CN1688599A - 二肽基肽酶iv抑制剂的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种DPIV抑制剂的新用途。本发明的化合物及其药学可接受的酸加成盐适用于治疗受DPIV或DPIV样酶调控的疾病，如免疫、自身免疫疾病或中枢神经系统疾病，选自中风、肿瘤、局部缺血、帕金森氏症和偏头痛。在一个更优选的实施方案中，本发明的化合物适用于治疗多发性硬化病。

Description

二肽基肽酶IV抑制剂的新用途

技术领域

本发明涉及二肽基肽酶IV或二肽基肽酶IV样酶活性的抑制剂。更具体而言，本发明涉及包含所述化合物的药用组合物，以及所述化合物在治疗中枢神经系统疾病、免疫或自身免疫疾病中的应用。特别地，本发明涉及一种治疗多发性硬化病的方法。

背景技术

二肽基肽酶IV(DPIV)是一种丝氨酸蛋白酶，它从次末端优选包含脯氨酸残基的肽链上切割N-端二肽。尽管DPIV在哺乳动物体内的生物学作用机制尚未被完全建立，可以确信它在神经肽代谢、T-细胞激活以及HIV进入淋巴细胞等过程中扮演着重要的角色。

类似地，已经发现DPIV与胰高血糖素样肽-1(GLP-1)以及也被称作肠抑胃肽的葡萄糖依赖性胰岛素释放肽(GIP)的失活有关。由于GLP-1是一种主要的胰腺胰岛素分泌的促进剂，对于糖代谢具有直接的好处，因此在WO 97/40832和US 6,303,661中显示了在治疗非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)中，抑制DPIV和DPIV样酶活性是一条具有吸引力的途径。

本发明提供一种DPIV抑制剂的新用途，用于预防和治疗受DPIV和DPIV样酶抑制调控的病症，特别是预防和治疗神经系统疾病和免疫病，包括多发性硬化病。本发明还提供药用组合物，例如用于抑制DPIV和DPIV样酶的药用组合物，以及抑制所述酶活性的方法。

本发明涉及一种治疗方法，特别是一种用于预防和治疗神经系统疾病、免疫和自身免疫疾病，特别是多发性硬化病的方法，以及用于所述方法的化合物和组合物。二肽基肽酶IV(DPIV)是一种存在于机体多种组织(包括肾、肝和肠)中的脯氨酸后(程度小的丙氨酸后、丝氨酸后或甘氨酸后)切割的丝氨酸蛋白酶。

已知DPIV抑制剂可以用于治疗葡糖耐量受损和糖尿病(国际专利申请公开WO 99/61431；Pederson RA等人，Diabetes.1998 Aug，47(8)：1253-8和Pauly RP等人，Metabolism 1999 Mar，48(3)：385-9)。特别是在WO 99/61431中公开了包含氨基酸残基和噻唑烷或吡咯烷基的DPIV抑制剂及其盐，特别是L-苏-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-苏-异亮氨酰吡咯烷、L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰吡咯烷及其盐。

低分子量二肽基肽酶IV抑制剂的其它实例包括如四氢异喹啉-3-羰酰胺衍生物、N-取代2-氰基吡咯或2-氰基吡咯烷、N-(N′-取代甘氨酰)-2-氰基吡咯烷、(N-取代甘氨酰)-噻唑烷、(N-取代甘氨酰)-4-氰基噻唑烷、氨酰基-二羟硼基-脯氨酰基抑制剂和稠合环丙基的吡咯烷。在US 6,011,155；US 6,107,317；US 6,110,949；US6,124,305；US 6,172,081；WO 99/61431；WO 99/67278；WO 99/67279；DE 19834591；WO 97/40832；DE 19616486C2；WO 98/19998；WO00/07617；WO 99/38501；WO 99/46272；WO 99/38501；WO 01/68603；WO 01/40180；WO 01/81337；WO 01/81304；WO 01/55105；WO 02/02560和WO 02/14271中描述了二肽基肽酶IV的抑制剂，有关这些抑制剂及其用途、定义和制备方法等的描述被本专利全部引用作为参考。

术语DPIV样酶涉及与DPIV/CD26结构和/或功能相关的酶蛋白(Sedo&Malik，二肽基肽酶IV样分子：相似的蛋白或相似的活性？(Dipeptidyl peptidase IV-like molecules：homologous proteins or homologousactivities？)Biochimica et Biophysica Acta 2001，36506：1-10)。从根本上说，这一小类酶与从寡肽或多肽N-端释放H-Xaa-Pro-二肽和H-Xaa-Ala-二肽的过程有关。它们的共性在于可以结合肽链上的Pro和Ala、Ser和Thr以及其它含有小的疏水性侧链的氨基酸如Gly和Val。水解效能为Pro＞Ala》Ser、Thr》Gly、Val。仅能得到如此少量的相同蛋白，以至于仅能够实现后Pro或后Ala切割。虽然蛋白DPIV、DPII、FAPα(Seprase)、DP6、DP8和DP9结构相关并且显示出高度的序列同源性，但具有吸引力的是一类特殊的功能性DPIV样酶，其特征在于具有类似的活性和抑制特征。

WO 01/19866、WO 02/34900和WO 02/31134公开了其它一些DPIV样酶。WO 01/19866公开了新型的人二肽基氨基肽酶8(DPP8)，其结构和功能类似于DPIV和成纤维细胞激活蛋白(FAP)。WO 02/34900公开了新型的二肽基肽酶9(DPP9)，其氨基酸序列与DPIV和DPP8具有明显的同源性。WO 02/31134公开了三种DPIV样酶DPRP1、DPRP2和DPRP3。序列分析表明DPRP1与WO 01/19866中公开的DPP8相同，DPRP2与DPP9相同，而DPRP3与WO 02/04610中公开的KIAA1492相同。

多发性硬化病(MS)是一种中枢神经系统脱髓鞘病，其发病机制推测是涉及自身抗原特异性CD4⁺T细胞和细胞因子(Rohowsky-Kochan，C.Molinaro.D.and Cook.SD，多发性硬化病中髓鞘碱性蛋白特异性T细胞的细胞因子分泌特征(Cytokine secretion profile of myelin basic protein-specific T cells in multiplesclerosis)，Multiple Sclerosis 6，69-77，2001)。

MS所涉及的退化是由于髓鞘的退化，髓鞘是一种包围神经纤维的电绝缘性的脂肪层，使得电信号快速传导。髓鞘丧失可能明显降低神经元传导电信号的效率。症状依赖于中枢神经系统(CNS)中哪一部位发生了髓鞘丧失，以及由此产生的神经通路受损。

这种疾病表现出了自身免疫的特征，即、是机体自身免疫系统造成了这种损害作用。髓鞘碱性蛋白(MBP)是自身免疫反应的主要靶位，虽然其它MS抗原也被推测是自身免疫反应的作用靶位。在疾病的初期，有一类称为少突细胞的CNS细胞可以修复损伤并且恢复丧失的髓鞘。但是在MS中这些细胞也会受到损害，并且随时间的推移受损细胞可能会丧失其修复能力，从而导致病症的进一步加剧。

病症进展的机制是复杂的，免疫系统中的几个因素均与该疾病有关。虽然根本上的组织损伤可能主要来源于T细胞调控的反应，对抗MS抗原的抗体常出现在脑脊髓液(CSF)和活性病灶中。抗体一般不会存在于CSF中，此时作为CNS周围保护性膜的血脑屏障(BBB)一定发生了某些破损，使得抗体、T细胞和巨噬细胞进入CSF中。这种BBB通透性的改变似乎是MS病症进展中确定要发生的事件之一。

激活的巨噬细胞分泌促炎细胞因子如TNF-α和干扰素-γ，导致分解酶和自由基产生。加之免疫反应自身的复杂特性，这种疾病可能也会影响多个靶位。除髓鞘外，其它细胞如星形胶质细胞和小胶质细胞可以受到攻击，构成被称为蚀斑或病灶的单独受损区域。这种病灶也被称作硬化(该疾病因此得名)，而且可以发生在大脑和神经结上。病灶的位置趋向于近血管处，通常见于视神经、小脑、脑室周围区域和脊索之中。

该疾病出现的初始机制尚不十分清楚，而且事实上在任何给定时间中活性病灶的数目非常低。这种疾病的异质特性以及由此所造成临床上亚型数目众多的情况说明MS可能并不是一种疾病，而是一类相关的疾病。

发明内容

本发明提供一种DPIV抑制剂的新用途。分子式1-12所代表的化合物及其相应的药学可接受的酸加成盐适用于治疗受DPIV或DPIV样酶调控的疾病，如免疫、自身免疫疾病或中枢神经系统疾病，选自中风、肿瘤、局部缺血、帕金森氏症和偏头痛。在一个更优选的实施方案中，本发明的化合物适用于治疗多发性硬化病。

附图说明

图1显示了实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的临床病程，其中研究了不同剂量的异亮氨酰噻唑烷富马酸盐对成年雌性Lewis大鼠EAE临床病程的作用。图中符号表示每天的平均临床分值“平均值±SEM”。用于重复测量的双处理因素ANOVA表明在处理因素“治疗”和“不同时间的临床评分”间存在明显交互效应，说明在9-12(13)天的标准初始急性期间，DPIV抑制剂加重了病症，而在13-15天期间它们又改善或加速了病症的缓解。

图2显示了在免疫后10-15天期间，采用异亮氨酰噻唑烷富马酸盐治疗大鼠实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的临床病程的裂区分析。分离的单处理因素ANOVA表明1mg剂量组在免疫后11和12天时病症明显加重，10mg剂量组在免疫后15明显降低了临床评分。这表明抑制剂最初加重病症但在随后的阶段中又导致病症的加速恢复。棒图表示每天的平均临床分值“平均值±SEM”。星号表示在PLSD检验中存在显著的post-hoc效应，^*＜0.05，^**＜0.001。

图3显示了实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的临床病程，其中研究了病症发展期间(免疫后5-15天)不同剂量的异亮氨酰噻唑烷富马酸盐对成年雄性Lewis大鼠EAE临床病程的作用。图中符号表示每天的平均临床分值“平均值±SEM”。用于重复测量的双处理因素ANOVA表明在处理因素“治疗”和“不同时间的临床评分”间存在明显交互效应，说明治疗明显调控了病症的过程，同时也表明不同剂量药物作用不同。中等剂量治疗后药物起促炎作用并造成病症的“早期峰值”和症状加重。在病症的急性期间(第9-13天)，高剂量的异亮氨酰噻唑烷富马酸盐明显改善了临床病程。

图4显示了在免疫后10-15天期间，采用异亮氨酰噻唑烷富马酸盐治疗大鼠实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的临床病程的裂区分析。分离的单处理因素ANOVA表明1mg剂量组在免疫后11和12天时病症明显加重，10mg剂量组在免疫后15明显降低了临床评分。这表明抑制剂最初加重病症但在随后的阶段中又导致病症的加速恢复。棒图表示每天的平均临床分值“平均值±SEM”。星号表示在PLSD检验中存在显著的post-hoc效应，^*＜0.05，^**＜0.001。

图5显示了实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的临床病程，其中研究了病症发展期间(免疫后5-15天)经套管脑室给药不同剂量的异亮氨酰噻唑烷富马酸盐对成年雌性Lewis大鼠EAE临床病程的作用。图中符号表示每天的平均临床分值“平均值±SEM”。用于重复测量的双处理因素ANOVA表明处理因素“治疗”存在主效应，处理因素“治疗”与“不同时间的临床评分”间存在明显交互效应，说明治疗明显调控了病症的过程。所有DPIV抑制剂剂量组均表现出抗炎作用，表现出临床病程发作的延迟以及症状的改善。

具体实施方式

本发明涉及抑制二肽基肽酶IV(DPIV)的领域。更具体而言，本发明涉及DPIV或DPIV样酶活性抑制剂的一种新用途，用于预防和治疗神经或免疫疾病，特别是治疗多发性硬化病。本发明还涉及包含所述化合物的药用组合物。

在一个说明性的实施方案中，本发明涉及由氨基酸和噻唑烷和吡咯烷基构成的二肽化合物以及二肽化合物的类似物及其盐，此后称其为二肽化合物。

特别适用于本发明目的的二肽化合物中所包含的氨基酸优选选自天然氨基酸，如亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸。

如表7所示，本发明所采用的二肽化合物在10μM浓度下降低DPIV或DPIV样酶活性至少10％，特别地可以降低酶活性降低至少40％。常常还需要将活性降低至少60％或至少70％。优选的效应物最大可降低活性20％或30％。

优选的化合物为L-别-异亮氨酰噻唑烷，L-苏-异亮氨酰吡咯烷及其盐，特别是富马酸盐，以及L-别-异亮氨酰吡咯烷及其盐。特别优选的化合物为分子式1和2所示的谷氨酰胺酰吡咯烷和谷氨酰胺酰噻唑烷。

其它优选实施例列于表1中。

二肽化合物的盐中二肽化合物组分和盐组分的摩尔比可以为1∶1或2∶1。例如，盐可以是(Ile-Thia)₂富马酸。

表1：其它优选二肽化合物的结构

效应物
	H-Asn-吡咯烷
H-Asn-噻唑烷
	H-Asp-吡咯烷
H-Asp-噻唑烷
	H-Asp(NHOH)-吡咯烷
H-Asp(NHOH)-噻唑烷
	H-Glu-吡咯烷
H-Glu-噻唑烷
	H-Glu(NHOH)-吡咯烷
H-Glu(NHOH)-噻唑烷
	H-His-吡咯烷
H-His-噻唑烷
	H-Pro-吡咯烷
H-Pro-噻唑烷
	H-Ile-azididine
H-Ile-吡咯烷
	L-别-Ile-噻唑烷
H-Vla-吡咯烷
	H-Vla-噻唑烷

在另一优选实施方案中，本发明提供分子式3所示的化合物，用于竞争性调节二肽基肽酶IV的催化反应：

其中：

A、B、C、D和E独立地是氨基酸部分，包括蛋白源氨基酸、非蛋白源氨基酸、L-氨基酸和D-氨基酸，其中E和/或D在以下附加条件下可以不存在：

分子式(3)的其它条件：

A为除D-氨基酸以外的任意氨基酸；

B为选自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮杂环丁烷基-(2)-甲酸和2-哌啶酸的氨基酸，

C为除Pro、Hyp、氮杂环丁烷基-(2)-甲酸、2-哌啶酸以外的任意氨基酸，N-烷基化氨基酸，如N-甲基缬氨酸和肌氨酸也除外，

D为任意氨基酸或不存在，并且

E为任意氨基酸或不存在；或者

C为除Pro、Hyp、氮杂环丁烷基-(2)-甲酸、2-哌啶酸以外的任意氨基酸，N-烷基化氨基酸如N-甲基缬氨酸和肌氨酸也除外，D-氨基酸也除外，

D为选自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮杂环丁烷基-(2)-甲酸和2-哌啶酸的氨基酸，

