PT1157040E - Derivados peptídicos de baixo peso moleculatr como inibidores da interacção laminina/nidogénio - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "DERIVADOS PEPTÍDICOS DE BAIXO PESO MOLECULAR COMO INIBIDORES DA INTERACÇÃO LAMININA/NIDOGÉNIO"

Os objectos da presente invenção são derivados peptidicos de baixo peso molecular que são capazes de actuar como inibidores da interacção entre a laminina e o nidogénio (interacção laminina/nidogénio), um processo para a sua preparação, composições farmacêuticas preparadas a partir deles e sua utilização para preparar fármacos e para identificar inibidores da interacção laminina/nidogénio. A associação de laminina (uma glicoproteína com 800 kDa) e nidogénio (uma glicoproteína com 160 kDa) é considerada como um mecanismo biomolecular crucial na síntese e estabilização de membranas basais (Mayer , u. rp ·* mp. 1, R. (1 994) em: Ext iracellui ar Matri: Assembly a nd Structu re (F ΤΊ Vi 1 urchenco, D . Bi rk e R. P. Mechar η, I 5d.) S. 38 i- 416, Ac a dei Tlic Pre ss, Orl ande v FL) . TV A. capae: i.dadí 5 do ni .dogéni o p ara fo: irmar con aplexos ternários c om todos P 't' principa is cor: ; S t.. .1. t uinte da m embu :ana bas ai, tais como, por exen iplo, i .soforn Id. 8 de lamini na contem lo γΐ (pa ra noment slati 1.1Γ 3 νθ.:Γ l Burqeson, K E. ; Ch.i Lque t, M»; Deat zmann, R ; Ekb.l.oí n, ? ,; Enael , J.; Kl ei nmanr: 1 f H.; Mart :in, G. R.; Meneguzs J- f G,; P au is: son M.; Sanes, J.; Tímp ;i, R.; (Ti yggvasso η, K d; Yamad a, Y.; ' Yurci: íenco, p. D. (1 9 S 4) atriz : B iology 14; 209-211 \ } f eolags anio IV, p >erieca mo Θ í lb· ulina / θ as estr uturas de assoe: i.açac ) de cad :a uma dela i o -g ' o / ^ ig; nific •a q ue assim ne a tunção de um li .gant Θ cjue liga, orga Θ spac.i .aim ente e est< abiliza as TTi 2 p rnc p -H -v—> 1 i.i»x J.· v.. O L. í. .. ituras i ndepen dent es (I Γο> J. K, ,; Mayer IJ * è j. s c n ·' f 1

(1391) EMB R.; Aumailley, M.; Reinhardt, D.; Wiedemann, Tiropl, R.; Krieg, T.; Engel, J.; e Chu, M.- L. 10,3137-3146} .

As membranas basais são estruturas extracelulares altamente especializadas às quais são atribuídas funções importantes no controlo das funções celulares e tecidulares, arquitectura tecidular, interacções tecidulares, crescimento celular, transformação celular, migração celular e na expressão génica específica de tecido (Adaras, u. C. e Watt, F. M. (1993) Devel.opment ' 1 : 1 fi O... ·; Ί Q p \ V'1 Ixperiências com anticorpos anti lami nin,: 3. p oliclonais proporcior • aram. provas claraí 3 da função centrai da interacçâo iarninina/nidogénio na síntese de uma membrana basal funcional. Os anticorpos descritos foram obtidos por imunização de co< alhos com la minina PI ou com o domínio de liga ição ao nidogénio , produzido de um modo recombinante, da lami .nina (yl 111 3-5). Os anticorpos c concentrados por c ί: οιτ \atografia de af inidade em matrizes de lamínína PI ou lami .nina yl 111 3-5 mostraram i: li Dição compre t s. d. a as s o c .1 a ç a o lami . n i n a / n .1 d o g έ η í o em ί ensaios de inibição. No entanto, esta é baseada no bloqueio esférico do acesso do nidogénio à lamínína pelos anticorpos, cujas regiões de ligação estão localizadas nas proximidades das sequências de ligação ao nidogénio da lamínína (Mayer, U.; Nischt, R.; Põschl, E.; Mann, K.; Fukuda, K.; Geri, M.; Yamada, Y.; Timpl, R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885).

Em culturas de órgãos embrionários, os anticorpos descritos inibiram o desenvolvimento de túbulos renais, a formação de alvéolos pulmonares e a morfogénese da glândula salivar embrionária. Estes três modelos são representativos de programas de ontogénese que dependem da síntese livre de nova membrana ba s a 1 (E kb 1 om, P.; E kb 1 om,

Fecker,

Klein,

Zhana. 2 Η.™ Υ.; Eadoya, Υ.; Chu, M.-L.; Mayer, U.; Timpl, R. (1994) Development 120; 2003-- 2014).

Os anticorpos direccionados contra a região da sequência da cadeia da laminina γΐ que é essencial para a ligação do nidogénio, são também capazes de inibir a associação laminína/nidogénío. A inibição é, no entanto, competitiva, em contraste com os anticorpos antilaminina descritos acima, porque estes competem, directamente com o nidogénio pelo local de ligação na laminina (documento WO 98/31709).

Um anticorpo monoclonal da subclasse IgM (antilaminina PI A6/2/4-DSM. ACC2327; ver documento WO 98/31709) inibe a interacção laminina/nidogénio in vitro com um IC50 de 30 nM. Tal como a preparação de anticorpo antilaminina policlonal descrito acima, previne a morfogénese da glândula salivar embrionária em cultura de órgãos. Isto acentua a especificidade da interacção laminina/nidogénio e a importância do módulo LE-4 e da região de sequência identificada no domínio da laminina γΐ III 4 nesta interacção. 0 domínio de ligação ao nidogénio da laminina foi inequivocamente identificado e caracterizado em termos da sua localização, sequência e estrutura espacial (estrutura por RMN e estrutura cristalina por raios X) (Geri, M.; Mann, K.;

Aumailley, Μ.; Iim pl, R. (1991) Eur. J. Biochem. 202 ; 167-174. Mayer, U.; Nischt, R.; Põschl, E.; Mann, K.; Fukuda, K.; Geri, M.; Yamada , y.; Timpl, R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885. Baumgartner , R.; C zisch, M.; Mayer, U .; Poschi, H .; j Huber, R.; Timpl, R„; Ho.Isk, T. A. (1996) J. Mol. Biol. 257; 658-668. Stetefeld, J.; May 'er, U.; Timpl, R.; Huber, R. (1996 i) J. Mol. Biol. 257; 644-657 ). Está localizado n um "módulo LE" ( semelhante 3 ao factor de crescimento epidérmico do tipo laminina) do braço ::urto da cadeia ia laminina, no domíni o v.

Os "módulo: LE" são motivos estruturais com 50-60 aminoácídos que apresentam um. padrão de aquisição da conformação nativa complexo, análogo ao EGF, com 4 pontes persulfureto (Bairoch, A.; (1995) Nomenciature of extracellular domains. The SWISS-PROT Protein sequence data bank, release 310, Engel, J. (1989) FEBS Letters 251; 1-7), . É de 97% entre dros iophila e Hcí f w.. Caen orhãbditi. s eleç kar.i. nen, T,; Ka.llun 263 ; 6751-61 ’ 5 8 . C 2 64; 1543-155 0. Wll il, E,; Ma ver :f U.; A ligação de elevada afinidade do nidogénio ao domínio da laminina complementar foi detectada para a laminina Pl de tumor EHS de murganho, laminina 2 e laminina 4 de placenta humana e laminina de drosophila. A causa desta especificidade de ligação com sobreposição de espécies é a identidade extremamente grande de sequências presentes no domínio yl III 4 para as espécies investigadas, É de 97% entre humano e murganho, 61% entre murganho murganho domínio

Biol, Chem. 263; 6751-6758. Chi, H.-C.; Hui, C.-F. (1989) et al. (1994) Nature 368 dd, J.; Bauragartner, R., Holak, T. A.; Huber, R.; Tim.pl, R. (1996) EMBO J. 15 5154-5159) .

Além da dependência da ligação do nidogénio numa estrutura tridimensional intacta, foram identificadas regiões da sequência não ambíguas, localizadas nos loops a e c estabilizados por S-S do domínio γΐ III 4. Foram identificados cinco aminoácídos essenciais, quatro localizados dentro de uma secção de 7 aminoácídos no loop a e uma cadeia lateral de tirosina no loop c (Mann, K.; Deutzmann, R.; Timpl, R. (1988) Eur. J. Biochem. 178;

Os péptidos sintéticos que podem ser derivados das 4 regiões apropriadas do domínio γΐ III 4 e são capazes de inibir completamente a ligação laminina/nidogénio em ensaios de ligação específicos foram revelados por J. w. Fox e R. Timpl (documento US 5493008) .

Pensa-se que a ligação de alta afinidade ao local de ligação do nidogénio na laminina necessita uma interacção com uma tirosina ou histidina de um loop (loop c) adjacente à actual sequência de ligação. Esta interacção aromática foi postulada como uma pré-condição para a inibição na gama IC50 < 500 nM com base na estrutura 3D da laminina γΐ III 3-5 e como um resultado das relações estrutura/função descritas na Patente US número 54 93008. No entanto., a questão se o loop c in tera ge directamente com o nidogén io ou se c ontrí bui para es tabí .1.1 7. :ar a estrutura espacial adequ ada da regia( a da sequência NI DPNA V, permanece por clarificar ( r/O S1 ahl, E.; Fox, J. W.; BI ock, Γ) .; Mayer, U.; Timpl, R, (199 4) EMBO J. J :.3; 3 7 4 ]... 37^7 Ba umga rtr ier, R.; Czisch, M.; Mayer, U 1.; PõSChl, E :.; Hi uber, R.; T.i. mpl, p .; Holak, T. A. (1396) J. Mo.1 . Biol. s-, ÍC „ -y / / b b 8 ··* b 6 8 „ St etef ele i, J.; Mayer, U.; Timpl, R.; Hui -'..-λ ν' p { ... ^ f \ e \ 1996) J. Moí.

Biol. 257; 644-657) . A interacção laminina/nidogénio é influenciada por um forte componente conformacional (Mayer, U.; Nischt, R.; Põschl, E.; Mann, K.; Fukuda, K.; Geri, M.; Yamada, Y.; Timpl, R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885. Mann, K.; Deutzmann, R.; Timpl, R. (1988)

Eu r „ J. Biochem. 178; 71-8 0) . Os péptidos sintétic. os que po dem ser oer.i vados do local de ligação do nidog énio na laminina não são r> pi " izes de f ormar um padrão de ligaÇi ão persu Ifureto como está prc 5 sente em. módulos LE, ma iS mostrar n uma a ctividsde em ensa ios de inibiç :ã.o que é cerca de 400-101 300 veze s mais fr a ca que 3 0.3 laminina PI ou lair li nina γ 1. ITT 3-5 .Intacta (Põschl, E.; 5

Fox, J, W.; .Block, D.; Maye z, LT.; Timpl, R, i 1 QO, 4) EMBO J. 13; 3741- 3747. J. W. Fox e R. Timpl; documento CJS 5493008) . Esta dimin uição na a atividade nâ< a é normal, uma v· 8Z CT u e e c onhec .i d o que esses péptidos podem assumir um nu mero infinito oe conto rmações diferentes em solução aquosa e q- -:θ apenas uma determinada percentagem de péptidos se encontra na conformação

ologicamente activa. 0 péptido ma is activo desc rito ate ao •mento (1C50 de 22 nM) apresenta i jm p. eso molecular de cerca de 00 Da (« cer ca de 50% de um módul .o Li ί) . Compreende um z OOP O "O intacto que, presumivelmente, estabiliza a estrutura da região sequênc ia NIDPNAV essencial (Põschl, E,; Fox, J. W Maver, N.; Timpl, R, (1994) EMBO J. 13; 3741-3 747 . , Tirapi ; documento US 5493008), A fórmula química da sequência NIDPNAV (Asn-Ile-Asp-Pro-

Asn-Ala-Val) é como se segue:

Os inibidores da interseção laminina/nidogénio devem ser adequados para preparar fármacos para doenças que estão relacionadas com uma síntese aumentada ou indesejada de membranas basais.

Tais doenças são e. g., todos os tipos de complicações secundárias da diabetes que são acompanhadas por espessamento de membranas basais (especialmente no rim, olho, sistema vascular), 6 fibrose hepática, especialmente, fibrose hepática alcoólica, caracterizadas por sintese de uma membrana basal contínua nos sinusoides e uma capilarização causada por isso, todas as fibroses (crónica ou iatrogénica) nas quais pode ser observada membrana :se aumentada de membrana bd.Sd.1 OTj. componentes da bct d ci J. \ .í... ins, pulmões, pele), aterosclerose :ada por uma .1 irai t ação da regulação do metabolismo que pode sei : provocada, i nter alia, por filtração ;te de lípopr oteínas através dos sinus éides hepáticos parcialmente capilarizados (as alterações patológicas no sistem; vascular que podem, ser observadas com a aterosc podem ser ata riba idas, en: i parte, a modí ficações da estrutura das membranas basais nos vasos sanguíneos), doenças nas quais a angiogénese contribui para uma deterioração no quadro clinico, por exemplo, cancros nos quais a neovascularização é necessária para o crescimento tumoral, retinopatia diabética, fibroplasia retrolental, distúrbios com um forte componente inflamatório (por exemplo, artrite reumatóide, osteoartrite, vasculíte), hemangiornas, psoríase e muitas outras. A utilização de péptidos, como os descritos na patente US número 5493008 como fármacos está, no entanto, limitada a uma extensão considerável devido a sua flexibilidade conformacional, sua instabilidade a proteases e sua fraca biodisponibilidade e fármacodinâmicas (Milner-White, E.J. (1989) Trends Pharmacol.

