KR20050098766A

KR20050098766A - ｍｄｍ2 기능을 억제하는 펩타이드

Info

Publication number: KR20050098766A
Application number: KR1020050000931A
Authority: KR
Inventors: 한규훈; 지승욱; 김현정; 이시형; 안민정; 김도형; 김재성; 박신애
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2004-04-06
Filing date: 2005-01-05
Publication date: 2005-10-12
Also published as: KR100788928B1; US8598127B2; WO2005097820A1; US20090030181A1

Abstract

본 발명은 mdm2-매개된 기능을 억제하는 펩타이드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

ｍｄｍ2 기능을 억제하는 펩타이드 {Peptides for inhibiting mdm2 function}

본 발명은 mdm2(mouse double minute 2) 기능을 억제하는 펩타이드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

p53 단백질은 세포성장과 어폽토시스(apoptosis)에 관여하는 단백질로 암 억제(tumor suppressor) 유전자로 작용하고, p53의 돌연변이에 의한 불활성화는 암 유발의 원인이 되고 있다. 그런데 어떤 경우에는 p53 유전자는 정상(wild type)인데, 그 단백질 산물이 불활성화 되는 경우가 있다. 이런 p53 불활성화 기작 중의 하나가 세포 발암유전자(cellular oncogene)인 mdm2의 과다발현이다. p53의 TAD (transcriptional activation domain)와 결합하여 p53의 기능을 저해하는 mdm2 단백질이 관여하는 되감김 루프 (feedback loop)에 의해 p53은 자동 조절되고 mdm2는 p53과 결합하여 유비퀴틴 의존적 경로로 p53의 분해를 촉진하여 암 유발을 촉진하게 된다(Oliner, J. D. et al. (1993) Nature 362, 857; Vassilev, L. T. et al. (2004) Science 303, 844-848; and Maki et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 16531)

이와 같이 mdm2 단백질이 인간의 많은 악성종양에서 증폭되거나 과대발현되고 이에 의해 p53의 기능이 저해되는 것이 밝혀짐에 따라 mdm2의 억제를 통한 p53 경로의 활성화는 암 치료제 개발의 새로운 타겟이 되고 있다.

이를 위한 연구의 일 분야가 p53과 mdm2간의 결합체 형성을 저해할 수 있는 소분자량의 제제 개발에 관한 것이며, 국제출원 공개번호 WO00/15657, 미국특허 US6770627 등에 mdm2와 p53의 상호작용을 억제하여 암 치료에 유용한 피페라진 유도체(piperazine derivative)를 기재되어 있고, 국제출원 공개번호 WO03/051360 에는 mdm2 단백질 억제제로 유방암, 대장암, 폐암 등의 치료에 유용한 시스-이미다졸린(cis-imidazoline)이 기재되어 있다. 국제출원공개번호 WO03/095625에는 mdm2 및 p53의 상호작용을 억제하는 1,4-벤조다이제핀(1,4-benzodiazepine)이 기재되어 있다. 국제출원공개번호 WO03/106384A2에는 mdm2의 발현 또는 mdm2 결합체 형성을 억제하는 보로닉 찰콘 유도체(boronic chalcone derivatives)에 대하여, Stoll의 문헌(Stoll, R. et al. (2001) Biochemistry 40, 336-344)에는 mdm2 과 p53의 결합을 저해하는 찰콘 유도체가 기재되어 있다.

또 다른 분야는 mdm2 단백질 발현을 억제하는 mdm2-특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 개발에 관한 것으로, 국제출원공개번호 WO99/49065, WO99/10486, 미국특허 US6013786, US6238921, EP1007658 등이 이런 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공하고 있다.

또한, mdm2와 특이적으로 결합하여 p53과 mdm2의 결합을 저해하는 펩타이드에 대한 연구들이 있었다. mdm2와 p53 TAD 펩타이드 결합체의 X선 결정구조에서는 p53 TAD의 18-26번 잔기에 해당하는 helix 부위만이 mdm2에 결합하는 것으로 나타난다(Kussie, R. H. et al., (1996) Science 274, 948-953). 따라서 이러한 X선 결정구조에 기초해 p53 α-helix에 초점을 맞춘 연구가 이후 추진되었다. 국제특허출원공개번호 WO9602642은 p53 α-helix의 아미노산 잔기 19 내지 23에 해당하는 펩타이드를, 미국특허 US5702908은 p53 α-helix의 아미노산 잔기 18 내지 23 부위에 해당하는 펩타이드를, 국제특허출원공개번호 WO98476525는 p53 α-helix의 아미노산 잔기 19 내지 23 부위에 해당하는 펩타이드를, 국제특허출원공개번호 WO9801467은 p53 α-helix의 아미노산 잔기 19 내지 26 부위에 해당하는 펩타이드, 미국특허 US5858976은 p53 α-helix를 포함하는 아미노산 잔기 14 내지 41 부위에 해당하는 펩타이드를 제공한다. 상기 펩타이드는 p53의 α-helix의 아미노산 해당하는 펩타이드를 이용하여, mdm2의 기능을 저해하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자는 이전의 연구에서, p53 TAD는 구조가 없는 무정형 단백질이라는 기존의 주장과 달리 p53 TAD가 mdm2와 결합하기 전 상태에서도 부분적으로 α-helix과 turn 같은 국부적인 이차구조를 가진다는 것을 밝혔다(Lee, H. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 29426-29432).

지금까지의 p53과 mdm2의 결합을 억제하는 펩타이드에 대한 모든 연구들이 mdm2와 p53 TAD 펩타이드 결합체의 X선 결정구조에 기초하여 p53 TAD의 helix 부위에 대해서만 이루어졌고, p53 TAD의 또 다른 이차구조에 해당하는 turn 부위와 mdm2 와의 실질적인 결합 형성 여부와 turn 유래한 mdm2와 p53의 결합을 억제하는 펩타이드에 대한 연구는 이루어지지 않았다.

이에, p53 TAD의 turn 부위가 mdm2의 결합에 미치는 영향을 핵자기공명분광법을 이용하여 화학적 이동 변동으로 살펴본 결과, helix 부위 뿐만 아니라 turn 부위도 mdm2와의 직접적 결합에 관여하고 있으며, 특히 turn Ⅱ에 해당하는 아미노산 서열 49 내지 54에 해당하는 부위가 mdm2와의 결합에 결정적인 기여를 하며, 이 부위에 해당하는 펩타이드 서열 또는 그 변이체를 암세포로 투여할 경우, p53과 mdm2와의 결합을 저해함으로써 p53 경로를 활성화시켜 세포사멸을 유도하는 것을 확인하고, mdm2 기능을 억제하는 펩타이드에 대한 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, mdm2 기능을 억제하는 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 mdm2-매개된 분해를 억제하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 투여하여 mdm2-매개된 분해를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는, mdm2 기능 억제를 위한 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

X¹-Z¹-X²-X³-Z²-Z³

상기식에서,

X¹, X², 및 X³은 동일하거나 상이하며, 천연 아미노산 및 비천연 아미노산으로부터 선택된 하나의 아미노산이고,

Z¹, Z², 및 Z³은 동일하거나 상이하며, 페닐알라닌, 루이신, 이소루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 티로신, 히스티딘, 메티오닌, 트립토판 및 이들의 비천연 아미노산 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 아미노산을 나타낸다.

본 발명에서 사용된 용어 “펩타이드(peptide)”란 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 아미노산으로 이루어진 폴리머이다. 본 발명의 목적상, mdm2에 특이적으로 결합하여 mdm2의 기능을 억제하는 펩타이드를 의미한다. 상기 펩타이드는 mdm2와 결합하는 p53 TAD의 turn Ⅱ에 해당하는 부위에 해당하는 아미노산 서열 또는 이에 상응하는 활성을 가지는 서열을 가지는 펩타이드로서, p53 등의 mdm2와 결합하는 단백질의 경쟁적 기질로 작용하여, mdm2와 결합하는 다양한 기질 단백질과의 결합을 억제하는 효과를 가진다. 바람직하게는, p53과 mdm2의 결합을 억제하는 펩타이드이다.

