JPWO2010047310A1

JPWO2010047310A1 - 腫瘍抗原ペプチド及びその利用

Info

Publication number: JPWO2010047310A1
Application number: JP2010534803A
Authority: JP
Inventors: 昇志佐藤; 智英塚原; 哲川口; 卓郎和田
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2008-10-20
Filing date: 2009-10-19
Publication date: 2012-03-22
Anticipated expiration: 2029-10-19
Also published as: US20110200629A1; US9260499B2; HK1163735A1; CN102257138A; CN102257138B; EP2363468A4; JP5606322B2; EP2363468B1; WO2010047310A1; EP2363468A1

Abstract

配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつHLA抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチドを提供する。本願発明のペプチドはin vivoまたはin vitroにおいてCTLの誘導剤、すなわち癌ワクチンとして用いることができ、骨肉腫や腎癌等の腫瘍に対して治療または改善効果を発揮する。本発明のペプチドは肉腫や腎癌等の腫瘍に対する腫瘍マーカーとしても有用である。

Description

本発明は、腫瘍抗原ペプチドに関する。さらに詳しくは、本発明は、腫瘍抗原タンパク質〔パピローマウイルス結合因子（Papillomavirus binding factor：PBF）〕の部分ペプチドおよびその遺伝子の、癌免疫分野における利用に関する。

生体による腫瘍細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（CTLと称する）が重要な働きをしている。CTLは、腫瘍細胞上の抗原ペプチド（腫瘍抗原ペプチド）とＭＨＣ（Major Histocompatibility Complex）クラスＩ抗原（ヒトの場合はHLA抗原と称する）との複合体を認識し、腫瘍細胞を攻撃・破壊する。
腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特有のタンパク質、すなわち腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアーゼにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原（HLA抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示された複合体を腫瘍特異的なCTLが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を示す。このような一連の作用の解明に伴い、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドをいわゆる癌免疫療法剤（癌ワクチン）として利用することにより、腫瘍患者の体内の腫瘍特異的CTLを増強させる治療法が可能となった。
腫瘍抗原タンパク質としては、（非特許文献１）のtable 1に記載のものが代表例として挙げられる。また、骨肉腫等の肉腫を含む癌（腫瘍）に対して適用可能な腫瘍抗原タンパク質として、パピローマウイルスのE2結合部位を認識するパピローマウイルス結合因子(Papillomavirus binding factor：PBF、 GenBank データベース Accession No. AF263928、配列番号：２)が報告され（特許文献１）、HLA-A24又はHLA-B55抗原と結合する腫瘍抗原ペプチドが挙げられている。しかしながら、HLA-A2抗原と結合するPBF由来の腫瘍抗原ペプチドは未だ見出されていない。

Immunity, vol.10:281, 1999 国際公開第04/029248号パンフレット上記文献は引用により本願の一部を構成する。

本発明の目的は、HLA-A2抗原と結合する腫瘍抗原タンパク質ＰＢＦの部分ペプチドおよびその遺伝子の、癌免疫分野における利用などを提供することにある。

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、GenBank Accession No. AF263928として登録されているパピローマウイルス結合因子(Papillomavirus binding factor：PBF)（配列番号：２）の部分ペプチドであってHLA-A2抗原に結合する腫瘍抗原ペプチドを見出した。
当該腫瘍抗原ペプチドが、in vivoまたはin vitroにおいてCTLの誘導剤、すなわち癌ワクチンとして用いることができ、骨肉腫や腎癌等の腫瘍に対して治療または改善効果を発揮することを明らかにした。また当該腫瘍抗原ペプチドは肉腫や腎癌等の腫瘍に対する腫瘍マーカーとしても有用である。

すなわち本発明は下記に掲げるものである。
〔1〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつHLA抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞（以下、「CTL」という。）により認識されるペプチド。
〔2〕HLA抗原がHLA-A2である、上記〔1〕に記載のペプチド。
〔3〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列又は、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸のメチオニン、バリン、イソロイシン若しくはグルタミンへの置換又はＣ末端のアミノ酸のロイシンへの置換を含むアミノ酸配列からなる、上記〔2〕に記載のペプチド。
〔4〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
〔5〕上記〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有してなるCTLの誘導剤。
〔6〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする核酸を含有してなる、CTLの誘導剤。
〔7〕ポリヌクレオチドが配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、上記〔6〕に記載のCTLの誘導剤。
〔8〕上記〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる核酸。
〔9〕上記〔8〕に記載の核酸を含有してなるCTLの誘導剤。
〔10〕以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）上記〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のペプチド、
（ｂ）上記（ａ）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、抗原提示能を有する細胞とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、抗原提示細胞の製造方法。
〔11〕上記〔10〕に記載の製造方法により製造される抗原提示細胞。
〔12〕以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）上記〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のペプチド、
（ｂ）上記（ａ）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、CTLの誘導方法。
〔13〕上記〔12〕に記載の誘導方法により誘導されるCTL。
〔14〕上記〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
〔15〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む腫瘍マーカー。
〔16〕配列番号：３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む、上記〔15〕記載の腫瘍マーカー。
〔17〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる腫瘍マーカー。
〔18〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一のポリペプチドからなる、上記〔17〕に記載の腫瘍マーカー。
〔19〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体、あるいは上記〔14〕に記載の抗体からなる腫瘍マーカー。
〔20〕配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体からなる、上記〔19〕に記載の腫瘍マーカー。
〔21〕上記〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のペプチドとHLA抗原とを含有するHLAテトラマー。
〔22〕上記〔21〕に記載のHLAテトラマーからなる腫瘍マーカー。
〔23〕腫瘍が肉腫または腎癌である、上記〔15〕〜〔20〕および上記〔22〕のいずれかに記載の腫瘍マーカー。
〔24〕上記〔15〕〜〔20〕、上記〔22〕および上記〔24〕のいずれかに記載の腫瘍マーカーを含有してなる腫瘍の診断薬。