E为除Pro、Hyp、氮杂环丁烷基-(2)-甲酸、2-哌啶酸以外的任意氨基酸，N-烷基化氨基酸如N-甲基缬氨酸和肌氨酸也除外。

权利要求书和说明书中氨基酸的实例为：

天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)，组氨酸(His)，甘氨酸(Gly)，丝氨酸(Ser)，半胱氨酸(Cys)，苏氨酸(Thr)，天冬酰胺(Asn)，谷氨酰胺(Gln)，酪氨酸(Tyr)，丙氨酸(Ala)，脯氨酸(Pro)，缬氨酸(Val)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，甲硫氨酸(Met)，苯丙氨酸(Phe)，色氨酸(Trp)，羟脯氨酸(Hyp)，β-丙氨酸(beta-Ala)，2-氨基辛酸(Aoa)，氮杂环丁烷基-(2)-甲酸(Ace)，2-哌啶酸(Pip)，3-氨基丙酸，4-氨基丁酸等等，α-氨基异丁酸(Aib)，肌氨酸(Sar)，鸟氨酸(Orn)，瓜氨酸(Cit)，高精氨酸(Har)，叔丁基丙氨酸(叔丁基-Ala)，叔丁基甘氨酸(叔丁基-Gly)，N-甲基异亮氨酸(N-Melle)，苯基甘氨酸(Phg)，环己基丙氨酸(Cha)，正亮氨酸(Nle)，半胱磺酸(Cya)，甲硫氨酸亚砜(MSO)，乙酰基-Lys，改性氨基酸如磷酸丝氨酸(Ser(P))，苄基丝氨酸(Ser(Bzl))和磷酸酪氨酸(Tyr(P))，2-氨基丁酸(Abu)，氨乙基半胱氨酸(AECys)，羧甲基半胱氨酸(Cmc)，脱氢丙氨酸(Dha)，脱氢氨基-2-丁酸(Dhb)，羧基谷氨酸(Gla)，高丝氨酸(Hse)，羟基赖氨酸(Hyl)，顺式羟脯氨酸(cisHyp)，反式羟脯氨酸(transHyp)，异缬氨酸(Iva)，焦谷氨酸(Pyr)，正缬氨酸(Nva)，2-氨基苯甲酸(2-Abz)，3-氨基苯甲酸(3-Abz)，4-氨基苯甲酸(4-Abz)，4-(氨甲基)苯甲酸(Amb)，4-(氨甲基)环己基甲酸(4-Amc)，青霉胺(Pen)，2-氨基-4-氰基丁酸(Cba)，环烷基甲酸。

ω-氨基酸的实例为：如5-Ara(氨基戊酸)，6-Ahx(氨基己酸)，8-Aoc(氨基辛酸)，9-Anc(氨基壬酸)，10-Adc(氨基癸酸)，11-Aun(氨基十一酸)，12-Ado(氨基十二酸)。其它氨基酸有：2，3-二氢化茚基甘氨酸(Igl)，二氢吲哚基-(2)-甲酸(Idc)，八氢吲哚基-(2)-甲酸(Oic)，二氨基丙酸(Dpr)，二氨基丁酸(Dbu)，萘基丙氨酸(1-Nal)、(2-Nal)，4-氨基苯丙氨酸(Phe(4-NH₂))，4-苯甲酰基苯丙氨酸(Bpa)，联二苯丙氨酸(Dip)，4-溴苯丙氨酸(Phe(Br))，2-氯苯丙氨酸(Phe(2-Cl))，3-氯苯丙氨酸(Phe(3-Cl))，4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))，3，4-二氯苯丙氨酸(Phe(3，4-Cl₂))，3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))，4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))，3，4-二氟苯丙氨酸(Phe(3，4-F₂))，五氟苯丙氨酸(Phe(F₅))，4-胍基苯丙氨酸(Phe(4-胍基))，高苯丙氨酸(hPhe)，3-碘苯丙氨酸(Phe(3-I))，4-碘苯丙氨酸(Phe(4-I))，4-甲基苯丙氨酸(Phe(4-Me))，4-硝基苯丙氨酸(Phe-4-NO₂)，联二苯丙氨酸(Bip)，4-膦酰基甲基苯丙氨酸(Pmp)，环己基甘氨酸(Ghg)，3-吡啶基丙氨酸(3-Pal)，4-吡啶基丙氨酸(4-Pal)，3，4-脱氢脯氨酸(A-Pro)，4-酮基脯氨酸(Pro(4-酮基))，硫代脯氨酸(Thz)，isonipecotic acid(Inp)，1，2，3，4-四氢异喹啉基-3-甲酸(Tic)，炔丙基甘氨酸(Pra)，6-羟基正亮氨酸(NU(6-OH))，高酪氨酸(hTyr)，3-碘酪氨酸(Tyr(3-I))，3，5-二碘酪氨酸(Tyr(3，5-I₂))，d-甲基酪氨酸(tyr(Me))，3-硝基酪氨酸(Tyr(3-NO₂))，磷酸酪氨酸(Tyr(PO₃H₂))，烷基甘氨酸，1-氨基1，2-二氢化茚基-1-甲酸，2-氨基1，2-二氢化茚基-2-甲酸(Aic)，4-氨基-甲基吡咯基-2-甲酸(Py)，4-氨基吡咯烷基-2-甲酸(Abpc)，2-氨基四氢萘基-2-甲酸(Atc)，二氨基乙酸(Gly(NH₂))，二氨基丁酸(Dab)，1，3-二氢-2H-异吲哚基甲酸(Disc)，高环己基丙氨酸(hCha)，高苯丙氨酸(hPhe或Hof)，反-3-苯基氮杂环丁烷基-2-甲酸，4-苯基吡咯烷基-2-甲酸，5-苯基吡咯烷基-2-甲酸，3-吡啶基丙氨酸(3-Pya)，4-吡啶基丙氨酸(4-Pya)，苯乙烯基丙氨酸，四氢异喹啉基-1-甲酸(Tiq)，1，2，3，4-四氢norharmane-3-甲酸(Tpi)，β-(2-噻吩)丙氨酸(Tha)。

其它参与基因编码的的氨基酸替代物也可包含于本发明的肽化合物中，并且被概括地归类于氨基酸中。

蛋白源氨基酸被定义为由天然蛋白衍生的α-氨基酸。非蛋白源氨基酸被定义为所有其它氨基酸，它们不作为常规天然蛋白的构件。

所得肽可以以C-端游离酸或C-端酰胺化的形式被合成。可以通过侧链修饰改造游离酸型或酰胺型的肽。这些侧链修饰包括但不限于高丝氨酸形成，焦谷氨酸形成，二硫键形成，天冬酰胺或谷氨酰胺残基的去酰胺化，甲基化，叔丁基化，叔丁氧羰基化，4-甲基苄基化，苯硫甲基化，甲苯硫基取代，苄氧甲基化，4-硝基苯基取代，苄氧羰基化，2-硝基苯甲酰化，2-硝基苯磺酰化，4-甲基苯磺酰化，五氟苯基化，联苯甲基化，2-氯苄氧羰基化，2，4，5-三氯苯基化，2-溴苄氧羰基化，9-芴甲氧羰基化，三苯甲基化，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢呋喃基-6-磺酰化，羟基化，甲硫氨酸氧化，甲酰化，乙酰化，苯氧甲基化，苄基化，苯甲酰化，三氟乙酰化，天冬氨酸或谷氨酸的羧化，磷酰化，硫酸化，半胱氨酰化，戊糖、脱氧己糖、氨基己糖、己糖或N-乙酰基氨基己糖的糖酰化，法呢基化，肉豆蔻酰化，生物素化，棕榈酰化，硬脂酰化，香叶基香叶基化，谷胱甘酰化，5′-腺苷化，ADP-核糖基化，采用N-乙醇酰神经胺酸、N-乙酰神经胺酸、磷酸吡哆醛、硫辛酸、4′-磷酸泛酰巯基乙胺或N-羟基琥珀酰亚胺进行的修饰。

在分子式(3)所示的化合物中，氨基酸片断A、B、C、D和E各自通过酰胺键与相邻片断结合，分子式中采用了标准命名法，即氨基酸(肽)的氨基端(N-端)写在左方，而羧基端(C-端)写在右方。

在本发明之前，脯氨酸特异性丝氨酸蛋白酶二肽基肽酶IV在体外已知的肽底物有三肽Diprotin A(Ile-Pro-Ile)，Diprotin B(Val-Pro-Leu)，Diprotin C(Val-Pro-Ile)。本发明的发明者们令人意想不道地发现了本发明所公开的化合物在哺乳动物体内是二肽基肽酶IV的底物，在药理学有效剂量下，通过竞争性催化机制抑制了内源性底物的生理更新。

作为二肽基肽酶IV和DPIV样酶的调节剂，本发明特别优选的化合物包括对Wistar大鼠静脉和/或灌胃给药时在体内DIPV结合显示K_i值，对DPIV进行有效抑制的化合物。

可用于本发明的其它优选化合物为分子式(4)所示的肽基酮：

其中：

A选自：

X¹为H或酰基或包含所有氨基酸和肽残基的氧羰基，

X²为H，-(CH)_n-NH-C₅H₃N-Y其中n＝2-4，或C₅H₃N-Y(二价吡啶基)，Y选自H、Br、Cl、I、NO₂或CN，

X³为H或未取代的或由一个、两个或更多个烷基、烷氧基、卤素、硝基、氰基或羧基取代的苯基或吡啶基，

X⁴为H或未取代的或由一个、两个或更多个烷基、烷氧基、卤素、硝基、氰基或羧基取代的苯基或吡啶基，

X⁵为或烷基、烷氧基或苯基，

X⁶为H或烷基。

n＝1时

X选自：H、OR²、SR²、NR²R³、N⁺R²R³R⁴，其中：

R²代表未取代的或由一个、两个或更多个烷基、环烷基、芳基或杂芳基取代的酰基，或未取代的或由一个、两个或更多个烷基、环烷基、芳基或杂芳基取代的所有氨基酸和肽残基或烷基，

R³代表烷基或酰基，其中R²和R³可以是一个或多个饱和和不饱和碳环或杂环环结构的一部分，

R⁴代表烷基，其中R²和R⁴或R³和R⁴可以是一个或多个饱和和不饱和碳环或杂环环结构的一部分。

n＝0时

X选自：

其中

B代表O、S、NR⁵，其中R⁵为H、亚烷基或酰基，

C、D、E、F、G、H各自独立到选自未取代或取代的烷基，烷氧基，烷硫基，氨烷基，羰酰烷基，酰基，氨基甲酰基，芳基或杂芳基；并且n＝0以及n＝1时

Z选自H，C₁-C₉支链或直链烷基或C₂-C₉支链或直链链烯基，C₃-C₈环烷基，C₅-C₇环烯基，芳基或杂芳基，或选自所有天然氨基酸及其衍生物的所有侧链的侧链。

此外，本发明公开了化合物5，6，7，8，9，10和11，包括其所有立体异构体及药学可接受的盐，这些化合物可用于本发明。

其中：

R¹为H，C₁-C₉支链或直链烷基，C₂-C₉支链或直链链烯基，C₃-C₈环烷基，C₅-C₇环烯基，芳基或杂芳基，或选自天然氨基酸及其衍生物的侧链，

R³和R⁴各自独立地选自H，羟基，烷基，烷氧基，芳氧基，硝基，氰基或卤素，

A为H或碳酸的电子等排体，如选自CN、SO₃H、CONHOH、PO₃R⁵R⁶、四唑、酰胺、酯、酸酐、噻唑和咪唑的基团，

B选自：

其中：

R⁵为H，-(CH)_n-NH-C₅H₃N-Y其中n＝2-4，C₅H₃N-Y(为二价吡啶基)，其中Y＝H，Br，Cl，I，NO₂或CN，

R¹⁰为H，酰基，氧羰基或氨基酸残基，

W为H或苯基或吡啶基，这些基团为未取代的或被一个、二个或更多个烷基、烷氧基、卤素、硝基、氰基或羧基取代，

W¹为H，烷基，烷氧基或苯基，

Z为H或或苯基或吡啶基，这些基团为未取代的或被一个、二个或更多个烷基、烷氧基、卤素、硝基、氰基或羧基取代，

Z¹为H或烷基，

D为C₄-C₇环烷基，未取代的或被一个、二个或更多个烷基取代的C₄-C₇环烯基，或者为4-7员杂环烷基或4-7员杂环烯基，

X²为O，NR⁶，N⁺(R⁷)₂或S，

X³至X¹²各自独立到选自CH₂，CR⁸R⁹，NR⁶，N⁺(R⁷)₂，O，S，SO和SO₂，

包括所有饱和及不饱和的结构，

R⁶、R⁷、R⁸、R⁹各自独立地选自H，C₁-C₉支链或直链烷基，C₂-C₉支链或直链链烯基，C₃-C₈环烷基，C₅-C₇环烯基，芳基或杂芳基，

其中各基团需满足以下条件：

分子式6：如果A不为H，则X⁶为CH，

分子式7：如果A不为H，则X¹⁰为C，

分子式8：如果A不为H，则X⁷为CH，

分子式9：如果A不为H，则X¹²为C。

在说明书和权利要求书中，术语“酰基”可以指C_1-20酰基，优选为C_1-8酰基，特别优选为C_1-4酰基；“环烷基”可以指C_3-12环烷基，优选为C₄、C₅或C₆环烷基；“碳环基”可以指C_3-12碳环基，优选为C₄、C₅或C₆碳环基；“杂芳基”指一种芳基，其中1至4个，优选为1、2或3个环原子被杂原子如N、S或O取代。“杂环烷基”指一种环烷基，其中1、2或3个环原子被杂原子如N、S或O取代。“肽”选自二肽至十肽，优选为二肽、三肽、四肽和五肽。构成“肽”的氨基酸可以选自上述氨基酸。

由于体内蛋白分布广泛并且涉及DPIV、DPIV活性和DPIV相关蛋白的多种机制，系统给药(肠道或非肠道给药)DPIV抑制剂可能造成一系列不期望的副作用。

所要解决的问题在于提出可以靶向作用于局部病理生理学和生理学过程的化合物。本发明的目的主要在于局部抑制DPIV或DPIV类似物的活性，以达到靶向调控局部活性底物的活性的目的。

利用本发明通式(12)所代表的化合物这一问题得到了解决：

其中：

A为侧链上带有至少一个官能团的氨基酸，

B为一种共价结合于A中至少一个官能团上的化合物，

C为通过酰胺键与A连接的噻唑烷，吡咯烷，氰基吡咯烷，羟脯氨酸，脱氢脯氨酸或哌啶基。

这些化合物可以用于缓解免疫、自身免疫或中枢神经系统相关的疾病。

依据本发明的一个优选实施方案，所采用的药用组合物包含至少一种通式(12)代表的化合物和至少一种适用于作用部位的常规辅料。

优选地，A为一种α-氨基酸，特别是侧链具有一个、二个或多个官能团的天然氨基酸，优选为苏氨酸，酪氨酸，丝氨酸，精氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸。