본 발명자는 p53 TAD의 helix 뿐만 아니라 turn 부위도 mdm2와의 결합에 관여하고, 특히 p53 TAD(49-54) 펩타이드가 p53 TAD(39-48) 보다 mdm2의 결합에 결정적인 역할을 한다는 것을 화학적 이동 변동 실험으로 밝혔다. p53 TAD(49-54) 펩타이드와 mdm2(3-109) 단백질의 특이적인 결합은 BiAcore 분석으로 다시 확인할 수 있었으며, 이 때 mdm2(3-109)에 결합된 상태에서는 p53 TAD(49-54) 펩타이드가 helix 구조를 형성함을 핵자기공명분광법 분석으로 알 수 있었다.

본 발명의 펩타이드는 상기한 화학식 1의 아미노산 서열의 N 말단 전방 및 C 말단 후방으로 추가의 아미노산 서열을 가질 수 있다. mdm2와 실질적인 결합을 형성하는 한 길이는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 N 말단 전방으로 0 내지 10개의 아미노산 서열 및 C 말단 후방으로 0 내지 3개의 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

따라서, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기한 화학식 1의 아미노산 서열, 이의 N 말단 전방으로 0 내지 10개의 아미노산 서열 및 C 말단 후방으로 0 내지 3개의 아미노산 서열을 포함하는, mdm2와 결합하는 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

상기 화학식 1의 아미노산 서열 중, 천연 아미노산은 아스파라긴산, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 루이신, 라이신, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택되며, 비천연 아미노산은 바람직하게는 알파-아미노부티르산(Aib: alpha-aminoisobutyric acid), 1-아미노-사이클로프로판카복실산(Ac3c: 1-amino-cyclopropanecarboxylic acid), 노르루이신(Nie: norleucine), 메틸글리신(MeGly: methylglycine), 4-포스포노메틸 페닐알라닌(Pmp: 4-phosphonomethyl phenylalanine), 5-메틸 트립토판(5-Me-Trp: 5-methyl tryptophane), 6-메틸 트립토판(6-Me-Trp: 6-methyl tryptophane), 6-클로로 트립토판(6-Cl-Trp: 6-Chlorotryptophane) 및 6-플루오로트립토판(6-F-Trp: 6-Fluorotryptophane)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 따라서, 아미노산 잔기 X¹, X², 및 X³은 아스파라긴산, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 루이신, 라이신, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, 알파-아미노부티르산, 1-아미노-사이클로프로판카복실산, 노르루이신, 메틸글리신, 4-포스포노메틸 페닐알라닌, 5-메틸트립토판6-메틸트립토판, 6-클로로트립토판 및 6-플루오로트립토판으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는, X¹은 아스파라긴산(Asp: D)이고, X²는 글루탐산(Glu: E)이고, X³는 글루타민(Gln: Q)이다.

아미노산 잔기 Z¹, Z², 및 Z³에서 비천연 아미노산 유도체는 Nie, 5-Me-Trp, 6-Me-Trp, 6-Cl-Trp 또는 6-F-Trp일 수 있다. 따라서, 아미노산 잔기 Z¹, Z², 및 Z³은 바람직하게는 페닐알라닌, 루이신, 이소루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 티로신, 히스티딘, 메티오닌, 트립토판, 노르루이신, 5-메틸트립토판, 6-메틸트립토판, 6-클로로트립토판 및 6-플루오로트립토판으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 Z¹, Z², 및 Z³은 페닐알라닌, 루이신, 이소루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 티로신, 히스티딘, 메티오닌, 트립토판 또는 노르루이신이다. 보다 바람직하게는 Z¹, Z², 및 Z³은 트립토판, 페닐알라닌, 루이신, 이소루이신 또는 노르루이신이다. 보다 더 바람직하게는 Z²는 트립토판(Trp: W)이고, Z¹은 이소루이신(Ile: I) 또는 트립토판이고, Z³는 페닐알라닌(Phe: F) 또는 트립토판이다.

바람직한 예시에서, X¹-Z¹-X²-X³-Z²-Z³ 펩타이드는 DFEQWF, DWEQWF, DIEQWF, DLEQWF, DFEQWW, DWEQWW, DIEQWW, DLEQWW, DFEQWL, DWEQWL, DIEQWL, DLEQWL, DFEQWI, DWEQWI, DIEQWI 또는 DLEQWI를 들 수 있으며, 보다 바람직한 예시에서, DWEQWW 또는 DIEQWF를 들 수 있다.

본 발명의 펩타이드의 아미노산은 L-형태 또는 D-형태일 수 있다. 상기 펩타이드는 목적에 따라 특정 원자나 원자단이 하이드록실기, 메틸기 등으로 치환된 유도체일 수 있으며, C 말단의 카복실기는 카복실아미드, 에스테르 등으로 치환될 수 있고, N 말단의 아미노기는 아세틸기, 수소 등으로 치환될 수 있다.

상기에서 용어, "N-말단 전방으로 0 내지 10개의 아미노산 서열"이란 펩타이드의 X¹아미노산 잔기를 기준으로 좌측으로 위치한 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 서열을 의미하고, 바람직하게는 D, PD, SPD, LSPD, MLSPD, LMLSPD, DLMLSPD, DDLMLSPD, MDDLMLSPD, 또는 AMDDLMLSPD의 서열을 포함한다. C-말단 후방으로 0 내지 3개의 아미노산 서열"이란 펩타이드의 Z³아미노산 잔기를 기준으로 우측으로 위치한 0, 1, 2, 또는 3개의 아미노산 서열을 의미하고, 바람직하게는 T, TE, 또는 TED의 서열을 포함한다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 추가의 아미노산 서열도 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 이펙터(effectors), 약물, 프로드럭, 독소, 펩타이드, 전달 분자 등의 커플링 파트너와 연결될 수 있다. 본 발명의 구체적인 양태에서는 펩타이드의 세포내로의 이동을 촉진하기 위하여 세포 투과성 펩타이드(cell permeable peptide)인, HIV-1 Tat 단백질의 48 내지 60개의 아미노산으로 구성된 세포 투과성 펩타이드를 본 발명의 mdm2 결합 펩타이드의 N 말단에 연결하여 사용하였다.

상기 펩타이드는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관내에서 합성하는 방법 등으로 제조된다.

본 발명의 펩타이드의 약제학적으로 허용 가능한 염은 무기산(예: 염산, 히드로브롬산, 인산, 질산, 황산 등), 유기 카르복실산(예: 아세트산, 트리플루오로아세트산과 같은 할로 아세트산, 프로피온산, 말레산, 숙신산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 살리실산), 및 산성 당(글루쿠론산, 갈락투론산, 글루콘산, 아스코르브산), 산성 폴리사카리드(예: 히알우론산, 콘드로이틴 술페이트, 아르기닌산), 콘드로이틴 술페이트와 같은 술폰산 당 에스테르를 포함하는 유기 술폰산(예: 메탄 술폰산, p-톨루엔 술폰산) 등을 첨가하여 염을 형성할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 펩타이드를 포함하는 mdm2-매개된 분해를 억제하는 조성물을 제공한다.

mdm2는 유비퀴틴 의존적 방식으로 p53 단백질의 분해를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물을 암세포 또는 바이러스 감염된 세포에 처리할 경우, mdm2-매개된 p53 단백질의 분해는 억제되고, 세포사멸이 유도된다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 음성대조구로 아미노산 서열 DAEQAA를 가지는 알라닌 치환된 펩타이드는 암세포에서 세포사멸을 유발할 수 없으나, mdm2에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열인 DIEQWF를 가지는 펩타이드는 세포사멸을 효과적으로 유발하며, 특히 DWEQWW로 치환된 펩타이드는 DIEQWF 보다 월등히 높은 세포사멸 유도 활성을 보여주었다.

따라서, 본 발명은 mdm2-매개된 분해를 억제하여 p53에 의한 세포사멸을 촉진하는 항암제 또는 항바이러스제 조성물을 제공하며, 보다 바람직하게는 mdm2 증폭 및 과발현에 의하는 암을 예방 또는 치료하는 조성물을 제공한다.

