PL208356B1

PL208356B1 - Pochodne peptydowe, środek farmaceutyczny, zastosowanie pochodnych peptydowych do wytwarzania leków i sposób identyfikacji związku, który hamuje oddziaływanie pomiędzy lamininą i nidogenem

Info

Publication number: PL208356B1
Application number: PL385359A
Authority: PL
Inventors: Hans Ulrich Stilz; Martin Gerl; Gary A. Flynn; Magda Stankova; Robert A. Binnie
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 2000-02-19
Publication date: 2011-04-29
Also published as: EP2239270A2; DK1157040T3; RU2262509C2; DE60036087D1; TR200102560T2; CZ20013063A3; EP1157040B1; PL202887B1; EP1070727A1; AU3157700A; PT1157040E; CA2363958C; DE60044832D1; CN1237075C; JP2002539092A; CN1775801A; US6365572B1; EP2239270A3; AU779779B2; DE60036087T2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są pochodne peptydowe o małej masie cząsteczkowej, zdolne do działania jako inhibitory oddziaływania pomiędzy lamininą i nidogenem (oddziaływania laminina/nidogen), środek farmaceutyczny wytworzony z ich użyciem, zastosowanie pochodnych peptydowych do wytwarzania leków i sposób identyfikacji związku, który hamuje oddziaływanie pomiędzy lamininą i nidogenem.

Połączenie lamininy (glikoproteiny o 800 kDa) i nidogenu (glikoproteiny o 160 kDa) uważa się za kluczowy biocząsteczkowy mechanizm w syntezie i stabilizacji błon podstawnych (Mayer U. i Timpl R. (1994) w: Extracellular Matrix Assembly and Structure (P. D. Yurchenco, D. Birk i R. P. Mecham, red.) str. 389-416, Academic Press, Orlando, FL). Zdolność nidogenu do tworzenia trójskładnikowych kompleksów z wszystkimi głównymi składnikami błony podstawnej, takimi jak np. izoformy lamininy zawierające γ1 (nomenklatura patrz: Burgeson R. E.; Chiquet M.; Deutzmann R.; Ekblom P.; Engel J.; Kleinmann H.; Martin G. R.; Meneguzzi G.; Paulsson M.; Sanes J.; Timpl R.; Tryggvasson K.; Yamada Y.; Yurchenco P.D. (1994) Matrix Biology 14; 209-211), kolagen IV, perlekan i fibulina, oraz z asocjacyjnymi strukturami każdego z tych składników, co oznacza, że spełnia on rolę łącznika, który łączy ze sobą, organizuje przestrzennie i stabilizuje niezależne makrostruktury (Fox J. W.; Mayer U.; Nischt R.; Aumailley M.; Reinhardt D.; Wiedemann H.; Mann K.; Timpl R.; Krieg T.; Engel J.; i Chu M. -L. (1991) EMBO J. 10, 3137-3146).

Błony podstawne stanowią wysoce wyspecjalizowane struktury pozakomórkowe, którym przypisuje się ważne funkcje w regulowaniu działania komórek i tkanek, struktury tkanek, oddziaływań tkanek, wzrostu komórek, przemian komórek, migracji komórek i tkankowo specyficznej ekspresji genu (Adams J. C. i Watt F. M. (1993) Development 117, 1183-1198). Doświadczenia z poliklonalnymi przeciwciałami przeciw lamininie wyraźnie potwierdziły centralną funkcję oddziaływania laminina/nidogen w syntezie funkcjonalnej błony podstawnej. Opisane przeciwciała otrzymano drogą immunizacji królików lamininą P1 lub rekombinacyjnie wytworzoną, wiążącą nidogen domeną lamininy (γ1 III 3-5). Przeciwciała zatężone drogą chromatografii powinowactwa na matrycach z lamininy P1 lub lamininy γ1 III 3-5 wykazały całkowite hamowanie połączenia laminina/nidogen w testach hamowania. Jednakże jest ono oparte na sferycznej blokadzie dostępu nidogenu do lamininy przez przeciwciała, których obszary wiązania są zlokalizowane w sąsiedztwie wiążących nidogen sekwencji lamininy (Mayer U.; Nischt R.; Poschl E.; Mann K.; Fukuda K.; Gerl M.; Yamada Y.; Timpl R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885).

W hodowlach embrionalnych narządów opisane przeciwciała hamują rozwój kanalików nerkowych, powstawanie pęcherzyków płucnych i morfogenezę embrionalnego gruczołu ślinowego. Te trzy modele są reprezentatywne dla programów ontogenezy, które zależą od niezakłóconej syntezy nowej błony podstawnej (Ekblom P.; Ekblom M.; Fecker L.; Klein G.; Zhang H.-Y.; Kadoya Y.; Chu M. -L; Mayer U.; Timpl R. (1994) Development 120; 2003 - 2014).

Przeciwciała skierowane przeciw obszarowi sekwencji łańcucha γ1 lamininy, niezbędnemu w wiązaniu nidogenu, mogą również hamować połączenie laminina/nidogen. Hamowanie to jest jednak konkurencyjne, w przeciwieństwie do przeciwciał przeciw lamininie opisanych powyżej, gdyż konkurują one bezpośrednio z nidogenem w stosunku o miejsce wiązania na lamininie (WO 98/31709).

Monoklonalne przeciwciało z podklasy IgM (anty-laminina P1 A6/2/4 - DSM ACC2327; patrz WO 98/31709) hamuje oddziaływanie laminina/nidogen in vitro, przy czym wartość IC50 wynosi 30 nM. Podobnie jak opisany powyżej preparat poliklonalnego przeciwciała przeciw lamininie, zapobiega ono morfogenezie embrionalnego gruczołu ślinowego w hodowli narządów. Potwierdza to specyficzność oddziaływania laminina/nidogen oraz znaczenie modułu LE-4 i zidentyfikowanego obszaru sekwencji w domenie γ1 III 4 lamininy w tym oddziaływaniu.

Wiążąca nidogen domena lamininy została jednoznacznie zidentyfikowana i scharakteryzowana pod względem położenia, sekwencji i struktury przestrzennej (metodami rentgenografii strukturalnej i NMR) (Gerl M.; Mann K.; Aumailley M.; Timpl R. (1991) Eur. J. Biochem. 202; 167-174. Mayer U.; Nischt R.; Poschl E.; Mann K.; Fukuda K.; Gerl M.; Yamada Y.; Timpl, R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885. Baumgartner R.; Czisch M.; Mayer U.; Poschl E.; Huber R.; Timpl R.; Holak T.A. (1996)

J. Mol. Biol. 257; 658-668. Stetefeld J.; Mayer U.; Timpl R.; Huber R. (1996) J. Mol. Biol. 257; 644-657). Jest ona zlokalizowana w „module LE (podobnym do naskórkowego czynnika wzrostu typu lamininy) krótkiego łańcucha γ1 lamininy, w domenie γ1 III 4. „Moduły LE stanowią motywy strukturalne o 50-60 resztach aminokwasów, o złożonym układzie składania, analogicznym do EGF, z 4 mostPL 208 356 B1 kami disulfidowymi (Bairoch, A.; (1995) Nomenclature of extracellular domains. The SWISS-PROT Protein sequence data bank. release 310. Engel, J. (1989) FEBS Letters 251; 1-7).

Wysokie powinowactwo wiązania nidogenu z dopełniającą domeną lamininy wykryto dla lamininy P1 z nowotworu EHS myszy, lamininy 2 i lamininy 4 z ludzkiego łożyska oraz lamininy z muszki owocowej. Przyczyną tej rozciągającej się na różne gatunki specyficzności wiązania jest wyjątkowo duża identyczność sekwencji obecnych w domenie γ1 III 4 zbadanych gatunków. Wynosi ona 97% dla domeny ludzkiej i mysiej, 61% dla myszy i muszki owocowej oraz, co jest zaskakujące, 51% dla myszy i Caenorhabditis elegans, przy uwzglę dnieniu cał ej domeny (Pikkarinen T.; Kallunki T.; Tryggvasson

K. (1987) J. Biol. Chem. 263; 6751-6758. Chi H.-C; Hui C.-F. (1989) J. Biol. Chem. 264; 1543-1550.

Wilson R. i in. (1994) Nature 368: 32-38. Poschl E.; Mayer U.; Stetefeld J.; Baumgartner R.; Holak T.A.; Huber R.; Timpl R. (1996) EMBO J. 15: 5154-5159).

Poza zależnością wiązania nidogenu od nienaruszonej trójwymiarowej struktury, jednoznacznie zidentyfikowano regiony sekwencji zlokalizowane w stabilizowanych wiązaniami S-S pętlach a i c domeny γ1 III 4. Zidentyfikowano 5 podstawowych aminokwasów, cztery zlokalizowane wewnątrz złożonej z 7 aminokwasów sekcji w pętli a, oraz boczny łańcuch tyrozyny w pętli c (Mann K.; Deutzmann R.; Timpl R. (1988) Eur. J. Biochem. 178; 71-80).

Syntetyczne peptydy, które mogą pochodzić z odpowiednich regionów domeny γ1 III 4 i są zdolne do całkowitego hamowania wiązania laminina/nidogen w specyficznych testach wiązania, ujawnili

J. W. Fox i R. Timpl (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5493008).

Sądzi się, że wiązanie z wysokim powinowactwem z wiążącym lamininę miejscem w nidogenie wymaga oddziaływania z tyrozyną lub histydyną z pętli (pętli c) sąsiadującą z rzeczywistą sekwencją wiązania. Postulowano, że to oddziaływanie aromatyczne stanowi wstępny warunek hamowania w zakresie wartości IC50 < 500 nM, na podstawie trójwymiarowej struktury domeny γ1 III 3-5 lamininy oraz zależności struktura/działanie, opisanych w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5493008. Nie jest jednak jasne, czy pętla c oddziaływuje bezpośrednio z nidogenem, czy przyczynia się ona do stabilizacji odpowiedniej przestrzennej struktury regionu sekwencji NIDPNAV (Poschl, E.; Fox J.W.; Block D.; Mayer U.; Timpl R. (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. Baumgartner R.; Czisch M.; Mayer U.; Poschl E.; Huber R.; Timpl R.; Holak T.A. (1996) J. Mol. Biol. 257; 658-668. Stetefeld J.; Mayer U.; Timpl R.; Huber R. (1996) J. Mol. Biol. 257; 644-657).

Na oddziaływanie laminina/nidogen wpływa silny składnik konformacyjny (Mayer U.; Nischt R.; Poschl E.; Mann K.; Fukuda K.; Gerl M.; Yamada Y.; Timpl R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885. Mann

K. ; Deutzmann R.; Timpl R. (1988) Eur. J. Biochem. 178; 71-80). Syntetyczne peptydy, które mogą pochodzić od miejsca wiązania nidogenu w lamininie, nie są zdolne do tworzenia układu połączeń disulfidowych, występującego w modułach LE, ale ich aktywność w testach hamowania jest około 400 -10000 razy słabsza w porównaniu z nienaruszoną lamininą P1 lub lamininą γ1 III 3-5 (Poschl E.; Fox J.W.; Block D.; Mayer U.; Timpl R. (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. J.W. Fox i R. Timpl; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5493008). Ten spadek aktywności nie jest czymś niezwykłym, gdyż wiadomo, że peptydy mogą przyjmować niezliczoną ilość różnych konformacji w roztworze wodnym, a tylko pewien procent peptydów występuje w biologicznie czynnej konformacji. Najaktywniejszy z dotychczas opisanych peptydów (IC50 22 nM) ma masę cząsteczkową około 2700 Da ( = około 50% modułu LE). Zawiera on nienaruszoną pętlę S-S, która prawdopodobnie stabilizuje strukturę kluczowego obszaru sekwencji NIDPNAV (Poschl E.; Fox J.W.; Block D.; Mayer U.; Timpl R. (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. J.W. Fox i R. Timpl. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5493008).

