ES2776977T3 - Anticuerpos de endoglina - Google Patents

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Charles Theuer
Maximiliano Vasquez
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Tracon Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 89, y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93, 94, 95 o 96; una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 90, y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93 o 94; o una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 91, y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93 o 94.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos de endoglina
Antecedentes de la invención
La endoglina, también conocida, entre otras, COMO CD105 o edg-1, es una glucoproteína de membrana homodimérica de tipo I que se expresa a altos niveles en células endoteliales vasculares en proliferación (Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1: 1623-1634). Por lo tanto, la endoglina es principalmente un marcador asociado a la proliferación de células endoteliales que sufren angiogénesis activa. Sin embargo, existe cierta expresión de endoglina por el endotelio vascular de los tejidos normales (Burrows et al., supra; Wang et al., 1993, Int. J. Cancer 54: 363-370). Se sabe que la endoglina humana se une específicamente al factor de crecimiento transformante p (TGF-p), y la secuencia de aminoácidos deducida de la endoglina tiene una fuerte homología con el p-glicano, un tipo de receptor de TGF-p.
La endoglina (EDG) se ha dirigido a métodos basados en anticuerpos para reducir la vasculatura tumoral, ya que EDG es un antígeno asociado a la proliferación en las células endoteliales y leucémicas. Su expresión está regulada por aumento en el endotelio vascular asociado a tumores, y EDG es esencial para la angiogénesis. La angiogénesis incluye la formación de nuevos vasos sanguíneos capilares que conducen a la neovascularización, así como al mantenimiento de la vasculatura existente. Es un proceso complejo que incluye una serie de pasos secuenciales que incluyen la degradación mediada por células endoteliales de la membrana basal vascular y las matrices intersticiales, la migración de células endoteliales, la proliferación de células endoteliales y la formación de bucles capilares por las células endoteliales.
Se han descrito varios anticuerpos anti-endoglina, en particular anticuerpos monoclonales anti-endoglina ("mAb"). El mAb SN6 es un anticuerpo generado a partir de la inmunización de ratones con mezclas de glucoproteínas de membranas celulares de células de leucemia humana (Haruta and Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 7898-7902). SN6 es un mAb murino que reconoce la endoglina humana. Los mAbs murinos Y4-2F1 y K4-2C10, conocidos como SN6j ySN6f respectivamente en la técnica, también reconocen la endoglina humana (Seon et al., US5928641). La contraparte quimérica del mAb SN6j, a saber, c-SN6j, se ha descrito (Shiozaki, 2006, Cancer Immunol Immunother 55: 140-150).
El mAb 44G4 es un anticuerpo generado a partir de la inmunización de ratones con suspensiones de células enteras de células de leucemia pre-B humanas (Gougos and Letarte, 1988, J. Immunol. 141: 1925-1933; 1990, J. Biol. Chem.
265: 8361- 8364). 44G4 también es un mAb murino que reconoce la endoglina humana. El mAb MJ7/18 es un anticuerpo generado a partir de la inmunización de ratas con pieles de ratón inflamadas (Ge and Butcher, 1994, supra). MJ7/18 es un mAb que reconoce la endoglina murina. El mAb Tec-11 es un anticuerpo generado a partir de la inmunización de ratones con células endoteliales de la vena umbilical humana (Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res.
1: 1623-1634). Tec-11 es un mAb murino con reactividad restringida a endoglina humana. Los anticuerpos contra la endoglina representan un área importante para el desarrollo de terapias para el tratamiento de una variedad de enfermedades y afecciones que implican, están influenciadas o afectadas por la angiogénesis.
La angiogénesis es el proceso fisiológico mediante el cual se desarrollan nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes (Varner, et al., Cell Adh. Commun. 1995, 3: 367-374; Blood, et al., Biochim. Biophys. Acta 1990, 1032: 89-118; Weidner, et al., J. Natl. Cancer Inst. 1992, 84: 1875-1887). Se ha sugerido que la angiogénesis desempeña un papel en los procesos normales y patológicos. Por ejemplo, los procesos angiogénicos están involucrados en el desarrollo de los sistemas vasculares de los órganos y tejidos animales. Estos procesos también están involucrados en las fases transitorias de la angiogénesis, por ejemplo, durante el ciclo menstrual, en el embarazo y en la curación de heridas. Por otro lado, se sabe que varias enfermedades están asociadas con la angiogénesis desregulada.
En ciertas condiciones patológicas, la angiogénesis se estimula como un medio para proporcionar un suministro adecuado de sangre y nutrientes a las células dentro del tejido afectado. Muchas de estas condiciones patológicas implican proliferación y/o regulación celular aberrante. Por lo tanto, la inhibición de la angiogénesis es un enfoque potencialmente útil para tratar enfermedades que se caracterizan por el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos. Por ejemplo, la angiogénesis está involucrada en afecciones patológicas que incluyen: diversas formas de enfermedades oculares y no oculares caracterizadas por angiogénesis/neovascularización (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética), nefropatía diabética, enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, EII), artritis reumatoide, osteoartritis y diversas formas de cáncer, tumores sólidos y metástasis y similares. Se ha demostrado que el anticuerpo quimérico c-SN6j mencionado anteriormente suprime la angiogénesis, el crecimiento tumoral y la metástasis en ratones (Shiozaki, 2006, Cancer Immunol Immunother 55: 140-150). El mAb anti-endoglina quimérico TRC105 ha mostrado evidencia de tolerabilidad y actividad clínica en un estudio de fase I en pacientes con cáncer refractario avanzado (Rosen et al., Resumen número 3518 en la reunión anual de la ASCO 2009).
Resumen de la invención
En el presente documento se proporcionan anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos según las reivindicaciones que se unen a la endoglina. Dichos anticuerpos tienen usos de purificación, detección, diagnóstico y terapéuticos in vitro e in vivo. También se proporcionan en el presente documento anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos según las reivindicaciones que se unen a una o más especies o variantes de endoglina e inhiben la angiogénesis. Además, en el presente documento se proporcionan anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de acuerdo con las reivindicaciones que se unen a la endoglina para su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas a la angiogénesis.
Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno que se unen a la endoglina y se describen en el presente documento pueden usarse para tratar o prevenir la degeneración macular, CNV, retinopatía diabética o vitreorretinopatía proliferativa. Aquí se describen métodos para tratar o prevenir la degeneración macular, la CNV, la retinopatía diabética o la vitreorretinopatía proliferativa mediante la administración de los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos aquí. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno que se unen a la endoglina y se describen en el presente documento también pueden encoger los vasos sanguíneos, inhibir la proliferación de células endoteliales asociadas con la enfermedad ocular, eliminar los síntomas de sangrado, tratar la visión nublada, proporcionar estasis de pérdida de visión y/o prevenir fugas de los vasos sanguíneos. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento también se pueden usar en medicamentos para el tratamiento de la degeneración macular, CNV, retinopatía diabética o vitreorretinopatía proliferativa. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento también pueden usarse en medicamentos para el tratamiento del cáncer.
En este documento se describen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que tienen una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 41 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 3.
En este documento se describen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a endoglina, que comprenden una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena pesada que tiene un conjunto de secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 41, en donde: dicha región variable de la cadena pesada comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 49; una sustitución de asparagina (N) por serina (S) en la posición 76; una sustitución de treonina (T) por arginina (R) en la posición 77; una sustitución de leucina (L) por valina (V) en la posición 78; una sustitución de asparagina (N) por isoleucina (I) en la posición 82a; una sustitución de valina (V) por isoleucina (I) o leucina (L) en la posición 89; una sustitución de treonina (T) por arginina (R) o glicina (G) en la posición 94; una sustitución de leucina (L) portreonina (T) en la posición 108; una sustitución de valina (V) por leucina (L) en la posición 109; y una sustitución de serina (S) por alanina (A) en la posición 113 utilizando el sistema de numeración Kabat; y la región variable de la cadena liviana comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) en la posición 1; una sustitución de glutamina (Q) por valina (V) en la posición 3; una sustitución de metionina (M) por leucina (L) en la posición 4; una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 5; una sustitución de tirosina (Y) por fenilalanina (F) en la posición 36; una sustitución de leucina (L) por prolina (P) en la posición 46; una sustitución de leucina (L) por triptófano (W) en la posición 47; una sustitución de serina (S) por valina (V) o alanina (A) en la posición 60; una sustitución de ácido aspártico (D) por serina (S) en la posición 70; una sustitución de fenilalanina (F) por tirosina (Y) en la posición 71; una sustitución de glutamina (G) por alanina (A) en la posición 100; y una sustitución de isoleucina (I) por leucina (L) en la posición 106 utilizando el sistema de numeración Kabat.
En este documento se describen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a endoglina, que tienen una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde dicha región variable de cadena pesada comprende:
(i) una CDR1 de SEQ ID NO: 66, una CDR2 de SEQ ID NO: 67, y una CDR3 de SEQ ID NO: 68;
(ii) una cadena pesada FR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 excepto por una o más sustituciones conservadoras;
(iii) una FR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 excepto por una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 49 utilizando el sistema de numeración de Kabat; y
(iv) una FR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, excepto una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de asparagina (N) por serina (S) en la posición 76;
(b) una sustitución de treonina (T) por arginina (R) en la posición 77;
(c) una sustitución de leucina (L) por valina (V) en la posición 78;
(d) una sustitución de asparagina (N) por isoleucina (I) en la posición 82a;
(e) una sustitución de valina (V) por isoleucina (I) o leucina (L) en la posición 89; y
(f) una sustitución de treonina (T) por arginina (R) o glicina (G) en la posición 94 utilizando el sistema de numeración Kabat; y
(v) una cadena pesada FR4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de leucina (L) por treonina (T) en la posición 108;
(b) una sustitución de valina (V) por leucina (L) en la posición 109; y
(c) una sustitución de serina (S) poralanina (A) en la posición 113 utilizando el sistema de numeración Kabat; y dicha región variable de la cadena liviana comprende:
(i) una CDR1 de SEQ ID NO: 63, una CDR2 de SEQ ID NO: 64 y una CDR3 de SEQ ID NO: 65;
(ii) una cadena liviana FR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) en la posición 1;
(b) una sustitución de glutamina (Q) por valina (V) en la posición 3;
(c) una sustitución de metionina (M) por leucina (L) en la posición 4; y
(d) una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 5; utilizando el sistema de numeración Kabat; y (iii) una FR2 de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, excepto una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de tirosina (Y) por fenilalanina (F) en la posición 36;
(b) una sustitución de leucina (L) por prolina (P) en la posición 46; y
(c) una sustitución de leucina (L) portriptófano (W) en la posición 47 utilizando el sistema de numeración Kabat; y (iv) una cadena liviana FR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de serina (S) por valina (V) o alanina (A) en la posición 60;
(b) una sustitución de ácido aspártico (D) por serina (S) en la posición 70; y
(c) una sustitución de fenilalanina (F) por tirosina (Y) en la posición 71 utilizando el sistema de numeración Kabat; y (v) una cadena liviana FR4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 100; y
(b) una sustitución de isoleucina (I) por leucina (L) en la posición 106 utilizando el sistema de numeración Kabat. En este documento se describe un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 42 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 4.
En el presente documento se describe un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la endoglina, que comprende una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecido como SEQ ID NO: 42, en donde: dicha región variable de la cadena pesada comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 49; una sustitución de asparagina (N) por serina (S) en la posición 76; una sustitución de treonina (T) por arginina (R) en la posición 77; una sustitución de leucina (L) por valina (V) en la posición 78; una sustitución de asparagina (N) por isoleucina (I) en la posición 82a; una sustitución de valina (V) por isoleucina (I) o leucina (L) en la posición 89; una sustitución de arginina (R) por treonina (T) o glicina (G) en la posición 94; una sustitución de leucina (L) por treonina (T) en la posición 108; una sustitución de valina (V) por leucina (L) en la posición 109; y una sustitución de serina (S) por alanina (A) en la posición 113 utilizando el sistema de numeración Kabat; y la región variable de la cadena liviana comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) en la posición 1; una sustitución de glutamina (Q) por valina (V) en la posición 3; una sustitución de metionina (M) por leucina (L) en la posición 4; una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 5; una sustitución de tirosina (Y) por fenilalanina (F) en la posición 36; una sustitución de prolina (P) por leucina (L) en la posición 46; una sustitución de triptófano (W) por leucina (L) en la posición 47; una sustitución de serina (S) por valina (V) o alanina (A) en la posición 60; una sustitución de ácido aspártico (D) por serina (S) en la posición 70; una sustitución de tirosina (Y) por fenilalanina (F) en la posición 71; una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 100; y una sustitución de isoleucina (I) por leucina (L) en la posición 106 utilizando el sistema de numeración Kabat.
En este documento se describe un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la endoglina, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana,
en donde dicha región variable de la cadena pesada comprende:
(i) una CDR1 de SEQ ID NO: 66, una CDR2 de SEQ ID NO: 67, y una CDR3 de SEQ ID NO: 68;
(ii) una cadena pesada FR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 excepto por una o más sustituciones conservadoras;
(iii) una FR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 excepto por una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 49 utilizando el sistema de numeración de Kabat; y
(iv) una FR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, excepto una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de asparagina (N) por serina (S) en la posición 76;
(b) una sustitución de treonina (T) por arginina (R) en la posición 77;
(c) una sustitución de leucina (L) por valina (V) en la posición 78;
(d) una sustitución de asparagina (N) por isoleucina en la posición 82a;
(e) una sustitución de valina (V) por isoleucina (I) o leucina (L) en la posición 89; y
(f) una sustitución de arginina (R) por treonina (T) o glicina (G) en la posición 94 utilizando el sistema de numeración Kabat; y
(v) una cadena pesada FR4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de leucina (L) por treonina (T) en la posición 108;
(b) una sustitución de valina (V) por leucina (L) en la posición 109; y
(c) una sustitución de serina (S) por alanina (A) en la posición 113 utilizando el sistema de numeración Kabat; y dicha región variable de la cadena liviana comprende:
(i) una CDR1 de SEQ ID NO: 63, una CDR2 de SEQ ID NO: 64 y una CDR3 de SEQ ID NO: 65;
(ii) una cadena liviana FR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) en la posición 1;
(b) una sustitución de glutamina (Q) por valina (V) en la posición 3;
(c) una sustitución de metionina (M) por leucina (L) en la posición 4; y
(d) una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 5; utilizando el sistema de numeración Kabat; y (iii) una FR2 de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: (a) una sustitución de tirosina (Y) por fenilalanina (F) en la posición 36;
(b) una sustitución de prolina (P) por leucina (L) en la posición 46; y
(c) una sustitución de triptófano (W) por leucina (L) en la posición 47 utilizando el sistema de numeración Kabat; y (iv) una cadena liviana FR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de serina (S) porvalina (V) o alanina (A) en la posición 60;
(b) una sustitución de ácido aspártico (D) por serina (S) en la posición 70; y
(c) una sustitución de tirosina (Y) por fenilalanina (F) en la posición 71 utilizando el
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numeración Kabat; y
(v) una cadena liviana FR4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 100; y
(b) una sustitución de isoleucina (I) por leucina (L) en la posición 106 utilizando el sistema de numeración Kabat.
En este documento se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93 (VK1AA) y una región variable de cadena pesada que tiene un conjunto de secuencia de aminoácidos establecida como SEQ
ID NO: 89 (VHIA2).
En el presente documento se describe un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la endoglina, que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 89 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93, en donde:
(i) la región variable de la cadena pesada comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de glicina (G) por alanina (A) o serina (S) en la posición 49; una sustitución de alanina (A) por isoleucina (I) en la posición 51; una sustitución de lisina (K) por arginina (R) o asparagina (Q) en la posición 52b; una sustitución de leucina (L) porvalina (V) en la posición 78 utilizando el sistema de numeración Kabat; y
(ii) la región variable de la cadena liviana comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de metionina (M) por leucina (L) en la posición 4; una sustitución de alanina (A) porvalina
(V) en la posición 19; una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 22; una sustitución de alanina (A) por isoleucina (I) en la posición 48; y una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 51 utilizando el sistema de numeración Kabat.
En el presente documento se proporciona un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 88, y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93, 94, 95 o 96; una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 90, y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93 o 94; o una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ
ID NO: 91 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93 o 94.
En un caso, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento están humanizados y pueden ser cualquier isotipo. También se incluyen en este documento AVIMER, diacuerpos y dímeros de cadena pesada (incluidos los camélidos y constructos de cadena pesada de tiburón).
Los términos "porción de unión a antígeno de un anticuerpo", "fragmento de unión a antígeno", "dominio de unión a antígeno", "fragmento de anticuerpo" o un "fragmento funcional de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno Los ejemplos no limitantes de fragmentos de anticuerpos incluidos dentro de dichos términos incluyen, entre otros, (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Cm; (ii) un Fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que contiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de la bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1, (iv) un fragmento Fv que contiene los dominios Vl y Vh de un variante único de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544 546), que contiene un dominio Vh, y (vi) un CDR aislado. Además, se incluyen en esta definición anticuerpos “de una mitad” que comprenden una cadena pesada y una cadena liviana. Otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, como los diacuerpos también son abarcadas aquí.
Un fragmento de unión a antígeno puede ser cualquiera de los descritos en este documento, que incluyen, pero no se limitan a, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2 , un fragmento Fv (que incluye enlaces no covalentes y covalentes fragmentos Fv), un fragmento scFv, un polipéptido de unión de cadena única, un fragmento Fd, un fragmento Fv o un fragmento dAb. En una realización no limitante, el fragmento de unión a antígeno es un scFv que, opcionalmente, puede fusionarse adicionalmente a una porción Fc humana de un anticuerpo.
En un ejemplo descrito en el presente documento, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la endoglina, comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 41, 42 o 43, y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 3, 4 o 5.
En otro ejemplo descrito aquí, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO 41 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 3.
En otro ejemplo descrito en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 41 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 4.
En otro ejemplo descrito en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un compuesto que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 41 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecido como SEQ ID NO: 5.
En otro ejemplo descrito en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 42 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 3.
En otro ejemplo descrito en el presente documento, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 42 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 4.
En otro ejemplo descrito en el presente documento, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 42 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 5.
En otro ejemplo descrito en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 43 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 3.
En otro ejemplo descrito en el presente documento, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 43 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 4.
En otro ejemplo descrito en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 43 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 5.
En otro ejemplo más descrito aquí, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, la región variable de la cadena pesada comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en: una sustitución de asparagina (N) por serina (S) en la posición 76; una sustitución de treonina (T) por arginina (R) en la posición 77; una sustitución de asparagina (N) por isoleucina (I) en la posición 82a; una sustitución de valina (V) por isoleucina (I) o leucina (L) en la posición 89; una sustitución de treonina (T) por glicina (G) en la posición 94; una sustitución de leucina (L) portreonina (T) en la posición 108; una sustitución de valina (V) por leucina (L) en la posición 109; y una sustitución de serina (S) por alanina (A) en una posición 113; y dicha región variable de la cadena liviana comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en: una sustitución de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) en la posición 1; una sustitución de glutamina (Q) por valina (V) en la posición 3; una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 5; una sustitución de tirosina (Y) por fenilalanina (F) una posición 36; una sustitución de serina (S) por valina (V) o alanina (A) en la posición 60; una sustitución de ácido aspártico (D) por serina (S) en la posición 70; una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 100, y una sustitución de isoleucina (I) por leucina (L) en la posición 106 utilizando el sistema de numeración Kabat.
En un aspecto, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden modificarse. Por ejemplo, en una realización, el compuesto puede modificarse para alterar una propiedad farmacocinética del compuesto tal como, por ejemplo, estabilidad in vivo, solubilidad, biodisponibilidad o vida media. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, PEGilación y/o glicosilación.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden formularse para suministro rápido o prolongado usando medios convencionales. En una realización no limitante, el suministro rápido es, por ejemplo, por inyección intravenosa. En otra realización no limitante, el suministro prolongado es, por ejemplo, por deposición subcutánea. En otra realización no limitante, el suministro se logra mediante administración por aerosol.
En este documento se proporcionan composiciones de los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento y un vehículo o excipiente aceptable.
En el presente documento se describen polinucleótidos (ácidos nucleicos) que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento.
Los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno, como se describe en el presente documento, se pueden usar para tratar diversas enfermedades y afecciones asociadas con la angiogénesis, por ejemplo, diversas formas de enfermedades oculares caracterizadas por angiogénesis/neovascularización (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética), nefropatía diabética, enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, EII), artritis reumatoide, osteoartritis y diversas formas de cáncer, tumores sólidos y metástasis. Además, estos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento pueden usarse en la formulación de un medicamento para la profilaxis, el tratamiento o el diagnóstico de enfermedades y afecciones asociadas con la angiogénesis, por ejemplo, diversas formas de enfermedades oculares y no oculares caracterizadas por angiogénesis/neovascularización (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética), nefropatía diabética, enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, EII), artritis reumatoide, osteoartritis y diversas formas de cáncer, tumores sólidos y metástasis.
En este documento se describe un método para inducir una respuesta inmune del huésped en un paciente contra la endoglina, mediante la administración al paciente de una composición, donde la composición comprende un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que induce una respuesta inmune del huésped efectiva contra el epítopo específicamente reconocido por dicho anticuerpo o fragmento del mismo.
La respuesta inmune del huésped puede ser una respuesta inmune humoral o una respuesta inmune mediada por células. Si la respuesta inmune es una respuesta inmune humoral, puede ser una respuesta de anticuerpos protectores que inhibe la angiogénesis, una enfermedad dependiente de la angiogénesis o un trastorno dependiente de la angiogénesis. Las respuestas inmunitarias también incluyen la inducción o el bloqueo de las vías de señalización celular (por ejemplo, señalización Smad). La enfermedad o trastorno dependiente de la angiogénesis puede ser, por ejemplo, diversas formas de enfermedades oculares y no oculares caracterizadas por angiogénesis/neovascularización (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética), nefropatía diabética, enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, EII), reumatoide artritis, osteoartritis, diversas formas de cáncer (tumores primarios y metástasis) y similares. La respuesta protectora del anticuerpo puede inhibir la angiogénesis.
En este documento se describe un método para afectar las vías de señalización celular asociadas con la endoglina y la angiogénesis. Las células angiogénicas pueden ponerse en contacto (in vitro, in vivo o ex vivo) con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito aquí en una cantidad suficiente para alterar las rutas de señalización celular. En un ejemplo no limitante, en respuesta a la unión de anticuerpos, la señalización de Smad 1, 5 y/u 8 se inhibe en aproximadamente 1.5 veces o más en células angiogénicas. En otro ejemplo no limitante, los niveles de Smad 3 aumentan aproximadamente 1.5 veces o más, lo que indica que las células están volviendo a un estado de reposo.
En el presente documento se describe un método para inhibir la angiogénesis o una enfermedad o trastorno dependiente de la angiogénesis en un sujeto mediante la administración de una composición proporcionada en el presente documento a un paciente. La enfermedad o trastorno dependiente de la angiogénesis puede ser cualquiera de los siguientes: diversas formas de enfermedades oculares y no oculares caracterizadas por angiogénesis/neovascularización (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética), nefropatía diabética, enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, EII), artritis reumatoide, osteoartritis y diversas formas de cáncer, tumores sólidos y metástasis. La inhibición de la angiogénesis o una enfermedad o trastorno dependiente de la angiogénesis puede aliviar los síntomas asociados con la enfermedad o trastorno. En otro ejemplo, inhibir la angiogénesis o una enfermedad o trastorno dependiente de la angiogénesis da como resultado una disminución del tamaño del tumor, prevención de la progresión del tumor, disminución de la proliferación celular, aumento de la apoptosis o aumento de la supervivencia de un paciente. La inhibición de la angiogénesis puede dar como resultado una disminución del tamaño del tumor o prevenir la progresión del tumor. El método puede incluir además la extirpación quirúrgica de un cáncer y/o la administración de uno o más agentes o tratamientos anticancerígenos adicionales a un paciente que padece cáncer.
Se describe en este documento un método para prevenir o tratar un cáncer o metástasis en un sujeto mediante la administración de una composición proporcionada en este documento. La administración de la composición farmacéutica puede prolongar la vida del sujeto por tratar. Un cáncer/tumor por tratar incluye un tumor sólido; un tumor puede ser un tumor primario o un tumor metastásico. Los tumores sólidos de ejemplo son de un tejido u órgano seleccionado entre piel, melanoma, pulmón, páncreas, mama, ovario, colon, recto, estómago, tiroides, laringe, ovario, próstata, colorrectal, cabeza, cuello, ojo, boca, garganta, esófago, tórax, hueso, testicular, linfoide, médula, hueso, sarcoma, renal, glándula sudorípara, hígado, riñón, cerebro, por ejemplo, glioblastoma multiforme y tejidos similares.
En un ejemplo no limitante, un tumor sólido es un tumor de colon, un tumor de mama, un tumor de riñón, un tumor de pulmón, un tumor de próstata, un tumor de ovario o metástasis de cualquiera de dichos tumores.
El método puede incluir además la extirpación quirúrgica del cáncer y/o la administración de uno o más agentes anticancerígenos. Se puede administrar un agente anticancerígeno antes de la administración de la composición farmacéutica concomitante o posterior a la misma. Se puede administrar un agente anticancerígeno dentro de una semana antes de la composición farmacéutica, dentro de una semana después de la composición farmacéutica, o el agente anticancerígeno se puede administrar el mismo día que la composición farmacéutica. Si se administra un agente anticancerígeno el mismo día que la composición farmacéutica, la administración puede ser concomitante.
En el presente documento se describe un método para prevenir o tratar un cáncer o una metástasis mediante la extirpación quirúrgica del cáncer/tumor y la administración concurrente de un agente o tratamiento anticancerígeno y una composición proporcionada en el presente documento a un sujeto.
En el presente documento se describe un método para inhibir la angiogénesis poniendo en contacto una célula o tejido con una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en este documento, suficiente para inhibir la angiogénesis.
En el presente documento se describe un método para inhibir el crecimiento de células cancerosas poniendo en contacto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en este documento, suficiente para inhibir el crecimiento de células cancerosas o causar apoptosis de la célula cancerosa.
Se describe en este documento un método que comprende poner en contacto un tejido con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en este documento, en donde el contacto inhibe la angiogénesis. El tejido puede ser una muestra de biopsia de tejido cultivada o puede estar presente en un sujeto.
En el presente documento se describe un método para prevenir o tratar un trastorno proliferativo celular (por ejemplo, angiogénico) mediante la administración aun sujeto que tiene o está en riesgo de tener un trastorno proliferativo celular una cantidad efectiva de una composición proporcionada en el presente documento eficaz para tratar el trastorno de proliferación celular. El trastorno de proliferación celular puede ser, por ejemplo, un tumor sólido o no sólido benigno o maligno y el tumor puede ser metastásico o no metastásico. El tratamiento puede mejorar la condición del sujeto y puede evaluarse determinando si se ha producido uno o más de los siguientes factores: disminución de la proliferación celular, disminución del número de células, aumento de la apoptosis o disminución de la supervivencia de al menos una parte de las células que comprenden el trastorno celular proliferativo. Una o más de estas ocurrencias pueden, en algunos casos, dar como resultado la eliminación parcial o total del cáncer y la prolongación de la supervivencia del paciente. Opcionalmente, el método puede incluir además administrar un agente o tratamiento anticancerígeno al sujeto.
En el presente documento se describe un método para tratar la retinopatía diabética, la degeneración macular, la neovascularización coroidea o el glaucoma neovascular en un paciente mediante la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición proporcionada en el presente documento. El tratamiento puede mejorar la condición del sujeto y puede evaluarse determinando si se ha producido uno o más de los siguientes factores: disminución del edema macular, disminución de las áreas de NVC o aumento de la agudeza visual.
En los métodos descritos en el presente documento, el sujeto puede ser un sujeto humano o no humano. Las composiciones y el agente o tratamientos anticancerígenos proporcionados en el presente documento pueden administrarse una o varias veces dependiendo de la salud del paciente, la progresión de la enfermedad o afección y la eficacia del tratamiento. Se pueden hacer ajustes a la terapia y los tratamientos durante todo el curso del tratamiento.
Las composiciones se pueden administrar localmente, regionalmente o sistémicamente, tal como, por ejemplo, administración por inyección subcutánea, intravítrea, intradérmica, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o intramuscular.
Además, los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento también se pueden usar en combinación con terapias y/o compuestos conocidos para el tratamiento de la degeneración macular, CNV, retinopatía diabética o vitreorretinopatía proliferativa. Ejemplos de tales compuestos incluyen, entre otros, bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap) o Macugen. Además de los modos de administración descritos en el presente documento, los anticuerpos anti-endoglina humanizados y los fragmentos de unión a antígeno pueden administrarse por vía intravítrea. Ejemplos no limitativos de modos de administración intravítreos incluyen inyección intravítrea y el uso de implantes intravítreos.
Otro aspecto es el tratamiento de una enfermedad inflamatoria crónica en un sujeto mediante la administración de una composición de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito aquí. Ejemplos no limitantes de enfermedades inflamatorias crónicas incluyen EII, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.
Otro aspecto es el tratamiento de la artritis reumatoide en un sujeto mediante la administración de una composición de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en este documento.
Otro aspecto es el tratamiento de la osteoartritis en un sujeto mediante la administración de una composición de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito aquí.
El tratamiento de un sujeto con artritis reumatoide y/o osteoartritis puede evaluarse por diversos medios, incluida la mejora en las categorías apropiadas de puntuaciones ACR según se mide de acuerdo con las guías publicadas.
Se describe en este documento un método para controlar la eficacia de uno o más de cualquiera de los métodos descritos en este documento. El aumento de los niveles de endoglina soluble se ha correlacionado con una disminución de la supervivencia en pacientes con cáncer. Por lo tanto, en un aspecto, los niveles de endoglina soluble se pueden controlar antes y durante la terapia. Una disminución en los niveles de endoglina soluble puede, por lo tanto, ser una indicación de que un régimen terapéutico es efectivo en el tratamiento del paciente.
Una realización de la presente invención contempla el uso de cualquiera de las composiciones de la presente invención para formular un medicamento para tratar un trastorno de la presente invención. Los medicamentos pueden formularse según las características físicas del paciente/sujeto que necesita tratamiento, y pueden formularse en formulaciones únicas o múltiples según la etapa del tejido canceroso. Los medicamentos de la presente invención se pueden empaquetar en un paquete farmacéutico adecuado con etiquetas apropiadas para la distribución a hospitales y clínicas en las que la etiqueta es para la indicación de tratar un trastorno como se describe en el presente documento en un sujeto. Los medicamentos se pueden empaquetar como una sola o múltiples unidades. Las instrucciones para la dosificación y administración de las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden incluir con los paquetes farmacéuticos.
En este documento se describe un método de diagnóstico para proporcionar una muestra de células cancerosas de un tumor sólido o plasma de un paciente por analizar, detectando en la muestra la expresión de al menos un gen o producto genético elegido de un panel de genes o productos genéticos cuya expresión se ha correlacionado con la sensibilidad o resistencia a un inhibidor de la angiogénesis, en donde el al menos un gen o producto genético se elige de uno o más genes o productos genéticos seleccionados del grupo que consiste en VEGF, receptor VEGF, HIF-1a, receptor de factor de crecimiento placentario y CD105, y comparando el nivel de expresión de al menos un gen o producto genético detectado en la muestra del paciente con un nivel de expresión de al menos un gen o producto genético que se ha correlacionado con la sensibilidad o resistencia a la inhibidor de la angiogénesis El inhibidor de la angiogénesis se puede elegir entre los inhibidores del receptor de VEGF, los inhibidores de VEGF y los inhibidores de endoglina.
En este documento se describe un kit para la detección de niveles de expresión de genes que se han correlacionado con la sensibilidad o resistencia a un inhibidor de la angiogénesis en una muestra de células cancerosas o plasma humano. Se pueden seleccionar uno o más genes de VEGF, receptor de VEGF, HIF-1a, receptor del factor de crecimiento placentario y endoglina.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 proporciona una cadena liviana variable (Vl) 02-V k1-39 humanizada que tiene las CDR Vl TRC105 quiméricas murinas monoclonales (subrayadas) injertadas entre las regiones marco (FR) 1-3 de la secuencia humana 02 -Vk1-39 y un marco región 4 de la secuencia Jk4 humana (SEQ ID NO: 4) (todo en negrita). Las variaciones que se pueden hacer a los FR humanos se indican en las posiciones 1, 3, 4, 5, 36, 46, 47, 60, 70, 71, 100 y 106 de la secuencia (secuencia descrita en la SEQ ID NO: 86) utilizando el sistema de numeración Kabat (mostrado en cursiva debajo de la secuencia humanizada).
La Figura 2 proporciona una cadena pesada variable VH3-15 humanizada (Vh) que tiene los CDR TRC105 Vh quiméricos monoclonales murinos monoclonales murinos (subrayados) injertados entre las regiones marco (FR) 1-3 de la secuencia humana VH3-15 y una región marco 4 de la secuencia JH4 humana (SEQ ID NO: 42) (todo en negrita). Una o más variaciones que se pueden hacer a los FR humanos se indican en las posiciones 49, 76, 77, 78, 82a, 89, 94, 108, 109 y 113 de la secuencia (secuencia descrita en la SEQ ID NO: 87) utilizando el sistema de numeración Kabat (mostrado en cursiva debajo de la secuencia humanizada).
La Figura 3 proporciona un diagrama de la ruta de señalización de TGF-P/ALK5. La vía TGF-P/ALK5 (A) conduce a la inhibición de la proliferación y migración celular. La vía TGF-p/ALK1 (B) induce la proliferación y migración de células endoteliales y requiere CD105 (endoglina) para la señalización de ALK1. Las líneas punteadas indican vías inactivas o bloqueadas. La flecha en negrita indica la estimulación de una vía de señalización.
La Figura 4 proporciona una alineación de secuencia de aminoácidos de cadenas VK humanizadas y de ratón de ejemplo (SEQ ID NO: 1-5, respectivamente, en orden de aparición) y cadenas Vh (SEQ ID NO: 39-43, respectivamente, en orden de aparición) producidas como se describe en el presente documento.
La Figura 5 proporciona una alineación de secuencia de aminoácidos de cadenas de VK de ratón y superhumanizadas de ejemplo (SEQ ID NOS 1 y 69-72, respectivamente, en orden de aparición) y cadenas de Vh (SEQ ID NOS 39 y 73­ 75, respectivamente, en orden de aparición) producido como se describe en el presente documento.
La Figura 6 proporciona una alineación de secuencia de aminoácidos y una comparación de cadenas de VK de ratón y humanizadas y superhumanizadas de ejemplo (SEQ ID NO: 1, 3 y 70, respectivamente, en orden de aparición) y cadenas Vh (SEQ ID NO: 39, 41 y 74 , respectivamente, en orden de aparición) producidos como se describe en el presente documento.
La Figura 7 ilustra la unión de constructos variantes humanizados a endoglina en un ensayo ELISA de competición.
Figura 8. ELISA de competición anti-CD 105 con anticuerpos humanizados y humanizados/desinmunizados. Las concentraciones variables de cada anticuerpo se mezclaron con una concentración fija de anticuerpo anti-CD 105 de referencia biotinilado (6.25 ng/ml) y se unieron a CD105 (100 ng/ml) capturado en una placa Nunc MaxiSorp. La unión se detectó mediante estreptavidina-HRP y sustrato TMB. La absorbancia (OD) a 450 nm se midió en un lector de placas y se trazó frente a la concentración de anticuerpos de prueba.
La Figura 9 ilustra los datos de ensayo de unión para la variante VK1AAVH1A más los controles que contienen VK2.
La Figura 10 ilustra los datos de ensayo de unión para quiméricos en comparación con VK1AAVH1A2 y VK2AAVH1A2.
La Figura 11 ilustra los datos de ensayo de unión para quimérico en comparación con VK2AAVH1Q.
La Figura 12 ilustra los datos de ensayo de unión para quiméricos en comparación con VK2AAVH1R.
La Figura 13 ilustra los datos de ensayo de unión para quiméricos en comparación con VK1AAVH1A2.
La Figura 14 ilustra los datos de ensayo de unión para quimérico en comparación con VK1AAVH1Q.
La Figura 15 ilustra los datos de ensayo de unión para quimérico en comparación con VK1AAVH1R.
La Figura 16 ilustra los datos de ensayo de unión para quimérico en comparación con VK2AAVH1A2.
La Figura 17 ilustra la región variable de la cadena pesada desinmunizada humanizada candidatas con CDR en negrita y subrayada (secuencia descrita en SEQ ID NO: 89). Las variaciones que se pueden hacerse indican en las posiciones identificadas de la secuencia utilizando el sistema de numeración Kabat (secuencia descrita en la SEQ ID NO: 116) (mostrada en cursiva debajo de la secuencia humanizada). Las variaciones pueden hacerse como una sola mutación o como más de una mutación, y pueden hacerse variaciones con mutaciones en cualquier combinación.
La Figura 18 ilustra la región variable de la cadena liviana desinmunizada humanizada candidatas con CDR en negrita y subrayada (secuencia descrita en SEQ ID NO: 93). Las variaciones que se pueden hacerse indican en las posiciones identificadas de la secuencia utilizando el sistema de numeración Kabat (secuencia descrita en la SEQ ID NO: 117) (mostrada en cursiva debajo de la secuencia humanizada). Las variaciones pueden hacerse como una sola mutación o como más de una mutación, y pueden hacerse variaciones con mutaciones en cualquier combinación.
La figura 19 ilustra el análisis de las regiones de la cadena pesada (SEQ ID NO: 41) usando iTope™. Los péptidos que abarcan toda la secuencia se probaron como péptidos 9mero en incrementos de un aminoácido. La unión pronosticada de cada residuo como el ancla pi de un péptido núcleo 9mero a los alelos MHC de clase II se indica con una "O" si la puntuación de unión fue de 0.55-0.6 y con una "X" si la puntuación de unión fue >0.6. Las regiones que contienen péptidos potencialmente inmunogénicos se indican en la columna "iTope", el gris oscuro indica péptidos de unión a MHC de clase II de alta afinidad promiscuas, el gris claro indica péptidos de unión a MHC de clase II de afinidad moderada promiscuas. Los números de alelos MHC de clase II que se unen se muestran en las columnas "total" y "alta afinidad". Los residuos potenciales de anclaje pi identificados como secuencias de línea germinal se muestran en tipo inverso en la columna "Secuencia".
La Figura 20 ilustra el análisis de las regiones variantes de variantes de la cadena pesada (SEQ ID NO: 118) usando iTope™. Los péptidos que abarcan toda la secuencia se probaron como péptidos 9mero en incrementos de un aminoácido. La unión pronosticada de cada residuo como el ancla pi de un péptido núcleo 9mero a los alelos MHC de clase II se indica con una "O" si la puntuación de unión fue de 0.55-0.6 y con una "X" si la puntuación de unión fue >0.6. Las regiones que contienen péptidos potencialmente inmunogénicos se indican en la columna "iTope", el gris oscuro indica péptidos de unión a MHC de clase II de alta afinidad promiscuas, el gris claro indica péptidos de unión a MHC de clase II de afinidad moderada promiscuas. Los números de alelos de MHC de clase II que se unen se muestran en las columnas "total" y "alta afinidad" y se muestra la diferencia de unión. Los residuos potenciales de anclaje pi identificados como secuencias de línea germinal se muestran en tipo inverso en la columna "Secuencia" y las diferencias de aminoácidos en las variantes están encuadradas.
La Figura 21 ilustra el análisis de las regiones de la cadena liviana (SEQ ID NO: 3) usando iTope™. Los péptidos que abarcan toda la secuencia se probaron como péptidos 9mero en incrementos de un aminoácido. La unión pronosticada de cada residuo como el ancla pi de un péptido núcleo 9mero a los alelos MHC de clase II se indica con una "O" si la puntuación de unión fue de 0.55-0.6 y con una "X" si la puntuación de unión fue >0.6. Las regiones que contienen péptidos potencialmente inmunogénicos se indican en la columna "iTope", el gris oscuro indica péptidos de unión a MHC de clase II de alta afinidad promiscuas, el gris claro indica péptidos de unión a MHC de clase II de afinidad moderada promiscuas. Los números de alelos MHC de clase II que se unen se muestran en las columnas "total" y "alta afinidad". Los residuos potenciales de anclaje pi identificados como secuencias de línea germinal se muestran en tipo inverso en la columna "Secuencia".
La Figura 22 ilustra el análisis de las regiones variantes de la cadena liviana (SEQ ID NO: 101) usando iTope™. Los péptidos que abarcan toda la secuencia se probaron como péptidos 9mero en incrementos de un aminoácido. La unión pronosticada de cada residuo como el ancla pi de un péptido núcleo 9mero a los alelos MHC de clase II se indica con una "O" si la puntuación de unión fue de 0.55-0.6 y con una "X" si la puntuación de unión fue >0.6. Las regiones que contienen péptidos potencialmente inmunogénicos se indican en la columna "iTope", el gris oscuro indica péptidos de unión a m Hc de clase II de alta afinidad promiscuas, el gris claro indica péptidos de unión a MHC de clase II de afinidad moderada promiscuas. Los números de alelos de MHC de clase II que se unen se muestran en las columnas "total" y "alta afinidad" y se muestra la diferencia de unión. Los residuos potenciales de anclaje pi identificados como secuencias de línea germinal se muestran en tipo inverso en la columna "Secuencia" y las diferencias de aminoácidos en las variantes están encuadradas.
La Figura 23 ilustra la frecuencia de los alotipos MHC Clase II en la población mundial y la población de estudio.
Figura 24 El anticuerpo anti-endoglina quimérico, el anticuerpo anti-endoglina humanizado VK1VH1 y el anticuerpo anti-endoglina humanizado/inmunizado VK1AAVH1A2 se probaron en ensayos de células T de curso de tiempo EpiScreen™ usando PBMC de 20 donantes. Los cultivos a granel de PBMC incubados con anticuerpos de prueba se muestrearon los días 5, 6, 7 y 8 y se pulsaron con 3H-timidina. Se recolectaron las células y se midió la incorporación de radioactividad por recuento de centelleo. Los resultados para cada muestra por triplicado se promediaron y normalizaron por conversión al Índice de estimulación (SI). El SI para cada punto de tiempo con cada donante se muestra arriba para el anticuerpo quimérico TRC105 (Figura 24A), VK1VH1 (Figura 24B) y VK1AAVH1A2 (Figura 24C). El límite para determinar respuestas positivas con un SI>2 se resalta mediante la línea de puntos y se indican respuestas significativas (p<0.05 en la prueba t de Student) (*).
Descripción detallada de la invención
Debe entenderse que esta aplicación no se limita a formulaciones particulares o parámetros de proceso, ya que estos pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende ser limitante. Además, se entiende que se pueden usar varios métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica de la presente divulgación.
