CN101528256B

CN101528256B - 抗-cd151抗体在治疗癌症中的用途

Info

Publication number: CN101528256B
Application number: CN2007800389060A
Authority: CN
Inventors: J-F·霍伊乌; L·高什
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2006-10-18
Filing date: 2007-10-15
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2027-10-15
Also published as: JP5757646B2; US8178096B2; WO2008049990A2; WO2008049990A3; MA30777B1; CA2665912C; CA2665912A1; IL198043A0; ES2361696T3; FR2907341A1; PL2079482T3; TN2009000144A1; JP5723420B2; BRPI0717455A2; CN101528256A; DE602007012743D1; RS51729B; HRP20110374T1; ATE499387T1; IL198043A

Abstract

本发明涉及能够与CD151蛋白结合并从而抑制肿瘤生长的至少一种抗体或其功能性片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。本发明还涉及用于治疗癌症的组合物，其包含能够与CD151蛋白结合和/或抑制原发性肿瘤的发展和/或抑制该蛋白的转移促进活性的至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段作为活性成分，所述抗体可以由抗体TS151和/或TS151r组成。

Description

抗-CD151抗体在治疗癌症中的用途

本发明涉及能够抑制肿瘤生长的抗-CD151抗体的新用途，所述抗体尤其是鼠类来源的单克隆的、嵌合的和人源化的。根据一个具体方面，本发明涉及这些抗体或其功能性片段作为用于癌症的预防性和/或治疗性治疗的药物的用途。最后，本发明包括包含与例如抗癌性抗体和/或试剂相联合或者与毒素相缀合的此类抗体的产品和/或组合物，以及其在预防和/或治疗某些癌症中的用途。

CD151，也称为PETA-3或SFA-1，是属于四跨膜蛋白(tétraspanine)家族的膜蛋白(Boucheix和Rubinstein，2001，CellMol.Life Sci.58，1189-1205；Hemler，2001，J.Cell Biol.155，1103-1107)。在人中，CD151具有253个氨基酸并且包括4个膜片段和2个细胞外结构域EC1(18个氨基酸，序列[40-57])和EC2(109个氨基酸，序列[113-221])，它们也称为细胞外环。然而，应当指出，在核苷酸序列水平上，迄今已鉴定了CD151的2个变体，即在位置395和409处分别具有核苷酸A和C的一个变体(SEQ ID No.1)[Fitter等人，1995，Blood 86(4)，1348-1355]，和在相同位置处具有核苷酸G和T而不是核苷酸A和C的另一个变体[Hasegawa等人，1996，J.Virol.70(5)，3258-3263]。因此，可以在肽序列水平上观察到突变，即分别在位置132和137处的残基K(Lys)和P(Pro)突变成残基R(Arg)和S(Ser)[Fitter等人，1995，Blood 86(4)，1348-1355/Hasegawa等人，1996，J.Virol.70(5)，3258-3263]。

CD151在许多癌症中过表达，例如肺癌[Tokuhara等人，2001，Clin.Cancer Res.7，4109-4114]、结肠癌[Hashida等人，2003，Br.J.Cancer 89，158-167]、前列腺癌[Ang等人，2004，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.13，1717-1721]或胰腺癌[Gesierich等人，2005，Clin.Cancer Res.11，2840-2852]。

使用不表达CD151的敲除小鼠以及抗-CD151抗体和siRNA以便在体外阻断不同细胞类型中CD151的功能性和表达已使得能够显示，CD151牵涉与癌症相关的许多现象，例如细胞粘着(Nishiuchi等人，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，1939-1944；Winterwood等人，2006，Mol.Biol.Cel 17，2707-2721)、细胞运动性(Kohno等人，2002，Int.J.Cancer 97，336-343)、细胞迁移(Yauch等人，1998，Mol.Biol.Cell 9，2751-2765；Testa等人，1999，CancerRes.59，3812-3820；Penas等人，2000，J.Invest.Dermatol.114，1126-1135；Klosek等人，2005，Biochem.Biophys.Res.Commun.336，408-416)、细胞侵入(invasion cellulaire)(Kohno等人，2002，Int.J.Cancer 97，336-343；Shiomi等人，2005，Lab.Invest.85，1489-1506；Hong等人，2006，J.Biol.Chem.281，24279-24292)和血管发生(Yanez-Mo等人，1998，J.Cell Biol.141，791-804；Sincock等人，1999，J.Cell Sci.112，833-844；Takeda等人，2006，Blood)。

四跨膜蛋白的显著性质之一是它们相互之间以及与大量其他表面分子相结合从而形成结构化的大分子复合物的能力。在这些复合物内，每个四跨膜蛋白与一个或多个表面分子特异地结合，从而形成由四跨膜蛋白和伙伴分子(molécule partenaire)组成的初级复合物。四跨膜蛋白能够组构出质膜的特定微域(microdomaine)，在所述微域中它们募集它们的可以被功能性地偶联的伙伴分子。涉及四跨膜蛋白的相互作用全体被称为“四跨膜蛋白网络”或“四跨膜蛋白网”。

CD151在细胞表面上与各种不同的膜蛋白相互作用。尤其是，已鉴定出了与作为层粘连蛋白受体的整联蛋白一起，更具体而言与整联蛋白α3β1或α6β4一起的对于某些去污剂的作用具有抗性的、非常稳定的复合物，所述α3β1或α6β4的优选配体是层粘连蛋白5(Yauch等人，1998，Mol.Biol.Cell 9，2751-2765；Lammerding等人，2003，Proc.Natl.Acad.Sci USA 100，7616-7621)。这种结合涉及CD151和整联蛋白的细胞外结构域。位于EC2环中的CD151的序列QRD[194-196]在这种结合中是非常重要的，因为这个位点的突变引起与某些整联蛋白的相互作用的丧失(Kazarov等人，2002，J.Cell Biol.158，1299-1309)。此外，已在肿瘤细胞中鉴定出了CD151/整联蛋白α6β4/c-Met(HGF的受体)这一功能性三元复合物(Klosek等人，2005，Biochem.Biophys.Res.Commun.336，408-416)。通过用干扰RNA处理细胞而引起的CD151表达的抑制导致抑制了由HGF诱导的细胞生长和迁移。

在同一细胞内，对于四跨膜蛋白网络形成而言所需的CD151与其他四跨膜蛋白的相互作用依赖于CD151的膜和细胞质区域，因为已显示EC2环的缺失不破坏CD151与其他四跨膜蛋白的结合(Berditchevski，2001，J.Cell Sci.114，4143-4151)。

CD151能够通过调节各种信号传导途径而调控细胞粘着、迁移和侵入这些现象，所述信号传导途径例如为经由与PI4-激酶结合来进行的磷酸肌醇途径(Yauch等人，1998，Mol.Biol.Cell 9，2751-2765)，经由FAK、Src、p38-MAPK和JNK的磷酸化来进行的c-Jun信号传导途径(Hong等人，2006)，由PKC对整联蛋白的磷酸化(Zhang等人，2001，J.Biol.Chem.276，25005-25013)，Rho家族的GTP酶的活化(Shigeta等人，2003，J.Cell Biol.163，165-176)。

细胞之间的嗜同型相互作用也负责细胞运动性和金属蛋白酶MMP-9表达的增加(Hong等人，2006)。这些细胞间CD151-CD151相互作用通过FAK、Src、p38-MAPK和JNK的磷酸化而造成c-Jun的活化。

尽管CD151蛋白具有这样的重要性，但迄今为止只产生了一种用于治疗目的的抗体，即单克隆抗体50-6。

通过用人表皮样癌HEp-3细胞进行消减式免疫接种(immunisation soustractive)而在小鼠中产生了针对CD151的单克隆抗体50-6(IgG1同种型)(Testa等人，1999，Cancer Res.59，3812-3820)。