Wzór chemiczny sekwencji NIDPNAV (Asn-Ile-Asp-Pro-Asn-Ala-Val) jest następujący:

Inhibitory oddziaływania laminina/nidogen powinny nadawać się do wytwarzania leków stosowanych w chorobach, które są związane ze zwiększoną lub niepożądaną syntezą błon podstawnych.

PL 208 356 B1

Do takich chorób należą np. wszystkie typy późnych powikłań cukrzycowych, którym towarzyszy pogrubienie błon podstawnych (zwłaszcza w nerkach, oku, układzie naczyniowym), zwłóknienie wątroby, zwłaszcza zwłóknienie wątroby związane z alkoholizmem, charakteryzujące się syntezą ciągłej błony podstawnej w zatokach i wywołaną na skutek tego kapilaryzacją, wszelkiego rodzaju zwłóknienia (przewlekłe lub jatrogenne), w których można zaobserwować nasiloną syntezę błony podstawnej lub składników błony podstawnej (nerek, płuc, skóry), miażdżyca tętnic charakteryzująca się ograniczeniem regulacji metabolizmu lipidów, co może być spowodowane między innymi zakłóconą filtracją lipoprotein przez częściowo ulegające kapilaryzacji zatoki wątroby (zmiany patologiczne w układzie naczyniowym, które można zaobserwować w przypadku miażdżycy tętnic, można również częściowo przypisać modyfikacją składu i budowy błon podstawnych w naczyniach), choroby, w których angiogeneza przyczynia się do zniszczenia w obrazie klinicznym, np. raki, w których neowaskularyzacja jest niezbędna do wzrostu guza, retynopatia cukrzycowa, pozasoczewkowy rozrost włóknisty, zaburzenia z silną skł adową zapaln ą (np. reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie stawów i koś ci, zapalenie naczyń), naczyniaki krwionośne, łuszczyca i wiele innych.

Zastosowanie peptydów, takich jak te opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5493008, jako leków jest jednak w znaczącym stopniu ograniczone z uwagi na ich elastyczność konformacyjną, brak odporności na proteazy oraz słabą biodostępność i farmakodynamikę (Milner-White E. J. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10; 70-74. Verber D.F.; Freidinger R.M.; (1985) Trends Neurosci. 8; 392-396. Hruby V.J. (1994) w: Peptides, Proc. Thirteenth American Peptide Symposium; (Hodges R. S.; Smith J. A.; red.) str. 3-17; ESCOM: Leiden, Holandia).

Celem niniejszego zgłoszenia było zatem wynalezienie pochodnych peptydowych o małej masie cząsteczkowej, które są zdolne do specyficznego oddziaływania z miejscem wiązania lamininy w nidogenie oraz do konkurencyjnego hamowania połączenia pomiędzy lamininą i nidogenem, w małym stężeniu.

Tak więc wynalazek dotyczy pochodnych peptydowych o wzorze I

w którym

R1 oznacza grupę o jednym z następujących wzorów

w których

R4 oznacza -A lub -NH2, a R5 oznacza -(CH2)1-COOA,

X oznacza grup ę o jednym z następują cych wzorów

PL 208 356 B1 w których

D oznacza (CH2)r, a R2 oznacza -A lub -E-OH, gdzie E oznacza niepodstawiony, liniowy lub rozgałęziony łańcuch C1-C10-alkilowy, a R3 oznacza grupę o jednym z następujących wzorów

w których R6 oznacza -H, -COOH, -CONH2, -CONR2 lub -CH2OH, a

R7 oznacza niepodstawiony, liniowy lub rozgałęziony C1-C10-alkil, a

R oznacza niepodstawiony, rozgałęziony lub nierozgałęziony C1-C6-alkil, albo R oznacza Ar, który jest ewentualnie podstawiony fenylem lub grupą -O-C1-C6-alkilo-fenyl, gdzie

Ar oznacza fenyl lub naftyl, a

Z oznacza (CH2)m,

A oznacza H lub C1-C4-alkil, l oznacza liczbę cał kowitą 0 lub 1, m oznacza liczbę cał kowitą 1, r oznacza liczbę cał kowitą 1, n oznacza liczbę cał kowitą 1, a k oznacza liczbę całkowitą 1 lub 2, w postaci dowolnych stereoizomerów i ich mieszanin w dowolnych stosunkach, a takż e ich fizjologicznie tolerowanych soli.

Fizjologicznie tolerowanymi solami są np. sole kwasów nieorganicznych i organicznych, np. kwasu chlorowodorowego, kwasu siarkowego, kwasu octowego, kwasu cytrynowego lub kwasu p-toluenosulfonowego, albo sole zasad nieorganicznych i organicznych, takich jak NH4OH, NaOH, KOH, Ca(OH)2, Mg(OH)2, dietanoloamina lub etylenodiamina, lub sole aminokwasów, takich jak arginina, lizyna, lizylo-lizyna lub kwas glutaminowy.

W jednej korzystnej postaci wynalazek dotyczy zwi ą zków o wzorze I, w którym R w grupie X oznacza Ar ewentualnie podstawiony grupą -O-C1-C6-alkilo-fenyl lub fenylem. Korzystniej R w grupie X oznacza Ar, a zwłaszcza Ar oznacza grupę o wzorze

W innej korzystnej postaci wynalazek dotyczy związków o wzorze I, w którym R w grupie X oznacza grupę o wzorze

PL 208 356 B1

W korzystnej postaci wynalazek dotyczy związków o wzorze I, w którym X oznacza grupę o następującym wzorze

W korzystnej postaci wynalazek dotyczy również zwią zków o wzorze I, w którym R1 oznacza grupę o następującym wzorze

Korzystnie R5 oznacza -(CH2)l-COOA, gdzie A oznacza korzystnie H, a l oznacza korzystnie 0. Korzystnie R4 oznacza -NH2 lub -A, gdzie A korzystnie oznacza H.

W kolejnej korzystnej postaci wynalazek dotyczy związków o wzorze I, w którym R1 oznacza grupę o następującym wzorze

w którym R4 korzystnie oznacza -NH2, R5 korzystnie oznacza -(CH2)l-COOA, gdzie l korzystnie oznacza 0, zaś A korzystnie oznacza H.

W kolejnej korzystnej postaci wynalazek dotyczy zwią zków o wzorze I, w którym R2 oznacza A, a korzystnie -CH3, albo R2 oznacza -E-OH, a korzystnie -CH2-OH.

W kolejnej korzystnej postaci wynalazek dotyczy związków o wzorze I, w którym R3 oznacza grupę o następującym wzorze

w którym k korzystnie oznacza 2.

PL 208 356 B1

W kolejnej korzystnej postaci wynalazek dotyczy związków o wzorze I, w którym R3 oznacza grupę o następującym wzorze \

\

R6

R7 w którym R7 korzystnie oznacza rozgałęziony C1-C10-alkil, korzystnie -CH(CH3)2, -C(CH3)3,

-CH(CH3)CH2CH3 lub -CH2-CH(CH3)2, a R6 korzystnie oznacza -H, -COOH, -CONH2, -CH2OH lub -CON(CH3)2.

Ponadto wynalazek dotyczy środka farmaceutycznego zawierającego substancję czynną oraz ewentualnie farmaceutycznie nieszkodliwe zaróbki i/lub dodatki, którego cechą jest to, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jedną pochodną peptydową o wzorze I, zdefiniowaną powyżej, i/lub jej fizjologicznie tolerowane sole.

Ponadto wynalazek dotyczy związków peptydowych o wzorze I, zdefiniowanych powyżej, i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli do stosowania jako lek.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania związków peptydowych o wzorze I, zdefiniowanych powyżej, i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli do wytwarzania leku do leczenia choroby związanej ze zwiększoną lub niepożądaną syntezą błon podstawnych, przy czym chorobę tę stanowią późne powikłania cukrzycowe, zwłóknienie, któremu towarzyszy zwiększona synteza błon podstawnych lub ich składników, korzystnie zwłóknienie wątroby, miażdżyca tętnic, rak, retynopatia cukrzycowa, pozasoczewkowy rozrost włóknisty, choroba związana z silną składową zapalną, korzystnie reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie stawów i kości lub zapalenie naczyń, choroba związana z naczyniakami krwionośnymi lub łuszczyca.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu identyfikacji związku, który hamuje oddziaływanie pomiędzy lamininą i nidogenem, który to sposób charakteryzuje się tym, że związek peptydowy zdefiniowany powyżej stosuje się jako konkurencyjny inhibitor oraz obejmuje etapy:

a) wytwarzanie bibliotek peptydów z zastosowaniem chemii w fazie stałej,

b) ekstrahowanie perełek z bibliotekami peptydów otrzymanych w etapie a), z otrzymaniem roztworów podstawowych związków peptydowych,

c) wstępne inkubowanie roztworów podstawowych związków otrzymanych w etapie b) z nidogenem,

d) inkubowanie wstępnego inkubatu otrzymanego w etapie c) z lamininą P1 i pomiar sygnału fluorescencji,

e) porównywanie wyników otrzymanych w etapie d) dla wyekstrahowanych roztworów podstawowych związków z kontrolnymi perełkami zawierającymi związki macierzyste na takim samym łączniku,

f) w przypadku gdy roztwory podstawowe związków hamują w takim samym stopniu lub w większym niż kontrolne perełki w etapie e) poddawanie tych roztworów spektrometrii masowej w celu oznaczenia mas cząsteczkowych,

g) poddawanie odpowiednich poszczególnych perełek degradacji Edmana w celu ustalenia sekwencji peptydów, i

h) analiza danych ze spektrometrii masowej i degradacji Edmana w celu identyfikacji budowy związków hamujących.

Korzystnie w odniesieniu do powyższego sposobu ponadto formułuje się zidentyfikowany związek w farmaceutycznie dopuszczalną postać.

Związki według wynalazku są nienaturalnymi (czyli nie występującymi w przyrodzie) pochodnymi peptydowymi o małej masie cząsteczkowej, zdolnymi do hamowania oddziaływania laminina/nidogen w nanomolowym zakresie stężeń. Nieoczekiwanie stwierdzono, że takie struktury o małej masie cząsteczkowej są zdolne do wiązania się z wysokim powinowactwem z miejscem wiązania lamininy w nidogenie, bez wymogu oddziaływania z tyrozyną lub histydyną z pętli (pętli c) sąsiadującą z właściwą sekwencją wiązania.

Jeszcze bardziej zaskakujące jest to, że pochodne peptydowe o małej masie cząsteczkowej, o masie cząsteczkowej od 550 do 800 Da, opisane w niniejszym opisie, wykazują zdolność hamowania takiego samego rzędu jak najaktywniejszy z dotychczas opisanych peptydów (IC50 22 nM) o masie cząsteczkowej około 2700 Da (= około 50% modułu LE), zawierający nienaruszoną pętlę S-S,

PL 208 356 B1 która prawdopodobnie stabilizuje strukturę podstawowego regionu sekwencji NIDPNAV (J.W. Fox i R. Timpl; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5493008).

Cel ten osiągnięto przeprowadziwszy w specyficzny sposób syntezę, w oparciu o zależności pomiędzy budową i działaniem oraz opublikowaną trójwymiarową strukturę miejsca wiązania nidogenu, pochodnych peptydowych na nośnikach żywicznych. Bloki strukturalne do syntez peptydu zmieniano zgodnie z odpowiednimi kryteriami, aby zapewnić dużą różnorodność struktury i wbudowanie nienaturalnych bloków strukturalnych. Odpowiedni czuły test przesiewowy zastosowano do zbadania i porównania otrzymanych pochodnych peptydowych pod wzglę dem działania hamują cego, po odszczepieniu od żywicy stanowiącej nośnik.

