl-303細胞の 反応性を指標に第 3回目のスクリーニングを行った。 その結果 4ゥエルに反応性が認 められた。 4ゥエルの c DNAの塩基配列を解析したところ、 同じ c DNAを含んでいる ことが明らかとなった。 この cDNAクローンを 1B9. 1H4と命名した。
2) HLA- A24遺伝子導入細胞を用いたスクリ一二ング
先の HLA-B* 5502遺伝子の場合と同様にして、 HLA-A* 2402遺伝子 （Cancer Res. , 55 : 4248-4252 (1995)、 GenBank Accession No. 64740) を 293- EBNA細胞（Invitrogen 社）に導入した細胞 293- EBNA- A24を準備した。 先の 293-EBNA- B55細胞を用いたスク リーエングと同様にスクリーニングを行い、 第 1回目のスクリーニングで選択した ゥエル 2E4から、 第 2回目のスクリーニングで 22個の反応性のゥエルが得られ、 第 3回目のスクリーニングで 4ゥエルが選ばれた。 4ゥエルの c DNAの塩基配列を解析 したところ、 HLA-B* 5502で選ばれた cDNAクローン 1B9. 1H4と同じ c DNAを含んでいる ことが明らかとなった。 3) cDNAクローン 1Β9· 1H4の解析
1B9. 1H4の cDNAを、 293- EBNA- B55または 293- EBNA- A24に導入して発現させた時の T cOS2000cl-303の反応性を、 前述の LDHリリースアツセィ （遊離 LDHの定量） により 測定した結果を図 1に示す。 また Tc0S2000cl- 303の反応性を5 1 Crリリースアツセィ (J. Immunol.， 159 : 4753, 1997) により測定した結果を図 2 (A、 B)に示す。 TcOS2000c
1-303は、 c DNAクローン 1B9. 1H4を導入して発現させた細胞を認識し、 特異的に傷 害活性を示した。 このことより、 c DNAクローン 1B9. 1H4は、 TcOS2000cl - 303が認識 する腫瘍抗原タンパク質の遺伝子をコードしていることが明らかとなった。
cDNAクローン 1B9. 1H4につレヽて BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reac tion Kit (Applied Biosystems社）を使用して塩基配列を決定した。 決定された塩 基配列を、 配列表の配列番号： 3に示す。 該 cDNAの全長は 1901塩基対であった。 配 列番号： 3に記載した塩基配列を、 公共のデータベースを使用して既知の配列と比 較した結果、 該 cDNAは、 GenBank Accession No. AF263928として登録されているパ ピロ一マウイノレス結合因子（Papillomavirus binding factor： PBF、 また Papilloma virus regulatory factor :PRF - 1とも称する） （Virology 293, 103- 117 (2002) ) と大 部分が同じ塩基配列を有していた。 当該 PBFの塩基配列を配列番号： 1に、 また対応 するアミノ酸配列を配列番号： 2に、 それぞれ示す。
次に、 PBF自身が先の 1B9. 1H4と同様の腫瘍抗原タンパク質活性 （CTL反応性） を 有するか否かを検討した。 まず、 0S2000細胞から抽出した R Aから cDNAを調製し、 配列番号： 4および配列番号： 5に示すプライマーを用いて PCRを行い、 PBFの cDNAを 増幅した。 増幅断片を発現ベクター pCEP4に組み込んで作製された PBF遺伝子発現べ クタ一を、 先の 293-68 -855または293-£8^-八24に導入して発現させた時の1(：0520 OOcl-303の反応性を、 LDHリリースアツセィにより測定した。 結果を図 3及び図 4に 示す。 図より明らかなように、 Tc0S2000cl- 303は、 PBF遺伝子発現ベクターを導入 して発現させた細胞に対しても傷害活性を示した。 このことより、 PBFは TC0S2000 cl-303が認識する腫瘍抗原タンパク質であることが明らかとなった。
実施例 3
HLA-B* 5502に結合する杭原ぺプチドの同定