De acuerdo con la presente solicitud, se pueden empleartécnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Se han producido anticuerpos monoclonales murinos (mAb) contra la endoglina que modulan la actividad de la endoglina y, por lo tanto, inhiben la angiogénesis y/o inhiben la vasodilatación de los vasos sanguíneos pequeños. Estos anticuerpos murinos se describen en las patentes estadounidenses 5,928,641, 6,200,566, 6,190,660 y 7,097,836. Además, se ha demostrado la eficacia ex vivo e in vivo de varios de estos anticuerpos; estos anticuerpos monoclonales que se unen a la endoglina son de interés como compuestos moduladores de la endoglina. Sin embargo, el uso terapéutico de estos anticuerpos murinos no es factible, ya que su administración tiene una serie de limitaciones, incluida la inmunogenicidad en, por ejemplo, la forma de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA). Los anticuerpos humanizados se hacen para abordar estas reacciones.
Los anticuerpos humanizados que se unen a la endoglina se describen en el presente documento que exhiben inmunogenicidad reducida mientras mantienen y/o mejoran su especificidad. Además, para abordar los problemas asociados con los anticuerpos murinos, en el presente documento se describen anticuerpos humanizados que se unen a la endoglina y disminuyen y/o inhiben la angiogénesis que exhiben inmunogenicidad reducida mientras mantienen y/o mejoran su especificidad. Estos anticuerpos endoglínicos humanizados son útiles para el diagnóstico y tratamiento de diversas afecciones y enfermedades, así como para la purificación y detección de endoglina.
I. Anticuerpos anti-endoglina
En el presente documento se proporcionan anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a endoglina. La endoglina se puede encontrar en las células que comprenden y apoyan la vasculatura existente, así como en las células que promueven el crecimiento y se convierten en parte de la nueva vasculatura. Estos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno pueden unirse a la endoglina y por lo tanto inhibir la angiogénesis, inhibir la vasculatura existente o el mantenimiento de la vasculatura existente, y/o inhibir la dilatación de los vasos pequeños. En lo sucesivo, una referencia a los términos "anticuerpo" o "anticuerpos" debe considerarse que incluye cualquiera de los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento y los términos deben ser intercambiables cuando corresponda. Además de su uso para la purificación de endoglina, estos anticuerpos son útiles para fines de purificación, detección y diagnóstico, así como con fines terapéuticos. Los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden usarse para la formulación de medicamentos para el tratamiento de una variedad de afecciones y enfermedades, métodos para tratar dichas afecciones y enfermedades y métodos de detección o diagnóstico. Como se usa en este documento, la angiogénesis incluye el crecimiento y/o desarrollo de nuevos vasos sanguíneos (también denominado neovascularización), dilatación de los vasos pequeños, crecimiento vascular excesivo o prolongado y mantenimiento de la vasculatura existente. Las condiciones y enfermedades de angiogénesis se refieren a aquellas enfermedades y afecciones relacionadas, causadas o asociadas con la angiogénesis. Ejemplos no limitantes de tales enfermedades incluyen, por ejemplo, diversas formas de enfermedades oculares caracterizadas por angiogénesis/neovascularización (por ejemplo, degeneración macular, CNV, retinopatía diabética), nefropatía diabética, enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, EII), artritis reumatoide, osteoartritis y diversas formas de cáncer (tumores primarios y metástasis).
A. Terminología de anticuerpos
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina (Ig) ya sea natural o producida total o parcialmente de forma sintética. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que tenga un dominio de unión que sea, o sea homólogo a, un dominio de unión a antígeno. El término incluye además "fragmentos de unión a antígeno" y otros términos intercambiables para fragmentos de unión similares como se describe más adelante. Este término también contempla los anticuerpos injertados en la región determinante de complementariedad (CDR) y otros anticuerpos humanizados (incluidas las modificaciones CDR y las modificaciones de la región marco).
Los anticuerpos nativos y las inmunoglobulinas nativas son generalmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Daltons, compuestas de dos cadenas livianas (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena liviana está típicamente unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable ("Vh") seguido de una serie de dominios constantes ("Ch"). Cada cadena liviana tiene un dominio variable en un extremo ("Vl") y un dominio constante ("Cl") en el otro extremo; el dominio constante de la cadena liviana está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena liviana está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena liviana y pesada.
Los términos "polinucleótido sintético", "gen sintético" o "polipéptido sintético", como se usan en el presente documento, significan que la secuencia polinucleotídica correspondiente o parte de la misma, o la secuencia de aminoácidos o parte de la misma, se deriva de una secuencia que ha sido diseñada, o sintetizada de novo, o modificada, en comparación con una secuencia natural equivalente. Los polinucleótidos sintéticos (anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno) o genes sintéticos pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, la síntesis química de secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Los genes sintéticos son típicamente diferentes de los genes naturales, ya sea a nivel de aminoácidos o de polinucleótidos (o ambos) y se ubican típicamente dentro del contexto de secuencias de control de expresión sintéticas. Por ejemplo, las secuencias genéticas sintéticas pueden incluir secuencias de aminoácidos o polinucleótidos que han cambiado, por ejemplo, mediante el reemplazo, la eliminación o la adición de uno o más aminoácidos o nucleótidos, proporcionando así una secuencia de aminoácidos del anticuerpo, o una secuencia codificante de polinucleótidos que es diferente de la secuencia fuente. Las secuencias polinucleotídicas de genes sintéticos pueden no necesariamente codificar proteínas con diferentes aminoácidos, en comparación con el gen natural; por ejemplo, también pueden abarcar secuencias de polinucleótidos sintéticas que incorporan diferentes codones pero que codifican el mismo aminoácido (es decir, los cambios de nucleótidos representan mutaciones silenciosas a nivel de aminoácidos).
Con respecto a los anticuerpos, el término "dominio variable" se refiere a los dominios variables de anticuerpos que se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente en todos los dominios variables de los anticuerpos. Más bien, se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables (también conocidas como CDR) en los dominios variables de la cadena liviana y de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan "regiones marco" o "FR". Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras no modificadas contienen cada uno cuatro FR (FR1, FR2, FR3 y FR4), adoptando en gran medida una configuración de hoja p intercalada con tres CDR que forman bucles de conexión y, en algunos casos, parte de la hoja p estructura. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), páginas 647-669).
Los términos "región hipervariable" y "CDR" cuando se usan en el presente documento, se refieren a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. Las CDR comprenden residuos de aminoácidos de tres regiones de secuencia que se unen de manera complementaria a un antígeno y se conocen como CDR1, CDR2 y CDR3 para cada una de las cadenas Vh y Vl. En el dominio variable de la cadena liviana, las CDR típicamente corresponden a aproximadamente los residuos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) y 89-97 (CDRL3), y en el dominio variable de la cadena pesada las CDR típicamente corresponden a aproximadamente los residuos 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) y 95-102 (CDRH3) según Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Se entiende que las CDR de diferentes anticuerpos pueden contener inserciones, por lo tanto, la numeración de aminoácidos puede diferir. El sistema de numeración de Kabat da cuenta de tales inserciones con un esquema de numeración que utiliza letras unidas a residuos específicos (por ejemplo, 27A, 27B, 27C, 27D, 27E y 27F de CDRL1 en la cadena liviana) para reflejar cualquier inserción en la numeración entre diferentes anticuerpos. Alternativamente, en el dominio variable de la cadena liviana, las CDR típicamente corresponden a aproximadamente los residuos 26-32 (CDRL1), 50-52 (CDRL2) y 91-96 (CDRL3), y en el dominio variable de la cadena pesada, las CDR típicamente corresponden a aproximadamente residuos 26-32 (CDRH1), 53-55 (CDRH2) y 96-101 (CDRH3) según Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)).
Como se usa en este documento, "región marco" o "FR" se refiere a residuos de aminoácidos marco que forman parte de la cavidad o ranura de unión a antígeno. En algunas realizaciones, los residuos marco forman un bucle que es parte de la cavidad o ranura de unión al antígeno y los residuos de aminoácidos en el bucle pueden o no contactar con el antígeno. Las regiones marco generalmente comprenden las regiones entre los CDR. En el dominio variable de la cadena liviana, los FR típicamente corresponden a aproximadamente los residuos 0-23 (FRL1), 35-49 (FRL2), 57­ 88 (FRL3) y 98-109 y en el dominio variable de la cadena pesada los FR típicamente corresponden aproximadamente a los residuos 0-30 (FRH1), 36-49 (FRH2), 66-94 (FRh 3) y 103-133 según Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)). Como se discutió anteriormente con la numeración de Kabat para la cadena liviana, la cadena pesada también representa las inserciones de manera similar (por ejemplo, 35A, 35B de CDRH1 en la cadena pesada). Alternativamente, en el dominio variable de la cadena liviana, los Fr típicamente corresponden a aproximadamente los residuos 0-25 (FRL1), 33-49 (FRL2) 53-90 (FRL3) y 97-109 (FRL4), y en la variable de la cadena pesada dominio, los FR típicamente corresponden a aproximadamente los residuos 0-25 (FRH1), 33-52 (FRH2), 56-95 (FRH3) y 102-113 (FRH4) de acuerdo con Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)).
Los aminoácidos del bucle de un FR pueden evaluarse y determinarse mediante inspección de la estructura tridimensional de una cadena pesada de anticuerpo y/o cadena liviana de anticuerpo. La estructura tridimensional se puede analizar para determinar las posiciones de aminoácidos accesibles a los disolventes, ya que es probable que tales posiciones formen un bucle y/o proporcionen contacto con el antígeno en un dominio variable de anticuerpo. Algunas de las posiciones accesibles con solventes pueden tolerar la diversidad de secuencias de aminoácidos y otras (por ejemplo, posiciones estructurales) son, en general, menos diversificadas. La estructura tridimensional del dominio variable del anticuerpo puede derivarse de una estructura cristalina o de un modelado de proteínas.
Los dominios constantes (Fc) de los anticuerpos no están involucrados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que exhiben diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos a través de interacciones con, por ejemplo, receptores Fc (FcR). Los dominios Fc también pueden aumentar la biodisponibilidad de un anticuerpo en circulación después de la administración a un paciente.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada (Fc) que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, £, y y M, respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
Las "cadenas livianas" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa o ("k" o "K") y lambda o ("A"), con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Los términos "porción de unión a antígeno de un anticuerpo", "fragmento de unión a antígeno", "dominio de unión a antígeno", "fragmento de anticuerpo" o "fragmento funcional de un anticuerpo" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Ejemplos no limitantes de fragmentos de anticuerpos incluidos dentro de dichos términos incluyen, pero no se limitan a, (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Crn; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que contiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1 (iv) un fragmento Fv que contiene los dominios Vl y Vh de un solo variante de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544546), que contiene un dominio Vh; y (vi) una CDR aislada. Además, se incluyen en esta definición los "anticuerpos a la mitad" que comprenden una cadena pesada simple y una cadena liviana simple. Otras formas de anticuerpos de cadena simple, tales como los diacuerpos, también se abarcan aquí.
Las unidades estructurales "F(ab')2" y "Fab" pueden producirse tratando una Ig con una proteasa tal como pepsina y papaína, e incluyen fragmentos de anticuerpos generados al digerir inmunoglobulina cerca de los enlaces disulfuro existentes entre las regiones de bisagra en cada una de las dos cadenas pesadas. Por ejemplo, la papaína escinde la IgG corriente arriba de los enlaces disulfuro existentes entre las regiones de bisagra en cada una de las dos cadenas pesadas para generar dos fragmentos de anticuerpos homólogos en los que una cadena liviana compuesta de Vl y Cl (región constante de la cadena liviana) y un fragmento de cadena pesada compuesto por la región Vh y ChY1 (y1) en la región constante de la cadena pesada) está conectado en sus regiones terminales C a través de un enlace disulfuro. Cada uno de estos dos fragmentos de anticuerpos homólogos se llama Fab'. La pepsina también escinde la IgG corriente abajo de los enlaces disulfuro existentes entre las regiones de la bisagra en cada una de las dos cadenas pesadas para generar un fragmento de anticuerpo ligeramente más grande que el fragmento en donde los dos Fab' mencionados anteriormente están conectados en la región de la bisagra. Este fragmento de anticuerpo se llama F(ab')2.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena liviana y el primer dominio constante (Ch1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo del dominio Ch1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteína(s) de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en la que los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
"Fv" se refiere a un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y cadena liviana en asociación estrecha, no covalente o covalente (los Fv unidos por disulfuro se han descrito en la técnica, Reiter et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 1239-1245). Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero Vh-Vl. Colectivamente, una combinación de una o más de las CDR de cada una de las cadenas Vh y Vl confiere especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Por ejemplo, se entendería que, por ejemplo, CDRH3 y CDRL3 podrían ser suficientes para conferir especificidad de unión a antígeno a un anticuerpo cuando se transfieren a cadenas Vh y Vl de un anticuerpo receptor o fragmento de unión a antígeno del mismo y esta combinación de CDR puede probarse para unión, afinidad, etc., usando cualquiera de las técnicas descritas en este documento. Incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque probablemente con una afinidad menor que cuando se combina con un segundo dominio variable. Además, aunque los dos dominios de un fragmento Fv (Vl y Vh) están codificados por genes separados, se pueden unir mediante métodos recombinantes mediante un conector sintético que les permite formarse como una cadena de proteínas única en la que el Vl y las regiones Vh se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 y Osbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16: 778). Tales scFvtambién están destinados a estar incluidos en el término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Cualquier secuencia Vh y Vl de scFv específico puede unirse a un ADNc de la región Fc o secuencias genómicas, para generar vectores de expresión que codifiquen moléculas completas de Ig (por ejemplo, IgG) u otros isotipos. Vh y Vl también pueden usarse en la generación de Fab, Fv u otros fragmentos de Igs usando química de proteínas o tecnología de ADN recombinante.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "sFv" comprenden los dominios Vh y Vl de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica única. En algunas realizaciones, el polipéptido Fv comprende además un conector de polipéptido entre los dominios Vh y Vl que permite que sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de sFvs, Véase, por ejemplo, Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, eds. Rosenburg andy Moore. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).
El término "AVIMER™" se refiere a una clase de proteínas terapéuticas de origen humano, que no están relacionadas con anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, y están compuestas por varios dominios de unión modulares y reutilizables, denominados dominios A (también denominados como módulo de clase A, repetición de tipo de complemento o dominio de clase A del receptor de LDL). Se desarrollaron a partir de dominios de receptores extracelulares humanos mediante la combinación aleatoria de exones in vitro y la presentación de fagos (Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23: 1493-1494; Silverman et al., 2006, Nat. Biotechnol. 24: 220). Las proteínas resultantes pueden contener múltiples dominios de unión independientes que pueden exhibir una afinidad mejorada (en algunos casos, sub-nanomolar) y especificidad en comparación con las proteínas de unión de un solo epítopo. Véase, por ejemplo, las solicitudes de patente de los Estados Unidos. Publ. Nos. 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0053973 y 2005/0089932, 2005/0048512 y 2004/0175756.
Cada uno de los 217 dominios A humanos conocidos comprende ~35 aminoácidos (~4 kDa); y estos dominios están separados por enlaces que promedian cinco aminoácidos de longitud. Los dominios A nativos se pliegan rápida y eficientemente a una estructura uniforme y estable mediada principalmente por la unión de calcio y la formación de disulfuro. Se requiere un motivo de andamio conservado de solo 12 aminoácidos para esta estructura común. El resultado final es una cadena de proteínas única que contiene múltiples dominios, cada uno de los cuales representa una función separada. Cada dominio de las proteínas se une independientemente y las contribuciones energéticas de cada dominio son aditivas. Estas proteínas se llamaron "AVIMER™" de multímeros de avidez.
El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena liviana en la misma cadena de polipéptidos (Vh-Vl). Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 6448 (1993).
Los polipéptidos de unión a antígeno también incluyen dímeros de cadena pesada tales como, por ejemplo, anticuerpos de camélidos y tiburones. Los anticuerpos de camélidos y tiburones comprenden un par homodimérico de dos cadenas de dominios tipo V y tipo C (ninguno tiene una cadena liviana). Dado que la región Vh de un dímero de cadena pesada IgG en un camélido no tiene que hacer interacciones hidrófobas con una cadena liviana, la región en la cadena pesada que normalmente entra en contacto con una cadena liviana se transforma en residuos de aminoácidos hidrófilos en un camélido. Los dominios Vh de las IgG de dímero de cadena pesada se denominan dominios Vhh. Los Shark Ig-NAR comprenden un homodímero de un dominio variable (denominado dominio V-NAR) y cinco dominios constantes de tipo C (dominios C-NAR). En los camélidos, la diversidad del repertorio de anticuerpos está determinada por las CDR 1, 2 y 3 en las regiones Vh o Vhh. El CDR3 en la región Vhh de camello se caracteriza por su longitud relativamente larga, con un promedio de 16 aminoácidos (Muyldermans et al., 1994, Protein Engineering 7 (9): 1129). Esto está en contraste con las regiones CDR3 de anticuerpos de muchas otras especies. Por ejemplo, el CDR3 de Vh de ratón tiene un promedio de 9 aminoácidos. Las bibliotecas de regiones variables de anticuerpos derivadas de camélidos, que mantienen la diversidad in vivo de las regiones variables de un camélido, se pueden hacer, por ejemplo, mediante los métodos descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No.
20050037421.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) incluyen anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una Ig no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son Igs humanos (anticuerpo receptor) en los que una o más de las CDR del receptor se reemplazan por CDR de un anticuerpo de especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y función de unión deseadas. En algunos casos, uno o más residuos de aminoácidos FR de la Ig humana se reemplazan por los residuos de aminoácidos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden contener residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se pueden hacer para refinar el rendimiento del anticuerpo, si es necesario. Un anticuerpo humanizado puede comprender sustancialmente todos al menos uno y, en algunos casos, dos dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también puede incluir al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles, véase Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Estructura Biol. 2: 593-596 (1992).
Un anticuerpo humanizado también incluye anticuerpos en los que parte, o todas las CDR de la cadena pesada y ligera se derivan de un anticuerpo monoclonal no humano, sustancialmente todas las porciones restantes de las regiones variables se derivan de la región variable humana ( cadena pesada y ligera), y las regiones constantes se derivan de una región constante humana. En una realización, las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de las cadenas pesada y ligera se derivan de un anticuerpo no humano. En otra realización más, al menos una CDR (por ejemplo, una CDR3) de las cadenas pesada y ligera se deriva de un anticuerpo no humano. Varias combinaciones de CDR1, CDR2 y CDR3 pueden derivarse de un anticuerpo no humano y se contemplan aquí. En un ejemplo no limitante, una o más de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cada una de las cadenas pesadas y ligeras se derivan de un clon de anticuerpo monoclonal quimérico murino TRC105.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que pueden incluir diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), o pueden elaborarse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No.
4,816,567). En ciertas realizaciones, los anticuerpos monoclonales pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fago usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos pueden aislarse y purificarse a partir del sobrenadante de cultivo o ascitis mencionados anteriormente mediante precipitación con sulfato de amonio saturado, método de precipitación con euglobulina, método de ácido caproico, método de ácido caprílico, cromatografía de intercambio iónico (DEAE o DE52), o cromatografía de afinidad usando una columna anti-Ig o una columna de proteína A, G o L como se describe con más detalle más adelante.
Los anticuerpos de ejemplo para su uso en las composiciones y métodos descritos en el presente documento son moléculas de inmunoglobulina intactas, tales como, por ejemplo, un anticuerpo humanizado o aquellas porciones de una molécula de Ig humanizada que contienen el sitio de unión al antígeno (es decir, paratope) o un solo cadena pesada y una sola cadena liviana, incluidas aquellas porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab', F(ab)', F(ab')2 , Fd, scFv, un dominio pesado variable, un dominio ligero variable, una variable Dominio NAR, scFv bi-específico, un Fab2 bi-específico, un Fab3 tri-específico y polipéptidos de unión de cadena única y otros también denominados fragmentos de unión a antígeno. Cuando se construye una molécula de inmunoglobulina o fragmentos de la misma, las regiones variables o porciones de la misma pueden fusionarse, conectarse o unirse a una o más regiones constantes o porciones de la misma para producir cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de los mismos descritos en este documento. Esto se puede lograr de varias maneras conocidas en la técnica, incluidas, entre otras, técnicas de clonación molecular o síntesis directa de los ácidos nucleicos que codifican las moléculas. También se pueden encontrar ejemplos de métodos no limitantes de construcción de estas moléculas en los ejemplos descritos aquí.
En una realización a modo de ejemplo, la aplicación contempla un polipéptido de unión de cadena única que tiene una región variable de cadena pesada, y una región variable de cadena liviana que se une a endoglina y tiene, opcionalmente, una región Fc de inmunoglobulina. En una realización a modo de ejemplo, la aplicación contempla un polipéptido de unión de cadena única que tiene una región variable de cadena pesada, y una región variable de cadena liviana que se une a endoglina e inhibe la angiogénesis y tiene, opcionalmente, una región Fc de inmunoglobulina. Dicha molécula es un fragmento variable de cadena sencilla que tiene opcionalmente función efectora o una vida media incrementada a través de la presencia de la región Fc de inmunoglobulina. Los métodos para preparar polipéptidos de unión de cadena única son conocidos en la técnica (por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2005/0238646).
Los términos "segmentos de genes de la línea germinal" o "secuencias de la línea germinal" se refieren a los genes de la línea germinal (los gametos haploides y las células diploides de las que se forman). El ADN de la línea germinal contiene múltiples segmentos de genes que codifican una sola cadena pesada o ligera de Ig. Estos segmentos de genes se transportan en las células germinales, pero no se pueden transcribir y traducir en cadenas pesadas y ligeras hasta que se organizan en genes funcionales. Durante la diferenciación de células B en la médula ósea, estos segmentos genéticos se mezclan aleatoriamente mediante un sistema genético dinámico capaz de generar más de 108 especificidades. La mayoría de estos segmentos de genes son publicados y recopilados por la base de datos de línea germinal.
Como se usa en el presente documento, "inmunorreactivo" se refiere a agentes de unión, anticuerpos o fragmentos de los mismos que son específicos de una secuencia de residuos de aminoácidos ("sitio de unión" o "epítopo"), pero si son reactivos cruzados con otros péptidos/proteínas, no son tóxicas a los niveles en los que están formuladas para la administración al uso humano. El término "unión" se refiere a una asociación directa entre dos moléculas, debido, por ejemplo, a interacciones covalentes, electrostáticas, hidrófobas, iónicas y/o de enlace de hidrógeno en condiciones fisiológicas, e incluye interacciones tales como puentes de sal y puentes de agua y cualquier otro medio de unión convencional. El término "se une preferentemente" significa que el agente de unión se une al sitio de unión con mayor afinidad que a las secuencias de aminoácidos no relacionadas. Preferiblemente, dicha afinidad es al menos 1 veces mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 6 veces mayor, al menos 7 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 9 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 20 veces mayor, al menos 30 veces mayor, al menos 40 veces mayor, al menos 50 veces mayor, al menos 60 veces mayor, al menos 70 veces mayor, al menos 80 veces mayor, al menos 90 veces mayor, al menos 100 veces mayor o al menos 1000 veces mayor que la afinidad del agente aglutinante por secuencias de aminoácidos no relacionadas. Los términos "inmunorreactivo" y "se une preferentemente" se usan indistintamente en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la constante de equilibrio para la unión reversible de dos agentes y se expresa como Kd. La afinidad de una proteína de unión a un ligando tal como la afinidad de un anticuerpo por un epítopo puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nanomolar(nM) a aproximadamente 0.1 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 picomolar (pM), o de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 femtomolar (fM). Como se usa en el presente documento, el término "avidez" se refiere a la resistencia de un complejo de dos o más agentes a la disociación después de la dilución. Las afinidades aparentes pueden determinarse mediante métodos tales como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o cualquier otra técnica familiar para un experto en la materia. La avidez se pueden determinar por métodos tales como un análisis de Scatchard o cualquier otra técnica familiar para un experto en la materia.
"Epítopo" se refiere a esa porción de un antígeno u otra macromolécula capaz de formar una interacción de unión con el bolsillo de unión de región variable de un anticuerpo. Dichas interacciones de unión pueden manifestarse como un contacto intermolecular con uno o más residuos de aminoácidos de una o más CDR. La unión al antígeno puede implicar, por ejemplo, un par CDR3 o CDR3 o, en algunos casos, interacciones de hasta las seis CDR de las cadenas Vh y Vl. Un epítopo puede ser una secuencia peptídica lineal (es decir, "continua") o puede estar compuesta de secuencias de aminoácidos no contiguas (es decir, "conformacional" o "discontinua"). Un anticuerpo puede reconocer una o más secuencias de aminoácidos; por lo tanto, un epítopo puede definir más de una secuencia de aminoácidos distinta. Los epítopos reconocidos por los anticuerpos pueden determinarse mediante mapeo de péptidos y técnicas de análisis de secuencia bien conocidas por un experto en la materia. Las interacciones de unión se manifiestan como contactos intermoleculares con uno o más residuos de aminoácidos de una CDR. TRC105 es un anticuerpo quimérico que es la misma secuencia de aminoácidos variable que el anticuerpo murino descrito como Y4-2F1 o SN6j en las Patentes Estadounidenses números 5,928,641; 6,200,566; 6,190,660; y 7,097,836. Los epítopos reconocidos por Y4-2F1 y SN6j, y por lo tanto TRC105, han sido previamente identificados.
El término "específico" se refiere a una situación en la que un anticuerpo no mostrará ninguna unión significativa a moléculas distintas del antígeno que contiene el epítopo reconocido por el anticuerpo. El término también es aplicable cuando, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno es específico para un epítopo particular que es transportado por varios antígenos, en cuyo caso el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que lleva el dominio de unión a antígeno podrá unirse a los diversos antígenos que llevan el epítopo. Los términos "se une preferentemente" o "se une específicamente" significa que los anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen a un epítopo con mayor afinidad que a las secuencias de aminoácidos no relacionadas y, si son reactivos cruzados a otros polipéptidos que contienen el epítopo, no son tóxicos en los niveles a los cuales están formulados para la administración al uso humano. En un aspecto, dicha afinidad es al menos 1 vez mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 6 veces mayor, al menos al menos 7 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 9 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 20 veces mayor, al menos 30 veces mayor, al menos 40 veces mayor, al menos 50 veces mayor, al menos 60 veces mayor, al menos 70 veces mayor, al menos 80 veces mayor, al menos 90 veces mayor, al menos 100 veces mayor o al menos 1000 veces mayor que la afinidad del anticuerpo o fragmento del mismo para secuencias de aminoácidos no relacionadas. Los términos "inmunorreactivo", "se une", "se une preferentemente" y "se une específicamente" se usan indistintamente en el presente documento. El término "unión" se refiere a una asociación directa entre dos moléculas, debido, por ejemplo, a interacciones covalentes, electrostáticas, hidrófobas y iónicas y/o de enlace de hidrógeno en condiciones fisiológicas, e incluye interacciones tales como puentes de sal y puentes de agua, así como cualquier otro medio convencional de unión.
La expresión "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere a la agrupación de aminoácidos en base a ciertas propiedades comunes. Una forma funcional de definir propiedades comunes entre aminoácidos individuales es analizar las frecuencias normalizadas de los cambios de aminoácidos entre las proteínas correspondientes de organismos homólogos (Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Según dichos análisis, se pueden definir grupos de aminoácidos en los que los aminoácidos dentro de un grupo se intercambian preferentemente entre sí y, por lo tanto, se parecen más en su impacto en la estructura proteica general (Schulz, G.E. and R.H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Ejemplos de grupos de aminoácidos definidos de esta manera incluyen:
(i) un grupo cargado, que consiste en Glu y Asp, Lys, Arg y His,
(ii) un grupo cargado positivamente, que consiste en Lys, Arg y His,
(iii) un grupo cargado negativamente, que consiste en Glu y Asp,
(iv) un grupo aromático, que consiste en Phe, Tyr y Trp,
(v) un grupo de anillo de nitrógeno, que consiste en His y Trp,
(vi) un gran grupo alifático no polar, que consiste en Val, Leu e Ile,
(vii) un grupo ligeramente polar, que consiste en Met y Cys,
(viii) un grupo de residuos pequeños, que consiste en Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln y Pro,
(ix) un grupo alifático que consiste en Val, Leu, Ile, Met y Cys, y
(x) un pequeño grupo hidroxilo que consiste en Ser y Thr.
Además de los grupos presentados anteriormente, cada residuo de aminoácido puede formar su propio grupo, y puede hacerse referencia al grupo formado por un aminoácido individual simplemente por la abreviatura de una y/o tres letras para ese aminoácido, comúnmente utilizada en la técnica como se describe anteriormente.
Un "residuo conservado" es un aminoácido que es relativamente invariable en un rango de proteínas similares. A menudo, los residuos conservados variarán solo al ser reemplazados por un aminoácido similar, como se describió anteriormente para la "sustitución conservadora de aminoácidos".
La letra "x" o "xaa" tal como se usa en las secuencias de aminoácidos del presente documento pretende indicar que cualquiera de los veinte aminoácidos estándar puede colocarse en esta posición a menos que se indique específicamente lo contrario. A los fines del diseño peptidomimético, una "x" o una "xaa" en una secuencia de aminoácidos puede reemplazarse por un imitador del aminoácido presente en la secuencia diana, o el aminoácido puede reemplazarse por un espaciador de esencialmente cualquier forma que no interfiere con la actividad del peptidomimético.
"Homología" o "identidad" o "similitud" se refiere a la similitud de secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. La homología y la identidad pueden determinarse comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse para fines de comparación. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas está ocupada por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición; cuando el sitio equivalente está ocupado por el mismo o un residuo de aminoácido similar (por ejemplo, similar en naturaleza estérica y/o electrónica), entonces las moléculas pueden denominarse homólogas (similares) en esa posición. La expresión como porcentaje de homología/similitud o identidad se refiere a una función del número de aminoácidos idénticos o similares en las posiciones compartidas por las secuencias comparadas. Una secuencia que es "no relacionada" o "no homóloga" comparte menos del 40% de identidad, aunque preferiblemente menos del 25% de identidad con una secuencia de la presente invención. Al comparar dos secuencias, la ausencia de residuos (aminoácidos o ácidos nucleicos) o la presencia de residuos adicionales también disminuye la identidad y la homología/similitud.
El término "homología" describe una comparación matemáticamente basada en similitudes de secuencia que se usa para identificar genes o proteínas con funciones o motivos similares. Las secuencias de ácido nucleico (nucleótido, oligonucleótido) y aminoácido (proteína) de la presente invención pueden usarse como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar a otros miembros de la familia, secuencias relacionadas u homólogos. Dichas búsquedas se pueden realizar utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación=100, longitud de palabra=12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de aminoácidos BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación=50, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineaciones separadas para fines de comparación, Gapted BLAST se puede utilizar como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res.
25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y BLAST) (véase, www.ncbi.nlm.nih.gov).
Como se usa en este documento, "identidad" significa el porcentaje de residuos de nucleótidos o aminoácidos idénticos en las posiciones correspondientes en dos o más secuencias cuando las secuencias están alineadas para maximizar la coincidencia de secuencias, es decir, teniendo en cuenta huecos e inserciones. La identidad se puede calcular fácilmente mediante métodos conocidos, incluidos, entre otros, los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos para determinar la identidad están diseñados para dar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Además, los métodos para determinar la identidad se codifican en programas informáticos disponibles al público. Los métodos de los programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete del programa GCG (Devereux, J., et a l., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) y Altschul etal. Nuc. Acidos Res. 25: 3389-3402 (1997)). El programa BLAST X está disponible públicamente en Nc Bi y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., n Cb I NlM NIH Bethesda, Md.
20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215 : 403-410 (1990). El conocido algoritmo Smith Waterman también puede usarse para determinar la identidad.
"Aislado" (usado indistintamente con "sustancialmente puro") cuando se aplica a polipéptidos significa un polipéptido o una porción del mismo que, en virtud de su origen o manipulación: (i) está presente en una célula huésped como producto de expresión de una porción de un vector de expresión; o (ii) está vinculado a una proteína u otra unidad estructural química distinta de aquel al que está vinculado en la naturaleza; o (iii) no se produce en la naturaleza, por ejemplo, una proteína que se manipula químicamente al agregar o agregar al menos una unidad estructural hidrófoba a la proteína para que la proteína esté en una forma no encontrada en la naturaleza. Por "aislado" se entiende además una proteína que: (i) se sintetiza químicamente; o (ii) expresado en una célula huésped y purificado lejos de proteínas asociadas y contaminantes. El término generalmente significa un polipéptido que se ha separado de otras proteínas y ácidos nucleicos con los que ocurre naturalmente. Preferiblemente, el polipéptido también se separa de sustancias tales como anticuerpos o matrices de gel (poliacrilamida) que se usan para purificarlo.
Como se usa en el presente documento, los términos "inhibidor de la angiogénesis", o "inhibición de la angiogénesis" o "antiangiogénico" incluyen vasculogénesis y pretenden significar una disminución en la extensión, cantidad o tasa de neovascularización. Efectuar una disminución en la extensión, cantidad o tasa de proliferación o migración de células endoteliales en el tejido es un ejemplo específico de inhibición de la angiogénesis.
El término "composición inhibidora de la angiogénesis" se refiere a una composición que inhibe procesos mediados por la angiogénesis tales como la migración de células endoteliales, la proliferación, la formación de tubos y posteriormente conduce a la inhibición de la generación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los existentes, y en concordancia afecta condiciones dependientes de angiogénesis.
Como se usa en el presente documento, el término "afección dependiente de angiogénesis" pretende significar una afección en la que el proceso de angiogénesis o vasculogénesis sostiene o aumenta una afección patológica o influye beneficiosamente en procesos fisiológicos normales. Por lo tanto, el tratamiento de una afección dependiente de la angiogénesis en la que la angiogénesis sostiene una afección patológica podría dar lugar a la mitigación de la enfermedad, mientras que el tratamiento de una afección dependiente de la angiogénesis en la que la angiogénesis influye beneficiosamente en los procesos fisiológicos normales podría dar como resultado, por ejemplo, la mejora de un proceso normal.
La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de capilares preexistentes o vénulas postcapilares. La vasculogénesis es el resultado de la formación de nuevos vasos sanguíneos que surgen de los angioblastos que son precursores de células endoteliales. Ambos procesos dan como resultado la formación de nuevos vasos sanguíneos y se incluyen en el significado del término condiciones dependientes de la angiogénesis. El término "angiogénesis", como se usa en el presente documento, pretende incluir la formación de novo de vasos tales como los que surgen de la vasculogénesis, así como los que surgen de la ramificación y brote de vasos, capilares y vénulas existentes. La angiogénesis también puede incluir la inducción de la señalización ALK1 y la fosforilación y/o señalización Smad 1/5/8 relacionada. También se sabe que CD105 está implicado en la ruta de señalización de ALK1 y, por lo tanto, también se incluye dentro del significado de angiogénesis.
"Inducir una respuesta inmune del huésped" significa que un paciente experimenta alivio o reducción de signos o síntomas de enfermedad, e incluye específicamente, sin limitación, la prolongación de la supervivencia. En ciertos ejemplos preferidos de los métodos descritos aquí, una célula T productora de IFN-y CD8+ se activa para inducir una respuesta inmune de linfocitos T citotóxicos (CTL) en el paciente al que se le administró el antagonista. En ciertos ejemplos de los métodos descritos en el presente documento, se activa una célula T productora de IFN-y CD4+ para inducir una respuesta inmune de células T auxiliares en el paciente administrado con la composición. Estas células T productoras de IFN-y CD4+ activadas (es decir, células T auxiliares) proporcionan la ayuda inmunológica necesaria (por ejemplo, mediante la liberación de citoquinas) para inducir y mantener no solo CTL, sino también una respuesta inmune humoral mediada por células B. Por lo tanto, en ciertos ejemplos de los métodos descritos en este documento, se activa una respuesta humoral al antígeno en el paciente administrado con la composición. En un aspecto, se puede agregar un adyuvante a la composición para aumentar una respuesta inmune. Los adyuvantes son bien conocidos en la técnica.
La activación de las células T CD8+ y/o CD4+ significa que las células T que tienen la capacidad de producir citoquinas (por ejemplo, IFN-y) realmente producen una o más citoquinas, o aumentar su producción de una o más más citoquina(s). "Inducción de la respuesta CTL" significa que los linfocitos T potencialmente citotóxicos exhiben citotoxicidad específica de antígeno. "Citotoxicidad específica de antígeno" significa citotoxicidad contra una célula que presenta un antígeno asociado con el antígeno asociado con el cáncer que es mayor que un antígeno que no está asociado con un cáncer. "Citotoxicidad" se refiere a la capacidad del linfocito T citotóxico para matar una célula diana. Dicha citotoxicidad específica de antígeno puede ser al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 10 veces mayor, al menos aproximadamente 100 veces mayor o más que la citotoxicidad contra una célula que no presenta el antígeno no asociado con el cáncer. La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) también incluye la activación de células asesinas naturales ("células NK") que median la muerte celular a través de la unión de anticuerpos. Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden mediar ADCC a través de células NK a través de la unión de endoglina.
Como se usa en el presente documento, los términos "trastorno proliferativo" y "afección proliferativa" significan cualquier afección fisiológica patológica o no patológica caracterizada por una proliferación aberrante o indeseable. Los términos "trastorno de proliferación celular" y "condición de proliferación celular" significan cualquier condición fisiológica patológica o no patológica caracterizada por una proliferación celular aberrante o indeseable, así como también condiciones caracterizadas por una proliferación o supervivencia celular indeseable o no deseada (por ejemplo, debido a apoptosis deficiente), afecciones caracterizadas por apoptosis deficiente o aberrante o deficiente, así como afecciones caracterizadas por supervivencia celular aberrante o indeseable o no deseada. El término "trastorno diferenciador" significa cualquier condición fisiológica patológica o no patológica caracterizada por diferenciación aberrante o deficiente.
Los trastornos proliferativos o diferenciales susceptibles de tratamiento incluyen enfermedades y afecciones fisiológicas no patológicas, benignas y neoplásicas, caracterizadas por números celulares, crecimiento celular o supervivencia celular anormales o indeseables. Tales trastornos o afecciones pueden, por lo tanto, constituir un estado de enfermedad e incluir todo tipo de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos malformados, o pueden ser no patológicos, es decir, una desviación de lo normal pero que no está típicamente asociada con una enfermedad. Un ejemplo específico de una afección no patológica que puede tratarse de acuerdo con la invención es el nuevo crecimiento de tejido a partir de la reparación de heridas que da como resultado la cicatrización.
Las células que comprenden el trastorno proliferativo o diferenciador pueden agregarse en una masa celular o dispersarse. El término "tumor sólido" se refiere a neoplasias o metástasis que típicamente se unen y forman una masa. Ejemplos particulares incluyen tumores viscerales tales como cáncer gástrico o de colon, hepatomas, carcinomas venosos, tumores/cánceres de pulmón y cerebro. Un "tumor no sólido" se refiere a neoplasias del sistema hematopoyético, como linfomas, mielomas y leucemias, o neoplasias de naturaleza difusa, ya que generalmente no forman una masa sólida. Ejemplos particulares de leucemias incluyen, por ejemplo, linfoblástica aguda y crónica, mieloblástica y mieloma múltiple.
Dichos trastornos incluyen neoplasias o cánceres, que pueden afectar prácticamente cualquier tipo de célula o tejido, por ejemplo, carcinoma, sarcoma, melanoma, trastornos metastásicos o trastornos neoplásicos hematopoyéticos. Un tumor metastásico puede surgir de una multitud de tipos de tumores primarios, que incluyen, entre otros, mama, pulmón, tiroides, cabeza y cuello, cerebro, linfoide, gastrointestinal (boca, esófago, estómago, intestino delgado, colon, recto), tracto genito-urinario (útero, ovario, cuello uterino, vejiga, testículo, pene, próstata), riñón, páncreas, hígado, hueso, músculo, piel, etc.
Los carcinomas se refieren a tumores malignos de tejido epitelial o endocrino, e incluyen carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas testiculares, carcinomas de mama, carcinomas prostáticos, carcinomas del sistema endocrino y melanomas. Carcinomas de ejemplo incluyen los que se forman a partir del cuello uterino, pulmón, próstata, mama, cabeza y cuello, colon, hígado y ovario. El término también incluye carcinosarcomas, por ejemplo, que incluyen tumores malignos compuestos de tejidos carcinomatosos y sarcomatosos. El adenocarcinoma incluye un carcinoma de tejido glandular, o en el cual el tumor forma una estructura similar a una glándula.
Un tejido ocular por tratar es, por ejemplo, un tejido de retina de un paciente con retinopatía diabética, degeneración macular o glaucoma neovascular y la angiogénesis a inhibir es la angiogénesis del tejido de retina donde hay neovascularización del tejido de retina.
Un tejido canceroso a tratar es, por ejemplo, un tejido endotelial que expresa un nivel anormal de endoglina. Como se usa en el presente documento, el término "células transformadas" se refiere a células que se han convertido espontáneamente a un estado de crecimiento sin restricciones, es decir, han adquirido la capacidad de crecer a través de un número indefinido de divisiones en cultivo. Las células transformadas pueden caracterizarse por términos tales como neoplásico, anaplásico y/o hiperplásico, con respecto a su pérdida de control del crecimiento. Para los fines de esta invención, los términos "fenotipo transformado de células malignas de mamífero" y "fenotipo transformado" pretenden abarcar, entre otros, cualquiera de los siguientes rasgos fenotípicos asociados con la transformación celular de células de mamífero: inmortalización, morfología o transformación de crecimiento y tumorigenicidad, tal como se detecta por crecimiento prolongado en cultivo celular, crecimiento en medios semisólidos o crecimiento tumorigénico en animales inmunocompetentes o singénicos.
El término "antígeno de células tumorales" se define en el presente documento como un antígeno que está presente en mayores cantidades en una célula tumoral o en fluidos corporales que las células tumorales no relacionadas, las células normales o el fluido corporal normal. La presencia de antígeno puede probarse mediante cualquier número de ensayos conocidos por los expertos en la técnica e incluye, sin limitación, selección negativa y/o positiva con anticuerpos, tales como un ensayo ELISA, un radioinmunoensayo o Inmunoprecipitación Western.