많은 암에서 p53의 돌연변이와 상관없는 mdm2의 증폭 및 과다 발현이 관찰된다. 예를 들어, mdm2 전사의 수준의 증가는 백혈병(leukemia), 임파종(lymphomas) 등에서 관찰되고, mdm2의 증폭은 식도암종 (esophageal carcinomas), 신경아세포종 (neuroblastoma), 연부조직암(soft tissue tumors) 등에서 발견된다. 연부조직암에는 유잉 육종 (Ewing's sarcoma), 레이오미싸코마 (leiomysarcoma), 리포마스(lipomas), 리포싸코마 (liposarcoma), 섬유성 조직구종(malignant fibrous histiocytomas), 악성 신경초종(maliginat schwannomas) 등이 있다[Jamil Momand et al,, (1998) Nucleic Acids Research, 26, 3453-3459].

따라서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 백혈병, 임파종, 식도암종, 신경아세포종, 또는 연부조직암을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

상기 발명의 조성물은 상기 펩타이드를 한 종류 이상 포함할 수 있으며, 상기 펩타이드는 당 사슬 화합물, 지질 화합물, 핵산 화합물, 다른 종류의 펩타이드 또는 단백질 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지질 화합물에는 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 팔미토일올레일포스파티딜글리세롤(POPG), 포스파티딜글리세롤(PG), C₁₈ 포화 지방산, C₁₆ 불포화 지방산, C₁₈ 불포화 지방산 등이 있다.

본 발명의 조성물은 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조된다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있고, 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트 등이 있다.

상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구투여용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 펩타이드의 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르빅산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 펩타이드는 세포내에서 펩타이드가 생성되도록, 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 펩타이드를 포함하는 mdm2-매개된 분해를 억제하는 방법을 제공한다.

바람직하게는 mdm2와 p53의 결합을 억제하여 암 또는 바이러스 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 보다 바람직하게는 백혈병, 임파종, 식도암종, 신경아세포종, 및 유잉 육종, 레이오미싸코마, 리포마스, 리포싸코마, 섬유성 조직구종, 악성 신경초종 등의 연부조직암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 허용 가능한 약제학적 담체와 함께 적절한 제제로 제형화되어 다양한 경로로 투여된다. "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트퓸, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효량으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효량"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 활성 물질을 약 0.01mg/kg/일 내지 1000mg/kg/일의 용량으로 투여할 수 있다. 경구 투여하는 경우, 50 내지 500mg/kg의 범위가 적합할 수 있으며 1일 1회 이상 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1- 인간 p53 TAD와 mdm2 단백질의 생산

인간 p53 TAD의 1-73번 잔기에 해당하는 p53 TAD 도메인(서열번호 1)을 클로닝하였다[Lee, H. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 29426-29432]. 서열번호 2의 정방향 프라이머와 서열번호 3의 역방향 프라이머에 해당하는 올리고뉴클레오타이드를 합성한 후 종합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였고 BamHI와 HindIII 제한부위를 이용하여 E. coli 발현벡터 pGEX-2T (Stratagene)에 삽입하였다.

프라이머: 5'-GGTCGGATCCATGGAGCCGCAGTCA-3'(서열번호 2)

프라이머: 3'-GGTGAAGCTTACACGGGGGGAGCAGCCTC-5'(서열번호 3)

p53 TAD(1-73)에는 벡터에서 유래한 글리신과 세린이 N-말단에 추가로 포함되고 글루타싸이오닌 전달 효소(Glutathionine transferase, GST)가 N-말단에 연결된 GST-p53 TAD(1-73)의 융합단백질로 발현되었다. GST-p53 TAD(1-73)를 과대발현 하기위해 형질전환된 BL21(DE3) E. coli 세포를 M9 최소배지에서 37℃로 배양하였다. OD600 값이 0.7일때 IPTG(isopropyl thio-β-D-thiogalactopyranoside)를 최종농도가 0.6mM 되도록 배지에 첨가한 후 세포들을 4시간 동안 추가 배양하였다. 15N 동위원소 표지를 위해 사용된 M9 최소배지에는 1mg/ml 15NH4Cl, 0.4% 글루코스, 2mg/l 바이오틴, 2mg/l 티아민, 1mM 황산마그네슘(MgSO₄), 0.1mM 염화칼슘 (CaCl₂), 0.05mg/ml 앰피실린이 첨가되어있다. 배양된 세포를 원심분리하여 모은 뒤 완충액(50mM sodium phosphate (pH 7.8), 1mM PMSF, 10mM β-mercaptoethanol)을 넣고 초음파분쇄로 세포를 용출(lysis)시켰다. GST-p53 TAD(1-73) 융합단백질을 글루타싸이오닌-세파로스 친화 레진(Glutathione Sepharose affinity resin)(Amersham Pharmacia Biotech)에 의해 정제한 후 트롬빈(Roche Molecular Biochemicals)으로 절단시킨다. 절단된 p53 TAD(1-73)을 SOURCE 15Q FPLC 이온 컬럼과 Vydac C18 HPLC 컬럼으로 정제하였다.

pLM1 벡터내에서 3-109번 잔기에 해당하는 인간 mdm2 단백질 N-말단 도메인(서열번호 4)을 BL21(DE3) E. coli 세포에서 과대발현시켰다[Uesugi M. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 14801-1480]. 형질전환된 E. coli 세포를 LB 배지에서 37℃로 배양하였고 OD600 값이 0.6일때 IPTG를 최종농도가 0.4 mM 되도록 배지에 첨가하였다. 이후 세포들은 30℃에서 4시간 동안 추가 배양하였다. 배양된 세포를 원심분리하여 모은 뒤 완충액(50mM TrisHCl (pH 7.5), 0.4M NaCl, 1mM PMSF, 10mM β-mercaptoethanol)을 넣고 초음파분쇄로 세포를 용출시켰다. 원심분리 후 상층액에 황산암모니움을 첨가하여 침전시켰다. 침전된 단백질을 완충액(50mM Tris.HCl (pH 7.5), 0.4M NaCl, 1mM PMSF, 10mM β-mercaptoethanol)에 녹인후 SP-sepharose와 Q-sepharose 컬럼 크로마토그래피, 하이프랩 26/60 세파크릴(Hiprep 26/60 Sephacryl) S-200 FPLC 컬럼(Pharmacia Biotech)을 이용하여 정제하였다. ¹⁵N과 ¹⁵N, ¹³C 동위원소 표지된 ¹⁵N-mdm2(3-109)와 ¹⁵N,¹³C-mdm2(3-109) 단백질은 ¹⁵NH4Cl 또는 ¹³C-글루코즈 및 ¹⁵NH₄Cl가 첨가된 M9 최소배지에서 세포배양을 수행하였고 IPTG 첨가한 후 20℃에서 16시간 동안 추가 배양하였다. 배양 이후의 정제방법은 상기 기술된 바와 동일하게 수행하였다.

실시예 2 - p53 절편 펩타이드 합성

p53 절편 펩타이드는 APEX 348W(Advanced Chemtech) 펩타이드 합성기를 이용하여 고체상 방법으로 합성하였다. 합성된 펩타이드는 다음과 같다:

p53(39-57) - AMDDLMLSPDDIEQWFTED (서열번호 5),

p53(49-54) - DIEQWF (서열번호 6),

p53(49-54)의 I50A/W53A/F54A 치환체- DAEQAA(서열번호 7),

p53(39-48) - AMDDLMLSPD (서열번호 8),

p53(49-57) - DIEQWFTED (서열번호 9),

p53(49-57)의 I50A/W53A/F54A 치환체 - DAEQAATED (서열번호 10),

p53(49-54)의 I50W/F54W 치환체 -DWEQWW (서열번호 11),

p53(49-54)의 I50V/W53V/F54V 치환체 -DVEQVV (서열번호 12).

합성된 p53 절편 펩타이드의 C 말단은 모두 아미드화(amidation)시켰고 합성 후 Vydac C18 HPLC 컬럼으로 정제하였다. 최종 정제된 절편 펩타이드들의 분자량은 MALDI-TOF 질량분석기로 확인하였다.