优选地，B为链长高达20个氨基酸的寡肽，分子量高达20,000g/mol的聚乙二醇，任选取代并含有8至50个碳原子的有机胺、酰胺、醇、酸或芳香化合物取代。

在说明书和权利要求书中，术语“烷基”可以指C_1-50烷基，优选为C_6-30烷基，特别优选为C_8-12烷基；例如烷基可以是甲基，乙基，丙基，异丙基或丁基。术语“alk”，如在“烷氧基”中那样，以及术语“alkan”，如在“烷酰基”中那样，均用于代表烷基；芳香化合物优选为取代的或任选未取代的苯基，苄基，萘基，联苯基或菲基，其中优选含有至少8个碳原子；术语“链烯基”可以指C_2-10链烯基，优选为C_2-6链烯基，它们在所需位置上含有双键，可以是取代或未取代的；术语“链炔基”可以指C_2-10链炔基，优选为C_2-6链炔基，它们在所需位置上含有叁键，可以是取代或未取代的；术语“取代”或取代基可以指任何所需的由一个或多个，优选为一个或二个烷基、链烯基、链炔基、一价或多价酰基、烷酰基、烷氧烷酰基或烷氧烷基所进行的取代；同时，上述取代基可以带有一个或多个(但优选为零)烷基，链烯基，链炔基，一价或多价酰基，烷酰基，烷氧烷酰基或烷氧烷基作为侧基；有机胺，酰胺，醇或酸各自含有8至50个碳原子，优选含有10至20个碳原子，可以由以下分子式所代表：(烷基)₂N-或烷基-NH-，-CO-N(烷基)₂或-CO-NH(烷基)，-烷基-OH或烷基-COOH。

尽管具有一个伸展的侧链官能，通式(12)的化合物仍能够与二肽基肽酶IV或类似酶的活性中心结合，但不再被肽转运蛋白PepT1活化转运。本发明的化合物因此具有降低的或明显受限制的可转运性能，以此以一种理想的方式局部抑制了DPIV或DPIV样酶的活性。

通式(12)的化合物和其它依据本发明所使用的化合物可以分别以外消旋体或光学纯化合物(对于通式(12)的化合物优选为L-苏或L-别的形式)的形式存在和使用。

在侧链改造中通过侧链的伸展/膨胀，例如侧链中超过7个碳原子，则有可能显著降低可转运性(如实施例12所示)。表12.1中的实施例清楚地显示了这样一种现象，即随侧链空间尺寸的增大，物质的可转运性下降。依据本发明通过侧链空间和立体上的膨胀，例如超过单取代苯基、羟胺基或氨基酸侧基原子团的尺寸，有可能改变或抑制目标物质的可转运性。

依据本发明，通式(12)的化合物以部位特异性的方式抑制了哺乳动物体内DPIV或DPIV样酶的活性。因此有可能有效作用于局部病理生理学和生理学过程(炎症，牛皮癣，关节炎，免疫、自身免疫疾病，过敏，也包括中枢神经系统疾病)，同时显著降低副作用。

优选的通式(12)的化合物为这样一些化合物，其中寡肽的链长为3至15个，特别是4至10个氨基酸，和/或聚乙二醇的分子量至少为250g/mol，优选为至少1500g/mol至高达15000g/mol，和/或任选进行取代的有机胺、酰胺、醇、酸或芳香化合物含有至少12个并优选高达30个的碳原子。

本发明的化合物可以被转化成酸加成盐，特别是药学可接受的酸加成盐并进行使用。在药学可接受的酸加成盐通常所采取的形式中氨基酸的碱性侧链被一种无机或有机酸质子化。代表性的有机或无机酸包括盐酸，氢溴酸，高氯酸，硫酸，硝酸，磷酸，乙酸，丙酸，乙醇酸，乳酸，琥珀酸，马来酸，富马酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，扁桃酸，甲磺酸，羟乙基磺酸，苯磺酸，草酸，棕榈酸，2-萘磺酸，对甲苯磺酸，环己氨基磺酸，水杨酸，糖酮酸或三氟乙酸。所有分子式1至12所示化合物的药学可接受的酸加成盐均包含于本发明的范围之内。

考虑到游离化合物和盐之间关系相近，只要条件可能或合适，文中在提及化合物时也意指它的盐。

本发明范围中也包含本发明化合物的前药。一般而言，这些前药是化合物的官能衍生物，它们在体内可以转化成所需的活性化合物。因此，在这些情况中，本发明的应用将包括采用一种或多种所要求的化合物的前药对多种所述疾病进行治疗，其中在给药后这些前药在体内转化成上述所要求的化合物。例如，在“Design of Prodrug”，H.Bundgaard编辑，Elsevier，1985和专利DE 198 28 113和DE 198 28 114中描述了适用的前药选择和制备的常规方法，此处全文引用作为参考。

当本发明化合物或前药中具有至少一个手性中心时，它们可以以对映体异构体的形式存在。当化合物或前药具有二个或多个手性中心时，它们中还可能出现非对映异构体。应该认识到所有这些异构体或其混合物均包含在本发明的范围之内。同时，某些化合物和前药的结晶可能具有多种晶形，它们也包含在本发明的范围之内。此外，某些化合物可能与水(即水合物)或常用溶剂构成溶剂化物，这些溶剂化物也包含在本发明的范围之内。

化合物，包括它们的盐也可能得到其水合物形式，或者其中包含用于结晶的其它溶剂。

如上所述，本发明的化合物和前药，以及相应的药学可接受的酸加成盐适用于抑制DPIV或DPIV样酶的活性。如实施例7和8所示，可以通过体外测量K_i值和IC₅₀值的DPIV活性试验验证本发明的化合物和前药、以及相应的药学可接受的酸加成盐抑制DPIV或DPIV样酶活性的能力。

如实施例11所示，可以通过对Wistar大鼠口服或插管给药验证本发明的化合物和前药、以及相应的药学可接受的酸加成盐体内抑制DPIV活性的能力。对Wistar大鼠口服或插管给药后，本发明的化合物在体内抑制了DPIV的活性。

DPIV存在于哺乳动物的多种器官或组织中，例如肠道(Gutschmidt S.等人，“原位”-大鼠空肠绒毛刷状缘区域中蛋白含量的测量以及它们与四种酶活性的相关性(“In situ”-measurements of protein contents inthe brush border region along rat jejunal villi and their correlations with fourenzyme activities)，Histochemistry 1981，72(3)，467-79)，外分泌上皮，肝细胞，肾小管，内皮，肌成纤维细胞(Feller A.C.等人，一种检测人类组织中的单克隆抗体(A monoclonal antibody detecting dipeptidylpeptidase IVin human tissue)，Virchows Arch.A.Pathol.Anat.Histopathol.1986；409(2)：263-73)，神经细胞，某些表面上皮如Fallopian管、子宫和泡状腺体的侧膜中，在如上皮泡状腺体的细胞质中，在Brunner腺体的粘膜细胞中(Hartel S.等人，大鼠器官中的二肽基肽酶(DPP)IV，免疫组织化学和活性组织化学的对比(Dipeptidyl peptidase(DPP)IV in rat organs.Comparison of immunohistochemistry and activity histochemistry)，Histochemistry 1988；89(2)：151-61)，生殖器官如附睾尾和壶腹、精囊及分泌物(Agrawal & Vanha-Perttula，牛生殖器官及分泌物中的二肽基肽酶(Dipeptidyl peptidases in bovine reproductive organs and secretions)，Int.J.Androl.1986，9(6)：435-52)。在人血清中存在两种分子形式的二肽基肽酶(Krepela E.等人，在正常人血清中存在两种分子形式的二肽基肽酶IV的证明(Demonstration of two molecular forms of dipeptidyl peptidase IV innormal human serum)，Physiol.Bohemoslov.1983，32(6)：486-96)。血清高分子量DPIV被表达在激活的T细胞表面上(Duke-Cohan J.S.等人，血清高分子量DPIV(CD26)与激活的T细胞释放的抗原DPPT-L类似(Serum high molecular weight dipeptidyl peptidase IV(CD26)is similar to anovel antigen DPPT-L released from activated T cells)，J.Immunol.1996，156(5)：1714-21)。

本发明的化合物和前药、以及相应的药学可接受的酸加成盐能够在体内抑制DPIV。在本发明的一个实施方案中，所有哺乳动物器官或组织中已发现的和尚未发现的DPIV的所有分子、同系物和抗原决定基均包含在本发明的范围之内。

作为一类少见的脯氨酸特异性蛋白酶，最初DPIV被认为仅为一种对多肽链N端次末端脯氨酸具有特异性的膜结合酶。但是，近期已经证实其它分子，甚至在结构上与DPIV无同系列关系的分子也具有相应的酶活性。到目前为止被确定的DPIV样酶有，如成纤维细胞激活蛋白α、二肽基肽酶IVβ、二肽基氨基肽酶样蛋白、N-乙酰化α连接的酸性二肽酶、休眠细胞脯氨酸二肽酶、二肽基肽酶II、attractin、以及二肽基肽酶IV相关的蛋白(DPP8)，并描述在Sedo & Malik的综述文章中(Sedo &Malik，二肽基肽酶IV样分子：同系列蛋白或类似的活性？(Dipeptidylpeptidase IV-like molecules：homologous proteins or homologous activities？)，Biochimica et Biophysica Acta 2001，36506：1-10)。其它的DPIV样酶在WO 01/19866，WO 02/34900和WO 02/31134中被公开。WO 01/19866公开了新型的人二肽基氨基肽酶8(DPP8)，其结构和功能类似于DPIV和成纤维细胞激活蛋白(FAP)。WO 02/34900中公开了新型的二肽基肽酶9(DPP9)，其氨基酸序列与DPIV和DPP8具有明显的同源性。WO02/31134公开了三种DPIV样酶DPRP1、DPRP2和DPRP3。

在本发明的另一个优选实施方案中，所有哺乳动物器官或组织中已发现的和尚未发现的DPIV的所有分子、同系物和抗原决定基均包含在本发明的范围之内。

如实施例9所述，可以通过测量Ki值的体外酶活性试验验证本发明的化合物和前药、以及相应的药学可接受的酸加成盐抑制DPIV样酶活性的能力。以本发明化合物结合猪二肽基肽酶II的K_i值为例，对于谷氨酰吡咯烷K_i＝8.52×10^-5M±6.33×10^-6M，对于谷氨酰噻唑烷K_i＝1.07×10^-5M±3.81×10^-7M。

在另一个实施方案中，本发明的化合物和前药、以及相应的药学可接受的酸加成盐不抑制非DPIV或非DPIV样脯氨酸特异性酶，如果有抑制力的话，其抑制力也不高。如实施例10所述，以谷氨酰吡咯烷和谷氨酰噻唑烷为例，未发现对二肽基肽酶I和脯氨酰寡肽酶的抑制。对于氨酰基脯氨酸二肽酶来说，与DPIV相比这两种化合物的结合效能非常低。对于氨酰基脯氨酸二肽酶测得谷氨酰噻唑烷的IC₅₀＞3mM，谷氨酰吡咯烷的IC₅₀＝3.4×10^-4M±5.63×10^-5M。

考虑到其抑制DPIV和DPIV样酶活性的能力，本发明的化合物以及相应的药学可接受的酸加成盐适用于治疗受所述酶活性调控的疾病。基于本发明实施例和文献中所述的发现，可以看出此处所公开的化合物适用于治疗如免疫、自身免疫疾病或中枢神经系统疾病，选自中风、肿瘤、局部缺血、帕金森氏症和偏头痛。

在更优选的实施方案中，本发明的化合物和前药、以及相应的药学可接受的酸加成盐适用于治疗多发性硬化病。可以采用EAE大鼠模型验证本发明的化合物、以及相应的药学可接受的酸加成盐缓解多发性硬化病症状的能力。该方法在实施例13中进行描述。

对于需要治疗的对象来说，本发明因此还提供一种用于预防和治疗受DPIV和DPIV样酶抑制调控的病症的方法，其包含给药本发明的化合物和药用组合物，采用治疗该疾病有效的用量以及用药方案。此外，本发明包含本发明的化合物和前药、以及相应的药学可接受的酸加成盐在制备用于预防和治疗受DPIV和DPIV样酶抑制调控的病症的药剂中的应用。可以采用常规给药方法，包括但不限于静脉、口服、皮下、肌注、皮内、非肠道或联合使用等方法进行给药。

在接下来描述的实施方案中，本发明提供采用化合物1至12及其相应药学可接受的前药和酸加成盐的药用组合物的配方。

此处采用术语“对象”指用于治疗、观察或试验的动物，优选为哺乳动物，最优选为人。

此处采用术语“治疗有效量”指研究人员、兽医、医学博士或其它临床医生寻找到的，对于组织、动物或人可以引起生物学和医学响应的活性化合物和药剂的用量。

此处采用术语“组合物”界定一种包含了治疗有效量的所要求化合物的产品、以及直接或间接与所要求化合物结合的任何产品。

为制备适用于本发明的药用组合物，依据常规药物混合技术将作为活性成分的一种或多种分子式1至12所示化合物或其相应的药学可接受的酸加成盐与一种药物载体混合均匀。依据给药途径，如口服或非肠道给药(如肌注)所要求的制剂形式，载体可以采取多种形式。在口服药用组合物的制备中，任何常规的药用载体均可使用。因此，对于液体口服制剂，如混悬剂、酏剂和溶液来说，适用的载体和添加剂包括水，二醇，油，醇，芳香剂，防腐剂，着色剂等；对于固体口服制剂，如散剂，胶囊，明胶胶囊和片剂来说，适用的载体和添加剂包括淀粉，糖，稀释剂，造粒剂，润滑剂，粘合剂，崩解剂等。由于方便给药，片剂和胶囊是最为有利的口服剂量单元形式，在这种情况下可以采用固体药物载体。如果有必要，可以采用常规技术对片剂进行包糖衣或肠溶衣。对于非肠道制剂来说，载体通常包括无菌水，也可以包含其它成分，如用于助溶或防腐目的的成分。

也可以制备注射用混悬液，在这种情况下可以采用适当的液体载体，助悬剂等。对于本发明的药用组合物来说，每一剂量单元，如片、胶囊、散剂、注射、勺等中含活性成分的量可以传递一单位的上述有效剂量。对于本发明的药用组合物来说，每一剂量单元，如片、胶囊、散剂、注射、勺等中含约0.01mg至1000mg(优选为5mg至500mg)活性成分，所提供的剂量为每天约0.1至300mg/kg体重(优选为每天约1至50mg/kg体重)。当然，剂量可以根据患者的需求、所治疗疾病的严重程度以及所采用化合物的性质作改变。可以采用每日给药或定期给药的方式。典型地，医生将根据病人的性质、病症以及所需治疗效果对剂量进行调整。