Sei. 10; 70-74. Verber , D. F. ; Freidinger, R.M.; (1985) T ·ν~ρ.70 pj o Neuro sei . 8; 39) i-396. Hruby, V. J. (1994) em: P· eptides, Proc. Tbirt eent h Ameri can Pe ;ptide Symposium; (fíodges, R.S.; Smith, J.A.; Ed. ) S. 3-1 Ί · pcr>,' . i / O ·. DM: Lei den, Holanda). 7 0 objectivo deste pedido foi, assim, peptídicos de baixo peso molecular que interagir especificamente com o local de liga laminina e inibir, de um modo competitivo, a lamínína e o nidogénio a baixa concentração. derivados sejam capazes de çao do nidogénio na associação entre a descobrir

Por isso, o objecto da presente invenção é um fórmula 1, em. que >mpcsto de

Ô RI é um grupo entre uma das seguintes fórmulas

e R5 significa -(CH2)iCOOA, - (CH2)iCONH2, -(CH2hNH2 ou -(CH2)r-S03fí, NH /-(ch2k ! N NH, ou Λ Λ. ' -(CH2)I-, , , / N NH, H 2 e X é um grupo entre uma das seguintes fórmulas 9

em que Y significa D significa R2 significa em que E significa 0, S, -N(A)-CQ- ou - (CH2) r, (CH2) rr 0, S, NH, NR, (CH2)r-0, (CH2)r-S, (CH2) r-NH ou (CH2) rNR e -A, -E-OH, -E-COOH ou -E-C0NH2, uma cadeia alquiloCi-C;;; linear ou ramificada que é não substituída ou substituída por -A, - (CH2)m-0H, - (CH2)m-C00H, - (CH2)m-C (0)NA2 ou por um grupo cicloalquiloCs-C;;:, 10 ou E significa um cicloalquiloCs-Cio que é não substituído ou substituído por -A, --(CH2)m-OH, - (CH2)m-COOH, - (CH2) -C (0) NA2 ou por um grupo cicloalquiloCl-Cio, e em que R7 significa um grupo alquiloCi-Cjn linear ou ramificado que é não substituído ou substituído por -A, - (0¾) K-0H, - (CH2)K- COOfí, - (Cfí2)m”C (0)NA2 ou por um grupo cicloalquiloCs-Cio, ou R7 significa um grupo cicloalquiloCi-Cio que é não substituído ou substituído por -A, - (CK2)- (CH2)rs“C0CH, - (CH2)nrC(0)NA2 ou por um grupo cicloalquiloCA-Cio, R sign: Lfica cicloalqui I0C5-C· 10, i Re t ou Ar que são substituídos, op Cl onalmente, por alqui ICi-C7,-Het, alqui lí !í-Cs'- Ar, -O-alquilCi-Cg-Hí d T - ... / -0-alqui. lí -· 1 ^ b Ar, Het ou por Ar, e m qu e et sign: Lfica um anel aromátio eo 0 u não aroméd si co com 5 até 10 me: cnbro: / monocícl ...ico ou bicíclico, conte sido ou 2 hete roátomos iguais ou dífe: rente t C; como merr tbros do referido anel, sele :;C( oionados c lo gi ::upo consistindo de 3. zo to, oxig énio e enxofre aue s ; 31 xo stituído ou não substituído poi : u; Γ: ou ruais gri IpOS hídroxilo ou car boxi lo e, em que 11

Ar signif. um anel aromático, raonocíclico bicíclico, com 0 a .:.0 membros que é substituído ou não substituído por um ou mais grupos hidroxilo ou 03^00--^1 .0, A significa 1, m e r n e k P q H ou alquiloCi-Ct, e são números inteiros desde 0 a 3, são números inteiros desde 1 a 2, é um número inteiro desde 0 a 1, e é um número inteiro desde 1 a 3, em todas as suas formas estereoisoméricas e suas misturas em todas as proporções, incluindo todos os seu sais fisiologicamente toleráveis.

Os sais fisiologicamente toleráveis são, por exemplo, sais de ácidos orgânicos e inorgânicos, e. g., ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido cítrico ou ácido p-toluenossulfónico ou sais de bases orgânicas e inorgânicas, tais como Nh40H, Na OH, KQti, Ca (OH) 2, Mg (Ofí) 2, dietano lamina ou eti 1 enodiamina ou saís de ami.noácídos, tais como arginina, lisina, lisil-lisina ou ácido glutamico bma lorma o.e reanzaçao preierida da presente invenção é um composto de fórmula I, em que n é 1. Z significa (Cij. NH, NR, N-C(0)~R ou NS0?R, 12

Uma outra forma de realização preferida é um composto fórmula I, em que R, no grupo X, significa Het. Por exemplo, significa de Het ou ou ou ou

13

Uma forma de realização preferida da presente invenção é também um composto de fórmula I, em que R, no grupo X, significa Ar que é substituído, opcionalmente, por -alquilCr-Ce-Ar, -O-alquilCi-Ce-Ar ou por Ar. De um modo preferido, R no grupo X, significa Ar.

Por exemplo, Ar significa ou ou ou

Uma forma de realização preferida é também um composto de fórmula I, em que R, no grupo X, significa 14 ou

No composto de fórmula I, X é, de um modo grupo da seguinte fórmula: preferido, um

De um modo preferido, Y significa -(CH2)r, em modo preferido, 0 ou 1 e k é, de um modo preferido,

Uma outra forma de realização preferida invenção é um composto de fórmula I, em que X seguinte fórmula que ré, de um 1 ou 2. da presente é um grupo da 15

D

λ Ο Ο R4

ζ r R5 em que Ζ significa, de um modo preferido, (0¾)m e m é 0 ou 1. De um modo preferido, R5 significa - (0¾) ].-C00A, em que A significa H, ou R5 significa - (CH2) ]~C0GNH2, em que 1 é 0. De um modo preferido, R4 significa -NH2 ou -A, em que A significa, de um modo preferido, H, ou, de um modo preferido, R4 significa -NHR1, em que -NHR1 significa, de um modo preferido,

O

(CHj)2 R5 r em que R5 significa, de um modo preferido,

H / 16 ou R5 significa, de um modo preferido, / 0 Λ

N NH. H '2 ou R5 significa, de um modo preferido, -NH2.

Uma outra forma de realização preferida da presente invenção é um composto A, composto de fórmula I, em que RI é um grupo da seguinte fórmula 0

em que Z significa, de um modo preferido, (CH2) ra-- e m é, de um modo preferido, 1 e em que R4 significa, de um modo preferido, -NH2 e R5 significa, de um modo preferido, -(CH2) r-COOA, em que 1 é, de um modo preferido, 0 e em que A significa, de um modo preferido, H.

Uma outra forma de realização preferida da presente invenção é um composto A, composto de fórmula I, em que RI é um grupo da seguinte fórmula 17 ο

em que R5 significa, de um modo preferido, -(CH2) χ-COOA, em que 1 é, de um modo preferido, 0 e A significa, de um modo preferido, H.

Uma outra forma de realização preferida da presente invenção é um composto de fórmula I, em que R2 significa A e A significa, de um modo preferido, -CH3 ou em que R2 significa -E-CQOH, de um modo preferido, -CH2-COQH, ou em que R2 significa -E-OH, de um modo preferido, -CH2-OH,

Uma outra forma de realização preferida da presente invenção é um composto de fórmula I, em que R7 é, de um modo preferido, um grupo alquiloCi-Cio ramificado, de um modo preferido, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CE (CH3) CH2-CH; ou -CH2-CH (CH3) 2 .

Os compostos, de acordo com a presente invenção, são derivados peptídicos de baixo peso molecular, não naturais (i. e. que não ocorrem naturalmente) que são capazes de inibir a interacção laminina/nidogénio na gama de concentração de nM. Verificou-se, de um modo surpreendente que as estruturas de baixo peso molecular são capazes de ligação de elevada afinidade do nidogénio ao local de ligação na laminina, sem estas necessitarem de uma interacção com uma tirosina ou histidina de um loop (loop c) adjacente à sequência de ligação actual. 18 É ainda mais surpreendente que os derivados peptidicos de baixo peso molecular, com pesos moleculares entre 550 e 800 Da, descritos na presente invenção apresentam inibição, na mesma ordem de magnitude, em comparação com o péptido mais activo descrito até ao momento ['. !Ci·0 de 22 nM) com um. peso molecular de cerca de 2700 Da t :s cerca de 50% de um módulo LE) e compreend ondo um loop — ints cto que, presumivelmente. estabiliz a a estrutu ra da região da seq- uêncis NIDPNAV essencial (J. W. Fo x e R. Timp] i; doc :umento US Ξ > d 9 3 C íuô) . 0 objectivo foi alcançado ao sintetizar especificamente, com base nas relações estrutura/função e estrutura tridimensional publicada do local de ligação do nidogénio, derivados peptidicos em suportes de resina. Os blocos de construção para as sinteses peptidicas foram variados de acordo com critérios adequados para garantir uma vasta diversidade estrutural e a integração de blocos de construção não naturais. Foi utilizado um ensaio de rastreio sensível, adequado para testar e comparar os derivados peptidicos resultantes para a actividade inibitória, depois de serem removidos por clivagem da resina de suporte.

Os compostos, de acordo com a presente invenção, podem ser utilizados para preparar um fármaco para o tratamento de uma doença que está relacionada com uma síntese aumentada ou indesejada de membranas basais.

Assim, as possíveis áreas de utilização terapêutica dos presentes derivados peptidicos e/ou dos seus sais fisiologicamente toleráveis são: 19 1. Todos os tipos de complicações secundárias da diabetes que são acompanhadas por espessamento das membranas basais (especialmente no rim, olho, sistema vascular). 2. Fibrose hepática, especialmente fibrose hepática alcoólica, caracterizada por síntese de uma membrana basal contínua nos sinusoides e uma capila rizaçáo provocada desse modo. 3, rf1 .-*> r] -q C1 ^ s fibro obs ervada uma sín· da membran a basal 4 , Aterosc lerose met abolism o lipíc f.í 1. tração insufle hep áticos parcial no sistema V 3 S C Ui ser provocaaa inti alia oor também podem ser atribuídas, em parte, a modificações da composição e estrutura das membranas basais nos vasos sanguíneos. 5, Doenças nas qua: is a angiogénese contribuí para uma deterioração no quadro clínico, por exer nplo, cancros nos quais é necessária a ne ova sei J..i. 3. T. 1. Z 3. Ç 3.0 p 3 T. 3 o crescimento tumorai, retínopatia diabética, fibroplasia ret rolental, distúrbios com um forte componente inflamatório (por exemplo, artrite reumatóíde, osteoartri te, vasculite), hemangiomas, psoríase e muitas outra s.

Assim, os compostos, de acordo com a presente invenção e/ou seus respectivos sais fisiologicamente toleráveis são adequados para utilização como um fármaco. Por isso, um outro objecto da 20 presente invenção é uma composição farmacêutica contendo, pelo menos, um composto de acordo com a presente invenção e/ou os seus sais fisiologicamente toleráveis.

Os compostos de fórmula I e seus sais fisiologicamente toleráveis e derivados podem ser administrados, de acordo com a invenção, a animais, de um modo preferido, a mamíferos e, em particular, a humanos como fármacos para terapia ou profilaxia. Podem ser administrados per se, em misturas com outro ou na forma de preparações farmacêuticas que permitem administração entérica ou parentérica e que, como constituinte activo, contêm uma dose eficaz de, pelo menos, um composto de fórmula I e/ou os seus sais e derivados fisiologicamente toleráveis, além de excipiente e/ou aditivos inócuos farmaceuticamente convencionais.

Os fármacos podem ser administrados sistemicamente ou localmente. Podem ser administrados, por exemplo, na forma de pílulas, comprimidos, comprimidos revestidos com película, comprimidos revestidos com açúcar, grânulos, cápsulas de gelatina mole e dura, pós, soluções, xaropes, emulsões, suspensões ou noutras formas farmacêuticas. No entanto, a administração também pode ser efectuada vaginalmente ou rectalmente, por exemplo, na forma de supositórios ou parentericamente ou por implantação, por exemplo, na forma de soluções para injecção ou soluções para infusão, microcápsulas ou bastonetes, topicamente ou percutaneamente, por exemplo, na forma de unguentos, soluções ou tinturas, ou de outro modo, por exemplo, na forma de vaporizadores nasais, misturas de aerossol ou como preparações inaláveis de pó seco. Se as soluções forem administradas parentericamente, podem ser administradas, por exemplo, intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente, 21 intra-articularmente, intrasinuvialmente ou de outro modo, e. g., por inalação de aerossóis secos ou preparações de pó seco.

As preparações farmacêuticas, de acordo com a invenção, são preparadas de um modo conhecido per se, sendo possível utilizar excipientes orgânicos e/ou inorgânicos farmaceuticamente inertes para além do(s) composto (s) de fórmula I e/ou seu/seus sais e derivados fisiologicamente toleráveis. Para a preparação de pílulas, comprimidos, comprimidos revestidos com açúcar e cápsulas de gelatina dura é possível utilizar, por exemplo, lactose, amido de milho ou seus derivados, talco, ácido esteárico ou seus sais, etc. Os excipientes para cápsulas de gelatina dura e supositórios são, por exemplo, gorduras, ceras, polióis semi-sólidos e líquidos, polietilenoglicóis, óleos endur ecidos ou naturais, θ' fcc, Oí a exci cientes adequado s par; 3 3. prepa .ΙΓβ ÇâO d* oluções, po; : e> íem mio, soluções cara in- ] ecção OU de e mui soe • 3 Γ\- j xarope s ScíO f por exemplo, água, álcoc gl ice rol, d.i .óis , políóí •f sa ca: t:ose, açúcar invertia o, ól eos veget 3 -Í. S ; et - r> Os excí .D.Í £ ;nte s adequi s dos para micro capsui as, ímpia ntes c Ί1 ba; stonetes são , p or exempj lo, co-polímeros de ác :ido lácti co e cLC ido gli cól ico, Norma Imente, as pr eparaç :Ões rarmacêutic as o ontêm, apro: t i ma .da mente, 0,5 a 90% em peso dos o o ίθ o 3 tOS d' 0 fórmula e/í ou os seus saís e derivados risíoloqicamente toleráveis.

Além dos compostos activos e excipientes, as preparações farmacêuticas podem conter, adicionalmente, auxiliares ou aditivos, tais como, por exemplo, enchimentos, desintegrantes, ligandos, lubrificantes, agentes de humidificação, estabilizantes, emulsionantes, conservantes, adoçantes, corantes, aromas ou aromatizantes, espessantes, diluentes, substâncias de tampão, solventes ou solubilizantes, meios para 22 alcançar um efeito de depósito, sais para alterar a pressão osmótica, agentes de revestimento ou antioxidantes. Também podem conter dois ou mais compostos de fórmula I e/ou os seus sais e derivados fisiologicamente toleráveis. Além disso, podem também conter uma ou mais outras substâncias terapeuticamente ou profilaticamente activas, para além de, pelo menos, um composto de fórmula I e/ou os seus sais e derivados fisiologicamente toleráveis. As preparações farmacêuticas contêm, normalmente, 0,2 a 500 mg, de um modo preferido, 1 a 100 mg de composto activo de fórmula I e/ou os seus sais e derivados fisiologicamente toleráveis por dose.

