JPWO2014157704A1 - Ｅｒａｐ１によるトリミング機能をきっかけとしたコンジュゲートワクチン - Google Patents

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Abstract

本発明は、式（１）：［式中、ＸaおよびＹaは単結合などを表し、癌抗原ペプチドＡはＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドを表し、Ｒ1は、水素原子、式（２）：（式中、ＸbおよびＹbは単結合などを表し、癌抗原ペプチドＢは、癌抗原ペプチドＡとは異なり且つＭＨＣクラスＩまたはＩＩ拘束性癌抗原ペプチドを表す。）で表される基、式（３）：（式中、ＸcおよびＹcはは単結合などを表し、癌抗原ペプチドＣは、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドを表す。）で表される基、または癌抗原ペプチドＤを表し、癌抗原ペプチドＤは、１つのシステイン残基を含むＭＨＣクラスＩまたはＩＩ拘束性癌抗原ペプチドを表す。］で表される化合物またはその塩などを提供する。

Description

本発明は、癌免疫療法の分野に属し、特定のペプチド分解酵素によりトリミングを受け得る、癌抗原ペプチド前駆体を硫黄−硫黄共有結合を介して複合化した、細胞傷害性Ｔ細胞を効率的に誘導する複合化（コンジュゲート）ワクチンに関する。
生体による癌細胞の排除には、主として細胞性免疫、特に細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ。以下、ＣＴＬと称する）が重要な働きをしている。ＣＴＬは、癌抗原タンパク質由来の抗原ペプチド（癌抗原ペプチド）とＭＨＣクラスＩ分子により形成される複合体を認識した前駆体Ｔ細胞が分化増殖して生成されるものであり、癌細胞を攻撃する。ＭＨＣは、ヒトではヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）と呼ばれ、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃｗ、ＦおよびＧなどが知られている。
癌抗原ペプチドは、癌細胞内で合成された癌抗原タンパク質の分解（プロセシング）、すなわち、硫黄−硫黄共有結合の還元によるタンパク質の変性、プロテオソームまたはプロテアーゼによる分解、小胞体内のトリミング酵素により最適な長さへの切断を経て生成されるペプチドであり、一般には８〜１２残基のアミノ酸から成る。
癌免疫療法においてヘルパーＴ細胞（ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ）の活性化も、ＣＴＬを含む他のＴ ｃｅｌｌの機能亢進に重要である。一般的に、抗原タンパク質は細胞内リソソームで分解され、１３〜１７残基程度のアミノ酸からなるペプチドで構成される断片ペプチドの一部が、抗原ペプチドとしてＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌのＴＣＲ・ＣＤ３複合体へ提示されることでｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌを活性化する。ヒトでは、ＨＬＡとしてＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱおよびＤＰなどが知られている。
癌ワクチンの抗原として主に癌抗原タンパク質そのものまたは癌抗原タンパク質由来の抗原ペプチドが用いられる（非特許文献１参照）。タンパク質を用いた癌ワクチンは、通常多様な癌抗原ペプチドを含むため、複数のＣＴＬやｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌを同時に誘導可能である。しかし、安定した供給やその品質管理に課題を有する。一方、ペプチドを用いた癌ワクチンは、簡便に製造・品質管理が可能であるものの、主に単一のＭＨＣクラスＩ提示ペプチド抗原で構成されており、ＣＴＬを効率良く誘導するには、更なる改良が必要である事が近年指摘されている（非特許文献２参照）。
その解決策の一つとして、多価抗原ペプチド提示型ペプチド癌ワクチンが挙げられる。このようなペプチド癌ワクチンとしては、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩに提示されるペプチド抗原を複数混合したカクテルワクチン、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩに提示されるペプチド抗原をアミド結合で連結した長鎖ペプチドワクチンなどが報告されている（非特許文献２参照）。しかし、カクテルワクチンの場合、多様なアミノ酸から組成された各ペプチド抗原が様々な物性を示すため、効率良くそれらに対応するＣＴＬを誘導する最適な製剤の開発が困難である場合が多い。また、長鎖ペプチドワクチンの場合、タンパク質と同様にその製造に課題を抱える場合があり、さらに、長鎖ペプチドワクチンはクラスＩおよびクラスＩＩに提示されるペプチド抗原を任意のペプチドスペーサーを介して結合するため細胞内酵素による切断部位の制御および予測が困難である。一方で、２つのペプチド単量体が相互にジスルフィド結合により結合しているペプチド二量体が報告されている（特許文献１参照）。これらは、カクテルワクチンと異なり、単一ペプチド２つが結合されているホモダイマーであるため、単一の物性を有しかつ簡便に製造可能である。その一方で、癌抗原ペプチドはそのアミノ酸配列内にシステインを含む必要があり、その汎用性は低い。
ＭＨＣクラスＩへの癌抗原ペプチド提示には複数のぺプチダーゼが関与する。それらペプチダーゼの内、Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ １（以下、ＥＲＡＰ１と称する）は、小胞体（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ。以下、ＥＲと称する）内のトリミング酵素の一つであり、特定の抗原ペプチド配列およびペプチドの長さを認識し、癌抗原ペプチド前駆体をＮ−末端から切断し、ＭＨＣクラスＩへの結合に最適な長さに調節することが報告されている（非特許文献３参照）。しかし、これまでに、ＥＲＡＰ１によるトリミング機能をきっかけとした複合化ワクチンの報告はなく、また、ＥＲＡＰ１が前駆体ペプチドからジシステインをＮ−末端から切断し、癌抗原ペプチドに変換することは報告されているものの、任意のアミノ酸配列中にシステインを含みＮ−末端へ導入した場合の影響は不明確であった（非特許文献３−６参照）。
国際公開第２００４／０６３２１７号
Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００９；８；６８５−６８６ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１１；１７（５）；３４３−３５０ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，２００５；１０２（４７）；１７１０７−１７１１２ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００８；３（１１）；ｅ３６５８；１−１２ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００９；１８３；５５２６−５５３６ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１０；１８４；４７２５−４７３２
本発明の課題は、ＣＴＬを効率良く誘導するコンジュゲートワクチンを提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、コンジュゲートワクチンを採用することを検討する中で、癌抗原ペプチドにシステインを付加することを着想し、さらにＥＲＡＰ１が、細胞内でのジスルフィド結合の還元的開裂により生じた多様な癌抗原ペプチドのＮ−末端から延長されたシステインなどを切断し、癌抗原ペプチドへ効率良く変換することが、ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルでの薬理試験などの結果により強く示唆されることを確認したことで、体内でＣＴＬを誘導できる多価抗原ペプチド提示型コンジュゲートワクチンを作成する発見に至り、本発明を完成した。
具体的には、上記課題の解決策を検討する過程で、異なる２つの癌抗原ペプチドを複合化する際に、必要なシステインを、ＭＨＣクラスＩへの抗原提示に影響することなく、Ｎ−末端またはＣ−末端へ任意の位置へ導入する方法を着想した。更なる検討の結果、癌抗原ペプチドのＮ末端にシステインを含む０〜５個のアミノ酸を導入したペプチドや、当該ペプチドのシステインを介したジスルフィド結合を含むコンジュゲート体を創製した。そして、当該ペプチドやコンジュゲート体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＥＲＡＰ１によるトリミングを受け易く、その結果癌抗原ペプチドを生成することを、本発明者らが初めて確認し、本発明が完成された。
製造容易で、汎用性に優れ、かつＣＴＬを効率良く誘導する新規な多価抗原ペプチド提示型ペプチド癌ワクチンの開発が望まれていたところ、本発明者らが発明したコンジュゲート体により、ＣＴＬが効率よく誘導され、物理化学的性質に優れ、製造が容易で、製造の管理も容易で、汎用性に優れた多価抗原ペプチド提示型ペプチド癌ワクチンを開発することが可能となった。
すなわち、本発明は、以下のものに関する。
項１．式（１）：
［式中、ＸaおよびＹaは、独立して、単結合または１〜４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基を表し、Ｘaのアミノ酸残基数とＹaのアミノ酸残基数の和は０〜４の整数であり、
癌抗原ペプチドＡは、７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドを表し、癌抗原ペプチドＡのＮ末端アミノ酸のアミノ基が式（１）中のＹaと結合し、癌抗原ペプチドＡのＣ末端アミノ酸のカルボニル基が式（１）中の水酸基と結合し、
Ｒ1は、水素原子、式（２）：
（式中、ＸbおよびＹbは、独立して、単結合または１〜４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基を表し、Ｘbのアミノ酸残基数とＹbのアミノ酸残基数の和は０〜４の整数であり、
癌抗原ペプチドＢは、癌抗原ペプチドＡとは配列が異なり且つ７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドまたは７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドを表し、癌抗原ペプチドＢのＮ末端アミノ酸のアミノ基が式（２）中のＹbと結合し、癌抗原ペプチドＢのＣ末端アミノ酸のカルボニル基が式（２）中の水酸基と結合し、
式（２）中のチオエーテル基が、式（１）中のチオエーテル基と結合する。）
で表される基、式（３）：
（式中、ＸcおよびＹcは、独立して、単結合または１〜４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基を表し、Ｘcのアミノ酸残基数とＹcのアミノ酸残基数の和は０〜４の整数であり、
癌抗原ペプチドＣは、７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドを表し、癌抗原ペプチドＣのＣ末端アミノ酸のカルボニル基が式（３）中のＸcと結合し、癌抗原ペプチドＣのＮ末端アミノ酸のアミノ基が式（３）中の水素原子と結合し、
式（３）中のチオエーテル基が、式（１）中のチオエーテル基と結合する。）
で表される基、または癌抗原ペプチドＤを表し、
癌抗原ペプチドＤは、１つのシステイン残基を含む７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドまたは１つのシステイン残基を含む７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドを表し、癌抗原ペプチドＤのシステイン残基のチオエーテル基が式（１）中のチオエーテル基と結合する。
但し、Ｒ1が水素原子である場合、式（１）で表される化合物の配列は癌抗原タンパク質の部分配列と同一ではない。］
で表される化合物、またはその薬学上許容される塩；
項２．Ｘaが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹaが単結合であるか、ＸaおよびＹaが独立して１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であるか、Ｘaが単結合であり且つＹaが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であるか、Ｘaが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹaが単結合であるか、Ｘaが単結合であり且つＹaが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であるか、またはＸaおよびＹaが単結合である、項１に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項３．Ｘaが単結合であり、Ｙaが単結合、アラニン残基、ロイシン残基またはメチオニン残基である、項１または２に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項４．Ｘaが単結合、アラニン残基、グリシン残基、セリン残基またはチロシン残基であり、Ｙaが単結合である、項１または２に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項５．ＸaおよびＹaが単結合である、項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項６．癌抗原ペプチドＡが７〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃｗ拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項７．癌抗原ペプチドＡが７〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ２９、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ４５、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ｂ５２、ＨＬＡ−Ｂ５３、ＨＬＡ−Ｃｗ２、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ｃｗ７、ＨＬＡ−Ｃｗ８またはＨＬＡ−Ｃｗ１６拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項８．癌抗原ペプチドＡが、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ａ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦＲ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＡＦＰ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ、Ｃａｓｐａｓｅ−８、ＣＤＫ−４、ＥＬＦ２、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、Ｍｙｏｓｉｎ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２、７０７−ＡＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＬｉｖｉｎおよびＳＹＴ−ＳＳＸからなる群から選ばれる癌抗原タンパク質由来のＭＨＣクラスＩ癌抗原ペプチドである、項１〜７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項９．癌抗原ペプチドＡが、以下のアミノ酸配列：
ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ （配列番号：３）、
ＥＹＬＱＬＶＦＧＩ （配列番号：１１）、
ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ （配列番号：１３）、
ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：１９）、
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ （配列番号：２６）、
ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ （配列番号：２７）、
ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ （配列番号：２９）、
ＬＩＹＲＲＲＬＭＫ （配列番号：３３）、
ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ （配列番号：４０）、
ＡＦＬＰＷＨＲＬＦ （配列番号：４１）、
ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：４３）、
ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ （配列番号：５０）、
ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：５３）、
ＡＹＩＤＦＥＭＫＩ （配列番号：６６）、
ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ （配列番号：８３）、
ＫＷＦＰＳＣＱＦＬＬ （配列番号：８４）および
ＧＹＤＱＩＭＰＫＫ （配列番号：８５）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであるか、または配列番号：３、１１、１３、１９、２６、２７、２９、３３、４０、４１、４３、５０、５３、６６、８３、８４および８５の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つＣＴＬ誘導活性を有するペプチドである、項１〜８のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項１０．癌抗原ペプチドＡが、以下のアミノ酸配列：
ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：１９）、
ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：４３）および
ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：５３）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、項１〜９のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項１１．Ｒ1が水素原子である、項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項１２．式（１）で表される化合物が、以下のアミノ酸配列：
ＣＡＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：８９）、
ＣＬＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：９０）、
ＣＭＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：９１）、
ＣＡＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：９２）、
ＣＬＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：９３）、
ＣＭＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：９４）、
ＣＡＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：９５）、
ＣＬＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：９６）および
ＣＭＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：９７）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、項１〜３および６〜１１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項１３．式（１）で表される化合物が、以下のアミノ酸配列：
ＣＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：９８）、
ＣＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：９９）および
ＣＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：１００）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項１４．Ｒ1が式（２）で表される基である、項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項１５．Ｘbが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹbが単結合であるか、ＸbおよびＹbが独立して１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であるか、Ｘbが単結合であり且つＹbが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であるか、Ｘbが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹbが単結合であるか、Ｘbが単結合であり且つＹbが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であるか、またはＸbおよびＹbが単結合である、項１〜１０および１４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項１６．Ｘbが単結合であり、Ｙbが単結合、アラニン残基、ロイシン残基またはメチオニン残基である、項１〜１０および１４〜１５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項１７．Ｘbが単結合または１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり、Ｙbが単結合である、項１〜１０および１４〜１５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項１８．ＸbおよびＹbが単結合である、項１〜１０および１４〜１７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項１９．癌抗原ペプチドＢが７〜１５残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜１０および１４〜１８のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項２０．癌抗原ペプチドＢが７〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃｗ拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜１０および１４〜１９のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項２１．癌抗原ペプチドＢが７〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ２９、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ４５、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ｂ５２、ＨＬＡ−Ｂ５３、ＨＬＡ−Ｃｗ２、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ｃｗ７、ＨＬＡ−Ｃｗ８またはＨＬＡ−Ｃｗ１６拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜１０および１４〜２０のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項２２．癌抗原ペプチドＢが、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ａ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦＲ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＡＦＰ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ、Ｃａｓｐａｓｅ−８、ＣＤＫ−４、ＥＬＦ２、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、Ｍｙｏｓｉｎ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２、７０７−ＡＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＬｉｖｉｎおよびＳＹＴ−ＳＳＸからなる群から選ばれる癌抗原タンパク質由来のＭＨＣクラスＩ癌抗原ペプチドである、項１〜１０および１４〜２１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項２３．癌抗原ペプチドＢが、以下のアミノ酸配列：
ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ （配列番号：３）、
ＥＹＬＱＬＶＦＧＩ （配列番号：１１）、
ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ （配列番号：１３）、
ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：１９）、
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ （配列番号：２６）、
ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ （配列番号：２７）、
ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ （配列番号：２９）、
ＬＩＹＲＲＲＬＭＫ （配列番号：３３）、
ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ （配列番号：４０）、
ＡＦＬＰＷＨＲＬＦ （配列番号：４１）、
ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：４３）、
ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ （配列番号：５０）、
ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：５３）、
ＡＹＩＤＦＥＭＫＩ （配列番号：６６）、
ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ （配列番号：８３）、
ＫＷＦＰＳＣＱＦＬＬ （配列番号：８４）および
ＧＹＤＱＩＭＰＫＫ （配列番号：８５）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであるか、または配列番号：３、１１、１３、１９、２６、２７、２９、３３、４０、４１、４３、５０、５３、６６、８３、８４および８５の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つＣＴＬ誘導活性を有するペプチドである、項１〜１０および１４〜２２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項２４．癌抗原ペプチドＢが、以下のアミノ酸配列：
ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：１９）、
ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：４３）および
ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：５３）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、項１〜１０および１４〜２３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項２５．式（１）で表される化合物が、式（４）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、または式（５）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物である、項１〜１０および１４〜２４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項２６．Ｘbがシステイン残基を含む２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹbが単結合であるか、またはＸbが単結合であり且つＹbがシステイン残基を含む２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、Ｘbのシステイン残基中のチオエーテル基またはＹbのシステイン残基中のチオエーテル基が、式（２０）：
（式中、ＸeおよびＹeは、独立して、単結合または１〜４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基を表し、Ｘeのアミノ酸残基数とＹeのアミノ酸残基数の和は０〜４の整数であり、
癌抗原ペプチドＥは、７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドを表し、癌抗原ペプチドＥのＣ末端アミノ酸のカルボニル基が式（２０）中のＸeと結合し、癌抗原ペプチドＥのＮ末端アミノ酸のアミノ基が式（２０）中の水素原子と結合する。）
中のチオエーテル基と結合している、項１〜１０、１４〜１５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項２７．ＸbがＣＡからなるジペプチドの二価基であり且つＹbが単結合であるか、またはＸbが単結合であり且つＹbがＣＡからなるジペプチドの二価基である、項２６に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項２８．癌抗原ペプチドＢが７〜１５残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドである、項２６〜２７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項２９．癌抗原ペプチドＢが７〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃｗ拘束性癌抗原ペプチドである、項２６〜２８のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項３０．癌抗原ペプチドＢが７〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ２９、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ４５、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ｂ５２、ＨＬＡ−Ｂ５３、ＨＬＡ−Ｃｗ２、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ｃｗ７、ＨＬＡ−Ｃｗ８またはＨＬＡ−Ｃｗ１６拘束性癌抗原ペプチドである、項２６〜２９のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項３１．癌抗原ペプチドＢが、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ａ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦＲ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＡＦＰ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ、Ｃａｓｐａｓｅ−８、ＣＤＫ−４、ＥＬＦ２、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、Ｍｙｏｓｉｎ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２、７０７−ＡＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＬｉｖｉｎおよびＳＹＴ−ＳＳＸからなる群から選ばれる癌抗原タンパク質由来のＭＨＣクラスＩ癌抗原ペプチドである、項２６〜３０のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項３２．癌抗原ペプチドＢが、以下のアミノ酸配列：
ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ （配列番号：３）、
ＥＹＬＱＬＶＦＧＩ （配列番号：１１）、
ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ （配列番号：１３）、
ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：１９）、
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ （配列番号：２６）、
ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ （配列番号：２７）、
ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ （配列番号：２９）、
ＬＩＹＲＲＲＬＭＫ （配列番号：３３）、
ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ （配列番号：４０）、
ＡＦＬＰＷＨＲＬＦ （配列番号：４１）、
ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：４３）、
ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ （配列番号：５０）、
ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：５３）、
ＡＹＩＤＦＥＭＫＩ （配列番号：６６）、
ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ （配列番号：８３）、
ＫＷＦＰＳＣＱＦＬＬ （配列番号：８４）および
ＧＹＤＱＩＭＰＫＫ （配列番号：８５）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであるか、または配列番号：３、１１、１３、１９、２６、２７、２９、３３、４０、４１、４３、５０、５３、６６、８３、８４および８５の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つＣＴＬ誘導活性を有するペプチドである、項２６〜３１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項３３．癌抗原ペプチドＢが、以下のアミノ酸配列：
ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：１９）、
ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：４３）および
ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：５３）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、項２６〜３２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項３４．Ｘeが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹeが単結合であるか、ＸeおよびＹeが独立して１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であるか、Ｘeが単結合であり且つＹeが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であるか、Ｘeが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹeが単結合であるか、Ｘeが単結合であり且つＹeが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であるか、またはＸeおよびＹeが単結合である、項２６〜３３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項３５．Ｘeが単結合であり、Ｙeが単結合、アラニン残基、ロイシン残基またはメチオニン残基である、項２６〜３４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項３６．Ｘeが単結合または１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり、Ｙeが単結合である、項２６〜３４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項３７．ＸeおよびＹeが単結合である、項２６〜３６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項３８．癌抗原ペプチドＥが７〜１５残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドである、項２６〜３７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項３９．癌抗原ペプチドＥが７〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱまたはＨＬＡ−ＤＰ拘束性癌抗原ペプチドである、項２６〜３８のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項４０．癌抗原ペプチドＥが１３〜１５残基のアミノ酸からなるＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチドである、項２６〜３９のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項４１．癌抗原ペプチドＥが、以下のアミノ酸配列：
ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （配列番号：１０１）および
ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ （配列番号：１０２）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであるか、または配列番号：１０１および１０２の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つヘルパーＴ細胞誘導活性を有するペプチドである、項２６〜４０のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項４２．癌抗原ペプチドＥが、以下のアミノ酸配列：
ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （配列番号：１０１）および
ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ （配列番号：１０２）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、項２６〜４１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項４３．式（１）で表される化合物が、式（１９）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、または式（２１）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物である、項１〜１０、１４〜１５および２６〜４２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項４４．癌抗原ペプチドＢが７〜１５残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜１０および１４〜１８のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項４５．癌抗原ペプチドＢが７〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱまたはＨＬＡ−ＤＰ拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜１０、１４〜１８および２６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項４６．癌抗原ペプチドＢが１３〜１５残基のアミノ酸からなるＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチドである、項１〜１０、１４〜１８および４４〜４５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項４７．癌抗原ペプチドＢが、以下のアミノ酸配列：
ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （配列番号：１０１）および
ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ （配列番号：１０２）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであるか、または配列番号：１０１および１０２の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つヘルパーＴ細胞誘導活性を有するペプチドである、項１〜１０、１４〜１８および４４〜４６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項４８．癌抗原ペプチドＢが、以下のアミノ酸配列：
ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （配列番号：１０１）および
ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ （配列番号：１０２）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、項１〜１０、１４〜１８および４４〜４７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項４９．式（１）で表される化合物が、式（６）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、式（７）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、式（１５）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、または式（１６）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物である、項１〜１０、１４〜１８および４４〜４８のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項５０．Ｒ1が式（３）で表される基である、項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項５１．Ｘcが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹcが単結合であるか、ＸcおよびＹcが独立して１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であるか、Ｘcが単結合であり且つＹcが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であるか、Ｘcが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹcが単結合であるか、Ｘcが単結合であり且つＹcが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であるか、またはＸcおよびＹcが単結合である、項１〜１０および５０のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項５２．Ｘcが単結合であり、Ｙcが単結合、アラニン残基、ロイシン残基またはメチオニン残基である、項１〜１０および５０〜５１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項５３．Ｘcが単結合または１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり、Ｙcが単結合である、項１〜１０および５０〜５１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項５４．ＸcおよびＹcが単結合である、項１〜１０および５０〜５３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項５５．癌抗原ペプチドＣが７〜１５残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜１０および５０〜５４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項５６．癌抗原ペプチドＣが７〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱまたはＨＬＡ−ＤＰ拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜１０および５０〜５５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項５７．癌抗原ペプチドＣが１３〜１５残基のアミノ酸からなるＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチドである、項１〜１０および５０〜５６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項５８．癌抗原ペプチドＣが、以下のアミノ酸配列：
ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （配列番号：１０１）および
ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ （配列番号：１０２）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであるか、または配列番号：１０１および１０２の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つヘルパーＴ細胞誘導活性を有するペプチドである、項１〜１０および５０〜５７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項５９．癌抗原ペプチドＣが、以下のアミノ酸配列：
ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （配列番号：１０１）および
ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ （配列番号：１０２）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、項１〜１０および５０〜５８のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項６０．式（１）で表される化合物が、式（８）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、式（９）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、式（１８）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、または式（１７）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物である、項１〜１０および５０〜５９のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項６１．Ｒ1が癌抗原ペプチドＤである、項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項６２．癌抗原ペプチドＤが、７〜１５残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜１０および６１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項６３．癌抗原ペプチドＤが、７〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃｗ拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜１０および６１〜６２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項６４．癌抗原ペプチドＤが７〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ２９、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ４５、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ｂ５２、ＨＬＡ−Ｂ５３、ＨＬＡ−Ｃｗ２、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ｃｗ７、ＨＬＡ−Ｃｗ８またはＨＬＡ−Ｃｗ１６拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜１０および６１〜６３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項６５．癌抗原ペプチドＤが、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ａ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦＲ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＡＦＰ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ、Ｃａｓｐａｓｅ−８、ＣＤＫ−４、ＥＬＦ２、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、Ｍｙｏｓｉｎ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２、７０７−ＡＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＬｉｖｉｎおよびＳＹＴ−ＳＳＸからなる群から選ばれる癌抗原タンパク質由来のＭＨＣクラスＩ癌抗原ペプチドである、項１〜１０および６１〜６４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項６６．癌抗原ペプチドＤが、以下のアミノ酸配列：
ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ （配列番号：８７）および
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ （配列番号：８８）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであるか、または配列番号：８７および８８の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つＣＴＬ誘導活性を有するペプチドである、項１〜１０および６１〜６５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項６７．癌抗原ペプチドＤが、以下のアミノ酸配列：
ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ （配列番号：８７）および
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ （配列番号：８８）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、項１〜１０および６１〜６６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項６８．式（１）で表される化合物が、式（１０）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物または式（１１）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物である、項１〜１０および６１〜６７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項６９．癌抗原ペプチドＤが、７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜１０および６１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項７０．癌抗原ペプチドＤが１３〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱまたはＨＬＡ−ＤＰ拘束性癌抗原ペプチドである、項１〜１０、６１および６９のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項７１．癌抗原ペプチドＤが１３〜１５残基のアミノ酸からなるＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチドである、項１〜１０、６１および６９〜７０のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項７２．癌抗原ペプチドＤが、以下のアミノ酸配列：
ａＫ−Ｃｈａ−ＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ−Ａｈｘ−Ｃ （配列番号：１０３）
のアミノ酸配列を含むペプチドであるか、または配列番号：１０３のアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つヘルパーＴ細胞誘導活性を有するペプチドである、項１〜１０、６１および６９〜７１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項７３．癌抗原ペプチドＤが、以下のアミノ酸配列：
ａＫ−Ｃｈａ−ＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ−Ａｈｘ−Ｃ （配列番号：１０３）
のアミノ酸配列からなるペプチドである、項１〜１０、６１および６９〜７２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項７４．式（１）で表される化合物が、式（１２）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物である、項１〜１０、６１および６９〜７３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項７５．癌抗原ペプチドＤが、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ＣＥＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ＭＵＣ１およびＳＡＲＴ−３からなる群から選ばれる癌抗原タンパク質由来のＭＨＣクラスＩＩ癌抗原ペプチドである、項１〜１０、６１および６９〜７０のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項７６．癌抗原ペプチドＤが、以下のアミノ酸配列：
ＡＡＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬ （配列番号：１０４）、
ＲＮＧＹＲＡＬＭＤＫＳＬＨＶＧＴＱＣＡＬＴＲＲ （配列番号：１０５）、
ＫＫＬＱＣＶＱＬＨＶＩＳＭ （配列番号：１０６）および
ＧＳＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬ （配列番号：１０７）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであるか、または配列番号：１０４、１０５、１０６および１０７の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つヘルパーＴ細胞誘導活性を有するペプチドである、項１〜１０、６１、６９〜７０および７５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項７７．癌抗原ペプチドＤが、以下のアミノ酸配列：
ＡＡＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬ （配列番号：１０４）、
ＲＮＧＹＲＡＬＭＤＫＳＬＨＶＧＴＱＣＡＬＴＲＲ （配列番号：１０５）、
ＫＫＬＱＣＶＱＬＨＶＩＳＭ （配列番号：１０６）および
ＧＳＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬ （配列番号：１０７）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、項１〜１０、６１、６９〜７０および７５〜７６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項７８．癌抗原ペプチドＡ、癌抗原ペプチドＢ、癌抗原ペプチドＣ、または／および癌抗原ペプチドＤが、ＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドではない、項１〜７７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩；
項７９．項１〜７８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学上許容される塩、および薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物；
項８０．癌ワクチンとして使用される、項７９に記載の医薬組成物；
項８１．項１〜７８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学上許容される塩の、癌ワクチンを製造するための使用；
項８２．癌を治療または予防するための方法であって、項１〜７８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学上許容される塩の治療または予防に有効な量を、それを必要としている癌抗原タンパク質陽性の癌患者に投与することからなる方法、
項８３．項１〜７８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学上許容される塩を、ＥＲＡＰ１と反応させることにより、２つの異なるＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープ、またはＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束性エピトープを得る方法；および
項８４．以下の工程を含む、化合物の合成方法：
（１）Ｆｍｏｃ−Ｃ（Ｍｍｔ）Ａ−ＳＢｎおよび１つのシステイン残基がＮ末端に結合している癌抗原ペプチドＢを用いて、Ｃ（Ｍｍｔ）ＡのＣ末端アミノ酸のカルボニル基と癌抗原ペプチドＢのＮ末端に結合しているＮ末端アミノ酸のアミノ基が結合したペプチドを合成する工程であって、癌抗原ペプチドＢが７〜１５残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドを表す工程、
（２）前記工程（１）で得られたペプチドおよびＳＰｙ基で保護された１つのシステイン残基がＮ末端に結合している癌抗原ペプチドＡを用いて、前記工程（１）で得られたペプチド中の癌抗原ペプチドＢのＮ末端に結合しているシステイン残基のチオエーテル基と癌抗原ペプチドＡのＮ末端に結合しているシステイン残基のチオエーテル基が結合したペプチドを合成する工程であって、癌抗原ペプチドＡは、７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドを表す工程、および
（３）前記工程（２）で得られたペプチドおよびＳＰｙ基で保護された１つのシステイン残基がＣ末端に結合している癌抗原ペプチドＥを用いて、前記工程（２）で得られたペプチド中の癌抗原ペプチドＡのＮ末端に結合しているシステイン残基のチオエーテル基と癌抗原ペプチドＥのＣ末端に結合しているシステイン残基のチオエーテル基が結合したペプチドを合成する工程であって、癌抗原ペプチドＥは、７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドを表す工程、
に関する。
本発明により、癌免疫療法剤として有用な前記の式（１）で表される化合物（以下、本発明の化合物ということもある。）を、提供することが可能となった。本発明の化合物により、インビボおよびインビトロでＣＴＬを効率的に誘導する癌ワクチンや癌免疫療法剤を提供することが可能となった。詳しくは、本発明の化合物により、配列の異なる２つのＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドもしくは配列の異なる２つのＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原エピトープ、ＭＨＣクラスＩ癌抗原拘束性ペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド、またはＭＨＣクラスＩ癌抗原拘束性癌抗原エピトープおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原エピトープを、インビボおよびインビトロで生成し、ＣＴＬを効率的に誘導することが可能となった。
中でも、配列の異なる２つのＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドのＨＬＡのサブタイプに関し、Ａ０２タイプ（Ａ−０２０１、Ａ０２０６など）のペプチドとＡ２４タイプ（Ａ−２４０２など）のペプチドとと組み合わせ得られる本発明の化合物（コンジュゲート体）が、特に好ましい。欧米人（Ｃａｕｃａｓｉａｎ）においては、ＨＬＡ−Ａ０２０１タイプまたはＨＬＡ−Ａ０２０６タイプであるＰｏｐｕｌａｔｉｏｎが約４７％と最も多く、次いでＨＬＡ−Ａ２４０２タイプが約１３％であり、これらのタイプの総和は、重複（すなわち両方のタイプを有するヒトを二重に計算すること）を除くと約５６％を占める（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６２：１００９;２００１）。一方日本人などにおいては、ＨＬＡ−Ａ２４０２であるＰｏｐｕｌａｔｉｏｎが約６０％と最も多く、次いでＨＬＡ−Ａ０２０１またはＨＬＡ−Ａ０２０６が約３９％であり、これらのタイプの総和は、重複（すなわち両方のタイプを有するヒトを二重に計算すること）を除くと約８１％を占める（ｗｗｗ．ｂｍｄｃ．ｉｒｃ．ｏｒ．ｊｐ／ＧＦ−Ａ．ｈｔｍ）。従って、本発明の化合物の利点としては、具体的には、より大きなＰｏｐｕｌａｔｉｏｎを一つの本発明の化合物でカバーするという利点、および必ずしも投与の事前に患者のＨＬＡのサブタイプを選別することが必須ではなくなり得るという利点などが挙げられる。
また、本発明の化合物により、物理化学的性質や安定性に優れ、製造が容易な癌ワクチンの有効成分を提供することが可能となった。これにより、癌ワクチンの製剤化も容易となった。
具体的には、物理化学的性質としては、溶解度、溶液の粘度、これに伴う精製の容易さ、凍結乾燥後の取り扱い易さ、これに伴う精製の容易さなどが挙げられる。安定性として、塩置換した後の安定性、吸湿性、熱安定性、エマルション形成後の安定性などが挙げられる。さらに薬理活性としては、癌ワクチンとしての薬効、ＡＰＩ（Ａｃｔｉｖｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ、医薬品有効成分）によって生じる違い、製剤中の添加剤との相互作用などが挙げられる。このうちＡＰＩによって生じる違いとは、ＡＰＩによる癌ワクチンとしての違いであり、具体的には、溶解度が大きく異なる２つのＡＰＩにおいては、溶解度が小さいＡＰＩの場合析出し易く、医薬品には必須要件であるメンブランフィルターの濾過による滅菌処理ができなくなる可能性が十分予想される。または、辛うじて溶解度が小さいＡＰＩの濾過による滅菌処理を行っても、濾液に含まれるＡＰＩの量が大きく減少し、癌ワクチンとして必須のＣＴＬ誘導能も著しく低下すると考えられる。よって、溶解度が小さいＡＰＩでは、生産上の効率が著しく低下するというデメリットが容易に予想される。
図１は、試験例２において、実施例１、２１および２５で合成された配列番号：１００、９９および９８の各ペプチドについて、ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング経時変化を試験した結果を示す図である。 図２は、試験例２において、実施例２、２２および２６で合成された配列番号：９５、９２および８９の各ペプチドについて、ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング経時変化を試験した結果を示す図である。 図３は、試験例２において、実施例１１、２３および２７で合成された配列番号：９６、９３および９０の各ペプチドについて、ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング経時変化を試験した結果を示す図である。 図４は、試験例２において、実施例１２、２４および２８で合成された配列番号：９７、９４および９１の各ペプチドについて、ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング経時変化を試験した結果を示す図である。 図５は、試験例３において、実施例１で合成された配列番号：１００のペプチドについて、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図６は、試験例３において、実施例２１で合成された配列番号：９９のペプチドについて、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図７は、試験例３において、実施例２５で合成された配列番号：９８のペプチドについて、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図８は、試験例４において、実施例２９で合成された式（４）で表される化合物について、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図９は、試験例５において、実施例３０で合成された式（１０）で表される化合物について、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図１０は、試験例５において、実施例３０で合成された式（１０）で表される化合物について、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図１１は、試験例１３において、実施例１０９で合成された式（１１）で表される化合物について、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図１２は、試験例１４において、実施例１１０で合成された式（５）で表される化合物について、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図１３は、試験例１９において、実施例１１２で合成された式（１６）で表される化合物について、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図１４は、試験例２０において、実施例１１３で合成された式（１７）で表される化合物について、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図１５は、試験例２１において、実施例１４７で合成された式（１８）で表される化合物について、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図１６は、試験例２２において、実施例１１１で合成された式（１５）で表される化合物について、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図１７は、試験例２３において、実施例１４９で合成された式（１９）で表される化合物について、配列番号：１９のペプチドのパルスまたは非パルスでの、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図１８は、試験例２３において、実施例１４９で合成された式（１９）で表される化合物について、配列番号：５３のペプチドのパルスまたは非パルスでの、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図１９は、比較例１において、参考例２および３で合成された配列番号：２３１および２３２で表されるペプチドについて、配列番号：１９のペプチドのパルスまたは非パルスでの、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図２０は、比較例１において、参考例２および３で合成された配列番号：２３１および２３２で表されるペプチドについて、配列番号：５３のペプチドのパルスまたは非パルスでの、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図２１は、比較例２において、参考例４および５で合成された配列番号：２３３および２３４で表されるペプチドについて、配列番号：１９のペプチドのパルスまたは非パルスでの、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。 図２２は、比較例２において、参考例４および５で合成された配列番号：２３３および２３４で表されるペプチドについて、配列番号：５３のペプチドのパルスまたは非パルスでの、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙによるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能を試験した結果を示す図である。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明における「アミノ酸残基」とは、ペプチドまたはタンパク質分子上で、ペプチドまたはタンパク質を構成しているアミノ酸の一単位に当たる部分を意味する。「アミノ酸残基」としては、天然もしくは非天然のα−アミノ酸残基、β−アミノ酸残基、γ−アミノ酸残基またはδ−アミノ酸残基が挙げられる。具体的には、天然のα−アミノ酸残基、オルニチン残基、ホモセリン残基、ホモシステイン残基、β−アラニン、γ−アミノブタン酸またはδ−アミノペンタン酸などが挙げられる。「アミノ酸残基」に、光学活性体があり得る場合、Ｌ体、Ｄ体の何れであってもよいが、Ｌ体が好ましい。
本発明における「アミノ酸残基」を略号で表示する場合、次の略号で記述する。
AlaまたはＡ：アラニン残基
ａ：Ｄ−アラニン残基
ArgまたはＲ：アルギニン残基
AsnまたはＮ：アスパラギン残基
AspまたはＤ：アスパラギン酸残基
CysまたはＣ：システイン残基
GlnまたはＱ：グルタミン残基
GluまたはＥ：グルタミン酸残基
GlyまたはＧ：グリシン残基
HisまたはＨ：ヒスチジン残基
IleまたはＩ：イソロイシン残基
LeuまたはＬ：ロイシン残基
LysまたはＫ：リジン残基
MetまたはＭ：メチオニン残基
PheまたはＦ：フェニルアラニン残基
ProまたはＰ：プロリン残基
SerまたはＳ：セリン残基
ThrまたはＴ：スレオニン残基
TrpまたはＷ：トリプトファン残基
TyrまたはＹ：チロシン残基
ValまたはＶ：バリン残基
Ａｂｕ：２−アミノ酪酸残基（α−アミノ酪酸残基とも言う）
Ｏｒｎ：オルニチン残基
Ｃｉｔ：シトルリン残基
Ｃｈａ：シクロヘキシルアラニン残基（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｌａｎｉｎｅ残基）
Ａｈｘ：２−アミノヘキサン酸残基（２−Ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ残基）
本発明における「ペプチド」のアミノ酸配列は、常法に従って、Ｎ末端アミノ酸のアミノ酸残基が左側に位置し、Ｃ末端アミノ酸のアミノ酸残基が右側に位置するように記述する。また「ペプチド」において、特に断りの無い限り、Ｎ末端アミノ酸のアミノ酸残基のアミノ基は水素原子と結合し、Ｃ末端アミノ酸のアミノ酸残基のカルボニル基は水酸基と結合している。ペプチドの二価基とは、Ｎ末端アミノ酸のアミノ酸残基のアミノ基およびＣ末端アミノ酸のアミノ酸残基のカルボニル基を介して結合する基を意味する。
本発明の化合物において、たとえば式（４）〜（１２）で表される化合物において、その部分構造にあたるペプチドについても、特に断りの無い限り、Ｎ末端アミノ酸のアミノ酸残基のアミノ基は水素原子と結合し、Ｃ末端アミノ酸のアミノ酸残基のカルボニル基は水酸基と結合している。
本発明における「Ｘa」および「Ｙa」は、独立して、単結合または１〜４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基を表す。Ｘaのアミノ酸残基数とＹaのアミノ酸残基数の和は０〜４の整数である。例えば、当該和が０の整数であるとは、ＸaおよびＹaが単結合であることを意味する。また、当該和が４の整数である場合としては、例えばＸaおよびＹaが独立して２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、Ｘaが３残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹaが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、Ｘaが４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹaが単結合である場合などが挙げられる。
当該和の整数として、好ましくは０〜２が挙げられ、より好ましくは０〜１が挙げられ、最も好ましくは０が挙げられる。すなわち、ＸaおよびＹaとしては、共に単結合である場合が最も好ましい。
当該和の整数が２である場合としては、Ｘaが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹaが単結合である場合、ＸaおよびＹaが独立して１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、またはＸaが単結合であり且つＹaが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合が挙げられる。