Los términos "apoptosis" o "muerte celular programada" se refieren al proceso fisiológico mediante el cual las células no deseadas o inútiles se eliminan durante el desarrollo y otros procesos biológicos normales. La apoptosis es un modo de muerte celular que ocurre en condiciones fisiológicas normales y la célula es un participante activo en su propia desaparición ("suicidio celular"). Se encuentra con mayor frecuencia durante el recambio celular normal y la homeostasis de los tejidos, la embriogénesis, la inducción y el mantenimiento de la tolerancia inmune, el desarrollo del sistema nervioso y la atrofia del tejido dependiente del sistema endocrino. Las células que sufren apoptosis muestran características morfológicas y bioquímicas características. Estas características incluyen la agregación de cromatina, la condensación nuclear y citoplasmática, la división del citoplasma y el núcleo en vesículas unidas a la membrana (cuerpos apoptóticos), que contienen ribosomas, mitocondrias morfológicamente intactas y material nuclear. In vivo, estos cuerpos apoptóticos son rápidamente reconocidos y fagocitados por macrófagos, células dendríticas o células epiteliales adyacentes. Debido a este mecanismo eficiente para la eliminación de células apoptóticas in vivo, no se produce respuesta inflamatoria. In vitro, los cuerpos apoptóticos, así como los fragmentos celulares restantes, finalmente se hinchan y finalmente experimentan lisis. Esta fase terminal de muerte celular in vitro se ha denominado "necrosis secundaria". La apoptosis se puede medir por métodos conocidos por los expertos en la técnica, como fragmentación de ADN, exposición de anexina V, activación de caspasas, liberación de citocromo c, etc. Una célula que ha sido inducida a morir se denomina en este documento como una “célula apoptótica”.
"Agente inductor de apoptosis" se define en el presente documento para inducir apoptosis/muerte celular programada, e incluye, por ejemplo, irradiación, agentes quimioterapéuticos o agentes de ligación del receptor, en donde las células, por ejemplo, las células tumorales son inducidas a sufrir muerte celular programada. Ejemplos de agentes inductores de apoptosis se describen con más detalle más adelante.
La apoptosis se puede probar usando un ensayo estándar de apoptosis de anexina V: NIH: las células OVCAR-3 se cultivan en placas de 6 pozos (NUNC) y se irradian o tratan con un antagonista (o en combinación con otro fármaco contra el cáncer) para 4-48 horas, lavadas y teñidas con anexina V-FITC (BD-Pharmingen) durante 1 hora. Las células se analizan por citometría de flujo (Becton-Dickinson, CellQuest), se contratiñen con yoduro de propidio y se analizan nuevamente en el citómetro de flujo.
B. Métodos para fabricar y expresar anticuerpos anti-endoglina humanizados
Se ha desarrollado un anticuerpo monoclonal quimérico que une endoglina. Este anticuerpo se denomina TR105 (también conocido como c-SN6j).
En un aspecto, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento se crearon por humanización de las secuencias Vl y Vh del anticuerpo monoclonal quimérico TRC105 (SEQ ID NOS.
1 y 39, respectivamente).
Las inmunoglobulinas humanizadas, incluidos los anticuerpos humanizados, se han construido mediante ingeniería genética. La mayoría de las inmunoglobulinas humanizadas que se han descrito previamente comprenden un marco que es idéntico al marco de una cadena de inmunoglobulina humana particular (es decir, un aceptor o receptor) y tres CDR de una cadena de inmunoglobulina no humana (es decir, donante). Como se describe en el presente documento, la humanización también puede incluir criterios mediante los cuales se identifica y se elige un número limitado de aminoácidos en el marco de una cadena de inmunoglobulina humanizada para que sean los mismos que los aminoácidos en esas posiciones en el donante en lugar de en el aceptor, para aumentar o mantener la afinidad de un anticuerpo que comprende la cadena de inmunoglobulina humanizada.
La presente invención se basa en parte en el modelo de que dos causas contribuyentes de la pérdida de afinidad en medios anteriores de producción de anticuerpos humanizados (usando como ejemplos anticuerpos de ratón como fuente de CDR) son: (1) cuando las CDR de ratón se combinan con un marco humano, los aminoácidos en los marcos cercanos a las CDR se vuelven humanos en lugar de ratones. Sin pretender estar ligados a la teoría, estos aminoácidos modificados pueden distorsionar ligeramente las CDR (por ejemplo, pueden crear fuerzas electrostáticas o hidrófobas diferentes a las del anticuerpo de ratón donante, y las CDR distorsionadas pueden no hacer contactos tan efectivos con el antígeno como las c Dr lo hicieron en el anticuerpo donante); (2) también, los aminoácidos en el anticuerpo original de ratón que están cerca, pero no son parte de, las CDR (es decir, todavía forman parte del marco), pueden hacer contactos con el antígeno que contribuyen a la afinidad. Estos aminoácidos se pierden cuando el anticuerpo se humaniza porque, en general, todos los aminoácidos marco se hacen humanos. Para sortear estos problemas, y para producir anticuerpos humanizados que tienen una afinidad muy fuerte por un antígeno deseado, los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden construirse usando uno o más de los siguientes principios.
Un principio no limitante es que, por ejemplo, como aceptor, se usa un marco de una inmunoglobulina humana particular que es inusualmente homóloga a la inmunoglobulina del donante por humanizar, o se usa un marco de consenso de muchos anticuerpos humanos como un aceptador. Por ejemplo, la comparación de la secuencia de una región variable de cadena pesada (o ligera) de ratón con las regiones variables pesadas (o ligeras) humanas en un banco de datos (por ejemplo, el National Biomedical Research Foundation Protein Identification Resource o la base de datos de secuencias de proteínas del the National Center for Biotechnology Information-NCBI) muestra que el alcance de la homología con diferentes regiones humanas puede variar mucho, por ejemplo, de aproximadamente 40% a aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% o más. Al elegir como inmunoglobulina aceptora una de las regiones variables de la cadena pesada humana que es más homóloga a la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina donante, se cambiarán menos aminoácidos al pasar de la inmunoglobulina donante a la inmunoglobulina humanizada. Al elegir como inmunoglobulina aceptora una de las regiones variables de la cadena liviana humana que es más homóloga a la región variable de la cadena liviana de la inmunoglobulina donante, se cambiarán menos aminoácidos al pasar de la inmunoglobulina donante a la inmunoglobulina humanizada. Generalmente, usando tales técnicas, hay una posibilidad reducida de cambiar un aminoácido cerca de una o más de las CDR que distorsionan su conformación. Además, la forma general precisa de un anticuerpo humanizado que comprende la cadena de inmunoglobulina humanizada puede parecerse más a la forma del anticuerpo donante, reduciendo así la posibilidad de distorsionar las CDR.
También se pueden usar cadenas livianas y pesadas del mismo anticuerpo humano como secuencias aceptoras, para mejorar la probabilidad de que las cadenas livianas y pesadas humanizadas hagan contactos favorables entre sí. Alternativamente, uno también puede usar cadenas livianas y pesadas de diferentes secuencias de línea germinal de anticuerpos humanos como secuencias aceptoras; cuando se usan tales combinaciones, se puede determinar fácilmente si el Vh y el Vl se unen a un epítopo de interés utilizando ensayos convencionales (por ejemplo, un ELISA). En un ejemplo, se elegirá el anticuerpo humano en donde las secuencias de las regiones variables de la cadena liviana y pesada, en conjunto, son en general más homólogas a las secuencias de la región variable de la cadena liviana y pesada del donante. Aveces se dará mayor peso a la secuencia de la cadena pesada. Independientemente de cómo se elija la inmunoglobulina aceptora, en algunos casos se puede lograr una mayor afinidad seleccionando una pequeña cantidad de aminoácidos en el marco de la cadena de inmunoglobulina humanizada para que sean los mismos que los aminoácidos en esas posiciones en el donante que en el aceptador. Los métodos de maduración por afinidad son conocidos en la técnica.
Los anticuerpos humanizados generalmente tienen al menos tres ventajas potenciales sobre los anticuerpos de ratón o quiméricos para uso en terapia humana. Debido a que la porción efectora de un anticuerpo es humana, se cree que interactúa mejor con las otras partes del sistema inmunitario humano (por ejemplo, destruye las células objetivo de manera más eficiente por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC))). Además, el sistema inmunitario humano no debería reconocer el marco o la región constante del anticuerpo humanizado como extraño, y por lo tanto la respuesta del anticuerpo contra dicho anticuerpo inyectado debería ser menor que contra un anticuerpo de ratón totalmente extraño o un anticuerpo quimérico parcialmente extraño. Finalmente, se sabe que los anticuerpos de ratón tienen una vida media en la circulación humana que es mucho más corta que la vida media de los anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanizados pueden, presumiblemente, tener una vida media más similar a los anticuerpos humanos de origen natural, lo que permite administrar dosis más pequeñas y menos frecuentes.
La humanización de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se puede lograr mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica y descritos aquí. De manera similar, la producción de anticuerpos humanizados también se puede lograr a través de métodos conocidos en la técnica y descritos aquí.
Los métodos para modificaciones de regiones marco se conocen en la técnica y se contemplan aquí. La selección de una o más posiciones relevantes de aminoácidos marco para alterar depende de una variedad de criterios. Un criterio para seleccionar los aminoácidos marco relevantes para cambiar pueden ser las diferencias relativas en los residuos marco aminoácidos entre las moléculas donantes y aceptoras. La selección de posiciones marco relevantes para alterar usando este enfoque tiene la ventaja de evitar cualquier sesgo subjetivo en la determinación de residuos o cualquier sesgo en la contribución de afinidad de unión de CDR por parte del residuo.
Otro criterio que puede usarse para determinar las posiciones de aminoácidos relevantes para cambiar puede ser, por ejemplo, la selección de residuos marco que se sabe que son importantes o que contribuyen a la conformación de CDR. Por ejemplo, los residuos del marco canónico son importantes para la conformación y/o estructura de CDR. La orientación de un residuo de marco canónico como una posición relevante para el cambio se puede utilizar para identificar un residuo de aminoácido más compatible en contexto con su secuencia de CDR donante asociada.
La frecuencia de un residuo de aminoácido en una posición de marco particular es otro criterio que puede usarse para seleccionar posiciones de aminoácidos de marco relevantes para cambiar. Por ejemplo, la comparación del marco seleccionado con otras secuencias del marco dentro de su subfamilia puede revelar residuos que ocurren en frecuencias menores en una posición o posiciones particulares. Las posiciones que albergan residuos menos abundantes son igualmente aplicables para la selección como una posición para alterar en el marco de la región variable del aceptador.
Las posiciones de aminoácidos relevantes para cambiar también se pueden seleccionar, por ejemplo, en base a la proximidad a una CDR. En ciertos contextos, los residuos de FR pueden participar en la conformación de CDR y/o la unión al antígeno. Además, este criterio puede usarse de manera similar para priorizar posiciones relevantes seleccionadas por otros criterios descritos aquí. Por lo tanto, diferenciar entre residuos proximales y distales a una o más CDR representa una forma de reducir el número de posiciones relevantes para cambiar.
Otros criterios para seleccionar las posiciones relevantes del marco de aminoácidos para alterar incluyen, por ejemplo, residuos que se sabe o se predice que residen en un espacio tridimensional cerca de la interfaz antígeno-CDR o que se predice que modulan la actividad CDR. De manera similar, se pueden seleccionar los residuos de estructura que se sabe o se pronostica que forman contactos entre la interfaz de la región variable de la cadena pesada (Vh) y ligera. Dichas posiciones de marco pueden afectar la conformación y/o afinidad de una CDR al modular la bolsa de unión de CDR, la interacción de antígeno (epítopo) o la interacción Vh y Vl. Por lo tanto, la selección de estas posiciones de aminoácidos para construir una población diversa para la detección de la actividad de unión se puede usar para identificar cambios en el marco que reemplazan los residuos que tienen efectos perjudiciales en la conformación de CDR o compensan los efectos perjudiciales de los residuos que se producen en otras partes del marco.
Otros residuos marco que pueden seleccionarse para la alteración incluyen posiciones de aminoácidos que son inaccesibles para el disolvente. Tales residuos generalmente están enterrados en la región variable y, por lo tanto, son capaces de influir en la conformación de las interacciones CDR o Vh y Vl. La accesibilidad a los disolventes puede predecirse, por ejemplo, a partir de la relativa hidrofobicidad del entorno creada por las cadenas laterales de aminoácidos del polipéptido y/o por datos estructurales tridimensionales conocidos.
Después de la selección de posiciones de aminoácidos relevantes en las CDR del donante, así como cualquier posición de aminoácidos relevante en las regiones marco que se desea variar, los cambios de aminoácidos en algunas o todas las posiciones seleccionadas se pueden incorporar en los ácidos nucleicos codificadores para el marco de la región variable del aceptador y las CDR de los donantes. El marco alterado o las secuencias CDR pueden hacerse y probarse individualmente, o pueden combinarse y probarse secuencial o simultáneamente.
La variabilidad en cualquiera o en todas las posiciones alteradas puede variar desde unos pocos hasta una pluralidad de residuos de aminoácidos diferentes, que incluyen los veinte aminoácidos naturales o equivalentes funcionales y análogos de los mismos. En algunos casos, los aminoácidos no naturales también pueden considerarse y son conocidos en la técnica.
La selección del número y la ubicación de las posiciones de aminoácidos para variar es flexible y puede depender del uso pretendido y la eficiencia deseada para la identificación de la región variable alterada que tiene una actividad deseable tal como sustancialmente la misma o mayor afinidad de unión en comparación con la región variable del donante. A este respecto, cuanto mayor sea el número de cambios que se incorporan en una población de región variable alterada, más eficiente es identificar al menos una especie que exhiba una actividad deseable, por ejemplo, sustancialmente la misma o mayor afinidad de unión que el donante. Alternativamente, cuando el usuario tiene datos empíricos o reales en el sentido de que ciertos residuos o posiciones de aminoácidos contribuyen desproporcionadamente a la afinidad de unión, entonces puede ser deseable producir una población limitada de regiones variables alteradas que se centre en los cambios dentro o alrededor de esos residuos identificados o posiciones.
Por ejemplo, si se desean regiones variables injertadas con CDR, una población grande y diversa de regiones variables alteradas puede incluir todas las posiciones de región marco no idénticas entre el marco donante y aceptor y todos los cambios de posición de aminoácidos CDR únicos. Alternativamente, una población de diversidad intermedia puede incluir subconjuntos, por ejemplo, de solo las posiciones marco proximales no idénticas que se incorporarán junto con todos los cambios de posición de aminoácidos de CDR individuales para, por ejemplo, aumentar la afinidad de los anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a antígeno. La diversidad de las poblaciones anteriores se puede aumentar aún más, por ejemplo, incluyendo adicionalmente todos los cambios de posición de aminoácidos de CDR por pares. Por el contrario, las poblaciones que se centran en residuos o posiciones predeterminadas que incorporan residuos variantes en tan solo un marco y/o una posición de aminoácido CDR pueden construirse de manera similar para la detección e identificación de una región variable de anticuerpo alterada. Al igual que con las poblaciones anteriores, la diversidad de tales poblaciones focalizadas puede incrementarse aún más expandiendo adicionalmente las posiciones seleccionadas para el cambio para incluir otras posiciones relevantes en cualquiera de las regiones marco y CDR o en ambas. Existen numerosas otras combinaciones que van desde pocos cambios hasta muchos cambios en una o ambas regiones marco y CDR que se pueden emplear adicionalmente, todo lo cual dará como resultado una población de regiones variables alteradas que pueden ser seleccionadas para la identificación de al menos una región variable alterada injertada con CDR que tiene actividad deseada, por ejemplo, actividad de unión a endoglina. Los expertos en la materia sabrán, o pueden determinar, qué posiciones seleccionadas de residuos en el marco o las CDR del donante, o subconjuntos de los mismos, pueden variarse para producir una población para el cribado e identificación de un anticuerpo alterado de la invención, dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas aquí. Los codones que codifican aminoácidos son conocidos en la técnica.
Otro método de humanización de anticuerpos incluye un método denominado "superhumanización". La superhumanización implica los pasos de obtener una secuencia peptídica para una región variable del sujeto codificada por un gen de anticuerpo maduro no humano e identificar un primer conjunto de tipos de estructura de CDR canónica para al menos dos CDR dentro de la región variable de anticuerpo no humano. Los tipos de estructura Canonical CDR son los tipos de estructura designados por Chothia (CITE). Chothia y sus colegas encontraron que las porciones críticas de las CDR de muchos anticuerpos adoptan conformaciones de esqueleto peptídico casi idénticas, a pesar de la gran diversidad en el nivel de la secuencia de aminoácidos. En concordancia, Chothia definió para cada CDR en cada cadena una o algunas "estructuras canónicas". Cada estructura canónica especifica principalmente un conjunto de ángulos de torsión del esqueleto peptídico para un segmento contiguo de residuos de aminoácidos que forman un bucle.
Después de la identificación del tipo de estructura CDR canónica, también se obtiene una biblioteca de secuencias de péptidos para regiones variables de anticuerpos humanos para anticuerpos humanos. Esta biblioteca contiene secuencias para regiones variables de la línea germinal humana codificadas por segmentos de ácido nucleico de la línea germinal, y puede incluir secuencias de anticuerpos humanos maduros. En cualquier caso, el método incluye identificar tipos de estructura CDR canónica (es decir, un segundo conjunto de tipos de estructura CDR canónica) para al menos dos CDR para cada secuencia dentro de la biblioteca de secuencias de región variable humana. De esta biblioteca, se selecciona un subconjunto de secuencias candidatas comparando el primer conjunto de tipos de estructura CDR canónica con el segundo conjunto de tipos de estructura CDR canónica (es decir, comparando los tipos de estructura CDR canónica del ratón con los tipos de estructura CDR canónica humana en las ubicaciones correspondientes dentro de la región variable) y seleccionando aquellas secuencias humanas donde el segundo conjunto de estructura CDR canónica es el mismo que el primer conjunto de tipos de estructura CDR canónica para las secuencias CDR en ubicaciones correspondientes dentro de las regiones variables no humanas y humanas, respectivamente. El método utiliza estas secuencias de región variable humana candidata como base para construir una molécula quimérica que incluye al menos dos de las secuencias de CDR de la región variable no humana (por ejemplo, de las CDR de ratón) combinadas con las regiones marco de la variable humana candidata secuencias de regiones. El resultado de la construcción es que el anticuerpo quimérico contiene cada una de las secuencias de CDR no humanas sustituidas por cada una de las secuencias de CDR humanas en ubicaciones correspondientes en las regiones variables, de modo que las secuencias marco en el anticuerpo quimérico difieren de las secuencias marco humanas candidatas.
La similitud con el sujeto CDR de secuencias de anticuerpos humanos candidatos se evalúa para cada dominio en dos niveles. Principalmente, se buscan conformaciones tridimensionales idénticas de esqueletos de péptidos CDR. Las coordenadas atómicas determinadas experimentalmente de las CDR del sujeto rara vez están disponibles, por lo tanto, la similitud tridimensional se aproxima determinando los tipos de estructura canónica de Chothia de las CDR del sujeto y excluyendo de una consideración adicional a los candidatos que poseen diferentes estructuras canónicas. En segundo lugar, se considera la homología de residuo a residuo entre las CDR del sujeto y las restantes CDR candidatas humanas, y se elige el candidato con la mayor homología.
La elección de la homología más alta se basa en varios criterios utilizados para clasificar las regiones variables humanas candidatas que tienen la misma estructura canónica que el sujeto de las regiones variables no humanas. El criterio para clasificar a los miembros del conjunto seleccionado puede ser por identidad de secuencia de aminoácidos u homología de aminoácidos o ambos. La identidad de aminoácidos es simple, una puntuación de las coincidencias posición por posición de los residuos de aminoácidos. La similitud por homología de aminoácidos es similitud posición por posición en la estructura de carácter del residuo. La homología se puede puntuar, por ejemplo, de acuerdo con las tablas y procedimientos descritos por Henikoff and Henikoff, (1992) Amino acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad.. Sci 89: 10915-10919, o por la serie BLOSu M descrita por Henikoff and Henikoff, (1996). Los pasos son los siguientes:
a) Determine las secuencias peptídicas de los dominios variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo sujeto. Estos pueden determinarse por cualquiera de varios métodos, como la secuenciación de ADN de los genes respectivos después de la clonación de ADNc convencional; Secuenciación de ADN de productos de clonación que han sido amplificados por la reacción en cadena de la polimerasa de transcripciones inversas o ADN de la línea de hibridoma sujeto; o secuenciación peptídica de una proteína de anticuerpo purificada.
b) Aplicar el sistema de numeración Kabat (Kabat et al, Id. 1991) a las secuencias de cadena pesada y ligera del anticuerpo no humano sujeto. Determine los tipos de estructura canónica para cada una de las CDR del anticuerpo no humano sujeto. Esta determinación se realiza a partir del examen de la secuencia de péptidos a la luz de las pautas discutidas en Chothia and Lesk (1987), Chothia et al (1992), Tomlinson et al (1995), Martin and Thornton (1996) y Al-Lazikani et al (1997).
Las características más destacadas de la determinación de la estructura canónica para cada una de las CDR son las siguientes. Para la CDR1 de cadena pesada, actualmente se conocen tres tipos de estructura canónica. La asignación de una nueva secuencia es sencilla porque cada tipo de estructura canónica tiene un número diferente de residuos. Como se describe en Al-Lazikani et. al (1997), cuando se asigna la numeración de Kabat a la secuencia, la numeración de los residuos 31-35 será la siguiente para las estructuras canónicas respectivas.
Estructura canónica tipo 1: 31, 32, 33, 34, 35.
Estructura canónica tipo 2: 31, 32, 33, 34, 35, 35a.
Estructura canónica tipo 3: 31, 32, 33, 34, 35, 35a, 35b.
Para la CDR2 de cadena pesada, actualmente se conocen cuatro tipos de estructura canónica. Varios tienen números únicos de residuos, y se distinguen fácilmente de su numeración Kabat única de las posiciones 52-56, a saber:
Estructura canónica tipo 1: 52, 53, 54, 55, 56.
Estructura canónica tipo 4: 52, 52a, 52b, 52c, 53, 54, 55, 56.
Los tipos de estructura canónica 2 y 3 para la CDR2 de la cadena pesada tienen el mismo número de residuos, por lo tanto, deben distinguirse por pistas dentro de su secuencia, como lo discutieron Chothia et al (1992). La numeración de Kabat del segmento que contiene estas pistas es: 52, 52a, 53, 54, 55. La estructura canónica tipo 2 tiene Pro o Ser en la posición 52a y Gly o Ser en la posición 55, sin restricción en las otras posiciones. La estructura canónica tipo 3 tiene Gly, Ser, Asn o Asp en la posición 54, sin restricción en las otras posiciones. Estos criterios son suficientes para resolver la asignación correcta en la mayoría de los casos. Además, el residuo de estructura 71 es comúnmente Ala, Val, Leu, Ile o Thr para la estructura canónica tipo 2 y comúnmente Arg para la estructura canónica tipo 3.
La cadena pesada CDR3 es la más diversa de todas las CDR. Se genera mediante procesos genéticos, algunos de naturaleza aleatoria, exclusivos de los linfocitos. En concordancia, las estructuras canónicas para CDR3 han sido difíciles de predecir. En cualquier caso, los segmentos del gen V de la línea germinal humana no codifican ninguna parte de CDR3; porque los segmentos del gen V terminan en la posición 94 de Kabat, mientras que las posiciones 95 a 102 codifican CDR3. Por estas razones, las estructuras canónicas de CDR3 generalmente no se consideran para elegir secuencias humanas candidatas.
Para CDR1 de cadena liviana, actualmente se conocen seis tipos de estructura canónica para CDR1 en cadenas kappa. Cada tipo de estructura canónica tiene un número diferente de residuos, por lo tanto, la asignación de un tipo de estructura canónica a una nueva secuencia es evidente a partir de la numeración de Kabat de las posiciones de residuos 27-31.
Estructura canónica tipo 1: 27, 29, 30, 31.
Estructura canónica tipo 2: 27, 28, 29, 30, 31.
Estructura canónica tipo 3: 27, 27a, 27b, 27c, 27d, 27e, 27f, 28, 29, 30, 31.
Estructura canónica tipo 4: 27, 27a, 27b, 27c, 27d, 27e, 28, 29, 30, 31.
Estructura canónica tipo 5: 27, 27a, 27b, 27c, 27d, 28, 29, 30, 31.
Estructura canónica tipo 6: 27, 27a, 28, 29, 30, 31.
Para CDR2 de cadena liviana, solo se conoce un único tipo de estructura canónica para CDR2 en cadenas kappa, por lo tanto, salvo las secuencias de anticuerpos de sujeto excepcionales, la asignación es automática. Para c DR3 de cadena liviana, se han descrito hasta seis tipos de estructura canónica para CDR3 en cadenas kappa, pero tres de estos son raros. Los tres comunes se pueden distinguir por su longitud, reflejada en la numeración de Kabat de las posiciones de residuos 91-97:
Estructura canónica tipo 1: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 (también con un Pro obligatorio en la posición 95 y Gin, Asn o His en la posición 90).
Estructura canónica tipo 3: 91, 92, 93, 94, 95, 97.
Estructura canónica tipo 5: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 96a, 97.
Después de identificar los tipos de estructura CDR canónica del anticuerpo no humano sujeto, los genes humanos del mismo tipo de cadena (pesada o ligera) que tienen la misma combinación de tipos de estructura canónica que el anticuerpo sujeto se identifican para formar un conjunto candidato de secuencias humanas. La mayoría de estos fragmentos de genes han sido descubiertos y ya han sido asignados a un tipo de estructura canónica (Chothia et al, 1992, Tomlinson et al, 1995).
Para la cadena pesada, se evalúa la conformidad de CDR1 y CDR2 con los tipos de estructura canónica de ratón, y se excluyen los genes que no se ajustan. Para la cadena liviana, primero se evalúa la conformidad de CDR1 y CDR2 de cada secuencia humana con los tipos de estructura canónica del anticuerpo sujeto. Se evalúa el potencial de los residuos 89-95 de un gen Vk candidato para formar una CDR3 del mismo tipo de estructura canónica que el anticuerpo sujeto, colocando una fusión del gen con una región J y aplicando criterios para la determinación del tipo de estructura c DR3 canónica a la secuencia fusionada, y las secuencias no conformes están excluidas.
Alternativamente, cuando un dominio variable del anticuerpo sujeto es de un tipo de estructura canónica no disponible en el genoma humano, se consideran los genes de la línea germinal V humana que tienen tipos de estructura canónica tridimensionalmente similares, pero no idénticos. Tal circunstancia ocurre a menudo con la cadena kappa CDR1 en anticuerpos murinos, incluidos dos de los ejemplos que se describen más adelante. Se han observado los 6 tipos de estructura canónica posibles en esta CDR en anticuerpos murinos, mientras que el genoma humano codifica solo los tipos canónicos 2, 3, 4 y 6. En estas circunstancias, un tipo de estructura CDR canónica que tiene longitud de residuos de aminoácidos dentro de dos de La longitud de los residuos de aminoácidos de la secuencia no humana en cuestión puede seleccionarse para la comparación. Por ejemplo, cuando se encuentra una estructura canónica tipo 1 en el anticuerpo sujeto, las secuencias Vk humanas con estructura canónica tipo 2 se usan para comparación. Cuando se encuentra una estructura canónica tipo 5 en el anticuerpo murino, las secuencias Vk humanas con estructura canónica tipo 3 o 4 se usan para la comparación.
Se pueden considerar secuencias de anticuerpos humanos reorganizados maduros para la comparación de secuencias. Tal consideración podría estar justificada bajo una variedad de circunstancias, que incluyen pero no se limitan a casos en los que la secuencia humana madura (1) está muy cerca de la línea germinal; (2) se sabe que no es inmunogénico en humanos; o (3) contiene un tipo de estructura canónica idéntico al del anticuerpo sujeto, pero que no se encuentra en la línea germinal humana.
Para cada uno de los genes V candidatos con tipos de estructura canónica coincidentes, también se evalúa la identidad y/o homología de la secuencia de residuo a residuo con la secuencia del sujeto para clasificar las secuencias humanas candidatas. Por ejemplo, los residuos evaluados son los siguientes: (1) las posiciones de los residuos de aminoácidos de CDR de cadena liviana Kappa (k) son CDR1 (26-32), CDR2 (50-52), Cd R3 (91-96); y (2) las posiciones de residuos de aminoácidos de CDR de cadena pesada son CDR1 (31-35) y CDR2 (50-60). Además, también se pueden considerar las posiciones de residuos de aminoácidos de CDR3 de cadena pesada 95 a 102.
La homología de residuo a residuo se puntúa primero por el número de residuos de aminoácidos idénticos entre el sujeto y las secuencias humanas candidatas. La secuencia humana utilizada para la construcción posterior de un anticuerpo convertido se elige entre el 25 por ciento de los candidatos con la puntuación más alta. Cuando sea apropiado, como cuando varias secuencias candidatas tienen puntuaciones de identidad similares, la similitud entre residuos de aminoácidos no idénticos puede considerarse adicionalmente como necesaria. Las coincidencias de alifático con alifático, aromático con aromático o polar con polar entre los residuos del sujeto y el objeto se agregan a las puntuaciones. En otro ejemplo, la evaluación cuantitativa de la homología de secuencia se puede realizar usando matrices de sustitución de aminoácidos tales como la matriz BLOSUM62 de Henikoff and Henikoff.
Se puede seleccionar una secuencia de objetos para la región marco C-terminal a la secuencia CDR3 del conjunto de segmentos conocidos de la línea germinal J humana. Se selecciona una secuencia de péptido J evaluando la homología de residuo a residuo para cada segmento J para las posiciones de secuencia para las cuales se solapan CDR3 y J, usando los criterios de puntuación especificados para la evaluación de genes V candidatos como se mencionó anteriormente. La secuencia peptídica del segmento del gen J utilizada para la construcción posterior de un anticuerpo convertido se elige entre el 25 por ciento de los candidatos con la puntuación más alta.
Como ejemplo, la cadena variable quimérica contiene al menos dos CDR de una secuencia no humana en cuestión, y secuencias marco de una secuencia humana candidata. En otro ejemplo, la cadena liviana quimérica contiene tres CDR de una secuencia sujeto no humana y secuencias marco de una secuencia humana candidata. En ejemplos adicionales, una cadena pesada quimérica contiene al menos dos CDR de una cadena pesada en cuestión, y la secuencia marco de una cadena pesada humana candidata, o una barbilla pesada quimérica contiene cada una de las CDR de la cadena pesada y las secuencias marco de un candidato cadena pesada humana. En otro ejemplo más, una cadena pesada de anticuerpo quimérico contiene las CDR 1 y 2 de una secuencia no humana en cuestión y los residuos 50-60 para CDR3 y los residuos 61-65 de una CDR de la cadena pesada humana candidata, junto con las secuencias marco de la secuencia humana candidata. En otro ejemplo, una secuencia de cadena pesada quimérica contiene cada CDR de la secuencia no humana del sujeto; las secuencias marco 27-30 forman la secuencia del sujeto y las secuencias marco de las secuencias candidatas. Sin embargo, en todos los casos, la molécula de anticuerpo quimérico contiene no más de 10 residuos de aminoácidos en la secuencia marco que difieren de los de la secuencia marco de la ración variable humana candidata.
Cuando se desea una mayor afinidad de un anticuerpo humanizado, los residuos dentro de las CDR de un anticuerpo convertido pueden sustituirse adicionalmente con otros aminoácidos. Típicamente, no se cambian más de cuatro residuos de aminoácidos en una CDR, y lo más típico es que no se cambien más de dos residuos en la CDR, excepto para la CDR2 de cadena pesada, donde se pueden cambiar hasta 10 residuos. Los cambios en la afinidad se pueden medir mediante métodos convencionales como los descritos en este documento (por ejemplo, Biacore).
Los métodos para superhumanizar anticuerpos se describen con más detalle en la Patente de los Estados Unidos No.
6,881,557.
Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno se pueden construir y producir usando técnicas convencionales conocidas en la técnica. Además, los anticuerpos preparados de forma recombinante a menudo se pueden producir en grandes cantidades, particularmente cuando se utilizan vectores de expresión de alto nivel.
Los anticuerpos pueden secuenciarse usando técnicas convencionales conocidas en la técnica. En un aspecto, las secuencias de aminoácidos de una o más de las CDR se insertan en una secuencia sintética de, por ejemplo, un marco de anticuerpo humano (o fragmento de unión a antígeno del mismo) para crear un anticuerpo humano que podría limitar las reacciones secundarias adversas de tratar a un paciente humano con un anticuerpo no humano. Las secuencias de aminoácidos de una o más de las CDR también se pueden insertar en una secuencia sintética de, por ejemplo, una proteína de unión tal como un AVIMER™ para crear un constructo para la administración a un paciente humano. Dichas técnicas pueden modificarse dependiendo de la especie de animal a tratar. Por ejemplo, para usos veterinarios, se puede sintetizar un anticuerpo, un fragmento de unión al antígeno o una proteína de unión para la administración de un no humano (por ejemplo, un primate, una vaca, un caballo, etc.).
En otro aspecto, usando técnicas reconocidas en la técnica tales como las proporcionadas e incorporadas aquí, los nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos de una o más de las CDR pueden insertarse, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes en sitios de endonucleasa de restricción de un polinucleótido existente que codifica un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de unión.
Para la expresión, un sistema de expresión es uno que utiliza el sistema GS (Lonza) usando un gen de glutamina sintetasa como marcador seleccionable. En resumen, se realiza una transfección en células CHO por electroporación (250V) usando el sistema GS (Lonza) usando el gen de glutamina sintetasa como marcador seleccionable. Las células CHO de tipo salvaje se cultivan en DMEM (Sigma) que contiene suero de ternera fetal dializado al 10% (FCS) con glutamina 2 mM. Se transfectan 6 x 107 células CHO con 300 |jg de ADN linealizado por electroporación. Después de la electroporación, las células se resuspenden en DMEM con glutamina y se depositan en placas de 36x96 pozos (50 jl/pozo), y se incuban a 37°C en CO2 al 5%. Al día siguiente, se agregan 150 jl/pozo de medio selectivo (DMEM sin glutamina). Después de aproximadamente 3 semanas, las colonias se analizan mediante ELISA (véase más adelante) usando un anticuerpo irrelevante como control negativo. Todas las colonias que producen >20 jg/m l se expanden en placas de 24 pozos y luego en matraces T25 duplicados.
Para la producción de alto nivel, el sistema de expresión de mamíferos más utilizado es el que utiliza el procedimiento de amplificación génica ofrecido por las células de ovario de hámster chino deficientes en dihidrofolato reductasa ("dhfr-"). El sistema es bien conocido por el experto en la materia. El sistema se basa en el gen "dhfr" de deshidrofolato reductasa, que codifica la enzima DHFR, que cataliza la conversión de deshidrofolato a tetrahidrofolato. Para lograr una alta producción, las células dhfr-CHO se transfectan con un vector de expresión que contiene un gen DHFR funcional, junto con un gen que codifica una proteína deseada. En este caso, la proteína deseada es la cadena pesada y/o la cadena liviana del anticuerpo recombinante.
Al aumentar la cantidad del inhibidor competitivo de DHFR metotrexato (MTX), las células recombinantes desarrollan resistencia al amplificar el gen dhfr. En casos estándar, la unidad de amplificación empleada es mucho más grande que el tamaño del gen dhfr y, como resultado, la cadena pesada del anticuerpo se coamplifica.
Cuando se desea la producción a gran escala de la proteína, como la cadena de anticuerpos, se tienen en cuenta tanto el nivel de expresión como la estabilidad de las células que se emplean. En el cultivo a largo plazo, las poblaciones de células CHO recombinantes pierden homogeneidad con respecto a su productividad específica de anticuerpos durante la amplificación, a pesar de que derivan de un solo clon parental.
Se describe en el presente documento un polinucleótido aislado (ácido nucleico) que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se describe en el presente documento, vectores que contienen dichos polinucleótidos y células huésped y sistemas de expresión para transcribir y traducir dichos polinucleótidos en polipéptidos.
También se describen constructos en forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido como se indicó anteriormente.
También se describe una célula huésped recombinante que comprende una o más constructos como se indicó anteriormente. Un ácido nucleico que codifica cualquier anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento tal como se proporciona en sí mismo forma una instancia de la presente descripción, al igual que un método de producción del anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo descrito en este documento, método que comprende la expresión del ácido nucleico codificador del mismo. La expresión se puede lograr convenientemente cultivando en condiciones apropiadas células huésped recombinantes que contienen el ácido nucleico. Después de la producción por expresión, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede aislarse y/o purificarse usando cualquier técnica adecuada, luego usarse según sea apropiado.
Los anticuerpos específicos, los fragmentos de unión a antígeno y las moléculas de ácido nucleico codificante y los vectores descritos en este documento pueden proporcionarse aislados y/o purificados, por ejemplo, de su entorno natural, en forma sustancialmente pura u homogénea. En el caso del ácido nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido nucleico o de genes de origen distinto de la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida. El ácido nucleico puede comprender ADN o ARN y puede ser total o parcialmente sintético. Los métodos de purificación son bien conocidos en la técnica.
Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes son bien conocidos. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, levadura y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de hámster bebé, células de mieloma de ratón NS0 y muchas otras. Un huésped bacteriano común es E. coli.
La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en células procariotas tales como E. coli está bien establecida en la técnica. Para una revisión, véase por ejemplo Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la técnica como una opción para la producción de los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento, véase revisiones recientes, por ejemplo, Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinión Biotech 6: 553-560.
Se pueden elegir o construir vectores adecuados, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, por ejemplo, 'fago o fagémido, según corresponda. Para más detalles, véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.
Por lo tanto, un caso adicional proporciona una célula huésped que contiene ácido nucleico como se describe en este documento. Todavía otro ejemplo proporciona un método que comprende introducir dicho ácido nucleico en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir, por ejemplo, transfección con fosfato de calcio, DEAE dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otro virus, por ejemplo, vaccinia o, para células de insecto, baculovirus. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir, por ejemplo, transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos.
La introducción puede seguirse causando o permitiendo la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células huésped en condiciones para la expresión del gen.
El ácido nucleico puede integrarse en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula huésped. La integración puede promoverse mediante la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas estándar. Las mejoras de Ig se pueden inicializar según sea necesario para maximizar la expresión.
También se describe un método que comprende usar un constructo como se indicó anteriormente en un sistema de expresión para expresar los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se indicó anteriormente.
La presente descripción también se refiere a ácidos nucleicos aislados, tales como moléculas de ADN recombinante o genes clonados, o variantes degeneradas de los mismos, mutantes, análogos o fragmentos de los mismos, que codifican un anticuerpo o secuencia de unión a antígeno descrita en el presente documento que une endoglina.
En un caso, la presente descripción describe un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento que se une a la endoglina.
En otro ejemplo, la secuencia de ADN completa de la molécula de ADN recombinante o el gen clonado de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento puede unirse operativamente a una secuencia de control de expresión que puede introducirse en un huésped apropiado. En concordancia, la descripción se extiende a huéspedes unicelulares transformados con el gen clonado o la molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica el Vh y/o Vl, o partes de los mismos, del anticuerpo.
Otra característica es la expresión de las secuencias de ADN descritas en este documento. Como es bien conocido en la técnica, las secuencias de ADN pueden expresarse uniéndolas operativamente a una secuencia de control de expresión en un vector de expresión apropiado y empleando ese vector de expresión para transformar un huésped unicelular apropiado.
Dicha vinculación operativa de una secuencia de ADN a una secuencia de control de expresión, por supuesto, incluye, si no es ya parte de la secuencia de ADN, la provisión de un codón de iniciación, ATG, en el marco de lectura correcto corriente arriba de la secuencia de ADN.
Los polinucleótidos y los vectores se pueden proporcionar en forma aislada y/o purificada (por ejemplo, libre o sustancialmente libre de polinucleótidos de origen distintos del polinucleótido que codifica un polipéptido con la función requerida). Como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" y "sustancialmente libre" se refieren a una solución o suspensión que contiene menos de, por ejemplo, aproximadamente 20% o menos de material extraño, aproximadamente 10% o menos de material extraño, aproximadamente 5% o menos de material extraño, aproximadamente 4% o menos de material extraño, aproximadamente 3% o menos de material extraño, aproximadamente 2% o menos de material extraño, o aproximadamente 1% o menos de material extraño.
Se puede emplear una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión para expresar las secuencias de ADN descritas en el presente documento. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, plásmidos de E. coli col El, Pcr1, Pbr322, Pmb9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4; ADN de fago, por ejemplo, los numerosos derivados de fago A, por ejemplo, NM989, y otro ADN de fago, por ejemplo, M13 y a Dn de fago monocatenario filamentoso; plásmidos de levadura tales como el plásmido 2u o derivados del mismo; vectores útiles en células eucariotas, tales como vectores útiles en células de insectos o mamíferos; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, tales como plásmidos que se han modificado para emplear ADN de fagos u otras secuencias de control de expresión; y similares.
También se describe en el presente documento una célula huésped recombinante que comprende uno o más constructos de polinucleótidos. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se describe en el presente documento forma un aspecto de la presente solicitud, al igual que un método de producción del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno cuyo método comprende la expresión del polinucleótido. La expresión se puede lograr, por ejemplo, cultivando en condiciones apropiadas células huésped recombinantes que contienen el polinucleótido. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede aislarse y/o purificarse entonces usando cualquier técnica adecuada, y usarse según sea apropiado.
Cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de expresión, secuencias que controlan la expresión de una secuencia de ADN operativamente unida a ella, se puede usar en estos vectores para expresar las secuencias de ADN. Dichas secuencias útiles de control de la expresión incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos o tardíos de SV40, CMV, vaccinia, polioma o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el sistema LTR, el operador principal y regiones promotoras del fago A, las regiones de control de la proteína de la cubierta fd, el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glucolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida (por ejemplo, Pho5), los promotores de los factores de apareamiento de la levadura y otras secuencias conocidas para controlar la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus, y varias combinaciones de los mismos.
Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes son bien conocidos. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, levadura y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster bebé, células de mieloma de ratón NS0 y muchas otras. Un huésped bacteriano común puede ser, por ejemplo, E. coli.
La expresión de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno en células procariotas, tales como E. coli, está bien establecida en la técnica. Para una revisión, véase por ejemplo Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la materia (Raff, M.E- (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560 )
Una amplia variedad de células huésped unicelulares también son útiles para expresar las secuencias de ADN. Estos hospedadores incluyen hospedadores eucariotas y procariotas bien conocidos, como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos como levaduras y células animales, como CHO, YB/20, NS0, SP2/0, R1. 1, células B-W y L-M, células de riñón de mono verde africano (por ejemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 y BMT10), células de insecto (por ejemplo, Sf9) y células humanas y células vegetales en cultivo de tejidos.
Se entenderá que no todos los vectores, secuencias de control de expresión y huéspedes funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de ADN. Tampoco todos los huéspedes funcionarán igual de bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la materia podrá seleccionar los vectores, las secuencias de control de expresión y los hospedadores adecuados sin una experimentación excesiva para lograr la expresión deseada sin apartarse del alcance de esta solicitud. Por ejemplo, al seleccionar un vector, se debe considerar el huésped porque el vector debe funcionar en él. También se considerará el número de copias del vector, la capacidad de controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, como los marcadores antibióticos. Un experto habitual en la técnica puede seleccionar los vectores, las secuencias de control de expresión y los hospedadores adecuados para lograr la expresión deseada sin apartarse del alcance de esta solicitud. Por ejemplo, al seleccionar un vector, el huésped se considera porque el vector funciona en él. También se puede considerar el número de copias del vector, la capacidad de controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, como los marcadores antibióticos.