优选地，这些组合物的片剂，丸剂，胶囊，散剂，颗粒剂，灭菌非肠道给药溶液或混悬液，定量气溶胶或液体喷剂，滴剂，安瓿剂，自动注射装置或栓剂采用单位剂量形式，用于口服、非肠道给药、鼻腔给药、舌下给药或直肠给药，或者通过吸入或吹入进行给药。组合物也可以采取适用于每周一次或每月一次进行给药的形式。例如，可以采用活性化合物的一种不溶性盐(如癸酸盐)制成供肌注的贮存制剂，对于固体组合物，如片剂的制备，将主要活性成分与药物载体，如常规制片材料如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶、以及其它药物稀释剂如水均匀混合构成组合物的固体预制剂，其中含有本发明化合物或其药学可接受盐的均匀混合物。当称这些预制剂为均匀的时，指活性成分均匀分散于组合物中使得组合物可以被均分为相等的有效剂量形式，如片，丸或胶囊。接着将这种组合物的固体预制剂分成上述单位剂量形式，其中含有约0.01至1000mg、优选为5mg至500mg本发明的活性成分。

为有利起见，可以对本发明新型组合物的片剂或丸剂进行包衣或制成具有长效特征的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含一种内组分和一种外组分，其中后者完全覆盖前者。两种组分间可以通过一层肠溶层进行分隔，该肠溶层可以抵抗胃的消化，使得内组分未经变化直接进入十二指肠或延迟释放。多种材料可以用于制备这种肠溶层或包衣，这些材料包括多种包含如虫胶、十六醇以及醋酸纤维素等材料的聚合酸。

用于口服或注射给药的本发明新型组合物的液体剂型包括水溶液，适用的矫味的糖浆剂，水基或油基混悬液，含有食用油如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的矫味的乳剂，以及酏剂或其它类似的药物载体。对于水基混悬液来说，适用的分散剂或助悬剂包括合成或天然的胶，如黄芪胶，阿拉伯树胶，海藻酸盐，糊精，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮或明胶。

虽然依据本发明制备化合物的方法得到立体异构体的混合物，这些异构体可以采用常规技术如制备色谱进行分离。化合物可以制备成外消旋体形式，或通过对映选择性合成或通过拆分的方法制备各对映异构体。通过标准手段，如与光学活性酸构成非对映异构体，如(-)-二对甲苯酰-D-酒石酸和/或(+)-二对甲苯酰-L-酒石酸成盐，然后分级结晶并重新游离出游离碱进行拆分，得到化合物的各对映异构体。也可以形成非对映异构的酯或酰胺，色谱分离并除去手性助剂对化合物进行拆分。此外，也可以采用手性HPLC柱对化合物进行拆分。

在本发明化合物的所有制备过程中，必须和/或希望对所涉及化合物中的敏感或反应性基团进行保护。可以采用常规保护基，如 Protective Groups in Organic Chemistry，J.F.W.McOmie编辑，Plenum Press，1973；以及T.W.Greene & P.G.M.Wuts， Protective Groups in Organic Synthesis，Jhon Wiley & Sons，1991中描述的保护基进行保护，此处全文引用作为参考。采用现有技术已知的方法在随后方便的时候可以除去这些保护基。

有关本发明所述受二肽基肽酶IV和DPIV样酶调控的疾病的治疗，可以采用包含一种或多种本发明所定义的化合物以及药学可接受载体的药用组合物进行。药用组合物中可包含约0.01mg至1000mg、优选为5至500mg的化合物，并且可以采取任何适用于所选给药途径的剂型。载体中包含必须的和惰性的药用辅料，包括但不限于粘合剂，助悬剂，润滑剂，矫味剂，甜味剂，防腐剂，染料和包衣。适用于口服给药的组合物包括固体制剂，如丸剂、片剂、胶囊(各自具有快速释放、定时释放和缓释的制剂)、颗粒剂和散剂，以及液体制剂，如溶液、糖浆、酏剂、乳剂和混悬液。适用于非肠道给药的制剂形式包括灭菌溶液，乳液和混悬液。

为有利起见，本发明的化合物可以按每天一次，或全天剂量分为每天二次、三次或四次进行给药。同时，按照本领域普通技术人员所熟知的方法，本发明的化合物通过局部使用适当鼻腔给药载体进行鼻腔给药，或通过的透皮贴剂进行给药。对于采用经皮给药系统进行的给药，与间歇性的给药方案不同，是采用了连续给药的模式。为获得所需治疗效果，需要对剂量进行调整。

更优选地，对于采用片剂或胶囊的口服给药来说，活性药物成分可以和口服、无毒、药学可接受的惰性载体如乙醇、甘油、水等混合。如果需要或必需，可以将适当的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂也加到混合物中。此处不作界定，适用的粘合剂包括淀粉，明胶，天然糖如葡萄糖和β-乳糖，玉米甜味剂，天然或合成胶如阿拉伯树胶、黄芪胶或油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠等。此处不作界定，崩解剂包括淀粉，甲基纤维素，琼脂，斑脱土，黄原胶以及本领域已知的其它化合物。

对于矫味的助悬剂或分散剂如合成或天然胶，如黄芪胶，阿拉伯树胶，甲基纤维素等来说，采用液体剂型是适宜的。对于非肠道给药来说，灭菌混悬液和溶液是适宜的。当需要静脉给药时，须采用含有适当防腐剂的等渗制剂。

本发明的化合物也可采取脂质体给药系统，例如小单室脂质体、大单室脂质体和多室脂质体形式进行给药。利用现有技术中被人熟知的方法，采用多种磷脂，如胆固醇、十八胺或磷脂酰胆碱可以构成脂质体。

本发明的化合物也可以和作为靶向药物载体的可溶性聚合物进行复合。这些聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羟丙基甲基丙烯酰胺-苯酚，聚羟乙基天冬酰胺-苯酚，或采用棕榈酰基取代的聚氧乙烯聚赖氨酸。此外，本发明的化合物也可以和用于药物控释的生物可降解聚合物进行复合，如聚乳酸、聚ω-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲嵌段共聚物。

当需要对所述疾病进行治疗时，本发明化合物可以以上述任何组合物形式，依照所建立的给药方案进行给药。

产品的日剂量可以在0.01至1.000mg/成人的宽范围内进行变动。对于口服给药来说，组合物优选采取其中含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250、500和1000mg活性成分的片剂形式，对于受治疗病人可以依据症状调整剂量。药物的有效剂量一般为每天约0.1mg/kg至300mg/kg。优选的剂量范围为每天约1mg/kg至50mg/kg。化合物可以按每天1至4次的方案进行给药。

最佳剂量的确定对于本领域的技术人员来说是容易的，根据具体所使用的化合物、给药方式、制剂浓度、依赖给药方式的生物利用度、以及疾病症状的进程可以发生改变。此外，与具体受治疗患者相关的因素，如病人的年龄、体重、饮食和给药时间等一般在剂量调整中也应被考虑。

本发明的化合物或组合物可以在饭前、饭中或饭后使用。

                        实施例

实施例1：二肽化合物的合成

1.1异亮氨酰噻唑烷盐的通用合成法

将Boc保护的氨基酸Boc-Ile-OH置于乙酸乙酯中，混合物冷却至-5℃。于恒温下滴加N-甲基吗啉、新戊酰氯(实验室规模)或新己酰氯(中试规模)。搅拌反应几分钟进行活化。顺序滴加N-甲基吗啉(实验室规模)和噻唑烷盐酸盐(实验室规模)，加入噻唑烷(中试规模)。在实验室中按常规方法采用盐溶液进行后处理，中试中采用NaOH和CH₃COOH溶液进行纯化。

采用HCl/二氧六环(实验室规模)或H₂SO₄(中试规模)除去Boc保护基。在实验室中采用EtOH/乙醚对盐酸盐进行重结晶。

中试中加入NaOH/NH₃制备游离碱。将富马酸溶于热乙醇中，滴加游离碱得到(Ile-Thia)²富马酸盐(M＝520.71gmol^-1)沉淀。利用电泳法分析异构体和对映异构体。

1.2谷氨酰吡咯烷游离碱的合成

酰化：

N-苄氧羰基谷氨酸(2.02g，7.21mmol)溶于35mlTHF中，混合物冷却至-15℃。向混合物中加入CAIBE(氯甲酸异丁基酯)(0.937ml，7.21mmol)和4-甲基吗啉(0.795ml，7.21mmol)，溶液搅拌15分钟。利用TLC(展开剂：CHCl₃/MeOH＝9/1)证明混合酸酐的形成。升温至-10℃后加入吡咯烷(0.596ml，7.21mmol)，反应混合物于室温下搅拌过夜。

后处理：

过滤除去沉淀并蒸去溶剂。将所得油状物溶于乙酸乙酯(20ml)中，顺序用硫酸氢钠饱和溶液、碳酸氢钠饱和溶液、水和盐水洗。分出有机相，干燥并蒸去溶剂。利用TLC(展开剂：CHCl₃/MeOH＝9/1)确定所得产品的纯度。得到1.18g蜡状固体。

裂解：

将所得1.18g Z-保护的化合物固体溶于40ml无水乙醇中。溶液中加入20mg的Pd/C(10％，FLUKA)催化剂，在氢气氛中振摇该悬浮液3小时。利用TLC(展开剂：CHCl₃/MeOH＝9/1)监测反应进程。反应完成后除去溶剂和催化剂得到游离碱。产率：99％。

利用TLC确定产物纯度：正丁醇/AcOH/水/乙酸乙酯＝1/1/1/1，R_f＝0.4。利用NMR鉴定反应产物。

1.3谷氨酰噻唑烷盐酸盐的合成

酰化：

N-叔丁氧羰基谷氨酸(2.0g，8.12mmol)溶于5ml THF中，混合物冷却至-15℃。向混合物中加入CAIBE(氯甲酸异丁基酯)(1.06ml，8.12mmol)和4-甲基吗啉(0.895ml，8.12mmol)，溶液搅拌15分钟。利用TLC(展开剂：CHCl₃/MeOH：9/1)证明混合酸酐的形成。升温至-10℃后再加入等量的4-甲基吗啉(0.895ml，8.12mmol)和噻唑烷盐酸盐(1.02g，8.12mmol)，反应混合物于室温下搅拌过夜。

后处理：

过滤除去沉淀并蒸去溶剂。将所得油状物溶于氯仿(20ml)中，顺序用硫酸氢钠饱和溶液、碳酸氢钠饱和溶液、水和盐水洗。分出有机相，干燥并蒸去溶剂。利用TLC(展开剂：CHCl₃/MeOH＝9/1)确定所得产品的纯度。得到1.64g固体。

裂解：

将所得640mg经Boc-保护的化合物固体溶于3.1ml冰冷却的HCl/二氧六环溶液(12.98M，20倍当量)中并保持在冰中。利用TLC(展开剂：CHCl₃/MeOH＝9/1)监测反应进程。反应完成后除去溶剂，所得油状物溶于甲醇中并再次蒸干。所得油状物经五氧化二磷干燥后在乙醚中研制两次。利用HPLC确定产品纯度。得到0.265g产品。

利用HPLC确定产品纯度。利用NMR鉴定反应产物。

1.4谷氨酰吡咯烷盐酸盐的合成

酰化：

N-叔丁氧羰基谷氨酸(3.0g，12.18mmol)溶于7ml的THF中，混合物冷却至-15℃。向混合物中加入CAIBE(氯甲酸异丁基酯)(1.6ml，12.18mmol)和4-甲基吗啉(1.3ml，12.18mmol)，溶液搅拌15分钟。利用TLC(展开剂：CHCl₃/MeOH＝9/1)证明混合酸酐的形成。升温至-10℃后再加入等当量的吡咯烷(1.0ml，12.18mmol)，反应混合物于室温下搅拌过夜。

后处理：

过滤除去沉淀并蒸去溶剂。将所得油状物溶于氯仿(20ml)中，顺序用硫酸氢钠饱和溶液、碳酸氢钠饱和溶液、水和盐水洗。分出有机相，干燥并蒸去溶剂。利用TLC(展开剂：CHCl₃/MeOH＝9/1)确定所得产品的纯度。得到2.7g固体。

裂解：

将所得2.7g所得固体溶于13.0ml冰冷却的HCl/二氧六环溶液(12.98M，20倍当量)中并保持在冰中。利用TLC(展开剂：CHCl₃/MeOH＝9/1)监测反应进程。反应完成后除去溶剂，所得油状物溶于甲醇中并再次蒸干。所得油状物经五氧化二磷干燥后在乙醚中研制两次。得到980mg产品。

利用HPLC确定产品纯度。利用NMR鉴定反应产物。

实施例2：所选二肽化合物的化学表征

2.1熔点的确定

采用Leica Aktiengesellschaft产的Kofler显微熔点仪(其数值未作校正)或DSC仪(Heumann-Pharma)测定熔点。

2.2旋光的测定

采用Perkin-Elmer公司生产的旋光仪-341或更高级别的仪器记录不同波长下的旋光值。

2.3质谱测量条件

采用PE Sciex公司生产的“API165”或“API365”以电喷雾(ESI)方式记录质谱图。所采用溶液浓度c＝10μg/ml，溶剂为MeOH/H₂O 50∶50，0.1％HCO₂H，利用喷雾泵(20μl/分钟)灌入。测量采用正模式[M+H]⁺，ESI电压U＝5600V。

2.4测量结果

2.4.1异亮氨酰噻唑烷富马酸盐(异构体)的测量结果

物质	Mp(℃)	CE(分钟)	MS	[α]H2O
					L-苏-IT*F	150DSC	160	203	-10.7(405nm)
D-苏-IT*F	147	158	203	未测定
					L-别-IT*F	145-6	154	203	-4.58(380nm)
D-别-IT*F	144-6	150	203	4.5(380nm)

IT*F＝异亮氨酰噻唑烷富马酸盐

NMR和HPLC数据确定了所测物质。

2.4.2其它异亮氨酰噻唑烷盐的测量结果

IT*盐	M(gmol-1)	Mp(℃)
			琥珀酸盐	522.73	116
酒石酸盐	352.41	122
			富马酸盐	520.71	156
盐酸盐	238.77	169
			磷酸盐	300.32	105

实施例3：Xaa-Pro-Yaa三肽的合成

所有合成均采用Fmoc/tBu策略，于肽合成仪SP 650(Labortec AG)中进行。经保护的氨基酸购自Novabiochem或Bachem。三氟乙酸(TFA)购自Merck，三异丙基硅烷(TIS)购自Fluka。

对预载的Fmoc-Yaa-Wang树脂(2.8g/取代度0.57mmol/g)采用20％哌啶/N，N-二甲基乙酰胺(DMF)脱保护。用DMF洗后，将2当量(1.1g)Fmoc-Pro-OH溶液溶于DMF(每g树脂12ml溶剂)中。加入2当量(1.04g)2-(1H苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基四氟硼酸尿(TBTU)和4当量(1.11ml)N，N-二异丙基乙胺(DIEA)并置于反应器中。混合物于室温下振摇20分钟。然后重复偶联循环。所得Fmoc-Pro-Ile-Wang树脂经DMF、二氯甲烷、异丙醇和乙醚洗后进行干燥，分为6份，供偶联最后-个氨基酸用。