抗体50-6能够在体外抑制经转染从而过表达CD151的人宫颈癌HeLa细胞以及HEp-3细胞的迁移，以及在尿囊绒膜新血管形成模型中抑制由bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)诱导的血管发生。它在两个鸡胚胎模型中在体内抑制通过接种HEp-3细胞而诱导的转移(Testa等人，1999，Cancer Res.59，3812-3820)。在这些模型中，通过测量肺提取物中蛋白质huPA(人尿激酶型纤溶酶原激活物)的活性来测定抗体50-6的抑制活性。根据这些作者所述，这种测定法反映了人细胞在肺中的存在。在测定后，据估计，与对照抗体相比较而言由抗体50-6引起的转移(HEp-3细胞散布到鸡胚胎的肺中)减少，在所谓的“自发转移”模型(其中在接种细胞后注射抗体)中是74％，和在所谓的“实验转移”模型(其中细胞和抗体一起接种)中是57％。根据这些作者所述，在体内观察到的抗体50-6的抗肿瘤性质看起来与细胞生长抑制或细胞毒性效应无关，因为其没有显示出对于HEp-3细胞的体外增殖的影响。

产生抗体50-6的杂交瘤可以以参考号CRL-2696于ATCC处获得(最初以参考号50-6[PTA-227]进行保藏的杂交瘤)。

根据总的方面，本发明涉及能够与CD151蛋白结合并从而抑制肿瘤生长的至少一种抗体或其功能性片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

几项实验研究已显示，四跨膜蛋白通过充当转移的抑制剂或促进剂而在转移形成中具有主要作用。因此，四跨膜蛋白例如CD9、CD63或CD82的转染减少癌症系的转移潜能。相反地，四跨膜蛋白CD151和Co-029的表达看起来似乎产生相反的作用。因此，这2种四跨膜蛋白是转移的促进剂。这些结果与各种临床研究相一致，所述临床研究已在多种癌症(乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、黑素瘤……)中证明，当存在转移时CD9和CD82在原发性肿瘤中较少表达，并且它们的表达降低预示着低的存活率。在肺癌中，CD9和CD82的表达的组合减少已与相比于当这两种抗原中仅一种的表达减少时而言更大的转移潜能相关联。

几项回顾性研究已显示，CD151的过表达与某些癌症(例如肺癌、结肠癌和前列腺癌)的攻击力相关，并且可以被认为是造成预后不良的因素(Tokuhara等人，2001，Clin.Cancer Res.7，4109-4114；Hashida等人，2003，Br.J.Cancer 89，158-167；Ang等人，2004，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.13，1717-1721)。在这些情况下，与具有不表达CD151的肿瘤的患者相比较，平均存活在具有表达CD151的肿瘤的患者中事实上是减少的。

由相应基因的转染而诱导的CD151在各种人肿瘤系(HeLa、RPMI14788、A172、HT1080)中的过表达引起经转染的细胞的运动性、迁移和侵入的增加(Testa等人，1999，Cancer Res.59，3812-3820；Kohno等人，2002，Int.J.Cancer 97，336-343)。这些现象在抗-CD151抗体存在下得到抑制。

根据另一个方面，根据本发明的抗体的功能性片段例如由下列组成：Fv、scFv(sc表示单链)、Fab、F(ab′)₂、Fab′或scFv-Fc片段或双抗体，或者其半衰期已通过化学修饰或通过掺入脂质体、微球体或PLGA中而得到延长的任何片段，所述化学修饰例如为添加聚(亚烷基)二醇例如聚乙二醇(“PEG化”)(PEG化的片段被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab′)₂-PEG或Fab′-PEG)(“PEG”来自聚乙二醇的英文名称)，所述片段一般能够发挥其所源自的抗体的活性，甚至部分活性。

优选地，所述功能性片段将由其所衍生自的抗体的可变重链或轻链的部分序列组成，或包含其所衍生自的抗体的可变重链或轻链的部分序列，所述部分序列足以保留与其所源自的抗体相同的结合特异性，和足够的亲和力，所述亲和力优选至少等于其所源自的抗体的亲和力的1/100，更优选至少1/10。

此种功能性片段将包含其所源自的抗体的序列的至少5个连续氨基酸，优选10、15、25、50和100个连续氨基酸。

优选地，这些功能性片段将是Fv、scFv、Fab、F(ab′)₂、F(ab′)、scFv-Fc类型的片段或双抗体，它们一般具有与其所源自的抗体相同的结合特异性。根据本发明，本发明的抗体片段可以通过诸如下列的方法从前面所述的抗体获得：使用酶例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶进行消化，和/或借助于化学还原来切割二硫桥。另外，本发明中所包括的抗体片段还可以通过本领域技术人员同样也众所周知的遗传重组技术，或者通过借助于例如自动肽合成仪(例如由公司Applied公司提供的那些)进行肽合成来获得。

根据本发明的一个方面，所使用的抗体由鼠类单克隆抗体组成。

根据本发明的抗体还包括嵌合或人源化抗体。

嵌合抗体是指这样的抗体，其包含衍生自给定物种的抗体的天然(轻链和重链)可变区以及对于所述给定物种而言异源的物种的抗体轻链和重链恒定区。

依照本发明使用的嵌合类型的抗体或其片段可以使用遗传重组技术来制备。例如，嵌合抗体可以通过克隆重组DNA来产生，所述重组DNA包含启动子，和编码根据本发明的非人(尤其是鼠类)单克隆抗体的可变区的序列，和编码人抗体的恒定区的序列。由此类重组基因编码的本发明的嵌合抗体将会例如是小鼠-人嵌合体，这种抗体的特异性由源自鼠类DNA的可变区决定，和它的同种型由源自人DNA的恒定区决定。关于制备嵌合抗体的方法，可以例如参考Verhoeyn等人(BioEssays，8：74，1988)这篇文献。

人源化抗体是指这样的抗体，其包含衍生自非人来源的抗体的CDR区，而抗体分子的其他部分衍生自一种(或多种)人抗体。此外，构架区段(称为FR)的某些残基可以进行修饰以保留结合亲和力(Jones等人，Nature，321：522-525，1986；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536，1988；Riechmann等人，Nature，332：323-327，1988)。

人源化抗体或其功能性片段可以通过本领域技术人员已知的技术来制备(例如，在Singer等人，J.Immun.150：2844-2857，1992；Mountain等人，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，10：1-142，1992；或Bebbington等人，Bio/Technology，10：169-175，1992这些文献中所描述的那些)。此类人源化抗体对于其在体内预防性和/或治疗性治疗方法中使用来说是优选的。其他人源化技术也是本领域技术人员已知的，例如由PDL所描述的“CDR嫁接”技术，其是专利EP 0451261、EP 0682040、EP 0939127、EP 0566647或者US 5,530,101、US6,180,370、US 5,585,089和US 5,693,761的主题。还可以提及专利US 5,639,641或6,054,297、5,886,152和5,877,293。

令人惊讶地并且与本领域技术人员的任何预期相反，本发明首次描述了如上所述的抗-CD151抗体或其功能性片段的用途，所述抗-CD151抗体或其功能性片段能够抑制肿瘤细胞的增殖和原发性肿瘤的发展，而并不依赖于其抑制血管发生和/或转移形成的能力。

因此，本申请中所描述的抗体具有在非常早的阶段时抑制肿瘤发展的能力。

本发明所涉及的抗体的这种抗肿瘤活性构成了针对CD151的抗体的新型且出乎预料的性质，因为没有一种迄今所描述的抗-CD151抗体具有这种类型的活性。因此，与先前所描述的抗体相比较，尤其是与抗体50-6相比较，本发明所涉及的抗体具有不同的和额外的性质，因为这种抗体的抗肿瘤性质并不与对于肿瘤细胞增殖的影响相关。

这个结果还构成了CD151和原发性肿瘤的发展(甚至体内肿瘤细胞增殖)之间的联系的首次证实。这是因为，迄今仅描述了CD151的促转移和促血管生成活性。

器官或组织的细胞的不受节制的增殖构成了癌症的第一阶段之一。肿瘤细胞是在所涉及的器官或组织内不再能够受制于细胞生长的正常控制的细胞。肿瘤生长是指数性的，并且肿瘤细胞在生长因子和血管生成因子的作用下以过量方式扩增。

根据一个主要方面，本发明涉及能够抑制原发性肿瘤的发展和肿瘤细胞的增殖的至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段的用途。