本発明により、CTLの誘導剤として有用な腫瘍抗原ペプチドおよびその遺伝子などが提供される。本発明のCTLの誘導剤は、肉腫や腎癌等の治療剤等として有用である。

CTL5A9のペプチド特異的細胞傷害活性を示す図である。縦軸は、細胞傷害活性、横軸は、CTL5A9の細胞数（effector）と標的細胞（target）の細胞数の比を表す。癌細胞株に対するCTL5A9の細胞傷害を示す図である。各細胞株のPBF発現、HLA-A0201発現、IFN-γ処理の有無を＋と−で示した。また各細胞株に対するCTL5A9の細胞傷害活性をeffector：targetの比を変えて評価した。

1)本発明のペプチド
本発明のペプチド（以下、「本発明のペプチド」と称する場合がある）とは、配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、前記ＰＢＦタンパク質の部分ペプチドであって、HLA抗原、好ましくはHLA-A2抗原と結合してCTLにより認識されるという活性を有する腫瘍抗原ペプチドである。
ここにおいて、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の腫瘍抗原ペプチドと同様の活性があれば特に限定はなく、具体的には配列番号：４に記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸をメチオニン、バリン、イソロイシンまたはグルタミンへの置換又はＣ末端のアミノ酸をロイシンへの置換を含むアミノ酸配列を挙げることができる。すなわち、HLA-A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207などのHLA-A2型のHLAについては、提示される抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）が以下の表１に示すように知られている（Immunogenetics,41,p178,1995、 J.Immunol.,155:p4749,1995、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）。

また本発明のペプチドは、天然物（例えば前記ＰＢＦタンパク質）に由来するペプチドであってもよく、また合成ペプチドであってもよい。ペプチドの長さとしては、好ましくは11以下のアミノ酸であり、より好ましくは９アミノ酸である。

本発明のペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該公知方法としては文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発続第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）などに記載されている方法が挙げられる。

本発明のペプチドが腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するか否は、HLA-A2抗原との複合体がCTLにより認識されるか否かをアッセイすることにより、確認することができる。
具体的な方法としては、例えば J.Immunol.,154,p2257,1995（本文献は引用により本願の一部を構成する）に記載の方法が挙げられる。すなわち、HLA-A2抗原が陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、in vitroで該候補ペプチドを添加して刺激した場合に、該候補ペプチドをパルスしたHLA-A2抗原陽性細胞を特異的に認識するCTLが誘導されることを確認すればよい。ここでCTLの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してCTLが産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γ）の量を、例えばELISA法などによって測定することにより、調べることができる。また⁵¹Crで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するCTLの傷害性を測定する方法（⁵¹Crリリースアッセイ、Int.J.Cancer,58:p317,1994、本文献は引用により本願の一部を構成する）によっても調べることができる。
前記CTLとしては、ヒトの末梢血リンパ球のペプチド刺激により調製されるものの他、Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）等に記載の方法により樹立したCTLを用いることができる。
また本発明のペプチドは、例えばヒトモデル動物を用いたアッセイ（WO 02/47474 号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）に供することにより、in vivoでの活性を確認することができる。

本発明のペプチドには、さらに、前記本発明のペプチドを含む複数のエピトープを連結したペプチド（ポリエピトープペプチド）も含まれる。
従って、該ポリエピトープペプチドであって、CTL誘導活性を有するペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
ここに、ポリエピトープペプチドとは、(i)具体的には本発明のペプチドと他のPBF由来の任意の複数のCTLエピトープ（腫瘍抗原ペプチド）を連結したペプチド、 (ii) 本発明のペプチドとヘルパーエピトープとを連結したペプチド、若しくは(iii) 本発明のペプチドと他のPBF由来の任意の複数のCTLエピトープ（腫瘍抗原ペプチド）にさらにヘルパーエピトープを連結したペプチドであって、抗原提示細胞内にてプロセッシングを受け、生じた腫瘍抗原ペプチドが抗原提示細胞に提示され、CTL誘導活性を導くペプチドとして定義される。
ここで、本発明のペプチドに連結させるエピトープがヘルパーエピトープの場合、用いるヘルパーエピトープとしては、前述のようなＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープの長さとしては、13〜30アミノ酸程度、好ましくは13〜17アミノ酸程度を挙げることができる。

このような複数のエピトープを連結させたペプチド（ポリエピトープペプチド）は、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープを連結させたポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のDNA合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献(Molecular Cloning, T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985)、これらの文献は引用により本願の一部を構成する)に記載の方法などに準じて行うことができる。
以上のようにして製造された複数のエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを、前述のin vitroアッセイや、WO 02/47474 号公報および Int J. Cancer:100,565-570 (2002)（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）に記述のヒトモデル動物を用いたin vivoアッセイに供すること等によりCTL誘導活性を測定することができる。

2)本発明の核酸
本発明の核酸（以下、「本発明の核酸」と称する場合がある）は、前記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する。
本発明のポリヌクレオチドは、種々の細胞や組織、例えば骨肉種や腎癌等に由来する細胞や組織の cDNAやmRNA、cRNA、または合成DNAのいずれであっても良い。また1本鎖、2本鎖のいずれの形態であっても良い。具体的には、
(a) 配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド及び、
(c) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、が挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドを含有する核酸は、１本鎖および２本鎖のいずれの形態もとることができる。本発明のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。すなわち本発明の核酸の範疇には、本発明の２本鎖型ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して作製された組換え発現ベクターも含まれる。

ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、pUC118、pUC119、pBR322、pCR3等のプラスミドベクター、λZAPII、λgt11などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、pYES2、pYEUra3などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMVなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。

前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Hisタグ、あるいはGST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（lac、tac、trc、trp、CMV、SV40初期プロモーターなど）を有するGST融合タンパク質ベクター（pGEX4Tなど）や、Myc、Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3.1/Myc-Hisなど）、さらにはチオレドキシンおよびHisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（pET32a）などを用いることができる。

前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E.coli K-12系統のHB101株、C600株、JM109株、DH5α株、AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、L929細胞、BALB/c3T3細胞、C127細胞、CHO細胞、COS細胞、Vero細胞、Hela細胞、293-EBNA細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはsf9などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。

以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のペプチドを、前述のチオレドキシンやHisタグ、GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、DNAの形態であってもRNAの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるDNAの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常のDNA合成やPCRによる増幅などによって、製造することができる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。

本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸は、１本鎖および２本鎖のいずれの形態もとることができる。本発明のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターや宿主細胞、宿主細胞の形質転換方法等については、前述の記載と同様である。

3)本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤
本発明のペプチドはCTL誘導活性を有するCTLの誘導剤となりうる。誘導されたCTLは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用を発揮することができる。従って本発明のペプチドは、腫瘍の治療または予防のための医薬の有効成分とすることができる。本発明のペプチドを有効成分として含有するCTLの誘導剤を腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞のHLA-A2抗原に本発明のペプチドが提示され、HLA-A2抗原と提示されたペプチドとの結合複合体特異的CTLが増殖して腫瘍細胞を破壊することができ、その結果、患者の腫瘍を治療又は予防することができる。
本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、配列番号：２に記載のPBFタンパク質陽性かつHLA-A2抗原陽性の腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば骨肉腫などの肉腫全般または腎癌などの癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。

本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、単一のCTLエピトープ（本発明のペプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（CTLエピトープやヘルパーエピトープ）と連結したポリエピトープペプチドを有効成分とするものであっても良い。近年、複数のCTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結したポリエピトープペプチドが、in vivoで効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1998, 161: 3186-3194（本文献は引用により本願の一部を構成する）には、癌抗原タンパク質PSA由来のHLA-A2, -A3, -A11, B53拘束性CTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結した約30merのポリエピトープペプチドが、in vivoでそれぞれのCTLエピトープに特異的なCTLを誘導したことが記載されている。またCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたポリエピトープペプチドにより、効率的にCTLが誘導されることも示されている。このようなポリエピトープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがHLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なCTLが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。このようにして腫瘍の治療または予防が達成される。

本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントと混合して投与、又は併用して投与することができる。

アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994、本文献は引用により本願の一部を構成する)に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分又はその誘導体、サイトカイン、植物由来成分又はその誘導体、海洋生物由来成分又はその誘導体、水酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルション製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェアー製剤、マイクロカプセル製剤なども考えられる。
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg 〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。

4)本発明の核酸を有効成分とするCTLの誘導剤
本発明の核酸を発現させた細胞は、CTLに認識されるという特徴を有する。すなわち本発明の核酸はCTLの誘導剤である。誘導されたCTLは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用を発揮することができる。従って本発明の核酸は、腫瘍の治療または予防のための医薬の有効成分とすることができる。本発明の核酸を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、例えば、本発明の核酸を腫瘍患者に投与し発現させることで、腫瘍を治療または予防し得るものである。

例えば発現ベクターに組み込まれた本発明の核酸を以下の方法により腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞内で腫瘍抗原ペプチドが高発現する。その後、生じた腫瘍抗原ペプチドがHLA-A2抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示されることにより、腫瘍特異的CTLが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療または予防が達成される。

本発明の核酸を有効成分とするCTLの誘導剤は、配列番号：１に記載のPBF遺伝子および当該遺伝子の発現産物であるPBFタンパク質陽性かつHLA-A2抗原陽性の腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば骨肉腫などの肉腫全般または腎癌などの癌の予防または治療のために使用することができる。
本発明の核酸を投与し細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）のいずれの方法も適用することができる。

ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のDNAウイルス又はRNAウイルスに本発明のDNAを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（DNAワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチン法、リポソーム法が好ましい。

本発明の核酸を実際に医薬として作用させるには、当該核酸を直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で核酸を該細胞に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）。in vivo法がより好ましい。

in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明の核酸を含有する注射剤等とされ、必要に応じて、医薬上許容されるキャリアー（担体）を加えてもよい。また、本発明の核酸を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明の核酸の含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、核酸中のポリヌクレオチドの含量として、0.0001mg〜100mg、好ましくは0.001mg〜10mgの本発明の核酸を、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。

また近年、複数のCTLエピトープ（腫瘍抗原ペプチド）を連結したポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、in vivoで効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1999, 162: 3915-3925（本文献は引用により本願の一部を構成する）には、HBV由来HLA-A2拘束性抗原ペプチド６種類、HLA-A11拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするDNA（ミニジーン）が、in vivoでそれぞれのエピトープに対するCTLを効果的に誘導したことが記載されている。
従って、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことにより、CTLの誘導剤の有効成分とすることができる。このようなCTLの誘導剤も、前記と同様の投与方法および投与形態をとることができる。