当該和の整数が１である場合としては、Ｘaが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹaが単結合である場合、またはＸaが単結合であり且つＹaが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合が挙げられる。このうち好ましくは、Ｘaが単結合であり且つＹaがアラニン残基、ロイシン残基またはメチオニン残基である場合、あるいははＸaがアラニン残基、グリシン残基、セリン残基またはチロシン残基であり且つＹaが単結合である場合が挙げられる。
本発明における「癌抗原ペプチドＡ」とは、７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドである。式（１）において癌抗原ペプチドＡは、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基が式（１）中のＹaと結合し、Ｃ末端アミノ酸のカルボニル基が式（１）中の水酸基と結合する。
まず、本発明における「ＭＨＣクラスＩ拘束性」とは、主要組織適合抗原（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）のクラスＩであるＭＨＣクラスＩ分子と結合してＣＴＬを誘導する特性を意味する。
ＭＨＣは、ヒトではヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。ＭＨＣクラスＩ分子に相当するＨＬＡは、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃｗ、ＦおよびＧなどのサブタイプに分類される。「ＭＨＣクラスＩ拘束性」として、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ拘束性、ＨＬＡ−Ｂ拘束性またはＨＬＡ−Ｃｗ拘束性が挙げられる。
ＨＬＡの各サブタイプについて、多型（対立遺伝子）が知られている。ＨＬＡ−Ａの多型としては、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ２４などの２７種以上が挙げられ、ＨＬＡ−Ｂの多型としては、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂ４４０３などの５９種以上が挙げられ、ＨＬＡ−Ｃｗの多型としては、ＨＬＡ−Ｃｗ０３０１、ＨＬＡ−Ｃｗ０４０１、ＨＬＡ−Ｃｗ０６０２などの１０種以上が挙げられる。これら多型の中、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ０２０１やＨＬＡ−Ａ２４が挙げられる。
癌抗原ペプチドＡとしては、７〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃｗ拘束性癌抗原ペプチドが好ましく、７〜１５残基のアミノ酸からなり且つＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ２９、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ４５、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ｂ５２、ＨＬＡ−Ｂ５３、ＨＬＡ−Ｃｗ２、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ｃｗ７、ＨＬＡ−Ｃｗ８またはＨＬＡ−Ｃｗ１６拘束性癌抗原ペプチドがより好ましい。
次に、本発明における「癌抗原ペプチド」とは、公知のヒト癌抗原タンパク質の部分ペプチドを意味する。具体的には、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ａ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦＲ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＡＦＰ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ、Ｃａｓｐａｓｅ−８、ＣＤＫ−４、ＥＬＦ２、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、Ｍｙｏｓｉｎ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２、７０７−ＡＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＬｉｖｉｎおよびＳＹＴ−ＳＳＸからなる群から選ばれる癌抗原タンパク質（以下、癌抗原タンパクとも言う。）のアミノ酸配列において連続する７〜３０残基のアミノ酸からなる部分ペプチドである。
但し、本発明における「癌抗原ペプチド」には、ヒトＷＴ１タンパク質（Ｃｅｌｌ，６０：５０９，１９９０、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ａ３８０８０）は含まれない。すなわち、本発明の化合物においては、癌抗原ペプチドＡ、癌抗原ペプチドＢ、癌抗原ペプチドＣ、または／および癌抗原ペプチドＤが、ＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドではない。癌抗原ペプチドＡ、癌抗原ペプチドＢ、癌抗原ペプチドＣまたは癌抗原ペプチドＤがＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドではないことがより好ましく、癌抗原ペプチドＡ、癌抗原ペプチドＢ、癌抗原ペプチドＣおよび癌抗原ペプチドＤが、ＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドではないことがさらに好ましい。
具体的には、前記の項１に示した式（１）で表される化合物において、癌抗原ペプチドＡが癌抗原タンパク質のアミノ酸配列において連続する７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドであり且つＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドとは異なり、Ｒ1が式（２）で表される基である場合、癌抗原タンパク質のアミノ酸配列において連続する７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドであり且つＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドとは異なり、Ｒ1が式（３）で表される基である場合、癌抗原ペプチドＣが癌抗原タンパク質のアミノ酸配列において連続する７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドであり且つＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドとは異なり、またＲ1が癌抗原ペプチドＤである場合、癌抗原ペプチドＤが癌抗原タンパク質のアミノ酸配列において連続する７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドであり且つＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドとは異なることが好ましい。
よって、本発明における「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」とは、インビトロおよび／またはインビボで、ＭＨＣクラスＩ抗原に結合し、複合体として提示されるペプチドであり、且つ該複合体が前駆体Ｔ細胞に認識された結果ＣＴＬを誘導するペプチドを意味する。「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」のアミノ酸残基数は、７〜３０であり、好ましくは７〜１５であり、より好ましくは８〜１２であり、更に好ましくは８〜１１であり、最も好ましくは８または９である。
７〜１２残基または好ましくは９残基のアミノ酸からなる「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」は、「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原エピトープ」とも呼ばれる。本発明における「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原エピトープ」とは、ＭＨＣクラスＩ抗原と結合し複合体として提示されるペプチドそのものを意味する。すなわち、「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」が、インビトロおよび／またはインビボで、Ｇａｍｍａ−Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｔｈｉｏｌ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＩＬＴ，ＧＬＴ）などのプロテオソームおよび／もしくはプロテアーゼによる細胞内での本発明化合物の分解（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ、ジスルフィド結合の還元的開裂）、ならびに／またはＥｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ １（ＥＲＡＰ１、ＥＲ−ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ １）による最適な残基数への切断（トリミングとも言う。）によって、「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原エピトープ」を生成する。当該生成においては、まずプロテオソームおよび／もしくはプロテアーゼによる分解の結果「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原エピトープ」のＣ末端アミノ酸が生じ、次にＥＲＡＰ１によるトリミング（切断）の結果「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原エピトープ」のＮ末端アミノ酸が生じるという生成過程が主に考えられる。ただし、当該生成においては、当該生成過程以外の過程も経由し得る。尚、現在、ＥＲＡＰ１は、ＥＲＡＡＰ（ＥＲ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）とも呼ばれ、かつては、Ａ−ＬＡＰ、ＰＩＬＳ−ＡＰまたはＡＲＴＳ−１とも呼ばれていた。
よって、「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」としては、７〜１２残基のアミノ酸からなる「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原エピトープ」のＣ末端アミノ酸のカルボニル基に１〜２３残基のアミノ酸が付加されて生成される７〜３０残基のアミノ酸からなるペプチドが好ましい。
「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」としては、例えば、表１〜９に記載されたペプチドが挙げられる。
表１中の配列番号：８のペプチドと配列番号：９のペプチドは、同じアミノ酸配列からなる同一のペプチドである。当該ペプチドは、ＨＬＡ−Ｃｗ３拘束性癌抗原ペプチドであり、またＨＬＡ−Ｃｗ１６拘束性癌抗原ペプチドでもある。
「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」として、好ましくは、以下のアミノ酸配列：
ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ （配列番号：３）、
ＥＹＬＱＬＶＦＧＩ （配列番号：１１）、
ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ （配列番号：１３）、
ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：１９）、
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ （配列番号：２６）、
ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ （配列番号：２７）、
ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ （配列番号：２９）、
ＬＩＹＲＲＲＬＭＫ （配列番号：３３）、
ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ （配列番号：４０）、
ＡＦＬＰＷＨＲＬＦ （配列番号：４１）、
ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：４３）、
ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ （配列番号：５０）、
ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：５３）、
ＡＹＩＤＦＥＭＫＩ （配列番号：６６）、
ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ （配列番号：８３）、
ＫＷＦＰＳＣＱＦＬＬ （配列番号：８４）、
ＧＹＤＱＩＭＰＫＫ （配列番号：８５）、
ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ （配列番号：８７）および
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ （配列番号：８８）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、または配列番号：３、１１、１３、１９、２６、２７、２９、３３、４０、４１、４３、５０、５３、６６、８３、８４、８５、８７および８８の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つＣＴＬ誘導活性を有するペプチドが挙げられる。「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」として、配列番号：３、１１、１３、１９、２６、２７、２９、３３、４０、４１、４３、５０、５３、６６、８３、８４、８５、８７および８８の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましく、配列番号：１９、４３および５３の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが更により好ましい。
本発明における「アミノ酸配列を含むペプチド」とは、通常のように、当該アミノ酸配列のＮ末端アミノ酸および／またはＣ末端アミノ酸に更なるアミノ酸が付加されたペプチドを意味する。「癌抗原ペプチドＡ」および「癌抗原ペプチドＢ」における「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」が付加される場合、Ｃ末端側に付加されたペプチドが好ましい。
本発明における「アミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つＣＴＬ誘導活性を有するペプチド」は、「改変キラーペプチド」とも呼ばれる。当該改変キラーペプチドは、アミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が、欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＭＨＣクラスＩに結合し、ＣＴＬを誘導するペプチドを意味する。置換されるアミノ酸の置換位置としては、９残基のアミノ酸からなるペプチドの場合、１位（Ｎ末端）、２位、３位および９位が挙げられる。付加（挿入も包含される）されるアミノ酸の数は好ましくは１または２であり、より好ましくは１である。好ましい付加位置としては、Ｃ末端が挙げられる。欠失されるアミノ酸の数は好ましくは１である。改変において、付加されるアミノ酸または置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。
本発明における「Ｒ1」は、水素原子、前記の式（２）で表される基、前記の式（３）で表される基または癌抗原ペプチドＤを表し、好ましくは、前記の式（２）で表される基、前記の式（３）で表される基または癌抗原ペプチドＤが挙げられる。
Ｒ1が水素原子である場合、式（１）の化合物は、式（１−１）：
（式中、Ｘa、Ｙaおよび癌抗原ペプチドＡは、式（１）における前記と同義であり、Cysはシステイン残基を表す。）
で表される化合物すなわちペプチドである。
Ｒ1が水素原子である式（１）の化合物すなわち式（１−１）で表されるペプチドについては、その配列は癌抗原タンパク質の部分配列と同一ではない。式（１）における要件「配列は癌抗原タンパクの部分配列と同一ではない」とは、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ａ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦＲ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＡＦＰ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ、Ｃａｓｐａｓｅ−８、ＣＤＫ−４、ＥＬＦ２、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、Ｍｙｏｓｉｎ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２、７０７−ＡＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＬｉｖｉｎおよびＳＹＴ−ＳＳＸからなる群から選ばれる癌抗原タンパク質のアミノ酸配列において連続する８〜３５残基のアミノ酸からなる部分ペプチドではないことを意味する。
すなわち、Ｒ1が水素原子である式（１）の化合物は、前記の癌抗原タンパクのアミノ酸配列において連続する８〜３５残基のアミノ酸からなる部分ペプチドではない。癌抗原ペプチドＡがＨＥＲ２／ｎｅｕ369-377ペプチドである場合を例に挙げて、具体的に説明する。ＨＥＲ２／ｎｅｕ369-377ペプチドは、そのアミノ酸配列がＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）であり、ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列における３６９位〜３７７位の連続する９残基のアミノ酸からなる部分ペプチドである。ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列においては、ＨＥＲ２／ｎｅｕ369-377ペプチドのＮ末端側に連続する３６８位はＫであり、さらに連続する３６７位はＣである。よって、ＨＥＲ２／ｎｅｕ367-377ペプチド（ＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）（配列番号：８６）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列において連続する１１残基のアミノ酸からなる部分ペプチドに該当する。一方、本願発明の要件「Ｒ1が水素原子である式（１）の化合物は、癌抗原タンパクのアミノ酸配列において連続する８〜３５残基のアミノ酸からなる部分ペプチドではない」に基づき、Ｒ1が水素原子である式（１）の化合物において、癌抗原ペプチドＡがＨＥＲ２／ｎｅｕ369-377ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）である場合には、ＨＥＲ２／ｎｅｕ367-377ペプチド（ＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）は本願発明の化合物ではないことから、Ｘaが単結合であり且つＹaがリジン残基になることはない。ＨＥＲ２／ｎｅｕ367-377ペプチド（ＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）（配列番号：８６）は、後記のとおり、本願発明の参考例であって、実施例ではない。
本願発明の「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原エピトープ」として好ましい、配列番号：３、１１、１３、１９、２６、２７、２９、３３、４０、４１、４３、５０、５３、６６、８３、８４および８５の各ペプチドについて、対応する癌抗原タンパクのアミノ酸配列におけるＮ末端側に連続する５残基のアミノ酸を、表１０〜１１に示す。
Ｘaのアミノ酸残基数とＹaのアミノ酸残基数の和は０〜４の整数であることから、前記の式（１−１）中のＸa−Ｃｙｓ-Ｙaを、例えば表１０および表１１に示した対応する癌抗原タンパクのアミノ酸配列におけるＮ末端側に連続する５残基のアミノ酸と比較することで、本願発明の要件「Ｒ1が水素原子である式（１）の化合物は、癌抗原タンパクのアミノ酸配列において連続する８〜３５残基のアミノ酸からなる部分ペプチドではない」に該当するか否かを、容易に区別できる。
Ｒ1が水素原子である式（１）の化合物として、以下のアミノ酸配列：
ＣＡＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：８９）、
ＣＬＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：９０）、
ＣＭＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：９１）、
ＣＡＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：９２）、
ＣＬＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：９３）、
ＣＭＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：９４）、
ＣＡＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：９５）、
ＣＬＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：９６）および
ＣＭＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：９７）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、さらに配列番号：８９〜９１の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが更により好ましい。
また、Ｒ1が水素原子である式（１）の化合物として、以下のアミノ酸配列：
ＣＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：９８）、
ＣＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：９９）および
ＣＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：１００）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドも好ましく、さらに配列番号：９８のアミノ酸配列からなるペプチドが更により好ましい。
「Ｒ1」が前記の式（２）で表される基である場合、式（１）の化合物は、式（１−２）：
（式中、Ｘa、Ｙaおよび癌抗原ペプチドＡは、式（１）における前記と同義であり、Ｘb、Ｙbおよび癌抗原ペプチドＢは、式（２）における前記と同義である。）で表される化合物である。
本発明における「Ｘb」および「Ｙb」は、独立して、単結合または１〜４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基を表す。Ｘbのアミノ酸残基数とＹbのアミノ酸残基数の和は０〜４の整数である。例えば、当該和が０の整数であるとは、ＸbおよびＹbが単結合であることを意味する。また、当該和が４の整数である場合としては、例えばＸbおよびＹbが独立して２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、Ｘbが３残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹbが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、Ｘbが４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹbが単結合である場合などが挙げられる。
当該和の整数として、好ましくは０〜２が挙げられ、より好ましくは０〜１が挙げられ、最も好ましくは０が挙げられる。すなわち、ＸbおよびＹbとしては、共に単結合である場合が最も好ましい。
当該和の整数が２である場合としては、Ｘbが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹbが単結合である場合、ＸbおよびＹbが独立して１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、またはＸbが単結合であり且つＹbが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合が挙げられる。
当該和の整数が１である場合としては、Ｘbが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹbが単結合である場合、またはＸbが単結合であり且つＹbが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合が挙げられる。このうち好ましくは、Ｘbが単結合であり且つＹbがアラニン残基、ロイシン残基またはメチオニン残基である場合である場合が挙げられる。
本発明における「癌抗原ペプチドＢ」とは、７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド、または７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドである。但し、式（１）で表される化合物において、癌抗原ペプチドＡと癌抗原ペプチドＢが同時に同じペプチドであることはない。すなわち、癌抗原ペプチドＢは、「癌抗原ペプチドＡとは異なり」との要件で限定される。
癌抗原ペプチドＡと癌抗原ペプチドＢが同時に同じペプチドであることはないことから、Ｒ1が前記の式（２）で表される基である式（１）の化合物は、仮にＸaおよびＸbが同じで且つＹaおよびＹbが同じであっても、ホモダイマーではなく、ヘテロダイマーである。ホモダイマーは、同じペプチド単量体が二量体化された二量体を意味し、ヘテロダイマーは、異なるペプチド単量体が二量体化された二量体を意味する。
癌抗原ペプチドＢにおいて、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基は式（２）中ではＹbと結合し（すなわち式（１−２）中でもＹbと結合し）、Ｃ末端アミノ酸のカルボニル基が式（２）中の水酸基と結合する（すなわち式（１−２）中でも水酸基と結合する）。
本発明における「癌抗原ペプチドＢ」が、７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドである場合、当該「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」については、前記と同義である。
Ｒ1が式（２）で表される基であり癌抗原ペプチドＢが７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドである場合の式（１）の化合物として、好ましくは、式（４）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物または式（５）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物が挙げられる。
また、Ｘbがシステイン残基を含む２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹbが単結合であるか、またはＸbが単結合であり且つＹbがシステイン残基を含む２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、より好ましくは、ＸbがＣＡからなるジペプチドの二価基であり且つＹbが単結合であるか、またはＸbが単結合であり且つＹbがＣＡからなるジペプチドの二価基である場合、式（１）の化合物は、Ｘbのシステイン残基中のチオエーテル基またはＹbのシステイン残基中のチオエーテル基が、式（２０）：
中のチオエーテル基と結合している化合物であってもよい。
本発明における「Ｘe」および「Ｙe」は、独立して、単結合または１〜４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基を表す。Ｘeのアミノ酸残基数とＹeのアミノ酸残基数の和は０〜４の整数である。例えば、当該和が０の整数であるとは、ＸeおよびＹeが単結合であることを意味する。また、当該和が４の整数である場合としては、例えばＸeおよびＹeが独立して２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、Ｘeが３残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹeが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、Ｘeが４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹeが単結合である場合などが挙げられる。
当該和の整数として、好ましくは０〜２が挙げられ、より好ましくは０〜１が挙げられ、最も好ましくは０が挙げられる。すなわち、ＸeおよびＹeとしては、共に単結合である場合が最も好ましい。
当該和の整数が２である場合としては、Ｘeが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹeが単結合である場合、ＸeおよびＹeが独立して１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、またはＸeが単結合であり且つＹeが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合が挙げられる。
当該和の整数が１である場合としては、Ｘeが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹeが単結合である場合、またはＸeが単結合であり且つＹeが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合が挙げられる。このうち好ましくは、Ｘeが単結合であり且つＹeがアラニン残基、ロイシン残基またはメチオニン残基である場合が挙げられる。
本発明における「癌抗原ペプチドＥ」とは、７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドである。式（２０）において癌抗原ペプチドＥは、Ｃ末端アミノ酸のカルボニル基が式（２０）中のＸeと結合し、癌抗原ペプチドＥのＮ末端アミノ酸のアミノ基が式（２０）中の水素原子と結合する。
本発明における「ＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド」とは、後述する「癌抗原ペプチドＢ」における「ＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド」の定義と同義である。
ＭＨＣクラスＩＩ分子に相当するＨＬＡは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱおよびＤＰなどのサブタイプに分類される。「ＭＨＣクラスＩＩ拘束性」として、好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性、ＨＬＡ−ＤＱ拘束性またはＨＬＡ−ＤＰ拘束性が挙げられる。
よって、本発明における「ＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド」とは、インビトロおよび／またはインビボで、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合し、ヘルパーＴ細胞を誘導するペプチドを意味する。「ＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド」のアミノ酸残基数は、７〜３０であり、好ましくは１４〜３０である。
本発明における「癌抗原ペプチドＥ」が７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドである場合、アミノ酸残基数は、９〜１５が好ましく、１３〜１５がより好ましい。癌抗原ペプチドＥとしては、１３〜１５残基のアミノ酸からなるＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチドがさらに好ましい。
本発明における「ユニバーサル癌抗原ペプチド」とは、ＭＨＣクラスＩＩのサブタイプや多型の種類に関わらず複数の種類のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合しヘルパーＴ細胞を誘導する癌抗原ペプチドやエピトープを意味する。「ＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド」は、ユニバーサル癌抗原ペプチドｐａｎ ＤＲ結合ペプチドとも言われる。
「癌抗原ペプチドＥ」としては、後述する「癌抗原ペプチドＢ」において挙げられるアミノ酸配列と同様に、以下のアミノ酸配列：
ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （配列番号：１０１）および
ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ （配列番号：１０２）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
式（１−２）の化合物において、Ｘbがシステイン残基を含む２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹbが単結合であるか、またはＸbが単結合であり且つＹbがシステイン残基を含む２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、より好ましくは、ＸbがＣＡからなるジペプチドの二価基であり且つＹbが単結合であるか、またはＸbが単結合であり且つＹbがＣＡからなるジペプチドの二価基である場合、Ｘbのシステイン残基中のチオエーテル基またはＹbのシステイン残基中のチオエーテル基が、式（２０）中のチオエーテル基と結合している化合物として、好ましくは、式（１９）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、または式（２１）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物が挙げられる。
次に、本発明における「癌抗原ペプチドＢ」における「ＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド」について、以下に説明する。
本発明における「ＭＨＣクラスＩＩ拘束性」とは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合してヘルパーＴ細胞を誘導する特性を意味する。
ＭＨＣクラスＩＩ分子に相当するＨＬＡは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱおよびＤＰなどのサブタイプに分類される。「ＭＨＣクラスＩＩ拘束性」として、好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性、ＨＬＡ−ＤＱ拘束性またはＨＬＡ−ＤＰ拘束性が挙げられる。
よって、本発明における「ＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド」とは、インビトロおよび／またはインビボで、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合し、ヘルパーＴ細胞を誘導するペプチドを意味する。「ＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド」のアミノ酸残基数は、７〜３０であり、好ましくは１４〜３０である。
本発明における「癌抗原ペプチドＢ」が７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドである場合、アミノ酸残基数は、９〜１５が好ましく、１３〜１５がより好ましい。癌抗原ペプチドＢとしては、１３〜１５残基のアミノ酸からなるＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチドがさらに好ましい。
本発明における「ユニバーサル癌抗原ペプチド」とは、ＭＨＣクラスＩＩのサブタイプや多型の種類に関わらず複数の種類のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合しヘルパーＴ細胞を誘導する癌抗原ペプチドやエピトープを意味する。「ＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド」は、ユニバーサル癌抗原ペプチドｐａｎ ＤＲ結合ペプチドとも言われる。
「ＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド」としては、例えば、表１２に記載されたペプチドが挙げられる。
「ユニバーサル癌抗原ペプチド」として、配列番号：１０１および１０２の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、または配列番号：１０１および１０２の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つヘルパーＴ細胞誘導活性を有するペプチドが好ましく、配列番号：１０１および１０２の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。