更具体而言，本发明涉及能够与CD151蛋白结合的至少一种抗体或其功能性片段在制备用于治疗原发性肿瘤的药物中的用途。

此外，不希望被任何理论所束缚，本申请人提出，抗-CD151抗体在癌症治疗领域中的用途是有价值的，这不仅是由于抑制了血管生成，而且还由于抑制了CD151的转移促进活性。

因此，本发明描述了如上所述的抗体或其功能性片段的用途，所述抗体或其功能性片段能够抑制所述CD151蛋白在肿瘤细胞内的转移促进活性。

更具体而言，本申请人认为，这种抑制表现为抑制了转移过程中的各个阶段，尤其是细胞粘着、细胞迁移和/或细胞侵入。

所述促进活性和更具体而言肿瘤散布和转移过程的典型步骤如下：

1/原发性肿瘤的细胞侵入支持组织，这需要通过蛋白水解酶(例如金属蛋白酶)来降解由结构蛋白例如层粘连蛋白、胶原或纤连蛋白组成的基底膜和细胞外基质，

2/肿瘤细胞经过所述组织进行迁移并进入血液循环中，

3/粘着在血管壁上，并且在器官中停下来，

4/离开血管(新的侵入步骤)，并适应新的环境(增殖和血管发生)。

细胞迁移在胚胎发育过程中是必需的。尽管细胞的迁移在成人中较不重要，但是在成人中某些细胞类型例如淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞在免疫应答、炎症和伤口愈合过程中将持续地移动，以便维持体内稳态。然而，在病理学水平上，肿瘤细胞的迁移在相当程度上促成肿瘤进展至转移阶段。一定数目的趋化因子负责该迁移，所述因子来源于肿瘤细胞或宿主。在这些因子中，可提及生长因子(特别是刺激血管生成的那些)、胶原降解肽、粘着蛋白例如层粘连蛋白和纤连蛋白。

根据一个特别的方面，本发明涉及能够抑制肿瘤细胞的细胞迁移的至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段的用途。

侵入是肿瘤的恶性的首要征兆：所述肿瘤离开其最初的部位而扩展到邻近和远处的组织中。这种侵入性特征表明了细胞的常规性质的丧失：通常，借助于粘着分子，大多数组织的细胞通过称为桥粒的结构而彼此粘着；在上皮中，它们还粘着至限制了上皮深度的基底膜。肿瘤细胞丧失了这些正常性质而获得新的性质。它们之间的联系减弱，并且所述细胞彼此不受束缚。它们获得了这样的运动性，所述运动性允许它们脱离原发病灶并且渗入(入侵)邻近组织，有时顺着结缔组织纤维来行进。对于通常以基底膜为边界的上皮和对于源自上皮的癌，这种膜是待跨越的第一个障碍。它通过由肿瘤细胞所分泌的酶(蛋白酶、组织蛋白酶)而被改变和溶解。基底膜的这种破坏有时通过通常由白细胞分泌并偏离其常规活性的酶而被加强。细胞行为的所有这些生物学和分子修饰是侵入的条件。

根据另一个方面，本发明涉及能够抑制肿瘤细胞的细胞侵入的至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段的用途。

生物体的细胞彼此粘着，并且还粘着至围绕它们的细胞外基质。细胞粘着是一种普遍存在的机制，所述机制牵涉大多数的生理学细胞现象例如细胞的存活、增殖或分化，以及牵涉各种病理学情况例如癌症和转移现象。各种不同的细胞表面蛋白质参与了细胞粘着，例如钙粘着蛋白或整联蛋白。

优选地，根据本发明的用途主要基于细胞粘着的抑制。

根据另外一个方面，本发明涉及能够抑制肿瘤细胞的细胞粘着的至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段的用途。

如上文已提及的，CD151蛋白是四跨膜蛋白家族的成员，并且由此而包含2个细胞外结构域EC1(18个氨基酸，序列[40-57])和EC2(109个氨基酸，序列[113-221])，它们也称为细胞外环。

根据本发明，所使用的抗体能够与位于细胞外结构域中的至少一个表位结合。优选地，所述抗体将在EC1和/或EC2环的范围内结合。

更具体而言，根据本发明的一个优选实施方案，描述了至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段的用途，所述至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段能够与包含在细胞外环1(EC1)和/或细胞外环2(EC2)中，优选包含在EC2中的表位结合，所述EC1和EC 2分别相应于CD151蛋白的氨基酸40-57(SEQ ID No.6)和氨基酸113-221(SEQ ID No.4)。

EC1环[40-57]包含18个氨基酸并且具有2002.2Da的理论质量。

EC2环[113-221]具有1个N-糖基化位点(残基Asn159)和6个形成3个二硫桥的半胱氨酸残基。基于四跨膜蛋白CD81的EC2环的三维结构，已提出了四跨膜蛋白尤其是CD151的EC2环的结构模型(Seigneuret等人，2001，J.Biol.Chem.276，40055-40064)。根据该模型，四跨膜蛋白具有由3个α螺旋和1个特异的可变结构域组成的、相对保守的共同支架。对于CD151，这个支架由区域[113-157]和[209-221]组成，并且所述可变结构域由区域[158-208]组成。

更特别地，EC2环的可变结构域参与了CD151与整联蛋白家族的蛋白质的特异相互作用。定向突变实验尤其已表明了区域[193-208]更精确地而言是三肽QRD[194-196]，和在位置192处的半胱氨酸残基，在CD151与某些作为层粘连蛋白受体的整联蛋白例如整联蛋白α3β1或α6β4结合中的重要性(Kazarov等人，2002，J.Cell Biol.158，1299-1309)。

更加优选地，本发明涉及至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段的用途，所述至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段能够与至少包含分别在CD151蛋白的位置194、195和196处的谷氨酰胺、精氨酸和天冬氨酸这些氨基酸(QRD^194-196)的EC2区域的表位结合。

根据另一个方面，必须理解，本发明主要由至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段的用途组成，所述至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段由单克隆抗体组成。

“单克隆抗体”应理解为这样的抗体，其源自基本上同质的(homogène)抗体的群体。更特别地，群体的各个抗体是相同的，除了可能天然产生并且可能以极低比例存在的少数可能的突变之外。换言之，单克隆抗体由同质抗体组成，所述同质抗体是由于单个细胞克隆(例如，杂交瘤、用编码同质抗体的DNA分子转染的真核宿主细胞、用编码同质抗体的DNA分子转染的原核宿主细胞，等等)的增殖而产生的，并且通常地其特征在于同一种类别和亚类的重链以及单一类型的轻链。单克隆抗体是高度特异的并且针对单种抗原。此外，与通常包含针对不同决定簇或表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原的单个表位。

根据本发明的一个具体实施方案，所使用的单克隆抗体选自抗体TS151和TS151r。在本说明书的下文中，TS151r和TS151R这两种表述可互换。

因此，本发明描述了至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段的用途，所述抗体由抗体TS151和/或抗体TS151r组成。

更具体而言，将抗体TS151定义为，它至少包含：

-分别为序列SEQ ID No.7、8和9的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3这三个重链CDR；和

-分别为序列SEQ ID No.11、12和13的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3这三个轻链CDR。

根据另一个实施方案，抗体TS151的特征在于，它包含含有序列SEQ ID No.10的重链和含有序列SEQ ID No.14的轻链。

下面的表1概括了这些要素。

表1

关于抗体TS151r，将其定义为，它至少包含：

-分别为序列SEQ ID No.15、16和17的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3这三个重链CDR；和

-分别为序列SEQ ID No.19、20和21的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3这三个轻链CDR。

根据另一个实施方案，抗体TS151r的特征在于，它包含含有序列SEQ ID No.18的重链和含有序列SEQ ID No.22的轻链。

下面的表2概括了这些要素。

表2

根据另一个实施方案，下面的表3概括了抗体TS151和TS151r的核苷酸序列。

表3

在实施例1中详细描述了所述抗体的产生。这2种抗体针对不同的表位，因为TS151识别CD151，无论CD151与整联蛋白结合还是游离在细胞的表面上(Chometon等人，2006，Exp.Cell Res.312，983-995)，而TS151r不识别CD151-整联蛋白复合物(Serru等人，1999，Biochem.J.340，103-111；Geary等人，2001，Tissue Antigens58，141-153；Kazarov等人，2002，J.Cell Biol.158，1299-1309；Sterk等人，2002，J.Cell Sci.115，1161-1173)。被TS151r所识别的表位位于EC2环中并且包含残基Q194、R195和D196(Kazarov等人，2002，J.Cell Biol.158，1299-1309)。因此，这种抗体至少部分地针对参与了与整联蛋白的相互作用的在CD151上的该位点。残基C192本身还可能参与了TS151r对于CD151的识别(Kazarov等人，2002，J.Cell Biol.158，1299-1309)。抗体TS151的表位尽管与TS151r不同，但仍未得到精确测定。