Związki według wynalazku można stosować do wytwarzania leków do leczenia choroby, która jest związana ze zwiększoną lub niepożądaną syntezą błon podstawnych.

Zatem do możliwych dziedzin zastosowania terapeutycznego pochodnych peptydowych według wynalazku i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli należą:

1. Wszystkie typy późnych powikłań cukrzycowych, którym towarzyszy pogrubienie błon podstawnych (zwłaszcza w nerkach, oku, układzie naczyniowym).

2. Zwłóknienie wątroby, zwłaszcza zwłóknienie wątroby związane z alkoholizmem, charakteryzujące się syntezą ciągłej błony podstawnej w zatokach i wywołaną na skutek tego kapilaryzacją.

3. Wszelkiego rodzaju zwłóknienia (przewlekłe lub jatrogenne), w których można zaobserwować nasiloną syntezę błony podstawnej lub składników błony podstawnej (nerek, płuc, skóry)

4. Miażdżyca tętnic charakteryzująca się ograniczeniem regulacji metabolizmu lipidów, co może być spowodowane między innymi zakłóconą filtracją lipoprotein przez częściowo ulegające kapilaryzacji zatoki wątroby. Zmiany patologiczne w układzie naczyniowym, które można zaobserwować w przypadku miażdżycy tętnic, moż na również częściowo przypisać modyfikacją składu i budowy błon podstawnych w naczyniach

5. Choroby, w których angiogeneza przyczynia się do zniszczenia w obrazie klinicznym, np. raki, w których neowaskularyzacja jest niezbędna do wzrostu guza, retynopatia cukrzycowa, pozasoczewkowy rozrost włóknisty, zaburzenia z silną składową zapalną (np. reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie stawów i kości, zapalenie naczyń), naczyniaki krwionośne, łuszczyca i wiele innych.

Tak więc związki według wynalazku i/lub ich odpowiednie fizjologicznie tolerowane sole są przydatne do stosowania jako leki. Zatem jak podano powyżej, wynalazek dotyczy środka farmaceutycznego zawierającego co najmniej jeden związek według wynalazku i/lub jego fizjologicznie tolerowane sole.

Związki o wzorze I i ich fizjologicznie tolerowane sole i pochodne można według wynalazku podawać istotom żywym, korzystnie ssakom, a zwłaszcza ludziom, jako leki do stosowania w terapii lub profilaktyce. Można je podawać pojedynczo, w postaci mieszanin jednego związku z drugim, albo w postaci ś rodków farmaceutycznych, umo ż liwiają cych podawanie dojelitowe lub pozajelitowe, które to środki jako substancję czynną zawierają skuteczną dawkę co najmniej jednego związku o wzorze I i/lub jego fizjologicznie tolerowanych soli i pochodnych, oprócz zwykłych farmaceutycznie nieszkodliwych zaróbek i/lub dodatków.

Środki farmaceutyczne można podawać doustrojowo lub miejscowo. Można je podawać np. w postaci piguł ek, tabletek, tabletek z powł oczką , tabletek powleczonych cukrem (draż etek), granulatów, twardych i miękkich kapsułek żelatynowych, proszków, roztworów, syropów, emulsji, zawiesin lub w innych postaciach farmaceutycznych. Jednakże można również je podawać dopochwowo lub doodbytniczo, np. w postaci czopków, albo pozajelitowo albo przez wszczepienie, np. w postaci roztworów do iniekcji lub roztworów do infuzji, mikrokapsułek lub pręcików, albo miejscowo albo przezskórnie, np. w postaci maści, roztworów lub nalewek, albo w inny sposób, np. w postaci sprejów do nosa lub mieszanin aerozolowych albo w postaci preparatów w formie suchego proszku do wdychania. Gdy roztwory podaje się pozajelitowo, można je podawać np. dożylnie, domięśniowo, podskórnie, dostawowo, wewnątrzmaziówkowo lub w inny sposób, np. przez wdychanie wilgotnych aerozoli lub preparatów w postaci suchego proszku.

Środki farmaceutyczne według wynalazku wytwarza się w znany sposób, przy czym można stosować farmaceutycznie obojętne zarobki nieorganiczne i/lub organiczne oprócz związku (związków) o wzorze I i/lub jego/ich fizjologicznie tolerowanych soli i pochodnych. Do wytwarzania piguł ek, tabletek, tabletek powlekanych cukrem (drażetek) i twardych kapsułek żelatynowych można stosować np. laktozę, skrobię kukurydzianą lub jej pochodne, talk, kwas stearynowy lub jego sole itp. Jako zaróbki miękkich kapsułek żelatynowych stosuje się np. tłuszcze, woski, półstałe i ciekłe poliole, glikole poliPL 208 356 B1 etylenowe, naturalne lub utwardzone oleje itp. Jako odpowiednie zaróbki do wytwarzania roztworów, np. roztworów do iniekcji, albo emulsji lub syropów stosuje się np. wodę, alkohole, glicerynę, diole, poliole, sacharozę, cukier inwertowany, glukozę, oleje roślinne itp. Jako odpowiednie zaróbki w przypadku mikrokapsułek, implantów lub pręcików stosuje się np. kopolimery kwasu glikolowego i kwasu mlekowego. Preparaty farmaceutyczne zawierają zazwyczaj 0,5 - 90% wag. związków o wzorze I i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli i pochodnych.

Oprócz substancji czynnych i zaróbek, środki farmaceutyczne mogą dodatkowo zawierać środki pomocnicze, lub dodatki, takie jak np. wypełniacze, środki rozsadzające, środki wiążące, środki poślizgowe, środki zwilżające, stabilizatory, emulgatory, środki konserwujące, środki słodzące, środki barwiące, środki zapachowe lub aromatyzujące, środki zagęszczające, rozcieńczalniki, substancje buforujące, rozpuszczalniki lub solubilizatory, środki zapewniające przedłużone działanie, sole zmieniające ciśnienie osmotyczne, środki powłokowe lub przeciwutleniacze. Mogą one również zawierać dwa lub większą liczbę związków o wzorze I i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli i pochodnych. Mogą one ponadto zawierać dwa lub większą liczbę substancji terapeutycznie lub profilaktycznie czynnych oprócz co najmniej jednego związku o wzorze I i/lub jego fizjologicznie tolerowanych soli i pochodnych. Środki farmaceutyczne zazwyczaj zawierają 0,2 - 500 mg, korzystnie 1 - 100 mg, substancji czynnej o wzorze I i/lub jej fizjologicznie tolerowanych soli i pochodnych, w przeliczeniu na dawkę.

Gdy związki o wzorze I lub zawierające je preparaty farmaceutyczne podaje się w postaci aerozoli, np. jako aerozole do nosa lub jako wilgotne aerozole lub suchy proszek do wdychania, można je podawać np. z użyciem odpowiednio rozpylacza, rozpylacza aerozolu, rozpylacza z pompką, urządzenia do inhalacji, inhalatora dozującego lub inhalatora do suchego proszku. Postacie farmaceutyczne do podawania związków o wzorze I w postaci aerozolu można wytwarzać sposobem znanym fachowcom. W celu ich otrzymania przydatne są np. roztwory lub dyspersje związków o wzorze I w wodzie, mieszaninach wody z alkoholem lub w odpowiednich roztworach soli, z użyciem zwykłych dodatków, np. alkoholu benzylowego lub innych odpowiednich środków konserwujących, środków wzmagających wchłanianie dla zwiększenia biodostępności, solubilizatorów, dyspergatorów i innych środków, oraz, w razie potrzeby, zwykłych propelentów, np. chlorofluorowęglowodorów i/lub fluorowęglowodorów; natomiast preparaty związków o wzorze I i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli, w postaci suchego proszku, można otrzymać przez liofilizację, albo, korzystnie, suszenie rozpryskowe wodnych roztworów związków o wzorze I i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli oraz odpowiednich dodatków rozpuszczalnych w wodzie, takich jak cukry lub pochodne cukrów i aminokwasy.

Dawka związków o wzorze I może zmieniać się w szerokich granicach i zazwyczaj będzie dostosowywana do poszczególnych warunków w każdym indywidualnym przypadku, w sposób znany lekarzowi. Zależy ona np. od charakteru i ostrości leczonej choroby, od stosowanego związku lub od tego, czy leczy się ostry, czy też przewlekły stan chorobowy lub związek stosuje się zapobiegawczo, albo od tego, czy oprócz związków o wzorze I stosuje się inne substancje czynne. Zazwyczaj, przy podawaniu doustnym, dzienna dawka wynosząca od około 0,01 do 100 mg/kg, korzystnie 0,1 - 10 mg/kg, a zwłaszcza 0,3 - 2 mg/kg (w każdym przypadku na kilogram wagi ciała) jest odpowiednia w przypadku dorosłej osoby dla osiągnięcia korzystnych wyników. W przypadku podawania dożylnego dzienna dawka zwykle wynosi 0,01 - 50 mg/kg, korzystnie 0,01 - 10 mg/kg wagi ciała. W szczególności, przy podawaniu stosunkowo dużych ilości, dzienną dawkę można podzielić na pewną liczbę, np. 2, 3 lub 4 częściowe dawki. W razie potrzeby, w zależności od indywidualnej odpowiedzi, konieczne może być podawanie dawek większych lub mniejszych do wskazanej dawki dziennej.

Ponadto związki o wzorze I i ich sole według wynalazku można stosować jako związki pośrednie do wytwarzania innych związków, a zwłaszcza innych związków farmaceutycznie czynnych, które można wytworzyć ze związków o wzorze I, np. przez modyfikację albo wprowadzenie grup lub grup funkcyjnych, np. drogą estryfikacji, redukcji, utleniania lub innych przemian grup funkcyjnych.

Stwierdzono, że pochodne peptydowe według wynalazku można stosować bezpośrednio jako środki terapeutyczne, ale mogą one także stanowić podstawę do syntezy pokrewnych struktur, które są również przydatne do stosowania jako środki terapeutyczne do leczenia chorób związanych ze wzmożoną lub niepożądaną syntezą błon podstawnych.

Jak podano powyżej, wynalazek dotyczy ponadto sposobu identyfikacji związku hamującego oddziaływanie lamininy z nidogenem, zgodnie z którym związek według wynalazku stosuje się jako konkurencyjny inhibitor. Sposób ten może ponadto obejmować formułowanie zidentyfikowanego związku w postać farmaceutycznie dopuszczalną.

