JP2003519630A - 抗血管新生タンパク質およびその断片ならびに使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 抗血管新生性を有するタンパク質およびその断片ならびにそれらのタンパク質および断片を使って血管新生を阻害または促進する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 関連出願 本願は、２０００年７月２１日出願の米国特許出願第０９／６２５，１９１号
、２０００年４月４日出願の米国特許出願第０９／５４３，３７１号および２０
００年１月７日出願の米国特許出願第０９／４７９，１１８号の一部継続出願で
ある。また、米国特許出願第０９／６２５，１９１号は米国特許出願第０９／５
４３，３７１号の一部継続出願であり、前記米国特許出願第０９／５４３，３７
１号は米国特許出願第０９／４７９，１１８号と共に１９９９年６月１７日出願
の米国特許出願第０９／３３５，２２４号の一部継続出願である。さらに、前記
米国特許出願第０９／３３５，２２４号は１９９８年６月１７日出願の米国仮特
許出願第６０／０８９，６８９号および１９９９年３月２５日出願の米国仮特許
出願第６０／１２６，１７５号の利益を主張する。上記全特許出願の開示はその
まま参照により本明細書に組み込まれる。

【０００２】 政府の支援 本発明の全部または一部は国立衛生研究所の助成金ＤＫ−５１７１１、ＤＫ−
５５００１による支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

【０００３】 発明の背景 基底膜は、上皮および内皮細胞が成長する土台となる支持構造をなし、筋肉ま
たは脂肪を取り囲んでいる、特殊化した細胞外マトリックスの薄い層である（Ｐ
ａｕｌｓｓｏｎ，Ｍ．，１９９２，Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７：９３−１２７）。基底膜は常に細胞と結合してお
り、基底膜が物理的な支持を提供するだけでなく、分化および増殖などの細胞の
挙動にも影響を及ぼすことが、十分に考証されている。血管基底膜はコラーゲン
、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、フィブロネクチンおよびエンタク
チンなどの高分子で構成されている（Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：６１８−２４）。機能的にはコラ
ーゲンは細胞接着、遊走、分化および成長を促進し（Ｐａｕｌｓｓｏｎ，Ｍ．，
１９９２，Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．
２７：９３−１２７）、これらの機能により、既存の血管から新しい血管が形成
される過程である血管新生（angiogenesis）に際して、内皮細胞の増殖と挙動に
決定的な役割を果たすと考えられている（Ｍａｄｒｉ，Ｊ．Ａ．ら，１９８６，
Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ３４：８５−９１；Ｆｏｌ
ｋｍａｎ，Ｊ．，１９７２，Ａｎｎ． Ｓｕｒｇ． １７５：４０９−１６）。
血管新生は複雑な過程であり、内皮細胞の出芽と遊走、それらの細胞の増殖なら
びにそれらの管状構造への分化および発達中の血管を取り囲む基底膜マトリック
スの産生を必要とする。また血管新生は、創傷治癒および子宮内膜リモデリング
などの正常な生理学的事象に不可欠な過程である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．ら，１
９９５，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１０９３１−３４）。血管新
生が転移と、数ｍｍ^３を越えるサイズを持つ固形腫瘍の成長に必要であることは
、現在では十分に考証されている（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，１９７２，Ａｎｎ．
Ｓｕｒｇ． １７５：４０９−１６、Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，１９９５，Ｎａ
ｔ． Ｍｅｄ． １：２７−３１）。腫瘍塊の拡大はその腫瘍を血液が灌流する
ことによって起こるだけでなく、新しい毛細管内皮が産生するいくつかの成長因
子およびマトリックスタンパク質による腫瘍細胞のパラクリン刺激によっても起
こる（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，１９９５，Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：２７−３１
）。最近、いくつかの血管新生阻害剤が同定された。すなわちアンジオスタチン
（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９４，Ｃｅｌｌ ７９：３１５−２８）
、エンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９７，Ｃｅｌｌ ８８
：２７７−８５）、レスチン（ｒｅｓｔｉｎ）（Ｒａｍｃｈａｎｄｒａｎ，Ｒ．
ら，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ
． ２５５：７３５−９）および色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）（Ｄａｗｓｏｎ
，Ｄ．Ｗ．ら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：２４５−８）である。

【０００４】 ＩＶ型コラーゲンは６種類のα鎖、すなわちα１〜α６として発現され（Ｐｒ
ｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．ら，１９９５，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．
６４：４０３−３４）、三重らせんに組み立てられる。これはさらにネットワ
ークを形成して、基底膜中の他の高分子に足場を提供する。これらのα鎖は３つ
のドメイン、すなわちＮ末端の７Ｓドメイン、中間の三重らせんドメインおよび
Ｃ末端の球状非コラーゲン（ｎｏｎ−ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ）（ＮＣ１）ドメ
インから構成されている（Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．ら，１９８１，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ． １２０：２０３−２１１）。コラーゲン代謝の阻害剤が抗血管
新生性を持つことはいくつかの研究によって示されており、基底膜コラーゲンの
合成と沈着が血管の形成と生存にとって極めて重要であるという認識を裏付けて
いる（Ｍａｒａｇｏｕｄａｋｉｓ，Ｍ．Ｅ．ら，１９９４，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎ
ｔ． ４３：１４７−５０、Ｈａｒａｌａｂｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｃ．ら，１９
９４，Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１：５７５−８２）。しかし、基底膜の組
織化および血管新生におけるコラーゲンの明確な役割はまだよくわかっていない
。

【０００５】 インテグリンは、多くの化合物に対して接着分子として機能する重要な細胞表
面接着受容体のファミリーである。インテグリンは細胞−細胞または細胞−細胞
外マトリックス相互作用に関与し、細胞の細胞外マトリックスとの相互作用を媒
介し、細胞を細胞外マトリックスと結合させる。インテグリンは、非共有結合し
た２つの膜貫通糖タンパク質サブユニット、αサブユニットおよびβサブユニッ
トからなるαβヘテロ二量体である。全てのαサブユニットは互いに相同性を示
し、同様に全てのβサブユニットも互いに相同性を示す。現在、１６種類のαサ
ブユニット（α_１〜α_９、α_Ｄ、α_Ｌ、α_Ｍ、α_Ｖ、α_Ｘ、α_ＩＩｂおよびα_{Ｉ ＥＬｂ} ）と８種類のβサブユニット（β_１〜β_８）が同定されており、これらの
サブユニットによって形成されることがわかっている組合わせは２２種類（β_１ とα_１〜α_９；β_１とα_Ｖ；β_２とα_Ｄ、α_Ｌ、α_Ｍおよびα_Ｘ；β_３とα_Ｖお
よびα_Ｘ；β_４とα_６；β_５とα_Ｖ；β_６とα_Ｖ；β_７とα_４およびα_ＩＥＬｂ ；β_８とα_Ｖ）である。利用可能なインテグリンサブユニットのプールは、一部
のインテグリンサブユニットのｍＲＮＡの選択的スプラインシングによって、さ
らに増加しうる。

【０００６】 インテグリンは一般に、細胞表面上の特定の点におけるインテグリンの濃度が
一定の最小域値を越えてフォーカルコンタクトまたはヘミデスモソームを形成し
た時に、そのリガンドを結合する。この低い結合親和性と限局性接触物の形成と
の組合わせにより、インテグリンは、インテグリン分子の濃度に依存して、弱く
結合することも強く結合することもできる。

【０００７】 発明の概要 本発明は抗血管新生タンパク質およびその生物活性断片に関する。本明細書に
記載する断片は、抗血管新生タンパク質を独立した活性（例えば抗血管新生活性
および抗腫瘍細胞活性）を持つ領域に細分できること、およびそれらの独立した
活性が大きなタンパク質分子を細分化しなければ明らかにならないことを示して
いる。ＩＶ型コラーゲンのα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの場合、これらの活性は
グッドパスチャー（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ）エピトープ領域外にもある。

【０００８】 特に本発明は、次に挙げる特徴の１または複数を有する抗血管新生性の単離さ
れたα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメイン非グッドパスチャー断片に関する：（ａ）α_Ｖ β_３インテグリンを結合することができること、（ｂ）内皮細胞の増殖を阻害す
ることができること、および（ｃ）内皮細胞のアポトーシスを引き起すことがで
きること。この単離された非グッドパスチャー断片は、本明細書で説明するよう
に、ＲＧＤ非依存的な機序によって、α_Ｖβ_３インテグリンに結合する。本明細
書にはこのようなＩＶ型コラーゲンのα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの単離された
断片を記載し、これを「タムスタチン（Tumstatin）」と呼ぶ。本明細書で使用
する用語としての「タムスタチン」は配列番号：１０または配列番号：１９を含
んでなる。また、本明細書で「Ｔｕｍ−１」または「タムスタチンＮ５３」（配
列番号：２２）と呼ぶもう１つの単離された非グッドパスチャー断片は、全長タ
ムスタチン（配列番号：１０）のアミノ酸残基５４〜アミノ酸２４４のアミノ酸
配列からなる。本明細書に開示する他の単離された断片には「Ｔｕｍ−２」（配
列番号：２３）、「Ｔｕｍ−３」（配列番号：２４）、「Ｔｕｍ−４」（配列番
号：２５）および「Ｔｕｍ−５」（配列番号：２６）があり、これらの断片はそ
れぞれ全長タムスタチン（配列番号：１０）の残基１〜１３２（Ｔｕｍ−２）、
残基１３３〜２４４（Ｔｕｍ−３）、残基１８１〜２４４（Ｔｕｍ−４）および
残基５４〜１３２（Ｔｕｍ−５）のアミノ酸配列からなる。また本明細書にはペ
プチド断片も開示する。これらのペプチド断片には「Ｔ１」（配列番号：２７）
、「Ｔ２」（配列番号：２８）、「Ｔ３」（配列番号：２９）、「Ｔ４」（配列
番号：３０）、「Ｔ５」（配列番号：３１）および「Ｔ６」（配列番号：３２）
が含まれ、これらのペプチド断片はそれぞれ全長タムスタチン（配列番号：１０
）のアミノ酸残基１〜２０（Ｔ１）、５４〜７３（Ｔ２）、６９〜８８（Ｔ３）
、８４〜１０３（Ｔ４）、９９〜１１７（Ｔ５）および１１４〜１３２（Ｔ６）
からなる。全長タムスタチンのさらにもう１つのペプチド断片を本明細書では「
タムスタチン４５−１３２」（配列番号：３３）と呼び、このペプチド断片は全
長タムスタチン（配列番号：１０）のアミノ酸残基４５〜１３２からなる。全長
タムスタチンのもう１つの断片を本明細書では「Ｔｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａ」
（配列番号：３４）と呼び、この断片は（全長タムスタチンの）１２６位のシス
テインが部位特異的変異誘発によってアラニンに変異されているタムスタチン４
５−１３２からなる。還元（例えばアルカリ還元）されたタムスタチンの断片が
抗血管新生性を有することも本明細書に記載する。他に、全長タムスタチン（配
列番号：１０）の残基２〜１２５（タムスタチン３３３）および残基２〜２４５
からなる「タムスタチン３３３」（配列番号：２０）および「タムスタチン３３
４」（配列番号：２１）の２断片も記載する。

【０００９】 また本発明は、次に挙げる特徴の１または複数を有する抗腫瘍細胞性の単離さ
れたα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの非グッドパスチャー断片を特徴とする：（ａ
）α_Ｖβ_３インテグリンを結合することができること、（ｂ）内皮細胞を結合す
ることができること、（ｃ）腫瘍細胞の増殖を阻害することができること、およ
び（ｄ）内皮細胞の増殖を阻害することができないこと。この単離された非グッ
ドパスチャー断片は、本明細書で説明するように、ＲＧＤ非依存的な機序によっ
てα_Ｖβ_３インテグリンを結合することができる。単離された非グッドパスチャ
ー断片の一つは全長タムスタチン（配列番号：１０）のアミノ酸残基１８５〜ア
ミノ酸２０３のアミノ酸配列を含んでなる。全長タムスタチンのもう１つのペプ
チド断片を本明細書では「Ｔ３」と呼び、このペプチド断片は全長タムスタチン
（配列番号：１０）のアミノ酸残基６９〜８８からなる。全長タムスタチンのさ
らにもう１つのペプチド断片を本明細書では「タムスタチン４５−１３２」と呼
び、このペプチド断片は全長タムスタチン（配列番号：１０）のアミノ酸残基４
５〜１３２からなる。全長タムスタチンのもう１つの断片を本明細書では「Ｔｕ
ｍ−５−１２６−Ｃ−Ａ」（配列番号：３４）と呼び、この断片は（全長タムス
タチンの）１２６位のシステインが部位特異的変異誘発によってアラニンに突然
変異されているタムスタチン４５−１３２（配列番号：３３）からなる。還元（
例えばアルカリ還元）されたタムスタチンの断片が抗血管新生性を有することも
本明細書に記載する。

【００１０】 また本発明は、例えば抗血管新生性のタンパク質およびペプチドと相互作用（
例えばそれらに結合）する受容体、結合タンパク質に関し、それによって抗血管
新生性のタンパク質、ペプチドおよび化合物を評価するためのターゲットを提供
する。これらの受容体およびそれらのサブユニットは、血管新生、腫瘍の成長お
よび転移、ならびに内皮細胞の増殖および遊走、ならびに内皮細胞管形成を媒介
する。これらの受容体は細胞アポトーシスをも媒介する。

【００１１】 特に本発明は、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα１鎖であるアレステン
（Ａｒｒｅｓｔｅｎ）に結合することがわかっているインテグリンサブユニット
α_１、α_２、α_３、α_Ｖ、β_１およびβ_３、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメイン
のα２鎖であるカンスタチン（Ｃａｎｓｔａｔｉｎ）に結合することがわかって
いるインテグリンサブユニットα_１、α_２およびβ_１、ならびにＩＶ型コラーゲ
ンのＮＣ１ドメインのα３鎖、タムスタチンに結合することがわかっているイン
テグリンサブユニットα_５、α_６、α_Ｖ、β_１およびβ_３に関する。インテグリ
ン結合によって媒介される血管新生および内皮細胞の増殖は、アレステン、カン
スタチンもしくはタムスタチンを投与するか、またはアレステン、カンスタチン
およびタムスタチンの受容体として働く上記インテグリンサブユニットに結合す
る他のタンパク質、ペプチドもしくは化合物を投与することによって阻害するこ
とができる。インテグリン結合によって媒介される内皮細胞のアポトーシスも、
アレステン、カンスタチンもしくはタムスタチンを投与するか、またはアレステ
ン、カンスタチンおよびタムスタチンの受容体として働く上記インテグリンサブ
ユニットに結合する他のタンパク質、ペプチドもしくは化合物を投与することに
よって阻害することができる。そのような化合物には、アレステン、カンスタチ
ンもしくはタムスタチンの抗体、断片もしくは一部、または上記インテグリンサ
ブユニットに結合するアレステン、カンスタチンもしくはタムスタチンの領域を
含むタンパク質もしくはペプチドが含まれうる。

【００１２】 また本発明は、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの受容体として
働くインテグリンサブユニットを模倣するタンパク質、ペプチドまたは化合物を
投与することによって、血管新生および細胞増殖を増強、促進または誘導する方
法に関する。そのようなタンパク質、ペプチドまたは化合物には、利用可能なア
レステン、カンスタチンまたはタムスタチンと相互作用（例えばそれらに結合）
するように働く選択されたサブユニットから構成されるインテグリンタンパク質
、ならびにその生物活性（例えば抗血管新生性）断片、突然変異体、アナログ、
ホモログおよび誘導体、ならびにその多量体（例えば二量体）および融合タンパ
ク質（本明細書ではキメラタンパク質ともいう）が含まれる。また上述のタンパ
ク質、ペプチドまたは化合物には、８．５×１０^−１１ＭのＫｄ_１値および３×
１０^６部位／細胞のＢｍａｘ_１でアレステンに結合するヘパラン硫酸プロテオグ
リカンも含まれる。ここで使用する「利用可能な」という用語は、インテグリン
またはそのサブユニットもしくは断片と接触または相互作用（例えばそれらに結
合）することができる可溶性タンパク質または循環タンパク質を意味しうる。血
管新生および細胞増殖は、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンに対す
る抗体、またはその生物活性（例えば抗血管新生性）断片、変異体、アナログ、
ホモログおよび誘導体、ならびにその多量体（例えば二量体）および融合タンパ
ク質（本明細書ではキメラタンパク質ともいう）を投与することによって増強す
ることもできる。そのような抗体はこれらの分子に結合し、それによってそれら
がそれぞれのインテグリン受容体と相互作用しないようにして、血管新生活性を
阻害する。

【００１３】 また本発明は、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンならびにその抗
血管新生性変異体および断片に似た方法で血管新生を阻害する抗血管新生性のタ
ンパク質、ペプチドおよび化合物を同定するためのキットを包含する。このよう
なキットは、適当なインテグリンサブユニット（例えばα_１、α_２、β_３サブユ
ニットなど）および下記実施例に記載するアッセイの１つを実施するのに必要な
他の同様の成分を含む。このようなキットを使って行われる例外的なアッセイに
は下記実施例１２および２８に記載の細胞接着アッセイならびに下記実施例２６
に記載の競合増殖アッセイが含まれる。

【００１４】 本発明は、組織（例えば哺乳動物組織またはヒト組織）における血管新生、腫
瘍成長または腫瘍転移を阻害する方法に関し、ここで前記組織はＩＶ型コラーゲ
ンのＮＣ１ドメインの１または複数のα鎖（例えばα_１〜α_６）と接触され、か
つ前記血管新生、腫瘍成長または腫瘍転移は１または複数のインテグリンもしく
はインテグリンサブユニットによって媒介される。

【００１５】 より具体的に述べると、本発明は、組織における血管新生を阻害する方法に関
し、ここで前記血管新生は１もしくはそれ以上の内皮細胞インテグリン（例えば
α_１β_１、α_２β_１、α_３β_１、α_Ｖβ_３）または１もしくはそれ以上の内皮細
胞インテグリンサブユニット（例えばα_１、α_２、α_３、α_Ｖ、β_１、β_３）に
よって媒介される。この方法は、内皮細胞をアレステンまたはその断片、突然変
異体、ホモログ、アナログもしくは対立遺伝子変異体と接触させることを含む。
上記血管新生は内皮細胞増殖、内皮細胞遊走または内皮細胞管形成の１または複
数を阻害することによって阻害することができる。

【００１６】 また本発明は、組織における腫瘍の成長または転移を阻害する方法に関し、こ
こで前記腫瘍の成長または転移は１もしくはそれ以上の内皮細胞インテグリン（
例えばα_１β_１、α_２β_１、α_３β_１、α_Ｖβ_３）または１もしくはそれ以上の
内皮細胞インテグリンサブユニット（例えばα_１、α_２、α_３、α_Ｖ、β_１、β _３ ）によって媒介される。この方法は、内皮細胞をアレステンまたはその断片、
変異体、ホモログ、アナログもしくは対立遺伝子変異体と接触させることを含む
。上記腫瘍成長は内皮細胞増殖、内皮細胞遊走または内皮細胞管形成の１または
複数を阻害することによって阻害することができる。

【００１７】 さらに本発明は、組織における内皮細胞アポトーシスを促進または誘導する方
法に関し、ここで前記内皮細胞アポトーシスは１もしくはそれ以上の内皮細胞イ
ンテグリン（例えばα_１β_１、α_２β_１、α_３β_１、α_Ｖβ_３）または１もしく
はそれ以上の内皮細胞インテグリンサブユニット（例えばα_１、α_２、α_３、α _Ｖ 、β_１、β_３）によって媒介される。この方法は、内皮細胞をアレステンまた
はその断片、変異体、ホモログ、アナログもしくは対立遺伝子変異体と接触させ
ることを含む。上記アポトーシスは内皮細胞増殖、内皮細胞遊走または内皮細胞
管形成の１または複数を阻害することによって促進または誘導することができる
。

【００１８】 本発明は組織における血管新生を阻害する方法に関し、ここで前記血管新生は
１もしくはそれ以上の内皮細胞インテグリン（例えばα_１β_１、α_２β_１）また
は１もしくはそれ以上の内皮細胞インテグリンサブユニット（例えばα_１、α_２ 、β_１）によって媒介される。この方法は、内皮細胞をカンスタチンまたはその
断片、突然変異体、ホモログ、アナログもしくは対立遺伝子変異体と接触させる
ことを含む。上記血管新生は内皮細胞増殖、内皮細胞遊走または内皮細胞管形成
の１または複数を阻害することによって阻害することができる。

【００１９】 また本発明は、組織における腫瘍の成長または転移を阻害する方法に関し、こ
こで前記腫瘍の成長または転移は１もしくはそれ以上の内皮細胞インテグリン（
例えばα_１β_１、α_２β_１）または１もしくはそれ以上の内皮細胞インテグリン
サブユニット（例えばα_１、α_２、β_１）によって媒介される。この方法は、内
皮細胞をカンスタチンまたはその断片、変異体、ホモログ、アナログもしくは対
立遺伝子変異体と接触させることを含む。上記腫瘍成長は内皮細胞増殖、内皮細
胞遊走または内皮細胞管形成の１または複数を阻害することによって阻害するこ
とができる。

【００２０】 さらに本発明は、組織における内皮細胞アポトーシスを促進または誘導する方
法に関し、ここで前記内皮細胞アポトーシスは１もしくはそれ以上の内皮細胞イ
ンテグリン（例えばα_１β_１、α_２β_１）または１もしくはそれ以上の内皮細胞
インテグリンサブユニット（例えばα_１、α_２、β_１）によって媒介される。こ
の方法は、内皮細胞をカンスタチンまたはその断片、変異体、ホモログ、アナロ
グもしくは対立遺伝子変異体と接触させることを含む。上記アポトーシスは内皮
細胞増殖、内皮細胞遊走または内皮細胞管形成の１または複数を阻害することに
よって促進または誘導することができる。

【００２１】 本発明は組織における血管新生を阻害する方法に関し、ここで前記血管新生は
１もしくはそれ以上の内皮細胞インテグリン（例えばα_５β_３、α_６β_１、α_Ｖ β_３）または１もしくはそれ以上の内皮細胞インテグリンサブユニット（例えば
α_５、α_６、α_Ｖ、β_１、β_３）によって媒介される。この方法は、内皮細胞を
タムスタチンまたはその断片、変異体、ホモログ、アナログもしくは対立遺伝子
変異体と接触させることを含む。上記血管新生は内皮細胞増殖、内皮細胞遊走ま
たは内皮細胞管形成の１または複数を阻害することによって阻害することができ
る。

【００２２】 また本発明は、組織における腫瘍の成長または転移を阻害する方法に関し、こ
こで前記腫瘍の成長または転移は１もしくはそれ以上の内皮細胞インテグリン（
例えばα_５β_３、α_６β_１、α_Ｖβ_３）または１もしくはそれ以上の内皮細胞イ
ンテグリンサブユニット（例えばα_５、α_６、α_Ｖ、β_１、β_３）によって媒介
される。この方法は、内皮細胞をタムスタチンまたはその断片、変異体、ホモロ
グ、アナログもしくは対立遺伝子変異体と接触させることを含む。上記腫瘍の成
長は内皮細胞増殖、内皮細胞遊走または内皮細胞管形成の１または複数を阻害す
ることによって阻害することができる。

【００２３】 さらに本発明は、組織における内皮細胞アポトーシスを促進または誘導する方
法に関し、ここで前記内皮細胞アポトーシスは１もしくはそれ以上の内皮細胞イ
ンテグリン（例えばα_５β_３、α_６β_１、α_Ｖβ_３）または１もしくはそれ以上
の内皮細胞インテグリンサブユニット（例えばα_５、α_６、α_Ｖ、β_１、β_３）
によって媒介される。この方法は、内皮細胞をタムスタチンまたはその断片、変
異体、ホモログ、アナログもしくは対立遺伝子変異体と接触させることを含む。
上記アポトーシスは内皮細胞増殖、内皮細胞遊走または内皮細胞管形成の１また
は複数を阻害することによって促進または誘導することができる。

【００２４】 さらに本発明は、組織を以下の物質の１またはそれ以上と接触させることを含
む、組織における血管新生または細胞増殖を阻害する方法に関する：インテグリ
ンのα_１サブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプチド、インテグリン
のα_２サブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプチド、インテグリンの
α_３サブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプチド、インテグリンのα _５ サブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプチド、インテグリンのα_６ サブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプチド、インテグリンのα_Ｖサ
ブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプチド、インテグリンのβ_１サブ
ユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプチド、またはインテグリンのβ_３ サブユニットに特異的に結合する抗体またはペプチド。この方法は、血管新生ま
たは細胞増殖を特徴とする状態の処置に使用することができる。

【００２５】 また本発明は、組織を以下の物質の１またはそれ以上と接触させることを含む
、組織における血管新生または細胞増殖を促進または誘導する方法に関する：イ
ンテグリンのα_１サブユニット、インテグリンのα_２サブユニット、インテグリ
ンのα_３サブユニット、インテグリンのα_５サブユニット、インテグリンのα_６ サブユニット、インテグリンのα_Ｖサブユニット、インテグリンのβ_１サブユニ
ット、またはインテグリンのβ_３サブユニット。上記１または複数のインテグリ
ンサブユニットは可溶型であり得、それらはまた、単量体、二量体、三量体、四
量体または多量体でありうる。

【００２６】 また本発明は、脊椎動物における増殖性疾患を抑制する方法に関し、ここで前
記疾患はアレステンに対する受容体（例えばα_１β_１インテグリン、α_２β_１イ
ンテグリン、α_３β_１インテグリン、α_Ｖβ_３インテグリン）によって媒介され
る。この方法は、アレステン受容体媒介性血管新生を阻害し、それによって前記
増殖性疾患を抑制することを含む。アレステン受容体媒介性血管新生の阻害は、
腫瘍の成長もしくは転移の阻害または確立（establish）した癌の退縮をもたら
すことができる。アレステン受容体媒介性血管新生の阻害は、アレステン受容体
媒介性血管新生を阻害する分子、例えばアレステン受容体に特異的に結合する抗
体（例：ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体）、抗体断片またはペ
プチドと増殖細胞を接触させることによって達成することができる。

【００２７】 さらに本発明は、アレステンに結合する１または複数の可溶性受容体を含む組
成物と組織を接触させることを含む、組織における血管新生を促進する方法に関
する。

【００２８】 別の側面において、本発明は、脊椎動物における増殖性疾患を抑制する方法に
関し、ここで前記疾患はカンスタチンに対する受容体（例えばα_１β_１インテグ
リン、α_２β_１インテグリン）によって媒介される血管新生を特徴とする。この
方法は、カンスタチン受容体媒介性血管新生を阻害することを含み、それによっ
て前記増殖性疾患を抑制する。カンスタチン受容体媒介性血管新生の阻害は、腫
瘍の成長もしくは転移の阻害または確立した癌の退縮をもたらすことができる。
カンスタチン受容体媒介性血管新生の阻害は、カンスタチン受容体媒介性血管新
生を阻害する分子、例えばカンスタチン受容体に特異的に結合する抗体（例：ポ
リクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体）、抗体断片またはペプチドと増
殖細胞を接触させることによって達成することができる。

【００２９】 さらに本発明は、組織を、カンスタチンに結合する１または複数の可溶性受容
体を含む組成物と接触させることを含む、組織における血管新生を促進する方法
に関する。

【００３０】 別の側面において、本発明は、脊椎動物における増殖性疾患を抑制する方法に
関し、ここで前記疾患がタムスタチンに対する受容体（例えばα_５β_１インテグ
リン、α_６β_１インテグリン、α_Ｖβ_３インテグリン）によって媒介される血管
新生を特徴とする。この方法は、タムスタチン受容体媒介性血管新生を阻害する
ことを含み、それによって前記増殖性疾患を抑制する。タムスタチン受容体媒介
性血管新生の阻害は、腫瘍の成長もしくは転移の阻害または確立した癌の退縮を
もたらすことができる。タムスタチン受容体媒介性血管新生の阻害は、タムスタ
チン受容体媒介性血管新生を阻害する分子、例えばタムスタチン受容体に特異的
に結合する抗体（例：ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体）、抗体
断片またはペプチドと増殖細胞を接触させることによって達成することができる
。

【００３１】 さらに本発明は、タムスタチンを結合する１または複数の可溶性受容体を含む
組成物と組織を接触させることを含む、組織における血管新生を促進する方法に
関する。

【００３２】 別の側面において、本発明は、組織におけるＦＬＩＰレベルを低下させる分子
と組織を接触させることを含む、組織における血管新生を阻害する方法に関する
。

【００３３】 また本発明は、１または複数のアレステン受容体もしくはアレステン受容体サ
ブユニット（例えばα_１β_１インテグリン、α_２β_１インテグリン、α_３β_１イ
ンテグリン、α_Ｖβ_３インテグリン、α_１インテグリンサブユニット、α_２イン
テグリンサブユニット、α_３インテグリンサブユニット、α_Ｖインテグリンサブ
ユニット、β_１インテグリンサブユニット、β_３インテグリンサブユニット）に
特異的に結合する１または複数の分子（例えば抗体、抗体断片、ペプチド）を生
物活性成分として含む組成物に関する。本組成物は任意に医薬的に許容されうる
担体を含んでもよい。本組成物は、血管新生活性を特徴とする疾患を抑制するた
めに、前記疾患を持つ患者に本組成物を投与することを含む方法で使用すること
ができる。前記疾患は血管新生活性によって特徴づけることができ、本組成物は
放射線療法、化学療法または免疫療法と組み合わせて患者に投与することができ
る。

【００３４】 別の側面において、本発明は、１または複数のアレステン受容体もしくはアレ
ステン受容体サブユニット（例えばα_１β_１インテグリン、α_２β_１インテグリ
ン、α_３β_１インテグリン、α_Ｖβ_３インテグリン、α_１インテグリンサブユニ
ット、α_２インテグリンサブユニット、α_３インテグリンサブユニット、α_Ｖイ
ンテグリンサブユニット、β_１インテグリンサブユニット、β_３インテグリンサ
ブユニット）を生物活性成分として含む組成物に関する。本組成物は任意に医薬
的に許容されうる担体を含んでもよい。本組成物は、血管新生を促進または誘導
するために、疾患を持つ患者に本組成物を投与することを含む方法で使用するこ
とができる。前記疾患は血管新生活性によって特徴づけることができ、本組成物
は放射線療法、化学療法または免疫療法と組み合わせて患者に投与することがで
きる。

【００３５】 また本発明は、１または複数のカンスタチン受容体もしくはカンスタチン受容
体サブユニット（例えばα_１β_１インテグリン、α_２β_１インテグリン、α_１イ
ンテグリンサブユニット、α_２インテグリンサブユニット、β_１インテグリンサ
ブユニット）に特異的に結合する１または複数の分子（例えば抗体、抗体断片、
ペプチド）を生物活性成分として含む組成物に関する。本組成物は任意に医薬的
に許容されうる担体を含んでもよい。本組成物は、血管新生活性を特徴とする疾
患を阻害するために、前記疾患を持つ患者に本組成物を投与することを含む方法
で使用することができる。前記疾患は血管新生活性によって特徴づけることがで
き、本組成物は放射線療法、化学療法または免疫療法と組み合わせて患者に投与
することができる。

【００３６】 別の側面において、本発明は、１または複数のカンスタチン受容体もしくはカ
ンスタチン受容体サブユニット（例えばα_１β_１インテグリン、α_２β_１インテ
グリン、α_１インテグリンサブユニット、α_２インテグリンサブユニット、β_１ インテグリンサブユニット）を生物活性成分として含む組成物に関する。本組成
物は任意に医薬的に許容されうる担体を含んでもよい。本組成物は、血管新生を
促進または誘導するために、疾患を持つ患者に本組成物を投与することを含む方
法で使用することができる。前記疾患は血管新生活性によって特徴づけることが
でき、本組成物は放射線療法、化学療法または免疫療法と組み合わせて患者に投
与することができる。

【００３７】 また本発明は、１または複数のタムスタチン受容体もしくはタムスタチン受容
体サブユニット（例えばα_５β_１インテグリン、α_６β_１インテグリン、α_Ｖβ _３ インテグリン、α_５インテグリンサブユニット、α_６インテグリンサブユニッ
ト、α_Ｖインテグリンサブユニット、β_１インテグリンサブユニット、β_３イン
テグリンサブユニット）に特異的に結合する１または複数の分子（例えば抗体、
抗体断片、ペプチド）を生物活性成分として含む組成物に関する。本組成物は任
意に医薬的に許容できる担体を含んでもよい。本組成物は、血管新生活性を特徴
とする疾患を抑制するために、前記疾患を持つ患者に本組成物を投与することか
らなる方法で使用することができる。前記疾患は血管新生活性によって特徴づけ
ることができ、本組成物は放射線療法、化学療法または免疫療法と組み合わせて
患者に投与することができる。

【００３８】 別の側面において、本発明は、１または複数のタムスタチン受容体もしくはタ
ムスタチン受容体サブユニット（例えばα_５β_１インテグリン、α_６β_１インテ
グリン、α_Ｖβ_３インテグリン、α_５インテグリンサブユニット、α_６インテグ
リンサブユニット、α_Ｖインテグリンサブユニット、β_１インテグリンサブユニ
ット、β_３インテグリンサブユニット）を生物活性成分として含む組成物に関す
る。本組成物は任意に医薬的に許容されうる担体を含んでもよい。本組成物は、
血管新生を促進または誘導するために、疾患を持つ患者に本組成物を投与するこ
とを含む方法で使用することができる。前記疾患は血管新生活性によって特徴づ
けることができ、本組成物は放射線療法、化学療法または免疫療法と組み合わせ
て患者に投与することができる。

【００３９】 さらなる側面において、本発明は、（ａ）前記細胞を含有する（例えば哺乳動
物から採取した）試料を提供する工程、（ｂ）前記試料を、１または複数の抗体
（例えばα_１β_１インテグリンに対する抗体、α_２β_１インテグリンに対する抗
体、α_３β_１インテグリンに対する抗体、α_Ｖβ_３インテグリンに対する抗体、
α_１インテグリンサブユニットに対する抗体、α_２インテグリンサブユニットに
対する抗体、α_３インテグリンサブユニットに対する抗体、α_Ｖインテグリンサ
ブユニットに対する抗体、β_１インテグリンサブユニットに対する抗体、β_３イ
ンテグリンサブユニットに対する抗体）と、前記１または複数の抗体が前記細胞
に結合するのに適した条件で充分な時間にわたって反応させる工程、ここで前記
細胞がアレステンの作用に対して感受性であるならば、この工程で細胞−抗体複
合体が形成される、そして次に（ｃ）前記細胞−抗体複合体の存在を検出する工
程を含み、その結果、前記試料中に前記細胞−抗体複合体の存在が、アレステン
の作用に対する細胞の感受性を示す、細胞（例えば癌細胞）がアレステンの作用
に対して感受性であるかどうかを決定する方法に関する。前記哺乳動物は、望ま
しくない血管新生を少なくとも一つの特徴とする状態を持ちうる。

【００４０】 さらなる側面において、本発明は、（ａ）前記細胞を含有する（例えば哺乳動
物から採取した）試料を用意する工程、（ｂ）前記試料を、１または複数の抗体
（例えばα_１β_１インテグリンに対する抗体、α_２β_１インテグリンに対する抗
体、α_１インテグリンサブユニットに対する抗体、α_２インテグリンサブユニッ
トに対する抗体、β_１インテグリンサブユニットに対する抗体）と、前記１また
は複数の抗体が前記細胞に結合するのに適した条件で充分な時間にわたって反応
させる工程、ここで前記細胞がカンスタチンの作用に対して感受性であるならば
、この工程で細胞−抗体複合体が形成される、そして次に（ｃ）前記細胞−抗体
複合体の存在を検出する工程を含んでなり、それによって前記試料中の前記細胞
−抗体複合体の存在が、前記細胞がカンスタチンの作用に対して感受性であるこ
とを示す、細胞（例えば癌細胞）がカンスタチンの作用に対して感受性であるか
どうかを決定する方法に関する。前記哺乳動物は、望ましくない血管新生を少な
くとも一つの特徴とする状態を持ちうる。

【００４１】 さらなる側面において、本発明は、（ａ）前記細胞を含有する（例えば哺乳動
物から採取した）試料を提供する工程、（ｂ）前記試料を、１または複数の抗体
（例えばα_５β_１インテグリンに対する抗体、α_６β_１インテグリンに対する抗
体、α_Ｖβ_３インテグリンに対する抗体、α_１インテグリンサブユニットに対す
る抗体、α_５インテグリンサブユニットに対する抗体、α_６インテグリンサブユ
ニットに対する抗体、α_Ｖインテグリンサブユニットに対する抗体、β_１インテ
グリンサブユニットに対する抗体、β_３インテグリンサブユニットに対する抗体
）と、前記１またはそれ以上の抗体が前記細胞に結合するのに適した条件で充分
な時間にわたって反応させる工程（前記細胞がタムスタチンの作用に対して感受
性であるならば、この工程で細胞−抗体複合体が形成される）、そして次に（ｃ
）前記細胞−抗体複合体の存在を検出する工程を含み、その結果、前記試料中の
前記細胞−抗体複合体の存在が、タムスタチンの作用に対する前記細胞の感受性
を示す、細胞（例えば癌細胞）がタムスタチンの作用に対して感受性であるかど
うかを決定する方法に関する。前記哺乳動物は、望ましくない血管新生を少なく
とも一つの特徴とする状態を持ちうる。

【００４２】 また本発明は、抗血管新生性を有するＩＶ型コラーゲンのα鎖のＮＣ１ドメイ
ンを含むタンパク質に関する。特に本発明は新規タンパク質アレステン、カンス
タチンおよびタムスタチン、ならびにその生物活性（例えば抗血管新生性）断片
、突然変異体、アナログ、ホモログおよび誘導体、ならびにその多量体（例えば
二量体）および融合タンパク質（本明細書ではキメラタンパク質ともいう）に関
する。これらのタンパク質は全て、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１（非コラーゲン１
）ドメインのＣ末端断片を含む。より具体的に述べると、アレステン、カンスタ
チンおよびタムスタチンは、それぞれＩＶ型コラーゲンのα１鎖、α２鎖および
α３鎖のＮＣ１ドメインのＣ末端断片である。特にアレステン、カンスタチンお
よびタムスタチンは単量体タンパク質である。これら３つのタンパク質はいずれ
も生体内で腫瘍成長を停止し、また、内皮管アッセイを含むいくつかのインビト
ロモデルで、毛細管の形成を阻害する。

【００４３】 本発明は、内皮細胞におけるアレステンの受容体として、これらの細胞におけ
る抗血管新生活性（内皮細胞アポトーシスを含む）を媒介する、インテグリンま
たはインテグリンサブユニット（例えばα_１β_１、α_１β_２およびα_２β_１イン
テグリン）を包含する。またアレステンは、マトリックスメタロプロテイナーゼ
２、３および９に特異的に結合し、その基底膜分解活性を阻害する。このような
分解活性は血管新生には不可欠な要素である。

【００４４】 また本発明は、抗血管新生活性を有するＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ド
メインを含む単離された組換え産生アレステン、前記単離されたアレステンの抗
血管新生断片、ならびに前記単離されたアレステンおよび抗血管新生断片の多量
体、ならびにそれらの抗血管新生タンパク質をコードするポリヌクレオチドも包
含する。さらに、単離されたアレステンもしくはその抗血管新生断片またはその
両方を生物活性成分として含む組成物も、本発明に包含される。別の態様におい
て、本発明は、哺乳動物における癌などの増殖性疾患を治療する方法に関し、こ
こで前記疾患が血管新生活性を特徴とする疾患であり、抗血管新生アレステンま
たはその断片を含む組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法に関する。
上記抗血管新生アレステンおよびその断片は、細胞移動または内皮細胞増殖を防
止するためにも使用することができる。また、単離された抗血管新生アレステン
およびその断片に対する抗体についても記載する。

【００４５】 また本発明は、内皮細胞におけるカンスタチンの細胞接着受容体として、これ
らの細胞における抗血管新生活性（内皮細胞アポトーシスを含む）を媒介する、
インテグリンまたはインテグリンサブユニット（例えばα_１β_１およびα_１β_２ インテグリン）も包含する。

【００４６】 また本発明は、抗血管新生活性を有するＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣ１ド
メインを含む単離された組換え生産カンスタチン、前記単離されたカンスタチン
の抗血管新生断片、ならびに前記単離されたカンスタチンおよび抗血管新生断片
の多量体、ならびにそれらの抗血管新生タンパク質をコードするポリヌクレオチ
ドも包含する。さらに、単離されたカンスタチンもしくはその抗血管新生断片ま
たはその両方を生物活性成分として含む組成物も、本発明に包含される。別の態
様において、本発明は、哺乳動物における癌などの増殖性疾患を処置する方法に
関し、前記疾患が血管新生活性を特徴とする疾患であり、該方法は、抗血管新生
カンスタチンまたはその断片を含む組成物を前記哺乳動物に投与することを含む
。上記抗血管新生カンスタチンおよびその断片は、細胞移動および内皮細胞増殖
を防止するためにも使用することができる。また、単離された抗血管新生カンス
タチンおよびその断片に対する抗体についても記載する。

【００４７】 また本発明は、内皮細胞におけるタムスタチンの受容体として、これらの細胞
における抗血管新生活性（内皮細胞アポトーシスを含む）を媒介する、インテグ
リンまたはインテグリンサブユニット（例えばα_５β_１、α_６β_１およびα_Ｖβ _３ インテグリン）も包含する。

【００４８】 また本発明は、抗血管新生活性を有するＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ド
メインを含む単離された組換え産生タムスタチン、前記単離されたタムスタチン
の抗血管新生断片、ならびに前記単離されたタムスタチンおよび抗血管新生断片
の多量体、ならびにそれらの抗血管新生タンパク質をコードするポリヌクレオチ
ドも包含する。さらに、単離されたタムスタチンもしくはその抗血管新生断片ま
たはその両方を生物活性成分として含む組成物も、本発明に包含される。別の態
様において、本発明は、哺乳動物における癌などの増殖性疾患を処置する方法に
関し、ここで前記疾患が血管新生活性を特徴とする疾患であり、該方法は、抗血
管新生タムスタチンまたはその断片を含む組成物を前記哺乳動物に投与すること
を含む。上記抗血管新生タムスタチンおよびその断片は、細胞移動および内皮細
胞増殖を防止するためにも使用することができる。また、単離された抗血管新生
タムスタチンおよびその断片に対する抗体に関する。

【００４９】 発明の詳細な説明 非常に様々な疾患は望ましくない血管新生の結果である。別の言い方をすれば
、多くの疾患および望ましくない状態は、毛細血管の成長および拡大を、特定の
条件下で、または特定の時期に、または特定の組織において停止することができ
れば防止または改善することができる。基底膜の組織化は、ＩＶ型コラーゲンの
Ｃ末端の球状非コラーゲン（ＮＣ１）ドメインを介して生じていると推測される
ＩＶ型コラーゲンネットワークの組み立てに依存している（Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．、
１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：６１８〜２４；Ｔｉ
ｍｐｌ，Ｒ．他、１９８１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：２０３〜２
１１）。ＩＶ型コラーゲンは６つの異なる遺伝子産物（すなわち、α_１〜α_６）
から構成される（Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．他、１９９５、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：４０３〜３４）。α_１およびα_２のイソ型はヒト基底膜
の至るところに存在している（Ｐａｕｌｓｓｏｎ，Ｍ．、１９９２、Ｃｒｉｔ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：９３〜１２７）が、それ以
外の４つのイソ型は限定的な分布を示す（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．他、１９９７、
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２４７０〜８）。

【００５０】 既に存在する血管からの新しい毛細管の形成（毛管新生）は腫瘍の成長および
転移のプロセスには必須である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．他、１９９２、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１〜４；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．、１９９５、
Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：２７〜３１；Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．他、１９９６、Ｃｅｌ
ｌ、８６：３５３〜６４）。しかし、ヒトおよび動物の腫瘍は初期には新生血管
を形成しないが、腫瘍が数ｍｍ^３よりも大きく成長するためには、腫瘍は新生血
管を形成させなければならない（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．、１９９５、Ｎａｔ．Ｍ
ｅｄ．１：２７〜３１；Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．他、１９９６、Ｃｅｌｌ、８６：
３５３〜６４）。血管新生表現型への切換えには、血管新生刺激因子のアップレ
ギュレーションおよび血管新生阻害因子のダウンレギュレーションの両方が必要
である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．、１９９５、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：２７〜３１）
。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧ
Ｆ）が、腫瘍において最も一般的に発現している血管新生因子である。新生血管
を形成した腫瘍は、腫瘍の成長を相乗的に促進し得るこれらの血管新生因子の１
つ以上を過剰に発現し得る。受容体アンタゴニストを用いてＶＥＧＦなどの１つ
の血管新生因子を阻害することは、腫瘍の成長を停止させるためには十分ではな
い。多数の血管新生阻害因子が近年において同定されているが、ＩＦＮ−α、血
小板因子−４（Ｍａｉｏｎｅ，Ｔ．Ｅ．他、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７
：７７〜９）およびＰＥＸ（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．他、１９９８、Ｃｅｌｌ、
９２：３９１〜４００）などのいくつかの因子は腫瘍細胞と内因的に関連してお
らず、これに対してアンギオスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．他、１９９
４、Ｃｅｌｌ、７９：３１５〜２８）およびエンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ
，Ｍ．Ｓ．他、１９９７、Ｃｅｌｌ、８８：２７７〜８５）は、腫瘍組織自身に
よって産生される腫瘍関連の血管新生阻害因子である。腫瘍の成長および転移を
これらの内因性血管新生阻害因子で処置することは非常に効果的であり、かつ注
目される考えではあるが、抗血管新生治療に関連するいくつかの潜在的な問題を
検討しなければならない。長期間にわたる抗血管新生的な治療によって誘導され
る遅れた毒性、ならびに処置期間中に生じる損なわれた創傷治癒および再現され
る（reproductive）血管新生の可能性は、真剣に検討しなければならない。

【００５１】 インテグリンは、一般に、受容体を細胞の細胞骨格に連結する短いＣ末端の細
胞質ドメインと、リガンドと結合するための長いＮ末端の細胞外ドメインとを有
する。αサブユニットおよびβサブユニットはともにリガンド結合に関与し、そ
して様々な潜在的なリガンドが存在する。いくつかの一般的なリガンドには、フ
ィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンおよび様々なタイプのコラーゲンが
含まれる。これらの一部（例えば、フィブロネクチンおよびラミニン）には多数
のインテグリンが結合する。Ｉ型コラーゲンには、インテグリンα_１β_１、α_２ β_１およびα_３β_１が結合することが知られており、ＩＶ型コラーゲンには、イ
ンテグリンα_１β_１およびα_２β_１が結合する。上皮細胞には、インテグリンα _２ β_１、α_６β_１、α_ｖβ_３およびα_６β_４が結合する。サイトカインにより活
性化された内皮細胞には、α_４β_１およびα_Ｌβ_２が結合し、血管内皮細胞には
α_Ｍβ_２インテグリンが結合する。

【００５２】 本発明において、抗血管新生性のタンパク質およびペプチドと相互作用する（
例えば、特異的に結合する）細胞表面受容体が開示される。詳細には、抗血管新
生性タンパク質のアレステン、カンスタチンおよびタムスタチンと結合するイン
テグリンおよびインテグリンサブユニットが開示される。これらのインテグリン
は、新しい抗血管新生性のタンパク質、ペプチドおよび化合物、または現在知ら
れている抗血管新生性のタンパク質、ペプチドおよび化合物のより強力な変異体
および断片（特に、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンのより強力な
変異体および断片）を評価するための標的を提供する。詳細には、本発明は、Ｉ
Ｖ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα１鎖であるアレステンに結合することが見
出されているインテグリンサブユニットのα_１、α_２、α_３、α_ｖ、β_１および
β_３に関する。本発明はまた、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα２鎖であ
るカンスタチンに結合することが見出されているインテグリンサブユニットのα _１ 、α_２およびβ_１に関する。さらに、本発明は、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ド
メインのα３鎖であるタムスタチンに結合することが見出されているインテグリ
ンサブユニットのα_５、α_６、α_ｖ、β_１およびβ_３に関する。他のインテグリ
ンまたはインテグリンサブユニットもまた、アレステン、カンスタチンまたはタ
ムスタチンに結合することができ、そしてこれらは、本明細書中に記載される方
法を使用して同定することができる（例えば、下記の実施例１２、実施例２６お
よび実施例２８を参照のこと）。

【００５３】 アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンを投与するか、あるいはアレス
テン、カンスタチンおよびタムスタチンに対する受容体として働く上記に示され
たインテグリンサブユニットに結合する別のタンパク質、ペプチドまたは化合物
を投与するかのいずれかによって、内皮細胞の血管新生および増殖を阻害するこ
とができ、あるいは内皮細胞のアポトーシスを促進または誘導することができる
。そのようなタンパク質、ペプチドおよび化合物には、抗体、アレステン、カン
スタチンまたはタムスタチンの抗体断片または一部、あるいは上記に示されたイ
ンテグリンサブユニットに特異的に結合する、アレステン、カンスタチンまたは
タムスタチンのそのような領域を含むタンパク質またはペプチドが挙げられる。
「特異的に結合する」により、特異的な結合性タンパク質（例えば、抗体または
受容体）に対するリガンド（例えば、抗原）の大きな結合力および／または大き
な結合親和性を有することが意味される。例えば、このような特異的な抗原にお
けるそのエピトープに対する抗体の結合は、任意の他のエピトープ（特に、目的
とする特異的な抗原に関連する分子に存在し得るか、または目的とする特異的な
抗原と同じサンプル中の分子に存在し得るエピトープ）に対する同じ抗体の結合
よりも強い。目的とする分子に特異的に結合する抗体は、弱いが、それでも検出
可能なレベル（例えば、目的とする分子に対して示される結合の１０％以下）で
他の分子に結合できると考えられる。そのような弱い結合またはバックグラウン
ドの結合を、例えば、適切な対照の使用によって、目的とする分子に対する特異
的な抗体結合から容易に区別することができる。

【００５４】 特定のペプチドに対する抗体は広く作製されており、所与のタンパク質に対す
る抗体を製造する方法は当業者には十分に知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅ
ｌ，Ｆ．Ｍ．他（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、
１９８７年）および１９９９年までの増補版）の第１１章、特に１１．４．２頁
〜１１．１１．５頁（「モノクローナル抗体の調製」）、１１．１２．１頁〜１
１．１３．４頁（「ポリクローナル抗血清の調製」）および最も特に１１．１４
．１頁〜１１．１５．４頁（「抗ペプチド抗体の調製」）を参照のこと）。特別
仕様の抗体もまた、多数の供給者から、例えば、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ Ｃｏ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）から市販品
を購入することができる。インテグリンおよびインテグリンサブユニットに対す
る抗体を作製する方法もまた十分に知られており、そのような抗体を作製する方
法は、Ｇａｌｌａｔｉｎ，Ｗ．Ｍ．他（米国特許第５，８１７，５１５号）およ
びＫｉｍ，Ｋ．Ｊ．他（米国特許第５，６５２，１１０号；同第５，６５２，１
０９号；同第５，５７８，７０４号）に記載されている（これらはすべて、その
すべての内容が参考として本明細書中に組み込まれる）。