También se describen en el presente documento constructos en forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión como se describe en otro lugar en el presente documento que comprenden al menos un polinucleótido como se indicó anteriormente. Se pueden elegir o construir vectores adecuados que contengan secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, marcadores seleccionables y otras secuencias según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, por ejemplo, fagos, fagémidos, etc., según corresponda. Para más detalles, véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.
Al seleccionar una secuencia de control de expresión, normalmente se considerarán una variedad de factores. Estos incluyen, por ejemplo, la fuerza relativa del sistema, su capacidad de control y su compatibilidad con la secuencia de ADN o gen particular que se va a expresar, particularmente en lo que respecta a posibles estructuras secundarias. Los huéspedes unicelulares adecuados se seleccionarán teniendo en cuenta, por ejemplo, su compatibilidad con el vector elegido, sus características de secreción, su capacidad para plegar proteínas correctamente y sus requisitos de fermentación, así como la toxicidad para el huésped del producto codificado por el ADN. secuencias por expresar, y la facilidad de purificación de los productos de expresión.
Un ejemplo adicional proporciona una célula huésped que contiene uno o más polinucleótidos como se describe en el presente documento. Sin embargo, otra instancia proporciona un método para introducir uno o más polinucleótidos en una célula huésped, cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir, por ejemplo, transfección con fosfato de calcio, DEAEDextran, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otro virus (por ejemplo, vaccinia) o, para células de insecto, baculovirus. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir, por ejemplo, transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos.
La introducción puede seguirse causando o permitiendo la expresión de uno o más polinucleótidos, por ejemplo, cultivando células huésped en condiciones de expresión de uno o más polipéptidos de uno o más polinucleótidos. Se pueden usar sistemas inducibles y se puede inducir la expresión mediante la adición de un activador.
Los polinucleótidos pueden integrarse en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula huésped. La integración puede promoverse mediante la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas estándar. En otro ejemplo, el ácido nucleico se mantiene en un vector episómico en la célula huésped.
En el presente documento se describen métodos que incluyen el uso de un constructo como se indicó anteriormente en un sistema de expresión para expresar un polipéptido específico.
Teniendo en cuenta estos y otros factores, una persona experta en la técnica podrá construir una variedad de combinaciones de secuencia de control de vector/expresión/huésped que expresarán las secuencias de ADN en la fermentación o en cultivo animal a gran escala.
Un polinucleótido que codifica un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una proteína de unión se puede preparar de forma recombinante/sintética además de, o en lugar de, clonar. El polinucleótido puede diseñarse con los codones apropiados para el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o una proteína de unión. En general, se seleccionarán codones preferidos para un huésped previsto si la secuencia se usa para la expresión. El polinucleótido completo puede ensamblarse a partir de oligonucleótidos superpuestos preparados por métodos estándar y ensamblados en una secuencia de codificación completa. Véase, por ejemplo, Edge, Nature, 292: 756 (1981); Nambair etal., Science, 223: 1299 (1984); Jayetal., J. Biol. Chem., 259: 6311 (1984).
Se describe un método general para la incorporación específica de sitio de aminoácidos no naturales en proteínas en Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244: 182-188 ( Abril de 1989). Este método puede usarse para crear análogos con aminoácidos no naturales.
Como se mencionó anteriormente, una secuencia de ADN que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede prepararse sintéticamente en lugar de clonarse. La secuencia de ADN puede diseñarse con los codones apropiados para el anticuerpo o la secuencia de aminoácidos del fragmento de unión al antígeno. En general, se seleccionarán codones preferidos para el huésped previsto si la secuencia se usará para la expresión. La secuencia completa se ensambla a partir de oligonucleótidos superpuestos preparados por métodos estándar y ensamblados en una secuencia de codificación completa. Véase, por ejemplo, Edge, Nature, 292: 756 (1981); Nambair et al., Science, 223: 1299 (1984); Jayetal., J. Biol. Chem., 259: 6311 (1984).
C. Análisis in silico de inmunogenicidad.
Si es necesario, se puede evaluar la inmunogenicidad de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento y, según sea necesario, se puede inmunizar (es decir, el anticuerpo se vuelve menos inmunorreactivo al alterar uno o más epítopos de células T). El análisis de la inmunogenicidad y los epítopos de células T presentes en los anticuerpos anti-endoglina humanizados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden llevarse a cabo mediante el uso de software y bases de datos específicas. El software y las bases de datos de ejemplo incluyen iTope™ desarrollado por Antitope de Cambridge, Inglaterra. iTope™ es una tecnología in silico para el análisis de la unión de péptidos a alelos MHC de clase II humanos.
El software iTope™ predice la unión de péptidos a alelos MHC de clase II humanos y, por lo tanto, proporciona una pantalla inicial para la ubicación de tales "posibles epítopos de células T". El software iTope™ predice interacciones favorables entre las cadenas laterales de aminoácidos de un péptido y los bolsillos de unión específicos dentro de las ranuras de unión de 34 alelos MHC de clase II humanos. La ubicación de los residuos de unión clave se logra mediante la generación in silico de péptidos 9mero que se solapan con un aminoácido que abarca la secuencia de la región variable del anticuerpo de prueba. Cada péptido 9mero puede probarse contra cada uno de los 34 alotipos de MHC de clase II y puntuarse en función de su potencial "ajuste" e interacciones con el surco de unión de MHC de clase II. Los péptidos que producen una puntuación de unión media alta (>0.55 en la función de puntuación iTope™) contra >50% de los alelos de clase II de MHC se consideran epítopos de células T potenciales. En tales regiones, la secuencia de aminoácidos del núcleo 9 para la unión de péptidos dentro del surco de MHC de clase II se analiza para determinar los residuos de bolsillo de m Hc de clase II (PI, P4, P6, P7 y P9) y el posible contacto del receptor de células T (TCR) residuos (P-1, P2, P3, P5, P8).
Después de la identificación de cualquier epítopo de células T, se pueden introducir cambios en los residuos de aminoácidos, sustituciones, adiciones y/o eliminaciones para eliminar el epítopo de células T identificado. Tales cambios se pueden hacer para preservar la estructura y función del anticuerpo mientras se elimina el epítopo identificado. Los cambios de ejemplo pueden incluir, entre otros, cambios conservadores de aminoácidos.
Se han puesto en práctica técnicas que explotan complejos solubles de moléculas de MHC recombinantes en combinación con péptidos sintéticos. Estos reactivos y procedimientos se pueden usar para identificar la presencia de clones de células T de muestras de sangre periférica de sujetos humanos o animales experimentales que pueden unir complejos particulares de péptidos MHC y no están adaptados para la detección de múltiples epítopos potenciales a una amplia diversidad de alotipos MHC.
Los ensayos biológicos de activación de células T siguen siendo la mejor opción práctica para proporcionar una lectura de la capacidad de una secuencia de péptido/proteína de prueba para provocar una respuesta inmune. Ejemplos de este tipo de metodología incluyen el uso de ensayos de proliferación de células T para la estafiloquinasa de la proteína bacteriana, seguido del mapeo de epítopos usando péptidos sintéticos para estimular las líneas de células T. De manera similar, los ensayos de proliferación de células T que utilizan péptidos sintéticos de la proteína de la toxina tetánica han dado como resultado la definición de regiones de epítopo inmunodominantes de la toxina.
Los epítopos de células T en una proteína de prueba pueden determinarse usando subconjuntos aislados de células inmunes humanas, promoviendo su diferenciación in vitro y el cultivo de las células en presencia de péptidos sintéticos de interés y la medición de cualquier proliferación inducida en el cultivo de células T. También se pueden usar otras técnicas. Dicha técnica implica la aplicación cuidadosa de técnicas de aislamiento celular y cultivo celular con múltiples suplementos de citoquinas para obtener los subconjuntos de células inmunes deseadas (células dendríticas, células T CD4+ o CD8+). En otro ejemplo, la presencia de epítopos de células T en un anticuerpo puede determinarse agregando el anticuerpo a subconjuntos aislados de células inmunes humanas, y evaluando su diferenciación in vitro y midiendo cualquier proliferación inducida en las células T cultivadas.
También se pueden utilizar técnicas in silico para definir ligandos de MHC de clase II para múltiples proteínas de interés terapéutico. Sin embargo, por razones como el requisito de procesamiento proteolítico y otros pasos fisiológicos que conducen a la presentación de péptidos inmunogénicos in vivo, un subconjunto de todo el repertorio de péptidos definible por esquemas basados en ordenador puede tener relevancia biológica. Por lo tanto, los ensayos de activación de células T humanas ex vivo se pueden usar para identificar las regiones dentro de la secuencia de proteínas de un polipéptido que pueden soportar la activación de células T y, por lo tanto, son biológicamente más relevantes para el problema de inmunogenicidad en esta proteína. Como se usa en el presente documento, "epítopo de células T" se refiere a una secuencia de aminoácidos que puede unirse a MHC de clase II, capaz de estimular a las células T y/o también a unirse (sin necesariamente una activación medible) de células T en complejo con MHC clase II.
De acuerdo con un método descrito aquí, los péptidos sintéticos o los anticuerpos completos se prueban para determinar su capacidad para provocar una respuesta proliferativa en células T humanas cultivadas in vitro. Las células T están presentes dentro de una capa de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fácilmente obtenible por medios bien conocidos a partir de muestras de sangre completa. Además, la preparación de PBMC contiene proporciones fisiológicas de células T y células presentadoras de antígeno y, por lo tanto, es una buena fuente de materiales con los que llevar a cabo una reacción inmune sustituta in vitro. En la operación de dicho ensayo, un índice de estimulación cercano o superior a 2.0 es una medida útil de la proliferación inducida. Sin embargo, el índice de estimulación puede ser diferente dependiendo del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, y puede establecerse con referencia a una línea base para cada anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, y la biblioteca de péptidos correspondiente. En un ejemplo de tales pruebas, el índice de estimulación (SI) puede derivarse convencionalmente por división de la puntuación de proliferación (por ejemplo, recuentos por minuto de radiactividad si se usa, por ejemplo, la incorporación de 3H-timidina) medida al péptido de prueba por la puntuación medida en células no contactadas con un péptido de prueba. Los péptidos que no evocan respuesta pueden dar un SI=1.0, aunque los valores de SI en el rango 0.8-1.2 también pueden no ser notables. Se pueden incorporar varios procedimientos técnicos en la operación de dichos ensayos para garantizar la confianza en los puntajes registrados. Por lo general, todas las determinaciones se realizan al menos por triplicado y se puede calcular la puntuación media. Cuando un SI calculado => 2.0, los puntajes individuales del triplicado se pueden examinar en busca de evidencia de datos periféricos. Los péptidos de prueba se ponen en contacto con las células en al menos dos concentraciones diferentes y las concentraciones típicamente abarcarían una diferencia de concentración mínima de dos veces. Tal rango de concentración proporciona un desplazamiento a la dimensión cinética del ensayo y puede ser útil cuando se realiza una determinación de un solo punto de tiempo, por ejemplo, en el día más 7. En algunos ensayos, se pueden realizar determinaciones de curso de tiempo múltiple y también se pueden hacer usando inmunógeno de péptido proporcionado a un mínimo de dos concentraciones diferentes. De manera similar, la inclusión de péptidos de control para los que se espera que la mayoría de las muestras de donantes de PBMC respondan puede incluirse en cada placa de ensayo. El péptido de hemaglutinina de la gripe 307-309, secuencia PKYv Kq NTLKLA (SEQ ID NO: 104); y la secuencia peptídica Chlamydia HSP60 KVVDQIKKiSk PVQH (SEQ ID NO: 105) son ejemplos de péptidos de control que se utilizarán en dicho ensayo. Alternativamente, o además, los ensayos también podrían usar un potente antígeno de proteína completa, como la hemocianina de Keyhole Limpet, al que se esperaría que todas las muestras de PBMC exhiban un SI significativamente mayor que 2.0. Otros antígenos de control para tal uso serán bien conocidos en la técnica.
Los métodos descritos en el presente documento pueden proporcionar un mapa de epítopos de anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, donde el mapa tiene relevancia para un amplio espectro de posibles alotipos de MHC. El mapa puede ser lo suficientemente representativo como para permitir el diseño o la selección de una proteína modificada para la cual la capacidad de la proteína de evocar una respuesta inmune impulsada por células T puede ser eliminada o al menos mejorada para la mayoría de los pacientes a quienes es probable que la proteína para ser administrado La mejora puede referirse a una reducción en una respuesta inmune (es decir, inmunogenicidad reducida) en comparación con una proteína no modificada (por ejemplo, aproximadamente 1.5 veces menos, aproximadamente 2 veces menos, aproximadamente 5 veces menos, aproximadamente 10 veces menos, aproximadamente 20 veces menos, aproximadamente 50 veces menos, aproximadamente 100 veces menos, aproximadamente 200 veces menos, aproximadamente 500 veces menos o más, o cualquier rango en el mismo). Alternativamente, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, con inmunogenicidad reducida pueden referirse a una reducción porcentual en su capacidad para provocar una respuesta inmune en comparación con una proteína no modificada (por ejemplo, aproximadamente 1% menos, aproximadamente 2% menos, aproximadamente 3% menos, aproximadamente 4% menos, aproximadamente 5% menos, aproximadamente 10% menos, aproximadamente 20% menos, aproximadamente 50% menos, aproximadamente 100% menos y cualquier rango en el mismo). Por consiguiente, en la práctica del proceso de selección, las células T derivadas de PBMC de donantes ingenuos se recogen de un grupo de donantes de diversidad inmunológica suficiente para proporcionar una muestra de al menos más del 90% del repertorio de MHC de clase II (HLA-DR) existente en la población humana. Cuando se detecta una respuesta de células T ingenua a un péptido (o anticuerpo) sintético dado, el péptido (o anticuerpo) en la práctica se pone en contacto con preparaciones de PBMC derivadas de múltiples donantes de forma aislada; el número de donantes (o el tamaño del "grupo de donantes"), para fines prácticos, no es probable que sea inferior a 20 individuos no relacionados y todas las muestras en el grupo de donantes pueden preseleccionarse de acuerdo con su haplotipo MHC de clase II.
Como se usa en este documento, el término "donante ingenuo" se refiere a un sujeto que no ha sido expuesto previamente a anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, descritos aquí ambientalmente, por vacunación o por otros medios tales como, por ejemplo , transfusiones de sangre.
Cuando se exploran los epítopos de células T, se pueden proporcionar células T a partir de una muestra de sangre periférica de una multiplicidad de donantes sanos diferentes pero que no han recibido la proteína terapéuticamente. Si es necesario, las muestras de sangre del paciente pueden analizarse para detectar la presencia de un polipéptido particular usando ensayos convencionales como un ELISA que usa anticuerpos para identificar la presencia o ausencia de uno o más polipéptidos. El ensayo se lleva a cabo utilizando PBMC cultivadas in vitro utilizando procedimientos convencionales conocidos en la técnica e implica poner en contacto las PBMC con especies de péptidos sintéticos representativos de la proteína de interés (es decir, una biblioteca), o una proteína completa, como un anticuerpo, y seguir una adecuada período de incubación, medición de la activación inducida de células T, como la proliferación celular. La medición puede realizarse por cualquier medio adecuado y, por ejemplo, puede realizarse utilizando la incorporación de timidina H3, por lo que la acumulación de H3 en material celular se mide fácilmente utilizando instrumentos de laboratorio. El grado de proliferación celular para cada combinación de muestra de PBMC y péptido sintético o proteína completa se puede examinar en relación con el observado en una muestra de PBMC no tratada. También se puede hacer referencia a la respuesta proliferativa observada después del tratamiento con un péptido o péptidos o proteínas completas para las cuales existe un efecto proliferativo esperado. A este respecto, es ventajoso usar un péptido o proteína completa con restricción amplia de MHC conocida y especialmente epítopos peptídicos con restricción de MHC a los isotipos DP o DQ, aunque la invención no se limita al uso de tales péptidos o proteínas restringidos. Dichos péptidos se han descrito anteriormente, por ejemplo, con respecto a la hemaglutinina de influenza y la clamidia HSP60.
En un ejemplo no limitante, los epítopos de células T se mapean y posteriormente se modifican usando los métodos descritos aquí. Para facilitar el ensamblaje de un mapa de epítopos, se produce una biblioteca de péptidos sintéticos. Cada uno de los péptidos tiene una longitud de 15 residuos de aminoácidos y cada uno solapa el siguiente péptido de la serie con 12 residuos de aminoácidos; es decir, cada péptido sucesivo de la serie agregó incrementalmente otros 3 aminoácidos al análisis. De esta manera, cualquier par adyacente dado de péptidos mapeó 18 aminoácidos de secuencia contigua. En los siguientes ejemplos se ilustra un método para definir un mapa de células T utilizando ensayos de células T ingenuos. Se sugiere que cada uno de los péptidos identificados mediante el método para definir un mapa de células T pueda unirse al MHC de clase II y comprometer al menos un TCR cognato con suficiente afinidad para provocar una explosión proliferativa detectable en el sistema de ensayo.
En otro ejemplo no limitante, el potencial de un anticuerpo para ser procesado para generar epítopos de células T que se unen a MHC de clase II y comprometen al menos un TCR cognato con suficiente afinidad para provocar un estallido proliferativo detectable en el sistema de ensayo.
Las moléculas descritas en el presente documento pueden prepararse de cualquiera de varias maneras, incluyendo el uso de métodos recombinantes. Las secuencias de proteínas y la información proporcionada en este documento pueden usarse para deducir un polinucleótido (ADN) que codifica una secuencia de aminoácidos. Esto se puede lograr, por ejemplo, utilizando herramientas de software como el paquete de software DNAstar [DNAstar Inc, Madison, Wisconsin, Estados Unidos] o similar. Cualquier polinucleótido que codifique los polipéptidos u homólogos significativos, variantes, truncamientos, alargamientos o modificaciones adicionales de los mismos, se contemplan en el presente documento.
En este documento se describen métodos para mapear (identificar) epítopos de células T y modificar los epítopos de modo que la secuencia modificada reduzca (parcial o completamente) la inducción de una respuesta T auxiliar. La modificación incluye sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos hechas en codones de un polinucleótido que codifica polipéptidos modificados para afectar cambios similares. Los codones que codifican los residuos de aminoácidos son bien conocidos en la técnica. Es posible usar métodos de ADN recombinante para lograr la mutagénesis dirigida de las secuencias diana y muchas de tales técnicas están disponibles, se describen en este documento y se conocen en la técnica, como se describió anteriormente. En general, la técnica de mutagénesis específica del sitio es bien conocida. En resumen, se emplea un vector bacteriófago que produce una plantilla monocatenaria para mutagénesis por PCR dirigida por oligonucleótidos. Los vectores de fagos (por ejemplo, M13) están disponibles comercialmente y su uso es generalmente bien conocido en la técnica. De manera similar, los plásmidos bicatenarios también se emplean habitualmente en mutagénesis dirigida al sitio, lo que elimina la etapa de transferir el polinucleótido de interés de un fago a un plásmido. Los cebadores oligonucleotídicos sintéticos que llevan la secuencia mutada deseada pueden usarse para dirigir la síntesis in vitro de ADN modificado (mutante deseado) a partir de esta plantilla y el a Dn heterodúplex se usa para transformar E. coli competente para la selección de crecimiento e identificación de clones deseados. Alternativamente, un par de cebadores pueden ser fusionados en dos cadenas separadas de un vector bicatenario para sintetizar simultáneamente ambas cadenas complementarias correspondientes con las mutaciones deseadas en una reacción de PCR.
En un ejemplo, se puede emplear el método Quick Change de mutagénesis dirigida al sitio usando plantillas de ADN plasmídico. La amplificación por PCR de la plantilla de plásmido que contiene el gen diana del inserto se logra usando dos cebadores oligonucleotídicos sintéticos que contienen la mutación deseada. Los cebadores oligonucleotídicos, cada uno complementario a las cadenas opuestas del vector, se extienden durante el ciclo de temperatura mediante la ADN polimerasa PfuTurbo de grado de mutagénesis. Al incorporar los cebadores oligonucleotídicos, se genera un plásmido mutado que contiene mellas escalonadas. Los productos no metilados amplificados se tratan con Dpn I para digerir la plantilla de ADN parental metilado y seleccionar las mutaciones que contienen ADN recién sintetizado. Dado que el a Dn aislado de la mayoría de las cepas de E. coli está metilado, es susceptible a la digestión Dpn I, que es específica para el ADN metilado y hemimetilado. Los productos de reacción se transforman en cepas de E. coli de alta eficiencia para obtener plásmidos que contienen las modificaciones deseadas. Los métodos adicionales para introducir modificaciones de aminoácidos en un polipéptido son bien conocidos en la técnica y también se pueden usar en el presente documento.
Las modificaciones adecuadas a una proteína pueden incluir la sustitución de aminoácidos de residuos particulares o combinaciones de residuos. Para la eliminación de epítopos de células T, las sustituciones de aminoácidos se realizan en puntos apropiados o residuos de aminoácidos dentro de una secuencia de aminoácidos prevista para lograr la reducción o eliminación de la actividad del epítopo de células T. En la práctica, un punto apropiado o un residuo de aminoácido preferiblemente equivaldrá a la unión de un residuo de aminoácido dentro de uno de los bolsillos provistos dentro del surco de unión de MHC de clase II. Dichas modificaciones pueden alterar la unión dentro del primer bolsillo de la hendidura en la posición denominada "P1" o "ancla de PI" del péptido. Se reconoce que la calidad de la interacción de unión entre el residuo de anclaje de PI del péptido y el primer bolsillo del surco de unión de MHC de clase II es un determinante principal de la afinidad de unión global para el péptido completo. Una sustitución apropiada en esta posición de la secuencia de aminoácidos generalmente incorporará un residuo de aminoácido que se acomoda menos fácilmente dentro de la bolsa (por ejemplo, la sustitución por un residuo más hidrófilo). Los residuos de aminoácidos en el péptido en posiciones equivalentes a la unión dentro de otras regiones de bolsillo dentro de la hendidura de unión a MHC también se consideran y caen dentro del alcance del presente.
Se entiende que las modificaciones de aminoácidos individuales dentro de un epítopo de células T potencial dado representan una ruta por la cual se pueden eliminar uno o más epítopos de células T. Se pueden contemplar combinaciones de modificaciones dentro de un solo epítopo y pueden ser apropiadas cuando los epítopos definidos individualmente se superponen entre sí. Además, las modificaciones de aminoácidos (ya sea individualmente dentro de un epítopo dado o en combinación dentro de un solo epítopo) se pueden hacer en posiciones que no sean iguales a los "residuos de bolsillo" con respecto al surco de unión de MHC de clase II, pero en cualquier punto dentro del aminoácido secuencia. Las modificaciones pueden hacerse con referencia a una estructura homóloga o método estructural producido usando técnicas in silico conocidas en la técnica y descritas en el presente documento pueden basarse en características estructurales conocidas del polipéptido. Se puede contemplar un cambio (modificación) para restaurar la estructura o la actividad biológica de la molécula variante. Dichos cambios compensatorios y cambios también pueden incluir la eliminación o adición (inserción) de residuos de aminoácidos particulares de un polipéptido. Además, se pueden hacer modificaciones que alteren la estructura y/o reduzcan la actividad biológica de la molécula y también eliminen un epítopo de células T, reduciendo así la inmunogenicidad de la molécula. Todos los tipos de modificaciones se contemplan aquí.
Un medio adicional para eliminar epítopos de las moléculas de proteína es el uso concertado de un esquema de ensayo de activación de células T ingenuas como se describe en el presente documento junto con una herramienta in silico desarrollada de acuerdo con el esquema descrito en el documento WO 02/069232.
El software simula el proceso de presentación de antígeno a nivel de la interacción de unión polipéptido-MHC de clase II para proporcionar una puntuación de unión para cualquier secuencia de polipéptido dada. Dicha puntuación se determina para muchos de los alotipos predominantes de MHC de clase II existentes en la población. Como este esquema puede probar cualquier secuencia de polipéptidos, se pueden predecir las consecuencias de las adiciones o eliminaciones de sustituciones de aminoácidos con respecto a la capacidad de un polipéptido para interactuar con un surco de unión de MHC de clase II. En concordancia, se pueden diseñar nuevas composiciones de secuencia que contengan un número reducido de aminoácidos capaces de interactuar con un MHC de clase II y, por lo tanto, funcionar como epítopos inmunogénicos de células T. Cuando el ensayo biológico que usa una muestra de donante determinada puede evaluar la unión a un máximo de cuatro alotipos DR, el proceso in silico puede probar una misma secuencia de polipéptidos usando >40 alotipos simultáneamente. En la práctica, este enfoque es capaz de dirigir el diseño de nuevas variantes de secuencia que se alteran en su capacidad de interactuar con múltiples alotipos MHC. Como quedará claro para un experto en la técnica, se podrían llegar a múltiples conjuntos alternativos de sustituciones para lograr el objetivo de eliminar epítopos no deseados. Sin embargo, se reconocería que las secuencias resultantes son estrechamente homólogas con las composiciones específicas descritas en este documento.
Una metodología combinada de usar una herramienta in silico para la identificación de ligandos de MHC de clase II y el diseño de análogos de secuencia que carecen de ligandos de MHC de clase II, en concierto con mapeo de epítopos y reevaluación opcionalmente usando ensayos biológicos de activación de células T es un método adicional y una realización de la presente solicitud. El método general de acuerdo con este ejemplo comprende los siguientes pasos: i) uso de ensayos de activación de células T ingenuos y péptidos sintéticos que abarcan colectivamente la secuencia de proteínas de interés para identificar regiones de epítopos capaces de activar células T;
ii) el uso de un esquema computacional que simula la unión del ligando peptídico con uno o más alotipos de MHC para analizar las regiones del epítopo identificadas en el paso (i) y así identificar los ligandos de MHC de clase II dentro de la región del epítopo;
iii) uso de un esquema computacional que simula la unión del ligando peptídico con uno o más alotipos de MHC para identificar análogos de secuencia de los ligandos de MHC incluidos en la(s) región(es) del epítopo que ya no se unen a MHC de clase II o se unen con afinidad reducida a un menor número de alotipos MHC y, opcionalmente,
iv) uso de ensayos de activación de células T ingenuos y péptidos sintéticos que abarcan completamente o en conjunto que abarcan las regiones del epítopo identificadas dentro de la proteína de interés y prueba de los análogos de secuencia en el ensayo de activación de células T ingenuo en paralelo con las secuencias de tipo salvaje (parental).
En un ejemplo, un método para hacer un anticuerpo modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que exhibe inmunogenicidad reducida en comparación con un anticuerpo no modificado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende identificar al menos un epítopo de células T dentro del aminoácido secuencia de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, y modificando al menos un residuo de aminoácido dentro de al menos un epítopo de células T identificado.
En otro ejemplo, un anticuerpo modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que exhibe inmunogenicidad reducida en comparación con un anticuerpo no modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se produce mediante un proceso de identificación de al menos un epítopo de células T dentro del amino secuencia ácida de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, y modificando al menos un residuo de aminoácido dentro de al menos un epítopo de células T identificado.
En otro ejemplo más, un método para seleccionar un anticuerpo modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que exhibe inmunogenicidad reducida en comparación con un anticuerpo no modificado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende identificar al menos un epítopo de células T dentro de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, modificando al menos un residuo de aminoácido dentro de al menos un epítopo de células T identificado, y seleccionando un anticuerpo modificado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que exhibe inmunogenicidad reducida en comparación con un anticuerpo no modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Los epítopos de células T descritos en el presente documento pueden caracterizarse adicionalmente por las regiones del epítopo. Dichas regiones incluyen el núcleo del epítopo, el N-terminal y el C-terminal. Como se usa en el presente documento, "núcleo de epítopo" se refiere a las secuencias de aminoácidos de 9-mero centrales de los epítopos de células T. El núcleo del epítopo puede incluir además 0, 1, 2 o 3 residuos de aminoácidos adyacentes a la secuencia de aminoácidos de 9-mero centrales en el extremo N y/o el extremo C. Así, el núcleo del epítopo puede variar en longitud desde aproximadamente 9 aminoácidos hasta aproximadamente 15 aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, "N-terminal" se refiere a los aminoácidos adyacentes al N-terminal del núcleo del epítopo e incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos adyacente y corriente arriba del extremo N del núcleo del epítopo.
Como se usa en el presente documento, "terminal C" se refiere a los aminoácidos adyacentes al terminal C del núcleo del epítopo e incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos ácidos adyacentes y corriente abajo del extremo C del núcleo del epítopo.
En un ejemplo, un anticuerpo modificado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, contiene una o más modificaciones.
En un ejemplo, un anticuerpo modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, contiene dos modificaciones.
En un ejemplo, un anticuerpo modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, contiene tres modificaciones.
En un ejemplo, un anticuerpo modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, contiene cuatro modificaciones.
En un ejemplo, un anticuerpo modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, contiene cinco modificaciones.
En un ejemplo, un anticuerpo modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, contiene seis modificaciones.
En un ejemplo, un anticuerpo modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, contiene siete modificaciones.
En un ejemplo, un anticuerpo modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, contiene ocho modificaciones.
En un ejemplo, un anticuerpo modificado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, contiene nueve modificaciones.
En un ejemplo, un anticuerpo modificado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, contiene diez modificaciones.
En un ejemplo, un anticuerpo modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, contiene hasta veinte modificaciones.
En este documento se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93-(VK1AA) y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecido como SEQ ID NO: 89 (VH1A2).
En este documento se describe un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como una cualquiera de las SEQ ID NO: 88, 89, 90, 91 y 92.
En este documento se describe un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como una cualquiera de las SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 97, 100, 102 y 103.
En este documento se describe un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la endoglina, que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 89 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecido como SEQ ID NO: 93, en donde:
(i) la región variable de la cadena pesada comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de glicina (G) por alanina (A) o serina (S) en la posición 49; una sustitución de alanina (A) por isoleucina (I) en la posición 51; una sustitución de lisina (K) por arginina (R) o asparagina (Q) en la posición 52b; una sustitución de leucina (L) porvalina (V) en la posición 78 utilizando el sistema de numeración Kabat; y
(ii) la región variable de la cadena liviana comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de metionina (M) por leucina (L) en la posición 4; una sustitución de alanina (A) porvalina (V) en la posición 19; una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 22; una sustitución de alanina (A) por isoleucina (I) en la posición 48; y una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 51 utilizando el sistema de numeración Kabat.
En este documento se describe un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 88, 89, 90, 91 y 92; y una región variable de la cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93, 95, 96, 97, 100, 102 o 103.
Además de los ejemplos y realizaciones mencionados anteriormente, se contempla un anticuerpo modificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, con una o más modificaciones de aminoácidos en uno o más epítopos de células T.
Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden tener al menos una modificación en al menos un epítopo de células T. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden tener al menos una modificación de aminoácidos en 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de los epítopos de células T descritos en este documento. Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden tener más de una modificación de aminoácidos en más de un epítopo de células T. Cualquier combinación de las modificaciones de aminoácidos en cualquier número de anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, epítopos de células T descritos anteriormente se contemplan aquí.
Epítopos de células T y frecuencia de alotipo
Los epítopos individuales encontrados dentro de los antígenos pueden presentarse preferentemente mediante alotipos específicos de MHC de clase II, y de manera similar otros epítopos específicos dentro del mismo antígeno pueden no presentarse en absoluto en las moléculas de MHC de clase II. Se ha demostrado que tales asociaciones de epítopos particulares con moléculas específicas de MCH clase II dependen del alotipo MHC clase II del individuo. La asociación de un epítopo específico con un alotipo específico también se puede considerar al modificar anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, para la eliminación de epítopos de células T. Dichas consideraciones pueden permitir la modificación altamente específica de un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para alotipos específicos (por ejemplo, para poblaciones específicas de sujetos que tienen ciertos alotipos de MHC de clase II). El alotipo MHC de clase II de un sujeto o sujetos se puede determinar fácilmente mediante métodos de genotipificado conocidos en la técnica, y la asociación de epítopos de células T con el alotipo dado se identifica así fácilmente, para su consideración en la modificación de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno del mismo, adaptado a ese alotipo. La identificación de asociaciones entre epítopos de células T y alotipos de MHC de clase II se describe con más detalle en los ejemplos más adelante. En el presente documento se contemplan anticuerpos modificados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que tienen modificaciones de epítopos de células T adaptadas a las asociaciones de MHC de clase II identificadas para los epítopos dados.
D. Anticuerpos anti-endoglina
La incorporación simultánea de todos los ácidos nucleicos que codifican FR y/o CDR y todos los cambios de posición de aminoácidos seleccionados se puede lograr mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, síntesis recombinante y química. Por ejemplo, la incorporación simultánea se puede lograr, por ejemplo, sintetizando químicamente la secuencia de nucleótidos para la región variable aceptora, fusionada junto con los ácidos nucleicos codificadores de CDR del donante, e incorporando en las posiciones seleccionadas para albergar residuos de aminoácidos variables una pluralidad de correspondientes codones de aminoácidos.
En el presente documento se proporcionan anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a endoglina. También se proporcionan anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a la endoglina e inhiben (parcial o totalmente) o manejan/tratan (parcial o totalmente) la angiogénesis/neovascularización, dilatación de pequeños vasos y/o enfermedades asociadas con angiogénesis excesiva. De manera similar, la inhibición de la función de la endoglina (por ejemplo, señalización, unión, activación y similares) también se incluye dentro del significado de inhibición o unión de la endoglina. En otra realización más, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inhibe la angiogénesis uniéndose a endoglina. La divulgación también describe líneas celulares que pueden usarse para producir los anticuerpos, métodos para producir las líneas celulares, métodos para expresar anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno y purificarlos.
Se puede reconocer que los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a la endoglina generada usando los métodos descritos en el presente documento se pueden probar usando los ensayos proporcionados en este documento o conocidos en la técnica por la capacidad de unirse a la endoglina usando métodos convencionales que incluyen, pero se limitan a, ELISA. La afinidad de los anticuerpos descritos en el presente documento también se puede determinar usando métodos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, Biacore o resonancia de plasmón superficial.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en este documento se construyeron por humanización de las secuencias Vh y Vl del anticuerpo TRC105. Para lograr esta humanización, se creó y analizó un modelo tridimensional de las cadenas Vh y Vl de TRC105. Las secuencias Vh y Vl se compararon luego individualmente con una base de datos de secuencias de línea germinal humana, de las cuales se seleccionaron las secuencias Vh y Vl humanas en función de su homología con las secuencias Vh y Vl de TRC105. La secuencia Vl humana elegida para la humanización fue O2/O12 (VK1-39) (SEQ ID NO. 2). O2/O12 tiene una identidad de secuencia con TRC105 del 65% y el gen está altamente expresado en el repertorio de la línea germinal humana. La secuencia de Vh humana elegida para la humanización fue VH3-15 (SEQ ID NO. 40). VH3-15 tiene identidad de secuencia con TRC105 del 70% y se expresa con frecuencia razonable en el repertorio de línea germinal humana. Las posiciones de aminoácidos que eran diferentes entre TRC105 y las secuencias humanas se examinaron en el modelo 3D de TRC105 para determinar qué sustituciones se considerarían para modificación. Los criterios de selección de aminoácidos basados en el análisis del modelo 3D incluyeron, pero no se limitaron a, por ejemplo, efectos estéricos relacionados con el aminoácido, la carga relativa del aminoácido y la ubicación del aminoácido dentro de la variable pesada y/o cadenas livianas, las sustituciones identificadas y propuestas para las regiones marco humanas se incorporan en las regiones marco humanas 02 y VH3-15, y las CDR de TRC105 se injertan en las regiones marco humanas 02 y VH3-15 correspondientes dando como resultado una multitud de anticuerpos o antígenos humanizados fragmentos de unión. Además, el FR-4 de la cadena liviana se deriva de la secuencia de la línea germinal J humana Jk4. De manera similar, el FR-4 de la cadena pesada se deriva de la secuencia JH4 de la línea germinal J humana.
En este documento se describen anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a antígeno que se unen a endoglina. También se describen en el presente documento anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a antígeno que se unen a endoglina e inhiben la angiogénesis. Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento se generaron como se describió anteriormente.
Los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno pueden tener una cadena pesada variable (Vh), una cadena liviana variable (Vl), ambas, o porciones de unión de las mismas. La cadena Vh puede tener una secuencia de aminoácidos establecida como cualquiera de SEQ ID NOS: 41-43, o una porción de unión de la misma. Dichas cadenas Vh pueden tener secuencias de regiones marco establecidas como cualquiera de SEQ ID NOS: 44-62. La cadena Vl puede tener una secuencia de aminoácidos establecida como cualquiera de SEQ ID NOS: 3-5, o una porción de unión de la misma. Dichas cadenas Vl pueden tener secuencias de regiones marco establecidas como cualquiera de SEQ ID NOS: 6-38.
En este documento se describe un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 41.
En este documento se describe un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 41, en donde: la región variable de la cadena pesada comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 49; una sustitución de asparagina (N) por serina (S) en la posición 76; una sustitución de treonina (T) por arginina (R) en la posición 77; una sustitución de leucina (L) por valina (V) en la posición 78; una sustitución de asparagina (N) por isoleucina (I) en la posición 82a; una sustitución de valina (V) por isoleucina (I) o leucina (L) en la posición 89; una sustitución de treonina (T) por arginina (R) o glicina (G) en la posición 94; una sustitución de leucina (L) por treonina (T) en la posición 108; una sustitución de valina (V) por leucina (L) en la posición 109; y una sustitución de serina (S) por alanina (A) en la posición 113 utilizando el sistema de numeración Kabat; y la región variable de la cadena liviana comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) en la posición 1; una sustitución de glutamina (Q) por valina (V) en la posición 3; una sustitución de metionina (M) por leucina (L) en la posición 4; una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 5; una sustitución de tirosina (Y) porfenilalanina (F) en la posición 36; una sustitución de leucina (L) por prolina (P) en la posición 46; una sustitución de leucina (L) por triptófano (W) en la posición 47; una sustitución de serina (S) por valina (V) o alanina (A) en la posición 60; una sustitución de ácido aspártico (D) por serina (S) en la posición 70; una sustitución de fenilalanina (F) portirosina (Y) en la posición 71; una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 100; y una sustitución de isoleucina (I) por leucina (L) en la posición 106 utilizando el sistema de numeración de Kabat.
En este documento se describe un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la endoglina que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 41, 42 o 43; y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 3, 4 o 5. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 41 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 3. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 41 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 4. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 41 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 5. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 42 y una variable de cadena liviana región que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 3. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 42 y una variable de cadena liviana región que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 4. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 42 y una variable de cadena liviana región que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 5. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 43 y una variable de cadena liviana región que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 3. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 43 y una variable de cadena liviana región que tiene una secuencia de aminoácidos establecido como SEQ ID NO: 4. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 43 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecido como SEQ ID NO: 5. Tales anticuerpos pueden unirse a la endoglina e inhibir la angiogénesis.
En cualquiera de dichos ejemplos, una región variable de la cadena pesada puede comprender además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en: una sustitución de asparagina (N) por serina (S) en la posición 76; una sustitución de treonina (T) por arginina (R) en la posición 77; una sustitución de asparagina (N) por isoleucina (I) en la posición 82a; una sustitución de valina (V) por isoleucina (I) o leucina (L) en la posición 89; una sustitución de treonina (T) por glicina (G) en la posición 94; una sustitución de leucina (L) portreonina (T) en la posición 108; una sustitución de valina (V) por leucina (L) en la posición 109; y una sustitución de serina (S) por alanina (A) en una posición 113; y la región variable de la cadena liviana puede comprender además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en: una sustitución de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) en la posición 1; una sustitución de glutamina (Q) por valina (V) en la posición 3; una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 5; una sustitución detirosina (Y) porfenilalanina (F) una posición 36; una sustitución de serina (S) por valina (V) o alanina (A) en la posición 60; una sustitución de ácido aspártico (D) por serina (S) en la posición 70; una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 100, y una sustitución de isoleucina (I) por leucina (L) en la posición 106 utilizando el sistema de numeración Kabat.
En este documento se describe un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la endoglina, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde dicha región variable de cadena pesada comprende:(i) una CDR1 de SEQ ID NO: 66, una CDR2 de SEQ ID NO: 67, y una CDR3 de SEQ ID NO: 68;
(ii) una cadena pesada FR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 excepto por una o más sustituciones conservadoras;
(iii) una FR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 excepto por una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 49 utilizando el sistema de numeración de Kabat; y
(iv) una FR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, excepto una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de asparagina (N) por serina (S) en la posición 76;
(b) una sustitución de treonina (T) por arginina (R) en la posición 77;
(c) una sustitución de leucina (L) por valina (V) en la posición 78;
(d) una sustitución de asparagina (N) por isoleucina (I) en la posición 82a;
(e) una sustitución de valina (V) por isoleucina (I) o leucina (L) en la posición 89; y
(f) una sustitución de treonina (T) por arginina (R) o glicina (G) en la posición 94 utilizando el sistema de numeración Kabat; y
(v) una cadena pesada FR4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de leucina (L) por treonina (T) en la posición 108;
(b) una sustitución de valina (V) por leucina (L) en la posición 109; y
(c) una sustitución de serina (S) por alanina (A) en la posición 113 utilizando el sistema de numeración Kabat; y dicha región variable de la cadena liviana comprende:
(i) una CDR1 de SEQ ID NO: 63, una CDR2 de SEQ ID NO: 64 y una CDR3 de SEQ ID NO: 65;
(ii) una cadena liviana FR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) en la posición 1;
(b) una sustitución de glutamina (Q) por valina (V) en la posición 3;
(c) una sustitución de metionina (M) por leucina (L) en la posición 4; y
(d) una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 5; utilizando el sistema de numeración Kabat; y (iii) una FR2 de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, excepto una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de tirosina (Y) por fenilalanina (F) en la posición 36;
(b) una sustitución de leucina (L) por prolina (P) en la posición 46; y
(c) una sustitución de leucina (L) portriptófano (W) en la posición 47 utilizando el sistema de numeración Kabat; y (iv) una cadena liviana FR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de serina (S) por valina (V) o alanina (A) en la posición 60;
(b) una sustitución de ácido aspártico (D) por serina (S) en la posición 70; y
(b) una sustitución de fenilalanina (F) portirosina (Y) en la posición 71 utilizando el sistema de numeración Kabat; y (v) una cadena liviana FR4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 100; y
(b) una sustitución de isoleucina (I) por leucina (L) en la posición 106 utilizando el sistema de numeración Kabat.
Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en el presente documento puede comprender una región variable de cadena pesada CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 66, una región variable de cadena pesada CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos como expuesto en la SEQ ID NO: 67, una región variable de cadena pesada CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 68, una región variable de cadena liviana CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 63 , una región variable de cadena liviana CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 64, y una región variable de cadena liviana CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 65.