按上述方法脱去Fmoc保护。加入0.54mmol的Boc-氨基酸、0.54mmol的TBTU和0.108mmol的DIEA在DMF中的溶液后振摇20分钟。重复偶联循环。最后如上所述清洗并干燥所得肽树脂。

采用含下列清除剂的三氟乙酸(TFA)混合物处理2.5小时将肽从树脂上裂解下来：TFA/H₂O/三异丙基硅烷(TIS)＝9.5/0.25/0.25。

粗品肽的产率平均为80-90％。采用Nucleosil C18柱(7μm，250×21.20mm，100A)利用HPLC纯化粗品肽，梯度淋洗条件为：在0.1％TFA/H₂O中逐步增加0.1％TFA/乙腈的浓度(40分钟内由5％增至65％)，流速为6ml/分钟。

经冻干后得到纯品肽，通过电喷雾质谱和HPLC对其进行鉴定。

3.1结果-化学合成后Xaa-Pro-Yaa三肽的鉴定

肽	分子量(计算值)	分子量(实测值)[M+H+]1	HPLCK’2
				Abu-Pro-Ile	313.4	314.0	5.7
Cha-Pro-Ile	381.52	382.0	10.4
				Nva-Pro-Ile	327.43	328.2	6.82
Phg-Pro-Ile	361.44	362.2	7.9
				Nle-Pro-Ile	341.45	342.2	8.09
Pip-Pro-Ile	338.56	340.0	6.5
				Thr-Pro-Ile	329.4	330.0	5.12
Trp-Pro-Ile	414.51	415.2	9.85
				Phe-Pro-Ile	375.47	376.2	8.96

Ser-Pro-Ile	315.37	316.3	5.24
				Ser(P)-Pro-Ile	395.37	396.0	3.35
Tyr(P)-Pro-Ile	471.47	472.3	5.14
				Val-Pro-Val	313.4	314.0	5.07
Ile-Pro-Val	327.43	328.5	6.41
				Ile-Pro-别-Ile	341.4	342.0	7.72
Val-Pro-别-Ile	327.4	328.5	6.51
				Tyr-Pro-别-Ile	391.5	392.0	7.02
2-氨基辛酸-Pro-Ile	369.5	370.2	10.63
				Ser(Bzl)-Pro-Ile	405.49	406.0	9.87
Orn-Pro-Ile	342.42	343.1	3.73
				Tic-Pro-Ile	387.46	388.0	8.57
Aze-Pro-Ile	311.4	312.4	5.29
				Aib-Pro-Ile	313.4	314.0	5.25
叔丁基-Gly-Pro-Ile	341.47	342.1	7.16
				Ile-Hyp-Ile	356.45	358.2	6.57
叔丁基-Gly-Pro-Val	327.4	328.4	6.32
				叔丁基-Gly-Pro-Gly	285.4	286.3	3.74
叔丁基-Gly-Pro-Ile-酰胺	340.47	341.3	7.8
				叔丁基-Gly-Pro-D-Val	327.4	328.6	7.27
叔丁基-Gly-Pro-叔丁基-Gly	341.24	342.5	9.09
				Ile-Pro-叔丁基-Gly	341.47	342.36	6.93
Val-Pro-叔丁基-Gly	327.4	328.15	5.98

¹[M+H⁺]采用电喷雾质谱在正离子化模式下进行测量。

²RP-HPLC条件：

色谱柱：        LiChrospher 100RP 18(5μm)，125×4mm

检测器(UV)：    214nm

梯度淋洗条件：  乙腈(ACN)/H₂O(0.1％TFA)，15分钟内ACN浓度由5

                ％增至50％

流量：          1ml/分钟

K’＝(t_r-t₀)/t₀

t₀＝1.16分钟

叔丁基-Gly为：

Ser(P)和Ser(Bzl)指磷酸丝氨酸和苄基丝氨酸。Typ(P)指磷酸酪氨酸。

实施例4：肽基酮的合成

8：R＝OC(O)Ac                                        6：R＝OC(O)Ac

9：R＝OC(O)Ph                                        7：R＝OC(O)Ph

H-Val-Pro-OMe·HCl 2

将Boc-Val-OH(3.00g，13.8mmol)溶于10ml无水THF中并冷却至-15℃。向反应混合物中加入CAIBE(1.80ml，13.8mmol)和NMM(1.52ml，13.8mmol)，搅拌反应液直至混合酸酐形成完全。将反应混合物温度升至-10℃，加入NMM(1.52ml，13.8mmol)，然后加入H-Pro-OMe·HCl(2.29g，13.8mmol)。反应混合物于室温下搅拌过夜。除去溶剂后按常规后处理操作得到酯1，对酯1未作鉴定。

将酯1溶于HCl/HOAc(5ml，6N)中并保持于0℃下，直至脱Boc保护完全。除去溶剂后所得油状物并用乙醚处理，得到白色固体2。

产率：2.5g，80％。

Z-Ala-Val-Pro-OMe 3

将Z-Ala-OH(3.5g，15.7mmol)和2(4.18g，15.7mmol)按上述制备1的方法进行处理得到白色固体3。

产率：4.2g，64％。

Z-Ala-Val-Pro-OH 4

将3(4.2g，9.6mmol)溶于30ml水/丙酮(1/5 V/V)中，加入11.6ml NaOH溶液(1N)。反应完全后蒸去有机溶剂，所得溶液用15ml饱和NaHCO₃溶液稀释。然后用10ml乙酸乙酯萃取该混合物3次。加入HCl(15％水溶液)将溶液pH调为2，所得混合物用30ml乙酸乙酯萃取3次。分出有机相，盐水洗3次，干燥(Na₂SO₄)后蒸去溶剂。

产率：3.5g，87％。

Z-Ala-Val-Pro-CH₂-Br 5

将4(2.00g，4.76mmol)溶于15ml无水THF中并用CAIBE(0.623ml，4.76mmol)和NMM(0.525ml，4.76mmol)将其转化成混合酸酐(参见化合物1)。滤除所生成的沉淀后将反应化合物冷却至-15℃。氩气保护下滴加重氮甲烷(23.8mmol/30ml乙醚)。反应混合物于0℃下放置1小时后加入1.27ml的HBr(33％乙酸溶液)并于室温下搅拌30分钟。此后加入70ml乙醚，反应混合物用20ml水洗涤2次。分出有机相，干燥(Na₂SO₄)后蒸去溶剂。

产率(粗品)：1.8g，80％。

Z-保护的酰氧亚甲基酮

将酸(2当量)溶于DMF中并加入等摩尔量的KF。混悬液于室温下搅拌1小时。然后加入溴代亚甲基化合物(1当量)并搅拌过夜。真空除去溶剂后将所得油状物溶于氯仿中并用盐水洗。分出有机相，干燥(Na₂SO₄)后蒸去溶剂。采用硅胶柱色谱分离纯化产品，洗脱液为己烷/氯仿。

Z-Ala-Val-Pro-CH₂O-C(O)-CH₃ 6

乙酸(230μl，4.02mmol)，KF(0.234g，4.02mmol)，5(1.00g，2.01mmol)。

产率：0.351g，36％。

Z-Ala-Val-Pro-CH₂O-C(O)-Ph 7

苯甲酸(0.275g，2.25mmol)，KF(0.131g，2.25mmol)，5(0.56g，1.13mmol)。

产率：0.34g，56％。

脱保护

将Z-保护的化合物溶于HBr/AcOH中并搅拌。反应完全后加入乙醚，过滤，收集沉淀并干燥。

H-Ala-Val-Pro-CH₂O-C(O)-CH₃·HBr 8

6(0.351g，0.73mmol)

产率：0.252g，98％。

H-Ala-Val-Pro-CH₂O-C(O)-Ph·HBr 9

7(0.34g，0.63mmol)

产率：0.251g，99％。

实施例5：环烷基酮的合成

Boc-异亮氨醛2

将草酰氯(714μl，8.28mmol)溶于10ml无水二氯甲烷中并冷却至-78℃。然后滴加DMSO(817μl，8.28mmol)。反应液于-78℃搅拌20分钟，然后加入1(1.00g，4.6mmol)并搅拌20分钟。加入TEA(2.58ml，18.4mmol)后任反应液升温至室温。反应混合物用己烷/乙酸乙酯(2/1 V/V)稀释并加入10ml HCl(10％水溶液)。分出有机相，水相用20ml二氯甲烷萃取。合并有机相并用盐水、水洗涤，干燥。采用硅胶柱色谱分离纯化产品，洗脱液为庚烷/氯仿。

产率：0.52g，52％。

N-[1-环戊基(羟基)甲基]-2-甲基丁基氨基甲酸叔丁基酯3

将2(0.52g，2.42mmol)溶于10ml无水THF中并冷却至0℃。此后加入环戊基溴化镁(1.45ml浓度为2M的溶液)。反应完成后加入2ml水，加入HCl水溶液进行中和。加入二氯甲烷，分出有机相后用Na₂SO₄干燥。除去溶剂后所得油状物未经鉴定直接使用。

叔丁基-N-[1-环己基羰基]-2-甲基丁基氨基甲酸酯4

与处理1的方法类似，对3(0.61g，2.15mmol)进行处理。草酰氯(333μl，3.87mmol)，DMSO(382μl，5.37mmol)，TEA(1.2ml，8.59mmol)。

产率：0.180g，30％。

1-环戊基-3-甲基-1-氧代-2-戊基氯化铵5

将4(0.18g，0.63mmol)溶于2ml的HCl(7N二氧六环溶液)中。反应完全后除去溶剂，采用硅胶柱色谱纯化所得油状物，洗脱液为梯度氯仿/甲醇/水。所得油状物在乙醚中研制。

产率：0.060g，54％。

实施例6：侧链修饰的DPIV抑制剂的合成

6.1 Boc-Glu-Thia的合成

依据方法B(具体方法参见6.4)将Boc-Glu(OMe)-OH和Thia·HCl反应，依据方法G对Boc-Glu(OMe)-Thia进行水解。

6.1.1 Boc-谷氨酰噻唑烷的分析数据

化合物	经验式Mr合成方法产率	MS[M+H]+TLC：Rf/展开体系m.p.	[α]20D浓度溶剂	元素分析(计算值/实测值)％	HPLCRt[分钟]/流动相
						Boc-Glu-Thia	C13H22N2O5S318.38B+G62％	319.50.52/A10.42/B1115-118℃	-3.1c＝1甲醇	C：49.04/48.89H：6.96/6.82N：8.80/8.59	13.93/A2

1薄层色谱

展开体系A：氯仿/甲醇90∶10

展开体系B：苯/丙酮/乙酸25∶10∶0.5

展开体系C：正丁醇/EA/乙酸/H₂O 1∶1∶1∶1

2 HPLC分离条件

色谱柱：Nucleosil C-18，7μ，250mm×21mm

流动相：恒梯度，40％ACN/水/0.1％TFA

流速：6ml/分钟

波长：λ＝220nm

6.2 侧链修饰的Boc-谷氨酰噻唑烷

在γ-羧基上引入不同大小的基团对Boc-Glu-Thia进行修饰。基团利用其氨基与γ-羧基构成酰胺键实现偶联，具体偶联方法视基团而定。利用本发明已所描述的方法将下列氨基成分与Boc-Glu-Thia连接：

氨基成分	偶联方法(参见3.4)	产率
			聚乙二醇胺(Mr≈8000)	C	93％
H-Gly-Gly-Gly-OH	D+E	49％
			H-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-OH	D+E	86％

在其中两个情况中，对化合物的纯化有别于常规合成中所述的方法。

Boc-Glu(Gly₅)-Thia

搅拌过夜期间产品已经从反应液中沉淀出来。随后将产品过滤出来，用0.1N HCl和大量水洗并在P₄O₁₀上进行真空干燥。

Boc-Glu(PEG)-Thia

与常规操作不同，将合成中起始原料溶于500倍过量的DMF中。反应完成后，真空下将DMF全部除去并将残余物溶于大量甲醇中。当加入乙醚构成上层液时，产品与未反应的PEG同时沉淀出来。进一步的纯化采用凝胶过滤柱利用制备性HPLC(Pharmacia，Sephadex G-25，90μm，260mm-100mm)进行。

分离条件：流动相：水；流速：5ml/分钟；λ＝220nm。

6.2.2侧链修饰的Boc-谷氨酰噻唑烷的有关合成数据

化合物	经验式Mr产率	MS[M+H]+TLC/Rf/展开体系m.p.	[α]20D浓度溶剂	元素分析(计算值/实测值)％	HPLCRt[分钟]/流动相
						Boc-Glu(Gly3)-Thia	C19H31N5O8S489.5449％	490.5		C：46.62H：6.38N：14.31
Boc-Glu(Gly5)-Thia	C23H37N7O10S603.6486％	604.50.09/C202℃分解	n.dm.	C：45.76/45.60H：6.18/6.11N：16.24/16.56	11.93/A2
						Boc-Glu(PEG)-Thia	93％	≈8000(主要质量数)52-53℃	n.dm.	n.dm.	n.dm.

2 HPLC分离条件

色谱柱：Nucleosil C-18，7μ，250mm×21mm

流动相：恒梯度，40％ACN/水/0.1％TFA

流速：6ml/分钟

波长：λ＝220nm

6.3 侧链修饰的谷氨酰噻唑烷

采用方法F由表6.2.2中描述的化合物进行N-端保护裂解。由Gly衍生物修饰的化合物采用制备性HPLC纯化，产品形式为三氟乙酸盐。对于H-Glu(PEG)-Thia采用与其Boc-保护的前体类似的纯化方法，利用凝胶过滤柱进行纯化。

6.3.1 侧链修饰的谷氨酰噻唑烷的有关合成数据

化合物	经验式Mr产率	MS[M+H]+TLC/Rf/展开体系m.p.	[α]20D浓度溶剂	元素分析(计算值/实测值)％	HPLCRt[分钟]/流动相
						H-Glu(Gly3)-Thia·TFA	C16H24N5O8SF3503.4594％	503.450.32/C91-94℃	+4.1c＝1甲醇	C：38.17/37.56H：4.80/4.78N：13.91/13.43	7.84/C3
H-Glu(Gly5)-Thia·TFA	C20H30N7O10SF3617.5598％	617.550.25/C105-107℃	n.dm.	C：38.90/38.82H：4.90/4.79N：15.88/15.39	8.22/C3
						H-Glu(PEG)-Thia·HCl	92％	≈8000(主要质量数)	n.dm.	n.dm.	n.dm.