5)本発明の抗原提示細胞
前記した本発明のペプチドおよび核酸は、腫瘍患者の治療において、以下のようにイン・ビトロで利用することができる。すなわち本発明のペプチド又は核酸のいずれかと抗原提示能を有する細胞とをイン・ビトロで接触させることにより、抗原提示細胞を作製することができる。具体的には本発明は、腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞と、本発明のペプチドまたは核酸のいずれかとをイン・ビトロで接触させることにより、当該細胞の細胞表面にHLA-A2抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞、およびその製造方法を提供するものである。
ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示することの可能なHLA-A2抗原を細胞表面に発現する細胞であれば特に限定されないが、特に抗原提示能が高いとされる樹状細胞が好ましい。

また、前記抗原提示能を有する細胞から本発明の抗原提示細胞を調製するために添加される物質としては、本発明のペプチド又は核酸のいずれであっても良い。
本発明の抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のペプチドをイン・ビトロでパルスして、HLA-A2抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させることにより得られる(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、Ｊ.Immunol.,158,p1796,1997、Cancer Res.,59,p1184,1999、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM-CSFおよびIL-4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明の核酸を導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該核酸は、DNAの形態であっても、RNAの形態であっても良い。具体的には、DNAの場合は Cancer Res.,56:p5672,1996や J.Immunol.,161: p5607,1998（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）などを参考にして行うことができ、またRNAの場合は J.Exp.Med., 184: p465,1996（本文献は引用により本願の一部を構成する）などを参考にして行うことができる。

前記抗原提示細胞はCTLの誘導剤の有効成分とすることができる。当該抗原提示細胞を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。このような抗原提示細胞を有効成分として含有してなるCTLの誘導剤を患者の体内に戻すことにより、本発明のPBF陽性の患者の体内で効率良く特異的なCTLが誘導され、腫瘍を治療することができる。

6)本発明のCTL
本発明のペプチドおよび核酸は、腫瘍患者の治療において、以下のようにイン・ビトロで利用することができる。すなわち本発明のペプチドおよび核酸のいずれかと末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることにより、CTLを誘導することができる。具体的には本発明は、腫瘍患者由来の末梢血リンパ球と、本発明のペプチド又は核酸のいずれかとをイン・ビトロで接触させることにより誘導されたCTL、およびその誘導方法を提供するものである。

例えばメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159 、1994、本文献は引用により本願の一部を構成する）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン・ビトロで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なCTLを増殖させ、該CTLをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J.Exp.Med.,185:453,1997 ）。これは、抗原提示細胞のHLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するCTLをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のペプチドまたは核酸を用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的CTLを増やした後、このCTLを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
当該CTLは腫瘍の治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。該治療剤または予防剤は、CTLを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。このようなCTLを有効成分として含有してなる腫瘍の治療または予防剤を患者の体内に戻すことにより、本発明のPBF陽性の患者の体内でCTLによる腫瘍細胞の傷害作用が促進され、腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療することができる。

7)本発明のペプチドに対する抗体
本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明のペプチドを免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良い。
本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば特に制限されないが、具体的には、配列番号：４記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチドに特異的に結合する抗体を挙げることができる。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989）（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）。

具体的には、本発明のペプチド（例えば配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド）を免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明のペプチド（例えば配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド）をマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11、本文献は引用により本願の一部を構成する）。

本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。

以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は、本発明のPBF遺伝子が発現している癌、例えば肉腫や腎癌等の診断において有効である。

8)腫瘍マーカー
(i)本発明のポリヌクレオチドに関する腫瘍マーカー
本発明の腫瘍マーカーは、前記本発明ポリヌクレオチド（配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド）及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とするものである。
具体的には、本発明の腫瘍マーカーは、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなるものを挙げることができる。

ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、前記配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。
ここで、正鎖側のポリヌクレオチドには、配列番号：３に記載の塩基配列からなるものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。

さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で腫瘍マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で腫瘍マーカーとして使用されてもよい。
本発明の腫瘍マーカーは、具体的には、前記配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。
本発明の腫瘍マーカーは、例えば配列番号：３に記載の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。具体的には前記本発明遺伝子の塩基配列を primer 3またはベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
本発明の腫瘍マーカーは、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。

本発明において腫瘍の検出（診断）は、被験者の生体組織、特に腫瘍（肉腫や腎癌）が疑われる被験組織における本発明のペプチド遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。この場合、上記本発明の腫瘍マーカーは、本発明のペプチド遺伝子の発現によって生じたRNAまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該RNAまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
本発明腫瘍マーカーを腫瘍の検出においてプライマーとして用いる場合には、好ましくは15bp〜30bpの塩基長を含有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、好ましくは15bp〜27bpの塩基長を含有するものが例示できる。
本発明の腫瘍マーカーは、ノーザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。

本発明の腫瘍マーカーは、腫瘍の診断、検出（罹患の有無や罹患の程度の診断）に有用である。具体的には、該腫瘍マーカーを利用した腫瘍の診断は、被験者における生体組織（腫瘍が疑われる組織）と正常者における同様の組織における本発明のペプチド遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。この場合、遺伝子発現レベルの違いには、発現のある／なしの違いだけでなく、被験者の組織と正常者の組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量の格差が2倍以上、好ましくは3倍以上の場合が含まれる。具体的には本発明のペプチド遺伝子は腫瘍で発現誘導を示すので、被験者の組織で発現しており、該発現量が正常者の対応組織の発現量と比べて2倍以上、好ましくは3倍以上多ければ、被験者について腫瘍の罹患が疑われる。