【００５５】 本明細書中に記載されるインテグリンおよびインテグリンサブユニットは可溶
性形態で組換えにより作製することができる。インテグリンおよびインテグリン
受容体を可溶性形態で作製する方法は、Ｂｒｉｅｓｅｗｉｔｚ，Ｒ．他（１９９
３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８９〜２９９６）、Ｋｅｒｎ，Ａ．
他（１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２８１１〜２２８１６）に
記載され、そしてまたＧａｌｌａｔｉｎ，Ｗ．Ｍ．他（米国特許第５，７２８，
５３３号および同第５，８３１，０２９号）およびＤｕｏｎｇ，Ｌ．Ｔ．他（米
国特許第５，８９５，７５４号）に記載されている（これらはすべて、そのすべ
ての内容が参考として本明細書中に組み込まれる）。

【００５６】 本発明はまた、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンに対する受容体
として役立つインテグリンサブユニットを模倣するタンパク質、ペプチドまたは
化合物を投与することによって、血管新生および細胞増殖を強化するか、または
細胞のアポトーシスを阻害する方法に関する。そのようなタンパク質、ペプチド
および化合物には、利用可能なアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンと
結合するのに役立つ、選択されたサブユニットから構成されるインテグリンタン
パク質、ならびにそれらの生物学的に活性な（例えば、抗血管新生性の）断片、
変異体、アナログ、ホモログおよび誘導体、ならびにそれらの多量体（例えば、
二量体）および融合タンパク質（これは本明細書中ではキメラタンパク質と呼ば
れる）が含まれる。それらにより、それらがそのそれぞれのインテグリン受容体
と相互作用することが妨げられ、そして血管新生活性が阻害される。アレステン
、カンスタチンまたはタムスタチンあるいはそれらの変異体および断片に結合す
るタンパク質、ペプチドまたは化合物にはまた、アレステン、カンスタチンおよ
びタムスタチンに対する抗体、あるいはそれらの変化体または断片に対する抗体
を挙げることができる。そのような抗体はこれらの分子と結合し、それにより、
それらがそのそれぞれのインテグリン受容体と相互作用することを妨げ、そして
血管新生活性が阻害される。

【００５７】 本発明において、アレステン、カンスタチンおよび／またはタムスタチン、あ
るいはそれらの断片または変異体は、組織における血管新生、内皮細胞の増殖、
内皮細胞の移動または内皮細胞の管形成を阻害するために、あるいは組織におけ
るアポトーシスを誘導または促進するために単独または組合せで使用することが
できる。アレステン、カンスタチンおよび／またはタムスタチンの組合せは、他
のコラーゲンドメインまたはＮＣ１鎖と、あるいは他の治療形態（例えば、放射
線療法、化学療法、免疫療法）とさらに組み合わせることができる。これらの分
子は抗アポトーシス性のタンパク質ＦＬＩＰ（ＦＬＩＣＥ阻害タンパク質、すな
わち、ＦＡＤＤ様インターロイキン１β変換酵素阻害タンパク質）のレベルを低
下させる。従って、血管新生は、ＦＬＩＰのレベルを低下させる分子によって阻
害され、それによりカスパーゼの活性化が引き起こされ、そして末端のアポトー
シスシグナルが送達される。

【００５８】 本明細書中に記載されるアレステン、カンスタチンおよびタムスタチンに対す
る受容体（例えば、α_１β_１、α_２β_１、α_３β_１、α_５β_１、α_６β_１および
α_ｖβ_３のインテグリン）および／またはそれらのサブユニット（例えば、α_１ 、α_２、α_３、α_５、α_６、α_ｖ、β_１、β_３）は、血管新生を促進または誘導
するために組み合わせて使用することができる。アレステン、カンスタチンおよ
び／またはタムスタチンに対する抗体もまた、アレステン、カンスタチンおよび
タムスタチンに対する受容体ならびにそれらの受容体サブユニットが組み合わせ
ることができように、組み合わせて１つの治療法にすることができる。

【００５９】 本発明はまた、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンと類似する様式
で血管新生を阻害する抗血管新生性のタンパク質、ペプチドおよび化合物ならび
にそれらの抗血管新生性の変異体および断片を同定するためのキットを含む。そ
のようなキットは、インテグリンの適切なサブユニット（例えば、α_１、α_２、
β_３など）、および下記の実施例に記載されるアッセイの１つを実施するために
必要なそのような他の成分を含む。そのようなキットを用いて行われる非常に優
れたアッセイには、下記の実施例１２および実施例２８に記載される細胞接着ア
ッセイ、ならびに下記の実施例２６に記載される競合的増殖アッセイが含まれる
。例えば、タムスタチンと類似する様式で挙動するタンパク質、ペプチドまたは
化合物を同定するためのキットは、実施例２８の細胞接着アッセイを行うために
必要なそのような成分および試薬（インテグリンの様々なサブユニット（α_６、
β_１、α_ｖ、β_３）およびＩｇＧ（これは対照として役立つ）に対する抗体など
）を含む。キットは、試験化合物および対照（ＩＶ型コラーゲンまたはラミニン
−１など）でコーティングされる９６ウェルプレートを任意に含むことができる
（あるいは、プレートは任意にプレコーティングすることができる）。キットは
また、細胞の増殖、トリプシン処理、再懸濁および染色に必要な試薬だけでなく
、ＢＳＡまたは他のブロッキング剤、および接着用の細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ
細胞）を任意に含むことができる。

【００６０】 潜在的な抗血管新生性化合物が一旦同定されると、別のキットを使用して、最
初にその化合物を同定するために使用された同じインテグリンサブユニットを用
いた競合による抗血管新生活性の喪失を明らかにすることができる。そのような
キットは、下記の実施例２６に記載される競合的増殖アッセイをもとにして組み
立てることができる。このキットは、（下記の実施例に記載される）増殖アッセ
イにおいて有用な細胞、およびタンパク質形態の適切なインテグリンサブユニッ
トを含みうる。キットはまた、試験化合物の抗増殖活性を妨害するときのインテ
グリンサブユニットタンパク質の作用を明らかにする際に必要または有用な染色
剤および他の試薬を必要に応じて含むことができる。

【００６１】 本発明において、抗血管新生性を有するタンパク質ならびにその断片、アナロ
グ、誘導体、ホモログおよび変異体が、血管新生により媒介される増殖性疾患を
阻害するために、これらのタンパク質、アナログ、誘導体、ホモログおよび変異
体を使用する方法とともに記載される。そのようなタンパク質は、ＩＶ型コラー
ゲンのα鎖のＮＣ１ドメインまたはそのようなドメインの一部、具体的には、Ｉ
Ｖ型コラーゲンのα１鎖、α２鎖およびα３鎖のＮＣ１ドメインのモノマーを含
む。これらのタンパク質は、特にモノマー形態であるときには、ガンのインビボ
モデルにおける腫瘍の成長を停止させ、そしてまた、内皮細胞管アッセイを含む
いくつかのインビトロモデルにおける毛細管の形成を阻害する。

【００６２】 これらのタンパク質はまた、ＮＣ１ドメインの接合領域を含みうる。α４鎖、
α５鎖およびα６鎖は、低下した抗血管新生活性または検出できないほどの抗血
管新生活性を有することが証拠により示唆されるので、α１鎖、α２鎖またはα
３鎖が好ましい。六量体形態もまた活性がほとんどないか、または低下している
ことが証拠により示唆されるので、一般には、これらのタンパク質のモノマー形
態が好ましい。

【００６３】 より詳細には、本発明は、「アレステン」と名付けられたタンパク質を記載す
る。これは、長さが約２３０アミノ酸のタンパク質であり、ヒトＩＶ型コラーゲ
ンのＮＣ１ドメインのα１鎖のＮ末端のアミノ酸に対応する（Ｈｏｓｔｉｋｋａ
，Ｓ．Ｌ．他、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１９４８８〜９３
）。

【００６４】 本明細書中に開示されているように、ヒトアレステンは、ペリプラズムへの輸
送を可能し、従って可溶性タンパク質を生じさせることができる細菌発現プラス
ミド（ｐＥＴ２２ｂなど）を使用して大腸菌において製造することができる。こ
のタンパク質は、Ｃ末端における６ヒスチジンタグを伴う２９ｋＤａの融合タン
パク質として発現される。（２６ｋＤａを越えた）さらなる３ｋＤａはポリリン
カー配列およびヒスチジンタグ配列から生じている。アレステンはまた、ｐｃＤ
ＮＡ３．１真核生物ベクターを使用して２９３腎臓細胞において分泌型の可溶性
タンパク質として製造された。２９３により製造されたこのタンパク質は精製用
または検出用の標識を有しない。

【００６５】 アレステンは、処置後の２時間程の早い時期に内皮細胞のアポトーシスを生じ
させる。この作用は内皮細胞に対して特異的であり、高用量のアレステンで処置
された腫瘍細胞では顕著な細胞死は認められなかった。代表的なＣＤ−３１染色
パターンは、対照マウスに対して処置されたマウスの血管系の減少を示していた
。腫瘍切片をＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）、フィブロネクチンおよびＩＶ型コラ
ーゲンについて染色したが、腫瘍細胞の増殖、あるいは腫瘍細胞を取り囲むＩＶ
型コラーゲンおよびフィブロネクチンの含有量または構造における差は見られな
かった。

【００６６】 大腸菌で産生されたアレステンは、ｂＦＧＦで刺激された内皮細胞の増殖を用
量依存的な様式で阻害し、０．２５μｇ／ｍｌのＥＤ_５０を有した。腎臓ガン細
胞（７８６−Ｏ）、前立腺ガン細胞（ＰＣ−３）またはヒト前立腺上皮細胞（Ｈ
ＰＥＣ）の増殖については顕著な作用は認められなかった。エンドスタチンは、
アレステンよりも３倍大きい０．７５μｇ／ｍｌのＥＤ_５０でＣ−ＰＡＥ細胞の
増殖を阻害したが、Ａ−４９８ガン細胞は阻害しなかった。

【００６７】 内皮細胞の増殖および移動の特異的な阻害は、本明細書中に記載されるように
、アレステンが細胞表面のタンパク質または受容体を介して機能することを示し
ている。マトリックスメタロプロテイナーゼ（すなわち、ＭＭＰ）の阻害は、バ
チマスタット（ＢＢ−９４）およびマリマスタット（ＢＢ−２５１６）と類似す
る、腫瘍の成長および転移におけるアレステンの直接的な役割を示唆している。

【００６８】 最近の研究により、α_１β_１およびα_１β_１およびα_２β_１のインテグリンが
、ＥＨＳ肉腫腫瘍から単離されたＩＶ型コラーゲンに結合することが推測されて
いる（Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．他、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１３６１２〜１３６１７）。アレステンはＩＶ型コラー
ゲンのα１鎖の断片であるので、α_１β_１／α_２β_１インテグリンを介する内皮
細胞の結合を媒介するその能力について評価された。インテグリンのα_１サブユ
ニットおよびβ_１サブユニットに対する抗体を機能的に阻止し、そしてアレステ
ンがコーティングされた培養ウェルに対するＨＵＶＥＣ細胞の結合を著しく低下
させることが示された（図１０Ａ）。アレステンがコーティングされた培養ウェ
ルに対する内皮細胞の付着は、α_１抗体の場合には６０％が阻害され、β_１イン
テグリン抗体の場合には７０％が阻害された。これらの結果は、^１２５Ｉで標識
されたアレステンを使用する結合アッセイの結果と一致している。アレステンは
、Ｋｄ_１値が８．５ｘ１０^−１１である大きな親和性で、そしてＫｄ_２値が４．
６ｘ１０^−８である低い親和性で内皮細胞と結合する。プレートがＩＶ型コラー
ゲンでコーティングされたときには、あまり大きくない阻害、α_１に対する中和
抗体の場合には３０％の阻害、β_１抗体の場合には４０％の阻害、そしてα_ｖβ _３ 抗体の場合には１５％の阻害が認められた（図１０Ｂ）。アレステンがコーテ
ィングされたプレートとＩＶ型コラーゲンがコーティングされたプレートとの間
における細胞接着の差は、ＩＶコラーゲン分子全体における潜在的なさらなるイ
ンテグリン結合部位のためであると考えられ、これに対してアレステンは、α_１ β_１インテグリンに単一の特異的な結合部位を提供している（図１０Ａおよび図
１０Ｂを参照のこと）。

【００６９】 アレステンの腫瘍抑制活性は、インテグリンによって、特にα_１β_１によって
媒介され得る。α_１β_１に対するアレステンの結合は、他の研究者（Ｂｌｏｃｈ
，Ｗ．他、１９９７、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３９：２６５〜２７８）によ
って以前に示されたα_１β_１インテグリンに対するＶＥＧＦの依存性によって示
唆されるように、ＶＥＧＦ誘導による内皮細胞の増殖および移動をダウンレギュ
レーションし得る。まとめると、これらの結果は、アレステンがその作用を血管
新生カスケードの種々の段階で発揮し得ることを示している。α１およびα２の
インテグリンサブユニットに対する抗体がインビボで血管新生を抑制し得ること
が示されていた（Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．、国際特許出願公開ＷＯ９９／１６４
６５）。アレステンは、ＶＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦのいずれかの活性を直
接的に抑制することによって機能し得る。ラットにおける３６時間のアレステン
の半減期は、臨床的使用に必要とされる用量が、エンドスタチンおよびアンギオ
スタチンなどの他のタンパク質阻害剤の場合よりもはるかに小さくなり得ること
を示唆している（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．他、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９：
３１５〜３２８；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．他、１９９７、Ｃｅｌｌ、８８：
２７７〜２８５）。

【００７０】 本発明において、カンスタチン、すなわち、ＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣ
１ドメインが、血管新生を阻害するために使用された。これは、内皮細胞の増殖
および移動の阻害によって、そして内皮細胞管形成の阻害によってアッセイされ
た。カンスタチンは内皮細胞の増殖を阻害し、そしてこれらの細胞のアポトーシ
スを誘導したが、非内皮細胞の増殖またはアポトーシスを阻害しなかった。カン
スタチンにより誘導されるアポトーシスは抗アポトーシスタンパク質ＦＬＩＰの
ダウンレギュレーションによって媒介される。ＣＤ−３１の組織化学的染色によ
り、対照マウスに対する処置マウスの血管系の減少が示された。カンスタチンに
よる内皮細胞の増殖および移動の特異的な阻害はまた、そのような抗血管新生活
性を明らかにし、そしてカンスタチンが細胞表面タンパク質／受容体を介して機
能し得ることを明らかにしている。インテグリン類は、それらの細胞外マトリッ
クス結合能力、ならびに遊走および増殖などの細胞挙動を調節できることに基づ
く潜在的な候補分子である。特に、α_ｖβ_３インテグリンは、血管新生時に誘導
されるために、そしてその無差別的な結合能力のために、カンスタチン受容体と
しての可能性を有する。

【００７１】 本発明において、タムスタチン、すなわち、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ
１ドメイン（Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．他、１９８１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
２０：２０３〜１１；Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．他、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．８９：５９２〜６０１）が、血管新生および腫瘍成長のインビトロおよ
びインビボでのモデルを使用して血管内皮細胞の増殖および血管新生を調節する
ために使用された。タムスタチンは腫瘍の血管新生過程の種々の段階でその作用
を発揮する。タムスタチンによる内皮細胞の特異的な阻害は、タムスタチンが細
胞表面のタンパク質または受容体を介して機能することを強く示唆している。最
近、タムスタチンのＣ末端部分に対応する長さが１９アミノ酸の合成ペプチドが
α_ｖβ_３インテグリンに結合することが報告された（Ｓｈａｈａｎ，Ｔ．Ａ．他
、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：４５８４〜４５９０）。下記の実施
例に記載される細胞接着アッセイの結果は、タムスタチンが内皮細胞上のα_ｖβ _３ インテグリンおよびα_６β_１インテグリンに結合することを示している。内皮
細胞にその後で結合するα_ｖβ_３インテグリンに対するその結合を阻害するため
に、タムスタチンをα_ｖβ_３インテグリンタンパク質とプレインキュベーション
した場合、タムスタチンの抗増殖作用は著しく低下する（図２２）。このことは
、タムスタチンの抗増殖作用が増殖中の内皮細胞の表面に存在するα_ｖβ_３イン
テグリンに結合することによって少なくとも部分的に媒介されることを示唆して
いる。血管新生はα_ｖβ_３インテグリンにより媒介される特異的な内皮細胞の接
着事象に依存する（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｓ．他、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９：１
１５７〜１１６４；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｓ．他、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
６４：５６９〜５７１）ので、タムスタチンは、ビトロネクチンおよびフィブロ
ネクチンなどのマトリックス成分と増殖中の内皮細胞との相互作用を乱すことに
よって抗血管新生を行い得る。増殖中の内皮細胞とビトロネクチンおよびフィブ
ロネクチンとの正常な相互作用は重要な抗アポトーシスシグナルと考えられる（
Ｉｓｉｋ，Ｆ．Ｆ．他、１９９８、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７５：１
４９〜１５５）。タムスタチンは、成長が刺激された内皮細胞におけるアポトー
シスを誘導し、そしてこの作用は、タムスタチンがサブコンフルエンスの単層物
に添加されたとき、すなわち、細胞が指数関数的に成長しているときに最も顕著
である。タムスタチンは、内皮細胞が活性化されている腫瘍の血管系に対して選
択的であると考えられる。

【００７２】 「α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメイン」により、哺乳動物ＩＶ型コラーゲンのα３鎖
のＮＣ１ドメインのアミノ酸配列の断片または一部分が意味される。そのような
断片の一例として、配列番号：１０のアミノ酸配列の断片が挙げられる。

【００７３】 α３（ＩＶ）鎖（タムスタチン）の分布は、ＧＢＭ、蝸牛のいくつかの基底膜
、眼の基底膜（前水晶体包、デスメ膜など）、卵巣および精巣の基底膜などのあ
る種の基底膜（Ｆｒｏｊｄｍａｎ，Ｋ．他、１９９８、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ
ｔｉｏｎ、８３：１２５〜３０）、ならびに肺胞毛細管基底膜（Ｋａｓｈｔａｎ
，Ｃ．Ｅ．、１９９８、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．９：１７３６〜５
０）に限定されている。しかし、この鎖は、腎臓の糸球体間質、皮膚の血管基底
膜および上皮基底膜、ならびに肝臓の血管基底膜には存在していない（Ｋａｓｈ
ｔａｎ，Ｃ．Ｅ．、上記）。傷が治癒する過程では、α３鎖およびα４鎖とは異
なるＩＶ型コラーゲンのα鎖が集まり、新しい毛細管が形成される。これは、そ
のような２つの鎖が「既存」（すなわち、真皮）の血管系の基底膜の成分ではな
いからである。α３（ＩＶ）鎖は正常なヒトの皮膚の元々の成分ではないので、
傷が治癒している損傷部におけるコラーゲン集合および血管新生のプロセスは、
タムスタチンを使用する処置によって変化しないと考えられる。

【００７４】 α３（ＩＶ）鎖は、ＧＢＭと同様に、ヒト腎臓血管基底膜において発現してい
る（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．他、１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：
２４７０〜８）。これらの「既存」の血管は、腎細胞ガンなどの原発性腎腫瘍の
進行に関与していることが推測される。タムスタチンは、α３（ＩＶ）鎖がそれ
以外のα鎖とともに呼び寄せられることにより媒介される血管新生を乱すことに
よって原発性腎腫瘍の処置において効果的であり得る。腎細胞ガンについて診断
される患者の数は１９９６年には合衆国では約３万人であり（Ｍｕｌｄｅｒｓ，
Ｐ．他、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：５１８９〜９５）、そして転
移した症例の予後はあまり好ましくない。放射線療法および化学療法の進歩にも
かかわらず、処置された患者の長期間の生存は未だ顕著には改善されていない（
Ｍｕｌｄｅｒｓ，Ｐ．他、上記）。腎細胞ガンに対する有意な処置の選択肢がな
いことにより、新しい治療法を開発することの重要性が強調される。この事実を
考慮して、固形腫瘍の血管新生を標的化することにより、最近、いくつかの動物
モデルで有望な結果が明らかにされている（Ｂａｉｌｌｉｅ，Ｃ．Ｔ．他、１９
９５、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７２：２５７〜６７；Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｆ．Ｊ
．他、１９９４、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６４：１５５〜７４；Ｔｈｏ
ｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．他、１９９５、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅ
ａｔ．３６：２３７〜５１）。腎細胞ガンの成長をインビボで阻害することにお
けるタムスタチンの作用は、この分子がこの腫瘍タイプに対する効果的な抗血管
新生治療としての可能性があることを示している。

【００７５】 本発明において、タムスタチンは、子ウシ肺動脈細胞の血清刺激された増殖を
インビトロで用量依存的な様式で特異的に阻害したが、インビトロにおける腫瘍
細胞株のＰＣ−３および７８６−Ｏの増殖に対しては効果がなかった。タムスタ
チンは、内皮細胞の移動を阻害しなかったが、インビトロにおけるマウスの大動
脈内皮細胞の管形成を顕著に抑制し、そしてまた内皮細胞のアポトーシスを誘導
した。タムスタチンは、インビボでの血管新生をマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ
）プラグアッセイにおいて６７％阻害し、そして６ｍｇ／ｋｇでは、ヒトの腎細
胞ガン（７８６−Ｏ）細胞および前立腺ガン（ＰＣ−３）細胞の腫瘍成長をマウ
スの異種移植片モデルにおいて抑制した。まとめると、これらの結果は、タムス
タチンが、血管新生過程の様々な段階を阻害することによって新しい血管の形成
を抑制することを示している。

【００７６】 インビボ研究において、タムスタチンは、血管新生をマトリゲルプラグアッセ
イにおいて阻害し、そしてＰＣ−３腫瘍および７８６−Ｏ腫瘍の成長をマウスの
異種移植片モデルにおいて抑制した。タムスタチンによって大きな腫瘍の成長が
阻害されたという事実は、特に臨床的状況における腫瘍の処置を考慮すれば、勇
気づけられるものである。

【００７７】 タムスタチンは、肺出血および迅速な進行性糸球体腎炎を特徴とする自己免疫
疾患であるグッドパスチャー症候群に対する病原性エピトープを有する（Ｂｕｔ
ｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．他、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：７８
７４〜７７；Ｓａｕｓ，Ｊ．他、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：
１３３７４〜８０；Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．他、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６６：２４０１８〜２４）ので、タムスタチンの急性投与または長期間の
投与はこの自己免疫疾患を誘導し得る可能性がある。いくつかの研究者グループ
は、α３（ＩＶ）ＮＣ１におけるグッドパスチャー自己エピトープの位置をマッ
ピングまたは予測することを試み、そしてＮ末端部分、中央部分およびＣ末端部
分がこのエピトープを有することが報告された（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．他、１９
９５、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．６：１１７８〜８５；Ｋａｌｌｕｒ
ｉ，Ｒ．他、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２〜８；Ｌｅ
ｖｙ，Ｊ．Ｂ．他、１９９７、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．８：１６９
８〜１７０５；Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，Ｓ．他、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６７：１９７８０〜４；Ｋｅｆａｌｉｄｅｓ，Ｎ．Ａ．他、１９９３、Ｋｉ
ｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４３：９４〜１００；Ｎｅｔｚｅｒ，Ｋ．Ｏ．他、１９９９
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１２６７〜７４）。最近、自己抗体の反
応性がα３（ＩＶ）ＮＣ１のＮ末端部のみに存在し、そして腎臓生存率と相関す
ることが報告された。これは、組換えキメラ構築物を使用して行われた（Ｈｅｌ
ｌｍａｒｋ，Ｔ．他、１９９９、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５５：９３６〜４４）
。疾患に関連するエピトープはまた、Ｎ末端部分の最初の４０アミノ酸に対して
同定された。従って、グッドパスチャー症候群に対するエピトープを除くために
、Ｎ末端の５３アミノ酸残基を有しない短縮型タムスタチンが合成された。この
分子は、マウスの異種移植片モデルにおいて７８６−Ｏ腫瘍の成長に対して阻害
作用を示す。また、この分子は、グッドパスチャー症候群の数人の患者に由来す
る自己抗体と結合しなかった。タムスタチンＮ−５３（これはまた本明細書中で
は「Ｔｕｍ−１」として示される）はまた内皮細胞の生存性を強力に低下させた
。驚くべきことに、この作用は、全長型分子よりもタムスタチンＮ−５３（Ｔｕ
ｍ−１）において大きかった。これらの結果は、Ｎ末端の５３アミノ酸が除かれ
た場合でさえ、タムスタチンの抗血管新生性領域が保存されていることを示して
いる。

【００７８】 Ｔｕｍ−１のほかに、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３およびＴｕｍ−４を含む他のタ
ムスタチン欠失変異体もまた作製された。これらはまた下記の実施例３５に記載
される。Ｔｕｍ−１は、上記に述べられているように、Ｃ末端の１９１アミノ酸
を含み、Ｎ末端の５３アミノ酸を有していない。「タムスタチン３３３」はタム
スタチンのＮ末端側のアミノ酸２〜１２５を含む。Ｔｕｍ−３はＣ末端の１１２
アミノ酸を含む。Ｔｕｍ−４は、アミノ酸１８５〜２０３を含むＣ末端の６４ア
ミノ酸を含む（Ｈａｎ他、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０３
９５〜４０１）。全長型タムスタチンのアミノ酸５４〜１３２の領域はＴｕｍ−
５と呼ばれた。Ｔｕｍ−５の伸長型（これは本明細素中では「タムスタチン−４
５−１３２」と呼ばれる）が、Ｔｕｍ−５の発現および溶解性を増大させるため
に作製された。タムスタチン−４５−１３２は、さらなる９個のアミノ酸のＮ末
端における伸長部を有するＴｕｍ−５からなる。さらにタムスタチン−４５−１
３２の変異体が作製された（これは「Ｔｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａ」と本明細書
中では呼ばれる）。この変異体は、（全長型タムスタチンの）１２６位における
システインが部位特異的変異誘発によってアラニンに変異しているタムスタチン
−４５−１３２の配列からなる。様々な欠失変異体がＴｕｍ−５からさらに作製
され、これらはＴ１と１組の部分的に重なるペプチド（Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５
およびＴ６）とを含んだ。

【００７９】 これらの変異体を下記の表１に示す。

【表１】

【００８０】 Ｔｕｍ−４は、本明細書中に示されるようにメラノーマ細胞（ＷＭ−１６４細
胞）の増殖を阻害し、α_ｖβ_３受容体と結合するが、この領域は、タムスタチン
の抗血管新生活性を担っていないと考えられる。これに対して、タムスタチンの
欠失変異体Ｔｕｍ−２（これはタムスタチンのＮ端側半分を含む）は、抗腫瘍細
胞活性ではなく、抗血管新生性を示した。従って、ある実験条件のもとでは、こ
れらの２つの活性は分離できると考えられる。

【００８１】 図３４Ａおよび図３５Ａに示されるように、全長型タムスタチンおよび欠失変
異体Ｔｕｍ−１がともに同等の抗血管新生活性を示すという事実により、残基１
〜５３の領域はこの活性に必要ないことが示される。全長型タムスタチンを上回
るＴｕｍ−１の増大した抗血管新生活性は、より大きな全長型分子とは対照的に
、変異体タンパク質に対する１μｇあたりの活性な分子の数が増大したことによ
って合理的に説明することができる。

【００８２】 全長型タムスタチンならびに欠失変異体のＴｕｍ−１およびＴｕｍ−２はすべ
て抗血管新生活性を示し（すなわち、内皮細胞の増殖を阻害し、そのアポトーシ
スを誘導し）、その一方でＴｕｍ−３およびＴｕｍ−４が抗血管新生活性を示さ
ないという事実は、タムスタチンの抗血管新生性が主として残基５４〜１３２に
存在することを示唆している。この活性はまた、残基１３２を越えた数残基にま
で及ぶが、Ｔｕｍ−３が、抗血管新生性を示すために十分な抗血管陰性性領域を
含まないことは明かである。

【００８３】 しかし、Ｔｕｍ−４は（図３３Ｂに示されるように）ＷＭ−１６４メラノーマ
細胞の成長を阻害したが、Ｔｕｍ−１およびＴｕｍ−２は阻害しなかった。この
ことは、タムスタチンの抗腫瘍細胞活性が残基１８１〜２４４に存在し得ること
を示している。Ｓｈａｈａｎ他（１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：４５
８４〜４５９０）の結果を考慮すると、抗腫瘍細胞活性は残基１８５〜２０３に
存在する可能性が一層高い。抗血管新生の分野におけるほとんどの研究が、その
血液供給を制限することによって腫瘍を阻害することに関しているので、タムス
タチンの抗血管新生活性および抗腫瘍細胞活性が分離されることは驚くべきこと
である。

【００８４】 興味深いことに、欠失変異体のＴｕｍ−１およびＴｕｍ−２の抗血管新生活性
がタムスタチンの抗血管新生活性と同等であるので、残基５４〜１３２の領域の
抗血管新生活性はまた、その領域が全長型の折り畳まれたタムスタチン分子に含
まれる場合にも効果的であることは明かである。対照的に、Ｔｕｍ−４は抗腫瘍
細胞活性を有し、これに対して、Ｔｕｍ−３（これは、Ｔｕｍ−４と同様に残基
１８５〜２０３を含む）は抗腫瘍細胞活性を有しなかった。従って、１８５〜２
０３の領域の抗腫瘍細胞活性は、この領域が全長型の折り畳まれたタムスタチン
分子の一部として存在するか、またはより大きなタムスタチン断片（例えば、Ｔ
ｕｍ−３）の内部にさえ存在する場合には得られなかった。この活性は、（下記
の実施例の場合のように）分子を短縮化することによるか、またはＨａｎ他（１
９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０３９５〜２０４０１）によって
行われたような代表的なペプチドの合成によるかのいずれかによってこの領域が
露出したときにだけ実現される。

【００８５】 全長型タムスタチンの他の断片および変異体もまた抗血管新生活性を有する。
タムスタチン−４５−１３２は、非内皮細胞に対する著しい作用を伴うことなく
、内皮細胞の増殖および生じるアポトーシスを特異的に阻害する。タムスタチン
−４５−１３２は、もとのタンパク質からの６４％の短縮であったとしても、２
４４アミノ酸の全長型分子と同じくらい活性である。タムスタチン−４５−１３
２の抗血管新生作用は、マトリゲルプラグアッセイを使用してインビボでさらに
確認された。１μｇ／ｍｌのタムスタチン−４５−１３２は、ＰＣ−３腫瘍を阻
害し、そしてマウス異種移植片における血管新生および微小血管密度を低下させ
ることが見出された。内皮細胞表面に対するビオチン化タムスタチン−４５−１
３２の結合が免疫細胞化学によって確認された。免疫沈殿実験により、タムスタ
チン−４５−１３２が、競合的増殖アッセイによって明らかにされるように、内
皮細胞の表面に存在するα_ｖβ_３インテグリンおよびβ_１インテグリンに結合す
ることが解明された。

【００８６】 また、アルカリ還元されたタムスタチン−４５−１３２が非還元型のタムスタ
チン−４５−１３２と同じくらい効果的であることが見出された。アルカリ還元
により、折り畳まれた分子の立体配座構造を維持することにおいて役割を果たし
ているシステイン残基間のジスルフィド結合が破壊される。非還元の分子と比べ
て、アルカリ還元されたタムスタチン−４５−１３２の活性が低下しないことは
、システイン結合により媒介されるタムスタチン−４５−１３２の立体配座的性
質はその抗血管新生活性に必須でないことを示している。従って、用語「変異体
」はまた、還元されているタムスタチン分子、あるいは１つ以上のシステイン残
基が別のアミノ酸に変異しているか、または完全に欠失しているタムスタチン分
子のすべてまたは一部分を意味し得る。

【００８７】 タムスタチン−４５−１３２の変異体（Ｔｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａ）が作製
された。これは、（全長型分子内の）残基番号１２６におけるシステインがアラ
ニンに変異している。この変異は高まったタンパク質発現を示し、そしてこの分
子は、変異体がタムスタチン−４５−１３２よりも強く腫瘍の成長を実際に阻害
したマウスでの異種移植片研究における腫瘍成長の阻害を除いて、タムスタチン
−４５−１３２と同等の抗血管新生性を有する。

【００８８】 抗血管新生活性および抗腫瘍細胞活性はともにグッドパスチャーエピトープ領
域の外側に存在する。α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの「非グッドパスチャー断片
」により、グッドパスチャー自己エピトープを含まない、哺乳動物ＩＶ型コラー
ゲンのα３鎖のＮＣ１ドメインのアミノ酸配列の（例えば、タンパク質、ペプチ
ドまたはポリペプチドの）断片または一部が意味される。自己抗体がα３（ＩＶ
）ＮＣ１のＮ末端と単独で反応することが最近報告された。

【００８９】 抗血管新生性領域または抗腫瘍細胞性領域はいずれも典型的な「ＲＧＤ」（Ａ
ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）結合部位を含まず、従って、両方の領域は、ＲＧＤに依
存しない機構によってそれらのリガンドに結合する。インテグリンまたはインテ
グリンサブユニットと結合する（例えば、タンパク質、ペプチドまたはポリペプ
チドの）断片の能力が「ＲＧＤに依存しない」ということにより、たとえ断片が
「ＲＧＤ」（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）のペプチド配列を含まなくても、断片が
インテグリンまたはインテグリンサブユニットと結合できることが意味される。
どちらにもＲＧＤ配列が含まれなくても、抗血管新生性領域および抗腫瘍細胞性
領域はともに依然としてα_ｖβ_３インテグリンに結合し、そして両領域は内皮細
胞に結合する。（例えば、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの）断片が
「α_ｖβ_３インテグリンに結合する能力」を有するということにより、断片がこ
のインテグリンまたはそのサブユニット（すなわち、α_ｖおよび／またはβ_３）
と結合し得ること、あるいはこのインテグリンまたはそのサブユニットに対する
抗体による前処理により、（下記の実施例１２または実施例２８に示される方法
によって明らかにされるように）このインテグリンおよび／またはそのサブユニ
ットに対する断片の結合が阻害されることが意味される。

【００９０】 これらの類似性に照らして、（１）抗血管新生性領域は内皮細胞の増殖を阻害
し、一方、抗腫瘍細胞性領域は内皮細胞の増殖を阻害しないこと、および（２）
抗血管新生性領域は腫瘍細胞を阻害せず、一方、抗腫瘍細胞性領域がそのような
細胞を阻害することは驚くべきことである。

【００９１】 （例えば、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの）断片が「腫瘍細胞の
増殖を阻害することができない」、または「腫瘍細胞の増殖を阻害する能力を有
しない」ということにより、断片が腫瘍細胞（例えば、培養されたメラノーマ細
胞、例えばＷＭ−１６４細胞）の増殖を妨げないことが意味される。試験方法は
、下記の実施例に、例えば、実施例３６、３７および３８に示される。同様に、
（例えば、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの）断片が「腫瘍細胞の増
殖を阻害する能力」を有するということにより、断片が腫瘍細胞（例えば、培養
されたメラノーマ細胞、例えばＷＭ−１６４細胞）の増殖を妨げることが意味さ
れる。そのような能力に対する試験方法もまた、下記の実施例に、例えば、実施
例３６、３７および３８に示される。

【００９２】 （例えば、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの）断片が「内皮細胞の
増殖を阻害することができない」、または「内皮細胞の増殖を阻害する能力を有
しない」ということにより、断片が内皮細胞（例えば、培養されたＣ−ＰＡＥ細
胞）の増殖を妨げないことが意味される。そのような能力がないことに対する試
験方法は、下記の実施例に、例えば、実施例５、６、７、２６、３４、３６、３
８などに示される。

【００９３】 （例えば、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの）断片が「内皮細胞に
結合する能力」を有するということにより、断片が内皮細胞（例えば、Ｃ−ＰＡ
Ｅ細胞）に結合することが意味される。そのような能力に対する試験方法もまた
、下記の実施例に、例えば、実施例２６、２８、３７に示される。

【００９４】 抗血管新生活性または抗腫瘍細胞活性のいずれかに必要とされる正確な最小の
長さをさらに示すために、下記の実施例に記載される方法を使用して、さらなる
欠失変異体を作製することは困難なことではなく、また厄介なことでもない。そ
のような試みは非常に好都合である。なぜならば、所望する活性を依然として示
す可能な最小分子は、所望する活性には不必要なアミノ酸を含む、より大きな分
子よりも単位重量基準で強力であるからである。

【００９５】 タムスタチンによって内皮細胞の増殖が特異的に阻害されることにより、タム
スタチンが細胞表面のタンパク質／受容体を介して機能し得ることが強く示唆さ
れる。血管新生はまた、インテグリンα_ｖβ_３により媒介される特異的な内皮細
胞の接着事象に依存する（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．他、１９９４、Ｃｅｌｌ、７
９：１１５７〜６４）。細胞付着アッセイにより、タムスタチンがα_ｖβ_３イン
テグリンおよびα_６β_１インテグリンを介して内皮細胞に結合することが解明さ
れた。タムスタチンの抗増殖作用が可溶性のα_ｖβ_３インテグリンタンパク質に
よって部分的に回復した。タムスタチンは、マトリックス成分に対する増殖中の
内皮細胞の相互作用を乱すと考えられ、従って、内皮細胞にアポトーシスを受け
させる（Ｒｅ，Ｆ．他、１９９４、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：５３７〜
４６）。様々なマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）が、腫瘍における
新しい血管の形成を調節する重要な酵素として関与している（Ｒａｙ，Ｊ．Ｍ．
他、１９９４、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．７：２０６２〜７２）。最近、ＭＭ
Ｐ−２（ＰＥＸ）の阻害剤が、血管新生を阻害することによって腫瘍の成長を抑
制できることが明らかにされた（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．他、Ｃｅｌｌ、９２：
３９１〜４００）。タムスタチンは、ＭＭＰの活性を阻害することによって機能
し得る。

【００９６】 Ｐｅｔｉｔｃｌｅｒｃ他（２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：８０
５１〜６１）は、α３（ＩＶ）ＮＣ１がα_ｖβ_３インテグリンを介して内皮細胞
に結合することを示したが、その結合は、α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインのＮ末端
に存在するＲＧＤ配列を介していると推測した。しかし、このＲＧＤ配列は、Ｎ
Ｃ１ドメインの一部ではなく、三重らせん領域に由来しており、そしてＮｅｉｌ
ｓｏｎ他（１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４０２〜５）により
記載される元のクローンに含まれる。Ｐｅｔｉｔｃｌｅｒｃ他はこのクローンを
使用して、α３（ＩＶ）ＮＣ１を２９３胚腎臓細胞において組換え発現させた。
この配列が、部位特異的変異誘発を使用して除かれた場合に、α_ｖβ_３結合部位
が保持されている。このことは、ＲＧＤに依存しない結合機構を示している。

【００９７】 Ｓｈａｈａｎ他（１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：４５８４〜４５９
０）は、α_ｖβ_３インテグリンに対するリガンドとして残基１８５〜２０３を同
定し、そしてこの相互作用が関連の抗腫瘍細胞の性質には重要であると推測した
。下記の実施例３７および実施例３８は、ＲＧＤに依存しないさらに別のα_ｖβ _３ （α_ｖβ_５またはβ_１ではない）インテグリン結合部位がタムスタチンの５４
〜１３２の残基領域内に存在することを示している。この第２の部位は、腫瘍細
胞の増殖を阻害するためには必ずしも必要ないが、抗血管新生活性には必要であ
る。Ｔｕｍ−２は、内皮細胞およびメラノーマ細胞の両方と結合するが、内皮細
胞の増殖を阻害するだけであり、腫瘍細胞の増殖に対する作用を有しない。Ｔｕ
ｍ−４は、残基１８５〜２０３を含み、内皮細胞およびメラノーマ細胞の両方と
結合するが、メラノーマ細胞の増殖を阻害するだけである。両方のインテグリン
結合部位について、可溶性のα_ｖβ_３タンパク質を用いた競合アッセイは、抗増
殖活性をリバースするためには十分である。このことは、ＲＧＤに依存しない２
つの異なる、タムスタチン上のα_ｖβ_３結合部位が、おそらくは異なるα_ｖβ_３ インテグリン媒介機構を介して２つの異なる抗腫瘍活性を媒介することを示唆し
ている。本明細書中に記載される結果は、α_ｖβ_３インテグリンおよびα_６β_１ インテグリンがタムスタチンと結合すること、そしてα_ｖβ_３の結合はＲＧＤに
依存しないことを示している。

【００９８】 欠失変異体が、インテグリン結合部位を検出するために細胞接着アッセイにお
いて使用された。タムスタチンのＮ末端部には、三重らせんの非コラーゲン性部
分に由来するＲＧＤ配列（アミノ酸残基７〜９）が存在する。ＲＧＤはα_ｖβ_３ 受容体の結合部位である。しかし、この配列を有しないＴｕｍ−１は、依然とし
てα_ｖβ_３インテグリンに結合する。従って、この結合部位は、１８５〜２０３
の領域について示されたようにＲＧＤに依存しない。この領域に対する抗体（例
えば、抗Ｔｕｍ−４抗体）は、α_ｖβ_３結合部位に部分的に結合することが示さ
れているが、Ｔｕｍ−１がα_ｖβ_３受容体に結合することを妨げず、そしてＴｕ
ｍ−１の抗増殖作用もまた影響されなかった。さらに、Ｔｕｍ−２（残基１〜１
３２）は、Ｃ末端のα_ｖβ_３結合部位（残基１８５〜２０３）を含まないが、細
胞接着アッセイにおいてα_ｖβ_３に結合し、そして内皮細胞の増殖を阻害するこ
とが実施例３８において示される。タムスタチンまたはＴｕｍ−２をα_ｖβ_３タ
ンパク質とインキュベーションして、内皮細胞の細胞膜に存在するα_ｖβ_３受容
体を飽和させた場合、タムスタチンの抗増殖作用は著しく低下した（４３％〜７
４％）。タムスタチンに対する可溶性α_ｖβ_３受容体の親和性が、膜結合型のα _ｖ β_３に対して、はるかに弱く、効率的でないと考えられることを考慮すれば、
このことは驚くべきことである。本明細書中に記載される結果は、α_ｖβ_３結合
部位がアミノ酸５４〜１３２の中に存在し得ることを示している。

【００９９】 タムスタチンの抗血管新生活性がα_ｖβ_３により媒介されることは、ＶＥＧＦ
により内皮細胞におけるα_ｖβ_３の発現がアップレギュレーションされるという
理解と一致している（Ｓｅｎｇｅｒ他、１９９６、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１
４９：２９３〜３０５；Ｓｕｚｕｍｅ他、１９９８、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈ
ａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３９：１０２８〜１０３５）。血管新生は、α_ｖ β_３インテグリンにより媒介される特異的な内皮細胞の接着事象に依存する（Ｂ
ｒｏｏｋｓ他、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４：５６９〜５７１；Ｂｒｏｏ
ｋｓ他、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９：１１５７〜１１８３）ので、タムスタチン
の抗血管新生作用は、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンなどのマトリック
ス成分に対する増殖中の内皮細胞の相互作用を乱すことによって媒介されると考
えられる。これは、重要な抗アポトーシスシグナル（３６）であると見なされる
。

【０１００】 第２のＲＧＤ非依存部位は、１８５〜２０３の部位に対してアミノ酸レベルで
著しい相同性を示していないが、両方とも、内皮細胞およびメラノーマ細胞にお
けるα_ｖβ_３インテグリンと結合する。α_ｖβ_３インテグリンは残基１８５〜２
０３に結合するが、内皮細胞の増殖阻害は認められなかった。

【０１０１】 タムスタチンはインビトロおよびインビボで血管新生を阻害し、これにより腫
瘍の進行の抑制がもたらされる。この方法を患者に適用するために、全身投与に
よるその潜在的な毒性または副作用もまた検討しなければならない。タムスタチ
ンの分布が限定されており、そして表皮基底膜にはほとんど存在しないという事
実は、タムスタチン処置による副作用の可能性が小さいことを示唆している。ま
た、腎臓などの限られた器官の血管基底膜にタムスタチンが存在することは、限
られた器官に生じる腫瘍を標的化することにおけるその潜在的な他にない利点を
示唆している。究極的には、遺伝子移入法（Ｋａｓｈｉｈａｒａ，Ｎ．他、１９
９７、Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．５：１２６〜３１；Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．他
、１９９６、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．７：２２１９〜２９；Ｍａｅ
ｓｈｉｍａ，Ｔ．他、１９９８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２５８
９〜９７）を用いてタムスタチン遺伝子を腫瘍の血管系においてインビボで発現
させる代替的な方法を開発することが望ましい。

【０１０２】 α３（ＩＶ）鎖の分布は、選択された器官の基底膜に限定されており、従って
、α鎖の組み立てを阻害することによるこの分子の可能な機能を考慮すれば、タ
ムスタチンはほとんど害を及ぼさないと考えられる。さらに、α３（ＩＶ）鎖は
腎臓の血管基底膜に認められており（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．他、１９９７、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２４７０〜８）、これらの血管は、腎細胞ガン
などの原発性腎腫瘍の進行に関与していると考えられている。従って、タムスタ
チンは、α３（ＩＶ）鎖とそれ以外のα鎖との組み立てを乱すことによってその
ような腫瘍の処置において効果的であると考えられる。

【０１０３】 本明細書中で使用される用語「血管新生」は、新しい血管が組織内または器官
内に生じることを意味し、内皮細胞の増殖を伴う。正常な生理学的条件のもとで
は、ヒトまたは動物は、非常に特定の限られた状況でのみ血管新生を受ける。例
えば、血管新生は、通常、創傷治癒、胎児および胚の発達、ならびに黄体、子宮
内膜および胎盤の形成において認められる。用語「内皮」は、漿膜腔、リンパ管
および血管の内側を覆う平らな上皮細胞の薄い層を意味する。従って、「抗血管
新生活性」は、血管の成長を阻害する組成物の能力をいう。血管の成長は、複雑
な一連の事象であり、個々の内皮細胞の下に位置する基底膜の限局的な破壊、そ
れらの細胞の増殖、将来の血管位置への細胞の移動、新しい血管膜を形成するた
めの細胞の再組織化、内皮細胞増殖の停止、ならびに新しい血管壁を支える周皮
細胞および他の細胞の取り込みを含む。従って、本明細書中で使用される「抗血
管新生活性」には、新しい血管の形成が阻害されるという最終的な結果を伴う、
これらの段階のいずれかまたはすべてを妨げることが含まれる。

【０１０４】 抗血管新生活性は内皮細胞阻害活性を含むことがある。これは、一般には血管
新生を阻害する組成物の能力、例えば、繊維芽細胞増殖因子、血管新生関連因子
または他の知られている増殖因子の存在下での培養においてウシ毛細管内皮細胞
の成長または移動を阻害する組成物の能力をいう。「増殖因子」は、細胞の成長
、再生産または合成活性を刺激する組成物である。「血管新生関連因子」は、血
管新生の阻害または促進のいずれかを行う因子である。血管新生関連因子の一例
として、血管新生の促進因子である塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）など
の血管新生性の増殖因子が挙げられる。血管新生関連因子の別の例として、例え
ば、アンギオスタチン（例えば、米国特許第５，８０１，０１２号、米国特許第
５，８３７，６８２号、米国特許第５，７３３，８７６号、米国特許第５，７７
６，７０４号、米国特許第５，６３９，７２５号、米国特許第５，７９２，８４
５号、国際公開ＷＯ９６／３５７７４号パンフレット、同ＷＯ９５／２９２４２
号パンフレット、同ＷＯ９６／４１１９４号パンフレット、同ＷＯ９７／２３５
００号パンフレットを参照のこと）またはエンドスタチン（例えば、国際公開Ｗ
Ｏ９７／１５６６６号パンフレットを参照のこと）などの血管新生阻害因子が挙
げられる。

【０１０５】 「実質的に同じ生物学的活性」または「実質的に同じか、または優れた生物学
的活性」により、組成物が抗血管新生活性を有し、そして標準的なアッセイで測
定されたとき、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンが挙動するのと同
様に挙動することが意味される。「標準的なアッセイ」には、抗血管新生活性、
細胞周期停止およびアポトーシスを評価するために分子生物学の分野で使用され
ている様々なそのようなプロトコルが含まれるが、これらに限定されない。その
ようなアッセイには、例えば、アポトーシス細胞形態学またはアネキシンＶ−Ｆ
ＩＴＣアッセイ、漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイ、およびヌードマウスにおける腎臓
ガン腫瘍成長の阻害によって、内皮細胞の増殖、内皮細胞の移動、細胞周期分析
、および内皮細胞の管形成をアッセイすること、アポトーシスの検出が含まれる
が、これらに限定されない。そのようなアッセイは下記の実施例に示される。

【０１０６】 「アレステン」（これはまた本明細書中では「アレスチン」と示される）は、
アレステン配列のアミノ酸配列の断片、変異体、ホモログ、アナログおよび対立
遺伝子変化体、ならびに他の哺乳動物に由来するアレステン、およびそのような
アレステンのアミノ酸配列の断片、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝
子変化体を含むものとする。

【０１０７】 本明細書中で使用される「カンスタチン」は、カンスタチン配列のアミノ酸配
列の断片、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変化体、ならびに他の
哺乳動物に由来するカンスタチン、およびそのようなカンスタチンのアミノ酸配
列の断片、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変化体を含むものとす
る。

【０１０８】 本明細書中で使用される「タムスタチン」は、タムスタチン配列のアミノ酸配
列の断片、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変化体、ならびに他の
哺乳動物に由来するタムスタチン、およびそのようなタムスタチンのアミノ酸配
列の断片、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変化体を含むものとす
る。

【０１０９】 本発明は、内皮細胞阻害活性（例えば、一般には血管新生を阻害する組成物の
能力、例えば、繊維芽細胞増殖因子、血管新生関連因子または他の知られている
増殖因子の存在下での培養においてウシ毛細管内皮細胞の成長または移動を阻害
する組成物の能力）を有する、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの
任意の誘導体を含むことが考えられることを理解しなければならない。本発明に
は、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの完全なタンパク質、これら
のタンパク質の誘導体、およびこれらのタンパク質の生物学的に活性な断片が含
まれる。これらには、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの活性を有
し、そしてアミノ酸の置換を有するか、あるいは糖または他の分子がアミノ酸官
能基に結合しているタンパク質が含まれる。