当該「アミノ酸配列を含む」は、前記と同義である「アミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つヘルパーＴ細胞誘導活性を有するペプチド」は、「改変ヘルパーペプチド」とも呼ばれる。当該改変ヘルパーペプチドは、アミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が、欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＭＨＣクラスＩＩに結合し、ヘルパーＴ細胞を誘導するペプチドを意味する。付加（挿入も包含される）されるアミノ酸の数は好ましくは１〜３である。欠失されるアミノ酸の数は好ましくは１〜５である。改変において、付加されるアミノ酸または置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。
Ｒ1が式（２）で表される基であり癌抗原ペプチドＢが７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドである場合の式（１）の化合物として、好ましくは、式（６）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、式（７）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、式（１５）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、または式（１６）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物が挙げられる。
「Ｒ1」が前記の式（３）で表される基である場合、式（１）の化合物は、式（１−３）：
（式中、Ｘa、Ｙaおよび癌抗原ペプチドＡは、式（１）における前記と同義であり、Ｘc、Ｙcおよび癌抗原ペプチドＣは、式（３）における前記と同義である。）で表される化合物である。
本発明における「Ｘc」および「Ｙc」は、独立して、単結合または１〜４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基を表す。Ｘcのアミノ酸残基数とＹcのアミノ酸残基数の和は０〜４の整数である。例えば、当該和が０の整数であるとは、ＸcおよびＹcが単結合であることを意味する。また、当該和が４の整数である場合としては、例えばＸcおよびＹcが独立して２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、Ｘcが３残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹcが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、Ｘcが４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹcが単結合である場合などが挙げられる。
当該和の整数として、好ましくは０〜２が挙げられ、より好ましくは０〜１が挙げられ、最も好ましくは０が挙げられる。すなわち、ＸcおよびＹcとしては、共に単結合である場合が最も好ましい。
当該和の整数が２である場合としては、Ｘcが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹcが単結合である場合、ＸcおよびＹcが独立して１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合、またはＸcが単結合であり且つＹcが２残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合が挙げられる。
当該和の整数が１である場合としては、Ｘcが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり且つＹcが単結合である場合、またはＸcが単結合であり且つＹcが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基である場合が挙げられる。このうち好ましくは、Ｘcが単結合であり且つＹcがアラニン残基、ロイシン残基またはメチオニン残基である場合である場合が挙げられる。
本発明における「癌抗原ペプチドＣ」とは、７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドである。当該「ＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド」については、前記と同義である。
本発明における「癌抗原ペプチドＣ」が７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドである場合、アミノ酸残基数は、９〜１５が好ましく、１３〜１５がより好ましい。癌抗原ペプチドＣとしては、１３〜１５残基のアミノ酸からなるＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチドがさらに好ましい。当該「ＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド」については、前記と同義である。
癌抗原ペプチドＣにおいて、Ｃ末端アミノ酸のカルボニル基は式（３）中ではＸcと結合し（すなわち式（１−３）中でもＸcと結合し）、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基が式（３）中の水素原子と結合する（すなわち式（１−３）中でも水素原子と結合する）。
Ｒ1が式（３）で表される基であり癌抗原ペプチドＣが７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドである場合の式（１）の化合物として、好ましくは、式（８）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、式（９）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、式（１８）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物、または式（１７）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物が挙げられる。
Ｒ1が癌抗原ペプチドＤである場合、癌抗原ペプチドＤのシステイン残基のチオエーテル基が式（１）中のチオエーテル基と結合する。癌抗原ペプチドＤにおいて、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基は水素原子と結合し、Ｃ末端アミノ酸のカルボニル基は水酸基と結合している。
癌抗原ペプチドＤは、１つのシステイン残基を含む７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドまたは１つのシステイン残基を含む７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドを表す。
本発明の「１つのシステイン残基を含む７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」においては、当該ペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも１つのシステイン残基を含んでいればよく、含まれるシステイン残基数としては、１〜３が好ましく、１〜２がより好ましく、１が最も好ましい。当該「ＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」については、前記と同義である。Ｒ1が「１つのシステイン残基を含む７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」である式（１）の化合物も、ホモダイマーではなく、ヘテロダイマーである。
「１つのシステイン残基を含む７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」としては、例えば、表１３に記載されたペプチドが挙げられる。
「１つのシステイン残基を含む７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」として、より好ましくは、以下のアミノ酸配列：
ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ （配列番号：８７）および
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ （配列番号：８８）
の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、または配列番号：８７および８８の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つＣＴＬ誘導活性を有するペプチドが挙げられ、最も好ましくは、配列番号：８７および８８の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。当該「アミノ酸配列を含む」および「アミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つＣＴＬ誘導活性を有するペプチド」は、前記と同義である。
Ｒ1が「１つのシステイン残基を含む７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチド」である場合の式（１）の化合物として、好ましくは、式（１０）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物または式（１１）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物が挙げられる。
本発明の「１つのシステイン残基を含む７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド」においては、当該ペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも１つのシステイン残基を含んでいればよく、含まれるシステイン残基数としては、１〜３が好ましく、１〜２がより好ましく、１が最も好ましい。当該「ＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド」については、前記と同義である。
「１つのシステイン残基を含む７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド」においては、アミノ酸残基数は９〜１５が好ましく、１３〜１５がより好ましく、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性はＨＬＡ−ＤＲ拘束性、ＨＬＡ−ＤＱ拘束性またはＨＬＡ−ＤＰ拘束性が好ましい。
癌抗原ペプチドＤが「１つのシステイン残基を含む１３〜１５残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド」である場合においては、「ＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド」として、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド、またはＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ＣＥＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ＭＵＣ１およびＳＡＲＴ−３からなる群から選ばれる癌抗原タンパク質由来の癌抗原ペプチドが好ましい。
「１つのシステイン残基を含む１３〜１５残基のアミノ酸からなるＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド」としては、例えば、表１４に記載されたペプチドが挙げられる。
「１つのシステイン残基を含む１３〜１５残基のアミノ酸からなるＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド」として、配列番号：１０３のアミノ酸配列を含むペプチド、または配列番号：１０３のアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つヘルパーＴ細胞誘導活性を有するペプチドが好ましく、配列番号：１０３のアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。当該「アミノ酸配列を含む」および「アミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つヘルパーＴ細胞誘導活性を有するペプチド」は、前記と同義である。
Ｒ1が「１つのシステイン残基を含む１３〜１５残基のアミノ酸からなるＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド」である場合の式（１）の化合物として、好ましくは、式（１２）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物が挙げられる。
「ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ＣＥＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ＭＵＣ１およびＳＡＲＴ−３からなる群から選ばれる癌抗原タンパク質由来の癌抗原ペプチドであり、１つのシステイン残基を含む１３〜１５残基のアミノ酸からなる癌抗原ペプチド」としては、例えば、表１５に記載されたペプチドが挙げられる。
「ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ＣＥＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ＭＵＣ１およびＳＡＲＴ−３からなる群から選ばれる癌抗原タンパク質由来の癌抗原ペプチドであり、１つのシステイン残基を含む１３〜１５残基のアミノ酸からなる癌抗原ペプチド」として、配列番号：１０４〜１０７の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、または配列番号：１０４〜１０７の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つヘルパーＴ細胞誘導活性を有するペプチドが好ましく、配列番号：１０４〜１０７の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。当該「アミノ酸配列を含む」および「アミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み且つヘルパーＴ細胞誘導活性を有するペプチド」は、前記と同義である。
本発明はまた、２つの異なるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチド、または２つの異なるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原エピトープおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原エピトープをそれぞれジスルフィド結合を介して結合させた化合物の合成方法を提供する。本発明の方法は以下の工程（１）〜（３）を含む。
本発明の工程（１）においては、Ｆｍｏｃ−Ｃ（Ｍｍｔ）Ａ−ＳＢｎおよび１つのシステイン残基がＮ末端に結合している癌抗原ペプチドＢを用いて、Ｃ（Ｍｍｔ）ＡのＣ末端アミノ酸のカルボニル基と癌抗原ペプチドＢのＮ末端に結合しているＮ末端アミノ酸のアミノ基が結合したペプチドを合成する。
「癌抗原ペプチドＢ」は、前記の「癌抗原ペプチドＢ」の定義と同義である。「Ｆｍｏｃ」は、９−フルオレニルメトキシカルボニル基を表す。「Ｍｍｔ」は、モノメトキシトリチル基を表す。「ＳＢｎ」は、チオベンジル基を表す。
本発明の工程（２）においては、前記工程（１）で得られたペプチドおよびＳＰｙ基で保護された１つのシステイン残基がＮ末端に結合している癌抗原ペプチドＡを用いて、前記工程（１）で得られたペプチド中の癌抗原ペプチドＢのＮ末端に結合しているシステイン残基のチオエーテル基と癌抗原ペプチドＡのＮ末端に結合しているシステイン残基のチオエーテル基が結合したペプチドを合成する。
「癌抗原ペプチドＡ」は、前記の「癌抗原ペプチドＡ」の定義と同義である。「ＳＰｙ」は、２−ピリジルスルフィド基を表す。
本発明の工程（３）においては、前記工程（２）で得られたペプチドおよびＳＰｙ基で保護された１つのシステイン残基がＣ末端に結合している癌抗原ペプチドＥを用いて、前記工程（２）で得られたペプチド中の癌抗原ペプチドＡのＮ末端に結合しているシステイン残基のチオエーテル基と癌抗原ペプチドＥのＣ末端に結合しているシステイン残基のチオエーテル基が結合したペプチドを合成する。
「癌抗原ペプチドＥ」は、前記の「癌抗原ペプチドＥ」の定義と同義である。
本発明の化合物およびペプチドならびにそれらの中間体にあたるペプチドは、本明細書の実施例に記載された方法、または通常のペプチド合成において用いられる方法に準じて製造することができる。製造方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
例えば、Ｆｍｏｃ法もしくはＢｏｃ法を用いて固相合成機で製造する方法や、Ｂｏｃ−アミノ酸もしくはＺ−アミノ酸を液相合成法で逐次縮合させて製造する方法が挙げられる（Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル基、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基、Ｚはベンジルオキシカルボニル基をそれぞれ表わす）。
本発明の化合物を製造するための中間体において、アミノ基、カルボキシ基、メルカプト基などの官能基は、必要に応じて保護、脱保護の技術を用い、適当な保護基で保護し、また脱保護することができる。好適な保護基、保護する方法、および脱保護する方法としては、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．；１９９０）」などに詳細に記載されている。たとえば、メルカプト基の保護基としてはアセトアミドメチル基またはトリチル基などが挙げられる。
本発明の化合物がジスルフィド結合を有する場合、通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて、システイン残基を含む異なる２つのペプチド間で、またはシステイン残基を含むペプチドとシステイン間で、当該ジスルフィド結合を形成することができる。ジスルフィド結合の形成方法は、文献（ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
具体的には、ペプチドに含まれるシステイン残基が１個の場合、システイン側鎖上のメルカプト基の保護基を含むすべての保護基を除去した後、不活性溶媒中で酸化させることにより、ジスルフィド結合を有する化合物（ジスルフィド化合物）を製造することができる。また、メルカプト基を持つ２つの中間体を適当な溶媒中に混合し酸化することにより製造することができる。当該酸化の方法としては、通常のペプチド合成でジスルフィド結合を形成させる公知の方法を適宜選択すればよい。例えば、ヨウ素酸化、アルカリ条件下で空気酸化反応に付す方法、またはアルカリ性もしくは酸性条件下酸化剤を添加してジスルフィド結合を形成する方法などが挙げられる。ここで、酸化剤としては、ヨウ素、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、フェリシアン化カリウムなどが挙げられる。溶媒としては水、酢酸、メタノール、クロロホルム、ＤＭＦもしくはＤＭＳＯなど、またはこれらの混合液を用いることができる。酸化反応によりしばしば、対称、非対称性ジスルフィド化合物の混合物を与える。目的の非対称性ジスルフィド化合物は種々のクロマトグラフィー、または再結晶などで精製することによって得ることができる。あるいは活性化されたメルカプト基をもつ中間体とメルカプト基をもつ中間体を混合することにより選択的なジスルフィド結合を形成することができる。活性化されたメルカプト基をもつ中間体としては、Ｎｐｙｓ基（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基）が結合したメルカプト基などが挙げられる。あるいは、あらかじめ一方の中間体と例えば２，２'−ジチオビス（５−ニトロピリジン）を混合することによりメルカプト基を活性化した後、他方の中間体を加えることにより選択的なジスルフィド結合を形成することができる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ． Ｖｏｌ． ３７． Ｎｏ． ９， ｐｐ． １３４７−１３５０）。
ペプチドに含まれるシステイン残基が２個以上の場合も、前記と同様の方法を用いることができる。この場合はジスルフィド結合様式が異なる異性体が得られる。システイン側鎖の保護基を特定の組み合わせにすることにより、目的のシステイン残基間でジスルフィド結合を形成した二量体を得ることができる。前記保護基の組み合わせとしては、ＭｅＢｚｌ（メチルベンジル）基とＡｃｍ（アセトアミドメチル）基、Ｔｒｔ（トリチル）基とＡｃｍ基、Ｎｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジルチオ）基とＡｃｍ基、Ｓ−Ｂｕ−ｔ（Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチル）基とＡｃｍ基などが挙げられる。例えばＭｅＢｚｌ基とＡｃｍ基の組み合わせの場合、まずＭｅＢｚｌ基とシステイン側鎖以外のその他の保護基を除去した後、ペプチド単量体を含む溶液を空気酸化反応に付して脱保護されたシステイン残基間にジスルフィド結合を形成し、次いでヨウ素による脱保護および酸化を行ってＡｃｍ基で保護されていたシステイン残基間にジスルフィド結合を形成する方法などが挙げられる。
得られた本発明の化合物、ペプチドおよび中間体は、当業者に公知の方法や通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて精製することができる。例えば、種々のクロマトグラフィー（例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、もしくは逆相クロマトグラフィー）、または再結晶などで精製することができる。例えば、再結晶溶媒としては、メタノール、エタノールもしくは２−プロパノールなどのアルコール系溶媒、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、酢酸エチルなどのエステル系溶媒、ベンゼンもしくはトルエンなどの芳香族炭化水素系溶媒、アセトンなどのケトン系溶媒、ヘキサンなどの炭化水素系溶媒、ジメチルホルムアミドもしくはアセトニトリルなどの非プロトン系溶媒、水、またはこれらの混合溶媒などを用いることができる。その他精製方法としては、実験化学講座（日本化学会編、丸善）１巻などに記載された方法などを用いることができる。
ジスルフィド化合物の精製方法は、文献（ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている。中でも、ＨＰＬＣが好ましい。
本発明の化合物において、１つ以上の不斉点がある場合、通常の方法に従って、その不斉点を有する原料（アミノ酸）を用いることによって、製造することができる。また、本発明の化合物の光学純度を上げるために、製造工程の適当な段階で光学分割などを行ってもよい。光学分割法として例えば、本発明の化合物もしくはその中間体を不活性溶媒中（例えばメタノール、エタノール、もしくは２−プロパノールなどのアルコール系溶媒、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、酢酸エチルなどのエステル系溶媒、トルエンなどの炭化水素系溶媒、またはアセトニトリルなどの非プロトン系溶媒、およびこれらの混合溶媒）、光学活性な酸（例えば、マンデル酸、Ｎ−ベンジルオキシアラニン、もしくは乳酸などのモノカルボン酸、酒石酸、ｏ−ジイソプロピリデン酒石酸もしくはリンゴ酸などのジカルボン酸、またはカンファースルフォン酸もしくはブロモカンファースルフォン酸などのスルホン酸）と塩を形成させるジアステレオマー法により行うことができる。本発明の化合物または中間体がカルボキシ基などの酸性官能基を有する場合は、光学活性なアミン（例えばα−フェネチルアミン、キニン、キニジン、シンコニジン、シンコニン、ストリキニーネなどの有機アミン）と塩を形成させることにより光学分割を行うこともできる。
塩を形成させる温度としては、室温から溶媒の沸点までの範囲から選択される。光学純度を向上させるためには、一旦、溶媒の沸点付近まで温度を上げることが望ましい。析出した塩を濾取する際、必要に応じて冷却し収率を向上させることができる。光学活性な酸、またはアミンの使用量は、基質に対し約０．５〜約２．０当量の範囲、好ましくは１当量前後の範囲が適当である。必要に応じ結晶を不活性溶媒中（例えばメタノール、エタノール、２−プロパノールなどのアルコール系溶媒、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、酢酸エチルなどのエステル系溶媒、トルエンなどの炭化水素系溶媒、アセトニトリルなどの非プロトン系溶媒およびこれらの混合溶媒）で再結晶し、高純度の光学活性な塩を得ることもできる。また、必要に応じて光学分割した塩を通常の方法で酸または塩基で処理しフリー体として得ることもできる。
本発明における「薬学上許容される塩」としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。例えば、酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などの有機酸塩が挙げられ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などの無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩などの有機塩基塩などが挙げられ、さらにはアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性あるいは酸性アミノ酸といったアミノ酸塩が挙げられる。
本発明の化合物またはその薬学上許容される塩の水和物、エタノール溶媒和物などの溶媒和物も、本発明に含まれる。さらに、本発明は、式（１)で表される化合物のあらゆるジアステレオマー、エナンチオマーなどの存在し得るあらゆる立体異性体、およびあらゆる態様の結晶形も包含している。
一般にペプチドの製造においては、光学活性なα−アミノ酸を縮合する工程、種々の保護基を除去する工程またはペプチドを樹脂から切り出す工程などで、アミノ酸が欠損したペプチド、加水分解や酸化などにより分解したペプチド、アミノ酸がラセミ化したペプチドなど種々の副生成物が生ずる。実験室スケールでは、種々のクロマトグラフィー（例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、もしくは逆相クロマトグラフィー）を組み合わせることによって、これらの不純物を除去し高純度のペプチドや化合物を得ることができる。しかしながら、医薬品として提供するために工業的なスケールで高純度のペプチドや化合物を得ることは容易ではない。
本発明の化合物は、その物理化学的性質においても、医薬品原薬として大量製造可能な性質を有する。具体的には、溶解性が高い、溶液中安定性に優れている、または濃縮された際にゲル化しにくいなどの性質を有し、逆相ＨＰＬＣなどのカラムクロマトグラフィーによる精製工程で、大量スケールにおいても容易に高純度の化合物を原薬として製造することができる。
このようにして製造された本発明の化合物は、システイン残基がジスルフィド結合を形成していることなどにより、溶液中での酸化剤などに対する安定性に優れており、医薬品原料として一定の品質と効率的なＣＴＬ誘導活性を保持するものである。
本発明の化合物は、癌免疫療法におけるＣＴＬ誘導剤の有効成分として、癌ワクチンの有効成分として、また医薬組成物の有効成分として有用である。すなわち本発明の化合物は、本明細書の実施例に示すとおり、優れた免疫原性を有し、優れたＣＴＬ誘導活性を効率よく示すことができる。また、本発明の化合物によって誘導されるＣＴＬは、驚くべきことに、癌細胞が本来保有する癌抗原タンパクの天然型部分ペプチドを認識することができる。
ＣＴＬ誘導活性は、ＨＬＡテトラマー法（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２））または限界希釈法（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．：４，３２１−３２７（１９９８））によりＣＴＬの数を測定することにより確認することができる。あるいは、例えばＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ誘導活性の場合、国際公開第０２／４７４７４号およびＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に記述されたＨＬＡ−Ａ２４モデルマウスを用いることなどにより調べることができる。
従って、本発明の化合物は、癌抗原タンパク質が発現している癌や癌抗原タンパク遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌の治療薬または予防薬（再発防止薬）として用いることができる。当該癌としては、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫もしくは悪性リンパ腫などの血液性癌、または胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌もしくは脳腫瘍などの固形癌が挙げられる。
本発明の化合物またはその薬学上許容される塩は、各化合物または各塩に応じて適切な形態とすることにより、癌の細胞性免疫療法におけるＣＴＬ誘導剤の有効成分、癌ワクチンの有効成分または／および医薬組成物の有効成分とすることができる。
本発明の化合物の細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントとともに投与することができる。アジュバントとしては、文献（Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｒｅｖ．，７：２７７-２８９，１９９４）に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分、ＧＭ-ＣＳＦ、インターロイキン−２、インターロイキン−７もしくはインターロイキン−１２などのサイトカイン、植物由来成分、海洋生物由来成分、水酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルジョン製剤）などを挙げることができる。菌体由来成分としては、リピドＡ（ｌｉｐｉｄ Ａ）、その誘導体であるモノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）、細菌（ＢＣＧ菌などのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が挙げられる）の死菌、細菌由来のタンパク質、ポリヌクレオチド、フロイント不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）、フロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）、細胞壁骨格成分（例えばＢＣＧ-ＣＷＳなどが挙げられる）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）などが挙げられる。
また本発明の化合物は、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤などにして投与することもできる。
さらに本発明の化合物（コンジュゲート体）は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチド（すなわちヘルパーペプチド）と共に投与することができる。共に投与する方法としては、コンジュゲート体とヘルパーペプチドを個別に投与することも可能であるが、一つの医薬組成物の中にコンジュゲート体とヘルパーペプチドを含むカクテル製剤（カクテル剤、カクテル）がより好ましい。本カクテル製剤は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチド（すなわちキラーペプチド）を生じ得るコンジュゲート体およびＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチド（すなわちヘルパーペプチド）を含むものである。よって、癌免疫療法における癌ワクチンとして、ヘルパーペプチドを含有した本カクテル製剤を投与することによって、ＣＴＬを含む他のＴ ｃｅｌｌの機能亢進に重要であるヘルパーＴ細胞（ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ）の活性化も可能となり、コンジュゲート体の機能・薬効（細胞性免疫能など）を向上させることができる。
ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチド（すなわちヘルパーペプチド）については、本願明細書中に記載したとおりである。本カクテル製剤は、細胞性免疫能などの癌ワクチンとしての薬効が向上されたものであることを、一例として本願明細書の実施例や試験例として示したように、確認できた。
製剤中の本発明の化合物の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重などにより適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇである。
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与などが挙げられる。ＣＴＬを効率良く誘導する皮内投与や皮下投与が好ましい。投与回数および投与間隔は、治療または予防目的の疾患、患者の個体差により適宜調整することができるが、通常複数回であり、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
このような本発明の化合物を有効成分とする医薬組成物を癌抗原タンパク陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供することができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによりなんら限定されるものではない。
実施例１
以下のアミノ酸配列：
ＣＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：１００）
からなるペプチドの合成
１．保護ペプチド樹脂Fmoc-Lys(Boc)-Ile-Phe-Gly-Ser(tBu)-Leu-Ala-Phe-Leu-Alko-Resinの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌｋｏ−樹脂（Ａｌｋｏはｐ−アルコキシベンジルアルコール）８．２５ｇ（渡辺化学製；０．７７ｍｍｏｌ／ｇ）を１．０Ｌガラス製反応容器内に入れ、３０％Ｐｉｐ（ピペリジン）／ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）１５０ｍＬ溶液で処理（１０分×１回、５分×２回：合計４５０ｍＬ）し、Ｆｍｏｃ基を除去した（工程１）。ＤＭＦおよびジエチルエーテルで樹脂を洗浄した後、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ ６．２ｇ（５当量）、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）６．０４ｇ（５当量）およびＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）２．４６ｇ（５当量）を加え、次いでＤＭＦ １５０ｍｌとＤＩＥＡ（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）５．５２ｍｌ（５当量）を加えて３時間室温撹拌を行った（工程２）。ＤＭＦで樹脂を２回洗浄し、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌｋｏ樹脂を合成した。
次いで、以下に示すアミノ酸を用いて、工程１および工程２を順次各々行った。
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ ５．１４ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ ５．６９ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ ６．１８ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ ４．９７ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ ６．６３ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ ５．９８ｇ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ ７．８３ｇ。
但しＦｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−ＯＨについては工程２を３回繰り返して行った後、得られた樹脂をＤＭＦで洗浄後、２５％Ａｃ2Ｏ（無水酢酸）を用いて、未反応のアミノ基をキャッピングした（１５分×２回）。最後に、ＤＭＦ洗浄操作を実施し、Fmoc-Lys(Boc)-Ile-Phe-Gly-Ser(tBu)-Leu-Ala-Phe-Leu-Alko-Resin １４．１４ｇを得た。
２. 保護ペプチド樹脂 H-Cys(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Phe-Gly-Ser(tBu)-Leu-Ala-Phe-Leu-Alko-Resinの合成