(ii)本発明の抗体に関する腫瘍マーカー
本発明は腫瘍マーカーとして、本発明のペプチドを特異的に認識することのできる抗体（以下、本発明の抗体と称する場合がある）を提供する。より具体的には、本発明は、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる本発明ペプチドを特異的に認識する抗体からなる腫瘍マーカーを提供する。
種々の肉腫および腎癌において、PBF遺伝子が特異的に高発現しているという知見が得られている。よってこれらの遺伝子の発現産物（ペプチド）の有無やその発現の程度を検出することによって、上記腫瘍（肉腫、腎癌等）の有無やその程度が特異的に検出でき、該疾患の診断を行うことができる。
上記抗体は、従って、被験者における上記ペプチドの発現の有無またはその程度を検出することによって、該被験者が腫瘍に罹患しているか否かまたはその疾患の程度を診断することのできるツール（腫瘍マーカー）として有用である。

本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明ペプチド（具体的には配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド）を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12〜11.13(2000)、本文献は引用により本願の一部を構成する）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明ペプチドを用いて、あるいは常法に従ってこれら本発明ペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明ペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11、本文献は引用により本願の一部を構成する）。

抗体の作製に免疫抗原として使用される本発明ペプチド（具体的には配列番号：４に記載のアミノ酸配列よりなるペプチド）は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号：３）に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのペプチドの回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）などに準じて行うことができる。また本発明ペプチドは、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号：４）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。詳しくは前述の1)及び2)の項を参照されたい。

(iii)本発明のペプチドに関する腫瘍マーカー
本発明は腫瘍マーカーとして、本発明ペプチドに対する抗体を特異的に認識することのできるペプチドを提供する。より具体的には、本発明は、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる本発明ペプチドからなる腫瘍マーカーを提供する。
本発明のペプチド（ポリペプチド）を診断薬として用い、腫瘍が疑われる患者から得た試料（例えば血液、腫瘍が疑われる組織など）中の抗体の存在を検出することにより、腫瘍を診断することが可能である。ここで用いる本発明ペプチドの製造法については、前記1)の項で述べたとおりである。

具体的には、患者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従ってペプチドを調製して、例えばウェスタンブロット法、ELISA法など公知の検出方法において、上記本発明ペプチドを常法に従ってプローブとして使用することによって、PBFに対する抗体を検出することができる。
腫瘍の診断に際しては、被験者組織における本発明のペプチドに対する抗体の量と正常な対応組織におけるF本発明のペプチドに対する抗体の量の違いを判定すればよい。この場合、ペプチド量の違いには、ペプチドのある／なし、あるいはペプチド量の違いが2倍以上、好ましくは3倍以上の場合が含まれる。具体的には本発明のペプチド遺伝子は腫瘍(肉腫、腎癌）で発現誘導を示すので、被験者組織で該遺伝子の発現産物（本発明のペプチド）に対する抗体が存在しており、この本発明のペプチドに対する抗体の量が正常な組織での本発明のペプチドに対する抗体量と比べて2倍以上、好ましくは3倍以上多いことが判定されれば、腫瘍の罹患が疑われる。

(iv)HLAテトラマーに関する腫瘍マーカー
本発明はまた、本発明のペプチドとHLA-A2抗原とを含有するHLAテトラマー、および当該HLAテトラマーからなる腫瘍マーカーを提供する。
ここでHLAテトラマーとは、HLA抗原のα鎖とβ2ミクログロブリンをペプチド（抗原ペプチド）と会合させた複合体（HLAモノマー）をビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したものを指す（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996)、これらの文献は引用により本願の一部を構成する)。現在では種々の抗原ペプチドを含有するHLAテトラマーが市販されており（例えば(株)医学生物学研究所）、本発明のペプチドとHLA-A2抗原とを含有するHLAテトラマーを容易に作製することができる。

具体的には、例えば配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチドとHLA-A2抗原とを含有するHLAテトラマーが挙げられる。
当該HLAテトラマーは、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の公知の検出手段により結合したCTLを容易に選別または検出することが出来るように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン（PE）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ペリジニンクロロフィルプロテイン（PerCP）などにより標識されたHLAテトラマーが挙げられる。

HLAテトラマーの作製法については、文献（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996)等、本文献は引用により本願の一部を構成する）により周知であるが、簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、HLA-A2α鎖発現ベクターおよびβ2ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例えばBL21）を用いることが好ましい。得られた単量体HLA-A2複合体と本発明ペプチドとを混合し、可溶性のHLA-ペプチド複合体を形成させる。次にHLA-ペプチド複合体におけるHLA-A24α鎖のC末端部位の配列をBirA酵素によりビオチン化する。このビオチン化されたHLA-ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを4：1のモル比で混合することにより、HLAテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。

(v)腫瘍の検出方法（診断方法）
本発明は、前述した本発明腫瘍マーカーを利用した腫瘍の検出方法（診断方法）を提供するものである。
具体的には、本発明の検出方法（診断方法）は、被験者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこに含まれるPBF由来の腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原との複合体を認識するCTLの量を、検出・測定することにより、肉腫や腎癌等の腫瘍の罹患の有無またはその程度を診断するものである。また本発明の検出（診断）方法は、例えば腫瘍患者において、該腫瘍の改善のために治療薬を投与した場合における、該疾患の改善の有無またはその程度を検出（診断）することもできる。さらに本発明の検出（診断)方法は、本発明のペプチドまたは核酸を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択や、当該医薬による治療効果の判定などにも利用できる。