PL 208 356 B1

Środek farmaceutyczny można wytwarzać w sposób obejmujący identyfikację związku, który hamuje oddziaływanie lamininy z nidogenem, przy czym związek według wynalazku stosuje się jako konkurencyjny inhibitor, oraz ponadto zmieszanie zidentyfikowanego związku i/lub jego fizjologicznie tolerowanych soli z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Związek o wzorze I

według wynalazku wytwarza się drogą kondensacji związku o wzorze II

ze związkiem o wzorze III

w których R1, X, n, R2 i R3 mają wyżej podane znaczenie, przy czym związki o wzorach II i III mogą być zabezpieczone przy grupach funkcyjnych określonych powyżej grupami zabezpieczającymi znanymi w chemii peptydów (patrz np. Houben-Weyl, Metoden der Organischen Chemie, tom 15/1 i 15/2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Odpowiednie sposoby kondensacji są dobrze znane (Houben-Weyl, Metoden der Organischen Chemie, tom 15/1 i 15/2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Do odpowiednich środków kondensujących lub środków sprzęgających należą np. karbonylodiimidazole, karbodiimidy, takie jak dicykloheksylokarbodiimid lub diizopropylokarbodiimid, albo tetrafluoroboran O-((cyjano(etoksykarbonylo)metyleno)amino)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy (TOTU) albo bezwodnik kwasu pirofosforowego (PPA). Reakcje kondensacji prowadzi się w zwykłych warunkach. Zazwyczaj podczas kondensacji peptydów trzeba zabezpieczać grupy aminowe, które nie mają brać udziału w reakcji sprzęgania, odpowiednimi grupami zabezpieczającymi, które łatwo usuwa się w warunkach odmiennych od tych, w których zachodzi sprzęganie. Odnosi się to również do grup karboksylowych, które nie mają brać udziału w reakcji sprzęgania, które korzystnie zabezpiecza się jako estry C1-C6-alkilowe, estry benzylowe lub estry t-butylowe podczas reakcji sprzęgania. Zabezpieczanie grup aminowych nie jest konieczne w przypadku gdy grupy aminowe występują w postaci prekursorów grup aminowych, np. w postaci grup nitrowych lub cyjanowych. Grupy aminowe można następnie uwolnić w etapie hydratacji po reakcji kondensacji. Po etapie kondensacji grupy zabezpieczające usuwa się dowolnymi odpowiednimi sposobami; np. grupy benzyloksykarbonylowe i benzylowe można usunąć przez hydratację estrów benzylowych; grupy zabezpieczające typu t-butylu zazwyczaj odszczepia się w środowisku kwaśnym; grupę 9-fluorenylometyloksykarbonylową usuwa się z użyciem amin drugorzędowych.

Związek o wzorze I według wynalazku można również wytworzyć przez stopniowe dodawanie odpowiednich składników, np. naturalnych lub nienaturalnych aminokwasów i ich pochodnych, do fazy stałej, przy czym te składniki można dodawać w różnej kolejności.

W celu wytworzenia związku o wzorze I dogodnie można nie prowadzić bezpośredniego sprzęgania związków o wzorach I i II drogą stopniowej kondensacji, ale sprzęgać ich odpowiednie dogodne prekursory dla otrzymania związku pośredniego, który można przeprowadzić w związek o wzorze I, np. wytwarzając jego pochodną.

PL 208 356 B1

Wyżej opisany sposób wprowadzania grup funkcyjnych nie bezpośrednio, ale poprzez ich odpowiednie prekursory, do cząsteczki, dla otrzymania związków pośrednich, z których łatwo można otrzymać produkt końcowy przeprowadzając grupy prekursorowych w odpowiednie grupy funkcyjne po reakcji kondensacji, można także zastosować w odniesieniu do różnych części cząsteczki związku o wzorze I, np. do bocznego łańcucha związku o wzorze I, odpowiednio R1- lub R1-X-.

P r z y k ł a d y

Stosowane skróty mają następujące znaczenie.

Środki i rozpuszczalniki

AcOH kwas octowy aq wodny

BSA albumina surowicy bydlęcej

DCC N,N'-dicykloheksylokarbodiimid

DCM dichlorometan

DIPEA N,N-diizopropyloetyloamina

DMAP 4-dimetyloaminopirydyna

DMF N,N-dimetyloformamid

DMSO dimetylosulfotlenek

Et2O eter dietylowy

EtOAc octan etylu (ester etylowy kwasu octowego)

EtOH etanol

Fmoc-OSucc

HOBT

KHMDS n-BuLi

MeOH

MTBE

TEA

TFA

THF

TMEDA

TMSCl

TOTU

Fmoc-O-sukcynoimid

1-hydroksybenzotriazol heksametylodisilazydek potasu n-butylolit metanol eter metylowo-t-butylowy trietyloamina kwas trifluorooctowy tetrahydrofuran tetrametyloetylenodiamina chlorek trimetylosililu tetrafluoroboran O-((cyjano(etoksykarbonylo)metyleno)amino)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy azydek trisililu

TrisN3

Grupy chemiczne:

Me	metyl	CH3
Et	etyl	CH3-CH2-
nPr	n-propyl	CH3-CH2CH2-
iPr	izopropyl	(CH3)2CH-
nBu	n-butyl	CH3CH2CH2CH2-
iBu	izobutyl	(CH3)2CHCH2-
tBu	t-butyl	(CH3)3C-
Ph	fenyl	C6^H5^-
Fmoc	9-fluorenylometoksykarbonyl
Z	benzyloksykarbonyl	C6H5-CH2-O-CO-
BOC	t-butoksykarbonyl	(CH3)3C-O-CO-

1. Przesiewanie biblioteki inhibitorów oddziaływania laminina/nidogen

Bibliotekę zaprojektowano aby znaleźć mniejsze, silniej działające i bardziej metabolicznie trwałe peptydy, w porównaniu ze znanym heptapeptydem NIDPNAV (Poschl E.; Fox J. W.; Block D.; Mayer U.; Timpl R. (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. Poschl E.; Mayer U.; Stetefeld J.; Baumgartner R.; Holak T. A.; Huber R.; Timpl R. (1996) EMBO J. 15: 5154-5159. Baumgartner R.; Czisch M.: Mayer U.; Poschl E.; Huber R.; Timpl R.; Holak T. A. (1996) J. Mol. Biol. 257; 658-668). Bibliotekę zsyntetyzowano i przesiewano jako 3 podbiblioteki; pentamerów, heksamerów i heptamerów. Poniżej opisano strategię przesiewania dla podbiblioteki pentamerów. Sposób jest reprezentatywny dla metod stosowanych w przypadku pozostałych dwóch podbibliotek, z tym, że do przesiewania heksamerów

PL 208 356 B1 w pierwszym etapie stosowano około 50 perełek/studzienkę, a w przypadku heptamerów do przesiewania użyto około 100 perełek/studzienkę.

1.1 Przesiewanie biblioteki pentamerów

Biblioteka pentamerów zawierała 2160 różnych związków.

1) Wytworzono zawiesinę około 8800 pojedynczych perełek w 0,1% HCl i rozprowadzono na dno z filtrem nr 7 w 96 studzienkowych płytkach mikrotitracyjnych, w ilości około 14 perełek/studzienkę.

2) Perełki przemyto dwukrotnie porcjami po 200 μl dejonizowanej wody, a następnie dodano 50 μl

500 mM HEPES o pH 7,0. Łącznik zastosowany w bibliotece uwalniał jedną porcję związku gdy wartość pH podwyższono do 7,0; ten etap rozszczepiania prowadzono przez noc.

3) Płytki nałożono na płytki filtracyjne z dnem w kształcie litery U i odwirowano. Mieszaniny związków uwolnionych z perełek zbierały się na spodniej płytce, podczas gdy odpowiadające im perełki pozostawały na wyjściowej płytce filtracyjnej.

4) Do perełek dodano DMSO w ilości 25 μl/studzienkę, w celu wymycia reszty wolnego związku z perełek i płytki ponownie odwirowano w celu oddzielenia związków w roztworze od perełek. Otrzymany roztwór podstawowy zawierał związek w stężeniu 27 μΜ w 333 mM HEPES, 33% DMSO.

5) Roztwory podstawowe związku inkubowano z nidogenem (10 μl roztworu podstawowego i 90 μl roztworu nidogenu) i próbę przeprowadzono zgodnie z załączonym opisem procedury, przy czym uzyskano końcowe stężenie przesiewowe 2,7 μM na związek.

6) W 25 studzienkach pomiarowych, w których wystąpiło powtarzalne hamowanie > 62%, odpowiednie perełki z wyjściowych płytek filtracyjnych zdyspergowano w 0,05% HCl, 0,1% Tween-20 i odpipetowano do 5 nowych płytek filtracyjnych w ilości 1 perełka/studzienkę. Do każdej płytki dodano w celu kontroli 2 perełki kontrolne ze związkiem macierzystym z takim samym łącznikiem.

7) Perełki przemyto dwukrotnie 200 μl dejonizowanej wody, po czym do każdej studzienki dodano 25 μl 50 mM NaOH. Łącznik zastosowany w bibliotece uwalniał drugą równomolową porcję związku gdy wartość pH podwyższono z 7,0 do 10,0 lub powyżej. Ten etap rozszczepiania prowadzono przez 3 godziny.

8) Płytki nałożono na płytki filtracyjne z dnem w kształcie litery U i odwirowano. Mieszaniny związków uwolnionych z perełek zbierały się na spodniej płytce, podczas gdy odpowiadające im perełki pozostawały na wyjściowej płytce filtracyjnej.

9) Perełki przemyto 20 μl 50 mM HEPES (wyjściowe pH 7,0) z dodatkiem 50 mM HCl i roztwór odwirowano na dolną płytkę, a następnie połączono z pierwszym uwolnionym roztworem.

10) Perełki przemyto po raz trzeci 25 μl DMSO, który pozostawiono z perełkami na 10 minut przed odwirowaniem w celu osiągnięcia równowagi.

11) Badano otrzymane roztwory uwolnionych związków w 1/10 objętości, jak w punkcie 5.

12) Roztwory, które zapewniały hamowanie takie same lub lepsze niż perełki kontrolne (hamowanie w około 50%) uznawano za trafione. Oddzielono 23 trafione perełki wraz z dwiema innymi potencjalnymi trafionymi perełkami w pojedynczych studzienkach, których aktywność przypisano dodatkowym słabym inhibitorom.

13) Trafione roztwory poddano spektrometrii masowej dla oznaczenia masy cząsteczkowej.

14) Odpowiednie pojedyncze trafione perełki poddano analizie Edmana dla ustalenia sekwencji peptydów.

15) Połączone dane MS i Edmana poddano analizie dla ustalenia budowy trafionych związków.

Struktury i częstość ich odzysku przedstawiono poniżej. G-Hopa = hydroksypropyloamid glicyny, reszta łącznika.

Częstość	IC50, μM
6	D	Nal2	N	D	V	G-Hopa	0,43
4	D	Nal2	N	A	V	G-Hopa	0,37
4	D	Nal2	N	D	I	G-Hopa	0,64
4	D	Nal2	N	S	V	G-Hopa	0,49
3	D	Nal2	N	S	I	G-Hopa	0,81
2	D	Nal2	N	A	I	G-Hopa	0,47

Legenda

Nal2 = L-3-(2-naftylo)alanyl:

PL 208 356 B1

G-Hopa = glicyno-3-hydroksypropyloamid:

D = Asp (aspartyl), P = Pro (prolil), N = Asn (asparaginyl). A = Ala (alanyl), V = Val (walinyl), S = Ser (seryl), I = Ile (izoleucyl).

1.2 Procedury: Wytwarzanie biblioteki peptydów

Biblioteki peptydów zsyntetyzowano drogą syntezy metodą split/mix (Lam K. S., Salmon S. E., Hersh E. M., Hruby V. J., Kazmierski W. M. i Knapp R. J. (1991) Nature 354, 82; Furka A., Sebestyen F., Asgedom M. i Dibo G. (1991) Int. J. Pept. Protein Res. 37, 487) z zastosowaniem standardowej chemii peptydów w fazie stałej z Fmoc (Stewart J. M. i Young J. D. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., Rockford, IL.; Atherton E. i Sheppard R. C. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis. IRL Press Oxford). Każdą z perełek żywicy wystawiano na działanie tylko jednego aminokwasu w każdym cyklu sprzęgania. Z tego względu po zakończeniu syntezy biblioteki na każdej perełce żywicy znajdował się tylko jeden rodzaj peptydu. Z uwagi na to, że nie jest możliwe osobne zbadanie wszystkich związków, zbudowano taką samą strukturę na każdej perełce żywicy w dwóch kopiach, poprzez zastosowanie dającego się różnie rozszczepiać łącznika, fig. 1 (Kocis P., Krchnak V. i Lebl M. (1993) Tetr.Lett. 34, 7251; Lebl M., Krchnak V., Salmon S. E. i Lam K. S. (1994) A Companion to Methods in Enzymology 6, 381). Peptyd można następnie uwolnić z perełki żywicy w kolejnych etapach, w oparciu o różne mechanizmy rozszczepiania. Pierwszą część peptydu z grupą hydroksypropyloamidową uwalniano w buforze o pH 7-9. Drugą część peptydu uwalniano w warunkach wyższej wartości pH (schemat 1).