실시예 3 - 핵자기공명분광법

모든 핵자기공명 데이터들은 베리안(Varian) Unity INOVA 600 MHz 핵자기공명분광기에서 5℃와 25℃에서 측정되었다. 15N-1H HSQC(heteronuclear single quantum coherence spectroscopy) 스펙트럼을 수집할 때 스펙트럼의 폭(spectral width)은 ¹H축은 8000 Hz로 ¹⁵N축은 1800 Hz로 하였다. 데이터 수는 t2 도메인은 1024 포인트이고 t1 도메인은 256 포인트이다.

¹⁵N,¹³C-mdm2(3-109)의 3차원 HNCA, HNCOCA실험과 15N-mdm2(3-109)의 ¹⁵N-edited TOCSY, 15N-edited NOESY (mixing time = 150ms) 실험을 25℃에서 수행하여 단독 상태 및 결합 상태의 mdm2(3-109) 단백질의 화학적 이동 지정(chemical shift assignment)을 수행하였다. 25mM TrisHCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 2mM DTT, 0.1mM PMSF, 0.1mM EDTA, 0.1mM benzamidine, 0.02% NaN3의 완충액에 녹여진 ¹⁵N-mdm2(3-109)와 ¹⁵N,¹³C-mdm2(3-109)를 0.4mM mdm2(3-109) 농도에서 단독 상태의 3차원 핵자기공명분광실험을 수행하였다. 이 단백질들에 몰농도비가 1:1이 되도록 p53 TAD(1-73)을 첨가한 후 결합 상태 mdm2(3-109)의 3차원 핵자기공명분광실험도 동일하게 수행하였다.

p53 TAD(39-57) 절편 펩타이드의 구조 해석을 위해 10℃ 온도, 4mM p53 TAD(39-57) 농도, pH 6.1의 조건에서 80% 메탄올에 녹인 p53 TAD(39-57)의 2차원 NMR 실험을 수행하였다. 또한 H₂O 상에서 mdm2(3-109)에 결합된 p53 TAD(39-57)의 구조를 규명하기위해서 TRNOE 실험을 수행하였다. TRNOE 스펙트럼은 0.1mM mdm2(3-109)와 2mM의 p53 TAD(39-57) 농도비에서 10℃의 온도와 100ms 의 mixing time에서 측정하였고 용매조건은 25mM TrisHCl (pH 7.5), 150mM NaCl 이였다.

TOCSY(Griesinger, C. et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110, 7870-7872), NOESY (mixing time =200ms) 및 ROESY 실험을 통해 서열 특이적 신호 지정 (Sequence-specific resonance assignment)을 수행하였고 DQF-COSY 실험(Rance, M. et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 117, 479-485)으로 ³J_HNH커플링 상수(coupling constant)를 측정하였다. 이러한 2차원 NMR 스펙트럼들을 수집할 때 스펙트럼의 폭(spectral width)은 양축 모두 8000 Hz로 하였다. 데이터 수는 t2 도메인은 2048 포인트이고 t1 도메인은 256 포인트였다. 모든 NMR 데이터는 Sun SPARCstation 워크스테이션에서 Varian Vnmr과 nmrPipe/nmrDraw 소프트웨어 (Delaglio, F. et al. (1995) J. Biomol. NMR. 6, 277-293)를 이용하여 분석하였다.

실시예 4 - 화학적 이동 변동 (Chemical shift perturbation) 실험

¹⁵N 동위원소 표지된 ¹⁵N-p53 TAD(1-73) 단백질을 50mM 아세트산나트륨-d3 (pH 6.3), 50mM NaCl (90% H₂O/10% D₂O)의 완충액에 녹여 0.4 mM ¹⁵N-p53 TAD(1-73) 농도와 5℃ 온도에서 2차원 ¹⁵N-1H HSQC 스펙트럼을 수집하였다. 이후 ¹⁵N-p53 TAD(1-73) 단백질에 mdm2(3-109) 단백질을 차례로 첨가시키며 ¹⁵N-p53 TAD(1-73) : mdm2(3-109)의 몰농도 비가 1:0, 1:0.3, 1:0.6, 1:1, 1:2인 지점에서 동일한 ¹⁵N-p53 TAD(1-73)의 ¹⁵N-1H HSQC 스펙트럼을 수집하였다.

이와는 반대로 ¹⁵N 동위원소 표지된 ¹⁵N-mdm2(3-109) 단백질을 25mM TrisHCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 2mM DTT, 0.1mM PMSF, 0.1mM EDTA, 0.1mM 벤즈아미딘, 0.02% NaN₃의 완충액에 녹여 0.2 mM의 15N-mdm2(3-109) 농도와 25℃ 온도에서 15N-1H HSQC 스펙트럼을 수집하였다. 이후 15N-mdm2(3-109) 단백질에 p53 TAD (1-73) 또는 실시예 2에 기술된 일련의 p53 절편 펩타이드들을 첨가하며 적정과정 동안 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 15N-1H HSQC 스펙트럼을 수집하였다. 적정과정 동안 ¹⁵N-mdm2(3-109) : p53 TAD의 몰농도비는 p53 TAD(1-73)의 경우 1:0, 1:0.2, 1:0.4, 1:0.6, 1:1, 1:1.7 이였고 p53 TAD 절편 펩타이드들의 경우 1:0, 1:0.5, 1:1, 1:3, 1:6 이였다.

실시예 5 - BIAcore 실험

BIAcore 실험은 BIAcore 2000 기기를 통해 수행하였다. CM5 센서칩 (Pharmacia Biosensor, Sweden)을 기기에 장착하고 HBS(10mM Hepes-NaOH, pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.005% Tween20) 완충액으로 세척을 한 후 EDC/NHS 혼합액을 100μl 주입하여 카르복시메틸 덱스트란 표면을 활성화시켰다. 25mM 아세트산나트륨(pH 4.5), 150mM NaCl의 완충액에 1mg/ml 농도로 녹인 mdm2(3-109) 150μl을 주입시켜 mdm2(3-109) 단백질을 아민 커플링법에 의해 CM5 센서칩에 고정화시켰다. mdm2(3-109) 단백질과 반응하지 않고 남아있는 활성화된 카르복시 그룹을 비활성화시키기 위해 1M 에탄올아민을 흘려주고 센서칩에 결합되지 않은 단백질을 세척하기위해 10mM glycine (pH 2.0)을 주입하였다. 이후 HBS 완충액에 녹아있는 p53(49-54) 펩타이드를 농도별 (50μM, 25μM, 12.5μM, 6.25μM, 3.125μM, 1.5625μM)로 60μl씩을 주입하고 시간에 따른 결합과 해리과정 중의 센소그램(sensogram) 데이터를 수집하였다. 매번 펩타이드 주입후 마다 1M 염화나트륨 10μl을 주입하여 결합된 펩타이드를 해리시켰다. 유속은 센서칩 활성화와 비활성화, 고정화시엔 10μl/min이고 결합과 염화나트륨 세척시엔 20μl/min이였다. 평형상태에서의 센서그램 데이터를 농도에 따라 플로팅(plotting) 및 피팅(fitting)을 하여 평형 해리상수(Kd) 계산을 하였다[van Holde, K. E. et al. (1998) Principles of Physical Biochemistry].

실시예 6 - p53 TAD 돌연변이의 전사활성 분석

p53 helix 와 turn 부위에 존재하는 소수성잔기들을 알라닌으로 치환한 p53 TAD 돌연변이들을 클로닝하였다. turn 부위의의 돌연변이 서열은 서열번호 13인 L43A 변이체, 서열번호 14의 L45A 변이체, 서열번호 15의 L43A/L45A 변이체, 서열번호 16의 I50A 변이체, 서열번호 17의 W53A 변이체, 서열번호 18의 F54A 변이체, 서열번호 19의 I50A/W53A/F54A 변이체, 서열번호 20의 L43A/L45A/I50A/W53A/F54A 변이체이고, helix 부위의 돌연변이 서열은 서열번호 21의 F19A/L22A/W23A/L26A 변이체이다.