本発明の検出方法は次の(a)、(b)及び(c)の工程を含むものである：
(a) 被験者の生体試料と本発明の腫瘍マーカーを接触させる工程、
(b) 生体試料中のPBF由来の腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原との複合体を認識するCTLの量を、上記腫瘍マーカーを指標として測定する工程、
(c) (b)の結果をもとに、腫瘍の罹患を判断する工程。
ここで用いられる生体試料としては、被験者の生体組織（腫瘍が疑われる組織及びその周辺組織、または血液など）から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から調製されるRNA含有試料、若しくはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料、または上記組織から調製されるペプチド、抗体を含む試料、あるいは上記組織から調製される末梢血リンパ球を含む試料を挙げることができる。
本発明の診断方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。

((v)-1) 測定対象の生体試料としてRNAを利用する場合
測定対象物としてRNAを利用する場合、腫瘍の検出は、具体的に下記の工程(a)、(b)及び(c)を含む方法によって実施することができる：
(a)被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、前記本発明の腫瘍マーカー（本発明のポリヌクレオチド及び/又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド）とを結合させる工程、
(b)該腫瘍マーカーに結合した生体試料由来のRNAまたは該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記腫瘍マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記(b)の測定結果に基づいて、腫瘍の罹患を判断する工程。
測定対象物としてRNAを利用する場合は、本発明の検出方法（診断方法）は、該RNA中の本発明の遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。具体的には、前述のポリヌクレオチドからなる本発明の腫瘍マーカー（本発明のポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチド）をプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法、DNAチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。

ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記腫瘍マーカーをプローブとして用いることによって、RNA中の本発明の遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の腫瘍マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（³²P、³³Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された腫瘍マーカー（DNA）とRNAとの二重鎖を、腫瘍マーカーの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、該プロトコールに従って腫瘍マーカー（プローブDNA）を標識し、被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、腫瘍マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。

RT-PCR法を利用する場合は、本発明の上記腫瘍マーカーをプライマーとして用いることによって、RNA中の本発明の遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として本発明の遺伝子が増幅できるように、本発明の腫瘍マーカーから調製した一対のプライマー（上記cDNA（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖DNAの検出は、上記ＰＣＲを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖DNAを検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した腫瘍マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖DNA産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。

DNAチップ解析を利用する場合は、本発明の上記腫瘍マーカーをDNAプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたDNAチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明の腫瘍マーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。

((v)-2) 測定対象の生体試料としてペプチドを用いる場合
測定対象物としてペプチドを用いる場合は、本発明の腫瘍の検出方法（診断方法）は、生体試料中の本発明のペプチドを検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には下記の工程(a)、(b)及び(c)を含む方法によって実施することができる：
(a)被験者の生体試料から調製されたペプチドと抗体に関する本発明の腫瘍マーカー（PBFを認識する抗体）とを結合させる工程、
(b)該腫瘍マーカーに結合した生体試料由来のペプチドを、上記腫瘍マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記(b)の測定結果に基づいて、腫瘍の罹患を判断する工程。
より具体的には、本発明の腫瘍マーカーとして抗体（本発明のペプチドを認識する抗体）を用いて、ウエスタンブロット法などの公知方法で本発明のペプチドを検出、定量する方法を挙げることができる。

ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明腫瘍マーカーを用いた後、二次抗体として¹²⁵Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した標識抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明腫瘍マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detction System (アマシャムファルマシアバイオテク社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(アマシャムファルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。

((v)-3) 測定対象の生体試料として抗体を用いる場合
測定対象物としてペプチド中に存在する抗体を用いる場合は、本発明の腫瘍の検出方法（診断方法）は、生体試料中の本発明のペプチドに対する抗体を検出し、その量を測定することによって実施される。具体的にはペプチドに関する本発明の腫瘍マーカーを用い、前記（(v)-2）と同様の手法にて行うことができる。

((v)-4) 測定対象の生体試料として腫瘍抗原特異的CTLを用いる場合
測定対象物として末梢血リンパ球中に存在する腫瘍抗原特異的CTLを用いる場合は、本発明の腫瘍の検出方法（診断方法）は、生体試料中の本発明のペプチド特異的CTLを検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には、文献（Science,274:p94,1996、本文献は引用により本願の一部を構成する）に記載の方法に従って蛍光標識したHLA抗原と本発明のペプチドとの複合体の4量体（HLAテトラマー）を作製し、これを用いて腫瘍が疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的CTLをフローサイトメーターにより定量することにより行うことができる。

((v)-5)腫瘍の診断
腫瘍の診断は、例えば、被験者の血液や腫瘍が疑われる被験組織における本発明のペプチド遺伝子の遺伝子発現レベル、これらの遺伝子の発現産物である本発明のペプチドの量、本発明のペプチドに対する抗体の量、または本発明のペプチド特異的CTLの量を測定することにより行うことができる。その際、場合によっては正常な対応組織における当該遺伝子発現レベルまたは当該ペプチドレベル等と比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
ここで被験者の被験組織と正常な対応組織との遺伝子、ペプチド、抗体、またはCTLの量（レベル）の比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な組織を用いて均一な測定条件で測定して得られた本発明のペプチド遺伝子の遺伝子発現レベル、本発明のペプチドの量、本発明のペプチドに対する抗体の量、または本発明のペプチド特異的CTLの量の平均値または統計的中間値を、正常者の値として、比較に用いることができる。