用抗体TS151r处理人角质形成细胞(上皮系HaCaT)造成细胞间接触的丧失、细胞骨架的重组、整联蛋白α6β4的细胞内再分布、和在层粘连蛋白1上的细胞迁移的增加(Chometon等人，2006，Exp.CellRes.312，983-995)。

更特别地，优选的所使用的抗体由抗体TS151组成。

优选地，抗-CD151抗体在癌症治疗领域中的用途十分特别地在过表达该相同的受体CD151的癌症中得到了证实。

此类癌症由结肠癌[Hashida等人，Br.J.Cancer 89(2003)：158-167]；肺癌，优选非小细胞肺癌[Tokuhara等人，Clin.Cancer Res.7(2001)：4109-4114]；前列腺癌[Ang等人，Cancer Epidemiol.Biomarkers 13(2004)：17]；和胰腺癌[Gesierich等人，Clin.CancerRes.11(2005)：2840-2852]组成。

因此，本发明要求保护如上所描述的抗体在治疗癌症中的用途，所述癌症优选由结肠癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌组成。

本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含由抗体或者其衍生化合物或功能性片段组成的化合物作为活性成分，优选地向其添加药学上可接受的赋形剂和/或载体。

更特别地，本发明涉及根据本发明的抗体在制备另外还包含至少一种药学上可接受的载体的药物组合物中的用途。

在本发明中，药学上可接受的载体是指掺入药物组合物中的化合物或化合物的组合，其不引起继发反应，并且例如使得能够有助于活性化合物的施用，增加活性化合物在生物体中的寿命和/或功效，增加活性化合物在溶液中的溶解度，或者改善活性化合物的保存。这些药学上可接受的载体是众所周知的，并且将由本领域技术人员根据所选择的活性化合物的性质和施用方式来进行调整。

优选地，这些化合物将通过全身途径，特别是通过静脉内途径，通过肌内、皮内、腹膜内或皮下途径，或者通过口服途径来进行施用。更优选地，包含根据本发明的抗体的组合物将以在时间上错开的方式多次重复地进行施用。

它们的最佳施用方式、施用剂量和盖伦氏形式可以根据在建立适合于患者的治疗中一般予以考虑的标准来确定，例如患者的年龄或体重、患者的一般状况的严重性、对于治疗的耐受性和经证实的继发效应。

根据本发明，描述了用于治疗癌症的组合物，其特征在于，所述组合物包含能够与CD151蛋白结合的至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段作为活性成分。

根据本发明，描述了用于治疗癌症的组合物，其特征在于，所述组合物包含能够与CD151蛋白结合和/或抑制CD151蛋白的转移促进活性的至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段作为活性成分。

根据本发明，还描述了用于治疗癌症的组合物，其特征在于，所述组合物包含能够抑制原发性肿瘤的发展的至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段作为活性成分。

根据本发明的另一个方面，描述了包含至少一种抗-CD151抗体或其功能性片段的组合物，所述至少一种抗体是选自抗体TS151或TS151r的单克隆抗体。

根据本发明的另外一个方面，要求保护包含抗体TS151和TS151r或其功能性片段的组合的组合物。

文献显示，CD151蛋白在癌症中，十分特别地在结肠癌[Hashida等人，Br.J.Cancer 89(2003)：158-167]、非小细胞肺癌[Tokuhara等人，Clin.Cancer Res.7(2001)：4109-4114]、前列腺癌[Ang等人，Cancer Epidemiol.Biomarkers 13(2004)：1717-1721]和胰腺癌[Gesierich等人，Clin.Cancer Res.11(2005)：2840-2852]中过表达。

当然，上面的列表仅为了举例说明而给出，并且任何癌症必须被理解为过表达CD151蛋白并因而能够按照本发明进行治疗。

本发明的另一个补充的实施方案由如上所描述的组合物组成，所述组合物另外还包含细胞毒剂/细胞生长抑制剂，和/或单克隆抗体，以作为用于同时、分开或在时间上错开使用的联合产品(produit decombinaison)。

因此，本发明还涉及如上所描述的组合物，其特征在于，所述组合物另外还包含至少一种细胞毒剂/细胞生长抑制剂，和/或细胞毒素，和/或放射性元素，和/或单克隆抗体，以作为用于同时、分开或在时间上错开使用的联合产品。

“同时使用”是指施用包含在同一个药物形式中的根据本发明的组合物的2种化合物。

“分开使用”是指在同一时刻施用包含在不同药物形式中的根据本发明的组合物的2种化合物。

“在时间上错开使用”是指顺次施用各自包含在不同药物形式中的根据本发明的组合物的2种化合物。

一般地，根据本发明的组合物显著增加癌症治疗的功效。换言之，根据本发明的抗体的疗效通过施用细胞毒剂而出乎意料地得到加强。由根据本发明的组合物产生的另一个主要的后续优点涉及有可能使用更低有效剂量的活性成分，这使得能够避免或减少出现继发效应的风险，特别是细胞毒剂的效应。此外，根据本发明的这种组合物使得能够更快速地达到预期的疗效。

“抗癌治疗剂”或“细胞毒剂”是指当施用给患者时治疗或预防患者中的癌症发展的物质。作为此类试剂的非限制性例子，可以提及“烷化”剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素药、抗雄激素药或免疫调节剂。

此类试剂例如在VIDAL中，在用于与癌学和血液学相联系的化合物的那一页上，在“细胞毒剂”这一栏中提及；在本文中提及通过参考该文献而提及的这些细胞毒性化合物作为优选的细胞毒剂。

“烷化剂”是指能够与细胞内的任何分子(优选核酸(例如DNA))共价偶联或者使细胞内的任何分子(优选核酸(例如DNA))烷化的任何物质。作为此类烷化剂的例子，可以提及氮芥类，例如氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、盐酸盐、哌泊溴烷、泼尼莫司汀、磷酸二钠或雌莫司汀；氧杂氮杂膦杂苯(oxazaphosphorines)，例如环磷酰胺、六甲蜜胺、曲磷胺、sulfofosfamide或异环磷酰胺；氮丙啶类或吖丙啶类，例如塞替派、三亚乙基胺或altétramine；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、链佐星、福莫司汀或洛莫司汀；烷基磺酸酯类，例如白消安、曲奥舒凡或英丙舒凡；三氮烯类，例如达卡巴嗪；或者铂络合物，例如顺铂、奥沙利铂或卡铂。

“抗代谢物”是指通过干扰某些活性(一般是DNA的合成)来阻断细胞生长和/或细胞代谢的物质。作为抗代谢物的例子，可以提及氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、5-氟脱氧尿苷、卡培他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-硫代鸟嘌呤(6-TG)、氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷、吉西他滨、克拉屈滨、脱氧考福霉素和喷司他丁。

“抗肿瘤抗生素”是指可以预防或抑制DNA、RNA和/或蛋白质合成的化合物。此类抗肿瘤抗生素的例子包括多柔比星、柔红霉素、伊达比星、戊柔比星、米托蒽醌、更生霉素、光神霉素、普卡霉素、丝裂霉素C、博来霉素和丙卡巴肼。

“有丝分裂抑制剂”阻止细胞周期和有丝分裂的正常进展。一般地，微管抑制剂或“紫杉烷类化合物”例如紫杉醇和多西他赛能够抑制有丝分裂。长春花生物碱例如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨也能够抑制有丝分裂。

“染色质功能抑制剂”或“拓扑异构酶抑制剂”是指这样的物质，其抑制塑造染色质的蛋白质(例如，拓扑异构酶I和II)的正常功能。此类抑制剂的例子，对于拓扑异构酶I而言包括喜树碱及其衍生物例如伊立替康或托泊替康，和对于拓扑异构酶II而言包括依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷。