En un ejemplo, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a endoglina y comprende una región variable de cadena pesada FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en s Eq ID NO: 44; una región variable de cadena pesada FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 45; una región variable de cadena pesada FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 47; una región variable de cadena pesada FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 56.
En otro ejemplo, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a la endoglina y comprende una región variable de cadena pesada FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 44; una región variable de cadena pesada FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 46; una región variable de cadena pesada FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 48; una región variable de cadena pesada FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 56.
En otro ejemplo, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena liviana f R1 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 6; una región variable de cadena liviana FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 20; una región variable de cadena liviana FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 28; y una región variable de cadena liviana FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 35.
En otro ejemplo, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a endoglina y comprende una región variable de cadena liviana FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 6; una región variable de cadena liviana FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 21; una región variable de cadena liviana FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 29; y una región variable de cadena liviana FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 35.
En otro ejemplo, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a endoglina y comprende una región variable de cadena liviana FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 7; una región variable de cadena liviana FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 21; una región variable de cadena liviana FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 29; y una región variable de cadena liviana FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 35.
En este documento se describe un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 42 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 4.
En este documento se describe un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la endoglina, que comprende una región variable de la cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 4 y una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecido como SEQ ID NO: 42, en donde: dicha región variable de la cadena pesada comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 49; una sustitución de asparagina (N) por serina (S) en la posición 76; una sustitución de treonina (T) por arginina (R) en la posición 77; una sustitución de leucina (L) por valina (V) en la posición 78; una sustitución de asparagina (N) por isoleucina (I) en la posición 82a; una sustitución de valina (V) por isoleucina (I) o leucina (L) en la posición 89; una sustitución de arginina (R) por treonina (T) o glicina (G) en la posición 94; una sustitución de leucina (L) portreonina (T) en la posición 108; una sustitución de valina (V) por leucina (L) en la posición 109; y una sustitución de serina (S) por alanina (A) en la posición 113 utilizando el sistema de numeración Kabat; y la región variable de la cadena liviana comprende además una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) en la posición 1; una sustitución de glutamina (Q) por valina (V) en la posición 3; una sustitución de metionina (M) por leucina (L) en la posición 4; una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 5; una sustitución de tirosina (Y) por fenilalanina (F) en la posición 36; una sustitución de prolina (P) por leucina (L) en la posición 46; una sustitución de triptófano (W) por leucina (L) en la posición 47; una sustitución de serina (S) por valina (V) o alanina (A) en la posición 60; una sustitución de ácido aspártico (D) por serina (S) en la posición 70; una sustitución de tirosina (Y) por fenilalanina (F) en la posición 71; una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 100; y una sustitución de isoleucina (I) por leucina (L) en la posición 106 utilizando el sistema de numeración Kabat.
En este documento se describe un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la endoglina, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana,
en donde dicha región variable de la cadena pesada comprende:
(i) una CDR1 de SEQ ID NO: 66, una CDR2 de SEQ ID NO: 67, y una CDR3 de SEQ ID NO: 68;
(ii) una cadena pesada FR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 excepto por una o más sustituciones conservadoras;
(iii) una FR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 excepto por una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 49 utilizando el sistema de numeración de Kabat; y
(iv) una FR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, excepto una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de asparagina (N) por serina (S) en la posición 76;
(b) una sustitución de treonina (T) por arginina (R) en la posición 77;
(c) una sustitución de leucina (L) por valina (V) en la posición 78;
(d) una sustitución de asparagina (N) por isoleucina (I) en la posición 82a;
(e) una sustitución de valina (V) por isoleucina (I) o leucina (L) en la posición 89; y
(f) una sustitución de arginina (R) por treonina (T) o glicina (G) en la posición 94 utilizando el sistema de numeración Kabat; y
(v) una cadena pesada FR4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de leucina (L) por treonina (T) en la posición 108;
(b) una sustitución de valina (V) por leucina (L) en la posición 109; y
(c) una sustitución de serina (S) por alanina (A) en la posición 113 utilizando el sistema de numeración Kabat; y dicha región variable de la cadena liviana comprende:
(i) una CDR1 de SEQ ID NO: 63, una CDR2 de SEQ ID NO: 64 y una CDR3 de SEQ ID NO: 65;
(ii) una cadena liviana FR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) en la posición 1;
(b) una sustitución de glutamina (Q) por valina (V) en la posición 3;
(c) una sustitución de metionina (M) por leucina (L) en la posición 4; y
(d) una sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 5; utilizando el sistema de numeración Kabat; y (iii) una FR2 de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: (a) una sustitución de tirosina (Y) por fenilalanina (F) en la posición 36;
(b) una sustitución de prolina (P) por leucina (L) en la posición 46; y
(c) una sustitución de triptófano (W) por leucina (L) en la posición 47 utilizando el sistema de numeración Kabat; y (iv) una cadena liviana FR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de serina (S) porvalina (V) o alanina (A) en la posición 60;
(b) una sustitución de ácido aspártico (D) por serina (S) en la posición 70; y
(b) una sustitución detirosina (Y) por fenilalanina (F) en la posición 71 utilizando el sistema de numeración Kabat; y
(v) una cadena liviana FR4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 excepto por una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una sustitución de glicina (G) por alanina (A) en la posición 100; y
(b) una sustitución de isoleucina (I) por leucina (L) en la posición 106 utilizando el sistema de numeración Kabat.
Una porción sustancial de un dominio variable incluirá tres regiones CDR, junto con sus regiones marco intermedias. La porción también puede incluir al menos aproximadamente el 50% de una o ambas regiones marco primera y cuarta, siendo el 50% el 50% C-terminal de la primera región marco y el 50% N-terminal de la cuarta región marco. Los residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de la parte sustancial del dominio variable pueden ser aquellos que normalmente no están asociados con regiones de dominio variable de origen natural. Por ejemplo, la construcción de anticuerpos endoglínicos humanizados y fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento realizados mediante técnicas de ADN recombinante puede dar como resultado la introducción de residuos N o C -terminales codificados por los conectores introducidos para facilitar la clonación u otros pasos de manipulación. Otros pasos de manipulación incluyen la introducción de enlazadores para unir dominios variables a secuencias de proteínas adicionales que incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo, en la producción de diacuerpos) o etiquetas de proteínas como se analiza con más detalle más adelante.
Las regiones CDR3 de endoglina humanizada que tienen secuencias de aminoácidos sustancialmente como se exponen como las regiones CDR3 de los anticuerpos descritos en el presente documento se llevarán a cabo en una estructura que permita la unión de las regiones c DR3 a la endoglina. La estructura para transportar los CDR3 puede ser de una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo o una porción sustancial de la misma en la que las regiones CDR3 están ubicadas en ubicaciones correspondientes a la región CDR3 de dominios variables de anticuerpos VH y VL de origen natural codificados por genes de inmunoglobulina reorganizados.
En un ejemplo no limitante, se proporcionan en el presente documento anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que contienen una cadena pesada variable que tiene una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 68 y/o una cadena liviana variable que tiene un CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 65. En un ejemplo, la cadena pesada variable tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 40, excepto por una sustitución de CDR3 por la secuencia de aminoácidos CDR3 establecida como SEQ ID NO: 68. En otro ejemplo, la cadena liviana variable tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 2 excepto por una sustitución del CDR3 por la secuencia de aminoácidos CDR3 establecida como SEQ ID NO: 65. Además, tales regiones/cadenas variables que contienen CDR3 pueden comprender una o más secuencias de aminoácidos de FR establecidas, por ejemplo, como se describió anteriormente (o tales FR que contienen una o más modificaciones adicionales), donde los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno tienen 3 CDR y 4 FR en cada una de las Las regiones Vh y Vl tienen actividad de unión específica para la endoglina y son capaces de inhibir la angiogénesis. Además, diversos segmentos de anticuerpos J también pueden sustituirse dentro de estas regiones variables para una variación adicional dentro de las cadenas de regiones variables.
En un aspecto, las cadenas pesadas y ligeras variables descritas en el presente documento también pueden crearse reemplazando adicionalmente las secuencias de FR4. Las secuencias de FR4 de cadena pesada pueden sustituirse por uno de los siguientes:
Figure imgf000042_0001
Las secuencias de FR4 de la cadena liviana pueden sustituirse por uno de los siguientes:
Figure imgf000043_0001
Se describen adicionalmente en el presente documento versiones humanizadas de anticuerpos anti-endoglina alternativamente denominados anticuerpos anti-endoglina "superhumanizados" o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Dichos anticuerpos superhumanizados, o sus fragmentos de unión a antígeno, pueden comprender una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 71 o 72 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO : 75.
En otro aspecto, la presente solicitud proporciona un anticuerpo humanizado capaz de competir con un anticuerpo anti-endoglina humanizado o unión a antígeno descrito en este documento en condiciones en las que al menos el 5% de un anticuerpo que tiene las secuencias Vh y Vl del anticuerpo se bloquea para que no se una a la endoglina al competir con dicho anticuerpo en un ensayo ELISA.
En el presente documento se proporcionan anticuerpos neutralizantes o fragmentos de unión a antígeno que se unen a la endoglina y modulan la actividad de la endoglina. El anticuerpo neutralizante puede, por ejemplo, inhibir la angiogénesis uniéndose a la endoglina.
Porcentaje de (%) inhibición de la angiogénesis por un anticuerpo anti-endoglina humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, a al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, o mayor que los controles negativos es indicativo de que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la angiogénesis. El porcentaje (%) de inhibición de la angiogénesis por un anticuerpo anti-endoglina humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de menos de 2 veces mayor que los controles negativos es indicativo de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que no inhibe la angiogénesis.
La unión de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a endoglina puede parcialmente (por ejemplo, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 6 0 %, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o cualquier número allí) o inhiben completamente la angiogénesis. La actividad neutralizadora o inhibidora de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede determinar usando un ensayo in vitro y/o in vivo usando ensayos reconocidos en la técnica, como los descritos en este documento o conocidos en la técnica.
En un aspecto, el fragmento de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos humanizados descritos anteriormente es un Fab, un Fab', un Fd, un F(ab')2 , un Fv, un scFv, una unión de cadena única polipéptido (por ejemplo, un scFv con porción Fc) o cualquier otro fragmento funcional del mismo como se describe en el presente documento.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento son útiles en aplicaciones de detección o diagnóstico como se describe con más detalle más adelante. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento son útiles para unirse a la endoglina, que, a su vez, puede inhibir la angiogénesis como se describe en el presente documento.
Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, descritos en el presente documento pueden modificarse adicionalmente para alterar las propiedades específicas del anticuerpo mientras conservan la funcionalidad deseada, si es necesario. Por ejemplo, en una realización, el compuesto puede modificarse para alterar una propiedad farmacocinética del compuesto, tal como estabilidad in vivo, solubilidad, biodisponibilidad o vida media. Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, descritos en el presente documento pueden comprender además una unidad estructural terapéutica, una unidad estructural detectable, o ambas, para uso en aplicaciones de diagnóstico y/o terapéuticas.
Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, descritos en el presente documento también pueden usarse como inmunoconjugados. Como se usa en el presente documento, a los fines de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, los inmunoconjugados se refieren a conjugados compuestos por anticuerpos anti-endoglina humanizados o fragmentos de los mismos de acuerdo con la presente invención y al menos un marcador terapéutico. Las etiquetas terapéuticas incluyen agentes antitumorales e inhibidores de la angiogénesis. Dichos agentes antitumorales son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, toxinas, fármacos, enzimas, citoquinas, radionúclidos, agentes fotodinámicos e inhibidores de la angiogénesis. Las toxinas incluyen, pero no se limitan a, cadena de ricina A, exotoxinas mutantes de Pseudomonas, toxoide diftérico, estreptonigrina, boamicina, saporina, gelonina y proteína antiviral de hierba carmín. Los fármacos incluyen daunorrubicina, metotrexato y caliqueamicinas. Los radionúclidos incluyen radiometales. Las citoquinas incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento transformante (TGF)-p, interleucinas, interferones y factores de necrosis tumoral. Los agentes fotodinámicos incluyen, pero no se limitan a, porfirinas y sus derivados. Se conocerán etiquetas terapéuticas adicionales en la técnica y también se contemplan en el presente documento. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para complejar los mAbs anti-endoglina o un fragmento de los mismos con al menos un agente antitumoral (es decir, conjugados de anticuerpos revisados por Ghetie et al., 1994, Pharmacol. Ther. 63: 209 -34). Dichos métodos pueden utilizar uno de varios reactivos heterobifuncionales disponibles utilizados para acoplar o unir moléculas. Radionucleidos adicionales se describen adicionalmente en el presente documento junto con métodos adicionales para unir moléculas, tales como etiquetas terapéuticas y de diagnóstico.
Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden modificarse usando técnicas conocidas en la técnica para diversos fines tales como, por ejemplo, mediante la adición de polietilenglicol (PEG). La modificación de PEG (PEGilación) puede conducir a uno o más tiempos de circulación mejorados, solubilidad mejorada, resistencia mejorada a la proteólisis, antigenicidad e inmunogenicidad reducidas, biodisponibilidad mejorada, toxicidad reducida, estabilidad mejorada y formulación más fácil (para una revisión véase, Francis et al., International Journal of Hematology 6 8 : 1-18, 1998).
En el caso de un fragmento de unión a antígeno que no contiene una porción Fc, se puede agregar una porción de Fc (por ejemplo, recombinantemente) al fragmento, por ejemplo, para aumentar la vida media del fragmento de unión a antígeno en circulación en sangre cuando se administra a un paciente. La elección de una región Fc apropiada y los métodos para incorporar dichos fragmentos son conocidos en la técnica. La incorporación de una región Fc de una IgG en un polipéptido de interés para aumentar su vida media circulatoria, pero para no perder su actividad biológica se puede lograr utilizando técnicas convencionales conocidas en la técnica como, por ejemplo, descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 6,096,871. Las porciones Fc de anticuerpos pueden modificarse adicionalmente para aumentar la vida media del fragmento de unión a antígeno en circulación en sangre cuando se administra a un paciente. Las modificaciones pueden determinarse utilizando medios convencionales en la técnica, tales como, por ejemplo, los descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 7,217,798.
También se conocen otros métodos para mejorar la vida media de las proteínas de fusión basadas en anticuerpos en circulación, tales como, por ejemplo, los descritos en las Patentes Estadounidenses Nos 7,091,321 y 6,737,056. Además, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden producirse o expresarse de modo que no contengan fucosa en sus complejas cadenas de azúcar unidas a N-glucósido. Se sabe que la eliminación de la fucosa de las complejas cadenas de azúcar unidas a N-glucósidos aumenta las funciones efectoras de los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno, que incluyen, entre otros, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). De manera similar, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que pueden unirse a la endoglina se pueden unir en su extremo C-terminal a la totalidad o parte de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgD e IgM y cualquier de las subclases de isotipos, particularmente IgG1, IgG2b, IgG2a, IgG3 e IgG4.
Además, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento también pueden modificarse para que puedan cruzar la barrera hematoencefálica. Tal modificación de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento permite el tratamiento de enfermedades cerebrales tales como el glioblastoma multiforme (GBM). Las modificaciones de ejemplo para permitir que proteínas tales como anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno crucen la barrera hematoencefálica se describen en la publicación de solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2007/0082380.
La glicosilación de inmunoglobulinas ha demostrado tener efectos significativos sobre sus funciones efectoras, estabilidad estructural y velocidad de secreción de las células productoras de anticuerpos (Leatherbarrow et al., Mol. Immunol. 22: 407 (1985)). Los grupos de carbohidratos responsables de estas propiedades generalmente están unidos a las regiones constantes (C) de los anticuerpos. Por ejemplo, se requiere la glucosilación de IgG en la asparagina 297 en el dominio Ch2 para la capacidad total de IgG para activar la ruta clásica de la citólisis dependiente del complemento (Tao and Morrison, J. Immunol. 143: 2595 (1989)). La glicosilación de IgM en la asparagina 402 en el dominio Ch3 es necesaria para el ensamblaje apropiado y la actividad citolítica del anticuerpo (Muraoka and Shulman, J. Immunol. 142: 695 (1989)). La eliminación de los sitios de glicosilación como las posiciones 162 y 419 en los dominios Ch1 y Ch3 de un anticuerpo IgA condujo a la degradación intracelular y al menos al 90% de inhibición de la secreción (Taylor and Wall, Mol. Cell. Biol. 8 : 4197 (1988)). Además, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden producirse o expresarse de modo que no contengan fucosa en sus complejas cadenas de azúcar unidas a N-glucósido. Se sabe que la eliminación de la fucosa de las complejas cadenas de azúcar unidas a N-glucósidos aumenta las funciones efectoras de los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno, que incluyen, entre otros, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Estos anticuerpos "desfucosilados" y fragmentos de unión a antígeno pueden producirse a través de una variedad de sistemas que utilizan técnicas de clonación molecular conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, animales transgénicos, plantas transgénicas o líneas celulares que han sido genéticamente modificadas para que ya no contienen las enzimas y las vías bioquímicas necesarias para la inclusión de una fucosa en las complejas cadenas de azúcar ligadas a N-glucósidos (también conocidas como animales, plantas o células noqueadas con fucosiltransferasa). Ejemplos no limitantes de células que se pueden diseñar para ser células inactivadas con fucosiltransferasa incluyen células CHO, células SP2/0, células NS0 y células YB2/0.
También se ha observado la glucosilación de inmunoglobulinas en la región variable (V). Sox and Hood informaron que aproximadamente el 20% de los anticuerpos humanos están glicosilados en la región V (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6 6 : 975 (1970)). Se cree que la glucosilación del dominio V surge de ocurrencias fortuitas de la señal de glucosilación ligada a N Asn-Xaa-Ser/Thr en la secuencia de la región V y no se ha reconocido en la técnica como que desempeña un papel en la función de inmunoglobulina.
La glicosilación en un residuo de estructura de dominio variable puede alterar la interacción de unión del anticuerpo con el antígeno. La presente divulgación incluye criterios mediante los cuales se elige mutar un número limitado de aminoácidos en el marco o CDR de una cadena de inmunoglobulina humanizada (por ejemplo, por sustitución, eliminación o adición de residuos) para aumentar la afinidad de un anticuerpo.
La afinidad por la unión de un antígeno polipeptídico predeterminado puede, en general, ser modulada mediante la introducción de una o más mutaciones en el marco de la región V, típicamente en áreas adyacentes a una o más CDR y/o en una o más regiones marco. Típicamente, tales mutaciones implican la introducción de sustituciones conservadoras de aminoácidos que destruyen o crean las secuencias del sitio de glicosilación pero no afectan sustancialmente las propiedades estructurales hidropáticas del polipéptido. Típicamente, se evitan las mutaciones que introducen un residuo de prolina. La glucosilación de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos se describe adicionalmente en la Patente de los Estados Unidos No. 6,350,861.
Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden formularse para suministro a corto plazo o suministro prolongado (a largo plazo).
Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a endoglina también se pueden usar para la purificación de endoglina y/o para detectar niveles de endoglina en una muestra o paciente para detectar o diagnosticar una enfermedad o trastorno asociado con endoglina como se describe en más detalles más adelante.
Los anticuerpos humanizados, los fragmentos de unión a antígeno y las proteínas de unión que se unen a la endoglina generada usando tales métodos pueden analizarse para una o más de sus capacidades de afinidad, avidez y neutralización de unión. Se pueden usar anticuerpos humanizados útiles, fragmentos de unión a antígeno y proteínas de unión para administrar a un paciente para prevenir, inhibir, manejar o tratar una enfermedad o trastorno asociado con la angiogénesis.
En este documento se describen métodos para identificar anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a endoglina. Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno pueden evaluarse para una o más de afinidad de unión, tasas de asociación, tasas de disociación y avidez. En un aspecto, se puede evaluar la capacidad de los anticuerpos para neutralizar la actividad de la endoglina o un polipéptido en donde está presente la secuencia de unión a la endoglina. La afinidad de unión a la medición, las tasas de asociación, las tasas de disociación y la avidez se pueden lograr utilizando ensayos reconocidos en la técnica que incluyen (Resonancia de plasmones de superficie), pero no se limitan a, un ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA), Análisis Scatchard, análisis BIACORE, etc., así como otros ensayos comúnmente utilizados y conocidos por los expertos en la materia.
La medición de la unión de anticuerpos a endoglina y/o la capacidad de los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno, por ejemplo, para inhibir la angiogénesis, puede determinarse usando, por ejemplo, un ensayo de inmunosorción ligada a enzimas (ELISA) , un ensayo de unión competitiva, un ensayo ELISPOt o cualquier otro ensayo útil conocido en la técnica. Estos ensayos son de uso común y bien conocidos por los expertos en la materia.
Se puede usar un ensayo ELISA para medir la capacidad de unión de anticuerpos específicos o fragmentos de unión a antígeno que se unen a endoglina.
Los ensayos, tales como un ELISA, también pueden usarse para identificar anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que exhiben una especificidad aumentada para la endoglina en comparación con otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Los ensayos, como un ELISA, también se pueden usar para identificar anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para unirse a epítopos a través de uno o más polipéptidos y a través de una o más especies de endoglina. El ensayo de especificidad se puede realizar ejecutando ELISA paralelos en los que los anticuerpos de prueba o sus fragmentos de unión a antígeno se seleccionan simultáneamente en cámaras de ensayo separadas para determinar la capacidad de unir uno o más epítopos en diferentes especies del polipéptido que contiene los epítopos de endoglina para identificar anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a endoglina. Otra técnica para medir la afinidad de unión aparente familiar para los expertos en la técnica es una técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un sistema BIACo Re 2 0 0 0 ) (Liljeblad, et al., Glyco. J. 2 0 0 0 , 17: 323-329). Heeley, R. P., Endocr., describen medidas estándar y ensayos de unión tradicionales. Res. 2002, 28: 217-229.
Los anticuerpos humanizados contra la endoglina también pueden probarse para determinar su capacidad para tratar diversas enfermedades y afecciones asociadas con la angiogénesis, por ejemplo, diversas formas de enfermedades oculares caracterizadas por angiogénesis/neovascularización (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética), nefropatía diabética, crónica enfermedades inflamatorias (por ejemplo, EII), artritis reumatoide, osteoartritis y diversas formas de cáncer (tumores primarios y metástasis). Cualquier ensayo adecuado conocido por un experto en la técnica puede usarse para controlar tales efectos. Varias de tales técnicas se describen en este documento. En un ejemplo, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento se analizan para determinar su capacidad para unir endoglina. En otro ejemplo, las constantes de afinidad por los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento se determinan por resonancia de plasmón superficial (SPR). En otro ejemplo más, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento se analizan para determinar su efecto sobre la inhibición de la angiogénesis.
II. Composiciones
Cada uno de los compuestos descritos en el presente documento puede usarse como una composición cuando se combina con un vehículo o excipiente aceptable. Dichas composiciones son útiles para el análisis in vitro o in vivo o para la administración a un sujeto in vivo o ex vivo para tratar a un sujeto con los compuestos descritos.
Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas pueden incluir, además del ingrediente activo, un excipiente, vehículo, regulador, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la ruta de administración.
Las formulaciones farmacéuticas que comprenden una proteína de interés, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, identificado por los métodos descritos en este documento, se pueden preparar para almacenamiento mezclando la proteína que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son aquellos que no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen reguladores como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones iónicos formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de proteína Zn); y/o tensioactivos no iónicos como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG).
Los portadores aceptables son fisiológicamente aceptables para el paciente administrado y retienen las propiedades terapéuticas de los compuestos con los que se administra. Los portadores aceptables y sus formulaciones se describen en general en, por ejemplo, Remington 'Pharmaceutical Sciences (18a edición, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, pA 1990). Un vehículo de ejemplo es la solución salina fisiológica. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación, implicado en transportar o transportar los compuestos sujetos desde el sitio de administración de un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo, o en un sistema de ensayo in vitro. Cada vehículo es aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial para un sujeto al que se administra. Un portador aceptable tampoco debería alterar la actividad específica de los compuestos en cuestión.
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables que incluyen disolventes (acuosos o no acuosos), soluciones, emulsiones, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotónicos y agentes promotores o retardadores de la absorción, compatibles con la administración farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas o formulaciones farmacéuticas, por lo tanto, se refieren a una composición adecuada para uso farmacéutico en un sujeto. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas incluyen una cantidad de un compuesto descrito aquí y un vehículo farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable.
Las composiciones pueden formularse para ser compatibles con una ruta particular de administración (es decir, sistémica o local). Por lo tanto, las composiciones incluyen vehículos, diluyentes o excipientes adecuados para la administración por diversas rutas.
En otra realización, las composiciones pueden comprender adicionalmente, si es necesario, un aditivo aceptable para mejorar la estabilidad de los compuestos en la composición y/o controlar la velocidad de liberación de la composición. Los aditivos aceptables no alteran la actividad específica de los compuestos en cuestión. Los aditivos aceptables de ejemplo incluyen, pero sin limitación, un azúcartal como manitol, sorbitol, glucosa, xilitol, trehalosa, sorbosa, sacarosa, galactosa, dextrano, dextrosa, fructosa, lactosa y mezclas de los mismos. Los aditivos aceptables se pueden combinar con vehículos y/o excipientes aceptables como la dextrosa. Alternativamente, los aditivos aceptables de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un tensioactivo tal como polisorbato 2 0 o polisorbato 80 para aumentar la estabilidad del péptido y disminuir la gelificación de la solución. El tensioactivo se puede agregar a la composición en una cantidad de 0.01% a 5% de la solución. La adición de tales aditivos aceptables aumenta la estabilidad y la vida media de la composición almacenada.
La composición farmacéutica puede administrarse, por ejemplo, mediante inyección, que incluye, pero no se limita a, inyección subcutánea, subcutánea, intravítrea, intradérmica, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o intramuscular. Los excipientes y vehículos para uso en la formulación de composiciones para cada tipo de inyección se contemplan en el presente documento. Las siguientes descripciones son solo a modo de ejemplo y no pretenden limitar el alcance de las composiciones. Las composiciones para inyección incluyen soluciones acuosas (donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina regulada con fosfato (PBS). El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Los agentes antibacterianos y antifúngicos incluyen, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico y timerosal. Se pueden incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio. Las soluciones resultantes pueden empaquetarse para su uso tal cual o liofilizarse; la preparación liofilizada se puede combinar más tarde con una solución estéril antes de la administración. Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio de la afección, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que esté libre de pirógenos y tenga un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la materia son capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos como la inyección de cloruro de sodio, la inyección de Ringer, la inyección de Ringer lactato. Se pueden incluir conservantes, estabilizadores, reguladores, antioxidantes y/u otros aditivos, según sea necesario. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando un ingrediente activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el ingrediente activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo.
Las composiciones pueden administrarse convencionalmente por vía intravítrea, subcutánea o mediante implante intravítreo.
Las composiciones pueden administrarse convencionalmente por vía intravenosa, tal como por inyección de una dosis unitaria, por ejemplo. Para la inyección, un ingrediente activo puede estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que esté sustancialmente libre de pirógenos y tenga un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Se pueden preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos como la inyección de cloruro de sodio, la inyección de Ringer, la inyección de Ringer lactato. Se pueden incluir conservantes, estabilizadores, reguladores, antioxidantes y/u otros aditivos, según sea necesario. Además, las composiciones pueden administrarse mediante aerosolización. (Lahn et al., Aerosolized Anti-T-cell-Receptor Antibodies Are Effective against Airway Inflammation and Hyperreactivity, Int. Arch. Allegery Immuno., 134: 49-55 (2004)).
En una realización, la composición se liofiliza, por ejemplo, para aumentar la vida útil en almacenamiento. Cuando se considera que las composiciones se usan en medicamentos o en cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, se contempla que la composición pueda estar sustancialmente libre de pirógenos, de modo que la composición no cause una reacción inflamatoria o una reacción alérgica insegura cuando se administra a un paciente humano. Las composiciones de prueba para pirógenos y la preparación de composiciones sustancialmente libres de pirógenos son bien entendidas por un experto en la materia o una técnica ordinaria y se pueden lograr usando kits disponibles comercialmente.
Los portadores aceptables pueden contener un compuesto que estabiliza, aumenta o retrasa la absorción o eliminación. Dichos compuestos incluyen, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa o dextranos; proteínas de bajo peso molecular; composiciones que reducen el aclaramiento o la hidrólisis de péptidos; o excipientes u otros estabilizadores y/o reguladores. Los agentes que retrasan la absorción incluyen, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Los detergentes también se pueden usar para estabilizar o aumentar o disminuir la absorción de la composición farmacéutica, incluidos los portadores liposómicos. Para proteger de la digestión, el compuesto puede formarse un complejo con una composición que lo haga resistente a la hidrólisis ácida y enzimática, o el compuesto puede formarse un complejo en un vehículo adecuadamente resistente, como un liposoma. Los medios para proteger los compuestos de la digestión son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Fix (1996) Pharm Res.
13: 17601764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48: 119135; y la Patente de los Estados Unidos No. 5,391,377, que describe composiciones lipídicas para la administración oral de agentes terapéuticos).
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y que normalmente no producen una reacción alérgica o similar, como malestar gástrico, mareos y similares, cuando se administran a un humano.
El término "dosis unitaria" cuando se usa en referencia a una composición terapéutica se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificación unitaria para humanos, cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el requerido diluyente; es decir, transportista o vehículo.
Las composiciones pueden administrarse de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad terapéuticamente efectiva. La cantidad por administrar depende del sujeto por tratar, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para utilizar el ingrediente activo y el grado de capacidad de unión deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo que deben administrarse dependen del criterio del profesional y son propias de cada individuo. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las inyecciones de refuerzo también son variables, pero se caracterizan por una administración inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de una o más horas por una inyección posterior u otra administración. Alternativamente, se contempla la infusión intravenosa continua suficiente para mantener las concentraciones en la sangre.
Una realización contempla el uso de las composiciones descritas aquí para hacer un medicamento para tratar una afección, enfermedad o trastorno descrito aquí. Los medicamentos pueden formularse según las características físicas del paciente/sujeto que necesita tratamiento, y pueden formularse en formulaciones únicas o múltiples según la etapa de la afección, enfermedad o trastorno. Los medicamentos se pueden empaquetar en un paquete adecuado con etiquetas apropiadas para la distribución a hospitales y clínicas en donde la etiqueta es para indicar el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad descrita aquí. Los medicamentos se pueden empaquetar como una sola o múltiples unidades. Las instrucciones para la dosificación y administración de las composiciones se pueden incluir con los paquetes como se describe más adelante. La invención se dirige además a medicamentos de un anticuerpo antiendoglina humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se proporcionan composiciones de anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a endoglina e incluyen los que se describen en otra parte del presente documento. Los anticuerpos humanizados y sus fragmentos de unión a antígeno que se unen a la endoglina como se describe en el presente documento pueden usarse para el tratamiento de diversas formas de enfermedades oculares caracterizadas por angiogénesis/neovascularización (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética), nefropatía diabética, enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, EII), artritis reumatoide, osteoartritis y diversas formas de cáncer (tumores primarios y metástasis).
Una composición (un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento) se puede administrar sola o en combinación con una segunda composición, ya sea simultánea o secuencialmente dependiente de la afección por tratar. Un segundo tratamiento terapéutico puede ser un inhibidor de la angiogénesis (como se describe en el presente documento). Cuando se administran dos o más composiciones, las composiciones se pueden administrar en combinación (secuencialmente o simultáneamente). Una composición puede administrarse en una dosis única o en dosis múltiples.
En una realización de la presente invención, las composiciones están formuladas para estar libres de pirógenos de modo que sean aceptables para la administración a pacientes humanos. Las pruebas de composiciones para pirógenos y la preparación de composiciones farmacéuticas libres de pirógenos son bien entendidas por un experto en la materia.
Una realización de la presente invención contempla el uso de cualquiera de las composiciones de la presente invención para hacer un medicamento para tratar un trastorno de la presente invención. Los medicamentos pueden formularse según las características físicas del paciente/sujeto que necesita tratamiento, y pueden formularse en formulaciones únicas o múltiples basadas en el trastorno. Los medicamentos de la presente invención se pueden empaquetar en un paquete farmacéutico adecuado con etiquetas apropiadas para la distribución a hospitales y clínicas en las que la etiqueta es para la indicación de tratar un trastorno como se describe en el presente documento en un sujeto. Los medicamentos se pueden empaquetar como una sola o múltiples unidades. Se pueden incluir con los paquetes farmacéuticos instrucciones para la dosificación y administración de las composiciones farmacéuticas de la presente invención.
III. Métodos de uso
En este documento se describe un método para inducir una respuesta en un paciente (humano o no humano) mediante la administración al paciente de una composición de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une preferentemente a la endoglina. El sitio de unión al que se une el anticuerpo puede ser un epítopo continuo o de conformación/discontinuo.
Se logra una respuesta efectiva de la presente invención cuando el paciente experimenta alivio o reducción parcial o total de los signos o síntomas de enfermedad, e incluye específicamente, sin limitación, la prolongación de la supervivencia y/o agudeza visual. Los tiempos de supervivencia sin progresión esperados se pueden medir en meses o años, dependiendo de factores pronósticos, incluido el número de recaídas, el estadio de la enfermedad y otros factores. La prolongación de la supervivencia incluye, sin limitación, tiempos de al menos 1 mes (mes), aproximadamente al menos 2 meses, aproximadamente al menos 3 meses, aproximadamente al menos 4 meses, aproximadamente al menos 6 meses, aproximadamente al menos 1 año, aproximadamente al menos 2 años, aproximadamente al menos 3 años, etc. La supervivencia general también se puede medir en meses o años. Alternativamente, una respuesta efectiva puede ser que los síntomas de un paciente permanezcan estáticos. Las indicaciones adicionales del tratamiento de las indicaciones se describen con más detalle más adelante.
Las composiciones de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden usarse como agentes no terapéuticos (por ejemplo, como agentes de purificación por afinidad). Generalmente, en una de tales realizaciones, una proteína de interés se inmoviliza en una fase sólida tal como una resina Sephadex o papel de filtro, usando métodos convencionales conocidos en la técnica. La proteína inmovilizada se pone en contacto con una muestra que contiene el objetivo de interés (o fragmento de la misma) para purificar, y luego el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra, excepto la proteína diana, que está unida al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, como el regulador de glicina, pH 5.0, que liberará la proteína diana. Además de la purificación, las composiciones pueden usarse para la detección, diagnóstico y terapia de enfermedades y trastornos asociados con la endoglina y la angiogénesis.
El término "contacto" como se usa en el presente documento se refiere a la adición de una solución o composición de un compuesto con un medio líquido que baña los polipéptidos, células, tejidos u órganos de un organismo. Alternativamente, "contacto" se refiere a mezclar juntos una solución o composición de un compuesto, con un líquido tal como sangre, suero o plasma derivado de un organismo. Para aplicaciones in vitro, una composición también puede comprender otro componente, como dimetilsulfóxido (DMSO). El DMSO facilita la absorción de los compuestos o la solubilidad de los compuestos. La solución que comprende el compuesto de prueba puede agregarse al medio que baña las células, tejidos u órganos, o mezclarse con otro líquido tal como sangre, utilizando un aparato de suministro, tal como un dispositivo basado en pipetas o un dispositivo basado en jeringas. Para aplicaciones in vivo, el contacto puede ocurrir, por ejemplo, mediante la administración de una composición a un paciente por cualquier medio adecuado; Las composiciones con excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables se han descrito con más detalle anteriormente.
Un "paciente" (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano o un animal no humano tal como un primate, roedor, vaca, caballo, cerdo, oveja, etc.) de acuerdo con una realización de la presente solicitud, es un mamífero que exhibe una o más manifestaciones clínicas y/o síntomas de una enfermedad o trastorno descrito aquí. En ciertas situaciones, el paciente puede ser asintomático y aun así tener manifestaciones clínicas de la enfermedad o trastorno. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede conjugarse con una unidad estructural terapéutica o ser una proteína de fusión que contiene una unidad estructural terapéutica. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede conjugarse con una unidad estructural detectable o ser una proteína de fusión que contiene una unidad estructural detectable. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede conjugarse tanto con una unidad estructural terapéutica como con una unidad estructural detectable. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede conjugarse o manipularse de forma recombinante con una etiqueta de afinidad (por ejemplo, una etiqueta de purificación). Las etiquetas de afinidad como, por ejemplo, las etiquetas His6 (SEQ ID NO: 85) son convencionales en la técnica.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados aquí son tales que pueden conjugarse o unirse a una unidad estructural terapéutica y/o una generación de imágenes o una unidad estructural detectable y/o una etiqueta de afinidad. Los métodos para conjugar o unir polipéptidos son bien conocidos en la técnica. Las asociaciones (unión) entre compuestos y marcadores incluyen cualquier medio conocido en la técnica, incluidas, entre otras, interacciones covalentes y no covalentes, conjugación química y técnicas recombinantes.
A. Unión de endoglina y angiogénesis
La endoglina (CD105) se expresa en la superficie celular como una proteína transmembrana homodimérica de 180 kDa. El dominio externo se une a las isoformas TGF-p1 y -3 con alta afinidad (50 nM), y los dominios transmembrana e intracelular de CD105 comparten una similitud de secuencia del 71% con betaglicano. El gen CD105 humano se encuentra en el cromosoma 9q34, identificado mediante hibridación fluorescente in situ, y la región de codificación contiene 14 exones, y se han caracterizado dos isoformas diferentes (L y S) de CD105 con capacidad para unirse a TGF-p. El L-CD105 consta de 633 residuos de aminoácidos con 47 residuos de aminoácidos en la cola citoplasmática, a diferencia del S-CD105, que consta de 600 residuos de aminoácidos con una cola citoplasmática de 14 aminoácidos. Sin embargo, L-CD105 es la forma predominante. El CD105 se fosforila constitutivamente en las células endoteliales, principalmente en los residuos de serina y treonina, y esta fosforilación se debe al TGF-p RII constitutivamente activo dentro de la célula. La unión de TGF-p a CD 105 da como resultado una baja regulación de la fosforilación, similar a los efectos observados con los inhibidores de la proteína quinasa C. La secuencia de aminoácidos del CD 105 humano contiene el tripéptido arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) ubicado en una región expuesta del dominio extracelular. El péptido RGD es una estructura de reconocimiento clave que se encuentra en las proteínas ECM como la fibronectina, la vitronectina, el factor von Willebrand (vWF), el colágeno tipo I y el fibrinógeno y es reconocido por las integrinas de la superficie celular. La adhesión a la integridad se ha implicado en la hemostasia, la trombosis, la angiogénesis y la inflamación, procesos en los que el endotelio desempeña un papel fundamental. (Duff et al., FASEB J., 17: 984-992 (2003)).
El CD105 es un miembro de la familia de receptores de TGF-p que se expresa mediante la proliferación de células endoteliales. Se necesitan niveles normales de CD105 para la proliferación de células endoteliales. La expresión de CD105 aumenta por la hipoxia celular a través de la producción de factor-1-a inducible por hipoxia (HIF-1-a) y protege a las células hipóxicas de la apoptosis. Varias funciones de CD105 están asociadas con la señalización de TGF-p. El TGF-p señala a través de receptores heterodiméricos que consisten en serina quinasas, receptor I (RI) y receptor II (RII). La unión de TGF-p a los dominios externos del receptor desenmascara la actividad citoplasmática de la RII quinasa que fosforila el TGF-p RI, que luego puede interactuar con los señalizadores corriente abajo como las proteínas Smad. CD105 forma parte del complejo receptor de TGF-p pero puede existir independientemente en la superficie celular. En muchas células in vitro, CD105 suprime la señalización de TGF-p.
CD105 también se une a otros factores de crecimiento tales como activina A y proteínas morfogenéticas óseas (BMP) -10, -9, -7 y -2. La unión de TGF-p u otros ligandos del factor de crecimiento a CD105 requiere la presencia de al menos el receptor RII, y no puede unirse a los ligandos por sí mismo. La asociación de CD105 con los receptores no altera su afinidad por el ligando mismo. Tras la asociación, el dominio citoplasmático de CD105 se fosforila mediante TGF-p RI y TGF-p RII; entonces TGF-p RI, pero no TGF-p RII, la quinasa se disocia del complejo receptor.
La expresión de CD105 inhibe los niveles de fosforilación de TGF-p RII pero aumenta la de TGF-p RI, dando como resultado un aumento de la fosforilación de Smad 2 pero no Smad 3. Dado que Smad 2 puede interactuar con una variedad de factores de transcripción, coactivadores, y supresores, el Smad 2 fosforilado puede actuar como un integrador de múltiples señales para modular la transcripción génica. Por lo tanto, CD105 modula las funciones de TGF-p a través de la interacción con TGF-p RI y TGF-p RII y modifica la fosforilación de las proteínas Smad corriente abajo.
El CD 105 actúa para modular la señalización de múltiples complejos de receptores de quinasas de la superfamilia TGF-p, incluidos los receptores de TGF-p (TGF-pR), las quinasas similares a receptores de activina (ALK) y los receptores de activina. En ausencia de CD105, la activación de los receptores de TGF-p produce la fosforilación de las proteínas SMAD (SMAD 2 y 3) que inhiben el crecimiento de las células endoteliales. Sin embargo, la activación de CD105 por TGF-p modula la fosforilación de la proteína SMAD (incluida la fosforilación de SMAD 1, 5 y 8 ). El resultado final es la liberación de los efectos inhibidores del crecimiento de la activación del receptor de TGF-p en las células endoteliales (véase Figura 3). No es sorprendente que la prevención de la activación de CD105 por el anticuerpo anti-CD 105 u oligonucleótido antisentido actúe de forma sinérgica con TGF-p para suprimir el crecimiento de células endoteliales.
El promotor CD105 tiene una longitud de 2.6 kb pero no contiene cuadros de inicio de transcripción TATA o CAAT. Sin embargo, tiene dos regiones ricas en GC, motivos de consenso para Sp1, ets, GATA, AP-2, NGF-p y Mad, así como elementos de respuesta de TGF-p. No obstante, CD105 tiene una distribución celular relativamente restringida. El nivel basal de transcripción parece requerir un sitio ets en la posición - 6 8 y los sitios Sp1, pero la restricción relativa de expresión, por ejemplo, a las células endoteliales, parece involucrar múltiples regiones reguladoras, en particular, una en -1294 a -932 y otro muy cerca del sitio de inicio de la transcripción. CD105 está regulado por TGF-p, y se ha demostrado que requiere un sitio Sp1 en -37 a -29, que también involucra uno o más sitios SBE corriente arriba yuxtapuestos que unen Smads 3 y/o 4 (que son activados por TGF- señalización p). La hipoxia es una característica común de los tejidos y tumores isquémicos, y es un potente estimulador para la expresión del gen CD105 en las células endoteliales vasculares (CE). Dicho efecto se potencia en combinación con TGF-p 1. El CD105 regulado por aumento puede ejercer una función de autoprotección en las CE bajo estrés hipóxico.