被験者が、腫瘍であるかどうかの判断は、例えば該被験者の組織における本発明のペプチド遺伝子の遺伝子発現レベル、本発明のペプチドの量、本発明のペプチドに対する抗体の量、または本発明のペプチド特異的CTLの量が、正常者のそれらのレベルと比較して２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として行うことができる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。

ペプチドの合成とHLA-A0201への結合親和性の測定
配列番号：４のペプチドをFmoc法により合成した。ペプチドのHLA-A0201に対する結合親和性は、HLAクラスI安定化アッセイ（J Immunol 2004, 173:1436、本文献は引用により本願の一部を構成する）により測定した。アッセイの陽性対照としてインフルエンザマトリックス蛋白質由来のペプチド（RYLRDQQLLGI、配列番号：５）、陰性対照としてマウスのH-2Kb結合性ペプチドVSV8（RGYVYQGL、配列番号：６）を用いた。アッセイはトリプリケートで行った。測定したペプチドのHLA-A0201への結合親和性は、FITC標識した抗HLA-A2モノクローナル抗体BB7.2（ATCCより購入）で染色し、フローサイトメーターで測定した％平均蛍光強度の増加(percent mean fluorescence Intensity increase; %MFI increase)を次式より求めて検出した。%MFI increase＝[(MFI with the given peptide - MFI without peptide)/(MFI without peptide)] x 100。陽性対照のインフルエンザマトリックス蛋白質由来のペプチド（配列番号：５）、陰性対照のH-2Kb結合性ペプチドVSV8（配列番号：６）、配列番号：４のペプチドの%MFI increase ± 標準偏差(SD)は、それぞれ44.9±6.8、5.6±8.2、74.5±6.6であり、配列番号：４のペプチドがHLA-A0201に結合することが示された。

抗原ペプチド特異的CTLの頻度解析
5名のPBF陽性の骨肉種患者のリンパ球を用いて、限界希釈の条件下での混合リンパ球ペプチド培養法（limiting dilution/mixed lymphocyte peptide culture; LD/MLPC）を行い、ペプチド特異的なCTLの誘導を行った（Cancer Sci. 2008. 99: 368-375.、本文献は引用により本願の一部を構成する）。患者No. 1、患者No. 2の2名については、末梢血50ml採取し、末梢血単核球（PBMC）を分離した。PBMCは、50μg/mlの配列番号：４のペプチドを添加した1％ヒト血清含有AIM-V培養液(Invitrogen社)で室温、60分間培養した。このペプチドをパルスしたPBMCは、U底の96ウェルマイクロプレートに10％ヒト血清、20U/mlのIL-2、10ng/mlのIL-7を含んだAIM-V培養液を用いて、2×10⁵細胞/200μl/ウェルで播種して培養した。培養開始7日後にIL-2、IL-7、配列番号：２のペプチドを含んだAIM-V培養液で各ウェル中の培養液の半量を交換して２回目の刺激を行った。培養開始14から21日後の細胞をテトラマーによる頻度解析に用いた。
患者No. 3、患者No. 4、患者No. 5の3名については、PBMCからマグネティック抗CD8マイクロビーズ（Miltenyi Biotec社）を用いてCD8陽性細胞を分離した。CD8陽性細胞は配列番号：４のペプチドで60分間パルスし、放射線照射して不活化した。1.0×10⁵〜2.1×10⁵/ウェルのCD8陽性細胞は、48ウェルマイクロプレートに10％ヒト血清、20U/mlのIL-2、10ng/mlのIL-7を含んだAIM-V培養液を用いて、2×10⁵〜5×10⁵細胞/ウェルのペプチドパルスした放射線照射CD8陽性細胞と一緒に培養した。培養7日後に前回と同様にペプチドパルスした放射腺照射CD8陽性細胞を添加して、2回目の刺激を行った。培養開始13から23日の細胞をテトラマーによる頻度解析に用いた。配列番号：４のペプチドを用いて作製したPE標識HLA-A0201/PBFテトラマー（MBL社）を解析に用いた。
また、陰性対照として、HIV由来のペプチドを用いて作製したFITC標識HLA-A0201/HIVテトラマー（MBL社）を用いた。LD/MLPC法で培養したリンパ球の一部をPE標識HLA-A0201/PBFテトラマーとFITC標識HLA-A0201/HIVテトラマー（25μlのPBS中に各10ｎM）で室温15分間インキュベートして染色した。さらにPE-Cy5標識抗CD8抗体(eBioscience社)を添加して15分間インキュベートして染色した。その後、PBSで2回洗浄し、0.5%のフォルマリンで固定して、フローサイトメーターのFACScanで解析した。PE-Cy5標識抗CD8抗体とPE標識HLA-A0201/PBFテトラマーの両方に染色された生細胞をテトラマー陽性のペプチド特異的CTLとした。配列番号：２のペプチドに特異的なCTLの頻度は、次式で求めた。頻度＝テトラマー陽性のウェル数/（試験した全ウェル数×LD/MLPC開始時のウェル当たりのCD8陽性細胞数）。5名の患者のCTL頻度の結果を表３に示した。5名中患者No. 2、3、4の3名の頻度はそれぞれ5×10^-6、2×10^-7、5×10^-7であり、配列番号：４のペプチドに特異的なCTLの誘導が認められた。