上記操作によって得られた保護ペプチド樹脂Fmoc-Lys(Boc)-Ile-Phe-Gly-Ser(tBu)-Leu-Ala-Phe-Leu-Alko-Resin ５０３ｍｇを２５ｍｌガラス製反応容器に入れ国産化学社製ロータリーシェーカーＮ−５００で振とうしながら、工程１の脱保護操作を行い、H-Lys(Boc)-Ile-Phe-Gly-Ser(tBu)-Leu-Ala-Phe-Leu-Alko-Resinとした。Fmoc-Cys(tBu)-OH ３４０．４ｍｇとＨＢＴＵ ２４８．２ｍｇ、ＨＯＢＴ ９２．９ｍｇをＤＭＦ １０ｍｌに溶解した溶液を加え、更にＤＩＥＡ ０．２ｍｌを加えて ３時間室温で振とうし、工程２のカップリング反応を行った。ＤＭＦ １０ｍｌで４回洗浄した後に、３０％Ｐｉｐ／ＤＭＦ １０ｍｌで処理（１０分×１回及び５分×２回）してＦｍｏｃ基を切断した。ＴＦＡカクテル(２．５％テトライソプロピルシラン／２．５％ドデカンチオール／２．５％Ｈ2Ｏ／９２．５％ＴＦＡ溶液)１００ｍｌを加え、室温で２．０時間攪拌した。その後、ジエチルエーテルを加え、グラスフィルターで濾過を行い、ＴＦＡカクテルとジエチルエーテルを濾液として除いた。濾上物をジエチルエーテルで洗浄し、粗ペプチド（ＣＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：１００））２６９．５ｍｇを得た。
３. 粗ペプチドの精製
得られた粗ペプチド２６９．５ｍｇを、１液＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡと２液＝ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡの溶出液で、２液＝ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡの濃度を２４．３％で平衡化しているＤａｉｓｏ社製 Ｄａｉｓｏ−Ｐａｋ ＯＤＳ ３０ Ｉ.Ｄ.ｘ２５０ｍｍのカラムをセットしたＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ製；ＬＣ８ＡＤ型）にチャージした。２２０ｎｍのＵＶでモニターしながら２液の濃度４４．３％まで８０分間で上昇させ、目的ペプチドを含む分画を集めた。得られた溶液を凍結乾燥することによって目的とする精製品４９ｍｇを得た。
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ製；ＬＣ−８Ａ型
カラム：ＯＤＳ Ｄａｉｓｏ−Ｐａｋ ＯＤＳ ３０ Ｉ.Ｄ. ｃｍφ×ｃｍＬ
溶出液１：Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ
溶出液２：ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ
流速：２０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２２０ｎｍ
質量分析：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ ＝１０９８．９ ［Ｍ＋１］+（理論値＝１０９８．４）
実施例２〜２０
実施例１と同様の方法で、配列番号：９５〜９７、１０８〜１２３のアミノ酸配列からなる各ペプチドを合成した。表１６〜１７に、合成した各ペプチドの質量分析結果を示した。
表１６〜１７の何れのペプチドも、式（１）において、Ｒ1が水素原子であり、Ｘaが単結合であり、Ｙaが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり、且つ癌抗原ペプチドＡが癌抗原タンパクＨＥＲ２／ｎｅｕの部分ペプチドであるＨＥＲ２／ｎｅｕ369-377ペプチド（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）（配列番号：５３）である、本発明の化合物である。
参考例１
実施例１と同様の方法で、配列番号：８６のアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。表１８に、合成したペプチドの質量分析結果を示した。
配列番号：８６のペプチドは、前記のとおり、本発明の化合物ではないことから、参考例１として記した。
実施例２１〜２４
実施例１と同様の方法で、配列番号：９２〜９４、９９のアミノ酸配列からなる各ペプチドを合成した。表１９に、合成した各ペプチドの質量分析結果を示した。
表１９の何れのペプチドも、式（１）において、Ｒ1が水素原子であり、Ｘaが単結合であり、Ｙaが単結合または１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり、且つ癌抗原ペプチドＡが癌抗原タンパクＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３の部分ペプチドであるＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３169-177ペプチド（ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ）（配列番号：４３）である本発明の化合物である。
実施例２５〜２８
実施例１と同様の方法で、配列番号：９８、８９〜９１のアミノ酸配列からなる各ペプチドを合成した。表２０に、合成した各ペプチドの質量分析結果を示した。
表２０の何れのペプチドも、式（１）において、Ｒ1が水素原子であり、Ｘaが単結合であり、Ｙaが単結合または１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり、且つ癌抗原ペプチドＡが癌抗原タンパクＭＡＧＥ−Ａ１０の部分ペプチドであるＭＡＧＥ−Ａ１０254-262ペプチド（ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ）（配列番号：１９）である本発明の化合物である。
試験例１：ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング試験
実施例１〜２０にて合成したペプチドのＮ末端アミノ酸のトリミング効率をＥＲＡＰ１（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８， ｖｏｌ．３， Ｉｓｓｕｅ １１， ｅ３６５８）を用いて評価した。５０μｌのＥＲＡＰ１（５０ｎｇ／ｍｌ）ｐＨ８．０ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ− １００ｍＭ ＮａＣｌ バッファー（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌバッファー）溶液を１４２μｌのＴｒｉｓ・ＨＣｌバッファーに加えた。２．５ｍＭのペプチド水溶液８．０μｌを上述のＥＲＡＰ１溶液に加えて、良く混和した後に室温で静置した。１．０時間後に５０μｌＵＦＬＣ（分析条件は以下に示す。）に打ち込み、目的とするペプチドのＡＵＣを求めた。トリミングによって得られるペプチドを別に化学的に合成し、酵素の無い同様の条件で分析して得られたＡＵＣを基にして、トリミングによって得られたペプチド〔ＨＥＲ２／ｎｅｕ369-377ペプチド（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）（配列番号：５３）〕の生成率を求め、表２１に示した。
分析条件
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製 ＵＦＬＣ
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＸＲ−ＯＤＳ ３．０ｍｍｉ．ｄ．ｘ７５ｍｍ
溶液：０．０５％ ＴＦＡ Ｈ2Ｏ（Ａ）― ０．０５％ ＴＦＡ ＣＨ3ＣＮ（Ｂ）
オーブン温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：λ＝２２０ｎｍ
グラジエント：０．０ｍｉｎから５．０ｍｉｎでＢ液濃度を１０％から６０％まで上昇
試験例２：ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミングの経時変化
実施例１〜２、１１〜１２、２１〜２８にて合成した各ペプチドについて、ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミングの時間経過による変化を評価した。２０μｌのＥＲＡＰ１（０．５ｍｇ／ｍｌ）Ｔｒｉｓ・ＨＣｌバッファー溶液を１７２μｌのＴｒｉｓ・ＨＣｌバッファーに加えた。１０ｍＭの各ペプチドのＤＭＳＯ溶液８．０μｌを上述のＥＲＡＰ１溶液に加えて、良く混和した後に室温で静置した。１．０、２．０、４．０および８．０時間後に５０μｌのサンプルを１５０μｌのＭｅＯＨに加えて反応を停止し、２５μｌをＵＦＬＣ（分析条件は以下に示す。）に打ち込み、目的とするペプチドのＡＵＣを求めた。トリミングによって得られるペプチドを別に化学的に合成し、酵素の無い同様の条件で分析して得られたＡＵＣを基にして、トリミングによって得られたペプチドの生成率を求め、表２２に示した。
分析条件
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製 ＵＦＬＣ
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＸＲ−ＯＤＳ ３．０ｍｍｉ．ｄ．ｘ７５ｍｍ
溶液：０．０５％ ＴＦＡ Ｈ2Ｏ（Ａ）― ０．０５％ ＴＦＡ ＣＨ3ＣＮ（Ｂ）
オーブン温度：40℃
流速：1.0ml/min
検出波長：λ＝２２０ｎｍ
グラジエント： ０．０ｍｉｎから５．０ｍｉｎでＢ液濃度を１．０％から７０％まで上昇
目的とするペプチド：
ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミングにより得られるペプチドは、
配列番号：１００および９５〜９７の各ペプチドの場合、ＨＥＲ２／ｎｅｕ369-377ペプチド（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）（配列番号：５３）であり、
配列番号：９９および９２〜９４の各ペプチドの場合、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３169-177ペプチド（ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ）（配列番号：４３）であり、また
配列番号：９８および８９〜９１のペプチドの場合、ＭＡＧＥ−Ａ１０254-262ペプチド（ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ）（配列番号：１９）である。
試験例３：ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能の評価
表２３に示すシステイン（Ｃｙｓ）を延長した各ペプチド（Ｃｙｓ延長ペプチド）のＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬ誘導試験によって評価した。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＨＬＡ−Ａ２．１ＤＲ１）は、マウスのＭＨＣを欠損し、ヒトのＭＨＣであるＨＬＡ−Ａ０２０１とマウスＭＨＣであるＨ−２ＤbのキメラＨＬＡおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１を発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ＨＬＡ−Ａ０２陽性のヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能である（Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；３４：３０６０−９）。
Ｃｙｓを延長した各ペプチド（配列番号：１００、９９または９８）の投与により、がん細胞に内因性に提示されるペプチド（配列番号：５３、４３または１９）に対するＣＴＬが誘導されるか否かは、Ｃｙｓを延長したペプチド（配列番号：１００、９９または９８）を投与した上記マウス由来の脾細胞をペプチド（配列番号：５３、４３または１９）で再刺激を行った場合にＩＦＮγを産生するか測定することで判断した。表２４に示したがん細胞に内因性に提示されるペプチド（配列番号：５３、４３または１９）は、本試験例においては、Ｃｙｓ非延長ペプチドともいう。
具体的には、各ペプチド（配列番号：１９、４３、５３、９８、９９または１００）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で２００ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ５）で２ｍｇ／ｍＬに希釈したのち、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合しエマルション化させた。エマルション化させたペプチドは、マウスの尾根部皮内に５０μｇ／ｓｉｔｅで２箇所投与した。１週間後に、マウスをＣＯ2ガスにより安楽死させたのち脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＩＦＮγ産生の測定には、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いた。脾細胞調製の前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗マウスＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でブロッキングした。調製したＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を２．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、ブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。各ペプチド（配列番号：１９、４３、５３、９８、９９または１００）をＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で４０μｇ／ｍＬに希釈した。配列番号：５３または１００で示されるペプチドを投与したマウス由来の脾細胞にはそれら両者の希釈ペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）をパルスし、配列番号：４３または９９で示されるペプチドを投与したマウス由来の脾細胞にはそれら両者の希釈ペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）をパルスし、配列番号：１９または９８で示されるペプチドを投与したマウス由来の脾細胞にはそれら両者の希釈ペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）をパルスし、２０時間、３７℃、５％ ＣＯ2下で培養することでｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるペプチド再刺激を行った。その後、上清を除き、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、ＫＳ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果は図５〜７に示す。各図において、縦軸は播種細胞数中に反応した細胞数を示している。何れの図でも非パルスの場合の結果を示す白棒の値は、殆ど認められていない。このことはペプチド非再刺激ではそれぞれの遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。即ち、色棒と白棒の値の差がｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激時に利用したペプチドに特異的なＣＴＬの数を示しており、各ペプチドの投与によってマウス生体内で誘導されたことを示す。ここで、色棒とは、Ｃｙｓ非延長ペプチドでパルスした場合の結果を示す黒棒、またはＣｙｓ延長ペプチドでパルスした場合の結果を示す灰色棒を意味する。図５は配列番号：５３あるいは１００で示されるペプチドを投与した結果を、図６は配列番号：４３あるいは９９で示されるペプチドを投与した結果を、図７は配列番号：１９あるいは９８で示されるペプチドを投与した結果を示す。これより、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において、ｉｎ ｖｉｖｏ投与したペプチドのＣｙｓの延長の有無に関らずＣｙｓ非延長ペプチドあるいはＣｙｓ延長ペプチドによるｉｎ ｖｉｔｒｏの刺激に対して同程度のＩＦＮγ産生が確認され、Ｃｙｓ延長ペプチド（配列番号：１００、９９および９８）がｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＴＬ誘導能を持つことが判明した。即ち、Ｃｙｓ延長ペプチドの投与（配列番号：１００、９９または９８）により、Ｃｙｓ非延長ペプチド（配列番号：５３、４３または１９）を認識できるＣＴＬを誘導し得ることが判明した。このことは、Ｃｙｓ延長ペプチドはがん細胞に内因性に提示されるペプチド（Ｃｙｓ非延長ペプチド）を認識するＣＴＬを誘導できることを示しており、マウス生体内でＣｙｓ延長ペプチドがＥＲＡＰ１による適切なトリミングを受けて、Ｃｙｓ非延長ペプチドへ実際に生成されることが強く示唆された。
実施例２９
式（４）
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物の合成
工程１． H-Cys(Pys)-Gly-Leu-Tyr-Asp-Gly-Met-Glu-His-Leu-OH)の合成
〔すなわち式（１３）：
で表される化合物の合成〕
実施例２５で得たH-Cys-Gly-Leu-Tyr-Asp-Gly-Met-Glu-His-Leu-OH（配列番号：９８）２７４ｍｇの２．７４ｍＬの２０％ｗ／ｗ酢酸水溶液に、２，２’-ビスピリジルジスルフィドのイソプロパノール溶液（０．２Ｍ）を１．２０ｍＬ加えた後、室温にて３０分攪拌した。反応液を逆相ＨＰＬＣにて精製した。
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ製；ＬＣ−８Ａ型
カラム：ＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ ３ｃｍφ×２５ｃｍＬ, １０μｍ
溶出液１：Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ
溶出液２：ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ
流速：２０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２２０ｎｍ
２液濃度１０％で平衡化させたカラムに当該反応液を注入した。その後１０分間かけて、２液濃度を３２％まで上昇させた後、更に２液濃度を１分間あたり０．２５％の割合で上昇させた。目的物を含む画分を集め凍結乾燥を行うことで、H-Cys(Pys)-Gly-Leu-Tyr-Asp-Gly-Met-Glu-His-Leu-OH（すなわち式（１３）で表される化合物）２３０ｍｇを得た。
質量分析：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ ＝１２４６．７［Ｍ＋Ｈ］1+ （理論値＝１２４６．５）
工程２． （H-Cys-Gly-Leu-Tyr-Asp-Gly-Met-Glu-His-Leu-OH）（H-Cys-Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu-OH）disulfide bondの合成
〔すなわち式（４）
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物の合成〕
工程１で得たH-Cys(Pys)-Gly-Leu-Tyr-Asp-Gly-Met-Glu-His-Leu-OH（すなわち式（１３）で表される化合物）２７ｍｇと実施例１で得たH-Cys-Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu-OH（配列番号：１００）２３ｍｇとを混合し、２０％ｖ／ｖ酢酸水を２ｍＬ加え、室温にて３０分間攪拌した。反応液を逆相ＨＰＬＣにて精製した。
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ製；ＬＣ−８Ａ型
カラム：ＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ ３ｃｍφ×２５ｃｍＬ, １０μｍ
溶出液１：Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ
溶出液２：ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ
流速：２０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２２０ｎｍ
２液濃度１０％で平衡化させたカラムに当該反応液を注入した。その後２液濃度を１０分間かけて３４％まで上昇させた後、更に１分間あたり０．２５％の割合で上昇させた。目的物を含む画分を集め凍結乾燥し、目的とする式（４）で表される化合物２１ｍｇを得た。
質量分析：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ ＝１１１８．０［Ｍ＋２Ｈ］2+ （理論値＝１１１７．８）
実施例３０
式（１０）
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物の合成
実施例２９と同様の方法で、式（１０）で表される化合物を合成した。
質量分析：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ ＝１０８２．２［Ｍ＋２Ｈ］2+ （理論値＝１０８２．３）
試験例４：ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能の評価
実施例２９で合成した式（４）で表される化合物のＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬ誘導試験によって評価した。式（４）
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物は、前記の式（１）に照らすと、特に癌抗原ペプチドＡがＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号：１９）であり且つ癌抗原ペプチドＢがＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）である化合物である。ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号：１９）およびＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）はＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性癌抗原ペプチドである。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＨＬＡ−Ａ２．１ＤＲ１）は、マウスのＭＨＣを欠損し、ヒトのＭＨＣであるＨＬＡ−Ａ０２０１とマウスＭＨＣであるＨ−２ＤbのキメラＨＬＡおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１を発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ＨＬＡ−Ａ０２陽性のヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能である（Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；３４：３０６０−９）。
がん細胞で内因性に提示される各ペプチド（配列番号：１９、５３）に対するＣＴＬが誘導されるか否かを評価する目的で、式（４）で表される化合物をＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスへ投与した。すなわち、式（４）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞を、ペプチド（配列番号：１９、５３）で再刺激を行った場合に、ＩＦＮγを産生するか否かで確認した。
具体的には、式（４）で表される化合物を注射用水で１０ｍｇ／ｍＬに希釈したのち、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合しエマルション化させた。エマルション化させた化合物を、マウスの尾根部皮内に２５０μｇ／ｓｉｔｅで２箇所投与した。１週間後に、マウスをＣＯ2ガスにより安楽死させたのち脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＩＦＮγ産生の測定には、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いた。脾細胞調製の前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗マウスＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でブロッキングした。調製したＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を０．２５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、ブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。ペプチド（配列番号：１９、５３）をＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で４０μｇ／ｍＬに希釈した。ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：１９または配列番号５３で表される希釈ペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）でパルスし、２０時間、３７℃、５％ ＣＯ2下で培養することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるペプチド再刺激を加えた。培養後に上清を除き、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ.Ｔ.Ｌ.社製）によって測定した。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果を図８に示した。
図８において、縦軸は播種細胞数中に反応した細胞数を示す。図８の黒棒、斜線棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：１９、５３で表される各ペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。即ち、黒棒または斜線棒と白棒の値の差がペプチド特異的ＣＴＬの数を示し、式（４）で表される化合物の投与によってマウス生体内において配列番号：１９、５３で表される各ペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたことを示す。
図８において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチドをパルスしない場合にはＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：１９、５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγの産生が確認された。
これより、式（４）で表される化合物は配列番号：１９、５３で表される各ペプチド特異的なＣＴＬを誘導し得ることが明らかとなった。式（４）で表される化合物は、マウス生体内でジスルフィド結合の切断とＥＲＡＰ−１による適切なトリミングを受けて、配列番号：１９および５３で表されるペプチドへ実際に生成されることが強く示唆された。
すなわち、本発明の化合物の一例である式（４）で表される化合物は、異なる２種のペプチドを式（１）に示されたようなジスルフィド結合を介して複合化されたコンジュゲート体であり、実際にｉｎ ｖｉｖｏにおいて異なる２種のＣＴＬを誘導できる癌抗原ペプチドコンジュゲートワクチンであることが、明らかとなった。
試験例５：ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスおよびＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能の評価
実施例３０で合成した式（１０）で表される化合物のＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスおよびＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬ誘導試験によって評価した。式（１０）
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物は、前記の式（１）に照らすと、特に癌抗原ペプチドＡがＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号：１９）であり且つ癌抗原ペプチドＤがＶＹＧＦＶＲＡＣＬ（配列番号：８７）である化合物である。ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号：１９）はＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性癌抗原ペプチドであり、ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ（配列番号：８７）はＨＬＡ−Ａ２４拘束性癌抗原ペプチドである。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスについては、試験例４に記したとおりである。一方、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウス (Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋb)は、ヒトのＭＨＣであるＨＬＡ−Ａ２４０２とマウスＭＨＣであるＨ−２ＫbのキメラＨＬＡを発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能である（Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００２；１００：５６５−７０）。
がん細胞で内因性に提示される各ペプチド（配列番号：１９、８７）に対するＣＴＬが誘導されるか否かを評価する目的で、式（１０）で表される化合物をＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスおよびＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウスへ投与した。すなわち、式（１０）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞を、ペプチド（配列番号：１９、８７）で再刺激を行った場合に、ＩＦＮγを産生するか否かで確認した。
具体的には、式（１０）で表される化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で８０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに注射用水で１０ｍｇ／ｍＬに希釈したのち、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合しエマルション化させた。エマルション化させた化合物を、マウスの尾根部皮内に２５０μｇ／ｓｉｔｅで２箇所投与した。１週間後に、マウスをＣＯ2ガスにより安楽死させたのち脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＩＦＮγ産生の測定には、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いた。脾細胞調製の前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗マウスＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でブロッキングした。調製したＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を０．２５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞を０．５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、ブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。ペプチド（配列番号：１９、８７）をＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で４０μｇ／ｍＬに希釈した。ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：１９で表される希釈ペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）でパルスし、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：８７で表される希釈ペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）でパルスし、２０時間、３７℃、５％ ＣＯ2下で培養することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるペプチド再刺激を加えた。培養後に上清を除き、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ.Ｔ.Ｌ.社製）によって測定した。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果を図９に、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果を図１０に示した。
各図において、縦軸は播種細胞数中に反応した細胞数を示す。図９の黒棒、白棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：１９で表されるペプチドのパルスおよび非パルスしながら培養した結果を、図１０の黒棒、白棒はＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：８７で表されるペプチドのパルスおよび非パルスしながら培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差がペプチド特異的ＣＴＬの数を示し、式（１０）で表される化合物の投与によってマウス生体内において配列番号：１９、８７で表される各ペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたことを示す。
特に図９において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチド非存在下ではＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞においては配列番号：１９で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγの産生が、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞においては配列番号：８７で表されるペプチド特異的なＩＦＮγの産生が確認された。
これより、式（１０）で表される化合物は配列番号：１９、８７で表される各ペプチド特異的なＣＴＬを誘導し得ることが明らかとなった。式（１０）で表される化合物は、マウス生体内でジスルフィド結合の切断とＥＲＡＰ−１による適切なトリミングを受けて、配列番号：１９および８７で表されるペプチドへ実際に生成されることが強く示唆された。
すなわち、本発明の化合物の一例である式（１０）で表される化合物は、異なる２種のペプチドを式（１）に示されたようなジスルフィド結合を介して複合化されたコンジュゲート体であり、実際にｉｎ ｖｉｖｏにおいて異なる２種のＣＴＬを誘導できる癌抗原ペプチドコンジュゲートワクチンであることが、明らかとなった。
実施例３１〜４９
実施例１と同様の方法で、配列番号：１２４〜１４２のアミノ酸配列からなる各ペプチドを合成した。表２５〜２６に、合成した各ペプチドの質量分析結果を示した。
表２５〜２６の何れのペプチドも、式（１）において、Ｒ1が水素原子であり、Ｘaが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり、Ｙaが単結合であり、且つ癌抗原ペプチドＡが癌抗原タンパクＨＥＲ２／ｎｅｕの部分ペプチドであるＨＥＲ２／ｎｅｕ369-377ペプチド（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）（配列番号：５３）である、本発明の化合物である。
実施例５０〜６８
実施例１と同様の方法で、配列番号：１４３〜１６１のアミノ酸配列からなる各ペプチドを合成した。表２７〜２８に、合成した各ペプチドの質量分析結果を示した。
表２７〜２８の何れのペプチドも、式（１）において、Ｒ1が水素原子であり、Ｘaが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり、Ｙaが単結合であり、且つ癌抗原ペプチドＡが癌抗原タンパクＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３の部分ペプチドであるＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３169-177ペプチド（ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ）（配列番号：４３）である、本発明の化合物である。
実施例６９〜８４
実施例１と同様の方法で、配列番号：１６２〜１７７のアミノ酸配列からなる各ペプチドを合成した。表２９〜３０に、合成した各ペプチドの質量分析結果を示した。