Se os compostos de fórmula I ou preparações farmacêuticas contendo-os são administrados como aerossóis, por exemplo, como aerossóis nasais ou por aerossóis secos ou inalação de pó seco, tal como ser efectuado, por exemplo, utilizando um vaporizador, um atomizador, um atomizador de bomba, um dispositivo de inalação, um inalador doseado ou um inalador de pó seco, respectivamente. As formas farmacêuticas para administração dos compostos de fórmula I como um aerossol podem ser preparadas através do processo bem conhecido pelos especialistas na técnica. Para a sua preparação, por exemplo, são adequadas soluções ou dispersões dos compostos de fórmula I em água, misturas de água-álcool ou soluções salinas adequadas utilizando aditivos normais, por exemplo, álcool benzilico ou outros conservantes, potenciadores de absorção para aumentar a biodisponibilidade, solubilizantes, dispersantes adequados e outros, e, se apropriado, são adequados propelantes normais, por exemplo, clorofluoro-hidrocarbonetos e/ou fluoro-hidrocarbonetos, enquanto que podem ser obtidas preparações de pó seco dos compostos da fórmula I e/ou os seus sais fisiologicamente toleráveis, através de secagem por 23 congelação ou, de um modo preferido, secagem por vaporização de soluções aquosas dos compostos de fórmula I e/ou os seus sais fisiologicamente toleráveis e de aditivos solúveis em água adequados, tais como açúcares ou derivados de açúcar e aminoácidos. A dose, quando se utiliza os compostos de fórmula I, pode variar dentro de vastos limites e, como normal, pode ser personalizada para as condições individuais em cada caso individual, como conhecido pelo médico. Depende, por exemplo, da natureza e gravidade de 2, 3 ou 4 administrações parciais. Se apropriado, dependendo do comportamento individual, pode ser necessário aumentar ou diminuir a dose diária indicada.

Além disso, os compostos de fórmula I e seus sais, de acordo com a presente invenção, podem ser utilizados como intermediários para a preparação de outros compostos, em particular, de outros compostos farmacêuticos activos que podem ser obtidos a partir de compostos de fórmula I, por exemplo, por modificação ou introdução de radicais ou grupos funcionais, por exemplo, por esterificação, redução, oxidação ou outras conversões de grupos funcionais.

Os derivados peptidicos, de acordo com a presente invenção, assim obtidos podem, por outro lado, ser utilizados directamente como agente terapêutico, mas também podem constituir a base para estruturas relacionadas que também são adequadas para utilização como agente terapêutico para tratar doenças relacionadas com uma sintese aumentada ou indesejada de membranas basais. 24 A presente descrição refere-se também a um método para preparar o composto de fórmula I, de acordo com a presente invenção.

0 composto de fórmula I

de acordo com a presente invenção, é preparado por uma condensação de fragmentos de um composto de fórmula II rKy/OH (Π)

A

com um composto de fórmula III

(CH,)qNOH

em que as variáveis Rl, X, n, R2 e R3 têm os significados acima mencionados e, desse modo, os compostos das fórmulas II e III 25 podem ser protegidos nos grupos funcionais acima definidos por grupos de protecção normais conhecidos em quimica peptídica (ver, por exemplo, Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, vol. 15/1 e 15/2, Georg Thieme Ver lag, Estugarda, 1974). Os métodos de condensação são bem conhecidos na técnica (Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, vol. 15/1 e 15/2, Georg Thieme Verlag, Estugarda, 1974) . Os agentes de condensação ou reagentes de junção adequados são, por exemplo, carbonil-diimidazoles, carbodiimidas, tais como di-ciclo-hexil-carbodiimida ou di-isopropil-carbodiimida ou 0- ( (ciano (etoxicarboníl) metileno) ~arrd.no) -N, Ν,Ν',N' -tetra-metil-urónio-tetrafluoro-borato (TOTU) ou ácido piro-fosfórico anidro (PPA). As reacções de condensação são efectuadas sob condições convencionais. Geralmente é necessário, durante a condensação peptidica, proteger os grupos amino que não se pretende que sejam envolvidos na reacção de junção por grupos de protecção que são facilmente removidos sob condições diferentes das condições sob as quais ocorre a junção. Aplica-se o mesmo aos grupos carboxilo não envolvidos na reacção de junção que são protegidos, de um modo preferido, como ésteres de alquiloCi-Cê, ésteres de benzilo ou ésteres de terc-butilo durante a reacção de junção. Não é necessária uma protecção dos grupos amino no caso de grupos amino que ainda estão presentes na forma de precursores do grupo amino, e. g„, na forma de grupos nitro ou cian Γ\ Os < grup )0S arai no sào de: pois fortm ados P N ν' um passo c le hídr 'clt d. Ç:âO ?. :í U D S equent .6 à reacção de conden saçã 0 . Apó s o passo c le cond .en sação, os ; grup 08 C le protí seção são reme rvi dos por método )S adeq ;ua dos c onhí seidos , e. g., c rs grupos ben; 7 í Ί .0x1- -carbonilo e benz 1.1 o poc iem ser r emo vidOS por hidra t^SÇ5. 0 0ΓΡ ésteres c le benz il o; os gr upos de j rrotecçl í.o do tipe J te rc- -but ilo são, o :m gera 1, cl ivados sob cond: içôes ac íd.íc. as / o residi; :o 9-f.l uc irenilrc leti léxica rbon. ilo é rs sm.ovi.do por " a ml .na icundárias. 26 acordo com a por adição aminoácidos sólida, desse as sequências A preparação do composto de fórmula I, de presente invenção, também pode ser efectuada sequencial dos respectivos componentes, e, g. naturais, não naturais e seus derivados, numa fase modo, os componentes podem ser adicionados em vá ri diferentes.

De modo a preparar o composto de fórmula I, também pode ser vantajoso não ligar directamente os compostos de fórmulas I e II por uma condensação de fragmentos, mas a ligação dos seus respectivos precursores adequados, de modo a obter um intermediário que pode ser transferido para um composto de fórmula I, e. g. por derivatização. 0 método descrito acima, para introduzir grupos funcionais não directamente, mas através dos seus respectivos precursores, na molécula, para obter intermediários a partir dos quais o produto final pode ser facilmente obtido por transformação dos grupos precursores nos respectivos grupos funcionais, subsequentemente, a reacção de condensação, também pode ser aplicada para diferentes partes da moléculas do composto de fórmula I, e. g. para a cadeia lateral do composto de fórmula I, RI- ou Rl-X-, respectivaraente. 27

Exemplos

As abreviaturas têm os seguintes significados

Agentes e solventes:

Ac: OH ácido acéticc aquoso albumina de soro bovino cr

CC N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida

DCM giciorometano

Dl PE A N, N···diisopropi 1 etiIaraina

DMAP 4-dime t i1ami n opiri di na N, N - d imet i 1 f o rmamd. da D. i meti. isulfc

Et?0 Éter dietilico

EtOAc

Etiietanoato (éster etílico do ácido acético)

EtOH etano1 28

Fmoc-OSi à c c Fmo c - 0 - s υ c c 1. n 1. mi da HOBT 1 - h i d r o x í b e η z o t r i a z o 1 e KHMDS hexametildísílazída de potássio n-buti1-1ític Me OH metanol MT BE éter metil-terc-butílico TEA trieti. lamina TFA THE ácido trifluoroacético tetra-hidrofurano TMSDA tetrametiletílondiamina TM SC I TOTU cloreto de triraetilsililo tetrafluoroborato c 0- ((ciano(etoxicarboni1)metileno)amino) ™i>E N, N ', M ' -tetrameeiluronio TrísEG trisi1ilazída

Grumos c luimicos: & meti lo Cl· 29

Et etilo nPr n-propilo iPr ísopropilo nBu n-butilo iBu isobutilo tBu terc-butilo

Ph fenilo CH3"-CH2··· CH3Cfí2CH2··· (CH3)3CH-CH3CH3CH2CR2·" (CH3) 3CHCH2” (CH3) 3C-

Fmoc 9-fluorenilmetoxi carbonilo Z benziloxicarbonilo BOC terc-butiloxicarboniio C&H5--CH2--0--C0-(CH3) jC-O-CO- 1. Rastreio de uma biblioteca de inibidores da interacção Laminina/Nidogénio A biblioteca foi concebida para identificar péptidos mais pequenos, metabolicamente mais estáveis e mais potentes relacionados com o heptapéptido NIDPNAV previamente conhecido (Põschl, E.; Fox, J.W.; Block, D.; Mayer, U.; Timpl, R, (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. Põschl, E.; Mayer, U.; Stetefeld, J.;

Baumgartner, R.; Holak, T.A.; Huber, R.; Timpl, R. (1996) EMBO J. 15: 5154-5159. Baumgartner, R.; Czisch, M.; Mayer, U.; 30 Põschl, E.; Huber, R.; Timpl, R.; Holak, T.A. (1996) J. Mol. Biol. 257; 658 - 668). A biblioteca foi sintetizada e rastreada como três sub-bibliotecas; pentâmero, hexâmero e heptâmero. Abaixo está uma descrição da estratégia de rastreio para a sub-biblioteca do pentâmero. 0 método é representativo dos métodos empregues para as outras duas sub-bibliotecas, excepto que os hexâmeros foram rastreados no primeiro passo a cerca de 50 esferas por poço e os heptâmeros foram rastreados a cerca de 100 esferas por poço. 1.1. Rastreio da biblioteca de pentâmero A biblioteca de pentâmero continha 2160 compostos diferentes. 1) Foram suspensas cerca de 8800 esferas individuais em HC1 a 0,1% e distribuídas em sete placas de microtitulação de 96 poços com fundo de filtro com, aproximadamente, catorze esferas por poço. 2) As esferas foram lavadas duas vezes com 200 :L de água desionizada, depois, foram adicionados 50 :I de HEPES 500 mM, pH 7,0. 0 ligante utilizado na biblioteca liberta uma alíquota do composto quando o pH é aumentado para 7,0 e este passo de clivagem ocorreu de um dia para o outro. 3) As placas foram colocadas sobre placas de fundo de filtro em U e centrifugadas. As misturas dos compostos libertados das esferas foram recolhidas no fundo da placa, enquanto as esferas correspondentes permaneceram no filtro da placa original. 31 4) Às esferas foram adicionados 25 :L de DMSO por poço para lavar o restante composto livre das esferas e as placas foram novamente centrifugadas para separar os compostos em solução das esferas. 0 stock resultante foi, presumivelmente, de 27 :M por composto em HEPES 333 mM, DMSO a 33%. 5) Os stocks dos compostos foram pré-incubados com nidogénio (10 :I de stock de composto para 90 :I de solução de nidogénio) e o ensaio foi efectuado como descrito no protocolo em anexo, proporcionando uma concentração de rastreio final de 2,7 :M por composto. 6) Nos 25 poços de ensaio, onde ocorreu >62% de inibição reprodutível, as esferas correspondentes às placas de filtro originais foram suspensas em HC1 a 0,05%, Tween-20 a 0,1% e pipetadas para cinco novas placas de filtro a 1 esfera por poço. Foram adicionadas, a cada placa, duas esferas de controlo, com o composto derivado no mesmo ligante, como controlo. 7) As esferas foram lavadas duas vezes com 200 :L de água desionizada, depois, foram adicionados 25 :I de NaOH 50 mM a cada poço. O ligante utilizado na biblioteca liberta a segunda alíquota equimolar do composto quando o pH é aumentado de 7,0 para 19,0 ou mais. Este passo de clivagem ocorreu durante 3 horas. 8) As placas foram colocadas sobre placas de fundo de filtro em U e centrifugadas. Os compostos libertados das esferas foram recolhidos no fundo da placa, enquanto as esferas correspondentes permaneceram na placa de filtro original. 32 9) As esferas foram lavadas com 20 :L de HEPES 50 mM (pH inicial 7,0) com adição de HC1 50 mM, e a solução foi centrifugada para a placa inferior e combinada com o primeiro libertado. 10) As esferas foram lavadas uma terceira vez com 25 :L de DMSO que foram deixados a equilibrar com as esferas durante 10 minutos antes da centrifugação. 11) Os libertados resultantes foram analisados com 1/10 do volume, como no Passo número 5. 12) As soluções que inibiram tanto ou melhor que as esferas de controlo (cerca de 50% de inibição) foram consideradas como sucessos. Foram recuperadas 23 esferas de sucesso, sendo explicados outros dois potenciais poços de sucesso como inibidores fracos aditivos nos poços individuais. 13) As soluções de sucesso foram submetidas a espectrometria de massa para determinar os pesos moleculares. 14) As esferas de sucesso individuais correspondentes foram submetidas à degradação de Edman para determinar as sequências peptidicas. 15) Os dados de EM e Edman combinados foram analisados para identificar as estruturas dos compostos de sucesso.

As estruturas e frequências da sua recuperação são apresentadas abaixo. G-Hopa = hidroxipropilamida de glicina, o restante ligante. 33

IC50, :M

Frequência 6 D Nal2 N D V G-Hopa 0, 4 D Nal2 N A V G-Hopa 0, 4 D Nal2 N D I G-Hopa 0, 4 D Nal2 N S V G-Hopa 0, 3 D Nal2 N S I G-Hopa 0, 2 D Nal2 N A I G-Hopa 0,

Legenda:

Nal2 = L-3 (2-naftil)-alanina

G-Hopa = glicina-3-hidroxipropilamida:

OH 0 D = Asp (aspartilo) , P = Pro (prolilo) , N = Asn (asparaginilo) , A = Ala (alanilo), V = Vai (valinilo), S = Ser (serilo), I = Ile (isoleucilo) . 34 1.2. Processos: Preparação da biblioteca péptidica

As bibliotecas peptídicas foram sintetizadas por uma abordagem de síntese split/mix (Lam, K. S., Salmon, S. E., Hersh, E. M., Hruby, V. J., Kazmierski, W. M., e Knapp, R. J. (1991) Nature 354, 82; Furka, A., Sebestyen, F., Asgedom, M., e Dibo, G. (1991) Int. J. Pept. Protein Res. 37, 487) utilizando química Fmoc péptidica em fase sólida convencional (Stewart, J. M., e Young, J. D. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., Rockford, IL.; Atherton, E., e Sheppard, R. C. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis. IRL Press Oxford). Cada esfera da resina foi exposta a apenas um aminoácido activado em cada ciclo de ligação. Por isso, no fim da síntese da biblioteca, cada esfera da resina expressa apenas uma entidade péptidica. Uma vez que não é possível testar todos os compostos em separado, foi construída a mesma estrutura em cada esfera de resina em duas cópias via ligante clivado de modo diferencial, fig. 1 (Kocis, P., Krchnak, V., e Lebl, M. (1993) Tetr. Lett. 34, 7251; Lebl, M., Krchnak, V., Salmon, S.E., e Lam, K. S. (1994) A Companion to Methods in Enzymolog 6, 381). A libertação do péptido da esfera de resina pode, depois, ser efectuada em passos sequenciais, utilizando diferentes mecanismos de clivagem. A libertação da primeira parte do péptido, como uma hidroxipropilamida, é efectuada em tampão a pH 7-9. A libertação da segunda parte do péptido é alcançada pela utilização de pH mais elevado (Esquema 1) .