“抗血管生成剂”是指抑制血管的生长的任何药物、化合物、物质或试剂。抗血管生成剂的例子包括但不限于，雷佐生、马立马司他、巴马司他、普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、CGS-27023A、卤夫酮、COL-3、新伐司他、BMS-275291、沙立度胺、CDC 501、DMXAA、L-651582、角鲨胺、内皮抑素、SU5416、SU6668、干扰素-α、EMD121974、白介素-12、IM862、血管抑素和vitaxine。

“抗雌激素药”或“抗雌激素剂”是指降低、拮抗或抑制雌激素的作用的任何物质。此类试剂的例子是他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxyfène、阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。

“抗雄激素药”或“抗雄激素剂”是指降低、拮抗或抑制雄激素的作用的任何物质。抗雄激素药的例子是氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、螺内酯、醋酸环丙孕酮、非那雄胺和西咪替丁。

免疫调节剂是刺激免疫系统的物质。此类免疫调节剂的例子包括干扰素；白介素，例如阿地白介素、OCT-43、地尼白介素-毒素连接物或白介素-2；肿瘤坏死因子，例如他索纳明；或其他类型的免疫调节剂，例如香菇多糖、西佐喃、罗喹美克、匹多莫德、培加酶、胸腺喷丁、聚肌胞或左旋咪唑(与5-氟尿嘧啶相组合)。

关于进一步的细节，本领域技术人员将可以参考由Association

des Enseignants de Chimie Thérapeutique出版的名称为“Traitéde chimie thérapeutique，Vol.6，Médicamentsantitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers，édition TEC & DOC，2003”的手册。

优选的单克隆抗体选自分离的能够特异性地抑制受体IGF-IR、EGFR、HER2/neu、cMET、VEGFR、VEGF等的酪氨酸激酶活性的抗体(或本领域技术人员已知的任何其他抗肿瘤抗体)，或者其功能性片段或衍生化合物，它们能够抑制由所述受体促进的增殖活性和/或抗凋亡活性和/或血管生成活性和/或诱导转移性散布的活性。

在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的作为联合产品的所述组合物的特征在于，将所述细胞毒剂化学偶联至所述抗体以用于同时使用。

在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的所述组合物的特征在于，所述细胞毒剂/细胞生长抑制剂选自纺锤体的抑制剂或稳定剂，优选长春瑞滨和/或长春氟宁和/或长春新碱。

为了促进所述细胞毒剂和根据本发明的所述抗体之间的偶联，尤其可以在待偶联的所述两种化合物之间引入间隔分子，例如聚(亚烷基)二醇例如聚乙二醇或氨基酸，或者在另一个实施方案中，使用所述细胞毒剂的活性衍生物，其中已引入了能够与根据本发明的所述抗体反应的官能团。这些偶联技术是本领域技术人员众所周知的，因而在本说明书中不再详细描述。

在另一个方面，本发明涉及组合物，其特征在于，将至少一种所述抗体或者其衍生化合物或功能性片段与细胞毒素和/或放射性元素相缀合。

优选地，所述毒素或所述放射性元素能够阻止肿瘤细胞的生长或增殖，尤其是使所述肿瘤细胞完全失活。

更优选地，所述毒素为肠细菌毒素，尤其是假单胞菌外毒素A。

优选地与在疗法中所使用的抗体相缀合的放射性元素(或放射性同位素)是发射γ射线的放射性同位素，优选碘¹³¹、钇⁹⁰、金¹⁹⁹、钯¹⁰⁰、铜⁶⁷、铋²¹⁷和锑²¹¹。发射β和α射线的放射性同位素也可以在疗法中使用。

与根据本发明的至少一种抗体或其功能性片段相缀合的毒素或放射性元素是指使得所述毒素或所述放射性元素能够连接至所述至少一种抗体的任何手段，尤其是通过所述两种化合物之间的共价偶联，其中引入或不引入连接分子。

在允许该缀合物的所有或部分组分的化学(共价)连接、静电连接或非共价连接的试剂中，十分特别地可以提及苯醌，碳二亚胺，更特别地EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳二亚胺盐酸盐)，二马来酰亚胺，联硫基二-硝基苯甲酸(DTNB)，S-乙酰基硫代乙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SATA)，呈现出一个或多个基团、具有一个或多个叠氮基苯基团且与紫外线(U.V.)反应的称为“桥接”试剂的试剂，十分优选地N-[-4-(叠氮基水杨基氨基)丁基]-3′-(2′-吡啶基联硫基)丙酰胺(APDP)、3-(2-吡啶基联硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SPDP)和6-肼基-烟酰胺(HYNIC)。

非常特别地对于放射性元素而言，另一种偶联形式可以由双官能的离子螯合剂的使用组成。

在这些螯合剂中，可以提及源自EDTA(乙二胺四乙酸)或DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)的螯合物，其已被开发用于结合金属(特别是放射性金属)和免疫球蛋白。因此，DTPA及其衍生物可以在碳链上用不同基团进行取代，以便增加配体-金属络合物的稳定性和刚性(Krejcarek等人(1977)；Brechbiel等人(1991)；Gansow(1991)；美国专利4831175)。

例如，已经在医学和生物学中以其游离形式或以与金属离子的络合物形式非常广泛地长期使用的DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)及其衍生物，具有这样的显著特征，即与金属离子形成稳定的螯合物以及与治疗性或诊断性目的蛋白例如抗体相偶联，以用于形成癌症疗法中的放射免疫缀合物(Meases等人(1984)；Gansow等人(1990))。

另外，本发明还包括根据本发明的组合物在制备药物中的用途。

因此，本发明更特别地涉及如上所描述的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在可以被预防和/或治疗的癌症中，优选结肠癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌。

此外，根据一个特别创新且有利的方面，本发明涉及如上所描述的组合物在制备用于治疗原发性肿瘤的药物中的用途。

本发明还涉及根据本发明的抗体在制备用于将生物学活性化合物特异性地靶向至表达或过表达受体CD151的细胞的药物中的用途。

在本文中，生物学活性化合物是指能够调节(尤其是抑制)细胞活性，特别是细胞生长、细胞增殖、基因的转录或翻译的任何化合物。

本发明的其他特征和优点将会与实施例和附图一起出现在说明书的下文中，所述附图的说明在下面给出：

附图说明

图1显示了CD151蛋白的核苷酸和蛋白质序列，在所述序列上突显了EC1和EC2环。

图2是示意图，其图解说明了CD151蛋白所属的四跨膜蛋白的结构，以及十分特别地显示了EC1和EC2这两个细胞外环。

图3显示了在A549同位模型中的PBS/对照抗体比较。

图4显示了在同位模型中抗体TS151的体内抗肿瘤活性的评估。通过胸膜内途径将1×10⁶个A549细胞移植到经免疫抑制的小鼠(n＝10)中。在移植后7天，通过腹膜内途径用500μg的唤起剂量(dose d’appel)的抗体TS151来治疗小鼠，随后为每周2次用250μg抗体/小鼠的剂量进行治疗并持续5周。对照组根据相同的施用方案用PBS进行注射。

图5图解说明了在患有前列腺癌的患者中CD151分子的表达。每个字母相应于一位患者的研究，并且对于每位患者而言上图相应于邻近肿瘤的正常组织和下图相应于肿瘤组织。

图6图解说明了在患有肺癌的患者中CD151分子的表达。每个字母相应于一位患者的研究，并且对于每位患者而言上图相应于邻近肿瘤的正常组织和下图相应于肿瘤组织。

图7图解说明了在PC3异种移植模型中抗体TS151和TS151R的体内活性。通过皮下途径将PC3细胞移植到Swiss裸鼠(n＝6)中。在细胞移植后5天，小鼠通过i.p.途径接受2mg/小鼠的唤起剂量的受试抗体，随后为每周2次施用1mg/小鼠的剂量的这些抗体。肿瘤体积通过公式“π/6×长度×宽度×厚度”进行评估，并且进行Mann-Whitney检验以用于所述结果的统计学评价。