表２９〜３０の何れのペプチドも、式（１）において、Ｒ1が水素原子であり、Ｘaが単結合であり、Ｙaが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり、且つ癌抗原ペプチドＡが癌抗原タンパクＭＡＧＥ−Ａ１０の部分ペプチドであるＭＡＧＥ−Ａ１０254-262ペプチド（ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ）（配列番号：１９）である、本発明の化合物である。
実施例８５〜１０３
実施例１と同様の方法で、配列番号：１７８〜１９６のアミノ酸配列からなる各ペプチドを合成した。表３１〜３２に、合成した各ペプチドの質量分析結果を示した。
表３１〜３２の何れのペプチドも、式（１）において、Ｒ1が水素原子であり、Ｘaが１残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基であり、Ｙaが単結合であり、且つ癌抗原ペプチドＡが癌抗原タンパクＭＡＧＥ−Ａ１０の部分ペプチドであるＭＡＧＥ−Ａ１０254-262ペプチド（ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ）（配列番号：１９）である、本発明の化合物である。
試験例６：ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング試験
実施例３１〜４９にて合成したペプチドのＮ末端アミノ酸のトリミング効率をＥＲＡＰ１を用いて評価した。５０μｌのＥＲＡＰ１（５０μｇ／ｍｌ）ｐＨ８．０ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ− １００ｍＭ ＮａＣｌ バッファー（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌバッファー）溶液を１４２μｌのＴｒｉｓ・ＨＣｌバッファーに加えた。１０ｍＭのペプチドＤＭＳＯ溶液２．０μｌおよびＤＭＳＯ６．０μＬを上述のＥＲＡＰ１溶液に加えて、良く混和した後に３０℃で静置した。１．０時間後に５０μｌＵＦＬＣ（分析条件は以下に示す。）に打ち込み、目的とするペプチドのＡＵＣを求めた。トリミングによって得られるペプチドを別に化学的に合成し、酵素の無い同様の条件で分析して得られたＡＵＣを基にして、トリミングによって得られたペプチド〔ＨＥＲ２／ｎｅｕ369-377ペプチド（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）（配列番号：５３）〕の生成率を求め、表３３に示した。
分析条件
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製 ＵＦＬＣ
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＸＲ−ＯＤＳ ３．０ｍｍｉ．ｄ．ｘ７５ｍｍ
溶液：０．０５％ ＴＦＡ Ｈ2Ｏ（Ａ）― ０．０５％ ＴＦＡ ＣＨ3ＣＮ（Ｂ）
オーブン温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：λ＝２２０ｎｍ
グラジエント：０．０ｍｉｎから５．０ｍｉｎでＢ液濃度を１０％から７０％まで上昇
試験例７：溶解度測定
工程１．等張緩衝液の調製
１．７５％リン酸水素二ナトリウム水溶液と５．５３％クエン酸水溶液を混合し、ｐＨ６．０および７．４の緩衝液を調製した。
工程２．試験溶液の調製
被験物を１ｍｇ程度秤量し、等張緩衝液を０．５ｍＬ加えこれを試験溶液とした。調製した試験溶液は室温にて９０分間振とう（振とう条件： TAITEC社製RECIPRO SHAKER SR-1N, Speed=８）後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間、室温）を行い、遠心分離後の上清を試験溶液とした。
工程３．標準液の調製
被験物約1ｍｇを精秤し、０．１％ＴＦＡ水／アセトニトリル＝１／１にて溶解し、全量を１０ｍＬとし、これを被験物の標準液として用いた。
工程４．被験物の濃度測定
被験物の標準液及び試験溶液をＨＰＬＣ（分析条件は表３４に記載）にて分析を行い、標準液のピーク面積比より被験物の溶解度を算出する。
ＨＰＬＣ測定条件
カラム：Ｃｈｅｍｃｏｐａｃｋ Ｑｕｉｃｋｓｏｒｂ(４．６ ｍｍφ×１５０ ｍｍ, ５μｍ) ケムコ株式会社製
移動相：Ａ液；０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液；０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液
カラム温度：室温
流速：１ｍＬ/ｍｉｎ
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ,２３０ｎｍ（２波長検出）
サンプル注入量：１０μＬ
配列番号：１９、８７および５３のアミノ酸配列からなる各ペプチドならびに実施例２９にて合成した式（４）で表される化合物（コンジュゲート体）について、上記の溶解度測定を行い、各溶解度を表３５に示した。
実施例１０４〜１０５
実施例１と同様の方法で、配列番号１９７および１９８のアミノ酸配列からなる各ペプチドを合成した。表３６に、合成した各ペプチドの質量分析結果を示した。
表３６の何れのペプチドも、式（２）において、Ｘbが単結合であり、Ｙbが単結合であり、且つ癌抗原ペプチドＢがＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド（配列番号：１０１および１０２）である、本発明の化合物である。
実施例１０６〜１０７
実施例１と同様の方法で、配列番号１９９および２００のアミノ酸配列からなる各ペプチドを合成した。表３７に、合成した各ペプチドの質量分析結果を示した。
表３７の何れのペプチドも、式（３）において、Ｘcが単結合であり、Ｙcが単結合であり、且つ癌抗原ペプチドＣがＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド（配列番号：１０１および１０２）である、本発明の化合物である。
実施例１０８
式（１４）
で表される化合物の合成
実施例２９工程１記載の合成法を用いてH-Cys（Ｐｙｓ）-Lys-Ile-Phe-Gｌｙ-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu-OHすなわち式（１４）で表される化合物を合成した。
質量分析：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ ＝１２０８．１［Ｍ＋Ｈ］+ （理論値＝１２０８．５）
実施例１０９〜１１３
実施例２９工程２記載の合成法及び実施例１０８記載の合成法を用いて式（５）、（１１）および（１５）〜（１７）で表される各化合物（コンジュゲート体）を合成した。表３８に質量分析結果を示した。（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
実施例１１４〜１４３
実施例１と同様の方法で、配列番号：２０１〜２３０のアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。表３９〜４１に、合成した各ペプチドの質量分析結果を示した。
表３９〜４１の何れのペプチドも、式（１）において、Ｒ1が水素原子であり、Ｘaが単結合であり、Ｙaが単結合であり、且つ癌抗原ペプチドＡが表１〜９に示したＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドである、本発明の化合物である。
試験例８
実施例１０９〜１１３にて合成した式（５）、（１１）および（１５）〜（１７）で表される化合物（コンジュゲート体）について、試験例７に示した溶解度測定を行い、各溶解度を表４２に示した。
試験例９：ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング試験
実施例６９〜８４にて合成したペプチドのＮ末端アミノ酸のトリミング効率をＥＲＡＰ１を用いて評価した。５０μｌのＥＲＡＰ１（１０μｇ／ｍｌ）ｐＨ８．０ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ− １００ｍＭ ＮａＣｌ バッファー（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌバッファー）溶液を１４２μｌのＴｒｉｓ・ＨＣｌバッファーに加えた。１０ｍＭのペプチドＤＭＳＯ溶液２．０μｌおよびＤＭＳＯ６．０μＬを上述のＥＲＡＰ１溶液に加えて、良く混和した後に３０℃で静置した。１．０時間後に５０μｌＵＦＬＣ（分析条件は以下に示す。）に打ち込み、目的とするペプチドのＡＵＣを求めた。トリミングによって得られるペプチドを別に化学的に合成し、酵素の無い同様の条件で分析して得られたＡＵＣを基にして、トリミングによって得られたペプチド〔ＭＡＧＥ‐Ａ１０254‐262ペプチド（ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ）（配列番号：１９）〕の生成率を求め、表４３および４４に示した。
分析条件
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製 ＵＦＬＣ
カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．６ｕ Ｃ１８ １００Ａ ３．０ｍｍｉ．ｄ．ｘ７５ｍｍ
溶液：０．１％ ＴＦＡ Ｈ2Ｏ（Ａ）― ０．１％ ＴＦＡ ＣＨ3ＣＮ（Ｂ）
オーブン温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：λ＝２２０ｎｍ
グラジエント：０．０ｍｉｎから８．５ｍｉｎでＢ液濃度を１０％から５０％まで上昇
試験例１０：ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング試験
実施例８５〜１０３にて合成したペプチドのＮ末端アミノ酸のトリミング効率をＥＲＡＰ１を用いて評価した。５０μｌのＥＲＡＰ１（１０μｇ／ｍｌ）ｐＨ８．０ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ− １００ｍＭ ＮａＣｌ バッファー（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌバッファー）溶液を１４２μｌのＴｒｉｓ・ＨＣｌバッファーに加えた。１０ｍＭのペプチドＤＭＳＯ溶液２．０μｌおよびＤＭＳＯ６．０μＬを上述のＥＲＡＰ１溶液に加えて、良く混和した後に３０℃で静置した。１．０時間後に５０μｌＵＦＬＣ（分析条件は以下に示す。）に打ち込み、目的とするペプチドのＡＵＣを求めた。トリミングによって得られるペプチドを別に化学的に合成し、酵素の無い同様の条件で分析して得られたＡＵＣを基にして、トリミングによって得られたペプチド〔ＭＡＧＥ‐Ａ１０254‐262ペプチド（ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ）（配列番号：１９）〕の生成率を求め、表４５および４６に示した。
分析条件
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製 ＵＦＬＣ
カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．６ｕ Ｃ１８ １００Ａ ３．０ｍｍｉ．ｄ．ｘ７５ｍｍ
溶液：０．１％ ＴＦＡ Ｈ2Ｏ（Ａ）― ０．１％ ＴＦＡ ＣＨ3ＣＮ（Ｂ）
オーブン温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：λ＝２２０ｎｍ
グラジエント：０．０ｍｉｎから８．５ｍｉｎでＢ液濃度を１０％から５０％まで上昇
試験例１１：ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング試験
実施例５０、５６、６４及び６７にて合成したペプチドのＮ末端アミノ酸のトリミング効率をＥＲＡＰ１を用いて評価した。５０μｌのＥＲＡＰ１（１０μｇ／ｍｌ）ｐＨ８．０ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ− １００ｍＭ ＮａＣｌ バッファー（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌバッファー）溶液を１４２μｌのＴｒｉｓ・ＨＣｌバッファーに加えた。１０ｍＭのペプチドＤＭＳＯ溶液２．０μｌおよびＤＭＳＯ６．０μＬを上述のＥＲＡＰ１溶液に加えて、良く混和した後に３０℃で静置した。１．０時間後に５０μｌＵＦＬＣ（分析条件は以下に示す。）に打ち込み、目的とするペプチドのＡＵＣを求めた。トリミングによって得られるペプチドを別に化学的に合成し、酵素の無い同様の条件で分析して得られたＡＵＣを基にして、トリミングによって得られたペプチド〔Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３169-177ペプチド（ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ）（配列番号：４３）〕の生成率を求め、表４７に示した。
分析条件
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製 ＵＦＬＣ
カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．６ｕ Ｃ１８ １００Ａ ３．０ｍｍｉ．ｄ．ｘ７５ｍｍ
溶液：０．１％ ＴＦＡ Ｈ2Ｏ（Ａ）― ０．１％ ＴＦＡ ＣＨ3ＣＮ（Ｂ）
オーブン温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：λ＝２２０ｎｍ
グラジエント：０．０ｍｉｎから８．５ｍｉｎでＢ液濃度を１０％から５０％まで上昇
試験例１２：ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング試験
実施例１１４〜１１５、１１８〜１２２、１２６、１２９、１３２、１３７、１３９および１４１〜１４３にて合成したペプチドのＮ末端アミノ酸のトリミング効率をＥＲＡＰ１を用いて評価した。５０μｌのＥＲＡＰ１（１０μｇ／ｍｌ）ｐＨ８．０ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ− １００ｍＭ ＮａＣｌ バッファー（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌバッファー）溶液を１４２μｌのＴｒｉｓ・ＨＣｌバッファーに加えた。１０ｍＭのペプチドＤＭＳＯ溶液２．０μｌおよびＤＭＳＯ６．０μＬを上述のＥＲＡＰ１溶液に加えて、良く混和した後に３０℃で静置した。１．０時間後に５０μｌＵＦＬＣ（分析条件は以下に示す。）に打ち込み、目的とするペプチドのＡＵＣを求めた。トリミングによって得られるペプチドを別に化学的に合成し、酵素の無い同様の条件で分析して得られたＡＵＣを基にして、トリミングによって得られたペプチドの生成率を求め、表４８〜４９に示した。
分析条件
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製 ＵＦＬＣ
カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．６ｕ Ｃ１８ １００Ａ ３．０ｍｍｉ．ｄ．ｘ７５ｍｍ
溶液：０．１％ ＴＦＡ Ｈ2Ｏ（Ａ）― ０．１％ ＴＦＡ ＣＨ3ＣＮ（Ｂ）
オーブン温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：λ＝２２０ｎｍ
グラジエント：０．０ｍｉｎから８．５ｍｉｎでＢ液濃度を１０％から５０％まで上昇
実施例１４４〜１４６
実施例２９と同様の方法で、式（７）〜（９）で表される各化合物（コンジュゲート体）を合成した。表５０に質量分析結果を示した。（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
試験例１３：ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能の評価
実施例１０９で合成した式（１１）で表される化合物のＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬ誘導試験によって評価した。式（１１）
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物は、前記の式（１）に照らすと、特に癌抗原ペプチドＡがＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号：１９）であり且つ癌抗原ペプチドＤがＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号：８８）である化合物である。ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号：１９）およびＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号：８８）はＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性癌抗原ペプチドである。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスについては、試験例４に記したとおりである。
がん細胞で内因性に提示される各ペプチド（配列番号：１９、８８）に対するＣＴＬが誘導されるか否かを評価する目的で、式（１１）で表される化合物をＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスへ投与した。すなわち、式（１１）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞を、ペプチド（配列番号：１９、８８）で再刺激を行った場合に、ＩＦＮγを産生するか否かで確認した。
具体的には、式（１１）で表される化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で８０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに注射用水で１０ｍｇ／ｍＬに希釈したのち、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合しエマルション化させた。エマルション化させた化合物を、マウスの尾根部皮内に２５０μｇ／ｓｉｔｅで２箇所投与した。１週間後に、マウスをＣＯ2ガスにより安楽死させたのち脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＩＦＮγ産生の測定には、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いた。脾細胞調製の前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗マウスＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でブロッキングした。調製したＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を０．２５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、ブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。ペプチド（配列番号：１９、８８）をＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で４０μｇ／ｍＬに希釈した。ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：１９または配列番号８８で表される希釈ペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）でパルスし、１７時間、３７℃、５％ ＣＯ2下で培養することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるペプチド再刺激を加えた。培養後に上清を除き、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ.Ｔ.Ｌ.社製）によって測定した。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果を図１１に示した。
図１１において、縦軸は播種細胞数中に反応した細胞数を示す。図１１の黒棒、斜線棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：１９、８８で表される各ペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。即ち、黒棒または斜線棒と白棒の値の差がペプチド特異的ＣＴＬの数を示し、式（１１）で表される化合物の投与によってマウス生体内において配列番号：１９、８８で表される各ペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたことを示す。
図１１において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチドをパルスしない場合にはＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：１９、８８で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγの産生が確認された。
これより、式（１１）で表される化合物は配列番号：１９、８８で表される各ペプチド特異的なＣＴＬを誘導し得ることが明らかとなった。式（１１）で表される化合物は、マウス生体内でジスルフィド結合の切断とＥＲＡＰ−１による適切なトリミングを受けて、配列番号：１９および８８で表されるペプチドへ実際に生成されることが強く示唆された。
すなわち、本発明の化合物の一例である式（１１）で表される化合物は、異なる２種のペプチドを式（１）に示されたようなジスルフィド結合を介して複合化されたコンジュゲート体であり、実際にｉｎ ｖｉｖｏにおいて異なる２種のＣＴＬを誘導できる癌抗原ペプチドコンジュゲートワクチンであることが、明らかとなった。
試験例１４：ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能の評価
実施例１１０で合成した式（５）で表される化合物のＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬ誘導試験によって評価した。式（５）
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物は、前記の式（１）に照らすと、特に癌抗原ペプチドＡがＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号：１９）であり且つ癌抗原ペプチドＡがＶＬＱＥＬＮＶＴＶ（配列番号：４３）である化合物である。ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号：１９）およびＶＬＱＥＬＮＶＴＶ（配列番号：４３）はＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性癌抗原ペプチドである。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスについては、試験例４に記したとおりである。
がん細胞で内因性に提示される各ペプチド（配列番号：１９、４３）に対するＣＴＬが誘導されるか否かを評価する目的で、式（５）で表される化合物をＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスへ投与した。すなわち、式（５）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞を、ペプチド（配列番号：１９、４３）で再刺激を行った場合に、ＩＦＮγを産生するか否かで確認した。
具体的には、式（５）で表される化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で８０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに注射用水で１０ｍｇ／ｍＬに希釈したのち、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合しエマルション化させた。エマルション化させた化合物を、マウスの尾根部皮内に２５０μｇ／ｓｉｔｅで２箇所投与した。１週間後に、マウスをＣＯ2ガスにより安楽死させたのち脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＩＦＮγ産生の測定には、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いた。脾細胞調製の前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗マウスＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でブロッキングした。調製したＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を０．２５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、ブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。ペプチド（配列番号：１９、４３）をＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で４０μｇ／ｍＬに希釈した。ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：１９または配列番号４３で表される希釈ペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）でパルスし、１７時間、３７℃、５％ ＣＯ2下で培養することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるペプチド再刺激を加えた。培養後に上清を除き、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ.Ｔ.Ｌ.社製）によって測定した。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果を図１２に示した。
図１２において、縦軸は播種細胞数中に反応した細胞数を示す。図１２の黒棒、斜線棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：１９、４３で表される各ペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。即ち、黒棒または斜線棒と白棒の値の差がペプチド特異的ＣＴＬの数を示し、式（５）で表される化合物の投与によってマウス生体内において配列番号：１９、４３で表される各ペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたことを示す。
図１２において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチドをパルスしない場合にはＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：１９、４３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγの産生が確認された。
これより、式（５）で表される化合物は配列番号：１９、４３で表される各ペプチド特異的なＣＴＬを誘導し得ることが明らかとなった。式（５）で表される化合物は、マウス生体内でジスルフィド結合の切断とＥＲＡＰ−１による適切なトリミングを受けて、配列番号：１９および４３で表されるペプチドへ実際に生成されることが強く示唆された。
すなわち、本発明の化合物の一例である式（５）で表される化合物は、異なる２種のペプチドを式（１）に示されたようなジスルフィド結合を介して複合化されたコンジュゲート体であり、実際にｉｎ ｖｉｖｏにおいて異なる２種のＣＴＬを誘導できる癌抗原ペプチドコンジュゲートワクチンであることが、明らかとなった。
試験例１５：ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング試験
実施例１２３〜１２５、１３０、１３４〜１３５及び１３８にて合成したペプチドのＮ末端アミノ酸のトリミング効率をＥＲＡＰ１を用いて評価した。５０μｌのＥＲＡＰ１（５０μｇ／ｍｌ）ｐＨ８．０ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ− １００ｍＭ ＮａＣｌ バッファー（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌバッファー）溶液を１４２μｌのＴｒｉｓ・ＨＣｌバッファーに加えた。１０ｍＭのペプチドＤＭＳＯ溶液２．０μｌおよびＤＭＳＯ６．０μＬを上述のＥＲＡＰ１溶液に加えて、良く混和した後に３０℃で静置した。１．０時間後に５０μｌＵＦＬＣ（分析条件は以下に示す。）に打ち込み、目的とするペプチドのＡＵＣを求めた。トリミングによって得られるペプチドを別に化学的に合成し、酵素の無い同様の条件で分析して得られたＡＵＣを基にして、トリミングによって得られたペプチドの生成率を求め、表５１に示した。
分析条件
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製 ＵＦＬＣ
カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．６ｕ Ｃ１８ １００Ａ ３．０ｍｍｉ．ｄ．ｘ７５ｍｍ
溶液：０．１％ ＴＦＡ Ｈ2Ｏ（Ａ）― ０．１％ ＴＦＡ ＣＨ3ＣＮ（Ｂ）
オーブン温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：λ＝２２０ｎｍ
グラジエント：０．０ｍｉｎから８．５ｍｉｎでＢ液濃度を１０％から５０％まで上昇
試験例１６：ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング試験
実施例１４０にて合成したペプチドのＮ末端アミノ酸のトリミング効率をＥＲＡＰ１を用いて評価した。５０μｌのＥＲＡＰ１（５０μｇ／ｍｌ）ｐＨ８．０ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ− １００ｍＭ ＮａＣｌ バッファー（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌバッファー）溶液を１４２μｌのＴｒｉｓ・ＨＣｌバッファーに加えた。１０ｍＭのペプチドＤＭＳＯ溶液２．０μｌおよびＤＭＳＯ６．０μＬを上述のＥＲＡＰ１溶液に加えて、良く混和した後に３０℃で静置した。１．０時間後に５０μｌＵＦＬＣ（分析条件は以下に示す。）に打ち込み、目的とするペプチドのＡＵＣを求めた。トリミングによって得られるペプチドを別に化学的に合成し、酵素の無い同様の条件で分析して得られたＡＵＣを基にして、トリミングによって得られたペプチドの生成率を求め、表５２に示した。
分析条件
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製 ＵＦＬＣ
カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．６ｕ Ｃ１８ １００Ａ ３．０ｍｍｉ．ｄ．ｘ７５ｍｍ
溶液：０．１％ ＴＦＡ Ｈ2Ｏ（Ａ）― ０．１％ ＴＦＡ ＣＨ3ＣＮ（Ｂ）
オーブン温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：λ＝２２０ｎｍ
グラジエント：０．０ｍｉｎから８．５ｍｉｎでＢ液濃度を１％から３０％まで上昇
試験例１７：ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング試験
実施例１３１にて合成したペプチドのＮ末端アミノ酸のトリミング効率をＥＲＡＰ１を用いて評価した。５０μｌのＥＲＡＰ１（１００μｇ／ｍｌ）ｐＨ８．０ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ− １００ｍＭ ＮａＣｌ バッファー（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌバッファー）溶液を１４２μｌのＴｒｉｓ・ＨＣｌバッファーに加えた。１０ｍＭのペプチドＤＭＳＯ溶液８．０μｌを上述のＥＲＡＰ１溶液に加えて、良く混和した後に３０℃で静置した。１．０時間後に１０μｌＵＦＬＣ（分析条件は以下に示す。）に打ち込み、目的とするペプチドのＡＵＣを求めた。トリミングによって得られるペプチドを別に化学的に合成し、酵素の無い同様の条件で分析して得られたＡＵＣを基にして、トリミングによって得られたペプチドの生成率を求め、表５３に示した。
分析条件
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製 ＵＦＬＣ
カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．６ｕ Ｃ１８ １００Ａ ３．０ｍｍｉ．ｄ．ｘ７５ｍｍ
溶液：０．１％ ＴＦＡ Ｈ2Ｏ（Ａ）― ０．１％ ＴＦＡ ＣＨ3ＣＮ（Ｂ）
オーブン温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：λ＝２２０ｎｍ
グラジエント：０．０ｍｉｎから８．５ｍｉｎでＢ液濃度を１０％から５０％まで上昇
試験例１８：ＥＲＡＰ１によるＮ末端アミノ酸のトリミング試験
実施例１３６にて合成したペプチドのＮ末端アミノ酸のトリミング効率をＥＲＡＰ１を用いて評価した。５０μｌのＥＲＡＰ１（１００μｇ／ｍｌ）ｐＨ８．０ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ− １００ｍＭ ＮａＣｌ バッファー（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌバッファー）溶液を１４２μｌのＴｒｉｓ・ＨＣｌバッファーに加えた。１０ｍＭのペプチドＤＭＳＯ溶液８．０μｌを上述のＥＲＡＰ１溶液に加えて、良く混和した後に３０℃で静置した。１．０時間後に１０μｌＵＦＬＣ（分析条件は以下に示す。）に打ち込み、目的とするペプチドのＡＵＣを求めた。トリミングによって得られるペプチドを別に化学的に合成し、酵素の無い同様の条件で分析して得られたＡＵＣを基にして、トリミングによって得られたペプチドの生成率を求め、表５４に示した。
分析条件
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製 ＵＦＬＣ
カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．６ｕ Ｃ１８ １００Ａ ３．０ｍｍｉ．ｄ．ｘ７５ｍｍ
溶液：０．１％ ＴＦＡ Ｈ2Ｏ（Ａ）― ０．１％ ＴＦＡ ＣＨ3ＣＮ（Ｂ）
オーブン温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：λ＝２２０ｎｍ
グラジエント：０．０ｍｉｎから８．５ｍｉｎでＢ液濃度を１％から３０％まで上昇
実施例１４７〜１４８
実施例２９と同様の方法で、式（１２）及び（１８）で表される各化合物（コンジュゲート体）を合成した。表５５に質量分析結果を示した。（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
参考例２〜９
実施例１と同様の方法で、配列番号：２３１〜２３８のアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。表５６に、合成した各ペプチドの質量分析結果を示した。
配列番号：２３１〜２３８は本発明の化合物ではないことから参考例として記載した。
表５６に示す配列番号：２３３、２３４、２３７及び２３８で表されるペプチドは非特許文献Cancer Science January 2012, Vol. 103, no. 1, 150-153. を参考に合成した。
実施例１４９
式（１９）
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物の合成
工程１．Fmoc-Cys(Mmt)-Ala-SBnの合成（Mmtは4-Methoxytrityl）
（Ｆｍｏｃ−Ｃ（Ｍｍｔ）Ａ−ＳＢｎの合成）
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨ（４．８０ｇ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．５６ｍＬ）、ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム（４．５０ｇ）及び公知の方法（例えばJournal of Organic Chemistry, Vol. 64, No. 24 8761-8769）にて合成されたＨ−Ａｌａ−ＳＢｎのクロロホルム（２０ｍＬ）溶液を室温にて１時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒はヘキサン／酢酸エチル）にて精製することで目的化合物であるＦｍｏｃ−Ｃ（Ｍｍｔ）Ａ−ＳＢｎ（２．８０ｇ）を得た。
ＮＭＲ：1H NMR （CDCl3）δ 7.72 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.38-7.34 (m, 7H), 7.29-7.25 (m, 6H), 7.23-7.15 (m, 7H), 6.76 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.15 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.95 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.57 (quin, J = 7.6 Hz, 1H), 4.35 (d, J = 6.8 Hz, 2H) 4.19-4.17 (m, 1H), 4.04 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.72 (dd, J = 13.2, 8.4 Hz, 1H), 2.61 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 1.31 (d, J = 7.2 Hz, 3H).