【０１１０】 本発明はまた、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンの断片、変異体
、ホモログおよびアナログを記載する。アレステン、カンスタチンまたはタムス
タチンの「断片」は、アレステン分子、カンスタチン分子またはタムスタチン分
子よりも短い任意のアミノ酸配列であり、アレステン、カンスタチンまたはタム
スタチンのポリペプチドの少なくとも２５個の連続したアミノ酸を含む。そのよ
うな分子はまた、クローニングの過程に由来するさらなるアミノ酸（例えば、完
全または部分的なリンカー配列に対応するアミノ酸残基またはアミノ酸配列）を
含んでもよく、または含まなくてもよい。本発明により包含されるためには、そ
のような変異体は、そのようなさらなるアミノ酸残基が存在または非存在であっ
ても、参照ポリペプチドの天然型または全長型と実質的に同じ生物学活性を有し
なければならない。

【０１１１】 「タムスタチンＮ−５３」と名付けられた１つのそのような断片が、標準的な
アッセイによって測定された場合に全長型タムスタチンの抗血管新生活性と同等
の抗血管新生活性を有することが見出された。タムスタチンＮ−５３は、Ｎ末端
の５３アミノ酸が欠失しているタムスタチン分子を含む。本明細書中に記載され
る他の変異体断片が、本明細書中に記載されるアッセイによって示されるように
、非常に大きなレベルの抗血管新生活性を有することが見出されている。これら
の断片、すなわち、「タムスタチン３３３」、「タムスタチン３３４」、「１２
ｋＤａのアレステン断片」、「８ｋＤａのアレステン断片」および「１０ｋＤａ
のカンスタチン断片」は、ＥＤ_５０値がそれぞれ、７５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／
ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌおよび８０ｎｇ／ｍｌである。対照的に
、全長型のアレステン、カンスタチンおよびタムスタチンは、それぞれ、４００
ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌおよび５５０ｎｇ／ｍｌのＥＤ_５０値を有するこ
とが見出されていた。タムスタチン３３３は配列番号１０のアミノ酸２〜１２５
を含み、タムスタチン３３４は配列番号１０のアミノ酸１２６〜２４５を含む。

【０１１２】 アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの「変異体」により、アレステ
ン、カンスタチンまたはタムスタチンの等価な参照ポリペプチドのアミノ酸配列
に対するアミノ酸配列における任意の変化を含むポリペプチドが意味される。そ
のような変化は自然に生じ得るか、あるいはヒトによる操作によって、化学エネ
ルギー（例えば、Ｘ線）によって、または他の形態の化学的変異誘発によって、
または遺伝子操作によって、または交配もしくは遺伝情報の他の形態の交換の結
果として生じ得る。変異には、例えば、塩基の変化、欠失、挿入、逆位、転座ま
たは重複が含まれる。変異体形態のアレステン、カンスタチンまたはタムスタチ
ンは、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの等価な参照ポリヌクレオ
チドに対して増大した抗血管新生活性または低下した抗血管新生活性のいずれか
を示すことがあり、そのような変異体はまた、クローニングの過程に由来するさ
らなるアミノ酸（例えば、完全または部分的なリンカー配列に対応するアミノ酸
残基またはアミノ酸配列）を含んでもよく、または含まなくてもよい。

【０１１３】 本発明の抗血管新生性タンパク質の変異体／断片はＰＣＲクローニングによっ
て作製することができる。「タムスタチン３３３」および「タムスタチン３３４
」と名付けられた断片はこの方法で作製され、そして下記の実施例２３に記載さ
れるように、また図３０および図３１に示されるように全長型タムスタチンの抗
血管新生活性よりも優れた抗血管新生活性を有する。そのような断片を作製する
ために、ＰＣＲプライマーが、それぞれのプライマー組により既知の部分配列が
全長タンパク質から増幅されるような方法で既知の配列から設計される。その後
、これらの部分配列は、ｐＥＴ２２ｂベクターなどの適切な発現ベクターにクロ
ーン化され、そして発現したタンパク質が、下記のアッセイにおいて記載される
ようにその抗血管新生活性について調べられる。

【０１１４】 本発明の抗血管新生性タンパク質の変異体／断片はまた、Ｍａｒｉｙａｍａ，
Ｍ．他（１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２５３〜８）によって
記載され、また下記の実施例３３に記載されるように、シュードモナス属細菌の
エラスターゼ消化によって作製することができる。この方法を使用して、１２ｋ
Ｄａおよび８ｋＤａのアレステン変異体ならびに１０ｋＤａのカンスタチン変異
体が製造された。これらの３つはすべて、元の全長型タンパク質よりも高レベル
の抗血管新生活性を有する。

【０１１５】 アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの「アナログ」により、アレス
テン、カンスタチンまたはタムスタチンの完全な分子あるいはそれらの断片また
は対立遺伝子変化体のいずれかと実質的に類似し、かつ実質的に同じか、または
優れた生物学的活性を有する非天然型の分子が意味される。そのようなアナログ
には、生物学に活性なアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの誘導体（
例えば、上記に規定されるような化学的誘導体）、ならびにその断片、変異体、
ホモログおよび対立遺伝子変化体が含まれるものとする。そのような誘導体は、
非修飾のアレステンポリペプチド、カンスタチンポリペプチドまたはタムスタチ
ンポリペプチド、断片、変異体、ホモログまたは対立遺伝子変化体の作用と定性
的に類似するアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を示す。

【０１１６】 アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの「対立遺伝子」により、アレ
ステン、カンスタチンまたはタムスタチンの参照ポリペプチドのポリペプチド配
列に対して天然に存在する配列変化を含むポリペプチド配列が意味される。アレ
ステン、カンスタチンまたはタムスタチンのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドの「対立遺伝子」により、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチ
ンの参照ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド配列に対する配列変化
を含むポリヌクレオチドが意味される。この場合、アレステン、カンスタチンま
たはタムスタチンのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの対立遺伝子は
、対立遺伝子形態のアレステンポリペプチド、カンスタチンポリペプチドまたは
タムスタチンポリペプチドをコードする。

【０１１７】 所与のポリペプチドが、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの断片
、変異体、アナログまたは対立遺伝子変化体のいずれかであり得ること、あるい
は所与のポリペプチドがこれらの２つ以上であり得ること、例えば、ポリペプチ
ドが、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンのポリペプチドのアナログ
および変異体の両方であり得ることが可能である。例えば、短小化体のアレステ
ン分子、カンスタチン分子またはタムスタチン分子（例えば、アレステン、カン
スタチンまたはタムスタチンの断片）を実験室において作製することができる。
その断片が、その後、この分野で知られている手段によって変異処理される場合
、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの断片および変異体の両方であ
る分子が作製される。別の例では、いくつかの哺乳類の個体において対立遺伝子
形態のアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンとして存在することがその
後に発見される変異体を作製することができる。従って、そのような変異体のア
レステン分子、カンスタチン分子またはタムスタチン分子は変異体および対立遺
伝子変化体の両方である。断片、変異体、対立遺伝子変化体およびアナログのそ
のような組合せは本発明に包含されるものとする。

【０１１８】 例えば、下記の実施例２３に記載される大腸菌発現クローニング法によって作
製されるタムスタチンは単量体である。このタムスタチンはまた、大腸菌発現ク
ローニング法により、天然タンパク質に存在しないポリリンカー配列およびヒス
チジン標識が発現タンパク質に付加されているので融合またはキメラなタンパク
質である。タムスタチン断片の「タムスタチンＮ−５３」（これはまた実施例２
３に記載される）は、全長型タムスタチンタンパク質の断片であり、かつ欠失変
異体であり、そして同じ大腸菌発現クローニング法によって作製された場合、こ
れもまた、さらなる配列が付加されており、従って全長型タムスタチンタンパク
質の融合またはキメラな変異体断片である。このタムスタチンＮ−５３のサブユ
ニットは、例えば、二量体、三量体などに組み合わせられた場合、タムスタチン
タンパク質の多量体の融合またはキメラな変異体断片をもたらす。

【０１１９】 本発明には、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンと実質的に同じア
ミノ酸配列を有するタンパク質、あるいはアレステン、カンスタチンまたはタム
スタチンをコードするポリヌクレオチドと実質的に同じ核酸配列を有するポリヌ
クレオチドが包含される。「実質的に同じ配列」は、参照配列（例えば、別の核
酸またはポリペプチド）と少なくとも約７０％の配列同一性、典型的には参照配
列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは参照配列と少なくとも約９０
％の配列同一性、より好ましくは参照配列と少なくとも約９５％の配列同一性、
最も好ましくは参照配列と少なくとも約９７％の配列同一性を示す核酸またはポ
リペプチドを意味する。配列について比較される長さは、一般には少なくとも７
５個のヌクレオチド塩基または２５個のアミノ酸であり、より好ましくは少なく
とも１５０個のヌクレオチド塩基または５０個のアミノ酸であり、最も好ましく
は２４３個〜２６４個のヌクレオチド塩基または８１個〜８８個のアミノ酸であ
る。本明細書中で使用される「ポリペプチド」はアミノ酸の分子鎖を示し、特定
の長さの生成物を示さない。従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク
質はポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、例えば、グリコシル化、
アセチル化、リン酸化およびその他などの発現後の修飾を受けているポリペプチ
ドを含むものとする。

【０１２０】 本明細書中で使用される「配列同一性」は、２つのポリマー分子（例えば、２
つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド）の間におけるサブユニット配
列の類似性をいう。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サ
ブユニットによって占められているとき、例えば、２つのペプチドのそれぞれに
おける１つの位置がセリンによって占められている場合、これらはその位置で同
一である。２つの配列の間における同一性は、一致した位置または同一位置の数
の直接的な関数である。例えば、２つのペプチドまたは化合物の配列における位
置の半分（例えば、長さが１０個のサブユニットであるポリマーにおいて５つの
位置）が同一である場合、２つの配列は５０％の同一性を有する；位置の９０％
（例えば、１０個のうちの９個）が一致する場合、２つの配列は９０％の配列同
一性を有する。例として、Ｒ_２Ｒ_５Ｒ_７Ｒ_１０Ｒ_６Ｒ_３およびＲ_９Ｒ_８Ｒ_１Ｒ_{１ ０} Ｒ_６Ｒ_３のアミノ酸配列は６つのうちの３つの位置が共通しているので、５０
％の配列同一性を有するが、Ｒ_２Ｒ_５Ｒ_７Ｒ_１０Ｒ_６Ｒ_３およびＲ_８Ｒ_１Ｒ_１０ Ｒ_６Ｒ_３の配列は５つのうちの３つの位置が共通しているので、６０％の配列同
一性を有する。２つの配列間の同一性は、一致した位置または同一位置の数の直
接的な関数である。従って、参照配列のある位置が特定のペプチドにおいて欠失
している場合、その欠失部分は、配列同一性を計算するためには計算されない。
例えば、Ｒ_２Ｒ_５Ｒ_７Ｒ_１０Ｒ_６Ｒ_３およびＲ_２Ｒ_５Ｒ_７Ｒ_１０Ｒ_３の配列は６
つのうちの５つの位置が共通しているので、８３．３％の配列同一性を有する。

【０１２１】 同一性は、多くの場合、配列分析ソフトウエアを使用して、例えば、ＢＬＡＳ
ＴＮまたはＢＬＡＳＴＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴから入手可能である）を使用して測定される。（ヌクレオチ
ド配列について）ＢＬＡＳＴＮによる２つの配列の比較（２つの配列の相互の「
Ｂｌａｓｔ比較」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ
／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌ）を行うための設定省略時のパラメーターは、一
致＝１、不一致ペナルティー＝−２、オープンギャップ＝５、伸長ギャップ＝２
に対するものである。ＢＬＡＳＴＰをタンパク質配列について使用する場合、設
定省略時のパラメーターは、一致＝０、不一致ペナルティー＝０、オープンギャ
ップ＝１１、伸長ギャップ＝１に対するものである。

【０１２２】 ２つの配列が「配列相同性」を有する場合、２つの配列は、保存的置換によっ
てのみ互いに異なることが意味される。ポリペプチド配列の場合、そのような保
存的置換は、配列内の所与位置における１つのアミノ酸が同じクラスの別のアミ
ノ酸（例えば、疎水性、電荷、ｐＫまたは他の立体配座的もしくは化学的な性質
を有するアミノ酸、例えば、ロイシンの代わりにバリン、リシンの代わりにアル
ギニン）に置換されていることからなるか、あるいはポリペプチドの生物学的活
性が破壊される程度にまでポリペプチドの立体配座または折り畳みを変化させな
い配列の位置に存在する１つまたは複数の非保存的なアミノ酸の置換、欠失また
は挿入によるものである。「保存的置換」の例には、ポリペプチドが必要な生物
学的活性を示すならば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなど
の１つの非極性（疎水性）残基を別のものに置換すること；アルギニンとリシン
との間、グルタミンとアスパラギンとの間、トレオニンとセリンとの間における
一方の極性（親水性）残基を別のものに置換すること；リシン、アルギニンまた
はヒスチジンなどの１つの塩基性残基を別のものに置換すること；あるいはアス
パラギン酸またはグルタミン酸などの１つの酸性残基を別のものに置換すること
；あるいは非誘導体化残基の代わりに化学的な誘導体化残基の使用が含まれる。
配列相同性を有する２つの配列は「配列ホモログ」と呼ばれることがある。

【０１２３】 本発明には、本明細書中に開示されるタンパク質およびペプチドの変異体が包
含される。この場合、１つ以上の変異はタンパク質またはペプチドの活性を実質
的に変化させず、すなわち、変異は実際には「サイレント」な変異である。１つ
のそのような変異体であるＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａが本明細書中に示される
。この変異体は、（全長型タムスタチン分子の）１２６番目の残基のシステイン
がシステインからアラニンに変異している。この変異は、ジスルフィド結合がそ
の残基で形成されることを妨げているが、Ｔｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａはその親
分子タムスタチン−４５−１３２の完全な活性を保持している。

【０１２４】 相同性は、ポリペプチドについては、典型的には、配列分析ソフトウエア（例
えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐの配列分析ソフトウエ
アパッケージ、ウイスコンシン大学生物工学センター、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７０５）を使用して測定さ
れる。タンパク質分析ソフトウエアは、様々な置換体、欠失体および他の修飾体
に対して相同性の程度を定めることによって類似する配列を照合する。保存的置
換として、典型的には下記のグループ内における置換が挙げられる：グリシン、
アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、
アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；および
フェニルアラニン、チロシン。

【０１２５】 アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンの化学的誘導体もまた本発明に
よって包含される。「化学的誘導体」は、１つまたは複数の残基が側鎖官能基の
反応によって化学的に誘導体化された当該ポリペプチドをいう。そのような誘導
体化された残基には、例えば、アミン塩酸塩を形成させるために未修飾アミノ基
が誘導体化されているそのような分子、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベン
ゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基
が含まれる。未修飾のカルボキシル基は、塩、メチルエステルおよびエチルエス
テルまたは他のタイプのエステル、あるいはヒドラジドを形成させるために誘導
体化することができる。未修飾のヒドロキシル基は、Ｏ−アシル誘導体またはＯ
−アルキル誘導体を形成させるために誘導体化することができる。ヒスチジンの
イミダゾール窒素は、Ｎ−インベンジルヒスチジン（ｉｍｂｅｎｚｙｌｈｉｓｔ
ｉｄｉｎｅ）を形成させるために誘導体化することができる。２０個の標準的な
アミノ酸の１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むそのようなペ
プチドもまた化学的誘導体として含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンを
プロリンの代わりに使用することができ、５−ヒドロキシリシンをリシンの代わ
りに使用することができ、３−メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに使用す
ることができ、ホモセリンをセリンの代わりに使用することができ、そしてオル
ニチンをリシンの代わりに使用することができる。

【０１２６】 本発明はまた、抗血管新生性のタンパク質、その断片、変異体、ホモログ、ア
ナログおよび対立遺伝子変化体（例えば、タムスタチンおよびカンスタチン、ま
たはＴ１およびＴ４など）を含む融合タンパク質およびキメラタンパク質を含む
。融合タンパク質またはキメラタンパク質は、組換え発現およびクローニングプ
ロセスの結果として製造することができる。例えば、全長または部分的なリンカ
ー配列に対応するさらなるアミノ酸またはアミノ酸配列を含むタンパク質を製造
することができ、例えば、本発明のアレステンは、大腸菌において産生させた場
合（下記の実施例２を参照のこと）、ヒスチジンタグを含む、タンパク質に付加
されたさらなるベクター配列を含む。本明細書中で使用される「融合またはキメ
ラなタンパク質」は、元のタンパク質配列に対するこのタイプの変化を包含する
ものとする。類似する変化がカンスタチンタンパク質およびタムスタチンタンパ
ク質に対して行われた（それぞれ、実施例１４および実施例２３）。融合または
キメラなタンパク質は、単一タンパク質の多量体から、例えば、抗血管新生タン
パク質の反復から構成され得るか、または融合タンパク質およびキメラタンパク
質は、数個のタンパク質から、例えば、数個の抗血管新生タンパク質から構成さ
れ得る。融合またはキメラなタンパク質は、２つ以上の既知の抗血管新生タンパ
ク質（例えば、アンギオスタチンおよびエンドスタチン、またはアンギオスタチ
ンおよびエンドスタチンの生物学的に活性な断片）の組み合せを含むことができ
、あるいは１つの抗血管新生タンパク質を標的化剤と組み合わせて（例えば、エ
ンドスタチンを上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）ペプチドまたはＲＧＤペプチドとと
もに）、または１つの抗血管新生タンパク質を免疫グロブリン分子と組み合わせ
て（例えば、エンドスタチンと、特にＦｃ部分が除かれたＩｇＧとを）含むこと
ができる。融合タンパク質およびキメラタンパク質はまた、抗血管新生タンパク
質、その断片、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変化体、ならびに
他の抗血管新生タンパク質（例えば、エンドスタチンまたはアンギオスタチン）
を含むことができる。他の抗血管新生タンパク質として、レスチンおよびアポミ
グレン（国際公開ＷＯ９９／２９８５６号パンフレット、その教示は参考として
本明細書中に組み込まれる）、ならびにエンドスタチンの断片（国際公開ＷＯ９
９／２９８５５号パンフレット、その教示は参考として本明細書中に組み込まれ
る）を挙げることができる。本明細書中で使用される用語「融合タンパク質」ま
たは用語「キメラタンパク質」はまた、例えば、化学療法剤を送達するためのさ
らなる成分を含むことができる。この場合、化学療法剤をコードするポリヌクレ
オチドは、抗血管新生タンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結される。
融合またはキメラなタンパク質はまた抗血管新生タンパク質の多量体（例えば、
二量体または三量体）を含むことができる。そのような融合タンパク質またはキ
メラタンパク質は、翻訳後修飾によって一緒に連結することができ（例えば、化
学的に連結することができ）、または融合タンパク質全体を組換え的に作製する
ことができる。

【０１２７】 アレステン、カンスタチン、タムスタチン、それらの断片、変異体、ホモログ
、アナログおよび対立遺伝子変化体を含む多量体タンパク質もまた本発明によっ
て包含されるものとする。「多量体」により、２コピー以上のサブユニットタン
パク質を含むタンパク質が意味される。サブユニットタンパク質は、本発明のタ
ンパク質のいずれかであり得る。例えば、アレステンを２回以上反復させること
ができ、あるいは断片、変異体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変化体、
例えば、タムスタチンの変異体または断片（例えば、タムスタチン３３３）を２
回以上反復させることができる。そのような多量体もまた融合またはキメラなタ
ンパク質であり得る。例えば、タムスタチンの反復変異体を、ポリリンカー配列
、および／または１コピーで存在し得るか、もしくはタンデム状にも反復し得る
１つもしくは複数の抗血管新生性ペプチドと組み合わせることができる。例えば
、タンパク質は、２つ以上の多量体を全長のタンパク質に含むことができる。

【０１２８】 本発明はまた、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンをコードする１
つまたは複数の単離されたポリヌクレオチドを含む組成物、ならびにそのような
ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび宿主細胞を包含し、そしてアレステ
ン、カンスタチンおよびタムスタチン、ならびにそれらの断片、変異体、ホモロ
グ、アナログおよび対立遺伝子変化体の製造方法を包含する。本明細書中で使用
される用語「ベクター」は、核酸片が挿入またはクローン化され得るキャリアを
意味し、そのようなキャリアは、その核酸片を宿主細胞内に移すように機能する
。そのようなベクターはまた、移された核酸片の複製および／または発現を生じ
させることができる。ベクターの例には、例えば、プラスミド、バクテリオファ
ージまたは哺乳動物ウイルス、植物ウイルスもしくは昆虫ウイルスに由来する核
酸分子、あるいはリガンド−核酸結合体、リポソームまたは脂質−核酸複合体な
どの非ウイルスベクターが含まれる。移される核酸は、移された核酸の発現を可
能にする発現ベクターを得るために発現制御配列に機能的に連結されることが望
ましい場合がある。核酸のそのような移動は、一般には「形質転換」と呼ばれ、
そして挿入のために使用される方法にかかわりなく、宿主細胞内に外因性ポリヌ
クレオチドを挿入することをいう。例えば、直接的な取り込み、形質導入または
ｆ交配が含まれる。外因性ポリヌクレオチドは非組込み型ベクター（例えば、プ
ラスミド）として維持され得るか、あるいはかわりに宿主ゲノムに組み込まれ得
る。「機能的に連結される（た）」は、記載された成分が、その意図された様式
でその成分が機能し得る関係にある状況をいう。例えば、コード配列に「機能的
に連結された」制御配列は、制御配列と適合可能な条件のもとでコード配列の発
現が達成されるような様式で連結されている。「コード配列」は、（例えば、適
切な調節配列に機能的に連結されて）適切な調節配列の制御下に置かれたときに
、ｍＲＮＡに転写され、かつポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列で
ある。コード配列の境界は、５’末端における翻訳開始コドンおよび３’末端に
おける翻訳停止コドンによって決定される。そのような境界は自然に存在し得る
か、あるいはこの分野で知られている方法によってポリヌクレオチド配列に導入
または付加することができる。コード配列は、ｍＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列およ
び組換えポリヌクレオチド配列を包含し得るが、これらに限定されない。

【０１２９】 クローン化されたポリヌクレオチドがクローン化されるベクターは、ベクター
が真核生物で機能するために選ぶことができ、あるいはかわりにベクターが原核
生物で機能するために選ばれる。アレステンタンパク質、カンスタチンタンパク
質およびタムスタチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドのクローニング
と、そのポリヌクレオチドからのそのようなタンパク質の発現との両方を可能に
するベクターの２つの例として、ｐＥＴ２２ｂベクターおよびｐＥＴ２８（ａ）
ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）と、
改変されたｐＰＩＣＺαＡベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）とが挙げられる。これらは、それぞれ、細菌
および酵母におけるタンパク質の発現を可能にする。例えば、国際公開ＷＯ９９
／２９８７８号パンフレットを参照のこと（その全教示はそれにより参考として
組み込まれる）。

【０１３０】 ポリヌクレオチドが好適なベクターに一旦クローン化されると、ベクターは適
切な宿主細胞に形質転換することができる。「宿主細胞」により、ベクターによ
って移された核酸の受容物として使用されているか、または核酸の受容物として
使用できる細胞が意味される。宿主細胞は、原核生物または真核生物（哺乳動物
、植物または昆虫）であり得るし、そして単細胞として、または集団として、例
えば、培養物として、あるいは組織培養物で、または組織もしくは生物に存在し
得る。宿主細胞はまた、多細胞生物（例えば、哺乳動物）に由来する正常な組織
または疾患組織に由来し得る。本明細書中で使用される宿主細胞は、核酸で形質
転換された元の細胞だけでなく、核酸を依然として含有するそのような細胞の子
孫をも含むものとする。

【０１３１】 １つの実施形態において、抗血管新生タンパク質をコードする単離されたポリ
ヌクレオチドは、ペプチドをコードするポリヌクレオチドリンカーをさらに含む
。そのようなリンカーは当業者には知られており、例えば、リンカーは、少なく
とも１つのさらなるアミノ酸をコードする少なくとも１つのさらなるコドンを含
むことができる。典型的には、リンカーは１個〜約２０個または３０個のアミノ
酸を含む。ポリヌクレオチドリンカーは、抗血管新生タンパク質をコードするポ
リヌクレオチドが翻訳されるように翻訳され、これにより、少なくとも１つのさ
らなるアミノ酸残基を抗血管新生タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末
端に有する抗血管新生タンパク質の発現がもたらされる。重要なことには、この
さらなる１つまたは複数のアミノ酸は抗血管新生タンパク質の活性を損なわない
。

【０１３２】 選択されたポリヌクレオチドがベクターに挿入された後、ベクターは適切な原
核生物株に形質転換され、そしてその原核生物株は、生物学的に活性な抗血管新
生タンパク質を産生させるために好適な培養条件のもとで培養（例えば、維持）
され、それにより生物学的に活性な抗血管新生タンパク質あるいはその変異体、
誘導体、断片または融合タンパク質が製造される。１つの実施形態において、本
発明は、抗血管新生タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ
２２ｂ、ｐＥＴ１７ｂまたはｐＥＴ２８ａにクローン化し、その後、このベクタ
ーを細菌に形質転換することを含む。次いで,細菌の宿主株は、抗血管新生タン
パク質を発現する。典型的には、抗血管新生タンパク質は、培養液１リットルあ
たり約１０〜２０ミリグラムまたはそれ以上の量で製造される。

【０１３３】 本発明の別の実施形態において、真核生物ベクターには、改変された酵母ベク
ターが含まれる。１つの方法は、プラスミドがマルチプルクローニング部位を含
むｐＰＩＣzαプラスミドを使用することである。マルチプルクローニング部位
はＨｉｓ．Ｔａｇモチーフのマルチプルクローニング部位に挿入されている。ま
た、ベクターは、ＮｄｅＩ部位または他の好適な制限部位を加えるために改変す
ることができる。そのような部位は当業者には十分に知られている。この実施形
態によって製造される抗血管新生タンパク質は、１つまたは複数のヒスチジン（
典型的には約５個〜２０個のヒスチジン）を含むヒスチジンタグモチーフ（Ｈｉ
ｓタグ）を含む。このタグはタンパク質の抗血管新生性を妨害しないだろう。

【０１３４】 アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンを製造する１つ方法は、例えば
、配列番号１、配列番号５または配列番号９のポリヌクレオチドをそれぞれ増幅
して、そのポリヌクレオチドを発現ベクター（例えば、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＥＴ２
８（ａ）、ｐＰＩＣＺαＡ、またはいくつかの他の発現ベクター）にクローン化
し、そしてそのポリヌクレオチドを含有するベクターを、そのポリヌクレオチド
によってコードされるポリペプチドを発現させることができる宿主細胞に形質転
換し、そして形質転換された宿主細胞を、タンパク質を発現させるために好適な
培養条件のもとで培養し、その後、タンパク質を培養物から抽出および精製する
ことである。一般的には抗血管新生タンパク質、具体的にはアレステン、カンス
タチンおよびタムスタチンを製造する例示的な方法が下記の実施例において示さ
れる。アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンのタンパク質はまた、トラ
ンスジェニック動物の産物として、例えば、遺伝子導入されたウシ、ヤギ、ヒツ
ジまたはブタの乳汁の成分として発現させることができ、あるいはトランスジェ
ニック植物の産物として、例えば、トウモロコシにおいてデンプン分子と結合ま
たは連結させて発現させることができる。これらの方法はまた、配列番号２、配
列番号６または配列番号１０のタンパク質の一部分を製造するために、配列番号
１、配列番号５または配列番号９の部分配列を用いて使用することができる。こ
れらの方法は、タムスタチン−３３３、タムスタチン−３３４、タムスタチン−
Ｎ５３、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３、Ｔｕｍ−４、タムスタチン−４５−１３２の
各断片、ならびにＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５およびＴ６の各ペプチドを製造
するために使用された。

【０１３５】 アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンはまた、化学合成の従来的な知
られている方法によって製造することができる。本発明のタンパク質を合成的手
段によって構築する方法は当業者には知られている。合成的に構築されたアレス
テン、カンスタチンまたはタムスタチンのタンパク質配列は、一次構造、二次構
造もしくは三次構造および／または立体配座特性を、例えば、組換え製造された
アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンと共有することにより、生物学的
活性を含む生物学的性質をそれらと同様に有することができる。従って、合成的
に構築されたアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンのタンパク質配列は
、治療化合物のスクリーニングおよび抗体を生じさせるための免疫学的プロセス
において、例えば、組換え製造および精製されたアレステンタンパク質、カンス
タチンタンパク質またはタムスタチンタンパク質の代わりになる生物学的に活性
な代用物または免疫学的代用物として用いることができる。

【０１３６】 アレステンタンパク質、カンスタチンタンパク質およびタムスタチンタンパク
質は、標準的なアッセイにおいて明らかにされるように、そして下記の実施例に
示されるように血管新生を阻害することにおいて有用である。アレステン、カン
スタチンまたはタムスタチンは、他の細胞型（例えば、非内皮細胞）の成長を阻
害しない。

【０１３７】 アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンをコードするポリヌクレオチド
は、単離されたＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーからクローン化することがで
きる。核酸およびポリペプチドは、本明細書中で「単離された」として示される
場合、（例えば、核酸の混合物で存在するか、または細胞中に存在するように）
それらが得られた生物学的供給源の物質を実質的に含まない（すなわち、そのよ
うな物質から分離された）核酸またはポリペプチドであり、これらはさらなる処
理を受けていてもよい。「単離された」核酸またはポリペプチドには、本明細書
中に記載される方法、類似する方法、または他の好適な方法によって得られる核
酸またはポリペプチドが含まれ、そして本質的に純粋な核酸またはポリペプチド
、化学合成により、化学的方法または生物学的方法の組合せにより製造された核
酸またはポリペプチド、ならびに単離されている組換え製造された核酸またはポ
リペプチドが含まれる。従って、単離されたポリペプチドは、通常の場合には伴
う他のタンパク質、炭水化物、脂質および他の細胞成分を比較的含まないポリペ
プチドを意味する。単離された核酸は、核酸が由来する生物の天然に存在するゲ
ノムにおいて核酸がじかに隣接している核酸の両方とじかに隣接していない（す
なわち、共有結合していない）。従って、この用語には、例えば、ベクター（例
えば、自律的に複製するウイルスまたはプラスミド）に取り込まれている核酸、
あるいは化学的手段または制限エンドヌクレアーゼ処理によって作製される核酸
断片などの他の核酸とは独立した別個の分子として存在する核酸が含まれる。

【０１３８】 本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質はまた、他の抗血管新生タンパク
質を単離するためのプローブを設計するために使用することができる。非常に優
れた方法が、Ｊａｃｏｂｓ他による米国特許第５，８３７，４９０号に示されて
いる（その全教示はその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。オリゴ
ヌクレオチドプローブの設計は好ましくは下記のパラメーターに従わなければな
らない：（ａ）オリゴヌクレオチドプローブは、不確かな塩基（「Ｎ」）が存在
する場合には、それらが最も少ない配列の部分領域に対して設計しなければなら
なず；そして（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブは、（それぞれのＡまたはＴに
対して２℃、そしてそれぞれのＧまたはＣに対して４℃を仮定して）約８０℃の
Ｔ_ｍを有するように設計しなければならない。

【０１３９】 オリゴヌクレオチドは、好ましくは、オリゴヌクレオチドを標識するために一
般に用いられている技術を使用して、ｇ−^３２Ｐ−ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌの比活性）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識されるだろう
。他の標識技術もまた使用することができる。取り込まれなかった標識は、好ま
しくは、ゲルろ過クロマトグラフィーまたは他の確立された方法によって除かれ
るだろう。プローブに取り込まれた放射能の量は、シンチレーションカウンター
で測定することによって定量化されるだろう。好ましくは、得られたプローブの
比活性は約４´１０^６ｄｐｍ／ｐｍｏｌになるだろう。全長型クローンのプール
を含む細菌培養物は好ましくは解凍され、そして保存物の１００μｌが、アンピ
シリンを１００μｇ／ｍｌで含有する２５ｍｌの殺菌されたＬ−ブロスを含む殺
菌された培養フラスコに接種するのに使用されるだろう。培養物は、好ましくは
、３７℃で飽和するまで生育させられ、そして飽和に達した培養物は、好ましく
は、新しいＬ−ブロスで希釈されるだろう。これらの希釈物のアリコートが、好
ましくは、３７℃で一晩生育させたときに、１５０ｍｍのペトリ皿において、１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１．５％の寒天を含有するＬ−ブロスを含
む固体の微生物学培地に約５０００個の認識可能な十分に分離されたコロニーを
生じさせる希釈および容量を決定するために平板培養されるだろう。認識可能な
十分に分離されたコロニーを得る他の知られている方法もまた用いることができ
る。

【０１４０】 その後、標準的なコロニーハイブリダイゼーション法が、コロニーをニトロセ
ルロースフィルターに移し、そしてコロニーを溶解し、変性し、ベイキンング処
理するために使用されるだろう。高ストリンジェントな条件は、少なくとも、例
えば、６５℃における１×ＳＳＣまたは４２℃における１×ＳＳＣおよび５０％
ホルムアミドと同じくらいのストリンジェントな条件である。適度なストリンジ
ェンシーの条件は、少なくとも、６５℃における４×ＳＳＣまたは４２℃におけ
る４×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドと同じくらいストリンジェントな条件で
ある。低下したストリンジェンシー条件は、少なくとも、５０℃における４×Ｓ
ＳＣまたは４０℃における６×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドと同じくらいの
ストリンジェンシーである条件である。

【０１４１】 その後、フィルターは、好ましくは、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ酵母
ＲＮＡおよび１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する６×ＳＳＣ（２０×ストック液は、
１７５．３ｇ／ｌのＮａＣｌ、８８．２ｇ／ｌのクエン酸Ｎａであり、ＮａＯＨ
でｐＨ７．０に調節される）中で穏やかに攪拌しながら６５℃で１時間インキュ
ベーションされる（１５０ｍｍのフィルター１枚あたり約１０ｍＬ）。好ましく
は、プローブは、その後、１´１０^６ｄｍｐ／ｍＬ以上の濃度でハイブリダイゼ
ーション混合物に添加される。その後、フィルターは、好ましくは、穏やかな攪
拌とともに６５℃で一晩インキュベーションされる。その後、フィルターは、好
ましくは、攪拌することなく室温において５００ｍＬの２´ＳＳＣ／０．５％Ｓ
ＤＳで洗浄され、その後、好ましくは、穏やかに振動させながら室温において５
００ｍＬの２´ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１５分間洗浄される。さらにもう１回
の洗浄が必要に応じて０．１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳを用いて６５℃で３０分
間〜１時間行われる。その後、フィルターは、好ましくは、乾燥され、Ｘ線フィ
ルムにおける陽性物を可視化するために十分な時間にわたってオートラジオグラ
フィーに供される。他の知られているハイブリダイゼーション方法もまた用いる
ことができる。その後、陽性のクローンを選び、培養で生育させて、プラスミド
ＤＮＡが、標準的な手順を使用して単離される。その後、陽性クローンは、制限
分析、ハイブリダイゼーション分析またはＤＮＡ配列決定によって確認すること
ができる。

【０１４２】 ハイブリダイゼーションに対するストリンジェンシー条件は、第１の核酸配列
が第２の核酸配列にハイブリダイゼーションすることができる温度および緩衝液
組成の条件を示し、その条件により、互いにハイブリダイゼーションするそれら
の配列間における同一性の程度が決定される。従って、「高ストリンジェンシー
条件」は、互いに非常に類似する核酸配列のみがハイブリダイゼーションするそ
のような条件である。配列が適度なストリンジェンシー条件のもとでハイブリダ
イゼーションする場合、それらの配列は互いにあまり類似していないと考えられ
る。２つの配列が低ストリンジェンシー条件のもとでハイブリダイゼーションす
るためには、さらに低い類似性が必要である。ハイブリダイゼーションが生じな
いストリンジェンシーレベルから、ハイブリダイゼーションが最初に認められる
レベルにまでハイブリダイゼーション条件を変化させることにより、所与の配列
が、それに最も類似するそのような配列にハイブリダイゼーションする条件を決
定することができる。特定のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決
定する正確な条件には、イオン強度、温度、およびホルムアミドなど脱安定化剤
の濃度だけでなく、核酸配列の長さ、それらの塩基組成、２つの配列の間におけ
るミスマッチ塩基対の割合、および他の同一でない配列内における配列の部分集
団の出現頻度（すなわち、反復の小さい領域）もまた含まれる。洗浄は、互いに
ハイブリダイゼーションする配列間の類似性の最小レベルが決定されるように条
件を設定する工程である。一般に、任意の選ばれたＳＳＣ濃度について、２つの
配列間における１％のミスマッチは、相同的なハイブリダイゼーションのみが生
じる最低温度から、融解温度（Ｔ_ｍ）の１℃の低下をもたらす。一般に、ＳＳＣ
の濃度を２倍にすると、約１７℃のＴ_ｍの上昇がもたらされる。これらの指針を
使用して、洗浄温度を、求めるミスマッチの程度に応じて経験的に決定すること
ができる。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅ
ｌ，Ｆ．Ｍ．他編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５年）
、および増補更新版）の２．１０．１頁〜２．１０．１６頁および６．３．１頁
〜６．３．６頁に説明されている。

【０１４３】 高ストリンジェンシー条件では、（１）６５℃における１×ＳＳＣ（１０×Ｓ
ＳＣ＝３ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸Ｎａ_３・２Ｈ_２Ｏ（８８ｇ／ｌ）、
１ＭのＨＣｌでｐＨを７．０にする）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）
、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、（２）４２℃におけ
る１×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／
ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、（３）６５℃における１％ウシ血清アルブミン（第
Ｖ画分）、１ｍＭのＮａ_２・ＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）
（１Ｍ ＮａＨＰＯ_４＝１リットルについて、１３４ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ _２ Ｏ、４ｍｌの８５％Ｈ_３ＰＯ_４）、７％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／
ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、（４）４２℃における５０％ホルムアミド、５×Ｓ
ＳＣ、０．０２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハルト液（１０
０×＝１０ｇのフィコール４００、１０ｇのポリビニルピロリドン、１０ｇのウ
シ血清アルブミン（第Ｖ画分）、水で５００ｍｌにする）、１０％デキストラン
硫酸、１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、（
５）６５℃における５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／
ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、または（６）４２℃における５×ＳＳＣ、５×デン
ハルト液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子
ＤＮＡのいずれかでのハイブリダイゼーションを、（１）６５℃における０．３
×ＳＳＣ〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、または（２）６５℃における１ｍ
ＭのＮａ_２ＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳのい
ずれかでの高ストリンジェンシーの洗浄とともに用いることができる。上記の条
件は５０塩基対以上のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて使用されることを目
的としている。ハイブリッドが１８塩基対未満の長さであると考えられる場合に
は、ハイブリダイゼーション温度および洗浄温度は、ハイブリッドの計算された
Ｔ_ｍの温度よりも５℃〜１０℃低くしなければならない。この場合、Ｔ_ｍ（℃の
単位で）＝（２×［Ａ塩基およびＴ塩基の数］）＋（４×［Ｇ塩基およびＣ塩基
の数］）。長さが約１８塩基対〜約４９塩基対であると考えられるハイブリッド
の場合には、Ｔ_ｍ（℃の単位で）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ_１０Ｍ）＋
０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）であり、「
Ｍ」は１価カチオン（例えば、Ｎａ^＋）のモル濃度であり、「Ｌ」は塩基対単位
のハイブリッドの長さである。

【０１４４】 中程度のストリンジェンシー条件では、（１）６５℃における４×ＳＳＣ（１
０×ＳＳＣ＝３ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸Ｎａ_３・２Ｈ_２Ｏ（８８ｇ／
ｌ）、１ＭのＨＣｌでｐＨを７．０にする）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、（２）４２℃
における４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２
ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、（３）６５℃における１％ウシ血清アルブミ
ン（第Ｖ画分）、１ｍＭのＮａ_２・ＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７
．２）（１Ｍ ＮａＨＰＯ_４＝１リットルについて、１３４ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４ ・７Ｈ_２Ｏ、４ｍｌの８５％Ｈ_３ＰＯ_４）、７％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２
ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、（４）４２℃における５０％ホルムアミド、
５×ＳＳＣ、０．０２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハルト液
（１００×＝１０ｇのフィコール４００、１０ｇのポリビニルピロリドン、１０
ｇのウシ血清アルブミン（第Ｖ画分）、水で５００ｍｌにする）、１０％デキス
トラン硫酸、１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮ
Ａ、（５）６５℃における５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、１％ＳＤＳ、１００
μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、または（６）４２℃における５×ＳＳＣ、５
×デンハルト液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性サ
ケ精子ＤＮＡのいずれかでのハイブリダイゼーションを、６５℃における１×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳの中程度のストリンジェンシーの洗浄とともに用いること
ができる。上記の条件は５０塩基対以上のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて
使用されることを目的としている。ハイブリッドが１８塩基対未満の長さである
と考えられる場合には、ハイブリダイゼーション温度および洗浄温度は、ハイブ
リッドの計算されたＴ_ｍの温度よりも５℃〜１０℃低くしなければならない。こ
の場合、Ｔ_ｍ（℃の単位で）＝（２×［Ａ塩基およびＴ塩基の数］）＋（４×［
Ｇ塩基およびＣ塩基の数］）。長さが約１８塩基対〜約４９塩基対であると考え
られるハイブリッドの場合には、Ｔ_ｍ（℃の単位で）＝（８１．５℃＋１６．６
（ｌｏｇ_１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５０
０／Ｌ）であり、「Ｍ」は１価カチオン（例えば、Ｎａ^＋）のモル濃度であり、
「Ｌ」は塩基対単位のハイブリッドの長さである。

【０１４５】 低ストリンジェンシー条件では、（１）５０℃における４×ＳＳＣ（１０×Ｓ
ＳＣ＝３ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸Ｎａ_３・２Ｈ_２Ｏ（８８ｇ／ｌ）、
１ＭのＨＣｌでｐＨを７．０にする）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）
、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、（２）４０℃におけ
る６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／
ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、（３）５０℃における１％ウシ血清アルブミン（第
Ｖ画分）、１ｍＭのＮａ_２・ＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）
（１Ｍ ＮａＨＰＯ_４＝１リットルについて、１３４ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ _２ Ｏ、４ｍｌの８５％Ｈ_３ＰＯ_４）、７％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／
ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、（４）４０℃における５０％ホルムアミド、５×Ｓ
ＳＣ、０．０２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハルト液（１０
０×＝１０ｇのフィコール４００、１０ｇのポリビニルピロリドン、１０ｇのウ
シ血清アルブミン（第Ｖ画分）、水で５００ｍｌにする）、１０％デキストラン
硫酸、１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、（
５）５０℃における５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／
ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、または（６）４０℃における５×ＳＳＣ、５×デン
ハルト液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子
ＤＮＡのいずれかでのハイブリダイゼーションを、５０℃における２×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳ、または（２）０．５％ウシ血清アルブミン（第Ｖ画分）、１ｍ
ＭのＮａ_２ＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳのい
ずれかの低ストリンジェンシーの洗浄とともに用いることができる。上記の条件
は５０塩基対以上のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて使用されることを目的
としている。ハイブリッドが１８塩基対未満の長さであると考えられる場合には
、ハイブリダイゼーション温度および洗浄温度は、ハイブリッドの計算されたＴ _ｍ の温度よりも５℃〜１０℃低くしなければならない。この場合、Ｔ_ｍ（℃の単
位で）＝（２×［Ａ塩基およびＴ塩基の数］）＋（４×［Ｇ塩基およびＣ塩基の
数］）。長さが約１８塩基対〜約４９塩基対であると考えられるハイブリッドの
場合には、Ｔ_ｍ（℃の単位で）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ_１０Ｍ）＋０
．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）であり、「Ｍ
」は１価カチオン（例えば、Ｎａ^＋）のモル濃度であり、「Ｌ」は塩基対単位の
ハイブリッドの長さである。

【０１４６】 本発明は、アレステン、カンスタチン、タムスタチン、あるいはそれらの生物
学的に活性な断片、アナログ、ホモログ、誘導体または変異体を使用して哺乳動
物の組織における血管新生を阻害する方法を含む。詳細には、本発明は、１つま
たは複数の抗血管新生タンパク質、あるいは１つまたは複数のその生物学的に活
性な断片、抗血管新生活性を有する断片の組合せ、あるいはアゴニストおよびア
ンタゴニストの有効量を用いて、血管新生により媒介される疾患を処置する方法
を含む。抗血管新生タンパク質の有効量は、疾患または症状を生じさせる血管新
生を阻害するために十分な量であり、従って、疾患または症状を完全または部分
的に緩和する。血管新生により媒介される疾患の緩和は、疾患の症候の緩和（例
えば、腫瘍サイズの低下または腫瘍成長の停止）を観測することによって決定す
ることができる。本明細書中で使用される用語「有効量」はまた、意味のある患
者利益（すなわち、関連する医学的状態の処置、治癒、防止または改善、あるい
はそのような状態の処置、治癒、防止または改善の速度の増大）を示すために十
分である組成物または方法の各有効成分の総量を意味する。組合せに適用される
場合、この用語は、組合せで、または連続的に、または同時に投与されるとして
も、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせた量をいう。血管新生により媒介
される疾患には、ガン、固形腫瘍、血管由来腫瘍（例えば、白血病）、腫瘍転移
、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、器官線維症、トラコーマ
および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、乾癬、眼の血管新生性疾患（例えば
、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障
、後水晶体線維増殖症、ルベオーシス）、オスラー・ウェバー症候群、心筋血管
新生、斑血管新生、毛細管拡張症、血友病関節、血管線維腫および創傷肉芽化が
含まれるが、これらに限定されない。抗血管新生タンパク質は、内皮細胞が過度
または異常に刺激される疾患の処置において有用である。このような疾患には、
腸癒着、クローン病、アテローム性動脈硬化症、強皮症および過形成性瘢痕（す
なわち、ケロイド）が含まれるが、これらに限定されない。抗血管新生タンパク
質は、胚着床に必要な血管新生を妨げることによって受胎調節剤として使用する
ことができる。抗血管新生タンパク質は、ネコ引っ掻き病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍ
ｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）および潰瘍（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ ｐｙ
ｌｏｒｉ）などの病理学的結果としての血管新生を有する疾患の処置において有
用である。抗血管新生タンパク質はまた、透析グラフト血管アクセス狭窄症を、
そして例えば、脂肪細胞における毛細管形成を阻害し、それによりその拡大を防
止することによって膨張を防止するために使用することができる。抗血管新生タ
ンパク質はまた、限局した（例えば、転移していない）疾患を処置するために使
用することができる。「ガン」は、新生物成長、過形成性もしくは増殖性の成長
または異常な細胞発達の病理学的状態を意味し、固形腫瘍、非固形腫瘍、および
白血病において見られる増殖などの任意の異常な細胞増殖を含む。本明細書中で
使用される「ガン」はまた、血管新生に依存するガンおよび腫瘍、すなわち、そ
の成長（容量および／または塊の拡大）のために、血液を腫瘍に供給する血管の
数および密度の増大を要求する腫瘍を意味する。「退行」は、当業者によく知ら
れている方法を使用して測定されるような腫瘍塊および腫瘍サイズの減少をいう
。

【０１４７】 あるいは、血管新生の増大が、例えば、傷の治癒または梗塞後の心臓組織にお
いて所望される場合には、抗血管新生タンパク質に対する抗体または抗血清を使
用して、局在化した本来の抗血管新生タンパク質および抗血管新生プロセスを阻
止し、それにより新しい血管の形成を増大させ、その結果、組織の萎縮を阻害す
ることができる。

【０１４８】 抗血管新生タンパク質は、疾患を処置するための他の組成物および手順と組み
合わせて使用することができる。例えば、腫瘍を、抗血管新生タンパク質と組み
合わせて、手術、放射線、化学療法または免疫療法によって従来的に処置するこ
とができ、その後、抗血管新生タンパク質を、微小転移の不活動状態を延ばすた
めに、そして何らかの残った原発性腫瘍の成長を安定化させ、かつ阻害するため
に患者に引き続き投与することができる。抗血管新生タンパク質、あるいはその
断片、抗血清、受容体アゴニストまたは受容体アンタゴニスト、あるいはそれら
の組合せもまた、他の抗血管形成性の化合物、あるいは他の抗血管新生タンパク
質（例えば、アンギオスタチン、エンドスタチン）のタンパク質、断片、抗血清
、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニストと組み合わせることができる。また
、抗血管新生タンパク質、あるいはその断片、抗血清、受容体アゴニスト、受容
体アンタゴニスト、あるいはそれらの組合せは、治療用組成物を作製するために
、薬学的に受容可能な賦形剤および必要に応じて持続放出マトリックス（生分解
性ポリマーなど）と組み合わせられる。本発明の組成物はまた、他の抗血管新生
のタンパク質または化学化合物（エンドスタチンまたはアンギオスタチン、なら
びにそれらの変異体、断片およびアナログなど）を含むことができる。本発明の
組成物は、タンパク質の活性を増強するか、あるいは処置におけるその活性また
は使用を補う他の薬剤（化学療法剤または放射活性剤など）をさらに含むことが
できる。そのようなさらなる因子および／または薬剤は、本発明のタンパク質と
の相乗効果を生じさせるか、または副作用を最小限にするために組成物に含める
ことができる。また、本発明の組成物の投与は、他の治療と同時に施すことがで
き、例えば、化学療法または放射線療法の治療法と一緒に施すことができる。

【０１４９】 本発明は、本発明のタンパク質を含む組成物と組織とを接触させることによっ
て哺乳動物（例えば、ヒト）の組織における血管新生を阻害する方法を含む。「
接触」により、局所的な適用だけでなく、組成物を組織または組織の細胞に導入
するそのような送達様式もまた意味される。

【０１５０】 徐放性または持続放出性の送達システムの使用もまた本発明に含まれる。その
ようなシステムは、手術が困難であるか、または不可能である状況では非常に望
ましい。例えば、年齢または疾患経過そのものにより衰弱している患者、あるい
は危険性−受益性分析により、治療を越える抑制が指示される場合である。

【０１５１】 本明細書中で使用される持続放出マトリックスは、酵素的加水分解または酸／
塩基加水分解によって、あるいは溶解によって分解し得る様々な物質（通常的に
はポリマー）から製造されるマトリックスである。体内に挿入されると、マトリ
ックスは酵素および体液によって作用を受ける。持続放出マトリックスは、望ま
しくは、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール
酸のポリマー）、ポリラクチド−コ−グリコリド（乳酸およびグリコール酸のコ
ポリマー）ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリタンパク質、ヒアルロン
酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、
核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンな
ど）、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよび
シリコーンなどの生体適合性物質から選ばれる。好ましい生分解性マトリックス
は、ポリラクチド、ポリグリコリドまたはポリラクチド−コ−グリコリド（乳酸
およびグリコール酸のコポリマー）のいずれかのマトリックスである。

【０１５２】 本発明の血管新生調節組成物は、固体、液体またはエアロゾルであってもよく
、任意の知られている投与経路によって投与することができる。固体の組成物の
例には、ピル、クリームおよび移植可能な投薬ユニットが含まれる。ピルは経口
投与することができ、治療用クリームは局所投与することができる。移植可能な
投薬ユニットは、例えば腫瘍部位に局所投与することができ、または血管新生調
節組成物を全身的に放出させるために、例えば、皮下に埋め込むことができる。
液体の組成物の例には、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射に適合した配合物、
ならびに局所的および眼内に投与される配合物が含まれる。エアロゾル配合物の
例には、肺に投与するための吸入器用配合物が含まれる。