NIH-3T3 세포를 FuGene 6 transfection reagent(Roche)을 이용하여 500 ng 의 pG5luc 리포터 플라스미드와 500 ng 의 p53 TAD 플라스미드와 25 ng 의 pCMV-LacZ 플라스미드를 트렌스펙션하였다. 이후 48 시간 동안 배양한 세포를 수집한 후 Luciferase Assay System(Promega)와 βgalactosidase Assay System(Promega)을 이용하여 루시퍼라제와 β-갈락토시다제 활성을 각 돌연변이에 대해 측정하였다.

실시예 7 - p53 turn 부위 절편 펩타이드에의한 암세포 사멸실험

습도조절된(humidified) 5% CO₂ 대기(Gibco-BRL, UK)에서 MCF-7, HCT 116, A549, SNU-71 암세포를 10% FBS 와 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 37℃로 배양하였다. HIV-1 Tat(48-60)-p53 TAD(50-54)와 서열번호 7의 알라닌 치환체, 서열번호 11의 트립토판 치환체를 배양된 암세포에 18 시간 동안 처리한 후 세포사멸 측정을 위해 테트라졸리움 염 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(MTT) 어세이를 수행하였다. MTT 어세이에서는 10% FBS 와 0.5 mg/ml MTT 를 포함한 RPMI-1640 를 2시간 동안 처리한 후에 배지를 제거하고 100μl DMSO 를 첨가하였다.

실시예 8 - 분자 모델링에 의한 p53 turn 부위 절편 펩타이드와 mdm2 단백질 결합체의 구조계산

mdm2 구조는 기존에 규명된 결정구조(RCSB entry number 1YCR) 를 활용하였고 트랜스퍼 NOE 실험결과에 근거하여 서열번호 6의 p53 TAD (49-54) 펩타이드 절편은 α-helix 구조를 이룬 상태에서 수동 도킹(manual docking)을 수행하여 초기 결합체 구조를 얻었다. InsightII 패키지 내의 DISCOVER 프로그램을 활용하여 분자 동력학 시뮬레이션을 수행하였고 이로부터 p53 TAD(49-54)와 mdm2 단백질 결합체의 최종 구조를 계산하였다.

상기 실시예에 의한 결과는 다음과 같다.

1) p53 TAD의 화학적 이동 변동실험

본 발명에서는 도 1에서 나타낸 바와 같이 ¹⁵N 동위원소 표지하여 정제된 15N-p53 TAD(1-73) 단독 상태의 2차원 ¹⁵N-1H HSQC 스펙트럼을 수집한 후 mdm2(3-109)를 첨가하여 적정(titration) 시키며 결합 상태 p53 TAD(1-73)의 15N-1H HSQC 스펙트럼을 수집하였다(도 2). 이 적정과정에서 73개 잔기 중 40개 잔기에 해당하는 NMR 신호(NMR peak)가 mdm2(3-109)와 결합하면서 사라졌다. 이는 적정과정 중 단독 상태 신호와 결합 상태 신호간의 화학적 교환(chemical exchange)에 의해 NMR peak의 선폭(linewidth)을 증가시켰기 때문이다. 이중 특히 p53 helix(Thr18-Leu26) 형성부위 중 Lys24, Leu25, Leu26 잔기에 해당하는 peak가 가장 먼저 15N-p53 TAD(1-73) : mdm2(3-109)의 몰농도비가 1:0.3인 지점에서 사라졌다. 다음 몰농비가 1:0.6인 지점에서는 helix 형성부위(도 1에서 적색 표시)중 나머지 잔기들과 turn 형성부위(Met40- Met44와 Asp48-Trp53)에 해당하는 NMR peak가 사라졌다(도 1에서 녹색 표시). 몰농도비가 1:1 인 지점에서는 helix 부위와 turn 부위에 해당하는 모든 잔기들의 NMR peak가 사라지고 몰농도비가 1:1 이상에서는 더 이상의 큰 변화는 관찰하지 못하였다. 도 3에 요약된 이상의 결과는 p53 TAD의 helix 뿐 아니라 turn 부위도 mdm2 결합에 관여한다는 것을 제시한다.

2) mdm2(3-109)의 화학적 이동 변동실험

상기 8-1)과 반대로 mdm2의 결합자리를 규명하기 위하여 15N 동위원소 표지된 15N-mdm2(3-109)를 정제한 후 p53 TAD(1-73)을 첨가하는 적정 과정 중에 2차원 15N-1H HSQC 스펙트럼들을 수집하였다. 먼저 단독 상태의 15N-mdm2(3-109)의 HSQC 스펙트럼을 수집하였다(도 4). 이후 p53 TAD(1-73)을 첨가하며 수집한 결합상태 15N-mdm2(3-109)의 15N-1H HSQC 스펙트럼에서는(도 5) p53 TAD(1-73)와 mdm2(3-109)가 친화도가 높은 결합을 하고 있기 때문에 느린 화학적 교환으로 인해 단독 상태와 결합 상태의 NMR 신호가 서로 다른 피크로 따로 관찰되었다. 한편 몰농비가 1:1이상인 지점에서는 결합 상태에 해당하는 피크만을 관찰하였다. 3차원 핵자기공명실험인 HNCA, HNCOCA, 15N-edited TOCSY, 15N-edited NOESY 스펙트럼 분석을 통해 단독 상태와 결합 상태 mdm2(3-109)의 화학적 이동 지정을 수행하였다. 화학적 이동으로부터 계산된 변동 폭은(도 6) 기존에 발표된 p53 α-helix의 화학적 이동 변동의 결과와 거의 유사하다[Stoll, R. et al. (2001) Biochemistry 40, 336-344]. 결론적으로 p53 α-helix와 p53 TAD(1-73)의 mdm2 결합자리가 같은 것을 증명하였다(도 7).

3) p53 turn 형성부위 절편 펩타이드의 화학적 이동 변동실험

¹⁵N 동위원소 표지하여 정제된 15N-mdm2(3-109) 단독 상태의 2차원 15N-1H HSQC 스펙트럼을 수집한 후 p53 TAD(39-57)를 첨가하여 적정시키며 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 15N-1H HSQC 스펙트럼들을 수집하였다. p53 TAD(39-57)와 15N-mdm2(3-109)가 친화도가 낮은 결합을 하고 있기 때문에 빠른 화학적 교환으로 인해 단독 상태와 결합 상태의 NMR 신호가 서로 평균되어 한 개의 NMR 피크로 관찰되었다. 적정과정 중 얻어진 다수의 15N-1H HSQC 스펙트럼을 중첩한 도 8에서 보이듯이 평균 피크는 적정과정 중 계속 움직이는 것을 관찰하였다. 이러한 화학적 이동의 변화로부터 얻은 화학적 이동 변동 폭의 그래프를 그리면 도 9와 같으며 변동이 관찰된 잔기를 변동 폭에 따라 색으로 구분해 표시하여 X선 결정구조상에서 mdm2의 결합자리를 규명하였다(도 10).

이 결과를 도 7과 비교하면 결합자리가 p53 TAD(1-73) 및 p53 helix 결합자리와 거의 같다는 것을 보여준다. 이후 서열번호 6의 p53 TAD(49-54)(도 11, 도 12), 서열번호 7의 p53 TAD(49-54)의 Ala 치환체(도 13), 서열번호 8의 TAD(39-48) (도 14), 서열번호 9의 TAD(49-57) (도 15), 서열번호 10의 p53 TAD(49-57)의 Ala 치환체(도 16), 서열번호 11의 p53 TAD(49-54)의 Trp 치환체(도 17), 서열번호 12의 p53 TAD(49-54)의 Val 치환체(도 18)를 포함하는 p53 절편 펩타이드들에 대하여 상기와 동일한 화학적 이동 변동실험을 수행하였다.