3 HPLC分离条件

色谱柱：Nucleosil C-18，7μ，250mm×21mm

流动相：ACN/水/0.1％TFA

梯度淋洗条件：30分钟内ACN浓度由20％增至90％

流速：6ml/分钟

波长：λ＝220nm

n.dm.-未测或不可测

6.4 通用合成方法

方法A：利用CFIBE为活化试剂采用混合酸酐法连接肽键

将10mmol N-端保护的氨基酸或肽溶于20ml无水THF中。溶液冷却至-15℃±2℃。搅拌下顺序加入10mmol N-MM和10mmol氯甲酸异丁酯，将反应液温度严格维持所述温度范围内。约6分钟后加入10mmol氨基成分。如果氨基成分为盐，向反应混合物中再加入10mmolN-MM。于冷却下搅拌反应混合物2小时，然后室温下搅拌过夜。

采用旋转蒸发仪浓缩反应混合物，溶于EA中，用5％KHSO₄溶液、饱和NaHCO₃溶液以及饱和NaCl溶液洗后Na₂SO₄干燥。真空下除去溶剂后化合物用EA/乙酸乙酯重结晶。

方法B：利用新戊酰氯为活化试剂采用混合酸酐法连接肽键

将10mmol N-端保护的氨基酸或肽溶于20ml无水THF中。溶液冷却至0℃。搅拌下顺序加入10mmol N-MM和10mmol特戊酰氯，将反应液温度严格维持所述温度范围内。约6分钟后将反应混合物冷却至-15℃，达到温度后立即加入10mmol氨基成分。如果氨基成分为盐，向反应混合物中再加入10mmol N-MM。于冷却下搅拌反应混合物2小时，然后室温下搅拌过夜。

后处理与方法A相同。

方法C：采用TBTU为活化试剂连接肽键

将10mmol N-端保护的氨基酸或肽和10mmol C-端保护的氨基酸或肽溶于20ml无水DMF中。溶液冷却至0℃。搅拌下顺序加入10mmolDIPEA和10mmol TBTU。于0℃下搅拌反应混合物1小时，然后室温下搅拌过夜。真空下将DMF全部除去，产品的后处理与方法A相同。

方法D：活性酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)的合成

将10mmol N-端保护的氨基酸或肽和10mmol N-羟基琥珀酰亚胺溶于20ml无水THF中。溶液冷却至0℃，搅拌下加入10mmol二环己基碳二酰亚胺。于0℃下搅拌反应混合物2小时，然后室温下搅拌过夜。滤去所得的N，N′-二环己基脲，真空下除去溶剂，残余物在EA/己烷中重结晶。

方法E：利用N-羟基琥珀酰亚胺酯连接酰胺键

将10mmol C-端未保护的氨基酸或肽加入NaHCO₃(20mmol于20ml水中)溶液中。室温于搅拌下将10mmol N-端保护的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于二氧六环中并缓慢滴加至反应液中。继续搅拌反应液过夜然后于真空下除去溶剂。

后处理与方法A相同。

方法F：Boc保护基的裂解

将3ml 1.1N HCl/冰醋酸溶液(方法F1)或3ml 1.1N HCl/二氧六环溶液(方法F2)或3ml 50％TFA二氯甲烷溶液(方法F3)加到1mmol Boc-保护的氨基酸吡咯烷、噻唑烷或肽中。裂解反应在室温下进行，反应进程用TLC监测。反应完成后(约2小时)，加入无水乙醚，产物以盐酸盐形式沉淀出来，抽滤收集沉淀，真空下采用P₄O₁₀干燥。采用甲醇/乙醚对产品进行重结晶或再沉淀。

方法G：水解

将1mmol肽的甲酯溶于10ml丙酮/11ml 0.1M NaOH溶液中，室温搅拌。水解进程采用TLC监测。反应完全后于真空下除去丙酮。采用浓KHSO₄溶液酸化剩余水溶液，直至pH达2-3。采用EA萃取几次将产品萃取出来，合并EA相后用饱和NaCl溶液洗，Na₂SO₄干燥，真空下除去溶剂。采用EA/己烷重结晶。

实施例7：K_i的测定

为测定谷氨酰吡咯烷和谷氨酰噻唑烷的Ki值，采用从猪肾中提取的二肽基肽酶IV，对于甘氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺的比活性为37.5U/mg，贮液中酶浓度为1.41mg/ml。

试验混合物

100μl浓度在1×10^-5-1×10^-8M的受试化合物与50μl不同浓度(0.4mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM，)的甘氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺和100μl HEPES(40mM，pH7.6，离子强度＝0.125)混合。试验混合物于30℃下预温育30分钟。预温育后，加入20μl DPIV(稀释率1∶600)，于30℃测量4-硝基苯胺释放所产生的黄色，采用plate reader(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)于405nm处测量10分钟。

采用软件Graphit(4.0.13和4.0.15版)(Erithacus Software，Ltd，UK)计算K_i值。

7.1 测量结果-DPIV抑制的K_i值

化合物	Ki[M]
		H-Asn-吡咯烷	1.20×10-5
H-Asn-噻唑烷	3.5×10-6
		H-Asp-吡咯烷	1.4×10-8
H-Asp-噻唑烷	2.9×10-6
		H-Asp(NHOH)-吡咯烷	1.3×10-5
H-Asp(NHOH)-噻唑烷	8.8×10-6
		H-Glu-吡咯烷	2.2×10-6
H-Glu-噻唑烷	6.1×10-7

H-Glu(NHOH)-吡咯烷	2.8×10-6
		H-Glu(NHOH)-噻唑烷	1.7×10-6
H-His-吡咯烷	3.5×10-6
		H-His-噻唑烷	1.8×10-6
H-Pro-吡咯烷	4.1×10-6
		H-Pro-噻唑烷	1.2×10-6
H-Ile-azididine	3.1×10-6
		H-Ile-吡咯烷	2.1×10-7
H-L-苏-Ile-噻唑烷	8.0×10-8
		H-L-别-Ile-噻唑烷	1.9×10-7
D-苏-异亮氨酰噻唑烷富马酸盐	不抑制
		D-别-异亮氨酰噻唑烷富马酸盐	不抑制
H-L-苏-Ile-噻唑烷琥珀酸盐	5.1×10-8
		H-L-苏-Ile-噻唑烷酒石酸盐	8.3×10-8
H-L-苏-Ile-噻唑烷富马酸盐	8.3×10-8
		H-L-苏-Ile-噻唑烷盐酸盐	7.2×10-8
H-L-苏-Ile-噻唑烷磷酸盐	1.3×10-7
		H-Val-吡咯烷	4.8×10-7
H-Val-噻唑烷	2.7×10-7
		Diprotin A	3.45×10-6
Diprotin B	2.24×10-5
		Nva-Pro-Ile	6.17×10-6
Cha-Pro-Ile	5.99×10-6
		Nle-Pro-Ile	9.60×10-6
Phe-Pro-Ile	1.47×10-5
		Val-Pro-Val	4.45×10-6

Ile-Pro-Val	5.25×10-6
		Abu-Pro-Ile	8.75×10-6
Ile-Pro-别-Ile	5.22×10-6
		Val-Pro-别-Ile	9.54×10-6
Tyr-Pro-别-Ile	1.82×10-5
		AOA-Pro-Ile	1.26×10-5
叔丁基-Gly-Pro-Ile	3.10×10-6
		Ser(Bzl)-Pro-Ile	2.16×10-5
Aze-Pro-Ile	2.05×10-5
		叔丁基-Gly-Pro-Val	3.08×10-6
Gln-吡咯烷	2.26×10-6
		Gln-噻唑烷	1.21×10-6
Val-Pro-叔丁基-Gly	1.96×10-5
		叔丁基-Gly-Pro-Gly	1.51×10-5
Ile-Pro-叔丁基-Gly	1.89×10-5
		叔丁基-Gly-Pro-IleNH2	5.60×10-6
叔丁基-Gly-Pro-D-Val	2.65×10-5
		叔丁基-Gly-Pro-叔丁基-Gly	1.41×10-5
Ile-环戊基酮	6.29×10-6
		叔丁基-Gly-环己基酮	2.73×10-4
Ile-环己基酮	5.68×10-5
		Val-环戊基酮	1.31×10-5
Val-Pro-甲基酮	4.76×10-8
		Val-Pro-酰氧基甲基酮	1.05×10-9
Val-Pro-苯甲酰基甲基酮	5.36×10-10
		Val-Pro-苯并噻唑甲基酮	3.73×10-8

H-Glu-噻唑烷	6.2×10-7
		H-Gly(NHOH)-噻唑烷	1.7×10-6
H-Glu(Gly3)-噻唑烷	1.92×10-8
		H-Glu(Gly5)-噻唑烷	9.93×10-8
H-Glu(PEG)-噻唑烷	3.11×10-6

叔丁基-Gly为：

Ser(P)和Ser(Bzl)指磷酸丝氨酸和苄基丝氨酸。Typ(P)指磷酸酪氨酸。

实施例8：IC₅₀值的测定

100μl抑制剂贮液与100μl缓冲液(HEPES pH7.6)和50μl底物(Gly-Pro-pNA，最终浓度0.4nM)混合，于30℃预温育。加入20μl纯化的猪DPIV开始反应。采用HTS 7000Plus plate reader(Perkin Elmer)于405nm测量10分钟，测量产品pNA的形成并计算斜率。最终抑制浓度在1mM至30nM之间。采用GraFit 4.0.13(Erithacus Software)计算IC₅₀。

8.1测量结果-IC₅₀值的测定

化合物	IC50[M]
		Ile-噻唑烷富马酸盐	1.28×10-7
Diprotin A	4.69×10-6
		Diprotin B	5.54×10-5
Phg-Pro-Ile	1.54×10-5
		Nva-Pro-Ile	2.49×10-5
Cha-Pro-Ile	2.03×10-5

Nle-Pro-Ile	2.19×10-5
		Ser(P)-Pro-Ile	0.012
Tyr(P)-Pro-Ile	0.002
		Phe-Pro-Ile	6.20×10-5
Trp-Pro-Ile	3.17×10-4
		Ser-Pro-Ile	2.81×10-4
Thr-Pro-Ile	1.00×10-4
		Val-Pro-Val	1.64×10-5
Ile-Pro-Val	1.52×10-5
		Abu-Pro-Ile	3.43×10-5
Pip-Pro-Ile	0.100
		Ile-Pro-别-Ile	1.54×10-5
Val-Pro-别-Ile	1.80×10-5
		Tyr-Pro-别-Ile	6.41×10-5
AOA-Pro-Ile	4.21×10-5
		叔丁基-Gly-Pro-Ile	9.34×10-6
Ser(Bzl)-Pro-Ile	6.78×10-5
		Tic-Pro-Ile	0.001
Orn-Pro-Ile	2.16×10-4
		Gln-Thia	5.27×10-6
Aze-Pro-Ile	7.28×10-5
		Ile-Hyp-Ile	0.006
叔丁基-Gly-Pro-Val	1.38×10-5
		Gln-Pyrr	1.50×10-5
Val-Pro-叔丁基-Gly	6.75×10-5
		叔丁基-Gly-Pro-Gly	5.63×10-5

Ile-Pro-叔丁基-Gly	8.23×10-5
		叔丁基-Gly-Pro-IleNH2	2.29×10-5
叔丁基-Gly-Pro-D-Val	1.12×10-4
		叔丁基-Gly-Pro-叔丁基-Gly	2.45×10-5
Aib-Pro-Ile	未抑制
		Ile-环戊基酮	3.82×10-5
叔丁基-Gly-环己基酮	2.73×10-4
		Ile-环己基酮	2.93×10-4
Val-环戊基酮	4.90×10-5
		Val-环己基酮	0.001
Val-Pro-甲基酮	5.79×10-7
		Val-Pro酰氧基甲基酮	1.02×10-8
Val-Pro-苯甲酰基甲基酮	1.79×10-8
		Val-Pro-苯并噻唑甲基酮	1.38×10-7

Ser(P)和Ser(Bzl)指磷酸丝氨酸和苄基丝氨酸。Typ(P)指磷酸酪氨酸。

实施例9：DPIV样酶-二肽基肽酶II的抑制

如果N-末端未质子化，DP II(3.4.14.2)从寡肽上释放二肽(McDonald，J.K.，Ellis，S.& Reilly，T.J.，1966，J.Biol.Chem.，241，1494-1501)。P₁位优选残基为Pro和Ala。其酶活性据称是DPIV样活性的，但DPII在酸性pH下活性最佳。所用酶自猪肾中提取纯化。

试验

将100μl浓度范围在1×10^-4M至5×10^-8M的谷氨酰吡咯烷和谷氨酰噻唑烷与100μl缓冲液(40mM HEPES，pH7.6，0.015％Brij，1mMDTT)、50μl赖氨酰丙氨酰氨甲基香豆素溶液(5mM)和20μl猪DPII(在缓冲液中稀释20倍)混合。于30℃下进行荧光测量，λ_激发＝380nm，λ_发射＝465nm，采用plate reader(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)测量25分钟。采用GraFit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd.UK)计算值，测得谷氨酰吡咯烷K_i＝8.52×10^-5±6.33×10^-6M，谷氨酰噻唑烷K_i＝1.07×10^-5±3.81×10^-7M。

实施例10：交叉反应酶

测量谷氨酰吡咯烷和谷氨酰噻唑烷对二肽基肽酶I、脯氨酰寡肽酶和氨酰基脯氨酸二肽酶交叉反应的能力。

二肽基肽酶I(DPI，组织蛋白酶C)：

DPI或组织蛋白酶C是一种从底物N-端切割二肽的溶酶体半胱氨酸蛋白酶(Gutman，H.R.& Fruton，J.S.，1948，J.Biol.Chem.，174，851-858)。它被归类为半胱氨酸蛋白酶。所用酶购自Qiagen(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)。为得到完全活性的酶，在MES缓冲液(pH5.6，40mMMES，4mM DTT，4mM KCl，4mM EDTA，0.015％Brij，)中将酶稀释100倍并于30℃下预温育30分钟。

试验

将50μl浓度范围在1×10^-5M至5×10^-7M的谷氨酰吡咯烷和谷氨酰噻唑烷与110μl酶的缓冲溶液混合。试验混合物于30℃下预温育15分钟。预温育后，加入100μl组氨酰丝氨酰-β-硝基苯胺(2×10^-5M)，λ_激发＝380nm，λ_发射＝465nm，于30℃下采用plate reader(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)测量10分钟。

采用GraFit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd.UK)计算IC₅₀值，未发现谷氨酰吡咯烷和谷氨酰噻唑烷对DP I酶活性有抑制作用。

脯氨酰寡肽酶(POP)

脯氨酰寡肽酶(EC 3.4.21.26)是一种在N-端Xaa-Pro键上切割肽的丝氨酸型内切蛋白酶(Walter，R.，Shlank，H.，Glass，J.D.，Schwartz，I.L.& Kerenyi，T.D.，1971，Science，173，827-829)。底物为分子量高达3000Da的肽。所用酶为重组人脯氨酰寡肽酶。按本领域所述标准条件在E.Coli中进行重组表达。