【０１５３】 上記に記載される抗血管新生活性を有するタンパク質およびタンパク質断片は
、当業者に知られている配合方法を使用して、薬学的に受容可能な配合物におい
て、単離され、かつ実質的に精製されたタンパク質およびタンパク質断片として
提供され得る。このような配合物は標準的な経路によって投与することができる
。一般に、配合物は、局所的、経皮的、腹腔内、頭蓋内、脳室内、大脳内、膣内
、子宮内、経口、直腸的または非経口的（例えば、静脈内、髄腔内、皮下または
筋肉内）の経路によって投与することができる。また、抗血管新生タンパク質は
、化合物の持続的な放出を可能にする生分解性ポリマーに混入することができる
。この場合、ポリマーは、薬物の送達が所望される部位の近傍に、例えば、腫瘍
の部位に埋め込まれるか、または抗血管新生タンパク質がゆっくり全身的に放出
されるように埋め込まれる。浸透圧ミニポンプもまた、高濃度の抗血管新生タン
パク質の制御された送達を、カニューレを介して、目的とする部位内に、例えば
、転移成長物内またはその腫瘍への血管供給物内に直接行うために使用すること
ができる。生分解性ポリマーおよびその使用は、例えば、Ｂｒｅｍ他（１９９１
、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：４４１〜４４６）に詳しく記載されている（
これはその全体が参考として本明細書に組み込まれる）。

【０１５４】 本発明のポリペプチドを含有する組成物は、例えば単位用量の注射によって、
静脈内投与することができる。本発明の治療用組成物に関連して使用する場合の
用語「単位用量」は、被験者のための単位用量として適切な物理的に別個の単位
を意味しており、各単位は必要な希釈液；すなわち担体または賦形剤に関連して
望ましい治療効果を作り出すために計算された規定量の有効物質を含有する。

【０１５５】 本発明の組成物の投与様式は、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨内、皮下および関
節内注射および注入を含む。非経口注射用の医薬組成物は、薬学的に許容できる
無菌水性もしくは非水性溶液、分散剤、懸濁液もしくは乳濁液並びに使用直前に
無菌注射溶液または分散剤へ復元するための無菌粉末を備える。適切な水性およ
び非水性担体、希釈液、溶剤または賦形剤の例には、水、エタノール、ポリオー
ル類（例、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールその
他）、カルボキシメチルセルロースおよび適切なその他の混合液、植物油（例、
オリーブ油）および例えばオレイン酸エチルのような注射用有機エステル類が含
まれる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティング剤の使用によっ
て、分散剤の場合には必要な粒径の保持によって、および界面活性剤の使用によ
って維持することができる。これらの組成物は、さらに例えば防腐剤、湿潤剤、
乳化剤および分散剤のような補助剤も含有することができる。微生物の作用の予
防は、例えばパラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノールその他のよう
な様々な抗菌剤および抗真菌剤を包含することによって保証できる。さらにまた
、例えば糖、塩化ナトリウム等のような等張性物質を含めることが望ましいこと
もある。注射用製剤形態の長時間吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム
およびゼラチンのような吸収を遅延させる剤を含めることによって引き起こすこ
とができる。注射用デポー剤（depot form）は、ポリラクチド−ポリグリコリド
、ポリ（オルトエステル）およびポリ（アンヒドリド）のような生物分解性ポリ
マー中に薬剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製する
。薬物対ポリマーの比率および使用する特定ポリマーの性質に依存して、薬物放
出速度を制御することができる。デポー注射用調製物は、さらに身体組織と適合
するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を取り込むことによって調
製される。注射用調製物は、例えば細菌捕集フィルターを通しての濾過または使
用直前に無菌水または他の無菌注射用溶剤中へ溶解または分散させることのでき
る無菌固形組成物の形態で殺菌剤を組み込むことによって殺菌することができる
。

【０１５６】 本発明の治療用組成物は、例えば無機酸または有機酸に由来してもよい組成物
の薬学的に許容できる塩をその中に含むことができる。“薬学的に許容できる塩
”とは、信頼できる薬学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応
その他を有していないヒトおよび下等動物の組織と接触させて使用するために適
合し、さらに合理的なベネフィット／リスク比と釣り合いが取れる塩類を意味す
る。薬学的に許容できる塩は、当分野においてよく知られている。例えば、Ｓ．
Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、参照して本明細書に組み込まれるＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１（以下参照）に薬学的に許
容できる塩を詳細に記述している。薬学的に許容できる塩には、例えば塩化水素
酸もしくはリン酸のような無機酸、または例えば酢酸、酒石酸、マンデル酸その
他のような有機酸を用いて形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基を
用いて形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、
例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第二鉄
のような無機塩基および例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エ
チルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインその他のような有機塩基に由来
し得る。これらの塩は、本発明の化合物の最終単離および精製中にｉｎ ｓｉｔ
ｕ（本来の場所）で、または遊離塩基性官能基を適切な有機酸と反応させること
によって個別に調製することができる。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピ
ン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼン
スルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸
塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩
、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシメタンスルホン酸塩
（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸
塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモエート、ペクチン酸塩、過
硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオ
ン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、
重炭酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびウンデカン酸塩が含まれるが、それ
らに限定されない。さらに、塩基性窒素含有基は、例えばメチル、エチル、プロ
ピルおよびブチル塩化物、臭化物およびヨウ化物のような低級アルキルハロゲン
化物；ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミル硫酸塩のようなジアルキル
硫酸塩；例えばデシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリル塩化物、臭化物
およびヨウ化物のような長鎖ハロゲン化物；ベンジルおよびフェネチル臭化物お
よびその他のようなアリルアルキルハロゲン化物のような剤を用いて四元化(qua
ternize)することもできる。水溶性もしくは油溶性または分散性生成物がこれに
より入手される。薬学的に許容できる酸付加塩を形成するために使用できる酸の
例には、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸のような無機酸並びにシュ
ウ酸、マレイン酸、コハク酸およびクエン酸のような有機酸が含まれる。

【０１５７】 ここで使用する用語「薬学的に許容できる」、「生理的に容認できる」、およ
びそれらの文法的変形は、それらが組成物、担体、希釈液および試薬に関する限
り、置き換え可能に使用され、さらに例えば悪心、眩暈、異常亢進その他の望ま
しくない生理的作用を最小限に抑えてそれらの物質を哺乳動物へ投与できること
を意味する。その中に溶解または分散された有効成分を含有する医薬組成物の調
製は、当該分野ではよく理解されており、処方書に基づいて限定する必要はない
。典型的には、そのような組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとしての注射
可能物質として調製できるが、液状で使用する前に溶液または懸濁液のために適
切な固体形もまた調製できる。この調製物は乳化することもできる。

【０１５８】 有効成分は、薬学的に許容でき、その有効成分と適合する賦形剤と、本明細書
に記載した治療方法で使用するために適切な量で混合できる。適切な賦形剤には
、例えば水、食塩液、ブドウ糖、グリセロール、エタノールその他およびそれら
の組み合わせが含まれる。さらに、必要であれば、その組成物は有効成分の有効
性を強化する例えば湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝液その他のようなわずかな
量の補助物質を含有できる。

【０１５９】 本発明の抗血管新生タンパク質は、プロドラッグを備える組成物中に含めるこ
ともできる。ここで使用する用語「プロドラッグ」とは、例えば血液中の酵素加
水分解によって親化合物を産生させるためにインビボで急速に転換される化合物
を意味する。完全な考察は、どちらも参照してここに組み込まれるＴ．Ｈｉｇｕ
ｃｈｉ ａｎｄ Ｖ． Ｓｔｅｌｌａ， Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ
Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（新規薬物送達システムとしてのプロドラ
ッグ）， Ｖｏｌ．１４ ｏｆ ｔｈｅ ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ
ｉｅｓおよびＥｄｗａｒｄ Ｂ． Ｒｏｃｈｅ編， Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌ
ｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（ドラッグデザインにお
ける生体内可逆性担体）， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｍａｇｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８
７の中に提供されている。本明細書で使用する用語「薬学的に許容できるプロド
ラッグ」とは、（１）信頼できる薬学的判断の範囲内で過度の毒性、刺激、アレ
ルギー反応等を有していないヒトおよび動物の組織と接触させて使用するために
適合し、合理的なベネフィット／リスク比と釣り合いが取れており、さらにそれ
らの使用目的のために有効である、および（２）可能な場合には親化合物の両性
イオン形である本発明の化合物のプロドラッグ類を意味する。

【０１６０】 本発明の抗血管新生タンパク質の用量は、治療される疾患状態または状況およ
び例えばヒトもしくは動物の体重および状態のような他の臨床的要素および化合
物の投与経路に左右されるであろう。ヒトまたは動物を治療するためには、約１
０ｍｇ／ｋｇ（体重）から約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）のタンパク質を投与するこ
とができる。例えば本発明のタンパク質と放射線療法、化学療法または免疫療法
と組み合わせた併用療法では、用量を約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約０．２ｍ
ｇ／ｋｇ（体重）へ低減することが可能である。特定の動物またはヒトにおいて
は、抗血管新生タンパク質の半減期に依存して、抗血管新生タンパク質は１日あ
たり数回から週１回の間で投与することができる。本発明は、ヒトおよび獣医学
的使用のための用途を有すると理解されなければならない。本発明の方法は、同
時または長期間に渡ってのどちらかで投与される単回並びに複数回の投与を予期
している。さらに、抗血管新生タンパク質は、例えば化学療法、放射線療法また
は免疫療法のような他の形態の療法と併せて投与することができる。

【０１６１】 抗血管新生タンパク質調製物には、経口、直腸内、眼科用（硝子体内または眼
房内を含む）、鼻内、局所（口腔内および舌下を含む）、子宮内、膣内または非
経口（皮下、腹腔内、筋内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内および硬膜外を含む
）投与のために適合する調製物が含まれる。抗血管新生タンパク質調製物は、好
都合にも単位剤形で表わすことができ、従来型の製薬学的方法によって調製でき
る。そのような方法は、有効成分と１つ以上の薬学的担体類または１つ以上の賦
形剤類とを組み合せるステップを含む。一般に、調製物は有効成分を液状担体類
または微細に分割された固形担体類あるいはその両方と一様かつ緊密に組み合せ
ることによって、およびその後、必要であればその生成物を成形することによっ
て調製される。

【０１６２】 非経口投与のために適合する調製物には、その調製物を所定の受容者の血液と
等張性にする抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および溶質を含むことができる水性およ
び非水性無菌注射用溶液；および懸濁剤および増粘剤を含むことができる水性お
よび非水性無菌懸濁液が含まれる。調製物は、例えば密封アンプルおよびバイア
ルのような単回投与または複数回投与容器で提供することができ、使用の直前に
例えば注射用水のような無菌液状担体の添加だけを必要とするフリーズドライ（
凍結乾燥）条件で保管することができる。即時注射溶液および懸濁液は、上記で
説明したような種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製できる。

【０１６３】 本発明の有効量のタンパク質を経口投与する場合には、本発明の抗血管新生タ
ンパク質は錠剤、カプセル剤、粉末、溶液またはエリキシル剤の形状であろう。
錠剤形態で投与する場合は、本発明の医薬組成物はさらに例えばゼラチンまたは
補助剤のような固形担体を含有することができる。錠剤、カプセル剤および粉末
は、約５〜９５％の本発明のタンパク質、および好ましくは約２５〜９０％の本
発明のタンパク質を含有する。液状形態で投与する場合は、例えば水、石油、動
物油または例えばピーナッツ油、鉱油、大豆油、ゴマ油のような植物起源の油も
しくは合成油のような液状担体を添加することができる。液状形態の医薬組成物
は、さらに生理的食塩溶液、ブドウ糖もしくはその他の糖類溶液、またはエチレ
ングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのような
グリコール類を含むことができる。液状形態で投与する場合は、医薬組成物は約
０．５〜９０重量％の本発明のタンパク質、および好ましくは約１〜５０重量％
の本発明のタンパク質を含有する。

【０１６４】 有効量の本発明のタンパク質を静脈内、皮内または皮下注射によって投与する
場合は、本発明のタンパク質は発熱物質を含まない、非経口的に許容できる水溶
液の形状であろう。ｐＨ、等張性、安定性その他を十分に顧慮して、そのような
非経口的に許容できるタンパク質溶液の調製物は、当分野の技術の範囲内に含ま
れる。静脈内、皮内、または皮下注射のための好ましい医薬組成物は、本発明の
タンパク質に加えて、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、ブドウ糖
注射液、ブドウ糖および塩化ナトリウム注射液、乳酸化リンガー注射液のような
等張性賦形剤、または当該分野において知られている他の賦形剤を含むことがで
きる。本発明の医薬組成物はさらに、安定剤、防腐剤、緩衝剤、抗酸化剤または
当業者に知られている他の添加物も含むことができる。

【０１６５】 本発明の医薬組成物中の本発明のタンパク質の量は、治療を受ける状態の性質
および重症度、さらにその患者が受けてきた以前の治療法の性質に左右されるで
あろう。最終的には、主治医がそれを用いて個々の各患者を治療するための本発
明のタンパク質の量を決定するであろう。最初は、主治医は低用量の本発明のタ
ンパク質を投与し、患者の反応を観察するであろう。その患者にとっての最適治
療効果が入手されるまでより高用量の本発明のタンパク質を投与することができ
、その時点以降は用量はそれ以上増加させられない。

【０１６６】 本発明の医薬組成物を使用する静脈内療法の治療期間は、治療される疾患の重
症度および個々の各患者個人の状態および潜在的特異体質的反応に左右されるで
あろう。本発明のタンパク質の各投与の期間は１２〜２４時間の持続的静脈内投
与の範囲内であることが予期されている。最終的には、主治医が本発明の医薬組
成物を使用する静脈内療法の適切な期間を決定するであろう。

【０１６７】 好ましい単位用量調製物は、投与される成分の１日量もしくは１日単位、１日
細分用量、またはそれらの適切なフラクションを含有する調製物である。特に上
記で言及した成分に加えて、本発明の調製物は問題のタイプの調製物を考慮して
当分野において慣習的な他の物質を含むことができると理解しなければならない
。任意で、患者へ二重療法を提供するために、細胞毒性物質を抗血管新生タンパ
ク質、またはそれらの生物学的に機能的なタンパク質断片を組み込む、またはさ
もなければそれらと結合することができる。

【０１６８】 本治療用組成物は、さらに現在では獣医学的適用も可能である。ヒトに加えて
、特に家畜およびサラブレッド系統の馬は本発明のタンパク質を用いたそのよう
な治療にとって望ましい患者である。

【０１６９】 リシンのような細胞毒性物質は、抗血管新生タンパク質およびそれらの断片と
結合することができ、それによって抗血管新生タンパク質に結合する細胞を破壊
するためのツールを提供する。これらの細胞は、微小癌組織の転移および原発性
腫瘍を含むがそれらに限定されない多数の場所で発見される可能性がある。細胞
毒性物質へ結合されたタンパク質は望ましい場所への送達を最大限にするために
デザインされた方法で融合させられる。例えば、リシン結合高親和性断片はカニ
ューレを通して標的部位へ供している血管または標的内へ直接に送達される。そ
のような物質は、さらにまた注入用カニューレへ接続された浸透圧ポンプを通し
て制御された方法で送達される。抗血管新生タンパク質とのアンタゴニストの組
み合わせは組織の血管新生(vascularization)を増加させるために血管新生(angi
ogenesis)の刺激物質と一緒に併用投与することができる。この治療法は転移性
癌を破壊する有効な手段を提供する。

【０１７０】 追加の治療方法には、細胞毒性物質へ結合させた抗血管新生タンパク質、断片
、アナログ、抗血清、またはレセプターアゴニストおよびそれらのアンタゴニス
トの投与が含まれる。抗血管新生タンパク質はヒト起源または動物起源であって
よいと理解しなければならない。抗血管新生タンパク質は、さらにまた化学反応
または発現系と結び付けた組換え法によって合成により作製することもできる。
抗血管新生タンパク質は、抗血管新生活性を有するタンパク質を生成するために
単離されたＩＶ型コラーゲンを酵素的に開裂させることによって作製することも
できる。抗血管新生タンパク質は、さらにまたＩＶ型コラーゲンを抗血管新生タ
ンパク質へ開裂する内因性酵素の作用を模倣する化合物によって作製することも
できる。抗血管新生タンパク質の産生は、開裂酵素の活性に影響を及ぼす化合物
によって調節することもできる。

【０１７１】 本発明は、さらにまた遺伝子療法を包含し、それによって抗血管新生タンパク
質、インテグリン、インテグリンサブユニット、またはそれらの突然変異体、断
片もしくは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが患者に導入かつ調節
される。あるいはまた遺伝子療法と呼ばれる、遺伝子産物タンパク質を発現させ
るためにＤＮＡを細胞へ導入または送達する様々な方法は、これにより参照して
本明細書に組み込まれるＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌ
ｉａｎ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ（インビボでの哺乳動物
体細胞内への遺伝子導入）， Ｎ． Ｙａｎｇ（１９９２） Ｃｒｉｔ． Ｒｅ
ｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎ． １２（４）：３３５−３５６に開示されている。遺
伝子療法は、エキソビボまたはインビボ療法のいずれかで使用するための体細胞
内または生殖系細胞内へのＤＮＡ配列の導入を含有している。遺伝子療法は遺伝
子を置換する、正常または異常遺伝子機能を強化する、および感染性疾患および
その他の病状と戦うために機能する。

【０１７２】 これらの医学的問題を遺伝子療法を用いて治療するための方法には、例えば欠
陥遺伝子を同定してその後欠陥遺伝子の機能を置換するためまたは極めて機能性
の低い遺伝子を増強するために機能的遺伝子を添加するような治療方法；または
その状態を治療するまたは組織もしくは器官を治療法に対してより感受性にする
遺伝子産物タンパク質に対して遺伝子を添加することのような予防方法が含まれ
る。予防方法の例としては、１種以上の抗血管新生タンパク質をコードする遺伝
子を患者の体内に挿入し、従って血管新生の発生を予防することができる；また
は腫瘍細胞を放射線に対してより感受性にさせる遺伝子を挿入することができる
ので、従って腫瘍への放射線は腫瘍細胞の死滅の増加を誘発するであろう。

【０１７３】 抗血管新生タンパク質のＤＮＡまたは調節配列を導入するための多数のプロト
コールは本発明において予見されている。特に抗血管新生タンパク質と関連して
通常発見されるもの以外のプロモーター配列のトランスフェクション、または抗
血管新生タンパク質の産生を増加させるであろう他の配列のトランスフェクショ
ンもまた、遺伝子療法の方法として予見されている。この技術の１つの例は、細
胞中のエリスロポエチン遺伝子を刺激する「遺伝子スイッチ」を挿入するために
相同的組み換えを使用するマサチューセッツ州ケンブリッジのＴｒａｎｓｋａｒ
ｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， Ｉｎｃ．において所見される。１９９４年
４月１５日付けのＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓを参照。
そのような「遺伝子スイッチ」は、通常はそれらのタンパク質（またはレセプタ
ー）を発現しない細胞中で抗血管新生タンパク質（またはそれらのレセプター）
を活性化するために使用できるであろう。

【０１７４】 遺伝子療法のための遺伝子導入法は、３つの広範囲のカテゴリーに分類される
：物理的（例、エレクトロポレーション、直接遺伝子導入および粒子衝撃）、化
学的（例、脂質を主成分とする担体類、または他の非ウイルスベクター類）およ
び生物学的（例、ウイルス由来ベクターおよびレセプター取込み）。例えば、Ｄ
ＮＡを用いてコーティングされたリポソームを含む非ウイルスベクターを使用す
ることができる。そのようなリポソーム／ＤＮＡ複合体は患者の静脈内へ直接注
射することができる。リポソーム／ＤＮＡ複合体は、それらがＤＮＡをマクロフ
ァージおよびクッパー細胞へ送達する肝臓で濃縮される。これらの細胞は寿命が
長いので、送達されたＤＮＡの長期間の発現を提供する。さらに、遺伝子のベク
ター類または“裸の”ＤＮＡは治療用ＤＮＡの目標とする送達のために望ましい
器官、組織もしくは腫瘍内へ直接に注射することができる。

【０１７５】 遺伝子療法の方法は、さらにまた送達部位によって説明することもできる。遺
伝子を送達する基本的な方法には、エキソビボ遺伝子導入、インビボ遺伝子導入
、およびインビトロ遺伝子導入が含まれる。エキソビボ遺伝子導入では、細胞が
患者から採取され、細胞培養中で増殖させられる。ＤＮＡは細胞内にトランスフ
ェクトされ、トランスフェクトされた細胞は数が増えた後、患者に再移植される
。インビトロ遺伝子導入では、形質転換された細胞は例えば組織培養細胞のよう
な培養中で増殖する細胞であり、特定の患者からの特定の細胞ではない。これら
の“実験用細胞”はトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞が選択
され、患者への移植するためまたは他の使用のために増大される。

【０１７６】 インビボ遺伝子導入は、細胞が患者の体内にある場合にＤＮＡを患者の細胞内
へ導入する工程を含む。この方法は、患者に遺伝子を送達するために非感染性ウ
イルスを使用して、または裸のＤＮＡを患者の体内の部位に注射することでウイ
ルス媒介性遺伝子導入を使用する工程を含んでおり、ＤＮＡは、遺伝子産物タン
パク質が発現される細胞の割合まで取り込まれる。さらに、例えば“遺伝子銃”
の使用のような本明細書で記載する他の方法もＤＮＡ、または抗血管新生タンパ
ク質の産生を調節する調節配列のインビトロ挿入のために使用することができる
。

【０１７７】 遺伝子療法の化学的方法は、細胞膜を越えてＤＮＡを輸送するために、必ずし
もリポソームではない脂質系化合物を含むことができる。負荷電ＤＮＡに結合す
る脂質系陽イオンであるリポフェクチンまたはサイトフェクチンは、細胞膜を越
えることのできる複合体を作製し、ＤＮＡをその細胞の内部へ提供する。別の化
学的方法は、レセプターに基づくエンドサイトーシスを使用するが、これは細胞
表面レセプターへ特異的リガンドを結合させる工程とそれを包んで細胞膜を越え
て輸送する工程とを含んでいる。リガンドはＤＮＡへ結合し、複合体全体が細胞
内へ輸送される。リガンド遺伝子複合体は血流内へ注射され、その後レセプター
を有する標的細胞は特異的にそのリガンドに結合してリガンド−ＤＮＡ複合体を
細胞内へ輸送するであろう。

【０１７８】 数多くの遺伝子療法の方法論は、遺伝子を細胞内へ挿入するためにウイルスベ
クターを使用する。例えば、エキソビボ方法では遺伝子を末梢および腫瘍浸潤リ
ンパ球、肝細胞、表皮細胞、ミオサイト、またはその他の体細胞内へ導入するた
めに改変レトロウイルスベクターが使用されてきた。これらの改変細胞はその後
挿入されたＤＮＡからの遺伝子産物を提供するために患者の体内へ導入される。

【０１７９】 ウイルスベクターは、さらにまたインビボプロトコールを使用して細胞内へ遺
伝子を挿入するためにも使用されてきた。異種遺伝子(foreign gene)の組織特異
的発現を指示するためには、組織特異的であることが知られているシス作用性調
節要素またはプロモーターを使用することができる。あるいはまた、これはイン
ビボでの特異的解剖学的部位へのＤＮＡまたはウイルスベクターのｉｎ ｓｉｔ
ｕ送達を使用して達成できる。例えばインビボでの血管への遺伝子導入は、動脈
壁上の選択された部位にインビトロで形質導入された内皮細胞を移植することに
よって達成された。ウイルスは周囲細胞に感染し、これらも遺伝子産物を発現し
た。ウイルスベクターは、例えばカテーテルによってインビボ部位へ直接に送達
できるので、従ってある領域だけをウイルスに感染させることができ、さらに長
期間の部位特異的遺伝子発現を提供する。レトロウイルスベクターを使用したイ
ンビボ遺伝子導入は、器官につながる血管内への変化したウイルスの注射によっ
て哺乳動物組織および肝組織においても証明されている。

【０１８０】 遺伝子療法プロトコールのために使用されてきたウイルスベクターには、レト
ロウイルス、例えばポリオウイルスもしくはシンドビスウイルスのような他のＲ
ＮＡウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ
４０、ワクシニアおよびその他のＤＮＡウイルスが含まれるが、それらに限定さ
れない。複製欠陥マウスレトロウイルスベクターは、最も広範囲に利用される遺
伝子導入ベクターである。マウス白血病レトロウイルスは、タンパク質コア（ｇ
ａｇ）によって包まれて宿主域を決定する糖タンパク質エンベロープ（ｅｎｖ）
によって取り囲まれている、核コアタンパク質およびポリメラーゼ（ｐｏｌ）酵
素と複合体化された一本鎖ＲＮＡから構成される。レトロウイルスのゲノム構造
は、５’および３’長末端反復（ＬＴＲ）によって封入されたｇａｇ、ｐｏｌお
よびｅｎｖ遺伝子を含んでいる。レトロウイルスベクター系は、ウイルス構造タ
ンパク質がパッケージング細胞系内でのトランスにおいて供給されることを条件
に、５’および３’ＬＴＲ並びにパッケージングシグナルを含有する最小ベクタ
ーがベクターのパッケージング、感染および標的細胞内への組込みを許容するの
に十分であるという事実を活用している。遺伝子導入にとってのレトロウイルス
ベクターの基本的長所には、ほとんどの細胞型における効率的な感染および遺伝
子発現、標的細胞染色体ＤＮＡ内への正確な単一コピーベクターの組込み、およ
びレトロウイルスゲノムの取り扱いの容易さが含まれる。

【０１８１】 アデノウイルスは、コアタンパク質と複合体化され、カプシドタンパク質に取
り囲まれた直鎖状二本鎖ＤＮＡから構成される。分子ウイルス学における進歩に
よって、これらの微生物の生物学を活用してインビボで標的細胞内へ新規遺伝子
配列を形質導入することのできるベクターを作製する能力が導かれてきた。アデ
ノウイルス系ベクターは高レベルで遺伝子産物タンパク質を発現するであろう。
アデノウイルスベクターは、低力価のウイルスを用いた場合でさえ、高効率の感
染性を有する。さらに、このウイルスは無細胞ビリオンとして十分に感染性であ
るので、プロデューサー細胞系の注射を必要としない。アデノウイルスベクター
にとってのもう１つの潜在的長所は、インビボでの異種遺伝子の長期発現を達成
する能力である。

【０１８２】 ＤＮＡ送達の機械的方法には、リポソームやその他の膜融合のための小胞のよ
うな融合誘導性脂質小胞、リポフェクチンのようなカチオン性脂質を取り込んで
いるＤＮＡの脂質粒子、ＤＮＡのポリリシン媒介性導入、胚細胞もしくは体細胞
内へのＤＮＡのマイクロインジェクション法のようなＤＮＡの直接注射、“遺伝
子銃”で使用される金粒子のような空気式で送達されるＤＮＡコーティング粒子
およびリン酸カルシウムトランスフェクションのような無機化学的アプローチが
含まれる。粒子媒介性遺伝子導入法は植物組織を形質転換させる際に最初に使用
された。粒子衝撃装置、もしくは“遺伝子銃”を用いると、ＤＮＡコーティング
高密度粒子（例、金またはタングステン）を標的器官、組織または細胞へ浸透で
きる高速度にまで加速するための推進力が生じる。粒子衝撃法は、インビトロシ
ステムにおいて、またはエキソビボもしくはインビボ法と一緒にＤＮＡを細胞、
組織または器官内へ導入するために使用できる。また別の方法であるリガンド媒
介性遺伝子療法には、ＤＮＡを特異的リガンドと複合させてリガンド−ＤＮＡ抱
合体を形成させてＤＮＡを特定の細胞または組織へ指向することが含まれる。

【０１８３】 プラスミドＤＮＡを筋細胞内へ注入するとトランスフェクトされてマーカー遺
伝子の持続的発現を有する細胞が高いパーセンテージで産生することが発見され
ている。プラスミドのＤＮＡは細胞のゲノム内に組み込まれる場合も組み込まれ
ない場合もある。トランスフェクトされたＤＮＡの非組込みは、細胞またはミト
コンドリアゲノムにおける突然変異による挿入、欠失または変化が発生する恐れ
を伴わずに長期間に渡って最終分化した非増殖性組織中の遺伝子産物タンパク質
のトランスフェクションおよび発現を可能にするであろう。長期間の、しかし必
ずしも永久的ではない特定細胞内への治療的遺伝子の導入は遺伝性疾患または予
防的使用のための治療を提供しうる。ＤＮＡは、受容細胞のゲノム内で突然変異
を発生させることなく遺伝子産物レベルを維持するために定期的に再注入するこ
とができるだろう。外因性ＤＮＡの非組込みは、様々な遺伝子産物を発現するす
べての構成物を含む１個の細胞内に数種の外因性ＤＮＡ構成物の存在を許容する
ことができる。

【０１８４】 遺伝子導入のためのエレクトロポレーションは、細胞または組織がエレクトロ
ポレーション媒介性遺伝子導入に対して感受性にするために電流を使用する。所
定の電界強さを備えた短い電気インパルスを使用して、ＤＮＡ分子が細胞内に浸
透できるような方法で膜の透過性を上昇する。この方法は、ＤＮＡを細胞、組織
または器官内へ導入するためにインビトロシステムで、またはエキソビボ法もし
くはインビボ法と一緒に使用することができる。

【０１８５】 異種ＤＮＡを細胞内へトランスフェクトするためには、インビボでの担体媒介
性遺伝子導入を使用できる。担体−ＤＮＡ複合体は体液または血流内へ好都合に
導入して、その後部位特異的に身体内の標的器官または組織へ差し向けることが
できる。例えばポリリシン、リポフェクチンまたはサイトフェクチンのようなリ
ポソームおよびポリカチオンはどちらも使用できる。細胞特異的または器官特異
的であるリポソームを発生させることができるので、従ってリポソームによって
運ばれる異種ＤＮＡは標的細胞によって取り込まれるであろう。ある細胞上の特
異的レセプターを標的とするイムノリポソーム類の注射は、そのレセプターを有
する細胞内へＤＮＡを挿入する便宜的な方法として使用できる。これまでに使用
されてきたもう１つの担体系は、インビボ遺伝子導入のためにＤＮＡを肝細胞へ
輸送するためのアシアロ糖タンパク質／ポリリシン抱合体系である。

【０１８６】 トランスフェクトされたＤＮＡは、さらにまたそのＤＮＡが受容細胞へ輸送さ
れ、その後細胞質または核質内に残るように他の種類の担体と複合させることも
できる。ＤＮＡは、特別に人工的に作り出された小胞複合体内の担体核タンパク
質へ結合させ、その核内へ直接に輸送することができる。

【０１８７】 抗血管新生タンパク質の遺伝子調節は、転写もしくは翻訳の速度を修飾するた
めに抗血管新生タンパク質、またはその遺伝子と関連する調節領域、または対応
するＲＮＡ転写体の１つをコードする遺伝子へ結合する化合物を投与することに
よって遂行することができる。さらに、抗血管新生タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列を用いてトランスフェクトされた細胞は、それらのタンパク質のインビボ
源を提供するために患者へ投与することができる。例えば、細胞は抗血管新生タ
ンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターを用いてトランスフェクトす
ることができる。トランスフェクトされる細胞は、患者の正常組織、患者の疾患
組織に由来する細胞であっても、非患者細胞であってもよい。

【０１８８】 例えば、患者から取り出された腫瘍細胞は、本発明のタンパク質を発現するこ
とのできるベクターを用いてトランスフェクトし、その患者の体内へ再導入する
ことができる。トランスフェクトされた腫瘍細胞は、その患者の体内で腫瘍の増
殖を阻害するレベルのタンパク質を産生する。患者はヒトであってもヒトではな
い動物であってもよい。細胞はさらにまた、非ベクターによって、または例えば
エレクトロポレーション、イオノポレーション(ionoporation)のような当分野に
おいて知られている物理的もしくは化学的方法によって、または“遺伝子銃”に
よってトランスフェクトすることもできる。さらに、ＤＮＡは担体を利用せずに
患者の体内に直接注射することもできる。特に、ＤＮＡは皮膚、筋肉または血液
内へ注射することができる。

【０１８９】 抗血管新生タンパク質を患者の体内へトランスフェクトするための遺伝子療法
プロトコールは、細胞のゲノム内、微小染色体内への抗血管新生タンパク質ＤＮ
Ａの取込みを通しても、または細胞の細胞質または核質内の個別複製もしくは非
複製ＤＮＡ構成物としてのどちらであってもよい。抗血管新生タンパク質の発現
は、細胞、組織もしくはまたは器官内の望ましい１つ以上のタンパク質レベルま
たは特定の血中レベルを維持するために長期間に渡って持続しても、または定期
的に再注射されてもよい。

【０１９０】 さらに、本発明は、新規の抗血管新生タンパク質を試験するために使用でき、
さらに血管新生活性もしくはそれの欠如を特徴とする、またはそれに関連する疾
患および病状の診断、予後診断または治療においても使用できる抗体および抗血
清を含んでいる。そのような抗体および抗血清は、さらにまた例えば心筋梗塞後
心臓組織におけるような望ましい場合に血管新生をアップレギュレーションする
ために使用でき、本発明のタンパク質に対する抗体または抗血清は局所的天然抗
血管新生タンパク質およびプロセスをブロックし、新規の血管形成を増加させ、
さらに心臓組織の萎縮を阻害するために使用できる。

【０１９１】 そのような抗体および抗血清は、薬学的に許容できる組成物および担体と結合
させて診断用、予後診断用または治療用組成物を形成することができる。用語「
抗体」または「抗体分子」は、免疫グロブリン分子群および／または免疫グロブ
リン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗体結合部位またはパラトープを含
有する分子を意味する。

【０１９２】 抗血管新生タンパク質へ特異的に結合する抗体を使用する受動的抗体療法は、
例えば生殖、発達および創傷治癒や組織修復のような血管新生依存性プロセスを
調節するために使用できる。さらに、抗血管新生タンパク質の抗体のＦａｂ領域
に指向される抗血清は、そのタンパク質へ結合するタンパク質に対する内因性抗
血清の能力をブロックするために投与できる。

【０１９３】 本発明の抗血管新生タンパク質は、さらにまた１種以上の阻害剤および１種以
上のレセプターに対して特異的である抗体を生成するためにも使用できる。この
抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でありうる。これらの抗
血管新生タンパク質またはそれらのレセプターへ特異的に結合する抗体は、体液
または組織中の抗血管新生タンパク質またはそれらのレセプターを検出または定
量するために当業者にはよく知られている診断的方法およびキットに使用できる
。これらのテストの結果を使用すると、癌およびその他の血管新生媒介性疾患の
発生または再発を診断または予測することができる。

【０１９４】 本発明は、さらに血管新生活性を特徴とする疾患の診断または予後診断におけ
る抗血管新生タンパク質、それらのタンパク質に対する抗体、およびそれらのタ
ンパク質および／またはそれらの抗体を備える組成物の使用を含んでいる。ここ
で使用する用語「予後診断的方法」とは、疾患、特に血管新生依存性疾患を有す
ると診断されたヒトまたは動物の疾患の進行に関する予測を可能にする方法を意
味する。ここで使用する用語「診断的方法」とは、ヒトまたは動物における血管
新生依存性疾患の存在または型の決定を可能にする方法を意味する。

【０１９５】 抗血管新生タンパク質は、それらのタンパク質に結合することのできる抗体を
検出および定量するための診断的方法およびキットにおいて使用できる。これら
のキットは、ｉｎ ｓｉｔｕで原発性腫瘍によって分泌された抗血管新生タンパ
ク質の存在下での微小癌転移の広がりを示す抗血管新生タンパク質に対する循環
中抗体の検出を可能にするであろう。そのような循環中抗タンパク質抗体を有す
る患者は多発性腫瘍および癌を発生する可能性が高いと思われ、さらに治療後ま
たは寛解期(remission)後に癌の再発を有する可能性が高いと思われる。これら
の抗タンパク質抗体のＦａｂ断片は、抗タンパク質抗体を中性化するために使用
できる抗タンパク質Ｆａｂ断片抗血清を生成するための抗原として使用できる。
そのような方法は、抗タンパク質抗体による循環中タンパク質の除去を減少させ
、それによって効果的に抗血管新生タンパク質の循環中レベルを上昇させるであ
ろう。

【０１９６】 本発明は、さらにまた抗血管新生タンパク質に対して特異的なレセプターの単
離を含んでいる。組織への高親和性結合を有するタンパク質断片を使用するとア
フィニティーカラム上で抗血管新生タンパク質のレセプターを単離することがで
きる。１種以上のレセプターの単離および精製は、抗血管新生タンパク質の作用
機序の解明に向かう基本的ステップである。レセプターの単離並びにアゴニスト
およびアンタゴニストの同定は、生物学的活性への最終経路であるレセプターの
活性を調節する薬物の開発を促進するであろう。レセプターの単離は、ｉｎ ｓ
ｉｔｕおよび溶液ハイブリダイゼーション法を使用して、レセプターの所在部位
および合成をモニターするためのヌクレオチドプローブの構築を可能にする。さ
らに、細胞型、組織または腫瘍が抗血管新生タンパク質に結合して局所的血管新
生を阻害する能力を増加させるために、そのレセプターの遺伝子を単離し、発現
ベクター内に組み込み、例えば患者腫瘍細胞のような細胞内にトランスフェクト
することができる。

【０１９７】 抗血管新生タンパク質は、培養された腫瘍細胞から抗血管新生タンパク質に対
する１種以上のレセプターを単離するためのアフィニティーカラムを開発するた
めに使用される。そのレセプターの単離および精製後にはアミノ酸シークエンシ
ングが行われる。この情報を用いるとそのレセプターをコードする１個以上の遺
伝子を同定かつ単離することができる。次に、そのレセプターを発現することの
できるベクター内に挿入するためにクローン化された核酸配列が発生される。こ
れらの方法は当業者にはよく知られている。そのレセプターをコードする１つ以
上の核酸配列の腫瘍細胞内へのトランスフェクション、およびトランスフェクト
された腫瘍細胞によるそのレセプターの発現は、これらの細胞の内因性または外
因性抗血管新生タンパク質への反応性を増強させ、それによって転移性増殖の速
度を低下させる。

【０１９８】 本発明の血管新生阻害タンパク質は、標準的な微量化学施設で合成することが
でき、純度はＨＰＬＣおよび質量分光測光法を用いてチェックすることができる
。タンパク質合成、ＨＰＬＣ精製および質量分光測光の方法は当分野の当業者に
は一般に知られている。抗血管新生タンパク質およびそれらのレセプタータンパ
ク質は、さらにまた組換え大腸菌または酵母発現系においても産生され、カラム
クロマトグラフィーを用いて精製される。

【０１９９】 下記を含むがそれらに限定されない数種の適用において使用するために無傷抗
血管新生タンパク質の様々なタンパク質断片を合成することができる：特異抗血
清を開発するための抗原として、抗血管新生タンパク質の結合部位で活性なアゴ
ニストおよびアンタゴニストとして、または抗血管新生タンパク質に結合する細
胞を死滅させることを標的とする細胞毒性物質に連結して、またはそれらと組み
合わせて使用されるタンパク質として。

【０２００】 抗血管新生タンパク質の合成タンパク質断片には様々な使用法がある。高い特
異性および親和力を備える抗血管新生タンパク質の１種以上のレセプターに結合
するタンパク質は、オートラジオグラフィー法および膜結合法を使用して結合部
位の可視化および定量のために放射標識して使用されている。この適用は重要な
診断用および研究用ツールを提供する。１種以上のレセプターの結合特性に関す
る知識により、１種以上のレセプターに連結した形質導入機序の研究が促進され
る。

【０２０１】 抗血管新生タンパク質およびそれらに由来するタンパク質は、標準的方法を使
用して他の分子へカップリングさせることができる。抗血管新生タンパク質のア
ミノ末端およびカルボキシル末端はどちらもチロシンおよびリシン残基を含有し
ており、例えば従来の方法を使用した放射能標識のような数多くの方法を用いて
同位体標識または非同位体標識される（チロシン残基−クロラミンＴ、ヨードゲ
ン、ラクトペルオキシダーゼ；リシン残基−ボルトン−ハンター［Ｂｏｌｔｏｎ
−Ｈｕｎｔｅｒ］試薬）。これらのカップリング法は当業者にはよく知られてい
る。あるいはまた、チロシンまたはリシンはタンパク質上での反応性アミノ基お
よび水酸基の標識付けを容易にするためにこれらの残基を有していない断片に付
加される。カップリング法は、アミノ酸で利用できるアミノ基、メルカプト基、
カルボキシル基、アミド基、フェノール基およびイミダゾール基を含むがそれら
に限定されない官能基に基づいて選択される。これらのカップリングを実行する
ために使用される様々な試薬には、特にグルタールアルデヒド、ジアゾ化ベンジ
ジン、カルボジイミド、およびｐ−ベンゾキノンが含まれる。

【０２０２】 抗血管新生タンパク質は、様々な用途のために化学的にアイソトープ、酵素、
担体タンパク質、細胞毒性物質、蛍光分子、化学発光、生物発光およびその他の
化合物へカップリングされる。カップリング反応の効率は、特定反応に対して適
切な様々な方法を使用して測定される。例えば、本発明のタンパク質の^１２５Ｉ
を用いた放射能標識は、高比活性を有するクロラミンＴおよびＮａ^１２５Ｉを使
用して遂行される。反応はメタ重亜硫酸ナトリウムを用いて停止され、結果とし
て生じる混合物は使い捨てカラム上で脱塩される。標識化タンパク質がカラムか
ら溶離され、フラクションが収集される。各フラクションからアリコートが除去
され、ガンマ計数器で放射能が測定される。この方法で、未反応Ｎａ^１２５Ｉは
標識化タンパク質から分離される。最高の放射能比活性を有するタンパク質フラ
クションを、抗血管新生タンパク質の抗血清へ結合する能力の分析のようなその
後の使用のために保管する。

【０２０３】 さらに、短命同位体を用いての抗血管新生タンパク質の標識化は、タンパク質
の結合部位を用いて腫瘍を局在化するためのポジトロン放出断層撮影法またはそ
の他の現代的なＸ線写真を使用するインビボでのレセプター結合部位の視覚化を
可能にする。

【０２０４】 これらの合成タンパク質内のアミノ酸の順序立てた置換は１種以上のレセプタ
ーへの結合を増強または減少する抗血管新生タンパク質の１種以上のレセプター
に対する高親和性タンパク質アゴニストおよびアンタゴニストを産生する。その
ようなアゴニストは微小癌転移の増殖を抑制し、それによって癌の広がりを制限
するために使用される。抗血管新生タンパク質に対するアンタゴニストは、抗血
管新生タンパク質の阻害作用をブロックして血管新生を促進するために、不適切
な血管新生の状況に適用される。例えば、この治療法は糖尿病患者における創傷
治癒を促進する治療作用を有する可能性がある。

【０２０５】 本発明を下記の実施例によってさらに詳細に説明するが、実施例はそれらの範
囲を制限するような方法で解釈されることは意図されていない。それとは反対に
、当業者が本明細書中の説明を読んだ後に本発明の意図および／または添付のク
レームの範囲から逸脱することなく、心に浮かぶ可能性がある様々な他の実施形
態、変形およびそれらの同等物をたよりにすることも可能であることは明確に理
解されるべきであろう。

【０２０６】 実施例 実施例１：天然アレステンの単離 アレステンは、ヒト胎盤および羊膜組織からミリグラム量で生成できる。アレ
ステンや類似タンパク質を単離するためのプロトコールは他の研究者によって記
載されている（例、Ｌａｎｇｅｖｅｌｄ、Ｊ．Ｐ．ら，１９８８， Ｊ． Ｂｉ
ｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１０４８１−１０４８８；Ｓａｕｓ， Ｊ．ら，
１９８８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１３３７４−１３３８
０；Ｇｕｎｗａｒ， Ｓ．ら， １９９０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２６５：５４６６−５４６９；Ｇｕｎｗａｒ， Ｓ．ら， １９９１， Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１５３１８−１５３２４；Ｋａｈｓａｉ，
Ｔ． Ｚ．ら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１７０
２３−１７０３２）。アレステンの組換え形の産生は、Ｎｅｉｌｓｏｎら（１９
９３， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：８４０２−８４０６）に記載
されている。このタンパク質は、さらにまた２９３腎細胞中で発現させることも
できる（例、Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ，Ｅ．ら，１９９８， ＥＭＢＯ Ｊ． １
７：１６５６−１６６４に記載されている方法によって）。アレステンはさらに
また、Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ， Ｔ．ら（１９８５， Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２６０：７６８１−７６８７）の方法に従って単離することもでき
る。

【０２０７】 ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα１鎖のヌクレオチド配列（配列番号１
）およびアミノ酸配列（配列番号２）は図１に示されており、ＧｅｎＢａｎｋア
クセッション番号第Ｍ１１３１５（Ｂｒｉｎｋｅｒ， Ｊ． Ｍ．ら， １９９
４）に相当する。アレステンは、一般にＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメ
イン、およびもしかするとさらにＮＣ１ドメインの直前の１２アミノ酸である接
合領域を備える。

【０２０８】 天然アレステンは、細菌コラゲナーゼ、アニオン交換クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣおよびアフィニティークロマトグラフィー（
Ｇｕｎｗａｒ， Ｓ．ら， １９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６
６：１５３１８−２４；Ｗｅｂｅｒ， Ｓ．ら， １９８４， Ｅｕｒ． Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３９：４０１−１０）を使用してヒト胎盤から単離した
。ヒト胎盤から単離したＩＶ型コラーゲン単量体はＣ−１８疎水性カラム（ファ
ルマシア［Ｐｈａｒｍａｃｉａ］製、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米
国）を使用してＨＰＬＣ精製した。構成タンパク質はアセトニトリル勾配（３２
％−３９％）を用いて溶解させた。主要ピークおよび小さな二重ピークを見るこ
とができた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により第１ピーク内に２つのバンドが判明し
たが、第２ピークではタンパク質を検出できなかった。免疫ブロット法によって
も、第２ピークにおける免疫検出可能なタンパク質は発見されなかったので、主
要ピークをアレステンであると同定した。

【０２０９】 実施例２： 大腸菌におけるアレステンの組換え産生 アレステンをコードする配列を、フォワードプライマー５’−ＣＧＧ ＧＡＴ
ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＴＴ ＧＡＴ ＣＡＣ ＧＧＣ ＴＴＣ−３’（配列番号
３）およびリバースプライマー５’−ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＧＴ ＴＣＴ
ＴＣＴ ＣＡＴ ＡＣＡ ＧＡＣ−３’（配列番号４）を使用してα１ＮＣ１
（ＩＶ）／ｐＤＳベクター（Ｎｅｉｌｓｏｎ， Ｅ．Ｇ．ら， １９９３， Ｊ
． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ． ２６８：８４０２−５）からＰＣＲによって増幅さ
せた。結果として生じたｃＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用い
て消化し、前消化ｐＥＴ２２ｂ（＋）（ノヴァゲン［Ｎｏｖａｇｅｎ］製、マデ
ィソン、ウィスコンシン州、米国）内へライゲーションした。この構成物は図２
に示されている。これは、アレステンをペリプラスム局在および溶解性タンパク
質の発現を許容するように、ｐｅｌＢリーダー配列の下流およびフレーム内に配
置した。追加のベクター配列がアミノ酸ＭＤＩＧＩＮＳＤ（配列番号１３）をコ
ードするタンパク質へ付加された。この配列の３’末端はポリヒスチジンタグ配
列と一緒のフレームでライゲーションされた。ｃＤＮＡの３’末端とｈｉｓ−タ
グとの間の追加のベクター配列はアミノ酸ＫＬＡＡＡＬＥ（配列番号１４）をコ
ードしていた。両方の鎖上で陽性クローンをシークエンシングした。

【０２１０】 アレステンをコードするプラスミド構築物を最初は大腸菌ＨＭＳ１７４（ノヴ
ァゲン［Ｎｏｖａｇｅｎ］製、マディソン、ウィスコンシン州、米国）内へ形質
転換させ、その後に発現させるためにＢＬ２１（ノヴァゲン［Ｎｏｖａｇｅｎ］
製、マディソン、ウィスコンシン州、米国）内へ形質転換させた。オーバーナイ
トの細菌培養を使用してＬＢ培地の５００ｍＬ培養物を接種した。この培養物を
細胞が０．６のＯＤ_６００に到達するまで約４時間増殖させた。その後、最終濃
度が１−２ｍＭとなるまでＩＰＴＧを添加することによりタンパク質発現を誘導
した。２時間の誘導後、５０００×ｇで遠心分離することにより細胞を回収し、
６Ｍグアニジン、０．１Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ８．０）中への再懸濁により溶解させた。再懸濁させた細胞を短時間超音波
処理にかけ、さらに１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清フラクショ
ンを２ｍｌ／ｍｉｎの速度で５ｍＬのＮｉ-ＮＴＡアガロースカラム（キアゲン
［Ｑｉａｇｅｎ］、ヒルデン、ドイツ）を４−６回通過させた。非特異的に結合
したタンパク質は、８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中１０ｍＭおよび２５ｍＭ両方のイミダゾール液を用
いて洗浄することによって除去した。アレステンタンパク質は８Ｍ尿素、０．１
Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のイミダ
ゾールの濃度を上昇させながら（５０ｍＭ、１２５ｍＭおよび２５０ｍＭ）カラ
ムから溶出させた。溶出したタンパク質は４℃でＰＢＳに対して２回透析した。
透析中に全タンパク質のわずかな部分が沈殿した。透析したタンパク質を収集し
、約３，５００×ｇで遠心分離し、ペレットと上清フラクションとに分離させた
。各フラクション中のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（ピアース・ケミカル［
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．］、ロックフォード、イリノイ州、米
国）および定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により測定した。ペレット中の全タンパ
ク質のフラクションは約２２％であり、残りの７８％は可溶性タンパク質として
回収された。タンパク質の総収量は約１０ｍｇ／Ｌであった。

【０２１１】 大腸菌発現タンパク質は主として可溶性タンパク質として単離され、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより２９ｋＤａでの単量体バンドが判明した。追加の３ｋＤａはポリ
リンカーおよびヒスチジンタグ配列から発生し、これはアレステン抗体および６
−ヒスチジンタグ抗体の両方によって免疫検出された。