腫瘍抗原タンパク質 PBFのァミノ酸配列 （配列番号： 2) を元にして種々のぺプチ ドを合成し、 Tc0S2000cl- 303の反応性を指標にして、 HLA- B* 5502に結合する抗原べ プチド領域の同定を試みた。 配列番号： 2の 499位〜 510位からなるぺプチド： Cys Thr Ala Cys Arg Trp Lys Lys Ala Cys Gin Arg (配列番号： 46) ImMで 1時間パル スした 8 X 104個の 293- EBNA- B55細胞を、 4 X 104個の TcOS2000cl_303細胞と混合培養 し、 実施例 2に記載の方法と同様に LDHリリースアツセィにより反応性を調べた。 結 果を図 5に示す。 TcOS2000cl-303細胞は、 ペプチドをパルスしていなレ、293_EBNA_B5 5細胞には反応しなかったが、 配列番号： 46のぺプチドをパルスした 293- EBNA-B55細 胞に対しては反応した。 よって、 配列番号: 46のペプチドは HLA-B* 5502に結合する 抗原ぺプチド領域を含んでレ、ることが明らかとなった。
実施例 4
各種細胞や組織での PBF遺伝子の発現解析
腫瘍抗原タンパク質 PBFをコードする遺伝子の各種細胞や組織での発現を、 RT-PC R法により解析した。 各細胞から Isogen ragent (Nippon Gene)を用いて抽出した RN Aをもとに、 オリゴ dTプライマーを用いて c DNAを調製し、 配列番号： 4および配列 番号： 5に示すプライマーを用いて PCRを行い、 PBFの cDNAを増幅した。 その後、 こ の増幅遺伝子を電気泳動で分離し、 解析した。 陽性コントロールとして GPDH遺伝子 の発現を、 前記と同様に RT- PCR法を行い確認した。 結果を図 6に示す。 PBF遺伝子は 正常末梢血リンパ球ゃスクリ一ユングに使用した 293-EBNA細胞では発現が認められ なかったが、 OS2000を含む多くの肉腫由来の細胞で発現が確認された。
実施例 5
腎癌組織での PBF遺伝子の発現解析
腫瘍抗原タンパク質 PBFをコードする遺伝子の腎癌組織と正常腎組織での発現を 、 DNAチップを用いて解析した。 DNAチップ解析は W0 03/048359号公報等に記載の 常法により行った。 その結果、 腎癌組織 91例の発現量の中央値が 780であったのに 対し、 正常腎組織 67例の発現量の中央値は 89であり、 腎癌組織では癌特異的に約 8. 7倍 PBF遺伝子の発現が増加していることが示された。
実施例 6
HLA_A* 2402に結合する抗原べプチドの同定
腫瘍抗原タンパク質 PBFのアミノ酸配列 （配列番号： 2) 中、 HLA- A24結合性のモ チーフ構造を有するペプチドである配列番号： 6、 7、 8、 10、 26、 27、 28、 29、 30 および 32に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドを合成した。 TcOS2000cl- 303の反 応性を指標にして、 HLA-A* 2402に結合する抗原ペプチドの同定を試みた。 前記いず れかのぺプチドをパルスした 293-EBNA-A24細胞を TcOS2000cl-303細胞と混合培養し 、 実施例 2に記載の方法と同様に LDHリリースアツセィにより反応性を調べることに より、 HLA-A* 2402に結合する抗原べプチドを同定することができる。 産業上の利用可能十生
本発明により、 腫瘍抗原タンパク質 PBFおよびその遺伝子の、 CTLの誘導剤として の用途などが提供される。 本発明の CTLの誘導剤は、 肉腫ゃ腎癌等の患者を処置す ることができる。

Claims

請求の範囲
1. 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質を有効成分として含有してなる、 細胞傷害性 T細胞 （以 下、 CTL) の誘導剤。
2. 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質の部分ぺプチドであって、 かつ HL A抗原と結合して C T Lにより認識されるぺプチド。
3. HLA抗原が HLA— A 24または HLA— B 55である、 請求項 2記載 のぺプチド。
4. 配列番号： 6〜配列番号： 46のいずれかに記載のァミノ酸配列を含有す る、 請求項 3記載のペプチド。
5. 配列番号： 6〜配列番号： 45のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2位 のアミノ酸をチロシン、 フエ二ルァラニン、 メチォニンまたはトリプトファンに置 換し、 及びノ又は C末端のアミノ酸をフエ二ルァラニン、 ロイシン、 イソロイシン 、 トリブトファンまたはメチォニンに置換したアミノ酸配列を含有する、 請求項 3 記載のぺプチド。
6. 請求項 2〜 5のいずれかに記載のぺプチドを含有するェピトープぺプチド 7. 請求項 2〜6のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有してなる