工程２．H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Gly-Leu-Tyr-Asp-Gly-Met-Glu-His-Leu-OHの合成
（Ｃ（Ｍｍｔ）ＡＣＧＬＹＤＧＭＥＨＬの合成）
工程１で得たFmoc-Cys(Mmt)-Ala-SBn（１１ｍｇ）と実施例２５で合成したH-Cys-Gly-Leu-Tyr-Asp-Gly-Met-Glu-His-Leu-OH（１６ｍｇ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２００μＬ）、３,３',３’’−フォスファネトリルトリプロパン酸塩酸塩（１ｍｇ）、４−メルカプトフェニル酢酸（１ｍｇ）及び０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５、２００μＬ）のＤＭＦ（４００μＬ）溶液を室温にて４時間撹拌した。反応液にジエチルアミン（２００μＬ）を加え更に１５分撹拌した。反応液を逆相ＨＰＬＣにて精製することで、目的化合物であるＣ（Ｍｍｔ）ＡＣＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（６ｍｇ）を得た。
質量分析：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ＝７９２．７ ［Ｍ＋２Ｈ］2+ （理論値＝７９２．９）
工程３．(H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Gly-Leu-Tyr-Asp-Gly-Met-Glu-His-Leu-OH）(H-Cys-Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu-OH) disulfide bondの合成
〔すなわち式（２０）：
(式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。)
で表される化合物の合成〕
工程２で得たH-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Gly-Leu-Tyr-Asp-Gly-Met-Glu-His-Leu-OH（１９ｍｇ）と実施例１０８で得た(H-Cys（Pys）-Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu-OH（１５ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を室温にて２時間撹拌した。反応液を逆相ＨＰＬＣにて精製することで目的化合物である(H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Gly-Leu-Tyr-Asp-Gly-Met-Glu-His-Leu-OH）(H-Cys-Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu-OH) disulfide bond〔すなわち式（２０）で示される化合物〕を１９ｍｇ得た。
質量分析：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ＝８０３．３ ［Ｍ−Ｍｍｔ＋３Ｈ］2+ （理論値＝８０３．３）
工程４．
ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａＣ（Ｐｙｓ）の合成
実施例１０７で得たａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａＣ（１３８ｍｇ）と２，２’−ジピリジルビスルフィド（０．２Ｍイソプロパノール溶液、７１８μＬ）の（２０％ｗ／ｗ酢酸水）／（アセトニトリル）＝１／１（５ｍＬ）溶液を室温にて２時間撹拌した。２，２’−ジピリジルビスルフィド（０．２Ｍイソプロパノール溶液、３５０μＬ）を更に加え、２時間撹拌した。反応液を逆相ＨＰＬＣにて精製することで目的化合物であるａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａＣ（Ｐｙｓ）を３４ｍｇ得た。
質量分析：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ＝ ５２０．５［Ｍ＋３Ｈ］3+ （理論値＝５２１．０）
工程５．式（１９）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）で表される化合物の合成
工程３で得た(H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Gly-Leu-Tyr-Asp-Gly-Met-Glu-His-Leu-OH）(H-Cys-Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu-OH) disulfide bond〔すなわち式（２０）で示される化合物〕（４０ｍｇ）、工程４で得たａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａＣ（Ｐｙｓ）（３５ｍｇ）及びトリイソプロピルシラン（３０μＬ）のトリフルオロ酢酸（５７０μＬ）溶液を室温にて３０分撹拌した。反応液を逆相ＨＰＬＣにて精製することで目的化合物である式（１９）で表される化合物を５ｍｇ得た。
質量分析：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ＝ １２８５．８［Ｍ＋３Ｈ］3+ （理論値＝１２８６．５）
試験例１９：ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能の評価
実施例１１２で合成した式（１６）で表される化合物のＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏＣＴＬ誘導試験によって評価した。式（１６）
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物は、前記の式（１）に照らすと、特に癌抗原ペプチドＡがＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）であり且つ癌抗原ペプチドＢがａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（配列番号：１０２）である化合物である。ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）はＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性癌抗原ペプチドであり、ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（配列番号：１０２）はＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド（すなわちヘルパーペプチド）である。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスについては、試験例４に記したとおりである。本マウスを用いることで、ＨＬＡ−Ａ０２陽性のヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能であることに加え、ヒトのＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１に結合してヘルパーＴ細胞を誘導し得るヘルパーペプチドのＣＴＬ誘導増強効果を評価することも可能である。
式（１６）で表される化合物の投与により、目的のペプチド（配列番号：５３）に対するＣＴＬが誘導されるか否かは、式（１６）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞をペプチド（配列番号：５３）で再刺激を行った場合にＩＦＮγを産生するか測定することで判断した。また、ヘルパーペプチド（配列番号：１０２）が生体内で作用しているか否かは、式（１６）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞と、配列番号：５３で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞を、ペプチド（配列番号：５３）で再刺激を行った場合のＩＦＮγ産生細胞数を比較することで判断した。
具体的には、式（１６）で表される化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で８０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに注射用水で５．１ｍｇ／ｍＬに希釈したのち、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合しエマルション化させた。エマルション化させた化合物を、マウスの尾根部皮内に１３０μｇ／ｓｉｔｅで２箇所投与した。１週間後に、マウスをＣＯ2ガスにより安楽死させたのち脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＩＦＮγ産生の測定には、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いた。脾細胞調製の前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗マウスＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でブロッキングした。調製したＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を０．１２５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、ブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。ペプチド（配列番号：５３）をＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で４０μｇ／ｍＬに希釈した。ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：５３で表される希釈ペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）でパルスし、１９時間、３７℃、５％ ＣＯ2下で培養することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるペプチド再刺激を加えた。培養後に上清を除き、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ.Ｔ.Ｌ.社製）によって測定した。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果を図１３に示した。図１３において、縦軸は播種細胞数中の反応した細胞数を、横軸はマウスに投与した化合物またはペプチドを示す。図１３の黒棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：５３で表されるペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差がペプチド特異的ＣＴＬの数を示し、配列番号：５３で表されるペプチドまたは式（１６）で表される化合物の投与によってマウス生体内において配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたことを示す。図１３において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチドをパルスしない場合にはＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγの産生が確認された。また、図１３において式（１６）で表される化合物の投与によって誘導された配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγ産生細胞の数は、配列番号：５３で表されるペプチドの投与によって誘導されたペプチド特異的なＩＦＮγ産生細胞の数より多かった。
これより、式（１６）で表される化合物は配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬを誘導し得ることが明らかとなった。また、式（１６）で表される化合物を投与した場合に配列番号：５３で表されるペプチドを投与した場合と比較して配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγ産生細胞が多く認められたのは、式（１６）で表される化合物から生成された配列番号：１０２で表されるヘルパーペプチドに反応性の細胞が誘導されたことによって、配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬの誘導が増強されたためと推察された。従って、式（１６）で表される化合物は、マウス生体内でジスルフィド結合の切断とＥＲＡＰ−１による適切なトリミングを受けて、配列番号：５３および１０２で表されるペプチドへ実際に生成されることが強く示唆された。
すなわち、本発明の化合物の一例である式（１６）で表される化合物は、異なる２種のペプチドを式（１）に示されたようなジスルフィド結合を介して複合化されたコンジュゲート体であり、実際にｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＴＬおよびヘルパーペプチド反応性細胞を誘導できる癌抗原ペプチドコンジュゲートワクチンであることが、明らかとなった。
試験例２０：ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能の評価
実施例１１３で合成した式（１７）で表される化合物のＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏＣＴＬ誘導試験によって評価した。式（１７）
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物は、前記の式（１）に照らすと、特に癌抗原ペプチドＡがＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）であり且つ癌抗原ペプチドＣがａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（配列番号：１０２）である化合物である。ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）はＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性癌抗原ペプチドであり、ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（配列番号：１０２）はＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド（すなわちヘルパーペプチド）である。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスについては、試験例４、１９に記したとおりである。
式（１７）で表される化合物の投与により、目的のペプチド（配列番号：５３）に対するＣＴＬが誘導されるか否かは、式（１７）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞をペプチド（配列番号：５３）で再刺激を行った場合にＩＦＮγを産生するか測定することで判断した。また、ヘルパーペプチド（配列番号：１０２）が生体内で作用しているか否かは、式（１７）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞と、配列番号：５３で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞を、ペプチド（配列番号：５３）で再刺激を行った場合のＩＦＮγ産生細胞数を比較することで判断した。
試験例１９と同様の方法でＣＴＬ誘導試験を行った。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果を図１４に示した。図１４において、縦軸は播種細胞数中の反応した細胞数を、横軸はマウスに投与した化合物またはペプチドを示す。図１４の黒棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：５３で表されるペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差がペプチド特異的ＣＴＬの数を示し、配列番号：５３で表されるペプチドまたは式（１７）で表される化合物の投与によってマウス生体内において配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたことを示す。図１４において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチドをパルスしない場合にはＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγの産生が確認された。また、図１４において式（１７）で表される化合物の投与によって誘導された配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγ産生細胞の数は、配列番号：５３で表されるペプチドの投与によって誘導されたペプチド特異的なＩＦＮγ産生細胞の数より多かった。
これより、式（１７）で表される化合物は配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬを誘導し得ることが明らかとなった。また、式（１７）で表される化合物を投与した場合に配列番号：５３で表されるペプチドを投与した場合と比較して配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγ産生細胞が多く認められたのは、式（１７）で表される化合物から生成された配列番号：１０２で表されるヘルパーペプチドに反応性の細胞が誘導されたことによって、配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬの誘導が増強されたためと推察された。従って、式（１７）で表される化合物は、マウス生体内でジスルフィド結合の切断とＥＲＡＰ−１による適切なトリミングを受けて、配列番号：５３および１０２で表されるペプチドへ実際に生成されることが強く示唆された。
すなわち、本発明の化合物の一例である式（１７）で表される化合物は、異なる２種のペプチドを式（１）に示されたようなジスルフィド結合を介して複合化されたコンジュゲート体であり、実際にｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＴＬおよびヘルパーペプチド反応性細胞を誘導できる癌抗原ペプチドコンジュゲートワクチンであることが、明らかとなった。
試験例２１：ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能の評価
実施例１４７で合成した式（１８）で表される化合物のＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏＣＴＬ誘導試験によって評価した。式（１８）
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物は、前記の式（１）に照らすと、特に癌抗原ペプチドＡがＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）であり且つ癌抗原ペプチドＣがＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：１０１）である化合物である。ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）はＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性癌抗原ペプチドであり、ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：１０１）はＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド（すなわちヘルパーペプチド）である。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスについては、試験例４、１９に記したとおりである。
式（１８）で表される化合物の投与により、目的のペプチド（配列番号：５３）に対するＣＴＬが誘導されるか否かは、式（１８）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞をペプチド（配列番号：５３）で再刺激を行った場合にＩＦＮγを産生するか測定することで判断した。また、ヘルパーペプチド（配列番号：１０１）が生体内で作用しているか否かは、式（１８）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞と、配列番号：５３で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞を、ペプチド（配列番号：５３）で再刺激を行った場合のＩＦＮγ産生細胞数を比較することで判断した。
試験例１９と同様の方法でＣＴＬ誘導試験を行った。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果を図１５に示した。図１５において、縦軸は播種細胞数中の反応した細胞数を、横軸はマウスに投与した化合物またはペプチドを示す。図１５の黒棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：５３で表されるペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差がペプチド特異的ＣＴＬの数を示し、配列番号：５３で表されるペプチドまたは式（１８）で表される化合物の投与によってマウス生体内において配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたことを示す。図１５において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチドをパルスしない場合にはＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγの産生が確認された。また、図１５において式（１８）で表される化合物の投与によって誘導された配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγ産生細胞の数は、配列番号：５３で表されるペプチドの投与によって誘導されたペプチド特異的なＩＦＮγ産生細胞の数より多かった。
これより、式（１８）で表される化合物は配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬを誘導し得ることが明らかとなった。また、式（１８）で表される化合物を投与した場合に配列番号：５３で表されるペプチドを投与した場合と比較して配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγ産生細胞が多く認められたのは、式（１８）で表される化合物から生成された配列番号：１０１で表されるヘルパーペプチドに反応性の細胞が誘導されたことによって、配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬの誘導が増強されたためと推察された。従って、式（１８）で表される化合物は、マウス生体内でジスルフィド結合の切断とＥＲＡＰ−１による適切なトリミングを受けて、配列番号：５３および１０１で表されるペプチドへ実際に生成されることが強く示唆された。
すなわち、本発明の化合物の一例である式（１８）で表される化合物は、異なる２種のペプチドを式（１）に示されたようなジスルフィド結合を介して複合化されたコンジュゲート体であり、実際にｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＴＬおよびヘルパーペプチド反応性細胞を誘導できる癌抗原ペプチドコンジュゲートワクチンであることが、明らかとなった。
試験例２２：ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能の評価
実施例１１１で合成した式（１５）で表される化合物のＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏＣＴＬ誘導試験によって評価した。式（１５）
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物は、前記の式（１）に照らすと、特に癌抗原ペプチドＡがＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）であり且つ癌抗原ペプチドＢがＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：１０１）である化合物である。ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）はＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性癌抗原ペプチドであり、ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：１０１）はＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド（すなわちヘルパーペプチド）である。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスについては、試験例４、１９に記したとおりである。
式（１５）で表される化合物の投与により、目的のペプチド（配列番号：５３）に対するＣＴＬが誘導されるか否かは、式（１５）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞をペプチド（配列番号：５３）で再刺激を行った場合にＩＦＮγを産生するか測定することで判断した。また、ヘルパーペプチド（配列番号：１０１）が生体内で作用しているか否かは、式（１５）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞と、配列番号：５３で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞を、ペプチド（配列番号：５３）で再刺激を行った場合のＩＦＮγ産生細胞数を比較することで判断した。
試験例１９と同様の方法でＣＴＬ誘導試験を行った。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果を図１６に示した。図１６において、縦軸は播種細胞数中の反応した細胞数を、横軸はマウスに投与した化合物またはペプチドを示す。図１６の黒棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：５３で表されるペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差がペプチド特異的ＣＴＬの数を示し、配列番号：５３で表されるペプチドまたは式（１５）で表される化合物の投与によってマウス生体内において配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたことを示す。図１６において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチドをパルスしない場合にはＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγの産生が確認された。一方で図１６において式（１５）で表される化合物の投与によって誘導された配列番号：５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγ産生細胞の数は、配列番号：５３で表されるペプチドの投与によって誘導されたペプチド特異的なＩＦＮγ産生細胞数と同程度であった。
試験例２１と試験例２２の結果より、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドとしてＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：１０１）を用いる場合、前記式（１）において癌抗原ペプチドＣがＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：１０１）である方が癌抗原ペプチドＢがＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：１０１）に比べ、より好ましい発明の実施形態であることが示唆された。
試験例２３
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能の評価
実施例１４９で合成した式（１９）で表される化合物のＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏＣＴＬ誘導試験によって評価した。式（１９）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物に含まれるＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）およびＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号：１９）はＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性癌抗原ペプチドであり、ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（配列番号：１０２）はＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド（すなわちヘルパーペプチド）である。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスについては、試験例４、１９に記したとおりである。
式（１９）で表される化合物の投与により、目的のペプチド（配列番号：１９、５３）に対するＣＴＬが誘導されるか否かは、式（１９）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞をペプチド（配列番号：１９、５３）で再刺激を行った場合にＩＦＮγを産生するか測定することで判断した。また、ヘルパーペプチド（配列番号：１０２）が生体内で作用しているか否かは、式（１９）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞と、式（４）で表される化合物を投与した上記マウス由来の脾細胞を、ペプチド（配列番号：１９、５３）で再刺激を行った場合のＩＦＮγ産生細胞数を比較することで判断した。
具体的には、式（４）で表される化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で８０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに注射用水で２ｍｇ／ｍＬに希釈したのち、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合してエマルション化させた。エマルション化させた化合物を、マウスの尾根部皮内に１００μｇ／ｓｉｔｅで２箇所投与した。また、式（１９）で表される化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で８０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに注射用水で３．４５ｍｇ／ｍＬに希釈したのち、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合してエマルション化させた。エマルション化させた化合物を、マウスの尾根部皮内に１７３μｇ／ｓｉｔｅで２箇所投与した。式（１９）で表される化合物のマウス１匹あたりの投与量に含まれる式（４）の化合物の物質量は、式（４）で表される化合物のマウス１匹あたりの投与量に含まれる物質量と等しくなるよう調整した。また、各エマルションに含まれるＤＭＳＯ濃度も一定にした。１週間後に、マウスをＣＯ2ガスにより安楽死させたのち脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＩＦＮγ産生の測定には、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いた。脾細胞調製の前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗マウスＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でブロッキングした。調製したＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を０．２５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、ブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。ペプチド（配列番号：１９、５３）をＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で４０μｇ／ｍＬに希釈した。希釈したペプチド（配列番号：１９、５３）を、最終濃度１０μｇ／ｍＬでＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞に添加した。ペプチドを添加した脾細胞を、１８時間、３７℃、５％ ＣＯ2下で培養することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるペプチド再刺激を加えた。培養後に上清を除き、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ.Ｔ.Ｌ.社製）によって測定した。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果を図１７および図１８に示した。各図において、縦軸は播種細胞数中の反応した細胞数を示す。図１７の黒棒および白棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：１９で表される目的のペプチドの存在下および非存在下で培養した結果を、図１８の黒棒および白棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：５３で表される目的のペプチドの存在下および非存在下で培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差が、式（４）および式（１９）で表される化合物の投与によってマウス生体内で誘導された目的の各ペプチド特異的ＣＴＬの数を示す。
各図中において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチド非存在下ではそれぞれの遺伝子導入マウスの脾細胞は反応しなかったことを示している。本試験の結果、式（４）および式（１９）で表される化合物を投与したＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：１９、５３で表される目的のペプチド特異的なＩＦＮγ産生がそれぞれ確認された。また、各図において式（１９）で表される化合物の投与によって誘導された配列番号：１９、５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγ産生細胞の数は、式（４）で表される化合物の投与によって誘導されたペプチド特異的なＩＦＮγ産生細胞の数より多かった。