【０２１２】 実施例３：２９３胎児腎細胞中のアレステンの発現 α１（ＩＶ）ＮＣ１を含有するｐＤＳプラスミドを使用して、それがｐｃＤＮＡ
３．１真核細胞発現ベクター（インヴィトロジェン［ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ］製
、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）内へインフレームでリーダーシグナ
ル配列ヘ付加するような方法でアレステンを増幅させた。全長α１（ＩＶ）鎖の
５’末端由来のリーダー配列は培地内へのタンパク質分泌を可能にするようにＮ
Ｃ１ドメインの５’末端へクローン化した。アレステン含有組換えベクターはフ
ランキングプライマーを使用してシークエンシングした。エラーフリーｃＤＮＡ
クローンをその後精製し、タンパク質発現を確認するためのインビトロ翻訳試験
のために使用した。アレステン含有プラスミドおよび対照プラスミドを用い、塩
化カルシウム法を使用して２９３個の細胞をトランスフェクトした。トランスフ
ェクトされたクローンをジェネチシン(geneticine)抗生物質処理（ライフテクノ
ロジーズ／ギブコ［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ］ＢＲＬ
、ゲーサーズバーグ、メリーランド州、米国）によって選択した。細胞は細胞死
が明白にならなくなるまで抗生物質の存在下で３週間経過させた。その後クロー
ンをＴ−２２５フラスコ内へ展開させ、コンフルエントな状態になるまで増殖さ
せた。その後上清を収集し、アミコン濃縮器（アミコン［Ａｍｉｃｏｎ， Ｉｎ
ｃ．］製、べバリー、マサチューセッツ州、米国）を使用して濃縮した。濃縮さ
せた上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロット法およびＥＬＩＳＡによってアレス
テン発現について解析した。ＥＬＩＳＡによって上清内の強力な結合が検出され
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では、約３０ｋＤａで単一の主要バンドが判明した。
アレステン含有上清はアレステン特異的抗体（Ｇｕｎｗａｒ， Ｓ．ら， １９
９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１５３１８−２４）を使用す
るアフィニティークロマトグラフィーに供した。アレステン抗体と免疫反応性で
あった約３０ｋＤａの単量体を含有する大きなピークが同定された。培養液１Ｌ
当たり約１−２ｍｇの組換えアレステンが生成された。

【０２１３】 実施例４：アレステンは内皮細胞増殖を阻害する １０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ中でコンフルエントな状態に
なるまでＣ−ＰＡＥ細胞を増殖させ、４８時間に渡って接触の阻害を維持した。
対照細胞は、７６８−Ｏ（腎臓癌）細胞、ＰＣ−３細胞、ＨＰＥＣ細胞、および
Ａ−４９８（腎臓癌）細胞であった。細胞は３７℃で５分間に渡ってトリプシン
化（ライフテクノロジーズ／ギブコ［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇ
ｉｂｃｏ］ＢＲＬ、ゲーサーズバーグ、メリーランド州、米国）を用いて回収し
た。１％ ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の１２，５００細胞の懸濁液を、１０μ
ｇ／ｍＬのフィブロネクチンがコーティングされた２４ウェルプレートの各ウェ
ルに添加した。細胞を５％ＣＯ_２および９５％湿度の３７℃で２４時間インキュ
ベートした。培地を除去し、０．５％ＦＣＳおよび３ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｒ
＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）製、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）を含
有するＤＭＥＭと取り替えた。非刺激対照にはｂＦＧＦを添加しなかった。細胞
を０．０１〜５０μｇ／ｍＬの範囲内の濃度のアレステンまたはエンドスタチン
を用いて処理した。全ウェルへ処理時に１μキュリーの^３Ｈ−チミジンを添加し
た。２４時間後、培地を除去し、ウェルをＰＢＳを用いて洗浄した。１Ｎ Ｎａ
ＯＨを用いて細胞を抽出し、４ｍＬのシンチバース（Ｓｃｉｎｔｉ Ｖｅｒｓｅ
）ＩＩ（フィッシャー・サイエンティフィック［Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ］、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、米国）液を含有するシンチレーシ
ョンバイアルへ添加した。シンチレーションカウンターを用いてチミジン取込み
を測定した。結果は、様々な量のアレステン（図３Ａ）またはエンドスタチン（
図３Ｂ）を用いて処理されたＣ−ＰＡＥ細胞内への^３Ｈ−チミジンの取込みを示
している１対のグラフである図３Ａおよび３Ｂに示されている。アレステンは、
エンドスタチンと同様にＣ−ＰＡＥ内へのチミジン取込みを阻害するように思わ
れた。アレステンおよびエンドスタチンを用いて処理された対照細胞の挙動もま
た図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄに示されているが、アレステンは７８６−Ｏ細
胞（図４Ａ）、ＰＣ−３細胞（図４Ｂ）またはＨＰＥＣ細胞（図４Ｃ）への作用
をほとんど有していなかった。エンドスタチンはＡ−４９８細胞（図４Ｄ）への
作用をほとんど有していなかった。図３および４に含まれている全群は３つずつ
のサンプルを表している。

【０２１４】 実施例５：アレステンは内皮細胞中でアポトーシスを誘導する。 １０％ＦＢＳが補給されたＤＭＥＭが入れられている６ウェル組織培養プレー
トの各ウェルへ１２時間に渡って５０，０００個のＣ−ＰＡＥ細胞を添加した。
２、４および６時間後の時点で新しい培地と一緒に５μｇ／ｍＬのアレステンま
たは４０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα（陽性対照）のどちらかを添加した。対照ウェル
には等量のＰＢＳを添加した。分離細胞および付着細胞を一緒にプールし、１，
５００ｒｐｍで遠心分離した。結合緩衝液（クローンテック［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
］製、パロアルト、カリフォルニア州、米国）を用いて細胞を洗浄し、製造業者
の説明書に従ってＦＩＴＣ標識化アネクシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ（クローンテ
ック［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ］製、パロアルト、カリフォルニア州、米国）を用いて
標識化することによって、さらにアポトーシスの指標であるホスファチジル−セ
リン（ＰＳ）外面化を測定した。アネクシン−ＦＩＴＣ標識細胞は、ファクスタ
ープラス［ＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓ］フローサイトメーター（ベクトン・ディ
ッキンソン［Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ］製、ウォルサム、マサチュー
セッツ州、米国）を使用して計数した。各処理について、１０，０００個の細胞
を係数し、保管した。このデータはその後、標準型セルクエスト（Ｃｅｌｌ Ｑ
ｕｅｓｔ）ソフトウエア（ベクトン・ディッキンソン［Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ］製、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を使用して解析した
。対照に対して、陽性対照のＴＮＦαについてはアネクスチン−Ｖ染色（アポト
ーシス性）細胞のパーセンテージは２時間後には約２７％まで増加し、４および
６時間後には２０％近くであった。アレステン処理細胞に対して、アポトーシス
細胞は２時間後には約１８％で、４および６時間後には約２３％であった。内皮
細胞の形態的変化は実験中にも観察され、対照細胞は重大な変化を示さなかった
が、他方アレステン処理および非付着性細胞はアポトーシスを示す細胞形態にお
ける変化を示した。

【０２１５】 実施例６：アレステンは内皮細胞移動を阻害する ボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバーアッセイ（ニューロプローブ［Ｎｅｕｒ
ｏ−Ｐｒｏｂｅ， Ｉｎｃ．］製、キャビンジョン、メリーランド州、米国）を
使用して、ＦＢＳ誘導性化学走化性へのアレステンおよびエンドスタチンの阻害
作用をヒト臍帯内皮細胞（ＥＣＶ−３０４細胞、ＡＴＣＣ １９９８−ＣＲＬ、
ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１ブルー
バード大学、マナッサス、バージニア州、２０１１０−２２０９、米国）につい
て試験した。ＥＣＶ−３０４細胞は１０％ ＦＢＳおよび５ｎｇ／ｍＬのＤｉｌ
Ｃ１８（３）リビング蛍光染色（モレキュラー・プローブ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．］製、ユージン、オレゴン州、米国）を含有するＭ
１９９培地中で一晩増殖させた。０．５％ ＦＢＳを含有するＭ１９９中で細胞
をトリプシン化、洗浄および希釈した後、アレステンまたはエンドスタチン（２
〜４０μｇ／ｍＬ）を添加して、または添加せずに６０，０００個の細胞を上方
チャンバーウェル上に播種した。２％ ＦＢＳを含有するＭ１９９培地は、化学
走化性物質として下方チャンバー内に配置した。細胞を含有するコンパートメン
トは孔径が８μｍのポリカーボネート製フィルター（ポレティクス［Ｐｏｒｅｔ
ｉｃｓ Ｃｏｒｐ．］製、リバーモア、カリフォルニア州、米国）を用いて化学
走化性物質から分離した。このチャンバーを５％ ＣＯ_２および９５％湿度の３
７℃で４．５時間インキュベートした。移動しなかった細胞を廃棄してＰＢＳを
用いて上方ウェルを洗浄した後、プラスチック製刃物を用いてフィルターを擦り
取り、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド内で固定し、スライドガラス上に置いた
。蛍光高出力領域を使用して、画像処理ソフトウェアＰＭＩＳ（ローパーサイエ
ンティフィック／ホトメトリックス［Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｈ
ｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ］製、トゥーソン、アリゾナ州、米国）を用いて操作する
デジタルセンシス［ＳｅｎＳｙｓ］^TM/span>カメラによって数枚の独立した均質
の画像を記録した。代表的な画像は図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示されており、こ
れらは２０μｇ／ｍＬでのエンドスタチンと同等に有効な２μｇ／ｍＬでのアレ
ステンを示している。細胞は、オプティマス（ＯＰＴＩＭＡＳ）６．０ソフトウ
ェア（メディア・サイバーネティクス［Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ］
製、ロチェスター、ニューヨーク州）を使用して計数し、その結果は顕微鏡写真
で所見された結果をグラフの形で示している図６に示されている。

【０２１６】 実施例７：アレステンは内皮管形成を阻害する 内皮管形成の阻害を測定するために、３２０μＬのマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇ
ｅｌ）（コラボレーティブ・バイオメディカル・プロダクツ［Ｃｏｌｌａｂｏｒ
ａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ］製、ベッドフォード、
マサチューセッツ州、米国）を２４ウェルプレートの各ウェルに添加し、重合化
させた（Ｇｒａｎｔ， Ｄ． Ｓ．ら， １９９４， Ｐａｔｈｏｌ． Ｒｅｓ
． Ｐｒａｃｔ． １９０：８５４−６３）。抗生物質を添加していないＥＧＭ
−２培地（クローンティクス・コーポレーション［Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ］製、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）中の２５，０
００マウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥ）の懸濁液をマトリゲルを用いてコーティン
グした各ウェル内に通過させた。アレステン、ＢＳＡ、無菌ＰＢＳまたは７Ｓド
メインのいずれかを濃度を上昇させながら細胞を処理した。全アッセイは３回ず
つ実施した。細胞は３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、ＣＫ２オリンパ
ス顕微鏡（接眼レンズ３．３、対物レンズ１０×）を使用して視認した。その後
細胞は４００ＤＫコーティングＴＭＡＸフィルム（コダック［Ｋｏｄａｋ］製）
を使用して写真撮影した。細胞は、ディフ−クイック（ｄｉｆｆ−ｑｕｉｋ）固
定液（シグマ・ケミカル［Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ］製
、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いて染色し、再度写真撮影した。１０
の領域を視認し、管を計数して平均した。結果は、アレステン（くろしかく）が
対照（無菌ＰＢＳ、くろひしがた；ＢＳＡ、しろさんかく；７ｓドメイン、−Ｘ
−）に比較して管形成を阻害することを示している図７に示されている。代表的
な明確に形成された管は、７Ｓドメインを用いて処理された細胞を示している図
８Ａにおいて観察できる（倍率１００×）。他方、図８Ｂは、０．８μｇ／ｍＬ
のアレステンを用いて処理されたＭＡＥ細胞における管形成が不良またはないこ
とを示している。

【０２１７】 マトリゲルアッセイをさらにＣ５７／ＢＬ６マウスのインビボでも実施した。
マトリゲルは４℃で一晩かけて解凍した。これをその後２０Ｕ／ｍＬのヘパリン
（ピアース・ケミカル［Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．］、ロックフ
ォード、イリノイ州、米国）、１５０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ
（Ｓｙｓｔｅｍｓ）製、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）、および１μｇ／ｍ
Ｌのアレステンまたは１０μｇ／ｍＬのエンドスタチンのどちらかと一緒に混合
した。マトリゲル混合液は２１ｇ注射針を用いて皮下に注射した。対照群には、
血管新生阻害剤を含まない同一混合液を摂取させた。１４日後、マウスを屠殺し
、マトリゲルプラグを除去した。マトリゲルプラグは室温で４時間に渡ってＰＢ
Ｓ中４％パラホルムアルデヒド液中で、その後２４時間はＰＢＳへ切り換えて固
定させた。プラグをパラフィンに包埋し、切片作製し、Ｈ＆Ｅ染色した。切片は
光線顕微鏡で試験し、１０の高出力領域からの血管の数を計数し、平均した。

【０２１８】 アレステンの濃度を上昇させながら、または上昇させずにマトリゲルをｂＦＧ
Ｆの存在下で入れた場合に、血管数の５０％減少が１μｇ／ｍＬのアレステンお
よび１０μｇ／ｍＬのエンドスタチンで観察された。これらの結果は、アレステ
ンが血管新生プロセスにおける様々なステップを阻害することによって新たな血
管の形成に影響を及ぼすことを証明している。これらの結果はさらにまた、１μ
ｇ／ｍＬのアレステンがインビボでの新規血管形成を阻害することにおいて１０
μｇ／ｍＬのエンドスタチンと同等に有効であることも示している。

【０２１９】 実施例８：アレステンはインビボでの腫瘍転移を阻害する Ｃ５７／ＢＬ６マウスに百万個のＭＣ３８／ＭＵＣ１を静脈内注射した（Ｇｏ
ｎｇ， Ｊ．ら， １９９７， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３：５５８−６１）。２
６日間に渡って１日置きに５匹の対照マウスに１０ｍＭの無菌ＰＢＳを注射し、
他方６匹の試験マウスには４ｍｇ／ｍＬのアレステンを注射した。２６日間の処
理後、各マウスについて肺腫瘍結節を計数し、２群について平均した。各群２匹
ずつの死亡が記録された。アレステンは、原発性結節の平均数を対照群マウスに
おける３００から２００へ有意に減少させた。

【０２２０】 実施例９：アレステンはインビボでの腫瘍増殖を阻害する ２百万個の７８６−Ｏ細胞を７〜９週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウスへ皮下注
射した。マウス６匹からなる第１群では、腫瘍は約７００ｍｍ^３へ増殖させた。
マウス６匹からなる第２群では、腫瘍は１００ｍｍ^３へ増殖させた。無菌ＰＢＳ
中のアレステンを７００ｍｍ^３の腫瘍を有するマウスには２０ｍｇ／ｋｇの濃度
で、そして１００ｍｍ^３の腫瘍を有するマウスには１０ｍｇ／ｋｇの濃度で１０
日間に渡って毎日腹腔内注射した。対照マウスにはＢＳＡまたはＰＢＳ賦形剤を
投与した。結果は図９Ａおよび９Ｂに示されている。図９Ａは１０ｍｇ／ｋｇの
アレステン処理（しろしかく）、ＢＳＡ処理（＋）および対照マウス（くろまる
）についての７００ｍｍ^３からの腫瘍容積の増加を示しているプロット図である
。アレステン処理マウスにおける腫瘍は７００から５００ｍｍ^３へ縮小したが、
ＢＳＡ処理および対照マウスにおける腫瘍は１０日間で約１，２００ｍｍ^３へ増
大した。図９Ｂは、１００ｍｍ^３の腫瘍を有するマウスにおいて、アレステン（
しろしかく）が約８０ｍｍ^３への腫瘍縮小を生じさせたが、他方ＢＳＡ処理腫瘍
（＋）は１０日間でサイズがほぼ５００ｍｍ^３へ増大したことを示している。

【０２２１】 約５百万個のＰＣ−３細胞（ヒト前立腺癌細胞）を採取し、７〜９週齢の雄性
胸腺欠損ヌードマウスへ皮下注射した。腫瘍を１０日間増殖させ、その後ベルニ
エ・カリパスを用いて測定した。腫瘍容積は標準公式（幅^２×長さ×０．５２）
を使用して計算した（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｍ． Ｓ．ら， １９９７， Ｃｅ
ｌｌ ８８：２７７−８５；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｍ． Ｓ．ら， １９９４，
Ｃｅｌｌ ７９：３１５−２８）。動物は各群５〜６匹に分けた。試験群には
アレステン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはエンドスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ／日
）を毎日腹腔内投与した。対照群には毎日ＰＢＳを投与した。結果は、アレステ
ン（しろしかく）がエンドスタチン（くろさんかく）または対照（くろまる）と
同様に、またはわずかに良好に腫瘍の増殖を阻害することを示した図９Ｃに示さ
れている。４ｍｇ／ｋｇ／日のアレステン用量を用いてこの実験を繰返した。結
果は図９Ｄに示されている（アレステン、しろしかく；対照、くろまる）。８日
後（矢印）に処理を中止したが、追加のアレステン処理を行わなくてもさらに１
２日間は有意な阻害が持続した。処理を実施しない１２日間後、腫瘍はアレステ
ンの阻害作用から離脱し始めた。

【０２２２】 実施例１０：アレステンの免疫組織化学 腫瘍試験に使用したマウスを処理の１０から２０日後に屠殺した。腫瘍を切除
し、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。組織をパラフィン包埋し、３μｍ
の切片を切り分け、スライドガラス上に載せた。切片からパラフィンを除去し、
再水和させ、３００ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＸＸＩＶ（シグマケミカル［ＳＩ
ＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．］製、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ
，ＵＳＡ）を用いて３７℃で５分間処理した。１００％エタノールを用いて消化
を停止させ、切片を風乾させ、１０％ウサギ血清を用いてブロックした。その後
スライドをラット抗マウスＣＤ−３１モノクローナル抗体（ファーミンゲン「Ｐ
ｈａｒＭｉｎｇｅｎ」製、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ
）の１：５０希釈液と一緒に４℃で一晩インキュベートし、その後ウサギ抗ラッ
ト免疫グロブリン（ＤＡＫＯ製）およびラットＡＰＡＡＰ（ＤＡＫＯ製）の１：
５０希釈液中において３７℃で２回の連続する３０分間ずつのインキュベートを
実施した。ニューフクシンを用いて呈色反応を実施し、ヘマトキシリンを用いて
切片を対比染色した。ＣＤ−３１染色パターンは対対照マウスに比較して処理マ
ウスの血管構造の減少を示した。

【０２２３】 ＰＣＮＡ染色のために、組織切片は抗ＰＣＮＡ抗体（シグネット・ラボラトリ
ーズ［Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］製、Ｄｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓ
ａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）の１：２００希釈液と一緒に室温で６０分間イン
キュベートした。検出は、製造業者の勧告に従ってＵＳＡホースラディッシュ・
ペルオキシダーゼ系（シグネット・ラボラトリーズ［Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ］製、Ｄｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を
使用して実施した。スライドはヘマトキシリンを用いて対比染色した。フィブロ
ネクチンおよびＩＶ型コラーゲンについての染色は、１：５００の希釈率のポリ
クローナル抗フィブロネクチン（シグマケミカル［ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．］製、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）および１：１
００の希釈率のＩＶ型コラーゲン（ＩＣＮファーマシューティカルズ［ＩＣＮ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ］製、Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，Ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して実施した。検出には製造業者の勧告に従ってベクタ
ステインエリート（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ）ＡＢＣキット（ベクタ
ー・ラボラトリーズ［Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ． Ｉｎｃ．］
製、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用した。細胞
外マトリックスのＰＣＮＡ、フィブロネクチンおよびＩＶ型コラーゲン染色は、
腫瘍細胞増殖または腫瘍細胞を取り囲んでいるＩＶ型コラーゲンおよびフィブロ
ネクチンの含量もしくは構造における相違を示さなかった。

【０２２４】 実施例１１：アレステンの循環中半減期 ヒト胎盤から単離した天然アレステンを体重２００ｇのラット(rate)に静脈内
注射した。各ラットは５ｍｇのヒトアレステンを投与した。抗アレステン抗体を
使用することによって循環アレステンの存在について様々な時点に直接ＥＬＩＳ
Ａによって血清を分析した。対照として、分析のために同一量の血清を使用する
ことを保証するために、各時点に血清アルブミンについても評価した。アレステ
ンは、約３６時間の半減期で血清中を循環することが発見された。

【０２２５】 また別の群のラットに２００μｇのヒトアレステンを腹腔内および／または皮
下注射し、肺、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、脳、精巣、卵巣等における疾患病原の
徴候について評価した。直接ＥＬＩＳＡを実施したところこれらのラットの血清
中でアレステン抗体を検出し、さらに以前に観察されたように腎糸球体基底膜上
でいくらかの内因性ＩｇＧ沈着が認められた（Ｋａｌｌｕｒｉ， Ｒ．ら， １
９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：６
２０１−５）。腎臓内の抗体沈着に炎症の徴候または腎機能の低下は付随しなか
った。これらの実験は、アレステンが非病原性であることを示唆している。

【０２２６】 実施例１２：アレステンが細胞付着に及ぼす影響 ９６ウェルプレートにヒトアレステンまたはヒトＩＶ型コラーゲン（コラボレ
ーティブ・バイオメディカル・プロダクツ［Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉ
ｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ］製、Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕ
ｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）のいずれかを１０μｇ／ｍｌの濃度で一晩３７℃でコーテ
ィングした。残留しているタンパク質結合部位はＰＢＳ中の１０％ＢＳＡ（シグ
マケミカル［ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．］製、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を用いて３７℃で２時間ブロックした。ＨＵＶＥＣ
細胞はＥＧＭ−２ ＭＶ培地（クローンティクス・コーポレーション［Ｃｌｏｎ
ｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ］製、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉａ，ＵＳＡ）中でサブコンフルエント（７０〜８０％）な状態になるまで
増殖させた。細胞を静かにトリプシン処理し、無血清培地（５×１０^４細胞／ｍ
ｌ）中に再懸濁させた。その後細胞は１０μｇ／ｍｌの抗体と混合し、室温で静
かに攪拌しながら１５分間インキュベートした。その後１００μｌの細胞懸濁液
を各ウェルに添加し、プレートを５％ＣＯ_２下で３７℃で４５分間インキュベー
トした。無血清培地を用いて洗浄することによって付着していない細胞を除去し
、付着した細胞を計数した。ヒトβ_１インテグリンサブユニット（クローンＰ４
Ｃ１０）に対する対照マウスＩｇＧおよびマウスモノクローナル抗体はライフ・
テクノロジーズ／ギブコ［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ］
ＢＲＬ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）から購入し
た。モノクローナル抗体α_１インテグリンサブユニットおよびα_Ｖβ_３（各々、
クローンＣＤ４９ａおよびＬＭ６０９）はケミコン・インターナショナル（ＣＨ
ＥＭＩＣＯＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入した。

【０２２７】 結果は、コーティングされたプレート上の付着性ＨＵＶＥＣ細胞（ｙ軸）のパ
ーセンテージを示している２枚のヒストグラムである図１０Ａおよび１０Ｂに示
されているが、このとき細胞はマウスＩｇＧ（ｃ、対照）、またはα_１もしくは
β_１インテグリンサブユニットに対する抗体、またはα_Ｖβ_３インテグリンに対
する抗体と混合された。図１０Ａおよび１０Ｂは、アレステンコーティングおよ
びＩＶ型コラーゲンコーティングプレート上の付着性細胞のパーセンテージを各
々示している。アレステンコーティングプレートについてはα_１サブユニットに
ついての細胞付着においては６０％の阻害、β_１サブユニットについての細胞付
着においては７０％の阻害が観察されたが（図１０Ａ）、ＩＶ型コラーゲンコー
ティングプレート（図１０ｂ）はα_１については３０％、β_１については４０％
およびα_Ｖβ_３中和抗体については１５％のより控え目な阻害を示した。

【０２２８】 実施例１３：アレステンによるマトリックス金属プロテイナーゼの結合および阻
害 ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびこれらの酵素に対する抗体はオンコジーン（Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ， Ｉｎｃ．）社から購入した。以前に記載されたようにして（
Ｋａｌｌｕｒｉ， Ｒ．ら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：６２０１−５）、ヒト胎盤から単離した天然アレ
ステンを使用して直接ＥＬＩＳＡを実施した。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９はど
ちらもアレステンに特異的に結合した。これらは７Ｓドメインには結合しなかっ
た。この結合は各々ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−１結合からは独立している。

【０２２９】 アレステンが基底膜を分解させる能力を評価するために、マトリゲルをＭＭＰ
−２およびＭＭＰ−９と一緒に静かに振とうしながら３７℃で６時間に渡ってイ
ンキュベートした。上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＶ型コラーゲンのα２鎖に
対する抗体を用いる免疫ブロット法によって分析した。変性アッセイの開始時に
、濃度を上昇させながらアレステンを添加し、ＭＭＰ−２活性の阻害を観察した
。ＮＣ１ドメインは２６ｋＤａの単量体および５６ｋＤａの二量体としてＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲル内で分離し、ＩＶ型コラーゲン抗体を使用したウェスタンブロッ
ト法によって視認することができた。濃度を上昇させながらのアレステンはＭＭ
Ｐ−２による基底膜の分解を阻害したが、これはアレステンがＭＭＰ−２に結合
して基底膜コラーゲンを分解させることを防止できることを示す。ＭＭＰ−９に
ついても同様の結果が得られた。

【０２３０】 実施例１４：Ｅ． ｃｏｌｉ内でのカンスタチンの組換え産生 細菌発現プラスミドであるｐＥＴ２２ｂを使用して、ヒトカンスタチン（Ｃａ
ｎｓｔａｔｉｎ）をＣ−末端６−ヒスチジンタグを有する融合タンパク質として
Ｅ． ｃｏｌｉ内で産生させた。

【０２３１】 ＩＶ型コラーゲンのα２ＮＣ１ドメインに対するヌクレオチド配列（配列番号
：５）およびアミノ酸配列（配列番号：６）は、各々図１１Ａおよび１１Ｂに示
されている。フォワードプライマー５’−ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＴＣ Ａ
ＧＣ ＡＴＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ＣＴＣ−３’（配列番号：７）およびリバース
プライマー５’−ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＣＴＴ ＣＡＴ
ＧＣＡ ＣＡＣ−３’（配列番号：８）を使用して、カンスタチンをコードする
配列をＰＣＲによってα２ＮＣＩ（ＩＶ）／ｐＤＳベクター（Ｎｅｉｌｓｏｎ，
Ｅ． Ｇ．ら， １９９３， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：８４
０２−５； ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．Ｍ２４７６６（Ｋｉｌｌ
ｅｎ， Ｐ． Ｄ．ら， １９９４））から増幅させた。結果として生じたｃＤ
ＮＡ断片はＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化させ、予め消化したｐ
ＥＴ２２ｂ（＋）（ノヴァゲン［Ｎｏｖａｇｅｎ］製、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ
ｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）内へライゲーションした。構成物は図１２に示されてい
る。このライゲーションは、カンスタチンをｐｅｌＢリーダー配列の下流かつイ
ンフレームに配置し、可溶性タンパク質のぺリプラスム局在および発現を可能に
した。アミノ酸ＭＤＩＧＩＮＳＤ（配列番号：１３）をコードする追加のベクタ
ー配列がタンパク質に付加された。この配列の３’末端はポリ−ヒスチジン−タ
グ配列とインフレームにライゲーションされた。ｃＤＮＡの３’末端とヒス−タ
グの間の追加のベクター配列はアミノ酸ＫＬＡＡＡＬＥ（配列番号：１４）をコ
ードした。陽性クローンを両方の鎖についてシークエンシングした。

【０２３２】 カンスタチンをコードするプラスミド構成物を最初はＥ． ｃｏｌｉ ＨＭＳ
１７４（ノヴァゲン［Ｎｏｖａｇｅｎ］製、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ，ＵＳＡ）内へ形質転換させ、その後発現させるためにＢＬ２１（ノヴァゲン
［Ｎｏｖａｇｅｎ］製、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）内へ形
質転換させた。ＬＢ培地中の５００ｍｌ培地を接種するために一晩細菌培養物を
使用した。この培養物を細胞が０．６のＯＤ_６００に達するまで約４時間増殖さ
せた。その後０．５ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することによりタンパク
質発現を誘導した。２時間の誘導後、５，０００×ｇで遠心することにより細胞
を回収し、６Ｍグアニジン、０．１Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中への再懸濁により溶解させた。再懸濁させた細胞を短
時間超音波処理にかけ、１２，０００×ｇで３０分間遠心した。上清フラクショ
ンを２ｍｌ／ｍｉｎの速度で５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（キアゲン
［Ｑｉａｇｅｎ］、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に４〜６回通過させた。非
特異的に結合したタンパク質は、８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に溶解させた各１０ｍＭ、２５ｍＭお
よび５０ｍＭのイミダゾール液を用いて洗浄することによって除去した。カンス
タチンタンパク質は８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の２種のイミダゾール濃度（１２５ｍＭおよび２５
０ｍＭ）を用いてカラムから溶離させた。溶離したタンパク質は４℃でＰＢＳに
対して２回透析した。透析中に全タンパク質の一部が沈降した。透析したタンパ
ク質を収集し、約３，５００×ｇで遠心し、ペレットと上清フラクションとに分
離させた。各フラクション中のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（ピアース・ケ
ミカル［Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．］、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌ
ｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）および定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により測定した。Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって、約２６−３２ｋＤａ、おそらく２７ｋＤａの単量
体バンドが判明し、それらの内３ｋＤａはポリリンカーおよびヒスチジンタグ配
列から生じたのであろう。カンスタチンを含有する溶出液を合わせ、引き続いて
のアッセイで使用するためにＰＢＳに対して透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび
ウェスタンブロット法によって分析したカンスタチンタンパク質はポリ−ヒスチ
ジンタグ抗体によって検出した。カンスタチン抗体はまた、細菌性発現組換えコ
ンスタチンタンパク質も検出した。

【０２３３】 Ｅ． ｃｏｌｉ発現タンパク質は主として可溶性タンパク質として単離された
。ペレット中の総タンパク質のフラクションは約４０％で、残り６０％は可溶性
タンパク質として回収された。タンパク質の総収率は約１５ｍｇ／リットルであ
った。

【０２３４】 実施例１５：２９３胎児腎細胞におけるカンスタチンの発現 ヒトカンスタチンも、ｐｃＤＮＡ３．１真核生物ベクターを使用して、２９３
胎児腎細胞において分泌可溶性タンパク質として作製し、アフィニティクロマト
グラフィを使用して、（精製も検出タグも用いることなく）単離した。

【０２３５】 α２（ＩＶ）ＮＣ１を含有するｐＤＳプラスミド（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．
ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４０２−５）を使用して、
リーダーシグナル配列がｐｃＤＮＡ３．１真核生物発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒ
ｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）にインフレー
ムで付加されるよう、カンスタチンをＰＣＲ増幅した。全長α２（ＩＶ）鎖の５
’末端に由来するリーダー配列をＮＣ１ドメインの５’にクローニングし、培養
培地中へのタンパク質分泌を可能にした。カンスタチン含有組換えベクターを、
両側プライマーを使用して配列決定した。エラーを含まないｃＤＮＡクローンを
さらに精製し、タンパク質発現を確認するためのインビトロ翻訳実験に使用した
。塩化カルシウム法（Ｃｕｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡの９．１
．４〜９．１．７頁のＫｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，１９９６，”Ｃａｌｃｉｕ
ｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ”）を使用して、２９３細
胞にトランスフェクトするため、カンスタチン含有プラスミド及び対照プラスミ
ドを使用した。トランスフェクトされたクローンをジェネテシン（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，Ｍ
ａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）抗生物質処理により選択した。細胞死が認められなく
なるまで、抗生物質の存在下で、細胞を３週間維持した。クローンをＴ−２２５
フラスコへと拡大(expand)し、コンフルエントになるまで増殖させた。次いで、
上清を収集し、アミコン濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍ
ａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用して濃縮した。濃縮された上清を、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング、及びＥＬＩＳＡにより、カンスタチ
ン発現に関して分析した。ＥＬＩＳＡにより、強い結合が上清において検出され
た。カンスタチン含有上清を、カンスタチン特異的抗体（Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら
，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５３１８−２４）を使用した
アフィニティクロマトグラフィに供した。カンスタチン抗体（抗α２ＮＣ１抗体
、１：２００希釈）と免疫反応性の純粋な約２４ｋＤａのモノマーを含有する主
要なピークが同定された。

【０２３６】 実施例１６：カンスタチンは内皮細胞増殖を阻害する 仔ウシ大動脈内皮（Ｃ−ＰＡＥ）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含
むＤＭＥＭ中でコンフルエントまで増殖させ、接触阻害状態を４８時間維持した
。３７℃で５分間のトリプシン処理（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇ
ｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）に
より、細胞を採集した。１２，５００個の細胞を含む、０．５％ＦＣＳを含むＤ
ＭＥＭの懸濁液を、１０μｇ／ｍｌフィブロネクチンでコーティングされた２４
穴プレートの各ウェルに添加した。５％ＣＯ_２、９５％湿度で、３７℃で、２４
時間、細胞をインキュベートした。培地を除去し、０．５％ＦＣＳ（未刺激）又
は１０％ＦＣＳ（刺激され処理された細胞）を含有するＤＭＥＭと交換した。７
８６−Ｏ細胞、ＰＣ−３細胞、及びＨＥＫ２９３細胞を対照とし、これらも、同
様に、コンフルエントまで増殖させ、トリプシン処理し、そして播いた。０．０
２５〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のカンスタチン又はエンドスタチンで、三連
で細胞を処理した。チミジン取り込み実験においては、処理の時点で、全てのウ
ェルに１ｍキュリーの^３Ｈ−チミジンを与えた。２４時間後、培地を除去し、ウ
ェルをＰＢＳで３回洗浄した。放射能を１Ｎ ＮａＯＨで抽出し、Ｓｃｉｎｔｉ
Ｖｅｒｓｅ ＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ
ｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）溶液４ｍｌを含有するシンチレーショ
ンバイアルへ添加した。チミジン取り込みを、シンチレーションカウンターを使
用して測定した。

【０２３７】 結果を、図１３Ａ及び１３Ｂに示す。図１３Ａは、Ｃ−ＰＡＥ細胞の増殖に対
する、様々な量のカンスタチンの効果を示すヒストグラムである。チミジン取り
込み（カウント毎分）がｙ軸上に示されている。ｘ軸上の「０．５％」とは、０
．５％ＦＣＳ（未刺激）対照であり、「１０％」とは、１０％ＦＣＳ（刺激）対
照である。増加する濃度のカンスタチンによる処理は、チミジン取り込みを着実
に減少させた。図１３Ｂは、非内皮細胞７８６−Ｏ（斑点付きのバー）、ＰＣ−
３（斜線付きのバー）、及びＨＥＫ２９３（白バー）におけるチミジン取り込み
に対する、増加する量のカンスタチンの効果を示すヒストグラムである。チミジ
ン取り込み（カウント毎分）がｙ軸に示されており、ｘ軸は、３つの各細胞株に
ついての、０．５％ＦＣＳ（未刺激）及び１０％ＦＣＳ（刺激）対照、続いて増
加する濃度のカンスタチンを示している。全ての群が三連の試料を表し、バーは
、平均カウント毎分±平均の標準誤差を表している。

【０２３８】 メチレンブルー染色試験も実施した。前記と同様に、３，１００個の細胞を各
ウェルに添加し、処理し、次いで、Ｏｌｉｖｅｒら（Ｏｌｉｖｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら
，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ９２：５１３−８）の方法を使用
して細胞を計数した。全てのウェルを１×ＰＢＳ１００ｍｌで１回洗浄し、室温
で３０分間、１０％ホルマリンを含む中性緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）１００ｍ
ｌを添加することにより、細胞を固定した。ホルマリンを除去した後、細胞を１
％メチレンブルー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を含む０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）の
溶液で、室温で３０分間、染色した。染色溶液を除去した後、ウェルを０．０１
Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）１００ｍｌで５回洗浄した。室温で１時間、０．
１Ｎ ＨＣｌ／エタノール（１：１混合物）１００ｍｌを用いて細胞からメチレ
ンブルーを抽出した。メチレンブルー染色の量を、６５５ｎｍ波長の吸光度を使
用して、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）上で測定した。

【０２３９】 結果を、図１３Ｃ及び１３Ｄに示す。図１３Ｃは、Ｃ−ＰＡＥ細胞による色素
取り込みに対する、増加する量のカンスタチンの効果を示すヒストグラムである
。ＯＤ_６５５における吸光度が、ｙ軸上に示されている。「０．１％」とは、０
．１％ＦＣＳで処理された（未刺激）対照を表し、「１０％」とは、１０％ＦＣ
Ｓで処理された（刺激）対照である。残りのバーは、増加する濃度のカンスタチ
ンによる処理を表している。Ｃ−ＰＡＥ細胞においては、約０．６２５〜１．２
５μｇ／ｍｌのカンスタチン処理レベルで、色素取り込みが、未刺激細胞におい
て見られるレベルにまで低下した。図１３Ｄは、非内皮細胞ＨＥＫ２９３（白バ
ー）及びＰＣ−３（斜線付きのバー）に対する、様々な濃度のカンスタチンの効
果を示すヒストグラムである。ＯＤ_６５５における吸光度が、ｙ軸上に示されて
いる。「０．１％」とは、０．１％ＦＣＳで処理された（未刺激）対照を表し、
「１０％」とは、１０％ＦＣＳで処理された（刺激）対照である。バーは、１つ
の処理濃度当たり８ウェルについての、６５５ｎｍにおける相対吸光単位の平均
±標準誤差を表している。

【０２４０】 １０％血清で刺激された内皮細胞の用量依存的な阻害は、およそ０．５μｇ／
ｍｌのＥＤ_５０値で検出された（図１３Ａ及び１３Ｃ）。４０ｍｇ／ｍｌまでの
カンスタチン用量において、腎臓癌細胞（７８６−Ｏ）、前立腺癌細胞（ＰＣ−
３）、又はヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）の増殖に対しては、有意な効果が観
察されなかった（図１３Ｂ及び１３Ｄ）。この内皮細胞特異性は、カンスタチン
が特に効果的な抗血管新生剤である可能性が高いことを示している。

【０２４１】 実施例１７：カンスタチンは内皮細胞の遊走を阻害する 血管新生の過程において、内皮細胞は、増殖のみならず、遊走も行う。従って
、内皮細胞の遊走に対するカンスタチンの効果を評価した。ＦＢＳにより誘導さ
れる走化性に対するカンスタチン及びエンドスタチンの阻害効果を、ボイデン（
Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバーアッセイ（Ｎｅｕｒｏ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａ
ｂｉｎ Ｊｏｈｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を使用して、ヒト臍内皮細胞（
ＨＵＶＥＣ）において試験した。ＨＵＶＥＣ細胞を、１０％ＦＢＳ及び５ｎｇ／
ｍｌ ＤｉＩＣ１８（３）生体蛍光染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，
Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を含有するＭ１９９（Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒ
ｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）中で一夜増殖させた。細胞をトリプシン処理し
、洗浄し、０．５％ＦＢＳを含有するＭ１９９で希釈した後、カンスタチン（０
．０１又は１．００ｍｇ／ｍｌ）と共に、又はカンスタチンなしで、６０，００
０個の細胞を上方チャンバーのウェルに播種した。２％ＦＢＳを含有するＭ１９
９を走化性因子として下方チャンバーに置いた。８μｍの孔サイズのポリカーボ
ネートフィルター（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ，Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）により、細胞含有画分を、走化性因子から隔離した
。５％ＣＯ_２、９５％湿度で、３７℃で、４．５時間チャンバーをインキュベー
トした。遊走しなかった細胞を廃棄し、上方ウェルをＰＢＳで洗浄した後、プラ
スチックブレードでフィルターを掻き、４％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固
定し、グラススライド上に置いた。蛍光高倍率視野を使用して、いくつかの独立
の同種の画像を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰＭ
ＩＳ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃ
ｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳＡ）で作動するディジタルＳｅｎＳｙｓ（登録商
標）カメラにより記録した。ＯＰＴＩＭＩＺＥ６．０ソフトウェア−プログラム
（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）（Ｋｌｅ
ｍｋｅ，Ｒ．Ｌ．ら，１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：８５９−６
６）を利用することにより、細胞を計数した。

【０２４２】 結果を、図１４に示す。図１４は、無ＶＥＧＦ処理（ＶＥＧＦも血清も含まな
い）、ＶＥＧＦ処理（１％ＦＣＳ及び１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ）細胞、０．０
１カンスタチン処理（１％ＦＣＳ及び１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ及び０．０１μ
ｇ／ｍｌカンスタチン）、及び１．０μｇ／ｍｌカンスタチン処理（１％ＦＣＳ
及び１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ及び１μｇ／ｍｌカンスタチン）についての、視
野１個当たりの遊走した内皮細胞の数（ｙ軸）を示す棒グラフである。

【０２４３】 カンスタチンは、ＨＵＶＥＣの遊走を阻害し、１０ｎｇ／ｍｌで有意な効果が
観察された。内皮細胞の増殖及び遊走の両方を阻害するカンスタチンの能力は、
カンスタチンが血管新生の過程の中の複数の段階で作用することを示唆する。又
は、カンスタチンは、増殖及び遊走の両方に影響を与えることができるであろう
、刺激された内皮細胞に対するアポトーシスシグナルとして機能するのかもしれ
ない。アポトーシスの誘導は、もう一つの抗血管新生分子アンジオスタチンにつ
いて報告されている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９４，Ｃｅｌｌ ７
９：３１５−２８；Ｌｕｃａｓ，Ｒ．ら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９２：４７３
０−４１）。

【０２４４】 実施例１８：カンスタチンは内皮管形成を阻害する カンスタチンの抗血管新生能の最初の試験として、肉腫由来のマウス基底膜タ
ンパク質の固体ゲルであるマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）における内皮細胞に
よる管形成を抑止する能力に関して、それを評価した。マウス大動脈内皮細胞を
、マトリゲル上で培養した場合、それらは、急速に整列し、中空管様構造を形成
する（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ
．１９０：８５４−６３）。

【０２４５】 マトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を、２４穴
プレートの各ウェルに添加し（３２０ｍｌ）、重合させた（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ
．ら、前記）。２５，０００個のマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥ）を含む、抗生
物質を含まないＥＧＭ−２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）培地の懸濁液を、マトリゲ
ルでコーティングされた各ウェルへ移した。細胞を、増加する濃度のカンスタチ
ン、ＢＳＡ、滅菌ＰＢＳ、又はα５−ＮＣ１ドメインのいずれかで処理した。全
てのアッセイを三連で実施した。細胞を３７℃で２４〜４８時間インキュベート
し、ＣＫ２ Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡（３．３接眼レンズ、１０×対物レンズ）を
使用して観察した。次いで、細胞を、４００ＤＫでコーティングされたＴＭＡＸ
フィルム（Ｋｏｄａｋ）を使用して写真撮影した。細胞をｄｉｆｆ−ｑｕｉｋ固
定液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏ
ｕｒｉ，ＵＳＡ）を用いて染色し、再度写真撮影した（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら
，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９０：８５４−６３）。１
０個の視野を観察し、管を計数し、平均化した。

【０２４６】 結果を図１５に示す。図１５は、ＢＳＡ（白四角）、カンスタチン（黒四角）
、及びα５ＮＣ１（白丸）の様々な処理の下での、対照（ＰＢＳ処理ウェル）の
管形成に対する比率（％）としての管形成の量（ｙ軸）を示すグラフである。垂
直のバーは、平均の標準誤差を表す。結果は、カンスタチンが対照と比較して内
皮管形成を大きく減少させることを示している。

【０２４７】 ２９３細胞において産生されたカンスタチンは、用量依存的に内皮管形成を選
択的に阻害し、カンスタチンタンパク質１ｍｇの添加により管形成のほぼ完全な
阻害が見られた（図１５）。対照タンパク質である、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）及びＩＶ型コラーゲンα５鎖のＮＣ１ドメインは、いずれも、内皮管形成に
対する効果を有しておらず、このことは、このアッセイにおけるカンスタチンの
阻害効果が、カンスタチンに特異的であり、添加されたタンパク質含有量による
のではないことを証明している。これらの結果は、カンスタチンが抗血管新生剤
であることを示した。

【０２４８】 実施例１９：ＥＲＫ活性化に対するカンスタチンの効果 カンスタチンの抗増殖活性及び抗遊走活性に関与する分子メカニズムをさらに理
解するため、２０％ウシ胎仔血清及び内皮マイトジェンにより誘導されるＥＲＫ
（細胞外シグナル制御型キナーゼ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ
−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ））に対するカンスタチンの効果を評価し
た。ＨＵＶＥＣ細胞を、２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、
１００μｇ／ｍｌヘパリン、及び５０μｇ／ｍｌ内皮マイトジェン（Ｂｉｏｍｅ
ｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａ
ｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）が補足されたマッコイ（ＭａＣｏｙ’ｓ）培
地中で一夜培養した。翌日、細胞を洗浄し、低血清培地（１％ペニシリン／スト
レプトマイシン、１００μｇ／ｍｌヘパリン、及び５％ＦＢＳが補足されたマッ
コイ培地）中で４時間増殖させた。４時間後、培地を、２０μｇ／ｍｌカンスタ
チンを含む、又は含まない新鮮な低血清培地と交換した。１時間後、血清濃度を
２０％に調整し、内皮マイトジェンを最終濃度５０μｇ／ｍｌまで添加した。０
、５、１０、２５、及び４０分後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、受動溶解混合物（
ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｍｉｘ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ
ｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）＋ロイペプチン、ＰＭＳＦ、ＮａＦ、Ｎａ_３ＶＯ_４ 、β−グリセロリン酸(glycerophosphate)、及びピロリン酸ナトリウムで溶解さ
せた。溶解物をタンパク質濃度に関して定量し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上
で分離した。抗ホスホ−ＥＲＫ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用して、血清処
理ＨＵＶＥＣ及び血清＋カンスタチン処理ＨＵＶＥＣについて、ホスホ−ＥＲＫ
のウェスタンブロットを作製した。ＨＵＶＥＣにおけるＥＲＫリン酸化は、増殖
因子による刺激後５分以内に認められた。２０μｇ／ｍｌのカンスタチンによる
処理は、ＥＲＫの初期の活性化を改変させなかった。ＥＲＫリン酸化の減少は、
比較的遅い時点で観察され、そのプロフィールは、いくつかのマイトジェンで観
察された応答（Ｇｕｐｔａ，Ｋ．ら，１９９９，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２
４７：４９５−５０４；Ｐｅｄｒａｍ，Ａ．ら，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７３．２６７２２−２６７２８）と一致していた。これらの観察は、カ
ンスタチンが、ＶＥＧＦ受容体又はｂＦＧＦ受容体により活性化される近位の(p
roximal)事象を阻害することにより主に作用するのではないことを示している。

【０２４９】 実施例２０：カンスタチンは内皮細胞のアポトーシスを誘導する アネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識。カンスタチンの可能性のある作用様式としての
アポトーシスを確立するため、アネキシンＶ−ＦＩＴＣを使用して、外側へ転移
(externalize)したホスファチジルセリン（ＰＳ）を標識し、アポトーシス細胞
を評価した。０．５×１０^６個のＣ−ＰＡＥ細胞、ＰＣ−３細胞、７８６−Ｏ細
胞、及びＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳが補足されたＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈ
ｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）中で
、一夜、６穴組織培養プレートの各ウェルに添加した。翌日、４０ｎｇ／ｍｌの
ＴＮＦ−α（陽性対照）又は１５μｇ／ｍｌのカンスタチンと共に、新鮮な培地
を全てのウェルに添加した。対照細胞には、等容積のＰＢＳを与えた。２４時間
の処理後、脱離した細胞を含有する培地を収集し、付着した細胞をトリプシン処
理し、脱離した細胞と合わせ、３，０００×ｇで遠心分離した。次いで、細胞を
洗浄し、ホスファチジルセリンの外側への転移（初期のアポトーシスの指標）を
、製造業者の指示に従いＦＩＴＣで標識されたアネキシンＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で標識することにより
測定した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣで標識された細胞を、ＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌ
ｕｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｗａｌｔｈａ
ｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用して計数した。各処理につい
て、１５，０００個の細胞を計数し、リストモード（ｌｉｓｔｍｏｄｅ）に保存
した。次いで、このデータを標準的なＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅ
ｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
，ＵＳＡ）を使用して分析した。

【０２５０】 カンスタチンは、内皮細胞のアポトーシスを特異的に誘導することが見出され
、ＰＣ−３細胞株、７８６−Ｏ細胞株、又はＨＥＫ２９３細胞株に対しては有意
な効果が観察されなかった。 ＦＬＩＰタンパク質レベル。ＨＵＶＥＣ細胞を前記のＥＲＫアッセイと同様に処
理し、０、１、３、６、及び２４時間後に採集した。血清処理ＨＵＶＥＣ細胞及
び血清＋カンスタチン処理ＨＵＶＥＣ細胞におけるＦＬＩＰタンパク質レベルを
、抗ＦＬＩＰ抗体（Ｓａｔａ，Ｍ．ら，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７３：３３１０３−３３１０６）を使用して定量し、ビンキュリンレベルを使用
したタンパク質負荷量に対して規準化し、０時間点に対する比率（％）としてプ
ロットした。

【０２５１】 結果を図１６に示す。図１６は、時間（ｘ軸）に対する、ｔ＝０において存在
していたタンパク質に対する比率としての、ビンキュリンレベルの関数としての
ＦＬＩＰタンパク質レベル（ｙ軸）のグラフである。カンスタチン処理の１時間
後、ＦＬＩＰタンパク質レベルの減少が存在し、それは血清刺激の２４時間後ま
で持続し、このことから、カンスタチンのアポトーシス作用が、Ｆａｓにより活
性化されるアポトーシス阻害剤ＦＬＩＰにより媒介される可能性が高いことが示
された。内皮細胞はＦａｓ及びＦａｓＬの両方を構成性発現しているため（Ｓａ
ｔａ，Ｍ．ら、前記）、このＦＬＩＰの減少が、カスパーゼ活性化を誘発し、最
終的なアポトーシスシグナルをもたらす可能性は高い。

【０２５２】 実施例２１：カンスタチンはインビボで腫瘍増殖を阻害する ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３細胞）を培養物から採集し、２００万個の細胞を
含む滅菌ＰＢＳを、７〜９週齢の雄ＳＣＩＤマウスへ皮下注射した。腫瘍をおよ
そ４週間増殖させ、その後、動物を４匹毎の群に分割した。実験群には、１０ｍ
ｇ／ｋｇの用量でカンスタチンを、全容積０．１ｍｌのＰＢＳを用いて、毎日腹
腔内注射した。対照群には、等容積のＰＢＳを毎日与えた。処理開始時（０日目
）、腫瘍の容積は対照マウスについては８８ｍｍ^３〜１３５ｍｍ^３、カンスタチ
ン処理マウスについては１０８ｍｍ^３〜１４９ｍｍ^３であった。各群は５匹のマ
ウスを含有していた。特定の日に計算された腫瘍容積を、処理０日目の容積で割
り、腫瘍容積比（Ｖ／Ｖ_０）を得た。結果を、図１７Ａに示す。図１７Ａは、処
理日数（ｘ軸）に対してプロットされた、腫瘍容積比（ｙ軸）±標準誤差を図示
するグラフである。カンスタチン処理された腫瘍（黒四角）のサイズは、対照（
白四角）と比較して、わずかにしか増加しなかった。