그 결과 p53 TAD(49-54)와 p53 TAD(49-57)는 p53 TAD(39-57)과 유사한 화화학적 이동 변동패턴을 보여주었으나(도 11, 도15) p53 TAD(39-48)의 경우는 화학적 이동의 변동 폭이 미미하였다(도 14). 따라서 C-말단에 위치한 p53 TAD(49-54)의 서열이 N-말단의 p53 TAD(39-48) 보다 mdm2 결합에 중요하다는 것을 증명한다. 한편 mdm2 결합에 중요하리라 예측되는 세 개의 소수성 잔기들(ILE50, Trp53, Phe54)을 모두 Ala으로 치환시킨 p53 TAD(49-54) 및 p53 TAD(49-57)의 Ala 치환체들은 화학적 이동 변동 폭이 현저히 감소되어 mdm2와 결합하지 않는다는 것을 보여주었다(도 13, 도 16). 한편 세 개의 소수성 잔기들 (ILE50, Trp53, Phe54)을 모두 Trp로 치환시킨 p53 TAD(49-54)의 Trp 치환체의 경우 p53 TAD(49-54)보다 화학적 이동의 변동 폭이 크게 증가하는 것을 관찰하였으며(도 17) 이는 mdm2와의 결합력이 증가를 의미한다. 반면 상기 잔기들을 모두 Val으로 치환시킨 p53 TAD(49-54)의 Val 치환체의 경우 미미한 화학적 이동의 변동 폭으로 볼때 결합력이 크게 감소됨을 보여주었다(도 18).

4) BIAcore 실험

도 19에 나타난 BIAcore 실험의 센소그램은 서열번호 6의 p53(49-54) 절편 펩타이드가 mdm2(3-109) 단백질에 특이적으로 결합을 하는 것을 보여주고 이 센소그램 데이터로부터 측정된 평형 해리상수(dissociation constant, kd)는 25μM이다.

5) p53 turn 부위 절편 펩타이드의 구조분석

80% 메탄올에서 측정된 TOCSY, NOESY 및 ROESY의 2차원 NMR 스펙트럼들을 분석하여 p53 TAD (39-57) 절편 펩타이드의 NMR peak의 신호 지정(resonance assignment)을 수행하였고 관찰된 NOE 신호들의 분석으로부터 수소원자간 거리 정보를 도출하였다. 도 20에 요약된 수소원자간 거리 정보, ³J_HNHcoupling constant 및 화학적 이동 색인(CSI, chemical shift index)은 p53 TAD(39-57) 절편 펩타이드의 49-51번 잔기가 α-helix 또는 turn의 2차 구조를 형성하고 있음을 증명한다.

H2O 상에서 mdm2(3-109)에 결합된 p53 TAD(39-57)의 구조를 규명하기위해서 TRNOE 실험을 수행하였다. 도 21에서 획득한 TRNOE 스펙트럼은 0.1mM mdm2(3-109)와 2mM의 p53 TAD(39-57) 농도비에서 10℃의 온도와 100ms 의 mixing time에서 측정하였고 용매조건은 25mM TrisHCl(pH 7.5), 150mM NaCl 이였다. 도 22에서 관찰된 NOE 패턴은 mdm2(3-109)에 결합된 상태에서 p53 TAD(39-57)의 48-54번 잔기가 helix 구조를 형성함을 증명한다.

6) p53 TAD 돌연변이의 전사활성 분석

도 23 에 요약된 p53 helix와 turn 부위에 존재하는 소수성 잔기들을 알라닌으로 치환한 p53 TAD 돌연변이들을 클로닝한 후 전사활성 측정을 수행하였다. β-갈락토시다제의 전사활성을 대조군으로 하였고 야생형 p53 TAD 에 대한 상대적인 루시페라제 활성을 백분율로 측정하였다. 도 23의 결과에서 보듯 p53 helix 부위뿐 아니라 turn 부위에 도입된 돌연변이들은 p53 TAD 의 전사활성을 소멸시켰다. 따라서 이는 turn 부위에 존재하는 소수성잔기들이 p53 TAD 기능에 중요한 역할을 하고 있음을 증명한다.

7) p53 turn 부위 절편 펩타이드에 의한 암세포 사멸실험

서열번호 22의 HIV-1 Tat 단백질의 48 내지 60개의 아미노산으로 구성된 세포 투과성 펩타이드 HIV-1 Tat(48-60)를 p53 TAD(50-54)의 N 말단에 연결시킨 HIV-1 Tat(48-60)-p53 TAD(50-54), 이의 알라닌 치환체, 트립토판 치환체를 성장하고 있는 4 종류의 암세포에 18 시간동안 처리한 후 MTT 어세이를 통해 세포사멸을 측정하고(도 24) 현미경으로 암세포를 관찰하였다(도 25). 대조군인 알라닌 치환체는 세포사멸 정도가 미미한 반면 p53 TAD (50-54) 와 트립토판 치환체는 약 50μM 정도의 IC₅₀ 값을 보이는 세포사멸이 측정되었다.

8) 분자 모델링에 의한 p53 turn 부위 절편 펩타이드와 mdm2 단백질 결합체의 구조계산

DISCOVER 프로그램을 활용하여 분자 동력학 시뮬레이션을 통해 p53 TAD (49-54)와 mdm2 단백질 결합체의 구조를 획득하였다(도 26). mdm2 구조는 기존에 규명된 결정구조(RCSB entry number 1YCR)를 활용하였고 트랜스퍼 NOE 실험결과에 근거하여 p53 TAD(49-54) 펩타이드 절편은 α-helix 구조를 이룬 상태에서 도킹을 수행하였다. 도 24에서 관찰되듯이 p53 TAD(49-54)의 소수성 잔기들인 50번 아이소루이신, 53번 트립토판, 54번 페닐알라닌이 mdm2 단백질 결합자리의 소수성 표면에 상보적인 결합을 하고 있다.

본 발명의 mdm2 단백질에 결합하는 펩타이드는, p53과 mdm2간 결합을 효과적으로 저해하고, 이를 암세포 또는 바이러스 감염 세포에 투여할 경우 세포사멸을 유도하므로 암 또는 바이러스 감염 치료제로 효과적으로 사용할 수 있으며, 상기 펩타이드 서열을 모티브(motif)를 기초로 하여 암 또는 바이러스 감염 치료제 약물설계 및 개발에 이용할 수 있다.

도 1은 15N-p53 TAD(1-73) 단독 상태의 15N-1H HSQC 스펙트럼이다. 이 스펙트럼은 0.4mM의 15N-p53 TAD(1-73) 농도와 5℃의 온도에서 측정되었다. α-helix 형성부위의 잔기들(Thr18-Leu26)과 turn 형성부위의 잔기들(Met40-Met44와 Asp48-Trp53)에 해당하는 NMR 신호들을 각각 적색과 녹색으로 표시하고 그 이외에 mdm2(3-109)와의 적정과정 중 사라진 신호들과 변화가 없는 신호들은 각각 청색과 검은색으로 나타낸다.

도 2는 15N-p53 TAD(1-73)를 mdm2(3-109)로 적정하며 수집한 결합 상태 15N-p53 TAD(1-73)의 15N-1H HSQC 스펙트럼들이다. 이들은 적정과정 중 15N-p53 TAD(1-73): mdm2(3-109)의 몰농도비가 1:0.3, 1:0.6, 1:1, 1:2인 지점에서 수집하였다.

도 3은 상기 도 2에서 언급된 15N-p53 TAD(1-73)의 mdm2(3-109) 적정과정 중 사라진 NMR 신호들을 도식화한 것이다. 사라진 NMR 신호들과 신호크기가 약화된 신호들을 각각 검은색과 흰색 원으로 표시한다.

도 4는 15N-mdm2(3-109) 단독 상태의 15N-1H HSQC 스펙트럼이다. 이 스펙트럼은 0.2mM의 15N-mdm2(3-109) 농도와 25℃의 온도에서 측정되었다. 화학적 이동 (chemical shift)이 지정 (assignment) 되어진 peak들은 해당 잔기를 표시하였다.