W bibliotekach peptydów zastosowano pereł ki z polistyrenu szczepionego glikolem polietylenowym lub TentaGel^®S NH2. W zasadzie można stosować perełki dowolnej żywicy nadające się do syntezy i przesiewania peptydów w środowisku wodnym.

Otrzymano biblioteki penta-, heksa- i heptamerów z jedną ustaloną pozycją (L-asparaginy). Hydroksypropyloamid glicyny na końcu C stanowi część łącznika:

H-X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH (2160 peptydów)

H-X5X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH (25920 peptydów)

H-X6X5X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH (311040 peptydów)

X1: N-Fmoc-L-aminokwasy (9) stosowane w pierwszej randomizacji: walina, izoleucyna, treonina, fenyloalanina, e(2-naftylo)alanina, kwas 2-azetydynokarboksylowy, prolina, cykloheksyloglicyna, fenyloglicyna.

X2: N-Fmoc-L-aminokwasy (4) stosowane w drugiej randomizacji: alanina, glicyna, seryna, kwas asparaginowy.

X3=X5=X6: N-Fmoc-L-aminokwasy (12) stosowane w trzeciej, piątej i szóstej randomizacji: kwas pipekolinowy, e(2-naftylo)alanina, kwas glutaminowy, lizyna, kwas 2-azetydynokarboksylowy, treonina, prolina, asparagina, izoleucyna, 3,5-dijodotyrozyna, cytrulina, arginina.

X4: N-Fmoc-L-aminokwasy (5) stosowane w czwartej randomizacji: kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, kwas 2-aminoadypinowy, O-siarczan tyrozyny, kwas γ-karboksyglutaminowy.

Żywicę (PEG-PS-HCl, Millipore®, 20 g, obciążenie 0,58 mmola/g, średnia wielkość cząstek 220 iim) spęczniano w N,N-dimetyloformamidzie przez 2 godziny, po czym zobojętniano 10% N,N-diizopropyloetyloaminą w dichlorometanie. Żywicę przemyto dichlorometanem i N,N-dimetyloformamidem. Łącznik (fig. 1, 3 równoważniki) sprzęgnięto z użyciem 1,3-diizopropylokarbodiimidu i 1-hydroksybenzotriazolu

PL 208 356 B1 (po 3 równoważniki) w N,N-dimetyloformamidzie w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Reakcję kontrolowano metodą z błękitem bromofenolowym (Krchnak V., Vagner J., Safar P. i Lebl M. (1988) Collec. Czech. Cem. Commun. 53, 2542). Zakończenie reakcji sprzęgania następnie ustalano na podstawie próby ninhydrynowej (Kaiser E., Colescott R. L, Bossinger C. D. i Cook P. I. (1969) Anal. Biochem. 34, 595). Po przemyciu N,N-dimetyloformamidem grupę zabezpieczającą Fmoc usunięto podziaławszy 50% piperydyną w N,N-dimetyloformamidzie przez 15 minut. Żywicę następnie przemyto N,N-dimetyloformamidem i ilość uwolnionego adduktu fulwen-piperydyna oznaczano ilościowo metodą spektrometrii UV (302 nm). Poziom trwałego obciążenia żywicy (mmol/g), oznaczany w ten sposób przez cały czas syntezy bibliotek, służył jako jeden ze środków kontroli jakości.

Żywicę podzielono na 9 równych porcji. Do każdej porcji żywicy dodano jeden z 9 Fmoc-zabezpieczonych aminokwasów (X1) i prowadzono sprzęganie w opisany sposób przez 2 godziny. Żywicę następnie zebrano w walcowym szklanym naczyniu z dnem ze spiekanego szkła. Przez mieszaninę żywicy przepuszczano pęcherzykami suchy azot. Grupę zabezpieczającą Fmoc usunięto w sposób opisany powyż ej.

Żywicę podzielono na 4 równe porcje. Do każdej porcji żywicy dodano jeden z 4 Fmoc-zabezpieczonych aminokwasów (X2) i prowadzono sprzęganie w opisany sposób. Grupę zabezpieczającą Fmoc usunięto i oznaczono stopień obciążenia żywicy. W następnym cyklu L-asparaginę sprzęgnięto w sposób opisany powyżej. Żywicę następnie podzielono na porcje do kolejnego cyklu sprzęgania. Po zakończeniu wszystkich etapów randomizacji, grupę Fmoc usunięto i odszczepiono grupy zabezpieczające łańcuchy boczne za pomocą mieszaniny kwasu trifluorooctowego (82,5%), anizolu (5%), wody (5%), tioanizolu (5%), etanoditiolu (2,5%) w ciągu 2,5 godziny. Żywicę przemyto następnie kwasem trifluorooctowym, dichlorometanem, N,N-dimetyloformamidem i metanolem. Biblioteki przechowywano w stanie wysuszonym w 4°C.

W celu zweryfikowania jako ś ci bibliotek kilka przypadkowo wybranych pere łek poddano sekwencjonowaniu metodą degradacji Edmana i analizie metodą spektrometrii masowej.

PL 208 356 B1

	Τ’ δ ?° § °5.....< 1 ZZ ' 33 >C 2 —( £* O ZS Z -3 A-A ś sz; ± >o < d - ί J. >°i =² < % /=° 2E d ^{x 2},, a	TJ i 1 1 J2 1 m 1 O > Έό 2 Ί? * I o Ί?> i 03 Jl a JO »>» c Sb s s o. I o 1 u _Q i	xz >° g \x 1 o=z / 5 >.....< ? X. ^x >> \= o o \ sf > za z ^o=$.....+1 SZ £ >° q 0=4 /-γ Y° a ' o a	T3 s 2 ł r~i Ó c >, <j Sb Ί3 5 6 J Λ ώ ό X β '3> J) £	°Y < _ -Sie. ' Z o V=o 3 4 i i °5......ΛI xz 7 γ γΑ* γ \ A L i i / ° Si zx 7..... = §	3 1 1 _1 ό ί -i i f i ύ i >. £ ł CS 1 ΓΊ 1 cc U 6 £ ce O, w <
ο tr* a	O\ A	Cft «3 i I j 6 ?. 1	Y A	2 G. ΰ ó f Cu £Λ	oo θ'
Czystość	χβ o^x «1 Os Λ	©K tr> Os A		£ & 1 κπ r*
S	tr> tn co	oo 2		\o
	IZ C 0> aj ? § N £		,t c 3 j
u z	t-M		..... ' ^{1 r} ”“ ' C4		cc

PL 208 356 B1

X z °i -< xz ^x^,_o XX §

rj K z c3 >

33 1 o

A< s A - \ X > Z3 $ J

-a g cS 0

sf z °“$.....< xz ' 0=°, zx £

JA 3 cS > cś < c <Λ

zo s es O 3

tura

°7......7=

<

.£ T

^o=$...../-ę

.3 ϊ5

7

A.....A

< 77

7s £

Struk

f⁵^ Cs

“><2^

KZ 1 V=o

2)-Asn

£ i 1 O

A/A.-

xz £ s \ 5Λ ] >=o <

£ 4 6

t sS>

XZ 'F°

Naftyl·

4 o T

o<

i cS

zx °7 %

>, c rO _O

9

CM £

§ Ts I

7

3

4

( s

Tb

7

co

i—i o

Co

00

o

U

_o

o L-«

T

/

ę?

o X

_c*

>°

Om Q

’co

X

s? £

CD 2

§

3 00

es L— eS

cS

CS

O-

ίΛ

eS

1

1 J

1

o

c’

A.

o

§

CS

Ł

es

o

O <

O £

naftyl

c

1 CM

ά

CM

t

» co t -1 ( o

có

»2 co

_0

j i

C*

0*~* 3 Oo

CM

A. 3 X

r-

T c

o

c?

3

C'- ©

i 3

o o

a o A4

υ

00

3 <ZJ

^ŁO

stoś

O'- tr>

s? o^x Ό

cA MO

N

O> A

O\ Λ

θ' Λ

o

i

oc

'Φ

rf

s

σ*\ in

oo MO

CM MO

t_

X K

Cu

CO *3 es

CU,

<M

K

N 1

oi Ό cS

Om

uz

£-

Z4

/.

rt

mo

'40

PL 208 356 B1

2. Synteza w dużej skali

2.1 Synteza N-Fmoc-trans-3-(2'-naftylo)-L-proliny (A8)

Schemat syntezy: N-Fmoc-trans-3-(2'-naftylo)-L-prolinę (A8) otrzymano w 10 etapach:

2.1.1. trans-3-(2'-Naftylo)propenian etylu (A1)

Do roztworu 2-naftaldehydu (7,8 g, 50 mmoli) w 50 ml etanolu w trakcie mieszania dodano (karbetoksymetyleno)trifenylofosforanu (18,3 g, 52,5 mmola). Stwierdzono nieznacznie egzotermiczną reakcję. W trakcie mieszania przez noc wytrącił się osad. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono Et2O (500 ml) i przemyto 1 M H3PO4 (2 x 100 ml), nasyconym roztworem NaHCO3 (1 X 100 ml), wodą (100 ml) i solanką (100 ml). Frakcję organiczną wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość przepuszczono przez wkład z SiO2, z elucją mieszaniną 9:1 heksan:EtOAc. Po zatężeniu pod próżnią odzyskano z wydajnością prawie ilościową produkt w postaci mieszaniny 85:15 izomerów geometrycznych (na korzyść izomeru trans według NMR). Produkt ten poddano rekrystalizacji z mieszaniny heksan/EtOAc (bogatej w heksan) i otrzymano 4,5 g żądanego produktu w postaci mieszaniny izomerów 97:3 (NMR). Roztwór macierzysty zatężono i poddano rekrystalizacji jak powyżej, w wyniku czego otrzymano dodatkowo 2,9 g produktu (łącznie 7,4 g, 33 mmole, 65% wydajności). NMR (CDCI3)

PL 208 356 B1 δ 7,93 (s, 1 H); 7,88-7,83 (c, 4 H); 7,67 (dd, 1 H, J = 1,6, 8,6 Hz); 7,53-7,50 (c, 2 H); 6,55 (d, 1 H, J = 16,0 Hz); 4,30 (q, 2 H, J = 7,1 Hz); 1,42 (t, 3 H, J = 7,1 Hz).

2.1.2. Kwas trans-3-(2'-Naftylo)propenowy (A2)

Do roztworu estru A1 (4,24 g, 18,8 mmola) w THF (75 ml) dodano LiOH^H₂O (2,36 g, 56,3 mmola) w wodzie (19 ml). Początkowo niejednorodną mieszaninę intensywnie mieszano przez noc, w wyniku czego stała się ona jednorodna. Mieszaninę reakcyjną zakwaszono stężonym HCl (do pH « 2), przy czym wytrącił się osad. Niejednorodną mieszaninę przeniesiono do rozdzielacza i wyekstrahowano EtOAc (3 x 150 ml). Połączone ekstrakty wysuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią, w wyniku czego otrzymano kwas karboksylowy w postaci białej substancji stałej (3,66 g, 98% wydajności). NMR (CDCl3) δ 7,97 (d, 1 H, J = 15,7 Hz); 7,90 (d, 1 H, J = 15,3 Hz); 7,90-7,83 (c, 3 H); 7,70 (dd, 1 H, J = 1,6, 8,6 Hz); 7,57-7,50 (c, 2 H); 6, 58 (d, 1 H, J = 16,0 Hz).