Nas bibliotecas peptídicas, foram utilizadas esferas de poliestireno enxertadas com polietilenoglicol ou TentaGel®S NH2. De facto, são adequadas quaisquer esferas de resina que sejam compatíveis com a síntese péptidica e rastreio sob condições aquosas. 35

Foram preparadas bibliotecas de pentâ-, hexâ- e heptâmeros com uma posição fixa (L-asparagina). A hidroxipropilamida de glicina no terminal C é uma parte de um ligante: H-X4X3-Asn-X2Xl-Gly-NH (CH2)30H (2160 péptidos) H-X5X4X3-Asn-X2Xl-Gly-NH (CH2)30H (25920 péptidos) H-X6X5X4X3-Asn-X2Xl-Gly-NH (CH2)30H (311040 péptidos) XI: N-Fmoc-L-aminoácidos (9) utilizados na primeira selecção aleatória: Valina, isoleucina, treonina, fenilalanina, β(2-naftil)alanina, ácido 2-azetidinocarboxílico, prolina, ciclo-hexilglicina, fenilglicina. X2: N-Fmoc-L-aminoácidos (4) utilizados na segunda selecção aleatória: Alanina, glicina, serina, ácido aspártico. X3=X5=X6: N-Fmoc-L-aminoácidos (12) utilizados na terceira, quinta e sexta selecção aleatória: Ácido pipecólico, β (2-naftil)alanina, ácido glutâmico, lisina, ácido 2-azetidinocarboxílico, treonina, prolina, asparagina, isoleucina, 3,5-diiodotirosina, citrulina, arginina. X4: N-Fmoc-L-aminoácidos (5) utilizados na quarta selecção aleatória: Ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido 2-aminoadípico, O-sulfato de tirosina, (ácido carboxiglutâmico). A resina (PEG-PS-HC1, Millipore®, 20 g, 0,58 mmol/g de carga, 220 ym de tamanho médio de partícula) foi emergida em N,N-dimetilformamida durante 2 horas e, depois, neutralizada com 36 Ν,Ν-diisopropiletilamina a 10% em diclorometano. A resina foi lavada com diclorometano e Ν,Ν-dimetilformamida. O ligante (Fig. 1, 3 eq) foi ligado utilizando 1,3-diisopropilcarbodiimida e 1-hidroxibenzotriazole (3 eq cada) em Ν,Ν-dimetilformamida à temperatura ambiente durante 12 horas. A reacção foi monitorizada pelo método de azul de bromofenol (Krchnak, V., Vagner, J., Safar, P., e Lebl, M. (1988) Collec.Czech.Cem. Commun.53, 2542). A conclusão da ligação foi, depois, determinada por um teste de ninidrina (Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., e Cook, P.I. (1969) Anal. Biochem. 34, 595). Após lavagem com Ν,Ν-dimetilformamida, o grupo de protecção Fmoc foi removido com piperidina a 50% em Ν,Ν-dimetilformamida durante 15 min. A resina foi depois lavada com Ν,Ν-dimetilformamida e a quantidade de aducto fulveno-piperidina libertado foi quantificada por espectrometria UV (302 nm) . Um nível estável de carga da resina (mmol/g) determinado, deste modo, através da síntese da biblioteca serviu como uma das determinações de controlo de qualidade. A resina foi dividida em 9 porções iguais. Foram depois adicionados, separadamente, nove aminoácidos protegidos com Fmoc (XI) a cada uma das alíquotas da resina e ligados pelo processo descrito durante 2 horas. A resina foi depois reunida num recipiente de vidro cilíndrico ajustado com uma frita no fundo. Foi borbulhado azoto seco para o seu interior para misturar a resina. 0 grupo de protecção Fmoc foi removido como descrito acima. A resina foi dividida em 4 porções iguais. Foram, depois, adicionados, separadamente, quatro aminoácidos protegidos com Fmoc (X2) a cada uma das alíquotas de resina e ligados utilizando o mesmo protocolo de ligação. O grupo de protecção 37 fmoc foi removido e foi determinada a carga da resina. No ciclo seguinte, foi ligada L-asparagina pelo processo descrito. A resina foi depois dividida em aliquotas para outro ciclo de ligação. Após a conclusão de todos os passos de selecção aleatória, o grupo Fmoc foi removido e os grupos de protecção da fluoroacético (82,5%) ), etanoditiol ..e (2,5%) ada com ácido -dimet.il formam d. d a e 3. Γ TQ 3 Z O Π 3,0 3, S S Θ C 3. S 3 ''•i limados com uma mistura de ácido anísole (5%), água (5%), tioanisole durante 2,5 horas. A resina foi depois trifluoroacéticc·, di clorometano, metanole. As bibliotecas foram

Para verificar a qualidade da biblioteca, várias esferas escolhidas aleatoriamente foram submetidas a sequenciação por degradação de Edman e técnicas de espectrometria de massa. 38

Esquema 1 1.3. Resultados (ver também figuras 2-12) N° Pm Pureza IC50 [: M] Estrutura 1 Controlo 855 >95% 3,9 V * v · v», °A " 0 Q O L-Asparaginil- asparaginil-L- L-isoleucil-L-aspartil-L-prolil-L- alanil-L-valil-glicina-3-hidroxipropilamida 39 (continuação) N° Pm Pureza IC50 [:M] Estrutura 2 Controlo 628 >95% 7,7 ^ν^Ν^Ν^ΛΝΙγΝνΛΝ^,Νν/ννΟΗ "V °wH °ah o 0 ° H-Asp-PrD-AsrvAla-VaW3lí-NH(CHjM)H L-Asparti; 3-hidroxij L-L-prolil-L-asparaginil-L-alanil-L-valil-glicina- ?ropilamida 3 772 >95% 0,51 J-OH — o ® H-Asp-Nal(2)-AsivAsp-Val-Gty-NH(CHíhOH L-Asparti] valil-glic L-L-3 :ina- - (z-nattil) alanii-L-asparagmil-L-aspartil-L- 3-hidroxipropilamida 4 744 >95% 0,38 OH o 0 H-As^Na!(2}^srvSer-yaW3ly'NH[CH2)3OH L-Asparti] valil-glic L-L-3 :ina- (2-naftil)alanil-L-asparaginil-L-seril-Ll 3-hidroxipropilamida 5 728 >95% 0,75 H-Aso-Nal{2VAsn-Ala-Val-Gty-NH(CH;)30H L-Asparti] valil-glic L L o (Λ-nal Lil) dldiiil-L-asparayinil-L-alanil-L- ~ :ina-3-hidroxipropilamida 40 (continuação) N° Pm Pureza IC50 [:M] Estrutura 6 786 >95% 1,38 L-Aspartil-L-3-(2-naftil)alanil-L-asparaginil-L-aspartil-L-valil-glicina-3-hidroxipropilamida 7 758 >95% 0,6 V*' eu "Y · v««, γ ° H-Asi>+la1(2y-Asn-Ser-llfrGl¥-NH(CH3bOH L-Aspartil-L-3-(2-naftil)alanil-L-asparaginil-L-seril-L-isoleucil-glicina-3-hidroxipropilamida 8 742 >95% 0,7 H-As^WaWMaWiWWÍI^NHICHjbOH L-Aspartil-L-3-(2-naftil)alanil-L-asparaginil-L-alanil-L-isoleucil-glicina-3-hidroxipropilamida 9 728 >95% 8,25 H-AsfrWal(1VAavAla-VaWty-NH(CH!bOH L-Aspartil-L-3-(1-naftil)alanil-L-asparaginil-L-alanil-L-valil-glicina-3-hidroxipropilamida 10 717 >95% 8, 57 Qy νΛγ—--0" n e^“M^ 0 H-Asp-Trj>As(vAl3-Val-G^-NHÍCH;)jOH L-Aspartil-L-triptofanil-L-asparaginil-L-alanil-L-valil- glicina-3-hidroxipropilamida 41 (continuação) N° Pm Pureza ICso [ :M] Estrutura 11 Controlo 678 >95% 3,38 ^A^ÁV-Ây^ V 0 V«H. 0 A 0 H-Asj^hfrAsfrAla-VaHjly-NHICHiXtH L-Aspartil glicina-3- .-L-fenilalanil-L-asparaginil-L-alanil-L-valil" -hidroxipropilamida 12 694 >95% 3,79 OH “V e >»». ° 0 0 H-Asp-Tyr-Asri-Ata.VaKSty-NHtCHilsOH L-Aspartil glicina-3- .-L-tirosil-L-asparaginil-L-alanil-L-valil- -hidroxipropilamida 13 734 >95% 7,03 H-AS^Alâ[3-í3-Benzotienil)>ASIVAIa-Val~Gfy-NH(CHíbOH L-Aspartil alanil-L-\ --L-3- (3-benzotienil)alanil-L-asparaginil-L-ralil-glicina-3-hidroxipropilamida 14 754 >95% 0,94 HoY " S ( " 0^H 0 ►WUp^yi{4-Bifenil)htoW«a-VaWlí-NH(CH!bOH L-Asparti] valil-glic --L-3- (4-bifenil)alanil-L-asparaginil-L-alanil-L-:ina-3-hidroxipropilamida 15 754 >95% 26,3 Y Vnh, ^ o ° H-AspAJa(3>Kfenil ^Asn-Al3-VaM5ly-NH(CHihOH L-Asparti! valil-glic -~L-(3,3-difenil)alanil-L-asparaginil-L-alanil-L-úna-3-hidroxipropilamida 42 (continuação) N° Pm Pureza IC5o [:M] Estrutura 16 720 50-75% 4,28 VA-" V 0 W 0 ^ 0 o o Η-ΑάΜΟε^ΓθπΐΙ^ινάβΓ-νβ^-ΝΗΐεΗιΙιΟΗ L-Aspartil-L-(3S)-fenilprolil-L-as valil-glicina-3-hidroxipropilamida paraginil-L-seril-L- 17 720 50-75% 2,27 0 0 ' H-Asp-Pro[(3R)-Fenil l-Asn-Ser-VslC WJ HICHjhOH L-Aspartil-L-(3R)-fenilprolil-L-as valil-glicina-3-hidroxipropilamida paraginil-L-seril-L- 18 695 50-75% 25 \ N W OH "V 0 0 A ° H^MaP^iri<l'IMaHSer-VaK3ly-NH(CH2)3QH L-Aspartil-L-3-(3-piridil)alanil-L valil-glicina-3-hidroxipropilamida -asparaginil-L-seril-L- 19 744 75-95% 25 OH -----OH HY M "v; · Μ$|ΗηΙ(2μ5ΐ>«α-νβίΟΗ4Η(εΗ2)90Η L-Aspartil-D-3-(2-naftil)alanil-L-asparaginii-L-seril-L-valil-glicina-3-hidroxipropilamida 20 708 50-75% 32,5 q > OH MY 0 v j; 0 ^ 0 H-As^of-AsivSer-VaWSIy-NHíattlJOH L-Aspartil-L-homofenilalanil-L-asparaginil-L-seril-L-valil-glicina-3-hidroxipropilamida 43 (continuação) N° Pm Pureza ICso [: M] Estrutura 21 Controlo 686 75-95% 0,34 OH "Y H ° Vhh” 0 -k H-As^Nal(2)-Asn-Ser-Val-Gly-NH2 L-Asparti. valil-glic L— L” j :ina- ( Z — Ild 1 amida ;il)alanil — L — d.t>jJd.-Ld.y-LIl_L]_ — L — ^ ------ 22 Controlo 629 75-95% 0,18 \ —— \~y -°H ° v y r -H. Π /Τ'»», ---\ H-AsD^al[2>Asn-Ser-VaWJH2 L-Asparti_ valina-am: .— L—3 Lda - (2-naft ;il)alanil -L-asparaginil-L-ser]j~^Ll!--- 23 777 50-75% 1,49 Ftalil-Nal(2)-Asn-SefVal-Gly-NH(CH2)30H Ptaloil-L-J- (z-naitil) alanil-L-asparaginil-ii-seril-L-vaiii- glicina-3-hidroxipropilamida 24 Ver Exemplo 2.3 729 >95% 0,39 W OM SutNal(2VAsn-Ser-VaU3lv-NH|CH2)30H Succinil-L-3-(2-nafti. valil-glicina-3-hidroj .)alanil-L-asparaginil-L-seril-L-íipropilamida 44 (continuação) N° Pm Pureza ICso [ :M] Estrutura 25 744 75-95% 0,23 b* ° ^ H-0Asp+)al(2>-Asn-Ser-Val-Gly-NH(CH3)jDH L-p-Aspartil-L-3-(2-naftil)alanil-L-asparaginil-L-seril-L-valil-glicina-3-hidroxipropilamida 26 743 75-95% 0,45 0 1 Giuta.ii+laK2Htóft-Sêr-VaW3fí-NH(CH2)30H Glutaril-L-3-(2-nafti. valil-glicina-3-hidro} .)alanil-L-asparaginil-L-seril-L-cipropilamida 27 901 >95% 0,44 0 k* 0 O H-Cit^spJtel(2HteivSer-VaWly-NH(CH2hOH L-Citruli) seril-L-ví .-L-aspartil-L-3-(2-naftil)alanil-L-asparaginil-L-ilil-glicina-3-hidroxipropilamida 28 900 75-95% 0,15 «*νλ* r ° wy- ° 0 H-An)-Asp-Nal(2^Asn-Ser-VaWàly-NH[CH2)30H L-Arginil-L-aspartil-L-3-(2-naftil)alanil-L-asparaginil-L-seril-L-valil-glicina-3-hidroxipropilamida 45 (continuação) N° Pm Pureza ICso [:M] Estrutura 29 872 >95% 0,24 H4vs-A3l)-Nal(2>Asn-Ser-VaH3l|f-NH(CH3)30H L-Lisil-L-aspartil-L-3-(2-nafti; seril-L-valil-glicina-3-hidroxij L)alanil-L-asparaginil-L- Dropilamida 30 713 >95% 0,25 0 Suc-Nal[2VAsn-Ala-VaU3tv-NHICH2)30H Succinil-L-3-(2-nafti] valil-glicina-3-hidroj _)alanil-L-asparaginil-L-alanil-L-cipropilamida 31 Ver exemplo 3.1 Controlo 598 >95% 0,19 “VSA* 5 0 V-kh, 0 0 Suo+)aí2VA3vAla-VaW)H2 Succinil-L-3-(2-nafti; valina-amida L)alanil-L-asparaginil-L-alanil-L- Succinil-L-3-(2-naftil)alanil-L-asparaginil-L-alanil-L-2-terc-butil-glicina-amida 33 Controlo 584 >95% 0,72 o » Vnh, o ^K. O Suc*Nal(2)-Asn-Gly*Val-NH2 Succinil-L-3-(2-nafti] valina-amida -)alanil-L-asparaginil-gliclnil-L- 46 (continuação)