【０２５３】 第二のＰＣ−３実験においては、ＰＣ−３細胞を培養物から採集し、３００万
個の細胞を、６〜７週齢の無胸腺ヌードマウスへ注射し、腫瘍をおよそ２週間皮
下で増殖させた後、動物を４匹毎の群に分割した。実験群（４匹）には、３ｍｇ
／ｋｇの用量でカンスタチンを、全容積０．２ｍｌのＰＢＳを用いて、又は８ｍ
ｇ／ｋｇで用量のエンドスタチンを、同容積のＰＢＳを用いて、毎日腹腔内注射
した。対照群（４匹）には、等容積のＰＢＳを毎日与えた。腫瘍の長さ及び幅を
Ｖｅｒｎｉｅｒカリパスを使用して測定し、長さ×幅^２×０．５２という標準式
を使用して、腫瘍容積を計算した。腫瘍の容積は２６ｍｍ^３〜７３ｍｍ^３の範囲
であり、前記と同様に、特定の日に計算された腫瘍容積を、処理０日目の容積で
割り、腫瘍容積比（Ｖ／Ｖ_０）を得た。結果を、図１７Ｂに示す。図１７Ｂは、
処理日数（ｘ軸）に対してプロットされた、腫瘍容積比（ｙ軸）±標準誤差を図
示するグラフである。対照（白四角）と比較して、カンスタチン処理された腫瘍
（黒四角）のサイズは、わずかにしか増加せず、結果は、エンドスタチン（白丸
）で達成された結果と比べて勝るとも劣らなかった。

【０２５４】 腎細胞癌細胞モデルについては、２００万個の７８６−Ｏ細胞を、７〜９週齢
の雄無胸腺ヌードマウスへ皮下注射した。腫瘍を、約１００ｍｍ^３又は約７００
ｍｍ^３のいずれかにまで増殖させた。各群は６匹のマウスを含有していた。カン
スタチンを含む滅菌ＰＢＳを、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で、１０日間、毎日、腹腔
内注射した。対照群には、同容積のＰＢＳを与えた。結果を、図１７Ｃ（１００
ｍｍ^３の腫瘍）及び１５Ｄ（７００ｍｍ^３の腫瘍）に示す。いずれの群において
も、カンスタチン処理された腫瘍（黒四角）は、対照（白四角）と比較して、実
際、萎縮した。

【０２５５】 大腸菌において産生されたカンスタチンは、腎細胞癌（７８６−Ｏ）の小さい
腫瘍（１００ｍｍ^３、図１７Ｃ）及び大きい腫瘍（７００ｍｍ^３、図１７Ｄ）の
増殖を、プラセボ処理マウスと比較して、それぞれ４倍及び３倍、阻害した。重
症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおける確立されたヒト前立腺（ＰＣ−３）
腫瘍については、カンスタチンは、１０ｍｇ／ｋｇで、賦形剤のみを注射された
マウスの５５％へと（１．８倍少なく）腫瘍容積比を維持した。無胸腺（ｎｕ／
ｎｕ）マウスにおいて、処理された腫瘍は、プラセボ処理マウスよりも２．４倍
小さかった。腫瘍サイズの減少は、ＣＤ−３１陽性脈管構造の減少（下記実施例
２９参照）と一致していた。無胸腺マウスにおいて、カンスタチン及びエンドス
タチンの両方を比較的低い用量で使用した場合、３ｍｇ／ｋｇのカンスタチンは
８ｍｇ／ｋｇのエンドスタチンと同一の抑制効果を有し、５ｍｇ／ｋｇの用量の
エンドスタチンは腫瘍増殖を抑制することができなかった。全てのインビボ研究
において、マウスは見かけ上健康であり、消耗の徴候はなく、いずれのマウスも
処理中死亡しなかった。

【０２５６】 実施例２２：カンスタチン処理マウスにおけるＣＤ３１免疫組織化学 インビボの腫瘍サイズの減少は、これらの腫瘍内の血管形成に対する抑制効果
を示唆している。異種移植腫瘍研究の最後に、マウスを屠殺し、腫瘍を切除した
。腫瘍血管を検出するため、パラフィン包埋された腫瘍切片に対して、抗ＣＤ３
１抗体アルカリホスファターゼ結合免疫細胞化学を実施した。除去された腫瘍を
、メスで、およそ３〜４ｍｍ厚さのいくつかの切片へと解体し、次いで４％パラ
ホルムアルデヒドで２４時間固定した。次いで、組織をＰＢＳへ２４時間移した
後、脱水及びパラフィン包埋を行った。パラフィン包埋後、３ｍｍの組織切片を
切り分け、取り付けた。切片を脱パラフィンし、再水和させ、３００ｍｇ／ｍｌ
プロテアーゼＸＸＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕ
ｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）で３７℃で５分間前処理した。１００％エタ
ノール中で消化を中止させた。切片を空気乾燥させ、再水和させ、１０％ウサギ
血清でブロッキングした。次いで、スライドを、ラット抗マウスＣＤ３１モノク
ローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ，ＵＳＡ）の１：５０希釈物と共に４℃で一夜インキュベートした後、ウサ
ギ抗ラット免疫グロブリン（ＤＡＫＯ）及びラットＡＰＡＡＰ（ＤＡＫＯ）の１
：５０希釈物と共に、３７℃で、それぞれ３０分間、連続的にインキュベートし
た。ニューフクシン（ｎｅｗ ｆｕｃｈｓｉｎ）を用いて発色反応を実施した。
切片をヘマトキシリンで対比染色した。

【０２５７】 カンスタチン処理腫瘍における腫瘍サイズの減少は、ＣＤ３１陽性脈管構造の
減少と一致していることが見出された。

【０２５８】 実施例２３：大腸菌におけるタムスタチン及びタムスタチン変異体の組換え作製 ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα３鎖のヌクレオチド配列（配列番号：
９）及びアミノ酸配列（配列番号：１０）が、それぞれ図１８Ａ及び１８Ｂに示
されている。フォワードプライマー５’−ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＧＧＴ Ｔ
ＴＧ ＡＡＡ ＧＧＡ ＡＡＡ ＣＧＴ−３’（配列番号：１１）及びリバース
プライマー５’−ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＣＴ ＴＴＴ
ＣＴＴ ＣＡＴ−３’（配列番号：１２）を使用して、α３ＮＣ１（ＩＶ）／ｐ
ＤＳベクター（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６８：８４０２−５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ９２９９３（
Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，Ｓ．ら，１９９４）、Ｍ８１３７９（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．ら
，１９９４）、及びＸ８００３１（Ｌｅｉｏｎｉｎ，Ａ．Ｋ．およびＭａｒｉｙ
ａｍａ，Ｍ．ら，１９９８））から、タムスタチンをコードする配列をＰＣＲに
より増幅した。得られたｃＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し
、予め消化されたｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉ
ｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）へとライゲートさせた。構築物を図１９に示す。ライ
ゲーションは、ｐｅｌＢリーダー配列の下流にインフレームでタムスタチンを配
置し、可溶性タンパク質のペリプラズムへの局在化及び発現を可能にした。アミ
ノ酸ＭＤＩＧＩＮＳＤ（配列番号：１３）をコードするさらなるベクター配列を
タンパク質に付加した。その配列の３’末端を、ポリヒスチジンタグ配列とイン
フレームでライゲートさせた。ｃＤＮＡの３’末端とｈｉｓタグとの間の付加的
なベクター配列は、アミノ酸ＫＬＡＡＡＬＥ（配列番号：１４）をコードしてい
た。陽性クローンを両鎖について配列決定した。タムスタチンをコードするプラ
スミド構築物を、まず、大腸菌ＨＭＳ１７４（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ
，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）へ形質転換し、次いで、発現のためＢＬ２１（
Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）へと形質転換
した。一夜細菌培養物を使用して、ＬＢ培地（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）中の培養物
５００ｍｌを接種した。この培養物を、細胞が０．６というＯＤ_６００に達する
まで、およそ４時間増殖させた。次いで、最終濃度１ｍＭまでのＩＰＴＧの添加
によりタンパク質発現を誘導した。２時間の誘導後、５，０００×ｇでの遠心分
離により細胞を採集し、６Ｍグアニジン、０．１Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０１
Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）への再懸濁により溶解させた。再懸濁した細
胞を短時間超音波処理し、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清画分
を、５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）に毎分２ｍｌのスピードで４〜６回通した。非特異的に結合した
タンパク質を、１０ｍＭイミダゾールを含む８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ _４ 、０．０１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び２５ｍＭイミダゾールを含
む８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８
．０）の両方で洗浄した。増加する濃度のイミダゾール（５０ｍＭ、１２５ｍＭ
、及び２５０ｍＭ）を含む８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０１Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で、カラムからタムスタチンタンパク質を溶出さ
せた。溶出したタンパク質を４℃でＰＢＳに対して２回透析した。全タンパク質
の一部が、透析中、沈殿した。透析されたタンパク質を収集し、およそ３，５０
０×ｇで遠心分離し、不溶性画分（ペレット）と可溶性画分（上清）へと分離し
た。

【０２５９】 大腸菌発現タムスタチンは、主に可溶性タンパク質として単離され、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ解析により３１ｋＤａにモノマーのバンドが出現した。付加的な３ｋＤ
ａが、ポリリンカー配列及びヒスチジンタグ配列より生じた。このバンドを含有
する溶出画分を、以下の実験において使用した。各画分中のタンパク質濃度をＢ
ＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，
Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）、及び走査型濃度計を使用した定量的ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析により決定した。非還元条件下で６０ｋＤａ付近に観察されたタムスタ
チンの二量体を表すバンドは、還元条件下で、３１ｋＤａの単一バンドとして分
離された。全タンパク質収量は、１リットル当たりおよそ５ｍｇであった。

【０２６０】 ５３個のＮ末端アミノ酸を欠いている組換え短縮型タムスタチン（タムスタチ
ン−Ｎ５３）を、他の変異体に関して以前に記載されたようにして（Ｋａｌｌｕ
ｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８）、
大腸菌において作製し、精製した。この変異体は、図２０に図示されている。図
２０は、α３（ＩＶ）ＮＣ１モノマー内の短縮されたアミノ酸の位置を示す合成
図である。黒丸は、「タムスタチン−Ｎ５３」（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９
９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８）を生成させるため、タ
ムスタチンから欠失させたＮ末端の５３アミノ酸残基に相当する。短いバーによ
り示されたジスルフィド結合は、α１（ＩＶ）ＮＣ１及びα２（ＩＶ）ＮＣ１（
Ｓｉｅｂｏｌｄ，Ｂ．ら，１９８８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６：６
１７−２４）に存在する場合と同様に配置されている。明確のため、２つの可能
性のあるジスルフィドコンフィギュレーションのうちの一方のみが示されている
。

【０２６１】 ヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１に対するウサギ抗体を、以前に記載されたようにして
調製した（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．
９９：２４７０−８）。モノクローナルラット抗マウスＣＤ３１（血小板内皮細
胞接着分子、ＰＥＣＡＭ−１）抗体は、（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）より購入した。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ラ
ットＩｇＧ抗体、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、及び西洋ワサビペルオ
キシダーゼと結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）より購入した。

【０２６２】 前記のようにして得られた濃縮された上清を、以前に記載されたようにして（
Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６
２−８）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングにより、タムスタチン発
現に関して分析した。一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１２％分離ゲル及び不連続緩
衝液系を用いて実施した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜へ移し、室
温で３０分間、２％ＢＳＡでブロッキングした。残りの結合部位をブロッキング
した後、膜を洗浄緩衝液で充分に洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１：１
０００に希釈された一次抗体と共にインキュベートした。インキュベーションは
、振とう器上で一夜室温で実施した。次いで、ブロットを洗浄緩衝液で充分に洗
浄し、振とう器上で、室温で、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した二次抗体
と共に３時間インキュベートした。再び、ブロットを充分に洗浄し、基質（０．
０１％塩化コバルト及びニッケルアンモニウムを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝
液に含まれたジアミノベンジジン）を添加し、室温で１０分間インキュベートし
た。次いで、基質溶液を流し捨て、過酸化水素を含有する基質緩衝液を添加した
。バンドの現像の後、蒸留水で反応を中止させ、ブロットを乾燥させた。３１ｋ
Ｄａの単一バンドが見られた。

【０２６３】 実施例２４：２９３胎児腎細胞におけるタムスタチンの発現 ヒトタムスタチンも、ｐｃＤＮＡ３．１真核生物ベクターを使用して、２９３
胎児腎細胞において分泌可溶性タンパク質として作製した。この組換えタンパク
質を、アフィニティクロマトグラフィを使用して、（精製も検出タグも用いるこ
となく）単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析及びイムノブロット分析により主要ピー
ク中に純粋なモノマー型を検出した。

【０２６４】 α３（ＩＶ）ＮＣ１を含有するｐＤＳプラスミド（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．
ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４０２−５）を使用して、
リーダーシグナル配列がｐｃＤＮＡ３．１真核生物発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒ
ｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）にインフレー
ムで付加されるよう、タムスタチンをＰＣＲ増幅した。全長α３（ＩＶ）鎖の５
’末端に由来するリーダー配列をＮＣ１ドメインの５’にクローニングし、培養
培地中へのタンパク質分泌を可能にした。タムスタチン含有組換えベクターを、
両側プライマーを使用して両鎖について配列決定した。エラーを含まないｃＤＮ
Ａクローンをさらに精製し、タンパク質発現を確認するためのインビトロ翻訳実
験に使用した。タムスタチン含有プラスミド及び対照プラスミドを使用して、塩
化カルシウム法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，１６．３２〜１６．４０頁）を使用し
て２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされたクローンをジェ
ネテシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）抗生物質処理により選択した
。細胞死が認められなくなるまで、抗生物質の存在下で、クローンを３週間維持
した。クローンをＴ−２２５フラスコへと拡大し、コンフルエントになるまで増
殖させた。次いで、上清を収集し、アミコン濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，
Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用して濃縮した。
濃縮された上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング、及びＥＬＩＳＡ
により、タムスタチン発現に関して分析した。ＥＬＩＳＡにより、強い結合が上
清において検出された。

【０２６５】 タムスタチン含有上清を、アフィニティクロマトグラフィに供し、抗タムスタ
チン抗体及び抗６−ヒスチジンタグ抗体（Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９１，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５３１８−２４）の両方を用いて免疫検出し
た。タムスタチン抗体と免疫反応性の約３１ｋＤａのモノマーを含有する主要な
ピークが同定された。

【０２６６】 実施例２５：タムスタチンは内皮細胞増殖を阻害する 大腸菌により産生された可溶性タンパク質を使用した^３Ｈ−チミジン取り込み
アッセイにより、Ｃ−ＰＡＥ細胞に対するタムスタチンの抗増殖効果を調べた。
細胞株及び培養物。７８６−Ｏ（腎臓明細胞癌系）、ＰＣ−３（ヒト前立腺癌細
胞株）、Ｃ−ＰＡＥ（ウシ肺動脈内皮細胞株）、ＨＰＥ（ヒト一次前立腺内皮細
胞）、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）、ＭＡＥ（マウス大動脈内皮細胞株）
は、全て、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手した。７８６−Ｏ細胞
株及びＣ−ＰＡＥ細胞株は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が補足された、１０
％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、及び１００ｍｇ／
ｍｌのストレプトマイシンが補足されたＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ
，ＵＳＡ）中で維持し、ＨＰＥ細胞は、ウシ下垂体抽出物及び組換えヒトＥＧＦ
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）が補足されたケラチノサイト−ＳＦＭ
中で維持し、ＨＵＶＥＣ細胞及びＭＡＥ細胞はＥＧＭ−２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳ
Ａ）中で維持した。 増殖アッセイ。Ｃ−ＰＡＥ細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中でコンフルエ
ントまで増殖させ、接触阻害状態を４８時間維持した。Ｃ−ＰＡＥ細胞は、２〜
４代目で使用した。７８６−Ｏ細胞及びＰＣ−３細胞は、この実験において、非
内皮対照として使用した。３７℃で５分間のトリプシン処理（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）により、細胞を採集した。１２，５００個の細胞を含む、
０．１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭの懸濁液を、１０μｇ／ｍｌフィブロネクチンで
コーティングされた２４穴プレートの各ウェルに添加した。細胞を５％ＣＯ_２、
９５％湿度で、３７℃で、２４時間インキュベートした。培地を除去し、２０％
ＦＣＳを含有するＤＭＥＭと交換した。未刺激対照細胞は、０．１％ＦＣＳと共
にインキュベートした。細胞を、０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度
のタムスタチンで処理した。処理開始の１２時間後に、全てのウェルに、１ｍキ
ュリーの^３Ｈ−チミジンを与えた。２４時間後、培地を除去し、ウェルをＰＢＳ
で３回洗浄した。細胞を１Ｎ ＮａＯＨで抽出し、ＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ Ｉ
Ｉ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓ
ｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）溶液４ｍｌを含有するシンチレーションバイアルへ添
加した。チミジン取り込みを、シンチレーションカウンターを使用して測定した
。

【０２６７】 メチレンブルー染色法においては、７０００個の細胞を９６ウェルプレートの
各ウェルに播き、前記と同様に処理した。次いで、Ｏｌｉｖｅｒら（Ｏｌｉｖｅ
ｒ，Ｍ．Ｈ．ら，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．９２：５１３−８）の方法
を使用して、細胞を計数した。４８時間の処理の後、全てのウェルをＰＢＳ１０
０μｌで洗浄し、１０％ホルマリンを含む中性緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）で細
胞を固定した。次いで、細胞を、１％メチレンブルー（Ｓｉｇｍａ）を含む０．
０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で染色した。０．０１Ｍホウ酸緩衝液でウェ
ルを洗浄し、０．１Ｎ ＨＣｌ／エタノールを用いて細胞からメチレンブルーを
抽出し、６５５ｎｍでマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕ
ｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で吸光度を測定した。内毒素を不活化
するため、ポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度５μｇ／ｍｌで使用した（
Ｌｉｕ，Ｓ．ら，１９９７，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：４５５−６３）
。

【０２６８】 結果を、図２１Ａ、２１Ｂ、及び２１Ｃに示す。これらの図は、様々な濃度の
タムスタチン（ｘ軸）で処理した場合の、Ｃ−ＰＡＥ細胞（図２１Ａ）、ＰＣ−
３細胞（図２１Ｂ）、及び７８６−Ｏ細胞（図２１Ｃ）の^３Ｈ−チミジン取り込
み（ｙ軸）を示すヒストグラムである。全ての群が三連の試料を表す。タムスタ
チンは、２０％ＦＣＳにより刺激される^３Ｈ−チミジン取り込みを用量依存的に
阻害し、ＥＤ_５０はおよそ０．０１ｍｇ／ｍｌであった（図２１Ａ）。また、前
立腺癌細胞（ＰＣ−３）又は腎臓癌細胞（７８６−Ｏ）では、２０ｍｇ／ｍｌま
でのタムスタチン用量ですら、有意な抗増殖効果が観察されなかった（図２１Ｂ
及び２１Ｃ）。タムスタチン処理（０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ）と対照とにおける ^３ Ｈ−チミジン取り込みの平均値の差は、有意（Ｐ＜０．０５）であった。ＰＣ
−３細胞又は７８６−Ｏ細胞をタムスタチンで処理した場合には、阻害効果が観
察されなかった（図２１Ｂ、２１Ｃ）。各ヒストグラム(column)は、三連ウェル
の平均±ＳＥを表す。この実験は３回繰り返された。アスタリスク付きのバーは
、有意である（片側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５）。

【０２６９】 実施例２６：競合増殖アッセイ 前記の内皮細胞増殖アッセイの場合で記載のようにして、Ｃ−ＰＡＥ細胞を、
９６ウェルプレートに播いた。最終濃度０．１μｇ／ｍｌのタムスタチンを、様
々な濃度（０、０．００８、０．０８、０．８、１．６、及び２．４μｇ／ｍｌ
）のヒトα_Ｖβ_３タンパク質（ＣＨＥＭＩＣＯＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）と共に、室温で３０分間
インキュベートした。次いで、この混合物をウェルに添加し、４８時間インキュ
ベートした。次いで、前記の内皮細胞増殖アッセイの場合で記載のようにして、
メチレンブルー染色法を使用して、増殖アッセイを実施した。

【０２７０】 結果を図２２に示す。図２２は、増加する量のα_Ｖβ_３と組み合わせられた０
．１μｇ／ｍｌタムスタチンの、Ｃ−ＰＡＥ細胞による色素取り込みに対する効
果を示すヒストグラムである。ＯＤ_６５５における吸光度がｙ軸上に示されてい
る。「０．１％ＦＣＳ」とは、０．１％ＦＣＳで処理された（未刺激）対照を表
し、「２０％ＦＣＳ」とは、２０％ＦＣＳで処理された（刺激）対照である。残
りのバーは、α_Ｖβ_３のみの対照、及びタムスタチン＋増加する濃度のα_Ｖβ_３ による処理を表す。各バーは、三連ウェルについての平均±平均の標準誤差を表
す。実験は３回繰り返された。アスタリスクは、片側スチューデントｔ検定によ
るＰ＜０．０５を示している。

【０２７１】 前記のように、通常、タムスタチンは、用量依存的に細胞増殖を阻害する。し
かしながら、α_Ｖβ_３インテグリンタンパク質を添加した場合、タムスタチンの
抗増殖効果は、増加する濃度のα_Ｖβ_３タンパク質により用量依存的に逆転(rev
erse)された。このことは、α_Ｖβ_３インテグリンタンパク質が、内皮細胞増殖
を阻害するために利用可能なタムスタチンを効率的に「飽和」させたことを示し
ている。α_Ｖβ_３は、２．４μｇ／ｍｌ（３倍モル過剰）で、タムスタチンによ
り誘導される抗増殖効果を、４３．１％、有意に逆転させた。α_Ｖβ_３のみによ
る処理は、内皮細胞増殖を阻害することができなかった。

【０２７２】 実施例２７：タムスタチンは内皮細胞のアポトーシスを誘導する アネキシンＶ−ＦＩＴＣアッセイ。アポトーシスの初期の段階においては、原
形質膜の内側表面から外側への膜リン脂質ＰＳの輸送が観察される（ｖａｎ Ｅ
ｎｇｅｌａｎｄ，Ｍ．ら，１９９８，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ３１：１−９；Ｚｈ
ａｎｇ，Ｇ．ら，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：５２５−５３
１；Ｋｏｏｐｍａｎ，Ｇ．ら １９９４，Ｂｌｏｏｄ ８４；１４１５−１４２
０）。外側へ転移したＰＳは、天然にＰＳとの高い結合親和性を有しているアネ
キシンＶのＦＩＴＣ結合物による染色により、検出されうる（ｖａｎ Ｅｎｇｅ
ｌａｎｄ、前記）。従って、タムスタチンで処理した際の、内皮細胞のアポトー
シスを、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識を使用して評価した。

【０２７３】 Ｃ−ＰＡＥ細胞（０．５×１０^６個／ウェル）を含む、１０％ＦＣＳが補足さ
れたＤＭＥＭを、６穴プレートに播いた。翌日、８０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（
陽性対照）又は０．０２〜２０μｇ／ｍｌの範囲のタムスタチンのいずれかと共
に、１０％ＦＣＳを含有する新鮮な培地を添加した。対照細胞には、等容積のＰ
ＢＳを与えた。１８時間の処理後、浮遊細胞を含有する培地を収集し、付着した
細胞をトリプシン処理し、浮遊細胞と共に３，０００×ｇで遠心分離した。次い
で、細胞をＰＢＳで洗浄し、結合緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐ
Ｈ７．４）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２）へ再懸濁させた
。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を最終濃度１５０ｎｇ／ｍｌまで添加し、細胞を暗所で
１０分間インキュベートした。細胞を再びＰＢＳで洗浄し、結合緩衝液へ再懸濁
させた。アネキシンＶ−ＦＩＴＣで標識された細胞を、ＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕ
ｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ
，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用して計数した。各処理について
、１５，０００個の細胞を計数し、リストモードに保存した。次いで、このデー
タをＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，
Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用して分析した。

【０２７４】 タムスタチンは、２０μｇ／ｍｌで、１８時間後にアネキシン蛍光ピークの明
確なシフトを示した。蛍光強度のシフトは、２０μｇ／ｍｌのタムスタチンと陽
性対照ＴＮＦ−α（８０ｎｇ／ｍｌ）とで類似していた。タムスタチンは、２μ
ｇ／ｍｌでも、アネキシン蛍光強度の穏和なシフトを示したが、０．２μｇ／ｍ
ｌ未満の濃度は、アネキシンＶ陽性を示さなかった。このピーク強度のシフトは
、非内皮細胞（ＰＣ−３）を使用した場合には観察されなかった。

【０２７５】 タムスタチンは、位相差顕微鏡によりモニタリングされるようにＣ−ＰＡＥ細
胞の細胞形態学も改変させた。フィブロネクチンでコーティングされたプレート
上で、１０％ＦＣＳの存在下で、２０μｇ／ｍｌのタムスタチンで細胞を２４時
間処理した後、アポトーシス細胞の典型的な形態学的特徴、膜の小疱形成、細胞
質の萎縮、及び染色質の凝縮が観察できた。対照ウェルにおいては、細胞は無傷
の形態学を示した。 カスパーゼ−３アッセイ。カスパーゼ−３（ＣＰＰ３２）は、アポトーシスの初
期段階で活性化される細胞内プロテアーゼであり、構造タンパク質及びＤＮＡ修
復タンパク質を分解することにより細胞の破壊を開始させる（Ｃａｓｃｉｏｌａ
−Ｒｏｓｅｎ，Ｌ．ら，１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１９５７−１
９６４；Ｓａｌｖｅｓｅｎ，Ｇ．Ｓ．ら，１９９７，Ｃｅｌｌ ９１：４４３−
４４６）。標識された基質（ＤＥＶＤ−ｐＮＡ）から切断される発色団（ｐ−ニ
トロアニリド）の検出により、カスパーゼ−３のプロテアーゼ活性を、分光測光
的に測定した。

【０２７６】 Ｃ−ＰＡＥ細胞又はＰＣ−３細胞（０．５×１０^６個／ウェル）を含む、１０
％ＦＣＳが補足されたＤＭＥＭを、フィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）で予め
コーティングされた６穴プレートに播き、一夜インキュベートした。翌日、培地
を２％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭと交換し、次いで３７℃で一夜インキュベート
した。次いで、細胞を、２％ＦＣＳが補足され、ＴＮＦ−α（８０ｎｇ／ｍｌ、
陽性対照）又はタムスタチン（１０μｇ／ｍｌ）のいずれかをも含有するＤＭＥ
Ｍに含まれたｂＦＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、２４時間インキュベートした
。対照にはＰＢＳ緩衝液を与えた。２４時間後、上清細胞を収集し、付着してい
る細胞をトリプシン処理し、上清細胞と合わせた。細胞を計測し、４×１０^７個
／ｍｌの濃度で、細胞溶解緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）に再懸濁させた。プロトコルの残りは、製造業者
の指示に従った（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ，ＵＳＡ）。カスパーゼ−３の特異的阻害剤、ＤＥＶＤ−ｆｍｋ（Ａｓｐ−Ｇ
ｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン）を使用して、アッセイの特異性
を確認した。吸光度は４０５ｎｍでマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で測定した。アッセイは
、各細胞株について３回繰り返された。

【０２７７】 結果を、図２３Ａ及び２３Ｂに示す。これらの図は、様々な処理（ｘ軸）の下
での、Ｃ−ＰＡＥ細胞（図２３Ａ）及びＰＣ−３細胞（図２３Ｂ）についての、
ＯＤ_４０５における吸光度の関数としてのカスパーゼ−３活性の量（ｙ軸）を示
す一対のヒストグラムである。各ヒストグラムは、三連ウェルの平均±平均の標
準誤差を表す。

【０２７８】 対照と比較して、２０μｇ／ｍｌタムスタチンで処理されたＣ−ＰＡＥ細胞は
、カスパーゼ−３活性の１．６倍の増加を示し、陽性対照ＴＮＦ−αはほぼ同等
（１．７倍）の増加を与えた。カスパーゼ−３の特異的阻害剤、ＤＥＶＤ−ｆｍ
ｋは、プロテアーゼ活性をベースラインまで減少させた。このことは、測定され
た活性の増加が、カスパーゼ−３に特異的であったことを示している。非内皮Ｐ
Ｃ−３細胞においては、対照とタムスタチン処理細胞との間にカスパーゼ−３活
性の差が存在しなかった。

【０２７９】 実施例２８：細胞接着アッセイ インテグリンサブユニットα_１〜α_６、β_１、及びα_Ｖβ_３インテグリン阻止
抗体の存在下での、タムスタチンでコーティングされたプレートへのＨＵＶＥＣ
の付着を調べた。このアッセイは、Ｓｅｎｇｅｒら（Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら
，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１３６１
２−１３６１７）の方法をわずかに修正したものに従い実施した。９６ウェルプ
レートを、１０μｇ／ｍｌの濃度のヒトタムスタチン、マウスラミニン−１、又
はヒトＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）
のいずれかで、３７℃で、一夜コーティングした。次いで、０．５μｇ／ｍｌの
濃度のビトロネクチン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を
使用してプレートをコーティングした。残留タンパク質結合部位を、１００ｍｇ
／ｍｌのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を含むＰＢＳで２時間ブロッキングした。ＨＵＶＥ
Ｃ細胞をサブコンフルエント（７０〜８０％）までＥＧＭ−２培地中で増殖させ
、穏和にトリプシン処理し、無血清培地に再懸濁させた（１．５×１０^５個／ｍ
ｌ）。細胞をマウスＩｇＧ_１（対照）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）
又は抗体（ヒトβ_１インテグリンに対するマウスモノクローナル抗体（クローン
Ｐ４Ｃ１０）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）；ヒトインテグリンα_１ 〜α_６（ＣＨＥＭＩＣＯＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）；α_Ｖβ_３インテグリン（クローンＬＭ６０９
）（ＣＨＥＭＩＣＯＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に対するモノクローナル
抗体のいずれか１０μｇ／ｍｌと混合し、穏和に撹拌しながら室温で１５分間イ
ンキュベートした。次いで、細胞懸濁液１００マイクロリットルを各ウェルに添
加し、３７℃で４５分間インキュベートした。付着していない細胞を洗浄により
除去し、付着した細胞の数を、メチレンブルー染色の後、計数した。前記手順に
従い、Ｃ−ＰＡＥ細胞を、別の実験で使用した。

【０２８０】 結果を、図２４Ａ〜２４Ｄ、及び図２５に示す。図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、
及び２４Ｄは、インテグリンサブユニットα_１〜α_６、β_１、及びα_Ｖβ_３イン
テグリン阻止抗体の存在下での、タムスタチン（図２４Ａ）、又はＩＶ型コラー
ゲン（図２４Ｂ）、ビトロネクチン（図２４Ｃ）、もしくはラミニン−１（図２
４Ｄ）の対照でコーティングされたプレートへのＨＵＶＥＣ細胞の結合を示す一
組の４つのヒストグラムである。図２５は、タムスタチンでコーティングされた
プレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合を示すヒストグラムである。プレートコーテ
ィングは各グラフの上に示されており、インキュベーションに使用された抗体が
各グラフのｘ軸上に示されている。ＢＳＡでコーティングされたプレートを陰性
対照として使用した。

【０２８１】 タムスタチンでコーティングされたプレートへのＨＵＶＥＣ細胞の付着は、Ｉ
ｇＧでコーティングされた対照プレートと比較して、抗α_６抗体、抗β_１抗体、
又は抗α_Ｖβ_３抗体により有意に阻止された。細胞付着は、抗β_１抗体と抗α_Ｖ β_３抗体とを共に使用した場合、さらに阻害された。対照ＩｇＧ処理と比較して
、α_Ｖβ_３抗体は、細胞付着を８０％阻害し、α_６抗体又はβ_１抗体は５４％阻
止した。α_５抗体はわずかな阻害（２０％）を示したが、サブユニットα_１〜α _４ に対する抗体は細胞付着を阻止しなかった。α_Ｖβ_３抗体とβ_１抗体とを共に
使用した場合、細胞結合は９１％阻止された。

【０２８２】 タムスタチンでコーティングされたプレートにおいて、ＨＵＶＥＣ細胞の代わ
りにＣ−ＰＡＥ細胞を使用した場合にも、ほぼ同等の阻害が観察された。ＩＶ型
コラーゲン、ビトロネクチン、及びラミニン−１でコーティングされたプレート
も対照とした。α_１β_１及びα_２β_１インテグリンはコラーゲンと結合する（Ｅ
ｌｉｃｅｓ，Ｍ．Ｊ．ら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８６：９９０６−９９１０；Ｉｇｎａｔｉｕｓ，Ｍ．Ｊ．ら，１９９０
，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：７０９−７２０）。ＩＶ型コラーゲンでコ
ーティングされたプレートへの細胞結合は、対照ＩｇＧと共にインキュベートさ
れた細胞と比較して、α_１（２０％）、α_２（２７％）、及びβ_１（５３％）に
対する抗体により部分的に阻害された。α_Ｖβ_３インテグリンは、ビトロネクチ
ンの受容体である（Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．ら，１９９２，Ｃｅｌｌ ６９：１１
−２５）。ビトロネクチンでコーティングされたプレートへの細胞結合は、α_Ｖ β_３抗体により６１％阻害された。α_５β_１及びα_６β_１インテグリンは、ラミ
ニンと結合する（Ｗａｙｎｅｒ，Ｅ．Ａ．ら，１９８８，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１０７：１８８１−１８９１；Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ，Ａ．ら，１９８８，
Ｎａｔｕｒｅ ３３６：４８７−４８９）。抗α_５抗体又は抗α_６抗体は、ラミ
ニン−１でコーティングされたプレートへの内皮細胞の結合を、それぞれ５０％
及び８９％、阻止した。タムスタチンでコーティングされたプレートへの細胞付
着（図２５）は、ＩｇＧで処理された対照と比較して、抗β_１抗体又は抗α_ｖβ _３ 抗体により有意に阻害された。抗β_１抗体と抗α_Ｖβ_３抗体とを共に使用した
場合、細胞付着はさらに阻害された。

【０２８３】 実施例２９：タムスタチンは内皮管形成を阻害する マトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を、２４穴
プレートの各ウェルに添加し（３２０ｍｌ）、重合させた（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ
．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９０：８５４−６３）
。２５，０００個のＭＡＥ細胞を含む、抗生物質を含まないＥＧＭ−２培地（Ｃ
ｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）の懸濁液を、マトリゲルでコーティングされた各ウェルへ
移した（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃ
ｔ．１９０：８５４−６３）。細胞を、増加する濃度のタムスタチン、ＢＳＡ、
又は７Ｓドメインのいずれかで処理した。対照細胞は、滅菌ＰＢＳと共にインキ
ュベートした。全てのアッセイを三連で実施した。細胞を３７℃で２４〜４８時
間インキュベートし、ＣＫ２ Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡（３．３×接眼レンズ、１
０×対物レンズの倍率）を使用して観察した。次いで、細胞を、４００ＤＫでコ
ーティングされたＴＭＡＸフィルム（Ｋｏｄａｋ）を使用して写真撮影した。細
胞をｄｉｆｆ−ｑｕｉｋ固定液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を用いて染色し、再度写真撮影した
（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１
９０：８５４−６３）。実験プロトコルを承知していない２人の研究者により１
０個の視野が観察され、管の数が計数され、そして平均をとった。

【０２８４】 結果を図２６に示す。マウス大動脈内皮細胞を、マウス基底膜タンパク質の固
体ゲルであるマトリゲル上で培養した場合、それらは、急速に整列し、中空管様
構造を形成する（Ｈａｒａｌａｂｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｃ．ら，１９９４，Ｌａ
ｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：５７５−８２）。２９３細胞において産生されたタム
スタチンは、ＢＳＡ対照と比較して、ＭＡＥ細胞における内皮管形成を用量依存
的に有意に阻害した（図２６）。１ｍｇ／ｍｌのタンパク質による処理後の管形
成の比率（％）は、ＢＳＡで９８．０±４．０、タムスタチンで１４．０±４．
０であった。大腸菌で産生されたタムスタチンを使用しても、類似の結果が得ら
れた。ＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン（Ｎ末端非コラーゲン性ドメイン）は、
内皮管形成に対する効果を有していなかった。タムスタチンによる最大阻害は、
８００〜１０００ｎｇ／ｍｌの間で達成された。タムスタチン処理（黒丸、０．
１〜１０ｍｇ／ｍｌ）と対照（ＢＳＡ（白四角）、７Ｓドメイン（白丸））との
平均比率の値の差は、有意であった（Ｐ＜０．０５）。各点は、三連ウェルの平
均±ＳＥを表す。この実験は、３回繰り返された。アスタリスク付きのデータ点
は、有意（片側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５）であった。良好に形
成された管が、７Ｓドメイン処理において観察された。０．８ｍｇ／ｍｌタムス
タチンにより処理されたＭＡＥ細胞は、減少した管形成を示した。

【０２８５】 新毛細管形成に対するタムスタチンのインビボ効果を評価するため、マトリゲ
ルプラグアッセイを実施した（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ，Ａ．ら，１９９２，Ｌａｂ
．Ｉｎｖｅｓｔ．６７：５１９−２９）。５〜６週齢の雄Ｃ５７／ＢＬ６マウス
（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉ
ｎｅ，ＵＳＡ）を入手した。マトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏ
ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔ
ｔｓ，ＵＳＡ）を４℃で一夜解凍させた。Ｃ５７／ＢＬ６マウスへ注射する前に
、２０Ｕ／ｍｌのヘパリン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃ
ｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）、１５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｒ＆
Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）
、及び１ｍｇ／ｍｌのタムスタチンと混合した。対照群には、血管新生阻害剤を
与えなかった。マトリゲル混合物を、２１ゲージの針を使用して皮下注射した。
１４日後、マウスを屠殺し、マトリゲルプラグを除去した。マトリゲルプラグを
４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で室温で４時間固定した後、２４時間Ｐ
ＢＳへと移した。プラグをパラフィン包埋し、切片化し、Ｈ＆Ｅ染色した。切片
を光学顕微鏡により検査し、１０個の高倍率視野で血管の数を計数し、平均した
。全ての切片が、暗号化され、実験プロトコルを承知していない病理学者によっ
て観察された。

【０２８６】 マトリゲルを、大腸菌で産生されたタムスタチンと共に、又は該タムスタチン
なしで、ｂＦＧＦ及びヘパリンの存在下においた場合、１ｍｇ／ｍｌタムスタチ
ンの処理により、血管の数の６７％の減少が観察された。高倍率視野１個当たり
の血管数は、タムスタチンで２．２５±１．３２、対照で７．５０±２．１７で
あった。各ヒストグラムは、１群当たり５〜６匹のマウスの平均±ＳＥを表して
いる。タムスタチン（１ｍｇ／ｍｌ）は、ＰＢＳで処理された対照と比較してイ
ンビボ新血管形成を有意に阻害した。タムスタチン処理動物と対照動物との平均
比率の値の差は、有意であった（Ｐ＜０．０５）。タムスタチン処理は、有意（
片側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５）であった。

【０２８７】 実施例３０：タムスタチン及びタムスタチン変異体はインビボで腫瘍増殖を阻害
する ５００万個のＰＣ−３細胞を採集し、７〜９週齢雄無胸腺ヌードマウスの背部
に皮下注射した。Ｖｅｒｎｉｅｒカリパスを使用して腫瘍を測定し、幅^２×長さ
×０．５２という標準式を使用して、容積を計算した。腫瘍を約１００ｍｍ^３ま
で増殖させ、次いで動物を５又は６匹毎の群に分けた。タムスタチン又はマウス
エンドスタチンを含む滅菌ＰＢＳを、各実験群に、１０日間毎日腹腔内注射した
（２０ｍｇ／ｋｇ）。対照群には、賦形剤注射（ＢＳＡ又はＰＢＳのいずれか）
を行った。２又は３日毎に１０日間、腫瘍容積を計算した。結果を、図２７Ａに
示す。図２７Ａは、ＰＢＳ対照（白四角）、２０ｍｇ／ｋｇタムスタチン（黒丸
）、及び２０ｍｇ／ｋｇエンドスタチン（白丸）についての、処理日数（ｘ軸）
に対する腫瘍容積（ｍｍ^３）（ｙ軸）を示すグラフである。大腸菌において産生
されたタムスタチンは、ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の増殖を有意に阻害した（図２
７Ａ）。２０ｍｇ／Ｋｇのタムスタチンによる腫瘍増殖の阻害は、２０ｍｇ／ｋ
ｇのエンドスタチンによる阻害と類似してした（図２７Ａ）。腫瘍増殖に対する
有意な阻害効果が１０日目に観察された（対照で２０２．８±５０．０ｍｍ^３、
タムスタチンで８２．９±−２５．２ｍｍ^３、エンドスタチンで６８．９±１６
．７ｍｍ^３）。タムスタチン又はエンドスタチンの毎日の腹腔内注射は、対照と
比較して、ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）腫瘍の増殖を阻害した。この実験は、
腫瘍容積が１００ｍｍ^３未満であったとき、開始された。

【０２８８】 マウスにおける他の確立された原発腫瘍に対するタムスタチンの効果も研究し
た。２００万個の７８６−Ｏ腎細胞癌細胞を、７〜９週齢雄無胸腺ヌードマウス
の背部に皮下注射した。腫瘍を約６００〜約７００ｍｍ^３まで増殖させ、次いで
動物を６匹毎の群に分けた。タムスタチンを含む滅菌ＰＢＳを、１０日間、毎日
腹腔内注射した（６ｍｇ／ｋｇ）。対照群には、ＢＳＡ注射を与えた。結果を、
図２７Ｂに示す。図２７Ｂは、ＰＢＳ対照（白四角）及び６ｍｇ／ｋｇタムスタ
チン（黒丸）についての、処理日数（ｘ軸）に対する腫瘍容積（ｍｍ^３）（ｙ軸
）を示すグラフである。大腸菌により産生されたタムスタチンは、６ｍｇ／ｋｇ
で、ＢＳＡ対照と比較して、７８６−Ｏヒト腎細胞癌の腫瘍増殖を阻害した（図
２７Ｂ）。腫瘍増殖に対する有意な阻害効果が１０日目に観察された（対照で１
０９６±１７９．７ｍｍ^３、タムスタチンで６１９±１２０．７ｍｍ^３）。タム
スタチンの毎日の腹腔内注射は、対照と比較して、ヒト腎細胞癌（７８６−Ｏ）
の腫瘍増殖を阻害した。この実験は、腫瘍容積が６００〜７００ｍｍ^３であった
とき、開始された。各点は、１群当たり５〜６匹のマウスの平均±ＳＥを表す。
アスタリスク付きのデータ点は、有意（片側スチューデントｔ検定によりＰ＜０
．０５）であった。

【０２８９】 ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメイン（α３（ＩＶ）ＮＣ１）の一部は
、グッドパスチャー症候群の病原性エピトープである（Ｂｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｒ
．Ｊ．ら，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：７８７４−７；Ｓａｕ
ｓ，Ｊ．ら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１３３７４−８０；
Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２４０
１８−２４）。グッドパスチャー症候群は、肺出血及び／又は急速に進行する糸
球体腎炎を特徴とする自己免役疾患である（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ．＆ Ｆ．Ｄｉｘ
ｏｎ，１９８６，Ｔｈｅ Ｋｉｄｎｅｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐ
ｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ，８００〜８９頁
；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｂ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１
６０３３−６）。この症候群は、α３（ＩＶ）ＮＣ１に対する自己抗体の結合に
よる、糸球体及び肺胞の基底膜の破壊により引き起こされる（Ｗｉｌｓｏｎ，１
９８６、前記；Ｈｕｄｓｏｎ，１９９３、前記）。いくつかのグループが、α３
（ＩＶ）上のグッドパスチャー自己抗原の位置をマッピング又は予測することを
試み（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９５，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ
．６：１１７８−８５；Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７１：９０６２−８；Ｌｅｖｙ，Ｊ．Ｂ．ら，１９９７，Ｊ．Ａｍ．
Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．８：１６９８−１７０５；Ｋｅｆａｌｉｄｅｓ，Ｎ．
Ａ．ら，１９９３，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４３：９４−１００；Ｑｕｉｎｏｎ
ｅｓ，Ｓ．ら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９７８０−４（
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１７３５８に正誤表(erratum)）；Ｎｅｔｚ
ｅｒ，Ｋ．Ｏ．ら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１２６７−
７４）、Ｎ末端、Ｃ末端、及び中央部分の残基がエピトープ位置であることが報
告された。最近、最も可能性の高い疾患関連病原性エピトープがＮ末端部分の最
初の４０アミノ酸の中に同定され（Ｈｅｌｌｍａｒｋ，Ｔ．ら，１９９９，Ｋｉ
ｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５５：９３６−４４）、Ｎ末端の４０個のアミノ酸であるこ
とがさらに確定された。病原性グッドパスチャー自己エピトープに対応するＮ末
端の５３個のアミノ酸を欠く短縮型タムスタチン（タムスタチン−Ｎ５３）を、
設計した。この変異型タンパク質を以下の実験において使用した。

【０２９０】 ２００万個の７８６−Ｏ腎細胞癌細胞を、７〜９週齢雄無胸腺ヌードマウスの
背部に皮下注射した。腫瘍を約１００〜１５０ｍｍ^３のサイズまで増殖させた。
次いで、マウスを５匹毎の群に分け、大腸菌で発現された、５３個のＮ末端アミ
ノ酸を欠く短縮型タムスタチン（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８）２０ｍｇ／ｋｇを、１０日間、毎日腹
腔内注射した。対照群には、ＰＢＳ注射を与えた。結果を図２８に示す。図２８
は、対照マウス（白四角）及びタムスタチン変異体Ｎ５３で処理されたマウス（
黒丸）についての、処理日数（ｘ軸）に対する腫瘍容積の増加（ｙ軸）を示すグ
ラフである。大腸菌により産生されたタムスタチン−Ｎ５３は、６ｍｇ／ｋｇで
、対照と比較して、４〜１０日目に、７８６−Ｏヒト腎腫瘍の増殖を有意に阻害
した（１０日目：タムスタチン−Ｎ５３で１１０．０±２９．０ｍｍ３、対照で
３４５．０±２４．０ｍｍ３）（図２８）。各点は、１群当たり５〜６匹のマウ
スの平均±ＳＥを表す。アスタリスク付きのデータ点は、有意（片側スチューデ
ントｔ検定によりＰ＜０．０５）であった。

【０２９１】 実施例３１：α３（ＩＶ）ＮＣ１及びＣＤ３１に関する免疫組織化学的染色 ７週齢雄Ｃ５７／ＢＬ６マウス由来の腎臓及び皮膚組織を免疫蛍光顕微鏡検査
による評価のため処理した。組織試料を液体窒素中で凍結させ、４ｍｍ厚さの切
片を使用した。組織を、以前に記載されたような間接的免疫蛍光技術（Ｋａｌｌ
ｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８）
により処理した。凍結切片を、一次抗体、ポリクローナル抗ＣＤ３１抗体（１：
１００希釈）又はポリクローナル抗α３（ＩＶ）ＮＣ１抗体（１：５０希釈）で
染色した後、二次抗体、ＦＩＴＣ結合抗ラットＩｇＧ抗体又はＦＩＴＣ結合抗ヒ
トＩｇＧ抗体により染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐ
ａｎ）下で免疫蛍光を調べた。陰性対照は、一次抗体を無関係な免疫前血清と置
換することにより実施した。

【０２９２】 マウス腎臓において、ＧＢＭ及び血管基底膜にα３（ＩＶ）ＮＣ１の発現が観
察された。ＣＤ３１、ＰＥＣＡＭ−１の発現は、糸球体内皮及び血管内皮に観察
された。マウス皮膚においては、上皮基底膜及び血管基底膜にはα３（ＩＶ）Ｎ
Ｃ１が存在しなかった。ＣＤ３１の発現は、皮膚の血管内皮に観察された。ＣＤ
３１発現は、マウス腎臓において糸球体及び小血管の内皮に観察され、α３（Ｉ
Ｖ）ＮＣ１発現は糸球体基底膜及び糸球体外血管基底膜に観察された。ＣＤ３１
の発現は、マウス皮膚において真皮(dermal)小血管の内皮に観察された。α３（
ＩＶ）ＮＣ１発現は、上皮基底膜には存在せず、真皮小血管の基底膜にはほとん
ど観察されなかった。これらの結果は、制限されたタムスタチンの分布の一例を
示している。

【０２９３】 実施例３２：タムスタチンＮ−５３は内皮細胞のアポトーシスを引き起こす タムスタチンＮ−５３のアポトーシス誘発(pro-apoptotic)活性を、Ｃ−ＰＡ
Ｅ細胞において調べた。ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル
）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイ（Ｓｕｇｉｙａｍａ
，Ｈ．ら，１９９８，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５４：１１８８−１１９６）によ
り細胞生存度を評価した。このアッセイは、生存細胞の、活性ミトコンドリアに
おいてテトラゾリウム環を開裂する能力に基づく、細胞生存に関する定量的比色
分析である。Ｃ−ＰＡＥ細胞（１ウェル当たり７，０００細胞）を含む１０％Ｆ
ＣＳ含有ＤＭＥＭを、９６ウェルプレートに播いた。翌日、ＴＮＦ−α（陽性対
照、８０ｎｇ／ｍｌ）、又は様々な濃度のタムスタチンもしくはタムスタチンＮ
−５３のいずれかをウェルに添加し、２４時間インキュベートした。次いで、Ｍ
ＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ；ＣＨＥＭＩＣＯＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔ
ｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を１０μｌ／ウェルの割合で
ウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートした。酸性イソプロパノール（
ａｃｉｄ−ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を添加し、充分に混合した。マイクロプレ
ートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ
ＳＡ）で５９０ｎｍで吸光度を測定した。

【０２９４】 結果を図２９に示す。図２９は、タムスタチン及びタムスタチンＮ−５３の増
加する濃度（ｘ軸）における、細胞生存度（ＯＤ_５９０の関数として、ｙ軸）を
示すグラフである。各点は、三連ウェルについての平均±平均の標準誤差を表す
。アスタリスクは、片側スチューデントｔ検定によるＰ＜０．０５を示す。

【０２９５】 タムスタチンＮ−５３は、用量依存的に細胞生存度を減少させた。５μｇ／ｍ
ｌにおいて、タムスタチンＮ−５３は、細胞生存度を対照と比較して４９．４％
減少させ、この効果は、陽性対照として使用された８０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−α
とほぼ同等であった。５μｇ／ｍｌのタムスタチンＮ−５３の４９．４％と比較
して、他の実験において、全長タムスタチンは、５μｇ／ｍｌでわずか２２．５
％、１０μｇ／ｍｌで６０％、細胞生存度を減少させた。驚くべきことに、タム
スタチンＮ−５３は、５μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌで、全長タムスタチンより
も(then)大きく、内皮細胞のアポトーシスを誘導する。