试验

将100μl浓度范围在1×10^-4M至5×10^-8M的谷氨酰吡咯烷和谷氨酰噻唑烷与100μl缓冲液(40mM HEPES，pH7.6，0.015％Brij，1mMDTT)和20μl POP溶液混合。试验混合物于30℃下预温育15分钟。预温育后，加入50μl甘氨酰脯氨酰-β-硝基苯胺(0.29mM)，于30℃测量4-硝基苯胺释放所产生的黄色，采用plate reader(Sunrise，Tecan，Crailsheim，Germany)于405nm处测量10分钟。采用GraFit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd.UK)计算IC₅₀值，未发现谷氨酰吡咯烷和谷氨酰噻唑烷对POP活性有抑制作用。

氨酰基脯氨酸二肽酶(X-Pro二肽酶)

氨酰基脯氨酸二肽酶(EC 3.4.13.9)最初被Bergmann & Fruton(Bergmann，M.& Fruton，JS，1937，J.Biol.Chem.189-202)所报道。氨酰基脯氨酸二肽酶从Xaa-Pro二肽上释放N-端氨基酸，最佳pH在6-9之间。

将源自猪肾的氨酰基脯氨酸二肽酶(ICN Bionedicals，Eschwege，Germany)溶于(1mg/ml)试验缓冲液(20mM NH₄(CH₃COO)₂，3mMMnCl₂，pH7.6)中，为获得完全的酶活性，于室温下预温育60分钟。

试验

将450μl浓度范围在5×10^-3M至5×10^-7M的谷氨酰吡咯烷和谷氨酰噻唑烷与500μl缓冲液(20mM NH₄(CH₃COO)₂，pH7.6)和250μlIle-Pro-OH溶液(在试验溶液中浓度为0.5mM)混合。试验混合物于30℃下预温育5分钟。预温育后，加入70μl氨酰基脯氨酸二肽酶溶液(按1∶10稀释比溶于试验缓冲液中)，于30℃下采用UV/Vis光度计(ThermoSpectronic，Cambridge，UK)于220nm处测量20分钟。

采用GraFit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd.UK)计算IC₅₀值，未发现谷氨酰吡咯烷和谷氨酰噻唑烷对POP活性有抑制作用。测得谷氨酰噻唑烷的IC₅₀＞3mM，谷氨酰吡咯烷IC₅₀＝3.4×10^-4M±5.63×10^-5M。

实施例11：对Wistar大鼠插管或口服给药后DPIV抑制活性的测定

动物

雄性Wistar大鼠(Shoe：Wist(Sho))，体重250至350g之间，购自Tierzucht Schnwalde(Schnwalde，Germany)。

饲养条件

动物在温控(22±2℃)的常规条件下分笼饲养，采取12/12小时光/暗循环(光照于06:00AM开始)。饮食为标准颗粒饲料(ssniff^Soest，Germany)和HCl酸化的自来水，采取随意食用的方式。

颈动脉插管

于饲养条件下适应≥1周后，在全身麻醉(腹腔注射0.25ml/kg b.w.Rompun^[2％]，BayerVital，Germany和0.5ml/kg b.w.氯胺酮10，AtarostGmbH&Co.，Twistringen，Germany)条件下将导管植入Wistar大鼠的颈动脉中。用1周的时间供动物恢复。导管每周用肝磷脂-生理盐水溶液(100IU/ml)冲洗3次。对于导管失效的情况，将第二条导管插入相应大鼠对侧的颈动脉中。手术后恢复1周后将该大鼠重新投入试验中。对于第二条导管也失效的情况，则试验中放弃该大鼠。重新取新的动物投入试验，按预定的试验计划，于导管植入7天后开始试验。

试验设计

通过口服或插管(动脉内)给药的途径对插管大鼠给药安慰剂(1ml盐水，0.154mol/l)或试验化合物。经过夜禁食后，于-30、-5和0分钟时收集100μl肝磷脂化的动脉血样。试验化合物现溶于1.0ml盐水(0.154mol/l)中，0分钟时通过饲管(75mm，Fine Science Tools，Heidelberg，Germany)口服或通过插管进行给药。对于口服给药，将1ml额外的盐水注入动脉导管中。对于插管给药，导管立即用30μl盐水冲洗并且将1ml额外的盐水通过饲管喂入动物体内。

给药安慰剂或试验化合物后，在2.5、5、7.5、10、15、20、40、60和120分钟时从清醒、未受限制大鼠的导管中收集动脉血样。用于血浆DPIV活性测量的所有血样均收集在冰冷却的，装有10μl 1M柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)的Eppendorf管(Eppendorf-Netheler-Hinz，Hamburg，Germany)中。立即对Eppendorf管进行离心(12000rpm，2分钟，HettichZentrifuge EBA 12，Tuttlingen，Germany)。收集血浆贮存于冰中或于-20℃下冷冻待分析。所有血浆样品标签具有以下内容：

●编号

●动物号

●采样日期

●采样时间

分析方法

测定血浆DPIV活性的试验混合物包含80μl试剂和20μl血浆样品。30℃下预温育2分钟后，于390nm下动态测量自底物甘氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺释放的黄色产物4-硝基苯胺。DPIV活性表示为mU/ml。

统计学方法

采用PRISM^3.02(GraphPad Software，Inc.)进行统计计算和绘图。所有参数被表示成包含平均值和SD的形式进行分析。

1.1.1测量结果-t_max时体内的DPIV抑制率

化合物结构	剂量(mg/kg)	插管(％)	口服(％)
				Gln-Pyrr	100	80	67
Gln-Thia	100	88	71
				Diprotin A	100	73	无抑制
Diprotin B	100	50	无抑制
				Tyr(P)-Pro-Ile	100	37	无抑制
叔丁基-Gly-Pro-Ile	100	71	28
				叔丁基-Gly-Pro-Val	100	72	25
Ala-Val-Pro-酰氧基甲基酮	100	89	86
				Ala-Val-Pro-苯甲酰基甲基酮	100	97	76
Ile-环戊基酮	100	34	15

实施例12：侧链修饰的谷氨酰噻唑烷作为不易转运的DPIV抑制剂的作用

合成结构为H-Glu(X)-噻唑烷的侧链经修饰的谷氨酰噻唑烷，其中X表示聚乙二醇或不同长度的寡聚甘氨酸链(参见描述化合物合成的实施例中的方法A)。检查这些衍生物的结合特性和对于肽转运蛋白Pep T1的可转运性。

令人吃惊地发现，侧链修饰仅轻微改变化合物对DPIV的结合特性。相反地，侧链修饰使得抑制剂被肽转运蛋白转运的能力显著下降。

因此，侧链修饰的DPIV或DPIV样酶抑制剂非常适用于体内局部抑制DPIV。

12.1试验结果：所选DPIV抑制剂的可转运性

化合物氨基酸噻唑烷	EC50(mM)1	Imax(nA)2
			H-Ile-ThiaH-Glu-Thia	0.981.1	25±835±13
侧链修饰的谷氨酰噻唑烷
			H-Gly(NHOH)-Thia	3.18	42±11
H-Glu(Gly3)-Thia	8.54	n.d.3
			H-Glu(Gly5)-Thia	＞10	n.d.3
H-Glu(PEG)-Thia	＞10	n.d.3

¹化合物50％抑制³H-D-Phe-Ala(80mM)结合P.Pastoric细胞表达的PepT1的有效浓度(EC₅₀值)；

²X.leavis卵母细胞表达的Pep T1的转运特性-通过双电极电压钳的方法，I＝转运产生的内向电流。

实施例13：二肽基肽酶IV在多发性硬化病模型中的作用效能

13.1试验1：1-15天腹腔注射治疗(每天0-30mg/kg b.w.异亮氨酰噻唑烷富马酸盐)，评分至免疫后第15天

材料与方法

动物

第一次试验中采用雌性自交Lewis大鼠(n＝50)，平均体重为196±6g，购自Charles River(Bad Sulzfeld，Germany)。将动物随机分组至各试验条件中。每笼饲养4只大鼠，采取12∶12小时光/暗循环(于18:00熄灯)，在恒温(24℃)，无特定病原体的空调动物房内饲养，饮食为Altromin颗粒饲料和自来水，采取随意食用的方式。每周按常规清理一次饲养笼。

EAE的诱导

将豚鼠MBP(50μg/大鼠)乳化于含有热杀灭的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，H37Ra，225μg/大鼠)的完全弗氏佐剂(CFA)中，取100μl(12)皮下注射于大鼠尾根部。CFA(Sigma)和热杀灭的结核分枝杆菌(H37Ra)购自Life Technologies，Inc.(Rockville，MD)。按以下标准对临床症状进行评分：0.5：部分丧失尾张力；1.0：尾张力完全丧失；2.0：后肢虚弱；2.5：后肢中一条腿麻痹；3.0：后肢中双腿麻痹；3.5：三条腿麻痹；4.0：四肢麻痹和垂死状态；5.0：因EAE导致死亡。由于大部分动物约48小时后达到临床症状最大分值，免疫后15天终止试验。采用尾根部作为免疫部位佐剂诱导的关节炎发病率非常低(第一次试验中n＝0)。概况而言，对于表现出关节炎症状但未发展成EAE症状或尸检中出现腹膜炎的动物，将其排除而不作进一步数据分析。第一次试验中未发现关节炎症状和突然死亡以及因反复腹腔注射导致的腹膜炎。1mg/kg治疗组中的两只动物未出现明显的EAE症状(评分＞1)，尽管可以用于反映治疗效果，但是还是将其排除而不作进一步的数据分析。尾根部进行免疫可能造成急性炎症，这可能会影响免疫后第一天的尾张力。

统计学分析

采用用于重复测量的双处理因素方差分析(ANOVA)对不同治疗组的EAE临床病程进行对比。根据每天的临床评分计算EAE临床评分之和、症状发作和峰值并采用单处理因素ANOVA进行分析，如果有必要，此后再进行post hoc Fisher′s PLSD分析。所有数据均表示为平均值±SEM。

试验结果

Lewis大鼠每天注射异亮氨酰噻唑烷富马酸盐对于EAE临床病程的效应

EAE临床病程显示于图1中。用于重复测量的双处理因素ANOVA(治疗×不同时间的临床评分)显示两处理因素间存在明显交互效应(F(4，56)＝1.7；p＝0.001))，表明存在一个疾病的分化过程。这种交互效应极可能是因为抑制剂治疗加重了EAE的起始过程但又对疾病的恢复有改善。

按天进行的独立单处理因素ANOVA裂区分析表明1mg剂量组在免疫后11和12天症状明显加重(第11天：F(4，43)＝2.8；p＜0.05；第12天：F(4，43)＝3.0；p＜0.05)，而10mg剂量组在免疫后15明显减轻了症状(F(4，43)＝4.8；p＜0.001)。这又一次证明了抑制剂最初加重症状，随后又导致疾病的加速恢复。对临床过程关键参数的进一步分析证明以剂量10mg/kg的抑制剂进行治疗将病症发作潜伏期缩短了约1天。

结论

在采用分散于CFA中的MBP进行免疫后的15天内，采用宽剂量范围的DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷富马酸盐每天腹腔注射对大鼠所进行的治疗表明，药物最初加重症状，在恢复期内改善了病症的临床过程。这可能是因为急性病症期间初始的促炎效应在病症达到峰值后可能转变成抗炎效应或其它临床改善效应。这些效应总的来说是有利的。通过对比“初期”和“后期”以及“诱导”和“发展”的病症效应，利用以下试验验证这一假设。

13.2试验2：5-15天腹腔注射治疗(每天0-30mg/kg b.w.异亮氨酰噻唑烷富马酸盐)，评分至免疫后第21天

材料与方法

动物

第二次试验中采用雄性自交Lewis大鼠(n＝50)，平均体重为230±12g，购自Charles River(Bad Sulzfeld，Germany)。将动物随机分组至各试验条件中。每笼饲养4只大鼠，采取12∶12小时光/暗循环(于18:00熄灯)，在恒温(24℃)、无特定病原体的空调动物房内饲养，饮食为Altromin颗粒饲料和自来水，采取随意食用的方式。每周按常规清理一次饲养笼。

EAE的诱导

将豚鼠MBP(50μg/大鼠)乳化于含有热杀灭的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，H37Ra，225μg/大鼠)的完全弗氏佐剂(CFA)中，取100μl(12)皮下注射于大鼠尾根部。CFA(Sigma)和热杀灭的结核分枝杆菌(H37Ra)购自Life Technologies，Inc.(Rockville，MD)。按以下标准对临床症状进行评分：0.5：部分丧失尾张力；1.0：尾张力完全丧失；2.0：后肢虚弱；2.5：后肢中一条腿麻痹；3.0：后肢中双腿麻痹；3.5：三条腿麻痹；4.0：四肢麻痹和垂死状态；5.0：因EAE导致死亡。免疫后21天后终止试验。

第二次试验中EAE进程的概括性观察结果

采用尾根部作为免疫部位佐剂诱导的关节炎发病率非常低(第二次试验中n＝0)。第二次试验中未发现关节炎症状。令人吃惊的是发现与第一次试验类似，1mg/kg治疗组中的四只动物未出现明显的EAE症状(评分＞1)。这一次将这些动物进行分析，因为出现这种情况可能是由于治疗的作用。在这一试验中观察到了“病症离异”现象。有几只动物出现了明显的尾紧张，这与后腿明显虚弱有关。这些动物的评分最高，即分值为2。

统计学分析

采用用于重复测量的双处理因素方差分析(ANOVA)对不同治疗组的EAE临床病程进行对比。根据每天的临床评分计算EAE临床评分之和、症状发作和峰值，并采用单处理因素ANOVA进行分析，如果有必要，此后再进行post hoc Fisher′s PLSD分析。所有数据均表示为平均值±SEM。

试验结果

EAE发展期间Lewis大鼠每天注射异亮氨酰噻唑烷富马酸盐的效应

EAE临床病程显示于图3中。用于重复测量的双处理因素ANOVA(治疗×不同时间的临床评分)显示了对于处理因素“治疗”的显著效应(F(4，45)＝4.3；p＝0.0048))，同时两处理因素间存在明显交互效应(F(4，45)＝3.5；p＜0.0001))，表明存在一个疾病的分化过程。这种交互效应极可能是因为在EAE的初期低剂量抑制剂治疗加重甚至“诱导”出一个初期的峰值，而高剂量明显改善了病症的急性期。按天进行的独立单处理因素ANOVA裂区分析表明在病症两个峰值间明显的病症加重效应。在开始治疗的6-9天后，3mg和10mg剂量组立即诱导出一个明显病症活性的第一个峰(参见图3，第6天：F(4，41)＝6.7；p＝0.0003；第7天：F(4，41)＝13.4；p＜0.0001；第8天：F(4，41)＝10.0；p＜0.0001；第9天：F(4，41)＝6.0；p＝0.0007)。第二个峰为“经典的急性EAE”，比第一个峰更为严重，1mg剂量组增加了临床评分，而30mg/kg的高剂量组显示出明显的延迟和缓解效应(参见图4，第10天：F(4，41)＝16；p＜0.0001；第11天：F(4，41)＝13.5；p＜0.0001；第12天：F(4，41)＝8.0；p＜0.0001；第13天：F(4，43)＝3.4；p＝0.017)。这表明低剂量组具有促炎效应而高剂量组在MS的这种病理模型中具有保护或抗炎样作用。对临床过程关键参数的进一步分析证明抑制剂治疗中1mg/kg剂量组表现出促炎效应，而30mg/kg剂量组表现出保护或抗炎样作用，使得病症出现延迟。