No Pm Pureza ICso [: M] Estrutura 34 Ver Exemplo 2.2 Controlo 624 >95% 0,027 çP o Suc-Pro((3R)-2- Naftil >Asn-Ala-VaWIH2 Succinil-L-(3R)-(2-naftil)prolil-L-asparaginil-L-alanil-L-valina-amida 35 Controlo 654 >95% 5, 02 0¾ 0 L U 0 | μ 0 Η0 N T N ^ N Y N NHí 0 H 0 VnÍ ° ^ SuoT/i<Bzl^A5n-Ala-VaW)H2 Succinil-L-O-benzil-tirosil-L-asparaginil-L-alanil-L-valina-amida 36 Controlo 624 >95% 2,83 ° M 0 v™" ° ^ Suc-Ala[3-(4-Bifen i l]>Asn-Ala-Val-NK2 Succinil-L-3-(z valina-amida -bifenil)alanil-L-asparaginil-L-alanil-L- 37 Controlo 599 >95% 0,83 S-HH. Suc-Nal(2}*Asn-Ala-Vaí-OH Succinil-L-3-(2-Naftil)alanil-L-asparaginil-L-alanil-L-valina 47 (continuação) —1 N° Pm Pureza ICso [:M] Estrutura ^___ 38 Controlo 585 >95% 0,26 Suc-Nalí2VAsfrAla-VaVol ______ Succinil-L-3- (2-Naftil) alanil-L-asparaginil-L-alanini-J-'Jj valinol 39 Controlo 597 >95% 1,5 \P u \ ^ Η o · H X- Η°γ^8\νΛχ 0 H 0 < H 0 <ΓΜΗ. Suc4laK2VAsn-Ala-NHCH(iPr)2 Succinil-L-3-(2-Naftil)alanil-L-asparaginil-L-alanina'^'4 dimetilpentilamida 40 Controlo 569 >95% i—1 \—1 hv—^ 0 H 0 < H 3 0^1«, Suc-NaV2i-AsrvAta-NHCH2C(CH3)3 Succinil-L-3- (2-Naftil)alanil-L-asparaginil-L-alanina- neopentilamida 41 Controlo 595 >95% 8,17 J-HH, Su&JM2)^iMla-3,3-dimetilpiperidina Succinil-L-3- (2-Naftil)alanil-L-asparaginil-L-alanina-3, 3-dimetilpiperidinilamida 48 (continuação)

No Pm Pureza ICso [:M] Estrutura 42 Controlo 626 75-95% 0,24 "°Ίτ— 0 0 SiitMal/ÍVAsn^la-Val-NíCHai? Succinil-L-3- (2-Naftil)alanil-L-asparaginil-L-alanil-L-valina-dimetilamida 43 Controlo 611 >95% 0, 026 çfP >-KM, Suc-Prol(3RV2- Naftil Wsn-Ala-Vakil Succinil-L-(3R)-(2-naftil)prolil-(2S)-amino-3-metil-l-butanol -L-asparaginil-L-alanil- 2. Síntese em grande escala 2.1 Síntese de K-Fmoc-trans-

Sumário: A N-Fmoc-trans-3- 3~(2'-naftil)-L-prolina (A8) (2'-naftil)-L-prolina (A8) foi preparada em 10 passos; 49 2 trai (2'-maftil)-propenoato de etilo (AI) r

CHO

Fmoc A8 A uma solução agitada de 2-naftaldeído (7,8 g, 50 mmol) em 50 mL de etanol, foi adicionado (carbetoximetileno) trifenilfosforano (18,3 g, 52,5 mmol). Foi observado uma ligeira exotermia. Formou-se um precipitado enquanto a mistura foi agitada de um dia para o outro. A mistura reaccional foi diluída com Et20 (500 mL) e lavada com H3P04 1 M (2 x 100 mL) , KaíiCCq saturado (1 x 100 mL) , água (100 mL) e solução salina saturada (100 mL) . A fracção orgânica foi seca (MaSCd) e concentrada sob pressão reduzida. A resina foi passada através de um tampão de SiO? eluído com hexano:EtOAc 9:1. Após concentração in vacuo, foi 50 recuperado um rendimento puro quantitativo do produto como uma mistura 85:15 de isómeros geométricos (favorecendo o trans, rmn) . 0 material foi recristalizado a partir de hexano/EtOAc (rico em hexano) para recuperar 4,5 g do produto desejado como uma mistura 97:3 de isómeros (rmn). A solução mãe foi concentrada e recristalizada, como anteriormente, para recuperar 2,9 g adicionais (total de 7,4 g, 33 mrao 1, 65¾ í de rendimento). RMN ! C DC13) ► 7,93 (s, 1 H); 7,88-7, 83 (c , 4 H) ; 7, 67 (dd, 1 H, J = 1, 6, 8,6 Hz) ; 7,53-7,50 (c, 2 H); 1 5,55 (d, 1 H, J = 16 ,0 Hz); 4,30 (q, 2 H, j = : 7,1 Hz) ; 1,42 (t, 3 H, J = •n ' t .1 Hz) . 2 .1.2 Ácido trai 13-3-(2'-naft.il)- propei OÓÍCO (A2) A uma solução de éster AI (/ 1,24 < g, 18, ,8 m rnol) em TRF (75 ml 1) foi adicior :3GO LiOK-H20 (2 , 36 g ΓΓ f' , J 0, 3 mrr tol) em água (19 π •L) . A mistu ra inicialmente het1 erogén ea foi agitada vigo v-q-N samente de um. d.ia para 0 out.i :: Ο Θ tornou -se homogénea. A mi st ur a reaccional f oi acidificada c om HC( 1 conc entr; ado (pH * 2) C.\ Γ O! rmou-se um ] precipitado. a mi st U Γ8 hete: rogénea foi tran 3 r erida para um 1 u n 1 -í a e 3 e p a .1 ração e ext traí d a com, stOAc (3 : K. 150 m.L) . Os < sxtractos combin ados foram secos (MgSOí) e conc entrados ín vácuo, para recupera .r 0 á eido tarbe ixílico, como um s ól. ido branco (3, CO ÇJ; 9 8 "5 (j.0 0 O'"Í ΡΊ θ Π 0) . ΚΓ 4N (C :DC13) ► 7,97 (d, H, J = 15,7 Hz ); 7,90 (d, 1 Hí j = 1 .5,3 H: s); 1 ', 90-7,83 (c, 3 H) / 7,70 (dd, 1 H, J - ·;-,6, 8,6 H2 :); 7, 57-7,5 0 (c , 2 H) ; 6,5 8 (d, 1 H, J = 16,0 Hz) 1 , 51 2,1.3 trans- (4S) -3- [3f - (2" -Naftil) -propenoil) -4 -fen.í 1-2-oxazolidinona (A3)

Uma soluça r>. r\ ,o ácido carboxílico Kl (3,66 g, 18,0 mmol) e trietílamina (1,87 g, 2,56 roL, 18,5 mmol) em THF anidro (74 mL) foi arrefecida para -78 Foi adicionado cloreto de pivaloílo (2,35 g, 2,40 mL, 19,4 mmol) durante dois minutos, acompanhado pela formação de um precipitado branco. Após 10 minutos, o frasco foi colocado numa banho a 0 °C durante 10 minutos, após os quais o frasco foi arrefecido novamente para -78 °C durante 1,5 h. Num frasco em separado, a oxazolidiona derivada de L-fenilglicinol (3,31 g, 20,3 mmol) em THF anidro (74 mL) foi arrefecido para -78 °C. Foi adicionada uma solução de n-BuLi (1,6 M em hexano, 11,6 mL, 18,5 mmol) e a agitação continuou durante cerca de 1 h, acompanhada pela precipitação de oxozolidinona metalada a partir da solução de THF/hexano. O anidro misto foi adicionado via cânula à oxozolidinona metalada e a mistura reaccionai colocada num banho a 0 °C. Após 1 h, o banho foi removido e a mistura aquecida para a temperatura ambiente de um dia para o outro. A reaccáo foi rapidamente arrefecic ia com 50 mL de NI -] 4 C1. saturado . 0 THF for removido sob pressão reduzida e, 8.pO 3 a transfer ência para um funil de separação, a mistura foi extraída com Ci-pCl? (3 x 75 mL) . As fraeções orgânicas combinadas foram lavadas com NaOH 1 M (2 x 50 mL) , secas (FigSCq) e concentradas. O resíduo for branco (3,87 g, 11,2 8,05 (d, 1 H, J = mmoi, 61

Hz) ; 87-7,81 (c, 3 H) ; 7,76 (d d, 1 H, J = 1,5, ./ c· .T. cl i. um sólido RMN (CDC13) ► J = 15,4 Hz); fíz) ; / ; J8"' / f ' 52 (C,

Η}; /, 41 - 7,3 4 (c, 5 Η) ; 5,58 (dei, 1 4,76 (t, 1 fí, J = 8,7 Hz); 4,33 (dd, 1 H, J f J = 8,7, 3,9 Hz); 8,8, 3,9 Hz). 2.1.4 (3'R4S)-3-(3'~(2"-Naftil)-4'-pentenoil)-4-fenil-2- oxazolidinona (A4) A uma solução de Cul (3,96 g, 20,9 mmol) e TMEDA (2,66 g, 3,46 mL, 22,9 mmol) em THF anidro (92 mL) a -78 °C, foi adicionado brometo de vinilmagnésio (1,0 M em THF, 20,9 mL, 20,9 mmol). A mistura foi agitada durante 15 minutos. Num frasco em separado, foi adicionado cloreto de trimetilsililo (5,69 g, 6,64 mL, 52,2 mmol) a uma solução da imida não saturada A3 (3,87 g, 11,3 mmol) em THF anidro (42 mL) . Devido a insolubilidade da imida, o septo do frasco contendo o reagente cuprato foi removido e adicionada a imida em massa espessa, numa porção, enxaguada rapidamente com uma pequena quantidade de THF. A temperatura do banho foi aumentada para -30 °C e a agitação continuou durante 1 h. A mistura reaccional foi vertida em 250 mL de uma mistura 3:2 de NH4C1 saturado:NH4OH concentrado. As camadas foram separadas e a fraeção aquosa extraída com EtOAc (3 x 200 mL) . As fraeções orgânicas combinadas foram lavadas sequencialmente com NH4C1 saturado (1 x 100 mL) e água (1 x 100 mL) . A fraeção orgânica foi seca (MgS04) e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por passagem através de um tampão de Si02 eluído com hexano:EtOAc 4:1. O eluído foi concentrado in vácuo para recuperar um sólido branco (3,64 g, 9,81 mmol, 87% de rendimento). RMN (CDC13) ► 7,87-7,82 (c, 3 H) ; 7,72 (s, 1 H); 7,54-7,27 (c, 8 H); 6,11 (ddd, 1 H, J = 6,7, 10,4, 17,0 Hz); 5,34 (dd, 1 H, J = 8,6, 3, 5 Hz) ; 5, 10 (d, 1 H, J = 8,2 Hz); 5,08 (d, 1 H, J = 17,2 Hz); 4, 56 (t, 1 H, J = 8,8 Hz) ; 4,26 (dd, 1 H, J = 8,8, 3, 5 Hz); 4,16 (ddd, 1 H, 53 J = 8,1, 7,0, 6,9 Hz); 3,68 (dd, 1 H, J = 8,4, 16,5 Hz); 3,50 (dd, 1 H, J = 6,5, 16,5 Hz) . 2.1.5 (2'S3'R4S)3-(2'-Azido-3'-(2"-naftil)-4'-pentenoil)-4-fenil-2-oxazolidinona (A5)

Foi adicionada hexametildisilazida de potássio (0,5 M em tolueno, 25,5 mL, 12,8 mmol) , numa porção, a THF anidro (34 mL) a -78 °C. A imida A4 (3,64 g, 9,81 mmol) foi transformada numa massa espessa em THF (34 mL) e adicionada via cânula, enxaguada com THF (2 x 11 mL) para completar a transferência. Após 30 min, foi dissolvida trisilazida (4,40 g, 14,2 mmol) em THF (34 mL), arrefecida para -78 °C e adicionada via cânula. Trinta minutos depois, foi adicionado AcOH (1,41 g, 1,34 mL, 23,4 mmol) para arrefecer rapidamente a reacção. A mistura foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura foi particionada entre CH2CI2 (300 mL) e solução salina saturada diluída (150 mL) . As camadas foram separadas e a fase aquosa extraída com CH2CI2 (3 x 150 mL) . As fracções orgânicas combinadas foram secas (MgS04) e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash para recuperar o produto (3,41 g, 8,28 mmol, 84% de rendimento). RMN (CDC13) ► 7,' 85- 7,82 (c, 3 H); 7,72 (S, 1 H); 7,53- 7,47 (c, 2 H) ; 7, 42 (dd, 1 H, J = 1,7, 8,5 Hz) ; 7,37- -7,31 (c, 3 H); 7,18 -7 ,15 (c , 2 H); 6, 28 (ddd, 1 H, J = = 8,2, 10,2 , 17, 1 Hz); 5,63 (d, 1 H, J = 10,2 Hz ); 5, 37 (d, 1 H, J = 17 ,0 Hz); 5, , 34 (d, 1 H, J = 10,2 Hz) T 4,83 (dd, 1 H , J = 3,0, 8,3 Hz) ; 4,14 (t, 1 H, J = 7,2 Hz); 4 ,07 (dd, 1 H, J = 9 ,3, 17,9 Hz); 2 i, 94 (dd, 1 H, J = 3,0, 5, 8 Hz ); 3, 68 (t, , 1 H, J = 8,6 Hz) . 54 2.1.6 (2S3R)-2-Azido-3-(2'-naftil)-4-pentenoato de metilo (A6)