图8图解说明了通过Western印迹来评估抗体TS151和TS151r对于人类形式的CD151的特异性。

图9图解说明了A549细胞在层粘连蛋白5上的粘着的抑制。A/细胞粘着被不同的抗整联蛋白抗体抑制。B/细胞粘着被TS151/抗整联蛋白α3抗体这一组合抑制。

实施例1：抗体TS 151r和TS 151的产生

抗体TS151r的产生

为了产生抗体TS151r，使用10⁷个HeLa细胞通过腹膜内途径免疫接种BALB/c小鼠。在3次免疫接种和最后一次加强注射(injection derappel)后，通过典型地由Kohler和Milstein所描述的技术使小鼠的脾细胞与P3X63AG8骨髓瘤细胞相融合(5×10⁷个脾细胞/3×10⁷个骨髓瘤细胞)。然后，通过流式细胞术就其识别HeLa细胞的能力来筛选由于所述融合而获得的杂交瘤的上清液，随后就其从在去污剂Brij97存在下制备的HeLa细胞的裂解物中免疫沉淀出CD151以及导致CD9的共免疫沉淀的能力来进行筛选。证实抗体TS151r具有这些不同的性质。

抗体TS151的产生

为了产生抗体TS151，使用10⁷个Jurkat细胞，随后为10⁷个HEL细胞，通过腹膜内途径免疫接种BALB/c小鼠(2次免疫接种)。在使用包含蛋白质ADAM10的蛋白质复合物(其获自Jurkat和HEL细胞的裂解物)进行最后一次加强注射后，通过典型地由Kohler和Milstein所描述的技术使脾细胞与P3X63AG8骨髓瘤细胞相融合(5×10⁷个脾细胞/3×10⁷个骨髓瘤细胞)。首先，通过流式细胞术就其识别Jurkat和HEL细胞的能力来筛选由于所述融合而获得的杂交瘤的上清液。然后，就其从在去污剂Brij 97存在下制备的细胞裂解物中免疫沉淀出CD151及导致其他四跨膜蛋白的共免疫沉淀的能力来选择所述抗体TS151。

实施例2：在A549同位模型中抗体TS151和TS151r的抗肿瘤活性的体内评估

材料和方法

在验证了CD151蛋白的表达后(数据未显示)，将得自ATCC的A549细胞在F12K培养基、10mM谷氨酰胺、10％FCS中常规地进行培养。这些细胞在移植前2天进行分裂，从而使得它们处于指数生长期。为了进行移植，在通过胸膜内途径接受1×10⁶个A549细胞之前，将7周龄的经免疫抑制的小鼠麻醉。该原发性肿瘤快速发展并在4天内蔓延到邻近注射位点的结构，包括纵隔、肺和隔膜。为了更好地模拟该疾病，在通过腹膜内途径植入了细胞后7天才开始治疗的起始。在注射了500μg/小鼠的唤起剂量后，以250μg/小鼠的剂量每周2次施用纯化的抗体TS151并持续5周。引入接受PBS的小鼠组作为对照，鉴于先前进行的实验已显示了对照IgG1同种型的施用对于动物的存活没有影响。

源自初步数据的图3证明了使用该抗-CD151抗体所观察到的活性的特异性。这是因为，使用用作对照同种型的鼠类IgG1(mIgG1)来治疗动物显示，所述鼠类IgG1对于注射了PBS(其用作这些抗体的载体)的动物的存活没有影响。

这个模型的评估参数是动物的存活，并且通过计算T/C％来表示抗肿瘤活性：T/C％＝经治疗的动物的存活中值/对照组动物的存活中值×100。已确定，大于或等于125％的T/C％表明该产品具有活性。

结果

图4显示了抗体TS151的抗肿瘤活性，其中计算出的T/C％为140％。

实施例3：在A549同位模型中抗体TS151和50-6的体内抗肿瘤活性的比较

材料和方法

所采用的方案与上面实施例2的方案相同。

结果

所获得的数据清楚地证实，抗体TS151具有明显超过抗体50-6的抗肿瘤活性，抗体50-6仅具有118的T/C％，即低于125％的阈值(数据未显示)。

所获得的结果，即根据如上定义而计算出的T/C％，显示在下面的表4中。

表4

实施例4：CD151分子的表达的研究

在来自患有前列腺癌或肺癌的患者的人类组织样品中通过免疫组织化学来研究CD151蛋白的表达。对于这些患者，可获得邻近肿瘤的正常组织的薄片，并因此将其包括在内以便相对于正常组织来校正肿瘤组织中的表达水平。

对于这些实验，使用商购可得的“组织阵列(Tissue array)”类型的薄片。在脱蜡后，借助于包含胃蛋白酶(Labvision ref.AP-9007-005)的酶促溶液于30℃进行抗原暴露。这个步骤之后为通过在0.3％过氧化氢(Sigma)水溶液中温育所述切片来去除内源性过氧化物酶的步骤。然后，用Ultra-V-Block(Labvision，ref.TA-125-UB)的溶液来进行非特异性位点的饱和，并且借助于以5μg/ml的终浓度进行使用的商购可得的鼠类抗-CD151抗体(Serotech，Ref.MCA 1856)来进行标记。对照鼠类IgG1同种型抗体(DakoCytomation，Ref.X0931)用作实验的阴性对照。使用Envision Dual Link可视化系统(DakoCytomation，Ref.K4061)来使标记可视化，并且DAB(过氧化物酶底物)的参照是DakoCytomation的S3309。

图5中所呈现的结果显示，正在形成前列腺肿瘤的多位患者表现出CD151分子的过表达。这种过表达对于20％的所研究的患者来说可能是非常显著的(患者A和C)或者中等的(患者A和D)。应当指出，除了在内皮细胞的水平上外，相应的正常前列腺组织不表达CD151或仅少量表达CD151，并且在其表达的情况下，它看起来似乎局限于腺类型的结构。患者E呈现了不表达CD151的肿瘤的例子。

在肺癌(图6)的情况下，在正常肺组织的某些细胞中观察到中等的(患者A)至强烈的(患者B)表达。然而，肿瘤组织显示出极高密度的经强烈标记的细胞(患者A和B)。患者C呈现了不表达CD151的肿瘤的例子。

实施例5：抗体TS151和TS151R对于经皮下途径植入裸鼠中的PC3肿瘤的体内生长的影响

鉴于在前列腺的“组织阵列”上通过免疫组织化学获得的结果，考虑在PC3肿瘤的异种移植物上来评估抗-CD151抗体。PC3系是得自ATCC的雄激素不依赖性前列腺系，并将其在F12K培养基+10％FCS+L-谷氨酰胺中进行培养。对于该评估，将5×10⁶个PC3细胞植入Swiss裸鼠的右胁腹中。在植入后5天，基于肿瘤体积使动物随机化并分配成3个可比较的组。所选择的移植动物组的肿瘤体积在处理的第0天时为41-47mm³(用公式“π/6×长度×宽度×厚度”计算出的体积)。然后，动物接受纯化的受试抗体或PBS。抗体剂量和注射频率如下：唤起剂量，2mg抗体/剂；维持剂量，1mg/剂，每周2次。

图7中所呈现的结果显示，所测试的两种抗体(TS151和TS151R)的行为相当，并且它们非常显著地抑制在皮下位置处植入Swiss裸鼠中的PC3肿瘤的生长。下面的表5概括了这些结果的统计学分析。

表5

平行进行并呈现在图8中的研究显示，抗体TS151和TS151R特异性地识别人CD151分子，没有任何与鼠类受体的交叉反应。因此，这个观察结果暗示，在裸鼠异种移植模型中所观察到的活性可以仅归因于对于所移植的人类组织的直接作用，并因此排除了抗体TS151和TS151R干扰肿瘤的基质细胞或鼠类内皮细胞的任何可能性。此外，TS151和TS151R都是鼠类IgG1，并因此且如本领域技术人员已知的，所观察到的活性与ADCC和CDC类型的效应子功能(其更特别地在小鼠中由鼠类IgG2a类型的抗体介导)相关这样的可能性很低。