2.1.3. trans-(4S)-3-(3'-(2-Naftylo)propenoilo)-4-fenylo-2-oksazolidynon (A3)

Roztwór kwasu karboksylowego A2 (3,66 g, 18,5 mmola) i trietyloaminy (1,87 g, 2,56 ml, 18,5 mmola) w bezwodnym THF (74 ml) ochłodzono do -78°C. Chlorek piwaloilu (2,35 g, 2,40 ml, 19,4 mmola) dodano w ciągu 2 minut, przy czym wytrącił się biały osad. Po 10 minutach kolbę umieszczono w łaźni o temperaturze 0°C na 10 minut, po czym kolbę ponownie chłodzono do -78°C w ciągu

1.5 godziny. W oddzielnej kolbie oksazolidion pochodzący od L-fenyloglicynolu (3,31 g, 20,3 mmola) w bezwodnym THF (74 ml) ochłodzono do -78°C. Dodano roztworu n-BuLi (1,6 M w heksanie, 11,6 ml, 18,5 mmola) i mieszanie kontynuowano przez około 1 godzinę, czemu towarzyszyło wytrącenie się metalowanego oksazolidynonu z roztworu THF/heksan. Mieszany bezwodnik dodano przez rurkę do metalowanego oksazolidynonu i mieszaninę reakcyjną umieszczono w łaźni o temperaturze 0°C. Po 1 godzinie łaźnię usunięto i mieszaninę pozostawiono na noc do ogrzania się do temperatury pokojowej. Reakcję przerwano dodawszy 50 ml nasyconego roztworu NH4CI. THF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i, po przeniesieniu do rozdzielacza, mieszaninę wyekstrahowano CH2CI2 (3 x 75 ml). Połączone frakcje organiczne przemyto 1M NaOH (2 x 50 ml), wysuszono (MgSO4) i zatężono. Pozostałość poddano rekrystalizacji z EtOAc/heksanu i otrzymano białą substancję stałą (3,87 g, 11,2 mmola, 61% wydajności). NMR (CDCI3) δ 8,05 (d, 1 H, J = 15,7 Hz); 7,94 (d, 1 H, J = 15,4 Hz); 7,87-7,81 (c, 3 H); 7,76 (dd, 1 H, J = 1,5, 8,6 Hz); 7,53-7,47 (c, 2 H); 7,41-7,34 (c, 5 H); 5,58 (dd, 1 H, J = 8,7, 3,9 Hz); 4,76 (t, 1 H, J = 8,7 Hz); 4,33 (dd, 1 H, J = 8,8, 3,9 Hz).

2.1.4. (3'R4S)-3-(3'-(2-Naftylo)-4'-pentenoilo)-4-fenylo-2-oksazolidynon (A4)

Do roztworu Cul (3,96 g, 20,9 mmola) i TMEDA (2,66 g, 3,46 ml, 22,9 mmola) w bezwodnym THF (92 ml) w -78°C dodano bromku winylomagnezu (1,0 M w THF, 20,9 ml, 20,9 mmola). Mieszaninę mieszano przez 15 minut. W osobnej kolbie chlorek trimetylosililu (5,69 g, 6,64 ml, 52,2 mmola) dodano do roztworu nienasyconego imidu A3 (3,87 g, 11,3 mmola) w bezwodnym THF (42 ml). Z uwagi na nierozpuszczalność imidu, wyjęto korek z przegrodą z kolby zawierającej reagent miedzianowy usunięto i zawiesinę imidu dodano w jednej porcji, szybko przemywając kolbę małą ilością THF. Temperaturę łaźni podwyższono do -30°C i mieszanie kontynuowano przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną wlano do 250 ml mieszaniny 3:2 nasyconego roztworu NH4CI:stężonego NH4OH. Warstwy rozdzielono i frakcję wodną wyekstrahowano EtOAc (3 x 200 ml). Połączone frakcje organiczne przemyto kolejno nasyconym roztworem NH4CI (1 x 100 ml) i wodą (1 x 100 ml). Frakcję organiczną wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono przez przepuszczenie przez wkład z SiO2, z elucją mieszaniną 4:1 heksan:EtOAc. Eluat zatężono pod próżnią i otrzymano białą substancję stałą (3,64 g, 9,81 mmola, 87% wydajności). NMR (CDCI3) δ 7,87-7,82 (c, 3 H); 7,72 (s, 1 H); 7,54-7,27 (c, 8 H); 6,11 (ddd, 1 H, J = 6,7, 10,4, 17,0 Hz); 5,34 (dd, 1 H, J = 8,6,

3.5 Hz); 5,10 (d, 1 H, J = 8,2 Hz); 5,08 (d, 1 H, J = 17,2 Hz); 4,56 (t, 1 H, J = 8,8 Hz); 4,26 (dd, 1 H, J = 8,8,

3.5 Hz); 4,16 (ddd, 1 H, J = 8,1, 7,0, 6,9 Hz); 3,68 (dd, 1 H, J = 8,4, 16,5 Hz); 3,50 (dd, 1 H, J = 6,5,

16.5 Hz).

2.1.5. (2'S3'R4S)-3-(2'-Azydo-3'-(2-naftylo)-4'-pentenoilo)-4-fenylo-2-oksazolidynon (A5)

Heksametylodisilazydek potasu (0,5 M w toluenie, 25,5 ml, 12,8 mmola) dodano w jednej porcji do bezwodnego THF (34 ml) w -78°C. Imid A4 (3,64 g, 9,81 mmola) w postaci zawiesiny w THF (34 ml) dodano przez rurkę, z przemywaniem THF (2 x 11 ml) dla zapewnienia całkowitego przeniesienia. Po 30 minutach azydek trisililu (4,40 g, 14,2 mmola) rozpuszczono w THF (34 ml), ochłodzono do -78°C i dodano przez rurkę. Po kolejnych 30 minutach dodano AcOH (1,41 g, 1,34 ml, 23,4 mmola) w celu przerwania reakcji. Mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę rozdzielono pomiędzy CH2CI2 (300 ml) i rozcieńczony roztwór soli (150 ml). Warstwy rozdzielono i fazę wodną wyekstrahowano CH2CI2 (3 x 150 ml). Połączone frakcje organiczne wysuszono (MgSO4)

PL 208 356 B1 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii rzutowej i otrzymano produkt (3,41 g, 8,28 mmola, 84% wydajności). NMR (CDCI3) δ 7,85-7,82 (c, 3 H); 7,72 (s, 1 H); 7,53-7,47 (c, 2 H); 7,42 (dd, 1 H, J = 1,7, 8,5 Hz); 7,37-7,31 (c, 3 H); 7,18-7,15 (c, 2 H); 6,28 (ddd, 1 H, J = 8,2, 10,2, 17,1 Hz); 5,63 (d, 1 H, J = 10,2 Hz); 5,37 (d, 1 H, J = 17,0 Hz); 5,34 (d, 1 H, J = 10,2 Hz); 4,83 (dd, 1 H, J = 3,0, 8,3 Hz); 4,14 (t, 1 H, J = 7,2 Hz); 4,07 (dd, 1 H, J = 9,3, 17,9 Hz); 3,94 (dd, 1 H, J = 3,0, 5.8 Hz); 3,68 (t, 1 H, J = 8,6 Hz).

2.1.6. (2S3R)-2-Azydo-3-(2'-naftylo)-4-pentenian metylu (A6)

Do roztworu imidu A5 (3,41 g, 8,28 mmola) w THF (62 ml) dodano wody (21 ml), 35% H2O2 (2,7 ml) i LiOH^H₂O (695 mg, 16,6 mmola). Po 2 godzinach dodano Na₂SO₃ (4,17 g, 33,1 mmola) w postaci roztworu w wodzie (41 ml). Mieszaninę mieszano przez 15 minut i THF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Wodny roztwór zakwaszono z użyciem HCl i wyekstrahowano EtOAc(2 x 150 ml). Połączone ekstrakty wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość przepuszczono przez kolumnę z wkładem SiO2, z elucją mieszaniną 1:1 heksan:EtOAc, w wyniku czego otrzymano po zatężeniu białą substancję stałą, którą stanowiła przede wszystkim mieszanina kwasu karboksylowego i chiralnego środka pomocniczego. Po rekrystalizacji z heksanu/EtOAc otrzymano chiralny środek pomocniczy w postaci igieł. Roztwór macierzysty zatężono i zastosowano w etapie estryfikacji. Pozostałość zawierającą surowy kwas karboksylowy rozpuszczono w bezwodnym MeOH (46 ml) i ochłodzono do 0°C. Dodano chlorku tionylu (1,18 g, 725 gl, 9,94 mmola) i po 10 minutach mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 2 godziny. Do mieszaniny dodano wody (1,0 ml), całość mieszano przez 10 minut i zawartość kolby zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozdzielono pomiędzy EtOAc (150 ml)i solankę (100 ml). Warstwy rozdzielono, po czym frakcję organiczną wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii rzutowej (19:1 heksan:EtOAc) i otrzymano ester metylowy (1,54 g, 5,48 mmola, 66% wydajności). NMR (CDCI3) δ 7,84-7,80 (c, 3 H); 7,71 (s, 1 H); 7,50-7,46 (c, 2 H); 7,39 (dd, 1 H, J = 1,8, 8,5 Hz); 6,23 (ddd, 1 H, J = 8,3, 10,9, 17,6 Hz); 5,30 (d, 1 H, J = 9,9 Hz); 5,28 (d, 1 H, J = 17,7 Hz); 4,22 (d, 1 H, J = 7,5 Hz); 4,06 (t, 1 H, J = 7,9 Hz).

2.1.7. Ester metylowy trans-3-(2'-naftylo)-L-proliny (A7)

Kompleks borowodór-sulfid metylowy (2,0 M w THF, 6,57 ml, 13,1 mmola) rozcieńczono bezwodnym THF (26 ml) i ochłodzono do 0°C. Cykloheksen (2,16 g, 2,66 ml, 26,3 mmola) dodano ostrożnie za pomocą strzykawki. Po 30 minutach wytrącił się biały osad. Mieszanie kontynuowano przez 3 godziny. Zawartość kolby zatężono pod próżnią. Przygotowano zawiesinę odczynnika w CH2CI2 (36 ml) i ochłodzono do 0°C. Azydek winylu A6 (1,23 g, 4,38 mmola) rozpuszczono w CH2CI2 (9 ml) i dodano przez rurkę. Mieszanina reakcyjna stała się bladożółta i widoczne było wywiązywanie się gazu. Mieszaninę pozostawiono na noc do ogrzania się do temperatury pokojowej. Dodano MeOH (26 ml) i mieszanie kontynuowano przez 15 minut. Mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość roztworzono w Et2O (25 ml) i wyekstrahowano 0,1M HCl (5 x 25 ml). Wodne ekstrakty zalkalizowano nasyconym roztworem NaHCO3 i wyekstrahowano CH2CI2 (3 x 100 ml). Ekstrakty organiczne wysuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią, w wyniku czego otrzymano cyklizowany produkt wraz z pewną ilością zanieczyszczeń pochodzących od dicykloheksyloborowodoru (974 mg, 3,82 mmola, 87% wydajności surowego produktu). NMR (CDCI3) δ 7,84-7,78 (c, 3 H); 7,71 (s, 1 H); 7,49-7,41 (c, 3 H); 3,91 (d, 1 H, J = 6,9 Hz); 3,69 (s, 3 H); 3,63 (m, 1 H), 3,48 (dd, 1 H, J = 8,2, 15,4 Hz); 3,27 (d, 1 H, J = 7,8 Hz); 3,25 (d, 1 H, J = 7,8 Hz); 2,33 (m, 1 H), 2,09 (m, 1 H).