A uma solução da imida A5 (3,41 g, 8,28 mmol) em THF (62 mL) , foi adicionada água (21 mL), H202 a 35% (2,7 mL) e Li0H*H20 (695 mg, 16,6 mmol). Após 2 horas, foi adicionado Na2S03 (4,17 g, 33,1 mmol) como uma solução em água (41 mL). A mistura foi agitada durante 15 minutos e o THF removido sob pressão reduzida. A solução aquosa foi acidificada com HC1 e extraída com EtOAc (2 x 150 mL) . Os extractos combinados foram secos (MgS04) e concentrados sob pressão reduzida. O resíduo foi passado através de uma coluna com tampão de Si02 eluída com hexano:EtOAc 1:1, para recuperar, após concentração, um sólido branco que era, presumivelmente, uma mistura do ácido carboxílico e auxiliar quiral. A recristalização a partir de hexano/EtOAc proporcionou o auxiliar quiral como agulhas. A solução mãe foi concentrada e transferida para o passo de esterificação. O resíduo contendo o ácido carboxílico em bruto foi dissolvido em MeOH anidro (46 mL) e arrefecido para 0 °C. Foi adicionado cloreto de tionilo (1,18 g, 725 :L, 9,94 mmol) e, após 10 minutos, a mistura aquecida a refluxo durante 2 h. À mistura foi adicionada água (1,0 mL), agitada durante 10 minutos e os conteúdos do frasco concentrados sob pressão reduzida. O resíduo foi particionado entre EtOAc (150 mL) e solução salina saturada (100 mL) . As camadas foram separadas e a fracção orgânica foi seca (MgSOí) e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (hexano:EtOAc 19:1) para recuperar o éster metílico (1,54 g, 5,48 mmol, 66% de rendimento). RMN (CDCI3) ► 7,84-7, 80 (c, 3 H) ; 7,71 (s, 1 H) ; 7,50-7, 46 (c, 2 H) ; 7,39 (dd, 1 H, J = 1,8, 8,5 Hz); 6,23 (ddd, 1 H, J = 8,3, 10,9, 17,6 Hz); 5,30 (d, 1 H, J = 9,9 Hz); 5,28 55 (d, 1 H, J = 17,7 Hz); 4,22 (d, 1 H, J = 7,5 Hz); 4,06 (t, 1 H, J = 7,9 Hz). 2.1.7 Éster metílico de trans-3-(2'-naftil)-L-prolina (A7) O complexo de borano-sulfureto de metilo (2,0 M em THF, 6,57 mL, 13,1 mmol) foi diluído em THF anidro (26 mL) e arrefecido para 0 °C. Foi adicionado, cuidadosamente, ciclo-hexeno (2,16 g, 2,66 mL, 26,3 mmol) via seringa. Após 30 minutos, formou-se um precipitado branco. A agitação foi continuada durante três horas. Os conteúdos do frasco foram concentrados in vácuo. O reagente foi transformado em massa espessa em CH2C12 (36 mL) e arrefecido para 0 °C. Foi dissolvida azida de vinilo A6 (1,23 g, 4,38 mmol) em CH2C12 (9 mL) e adicionado via cânula. A mistura reaccional tornou-se amarelo pálido e foi evidente a libertação de gás. A mistura foi aquecida para a temperatura ambiente de um dia para o outro. Foi adicionado MeOH (26 mL) e agitado durante 15 minutos adicionais. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi recolhido em Et20 (25 mL) e extraído com HC1 0,1 M (5 x 25 mL) . Os extractos aquosos foram basificados com NaHC03 saturado e extraídos com CH2C12 (3 x 100 mL) . Os extractos orgânicos foram secos (MgS04) e concentrados in vacuo para recuperar o produto cliclizado juntamente com algum derivado diciclo-hexilo borano contaminante (974 mg, 3,82 mmol, 87% de rendimento do material em bruto). RMN (CDC13) ► 7, 84-7,78 (c, 3 H) ; 7,71 (s, 1 H) ; 7,49-7,41 (c, 3 H) ; 3,91 (d, 1 H, J = 6,9 Hz); 3,69 (s, 3 H) ; 3,63 (m, 1 H) , 3,48 (dd, 1 H, J = 8,2, 15,4 Hz); 3,27 (d, 1 H, J = 7,8 Hz); 3,25 (d, 1 H, J = 7,8 Hz); 2,33 (m, 1 H), 2,09 (m, 1 H) . 56 2.1.8 N-Fmoc-trans-3-(2'-naftil)-L-prolina (A8) São aquecidas 510 mg (2 mmol) de éster metílico (A7) em 12 mL de HC1 6 N a 100 °C durante 10 horas. A solução reaccional é concentrada sob pressão reduzida e o resíduo sólido é suspenso em 15 mL de acetona. A suspensão é ajustada para pH 9-10 utilizando solução de Na2C03 2 N. Depois, são lentamente adicionadas 742 mg (2,2 mmol) de Fmoc-O-succinimida . 0 pH é subsequentemente ajustado para 9-10 e a mistura é agitada à temperatura ambiente durante 4 horas e, depois, permanece à temperatura ambiente de um dia para o outro 0 pH é subsequentemente ajustado para 2 utilizando HC1 conc. e a mistura é misturada com acetato de etilo. São removidas por filtração com sucção 560 mg do produto precipitado. A fase aquosa é extraída três vezes com acetato de etilo e subsequentemente misturada com cloreto de metileno. Esta proporciona 185 mg adicionais do produto como um precipitado. Rendimento: 745 mg (80,4%). RMN (d6-DMSO) ► 7, 95-7,80 (c, 6 H) ; 7,68 (d, 1 H, J = 7,3 Hz); 7,60 (d, 1 H, J = 7,4 Hz); 7,50-7,34 (c, 6 H); 7,25 (m, 1 H), 4,39-4,15 (c, 4 H); 3,70-3,48 (c, 3 H); 2,29 (m, 1 H); 2,14 (m, 1 H). 57 2,2 N-Succínil-trans-3-(2/ -naltil)-L-prolil-L-asparagíníl-L-alaninil-L-valina-amida (34)

2,2.1 N-Frooc-trans-3-(2'naftil)-L-prolina-L-asparagina-L-a.], a.n i.n a j.j··· va. r i.π a amio.a ( ru. ) São dissolvidas 463,5 mg (1 mmol) de N-Fmoc-trans-3- (2' -naftil)-L-prolina (A8), 338 mg de cloridrato de H-Asn-Ala-Val-NHa (preparado de acordo com métodos convencionais de química peptídica) e 135 mg de HOBT em 2 0 mL de DMF. A 0 °C, são adicionados 0,13 mL de N-etilmor folrna e 220 mg de DCC, A mistura é agitada ΓΪ o p durante 1 hera e, d epois, à temperatura ambiente durante 3 hor as e é, subseguer ;r emente, deixada à temperatura ambiente de um dia para o outro, 0 precipitado é re movido por filtra. C3-0 ' com. V-b cuo el evado . 0 re; 3ÍGUC ) é de NafíCCç. A fase c ie pent; C· loção de H2í j / ti a C r 0 ; pre su cçâo e exaustiva i.m.ent pr oporei ona L 173 mg de; p ut i1izan do Na: >bUzL β concí ent: icção e a solução ê concentrada sob rticionado entre pentanol e solução 1 é lavada com solução de KHSOl e >itado é removido por filtração com i.turado com éter dietilico. Este luto, A fase de pentanol ê seca e concentrada. 0 resíduo é triturado duas vezes 58 éter dietílic com produto. o. r.,sre p r ορο rc i o n ou 257 ma adicionai: de

Rendimento: 730 mg (37,7%) 2.2 .2 t .rar 'S-3- !?' “-'d V, ... aftil) ·· •L-prol. ina-1 L-asparag ina -L- ai anina- L~ valina - ara i da í B 2) . íh _ O d O rei sol hidas 2 48 mg (0 , 332 m mol) de N-Fm .oc- r. r a ns -3- (2'- na ftil) - I-pr olu ..na-L-as spa ragma·- L-alan ina-1 Lr- vai ina- a mi da Bi em 5 mL de DMF . S d O d. O. X C :.i.o: nados C ),35 mi : (3, 32 rai mo 1) oe di ilamina a mi st ura é 30 -L. L-d'jÍd. 3. temoer a L-U -I a : 3mblente dura nte 1 5 m inutos. A mis tu ra é fiItrad a com s' ucção atra vés de ume l· c arr cada de cl arific ação > e concentra .da sob vácuo elev 'ado. 0 r es i duo s ólido é tr iturad 0 c :om éter di etílico e r eraov: ido por f i Itr aç ão com su cçâo,

Rendimento: 141 mg (81 %) . 2.2.3 terc-Butil succinato de metilo (B3).

Sob árgon, são suspensas 13,2 g (100 mmol) de succinato de monometilo em 500 mL de cloreto de metileno. Durante um período de 30 minutos, são adicionados, gota a gota, 12,9 mL (150 mmol) de cloreto de oxalilo e a mistura é subsequentemente agitada à temperatura ambiente durante 6 horas. Após, aproximadamente, 3,5 horas, forma-se uma solução límpida. São, subsequentemente, adicionados, gota a gota, 300 mL de terc-butanol. A mistura é depois deixada à temperatura ambiente durante 21 horas e a solução límpida é concentrada. O resíduo é dissolvido em acetato 59 de etilo e lavado com H20, solução de NaHC03 e Η20. A solução é seca com Na2SC>4 e concentrada.

Rendimento: 21,6 g (produto do tipo óleo em bruto). 2.2.4 Mono-terc-butil succinato (B4) São dissolvidas 9,4 g (50 mmol) de terc-butil succinato de metilo (B3) em 115 mL de 1,4-dioxano. Subsequentemente, são adicionados 110 mL de NaOH 0,5 N. A mistura é deixada à temperatura ambiente e o produto é removido por precipitação. A mistura é deixada à temperatura ambiente durante o fim-de-semana e é subsequentemente concentrada. A solução aquosa é extraída utilizando éter dietílico. A fase aquosa é arrefecida para 0 °C e acidificada para pH 4 utilizando H2SO4 2 N frio. A mistura é subsequentemente extraída cinco vezes, utilizando éter dietílico. As fases orgânicas são combinadas, lavadas com H20, secas com Na2SC>4 e concentradas.

Rendimento: 5,62 g de um óleo (64,5%). 2.2.5 N-terc-Butil-succinil-trans-3-(2'-naftil)-L-prolina-L-asparagina-L-alanina-L-valina-amida (B5) 262 mg (0,5 mmol) de trans-3-(2'-naftil)-L-prolina-L-asparagina-L-alanina-L-valina-amida (B2), 87,1 mg (0,5 mmol) de mono-terc-butil succinato (B4) e 67,5 mg de HOBt são dissolvidas em 5 mL de DMF. A 0 °C, são adicionadas 110 mg de DCC e a mistura é agitada a 0 °C durante 1 hora e, depois, à temperatura ambiente durante 2 horas e deixada à temperatura ambiente de um 60 dia para o outro. 0 precipitado é removido por filtração com sucção e o filtrado é concentrado sob vácuo elevado. 0 resíduo é triturado com solução de NaHCCb, removido por filtração com sucção, lavado com H20 e seco num excicador.

Rendimento: 169 mg (49,6%). 2.2.6 N-Succinil-trans-3-(2'-naftil)-L-prolina-L-aspara-gina-L-alanina-L-valina-amida (34) São dissolvidas 316 mg de IV-terc-butil-succinil-trans-3-(2'-naftil)-L-prolina-L-asparagina-L-alanina-L-valina-amida (B5) em 2 mL de ácido trifluoroacético com 90% de força e deixadas à temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura é subsequentemente filtrada através de uma camada de clarificação e concentrada. O resíduo é triturado com éter dietílico e removido por filtração com sucção. Este proporciona 159 mg do produto em bruto. Para a purificação, a substância é submetida a cromatografia por Sephadex® LH20, utilizando uma mistura de butanol/ácido acético glacial/água.

Rendimento: 27,5 mg (9,5%). m/z: 625,298949 (M+H)+ (espectro de massa de elevada resolução). 61

Dados de RMN do composto 34 (controlo):

Desvios químicos do composto 34 em DMSO a 300 K:

Ver fórmula acima 1JC trans cis trans cis But-1 - - 173,88 173,92 But-2 2,54/2,46 2,61/2,20 28,64 28,37 But-3 2,70/2,54 2,56/2,39 28,80 28,80 But-4 - - 170,67 170,22 Pro-a 4,39 4,68 66,18 65,46 Pro-C' - - 171,03 170,94 Pro-β 3, 55 3, 68 47,42 49, 45 Pro-γ 2,40/2,16 2,33/1,94 32,02 30,41 Pro-δ 3,81/3,72 3,59/3,53 46,12 45, 40 Nap-1 - - 138,79 139,55 Nap-2 7,76 7,78 125,14 124,79 Nap-2a - - 132,97 132,97 Nap-3 7, 87 7,87 127,66 127,66 Nap-4 7,49 7,49 126,03 126,03 Nap-5 7,48 7,48 125,63 125,63 Nap-6 7, 88 7,88 127,33 127,33 62 (continuação)

Ver fórmula acima 1JC trans cis Trans cis Nap-6a - - 131,98 131,98 Nap-7 7, 87 7,89 127,97 127,97 Nap-8 7,45 7,46 125,96 125,96 Asn-NH 8,31 8,50 - - Asn-a 4,44 4,64 50,13 49, 79 Asn-C' - - 170,58 170,29 Asn-β 2,64/2,46 2,57/2,45 36, 96 36,25 Asn-y-C' - - 171,73 171,44 Asn-5-NH2 7,41/6,93 7,33/6,93 - - Ala-NH 7, 74 8,02 - - Ala-a 4,19 4,27 48,71 48,46 Ala-C' - - 171,84 171,78 Ala-β 1,22 1,19 17,49 18,04 Val-NH 7,48 7,70 - - Val-a 4,04 4,08 57,69 57,57 Val-C' - - 172,77 172,73 Val-β 1, 97 1,97 30,08 30,29 Val-γ 0, 82 0,86 19,24 19,27 Val-γ' 0, 82 0,84 17,89 17, 97 Val-NH2 7,15/6,99 7,27/7,00 - - 63 2.3 N-Succinil-L-(2-naftil)alaninli-L-asparaginil-L-serinil-L-valinil-glicina-3-hidroxipropilamida (24)

2.3.1 Benziloxicarbonil-glicina-(3-propanol)amida (Cl) São dissolvidas 627 g (30 mmol) de Gly-OH, 2,45 mL de 3-amino-l-propanol e 4,05 g de HOBt em 60 mL de DMF. A 0 °C, são adicionadas 6,6 g de DCC. A mistura é agitada a 0 °C durante 1 hora e à temperatura ambiente durante 3 horas e deixada à temperatura ambiente de um dia para o outro. O precipitado é removido por filtração com sucção e o filtrado é concentrado sob vácuo elevado. O residuo é particionado entre acetato de etilo e solução de NaHC03. A fase orgânica é, depois, lavada com solução de NaHC03 e H20/NaCl, seca utilizando Na2S04 e concentrada. O residuo é triturado com éter dietilico.