도 5는 15N-mdm2(3-109) 단독 상태와 p53 TAD(1-73) 결합 상태의 15N-1H HSQC 스펙트럼을 중첩한 도면이다. 이 두개의 스펙트럼은 모두 0.2mM의 15N-mdm2(3-109) 농도와 25℃의 온도에서 측정되었다. 단독 상태 mdm2(3-109)의 스펙트럼은 검은색으로 나타내고 15N-mdm2(3-109): p53 TAD(1-73)의 몰농도비가 1:1인 지점에서 측정된 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 스펙트럼은 적색으로 나타낸다. 스펙트럼의 x축과 y축은 각각 1H와 15N의 화학적 이동(단위: ppm)을 나타낸다.

도 6은 단독 상태와 p53 TAD(1-73) 결합 상태에서의 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동의 차이로부터 계산된 변동 폭을 그래프로 나타내었고 공지된 공식[Stoll, R. et al. (2001) Biochemistry 40, 336-344]에 따라 이 화학적 이동의 차이로부터 변동 폭을 계산하였다. 그래프의 x축은 mdm2 단백질의 아미노산 잔기를 표시하고 y축은 화학적 이동의 변동 폭이다.

도 7은 상기 도 6에서 계산된 변동이 나타난 잔기를 X선 결정구조에 색으로 구분하여 표시한 입체도(stereoview)이다. mdm2의 X선 결정구조는 공지된 PDB (Protein Data Bank) 좌표 (PDB code : 1YCR)를 이용하였다[Kussie, R. H. et al. (1996) Science 274, 948-953]. 본 도의 구조에서 전체 분자의 N 말단이 좌측 상단에 위치하고 있다. X선 결정구조상에 보이는 p53 TAD 절편은 p53 helix 부위 (15-29번 잔기)이고 helix의 N 말단은 우측에 위치하고 있다. 화학적 이동의 변동 폭이 0.3이상이면 적색으로 0.2-0.3이면 분홍색으로 0.1-0.2이면 노란색으로 0.1이하이면 청색으로 리본을 표시한다.

도 8은 15N-mdm2(3-109)를 p53 TAD(39-57)로 적정하며 수집한 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 15N-1H HSQC 스펙트럼이다. 이 스펙트럼은 0.2mM 의 15N-mdm2(3-109) 농도와 25℃의 온도에서 측정되었다. p53 TAD(39-57)로 적정하며 수집한 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 15N-1H HSQC 스펙트럼 3개를 단독 상태의 스펙트럼과 중첩한 것이다. 단독 상태 15N-mdm2(3-109)의 스펙트럼은 검은색으로 나타내고 15N-mdm2(3-109) : p53 TAD(39-57)의 몰농도비가 1:1, 1:2, 1:3인 지점에서 수집된 결합 상태 mdm2(3-109)의 스펙트럼은 각각 청색, 분홍색, 적색으로 나타낸다.

도 9는 단독 상태와 p53 TAD(39-57) 결합 상태에서의 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동의 차이로부터 계산된 변동 폭을 잔기별로 나타낸 그래프이다. 화학적 이동 차이로부터 변동 폭을 계산하는 방법은 상기 도 6과 동일하다. 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동은 15N-mdm2(3-109) : p53 TAD(39-57)의 몰농도비가 1:3인 지점에서 측정한 값이다. 그래프의 x축은 mdm2 단백질의 아미노산 잔기를 표시하고 y축은 화학적 이동의 변동 폭이다.

도 10은 상기 도 9에서 계산된 변동이 나타난 잔기를 변동 폭에 따라 색으로 구분하여 X선 결정구조에 표시한 입체도이다. 색 표시 방법은 상기 도 7과 동일하다.

도 11은 p53 TAD(49-54)을 첨가한 후 측정한 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동으로부터 계산된 변동 폭을 잔기별로 나타낸 그래프이다. 0.2mM의 15N-mdm2(3-109) 농도와 25℃의 온도에서 15N-1H HSQC 스펙트럼을 수집하였고 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동은 15N-mdm2(3-109) : p53 TAD(49-54)의 몰농도비가 1:6인 지점에서 측정하였다. 그래프의 x축은 15N-mdm2 단백질의 아미노산 잔기를 표시하고 y축은 화학적 이동의 변동 폭이다.

도 12는 상기 도 11에서 계산된 변동이 나타난 잔기들을 변동 폭에 따라 색으로 구분하여 X선 결정구조에 표시한 입체도이다. 색 표시 방법은 상기 도 7과 동일하다.

도 13은 p53 TAD(49-54)의 Ala 치환체를 첨가한 후 측정한 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동으로부터 계산된 변동 폭을 잔기별로 나타낸 그래프이다. 0.2mM의 15N-mdm2(3-109) 농도와 25℃의 온도에서 15N-1H HSQC 스펙트럼을 수집하였고 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동은 15N-mdm2(3-109) : p53 TAD(49-54)의 Ala 치환체의 몰농도비가 1:3인 지점에서 측정하였다. 그래프의 x축은 15N-mdm2 단백질의 아미노산 잔기를 표시하고 y축은 화학적 이동의 변동 폭이다.

도 14는 p53 TAD(39-48)를 첨가한 후 측정한 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동으로부터 계산된 변동 폭을 잔기별로 나타낸 그래프이다. 0.2mM의 15N-mdm2(3-109) 농도와 25℃의 온도에서 15N-1H HSQC 스펙트럼을 수집하였고 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동은 15N-mdm2(3-109) : p53 TAD(39-48)의 몰농도비가 1:3인 지점에서 측정하였다. 그래프의 x축은 15N-mdm2 단백질의 아미노산 잔기를 표시하고 y축은 화학적 이동의 변동 폭이다.

도 15는 p53 TAD(49-57)를 첨가한 후 측정한 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동으로부터 계산된 변동 폭을 잔기별로 나타낸 그래프이다. 0.2mM의 15N-mdm2(3-109) 농도와 25℃의 온도에서 15N-1H HSQC 스펙트럼을 수집하였고 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동은 15N-mdm2(3-109) : p53 TAD(49-57)의 몰농도비가 1:6인 지점에서 측정하였다. 그래프의 x축은 15N-mdm2 단백질의 아미노산 잔기를 표시하고 y축은 화학적 이동의 변동 폭이다.

도 16은 p53 TAD(49-57)의 Ala 치환체를 첨가한 후 측정한 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동으로부터 계산된 변동 폭을 잔기별로 나타낸 그래프이다. 0.2mM의 15N-mdm2(3-109) 농도와 25℃의 온도에서 15N-1H HSQC 스펙트럼을 수집하였고 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동은 15N-mdm2(3-109) : p53 TAD(49-57)의 Ala 치환체의 몰농도비가 1:3인 지점에서 측정하였다. 그래프의 x축은 15N-mdm2 단백질의 아미노산 잔기를 표시하고 y축은 화학적 이동의 변동 폭이다.

도 17은 p53 TAD(49-54)의 Trp 치환체를 첨가한 후 측정한 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동으로부터 계산된 변동 폭을 잔기별로 나타낸 그래프이다. 0.2mM의 15N-mdm2(3-109) 농도와 25℃의 온도에서 15N-1H HSQC 스펙트럼을 수집하였고 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동은 15N-mdm2(3-109) : p53 TAD(49-54)의 Trp 치환체의 몰농도비가 1:5.4인 지점에서 측정하였다. 그래프의 x축은 15N-mdm2 단백질의 아미노산 잔기를 표시하고 y축은 화학적 이동의 변동 폭이다.

도 18은 p53 TAD(49-54)의 Val 치환체를 첨가한 후 측정한 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동으로부터 계산된 변동 폭을 잔기별로 나타낸 그래프이다. 0.2mM의 15N-mdm2(3-109) 농도와 25℃의 온도에서 15N-1H HSQC 스펙트럼을 수집하였고 결합 상태 15N-mdm2(3-109)의 화학적 이동은 15N-mdm2(3-109) : p53 TAD(49-54)의 Val 치환체의 몰농도비가 1:5.4인 지점에서 측정하였다. 그래프의 x축은 15N-mdm2 단백질의 아미노산 잔기를 표시하고 y축은 화학적 이동의 변동 폭이다.

도 19는 mdm2(3-109) 단백질과 p53(49-54) 펩타이드 간의 결합과 해리 과정을 시간별로 측정한 BIAcore 실험의 센소그램(sensogram)이다.