【０２９６】 実施例３３：抗血管新生タンパク質の変異体及び断片 アレステン及びカンスタチンの断片及び変異体も、Ｍａｒｉｙａｍａら（１９
９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２５３−８）のシュードモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エラスターゼ消化に従い作製した。消化物をゲル濾過Ｈ
ＰＬＣにより分離し、得られた断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、前記の内
皮管アッセイにおいて評価した。これらの断片は、アレスチンの１２ｋＤａの断
片、アレステンの８ｋＤａの断片、およびカンスタチンの１０ｋＤａの断片を含
んでいた。さらに、タムスタチンの２つの断片（「３３３」及び「３３４」）を
、ＰＣＲクローニングにより生成させた。

【０２９７】 図３０に示されるように、前記と同様に実施された内皮管アッセイにおいて、
２つのアレステン断片（１２ｋＤａ（黒四角）及び８ｋＤａ（白四角））並びに
カンスタチン断片（１９ｋＤａ（黒三角））は、アレステン（黒丸）又はカンス
タチン（白丸）よりもはるかに大きい程度に内皮管の形成を阻害した。図３１は
、タムスタチン断片、「３３３」（黒丸）及び「３３４」（白丸）が、同様に、
タムスタチン（黒三角）より性能が優れていることを示している。ここでは、Ｂ
ＳＡ（黒四角）及びα６鎖（白四角）を対照とした。

【０２９８】 実施例３４：内皮細胞及びＷＭ−１６４細胞の増殖に対するタムスタチンの効果 内皮細胞増殖を、前記の実施例２５に記載のようにして、^３Ｈ−チミジン取り
込み又はメチレンブルー染色により実施した。Ｃ−ＰＡＥ細胞（２〜４代目）を
コンフルエントまで増殖させ、接触阻害状態を４８時間維持した。７８６−Ｏ細
胞、ＰＣ−３細胞、及びＷＭ−１６４細胞を非内皮対照として使用し、前記の実
施例２５に記載のようにして培養した。ＨＰＥ（ヒト一次前立腺上皮細胞）を、
ウシ下垂体及び組換えヒトＥＧＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉ
ｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）が補
足されたケラチノサイト−ＳＦＭ中で培養した。黒色腫細胞株ＷＭ−１６４は、
Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｅｎｎｓｙ
ｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）のＭｅｅｎｈａｒｄ Ｈｅｒｌｙｎ博士より得られ、Ｈ
ｅｒｌｙｎら（１９９０，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：２１３−２３
４）により記載されたような、７８％ＭＣＤＢ−１５３培地、１０％Ｌ−１５培
地、１０％トリプトース(tryptose)リン酸ブロス、２％ＦＢＳ、及び５０単位／
ｍｌインスリン中で培養した。

【０２９９】 Ｃ−ＰＡＥ細胞、ＰＣ−３細胞、及び７８６−Ｏ細胞における^３Ｈ−チミジン
取り込みの結果は、図２１Ａ〜Ｃに示され、前記実施例２５に記載されている。
ＨＰＥ細胞、Ｃ−ＰＡＥ細胞、及びＷＭ−１６４細胞のメチレンブルー染色は、
図３２Ａ、３２Ｂ、及び３２Ｃに示されている。これらの図は、増加する濃度の
タムスタチン（ｘ軸）の、ＨＰＥ細胞（図３２Ａ）、Ｃ−ＰＡＥ細胞（図３２Ｂ
）、及びＷＭ−１６４細胞（図３２Ｃ）の増殖（ｙ軸）に対する効果を示す一組
の３つのヒストグラムである。結果は、タムスタチンが、ＦＣＳにより刺激され
るＣ−ＰＡＥ細胞の増殖を用量依存的に阻害することを示している（図２１Ａ）
。タムスタチン処理細胞（０．１〜１０μｇ／ｍｌ）と対照細胞との^３Ｈ−チミ
ジン取り込みの平均値の差は、有意（Ｐ＜０．０５）であった。ＰＣ−３細胞（
図２１Ｂ）、７８６−Ｏ細胞（図２１Ｃ）、ＨＰＥ細胞（図３２Ａ）、及びＷＭ
−１６４細胞（図３２Ｃ）は、タムスタチンによる阻害効果を示さなかった。内
毒素を活性化するためにポリミキシンＢ（５μｇ／ｍｌ）を添加した場合、タム
スタチンの阻害効果は変化しなかった（図３２Ｂ）。

【０３００】 興味深いことに、他者（Ｈａｎら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
２：２０３９５−２０４０１）がα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインのアミノ酸１８５
〜２０３によるＷＭ−１６４細胞の阻害を報告しているにもかかわらず、全長タ
ムスタチンは、ＷＭ−１６４細胞の増殖に対する効果を有していなかった。これ
は、領域１８５〜２０３の抗腫瘍細胞活性が、全長の折り畳まれたタムスタチン
の一部として存在する場合には、利用可能でないことを示唆している。

【０３０１】 実施例３５：タムスタチン変異体Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３、及びＴ
ｕｍ−４の組換え作製 α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインは、インビトロで、黒色腫、及びその他の上皮腫
瘍細胞株と結合し、それらの増殖を阻害することが示されている（Ｈａｎら，１
９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０３９５−２０４０１）。Ｈａｎ
らは、黒色腫細胞との結合部位がα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインのアミノ酸１８５
〜２０３であることを示した。この部位に対するモノクローナル及びポリクロー
ナルの抗体は、黒色腫細胞との接着及び増殖阻害を阻止することができた（Ｈａ
ｎら、前記）。Ｈａｎらは、アミノ酸１８９〜１９１内に位置する特異的配列「
ＳＮＳ」が、黒色腫細胞の接着及び増殖阻害の両方に必要であることも見出した
（Ｈａｎら、前記）。これらの研究において、１８５−２０３α３（ＩＶ）ＮＣ
１合成ペプチドは、内皮細胞を含む他の細胞株においては試験されなかった。さ
らに、Ｈａｎらは、単離されたヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインを使用しなかっ
た。

【０３０２】 ４種の組換え欠失変異体を、前記の実施例２３及び（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら
，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８）に記載のように
して、作製し、精製した。Ｔｕｍ−１は、タムスタチンＮ−５３としても知られ
、配列番号：１０のＣ末端の１９１アミノ酸からなり、Ｎ末端の５３アミノ酸を
欠いている。Ｔｕｍ−１は、前記実施例２３にも記載されている。タムスタチン
３３３は、タムスタチン（配列番号：１０）のＮ末端のアミノ酸２〜１２５から
なる。Ｔｕｍ−３は、Ｃ末端の１１２アミノ酸からなる。Ｔｕｍ−４は、アミノ
酸１８５〜２０３（Ｈａｎら、前記）を含むＣ末端の６４アミノ酸である。これ
らの欠失変異体を、前記の実施例２３に記載されたようなｐＥＴ２２ｂ又はｐＥ
Ｔ２８ａ（＋）発現系（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
，ＵＳＡ）を使用して、大腸菌において発現させた。これらの変異体は前記の表
１に例示されている。

【０３０３】 実施例３６：内皮細胞及びＷＭ−１６４細胞の増殖及びアポトーシスに対するタ
ムスタチン変異体の効果 内皮細胞（Ｃ−ＰＡＥ細胞）及びＷＭ−１６４黒色腫細胞の増殖を、前記の実
施例２５及び３４と同様のメチレンブルー染色によりアッセイした。結果を、図
３３Ａ及び３３Ｂに示す。これらの図は、増加する濃度（ｘ軸）のタムスタチン
、Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３、及びＴｕｍ−４の、Ｃ−ＰＡＥ細胞（
図３３Ａ）及びＷＭ−１６４細胞（図３３Ｂ）の相対数（ｙ軸）に対する効果を
示す一対のグラフである。図３３Ａは、タムスタチン、Ｔｕｍ−１、及びＴｕｍ
−２が、Ｃ−ＰＡＥ細胞増殖を用量依存的に阻害したことを示している。図３３
Ｂは、ＷＭ−１６４黒色腫細胞株が、Ｔｕｍ−１によってもＴｕｍ−２によって
も影響されなかったことを示している。しかしながら、Ｔｕｍ−４は、この細胞
株における抗増殖活性を有していた。下記表２に示されるように、タムスタチン
は、１５μｇ／ｍｌでＣ−ＰＡＥ細胞増殖を７８．５％阻害した。Ｔｕｍ−１及
びＴｕｍ−２は、Ｃ−ＰＡＥ細胞を、それぞれ６５．６％及び７３．３％、阻害
した。対照的に、Ｔｕｍ−３及びＴｕｍ−４は、Ｃ−ＰＡＥ細胞を阻害しなかっ
た。Ｔｕｍ−４のみがＷＭ−１６４黒色腫細胞を阻害した。５０μｇ／ｍｌのＴ
ｕｍ−４は、これらの細胞を４６．１％阻害したが、Ｃ−ＰＡＥ細胞は阻害する
ことができなかった。

【０３０４】

【表２】

【０３０５】 ＭＴＴアッセイを使用して、タムスタチン、Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ
−３、及びＴｕｍ−４による処理後の、Ｃ−ＰＡＥ内皮細胞及びＷＭ−１６４黒
色腫細胞の細胞生存度を評価した。結果を、図３４Ａ及び３４Ｂに示す。これら
の図は、増加する濃度（ｘ軸）のタムスタチン、Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕ
ｍ−３、及びＴｕｍ−４の、Ｃ−ＰＡＥ細胞（図３４Ａ）及びＷＭ−１６４細胞
（図３４Ｂ）の細胞生存度（ｙ軸）に対する効果を示す一対のグラフである。各
点は、三連ウェルの平均＋／−平均の標準誤差を表す。図３４Ａは、Ｔｕｍ−１
が細胞生存度を用量依存的に減少させることを示している。１及び５μｇ／ｍｌ
の用量で、Ｔｕｍ−１の、細胞生存度を減少させる効果は、タムスタチンよりも
有意に高かった。Ｔｕｍ−４は、ＷＭ−１６４黒色腫細胞の生存率を減少させた
唯一の欠失変異体であった（図３４Ｂ）。

【０３０６】 前記の実施例２７に記載されたようにして、カスパーゼ−３活性を測定するこ
とにより、アポトーシスも評価した。結果を、図３５に示す。図３５は、５μｇ
／ｍｌのＴｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３、もしくはＴｕｍ−４、又は８０
ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、又はＰＢＳ緩衝液（対照）で処理されたＣ−ＰＡＥ細
胞（ｘ軸）の、ＯＤ_４０５における吸光度の測定値としてのカスパーゼ−３活性
（ｙ軸）を示すヒストグラムである。Ｔｕｍ−１及びＴｕｍ−２は、Ｃ−ＰＡＥ
細胞におけるカスパーゼ−３活性を増加させたが、Ｔｕｍ−３及びＴｕｍ−４は
増加させなかった。

【０３０７】 実施例３７：内皮細胞上のα_ｖβ_３インテグリンへのタムスタチン変異体の結合 タムスタチン欠失変異体でコーティングされたプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の
付着を決定するため、細胞接着アッセイを前記と同様に実施した（例えば、実施
例２８参照）。Ｔｕｍ−４に対するウサギ抗体は、以前に記載されたようにして
調製した（Ｋａｌｌｕｒｉら，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：
２４７０−２４７８）。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ウサギＩ
ｇＧ抗体は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）より購入した。結果を、図３６Ａ、３６Ｂ、及
び３６Ｃに示す。これらの図は、対照ＩｇＧ、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、及びＢＳＡ
の存在下での、Ｔｕｍ−１（図３６Ａ）、Ｔｕｍ−２（図３６Ｂ）、及びＴｕｍ
−４（図３６Ｃ）でコーティングされたプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合率（
ｙ軸）を示す一組の３つのヒストグラムである。Ｔｕｍ−１でコーティングされ
たプレート（図３６Ａ）は、α_ｖβ_５結合部位のみならず、以前に報告された（
Ｓｈａｈａｎら，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：４５８４−４５９０
）α_ｖβ_３結合部位も阻止するため、抗Ｔｕｍ−４抗体（１：２００希釈）でも
処理した。

【０３０８】 α_ｖβ_３抗体は、Ｃ−ＰＡＥ細胞のＴｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、又はＴｕｍ−４
への付着を、それぞれ５５．９％、６９．８％、及び６２．６％、阻害した。Ｔ
ｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、又はＴｕｍ−４でコーティングされたプレートへのＣ−
ＰＡＥ細胞の結合は、α_ｖβ_５抗体によっては阻害されなかった。（アミノ酸２
０９〜２４４と結合する）抗Ｔｕｍ−４抗体を添加した場合ですら、α_ｖβ_３抗
体は、Ｃ−ＰＡＥ細胞のＴｕｍ−１への付着を阻害した（図３６Ａ）。

【０３０９】 タムスタチン、Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、及びＴｕｍ−４は、図３７に示され
るように、ＷＭ−１６４細胞とも結合する。図３７は、ＰＢＳ、タムスタチン、
Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−４、又はＢＳＡ（ｘ軸）でコーティングされ
たプレートと付着したＷＭ−１６４細胞についての、ＯＤ_６５５における吸光度
（ｙ軸）によるメチレンブルー染色のレベルを示すヒストグラムである。タムス
タチン及び３つの欠失変異体全てが、ＷＭ−１６４黒色腫細胞のプレートへの付
着を増強させた。

【０３１０】 実施例３８：タムスタチン欠失変異体の活性の逆転 Ｔｕｍ−１による内皮細胞増殖の阻害が、抗Ｔｕｍ−４抗体により取り消され
うるか否かを決定するため、前記の実施例２６に記載のようにして、競合増殖ア
ッセイを実施した。α_ｖβ_３インテグリン結合部位を少なくとも部分的に阻止す
ることを目的として、Ｔｕｍ−１を抗Ｔｕｍ−４抗体と共にプレインキュベート
した。次いで、それを内皮細胞増殖アッセイにおいて使用した。

【０３１１】 結果を、図３８Ａ及び３８Ｂに示す。これらの図は、抗Ｔｕｍ−４抗体（１：
１００、１：２００、１：５００希釈）（ｘ軸）と共にプレインキュベートされ
た１．５μｇ／ｍｌのＴｕｍ−１（図３８Ａ）又はＴｕｍ−２（図３８Ｂ）で処
理されたＣ−ＰＡＥ細胞の増殖（ｙ軸）を示すヒストグラムである。各ヒストグ
ラムは、三連ウェルについての平均±平均の標準誤差を表す。実験は、３回繰り
返された。アスタリスクは、片側スチューデントｔ検定によるＰ＜０．０５を示
す。

【０３１２】 Ｔｕｍ−１の抗増殖効果は、抗Ｔｕｍ−４抗体又は対照ウサギＩｇＧと共にプ
レインキュベートされた場合でも改変されなかった（図３８Ａ）。同様に、Ｔｕ
ｍ−２の抗増殖効果も、抗Ｔｕｍ−４抗体又は対照ウサギＩｇＧのプレインキュ
ベーションにより影響されなかった（図３８Ｂ）。

【０３１３】 次いで、インテグリンα_ｖβ_３を、タムスタチンおよびＴｕｍ−２の抗増殖効
果を逆転させる能力について検討した。タムスタチンおよびＴｕｍ−２を、α_ｖ β_３タンパク質と共に３０分間インキュベートし、９６ウェルプレートへと播か
れたＣ−ＰＡＥ細胞へと添加し、増殖培地と共に一夜インキュベートした。４８
時間のインキュベーションの後、メチレンブルー染色により細胞数を決定した。
図２２に示され、実施例２６に記載されたように、タムスタチンの抗増殖効果は
、増加する用量のα_ｖβ_３可溶性タンパク質により用量依存的に逆転され、２．
４μｇ／ｍｌ（タムスタチンに対し３倍モル過剰）で、α_ｖβ_３はタムスタチン
の抗増殖効果を有意に回復させた（４３．１％）。α_ｖβ_３タンパク質のみによ
る処理は、内皮細胞増殖を阻害しなかった。図３８Ｃに示されるように、Ｔｕｍ
−２の抗増殖効果は、増加する用量のα_ｖβ_３可溶性タンパク質により用量依存
的に逆転され、２μｇ／ｍｌのα_ｖβ_３タンパク質により、Ｔｕｍ−２の抗増殖
効果は、７４．１％と有意に回復した。

【０３１４】 次いで、黒色腫細胞に対するＴｕｍ−４の抗増殖効果を打ち消す能力に関して
、α_ｖβ_３を試験した。タムスタチンおよびＴｕｍ−４を、α_ｖβ_３インテグリ
ンタンパク質と共に室温で３０分間プレインキュベートし、次いで９６ウェルプ
レートで増殖させたＷＭ−１６４細胞へと添加した。４８時間のインキュベーシ
ョンの後、メチレンブルー染色により細胞数の増加を決定した。結果を、図３８
Ｄ及び３８Ｅに示す。タムスタチンはＷＭ−１６４細胞に対する効果を有してい
なかった。Ｔｕｍ−４の抗増殖効果は、増加する用量のα_ｖβ_３可溶性タンパク
質により用量依存的に逆転された。α_ｖβ_３タンパク質は、２μｇ／ｍｌで、Ｔ
ｕｍ−４により誘導される抗増殖効果を７６．７％有意に回復させた。α_ｖβ_３ タンパク質のみによる処理は、黒色腫細胞増殖を阻害しなかった。

【０３１５】 タムスタチンの増殖効果を、エンドスタチン及び抗α_ｖβ_３抗体の効果と比較
した。等モル量のタムスタチン及び抗α_ｖβ_３インテグリン抗体を、Ｃ−ＰＡＥ
細胞に添加した。結果を、図３９に示す。図３９は、ｙ軸上の相対細胞数に対し
、タムスタチン、エンドスタチン、抗α_ｖβ_３抗体、及びＩｇＧ（対照）の濃度
をｘ軸上に示しているグラフである。各点は、三連ウェルの平均±平均の標準誤
差を表す。実験は、３回繰り返された。アスタリスクは、片側スチューデントｔ
検定によるＰ＜０．０５を示す。増加する量の抗α_ｖβ_３抗体は、内皮細胞増殖
を阻害せず、タムスタチン及びエンドスタチンは、内皮細胞増殖の用量依存的阻
害を示した。

【０３１６】 実施例３９：カンスタチンの欠失変異体 カンスタチン欠失変異体を、前記の実施例２３及び３５と同様にして、構築し
た。Ｃａｎ−１は、全長カンスタチン（配列番号：６）のＮ末端の１１４アミノ
酸からなり、Ｃａｎ−２は、Ｃ末端の１１３アミノ酸からなる。これら２つの変
異体を、それぞれｐＥＴ２２ｂ及びｐＥＴ２８ａにクローニングし、タンパク質
発現のためＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ，ＵＳＡ）へとシャトル（shuttled）した。タンパク質を発現クローンから容
易に作製し、ベクターへ取り込まれたポリヒスチジンタグを使用して、Ｎｉ−Ｔ
Ａカラムで精製した。増加する濃度のイミダゾールを用いてタンパク質をカラム
から溶出させ、次いでＰＢＳに対して透析した。透析中に溶液から沈降したタン
パク質を不溶性と呼び、溶液中に留まったものを可溶性画分と呼んだ。可溶性画
分を濃縮し、滅菌濾過し、−２０℃で保存した。不溶性タンパク質は、ＰＢＳに
再懸濁させ、−２０℃で保存した。

【０３１７】 増殖アッセイのため、カンスタチン、Ｃａｎ−１、及びＣａｎ−２可溶性タン
パク質（０．１〜２０．０μｇ／ｍｌ）を増殖Ｃ−ＰＡＥ細胞の増殖培地中へ添
加し、５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ及び３ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦに加え、１０％ＦＢ
Ｓを含むＤＭＥＭでも刺激した。結果を、図４０に示す。図４０は、増加する濃
度のカンスタチン（黒ひし形）、Ｃａｎ−１（黒四角）、及びＣａｎ−２（黒三
角）（ｘ軸）の、Ｃ−ＰＡＥ細胞の相対細胞数（ｙ軸）に対する効果を示すグラ
フである。各濃度の各タンパク質を四つ組で試験した。ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）を対照処理として使用した。内毒素の干渉を抑えるため、ポリミキシンＢ
を使用したが、培地へポリミキシンＢを添加したアッセイと、添加しなかったア
ッセイとで、差は見出されなかった。細胞を４８時間増殖させ、次いで固定し、
染色し、Ｂｉｏ−Ｒａｄプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ
，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で密度を読み取った。カンスタチン及びＣａ
ｎ−１は、いずれも細胞数（％）の用量依存的な減少を引き起こし、いずれも５
μｇ／ｍｌ以上の濃度で８０％細胞数を減少させた。Ｃａｎ−２は、１０μｇ／
ｍｌを超える濃度で細胞数（％）のわずかな減少を示し、最高濃度（２０μｇ／
ｍｌ）で、Ｃａｎ−２は３３％増殖を阻害した。

【０３１８】 ＡｐｏＡｌｅｒｔキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用したアネキシンＶ−ＦＩＴＣアッセイにより、ア
ポトーシスを測定した。ヨウ化プロピジウムを使用して、アポトーシス以外の手
段で死滅した細胞の核を染色した。カンスタチン、Ｃａｎ−１、及びＣａｎ−２
は、全て、１μｇ／ｍｌを超える濃度で、内皮細胞のアポトーシスを誘導した。
１μｇ／ｍｌ未満の濃度では、Ｃａｎ−１によるアポトーシス誘導が最も強力で
あった。

【０３１９】 ２μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌいずれかの不溶性タンパク質、５０ｎｇ／ｍ
ｌ ＶＥＧＦ、及び２０Ｕ／ｍｌヘパリンを含有するマトリゲル０．５ｍｌをＣ
５７／ＢＬ６マウスの両側腹へ同時に注射する、インビボマトリゲルプラグアッ
セイにより、抗血管新生活性を測定した。プラグを１４日間マウス体内に放置し
た後、マウスを屠殺し、プラグを切除し、固定した。プラグを包埋し、切片化し
、Ｈ＆Ｅ染色した。試料を盲検化し、血管を定量した。２つのタンパク質濃度間
に、血管数の差は見出されなかったため、６つ全ての計数値を平均化しプロット
した。

【０３２０】 結果を、図４１に示す。図４１は、ＰＢＳ（対照）、カンスタチン、Ｃａｎ−
１、及びＣａｎ−２による処理についての、プラグ１個当たりの平均血管数（ｙ
軸）を示すヒストグラムである。カンスタチン又はＣａｎ−１で処理されたプラ
グは、ＰＢＳ又はＣａｎ−２で処理されたプラグと比較して、有意に少ない血管
を示した。

【０３２１】 実施例４０：タムスタチンの合成断片の活性 タムスタチンのペプチド断片：タムスタチンのアミノ酸５４〜１３２の領域を
Ｔｕｍ−５と名付けた。ペプチドＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、及びＴ６を合
成した。Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、及びＴ６は部分的に重複しており、Ｔｕｍ−
５内に位置している。タムスタチン内のこれらのペプチドの位置を、図４２及び
下記表３に示す。

【０３２２】

【表３】

【０３２３】 抗増殖活性：内皮細胞（Ｃ−ＰＡＥ細胞）に対するペプチドＴ２、Ｔ３、Ｔ４、
Ｔ５、及びＴ６の抗増殖活性を調査した。結果を、図４３Ａに示す。図４３Ａは
、１０μｇ／ｍｌのＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、及びＴ６（ｘ軸）による内皮細胞
増殖の阻害（ｙ軸）を示すヒストグラムである。対照は、未刺激の細胞、及び２
０％ＦＣＳで刺激された細胞である。ペプチドＴ３が、内皮細胞の増殖を有意に
（ｐ＜０．０５）阻害することが見出され、その阻害は、図４３Ｂに示されるよ
うに用量依存的であった。図４３Ｂは、０．１、１．０、及び１０．０μｇ／ｍ
ｌのペプチドＴ３（ｘ軸）で処理した場合の、Ｃ−ＰＡＥ細胞増殖の阻害（ｙ軸
）を示すヒストグラムである。

【０３２４】 ペプチドＴ３の抗増殖効果を逆転させる能力に関して、インテグリンα_Ｖβ_３ を検討した。Ｔ３ペプチドを０、０．００１、０．０１、０．１、０．５、又は
１．０μｇ／ｍｌのα_Ｖβ_３インテグリンタンパク質（ＣＨＥＭＩＣＯＮ Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）
と共に、室温で、３０分間インキュベートし、次いで、２０μｇ／ｍｌの最終濃
度で、増殖培地中で９６ウェルプレート内で増殖させたＣ−ＰＡＥ細胞に添加し
た。４８時間のさらなるインキュベーションの後、メチレンブルーアッセイによ
り細胞数を決定した。結果を、図４３Ｃに示す。図４３Ｃは、様々な濃度（ｘ軸
）のα_Ｖβ_３インテグリンと共にプレインキュベートされたＴ３ペプチドで処理
した場合の、Ｃ−ＰＡＥ細胞の増殖（ｙ軸）を示すヒストグラムである。ペプチ
ドＴ３の抗増殖効果は、α_Ｖβ_３インテグリンタンパク質とのプレインキュベー
ションにより有意に減少した。α_Ｖβ_３インテグリン自体は、増殖を阻害しなか
った（対照）。 アポトーシス活性：前記の実施例３２及び３６に記載されたようなＭＴＴアッセ
イを使用して、ペプチドＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、及びＴ６（１０μｇ／ｍｌ濃
度）を、Ｃ−ＰＡＥ細胞の生存率に対する効果に関して試験した。結果を、図４
３Ｄに示す。図４３Ｄは、ＯＤ_５９５で測定された細胞生存度（ｙ軸）及び合成
ペプチドによる処理（ｘ軸）を示すヒストグラムである。ペプチドＴ３は、Ｔｕ
ｍ−５由来の他のペプチドと比較して、細胞生存度を有意に減少させることが見
出された。ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ）を、内皮細胞アポトーシス誘導にお
ける陽性対照として使用した。 細胞接着活性。内皮細胞を使用した細胞付着を、前記と同様に実施した。ＨＵＶ
ＥＣ細胞又はＣ−ＰＡＥ細胞をモノクローナル抗ヒトインテグリン抗体、対照マ
ウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）、又は合成ペプチドと共にインキュベートし、予
めコーティングされた９６ウェルプレートに播き、ＯＤ_６５５におけるメチレン
ブルー染色の測定を使用して、プレートに付着している細胞の数を決定した。図
４４Ａは、ＢＳＡ（対照）、抗体なし（対照）、マウスＩｇＧ（対照）、及びα _Ｖ β_３インテグリン抗体の存在下での、Ｔｕｍ−５ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）
でコーティングされたプレートへのＨＵＶＥＣ細胞の結合を示している。細胞付
着は、抗α_Ｖβ_３インテグリン抗体により有意に阻害された。対照マウスＩｇＧ
は、細胞付着の阻害を示さなかった。図４４Ｂは、１０μｇ／ｍｌの組換えＴｕ
ｍ−５ペプチドでコーティングされた９６ウェルプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の
付着を示すヒストグラムである。これらのプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の付着は
、ＲＧＤペプチドとのインキュベーションにより阻害されず、これらの内皮細胞
のＴｕｍ−５との結合がＲＧＤ非依存性であることが示された。ＣＮＧＲＣペプ
チドを対照として使用した。

【０３２５】 次いで、Ｔｕｍ−５でコーティングされたプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の付着
に対する、合成ペプチドＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、及びＴ６の効果を試験した。
結果を、図４４Ｃに示す。図４４Ｃは、Ｔｕｍ−５でコーティングされ、２．５
μｇ／ｍｌのＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、又はＴ６ペプチドで処理された９６ウェ
ルプレート、又はＴｕｍ−４でコーティングされ、Ｔ３で処理されたプレート（
ｘ軸）へのＣ−ＰＡＥ細胞の結合（ｙ軸）を示すヒストグラムである。ＰＢＳ処
理を対照とした。Ｔｕｍ−５でコーティングされたプレートへの細胞付着は、Ｔ
３ペプチドにより有意に阻害され、Ｔ３が内皮細胞とＴｕｍ−５との相互作用を
担っていることが示された。その他の合成ペプチドは、この効果を示さず、Ｔ３
はＴｕｍ−４ペプチドでコーティングされたプレートへの内皮細胞の付着は阻害
することができなかった。図４４Ｄのヒストグラムは、様々な濃度のＴ３ペプチ
ド（ｘ軸）の、Ｔｕｍ−５でコーティングされたプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の
結合（ｙ軸）に対する効果を示している。ＰＢＳ処理を対照とした。Ｔ３ペプチ
ドは、Ｔｕｍ−５でコーティングされたプレートへの内皮細胞の付着を、用量依
存的に阻害することが見出された。

【０３２６】 ペプチドでコーティングされたプレートへの内皮細胞の付着は、図４４Ｅに示
されるように、Ｔ３ペプチドについてはα_Ｖβ_３インテグリンによってのみ阻害
され、内皮細胞とペプチドＴ３との相互作用がα_Ｖβ_３インテグリンにより媒介
されることが示された。図４４Ｆは、Ｔ３ペプチドでコーティングされたプレー
トへのＣ−ＰＡＥ細胞の付着が、抗β３インテグリン抗体とのプレインキュベー
ションにより阻害されたことを示している。しかしながら、抗α_Ｖインテグリン
抗体又は抗β_１インテグリン抗体は、Ｔ３でコーティングされたプレートへの細
胞付着を阻害しなかった。図４４Ｇは、２．５μｇ／ｍｌビトロネクチンでコー
ティングされたプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合が、Ｔ３ペプチドとのインキ
ュベーションにより阻害されなかったことを示しており、これにより、Ｔ３が、
ビトロネクチン結合には使用されないα_Ｖβ_３インテグリン上の別のドメインと
結合することが示された。細胞とＴ６ペプチドとのインキュベーションも、付着
を阻害しなかった。

【０３２７】 実施例４１：タムスタチンの欠失変異体の活性 タムスタチンの欠失断片を細菌発現ベクターへとクローニングし、発現させ、
ニッケルクロマトグラフィを使用して精製し、次いで、インビトロの抗血管新生
活性及び関連する活性に関して分析した。タンパク質調製物からの夾雑内毒素の
除去を確実にするため、特に努力した。全長タムスタチン、タムスタチン−Ｎ５
３、及び２つのさらなる欠失変異体（Ｔｕｍ−２Ｃ及びＴｕｍ−ＫＥ）を作製し
、試験した。欠失変異体を、内皮細胞増殖、細胞周期進行、アポトーシス、及び
内皮管形成に関して試験した。分子の内皮細胞特異性を証明するため、活性タム
スタチン断片の非内皮細胞に対する効果も分析した。これらの活性は、下記表４
に要約されている。

【０３２８】

【表４】

【０３２９】 タムスタチン−Ｎ５３は、これらのアッセイにおいて最も活性が高いことが見
出された。インビトロにおいて、タムスタチン−Ｎ５３は、１０％ウシ胎仔血清
（ＦＢＳ）の存在下で、内皮細胞アポトーシスを誘導し、内皮細胞における細胞
周期進行を阻害した。ＩＣ_５０は、両活性に関して約５μｇ／ｍｌであり、エン
ドスタチンは、２０μｇ／ｍｌを越える濃度で、これらの同一アッセイにおいて
活性を示さなかった。

【０３３０】 タムスタチン−Ｎ５３を細胞付着アッセイにおいても使用した。タムスタチン
−Ｎ５３（１０μｇ／ｍｌ）は、９６ウェルプレートへコーティングされた場合
、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）付着を支持した。図４５に示されるように
、α_Ｖβ_３インテグリン及びβ_１インテグリンに対する抗体は、ＨＵＶＥＣと共
にプレインキュベートされた場合、この付着を阻害したが、α_６に対する抗体は
阻害しなかった。従って、タムスタチン−Ｎ５３は、α_Ｖβ_３インテグリン及び
β_１インテグリンを介して、その抗血管新生効果を発揮するのかもしれない。こ
れは、前記実施例２８に記載されたような全長タムスタチンで見られた結果と一
致している。

【０３３１】 タムスタチン−Ｎ５３は、新血管形成に関するマトリゲルプラグアッセイにお
いても血管新生を阻害する。タムスタチン−Ｎ５３は、ＰＣ３前立腺異種移植モ
デル及びＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌正所性モデルの両方における実質的な抗腫瘍活
性も示す。タムスタチン−Ｎ５３（１キログラム当たり５ｍｇ又は２０ｍｇ）を
１日２回投与した。これらの最後の２つのアッセイの結果を、図４６及び４７に
示す。図４６は、賦形剤（対照、白丸）、１日当たり１ｋｇ当たり５ｍｇのタム
スタチン−Ｎ５３（白四角）、又は１日当たり１ｋｇ当たり２０ｍｇのタムスタ
チン−Ｎ５３（白ひし形）で処理された腫瘍についての、１５日間（ｘ軸）のＰ
Ｃ３前立腺腫瘍の平均腫瘍容積（ｍｍ^３）（ｙ軸）を示すグラフである。図４７
は、賦形剤（対照、白丸）、１日当たり１ｋｇ当たり２０ｍｇのタムスタチン−
Ｎ５３（白四角）、又は１日当たり１ｋｇ当たり５ｍｇのタムスタチン−Ｎ５３
（白ひし形）で処理された腫瘍についての、２２日間（ｘ軸）のＭＤＡ−ＭＢ４
３５乳癌腫瘍の平均腫瘍容積（ｍｍ^３）（ｙ軸）を示すグラフである。１日当た
り１ｋｇ当たり５ｍｇの用量と２０ｍｇの用量は、ほぼ同等の抗腫瘍活性を示し
たため、より低い用量を使用しても、有意な抗腫瘍活性を達成することが可能で
ある。

【０３３２】 第二のグッドパスチャーエピトープＧＰＢが、タムスタチン−Ｎ５３内のある
領域（全長タムスタチンのアミノ酸１４０〜１５３）に最近マッピングされた。
従って、この領域を除去し、さらなる欠失変異体を作製した。変異体タムスタチ
ン−４５−１３２（全長タムスタチンのアミノ酸４５〜１３２）は、高レベルの
発現を示し、タムスタチン−Ｎ５３よりも低い用量で、細胞周期進行を阻害する
。これは、図４８に示されている。図４８は、ＰＢＳ（対照）、緩衝液（対照）
、２０μｇ／ｍｌタムスタチン−Ｎ５３、１０μｇ／ｍｌタムスタチン−４５−
１３２、及び５μｇ／ｍｌタムスタチン−４５−１３２（ｘ軸）で処理した場合
の、Ｓ期のＣ−ＰＡＥ細胞の比率（％）（ｙ軸）を示すヒストグラムである。タ
ムスタチン−４５−１３２は、ＨＵＶＥＣ細胞付着も支持し、α_Ｖβ_３インテグ
リン及びβ_１インテグリンに対する抗体により阻害される。これは、図４９に示
されている。図４９は、ＰＢＳ（対照）、α_Ｖβ_３インテグリン抗体、β_１イン
テグリン抗体、α_６インテグリン抗体、及びＢＳＡ（対照）の存在下での、タム
スタチン−４５−１３２でコーティングされた（２０μｇ／ｍｌ）プレートへの
ＨＵＶＥＣ細胞の付着（ＯＤ_５９５、ｙ軸）（ｙ軸）を示すヒストグラムである
。従って、タムスタチンの抗血管新生活性は、アミノ酸４５〜１３２の領域内に
存在する可能性が高い。これらの断片のさらなる欠失変異体、例えば（全長タム
スタチンの）６番目のシステイン残基を欠失させたタムスタチン−４５−１３２
の断片も、これらの方法に従い作製されうる。

【０３３３】 実施例４２ タムスタチン−４５−１３２及びＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａの発
現及び精製 全長タムスタチンのアミノ酸４５〜１３２からなるタムスタチン−４５−１３
２を、Ｃ末端６ヒスチジンタグとの融合タンパク質として、発現プラスミドｐＥ
Ｔ２８ａを使用して大腸菌において発現させた。大腸菌で発現されたタンパク質
は、再折り畳み及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後、主に１２ｋＤａの可溶性タンパ
ク質として単離された。タムスタチン−４５−１３２は、抗ポリヒスチジンタグ
抗体により免疫検出可能であった。付加的な９アミノ酸（全長タムスタチンの残
基４５〜５４）は、タンパク質発現効率及び可溶性を増強するために、Ｔｕｍ−
５に付加された。低い（５０ＥＵ／ｍｇ未満）内毒素レベルを有する可溶性タン
パク質のみを、さらなる実験に使用した。

【０３３４】 組換えタムスタチン−４５−１３２を、前記と同様に、酵母ピキア・パストリ
ス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）においても発現させた。タンパク質がＣ
末端６ヒスチジンタグと融合するよう、ベクターｐＰＩＣＺαＡを使用してタム
スタチン−４５−１３２をサブクローニングした。

【０３３５】 Ｔｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａ（配列番号：３４）は、タムスタチン−４５−１
３２の分泌を増強するため、（全長タムスタチンの）残基１２６のシステインか
らアラニンへの部位特異的突然変異誘発により作製した。それを大腸菌において
発現させたところ、抗ポリヒスチジンタグ抗体を使用したウェスタンブロッティ
ングにより同一分子量サイズで検出された。

【０３３６】 グッドパスチャー症候群は、α３（ＩＶ）ＮＣ１に対する自己抗体活性と関連
した免疫傷害による、糸球体及び肺胞の基底膜の破壊により引き起こされる、肺
出血及び／又は急速に進行する糸球体腎炎を特徴とする自己免疫疾患である。最
近、最も確率の高い疾患関連病原性エピトープがＮ末端部分に同定され（Ｋａｌ
ｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８
；Ｈｅｌｌｍａｒｋ，Ｔ．ら，１９９９，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５５：９３８
−４４）、次いでＮ末端の４０アミノ酸内にさらに確定された（Ｈｅｌｌｍａｒ
ｋ，Ｔ．ら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２５８６２−８；Ｎ
ｅｔｚｅｒ，Ｋ．Ｏ．ら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１２
６７−７４）。Ｎ末端タムスタチン−４５−１３２は、グッドパスチャー自己エ
ピトープの外にあるタムスタチンの残基４５〜１３２からなる。タムスタチン−
４５−１３２がグッドパスチャー自己抗体により検出されないであろうことをさ
らに確認するため、グッドパスチャー患者由来の抗血清をウェスタンブロッティ
ングのため使用した。この抗血清は、２９３細胞で発現された全長タムスタチン
を高感度に検出したが、大腸菌で発現されたタムスタチン−４５−１３２及びピ
キアで発現されたＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａは検出することができなかった。
このことは、タムスタチン−４５−１３２及びＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａが、
グッドパスチャー自己エピトープを含有していないことを示しており、これらの
組換えタンパク質が、ヒトへの投与時にこの自己免役疾患を誘導する可能性は排
除される。

【０３３７】 実施例４３ タムスタチン−４５−１３２及びＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａの活
性 タムスタチン−４５−１３２を、内皮細胞増殖、細胞周期（Ｇ_１／Ｓ）停止、
及び細胞生存度に対する効果に関して調査した。

【０３３８】 タムスタチン−４５−１３２のＣ−ＰＡＥ細胞に対する抗増殖効果は、Ｂｒｄ
Ｕ取り込みアッセイにより調査した。このアッセイは、チミジンアナログとして
［^３Ｈ］チミジンの代わりにブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を使用する。
ＢｒｄＵは、活発に増殖中の細胞において新たに合成されるＤＮＡ鎖に取り込ま
れる。次いで、細胞へと取り込まれたＢｒｄＵは、免疫化学的に検出されうる。
アッセイは、製造業者の指示をいくつか修飾したものに従い、ＢｒｄＵ増殖アッ
セイキット（ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
，ＵＳＡ）を使用して実施した。Ｃ−ＰＡＥ細胞を含む、１０％ＦＣＳを含有す
るＤＭＥＭを、９６ウェルプレートに播いた。翌日、培地を、大腸菌で発現され
たタムスタチン−４５−１３２又は２９３細胞で発現された全長タムスタチンを
含む、又は含まない、２％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭと交換した。次いで、プレ
ートを４６時間インキュベートし、次いで細胞を１０ｎＭ ＢｒｄＵで２時間パ
ルス処理した。次いで、細胞及びＤＮＡをウェルに固定化し、抗ＢｒｄＵ一次抗
体及び二次抗体と反応させ、次いでキットと共に供給された比色反応により現像
した。次いで、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓ
ｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）上でＯＤ_４５０でプレート
を読み取った。

【０３３９】 細胞周期に対するタムスタチン−４５−１３２及びＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−
Ａの効果は、前記実施例４と同様にアッセイした。簡単に説明すると、接触阻害
により、４８時間、Ｃ−ＰＡＥ細胞の増殖を停止させた。次いで、１ウェル当た
り１０^５個の細胞を採集し、フィブロネクチンを含む５％ＦＣＳ、及び組換えタ
ムスタチン−４５−１３２又はＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａのいずれかでコーテ
ィングされた１２穴プレートに播いた。２１時間後、細胞を採集し、７０％氷冷
エタノールで固定した。固定された細胞を、２％ＦＣＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ
−２０を含有するＰＢＳ中で室温で３０分間再水和させ、遠心分離し、同緩衝液
０．５ｍｌに再懸濁させた。ＲＮａｓｅ（５μｇ／ｍｌ）消化を３７℃で１時間
行った後、ヨウ化プロピジウム（５μｇ／ｍｌ）で染色した。次いで、ＥＰＩＣ
Ｓ ＸＬ−ＭＣＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）
を使用して、細胞を計数した。

【０３４０】 細胞生存度は、前記と同様のＭＴＴアッセイにより測定した。

【０３４１】 図５０〜５２に示されるように、タムスタチン−４５−１３２は、内皮細胞の
増殖を特異的に阻害し（図５０Ａ及び５０Ｂ）、細胞周期停止を誘導し（図５１
）、細胞生存度を減少させる（図５２Ａ、５２Ｂ、５２Ｃおよび５２Ｄ）。

【０３４２】 図５０Ａは、０、０．１２５、０．２５、０．５、１．０、又は２．０μＭの
濃度（ｘ軸）の、大腸菌発現タムスタチン−４５−１３２（黒バー）又は２９３
細胞発現全長タムスタチン（白バー）で処理されたＣ−ＰＡＥ細胞を用いたＢｒ
ｄＵアッセイによりＯＤ_４５０で測定された細胞増殖（ｙ軸）を示すヒストグラ
ムである。タムスタチン−４５−１３２及び全長タムスタチンの両方が、Ｃ−Ｐ
ＡＥ細胞におけるＢｒｄＵの取り込みを用量依存的に減少させた。図５０Ｂは、
０、０．１、１．０、５．０、及び１０．０μｇ／ｍｌの濃度（ｘ軸）のピキア
発現タムスタチン−４５−１３２で処理されたＣ−ＰＡＥ細胞を用いた、メチレ
ンブルー染色によりＯＤ_６５５で測定された細胞増殖（ｙ軸）を示すヒストグラ
ムである。未刺激Ｃ−ＰＡＥ細胞を対照とした。タムスタチン−４５−１３２は
、２０％ＦＣＳで刺激されたＣ−ＰＡＥ細胞を用量依存的に阻害し、ＥＤ_５０は
５μｇ／ｍｌであった。対照処理（０μｇ／ｍｌ）とタムスタチン−４５−１３
２処理（５及び１０μｇ／ｍｌ）との間の差は、有意（片側スチューデントｔ検
定によりＰ＜０．０５）であった。対照ヒト黒色腫細胞（ＭＷ−１６４細胞）を
使用した場合、タムスタチン−４５−１３２の抗増殖効果は観察されなかった。

【０３４３】 図５１は、増殖期内皮細胞のＧ_１停止を示すヒストグラムである。増殖停止さ
れた接触阻害された細胞において、細胞の５．８％が０時点でＳ期にあった。細
胞を５％ＦＣＳで２１時間刺激した場合、Ｓ期の細胞の比率（％）が２１．５％
へと３．７倍増加した。タムスタチン−４５−１３２による処理は、Ｓ期の細胞
の比率（％）を６．０％へと減少させた。この効果は用量依存的であり、Ｓ期の
細胞の比率（％）は、１μｇ／ｍｌタムスタチン−４５−１３２で１９．３％、
１０μｇ／ｍｌタムスタチン−４５−１３２で１１．３％であった。もう一つの
実験において、Ｇ_０／Ｇ_１期の細胞の比率（％）は、５％ＦＣＳで処理された対
照群において最も低く、タムスタチン−４５−１３２による処理により上昇した
。これらの結果は、タムスタチン−４５−１３２による処理が、増殖期内皮細胞
における細胞周期停止を引き起こすことを示している。Ｔｕｍ−５−１２６−Ｃ
−Ａによる処理は、タムスタチン−４５−１３２による処理と等価な結果を示し
た。

【０３４４】 図５２Ａ、５２Ｂ、５２Ｃ、及び５２Ｄは、タムスタチン−４５−１３２及び
Ｔｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａの細胞生存度に対する効果を示す一組の４つのヒス
トグラムである。図５２Ａは、０、３、６、１２、２５、及び５０μｇ／ｍｌ（
ｘ軸）のタムスタチン−４５−１３２（黒バー）及びアルキル化され還元された
タムスタチン−４５−１３２（白バー）で処理されたＣ−ＰＡＥ細胞に関する、
ＭＴＴアッセイにおいてＯＤ_５６２において測定された細胞生存度（ｙ軸）を示
している。タムスタチン−４５−１３２は、細胞生存度を用量依存的に有意に減
少させ、ＥＤ_５０は１２μｇ／ｍｌであった。還元型アルキル化タムスタチン−
４５−１３２の、Ｃ−ＰＡＥ細胞の細胞生存度を減少させる効果は、未処理タム
スタチン−４５−１３２の効果と類似していた。従って、タムスタチン−４５−
１３２の抗血管新生効果は、システイン残基間のジスルフィド結合に由来するコ
ンフォメーションには依存していない。

【０３４５】 Ｔｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａは、図５２Ｂに示されるように、タムスタチン−
４５−１３２の効果と類似の細胞生存度に対する効果を示した。図５２Ｂは、０
、３、６、１２、２５、及び５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のＴｕｍ−５−１２６−Ｃ
−Ａで処理されたＣ−ＰＡＥ細胞についての、ＭＴＴアッセイにおいてＯＤ_{５６ ２} で測定された細胞生存度（ｙ軸）を示している。

【０３４６】 タムスタチン−４５−１３２及びＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−ＡのＣ−ＰＡＥ細
胞の細胞生存度に対する効果は、図５２Ｃ及び５２Ｄに示されるように、対照の
ＰＣ−３細胞及びＤＵ−１４５細胞には見られなかった。図５２Ｃは、０、３、
６、１２、２５、及び５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のタムスタチン−４５−１３２で
処理されたＰＣ−３細胞についての、ＭＴＴアッセイにおいてＯＤ_５６２で測定
された細胞生存度（ｙ軸）を示している。図５２Ｄは、０、３、６、１２、２５
、及び５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のタムスタチン−４５−１３２で処理されたＤＵ
−１４５細胞についての、ＭＴＴアッセイにおいてＯＤ_５６２で測定された細胞
生存度（ｙ軸）を示している。従って、タムスタチン−４５−１３２の活性は、
内皮細胞に特異的である。

【０３４７】 実施例４４ 内皮細胞に対するタムスタチン−４５−１３２の効果 以下のアッセイにより示されるように、タムスタチン−４５−１３２は、内皮
細胞アポトーシスを誘導し、内皮管形成を阻害することが見出された。

【０３４８】 タムスタチン−４５−１３２は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣアッセイにより示さ
れるように、内皮細胞アポトーシスを誘導することが見出された。アッセイは、
Ｃ−ＰＡＥ細胞をタムスタチン−４５−１３２で１８時間処理することにより、
前記と同様に実施した。対照細胞にはＰＢＳを与えた。タムスタチン−４５−１
３２は、５μｇ／ｍｌで、対照ＴＮＦ−αと比較して蛍光強度ピークの明確なシ
フトを誘導した。

【０３４９】 カスパーゼ−３活性も、前記と同様にアッセイした。特異的カスパーゼ−３阻
害剤であるＤＥＶＤ−ｆｍｋを、タムスタチン−４５−１３２の特異性を示すた
めの内部対照として使用した。ＴＮＦ−α（８０ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照として
使用した。実験は３回繰り返された。

【０３５０】 結果を、図５３に示す。図５３は、対照、対照＋ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、ＴＮＦ−
α、ＴＮＦ−α＋ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、タムスタチン−４５−１３２（１μｇ／ｍ
ｌ及び１０μｇ／ｍｌ）、及びタムスタチン−４５−１３２（１０μｇ／ｍｌ）
＋ＤＥＶＤ−ｆｍｋ（ｘ軸）のカスパーゼ−３活性（ＯＤ_４０５において測定、
ｙ軸）を示すヒストグラムである。１０μｇ／ｍｌの大腸菌で発現されたタムス
タチン−４５−１３２でＣ−ＰＡＥ細胞を処理することにより、カスパーゼ−３
活性の４．５倍の増加が観察された。陽性対照ＴＮＦ−αも、４．５倍の増加を
与えた。特異的カスパーゼ−３阻害剤であるＤＥＶＤ−ｆｍｋは、基線レベルの
プロテアーゼ活性を減少させ、このことから、測定された活性の増加がカスパー
ゼ−３に特異的であることが示された。この増加した活性は、タムスタチン−４
５−１３２によりＰＣ−３細胞を処理することによっては観察されなかった。

【０３５１】 タムスタチン−４５−１３２は、マトリゲルアッセイにより示されるように内
皮管形成を阻害することも見出された。マトリゲルアッセイは、前記実施例に記
載のようにして実施した。簡単に説明すると、５μｇ／ｍｌの大腸菌発現タムス
タチン−４５−１３２と共に又は無しでインキュベートされたマトリゲルでコー
ティングされたプレート上で、ＨＵＶＥＣに管を形成させた。ＢＳＡで処理され
た細胞及び酵母発現ヒトエンドスタチン（５及び２０μｇ／ｍｌ）を対照として
使用した。タムスタチン−４５−１３２は、内皮管形成を、用量依存的に、対照
と比較して有意に阻害した。処理後の平均管分岐形成率（％）は、ＢＳＡ処理で
２２．７±３．１、タムスタチン−４５−１３２処理で２．１±２．０であり、
エンドスタチンは、５μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌで、それぞれ１９．４±３
．０及び７．５±６．０という平均を与えた。タムスタチン−４５−１３２は、
５μｇ／ｍｌで、対照と比較して有意に内皮管形成を減少させた。ヒトエンドス
タチンは、２０μｇ／ｍｌですら、５μｇ／ｍｌのタムスタチン−４５−１３２
よりも低い阻害効果を示した。