因此，所有这些结果和直接与抗体TS151和TS151R对于体内肿瘤细胞增殖的抑制相关的作用机制相一致。

实施例6：抗体TS151和TS151r的特异性

通过Western印迹来评估抗体TS151和TS151r的特异性。将人和鼠的肺、胰腺和结肠组织的裂解物(Biochain，10μg总蛋白质)以及量逐渐增加的HT-29细胞裂解物(10、20和50μg总蛋白质)置于4-12％丙烯酰胺凝胶(BioRad)上。在电泳(非还原性条件)后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。然后，将该转移膜与纯化的抗体TS151和TS151r一起温育，然后与偶联有过氧化物酶的兔抗小鼠Ig多克隆抗体(GE Healthcare)一起温育，随后进行ECL类型的可视化。

抗体TS151和TS151r显示出对于人类形式的CD151的特异性，如在HT-29细胞和人类来源的不同组织的裂解物中CD151的识别(通过Western印迹)所证实的(图8)。在取自小鼠的各种不同组织的裂解物中与鼠类CD151的反应性的不存在确证了抗体TS151和TS151r对于人类形式的CD151的特异性。

实施例7：细胞粘着的抑制

在96孔平板中进行在层粘连蛋白5上的肿瘤细胞粘着实验，所述层粘连蛋白5是CD151能够与其结合的整联蛋白α3β1和α6β4的配体。在于37℃使层粘连蛋白5(Chemicon，200μl，1μg/ml)固定化1小时后，孔用2mg/ml BSA进行饱和(200μl，1小时，于37℃)。使用二乙酸5-氯甲基荧光素(CMFDA，Invitrogen)来标记悬浮的A549细胞，然后在抗体(100μl)存在或不存在的情况下以100000个细胞(100μl)/孔的比率加入。于37℃温育15、30或60分钟后，去除未粘着的细胞。在用发光计(Mithras，Berthold)读取化学发光后，借助于用CMFDA标记的细胞的范围来测定已粘着的细胞的百分比。以20μg/ml的终浓度来评估抗-CD151抗体TS151以及抗整联蛋白α3抗体P1B5、抗α6抗体NKI-Go3和抗β4抗体ASC-3(Chemicon)。针对大肠杆菌(Escherichia coli)的膜蛋白的抗体9G4用作同种型对照。

抗整联蛋白α3抗体P1B5抑制A549细胞在层粘连蛋白5上的粘着(图9A)，而抗整联蛋白α6抗体NKI-Go3和抗整联蛋白β4抗体ASC-3不抑制A549细胞在该相同配体上的粘着。然而，注意到作为时间的函数的抑制的丧失。这是因为，由P1B5所引起的抑制在15分钟时大于90％，但在1小时后下降至约20％。抗体P1B5与抗整联蛋白α6抗体NKI-Go3或抗整联蛋白β4抗体ASC-3的联合允许在1小时后维持对于粘着的强烈抑制：该抑制对于与抗α6抗体的联合而言大于90％，和对于与抗β4抗体的组合而言为约70％。这些结果证明，A549细胞在第一时期借助于整联蛋白α3β1，然后在第二时期借助于整联蛋白α6β4而粘着在层粘连蛋白5上。

当独自使用时，抗-CD151抗体TS151不抑制A549细胞在层粘连蛋白5上的粘着(图9B)。然后，评估TS151与P1B5的组合对于A549细胞粘着的影响并与先前提及的组合相比较。这种TS151/P1B5组合产生与抗α6抗体/抗α3抗体和抗β4抗体/抗α3抗体的联合相当的结果。这是因为，在1小时后观察到维持了大约80％的粘着抑制。因此，抗体TS151能够经由对于整联蛋白α6β4的拮抗效应而抑制A549细胞的粘着。

序列表

<110>Pierre Fabre Médicament

<120>抗-CD151抗体在治疗癌症中的用途

<130>cas 640

<150>FR 06/09135

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<160>38

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

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<212>DNA

<213>智人

<400>1

atgggtgagt tcaacgagaa gaagacaaca tgtggcaccg tttgcctcaa gtacctgctg 60

tttacctaca attgctgctt ctggctggct ggcctggctg tcatggcagt gggcatctgg 120

acgctggccc tcaagagtga ctacatcagc ctgctggcct caggcaccta cctggccaca 180

gcctacatcc tggtggtggc gggcactgtc gtcatggtga ctggggtctt gggctgctgc 240

gccaccttca aggagcgtcg gaacctgctg cgcctgtact tcatcctgct cctcatcatc 300

tttctgctgg agatcatcgc tggtatcctc gcctacgcct actaccagca gctgaacacg 360

gagctcaagg agaacctgaa ggacaccatg accaagcgct accaccagcc gggccatgag 420

gctgtgacca gcgctgtgga ccagctgcag caggagttcc actgctgtgg cagcaacaac 480

tcacaggact ggcgagacag tgagtggatc cgctcacagg aggccggtgg ccgtgtggtc 540

ccagacagct gctgcaagac ggtggtggct ctttgtgggc agcgagacca tgcctccaac 600

atctacaagg tggagggcgg ctgcatcacc aagttggaga ccttcatcca ggagcacctg 660

agggtcattg gggctgtggg gatcggcatt gcctgtgtgc aggtctttgg catgatcttc 720

acgtgctgcc tgtacaggag tctcaagctg gagcactac 759

<210>2

<211>253

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Gly Glu Phe Asn Glu Lys Lys Thr Thr Cys Gly Thr Val Cys Leu

1 5 10 15

Lys Tyr Leu Leu Phe Thr Tyr Asn Cys Cys Phe Trp Leu Ala Gly Leu

20 25 30

Ala Val Met Ala Val Gly Ile Trp Thr Leu Ala Leu Lys Ser Asp Tyr

35 40 45

Ile Ser Leu Leu Ala Ser Gly Thr Tyr Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Leu

50 55 60

Val Val Ala Gly Thr Val Val Met Val Thr Gly Val Leu Gly Cys Cys

65 70 75 80

Ala Thr Phe Lys Glu Arg Arg Asn Leu Leu Arg Leu Tyr Phe Ile Leu

85 90 95

Leu Leu Ile Ile Phe Leu Leu Glu Ile Ile Ala Gly Ile Leu Ala Tyr

100 105 110

Ala Tyr Tyr Gln Gln Leu Asn Thr Glu Leu Lys Glu Asn Leu Lys Asp

115 120 125

Thr Met Thr Lys Arg Tyr His Gln Pro Gly His Glu Ala Val Thr Ser

130 135 140

Ala Val Asp Gln Leu Gln Gln Glu Phe His Cys Cys Gly Ser Asn Asn

145 150 155 160

Ser Gln Asp Trp Arg Asp Ser Glu Trp Ile Arg Ser Gln Glu Ala Gly

165 170 175

Gly Arg Val Val Pro Asp Ser Cys Cys Lys Thr Val Val Ala Leu Cys

180 185 190

Gly Gln Arg Asp His Ala Ser Asn Ile Tyr Lys Val Glu Gly Gly Cys

195 200 205

Ile Thr Lys Leu Glu Thr Phe Ile Gln Glu His Leu Arg Val Ile Gly

210 215 220

Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Cys Val Gln Val Phe Gly Met Ile Phe