CTLの誘導剤。
8. 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸を含有し てなる、 CTLの誘導剤。
9. ポリヌクレオチドが配列番号： 1、 配列番号： 1の第 337位〜第 187
8位、 または配列番号： 3に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドである、 請求項 8記載の C T Lの誘導剤。
10. 請求項 2〜 6のいずれかに記載のぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチ ドを含有する核酸。
1 1. 請求項 1 0記載の核酸を含有してなる CTLの誘導剤。
1 2. 以下の （a) 〜 （d) ：
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するタンパク質、
(b) 上記 （a) 記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸
(c) 請求項 2〜 6のいずれかに記載のペプチド、 および
(d) 上記 （c) 記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、 のいずれかと、 抗原提示能を有する細胞とをイン · ビトロで接触させることを特徴 とする、 抗原提示細胞の製造方法。
1 3. 請求項 1 2記載の製造方法により製造される抗原提示細胞。
14. 以下の （a) 〜 （d) ：
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するタンパク質、
(b) 上記 （a) 記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸
(c) 請求項 2〜 6のいずれかに記載のペプチド、 および
(d) 上記 （c) 記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、 のいずれかと、 末梢血リンパ球とをイン · ビトロで接触させることを特徴とする、 CTLの誘導方法。
1 5. 請求項 14記載の誘導方法により誘導される CTL。
1 6. 請求項 2〜 5のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
1 7. 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質をコ一ドするポリヌクレオチドの塩基配列において、 連続する少なくとも 1 5塩基を含有するポリヌクレオチド及び Zまたは該ポリヌク レオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる腫瘍マーカー。
1 8. 配列番号： 1または配列番号： 3に記載の塩基配列において、 連続する 少なくとも 1 5塩基を含有するポリヌクレオチド及び _ または該ポリヌクレオチド に相補的なポリヌクレオチドからなる、 請求項 1 7記載の腫瘍マーカー。
1 9 . 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質のアミノ酸配列において、 連続する少なくとも 8アミ ノ酸を含有するポリべプチドからなる腫瘍マーカー。
2 0 . 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列において、 連続する少なくとも 8ァ ミノ酸を含有するポリペプチドからなる、 請求項 1 9記載の腫瘍マーカ一。
2 1 . 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質に対する抗体、 若しくは請求項 1 6に記載の抗体から なる腫瘍マーカー。
2 2 . 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体か らなる、 請求項 2 1記載の腫瘍マーカー。
2 3 . 請求項 2〜 5のいずれかに記載のぺプチドと H L A抗原とを含有する H L Aテトラマー。
2 4 . 請求項 2 3記載の H L Aテトラマーからなる腫瘍マーカー。
2 5 . 腫瘍が肉腫または腎癌である、 請求項 1 7 ~ 2 2および請求項 2 4のい ずれかに記載の腫瘍マーカー。
2 6 . 請求項 1 7〜 2 2、 請求項 2 4および請求項 2 5のいずれかに記載の腫 瘍マーカーを含有してなる腫瘍の診断薬。
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