【０３５２】 実施例４５ タムスタチン−４５−１３２の結合活性 細胞付着アッセイを実施したところ、タムスタチン−４５−１３２が内皮細胞
上のα_Ｖβ_３インテグリン及びβ_１インテグリンと結合すること、並びにその結
合が「ＲＧＤ」ペプチド配列に依存していないことが示された。

【０３５３】 前記と同様に、細胞付着アッセイを実施した。簡単に説明すると、９６ウェル
プレートを、１０μｇ／ｍｌのタムスタチン−４５−１３２又は０．５〜２．５
μｇ／ｍｌのビトロネクチン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳ
Ａ）のいずれかで一夜コーティングした。プレートをＢＳＡでブロッキングし、
ＨＵＶＥＣ細胞又はＣ−ＰＡＥ細胞を、１０μｇ／ｍｌの抗体又は合成ペプチド
（合成ペプチドＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号：３５）又は合成対照ペプチドＣ
ＮＧＲＣ（配列番号：３６））のいずれかと共に１５分間インキュベートした。
細胞をプレートに添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、プレ
ートを洗浄し、付着した細胞の数をメチレンブルー染色により決定した。

【０３５４】 大腸菌で発現されたタムスタチン−４５−１３２でコーティングされたプレー
トへのＨＵＶＥＣ細胞の付着は、α_Ｖβ_３インテグリン及びβ_１インテグリンに
対する抗体により有意に阻害された。α_Ｖβ_３インテグリン抗体、β_１インテグ
リン抗体は、対照として使用されたマウスＩｇＧと比較して、それぞれ４７．１
％及び４７．５％、細胞付着を阻害した。Ｃ−ＰＡＥ細胞はほぼ同等の阻害を示
した。

【０３５５】 合成ペプチドＣＤＣＲＧＤＣＦＣは、５μｇ／ｍｌで、ビトロネクチンでコー
ティングされたプレートへの内皮細胞の付着を阻害した。対照ペプチドＣＮＧＲ
Ｃは、そのような阻害を示さなかった。しかしながら、細胞を１．０又は１０．
０μｇ／ｍｌのＣＤＣＲＧＤＣＦＣペプチドと共にインキュベートした場合、大
腸菌発現タムスタチン−４５−１３２でコーティングされたプレートへのＣ−Ｐ
ＡＥ細胞の付着は阻害されず、タムスタチン−４５−１３２が、内皮細胞上のα _Ｖ β_３インテグリン受容体上の、以前に記載されたＲＧＤ結合部位（Ａｒａｐ，
Ｗ．ら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３７７−８０）とは異なる別の部
位と結合することが示唆された。ＣＮＧＲＣ対照ペプチドは、タムスタチン−４
５−１３２でコーティングされたプレートへの細胞の付着も阻害しなかった。

【０３５６】 可溶性α_Ｖβ_３インテグリンタンパク質は、タムスタチン−４５−１３２の抗
増殖効果を逆転させた。これは、前記の実施例２６と同様の競合増殖アッセイに
より示された。ビトロネクチンでコーティングされたプレートをα_Ｖβ_３可溶性
タンパク質と共にインキュベートし、次いで細胞付着アッセイを実施した。可溶
性α_Ｖβ_３タンパク質は、１μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌで、コーティングされ
たプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の付着を有意に阻害した。次いで、大腸菌発現タ
ムスタチン−４５−１３２を、α_Ｖβ_３インテグリンタンパク質と共に３０分間
インキュベートし、次いで２０％ＦＣＳと共にＣ−ＰＡＥ細胞へと添加した。４
８時間後、メチレンブルー染色により細胞増殖を決定した。タムスタチン−４５
−１３２の抗増殖効果は、増加する濃度のα_Ｖβ_３可溶性タンパク質により用量
依存的に逆転された。１μｇ／ｍｌで、α_Ｖβ_３タンパク質は、タムスタチン−
４５−１３２により誘導される抗増殖効果を６５．９％有意に逆転させた。タム
スタチン−４５−１３２なしのα_Ｖβ_３タンパク質自体による処理は、内皮細胞
増殖を阻害せず、タムスタチン−４５−１３２の抗血管新生活性が、内皮細胞表
面上のα_Ｖβ_３インテグリンとの結合により媒介されることがさらに示された。

【０３５７】 タムスタチン−４５−１３２の内皮細胞表面との結合をさらに証明するため、
ビオチン化されたタムスタチン−４５−１３２を細胞表面標識に使用した。組換
え大腸菌発現タムスタチン−４５−１３２を、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン
（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｏｎｏ
ｉｓ，ＵＳＡ）を使用してビオチン化した。タムスタチン−４５−１３２を含む
、１０％ＤＭＳＯ及び５％Ｄ−マンニトールを含有する緩衝液を、１２Ｍ過剰の
スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンと共に４℃で一夜インキュベートした。このイ
ンキュベーション中、ビオチン化タムスタチン−４５−１３２が、溶液から沈殿
した。沈殿物を蒸留水で２回洗浄し、ＤＭＳＯに再懸濁させ、次いで蒸留水と１
：１で混合し、およそ４ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。ビオチン化タムスタチン
−４５−１３２を、４℃で保存した。

【０３５８】 細胞表面標識のため、サブコンフルエントのＨＵＶＥＣ細胞を、軽いトリプシ
ン処理によりＥＤＴＡを使用してフラスコから除去し、次いで２％ＢＳＡを含有
するＤＭＥＭで２回洗浄した。次いで、細胞をＤＭＥＭ／ＢＳＡに再懸濁させ、
ビオチン標識されたタムスタチン−４５−１３２、又はタムスタチン−４５−１
３２なしの偽ビオチン反応の産物のいずれかと共に４℃で１時間インキュベート
した。次いで、ＤＭＥＭ／ＢＳＡで細胞を２回洗浄し、次いでストレプトアビジ
ン−ＦＩＴＣ（「Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＦＩＴＣ」，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）と共に４
℃で３０分間インキュベートした。次いで、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６
００蛍光顕微鏡で試料を観察し、フローサイトメトリーにより分析した。

【０３５９】 タムスタチン−４５−１３２と間接的に結合したＦＩＴＣが、懸濁液中のＨＵ
ＶＥＣ細胞の表面上に検出され、蛍光は付着後の細胞表面上に比較的小さい斑点
状パターンで広範に分布していた。細胞を、ビオチン化タムスタチン−４５−１
３２の代わりに遊離ビオチンと共にインキュベートした場合、細胞表面上には有
意な蛍光が検出されなかった。ＦＩＴＣ陽性細胞、即ちタムスタチン−４５−１
３２と結合した細胞の数は、ビオチン化タムスタチン−４５−１３２の濃度が増
加するにつれ用量依存的に増加し、タムスタチン−４５−１３２が内皮細胞の表
面と結合することが示された。

【０３６０】 実施例４６ 血管新生及び腫瘍増殖に対するタムスタチン−４５−１３２の効果 新毛細管形成に対するタムスタチン−４５−１３２のインビボ効果を評価する
ため、マトリゲルプラグアッセイを実施した。６日間の処理後、形成された新血
管の数は、５μｇ／ｍｌの大腸菌発現タムスタチン−４５−１３２による処理に
より、ＰＢＳ処理対照と比較して９１％減少した。全長タムスタチンのＮ末端の
５３アミノ酸を欠くＴｕｍ−１も試験したところ、それは、新血管形成を９５％
減少させた。（３〜４個のマトリゲルプラグの）平均血管数は、Ｔｕｍ−１処理
プラグで０．４７±０．１６、タムスタチン−４５−１３２処理プラグで０．８
０±０．１６、ＰＢＳ処理対照で８．８１±０．３５であった。

【０３６１】 タムスタチン−４５−１３２を、腫瘍増殖を抑制する能力に関しても試験した
。５〜６週齢、約２５ｇの雄無胸腺ヌードＮＣＲＮＵマウスに、およそ２×１０ ^６ 個のＰＣ−３（前立腺癌）細胞を背側皮下へと移植した。Ｖｅｒｎｉｅｒカリ
パスを使用して腫瘍を測定し、標準式（幅^２×長さ×０．５２）を使用して腫瘍
の容積を計算した。腫瘍を約５０ｍｍ^３にまで増殖させ、次いで６匹の群へと動
物のペアマッチングを行った。タンパク質又は賦形剤（ＰＢＳ、対照）の初回用
量を、ペアマッチングの日（１日目）に与えた。タムスタチン−４５−１３２、
Ｔｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａ、又はヒトエンドスタチンを含む滅菌ＰＢＳを、１
〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、２０日間、毎日１日２回腹腔内注射した。対
照動物にはＰＢＳ賦形剤の注射を与えた。１つの処理においては、外科的に埋め
込まれたＡｌｚｅｔミニポンプを使用して、タムスタチン−４５−１３２の連続
的な皮下輸送を行った。１日目から開始して、マウスを週２回計量し、腫瘍測定
を行った。推定された平均腫瘍容積を計算し、２１日目に、マウスを計量し、屠
殺し、それらの腫瘍を切除し、光学顕微鏡及びＣＤ３１免疫染色により調査した
。対照腫瘍の平均重量で割った、処理された腫瘍の平均重量を、１から差し引き
、百分率で表し、各群についての腫瘍増殖阻害を得た。

【０３６２】 結果を、図５４に示す。図５４は、賦形剤（対照、白四角）、１ｍｇ／ｋｇタ
ムスタチン−４５−１３２（黒ひし形）、１ｍｇ／ｋｇ Ｔｕｍ−５−１２６−
Ｃ−Ａ（黒丸）、２０ｍｇ／ｋｇエンドスタチン（白丸）、及びミニポンプ投与
タムスタチン−４５−１３２（１ｍｇ／ｋｇ、白三角）による処理の、０、５、
１０、１５、及び２０日目（ｘ軸）における、Ｖ／Ｖ_０（平均腫瘍容積／初期腫
瘍容積）としての腫瘍容積比（ｙ軸）を示す線グラフである。重量変化により判
断されるように、タンパク質処理による毒性は見られなかった。タムスタチン−
４５−１３２及びＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａの両方が、ＰＣ−３細胞の増殖を
有意に阻害した。賦形剤注射対照群と比較して、ヒトタムスタチン−４５−１３
２は、１ｍｇ／ｋｇで、７４．１％（ｐ＝０．０２）の腫瘍増殖阻害を有し、Ｔ
ｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａは９２．０％（ｐ＝０．００１）の腫瘍増殖阻害を有
していた。Ａｌｚｅｔミニポンプを介したタムスタチン−４５−１３２の連続輸
送（２４時間で１ｍｇ／ｋｇ）も、７０．１％の有意な腫瘍増殖阻害を示した（
ｐ＝０．０３）。２０ｍｇ／ｋｇの用量（１日２回、ボーラス注射）で輸送され
たエンドスタチンは、賦形剤処理対照群と比較して、有意な腫瘍増殖阻害を示さ
なかった。

【０３６３】 ＣＤ３１免疫染色を使用して、標準的なストレプトアビジン−ビオチン−ペル
オキシダーゼ検出系（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ Ｋｉｔ，Ｖ
ｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ
）と共にラット抗マウスＶＤ３１モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して、ＰＣ−３腫
瘍異種移植片の凍結組織学的切片における腫瘍内微小血管密度（ＭＶＤ）を決定
した。内因性ペルオキシダーゼ活性を１％Ｈ２Ｏ２／メタノールを使用して３０
分間ブロッキングし、次いでスライドをプロテイナーゼＫと共に室温で３０分間
インキュベートすることにより抗原修復に供した。切片を５％正常ヤギ血清／Ｐ
ＢＳ＋０．１％ＴＷＥＥＮ−２０でブロッキングした後、抗マウスＣＤ３１抗体
を０．１％ＴＷＥＥＮ−２０を含有するＰＢＳで１：２０に希釈し、２時間イン
キュベートした。正常ラットＩｇＧを陰性対照として使用した。イムノペルオキ
シダーゼ染色を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ試薬キットを使用
して実施した。切片をメチルグリーン（ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｅｅｎ）で対比染色
した。低倍率で腫瘍をスキャンし、次いで最大数の明確な微小血管を含有してい
る腫瘍周縁部の３つの範囲を同定し、次いで個々の微小血管を４０×視野で計数
することにより、ＭＶＤを評価した。平均微小血管密度を、処理群間で比較し、
スチューデントｔ検定を使用して分析した。

【０３６４】 タムスタチン−４５−１３２腹腔内注射は、賦形剤注射対照群と比較して、Ｐ
Ｃ−３異種移植片における微小血管密度を有意に阻害した。低倍率（４０×）視
野１個当たりのＣＤ３１陽性血管の数は、タムスタチン−４５−１３２処理の６
．３３±０．５４に対し、対照では９．４４±１．０５であった（ｐ＝０．０４
７）。Ｔｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａ又はミニポンプ投与タムスタチン−４５−１
３２で処理された群は、平均血管密度の類似の減少を示した。

【０３６５】 全ての参照、特許、及び特許出願が、参照により完全に本明細書に組み込まれ
る。好ましい実施態様を参照しつつ本発明を具体的に示し説明したが、添付の特
許請求の範囲において定義されるような本発明の精神及び範囲から逸脱すること
なく、形式及び詳細を様々に変化させうることが、当業者には理解されよう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａおよび図１Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα１鎖のヌクレオチド配列（
図１Ａ、配列番号：１）およびアミノ酸配列（図１Ｂ、配列番号：２）を示す図
である。ｐＥＴ２２ｂ（＋）のフォワードプライマー（配列番号：３）およびリ
バースプライマー（配列番号：４）の位置が二重下線によって示され、そしてｐ
ＰＩＣＺαＡのフォワードプライマー（配列番号：１５）およびリバースプライ
マー（配列番号：１６）の位置が一本下線によって示される。

【図２】 図２は、アレステンのクローニングベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を表す概略図
である。フォワードプライマー（配列番号：３）およびリバースプライマー（配
列番号：４）ならびにアレステンのクローン化部位が示されている。

【図３】 図３Ａおよび図３Ｂは、内皮細胞（Ｃ−ＰＡＥ）の増殖を指標とする^３Ｈ−チ
ミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステン（図３Ａ、０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ
／ｍｌ：ｘ軸）およびエンドスタチン（図３Ｂ、０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ
：ｘ軸）の作用を示す１組の線グラフである。

【図４】 図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃおよび図４Ｄは、内皮細胞の増殖を指標とする^３Ｈ−
チミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステンおよびエンドスタチンの作用を示
す４つの棒グラフの１組である。図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃは、それぞれ、７
８６−Ｏ細胞、ＰＣ−３細胞、ＨＰＥＣ細胞に対するアレステン（０μｇ／ｍｌ
〜５０μｇ／ｍｌ（図４Ａおよび図４Ｂ）および０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ
（図４Ｃ））の作用を示す。図４Ｄは、Ａ−４９８細胞に対する０．１〜１０μ
ｇ／ｍｌのエンドスタチンの作用を示す。

【図５】 図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃは、ヒト臍帯内皮（ＥＣＶ−３０４）細胞におけ
るＦＢＳ誘導による走化性を介する内皮細胞の遊走に対するアレステン（２μｇ
／ｍｌ、図５Ｂ）およびエンドスタチン（２０μｇ／ｍｌ、図５Ｃ）の作用を示
す４枚の顕微鏡写真の１組である。図５Ａは未処置の対照細胞を示す。

【図６】 図６は、図５の結果をグラフ化して示す棒グラフである。図６は、ＥＣＶ−３
０４内皮細胞の遊走に対するアレステン（２μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌ）
およびエンドスタチン（２．５μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌ）のいずれかの
作用を示す。

【図７】 図７は、内皮細胞管形成に対するアレステンの作用を示す線グラフである。管
形成の割合がｙ軸に示され、阻害剤の濃度がｘ軸に示される。処置は下記の通り
であった：無処置（対照、黒ひし形）、ＢＳＡ（対照、白三角）、７Ｓドメイン
（対照、Ｘ）およびアレステン（黒四角）。

【図８】 図８Ａおよび図８Ｂは、対照（図８Ａ）に対する、内皮細胞管形成におけるア
レステン（０．８μｇ／ｍｌ、図８Ｂ）の作用を示す１組の顕微鏡写真である。

【図９】 図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃおよび図９Ｄは、インビボでの腫瘍成長に対するアレ
ステンおよびエンドスタチンの作用を示す４つの線グラフの１組である。図９Ａ
は、１０ｍｇ／ｋｇのアレステンで処置されたマウス（白四角）、ＢＳＡで処置
されたマウス（＋）および対照マウス（黒丸）について７００ｍｍ^３からの腫瘍
容積の増大を示すグラフである。図９Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇのアレステンで処置
された腫瘍（白四角）およびＢＳＡで処置された腫瘍（＋）について１００ｍｍ ^３ からの腫瘍容積の増大を示す。図９Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇのアレステンで処置
されたマウス（白四角）、エンドスタチンで処置されたマウス（黒三角）および
対照マウス（黒丸）について約１００ｍｍ^３からの腫瘍容積の増大を示す。図９
Ｄは、対照（黒四角）に対する、アレステン（白四角）で処置されたときの２０
０ｍｍ^３の腫瘍に対する増大を示す。

【図１０】 図１０Ａおよび図１０Ｂは、Ｃ−ＰＡＥ細胞（図１０Ａ）およびＰＣ−３細胞
（図１０Ｂ）について様々な処置（ｘ軸）におけるＯＤ_４０５での吸光度を関数
とするカスパーゼ−３活性の量（ｙ軸）を示す１組のヒストグラムである。それ
ぞれの棒は、三連ウェルの平均＋／−平均の標準誤差を表す。

【図１１】 図１１Ａおよび図１１Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα２鎖のヌクレオチド配
列（図１１Ａ、配列番号：５）およびアミノ酸配列（図１１Ｂ、配列番号：６）
を示す図である。ｐＥＴ２２ｂ（＋）のフォワードプライマー（配列番号：７）
およびリバースプライマー（配列番号：８）の位置が二重下線によって示され、
そしてｐＰＩＣＺαＡのフォワードプライマー（配列番号：１７）およびリバー
スプライマー（配列番号：１８）の位置が一本下線によって示される。

【図１２】 図１２は、カンスタチンのクローニングベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を表す概
略図である。フォワードプライマー（配列番号：７）およびリバースプライマー
（配列番号：８）ならびにカンスタチンのクローン化部位が示されている。

【図１３】 図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃおよび図１３Ｄは、内皮（Ｃ−ＰＡＥ）細胞（
図１３Ａおよび図１３Ｃ）および非内皮（７８６−Ｏ、ＰＣ−３およびＨＥＫ２
９３）細胞（図１３Ｂおよび図１３Ｄ）の増殖に対する、カンスタチンの濃度（
ｘ軸）を変化させたときの作用を示すヒストグラムである。増殖は、^３Ｈ−チミ
ジン取り込み（図１３Ａおよび図１３Ｂ）およびメチレンブルー染色（図１３Ｃ
および図１３Ｄ）の関数として測定された。

【図１４】 図１４は、無ＶＥＧＦ（無ＶＥＧＦまたは血清）細胞およびＶＥＧＦ（１％Ｆ
ＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ）細胞の処置、ならびに０．０１カンスタ
チン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦおよび０．０１μｇ／ｍｌカ
ンスタチン）および１．０μｇ／ｍｌカンスタチン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ
／ｍｌ ＶＥＧＦおよび１μｇ／ｍｌカンスタチン）の処置について視野あたり
の遊走した内皮細胞の数（ｙ軸）を示す棒グラフである。

【図１５】 図１５は、ＢＳＡ（白四角）、カンスタチン（黒四角）およびα５ＮＣ１（白
丸）の様々な処置における内皮細胞管形成の量を対照（ＰＢＳ処置ウェル）の管
形成の百分率（ｙ軸）として示す線グラフである。垂直な棒は平均の標準誤差を
表す。

【図１６】 図１６は、時間（ｘ軸）に対する、ｔ＝０において存在するタンパク質の割合
としてビンキュリンのレベルを関数とするＦＬＩＰ（ＦＬＩＣＥ阻害タンパク質
、すなわち、ＦＡＤＤ様インターロイキン−１β変換酵素阻害タンパク質）レベ
ル（ｙ軸）のグラフである。

【図１７】 図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃおよび図１７Ｄは、処置日数（ｘ軸）に対して
プロットされた腫瘍容積比（ｙ軸、図１７Ａおよび図１７Ｂ）またはｍｍ^３単位
の腫瘍容積（ｙ軸、図１７Ｃおよび図１７Ｄ）について、カンスタチン（黒四角
）、エンドスタチン（白丸）および対照（白四角）のＰＣ−３細胞（図１７Ａお
よび図１７Ｂ）および７８６−Ｏ細胞（図１７Ｃおよび図１７Ｄ）に対する作用
を示す線グラフである。

【図１８】 図１８Ａおよび図１８Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα３鎖のヌクレオチド配
列（図１８Ａ、配列番号：９）およびアミノ酸配列（図１８Ｂ、配列番号：１０
）を示す図である。ｐＥＴ２２ｂ（＋）のフォワードプライマー（配列番号：１
１）およびリバースプライマー（配列番号：１２）の位置が二重下線によって示
される。「タムスタチン３３３」（配列番号：２０）および「タムスタチン３３
４」（配列番号：２１）の断片の開始部および終了部もまた示されている（「^＊ 」＝タムスタチン３３３；「＋」＝タムスタチン３３４）。

【図１９】 図１９は、タムスタチンのクローニングベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を表す概
略図である。フォワードプライマー（配列番号：１１）およびリバースプライマ
ー（配列番号：１２）ならびにタムスタチンのクローン化部位が示されている。

【図２０】 図２０は、タムスタチン変異体のタムスタチンＮ−５３（Ｔｕｍ−１）におい
てα３（ＩＶ）ＮＣ１モノマー内の除かれたアミノ酸の位置を示す概略図である
。黒丸は、この変異体を作製するためにタムスタチンから欠失させたＮ末端の５
３アミノ酸残基に対応する。短い棒により示されるジスルフィド結合は、ジスル
フィド結合がα１（ＩＶ）ＮＣ１およびα２（ＩＶ）ＮＣ１に存在するように配
置される。

【図２１】 図２１Ａ、図２１Ｂおよび図２１Ｃは、様々な濃度のタムスタチン（ｘ軸）で
処置したときの、Ｃ−ＰＡＥ細胞（図２１Ａ）、ＰＣ−３細胞（図２１Ｂ）およ
び７８６−Ｏ細胞（図２１Ｃ）に対する^３Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）を示す
３つのヒストグラムの１組である。すべての群は三連のサンプルを表す。

【図２２】 図２２は、α_ｖβ_３の量を増大させることと組み合わせたときの、Ｃ−ＰＡＥ
細胞による色素の取り込みに対する０．１μｇ／ｍｌタムスタチンの作用をｘ軸
に示すヒストグラムである。ＯＤ_６５５での吸光度がｙ軸に示される。「０．１
％ＦＣＳ」は０．１％ＦＣＳ処置（未刺激）の対照を表し、「２０％ＦＣＳ」は
２０％ＦＣＳ処置（刺激）の対照である。残りの棒は、α_ｖβ_３単独の対照、お
よびタムスタチン＋増大濃度のα_ｖβ_３による処置を表す。それぞれの棒は、三
連ウェルに対する平均＋／−平均の標準誤差を表す。実験は３回繰り返された。
星印は、片側スチューデントｔ検定によってＰ＜０．０５であることを示す。

【図２３】 図２３Ａおよび図２３Ｂは、様々な処置（ｘ軸）におけるＣ−ＰＡＥ細胞（図
２３Ａ）およびＰＣ−３細胞（図２３Ｂ）についてＯＤ_４０５での吸光度を関数
とするカスパーゼ−３活性の量（ｙ軸）を示す１組のヒストグラムである。それ
ぞれの棒は、三連ウェルの平均＋／−平均の標準誤差を表す。

【図２４】 図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃおよび図２４Ｄは、様々なインテグリンサブユ
ニット（α_１〜α_６、β_１）またはα_ｖβ_３インテグリンの阻止抗体の存在下に
おける、タムスタチン（図２４Ａ）あるいは対照のＩＶ型コラーゲン（図２４Ｂ
）またはビトロネクチン（図２４Ｃ）またはラミニン−１（図２４Ａ）がコーテ
ィングされたプレートに対するＨＵＶＥＣ細胞の結合を示す４つのヒストグラム
の１組である。プレートのコーティングは各グラフの上部に示され、インキュベ
ーションのために使用された抗体は各グラフのｘ軸に示される。ＢＳＡがコーテ
ィングされたプレートを陰性対照として使用した。

【図２５】 図２５は、タムスタチンがコーティングされたプレートに対するＣ−ＰＡＥ細
胞の結合を示すヒストグラムである。ＢＳＡがコーティングされたプレートを陰
性対照として使用した。

【図２６】 図２６は、タムスタチン（黒丸）、ＢＳＡ（対照、白四角）および７Ｓドメイ
ン（対照、白丸）の量（ｘ軸）を変化させたときの内皮細胞の管形成（ｙ軸）に
対する作用を示す線グラフである。

【図２７】 図２７Ａおよび図２７Ｂは、対照（白四角）に対する、タムスタチン（黒丸）
およびエンドスタチン（白丸）の処置日数（ｘ軸）に対する腫瘍容積（ｍｍ^３、
ｙ軸）における作用を示す１組の線グラフである。星印で示されるデータ点は、
片側スチューデントｔ検定によってＰ＜０．０５で有意である。

【図２８】 図２８は、対照マウス（白四角）およびタムスタチン変異体Ｎ−５３処置マウ
ス（黒丸）について処置日数（ｘ軸）に対する腫瘍容積（ｙ軸）の増大を示すグ
ラフである。星印により示されるデータ点は、片側スチューデントｔ検定によっ
てＰ＜０．０５で有意である。

【図２９】 図２９は、タムスタチンおよびタムスタチンＮ−５３の濃度（ｘ軸）を増大さ
せたときの細胞生存度（ＯＤ_５９０の関数として、ｙ軸）を示すグラフである。
各点は、三連ウェルについて平均＋／−平均の標準誤差を表す。星印は、片側ス
チューデントｔ検定によってＰ＜０．０５であることを示す。

【図３０】 図３０は、アレステン（黒丸）、カンスタチン（白丸）、１２ｋＤａのアレス
テン断片（黒四角）、８ｋＤａのアレステン断片（白四角）および１０ｋＤａの
カンスタチン断片（黒三角）の濃度（ｘ軸）を変更させたことによる内皮細胞の
管形成の阻害（ｙ軸）を示す線グラフである。

【図３１】 図３１は、タムスタチン断片３３３（黒丸）、タムスタチン断片３３４（白丸
）、ＢＳＡ（対照、黒四角）、α６（対照、白四角）およびタムスタチン（黒三
角）の濃度（ｘ軸）を増大させたことによる内皮細胞管の形成の阻害（ｙ軸）を
示す線グラフである。

【図３２】 図３２Ａ、図３２Ｂおよび図３２Ｃは、ＨＰＥ細胞（図３２Ａ）、Ｃ−ＰＡＥ
細胞（図３２Ｂ）およびＷＭ−１６４細胞（図３２Ｃ）の増殖（ｙ軸）に対する
タムスタチンの濃度（ｘ軸）を変更させたときの作用を示す３つのヒストグラム
の１組である。

【図３３】 図３３Ａおよび図３３Ｂは、Ｃ−ＰＡＥ細胞（図３３Ａ）およびＷＭ−１６４
細胞（図３３Ｂ）の相対的な数（ｙ軸）に対する、タムスタチン（黒ひし形）、
Ｔｕｍ−１（白四角）、Ｔｕｍ−２（黒丸）、Ｔｕｍ−３（白ひし形）およびＴ
ｕｍ−４（黒三角）の濃度（ｘ軸）を変更させたときの作用を示す１組のグラフ
である。

【図３４】 図３４Ａおよび図３４Ｂは、Ｃ−ＰＡＥ細胞（図３４Ａ）およびＷＭ−１６４
細胞（図３４Ｂ）の細胞生存度（ｙ軸）に対する、タムスタチン（黒ひし形）、
Ｔｕｍ−１（白四角）、Ｔｕｍ−２（黒丸）、Ｔｕｍ−３（白ひし形）およびＴ
ｕｍ−４（黒三角）の濃度（ｘ軸）を増大させたときの作用を示す１組のグラフ
である。

【図３５】 図３５は、５μｇ／ｍｌのＴｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３またはＴｕｍ
−４あるいは８０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αあるいはＰＢＳ緩衝液（対照）で処置
されたＣ−ＰＡＥ細胞（ｘ軸）のカスパーゼ−３活性をＯＤ_４０５での吸光度（
ｙ軸）の大きさとして示すヒストグラムである。

【図３６】 図３６Ａ、図３６Ｂおよび図３６Ｃは３つのヒストグラムの１組である。図３
６Ａ、図３６Ｂおよび図３６Ｃは、対照ＩｇＧ、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５およびＢＳ
Ａの存在下における、Ｔｕｍ−１（図３６Ａ）、Ｔｕｍ−２（図３６Ｂ）および
Ｔｕｍ−４（図３６Ｃ）がコーティングされた各プレートに対するＣ−ＰＡＥ細
胞の結合割合（ｙ軸）を示す。

【図３７】 図３７は、ＰＢＳ、タムスタチン、Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−４また
はＢＳＡ（ｘ軸）がコーティングされたプレートに結合したＷＭ−１６４細胞に
ついてＯＤ_６５５での吸光度によるメチレンブルー染色のレベル（ｙ軸）を示す
ヒストグラムである。

【図３８】 図３８Ａ、図３８Ｂ、図３８Ｃ、図３８Ｄおよび図３８Ｅは、１．５μｇ／ｍ
ｌのＴｕｍ−１（図３８Ａ）またはＴｕｍ−２（図３８Ｂ）で処置された、抗Ｔ
ｕｍ−４抗体（１：１００希釈、１：２００希釈、１：５００希釈）（ｘ軸）ま
たはα_ｖβ_３タンパク質（図３８Ｃ）でプレインキュベーションされていたＣ−
ＰＡＥ細胞（ｙ軸）、あるいはタムスタチン（図３８Ｄ）またはＴｕｍ−４（図
３８Ｅ）で処置されたＷＭ−１６４細胞の増殖を示す５つのヒストグラムの１組
である。

【図３９】 図３９は、ｙ軸の相対的細胞数に対して、タムスタチン（黒丸）、エンドスタ
チン（白三角）、抗α_ｖβ_３抗体（白四角）およびＩｇＧ（黒ひし形）（対照）
の濃度をｘ軸に示すグラフである。各点は、三連ウェルについて平均±平均の標
準誤差を表す。実験は３回繰り返された。星印は、片側スチューデントｔ検定に
よってＰ＜０．０５であることを示す。

【図４０】 図４０は、Ｃ−ＰＡＥ細胞の相対的細胞数（ｙ軸）に対する、カンスタチン（
黒ひし形）、Ｃａｎ−１（黒四角）およびＣａｎ−２（黒三角）の濃度（ｘ軸）
を増大させたときの作用を示すグラフである。各タンパク質のそれぞれの濃度は
四連で試験された。

【図４１】 図４１は、ＰＢＳ（対照）、カンスタチン、Ｃａｎ−１およびＣａｎ−２によ
る処置についてプラグあたりの平均血管数（ｙ軸）を示すヒストグラムである。

【図４２】 図４２は、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５およびＴ６のペプチドの位置が示さ
れるタムスタチンタンパク質配列の図である。ＧＰ−Ａ＝第１のグッドパスチャ
ーエピトープ。ＧＰ−Ｂ＝第２のグッドパスチャーエピトープ。

【図４３】 図４３Ａ、図４３Ｂ、図４３Ｃおよび図４３Ｄは、Ｔ３ペプチドによる内皮細
胞の増殖の阻害（図４３Ａ、図４３Ｂおよび図４３Ｃ）および内皮細胞のアポト
ーシスの誘導（図４３Ｄ）を示す４つのヒストグラムである。図４３Ａは、Ｔ２
、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５またはＴ６の１０μｇ／ｍｌのペプチド（ｘ軸）で処置され
たＣ−ＰＡＥ細胞の増殖（ｙ軸）を示す。図４３Ｂは、０．１μｇ／ｍｌ、１．
０μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチドで処置されたＣ−ＰＡＥ細胞
の増殖（ｙ軸）を示す。図４３Ｃは、α_ｖβ_３インテグリンの濃度（ｘ軸）を変
化させながらプレインキュベーションし、かつＴ３ペプチドで処置したときのＣ
−ＰＡＥ細胞の細胞成長（ｙ軸）を示す。図４Ｄは、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５ま
たはＴ６の１０μｇ／ｍｌのペプチドで細胞を処置した後におけるＭＴＴアッセ
イによって測定されるＣ−ＰＡＥ細胞の細胞生存度（ｙ軸）を示す。すべての棒
は、三連ウェルの平均＋／−ＳＥＭを表す。

【図４４】 図４４Ａ、図４４Ｂ、図４４Ｃ、図４４Ｄ、図４４Ｅ、図４４Ｆおよび図４４
Ｇは、抗ヒトインテグリン抗体、マウスＩｇＧ（対照）あるいはペプチドＴ２、
Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５またはＴ６で処置したときのＣ−ＰＡＥ細胞の接着を示す７つ
のヒストグラムの１組である。図４４Ａは、ＢＳＡ（対照）、無抗体（対照）、
マウスＩｇＧ（対照）およびα_ｖβ_３インテグリン抗体の存在下（ｘ軸）におけ
る、Ｔｕｍ−５ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）がコーティングされたプレートに対
するＨＵＶＥＣ細胞の結合（ｙ軸）を示す。図４４Ｂは、１０μｇ／ｍｌの組換
えＴｕｍ−５ペプチドがコーティングされた９６ウェルプレート（ｘ軸）に対す
るＣ−ＰＡＥ細胞の結合（ｙ軸）を示すヒストグラムである。図４４Ｃは、Ｔｕ
ｍ−５がコーティングされ、かつ２．５μｇ／ｍｌのペプチドＴ２、Ｔ３、Ｔ４
、Ｔ５またはＴ６で処置された９６ウェルプレート（ｘ軸）、あるいはＴ３で処
置されたＴｕｍ−４コーティングプレートに対するＣ−ＰＡＥ細胞の結合（ｙ軸
）を示すヒストグラムである。ＰＢＳ処置は対照として使用された。図４４Ｄは
、様々な濃度のＴ３ペプチド（ｘ軸）のＴｕｍ−５コーティングプレートに対す
るＣ−ＰＡＥ細胞の結合（ｙ軸）における作用を示す。ＰＢＳ処置は対照として
使用された。図４４Ｅは、ＰＢＳ（対照）、ＩｇＧ（対照）またはα_ｖβ_３イン
テグリン抗体の存在下における、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５またはＴ６がコーティ
ングされたプレート（ｘ軸）に対するＣ−ＰＡＥ細胞の結合（ｙ軸）を示す。図
４４Ｆは、ＰＢＳ（対照）、ＩｇＧ（対照）またはα_ｖインテグリン抗体、β_１ インテグリン抗体、β_３インテグリン抗体、α_ｖβ_５インテグリン抗体またはＢ
ＳＡ（対照）（ｘ軸）とともにインキュベーションしたときの、Ｔ３がコーティ
ングされたプレートに対するＣ−ＰＡＥ細胞の結合（ｙ軸）を示す。図４４Ｇは
、ＰＢＳ（対照）、ＢＳＡ（対照）、または様々な濃度（０．１μｇ／ｍｌ、１
．０μｇ／ｍｌ、１０．０μｇ／ｍｌ）のＴ３ペプチド、または様々な濃度（０
．１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１０．０μｇ／ｍｌ）のＴ６ペプチド（ｘ
軸）とともにインキュベーションしたときの、ビトロネクチン（２．５μｇ／ｍ
ｌ）がコーティングされたプレートに対するＣ−ＰＡＥ細胞の結合（ｙ軸）を示
す。各棒は、三連のウェルの平均＋／−ＳＥＭを表す。実験は３回繰り返された
。^＊片側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５。

【図４５】 図４５は、ＰＢＳ（対照）、α_ｖβ_３インテグリン抗体、β_１インテグリン抗
体、α_６インテグリン抗体またはＢＳＡ（対照）の存在下における、タムスタチ
ンＮ−５３（２０μｇ／ｍｌ）がコーティングされたプレートに対するＨＵＶＥ
Ｃ細胞の接着を示すヒストグラムである。

【図４６】 図４６は、賦形剤（対照、白丸）、５ｍｇ／ｋｇ／日のタムスタチン−Ｎ５３
（白四角）または２０ｍｇ／ｋｇ／日のタムスタチン−Ｎ５３（白ひし形）で処
置された腫瘍について１５日間（ｘ軸）にわたるＰＣ３前立腺腫瘍（ＰＣ３前立
腺異種移植片モデル）に対する平均腫瘍容積（ｙ軸）をｍｍ^３単位で示すグラフ
である。

【図４７】 図４７は、賦形剤（対照、白丸）、２０ｍｇ／ｋｇ／日のタムスタチン−Ｎ５
３（白四角）または５ｍｇ／ｋｇ／日のタムスタチン−Ｎ５３（白ひし形）で処
置された腫瘍について２２日間（ｘ軸）にわたるＭＤＡ−ＭＢＡ４３５乳癌腫瘍
に対する平均腫瘍容積（ｙ軸）をｍｍ^３単位で示すグラフである。

【図４８】 図４８は、ＰＢＳ（対照）、緩衝液（対照）、２０μｇ／ｍｌのタムスタチン
−Ｎ５３、１０μｇ／ｍｌのタムスタチン−４５−１３２、および５μｇ／ｍｌ
のタムスタチン−４５−１３２（ｘ軸）で処置したときの、Ｓ期のＣ−ＰＡＥ細
胞の割合（ｙ軸）を示すヒストグラムである。細胞周期アッセイは１０％ＦＢＳ
の存在下で行われた。

【図４９】 図４９は、ＰＢＳ（対照）、α_ｖβ_３インテグリン抗体、β_１インテグリン抗
体、α_６インテグリン抗体またはＢＳＡ（対照）の存在下における、タムスタチ
ン−４５−１３２（２０μｇ／ｍｌ）がコーティングされたプレートに対するＨ
ＵＶＥＣ細胞の接着（ＯＤ_５９５、ｙ軸）（ｙ軸）を示すヒストグラムである。

【図５０】 図５０Ａおよび図５０Ｂは、細胞増殖に対するタムスタチン−４５−１３２の
作用を示す２つのヒストグラムの１組である。図５０Ａは、０μＭ、０．１２５
μＭ、０．２５０μＭ、０．５００μＭ、１．０μＭまたは２．０μＭの濃度（
ｘ軸）の大腸菌発現タムスタチン−４５−１３２（黒バー）または２９３細胞発
現の全長型タムスタチン（白バー）で処置されたＣ−ＰＡＥ細胞を用いてＢｒｄ
Ｕアッセイにより測定された細胞増殖（ＯＤ_４５０で、ｙ軸）を示す。図５０Ｂ
は、０μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌお
よび１０．０μｇ／ｍｌの濃度（ｘ軸）のピキア発現タムスタチン−４５−１３
２で処置されたＣ−ＰＡＥ細胞を用いてメチレンブルー染色により（ＯＤ_６５５ で）測定された細胞増殖を示す。未刺激のＣ−ＰＡＥ細胞を対照として使用した
。

【図５１】 図５１は、細胞周期の進行に対する大腸菌発現のタムスタチン−４５−１３２
およびＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａの作用を示すヒストグラムである。Ｓ期にお
けるＣ−ＰＡＥ細胞の割合（ｙ軸）が０時間（対照）で示され、そしてその後、
０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）の
タムスタチン−４５−１３２（黒バー）またはＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａ（白
バー）によって処置された。実験は３回繰り返された。

【図５２】 図５２Ａ、図５２Ｂ、図５２Ｃおよび図５２Ｄは、細胞生存度に対するタムス
タチン−４５−１３２またはＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａの作用を示す４つのヒ
ストグラムの１組である。図５２Ａは、０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、６μｇ／
ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のタムス
タチン−４５−１３２（黒バー）ならびにアルキル化された還元型タムスタチン
−４５−１３２（白バー）で処置されたＣ−ＰＡＥ細胞についてＭＴＴアッセイ
におけるＯＤ_５６２で測定された細胞生存度（ｙ軸）を示す。図５２Ｂは、０μ
ｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよ
び５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａで処置されたＣ−ＰＡ
Ｅ細胞についてＭＴＴアッセイにおけるＯＤ_５６２で測定された細胞生存度（ｙ
軸）を示す。図５２Ｃは、０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、１２μ
ｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のタムスタチン−４５
−１３２で処置されたＰＣ−３細胞についてＭＴＴアッセイにおけるＯＤ_５６２ で測定された細胞生存度（ｙ軸）を示す。図５２Ｄは、０μｇ／ｍｌ、３μｇ／
ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ（
ｘ軸）のタムスタチン−４５−１３２で処置されたＤＵ−１４５細胞についてＭ
ＴＴアッセイにおけるＯＤ_５６２で測定された細胞生存度（ｙ軸）を示す。

【図５３】 図５３は、（ｘ軸）対照；対照＋ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−α
＋ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、タムスタチン−４５−１３２（１μｇ／ｍｌおよび１０μ
ｇ／ｍｌ）、およびタムスタチン−４５−１３２（１０μｇ／ｍｌ）＋ＤＥＶＤ
−ｆｍｋのカスパーゼ−３活性（ＣＤ_４０５で測定、ｙ軸）を示すヒストグラム
である。

【図５４】 図５４は、賦形剤（対照、白四角）、１ｍｇ／ｋｇのタムスタチン−４５−１
３２（黒ひし形）、１ｍｇ／ｋｇのＴｕｍ−５−１２６−Ｃ−Ａ（黒丸）、２０
ｍｇ／ｋｇのエンドスタチン（白丸）およびミニポンプ投与されたタムスタチン
−４５−１３２（１ｍｇ／ｋｇ、白三角）による処置の０日目、５日目、１０日
目、１５日目および２０日目（ｘ軸）におけるＶ／Ｖ_０（平均腫瘍容積／初期腫
瘍容積）に関する腫瘍容積比（ｙ軸）を示す線グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 35/00 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ １１１ １１１ Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ０７Ｋ 16/18 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０９／６２５，１９１ (32)優先日 平成12年７月21日(2000．7．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA02 CA05 HA17 4C084 AA02 AA07 AA17 BA01 BA08 BA18 BA20 BA21 BA22 BA23 DA45 MA01 NA14 ZA362 ZB212 ZB262 ZC412 4C085 AA13 AA14 CC32 EE01 GG01 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 EA28

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １つもしくはそれ以上の内皮細胞インテグリンまたは１つも
   しくはそれ以上の内皮細胞インテグリンサブユニットにより媒介される血管新生
   を組織において阻害することを含む障害の治療のための薬剤の調製における、ア
   レステン、カンスタチンもしくはタムスタチン、またはその断片、変異体、ホモ
   ログ、アナログもしくは対立遺伝子変異体の使用。
2. 【請求項２】 障害が腫瘍成長である、請求項１記載の使用。
3. 【請求項３】 １つもしくはそれ以上の内皮細胞インテグリンまたは１つも
   しくはそれ以上の内皮細胞インテグリンサブユニットにより媒介される内皮細胞
   アポトーシスを組織において促進または誘導することにより障害を治療するため
   の薬剤の調製における、アレステン、カンスタチンもしくはタムスタチン、また
   はその断片、変異体、ホモログ、アナログもしくは対立遺伝子変異体の使用。
4. 【請求項４】 血管新生が、内皮細胞増殖、内皮細胞移動、または内皮細胞
   管形成の１つまたはそれ以上を阻害することにより阻害される、請求項１または
   ２記載の使用。
5. 【請求項５】 １つまたはそれ以上のインテグリンが、α１β１、α２β１
   、α３β１およびαＶβ３からなる群より選択され、１つまたはそれ以上のイン
   テグリンサブユニットが、α１、α２、α３、αＶ、β１およびβ３からなる群
   より選択される、請求項１〜４いずれか記載の使用。
6. 【請求項６】 組織において血管新生または細胞増殖を阻害するための薬剤
   の調製における、 （ａ） インテグリンのα１サブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプ
   チド； （ｂ） インテグリンのα２サブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプ
   チド； （ｃ） インテグリンのα３サブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプ
   チド； （ｄ） インテグリンのα５サブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプ
   チド； （ｅ） インテグリンのα６サブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプ
   チド； （ｆ） インテグリンのαＶサブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプ
   チド； （ｇ） インテグリンのβ１サブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプ
   チド；または （ｈ） インテグリンのβ３サブユニットに特異的に結合する抗体もしくはペプ
   チド の使用。
7. 【請求項７】 該薬剤が、血管新生または細胞増殖を特徴とする状態を治療
   するためのものである、請求項６記載の使用。
8. 【請求項８】 組織において血管新生または細胞増殖を促進または誘導する
   ための薬剤の調製における、 （ａ） インテグリンのα１サブユニット； （ｂ） インテグリンのα２サブユニット； （ｃ） インテグリンのα３サブユニット； （ｄ） インテグリンのα５サブユニット； （ｅ） インテグリンのα６サブユニット； （ｆ） インテグリンのαＶサブユニット； （ｇ） インテグリンのβ１サブユニット；または （ｈ） インテグリンのβ３サブユニット の使用。
9. 【請求項９】 １つまたはそれ以上のインテグリンサブユニットが可溶性形
   態である、請求項８記載の使用。
10. 【請求項１０】 １つまたはそれ以上のインテグリンサブユニットが、単量
    体、二量体、三量体、四量体、多量体である、請求項８または９記載の使用。
11. 【請求項１１】 脊椎動物の増殖性疾患を治療するための薬剤の調製におけ
    る受容体媒介性血管新生のインヒビターの使用であって、該疾患がアレステン、
    カンスタチンまたはタムスタチンに対する受容体により媒介される血管新生を特
    徴とし、かつ阻害される該レセプターがアレステン受容体、カンスタチン受容体
    またはタムスタチン受容体である、受容体媒介性血管新生のインヒビターの使用
    。
12. 【請求項１２】 アレステン受容体が、α１β１、α２β１、α３β１およ
    びαｖβ３インテグリンからなる群より選択される、請求項１１記載の使用。
13. 【請求項１３】 カンスタチン受容体が、α１β１またはα２β１からなる
    群より選択される、請求項１１記載の使用。
14. 【請求項１４】 タムスタチン受容体が、α５β１、α６β１およびαＶβ
    ３インテグリンからなる群より選択される、請求項１１記載の使用。
15. 【請求項１５】 該薬物が、腫瘍成長の阻害のためのものである、請求項１
    １記載の使用。
16. 【請求項１６】 該薬剤が、確立した腫瘍の退行のためのものである、請求
    項１１記載の使用。
17. 【請求項１７】 アレステン受容体媒介性血管新生、カンスタチン受容体媒
    介性血管新生またはタムスタチン受容体媒介性血管新生を阻害する分子が、該薬
    物を調製するために使用される、請求項１１〜１６いずれか記載の使用。
18. 【請求項１８】 アレステン受容体、カンスタチン受容体またはタムスタチ
    ン受容体に特異的に結合する抗体、抗体断片またはペプチドが、該薬剤を調製す
    るために使用される、請求項１７記載の使用。
19. 【請求項１９】 該抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体
    である、請求項１８記載の使用。
20. 【請求項２０】 組織内での血管新生を促進するための薬剤の存在下におけ
    る、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンに結合する１つまたはそれ以
    上の可溶性受容体の使用。
21. 【請求項２１】 組織におけるＦＬＩＰレベルを減少させる分子と組織を接
    触させることを含む、請求項２０記載の使用。
22. 【請求項２２】 （ａ） αＶβ３インテグリンに結合する能力； （ｂ） 内皮細胞の増殖を阻害する能力；および （ｃ） 内皮細胞のアポトーシスを引き起こす能力 からなる群より選択される１つまたは両方の特徴を有する、α３（ＩＶ）ＮＣ１
    ドメインの非グッドパスチャー断片。
23. 【請求項２３】 （ａ） αＶβ３インテグリンに結合する能力； （ｂ） 内皮細胞に結合する能力； （ｃ） 腫瘍細胞の増殖を阻害する能力；および （ｄ） 内皮細胞の増殖を阻害する能力の欠陥 からなる群より選択される１つまたはそれ以上の特徴を有する、α３（ＩＶ）Ｎ
    Ｃ１ドメインの非グッドパスチャー断片。
24. 【請求項２４】 αＶβ３インテグリンに結合する能力がＲＧＤ非依存性で
    ある、請求項２２または２３記載の断片。
25. 【請求項２５】 腫瘍細胞の増殖を阻害する能力の欠陥をさらに含む、請求
    項２４記載の断片。
26. 【請求項２６】 血管新生が関与する障害を治療するための薬剤の調製にお
    ける請求項２２〜２５いずれか記載の断片の使用。
27. 【請求項２７】 腫瘍成長が関与する障害を治療するための薬剤の調製にお
    ける請求項２２〜２５いずれか記載の断片の使用。
28. 【請求項２８】 請求項２２〜２５いずれか記載の断片を含有してなる医薬
    組成物。
29. 【請求項２９】 配列番号：１０のアミノ酸残基５４〜アミノ酸１２４のア
    ミノ酸配列を有してなる、請求項２２または２３記載の断片。
30. 【請求項３０】 配列番号：１０のアミノ酸残基１８５〜アミノ酸２０３の
    アミノ酸配列を有してなる、請求項２４記載の断片。
31. 【請求項３１】 アミノ酸配列 を含んでなる、請求項２２または２３記載の断片。
32. 【請求項３２】 アミノ酸配列 を含んでなる、請求項２２または２３記載の断片。
33. 【請求項３３】 アミノ酸配列 ＬＱＲＦＴＴＭＰＦＬＦＣＮＶＮＤＶＣＮＦ（配列番号：２９） を含んでなる、請求項２２または２３記載の断片。
34. 【請求項３４】 医薬に使用するための請求項２９〜３３いずれか記載の断
    片。
35. 【請求項３５】 血管新生が関与する障害を治療するための薬剤の調製にお
    ける請求項２９〜３３いずれか記載の断片の使用。
36. 【請求項３６】 腫瘍成長が関与する障害を治療するための薬剤の調製にお
    ける請求項２９〜３３いずれか記載の断片の使用。
37. 【請求項３７】 請求項２９〜３３いずれか記載の断片を含有してなる医薬
    組成物。
38. 【請求項３８】 １つまたはそれ以上のシステイン残基がアルカリ還元され
    てなる、請求項２９〜３３いずれか記載の断片。
39. 【請求項３９】 １つまたはそれ以上のシステイン残基が、別のアミノ酸に
    変異されてなる、請求項２９〜３３いずれか記載の断片。
40. 【請求項４０】 １つまたはそれ以上のシステイン残基がアラニンに変異さ
    れてなる、請求項３９記載の断片。
41. 【請求項４１】 アミノ酸配列 を含んでなる、請求項２２または２３または４０いずれか記載の断片。