Rendimento: 7,05 g (88,2%). 64 2.3.2 Benziloxicarbonil-glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C2) São dissolvidas 7 g (26,28 mmol) de benziloxicarbonil-glicina- (3-propanol) amida (Cl) em 60 mL de dioxano. A baixa temperatura (C02 liquido), são lentamente adicionados 6 mL de H2SO4. Subsequentemente, são adicionados 60 mL de isobutileno condensado. A mistura é agitada num autoclave à temperatura ambiente e uma pressão de azoto de, aproximadamente, 20 bar durante 3 dias. A mistura é depois misturada com éter dietilico e extraída três vezes com solução de Na2C03 2 N. A solução aquosa é lavada com éter dietilico. As fases orgânicas são combinadas, lavadas com água, secas com Na2SC>4 e concentradas.

Rendimento: 7,98 g (94,2%). 2.3.3 Cloridrato de glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C3) São dissolvidas 7,98 g (24,75 mmol) de benziloxicarbonil-glicina- (éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C2) em 80 mL de MeOH, misturadas com Pd/carbono e hidrogenadas num auto-triturador utilizando HC1 metanólico e H2. O catalisador é subsequentemente removido por filtração com sucção e o filtrado é concentrado. O resíduo é seco sob elevado vácuo.

Rendimento: 4,7 g (84,5%). 65 2.3.4

Benziloxicarbonil-L-valina-glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C4) São dissolvidas 5,13 g (20,43 mmol) de benziloxicarbonil-Val-OH, 4,59 g (20, 43 mmol) de cloridrato de glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C3) e 2,75 g de HOBt em 60 mL de DMF. A 0 °C, são adicionados 2,65 mL de N-etilmorfolina e 4,5 g de DCC. A mistura é agitada a 0 °C durante 1 hora e, depois, à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura é deixada à temperatura ambiente de um dia para o outro e, depois, concentrada sob elevado vácuo. O resíduo é particionado entre ácido acético glacial e solução de NaHC03. A fase de ácido acético glacial é depois lavada com solução de NaHC03, solução de KHS04 e H20/NaCl, seca utilizando Na2S04 e concentrada. O resíduo sólido é triturado com éter dietílico e removido por filtração com sucção.

Rendimento: 7,32 g (85%). 2.3.5 Cloridrato de L-valina-glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C5) São dissolvidas 7,29 g (17,3 mmol) de benziloxicarbonil-L-valina-glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C4) em 90 mL de MeOH, misturadas com Pd/carbono e hidrogenadas num auto-triturador utilizando HC1 metanólico. O catalisador é subsequentemente removido por filtração com sucção e o filtrado é concentrado. O resíduo (amorfo) é seco sob elevado vácuo, triturado com éter dietílico e removido por filtração com sucção. 66

Rendimento: 5,22 g (93,2%). 2.3.6 Benziloxicarbonil-L-serina(éster terc-butílico)-L-valina-glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C6) São dissolvidas 5,46 g (18,5 mmol) de Z-Ser(But)OH, 6 g (18,5 mmol) de cloridrato de L-valina-glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol) amida (C5) e 2,5 g de HOBt em 60 mL de DMF. A 0 °C, são adicionado 2,4 mL de N-etilmorfolina e 4,07 g de DCC. A mistura é agitada a 0 °C durante 1 hora e à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura é deixada à temperatura ambiente de um dia para o outro e, depois, concentrada sob elevado vácuo. O resíduo sólido é particionado entre ácido acético glacial e solução de NaHC03. A fase de ácido acético glacial é lavada com solução de NaHCCh, solução de KHS04 e H20/NaCl seca utilizando Na2S04, e concentrada. O resíduo é triturado com éter dietílico e removido por filtração com sucção.

Rendimento: 9,74 g (93,2%). 2.3.7 Cloridrato de L-Serina(éster terc-butílico)-L-valina-glicina- (éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C7) São dissolvidas 9,74 g (17,25 mmol) de benziloxicarbonil-L-serina(éster terc-butílico)-L-valina-glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C6) em, aproximadamente, 100 mL de MeOH, misturadas com Pd/carbono e hidrogenadas num auto-triturador utilizando HC1 metanólico. O catalisador é subsequentemente removido por filtração com sucção e o filtrado 67 é concentrado. 0 resíduo (amorfo) é seco sob elevado vácuo, subsequentemente triturado com éter dietílico e removido por filtração com sucção.

Rendimento: 8,02 g (99,6%). 2.3.8 Benziloxicarbonil-L-asparagina-L-serina(éster terc-butílico)-L-valina-glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C8) São dissolvidas 4,53 g (17 mmol) de Z-Asn-OH, 7,94 g de cloridrato de L-serina(éster terc-butílico)-L-valina-glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C7) e 2,3 g de HOBt em 60 mL de DMF. A 0 °C, são adicionados 2,21 mL de N-etilmorfolina e 3,74 g de DCC. A mistura é agitada a 0 °C durante 1 hora e à temperatura ambiente durante 3 horas e, depois, concentrada em elevado vácuo. O resíduo é particionado entre pentanol e solução de NaHCCt. A fase de pentanol é lavada com solução de NaHCCh, solução de KHS04 e H20/NaCl, seca sobre Na2S04 e removida por filtração com sucção e o filtrado é concentrado sob vácuo elevado. O residuo é triturado com éter dietílico, arrefecido e removido por filtração com sucção. O produto é seco num exsicador sobre P205.

Rendimento: 10,8 g (93,6%). 68 2.3.9 Cloridrato de L-asparagina-L-serina(éster terc-butílico)-L-valina-glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C9) São dissolvidas 10,8 g (15,9 mmol) de benziloxicarbonil-L-asparagina-L-serina(éster terc-butílico)-L-valina-glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C8) em, aproximadamente, 160 mL de MeOH quente, misturadas com Pd/carbono e hidrogenadas num auto-triturador utilizando HC1 metanólico. O catalisador é subsequentemente removido por filtração com sucção e o filtrado é concentrado. O resíduo amorfo é seco sob elevado vácuo, triturado com éter dietílico, arrefecido e removido por filtração com sucção.

Rendimento: 8,96 g (97%). 2.3.10 Benziloxicarbonil-L-2-naftilalanina-L-asparagina-L-serina(éster terc-butílico)-L-valina-glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (CIO) São dissolvidas 5,24 g (15 mmol) de benziloxicarbonil-2-Nal-OH, 8,72 g (15 mmol) de cloridrato de L-asparagina-L-serina (éster terc-butílico)-L-valina-glicina-(éster terc-butílico de 3-propanol)amida (C9) e 2,04 g de HOBt em 60 mL de DMF. A 0 °C, são adicionados 1,95 mL de N-etilmorfolina e 3,3 g de DCC. A mistura é agitada a 0 °C durante 1 hora e à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura é depois deixada à temperatura ambiente de um dia para o outro, diluída com DMF e ligeiramente aquecida. O precipitado é subsequentemente removido por filtração com sucção e o filtrado é concentrado sob elevado vácuo. O resíduo é triturado com solução de NaHCCh e removido por 69 filtração com sucção e é depois triturado com solução de KHSO4, removido por filtração com sucção, triturado com H20, removido por filtração com vácuo e lavado com H20 e seco num exsicador sobre P205.

Rendimento: 13,25 g (>99%). 2.3.11 Cloridrato de L-2-naftilalanina-L-asparagina-L-serina(éster de terc-butilo)-L-valina-glicina-(éster terc-butilico de 3-propanol)amida (Cll) São parcialmente dissolvidas 8,85 g (10,1 mmol) de benziloxicarbonil-L-2-naftilalanina-L-asparagina-L-serina(éster terc-butilico)-L-valina-glicina-(éster terc-butilico de 3-propanol) amida (CIO) em 270 mL de MeoH, misturadas com

Pd/carbono e hidrogenadas num auto-triturador, utilizando HC1 metanólico. A suspensão é diluida com DMF. Após, aproximadamente, 6 horas, a mistura é concentrada para metade do seu volume original. Todos os materiais são dissolvidos. A mistura é deixada à temperatura ambiente de um dia para o outro. O catalisador é subsequentemente removido por filtração com sucção e o filtrado é diluído com a mesma quantidade de MeOH, misturado com novo catalisador (Pd/carbono) e novamente hidrogenado no auto-triturador. Após 7 horas, a mistura é deixada á temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura é subsequentemente hidrogenada durante 4 horas adicionais, o catalisador removido por filtração com sucção e o filtrado é concentrado. O resíduo (amorfo) é seco sob elevado vácuo e subsequentemente triturado com éter dietílico e removido por filtração com sucção. 70

Rendimento: 7,56 g (96,2%). 2.3.12 N-terc-Butil-succinil-L-2-naftilalanina-L-aspara-gina-L-serina-L-valina-glicina-(3-propanol)amida (C12) São dissolvidas 523 mg (3 mmol) de cloridrato de L-2-naftilalanina-L-asparagina-L-serina (éster terc-butilico)-L- valina-glicina-(éster terc-butilico de 3-propanol)amida (Cll), 2,33 g de mono-terc-butil succinato (B4) e 405 mg de HOBt em 20 mL de DMF. A 0 °C, são adicionados 0,39 mL de N-etilmorfolina e 660 mg de DCC. A mistura é agitada a 0 °C durante 1 hora, à temperatura ambiente durante 2 horas e, depois, deixada à temperatura ambiente de um dia para 0 outro. A mistura é concentrada sob elevado vácuo, o residuo sólido é triturado com solução de NaHC03 e removido por filtração com sucção. O produto é subsequentemente triturado com solução de KHSO4 e removido por filtração com sucção, lavado com H20 e seco num exsicador sobre P2O5.

Rendimento: 3,04 g (produto em bruto). 2.3.13 N-Succinil-L-2-naftilalanina-L-asparagina-L-serina-L-valina-glicina-(3-propanol)amida (24) São dissolvidas 3 g (produto em bruto) de N-terc-butil-succinil-L-2-naftilalanina-L-asparagina-L-serina-L-valina-glicina-(3-propanol) amida (C12) em 30 mL de ácido trifluoroacético com 90% de força e deixadas à temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura é subsequentemente concentrada e o residuo é triturado com éter dietílico e 71 removido por filtração com sucção. Este proporciona 2,6 g de produto em bruto. Para a purificação, são dissolvidas 250 mg de produto em bruto em ácido acético glacial quente e submetidas a cromatografia numa Sephadex LH20, utilizando uma mistura de butanol/ácido acético glacial/água.

Rendimento: 103 mg m/z: 730.341246 (M+H)+ (espectro de massa de alta resolução).

Dados de RMN do composto 24:

Desvios químicos do composto 24 em DMSO a 300 K:

Ver fórmula acima ^ ' o Ό —1 But-1 - 173,71 But-2 2,29 28,99 But-3 2,32/2,26 29, 91 But-4 - 171,15 Nap-NH 8,19 - Nap-a 4,60 53, 92 Nap-C' - 171,20 Nap-β 3,19/2,91 37,56 72 (continuação)

Ver fórmula acima 1JC Nap-1 - 135,62 Nap-2 7,42 127,85 Nap-3 7,80 127,30 Nap-3 a - 131,75 Nap-4 7,85 127,38 Nap-5 7,44 125,31 Nap-6 7,47 125,83 Nap-7 7,82 127,38 Nap-7a - 132,91 Nap-8 7,73 127,38 Asn-NH 8,35 - Asn-a 4,60 49, 73 Asn-C' - 170,92 Asn-β 2,60/2,49 37,03 Asn-y-C' - 171,73 Asn-5-NH2 7,44/6,99 - Ser-NH 7,89 - Ser-a 4,33 55,15 Ser-C' - 170,13 Ser-β 3,66/3,56 61,52 Ser-OH 4,93 - Val-NH 7,82 - Val-a 4,10 58,37 Val-C' - 171,02 Val-β 2,04 29, 91 Val-y 0,86 19,17 Val-y' 0,86 18,11 Gly-NH 8,06 - 73 (continuação)

Ver fórmula acima U- 1JC Gly-a 3,65 41,97 Gly-C' - 168,45 Xxx-NH 7,63 - Xxx-2' 3,10 35,78 Xxx-3' 1,54 32,24 Xxx-4' 3,40 58,33 Xxx-4'-OH 4,40 - 3. Inibição da interacção laminina/nidogénio e actividade biológica

Excepto quando indicado em contrário, os produtos químicos utilizados foram adquirido da Merck (Darmstadt), Sigma (Munique) ou Riedel de Haên (Seelze). 0 isolamento da laminina Pl de placenta humana, nidogénio humano de células HEK-293 transfectadas e laminina de murganho γΐ III 3-5 de células HEK-293 é descrito no documento WO 98/31709. 74

Exemplo 3.1 Ensaios de inibição - inibição da ligação laminina/nidogénio com os derivados peptidicos identificados. 3.1.1. Ensaio de rastreio HTS (variante altamente sensivel do ensaio):

Ensaio de Fluorescência Resolvida no Tempo

Revestimento dos tubos do teste

As placas de microtitulação (por exemplo, FluoroNunc®) foram revestidas com 75 pL de uma solução de laminina PI 0,1 pg/mL (em 0,159 g de Na2C03, 0,293 g de NaHC03, 0,02 g de NaN3/litro, pH 9,2) à temperatura ambiente durante 1 hora. A solução foi depois descartada e os locais de ligação livres foram bloqueados por incubação com BSA a 0,5% (em 7,9 g de NaCl, 1,2 g de Na2HPC>4, 0,31 g de KC1, 0,23 g de NaERPCg, Tween 20/litro a 0,04%, pH 7,2) à temperatura ambiente durante 0,5 hora. A conclusão da reacção de bloqueio foi seguida por decantação da solução e lavagem, uma vez, com 250 pL de tampão de lavagem (PBS/Tween a 0,04%).