225 230 235 240

Thr Cys Cys Leu Tyr Arg Ser Leu Lys Leu Glu His Tyr

245 250

<210>3

<211>327

<212>DNA

<213>智人

<400>3

gcctactacc agcagctgaa cacggagctc aaggagaacc tgaaggacac catgaccaag 60

cgctaccacc agccgggcca tgaggctgtg accagcgctg tggaccagct gcagcaggag 120

ttccactgct gtggcagcaa caactcacag gactggcgag acagtgagtg gatccgctca 180

caggaggccg gtggccgtgt ggtcccagac agctgctgca agacggtggt ggctctttgt 240

gggcagcgag accatgcctc caacatctac aaggtggagg gcggctgcat caccaagttg 300

gagaccttca tccaggagca cctgagg 327

<210>4

<211>109

<212>PRT

<213>智人

<400>4

Ala Tyr Tyr Gln Gln Leu Asn Thr Glu Leu Lys Glu Asn Leu Lys Asp

1 5 10 15

Thr Met Thr Lys Arg Tyr His Gln Pro Gly His Glu Ala Val Thr Ser

20 25 30

Ala Val Asp Gln Leu Gln Gln Glu Phe His Cys Cys Gly Ser Asn Asn

35 40 45

Ser Gln Asp Trp Arg Asp Ser Glu Trp Ile Arg Ser Gln Glu Ala Gly

50 55 60

Gly Arg Val Val Pro Asp Ser Cys Cys Lys Thr Val Val Ala Leu Cys

65 70 75 80

Gly Gln Arg Asp His Ala Ser Asn Ile Tyr Lys Val Glu Gly Gly Cys

85 90 95

Ile Thr Lys Leu Glu Thr Phe Ile Gln Glu His Leu Arg

100 105

<210>5

<211>54

<212>DNA

<213>智人

<400>5

tggacgctgg ccctcaagag tgactacatc agcctgctgg cctcaggcac ctac 54

<210>6

<211>18

<212>PRT

<213>智人

<400>6

Trp Thr Leu Ala Leu Lys Ser Asp Tyr Ile Ser Leu Leu Ala Ser Gly

1 5 10 15

Thr Tyr

<210>7

<211>8

<212>PRT

<213>小鼠

<400>7

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser

1 5

<210>8

<211>8

<212>PRT

<213>小鼠

<400>8

Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro

1 5

<210>9

<211>13

<212>PRT

<213>小鼠

<400>9

Ala Arg Arg Glu Tyr Gly Asn Tyr Tyr Gly Met Glu Tyr

1 5 10

<210>10

<211>120

<212>PRT

<213>小鼠

<400>10

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Arg Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Tyr Gly Asn Tyr Tyr Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>小鼠

<400>11

Gln Ser Val Ser Thr Ser Thr Phe Ser Tyr

1 5 10

<210>12

<211>3

<212>PRT

<213>小鼠

<400>12

Ser Ala Ser

1

<210>13

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠

<400>13

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Leu Thr

1 5

<210>14

<211>111

<212>PRT

<213>小鼠

<400>14

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Thr Phe Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210>15

<211>8

<212>PRT

<213>小鼠

<400>15

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Trp

1 5

<210>16

<211>8

<212>PRT

<213>小鼠

<400>16

Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr

1 5

<210>17

<211>16

<212>PRT

<213>小鼠

<400>17

Ala Arg Gly Asp Asp Ala Tyr Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210>18

<211>123

<212>PRT

<213>小鼠

<400>18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Val Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Trp Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Val Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Val Asp Leu Asn Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Asp Ala Tyr Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>19

<211>10

<212>PRT

<213>小鼠

<400>19

Gln Ser Val Ser Thr Ser Arg Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210>20

<211>3

<212>PRT

<213>小鼠

<400>20

Tyr Ala Ser

1

<210>21

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠

<400>21

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr

1 5

<210>22

<211>111

<212>PRT

<213>小鼠

<400>22

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Arg Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Ile Gln Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>小鼠

<400>23

ggttatacct tcacagacta ttca 24

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>小鼠

<400>24

ataaacactg agactggtga gcca 24

<210>25

<211>39

<212>DNA

<213>小鼠

<400>25

gctagaaggg agtatggtaa ctactatggt atggagtac 39

<210>26

<211>360

<212>DNA

<213>小鼠

<400>26

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tgcactgggt gaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180

acagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccaa cactgcctat 240

ttgcggatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc tagaagggag 300

tatggtaact actatggtat ggagtactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcgtca 360

<210>27

<211>30

<212>DNA

<213>小鼠

<400>27

caaagtgtca gtacatctac ctttagttat 30

<210>28

<211>9

<212>DNA

<213>小鼠

<400>28

tctgcatcc 9

<210>29

<211>27

<212>DNA

<213>小鼠

<400>29

cagcacagtt gggagattcc gctcacg 27

<210>30

<211>333

<212>DNA

<213>小鼠

<400>30

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctacct ttagttatat acactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt ctgcatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatccat 240

cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat ttctgtcagc acagttggga gattccgctc 300

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333

<210>31

<211>24

<212>DNA

<213>小鼠

<400>31

ggctacacct tcaccagctc ctgg 24

<210>32

<211>24

<212>DNA

<213>小鼠

<400>32

attcatccta atagtggtaa tact 24

<210>33

<211>48

<212>DNA

<213>小鼠

<400>33

gcaagagggg atgatgctta ctacagcggg ctctatgcta tggactac 48

<210>34

<211>369

<212>DNA

<213>小鼠

<400>34

caggtccaac tgcagcagcc tgggtctgtg gtggtgaggc ctggagcttc agtgaaactg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctcctgga tgcactgggc gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggacag attcatccta atagtggtaa tactaattac 180

aatgagaagt tcaaggtcaa ggccacactg actatagaca catcctccag cacagcctac 240

gtggatctca acagcctgac atctggggac tctgcggtct attactgtgc aagaggggat 300

gatgcttact acagcgggct ctatgctatg gactactggg gtcagggaac ctcagtcacc 360

gtctcctca 369

<210>35

<211>30

<212>DNA

<213>小鼠

<400>35

caaagtgtca gtacatctag gtatagttat 30

<210>36

<211>9

<212>DNA

<213>小鼠

<400>36

tatgcatcc 9

<210>37

<211>27

<212>DNA

<213>小鼠

<400>37

caacacagtt gggagattcc gtacacg 27

<210>38

<211>333

<212>DNA

<213>小鼠

<400>38

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctaggt atagttatat gcactggtac 120

caacagatac aaggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat cactgtcaac acagttggga gattccgtac 300

acgttcggag gggggaccac gctggaaata aaa 333

Claims

1.能够与CD151蛋白结合并从而抑制肿瘤生长的至少一种抗体在制备用于治疗过表达人CD151蛋白的原发性肿瘤的药物中的用途，其中所述抗体选自：

(a)包含分别为序列SEQ ID No.7、8和9的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3这三个重链CDR以及分别为序列SEQ ID No.11、12和13的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3这三个轻链CDR的抗体；和

(b)包含分别为序列SEQ ID No.15、16和17的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3这三个重链CDR以及分别为序列SEQ ID No.19、20和21的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3这三个轻链CDR的抗体。

2.根据权利要求1的用途，其特征在于，所述至少一种抗-CD151抗体由单克隆抗体组成。

3.根据权利要求1的用途，其特征在于，所述抗体由含有序列SEQID No.10的重链和含有序列SEQ ID No.14的轻链组成。

4.根据权利要求1的用途，其特征在于，所述抗体由含有序列SEQID No.18的重链和含有序列SEQ ID No.22的轻链组成。

5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其特征在于，所述至少一种抗-CD151抗体当与抗整联蛋白α3抗体联合施用时能够抑制过表达人CD151蛋白的肿瘤细胞的细胞粘着。

6.根据权利要求1-4中任一项的用途，其特征在于，所述原发性肿瘤由结肠癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌组成。

7.根据权利要求1-4中任一项的用途，所述用途为用于制备另外还包含至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。

8.用于治疗过表达人CD151蛋白的原发性肿瘤的组合物，其特征在于，所述组合物包含能够与CD151蛋白结合的至少一种抗-CD151抗体作为活性成分，其中所述抗体选自：

9.根据权利要求8的组合物，其特征在于，所述至少一种抗-CD151抗体是选自下列抗体的单克隆抗体：由含有序列SEQ ID No.10的重链和含有序列SEQ ID No.14的轻链组成的抗体，和由含有序列SEQ ID No.18的重链和含有序列SEQ ID No.22的轻链组成的抗体。

10.根据权利要求8的组合物，其特征在于，所述组合物包含下列抗体的组合：由含有序列SEQ ID No.10的重链和含有序列SEQ ID No.14的轻链组成的抗体，和由含有序列SEQ ID No.18的重链和含有序列SEQID No.22的轻链组成的抗体。

11.根据权利要求8-10中任一项的组合物，其特征在于，作为用于同时、分开或在时间上错开使用的联合产品，所述组合物另外还包含至少一种细胞毒剂或细胞生长抑制剂，和/或细胞毒素，和/或放射性元素，和/或单克隆抗体。

12.根据权利要求8-11中任一项的组合物在制备用于治疗过表达人CD151蛋白的原发性肿瘤的药物中的用途。