免疫后5-15(21)天受治疗的雄性Lewis大鼠EAE的临床评分

                    异亮氨酰噻唑烷富马酸盐

临床评分         0mg/kg     1mg/kg    3mg/kg    10mg/kg    30mg/kg

病症出现

                 11.8       10.3^*    12.0      12.1       14.0^***

(评分＞1的第1天)

最大分值         2.6        2.8       3.0       2.1        2.0^*

分值之和         10.2       14.2^*    12.0      10.8       5.6^**

分值平均值       0.68       0.96^*    0.8       0.72       0.37^**

第5-15天中，对于不同剂量异亮氨酰噻唑烷富马酸盐治疗的大鼠来说，从EAE评分衍生出的各关键参数明显不同。1mg/kg剂量组的促炎效应和30mg/kg剂量组的抗炎样效应是明显的。数据表示为^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001vs.对照。

结论

这一试验观察了采用宽剂量范围的DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷富马酸盐每天腹腔注射对雄性Lewis大鼠的治疗效果，治疗共进行了10天，在采用分散于CFA中的MBP免疫后5天进行治疗。在这一试验设计和MS模型中，治疗产生了明显剂量依赖的和生物形式的治疗效果。低剂量(1mg)药物最初加重了EAE的急性期。中等剂量(3和10mg)的异亮氨酰噻唑烷富马酸盐在病症起始后立即诱导出一个早期“第一个峰”，说明了体内的促炎效应。高剂量(30mg)药物表现出明显的抗炎效应并延迟了病症的起始。

13.3试验3：病症发展期的经套管脑室给药治疗(5-15天中，每天0-50nmol异亮氨酰噻唑烷富马酸盐/5μl)

材料与方法

动物

第三次试验中采用雌性自交Lewis大鼠(n＝50)，平均体重为201±5g，购自Charles River(Bad Sulzfeld，Germany)。将动物随机分组至各试验条件中。每笼饲养4只大鼠，采取12∶12小时光/暗循环(于18:00熄灯)，在恒温(24℃)、无特定病原体的空调动物房内饲养，饮食为Altromin颗粒饲料和自来水，采取随意食用的方式。每周按常规清理一次饲养笼。

手术及经套管脑室给药

在氯胺酮/赛拉嗪(100/5mg/kg，腹腔注射)麻醉下，将大鼠固定于Kopf立体定位架上，利用在别处详细描述的标准立体定位技术将套管(Plastic One，Inc.，Roanoke，VA，USA)植于侧脑室上(坐标：A：0.7mm尾侧，L：1.4mm侧面至前囱，V：3.2mm中部至头颅表面；齿条+3.0耳条之上)。经过4天恢复期后，每天假装注射使大鼠适应试验操作，适应期为三天。侧脑室植入套管7天后诱导EAE。

EAE的诱导

将豚鼠MBP(50μg/大鼠)乳化于含有热杀灭的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，H37Ra，225μg/大鼠)的完全弗氏佐剂(CFA)中，取100μl(12)皮下注射于大鼠尾根部。CFA(Sigma)和热杀灭的结核分枝杆菌(H37Ra)购自Life Technologies，Inc.(Rockville，MD)。按以下标准对临床症状进行评分：0.5：部分丧失尾张力；1.0：尾张力完全丧失；2.0：后肢虚弱；2.5：后肢中一条腿麻痹；3.0：后肢中双腿麻痹；3.5：三条腿麻痹；4.0：四肢麻痹和垂死状态；5.0：因EAE导致死亡。免疫后15天后终止试验。

第三次试验中EAE进程的概括性观察结果

第三次试验中未发现关节炎症状。对照组中一只动物的侧脑室套管丢失，将其排除而不进行进一步数据分析。其它所有动物均抵抗住试验的考验，未出现任何排斥和病态反应。

统计学分析

采用用于重复测量的双处理因素方差分析(ANOVA)对不同治疗组的EAE临床病程进行对比。根据每天的临床评分计算EAE临床评分之和，症状发作和峰值并采用单处理因素ANOVA进行分析，如果有必要，此后再进行post hoc Fisher′s PLSD分析。所有数据均表示为平均值±SEM。

试验结果

EAE发展期间雌性Lewis大鼠每天经套管脑室给药异亮氨酰噻唑烷富马酸盐的效应

EAE 临床病程显示于图5中。用于重复测量的双处理因素ANOVA(治疗×不同时间的临床评分)显示了对于处理因素“治疗”的显著效应(F(4，56)＝3.0；p＝0.003)，同时两处理因素间存在明显交互效应(F(4，56)＝2.1；p＜0.0001)，表明存在一个疾病的分化过程。这种交互效应极可能是因为所有剂量的化合物延迟和/或减轻EAE的临床病程。

对临床过程关键参数的进一步分析证明抑制剂治疗对所有观察的参数均表现出抗炎作用。

免疫后5-15天经套管脑室给药治疗的雌性Lewis大鼠EAE的临床评分

                     异亮氨酰噻唑烷富马酸盐

临床评分         0nmol     0.5nmol     5nmol     10nmol     50nmol

病症出现

                 9.6       10.5        11.2^*    12.5^**    13.5^***

(评分＞1的第1天)

最大分值         2.5       2.75        2.0        2.0       1.6^*

分值之和         11.5      10.6        6.5^*      6.7^*     4.9^**

分值平均值       0.76      0.7         0.44^*     0.45^*    0.31^**

第5-15天中，对于不同剂量异亮氨酰噻唑烷富马酸盐治疗的大鼠来说，从EAE评分衍生出的各关键参数明显不同。剂量为5-50nmol时剂量依赖性的和强的抗炎效应是显著的。数据表示为^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001vs.对照。

结论

这一试验观察了采用宽剂量范围的DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷富马酸盐每天经套管脑室给药对于雌性Lewis大鼠的治疗效果，采用分散于CFA中的MBP免疫后，免疫后5-15天中治疗共进行了10天。这一试验设计的目的在于观察EAE期间药物对CNS局部炎症中所包含的细胞成分的作用。经套管脑室5-50nmol异亮氨酰噻唑烷富马酸盐产生剂量依赖性的抗炎作用。这些发现表明了药物具有强效抗炎作用。

Claims (13)

1、二肽基肽酶IV(DPIV)或DPIV样酶抑制剂在缓解免疫、自身免疫疾病或中枢神经系统疾病中的应用，所述疾病选自中风、局部缺血、帕金森氏症、多发性硬化病和偏头痛。

2、如权利要求1所述的应用，其中疾病为多发性硬化病。

3、如权利要求1或2所述的应用，其中二肽基肽酶IV样酶选自成纤维细胞激活蛋白α、二肽基肽酶IVβ、二肽基氨基肽酶样蛋白、N-乙酰化α连接的酸性二肽酶、休眠细胞脯氨酸二肽酶、二肽基肽酶II、attractin、二肽基肽酶IV相关的蛋白(DPP8)、二肽基肽酶9(DPP9)、KIAA1492、DPRP1、DPRP2和DPRP3。

4、如上述任意权利要求之一所述的应用，其中二肽基肽酶IV样酶的结构尚未被发现。

5、如上述任意权利要求之一所述的应用，其中抑制剂为氨基酸和吡咯烷或噻唑烷基构成的二肽化合物以及它们的盐。

6、如上述任意权利要求之一所述的应用，其中二肽化合物选自L-苏-异亮氨酰吡咯烷、L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰吡咯烷、L-谷氨酰噻唑烷、L-谷氨酰吡咯烷、L-谷氨酸噻唑烷、L-谷氨酸吡咯烷及其盐。

7、如权利要求1-4任意之一所述的应用，其中抑制剂为以下通式所代表的，竞争性调节二肽基肽酶IV催化反应的肽化合物：

其中：

A为除D-氨基酸以外的任意氨基酸；

B为选自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮杂环丁烷基-(2)-甲酸和2-哌啶酸的氨基酸，

C为除Pro、Hyp、氮杂环丁烷基-(2)-甲酸、2-哌啶酸以外的任意氨基酸，N-烷基化氨基酸如N-甲基缬氨酸和肌氨酸也除外，

D为任意氨基酸或不存在，并且

E为任意氨基酸或不存在，

或者：

C为除Pro、Hyp、氮杂环丁烷基-(2)-甲酸、2-哌啶酸以外的任意氨基酸，N-烷基化氨基酸如N-甲基缬氨酸和肌氨酸也除外，D-氨基酸也除外，

D为选自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮杂环丁烷基-(2)-甲酸和2-哌啶酸的氨基酸，

E为除Pro、Hyp、氮杂环丁烷基-(2)-甲酸、2-哌啶酸以外的任意氨基酸，N-烷基化氨基酸如N-甲基缬氨酸和肌氨酸也除外。

8、如权利要求1-4任意之一所述的应用，其中抑制剂为以下通式所代表的肽基酮，包括其所有的立体异构体及药学可接受的盐：

其中：

A选自：

X¹为H或酰基或氧羰基或氨基酸或肽残基，

X²为H，-(CH)_n-NH-C₅H₃N-Y其中n＝2-4，或C₅H₃N-Y(一个二价吡啶基)，Y选自H、Br、Cl、I、NO₂或CN，

X³为H或未取代的或由一个、两个或更多个烷基、烷氧基、卤素、硝基、氰基或羧基取代的苯基或吡啶基，

X⁴为H或未取代的或由一个、两个或更多个烷基、烷氧基、卤素、硝基、氰基或羧基取代的苯基或吡啶基，

X⁵为H或烷基、烷氧基或苯基，

X⁶为H或烷基，

n＝1时

X选自H、OR²、SR²、NR²R³、N⁺R²R³R⁴，其中：

R²代表未取代的或由一个、两个或更多个烷基、环烷基、芳基或杂芳基取代的酰基，或代表未取代的或由一个、两个或更多个烷基、环烷基、芳基或杂芳基取代的所有氨基酸和肽残基或烷基，

R³代表烷基或酰基，其中R²和R³可以是一个或多个饱和及不饱和碳环或杂环环结构的一部分，

R⁴代表烷基，其中R²和R⁴或R³和R⁴可以是一个或多个饱和及不饱和碳环或杂环环结构的一部分，

n＝0时

X选自：

其中

B代表O，S，NR⁵，其中R⁵为H，亚烷基或酰基，

C、D、E、F、G、H各自独立地选自未取代或取代的烷基，烷氧基，烷硫基，氨烷基，羰基烷基，酰基，氨基甲酰基，芳基或杂芳基；并且

n＝0以及n＝1时

Z选自H，C₁-C₉支链或直链烷基或C₂-C₉支链或直链链烯基，C₃-C₈环烷基，C₅-C₇环烯基，芳基或杂芳基，或选自所有天然氨基酸及其衍生物的所有侧链的侧链。

9、如权利要求1-4任意之一所述的应用，其中抑制剂为以下通式5、6、7、8、9、10和11所代表的氨基酮衍生物，包括其所有的立体异构体及药学可接受的盐：

其中：

R¹为H，C₁-C₉支链或直链烷基，C₂-C₉支链或直链链烯基，C₃-C₈环烷基，C₅-C₇环烯基，芳基或杂芳基，或选自天然氨基酸及其衍生物的侧链，

R³和R⁴各自独立地选自H，羟基，烷基，烷氧基，芳氧基，硝基，氰基或卤素，

A为H或碳酸的电子等排体，如选自CN、SO₃H、CONHOH、PO₃R⁵R⁶、四唑、酰胺、酯、酸酐、噻唑和咪唑的官能团，

B选自：

其中：

R⁵为H，-(CH)_n-NH-C₅H₃N-Y其中n＝2-4，C₅H₃N-Y(为二价吡啶基)，

其中Y＝H，Br，Cl，I，NO₂或CN，

R¹⁰为H，酰基，氧羰基或氨基酸残基，

W为H或苯基或吡啶基，这些基团为未取代的或被一个、二个或更多个烷基、烷氧基、卤素、硝基、氰基或羧基取代，

W¹为H，烷基，烷氧基或苯基，

Z为H或苯基或吡啶基，这些基团为未取代的或被一个、二个或更多个烷基、烷氧基、卤素、硝基、氰基或羧基取代，

Z¹为H或烷基，

D为C₄-C₇环烷基，C₄-C₇环烯基，该基团可以是未取代的或被一个、二个或更多个烷基取代，或者为4-7员杂环烷基或4-7员杂环烯基，

X²为O，NR⁶，N⁺(R⁷)₂或S，

X³至X¹²各自独立地选自CH₂，CR⁸R⁹，NR⁶，N⁺(R⁷)₂，O，S，SO和SO₂，包括所有饱和和不饱和的结构，

R⁶、R⁷、R⁸、R⁹各自独立地选自H，C₁-C₉支链或直链烷基，C₂-C₉支链或直链链烯基，C₃-C₈环烷基，C₅-C₇环烯基，芳基或杂芳基，

其中各基团需满足以下条件：

分子式6：如果A不为H，则X⁶为CH，

分子式7：如果A不为H，则X¹⁰为C，

分子式8：如果A不为H，则X⁷为CH，

分子式9：如果A不为H，则X¹²为C。

10、如权利要求1-4任意之一所述的应用，其中DPIV或DPIV样酶抑制剂为以下通式所代表的化合物，包括其所有的立体异构体及药学可接受的盐：

其中：

A为侧链上带有至少一个官能团的氨基酸，

B为一种共价结合于A中至少一个官能团上的化合物，特别是

-链长最多为20个氨基酸的寡肽，或者

-摩尔质量最多为20000g/mol的聚乙二醇，

-任选被取代并有8-50个碳原子的有机胺、酰胺、醇、酸或芳香化合物；以及

C为通过酰胺键与A连接的噻唑烷、吡咯烷、氰基吡咯烷、羟脯氨酸、脱氢脯氨酸或哌啶基。

11、如权利要求10所述的应用，其中A为一种氨基酸，优选为一种α-氨基酸，特别是侧链具有一个、二个或多个官能团的天然氨基酸，选自苏氨酸、酪氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸。

12、如上述任意权利要求之一所述的应用，其中所述抑制剂是一种药用组合物，其中包含药学可接受的载体或稀释剂以及治疗有效量的所述抑制剂或其药学可接受的酸加成盐。

13、如上述任意权利要求之一所述的应用，其中抑制剂与药学可接受的载体和/或稀释剂联合使用。

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