抗原ペプチド特異的CTL株の樹立
T細胞の培養には、HLA-A0201陽性の健常人のB細胞をEBウイルスでトランスフォームしたB細胞株NS-EBV-B細胞、HLA-A0201陰性の骨肉種患者のB細胞をEBウイルスでトランスフォームしたB細胞株LCL-S2000細胞（J Orthop Sci. 2003. 8: 554-559.、本文献は引用により本願の一部を構成する）を用いた。実施例２でテトラマー陽性であった患者No.4のウェルのT細胞を96ウェルマイクロプレートにウェル当たり1個細胞で播種し、各ウェルに放射線照射し配列番号：４のペプチドをパルスしたNS-EBV-B細胞を2×10⁴個及び放射線照射したアロジェニックのPBMCを8×10⁴個を加え、10％ヒト血清、200U/mlのIL-2、10ng/mlのIL-7を含んだ200μlのAIM-V培養液で培養した。培養開始14日後、21日後に培養液100μlを放射線照射し配列番号：４のペプチドをパルスしたNS-EBV-B細胞1×10⁴個、LCL-OS2000細胞1×10⁴個及び放射線照射したアロジェニックのPBMCを8×10⁴個を含んだ新しい培養液と交換した。培養開始35日後に全ウェルの一部の細胞をHLA-A0201/PBFテトラマーで解析した。
テトラマー陽性のウェルの細胞を集め、丸底の96ウェルマイクロプレートにウェル当たり2×10³個の細胞を放射線照射したアロジェニックのPBMC1×10³個と一緒に10％ヒト血清、200U/mlのIL-2及び7.5μg/mlのフィトヘマグルチニンPを含むAIM-V培養液100μlで培養を開始した。7日後に各ウェルに10％ヒト血清とIL-2を含むAIM-V培養液100μlを加えた。14日後に増殖した全ての細胞を集め、48ウェルマイクロプレートにウェル当たり0.5〜１×10⁶個の細胞を添加して、10％ヒト血清とIL-2を含むAIM-V培養液で培養した。このようにして樹立された細胞株をCTL5A9と名付けた。CTLによる細胞傷害活性は、⁵¹Crリリースアッセイ（J Immunol 2002. 169: 1611-1618.、本文献は引用により本願の一部を構成する）で測定した。
骨肉腫細胞株のU2OS（図２中、U2OS）とOS2000（図２中、OS2000）、赤白血病由来細胞株K562（図１及び２中、K562）及びリンパ芽球細胞株T2細胞（図１中、T2）を標的細胞として用いた。U2OSはHLA-A0201陽性、PBF陽性、OS2000はHLA-A0201陰性、PBF陽性、K562はHLA-A0201陰性、PBF陽性、T2はHLA-A0201陽性、PBF陰性である。標的細胞は、100μCiの⁵¹Crで1時間ラベルした。T2は、⁵¹Cr でラベル後に50μg/mlの配列番号：４のペプチドで1時間パルスした細胞とペプチドをパルスしない細胞を用意した。U2OSは、100U/mlのインターフェロンγで48時間処理した細胞と無処理の細胞を用意した。図１にペプチドをパルスしたT2細胞、ペプチドをパルスしていないT２細胞及びK562に対するCTL5A9の傷害活性を示した。CTL5A9は、ペプチドをパルスした細胞に対してのみ細胞傷害活性をしめした。
図2に骨髄腫細胞株のU2SO、OS2000に対するCTL5A９の傷害活性を示した。CTLA5A9は、PBF陽性、HLA-A0201陽性のU2OS細胞を傷害したが、PBF陽性であってもHLA-A0201陰性のOS2000細胞、K562を傷害しなかった。また、IFN−γ処理によりU2SO細胞のHLA-A0201の発現量を増加させるとCTL5A9に対して傷害を受けやすくなった。これらのことより、CTL5A9は癌細胞内で産生されたPBF由来の抗原ペプチドとHLA-0201の複合体を認識して傷害活性を示すことが明らかとなった。

本発明により、腫瘍抗原タンパク質PBFおよびその遺伝子の、CTLの誘導剤としての用途などが提供される。本発明のCTLの誘導剤は、肉腫や腎癌等の患者を処置することができる。

配列番号：３〜６に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

Claims

配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつHLA抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞（以下、「CTL」という。）により認識されるペプチド。
HLA抗原がHLA-A2である、請求項１記載のペプチド。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列又は、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸のメチオニン、バリン、イソロイシン若しくはグルタミンへの置換又はＣ末端のアミノ酸のロイシンへの置換を含むアミノ酸配列からなる、請求項２記載のペプチド。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有してなるCTLの誘導剤。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする核酸を含有してなる、CTLの誘導剤。
ポリヌクレオチドが配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項６記載のCTLの誘導剤。
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる核酸。
請求項８記載の核酸を含有してなるCTLの誘導剤。
以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド、
（ｂ）上記（ａ）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、抗原提示能を有する細胞とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、抗原提示細胞の製造方法。
請求項１０記載の製造方法により製造される抗原提示細胞。
以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド、
（ｂ）上記（ａ）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、CTLの誘導方法。
請求項１２記載の誘導方法により誘導されるCTL。
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む腫瘍マーカー。
配列番号：３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む、請求項１５記載の腫瘍マーカー。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる腫瘍マーカー。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一のポリペプチドからなる、請求項１７記載の腫瘍マーカー。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体、あるいは請求項１４に記載の抗体からなる腫瘍マーカー。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体からなる、請求項１９記載の腫瘍マーカー。
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドとHLA抗原とを含有するHLAテトラマー。
請求項２１記載のHLAテトラマーからなる腫瘍マーカー。
腫瘍が肉腫または腎癌である、請求項１５〜２０および請求項２２のいずれかに記載の腫瘍マーカー。
請求項１５〜２０、請求項２２および請求項２３のいずれかに記載の腫瘍マーカーを含有してなる腫瘍の診断薬。