これより、式（１９）で表される化合物は配列番号：１９、５３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬを誘導し得ることが明らかとなった。また、式（１９）で表される化合物を投与した場合に式（４）で表される化合物を投与した場合と比較して配列番号：１９、５３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγ産生細胞が多く認められたのは、式（１９）で表される化合物から生成された配列番号：１０２で表されるヘルパーペプチドに反応性の細胞が誘導されたことによって、配列番号：１９、５３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬの誘導が増強されたためと推察された。従って、式（１９）で表される化合物は、マウス生体内でジスルフィド結合の切断とＥＲＡＰ−１による適切なトリミングを受けて、配列番号：１９、５３および１０２で表されるペプチドへ実際に生成されることが強く示唆された。
すなわち、本発明の化合物の一例である式（１９）で表される化合物は、異なる３種のペプチドをジスルフィド結合を介して複合化されたコンジュゲート体であり、実際にｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＴＬおよびヘルパーペプチド反応性細胞を誘導できる癌抗原ペプチドコンジュゲートワクチンであることが明らかとなった。
比較例１
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能の評価
実施例２９で合成した式（４）で表される化合物、および、参考例２および３で合成した配列番号：２３１および２３２で表されるペプチドのＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏＣＴＬ誘導試験によって評価した。式（４）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物については、試験例４に記したとおりである。配列番号：２３１および２３２で表されるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性の癌抗原ペプチドＡであるＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号：１９）および癌抗原ペプチドＢであるＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）をアミド結合で連結した長鎖ペプチドである。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスついては、試験例４に記したとおりである。
式（４）で表される化合物および配列番号：２３１、２３２で表されるペプチドの投与により、目的のペプチド（配列番号：１９、５３）に対するＣＴＬが誘導されるか否かは、式（４）で表される化合物および配列番号：２３１、２３２で表されるペプチドを投与した上記マウス由来の脾細胞をペプチド（配列番号：１９、５３）で再刺激を行った場合にＩＦＮγを産生するか測定することで判断した。
具体的には、式（４）で表される化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で８０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに注射用水で１０ｍｇ／ｍＬに希釈したのち、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合しエマルション化させた。エマルション化させた化合物を、マウスの尾根部皮内に２５０μｇ／ｓｉｔｅで２箇所投与した。また、配列番号：２３１、２３２で表されるペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で８０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに注射用水で９ｍｇ／ｍＬに希釈したのち、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合しエマルション化させた。エマルション化させた化合物を、マウスの尾根部皮内に２２５μｇ／ｓｉｔｅで２箇所投与した。１週間後に、マウスをＣＯ2ガスにより安楽死させたのち脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＩＦＮγ産生の測定には、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いた。脾細胞調製の前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗マウスＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でブロッキングした。調製したＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を０．２５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、ブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。ペプチド（配列番号：１９、５３）をＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で４０μｇ／ｍＬに希釈した。希釈したペプチド（配列番号：１９、５３）を、最終濃度１０μｇ／ｍＬでＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞に添加した。ペプチドを添加した脾細胞を、１８時間、３７℃、５％ ＣＯ2下で培養することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるペプチド再刺激を加えた。培養後に上清を除き、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ.Ｔ.Ｌ.社製）によって測定した。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果を図１９、２０に示した。各図において、縦軸は播種細胞数中の反応した細胞数を示す。図１９の黒棒および白棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：１９で表される目的のペプチドの存在下および非存在下で培養した結果を、図２０の黒棒および白棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：５３で表される目的のペプチドの存在下および非存在下で培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差が、式（４）で表される化合物および配列番号：２３１、２３２で表されるペプチドの投与によってマウス生体内で誘導された目的の各ペプチド特異的ＣＴＬの数を示す。
各図中において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチド非存在下ではそれぞれの遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、式（４）で表される化合物を投与したＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：１９、５３で表される目的のペプチド特異的なＩＦＮγ産生がそれぞれ確認された。一方で、配列番号：２３１で表されるペプチドを投与したマウス由来の脾細胞においては配列番号：１９で表される目的のペプチド特異的なＩＦＮγ産生は認められたものの、式（４）で表される化合物を投与したマウス由来の脾細胞と比較するとその数は少なかった。配列番号：２３２で表されるペプチドを投与したマウス由来の脾細胞においては配列番号：１９で表される目的のペプチド特異的なＩＦＮγ産生が確認された。また、配列番号：２３１、２３２で表されるペプチドを投与したマウス由来の脾細胞においては配列番号：５３で表される目的のペプチド特異的なＩＦＮγ産生は認められたものの、式（４）で表される化合物を投与したマウス由来の脾細胞と比較するとその数は非常に少なかった。
これより、本発明の式（４）で表される化合物は配列番号：１９で表されるペプチド特異的なＣＴＬおよび配列番号：５３で表されるペプチド特異的なＣＴＬを双方とも効率よく誘導し得ることが明らかとなった。一方で、配列番号：２３１、２３２で表される長鎖ペプチドは、配列番号：１９および配列番号：５３で表されるペプチド特異的なＣＴＬを双方とも効率よく誘導することはできなかった。
比較例２
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能の評価
実施例２９で合成した式（４）で表される化合物、および、参考例４および５で合成した配列番号：２３３、２３４で表されるペプチドのＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏＣＴＬ誘導試験によって評価した。式（４）：
（式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表される化合物については、試験例４に記したとおりである。配列番号：２３３および２３４で表されるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性の癌抗原ペプチドＡであるＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号：１９）および癌抗原ペプチドＢであるＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：５３）を、ペプチドスペーサーとして６個のグリシンを介してアミド結合で連結した長鎖ペプチドである。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスついては、試験例４に記したとおりである。
式（４）で表される化合物および配列番号：２３３、２３４で表されるペプチドの投与により、目的のペプチド（配列番号：１９、５３）に対するＣＴＬが誘導されるか否かは、式（４）で表される化合物および配列番号：２３３、２３４で表されるペプチドを投与した上記マウス由来の脾細胞をペプチド（配列番号：１９、５３）で再刺激を行った場合にＩＦＮγを産生するか測定することで判断した。
具体的には、式（４）で表される化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で８０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに注射用水で１０ｍｇ／ｍＬに希釈したのち、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合しエマルション化させた。エマルション化させた化合物を、マウスの尾根部皮内に２５０μｇ／ｓｉｔｅで２箇所投与した。また、配列番号：２３３、２３４で表されるペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で８０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに注射用水で１０．５ｍｇ／ｍＬに希釈したのち、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合しエマルション化させた。エマルション化させた化合物を、マウスの尾根部皮内に２６５μｇ／ｓｉｔｅで２箇所投与した。以降比較例１と同様の操作を行った。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果を図２１、２２に示した。各図において、縦軸は播種細胞数中の反応した細胞数を示す。図２１の黒棒および白棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：１９で表される目的のペプチドの存在下および非存在下で培養した結果を、図２２の黒棒および白棒はＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：５３で表される目的のペプチドの存在下および非存在下で培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差が、式（４）で表される化合物および配列番号：２３３、２３４で表されるペプチドの投与によってマウス生体内で誘導された目的の各ペプチド特異的ＣＴＬの数を示す。
各図中において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチド非存在下ではそれぞれの遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、式（４）で表される化合物を投与したＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：１９、５３で表される目的のペプチド特異的なＩＦＮγ産生がそれぞれ確認された。一方で、配列番号：２３３、２３４で表されるペプチドを投与したマウス由来の脾細胞においても配列番号：１９で表される目的のペプチド特異的なＩＦＮγ産生が確認された。しかし、配列番号：２３３、２３４で表されるペプチドを投与したマウス由来の脾細胞において、配列番号：５３で表される目的のペプチド特異的なＩＦＮγ産生は認められたものの、式（４）で表される化合物を投与したマウス由来の脾細胞と比較するとその数は非常に少なかった。
これより、本発明の式（４）で表される化合物は配列番号：１９で表されるペプチド特異的なＣＴＬおよび配列番号：５３で表されるペプチド特異的なＣＴＬを双方とも効率よく誘導し得ることが明らかとなった。一方で、配列番号：２３３、２３４で表される長鎖ペプチドは、配列番号：１９および配列番号：５３で表されるペプチド特異的なＣＴＬを双方とも効率よく誘導することはできなかった。
２つの抗原ペプチドを含有するワクチンを作成する場合の一例として、２つの異なるペプチドを一つの製剤にするカクテル化ワクチンがあげられる。カクテル化ワクチンを作成する際、混合する癌抗原ペプチドの物性が一つの問題となる。表３５及び表４２に示した通り、２つの抗原ペプチドをカクテル化する際には溶解度、すなわち物性の異なる２つのペプチドを一つの製剤にすることになる。これに対し、本発明のコンジュゲート体は２つの抗原ペプチドをジスルフィド結合により結合した化合物であり、単一の溶解度すなわち物性を示した。このことは本発明のコンジュゲート体が単一の物性である上に試験例４に示すように２つの抗原ペプチドに対して応答する性質を有することを示している。この点において、本発明のコンジュゲート体はカクテル化ワクチンのように２つの抗原ペプチド同士の相互作用などを考慮することなく２つの抗原ペプチドに対する応答を引き起こすことができる化合物であることが示された。
参考例１０
実施例１と同様の方法で、配列番号：２３９〜２４２のアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。表５７に、合成した各ペプチドの質量分析結果を示した。
配列番号：２３９〜２４２は本発明の化合物ではないことから参考例として記載した。
表５７に示す配列番号：２４１及び２４２で表されるペプチドは非特許文献Cancer Science January 2012, Vol. 103, no. 1, 150-153. を参考に合成した。
試験例２４
フィルター濾過を経た後に、ＨＬＡ−Ａ２４０１遺伝子導入マウスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ誘導能の評価
ジスルフィド結合を介して形成した配列番号４のホモダイマーおよび式（５）で表される化合物を３−１０ｍｇ／ｍＬとなるように注射用水にて溶解する。各化合物の薬理活性を、CTL誘導活性を指標としてＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウス (Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋb)を利用して評価する。ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウスに投与するにあたり、注射用水で溶解した化合物をタンパク質低結合性のフィルター（注射剤の滅菌処理を目的としたグレードのメンブランフィルター）にて濾過滅菌したのち、不完全フロイントアジュバントと混合しエマルション化させる。
エマルション化させた化合物はＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウスの尾根部皮内に投与する。投与１週間後、マウスをＣＯ2ガスにより安楽死させたのち脾臓あるいは鼠蹊部リンパ節を摘出し、脾細胞あるいはリンパ節細胞を調製する。ＩＦＮγ産生の測定には、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いる。細胞調製の前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗マウスＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でブロッキングする。調製したマウス由来の細胞をブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種する。ペプチド（配列番号：４）をＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で４０μｇ／ｍＬに希釈する。希釈したペプチド（配列番号：４）を、最終濃度１０μｇ／ｍＬでＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞あるいはリンパ節細胞に添加する。ペプチドを添加した細胞を、１６−２０時間、３７℃、５％ ＣＯ2下で培養することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるペプチド再刺激を加える。培養後に上清を除いたのち、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、添付のプロトコールに従って発色させる。発色したスポット数は、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ.Ｔ.Ｌ.社製）によって測定する。
本発明の化合物は、ＣＴＬを効率良く誘導し且つ製造が容易な癌ワクチンの有効成分として、有用である。本出願は、日本で出願された特願２０１３−０７４４４１（出願日：平成２５年３月２９日）および特願２０１３−１５８３８６（出願日：平成２５年７月３１日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
次に、本発明における「癌抗原ペプチド」とは、公知のヒト癌抗原タンパク質の部分ペプチドを意味する。具体的には、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ａ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦＲ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＡＦＰ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ、Ｃａｓｐａｓｅ−８、ＣＤＫ−４、ＥＬＦ２、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、Ｍｙｏｓｉｎ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２、７０７−ＡＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＬｉｖｉｎおよびＳＹＴ−ＳＳＸからなる群から選ばれる癌抗原タンパク質（以下、癌抗原タンパクとも言う。）のアミノ酸配列において連続する７〜３０残基のアミノ酸からなる部分ペプチドである。
但し、本発明における「癌抗原ペプチド」には、ヒトＷＴ１タンパク質（Ｃｅｌｌ，６０：５０９，１９９０、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ａ３８０８０）は含まれない。すなわち、本発明の化合物においては、癌抗原ペプチドＡ、癌抗原ペプチドＢ、癌抗原ペプチドＣ、または／および癌抗原ペプチドＤが、ＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドではない。癌抗原ペプチドＡ、癌抗原ペプチドＢ、癌抗原ペプチドＣまたは癌抗原ペプチドＤがＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドではないことがより好ましく、癌抗原ペプチドＡ、癌抗原ペプチドＢ、癌抗原ペプチドＣおよび癌抗原ペプチドＤが、ＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドではないことがさらに好ましい。
具体的には、前記の項１に示した式（１）で表される化合物において、癌抗原ペプチドＡが癌抗原タンパク質のアミノ酸配列において連続する７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドであり且つＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドとは異なり、Ｒ1が式（２）で表される基である場合、癌抗原ペプチドＢが癌抗原タンパク質のアミノ酸配列において連続する７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドであり且つＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドとは異なり、Ｒ1が式（３）で表される基である場合、癌抗原ペプチドＣが癌抗原タンパク質のアミノ酸配列において連続する７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドであり且つＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドとは異なり、またＲ1が癌抗原ペプチドＤである場合、癌抗原ペプチドＤが癌抗原タンパク質のアミノ酸配列において連続する７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドであり且つＷＴ１タンパク質由来の癌抗原ペプチドとは異なることが好ましい。
本発明における「ユニバーサル癌抗原ペプチド」とは、ＭＨＣクラスＩＩのサブタイプや多型の種類に関わらず複数の種類のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合しヘルパーＴ細胞を誘導する癌抗原ペプチドやエピトープを意味する。「ＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド」は、ｐａｎ ＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチドとも言われる。
本発明における「ユニバーサル癌抗原ペプチド」とは、ＭＨＣクラスＩＩのサブタイプや多型の種類に関わらず複数の種類のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合しヘルパーＴ細胞を誘導する癌抗原ペプチドやエピトープを意味する。「ＨＬＡ−ＤＲ拘束性のユニバーサル癌抗原ペプチド」は、ｐａｎ ＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチドとも言われる。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＨＬＡ−Ａ２．１ＤＲ１）は、マウスのＭＨＣを欠損し、ヒトのＭＨＣであるＨＬＡ−Ａ０２０１とマウスＭＨＣであるＨ−２ＤbのキメラＨＬＡおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１ ＊ ０１０１を発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ＨＬＡ−Ａ０２陽性のヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能である（Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；３４：３０６０−９）。
Ｃｙｓを延長した各ペプチド（配列番号：１００、９９または９８）の投与により、がん細胞に内因性に提示されるペプチド（配列番号：５３、４３または１９）に対するＣＴＬが誘導されるか否かは、Ｃｙｓを延長したペプチド（配列番号：１００、９９または９８）を投与した上記マウス由来の脾細胞をペプチド（配列番号：５３、４３または１９）で再刺激を行った場合にＩＦＮγを産生するか測定することで判断した。表２４に示したがん細胞に内因性に提示されるペプチド（配列番号：５３、４３または１９）は、本試験例においては、Ｃｙｓ非延長ペプチドともいう。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＨＬＡ−Ａ２．１ＤＲ１）は、マウスのＭＨＣを欠損し、ヒトのＭＨＣであるＨＬＡ−Ａ０２０１とマウスＭＨＣであるＨ−２ＤbのキメラＨＬＡおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１ ＊ ０１０１を発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ＨＬＡ−Ａ０２陽性のヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能である（Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；３４：３０６０−９）。
ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子導入マウスについては、試験例４に記したとおりである。本マウスを用いることで、ＨＬＡ−Ａ０２陽性のヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能であることに加え、ヒトのＨＬＡ−ＤＲＢ１ ＊ ０１０１に結合してヘルパーＴ細胞を誘導し得るヘルパーペプチドのＣＴＬ誘導増強効果を評価することも可能である。

Claims (19)

  1. 式（１）：
    ［式中、ＸaおよびＹaは、独立して、単結合または１〜４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基を表し、Ｘaのアミノ酸残基数とＹaのアミノ酸残基数の和は０〜４の整数であり、
    癌抗原ペプチドＡは、７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドを表し、癌抗原ペプチドＡのＮ末端アミノ酸のアミノ基が式（１）中のＹaと結合し、癌抗原ペプチドＡのＣ末端アミノ酸のカルボニル基が式（１）中の水酸基と結合し、
    Ｒ1は、水素原子、式（２）：
    （式中、ＸbおよびＹbは、独立して、単結合または１〜４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基を表し、Ｘbのアミノ酸残基数とＹbのアミノ酸残基数の和は０〜４の整数であり、
    癌抗原ペプチドＢは、癌抗原ペプチドＡとは異なり且つ７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドまたは７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドを表し、癌抗原ペプチドＢのＮ末端アミノ酸のアミノ基が式（２）中のＹbと結合し、癌抗原ペプチドＢのＣ末端アミノ酸のカルボニル基が式（２）中の水酸基と結合し、
    式（２）中のチオエーテル基が、式（１）中のチオエーテル基と結合する。）
    で表される基、式（３）：
    （式中、ＸcおよびＹcは、独立して、単結合または１〜４残基のアミノ酸からなるペプチドの二価基を表し、Ｘcのアミノ酸残基数とＹcのアミノ酸残基数の和は０〜４の整数であり、
    癌抗原ペプチドＣは、７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドを表し、癌抗原ペプチドＣのＣ末端アミノ酸のカルボニル基が式（３）中のＸcと結合し、癌抗原ペプチドＣのＮ末端アミノ酸のアミノ基が式（３）中の水素原子と結合し、
    式（３）中のチオエーテル基が、式（１）中のチオエーテル基と結合する。）
    で表される基、または癌抗原ペプチドＤを表し、
    癌抗原ペプチドＤは、１つのシステイン残基を含む７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性癌抗原ペプチドまたは１つのシステイン残基を含む７〜３０残基のアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩＩ拘束性癌抗原ペプチドを表し、癌抗原ペプチドＤのシステイン残基のチオエーテル基が式（１）中のチオエーテル基と結合する。
    但し、Ｒ1が水素原子である場合、式（１）の配列は癌抗原タンパクの部分配列と同一ではない。］
    で表される化合物、またはその薬学上許容される塩。
  2. Ｘaが単結合であり、Ｙaが単結合、アラニン残基、ロイシン残基またはメチオニン残基である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  3. Ｘaが単結合、アラニン残基、グリシン残基、セリン残基またはチロシン残基であり、Ｙaが単結合である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  4. ＸaおよびＹaが単結合である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  5. 癌抗原ペプチドＡが、以下のアミノ酸配列：
    ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：１９）、
    ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：４３）および
    ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：５３）
    の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  6. Ｒ1が水素原子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  7. Ｒ1が式（２）で表される基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  8. ＸbおよびＹbが単結合である、請求項１〜５および７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  9. 癌抗原ペプチドＢが、以下のアミノ酸配列：
    ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ （配列番号：１９）、
    ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ （配列番号：４３）および
    ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ （配列番号：５３）
    の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１〜５および７〜８のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  10. 癌抗原ペプチドＢが、以下のアミノ酸配列：
    ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （配列番号：１０１）および
    ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ （配列番号：１０２）
    の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１〜５および７〜８のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  11. Ｒ1が式（３）で表される基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  12. ＸcおよびＹcが単結合である、請求項１〜５および１１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  13. 癌抗原ペプチドＣが、以下のアミノ酸配列：
    ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （配列番号：１０１）および
    ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ （配列番号：１０２）
    の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１〜５および１１〜１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  14. Ｒ1が癌抗原ペプチドＤである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  15. 癌抗原ペプチドＤが、以下のアミノ酸配列：
    ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ （配列番号：８７）、および
    ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ （配列番号：８８）
    の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１〜５および１４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  16. 癌抗原ペプチドＤが、以下のアミノ酸配列：
    ａＫ−Ｃｈａ−ＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ−Ａｈｘ−Ｃ （配列番号：１０３）
    のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１〜５および１４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  17. 癌抗原ペプチドＤが、以下のアミノ酸配列：
    ＡＡＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬ （配列番号：１０４）、
    ＲＮＧＹＲＡＬＭＤＫＳＬＨＶＧＴＱＣＡＬＴＲＲ （配列番号：１０５）、
    ＫＫＬＱＣＶＱＬＨＶＩＳＭ （配列番号：１０６）および
    ＧＳＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬ （配列番号：１０７）
    の中から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１〜５および１４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
  18. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学上許容される塩、および薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
  19. 癌を治療または予防するための方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学上許容される塩の治療または予防に有効な量を、それを必要としている癌抗原タンパク質陽性の癌患者に投与することからなる方法。
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