La EC vascular es la principal fuente de CD105. Otros tipos de células, incluidas las células vasculares del músculo liso, los fibroblastos, los macrófagos, las células leucémicas de origen pre-B y mielomonocítico, y los precursores eritroides expresan CD105 en menor medida.
El CD105 está implicado en la angiogénesis. Los experimentos antisentido han demostrado que la supresión de la expresión de CD105 en HUVEC produce una marcada inhibición de la angiogénesis in vitro en combinación con TGF-p1, lo que indica que CD105 es un componente proangiogénico en las células endoteliales. La evidencia adicional del papel importante de CD 105 en la angiogénesis proviene de ratones nulos CD105. Los ratones nulos CD105 exhiben múltiples defectos vasculares y cardíacos que conducen a la muerte en una etapa embrionaria temprana. Las alteraciones vasculares graves observadas en ratones nulos CD105 indican que se requiere CD 105 para la formación de vasos sanguíneos maduros en la vasculatura extraembrionaria, lo que confirma aún más el papel directo de la endoglina en la angiogénesis.
La endoglina, también conocida, entre otras, como CD105 o edg-1, es una glucoproteína de membrana homodimérica de tipo I que se expresa a altos niveles en células endoteliales vasculares en proliferación. Por lo tanto, la endoglina es principalmente un marcador asociado a la proliferación de células endoteliales que sufren angiogénesis activa. Sin embargo, puede haber una expresión limitada de endoglina por el endotelio vascular de los tejidos normales. Se sabe que la endoglina humana se une específicamente al factor de crecimiento transformante p (TGF-p), y la secuencia de aminoácidos deducida de la endoglina tiene una fuerte homología con el p-glicano, un tipo de receptor de TGF-p.
La endoglina (EDG) se ha dirigido a métodos basados en anticuerpos para reducir la vasculatura tumoral, ya que EDG es un antígeno asociado a la proliferación en las células endoteliales y leucémicas. Su expresión está regulada por aumento en el endotelio vascular asociado a tumores, y EDG es esencial para la angiogénesis. La angiogénesis incluye la formación de nuevos vasos sanguíneos capilares que conducen a la neovascularización, así como al mantenimiento de la vasculatura existente. Es un proceso complejo que incluye una serie de pasos secuenciales que incluyen la degradación mediada por células endoteliales de la membrana basal vascular y las matrices intersticiales, la migración de células endoteliales, la proliferación de células endoteliales y la formación de bucles capilares por las células endoteliales.
En el presente documento se proporcionan anticuerpos humanizados que se unen a endoglina. La endoglina se puede encontrar en las células que comprenden y apoyan la vasculatura existente, así como en las células que promueven el crecimiento y se convierten en parte de la nueva vasculatura. Los anticuerpos pueden unirse a la endoglina e inhibir así la angiogénesis, inhibir la vasculatura existente o el mantenimiento de la vasculatura existente, y/o inhibir la dilatación de los vasos pequeños. Además de su uso para la purificación de endoglina, estos anticuerpos son útiles para fines de purificación, detección y diagnóstico, así como con fines terapéuticos. Los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden usarse para la formulación de medicamentos para el tratamiento de una variedad de afecciones y enfermedades, métodos para tratar dichas afecciones y enfermedades y métodos de detección o diagnóstico.
Se han producido anticuerpos monoclonales murinos (mAbs) contra la endoglina que modulan la actividad de la endoglina y por lo tanto inhiben la angiogénesis y/o inhiben la vasodilatación de los vasos sanguíneos pequeños. Estos anticuerpos murinos se describen en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,928,641, 6,200,566, 6,190,660 y 7,097,836. Además, se ha demostrado la eficacia ex vivo e in vivo de varios de estos anticuerpos; Los anticuerpos monoclonales que se unen a la endoglina son de interés como compuestos moduladores de la endoglina. Sin embargo, el uso terapéutico de los anticuerpos murinos no es factible, ya que la administración de los anticuerpos murinos tiene una serie de limitaciones, incluida la inmunogenicidad en, por ejemplo, la forma de los anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA).
"Angiogénesis" se usa en el presente documento para incluirtodos los aspectos del mantenimiento y desarrollo de los vasos sanguíneos. Por lo tanto, la angiogénesis incluye la formación de nuevos vasos sanguíneos capilares que conducen a la neovascularización, así como el mantenimiento y control de la vasculatura existente y los vasos sanguíneos pequeños. La angiogénesis es un proceso complejo que incluye una serie de pasos secuenciales que incluyen la degradación mediada por células endoteliales de la membrana basal vascular y las matrices intersticiales, la migración de células endoteliales, la proliferación de células endoteliales y la formación de bucles capilares por las células endoteliales. La angiogénesis incluye el crecimiento y/o desarrollo de nuevos vasos sanguíneos (también conocidos como neovascularización), dilatación de los vasos pequeños, crecimiento vascular excesivo o prolongado y mantenimiento de la vasculatura existente. Se sabe que la endoglina está involucrada en la regulación de la angiogénesis y se cree que está involucrada en múltiples vías bioquímicas relacionadas con la inducción de la angiogénesis. (Duff et al., FASEB J., 17: 984-992 (2003); Bernabeu et al., J. Cell. Biochem., 102 (6 ): 1375-1388 (2007)).
Como se usa en el presente documento, los términos "inhibidor de la angiogénesis", "inhibición de la angiogénesis" o "antiangiogénico" incluyen la inhibición de la vasculogénesis, y están destinados a significar una disminución en la extensión, cantidad o tasa de neovascularización. Efectuar una disminución en la extensión, cantidad o tasa de proliferación o migración de células endoteliales en el tejido es un ejemplo específico de inhibición de la angiogénesis.
El término "composición inhibidora de la angiogénesis" se refiere a una composición que inhibe los procesos mediados por la angiogénesis tales como la migración de células endoteliales, la proliferación, la formación de tubos y que posteriormente conduce a la inhibición de la generación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los existentes, y en concordancia afecta condiciones dependientes de angiogénesis.
El término "enfermedad asociada a la angiogénesis" se usa en el presente documento, a los fines de la especificación y las reivindicaciones, para referirse a ciertos procesos patológicos en humanos donde la angiogénesis se prolonga anormalmente. Esto incluye además condiciones y enfermedades de angiogénesis, tales como aquellas enfermedades y afecciones relacionadas, causadas o asociadas con la angiogénesis. Ejemplos no limitantes de tales enfermedades incluyen varias formas de enfermedades oculares caracterizadas por angiogénesis/neovascularización (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética), nefropatía diabética, enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, EII), artritis reumatoide, osteoartritis y diversas formas de cáncer y metástasis. Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en este documento pueden usarse para tratar una enfermedad asociada a la angiogénesis uniendo endoglina e inhibiendo la angiogénesis.
El término "terapia antiangiogénica" se usa en el presente documento, a los fines de la especificación y las reivindicaciones, para referirse a la terapia dirigida a células y/o vasculatura que expresa endoglina (expresada a niveles más altos en la vasculatura proliferativa en comparación con la vasculatura quiescente); esto incluye además terapia dirigida contra la angiogénesis (es decir, la formación de nuevos vasos sanguíneos capilares que conducen a la neovascularización), terapia dirigida contra la vasculatura existente y/o la vascularización excesiva o el crecimiento de vasos sanguíneos, terapia dirigida hacia la dilatación de los vasos pequeños, y terapia dirigida a una enfermedad o afección (por ejemplo, terapia de direccionamiento vascular). Las enfermedades o afecciones de ejemplo contempladas dentro de la invención incluyen, pero no se limitan a, diversas formas de enfermedades oculares caracterizadas por angiogénesis/neovascularización (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética), nefropatía diabética, enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, EII), artritis reumatoide, osteoartritis y diversas formas de cáncer, tumores sólidos y metástasis.
"Enfermedad ocular caracterizada por neovascularización" se usa en el presente documento, a los fines de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, para referirse a cualquier enfermedad ocular causada por, o que resulta en, un aumento de la angiogénesis dentro de cualquier porción del ojo, incluyendo la retina, la córnea, la pupila, iris, humor vítreo o humor acuoso. Dichas enfermedades incluyen, por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad, la retinopatía diabética, la retinopatía no diabética, la neovascularización coroidea (CNV) y la neovascularización subretinal (SRN o SRNV) y las neoplasias del ojo.
B. Aplicaciones diagnósticas
Los anticuerpos anti-endoglina humanizados y sus fragmentos pueden usarse para fines de detección, diagnóstico y/o monitorización in vivo e in vitro. Se cree que la endoglina está involucrada en múltiples enfermedades y trastornos como se describe más adelante. El tratamiento de enfermedades y afecciones relacionadas con endoglina depende, en parte, de su diagnóstico, y los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento son útiles para el diagnóstico de endoglina en exceso o para el diagnóstico de enfermedades y afecciones asociadas con la actividad de endoglina.
Se describe en este documento un método para detectar niveles de endoglina en una muestra o un sujeto que comprende (i) poner en contacto un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento con la muestra o sujeto, y (ii) detectar un complejo del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo y endoglina.
Se describe en el presente documento un método para obtener imágenes o diagnosticar la angiogénesis o una enfermedad o trastorno dependiente de angiogénico, que comprende poner en contacto una composición de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento con una muestra. La muestra puede ser, por ejemplo, sangre, suero, plasma, plaquetas, líquido de biopsia, líquido de la médula espinal, meninges y orina. El método de imagen o diagnóstico puede ocurrir en un ensayo in vitro. Alternativamente, cuando el contacto se realiza mediante la administración de la composición a un paciente, la angiogénesis o la enfermedad o trastorno dependiente de angiogénico se forma una imagen o se diagnostica in vivo.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender además una unidad estructural detectable. La detección puede ocurrir in vitro, in vivo o ex vivo. Los ensayos in vitro para la detección y/o determinación (cuantificación, calificación, etc.) de endoglina con los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, ELISA, RIA e inmunotransferencias Western. La detección in vitro, el diagnóstico o la monitorización de la endoglina pueden ocurrir al obtener una muestra (por ejemplo, una muestra de sangre) de un paciente y analizar la muestra en, por ejemplo, un ensayo ELISA estándar. Por ejemplo, una placa de microtitulación de 96 pozos puede recubrirse con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito aquí, lavarse y recubrirse con PBS-Tween/BSA para inhibir la unión no específica. La muestra de sangre puede diluirse en serie y colocarse en pozos duplicados en comparación con una curva estándar de endoglina diluida en serie. Después de incubar y lavar los pozos, se puede agregar un anticuerpo anti-endoglina marcado con biotina, seguido de la adición de estreptavidina-fosfatasa alcalina. Los pozos se pueden lavar y añadir un sustrato (peroxidasa de rábano picante) para desarrollar la placa. La placa se puede leer usando un lector de placa convencional y un software.
Cuando la detección ocurre in vivo, el contacto ocurre a través de la administración del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno usando cualquier medio convencional tal como los descritos en otra parte del presente documento. En tales métodos, la detección de endoglina en una muestra o un sujeto puede usarse para diagnosticar una enfermedad o trastorno asociado con, o correlacionado con la actividad de endoglina, tal como las enfermedades y trastornos descritos en este documento.
En la detección, diagnóstico o monitorización in vivo de endoglina, a un paciente se le administra un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a la endoglina, cuyo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a una unidad estructural detectable. La unidad estructural detectable puede visualizarse utilizando métodos reconocidos en la técnica, tales como, entre otros, imágenes de resonancia magnética (MRI), fluorescencia, radioimagen, fuentes de luz suministradas por endoscopios, laparoscopios o catéteres intravasculares (es decir, mediante la detección de agentes fotoactivos), escaneo fotográfico, tomografía por emisión de positrones (PET), resonancia magnética nuclear (RMN) de todo el cuerpo, radioescintografía, tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), escaneo dirigido de la región del infrarrojo cercano (NIR), rayos X, ultrasonido, etc. descrito, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6,096,289, Patente de los Estados Unidos No. 7,115,716, Patente de los Estados Unidos No.
7,112,412, Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20030003048 y Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20060147379.
Las etiquetas para detectar compuestos usando tales métodos también se conocen en la técnica y se describen en tales patentes y solicitudes.
La visualización de la unidad estructural detectable puede permitir la detección, diagnóstico y/o monitorización de una afección o enfermedad asociada con endoglina y/o angiogénesis.
Los ensayos de diagnóstico adicionales que utilizan anticuerpos específicos para la proteína diana deseada, es decir, endoglina, son conocidos en la técnica y también se contemplan en el presente documento.
Las condiciones, enfermedades y trastornos no limitantes a considerar para estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aquellos asociados con la angiogénesis tales como, por ejemplo, diversas formas de enfermedades oculares caracterizadas por angiogénesis/neovascularización (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética), nefropatía diabética, enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, EII), artritis reumatoide, osteoartritis y diversas formas de cáncer (tumores primarios y metástasis). En la detección, diagnóstico o monitorización de tales enfermedades, al paciente sujeto se le administra una composición de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en este documento, cuyo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se conjuga con una unidad estructural detectable. La unidad estructural se puede visualizar usando métodos reconocidos en la técnica, tales como los descritos anteriormente. La visualización de la unidad estructural detectable puede permitir la detección, diagnóstico y/o monitorización de tales afecciones y enfermedades.
Para los métodos de detección in vitro, las muestras que se obtienen de un paciente incluyen, pero no se limitan a, sangre, muestras de biopsia de tejido y líquido a partir de las mismas.
Por lo tanto, la presente invención proporciona anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos contra endoglina que son útiles para detectar o diagnosticar niveles de endoglina asociados con una enfermedad o trastorno, lo que potencialmente indica la necesidad de tratamiento terapéutico. En ciertas realizaciones, los anticuerpos comprenden un anticuerpo anti-endoglina humanizado descrito aquí. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende además un segundo agente. Tal agente puede ser una molécula o unidad estructural tal como, por ejemplo, una molécula informadora o un marcador detectable. Las etiquetas/unidades estructurales detectables para tales métodos de detección son conocidos en la técnica y se describen con más detalle más adelante. Las moléculas indicadoras son cualquier unidad estructural que puede detectarse usando un ensayo. Ejemplos no limitantes de moléculas indicadoras que se han conjugado con polipéptidos incluyen enzimas, radiomarcadores, haptenos, marcadores fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminiscentes, cromóforos, moléculas luminiscentes, moléculas de fotoafinidad, partículas coloreadas o ligandos, como la biotina. Los marcadores detectables incluyen compuestos y/o elementos que pueden detectarse debido a sus propiedades funcionales específicas y/o características químicas, cuyo uso permite detectar y/o cuantificar adicionalmente el polipéptido al que están unidos. En la técnica se conocen muchos agentes detectables (de formación de imágenes) apropiados, al igual que los métodos para su unión a polipéptidos (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos.
5,021,236; 4.938,948 y 4,472,509.
Los métodos para unir polipéptidos tales como anticuerpos con unidades estructurales detectables son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, tecnología de ADN recombinante para formar proteínas de fusión y conjugación (por ejemplo, conjugación química). Los métodos para preparar proteínas de fusión mediante conjugación química o ingeniería recombinante son bien conocidos en la técnica. Los métodos de unión covalente y no covalente de componentes también son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Williams (1995) Biochemistry 34: 1787 1797; Dobeli (1998) Proteína Expr. Purif. 12: 404-414; y Kroll (1993) DNACell. Biol. 12: 441-453.
Puede ser necesario, en algunos casos, introducir una región enlazadora de polipéptidos no estructurada entre un marcador o una unidad estructural y una o más porciones de los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno o proteínas de unión descritas en este documento. Un enlazador puede facilitar una mayor flexibilidad y/o reducir el impedimento estérico entre dos fragmentos cualquiera. El enlazador también puede facilitar que ocurra el plegamiento apropiado de cada fragmento. El enlazador puede ser de origen natural, como una secuencia que se determine que existe en una espiral aleatoria entre dos dominios de una proteína. Una secuencia enlazadora es el enlazador encontrado entre los dominios C-terminal y N-terminal de la ARN polimerasa de una subunidad. Otros ejemplos de enlazadores naturales incluyen enlazadores encontrados en las proteínas 1CI y LexA.
Dentro de un enlazador, una secuencia de aminoácidos puede variarse basándose en las características del enlazador según lo determinado empíricamente o según lo revelado por el modelado. Las consideraciones al elegir un enlazador incluyen la flexibilidad del enlazador, la carga del enlazador y la presencia de algunos aminoácidos del enlazador en las subunidades naturales. El enlazador también puede diseñarse de tal manera que los residuos en el enlazador entren en contacto con el ácido nucleico desoxirribosa (ADN), influyendo así en la afinidad o especificidad de unión, o para interactuar con otras proteínas. En algunos casos, como cuando es necesario abarcar una distancia más larga entre subunidades o cuando los dominios deben mantenerse en una configuración particular, el enlazador puede, opcionalmente, contener un dominio plegado adicional. En algunas realizaciones, el diseño de un enlazador puede implicar una disposición de dominios que requiere que el enlazador abarque una distancia relativamente corta, por ejemplo, menos de aproximadamente 10 Angstroms (A). Sin embargo, en ciertas realizaciones, los enlazadores abarcan una distancia de hasta aproximadamente 50 Angstroms.
Dentro del enlazador, la secuencia de aminoácidos se puede variar en función de las características del enlazador según lo determinado empíricamente o según lo revelado por el modelado. Las consideraciones al elegir un enlazador incluyen la flexibilidad del enlazador, la carga del enlazador y la presencia de algunos aminoácidos del enlazador en las subunidades naturales. El enlazador también puede diseñarse de tal manera que los residuos en el enlazador entren en contacto con el ADN, influyendo así en la afinidad o especificidad de unión, o para interactuar con otras proteínas. En algunos casos, cuando es necesario abarcar una distancia mayor entre subunidades o cuando los dominios deben mantenerse en una configuración particular, el enlazador puede contener opcionalmente un dominio plegado adicional.
Los métodos para acoplar polipéptidos (libres o unidos a células) a gránulos son conocidos en la técnica. Los métodos para seleccionar polipéptidos acoplados o células que muestran un polipéptido también son conocidos en la técnica. En resumen, las micropartículas de poliestireno paramagnético están disponibles comercialmente (Spherotech, Inc., Libertyville, IL; Invitrogen, Carlsbad, CA) que acoplan péptidos a superficies de micropartículas que han sido modificadas con grupos funcionales o recubiertas con varios anticuerpos o ligandos como, por ejemplo, avidina, estreptavidina o biotina.
La propiedad paramagnética de las micropartículas les permite separarse de la solución usando un imán. Las micropartículas se pueden resuspender fácilmente cuando se retiran del imán. Los polipéptidos se pueden acoplar a micropartículas de poliestireno paramagnético recubiertas con una capa de poliuretano en un tubo. Los grupos hidroxi en la superficie de la micropartícula se activan por reacción con cloruro de p-toluensulfonilo (Nilsson K and Mosbach K. "p-Toluenesulfonyl chloride as an activating agent of agarose forthe preparation of immobilized affinity ligands and proteins". Eur. J. Biochem 1980: 112: 397-402). Alternativamente, las micropartículas de poliestireno paramagnético que contienen ácido carboxílico de superficie pueden activarse con una carbodiimida seguido del acoplamiento a un polipéptido, lo que da como resultado un enlace amida estable entre un grupo amino primario del polipéptido y los grupos de ácido carboxílico en la superficie de las micropartículas (Nakajima N and Ikade Y, Mechanism of amide formation by carbodiimide for bioconjugation in aqueous media, Bioconjugate Chem. 1995, 6(1): 123-130; Gilles MA, Hudson AQ and Borders CL Jr, Stability of water-soluble carbodiimides in aqueous solution, Anal Biochem.1990 1 de febrero; 184(2): 244-248; Sehgal D and Vijay IK, A method fo rthe high efficiency of water-soluble carbodiimidemediated amidation, Anal Biochem.1994 Abr; 218(1): 87-91; Szajani B et al, Effects of carbodiimide structure on the immobilization of enzymes, Appl Biochem Biotechnol. 1991 agosto; 30(2): 225-231). Otra opción es acoplar polipéptidos biotinilados a micropartículas de poliestireno paramagnético cuyas superficies se han unido covalentemente con una monocapa de estreptavidina. (Argarana Ce , Kuntz ID, Birken S, Axel R, Cantor CR. Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene. Nucleic Acids Res. 1986; 14(4): 1871-82; Pahler A, Hendrickson WA, Gawinowicz Kolks MA , Aragana CE, Cantor CR. Characterization and crystallization of core streptavidin. J Biol Chem 1987: 262 (29): 13933-13937).
Los polipéptidos se pueden conjugar con una amplia variedad de colorantes fluorescentes, inhibidores y haptenos tales como fluoresceína, R-ficoeritrina y biotina. La conjugación puede ocurrir durante la síntesis del polipéptido o después de que el polipéptido se haya sintetizado y purificado. La biotina es una vitamina pequeña (244 kilodaltons) que se une con gran afinidad a las proteínas de avidina y estreptavidina y puede conjugarse con la mayoría de los péptidos sin alterar sus actividades biológicas. Los polipéptidos marcados con biotina se purifican fácilmente a partir de polipéptidos sin marcar usando geles de afinidad con estreptavidina y avidina inmovilizados, y las sondas de estreptavidina o conjugadas con avidina se pueden usar para detectar polipéptidos biotinilados en, por ejemplo, ELISA, aplicaciones de transferencia de puntos o inmunoprecipitación Western. Los ésteres de N-hidroxisuccinimida de biotina son el tipo de agente de biotinilación más utilizado. Las biotinas activadas por N-hidroxisuccinimida reaccionan eficientemente con grupos amino primarios en reguladores fisiológicos para formar enlaces amida estables. Los polipéptidos tienen aminas primarias en el extremo N-terminal y también pueden tener varias aminas primarias en la cadena lateral de residuos de lisina que están disponibles como objetivos para el marcado con reactivos de biotina activados con N-hidroxisuccinimida. Se encuentran disponibles varios ésteres diferentes de N-hidroxisuccinimida de biotina, con propiedades variables y longitud del variante espaciador (Pierce, Rockford, IL). Los reactivos de éster de sulfo-N-hidroxisuccinimida son solubles en agua, lo que permite que las reacciones se realicen en ausencia de solventes orgánicos.
La relación mol-molar de biotina a polipéptido se puede estimar usando un ensayo de ácido 2-(4'-hidroxiazobenceno-2-carboxílico) usando técnicas reconocidas en la técnica (Green, NM, (1975)"Avidin. In Advances in Protein Chemistry. "Academic Press, Nueva York. 29, 85-133; Green, NM, (1971) "The use of bifunctional biotinyl compoundsto determine the arrangement of subunits in avidin". Biochem J. 125, 781-791 ; Green, NM., (1965) "A spectrophotometric assay for avidin and biotin based on binding of dyes by avidin". Biochem. J. 94: 23c-24c). Se pueden conjugar varias moléculas de biotina con un polipéptido y cada molécula de biotina puede unirse a una molécula de avidina. La formación de enlaces biotina-avidina es muy rápida y estable en solventes orgánicos, pH extremo y reactivos desnaturalizantes. Para cuantificar la biotinilación, se agrega una solución que contiene el polipéptido biotinilado a una mezcla de ácido 2-(4'-hidroxiazobenceno-2-carboxílico) y avidina. Debido a que la biotina tiene una mayor afinidad por la avidina, desplaza el ácido 2-(4'-hidroxiazobenceno-2-carboxílico) y la absorbancia a 500 nanómetros disminuye proporcionalmente. La cantidad de biotina en una solución se puede cuantificar en una sola cubeta midiendo la absorbancia de la solución de ácido 2-(4'-hidroxiazobenceno-2-carboxílico)-avidina antes y después de la adición del péptido que contiene biotina. El cambio en la absorbancia se relaciona con la cantidad de biotina en la muestra por el coeficiente de extinción del complejo 2-(4'-hidroxiazobenceno-2-ácido carboxílico)-avidina.
Alternativamente, un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de unión puede conjugarse con una unidad estructural fluorescente. Los polipéptidos conjugados con unidades estructurales fluorescentes (por ejemplo, R-Ficoeritrina, isotiocianato de fluoresceína (FITC), etc.) pueden lograrse usando técnicas reconocidas en las técnicas descritas en, por ejemplo, Glazer, AN and Stryer L. (1984). Trends Biochem. Sci. 9: 423-7; Kronick, MN and Grossman,
PD (1983) Clin. Chem 29: 1582-6; Lanier, LLand Loken, MR (1984) J. Immunol., 132: 151-156; Parks, DRetal. (1984) Citometry 5:159-68; Hardy, RR et al. (1983) Nature 306: 270-2; Hardy RR et al. (1984) J. Exp. Med. 159: 1169-88;
Kronick, MN (1986) J. Immuno. Meth 92: 1-13; Der-Balian G, Kameda, N and Rowley, G. (1988) Anal. Biochem. 173:
59-63.
En una realización no limitante, un fragmento de unión a antígeno de anticuerpo puede asociarse (conjugarse con) un marcador detectable, tal como un radionúclido, un compuesto relacionado con el hierro, un tinte, un agente de formación de imágenes o un agente fluorescente para la inmunodetección de endoglina que se puede usar para visualizar la unión de los anticuerpos a la endoglina in vitro y/o in vivo.
Ejemplos no limitantes de radiomarcadores incluyen, por ejemplo, 32P, 33P, 43K, 52Fe, 57Co, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga,
71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 77Br, 81Rb/81MKr, 87MSr, 90Y, 97Ru, 99Tc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 111Ag 119Sb, 121Sn, 123I, 125I, 127Cs, 128Ba, 129Cs, 131I, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169Eu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 191Os,
193Pt, 194Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb, 211At, 212Pb, 212Bi y 213Bi. Los radiomarcadores se pueden unir a compuestos usando química convencional conocida en la técnica de la formación de imágenes de anticuerpos. Los compuestos radiomarcados son útiles en técnicas de diagnóstico in vitro y en técnicas de radioimagen in vivo y en radioinmunoterapia. Por ejemplo, en el caso de la obtención de imágenes in vivo, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden conjugarse con un agente de obtención de imágenes en lugar de uno o más radioisótopos, que incluyen pero no se limitan a un agente potenciador de la imagen de resonancia magnética, en donde, por ejemplo, la molécula de anticuerpo se carga con una gran cantidad de iones paramagnéticos a través de grupos quelantes. Ejemplos de grupos quelantes incluyen EDTA, porfirinas, poliaminas, éteres de corona y polioxima.
Ejemplos de iones paramagnéticos incluyen gadolinio, hierro, manganeso, renio, europio, lantano, holmio y terbio.
Dichas unidades estructurales detectables también incluyen: metales; quelantes de metales; lantánidos; quelantes de lantánidos; radiometales; quelantes radiometales; núcleos emisores de positrones; microburbujas (para ultrasonido); liposomas; moléculas microencapsuladas en liposomas o nanoesferas; nanocompuestos de óxido de hierro monocristalinos; agentes de contraste de resonancia magnética; agentes absorbentes de luz, reflectores y/o dispersantes; partículas coloidales; fluoróforos, como los fluoróforos del infrarrojo cercano. En muchas realizaciones, dicha funcionalidad/unidad estructural secundario será relativamente grande, por ejemplo, de al menos 25 u.m.a. de tamaño, y en muchos casos puede tener al menos 50, 100 o 250 u.m.a. de tamaño. En ciertas realizaciones, la funcionalidad secundaria es una unidad estructural quelante para quelar un metal, por ejemplo, un quelante para un ion radiometal o paramagnético. En realizaciones, es un quelante para un radionúclido útil para radioterapia o procedimientos de imagen.
Los antagonistas de la invención también pueden analizarse para determinar su capacidad para modular la angiogénesis en un tejido. Cualquier ensayo adecuado conocido por un experto en la técnica puede usarse para controlar tales efectos. Varias de tales técnicas se describen en este documento.
Se mide la angiogénesis en un modelo de ojo de conejo in vivo y se denomina ensayo de ojo de conejo. Otros han descrito el ensayo de ojo de conejo en detalle, y además se ha utilizado para medir tanto la angiogénesis como la neovascularización en presencia de inhibidores angiogénicos como la talidomida. Véase D'Amato et al. (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. 91: 4082-4085.
El ensayo de ojo de conejo es un modelo de ensayo bien reconocido para la angiogénesis in vivo porque el proceso de neovascularización, ejemplificado por vasos sanguíneos de conejo que crecen desde el borde de la córnea hacia la córnea, se visualiza fácilmente a través de la córnea transparente natural del ojo. Además, tanto el alcance como la cantidad de estimulación o inhibición de la neovascularización o la regresión de la neovascularización se pueden controlar fácilmente con el tiempo.
Finalmente, el conejo es expuesto a cualquier reactivo de prueba y, por lo tanto, la salud del conejo es una indicación de toxicidad del reactivo de prueba.
Otro ensayo mide la angiogénesis en el ratón quimérico: modelo de ratón humano y se denomina ensayo de ratón quimérico. El ensayo ha sido descrito en detalle por otros, y además se ha descrito aquí para medir la angiogénesis, la neovascularización y la regresión de los tejidos tumorales. Véase Yan, et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 986-996.
El ensayo quimérico de ratón es un modelo de ensayo útil para la angiogénesis in vivo porque los injertos de piel trasplantados se parecen mucho histológicamente a la piel humana normal y se está produciendo una neovascularización de tejido completo en donde los vasos sanguíneos humanos reales crecen desde la piel humana injertada hacia el tejido tumoral humano en el superficie de la piel humana injertada. El origen de la neovascularización en el injerto humano puede demostrarse mediante tinción inmunohistoquímica de la neovasculatura con marcadores de células endoteliales específicas de humanos.
El ensayo quimérico de ratón demuestra la regresión de la neovascularización basada tanto en la cantidad como en el alcance de la regresión del crecimiento de nuevos vasos. Además, es fácil controlar los efectos sobre el crecimiento de cualquier tejido trasplantado sobre la piel injertada, como un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es útil porque hay un control interno para la toxicidad en el sistema de ensayo. El ratón quimérico es expuesto a cualquier reactivo de prueba y, por lo tanto, la salud del ratón es una indicación de toxicidad. Otros modelos animales descritos aquí y conocidos en la técnica también pueden utilizarse en los métodos descritos aquí.
C. Tratamiento con anticuerpos endocrinos humanizados
En este documento se describen métodos para prevenir o tratar una o más enfermedades o trastornos asociados con angiogénesis/neovascularización, vascularización excesiva o dilatación de vasos pequeños que comprende administrar una composición que comprende un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno descrito en este documento que se une a endoglina asociada con la enfermedad o trastorno y previene la angiogénesis, previniendo, tratando, mejorando o disminuyendo la enfermedad o su gravedad.
Se describen en el presente documento métodos para prevenir o tratar una o más enfermedades o trastornos asociados con la angiogénesis/neovascularización que comprenden administrar una composición que comprende un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento que se une al endoglina asociado con la enfermedad o trastorno, disminuye la angiogénesis, o previene la angiogénesis excesiva.
Como se usa en el presente documento, "prevención" se refiere a profilaxis, prevención de aparición de síntomas, prevención de progresión de una enfermedad o trastorno asociado con angiogénesis o correlacionado con actividad de endoglina. Como se usa en el presente documento, "inhibición", "tratamiento" y "tratar' se usan indistintamente y se refieren, por ejemplo, a la estasis de los síntomas, la prolongación de la supervivencia, la mejora parcial o total de los síntomas y la erradicación parcial o total de una afección, enfermedad o trastorno asociado con angiogénesis o correlacionado con la actividad endoglínica.
Las composiciones pueden administrarse a un paciente en una cantidad terapéuticamente efectiva que sea efectiva para producir algún efecto terapéutico deseado inhibiendo una enfermedad o trastorno tal como se describe en el presente documento que puede asociarse con endoglina, a una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Para la administración de las presentes composiciones a pacientes humanos, las composiciones pueden formularse mediante una metodología conocida por un experto en la materia. Una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que logra al menos parcialmente un efecto terapéutico o profiláctico deseado en un órgano o tejido. La cantidad de un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo necesaria para lograr la prevención y/o el tratamiento terapéutico de una enfermedad o trastorno no se fija per se. La cantidad de anticuerpo anti-endoglina humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo administrado puede variar con el tipo de enfermedad, la extensión de la enfermedad y el tamaño del mamífero que padece la enfermedad o trastorno. Dos o más anticuerpos anti-endoglina humanizados descritos en este documento pueden administrarse a un paciente en combinación. La combinación incluye la administración concomitante o posterior de los anticuerpos.
"Administrar" se define en el presente documento como un medio que proporciona la composición al paciente de una manera que da como resultado que la composición esté dentro del cuerpo del paciente. Dicha administración puede ser por cualquier vía, incluyendo, sin limitación, local, regional o sistémica mediante administración subcutánea, intravítrea, intradérmica, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o intramuscular (por ejemplo, inyección). "Administración concurrente" significa la administración dentro de un período de tiempo relativamente corto entre sí; dicho período de tiempo puede ser inferior a 2 semanas, inferior a 7 días, inferior a 1 día e incluso podría administrarse simultáneamente.
Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin ser tóxico al paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto particular empleado, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular empleado, la duración del tratamiento, otros medicamentos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con la composición particular empleada, la edad, el sexo, el peso, la condición, la salud general y el historial médico previo del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las artes médicas. Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden administrarse a un sujeto en diversas cantidades de dosificación y durante diversos períodos de tiempo. Las dosis no limitantes incluyen aproximadamente 0.01 mg/kg, aproximadamente 0.05 mg/kg, aproximadamente 0.1 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 60 mg/kg, aproximadamente 70 mg/kg, aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 90 mg/kg, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 125 mg/kg, aproximadamente 150 mg/kg, aproximadamente 175 mg/kg, aproximadamente 200 mg/kg o cualquier número entero intermedio. Además, la(s) dosis(s) de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede administrar dos veces por semana, semanalmente, cada dos semanas, cada tres semanas, cada 4 semanas, cada 6 semanas, cada 8 semanas, cada 12 semanas, o cualquier combinación de semanas en el mismo. También se contemplan ciclos de dosificación tales como, por ejemplo, la administración de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos una o dos veces por semana durante 4 semanas, seguido de dos semanas sin terapia. Los ciclos de dosificación adicionales que incluyen, por ejemplo, diferentes combinaciones de las dosis y los ciclos semanales descritos aquí también se contemplan dentro de la invención.
"Poner en contacto" se define en el presente documento como un medio para llevar una composición como se proporciona en el presente documento a proximidad física con una célula, órgano, tejido o fluido como se describe en el presente documento. El contacto abarca la administración sistémica o local de cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento e incluye, sin limitación, procedimientos y métodos in vitro, in vivo y/o ex vivo. "Combinar" y "contactar" se usan indistintamente en el presente documento y están destinados a definirse de la misma manera.
Se logra una respuesta cuando el paciente experimenta alivio parcial o total, o reducción de signos o síntomas de enfermedad, e incluye específicamente, sin limitación, la prolongación de la supervivencia. Los tiempos de supervivencia sin progresión esperados se pueden medir en meses o años, dependiendo de los factores pronósticos, incluido el número de recaídas, el estadio de la enfermedad y otros factores. La prolongación de la supervivencia incluye, sin limitación, tiempos de al menos 1 mes (mes), aproximadamente al menos 2 meses (meses), aproximadamente al menos 3 meses, aproximadamente al menos 4 meses, aproximadamente al menos 6 meses, aproximadamente al menos 1 año, aproximadamente al menos 2 años, aproximadamente al menos 3 años o más. La supervivencia general también se puede medir en meses o años. Los síntomas del paciente pueden permanecer estáticos o pueden disminuir.
Un médico o veterinario con experiencia ordinaria en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva (ED50) de la composición requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría comenzar las dosis de los compuestos empleados en la composición a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado. Alternativamente, una dosis puede permanecer constante.
Las composiciones se pueden administrar a un paciente por cualquier ruta conveniente tal como se describió anteriormente. Independientemente de la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que se pueden usar en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones, se formulan en formas de dosificación aceptables, tal como se describe más adelante o por otros métodos convencionales conocidos por aquellos de habilidad en el arte.
Los anticuerpos pueden combinarse con una unidad estructural terapéutica o con una unidad estructural detectable (formación de imágenes) usando métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, conjugación química, enlaces covalentes o no covalentes o técnicas recombinantes para crear conjugados o proteínas de fusión tales como se describe con más detalle más adelante. Alternativamente, los anticuerpos y/u otros agentes pueden combinarse en composiciones separadas para administración simultánea o secuencial.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de dicho ingrediente pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Si bien se pueden usar compuestos que exhiben efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado al diseñar un sistema de administración que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células sanas y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un rango de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método descrito aquí, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr una disposición de concentración plasmática circulante que incluya la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición semimáxima) como se determina en el cultivo celular. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución. Dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos.
El papel proangiogénico de la endoglina se ha establecido en muchos modelos, incluidos el cultivo de células endoteliales y los modelos de ratones inactivados. El endotelio y las células asociadas son bien conocidas por expresar endoglina (CD105), y el papel de la endoglina en la angiogénesis, en general, así como el desarrollo cardíaco también se ha confirmado en numerosos estudios, modelos de cultivo y modelos animales. (Duff et al., FASEB J., 17: 984-992 (2003); Bernabeu et al., J. Cell. Biochem., 102(6): 1375-1388 (2007); Patente de los Estados Unidos No. 7,097,836).
Por lo tanto, los métodos que inhiben la angiogénesis en un tejido enfermo mejoran los síntomas de la enfermedad y, dependiendo de la enfermedad, pueden contribuir a la curación de la enfermedad. En una realización, la invención contempla la inhibición de la angiogénesis en un tejido. La extensión de la angiogénesis en un tejido y, por lo tanto, la extensión de la inhibición lograda por los métodos descritos, puede evaluarse mediante una variedad de métodos, como los descritos aquí.
La especificidad única de los anticuerpos que reconocen (por ejemplo, se unen a) un epítopo en la endoglina e inhiben la angiogénesis, proporciona usos diagnósticos y terapéuticos para enfermedades caracterizadas por angiogénesis (neovascularización), dilatación de vasos pequeños y/o vascularización excesiva tal como se describe en el presente documento. Los anticuerpos anti-endoglina humanizados y sus fragmentos pueden administrarse a un sujeto como un mamífero (por ejemplo, un humano) que padece un trastorno médico, por ejemplo, diversas formas de enfermedades oculares caracterizadas por angiogénesis/neovascularización (por ejemplo, degeneración macular, diabetes, retinopatía), nefropatía diabética, enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, EII), artritis reumatoide, osteoartritis y diversas formas de cáncer (tumores primarios y metástasis). Aquí se describe un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad ocular caracterizada por angiogénesis mediante la administración de un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo descrito aquí que se une a la endoglina e inhibe la angiogénesis. También se describe en el presente documento un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria crónica mediante la administración de un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo descrito en el presente documento que se une a la endoglina e inhibe la angiogénesis. Ejemplos de tales enfermedades inflamatorias crónicas incluyen, entre otras, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Además se describe en el presente documento un método para tratar a un sujeto que tiene nefropatía diabética mediante la administración de un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo descrito en el presente documento. Aquí se describe un método para tratar a un sujeto que tiene artritis reumatoide u osteoartritis mediante la administración de un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo descrito aquí.
Se entendería que los anticuerpos anti-endoglina pueden ser eficaces para tratar la angiogénesis, se contempla en el presente documento que un sujeto también se puede tratar con uno o más inhibidores de la angiogénesis adicionales.
El término "inhibidor de la angiogénesis" se usa en el presente documento, para los fines de la especificación y las reivindicaciones, para referirse a un compuesto o molécula que incluye, pero no se limita a, péptidos, proteínas, enzimas, polisacáridos, oligonucleótidos, ADN, ARN, vectores recombinantes y fármacos que funcionan para inhibir la angiogénesis. Los inhibidores de la angiogénesis son conocidos en la técnica y todos los tipos se contemplan aquí. Ejemplos no limitantes de compuestos y moléculas incluyen biomoléculas naturales y sintéticas tales como paclitaxel, O-(cloroacetil-carbomil) fumagilol ("TNP-470" o "AGM 1470"), trombospondina-1, trombospondina-2, angiostatina, condrocito humano inhibidor de la angiogénesis derivado ("hCHIAMP"), inhibidor angiogénico derivado del cartílago, factor plaquetario 4, gro-beta, proteína inducible por interferón humano 10 ("IP10"), interleucina 12, Ro 318220, triciclodecan-9-ilo xantato ("D609"), irsogladina, bromuro de 8,9-dihidroxi-7-metil-benzo[b]quinolizinio ("GPA 1734"), medroxiprogesterona, una combinación de heparina y cortisona, inhibidores de glucosidasa, genisteína, talidomida, diamino-antraquinona, herbimicina, ácido ursólico y ácido oleanólico. Ejemplos no limitantes de anticuerpos incluyen aquellos dirigidos hacia moléculas tales como VEGF, receptor de VEGF o diferentes epítopos de endoglina. Además, los inhibidores moleculares pequeños del receptor de VEGF son conocidos y contemplados aquí. Ejemplos no limitantes de inhibidores del receptor de VEGF incluyen bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (Lucentis), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar), axitinib, pegaptanib y pazopanib.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con inhibidores del receptor de VEGF para la terapia de combinación de cualquiera de las afecciones o enfermedades relacionadas con la angiogénesis descritas en el presente documento. En una realización no limitante, el inhibidor del receptor VEGF es bevacizumab. Las dosis de ejemplo para bevacizumab son aproximadamente 7.5, aproximadamente 10 o aproximadamente 15 mg/kg, administradas cada 2 o 3 semanas.
En una realización no limitante, el inhibidor del receptor de VEGF es ranibizumab. Las dosis oculares de ejemplo para ranibizumab incluyen aproximadamente 0.5 mg, administrados por vía intravítrea mensualmente. En una realización no limitante, el inhibidor del receptor de VEGF es aflibercept (VEGF-Trap). Las dosis de ejemplo para VEGF-Trap incluyen aproximadamente 0.5-aproximadamente 10 mg/kg administrados cada 2 o 3 semanas. Las dosis oculares de ejemplo para VEGF-Trap incluyen aproximadamente 0.5-aproximadamente 2.0 mg administrados intravítreamente mensualmente o trimestralmente.
En otra realización no limitante, el inhibidor del receptor VEGF es sunitinib. Los regímenes de ejemplo para sunitinib incluyen aproximadamente 50 mg administrados durante 4 semanas, seguidos de 2 semanas sin fármaco. Los regímenes de tratamiento pueden repetirse de forma cíclica o acíclica.
En otra realización no limitante, el inhibidor del receptor de VEGF es sorafenib. Las dosis de ejemplo para sorafenib incluyen aproximadamente 400 mg administrados diariamente.
En otra realización no limitante, el inhibidor del receptor de VEGF es axitinib. Las dosis de ejemplo para axitinib incluyen aproximadamente 3, aproximadamente 5 o aproximadamente 10 mg administrados dos veces al día.