2.1.8. N-Fmoc-trans-3-(2'-naftylo)-L-prolina (A8)

Porcję 510 mg (2 mmole) estru metylowego (A7) w 12 ml 6N HCl ogrzewano w 100°C przez 10 godzin. Roztwór reakcyjny zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i stałą pozostałość przeprowadzono w stan zawiesiny w 15 ml acetonu. Odczyn zawiesiny doprowadzono do pH 9-10 z użyciem 2N roztworu Na2CO3. Następnie powoli dodano 742 mg (2,2 mmola) Fmoc-O-sukcynimidu. Następnie odczyn mieszaniny doprowadzono do pH 9-10 i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, po czym odstawiono ją na noc w temperaturze pokojowej. Następnie odczyn mieszaniny doprowadzono do pH 2 z użyciem stężonego HCl i mieszaninę zmieszano z octanem etylu. Wytrącony produkt (560 mg) odsączono pod próżnią. Fazę wodną wyekstrahowano trzy razy octanem etylu, a następnie zmieszano z chlorkiem metylenu. Tak otrzymano dodatkowo 185 mg produktu w postaci osadu. Wydajność: 745 mg (80,4%). NMR (d6-DMSO) δ 7,95-7,80 (c, 6 H); 7,68 (d, 1 H, J = 7,3 Hz); 7,60 (d, 1 H, J = 7,4 Hz); 7,50-7,34 (c, 6 H); 7,25 (m, 1 H), 4,39-4,15 (c, 4 H); 3,703,48 (c, 3 H); 2,29 (m, 1 H); 2, 14 (m, 1 H).

PL 208 356 B1

2.2. N-Sukcynylo-trans-3-(2'-naftylo)-L-prolilo-L-asparaginylo-L-alaninylo-L-walinoamid (6)

2.2.1. N-Fmoc-trans-3-(2'-naftylo-L-prolino-L-asparagino-L-alanino-L-walinoamid (B1)

Porcję 463,5 mg (1 mmol) N-Fmoc-trans-3-(2'-naftylo)-L-proliny (A8), 338 mg chlorowodorku H-Asn-Ala-Val-NH2 (otrzymanego zwykle stosowanymi metodami w chemii peptydów) i 135 mg HOBT rozpuszczono w 20 ml DMF. W temperaturze 0°C dodano 0,13 ml N-etylomorfoliny i 220 mg DCC. Mieszaninę mieszano w 0°C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, po czym odstawiono ją na noc w temperaturze pokojowej. Wytrącony osad odsączono pod próżnią i roztwór zatężono pod wysoką próż nią . Pozostał o ść rozdzielono pomię dzy pentanol i roztwór NaHCO3. Fazę pentanolu przemyto roztworem KHSO4 i roztworem H2O/NaCl. Wytrącony osad odsączono pod próżnią i starannie roztarto z eterem dietylowym. Otrzymano 473 mg produktu. Fazę pentanolu wysuszono z użyciem Na2SO4 i zatężono. Pozostałość roztarto dwukrotnie z eterem dietylowym. Otrzymano dodatkowo 257 mg produktu. Wydajność: 730 mg (97,7%).

2.2.2. trans-3-(2'-Naftylo)-L-prolino-L-asparagino-L-alanino-L-walinoamid (B2)

Porcję 248 mg (0,332 mmola) N-Fmoc-trans-3-(2'-naftylo)-L-prolino-L-asparagino-L-alanino-L-walinoamidu B1 roztworzono w 5 ml DMF. Dodano 0,35 ml (3,32 mmola) dietyloaminy i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Mieszaninę przesączono pod próżnią przez warstwę klarującą i zatężono pod wysoką próżnią. Stałą pozostałość roztarto z eterem dietylowym i przesączono pod próżnią.

Wydajność: 141 mg (81%).

2.2.3. Bursztynian metylowo-t-butylowy (B3)

W atmosferze argonu sporzą dzono zawiesinę 13,2 g (100 mmoli) bursztynianu monometylu w 500 ml chlorku metylenu. W ciągu 30 minut wkroplono 12,9 ml (150 mmoli) chlorku oksalilu i mieszaninę reakcyjną następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 6 godzin. Po około 3,5 godziny powstał przejrzysty roztwór. Następnie wkroplono 300 ml t-butanolu. Mieszaninę odstawiono w temperaturze pokojowej na 21 godzin i przejrzysty roztwór zatężono. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i przemyto H2O, roztworem NaHCO3 i H2O. Roztwór wysuszono Na2SO4 i zatężono. Wydajność: 21,6 g (surowy produkt podobny do oleju).

2.2.4. Bursztynian mono-t-butylu (B4)

Porcję 9,4 g (50 mmoli) bursztynianu metylowo-t-butylowego (B3) rozpuszczono w 115 ml 1,4-dioksanu. Następnie dodano 110 ml 0,5N NaOH. Mieszaninę odstawiono w temperaturze pokojowej, przy czym wytrącił się produkt. Mieszaninę odstawiono w temperaturze pokojowej na weekend, a następnie zatężono. Wodny roztwór wyekstrahowano eterem dietylowym. Fazę wodną ochłodzono do 0°C i zakwaszono do pH 4 zimnym 2N H2SO4. Mieszaninę następnie pięciokrotnie wyekstrahowano eterem dietylowym. Fazy organiczne połączono, przemyto H2O, wysuszono Na2SO4 i zatężono. Wydajność: 5,62 g oleju (64,5%).

2.2.5. N-t-Butylosukcynylo-trans-3-(2'-naftylo)-L-prolino-L-asparagino-L-alanino-L-walinoamid (B5)

Porcję 262 mg (0,5 mmola) trans-3-(2'-naftylo)-L-prolino-L-asparagino-L-alanino-L-walinoamidu (B2), 87,1 mg (0,5 mmola) bursztynianu mono-t-butylu (B4) i 67,5 mg HOBt rozpuszczono w 5 ml DMF. W temperaturze 0°C dodano 110 mg DCC i mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, po czym odstawiono na noc w temperaturze pokojowej. Wytrącony osad odsączono pod próżnią i przesącz zatężono pod wysoką próżnią.

PL 208 356 B1

Pozostałość roztarto z roztworem NaHCO3, przesączono pod próżnią, przemyto H2O i wysuszono w eksykatorze. Wydajność: 169 mg (49,6%).

2.2.6. N-Sukcynylo-trans-3-(2'-naftylo)-L-prolino-L-asparagino-L-alanino-L-walinoamid (6)

Porcję 316 mg N-t-butylosukcynylo-trans-3-(2'-naftylo)-L-prolino-L-asparagino-L-alanino-L-walinoamidu (B5) rozpuszczono w 2 ml 90% kwasu trifluorooctowego i odstawiono w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Mieszaninę następnie przesączono przez warstwę klarującą i zatężono. Pozostałość roztarto z eterem dietylowym i przesączono pod próżnią. Otrzymano 159 mg surowego produktu. W celu oczyszczenia substancję poddano chromatografii na Sephadex^® LH20, z użyciem mieszaniny butanol/lodowaty kwas octowy/woda. Wydajność: 27,5 mg (9,5%). m/z: 625,298949 (M+H)⁺ (widmo masowe wysokiej rozdzielczości).

Dane NMR dla związku 6

Przesunięcia chemiczne dla związku 6 w DMSO w 300 K

Patrz powyższy wzór	¹H	¹³C
	trans	cis	trans	cis
But-1	-	-	173,88	173,92
But-2	2,54/2,46	2,61/2,20	28,64	28,37
But-3	2,70/2,54	2,56/2,39	28,80	28,80
But-4	-	-	170,67	170,22
Pro-α	4,39	4,68	66,18	65,46
Pro-C'	-	-	171,03	170,94
Pro-β	3,55	3,68	47,42	49,45
Pro-γ	2,40/2,16	2,33/1,94	32,02	30,41
Pro-δ	3,81/3,72	3,59/3,53	46,12	45,40
Nap-1	-	-	138,79	139,55
Nap-2	7,76	7,78	125,14	124,79
Nap-2a	-	-	132,97	132,97
Nap-3	7,87	7,87	127,66	127,66
Nap-4	7,49	7,49	126,03	126,03

PL 208 356 B1

Patrz powyższy wzór	¹H	¹³C
Nap-5	7,48	7,48	125,63	125,63
Nap-6	7,88	7,88	127,33	127,33
Nap-6a	-	-	131,98	131,98
Nap-7	7,87	7,89	127,97	127,97
Nap-8	7,45	7,46	125,96	125,96
Asn-NH	8,31	8,50	-	-
Asn-α	4,44	4,64	50,13	49,79
Asn-C'	-	-	170,58	170,29
Asn-β	2,64/2,46	2,57/2,45	36,96	36,25
Asn-Y-C'	-	-	171,73	171,44
Asn^-NH2	7,41/6,93	7,33/6,93	-	-
Ala-NH	7,74	8,02	-	-
Ala-α	4,19	4,27	48,71	48,46
Ala-C'	-	-	171,84	171,78
Ala-β	1,22	1,19	17,49	18,04
Val-NH	7,48	7,70	-	-
Val-a	4,04	4,08	57,69	57,57
Val-C'	-	-	172,77	172,73
Val-e	1,97	1,97	30,08	30,29
Val-Y	0,82	0,86	19,24	19,27
Val-Y'	0,82	0,84	17,89	17,97
Val-NH2	7,15/6,99	7,27/7,00	-	-

3. Hamowanie oddziaływania laminina/nidogen i działanie biologiczne

O ile nie podano inaczej, stosowane chemikalia nabyto z firmy Merck (Darmstadt), Sigma (Monachium) lub Riedel de Haen (Seelze).

Izolowanie lamininy P1 z ludzkiego łożyska, ludzkiego nidogenu z transfekowanych komórek HEK-293 i mysiej lamininy γ1 III 3-5 z komórek HEK-293 opisano w WO 98/31709.

P r z y k ł a d 3.1. Próby hamowania - hamowanie wiązania laminina/nidogen z użyciem znalezionych pochodnych peptydowych

3.1.1. Próba przesiewania HTS (bardzo wrażliwy wariant próby)

Szybka próba fluorescencyjna

Powlekanie probówek

Płytki mikrotitracyjne (np. FluoroNunc®) powleczono 75 gl 0,1 gg/ml roztworu lamininy P1 (w 0,159 g Na2CO3, 0,293 g NaHCO3, 0,02 g NaN3/litr, pH 9,2) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Roztwór następnie odpipetowano i wolne miejsca wiązania zablokowano przez inkubację z 0,5% BSA (w 7,9 g NaCl, 1,2 g Na2HPO4, 0,31 g KCl, 0,23 g NaH2PO4, 0,04% Tween 20/litr, pH 7,2) w temperaturze pokojowej przez 0,5 godziny. Po zakończeniu reakcji blokowania roztwór zdekantowano i przeprowadzono jednorazowe przemywanie 250 gl buforu do przemywania (PBS/0,04% Tween).

Hamowanie sekwencyjne

Równolegle z powlekaniem przeprowadzono wstępną inkubację 85-100 gl 0,25 nM roztworu nidogen (ludzkiego nidogenu otrzymanego rekombinacyjnie) z inhibitorem lub wzorcem, w odrębnym naczyniu reakcyjnym (1 godzina w temperaturze pokojowej, w 7,9 g NaCl, 1,2 g Na2HPO4, 0,31 g KCl, 0,23 g NaH2PO4, 0,04% Tween 20/litr, 0,5% BSA, pH 7,2).