Inibição sequencial

Em paralelo com o revestimento, foi efectuada uma pré-incubação de 85-100 pL de uma solução de nidogénio 0,25 nM (nidogénio humano produzido de modo recombinante) com inibidor ou padrão num vaso reaccional em separado (1 hora à temperatura 75 ambiente em 7,9 g de NaCl, 1,2 g de Na2HP04, 0,31 g de KC1, 0,23 g de NaH2P04, Tween 20/litro a 0,04%, BSA a 0,5%, pH 7,2).

Foram transferidos 75 pL da pré-incubação (nidogénio + inibidor ou padrão) para os poços revestidos da placa de microtitulação e incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. Isto foi seguido por lavagem, duas vezes, com PBS/Tween a 0,04%. A detecção do nidogénio ligado foi efectuada por incubação (à temperatura ambiente) durante 1 hora com 75 pL de uma preparação de anticorpo especifico obtida a partir de gemas de ovos de uma galinha imunizada com nidogénio humano. A fracção IgY foi utilizada numa diluição de 1:500 em PBS/Tween a 0,04%. O complexo de nidogénio e anticorpos ligados especificamente foi, após lavagem, duas vezes, com PBS/Tween a 0,04%, detectado por adição de IgY-biotina anti-galinha (75 pL de uma diluição 1:2500; Promega, Madison, WI 53711, 608-274-4330) . Um tempo de incubação de 1 hora e duas lavagens com PBS/Tween a 0,04% foram seguidas, para este objectivo, por incubação com estreptavidina-európio (Wallac; 1 hora à temperatura ambiente) e duas lavagens com PBS/Tween a 0,04%. Foi finalmente possível, após adição de 100 pL de solução de potenciação (Wallac) e agitação durante 5 minutos, determinar um sinal de fluorescência num contador Victor multilabel, utilizando o protocolo do európio. Foi obtida a relação entre a quantidade de nidogénio ligada nas soluções com o inibidor e a de nidogénio sem o inibidor adicionado. 76 3.1.2. Ensaio de três dias de equilíbrio

Foram investigados inibidores seleccionados para a actividade inibitória nesta variante do ensaio. 0 ensaio é descrito na patente US número 5493008. A seguinte tabela compara valores IC50 de substâncias seleccionadas com os resultados do ensaio de rastreio HTS. É evidente que o ensaio de 3 dias proporciona valores determinados ligeiramente mais baixos e, como esperado, é mais sensível que o ensaio de rastreio. No entanto, é também evidente da comparação que as estruturas inibitórias podem ser identificadas, com segurança, com o ensaio de rastreio desenvolvidos pelos requerentes.

Tabela 2: Caracterização de inibidores específicos da associação laminina/nidogénio: valores IC50 (μΜ) nas várias variantes do ensaio

Estrutura Ensaio Ensaio de 3 dias de HTS equilíbrio NIDPNAV 3,9 1,2 DPNAV 7,7 5,0 Composto 24 0,36 0,09 Composto 31 (controlo) 0,19 0,085

Exemplo 3.2 (teórico)

Teste da actividade biológica dos derivados peptídicos 77

Para testar a actividade biológica dos derivados peptidicos podem ser utilizados vários modelos que são descritos em detalhe na literatura.

Alguns modelos representativos são mencionados abaixo:

Formation of tubuli in cultures of embryonic kidneys.

Grobstein, C.; (1956) Exp. Cell Res. 10: 424-440.

Ekblom, P. et al. (1994) Development 120: 2003-2014 Branching morphology in embryonic lungs.

Ekblom, P. et al. (1994) Development 120: 2003-2014 Branching morphology in embryonic salivary glands.

Grobstein, C. (1953) J. Exp. Zool.124: 383-413 Kadoya, Y. et al. (1997) Development 124: 683-691 Basement membrane assembly in a organotypic skin culture.

Smola, H.; Stark, H.-J.; Thiekõtter. G.; Mirancea, N.; Krieg, T.; Fusenig, N.E. (1998) Exp. Cell Res. 239: 399-410 Reconstitution of hydra from disintegrated cells.

Yang, Y.G.; Mayura, K.; Spainhour, C.B.; Edwards Jr., J.F.; Phillips, T.D. (1993) Toxicology 85: 179-198

Thickening of basement membranes in hydra after culturing at increased glucose concentration.

Zhang, X./ Huff, J.K.; Hudson, B.G.; Sarras Jr.; M.P. (1990) Diabetologia 33: 704-707

Todos os tipos de ensaios quantitativos de angiogénese resumidos num artigo de revisão por Jain, R.K. et al. em Nature Medicine (1997) Vol. 3, No. 11, por exemplo:

Induction of Haemangiomes in mice by implantation of cells from spontaneous hemangioendotheliomes. 78 0'Reilly, M.S.; Brem, M.S.; Folkman, J. (1995) J. Pediatr. Surg. 30:2; 325-329 Growth of micro-vessels in a serum-free culture of rat aorta.

Nicosia, R.F.; Ottinetti, A. (1990) Lab. Invest Vol.63, No. 1, 115-122

Formation of capillaries of endothelic cells on micro-carriers after imbedding into a fibrin gel.

Nehls, V.; Drenckhahn, D. (1995) Microvascular Research 50: 311-322 .

Lisboa, 11 de Setembro de 2007 79

Claims (66)

1. REIVINDICAÇÕES Composto de fórmula I

   ÀQ GiU RI é um grupo de uma das seguintes fórmulas

   em Gue R4 significa -NH? --NHR, -NHR1, OU

   CH, ( CH,

   CH3)k e R5 significa -(CtRhCOOA, - (CH2)iCONH2, -(CH2)iNH2 ou - (CH2h-SG3H, NH

   n

   NH2 e X é um grupo de uma das seguintes fórmulas

   2 em que Y significa 0, S, -N (A) ---(30-- ou — (CH2) tf D significa (CH2) r, 0, S, NH, NE, (CH2) r-0, (CH2) r-S, (CH2) r-NH ou (CH2) rNR e R2 significa -A, -E-OH, -E-C00H ou -E-C0NH2, em que E significa uma cadeia alquiloCt-Cin linear ou ramificada que é não substituída ou substituída por -A,- (CH2)m-0H, - (CH2)m-C00H, -(CH2)m-C(0)NA2 ou por um grupo cicloalquiloCi-Cio, ou E significa um cicloalquiloC5-Cio que é não substituído ou substituído por -A, - (CH2)m-0H, - (CH2)m-C00H, -(CH2)-C(0)NA2 ou por um grupo cicloalquiloCR-Cio, e em que R7 significa um grupo alquiloCi-Cio linear ou ou Ri significa ramificado que é não substituído ou substituído por -A, - (CH2) r„-0Hf (CH2);TI-C00fí, (CH2)nT-C (0)NA2 ou por um grupo cicloalquiloCs-C.io, um grupo cicloalquiloCs-Cio que é não substituído ou substituído por -A, -(CH2)m-0H, -(CHah-a-COOH, 3 por um grupo -(CH2)m-C(0)NA2 ou cicloalquiloCR-Cio, e R significa cí cl oalquiioCR-CiOf Ret ou Ar que são substituídos, opcionalmei ite, por alquílCi-Ce-Ret, alquilCi-Cg" - h ν' -0-a l.quí l.Ci—Ce—B et, -0-alquí l.Ci -Cb- Ar, Ret ou por Ar, e :;m que Ret significa Ar sicmifi anel Cl· 1. omático ou nãc : ar •otnát ico com 5 a.' t- C; 10 π cerniu - o s, monc c .1. c .1 í co ou b.i .cm. r> " - CO, cor ítendí λ ! ou 9 h0Í. 0ΓΟ át omo 3 l.C j 1 } η CJ QIj dif eren tes / i '"Wp'"n me cobros d.0 refe rido an e 1, sel.ecc io na d os d .o g· CUpO cons isti ndo de azc ;tc ix.ígé nío e enxo.fr Θ O, Li e é substí tu ido Γ\ ' - não subs titu ídO por um ou mai s g o p., b s b i •N ν' ,-Ά p? :ilo ou. carbox .1.1 0 G , em. que um an< n | ar omá.t ICO, moni ocíc. 1 i co ou bícícl ic r- com 0 3 .10 memb ros que é sub st: itu ido OU não subs titu ido por um ou ma is grupos hidroxílo ou carboxilo, e Z significa (C[-í2) m, 0, S, NH, NR, N-C (0) -R ou NSCqR, A significa H ou alquiloCt-Cg, e são números inteiros desde 0 a 3, 4 n e k P q são números inteiros desde 1 a 2, é um número inteiro desde 0 a 1, e é um número inteiro desde 1 a 3 em todas as suas formas estereoisoméricas e suas misturas em todas as proporções, incluindo todos os seu sais fisiologicamente toleráveis.
2. 2. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 1, em que n é 1.
3. 3. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 1 ou 2, em que R no grupo X significa Het.
4. 4. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 3, em que Het significa
5. 5. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 3, em que Het significa 5 ί Ν
6. 6. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 3, em que Het significa
7. 7. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 3, em que Het significa
8. 8. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 3, em que Het significa

   6
9. 9. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 1 ou 2, em que R no grupo X significa Ar que é opcionalmente substituído por -alquilCi-C6-Ar, -O-alquilCi-Cê-Ar ou por Ar.
10. 10. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 9, em que R no grupo X significa Ar.
11. 11. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 10, em que Ar significa
12. 12. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 10, em que Ar significa
13. 13. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 10, em que Ar significa

    7
14. 14. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 10, em que Ar significa
15. 15. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 9, em que R no grupo X significa
16. 16. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 9, em que R no grupo X significa
17. 17. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 1 a 16, em que X é um grupo com a seguinte fórmula
18. 18. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 17, em que Y significa -(CH2)r-.
19. 19. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 18, em que r é 1.
20. 20. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 18, em que r é 0.
21. 21. Composto de fórmula I, como reivindicado nas reivindicações 17 a 20, em que k é 2.
22. 22. Composto de fórmula I, como reivindicado nas reivindicações 17 a 20, em que k é 1.
23. 23. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 1 a 16, em que X é um grupo com a seguinte fórmula
24. 24. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 23, em que D significa -(CH2)r-· 9
25. 25. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 23, em que r é 0.
26. 26. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 23, em que r é 1.
27. 27. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 1 a 26, em que RI é um grupo com a seguinte fórmula

    R5
28. 28. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 27, em que Z significa (CH2)m-
29. 29. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 28, em que m é 0.
30. 30. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 23, em que m é 1.
31. 31. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 27 a 30, em que R5 significa - (CH2)í-COOA.
32. 32. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 31, em que A significa H. 10 33. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das 34. 35. 36. 37. 38. 39. reivindicações 27 a 30, em que R5 significa -(CH2) i-COONH2. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 30 a 33, em que 1 é 0. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 27 a 34, em que R4 significa -NH2. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 27 a 34, em que R4 significa -A. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 36, em que A significa H. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 27 a 34, em que R4 significa -NHR1. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 38, em que -NHR1 significa O

    (CH2)2 R5 r Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 39, em que R5 significa 11 ΝΗ / i κι N H ΝΗ,
33. 41. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 39, em que R5 significa O

    H
34. 42. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 39, em que R5 significa -NH2.
35. 43. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 1 a 26, em que RI é um grupo com a seguinte fórmula O
36. 44. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 43, em que Z significa -(CH2)m--
37. 45. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 44, em que m é 1.
38. 46. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 43 a 45, em que R4 significa -NH2. 12
39. 47. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 43 a 46, em que R5 significa - (CH2) í-COOA.
40. 48. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 47, em que 1 é 0.
41. 49. Composto de fórmula I, como reivindicado nas reivindicações 47 ou 48, em que A significa H.
42. 50. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 1 a 26, em que RI é um grupo com a seguinte fórmula
43. 51. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 50, em que R5 significa -(CH2) í-COOA.
44. 52. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 51, em que 1 é 0 e A significa H.
45. 53. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 1 a 52, em que R2 significa A.
46. 54. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 53, em que R2 significa -CH3. 13
47. 55. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 1 a 52, em que R2 significa -E-COOH.
48. 56. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 55, em que R2 significa -CH2-COOH.
49. 57. Composto de fórmula I, como reivindicado numa ou mais das reivindicações 1 a 52, em que R2 significa -E-OH. co LO Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 57, em que R2 ! significa -CH2-OH. 59. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 1, em que R7 é um grupo alquiloCi-Cio ramificado • 60. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 1, em que R7 significa -CH(CH3)2. 61. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 1, em que R7 significa -C(CH2)3. 62. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 1, em que R7 significa -CH(CH3)CH2-CH3. 63. Composto de fórmula I, como reivindicado na reivindicação 1, em que R7 significa -CH2CH(CW3)2.
50. 64. Composto de fórmula I, como reivindicado numa das reivindicações 59 a 63, em que q é 2. 14
51. 65. Composição farmacêutica contendo, pelo menos, um composto de acordo com uma ou mais das reivindicações anteriores e/ou os seus sais fisiologicamente toleráveis.
52. 66. Composto de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 64 e/ou os seus sais fisiologicamente toleráveis para utilização como um medicamento.
53. 67. Utilização de um composto, de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 64, e/ou os seus sais fisiologicamente toleráveis, para preparar um fármaco para o tratamento de uma doença que está relacionada com uma síntese aumentada ou indesejada de membranas basais.
54. 68. Utilização como reivindicado na reivindicação 67, em que a doença são complicações secundárias da diabetes mellitus.
55. 69. Utilização como reivindicado na reivindicação 67, em que a doença é uma fibrose acompanhada por uma síntese aumentada de membranas basais ou os seus componentes.
56. 70. Utilização como reivindicado na reivindicação 69, em que a doença é uma fibrose do fígado.
57. 71. Utilização como reivindicado na reivindicação 67, em que a doença é aterosclerose.
58. 72. Utilização como reivindicado na reivindicação 67, em que a doença é cancro.
59. 73. Utilização como reivindicado na reivindicação 67, em que a doença é retinopatia diabética. 15
60. 74. Utilização como reivindicado na reivindicação 67, em que a doença é fibroplasia retrolental.
61. 75. Utilização como reivindicado na reivindicação 67, em que a doença está relacionada com um forte componente inflamatório.
62. 76. Utilização como reivindicado na reivindicação 75, em que a doença é artrite reumatóide.
63. 77. Utilização como reivindicado na reivindicação 75, em que a doença é osteoartrite.
64. 78. Utilização como reivindicado na reivindicação 75, em que a doença é vasculite.
65. 79. Utilização como reivindicado na reivindicação 67, em que a doença está relacionada com hemangiomas.
66. 80. Utilização como reivindicado na reivindicação 67, em que a doença é psoriase. Lisboa, 11 de Setembro de 2007 16