En otra realización no limitante, el inhibidor del receptor de VEGF es pegaptanib. Las dosis de ejemplo de pegaptanib incluyen aproximadamente 0.3-aproximadamente 3 mg administrados por vía intravítrea cada 6 semanas.
En otra realización no limitante más, el inhibidor del receptor de VEGF es pazopanib. Las dosis de ejemplo de pazopanib incluyen aproximadamente 2 0 0 -aproximadamente 1 00 0 mg administrados diariamente.
Se pueden administrar múltiples combinaciones de estos inhibidores del receptor de VEGF con los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento. En una realización, las combinaciones pueden dar como resultado el uso de dosis más bajas para los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos aquí, los inhibidores del receptor de VEGF, o ambos. Dichas alteraciones en la dosificación pueden resultar de efectos sinérgicos de las combinaciones de los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos aquí con los inhibidores del receptor de VEGF.
Condiciones oculares que implican angiogénesis
Condiciones de degeneración macular y retinopatía diabética
En un aspecto, la presente invención describe un método para tratar la retinopatía diabética, la degeneración macular, la neovascularización coroidea o el glaucoma neovascular en un paciente mediante la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento.
La endoglina es un receptor asociado con la angiogénesis y la matriz extracelular. La degeneración macular (AMD) es la pérdida de fotorreceptores en la porción de la retina central, denominada mácula, responsable de la visión de alta agudeza. La degeneración de la mácula se asocia con un depósito anormal de componentes de la matriz extracelular y otros desechos en la membrana entre el epitelio pigmentario de la retina y la coroides vascular. Este material similar a los escombros se denomina drusa. La drusa se observa con un examen de ojo fundoscópico. Los ojos normales pueden tener máculas libres de drusas, pero las drusas pueden ser abundantes en la periferia retiniana. La presencia de drusas suaves en la mácula, en ausencia de cualquier pérdida de visión macular, se considera una etapa temprana de la DMAE. La degeneración macular se caracteriza por la neovascularización coroidea (CNV), el desarrollo de vasos sanguíneos anormales debajo de la capa de epitelio pigmentario de la retina (RPE) de la retina. Estos vasos se rompen a través de la membrana de Bruch, alterando el epitelio pigmentado de la retina, sangrando y eventualmente causan cicatrices maculares que resultan en una pérdida profunda de la visión central (cicatrización disciforme).
La neovascularización coroidea (CNV) ocurre comúnmente en la degeneración macular además de otros trastornos oculares y está asociada con la proliferación de células endoteliales coroidales, la sobreproducción de matriz extracelular y la formación de una membrana subretiniana fibrovascular. La proliferación celular del epitelio pigmentario de la retina y la producción de factores angiogénicos parecen afectar la neovascularización coroidea.
La retinopatía diabética (DR) es un trastorno ocular caracterizado por una angiogénesis excesiva que se desarrolla en la diabetes debido al engrosamiento de las membranas basales capilares y la falta de contacto entre los pericitos y las células endoteliales de los capilares. La pérdida de pericitos aumenta la fuga de los capilares y conduce a la ruptura de la barrera sangre-retina. La retinopatía diabética es el resultado de cambios microvasculares en la retina. La muerte del pericito inducida por hiperglucemia y el engrosamiento de la membrana basal conducen a la incompetencia de las paredes vasculares. Estos daños cambian la formación de la barrera retiniana de la sangre y también hacen que los vasos sanguíneos de retina se vuelvan más permeables. Los vasos sanguíneos pequeños, como los del ojo, son especialmente vulnerables al control deficiente del azúcar en la sangre (glucosa en la sangre). Una acumulación excesiva de glucosa y/o fructosa daña los pequeños vasos sanguíneos de la retina. El edema macular también puede desarrollarse cuando los vasos sanguíneos dañados pierden líquido y lípidos en la mácula. Estos líquidos hacen que la mácula se hinche, lo que difumina la visión. Este daño también resulta en una falta de oxígeno en la retina.
A medida que la enfermedad progresa, la falta de oxígeno en la retina estimula la angiogénesis a lo largo de la retina y en el humor vítreo transparente y gelatinoso que llena el interior del ojo. Sin un tratamiento oportuno, estos nuevos vasos sanguíneos pueden sangrar, nublar la visión y destruir la retina. La proliferación fibrovascular también puede causar desprendimiento de retina traccional. Los nuevos vasos sanguíneos también pueden crecer en el ángulo de la cámara anterior del ojo y causar glaucoma neovascular.
La vitreorretinopatía proliferativa está asociada con la proliferación celular de las membranas celulares y fibróticas dentro de las membranas vítreas y en las superficies de la retina. La proliferación y migración de células del epitelio pigmentario de la retina es común con este trastorno ocular. Las membranas asociadas con la vitreorretinopatía proliferativa contienen componentes de la matriz extracelular, tales como los tipos de colágeno I, II y IV y la fibronectina, y se vuelven progresivamente fibróticos.
La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) y la retinopatía diabética son las dos causas principales de ceguera en el mundo desarrollado. La reciente aprobación de las macromoléculas LUCENTIS®, AVASTIN® y MACUGEN® ha mejorado las opciones de tratamiento disponibles para pacientes con AMD. LUCENTIS® es un Fab y AVASTIN® es un anticuerpo monoclonal. Ambos se unen al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y han demostrado los resultados más impresionantes hasta la fecha en el tratamiento de la DMAE; sin embargo, solo una minoría de pacientes tratados experimenta una mejora significativa en la agudeza visual. La terapia antiangiogénica centrada en una diana que no sea VEGF puede superar algunas de las limitaciones asociadas con los agentes que se dirigen a la ruta VEGF.
Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno que se unen a la endoglina y se describen en el presente documento pueden usarse para tratar o prevenir la degeneración macular, la NVC, la retinopatía diabética o la vitreorretinopatía proliferativa. Aquí se describen métodos para tratar o prevenir la degeneración macular, la CNV, la retinopatía diabética o la vitreorretinopatía proliferativa mediante la administración de los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos aquí. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno que se unen a la endoglina y se describen en el presente documento también pueden encoger los vasos sanguíneos, inhibir la proliferación de células endoteliales asociadas con la enfermedad ocular, aclarar los síntomas de sangrado, tratar la visión nublada, proporcionar estasis de pérdida de visión y/o prevenir fugas de los vasos sanguíneos. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento también se pueden usar en medicamentos para el tratamiento de la degeneración macular, CNV, retinopatía diabética o vitreorretinopatía proliferativa.
Además, los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento también se pueden usar en combinación con terapias y/o compuestos conocidos para el tratamiento de la degeneración macular, CNV, retinopatía diabética o vitreorretinopatía proliferativa. Ejemplos de tales compuestos incluyen, entre otros, bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib, pazopanib o MACUGEN®. Además de los modos de administración descritos en el presente documento, los anticuerpos anti-endoglina humanizados y los fragmentos de unión a antígeno pueden administrarse por vía intravítrea. Ejemplos no limitativos de modos de administración intravítreos incluyen inyección intravítrea y el uso de implantes intravítreos.
Se puede evaluar a los pacientes para mejorar y responder al tratamiento. El tratamiento incluye, entre otros, la disminución del edema macular, la disminución de las áreas de NVC y el aumento de la agudeza visual. Las medidas de los síntomas son como se conocen en la técnica y se describen adicionalmente en los ejemplos más adelante.
Enfermedades inflamatorias crónicas
Cualquiera de una variedad de tejidos u órganos compuestos de tejidos organizados, puede soportar la angiogénesis en condiciones de enfermedad que incluyen piel, músculo, intestino, tejido conectivo, articulaciones, huesos y tejido similar en donde los vasos sanguíneos pueden invadir estímulos angiogénicos. Por lo tanto, en una realización, un tejido a tratar es un tejido inflamado y la angiogénesis a inhibir es la angiogénesis de tejido inflamado donde hay neovascularización de tejido inflamado.
Enfermedades inflamatorias del intestino
La angiogénesis juega un papel importante en la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). EII es un término general para un conjunto de enfermedades o afecciones intestinales, incluida la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. La enfermedad de Crohn se caracteriza típicamente por la inflamación del intestino delgado y grueso, mientras que la colitis ulcerosa generalmente se localiza en el colon. La angiogénesis anormal o patológica es fundamental tanto para la enfermedad de Crohn como para la colitis ulcerosa. Ambas enfermedades implican una mayor densidad microvascular y disfunción microvascular, y esta angiogénesis está temporalmente relacionada con la patología del tejido y los ciclos inflamatorios que se encuentran en ambas enfermedades. Se sabe que la endoglina se expresa en estos tejidos y desempeña un papel en la desregulación de la angiogénesis durante la EII. (Chidlow et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 293: 5-18 (2007)).
Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno que se unen a la endoglina y se describen en este documento pueden usarse para tratar la EII. Además, los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno que se unen a la endoglina pueden usarse para el tratamiento de la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa. Los anticuerpos anti-endoglina humanizados y los fragmentos de unión a antígeno también se pueden usar en combinación con cirugía y/o terapias conocidas para la EII, la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa. Ejemplos de tales terapias conocidas incluyen, pero no se limitan a, aminosalicilatos (por ejemplo, mesalamina), corticosteroides (por ejemplo, budesonida, prednisona, etc.), antibióticos (por ejemplo, metronidizol, etc.), fármacos inmunosupresores (por ejemplo, azatioprina, 6 -mercaptopurina, metotrexato, tacrolimus y ciclosporina, etc.), y medicamentos biológicos como proteínas y anticuerpos (por ejemplo, infliximab, etc.).
El tratamiento de la EII se puede evaluar mediante la disminución de la vascularización del tejido inflamado. El tratamiento también se puede evaluar mediante estasis, resolución y/o curación de las lesiones ulcerativas que caracterizan la EII.
Nefropatía diabética e isquemia de trasplante renal
La nefropatía diabética es una causa principal de morbilidad y mortalidad tanto en diabéticos tipo 1 como tipo 2. Es la principal causa de enfermedad renal en etapa terminal en todo el mundo. La nefropatía diabética se caracteriza por una lesión microvascular glomerular debido al aumento de la síntesis de factores proangiogénicos. Estos factores proangiogénicos causan un aumento de la proliferación de células endoteliales y una angiogénesis posterior, y se sabe que la endoglina está regulada positivamente en la enfermedad renal crónica. Esta angiogénesis da como resultado la destrucción de los glomérulos y finalmente la insuficiencia renal. (Zent et al., Seminars in Nephrology, 27(2): 161-171 (2007); Roy-Chaudhury et al., Exp. Nephrol., 5: 55-60(1997)).
Se observan efectos similares en el trasplante renal que dan como resultado isquemia y fallo del órgano trasplantado. La regulación positiva de la endoglina produce angiogénesis regulada por aumento e inflamación en el riñón. Por el contrario, los estudios con ratones nulos de endoglina muestran un daño renal significativamente reducido después del trasplante/isquemia y una mayor supervivencia de los órganos. (Docherty et al., Nephrol. Dial. Transplant., 21: 2106-2119 (2006)).
Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno que se unen a la endoglina y se describen en este documento pueden usarse para tratar o prevenir la nefropatía diabética, la insuficiencia renal después del trasplante y/o la lesión renal isquémica después del trasplante.
En este documento se describen métodos para tratar o prevenir la nefropatía diabética, la insuficiencia renal después del trasplante y/o la lesión renal isquémica después del trasplante mediante la administración de los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento también pueden usarse en medicamentos para el tratamiento de nefropatía diabética, insuficiencia renal después del trasplante y/o lesión renal isquémica después del trasplante. Además, los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento también pueden usarse en combinación con terapias y/o compuestos conocidos para el tratamiento de la nefropatía diabética, insuficiencia renal después del trasplante y/o lesión renal isquémica después del trasplante.
Los pacientes pueden evaluarse con respecto a la eficacia del tratamiento mediante, por ejemplo, una mejora en la función renal.
Artritis reumatoide y osteoartritis
La artritis reumatoide se caracteriza por una angiogénesis excesiva, y se entiende bien a este respecto. La inflamación y destrucción encontrada en los fluidos sinoviales está directamente relacionada con el aumento de la angiogénesis que se encuentra alrededor y en los tejidos sinoviales. Numerosos factores proangiogénicos están presentes en los tejidos afectados de pacientes con artritis reumatoide. (Koch and Distler, Arthritis Res. & Ther., 9 (Supl. 2): S3, 1-9 (2007).
La osteoartritis es un grupo de afecciones discapacitantes crónicas que afectan las articulaciones sinoviales. La angiogénesis y la inflamación son procesos integrales en la fisiopatología de la enfermedad y contribuyen al daño articular a través de una variedad de mecanismos, que incluyen, entre otros, la estimulación de la producción de MMP y la osificación endocondral. Además, la angiogénesis en la osteoartritis induce una mayor inervación, que se convierte en un circuito de retroalimentación donde cada uno continúa estimulando al otro. (Bonnet & Walsh, Rheumatology, 44: 7-16 (2005)).
Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno que se unen a la endoglina y se describen en este documento pueden usarse para tratar o prevenir la artritis reumatoide y la osteoartritis. Aquí se describen métodos para tratar o prevenir la artritis reumatoide y la osteoartritis mediante la administración de los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos aquí. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento también se pueden usar en medicamentos para el tratamiento de la artritis reumatoide y la osteoartritis.
Dos medidas compuestas bien aceptadas de mejora de la AR en los ensayos son: los Criterios Paulus y The American College of Rheumatology Criteria (ACR). Los criterios de Paulus se definen como la mejora en 4 de los siguientes: recuentos de articulaciones sensibles e hinchados, rigidez matutina, evaluación del paciente de la actividad de la enfermedad, evaluación médica de la actividad de la enfermedad y rabia de velocidad de sedimentación globular (VSG). El nivel de mejora se establece como una mejora porcentual de cada una de estas variables, es decir, una clasificación Paulus 20 indica un respondedor que ha mostrado una mejora del 20% en 4 de los 6 parámetros.
La artritis reumatoide también se puede evaluar utilizando la puntuación del American College of Rheumatology (ACR). En resumen, los criterios de clasificación ACR para determinar la remisión clínica en la artritis reumatoide se evalúan por la presencia de 5 o más de los siguientes factores presentes al menos dos meses consecutivos:
a. Rigidez matutina <15 minutos;
b. Sin fatiga;
c. Sin dolor en las articulaciones;
d. No hay dolor en las articulaciones ni dolor al moverse;
e. No hay inflamación de los tejidos blandos en las articulaciones o las vainas del tendón; y
f. ESR (método Westergren) <30 mm/hora para una mujer o 20 mm/hora para un hombre.
Pueden presentarse exclusiones e incluyen: manifestaciones clínicas de vasculitis activa, pericarditis, pleuritis o miositis, y la pérdida de peso reciente o fiebre inexplicable atribuible a la artritis reumatoide prohibirá una designación de remisión clínica completa (Pinals RS, e t.a l.: Artritis Rheum 24: 1308, 1981). Además, los criterios de clasificación ACR del estado funcional en la artritis reumatoide incluyen una clasificación basada en las siguientes habilidades del paciente:
Clase I: Completamente capaz de realizar las actividades habituales de la vida diaria (autocuidado, vocacionales y avocacionales);
Clase II: Capaz de realizar actividades habituales de cuidado personal y vocacionales, pero limitado en actividades avocacionales;
Clase III: Capaz de realizar actividades habituales de cuidado personal, pero limitado en actividades vocacionales y avocacionales; y
Clase IV: Capacidad limitada para realizar actividades habituales de cuidado personal, vocacionales y avocacionales. La osteoartritis también se puede evaluar usando la puntuación ACR. Los criterios de clasificación clínica de ACR para la osteoartritis de cadera se evalúan utilizando el historial del paciente, el examen físico y los hallazgos de laboratorio: se evalúa el dolor en la cadera de un paciente y uno de los siguientes:
(1) Rotación interna de cadera de menos de 15 grados y ESR menor o igual a 45 grados mm/hora o flexión de cadera menor o igual a 115 grados si la ESR no está disponible; o
(2) Rotación interna de la cadera de menos de 15 grados, dolor asociado con la cadera interna, rigidez matutina de la cadera durante menos de 60 minutos y el paciente tiene más de 50 años.
Utilizando la historia, el examen físico, los hallazgos de laboratorio y radiográficos, el formato tradicional es dolor en la cadera y dos de las siguientes indicaciones: VSG inferior a 20 mm/hora, osteofitos radiográficos femorales y/o acetabulares, o estrechamiento del espacio radiográfico de la articulación (superior, axial y/o medial). Un árbol de clasificación es el siguiente: dolor en la cadera en asociación con (1 ) osteofitos radiográficos femorales y/o acetabulares o (2) VSG menor o igual a 20 mm/hora y estrechamiento radiográfico del espacio articular axial (Altman, R, etal.: Arthritis Rheum 34: 505, 1991).
Criterios de clasificación clínica de ACR para la osteoartritis de rodilla
Los criterios de clasificación clínica de ACR para la osteoartritis de la rodilla se evalúan mediante la historia clínica y el examen físico utilizando los siguientes criterios: dolor en la rodilla en relación con tres (3) de los siguientes:
(1) un paciente tiene más de 50 años de edad;
(2) menos de 30 minutos de rigidez matutina;
(3) Crepitación en movimiento activo;
(4) debilidad ósea;
(5) agrandamiento óseo; y
(6 ) sin calor palpable del sinovio.
Utilizando el historial del paciente, el examen físico y los hallazgos radiográficos, el dolor en la rodilla se puede evaluar en relación con una de las siguientes características del paciente: (1) un paciente tiene más de 50 años de edad; (2) menos de 30 minutos de rigidez matutina; y (3) crepitación en movimiento activo y osteofitos. Utilizando el historial, el examen físico y los hallazgos de laboratorio: el dolor en la rodilla se puede evaluar en conexión con cinco (5) de las siguientes características:
(1) un paciente tiene más de 50 años de edad;
(2) menos de 30 minutos de rigidez matutina;
(3) Crepitación en movimiento activo;
(4) debilidad ósea;
(5) agrandamiento óseo;
(6) Sin calor palpable de sinovial;
(7) el FSE es inferior a 40 mm/hora;
(8) Factor reumatoide (RF) de menos de 1:40; y
(9) Signos del líquido sinovial (SF) de osteoartritis.
Véase, por ejemplo, Altman, R, et a l .: Arthritis Rheum 29: 1039, 1986.
Los criterios de clasificación clínica de ACR para la osteoartritis de la mano se pueden evaluar de la siguiente manera: dolor, dolor o rigidez en la mano en relación con tres (3) de los siguientes: (1) agrandamiento del tejido duro de dos o más de los siguientes articulaciones (segunda y tercera distal interfalángica, la segunda y tercera proximal interfalángica, y las primeras articulaciones carpometacarpianas de ambas manos; (2) agrandamiento del tejido duro de dos o más articulaciones interfalángicas distales; (3) menos de tres articulaciones inflamadas MCP y (4) deformidad de al menos una de las uniones enumeradas anteriormente en (1).
Cáncer
El CD 105 está asociado con la angiogénesis tumoral y está fuertemente regulado en el endotelio de varios tejidos tumorales en comparación con el de los tejidos normales. El CD 105 está regulado en una amplia gama de endotelios tumorales que incluyen, por ejemplo, cáncer de colon, mama, cerebro, pulmón, próstata, endometrio, riñón, hígado, gástrico, cabeza y cuello y cuello uterino. Además, se sabe que hay una expresión más fuerte de CD 105 en el endotelio tumoral que los tejidos normales correspondientes. (Duff et al., FASEB J., 17: 984-992 (2003); Bernabeu et al., J. Cell. Biochem., 102(6): 1375-1388 (2007); Patente de los Estados Unidos No. 7,097,836). Por lo tanto, la inhibición de la angiogénesis con anticuerpos humanizados anti-endoglina representa una opción de tratamiento para tumores cancerosos. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno que se unen a la endoglina y se describen en este documento pueden usarse para tratar tumores cancerosos. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento también pueden usarse en medicamentos para el tratamiento de tumores cancerosos.
El término "tumor" se usa en el presente documento para referirse a un tejido canceroso que expresa endoglina (en comparación con la expresión por tejido normal del mismo tipo). Los tumores pueden incluir tumores sólidos y tumores semisólidos. Ejemplos no limitantes de tumores incluyen leucemias humanas, que incluyen leucemia linfoblástica aguda (LLA) no de tipo de células T (no T), leucemia mielomonocítica; y tumores humanos sólidos y semisólidos, con su vasculatura circundante que expresa endoglina a niveles moderados a altos (en comparación con la expresión por tejido normal del mismo tipo), incluyendo angiosarcoma, carcinoma de mama, cáncer de estómago, carcinoma de colon, linfoma de Hodgkin, linfoma, glioblastoma multiforme (GBM), carcinoma de pulmón, melanoma, mieloma, linfoma, osteosarcoma, carcinoma de ovario, tumor parotídeo, carcinoma faríngeo, carcinoma de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma renal y carcinoma rectosigmoide.
Un tejido canceroso por tratar es, por ejemplo, un tejido endotelial que expresa un nivel anormal de endoglina.
En ausencia de neovascularización del tejido tumoral, el tejido tumoral no obtiene los nutrientes necesarios, disminuye el crecimiento, detiene el crecimiento adicional, retrocede y finalmente se vuelve necrótico, lo que resulta en la muerte del tumor. La presente descripción proporciona un método para inhibir la neovascularización tumoral inhibiendo la angiogénesis tumoral de acuerdo con los métodos descritos. De manera similar, aquí se describe un método para inhibir el crecimiento tumoral mediante la práctica de los métodos de inhibición de la angiogénesis.
Los métodos también son particularmente efectivos contra la formación de metástasis porque su formación requiere la vascularización de un tumor primario para que las células cancerosas metastásicas puedan salir del tumor primario y su establecimiento en un sitio secundario requiere neovascularización para soportar el crecimiento de las metástasis.
Se apreciará que un "paciente que padece un cáncer/metástasis" de la invención puede expresar una proteína mutante (antígeno asociado a tumor) o un gen mutante y aún no ser sintomático para la enfermedad. En un ejemplo no limitante, donde el cáncer es cáncer de colon (que está asociado con la proteína K-ras mutante), un paciente con una proteína K-ras mutante en algunas células del colon es un paciente de acuerdo con la invención aunque ese paciente aún puede no ser sintomático para el cáncer de colon. Los "signos o síntomas de enfermedad" son manifestaciones clínicamente reconocidas o indicaciones de enfermedad.
Por "tratar" a un paciente que padece cáncer se entiende que los síntomas del paciente se alivian parcial o totalmente, o permanecen estáticos después del tratamiento de acuerdo con la invención. Un paciente que ha sido tratado puede mostrar un alivio parcial o total de los síntomas y/o la carga tumoral. Esto está destinado a abarcar la profilaxis, la terapia y la cura. En un ejemplo no limitante, un paciente que padece un cáncer altamente metastásico (por ejemplo, cáncer de mama) se trata donde no se producen metástasis adicionales o se reduce su número en comparación con un paciente que no recibe tratamiento. En otro ejemplo no limitante, se trata a un paciente donde el cáncer sólido del paciente se reduce o no aumenta de tamaño en comparación con un paciente que no recibe tratamiento. En otro ejemplo no limitante, el número de células cancerosas en un paciente tratado no aumenta o se reduce en comparación con el número de células cancerosas en un paciente que no recibe tratamiento. La mejora también se puede definir, por ejemplo, como disminución de la proliferación celular, disminución del número de células, aumento de la apoptosis y/o aumento de la supervivencia del paciente que se está tratando.
Como se usa adicionalmente aquí, el tratamiento del cáncer incluye estasis, eliminación parcial o total de un tumor o crecimiento canceroso. El tratamiento o la eliminación parcial incluye, por ejemplo, una reducción del crecimiento o del tamaño y/o volumen del tumor, tal como aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 50 veces, o cualquier reducción de veces en el medio. Del mismo modo, el tratamiento o la eliminación parcial pueden incluir una reducción porcentual en el crecimiento o el tamaño y/o volumen del tumor de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o cualquier reducción porcentual en el medio.
Un tumor o cáncer por tratar en los métodos descritos en este documento incluye, pero no se limita a, un cáncer de pulmón, una neoplasia maligna ginecológica, un melanoma, un cáncer de mama, un cáncer de cerebro (por ejemplo, glioblastoma multiforme, "GBM") un cáncer pancreático, un cáncer de ovario, un cáncer uterino, un cáncer colorrectal, un cáncer de próstata, un cáncer de riñón, un cáncer de cabeza, un cáncer de hígado (cáncer hepatocelular), un cáncer uterino, un cáncer de cuello, un cáncer de riñón (cáncer de células renales), un sarcoma, un mieloma y un linfoma. En una realización, un tumor a tratar es un tumor sólido o semisólido. En otra realización, un tumor a tratar es un tumor primario. En otra realización, un tumor a tratar es un tumor metastásico. En una realización, un tumor o cáncer por tratar es de origen epitelial. En otra realización, el cáncer por tratar es el mieloma. En otra realización, el cáncer por tratar es cáncer de ovario. En otra realización, el cáncer por tratar es cáncer de riñón/renal. En otra realización más, el cáncer por tratar es cáncer hepatocelular/hepático.
Cáncer de pulmón
En un caso, descrito aquí es un método para tratar el cáncer de pulmón. El tipo más común de cáncer de pulmón es el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), que representa aproximadamente el 80-85% de los cánceres de pulmón y se divide en carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas y carcinomas indiferenciados de células grandes. El cáncer de pulmón de células pequeñas representa el 15-20% de los cánceres de pulmón.
La estadificación del cáncer de pulmón es una evaluación del grado de diseminación del cáncer desde su fuente original. Es un factor importante que afecta el pronóstico y el posible tratamiento del cáncer de pulmón. El carcinoma de pulmón de células no pequeñas se clasifica desde IA ("uno A"; mejor pronóstico) hasta IV ("cuatro"; peor pronóstico). El carcinoma de pulmón de células pequeñas se clasifica como estadio limitado si está confinado a la mitad del tórax y dentro del alcance de un solo campo de radioterapia; de lo contrario, es una etapa extensa.
El cáncer de pulmón de células no pequeñas se puede estadificar mediante EUS (ultrasonido endoscópico) o tomografía computarizada o resonancia magnética o en una cirugía para clasificar la extensión de la enfermedad según el sistema TNM. Estos sujetos se someten a estadificación como parte del proceso de considerar el pronóstico y el tratamiento. El AJCC recomienda la estadificación TNM seguida de una mayor agrupación.
Tumor primario (T): TX: el tumor primario no se puede evaluar, o hay células malignas en el esputo o el lavado broncoalveolar, pero no se ven en la imagen o la broncoscopia; Tis: carcinoma in situ. T0: no hay evidencia de tumor primario. T1: tumor de menos de 3 cm en su mayor dimensión, rodeado de pleura pulmonar o visceral y sin invasión broncoscópica en el bronquio principal. T2: un tumor con cualquiera de: más de 3 cm en su mayor dimensión; que se extiende hacia el bronquio principal (pero más de 2 cm distal a la carina) y neumonitis obstructiva (pero que no afecta a todo el pulmón). T3: un tumor con cualquiera de: invasión de la pared torácica, diafragma, pleura mediastínica o pericardio parietal; que se extiende hasta el bronquio principal, a menos de 2 cm de la carina, pero que no afecta a la carina; y neumonitis obstructiva de todo el pulmón. T4: un tumor con cualquiera de: invasión del mediastino, corazón, grandes vasos, tráquea, esófago, vértebra o carina; nódulos tumorales separados en el mismo lóbulo; y derrame pleural maligno. Ganglios linfáticos (N): NX: no se pueden evaluar los ganglios linfáticos; N0: no hay ganglios linfáticos involucrados; N1: Metástasis a los ganglios linfáticos ipsilaterales peribronquiales o ipsilaterales; N2: Metástasis a los ganglios linfáticos mediastínicos o subcarinales ipsilaterales; y n 3: metástasis a cualquiera de los ganglios linfáticos supraclaviculares ipsilaterales; ganglios linfáticos escalenos ipsilaterales; y ganglios linfáticos contralaterales. Metástasis a distancia (M): MX: no se puede evaluar la metástasis a distancia; M0: sin metástasis a distancia; y M1: metástasis a distancia está presente.
Cánceres uterinos/neoplasia maligna ginecológica
Los cánceres de útero pueden referirse a cualquiera de varios tipos diferentes de cáncer que ocurren en el útero, a saber: sarcomas uterinos (por ejemplo, los sarcomas del miometrio, o la capa muscular del útero, son comúnmente leiomiosarcomas); cáncer endometrial; y cáncer cervical.
En otro caso descrito aquí es un método para tratar el cáncer de endometrio. El cáncer de endometrio es un cáncer que comienza en el endometrio, el revestimiento interno del útero. Algunos de los ejemplos de cáncer de útero y endometrio incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinomas, adenoacantomas, carcinomas adenoescamosos, adenocarcinomas serosos papilares, adenocarcinomas de células claras, sarcomas uterinos, sarcomas estromales, tumores mesodérmicos mixtos malignos y leiomiosarcomas.
En otro caso, el método trata el cáncer cervical, preferiblemente un adenocarcinoma en el cuello uterino epitelial. Existen dos tipos principales de este cáncer: carcinoma de células escamosas y adenocarcinomas. El primero constituye aproximadamente el 80-90% de todos los cánceres cervicales y se desarrolla donde se unen el ectocérvix (porción más cercana a la vagina) y el endocérvix (porción más cercana al útero). Estos últimos se desarrollan en las células de las glándulas productoras de mucosa del endocérvix. Algunos cánceres cervicales tienen características de ambos y se denominan carcinomas adenoescamosos o carcinomas mixtos.
Cáncer de ovarios
En otro caso, se describe en el presente documento un método para tratar el cáncer de ovario que incluye tumores epiteliales de ovario.
El cáncer de ovario se clasifica según la histología del tumor, obtenido en un informe de patología. El tumor epitelialestromal superficial, también conocido como carcinoma epitelial de ovario, es el tipo más típico de cáncer de ovario. Incluye tumor seroso, tumor endometrioide y cistadenocarcinoma mucinoso. El tumor del estroma del cordón sexual, incluido el tumor de células granulosas productoras de estrógenos y el tumor de células de Sertoli-Leydig virilizante o arrhenoblastoma, representa el 8% de los cánceres de ovario. El tumor de células germinales representa aproximadamente el 30% de los tumores de ovario, pero solo el 5% de los cánceres de ovario porque la mayoría de los tumores de células germinales son teratomas y la mayoría de los teratomas son benignos. El tumor de células germinales tiende a aparecer en mujeres y niñas jóvenes. El pronóstico depende de la histología específica del tumor de células germinales, pero en general es favorable. Los tumores mixtos contienen elementos de más de una de las clases anteriores de histología tumoral.
El cáncer de ovario también puede ser un cáncer secundario, el resultado de metástasis de un cáncer primario en otras partes del cuerpo. Los cánceres primarios comunes son el cáncer de mama y el cáncer gastrointestinal (en cuyo caso el cáncer de ovario es un cáncer de Krukenberg). El tumor del estroma epitelial superficial puede originarse en el peritoneo (el revestimiento de la cavidad abdominal), en cuyo caso el cáncer de ovario es secundario al cáncer peritoneal primario, pero el tratamiento es básicamente el mismo que para el tumor del estroma epitelial superficial primario que involucra el peritoneo.
La estadificación del cáncer de ovario se realiza mediante el sistema de estadificación FIGO y utiliza la información obtenida después de la cirugía, que puede incluir una histerectomía abdominal total, extirpación de los ovarios y las trompas de Falopio, el epiplón y los lavados pélvicos (peritoneales) para citología. La etapa AJCC es la misma que la etapa FIGO.
La etapa I se refiere al cáncer de ovario limitado a uno o ambos ovarios: IA: involucra un ovario; cápsula intacta; sin tumor en la superficie ovárica; sin células malignas en ascitis o lavados peritoneales; IB: involucra ambos ovarios; cápsula intacta; sin tumor en la superficie ovárica; lavados negativos; e IC: tumor limitado a ovarios con cualquiera de los siguientes: cápsula rota, tumor en la superficie ovárica, lavados positivos.
La etapa II se refiere a la extensión o implantes pélvicos: IIA-extensión o implantes en el útero o las trompas de Falopio; lavados negativos; IIB-extensión o implantes en otras estructuras pélvicas; lavados negativos; e IIC: extensión pélvica o implantes con lavados peritoneales positivos.
La etapa III se refiere a implantes peritoneales microscópicos fuera de la pelvis; o limitado a la pelvis con extensión al intestino delgado o al epiplón: IIIA-metástasis peritoneales microscópicas más allá de la pelvis; IIIB: metástasis peritoneales macroscópicas más allá de la pelvis de menos de 2 cm de tamaño; y IIIC: metástasis peritoneales más allá de la pelvis >2 cm o metástasis en los ganglios linfáticos.
La etapa IV se refiere a metástasis distantes al hígado o fuera de la cavidad peritoneal.
Las metástasis de ganglios linfáticos paraaórticos se consideran ganglios linfáticos regionales (Etapa IIIC).
Los métodos descritos en el presente documento pueden tratar un cáncer de ovario seleccionado entre los siguientes: un adenocarcinoma en el ovario y un adenocarcinoma que ha migrado desde el ovario hacia la cavidad abdominal.
Melanoma
Un melanoma es un tumor maligno de melanocitos que se encuentra predominantemente en la piel pero también en el intestino y el ojo (melanoma uveal). Es uno de los tipos más raros de cáncer de piel, pero causa la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer de piel. El melanoma maligno es un tipo grave de cáncer de piel causado por el crecimiento descontrolado de las células pigmentarias, llamadas melanocitos. Los melanomas también incluyen, pero no se limitan a, un melanoma de coroides, melanomas malignos, melanomas cutáneos y melanomas intraoculares.
El melanoma se puede dividir en los siguientes tipos: lentigo maligno, melanoma lentigo maligno, melanoma de extensión superficial, melanoma lentiginoso acral, melanoma mucoso, melanoma nodular, melanoma polipoide, melanoma desmoplásico, melanoma amelanótico, melanoma de tejidos blandos y melanoma uveal. Las etapas del melanoma son las siguientes:
Etapa 0: melanoma in situ (Clark Nivel I).
Etapa I/II-melanoma invasivo: T1a: menos de 1.00 mm primario, sin ulceración, Clark Nivel II-IN; T1b: menos de 1.00 mm primario, con ulceración o Clark Nivel IV-V; y T2a: 1.00-2.00 mm primario, sin ulceración.
Etapa II-Melanoma de alto riesgo: T2b: 1.00-2.00 mm primario, con ulceración; T3a: 2.00-4.00 mm primario, sin ulceración; T3b: 2.00-4.00 mm primario, con ulceración; T4a: primario de 4.00 mm o más sin ulceración; y T4b: primario de 4.00 mm o más con ulceración.
Etapa III-Metástasis regional: N1: ganglio linfático positivo único; N2: 2-3 ganglios linfáticos positivos o metástasis regionales en piel/en tránsito; y N3: 4 ganglios linfáticos positivos o ganglios linfáticos y metástasis regionales en piel/en tránsito.
Etapa IV-Metástasis distante: M1a: Metástasis cutáneas distantes, LDH normal; M1b: metástasis pulmonares, LDH normal; y M1c: otras metástasis distantes o cualquier metástasis distante con LDH elevada.
Los métodos descritos en este documento pueden tratar un melanoma
Cáncer de colon y cáncer colorrectal
El cáncer colorrectal (también llamado cáncer de colon o cáncer de intestino grueso) incluye crecimientos cancerosos en el colon, el recto (ano) y el apéndice. Con 655.000 muertes en todo el mundo por año, es la tercera forma más común de cáncer y la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en el mundo occidental. Se cree que muchos cánceres colorrectales surgen de pólipos adenomatosos en el colon. Estos crecimientos similares a hongos son generalmente benignos, pero algunos pueden convertirse en cáncer con el tiempo.
La clasificación de Dukes puede usarse para clasificar el cáncer colorrectal según las etapas A-D. El estadio A se refiere al cáncer colorrectal que se limita a la mucosa (es decir, no ha invadido a través de la pared intestinal). La etapa B1 se refiere a extenderse hacia la muscularis propria, pero no penetrar a través de ella (es decir, no se han invadido los ganglios linfáticos); mientras que el cáncer en etapa B2 ha penetrado a través de la muscularis propria, pero no penetra a través de ella (es decir, no se han invadido los ganglios linfáticos). El estadio C1 se refiere al cáncer que se extiende hacia la muscularis propria, pero que no penetra a través de él (es decir, están involucrados los ganglios linfáticos); mientras que la etapa C2 se refiere al cáncer que se extiende hacia la muscularis propria y penetra a través de ella (es decir, los ganglios linfáticos están involucrados). La etapa D se refiere a diseminación metastásica distante. El sistema TNM también puede usarse para estadificar el cáncer colorrectal de acuerdo con los medios convencionales conocidos en la técnica.
Cáncer de mama
Existen varios tipos de cáncer de mama que pueden tratarse mediante los métodos descritos en este documento. Un carcinoma lobular in situ y un carcinoma ductal in situ son cánceres de mama que se han desarrollado en los lobulillos y los conductos, respectivamente, pero que no se han extendido al tejido adiposo que rodea la mama ni a otras áreas del cuerpo. El carcinoma lobular y ductal infiltrante (o invasivo) son cánceres que se han desarrollado en los lobulillos y los conductos, respectivamente, y se han extendido al tejido graso de las mamas y/u otras partes del cuerpo. En un caso, se describe en el presente documento un método para tratar el cáncer de mama, como un carcinoma ductal en el tejido del conducto de una glándula mamaria, un cáncer de mama que es Her2- y/o ER- y/o PR-. Otros cánceres de mama que se beneficiarían del tratamiento mediante los métodos son los carcinomas medulares, los carcinomas coloides, los carcinomas tubulares y el cáncer de mama inflamatorio.
El cáncer de mama se puede estadificar según el sistema TNM. El pronóstico está estrechamente relacionado con los resultados de la estadificación, y la estadificación también se utiliza para asignar pacientes a los tratamientos tanto en ensayos clínicos como en la práctica clínica.
En resumen, la información para la estadificación es la siguiente: TX: no se puede evaluar el tumor primario. T0: no hay evidencia de tumor. Tis: carcinoma in situ, sin invasión; T1: el tumor mide 2 cm o menos; T2: el tumor mide más de 2 cm pero no más de 5 cm; T3: el tumor mide más de 5 cm; T4: tumor de cualquier tamaño que crece en la pared torácica o la piel, o cáncer inflamatorio de mama. NX: no se pueden evaluar los ganglios linfáticos cercanos. N0: el cáncer no se ha diseminado a los ganglios linfáticos regionales. N1: el cáncer se diseminó a 1 a 3 maxilares o un ganglio linfático mamario interno N2: el cáncer se diseminó a 4 a 9 ganglios linfáticos maxilares o múltiples ganglios linfáticos mamarios internos N3: se aplica uno de los siguientes: el cáncer se diseminó a 10 o más maxilares ganglios linfáticos, o el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos debajo de la clavícula (hueso del cuello), o el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos por encima de la clavícula, o el cáncer involucra los ganglios linfáticos maxilares y ha agrandado los ganglios linfáticos mamarios internos, o el cáncer involucra 4 o más ganglios linfáticos maxilares, y se encuentran pequeñas cantidades de cáncer en los ganglios linfáticos mamarios internos en la biopsia de ganglio linfático centinela. MX: no se puede evaluar la presencia de diseminación a distancia (metástasis). M0: sin propagación a distancia. M1: se ha extendido a órganos distantes (sin incluir el ganglio linfático supraclavicular).
Cáncer de páncreas
En otro caso, se describe en el presente documento un método para tratar el cáncer de páncreas seleccionado entre los siguientes: un carcinoma epitelial en el tejido del conducto pancreático y un adenocarcinoma en un conducto pancreático. El tipo más común de cáncer de páncreas es un adenocarcinoma, que se produce en el revestimiento del conducto pancreático.
Los métodos descritos en este documento pueden tratar un cáncer pancreático.
Cáncer de próstata
En otro caso, se describe en el presente documento un método para tratar el cáncer de próstata seleccionado entre los siguientes: un adenocarcinoma o un adenocarcinoma que ha migrado al hueso. El cáncer de próstata se desarrolla en el órgano de la próstata en los hombres, que rodea la primera parte de la uretra. La próstata tiene varios tipos de células, pero el 99% de los tumores son adenocarcinomas que se desarrollan en las células glandulares responsables de generar líquido seminal.
Hay dos esquemas comúnmente utilizados para estadificar el cáncer de próstata. El más común es el sistema TNM, que evalúa el tamaño del tumor, la extensión de los ganglios linfáticos afectados y cualquier metástasis (diseminación a distancia). Al igual que con muchos otros tipos de cáncer, estos a menudo se agrupan en cuatro etapas (I-IV). Otro esquema, usado con menos frecuencia, es la etapa Whitmore-Jewett.
En resumen, la enfermedad en etapa I es un cáncer que se encuentra incidentalmente en una pequeña parte de la muestra cuando se extrajo el tejido prostático por otras razones, como la hipertrofia prostática benigna, y las células se parecen mucho a las células normales y la glándula se siente normal para el examinar el dedo. En la Etapa II está involucrada más próstata y se puede sentir un bulto dentro de la glándula. En el estadio III, el tumor se diseminó a través de la cápsula prostática y el bulto se puede sentir en la superficie de la glándula. En la enfermedad en estadio IV, el tumor ha invadido estructuras cercanas o se ha diseminado a los ganglios linfáticos u otros órganos. La clasificación se basa en el contenido celular y la arquitectura de los tejidos de las biopsias (Gleason) que proporciona una estimación del potencial destructivo y el pronóstico final de la enfermedad.
Los métodos descritos en este documento pueden tratar un cáncer de próstata.
Cánceres de cabeza y cuello
Los cánceres de cabeza y cuello (por ejemplo, oral, laríngeo, nasofaríngeo, esofágico, etc.), se refieren a un grupo de cánceres biológicamente similares que se originan en el tracto aerodigestivo superior, que incluyen el labio, la cavidad oral (boca), la cavidad nasal, senos paranasales, faringe y laringe. La mayoría de los cánceres de cabeza y cuello son carcinomas de células escamosas, que se originan en el revestimiento de la mucosa (epitelio) de estas regiones. Los cánceres de cabeza y cuello a menudo se extienden a los ganglios linfáticos del cuello, y esta es a menudo la primera (y a veces la única) manifestación de la enfermedad en el momento del diagnóstico. El cáncer de cabeza y cuello está fuertemente asociado con ciertos factores de riesgo ambientales y de estilo de vida, incluido el tabaquismo, el consumo de alcohol y ciertas cepas del virus del papiloma humano de transmisión sexual. El manejo de pacientes con cánceres de cabeza y cuello sigue siendo una tarea formidable. Los cánceres tales como el cáncer hipofaríngeo, el cáncer laríngeo, el cáncer nasofaríngeo y el cáncer orofaríngeo pueden tratarse usando los compuestos descritos en este documento.