PL 208 356 B1

Porcję 75 μΐ mieszaniny preinkubacyjnej (nidogen + inhibitor lub wzorzec) przeniesiono do powlekanych studzienek na płytce mikrotitracyjnej i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie przeprowadzono dwukrotne przemywanie PBS/0,04% Tween. Związany nidogen wykrywano drogą inkubacji (w temperaturze pokojowej) przez 1 godzinę z 75 μl preparatu specyficznych przeciwciał, otrzymanego z żółtek jaja od kur immunizowanych ludzkim nidogenem. Frakcję IgY zastosowano w rozcieńczeniu 1:500 w PBS/0,04% Tween. Kompleks nidogenu i specyficznie związanego przeciwciała, po dwukrotnym przemyciu PBS/0,04% Tween, wykryto przez dodanie przeciwkurczęcej IgY-biotyny (75 μl w rozcieńczeniu 1:2500; Promega, Madison, Wl 53711, 608-274-4330). W tym celu po trwającej 1 godzinę inkubacji i idwukrotnym przemyciu PBS/0,04% Tween przeprowadzono inkubację ze streptawidyną-europem (Wallac; 1 godzina w temperaturze pokojowej) i dwukrotne przemywanie PBS/0,04% Tween. Na koniec, po dodaniu 100 μl roztworu wzmacniającego (Wallac) i wytrząsaniu przez 5 minut, zmierzono sygnał fluorescencji w wieloznacznikowym liczniku Victor, z zastosowaniem procedury dla europu. Ustalono zależność między ilością związanego nidogenu w roztworach z inhibitorem i ilością nidogenu bez inhibitora.

3.1.2. Trzydniowa próba równowagi

W tym wariancie próby zbadano hamujące działanie wybranych inhibitorów. Próbę tę opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5493008.

W poniższej tabeli porównano wartości IC50 dla wybranych substancji z wynikami próby przesiewowej HTS. Wyraźnie widać, że w próbie trzydniowej uzyskuje się nieznacznie niższe zmierzone wartości, oraz, zgodnie z oczekiwaniem, że jest ona czulsza niż próba przesiewowa. Jednakże z tego porównania również wynika, że struktury hamujące można w sposób wiarygodny identyfikować w opracowanej próbie przesiewowej

T a b e l a 2. Charakterystyka określonych inhibitorów połączenia laminina/nidogen:

wartości IC50 ^M) w różnych wariantach próby

Struktura	Próba HTS	Trzydniowa próba równowagi
NIDPNAV	3,9	1,2
DPNAV	7,7	5,0
Związek 4	0,19	0,085

P r z y k ł a d 3.2 (hipotetyczny)

Badanie działania biologicznego pochodnych peptydowych

Do badania działania biologicznego pochodnych peptydowych można stosować szereg modeli szczegółowo opisanych w literaturze.

Pewne reprezentatywne modele wymieniono poniżej:

Tworzenie się kanalików w hodowlach embrionalnych nerek.

Grobstein C; (1956) Exp. Cell Res. 10: 424-440.

Ekblom P. i in., (1994) Development 120: 2003-2014 Morfologia rozgałęziania w embrionalnych płucach.

Ekblom P. i in., (1994) Development 120: 2003-2014 Morfologia rozgałęziania w embrionalnych gruczołach ślinowych.

Grobstein C. (1953) J. Exp. Zool, 124: 383-413 Kadoya Y. i in., (1997) Development 124: 683-691 Składanie błony podstawnej w organotypowej hodowli skóry.

Smola H.; Stark H.-J.; Thiekotter G.; Mirancea N.; Krieg, T.; Fusenig, N.E. (1998) Exp. Cell Res. 239: 399-410

Odtwarzanie hydry z rozbitych komórek.

Yang Y. G.; Mayura K.; Spainhour C. B.; Edwards Jr. J. F.; Phillips T. D. (1993) Toxicology 85: 179-198.

Pogrubianie błon podstawnych u hydry po hodowli przy podwyższonym stężeniu glukozy. Zhang X.; Huff J. K.; Hudson B. G.; Sarras Jr. M. P. (1990) Diabetologia 33: 704-707

Wszystkie typy prób ilościowej oceny angiogenezy zestawiono w artykule przeglądowym Jain, R.K. i in., w Nature Medicine (1997) tom 3. nr 11, np.:

Wywoływanie naczyniaków krwionośnych u myszy przez szczepianie komórek spontanicznych naczyniaków krwionośnych z komórek śródbłonkowych.

PL 208 356 B1

O'Reilly M. S.; Brem M. S.; Folkman J. (1995) J. Pediatr. Surg. 30:2; 325-329 Wzrost mikronaczyń w wolnej od surowicy hodowli aorty szczura.

Nicosia R. F.; Ottinetti A. (1990) Lab. Invest, 63, nr. 1, 115-122

Tworzenie się kapilar komórek śródbłonkowych na mikronośnikach po osadzeniu w żelu fibrynowym.

Nehls V.; Drenckhahn D. (1995) Microvascular Research 50: 311-322.

Claims

1. Pochodne peptydowe o wzorze I w którym

R1 oznacza grupę o jednym z następujących wzorów w których

R4 oznacza -A lub -NH2, a R5 oznacza -(CH2)l-COOA,

X oznacza grup ę o jednym z następują cych wzorów w których

PL 208 356 B1 w których R6 oznacza -H, -COOH, -CONH2, -CONR2 lub -CH2OH, a R7 oznacza niepodstawiony, liniowy lub rozgałęziony C1-C10-alkil, a

Ar oznacza fenyl lub naftyl, a Z oznacza (CH2)m,

A oznacza H lub C1-C4-alkil, l oznacza liczbę całkowitą 0 lub 1, m oznacza liczbę całkowitą 1, r oznacza liczbę całkowitą 1, n oznacza liczbę całkowitą 1, a k oznacza liczbę całkowitą 1 lub 2, w postaci dowolnych stereoizomerów i ich mieszanin w dowolnych stosunkach, a także ich fizjologicznie tolerowanych soli.

2. Związki o wzorze I według zastrz. 1, w którym R w grupie X oznacza Ar ewentualnie podstawiony grupą -O-C1-C6-alkilo-fenyl lub fenylem.

3. Związki o wzorze I według zastrz. 2, w którym R w grupie X oznacza Ar.

4. Związki o wzorze I według zastrz. 3, w którym Ar oznacza grupę o wzorze

5. Związki o wzorze I według zastrz. 3, w którym Ar oznacza grupę o wzorze

6. Związki o wzorze I według zastrz. 3, w którym Ar oznacza grupę o wzorze

7. Związki o wzorze I według zastrz. 2, w którym R w grupie X oznacza grupę o wzorze

8. Związki o wzorze I według zastrz. 2, w którym R w grupie X oznacza grupę o wzorze

PL 208 356 B1

9. Związki o wzorze I według zastrz. 1 - 8, w którym X oznacza grupę o następującym wzorze

10. Związki o wzorze I według zastrz. 1 - 9, w którym R1 oznacza grupę o następującym wzorze

11. Związki o wzorze I według zastrz. 10, w którym R5 oznacza -(CH2)I-COOA.

12. Związki o wzorze I według zastrz. 11, w którym A oznacza H.

13. Związki o wzorze I według zastrz. 11 albo 12, w którym l oznacza 0.

14. Związki o wzorze I według zastrz. 10 - 13, w którym R4 oznacza -NH2.

15. Związki o wzorze I według zastrz. 10 - 13, w którym R4 oznacza -A.

16. Związki o wzorze I według zastrz. 15, w którym A oznacza H.

17. Związki o wzorze I według zastrz. 1 - 9, w którym R1 oznacza grupę o następującym wzorze

18. Związki o wzorze I według zastrz. 17, w którym R4 oznacza -NH2.

19. Związki o wzorze I według zastrz. 17 albo 18, w którym R5 oznacza -(CH2)l-COOA.

20. Związki o wzorze I według zastrz. 19, w którym l oznacza 0.

21. Związki o wzorze I według zastrz. 19 albo 20, w którym A oznacza H.

22. Związki o wzorze I według zastrz. 1 - 21, w którym R2 oznacza A.

23. Związki o wzorze I według zastrz. 22, w którym R2 oznacza -CH3.

24. Związki o wzorze I według zastrz. 1 - 21, w którym R2 oznacza -E-OH.

25. Związki o wzorze I według zastrz. 24, w którym R2 oznacza -CH2-OH.

26. Związki o wzorze I według zastrz. 1 - 25, w którym R3 oznacza grupę o następującym wzorze

27. Związki o wzorze I według zastrz. 26, w którym k oznacza 2.

PL 208 356 B1

28. Związki o wzorze I według zastrz. 1 - 25, w którym R3 oznacza grupę o następującym wzorze

29. Związki o wzorze I według zastrz. 1 - 25, w którym R3 oznacza grupę o następującym wzorze

30, w którym R7 oznacza 30, w którym R7 oznacza 30, w którym R7 oznacza 34, w którym R6 oznacza 34, w którym R6 oznacza 34, w którym R6 oznacza 34, w którym R6 oznacza 34, w którym R6 oznacza według zastrz. według zastrz. według zastrz. według zastrz. 29 według zastrz. 29 według zastrz. 29 według zastrz. 29 według zastrz. 29

C10-alkil.

C(CH3)3.

CH(CH3)CH2CH3.

CH2-CH(CH3)2.

H.

COOH. CONH2. CH2OH. CON(CH3)2.

30. Związki o wzorze

31. Związki o wzorze

32. Związki o wzorze

33. Związki o wzorze

34. Związki o wzorze

35. Związki o wzorze

36. Związki o wzorze

37. Związki o wzorze

38. Związki o wzorze Związki o wzorze według zastrz. 29, w którym R7 oznacza rozgałęziony C1 według zastrz. 30, w którym R7 oznacza -CH(CH3)2.

39.

40. Środek farmaceutyczny zawierający substancję czynną oraz ewentualnie farmaceutycznie nieszkodliwe zaróbki i/lub dodatki, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden związek peptydowy określony w zastrz. 1 - 39 i/lub jego fizjologicznie tolerowane sole.

41. Związki peptydowe określone w zastrz. 1 - 39 i/lub ich fizjologicznie tolerowane sole do stosowania jako lek.

42. Zastosowanie związków peptydowych określonych w zastrz. 1 - 39 i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli do wytwarzania leku do leczenia choroby związanej ze zwiększoną lub niepożądaną syntezą błon podstawnych, przy czym chorobę tę stanowią późne powikłania cukrzycowe, zwłóknienie, któremu towarzyszy zwiększona synteza błon podstawnych lub ich składników, korzystnie zwłóknienie wątroby, miażdżyca tętnic, rak, retynopatia cukrzycowa, pozasoczewkowy rozrost włóknisty, choroba związana z silną składową zapalną, korzystnie reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie stawów i kości lub zapalenie naczyń, choroba związana z naczyniakami krwionośnymi lub łuszczyca.

43. Sposób identyfikacji związku, który hamuje oddziaływanie pomiędzy lamininą i nidogenem, znamienny tym, że związek peptydowy określony w zastrz. 1 - 39 stosuje się jako konkurencyjny inhibitor oraz obejmuje etapy:

a) wytwarzanie bibliotek peptydów z zastosowaniem chemii w fazie stałej,

c) wstępne inkubowanie roztworów podstawowych związków otrzymanych b) z nidogenem,

44. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że ponadto formułuje się zidentyfikowany związek w farmaceutycznie dopuszczalną postać.