도 20은 p53 TAD(39-57)의 NOESY 스펙트럼에서 관찰된 NOE 패턴, ³J_HNH커플링 상수(coupling constant) 및 화학적 이동 지수(CSI, Chemical Shift Index)를 요약한 도면이다. 이 정보들은 10℃ 온도, 2mM 농도, 80% 메탄올(pH 6.1)의 조건에서 측정된 2차원 NMR 실험들로부터 도출되었다.

도 21은 mdm2(3-109)에 결합된 p53 TAD(39-57)의 TRNOE 스펙트럼이다. 이 스펙트럼은 0.1mM mdm2(3-109)와 2mM의 p53 TAD(39-57) 농도비에서 10℃의 온도와 100ms 의 mixing time에서 측정되었다. 용매조건은 25mM TrisHCl (pH 7.5), 150mM NaCl 이다. 왼쪽 스펙트럼은 NOESY 의 NH/NH 부위이고 오른쪽 스펙트럼은 NH/HA 부위이다. helix 구조임을 증명하는 NOE 들은 해당잔기를 표시하였다.

도 22는 mdm2(3-109)에 결합된 p53 TAD(39-57)의 TRNOE 스펙트럼에서 관찰된 NOE 패턴을 요약한 도면이다. * 는 중첩된 NMR 신호를 의미한다.

도 23은 p53 TAD 돌연변이들의 전사활성 측정결과이다. β-갈락토시다제의 전사활성을 대조군으로 하였고 야생형 p53 TAD 에 대한 상대적인 루시퍼라제 활성을 백분율로 표시하였다. 막대는 세 번의 독립적인 실험의 평균치를 나타내며 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.

도 24는 p53 TAD(50-54)와 Trp 치환체의 암세포 사멸 실험결과이다. p53 TAD(50-54)의 MTT 어세이 실험결과는 회색막대로 나타내었고 Ala 치환체와 Trp 치환체는 각각 흰색과 검은색 막대로 나타내었다.

도 25는 p53 TAD(50-54)와 Trp 치환체를 처리한 MCF-7 암세포의 현미경 사진이다. p53 TAD(50-54)의 사진을 중앙에 표시하였고 Ala 치환체와 Trp 치환체는 각각 상단과 하단에 표시하였다. 스케일 막대의 길이는 100 ㎛ 이다.

도 26은 분자모델링을 통해 계산된 p53 TAD(49-54)와 mdm2 단백질 결합체의 구조이다. 상단에서 mdm2 는 GRASP 프로그램을 통해 얻어진 EP(electronic potential) 로 표시하였고 p53 TAD(49-54)은 분홍색 모델로 표현하였다. 중앙에는 mdm2를 리본으로 표시하였고 p53 TAD(49-54)를 녹색의 막대 모델로 표시하였다. mdm2의 결합자리에 소수성결합하는 p53 잔기를 표시하였다. 하단에서는 mdm2와 p53 TAD(49-54)와 분자간 상호인접표면을 표시하였다. mdm2 는 노란색 CPK 모델로 나타내고 mdm2의 표면은 파란색 그물로 표현하였다. mdm2 결합부위에 상보적으로 결합하는 p53의 잔기도 표시하였다.

<110> Korea Research institute of Bioscience and Biotechnology <120> Peptides for inhibiting mdm2 function <150> KR10-2004-23565 <151> 2004-04-06 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(73) <223> p53 TAD domain <400> 1 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val 65 70 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying the p53 TAD domain <400> 2 ggtcggatcc atggagccgc agtca 25 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying the p53 TAD domain <400> 3 ctccgacgag gggggcacat tcgaagtgg 29 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(107) <223> N-terminal domain 3-109 of mdm2 protein <400> 4 Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr Ser Gln 1 5 10 15 Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro Leu Leu 20 25 30 Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr Thr Met 35 40 45 Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile Met Thr Lys Arg Leu 50 55 60 Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His Ile Val Tyr Cys Ser Asn Asp Leu Leu 65 70 75 80 Gly Asp Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His Arg Lys 85 90 95 Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg Asn Leu Val Val 100 105 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide of p53 <400> 5 Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln Trp Phe 1 5 10 15 Thr Glu Asp <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide of p53 <400> 6 Asp Ile Glu Gln Trp Phe 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide varient of p53 <400> 7 Asp Ala Glu Gln Ala Ala 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide of p53 <400> 8 Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 1 5 10 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide of p53 <400> 9 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide varient of p53 <400> 10 Asp Ala Glu Gln Ala Ala Thr Glu Asp 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide varient of p53 <400> 11 Asp Trp Glu Gln Trp Trp 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide varient of p53 <400> 12 Asp Val Glu Gln Val Val 1 5 <210> 13 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide varient of p53 <400> 13 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Ala Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val 65 70 <210> 14 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide varient of p53 <400> 14 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Ala Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val 65 70 <210> 15 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide varient of p53 <400> 15 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Ala Met Ala Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val 65 70 <210> 16 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide varient of p53 <400> 16 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ala Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val 65 70 <210> 17 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide varient of p53 <400> 17 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Ala Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val 65 70 <210> 18 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide varient of p53 <400> 18 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Ala Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val 65 70 <210> 19 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide varient of p53 <400> 19 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ala Glu Gln Ala Ala Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val 65 70 <210> 20 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide varient of p53 <400> 20 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Ala Met Ala Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ala Glu Gln Ala Ala Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val 65 70 <210> 21 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide varient of p53 <400> 21 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Ala Ser Asp Ala Ala Lys Leu Ala Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val 65 70 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> HIV-1 Tat(48-60) <400> 22 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10

Claims

화학식 1의 아미노산 서열, 이의 N 말단 전방으로 0 내지 10개의 아미노산 서열 및 C 말단 후방으로 0 내지 3개의 아미노산 서열을 포함하는, mdm2(mouse double minute 2) 억제를 위한 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.

화학식 1

X¹-Z¹-X²-X³-Z²-Z³

상기식에서,

X¹, X², 및 X³은 동일하거나 상이하며, 아스파라긴산, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 루이신, 라이신, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, 알파-아미노부티르산, 1-아미노-사이클로프로판카복실산, 노르루이신, 메틸글리신, 4-포스포노메틸 페닐알라닌, 5-메틸트립토판, 6-메틸트립토판, 6-클로로트립토판 및 6-플루오로트립토판으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 아미노산이고,

Z¹, Z², 및 Z³은 동일하거나 상이하며, 페닐알라닌, 루이신, 이소루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 티로신, 히스티딘, 메티오닌, 트립토판, 노르루이신, 5-메틸트립토판, 6-메틸트립토판, 6-클로로트립토판 및 6-플루오로트립토판으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 아미노산을 나타낸다.
제 1항에 있어서, Z¹, Z², 및 Z³가 페닐알라닌, 루이신, 이소루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 티로신, 히스티딘, 메티오닌, 트립토판 및 노르루이신으로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
제 2항에 있어서, Z¹, Z², 및 Z³가 트립토판, 페닐알라닌, 루이신, 이소루이신 또는 노르루이신인 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
제 3항에 있어서, Z²가 트립토판인 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
제 1항에 있어서, N 말단 전방으로 AMDDLMLSPD를 포함하는 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서, C 말단 후방으로 TED를 포함하는 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서, DFEQWF, DWEQWF, DIEQWF, DLEQWF, DFEQWW, DWEQWW, DIEQWW, DLEQWW, DFEQWL, DWEQWL, DIEQWL, DLEQWL, DFEQWI, DWEQWI, DIEQWI 또는 DLEQWI인 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
제7항에 있어서, DWEQWW 또는 DIEQWF인 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
제1항의 펩타이드를 포함하는 mdm2-매개된 분해를 억제하는 조성물.
제9항에 있어서, 항암 또는 항바이러스용 조성물.
제10항에 있어서, 백혈병(leukemia), 임파종(lymphomas), 식도암종 (esophageal carcinomas), 신경아세포종 (neuroblastoma), 또는 연부조직암(soft tissue tumors)에 대한 항암 조성물.