Los métodos descritos en este documento pueden tratar un cáncer de cabeza o cuello.
Cáncer de riñón
En otro caso, descrito aquí es un método para tratar el cáncer de riñón. El cáncer de riñón (también llamado cáncer de células renales, carcinoma de células renales, adenocarcinoma renal e hipernefroma) es una enfermedad en la que se encuentran células malignas en el revestimiento de los túbulos en el riñón. El carcinoma de células renales es la forma más común de cáncer de riñón que surge del túbulo renal proximal. Es el tipo más común de cáncer de riñón en adultos, responsable de aproximadamente el 80% de los casos.
Los métodos descritos en este documento pueden tratar un cáncer de riñón.
Cáncer de hígado
En otro caso, descrito aquí es un método para tratar el cáncer primario de hígado (cáncer que comienza en el hígado). El cáncer primario de hígado puede ocurrir tanto en adultos como en niños. El cáncer de hígado se caracteriza por la presencia de tumores hepáticos malignos: tumores o crecimientos en el hígado. Se pueden descubrir en imágenes médicas (incluso por una razón diferente al cáncer en sí), o pueden estar presentes en pacientes como una masa abdominal, dolor abdominal, ictericia o alguna otra disfunción hepática. Existen varios tipos de cáncer de hígado.
Hemangiomas: Estos son el tipo más común de tumor de hígado benigno. Comienzan en los vasos sanguíneos. La mayoría de estos tumores no causan síntomas, no necesitan tratamiento. Algunos pueden sangrar y deben eliminarse si es de leve a grave.
Adenomas hepáticos: Estos tumores hepáticos epiteliales benignos se desarrollan en el hígado. En la mayoría de los casos, se encuentran en el lóbulo hepático derecho y con frecuencia se consideran solitarios. El tamaño de los adenomas varía de 1 a 30 cm. Los síntomas asociados con adenomas hepáticos están asociados con lesiones grandes que pueden causar dolor abdominal intenso.
Hiperplasia nodular focal: La hiperplasia nodular focal (HNF) es el segundo tumor más común del hígado. Este tumor es el resultado de una respuesta hepatocítica congénita de malformación arteriovenosa. Este proceso es uno en donde están presentes todos los componentes normales del hígado, pero el patrón por el cual se presentan es anormal. A pesar de que existen esas condiciones, el hígado todavía parece funcionar en el rango normal.
Cáncer hepatocelular: El cáncer hepatocelular (CHC) es el cáncer de hígado más común. Se asocia con el abuso de alcohol y la infección por hepatitis B y es particularmente frecuente en Asia. La mayoría de los CHC se detectan en un momento en que no es posible la curación mediante resección quirúrgica; El tratamiento sistémico del CHC no resecable se asocia con una supervivencia de menos de un año.
Los métodos descritos en este documento pueden tratar un cáncer de hígado.
Linfoma
El linfoma es un tipo de cáncer que se origina en los linfocitos del sistema inmune. A menudo se originan en los ganglios linfáticos, presentándose como un agrandamiento del ganglio (un tumor). Los linfomas están estrechamente relacionados con las leucemias linfoides, que también se originan en los linfocitos, pero generalmente involucran solo la sangre circulante y la médula ósea (donde las células sanguíneas se generan en un proceso denominado hematopoyesis) y generalmente no forman tumores. Existen muchos tipos de linfomas y, a su vez, los linfomas son parte del amplio grupo de enfermedades llamadas neoplasias hematológicas. Algunas formas de linfoma son indolentes (por ejemplo, linfoma linfocítico pequeño), compatibles con una larga vida incluso sin tratamiento, mientras que otras formas son agresivas (por ejemplo, linfoma de Burkitt), causando un rápido deterioro y la muerte.
La Clasificación de la OMS, publicada en 2001 y actualizada en 2008; http://en.wikipedia.org/wiki/Lymphomacite_note-isbn92-832-2411-6-2#cite_note-isbn92-832-2411-6-2 es la última clasificación de linfoma y se basa en los cimientos establecidos dentro de la "Revised European-American Lymphoma classification" (REAL). Este sistema agrupa los linfomas por tipo de célula (es decir, el tipo de célula normal que más se parece al tumor) y define las características fenotípicas, moleculares o citogenéticas. Hay tres grandes grupos: las células B, las células T y los tumores de células asesinas naturales. También se reconocen otros grupos menos comunes. El linfoma de Hodgkin, aunque se considera por separado dentro de las clasificaciones de la OMS (y anteriores), ahora se reconoce como un tumor de, aunque notablemente anormales, linfocitos de linaje de células B maduras.
Los métodos descritos en este documento pueden tratar un linfoma.
Sarcoma
Un sarcoma es un cáncer del tejido conectivo (hueso, cartílago, grasa) que produce la proliferación de mesodermo.
Esto contrasta con los carcinomas, que son de origen epitelial (mama, colon, páncreas y otros). Sin embargo, debido a una comprensión evolutiva del origen del tejido, el término "sarcoma" a veces se aplica a tumores que ahora se sabe que surgen del tejido epitelial. El término sarcoma de tejido blando se usa para describir tumores de tejido blando, que incluye elementos que están en el tejido conectivo, pero que no se derivan de él (como los músculos y los vasos sanguíneos).
Los sarcomas reciben varios nombres diferentes, en función del tipo de tejido del que surgen. Por ejemplo, el osteosarcoma surge del hueso, el condrosarcoma surge del cartílago y el leiomiosarcoma surge del músculo liso. Los sarcomas afectan a personas de todos los rangos de edad, pero son muy raros y representan solo el 1% de todos los casos de cáncer. El GIST es la forma más común de sarcoma, con aproximadamente 3000-3500 casos por año en los Estados Unidos. Esto debería compararse con el cáncer de mama, con aproximadamente 200.000 casos por año en América del Norte.
Aproximadamente el 50% de los sarcomas óseos y el 20% de los sarcomas de tejidos blandos se diagnostican en personas menores de 35 años. Algunos sarcomas, como leiomiosarcoma, condrosarcoma y tumor del estroma gastrointestinal (GIST), son más comunes en adultos que en niños. La mayoría de los sarcomas óseos de alto grado, incluidos el sarcoma de Ewing y el osteosarcoma, son mucho más comunes en niños y adultos jóvenes.
Los métodos descritos en este documento pueden tratar un sarcoma.
Carcinoma
Un carcinoma es cualquier cáncer maligno que surge de las células epiteliales. Los carcinomas invaden los tejidos y órganos circundantes y pueden hacer metástasis o diseminarse a los ganglios linfáticos y otros sitios.
El carcinoma, como todas las neoplasias, se clasifica por su apariencia histopatológica. El adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas, dos términos descriptivos comunes para tumores, reflejan el hecho de que estas células pueden tener aspectos de células escamosas o glandulares, respectivamente. Los tumores gravemente anaplásicos pueden estar tan indiferenciados que no tienen una apariencia histológica distinta (carcinoma indiferenciado).
A veces se hace referencia a un tumor por el órgano presuntivo del primario (por ejemplo, carcinoma de próstata) o la supuesta célula de origen (carcinoma hepatocelular, carcinoma de células renales).
El adenocarcinoma es un tumor maligno que se origina en las células epiteliales del tejido glandular y forma estructuras glandulares. Esto es común en el pulmón (formando el 30-40% de todos los carcinomas de pulmón). Se encuentra periféricamente, que surge de las células caliciformes o de los neumocitos tipo II.
El carcinoma de células escamosas resulta de la metaplasia escamosa. Esto representa el 20-30 por ciento de los tumores de pulmón y generalmente es de origen hilar.
El carcinoma de células pequeñas es casi seguro debido al tabaquismo. Éstas hacen metástasis temprano y pueden secretar ADH (disminución de la concentración de sodio del paciente).
Los carcinomas indiferenciados de células grandes representan el 10-15 por ciento de las neoplasias pulmonares. Estos son agresivos y difíciles de reconocer debido a la naturaleza indiferenciada. Estos son más comúnmente centrales en el pulmón.
Carcinoma indiferenciado sinonasal.
Los métodos descritos en este documento pueden tratar un carcinoma.
Mieloma
El mieloma múltiple (también conocido como MM, mieloma, mieloma de células plasmáticas o enfermedad de Kahler por Otto Kahler) es un cáncer de células plasmáticas. Estas células inmunes se forman en la médula ósea, son numerosas en los linfáticos y producen anticuerpos. El mieloma se considera incurable, pero se pueden inducir remisiones con esteroides, quimioterapia, talidomida y trasplantes de células madre. El mieloma es parte del amplio grupo de enfermedades llamadas neoplasias hematológicas.
El mieloma múltiple se desarrolla en los linfocitos B del centro postgerminal. Con frecuencia se observa una translocación cromosómica entre el gen de la cadena pesada de inmunoglobulina (en el decimocuarto cromosoma, locus 14q32) y un oncogén (a menudo 11q13, 4p16.3, 6p21, 16q23 y 20q11) en pacientes con mieloma múltiple. Esta mutación da como resultado una desregulación del oncogén que se cree que es un evento iniciador importante en la patogénesis del mieloma. El resultado es la proliferación de un clon de células plasmáticas y la inestabilidad genómica que conduce a mutaciones y translocaciones adicionales. La anomalía del cromosoma 14 se observa en aproximadamente el 50% de todos los casos de mieloma. La eliminación de (partes de) el decimotercer cromosoma también se observa en aproximadamente el 50% de los casos.
La producción de citoquinas (especialmente IL-6) por las células plasmáticas causa gran parte de su daño localizado, como la osteoporosis, y crea un microambiente en donde prosperan las células malignas. La angiogénesis (la atracción de nuevos vasos sanguíneos) aumenta.
Los métodos descritos en este documento pueden tratar un mieloma.
Cáncer de estómago
El cáncer de estómago o gástrico puede desarrollarse en cualquier parte del estómago y puede extenderse por todo el estómago y a otros órganos; particularmente el esófago, los pulmones y el hígado. El cáncer de estómago causa alrededor de 800.000 muertes en todo el mundo por año.
La metástasis ocurre en el 80-90% de las personas con cáncer de estómago, con una tasa de supervivencia de seis meses del 65% en aquellos diagnosticados en etapas tempranas y menos del 15% de aquellos diagnosticados en etapas tardías.
El cáncer de estómago a menudo es asintomático o causa solo síntomas inespecíficos en sus etapas iniciales. Para cuando se presentan los síntomas, el cáncer generalmente ha hecho metástasis a otras partes del cuerpo, una de las principales razones de su mal pronóstico.
Los métodos descritos en este documento pueden tratar un cáncer de estómago.
Cáncer de tiroides
La neoplasia de tiroides o el cáncer de tiroides generalmente se refieren a cualquiera de los cuatro tipos de tumores malignos de la glándula tiroides: papilar, folicular, medular o anaplásico. Los tumores papilares y foliculares son los más comunes. Crecen lentamente y pueden reaparecer, pero generalmente no son fatales en pacientes menores de 45 años. Los tumores medulares tienen un buen pronóstico si están restringidos a la glándula tiroides y un peor pronóstico si se produce metástasis. Los tumores anaplásicos crecen rápidamente y responden mal a la terapia.
El cáncer de tiroides generalmente se encuentra en un paciente eutiroideo, pero los síntomas de hipertiroidismo o hipotiroidismo pueden estar asociados con un tumor grande o metastásico bien diferenciado. Los nódulos son especialmente preocupantes cuando se encuentran en menores de 20 años. La presentación de nódulos benignos a esta edad es menos probable y, por lo tanto, el potencial de malignidad es mucho mayor.
Los cánceres de tiroides se pueden clasificar según sus características patológicas. Se pueden distinguir las siguientes variantes (la distribución en varios subtipos puede mostrar variación regional): cáncer papilar de tiroides (hasta 75%); cáncer de tiroides folicular (hasta 15%); cáncer medular de tiroides (hasta 8%); y cáncer anaplásico de tiroides (menos del 5%). Los tipos folicular y papilar juntos se pueden clasificar como "cáncer diferenciado de tiroides". Estos tipos tienen un pronóstico más favorable que los tipos medulares e indiferenciados. El adenoma tiroideo es una neoplasia benigna de la tiroides.
Los métodos descritos en este documento pueden tratar un cáncer de tiroides.
Cáncer de vejiga
El cáncer de vejiga se refiere a cualquiera de varios tipos de crecimientos malignos de la vejiga urinaria. Es una enfermedad en la cual las células anormales se multiplican sin control en la vejiga. La vejiga es un órgano muscular hueco que almacena orina; se encuentra en la pelvis. El tipo más común de cáncer de vejiga comienza en las células que recubren el interior de la vejiga y se llama carcinoma de células de transición (a veces carcinoma de células uroteliales).
El 90% de los cánceres de vejiga son carcinomas de células de transición. El otro 10% son carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, sarcoma, carcinoma de células pequeñas y depósitos secundarios de cánceres en otras partes del cuerpo.
Las siguientes etapas se usan para clasificar la ubicación, el tamaño y la propagación del cáncer, de acuerdo con el sistema de estadificación TNM (tumor, ganglio linfático y metástasis): Etapa 0: las células cancerosas se encuentran solo en el revestimiento interno de la vejiga. Etapa I: las células cancerosas han proliferado en la capa más allá del revestimiento interno de la vejiga urinaria, pero no en los músculos de la vejiga urinaria. Etapa II: las células cancerosas han proliferado en los músculos de la pared de la vejiga, pero no en el tejido graso que rodea la vejiga urinaria. Etapa III: las células cancerosas han proliferado en el tejido graso que rodea la vejiga urinaria y en la próstata, la vagina o el útero, pero no en los ganglios linfáticos u otros órganos. Etapa IV: las células cancerosas han proliferado a los ganglios linfáticos, la pared pélvica o abdominal y/u otros órganos. Recurrente: el cáncer ha recurrido en la vejiga urinaria o en otro órgano cercano después de haber sido tratado.
El CCT de vejiga se clasifica de acuerdo con el sistema TNM de 1997: tumor tumoral papilar no invasivo; T1 Invasivo pero no tan lejos como la capa muscular de la vejiga; T2 invasivo en la capa muscular; T3 Invasivo más allá del músculo hacia la grasa fuera de la vejiga; y T4 invasiva en estructuras circundantes como la próstata, el útero o la pared pélvica.
Los métodos descritos en este documento pueden tratar un cáncer de vejiga.
De acuerdo con la invención, los anticuerpos endoglínicos humanizados o sus fragmentos pueden administrarse solos o en combinación con agentes activos o inactivos. Cuando se usan combinaciones, la invención contempla la administración simultánea o secuencial de los anticuerpos endoglínicos humanizados o fragmentos de unión a antígeno y los agentes activos o inactivos.
Los compuestos de la presente invención pueden administrarse, según sea necesario, en combinación con uno o más tratamientos terapéuticos que incluyen, pero sin limitación, adriamicina, ciclofosfamida, paclitaxel, pemetrexed, temozolomida, oxaliplatino, bevacizumab, erbitux, vectibix, sorafenib, sunitinib, gefitinib, erlotinib, 5-fluorouracilo (5-FU) irinotecan, topotecan, leucovorin, VELCADE®, lenalidomida, talidomida, xeloda, taxotere y muchas otras terapias convencionales contra el cáncer descritas en este documento. Se entendería que la lista de los regímenes terapéuticos enumerados más adelante representa las terapias convencionales, pero la presente invención abarca otros regímenes terapéuticos conocidos que no se describen específicamente aquí.
Como se usa en este documento, "radiación" se refiere, por ejemplo, a microondas, radiación ultravioleta (UV), infrarroja (IR), o radiación alfa, beta o gamma. La radiación puede "enfocarse" o administrarse localmente utilizando técnicas convencionales para dirigir la radiación al sitio de uno o más tumores sin irradiar todo el cuerpo.
En una realización, el cáncer es cáncer de ovario y el uno o más tratamientos terapéuticos es cirugía, quimioterapia (por ejemplo, doxorrubicina, doxil, gemcitabina, rubitecan y quimioterapéuticos basados en platino tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino), melfalan, paclitaxel, inhibidores de topoisomerasa I como topotecan e irinotecan, terapia basada en taxanos, hormonas, radioterapia, hipotermia de cuerpo entero, derivados de isoflavona como fenoxodial, macrólidos citotóxicos como epotilonas, inhibidores de angiogénesis como bevacizumab, inhibidores de transducción de señales, como terapia génica trastumínica, terapia de ARNi, inmunoterapia, anticuerpos monoclonales, inhibidores de la quinasa de tipo fosfatidilinositol como la rapamicina, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y doxil. En otra realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y topotecan. En otra realización más, la combinación es un anticuerpo antiendoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un inhibidor del receptor de VEGF. Ejemplos no limitantes de inhibidores del receptor de VEGF incluyen bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib y pazopanib. La terapia de combinación de los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento con las terapias contra el cáncer de ovario también puede proporcionar dosis más bajas de cualquiera de las terapias, o de ambas, debido a un efecto sinérgico de la administración conjunta de las terapias.
En una realización, el cáncer es cáncer renal/de riñón y el uno o más tratamientos terapéuticos es cirugía, quimioterapia, sunitinib, sorafenib, pazopanib, AVASTIN®, interferón alfa o IL-2. En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y sorafenib. En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y sunitinib. En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y AVASTIN®. En otra realización más, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un inhibidor del receptor de VEGF. Ejemplos no limitantes de inhibidores del receptor de VEGF incluyen bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib y pazopanib. La terapia de combinación de los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento con las terapias contra el cáncer de riñón también puede proporcionar dosis más bajas de cualquiera de las terapias, o ambas, debido a un efecto sinérgico de la administración conjunta de las terapias.
En una realización, el cáncer es mieloma y el uno o más tratamientos terapéuticos es cirugía, radioterapia, VELCADE®, lenalidomida o talidomida. En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y VELCADE®. Las dosis para cualquiera de estas terapias son conocidas en la técnica y pueden ajustarse con la terapia de combinación en concordancia.
En una realización, el cáncer es cáncer de próstata y el uno o más tratamientos terapéuticos es cirugía, radioterapia (por ejemplo, haz externo o braquiterapia), privación hormonal (supresión de andrógenos), inhibidores de la proteína de choque térmico 90 (HSP90), quimioterapia (por ejemplo, docetaxel, quimioterapia basada en platino, como cisplatino, carboplatino, satraplatino y oxaliplatino, taxano, estramustina), prednisona o prednisolona, medicamentos para reducir el colesterol, como estatinas, agonistas de la hormona liberadora de hormonas leutinizantes (LHRH), terapia con ARNi, tumor completo células genéticamente modificadas para secretar macrófagos de granulocitos-factor estimulante de colonias (GM-CSF) (también conocido como GVAX), o cualquier combinación de los mismos. En otra realización más, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un inhibidor del receptor de VEGF. Ejemplos no limitantes de inhibidores del receptor de VEGF incluyen bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCEn T iS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib y pazopanib.
En una realización, el cáncer es cáncer de pulmón y el uno o más tratamientos terapéuticos es cirugía, radioterapia (por ejemplo, radioterapia torácica, radioterapia con partículas cargadas, uracilo-tegafur y quimioterapia basada en platino (por ejemplo, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, etc.) y vinorrelbina, Erlotinib (TARCEVa ®), Gefitinib (IRESSA®), anticuerpos anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, Cetuximab), anticuerpos anti­ factor de crecimiento endotelial vascular (por ejemplo, Bevacizumab), inhibidores de moléculas pequeñas de tirosina quinasas, inhibidores directos de proteínas involucradas en la proliferación celular del cáncer de pulmón, inhibidores de la quinasa Aurora, termoterapia inducida por láser, terapia con ARNi, células tumorales completas modificadas genéticamente para secretar macrófagos granulocitos-factor estimulante de colonias (GM-CSF) (también conocido como GVAX), o cualquier combinación de los mismos. Los tratamientos terapéuticos adicionales incluyen Taxol y pemetrexed. En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno de los mismos y erlotinib. En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y gefitinib. En una realización, la combinación es un anticuerpo antiendoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y pemetrexed. En otra realización más, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un inhibidor del receptor de VEGF. Ejemplos no limitantes de inhibidores del receptor de VEGF incluyen bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib y pazopanib. Las dosis para cualquiera de estas terapias son conocidas en la técnica y pueden ajustarse con la terapia de combinación en concordancia.
En una realización, el cáncer es cáncer de mama y el uno o más tratamientos terapéuticos es cirugía, anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos Her-2, herceptin), quimioterapia adyuvante tal como quimioterapia de agente único o quimioterapia combinada (por ejemplo, antraciclina- y poliquemoterapias a base de taxanos, taxol o trastuzumab específico de diana con o sin manipulación endocrina con o sin PMRT, vinorrelbina), adriamicina, ciclofosfamida, xeloda, taxotere, moduladores selectivos de receptores de estrógenos como Tamoxifeno y Raloxifeno, moduladores alostéricos del receptor de estrógenos como Trilostano, radiación (por ejemplo, braquiterapia intersticial, dispositivo Mammosite, radiación externa conformada tridimensional y radioterapia intraoperatoria), inhibidores de la aromatasa que inhiben la síntesis corporal total (por ejemplo, anastrozol, exemestano y letrozol), terapia ARNi, análogos intravenosos de rapamicina que son inmunosupresores y antiproliferativo como Temsirolimus (CCI779), o cualquier combinación de los mismos. Kim et al., Breast Cancer Research Treatment 85(3): 281-91 (2004) describen una revisión de los métodos para realizar modelos tridimensionales de cultivo de tejidos in vitro de cáncer de mama. Se conocen otros modelos in vivo e in vitro para probar cánceres y se pueden usar para probar anticuerpos antiendoglina descritos aquí. En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, taxol y AVASTIN®. En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y adriamicina. En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y xeloda. En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un taxotere. En otra realización más, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un inhibidor del receptor de VEGF. Ejemplos no limitantes de inhibidores del receptor de VEGF incluyen bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCEn T iS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib y pazopanib. Las dosis para cualquiera de estas terapias son conocidas en la técnica y pueden ajustarse con la terapia de combinación en concordancia.
En una realización, el cáncer es cáncer de colon y el uno o más tratamientos terapéuticos es cirugía, radioterapia y quimioterapia (por ejemplo, 5-fluorouracilo, levamisol, leucovorina o semustina (CCNU de metilo)), N-[2-(dimetilamino)etil]acridina-4-carboxamida y otros medicamentos anticancerosos relacionados con carboxamida; inhibidores no topoisomerasa II, irinotecán, topotecán liposómico, clase taxano de agentes anticancerígenos (por ejemplo, paclitaxel o docetaxel), un compuesto de la clase de ácido xantenona acético (por ejemplo, ácido 5,6-dimetilantona-4-acético PMAA), laminarina, análogos de AMP cíclicos selectivos para el sitio (por ejemplo, 8-cloroadenosina 3',5'-fosfato cíclico), inhibidores de piranoindol de Cox-2, inhibidores de carbazol de Cox-2, inhibidores de tetrahidrocarbazol de Cox-2, inhibidores de indeno de Cox-2, inhibidores localizados de los AINE (por ejemplo, ácidos antranílicos, aspirina (ácido 5-acetilsalicílico), azodisal sódico, ácidos carboheterocíclicos, carprofeno, clorambucilo, diclofenaco, fenbufen, fenclofenaco, fenoprofeno, ácido flufenámico, flurbiprofeno, fluprofeno, furosemida, tiomalato de oro y sodio, ibuprofeno, indometacina, indoprofeno, ketoprofeno, lonazolac, loxoprofeno, ácido meclofenámico, ácido mefanámico, melfalán, naproxeno, penicilamina, ácidos fenilacéticos, ácidos propiónicos, ácidos salicílicos, salazosulfapiridina, sulindac, tolmetina, un NSAID de pirazolona butazona propazona, meloxicam, oxicams, piroxicam, feldene, piroxicam beta ciclodextrano, tenoxicam. etodolaco y oxaprozina), un inhibidor de HER-2/neu, terapia de ARNi, GM-CSF, anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos anti-Her-2/neu, anticuerpos anti-CEA, A33 (HB 8779), 100-210 (HB 11764) y 100-310 (HB 11028)), erbitux, vectibix, terapia hormonal, pirimidinamina, derivados de camptotecina (por ejemplo, CPT-11), ácido folínico (FA), gemcitabina, Ara-C, quimioterapia a base de platino tal como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino, un inhibidor de la fosfodiesterasa específico de cGMP, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y una combinación de 5-FU, leucovorina y oxaliplatino (FOLFOX). En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y una combinación de 5-FU, irinotecán y leucovorina (IFL). En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y erbitux. En una realización, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y una vectibix. En otra realización más, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un inhibidor del receptor de VEGF. Ejemplos no limitantes de inhibidores del receptor VEGF incluyen bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib y pazopanib. Las dosis para cualquiera de estas terapias son conocidas en la técnica y pueden ajustarse con la terapia de combinación en concordancia.
En una realización, el cáncer es cáncer de páncreas y el uno o más tratamientos terapéuticos es cirugía, radioterapia (RT), fluorouracilo (5-FU) y RT, terapia sistémica, colocación de cánula endoluminal, gemcitabina (GEMZAR®), gemcitabina y RT, Cetuximab, erlotinib (TARCEVA®), quimiorradiación, bevacizumab (AVASTIN®), o cualquier combinación de los mismos. En otra realización más, la combinación es un anticuerpo anti-endoglina humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un inhibidor del receptor de VEGF. Ejemplos no limitantes de inhibidores del receptor de VEGF incluyen bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUc En TIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib y pazopanib.
Los pacientes pueden evaluarse con respecto a los síntomas en uno o más puntos de tiempo múltiples, incluso antes, durante y después de los regímenes de tratamiento. El tratamiento puede mejorar la condición del sujeto y puede evaluarse determinando si se ha producido uno o más de los siguientes factores: disminución del tamaño del tumor, disminución de la proliferación celular, disminución del número de células, disminución de la neovascularización, aumento de la apoptosis o disminución de la supervivencia de al menos una porción de las células que comprende el trastorno proliferativo celular. Una o más de estas ocurrencias pueden, en algunos casos, dar como resultado la eliminación parcial o total del cáncer y la prolongación de la supervivencia del paciente. Alternativamente, para los cánceres en etapa terminal, el tratamiento puede provocar la estasis de la enfermedad, una mejor calidad de vida y/o una prolongación de la supervivencia.
Evaluación de biomarcadores
Ciertos genes pueden expresarse a niveles aumentados o disminuidos en los cánceres. Los cambios en los niveles de expresión de genes en los cánceres pueden ser indicativos de resistencia o sensibilidad a una terapia o tratamiento contra el cáncer.
En este documento se describe un método de diagnósti
un panel de genes cuya expresión se ha correlacionado con la sensibilidad o resistencia a un inhibidor de la angiogénesis, en donde el al menos un gen es: VEGF, receptor de VEGF, HIF-1a, receptor del factor de crecimiento placentario o endoglina (CD105). El método puede incluir además el paso de comparar el nivel de expresión de al menos un gen detectado en la muestra del paciente con un nivel de expresión de al menos un gen que se ha correlacionado con la sensibilidad o resistencia al inhibidor de la angiogénesis. El inhibidor de la angiogénesis puede ser un anticuerpo anti-endoglina humanizado. En otro ejemplo, el inhibidor de la angiogénesis puede ser un inhibidor del receptor de VEGF o un inhibidor de VEGF.
Como se usa en el presente documento, el término "expresión", cuando se usa en relación con la detección de la expresión de un gen, puede referirse a la detección de la transcripción del gen y/o a la detección de la traducción del gen. Detectar la expresión de un gen se refiere al acto de determinar activamente si un gen se expresa o no. Esto puede incluir determinar si la expresión génica está regulada por aumento en comparación con un control, regulada por disminución en comparación con un control o sin cambios en comparación con un control. Por lo tanto, el paso de detectar la expresión no requiere que la expresión del gen en realidad esté regulada al alza o a la baja, sino que también puede incluir la detección de que la expresión del gen no ha cambiado (es decir, no detectar ninguna expresión del gen o ningún cambio en expresión del gen).
Los biomarcadores a evaluar en relación con la presente invención incluyen receptor de VEGF, factor de crecimiento placentario, HIF-1a y endoglina (CD105).
Para la evaluación de la expresión de biomarcadores, las muestras de pacientes que contienen tejido endotelial, células tumorales o proteínas o ácidos nucleicos producidos por células tumorales, se pueden usar en los métodos descritos en este documento y conocidos en la técnica. En resumen, el nivel de expresión del biomarcador puede evaluarse evaluando la cantidad (por ejemplo, cantidad absoluta o concentración) del marcador en una muestra, por ejemplo, una biopsia tumoral obtenida de un paciente u otra muestra de paciente que contenga material derivado del tumor (por ejemplo, sangre, suero, orina u otros fluidos corporales o excreciones como se describe anteriormente en este documento). La muestra celular puede, por supuesto, someterse a una variedad de técnicas preparativas y de almacenamiento después de la recolección bien conocidas (por ejemplo, extracción de ácido nucleico y/o proteína, fijación, almacenamiento, congelación, ultrafiltración, concentración, evaporación, centrifugación, etc.) antes de evaluar la cantidad del marcador en la muestra. Del mismo modo, las biopsias tumorales también pueden someterse a técnicas de preparación y almacenamiento posteriores a la recolección, por ejemplo, fijación.
Se puede detectar la expresión de proteínas biomarcadoras que tienen al menos una porción que se muestra en la superficie de las células que la expresan. Se puede determinar si una proteína marcadora, o una porción de la misma, está expuesta en la superficie celular. Por ejemplo, se pueden usar métodos inmunológicos para detectar tales proteínas en células enteras, o se pueden usar métodos de análisis de secuencia basados en ordenador bien conocidos para predecir la presencia de al menos un dominio extracelular (es decir, incluyendo proteínas secretadas y proteínas que tienen al menos un dominio de superficie celular). La expresión de una proteína marcadora que tiene al menos una porción que se muestra en la superficie de una célula que la expresa puede detectarse sin necesariamente lisar la célula tumoral (por ejemplo, usando un anticuerpo marcado que se une específicamente con un dominio de la superficie de la célula de la proteína)
La expresión de biomarcadores puede evaluarse mediante cualquiera de una amplia variedad de métodos bien conocidos para detectar la expresión de un ácido nucleico o proteína transcrita. Ejemplos no limitantes de tales métodos incluyen, por ejemplo, métodos inmunológicos para la detección de proteínas secretadas, de superficie celular, citoplasmáticas o nucleares, métodos de purificación de proteínas, ensayos de función o actividad de proteínas, métodos de hibridación de ácidos nucleicos, métodos de transcripción inversa de ácidos nucleicos, y métodos de amplificación de ácido nucleico o cualquier otro método conocido en la técnica.
Una mezcla de polinucleótidos transcritos obtenidos de la muestra puede ponerse en contacto con un sustrato que tiene fijado al mismo un polinucleótido complementario u homólogo con al menos una porción (por ejemplo, al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500 o más residuos de nucleótidos) de un ácido nucleico biomarcador. Si los polinucleótidos complementarios u homólogos con, son detectables diferencialmente en el sustrato (por ejemplo, detectables usando diferentes cromóforos o fluoróforos, o fijados en diferentes posiciones seleccionadas), entonces los niveles de expresión de una pluralidad de biomarcadores pueden evaluarse simultáneamente usando un solo sustrato (por ejemplo, una micromatriz de "chip genético" de polinucleótidos fijados en posiciones seleccionadas). Cuando se usa un método para evaluar la expresión de biomarcadores que implica la hibridación de un ácido nucleico con otro, la hibridación puede realizarse bajo condiciones de hibridación rigurosas.
Cuando se usa una pluralidad de biomarcadores aquí descritos en los métodos descritos aquí, el nivel de expresión de cada biomarcador en una muestra de paciente puede compararse con el nivel normal de expresión de cada uno de la pluralidad de biomarcadores en muestras no cancerosas del mismo tipo, ya sea en una mezcla de reacción única (es decir, usando reactivos, como diferentes sondas fluorescentes, para cada biomarcador) o en mezclas de reacción individuales correspondientes a uno o más de los biomarcadores.
El nivel de expresión de un biomarcador en tejido humano normal (es decir, no canceroso) se puede evaluar de varias maneras. Este nivel de expresión normal puede evaluarse evaluando el nivel de expresión del biomarcador en una porción de células que parece no cancerosa, y luego comparando el nivel de expresión normal con el nivel de expresión en una porción de las células tumorales. A medida que se obtiene más información como resultado del rendimiento rutinario de los métodos descritos en este documento, se pueden usar valores promedio de la población para la expresión normal de los biomarcadores. Alternativamente, el nivel normal de expresión de un biomarcador se puede determinar evaluando la expresión del biomarcador en una muestra de paciente obtenida de un paciente no afectado por cáncer, a partir de una muestra de paciente obtenida de un paciente antes de la sospecha de aparición de cáncer en el paciente, de muestras de pacientes archivadas, y similares.
Un método de ejemplo para detectar la presencia o ausencia de una proteína biomarcadora o ácido nucleico en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica de un sujeto de prueba y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar el polipéptido o nucleico ácido (por ejemplo, ARNm, ADN genómico o ADNc). Los métodos de detección pueden, por lo tanto, usarse para detectar ARNm, proteína, ADNc o ADN genómico, por ejemplo, en una muestra biológica in vitro e in vivo. Las técnicas in vitro para la detección de ARNm incluyen, por ejemplo, la transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR; por ejemplo, la realización experimental expuesta en Mullis, 1987, Patente de los Estados Unidos No. 4,683,202), hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de una proteína biomarcadora incluyen, pero no se limitan a, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), inmunotransferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección de ADN genómico incluyen, por ejemplo, hibridaciones Southern. Las técnicas in vivo para la detección de ARNm incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR cuantitativa, hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Además, las técnicas in vivo para la detección de una proteína biomarcadora incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo marcado dirigido contra la proteína o fragmento de la misma. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto puede detectarse mediante técnicas de imagen estándar.
Un principio general de tales ensayos de diagnóstico y pronóstico implica la preparación de una muestra o mezcla de reacción que puede contener un biomarcador y una sonda, en condiciones apropiadas y durante un tiempo suficiente para permitir que el biomarcador y la sonda interactúen y se unan, formando así un complejo que puede eliminarse y/o detectarse en la mezcla de reacción. Estos ensayos pueden llevarse a cabo de varias maneras usando una variedad de métodos.
También es posible detectar directamente la formación de complejo de biomarcador/sonda sin más manipulación o etiquetado de ninguno de los componentes (biomarcador o sonda), por ejemplo, utilizando la técnica de transferencia de energía de fluorescencia (es decir, FET, véase, por ejemplo, Lakowicz et al. al., Patente de los Estados Unidos No.
5,631,169 y Stavrianopoulos, et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,868,103).
La determinación de la capacidad de una sonda para reconocer un biomarcador puede lograrse sin marcar ninguno de los componentes del ensayo (sonda o biomarcador) mediante el uso de una tecnología como el Análisis de interacción biomolecular en tiempo real (BIA; Véase, por ejemplo, Sjolander, S. and Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem.
63: 2338-2345 and Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705). Como se usa en el presente documento, "BIA" o "resonancia de plasmón superficial" se refieren a una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin etiquetar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIAcore). Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativo de un evento de unión) resultan en alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR)), lo que resulta en una señal detectable que puede usarse como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.
Como alternativa a hacer determinaciones basadas en el nivel de expresión absoluta del biomarcador, las determinaciones pueden basarse en el nivel de expresión normalizado del biomarcador. Los niveles de expresión se normalizan corrigiendo el nivel de expresión absoluto de un biomarcador al comparar su expresión con la expresión de un gen que no es un biomarcador, por ejemplo, un gen de mantenimiento que se expresa constitutivamente. Los genes adecuados para la normalización incluyen genes de mantenimiento como el gen de la actina o genes específicos de células epiteliales. Esta normalización permite la comparación del nivel de expresión en una muestra, por ejemplo, una muestra de paciente, con otra muestra, por ejemplo, una muestra no tumoral, o entre muestras de diferentes fuentes.
Alternativamente, el nivel de expresión se puede proporcionar como un nivel de expresión relativo. Para determinar un nivel de expresión relativo de un biomarcador (por ejemplo, receptor VEGF, factor de crecimiento placentario, Hif-1a y endoglina (CD105)), el nivel de expresión del biomarcador se determina para 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, o 50 o más muestras de aislados de células normales frente a células cancerosas antes de la determinación del nivel de expresión para la muestra en cuestión. Se determina el nivel de expresión medio de cada uno de los genes analizados en el mayor número de muestras y se utiliza como nivel de expresión de referencia para el biomarcador. El nivel de expresión del biomarcador determinado para la muestra de prueba (nivel absoluto de expresión) se divide por el valor de expresión medio obtenido para ese biomarcador. Esto proporciona un nivel de expresión relativo.
En otro ejemplo de la presente descripción, se detecta una proteína biomarcadora. Un tipo de agente para detectar la proteína biomarcadora de la invención es un anticuerpo capaz de unirse a dicha proteína o un fragmento de la misma, como, por ejemplo, un anticuerpo marcado de forma detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Se puede usar un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, polipéptido de cadena de unión única). El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende abarcar el marcado directo de la sonda o anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, la unión física) de una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como el marcado indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está marcado directamente. Ejemplos de marcado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y el marcado final de una sonda de ADN con biotina de modo que pueda detectarse con estreptavidina marcada con fluorescencia. Se puede emplear una variedad de formatos para determinar si una muestra contiene una proteína que se une a un anticuerpo dado. Ejemplos de dichos formatos incluyen, pero no se limitan a, inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), análisis de inmunotransferencia Western y ensayo de inmunosorción enzimática (ELISA). Un experto en la materia puede adaptar fácilmente los métodos conocidos de detección de proteínas/anticuerpos para determinar si las células tumorales expresan un biomarcador de la presente invención. También se puede usar una combinación de dos o más de los ensayos para la detección de biomarcadores (los ejemplos no limitantes incluyen los descritos anteriormente) para evaluar uno o más biomarcadores.
También se describe en el presente documento un método para seleccionar un paciente con cáncer para el tratamiento con un inhibidor de la angiogénesis. El método comprende proporcionar una muestra del cáncer del paciente, detectando la expresión de uno o más genes cuya expresión se ha correlacionado con la sensibilidad o resistencia a un inhibidor de la angiogénesis, comparando el nivel de expresión del gen o genes detectados en la muestra del paciente a un nivel de expresión del gen o genes que se han correlacionado con la sensibilidad o resistencia al inhibidor de la angiogénesis. Ejemplos no limitantes de genes que se han correlacionado con la sensibilidad o la resistencia al inhibidor de la angiogénesis incluyen VEGF, receptor de VEGF, HIF-1a, receptor del factor de crecimiento placentario y endoglina (CD105). En un ejemplo adicional, se selecciona un paciente que se predice que se beneficiará de la administración del inhibidor de la angiogénesis si la expresión del gen o genes es similar a la expresión del gen o genes que se han correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de la angiogénesis. En un ejemplo no limitante, el inhibidor de la angiogénesis para el que se analiza la sensibilidad o resistencia del sujeto o el cáncer del sujeto es un inhibidor de endoglina (CD105) (por ejemplo, anticuerpos anti-endoglina humanizados). En otro ejemplo, el inhibidor de la angiogénesis para el que se analiza la sensibilidad o resistencia del sujeto o el cáncer del sujeto es un inhibidor del receptor de VEGF o un inhibidor de VEGF.
IV. Ensayos Funcionales
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden analizarse para una variedad de funciones usando una variedad de métodos in vitro e in vivo que incluyen, pero no se limitan a los conocidos en la técnica y los descritos aquí.
Métodos de ensayo de señalización y función de CD105
El CD 105 (endoglina) es un miembro de la familia de receptores de TGF-p que se expresa mediante la proliferación de células endoteliales, y se necesitan niveles normales de CD 105 para la proliferación de células endoteliales. La expresión de CD 105 aumenta por la hipoxia celular a través de la producción de factor-1-a inducible por hipoxia (HIF-1-a) y protege a las células hipóxicas de la apoptosis. El CD 105 actúa para modular la señalización de múltiples complejos de receptores de quinasa de la superfamilia de TGF-p, incluidos los receptores de TGF-p (TGF-pR), las quinasas similares a receptores de activina (ALK) y los receptores de activina. En ausencia de CD105, la activación de los receptores de TGF-p produce la fosforilación de las proteínas SMAD que inhiben el crecimiento de las células endoteliales. Sin embargo, la activación de CD105 por TGF-p modula la fosforilación de la proteína SMAD. El resultado final es la liberación de los efectos inhibidores del crecimiento de la activación del receptor de TGF-p en las células endoteliales. La prevención de la activación de CD 105 por el anticuerpo anti-CD 105 actúa sinérgicamente con TGF-p para suprimir el crecimiento de células endoteliales. El TGF-p puede estimular dos vías distintas de señalización del receptor tipo I/SMAD con efectos opuestos en las células endoteliales. La ruta de señalización de TGF-p/ALK5 (A) conduce a la inhibición de la proliferación y migración celular, mientras que la ruta de TGF-p/ALK1 (B) induce la proliferación y migración de células endoteliales. CD105, un receptor accesorio de TGF-p, altamente expresado durante la angiogénesis, es esencial para la señalización de ALK1. En ausencia de CD105, la señalización de TGF-p/ALK5 es predominante y mantiene el endotelio inactivo. La alta expresión de CD105 estimula la vía ALK1 e inhibe indirectamente la señalización de ALK5, promoviendo así el estado de activación de la angiogénesis.
En una realización no limitante, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno proporcionados en este documento bloquean la angiogénesis bloqueando la ruta de señalización de TGF-p/ALK1. En otra realización, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno proporcionados en este documento bloquean la angiogénesis evitando la fosforilación y/o señalización de Smad1/5/8. CD 105 participa en la promoción de la angiogénesis a través de la señalización del TGF-p/ALK1, que a su vez implica la disminución y/o bloqueo de la fosforilación de las proteínas Smad2/3. En otra realización más, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno proporcionados en este documento bloquean la angiogénesis mejorando la fosforilación y/o señalización de Smad2/3. Los métodos y técnicas para analizar el efecto de bloqueo o inhibidor de los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno proporcionados aquí en la ruta de señalización de TGF-p/ALK1 y/o la fosforilación de Smad1/5 incluyen, entre otras, técnicas moleculares conocidas. A modo de ejemplo, la inmunotransferencia Western con anticuerpos específicos para cualquiera de las proteínas en las vías TGF-p/ALK5 o TGF-p/ALK1 puede usarse para determinar el efecto inhibidor y/o estimulante de los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos aquí en las vías TGF-p/ALKS o TGF-p/ALK1. De manera similar, la detección de ARNm o la regulación del ARNm para las proteínas involucradas en las vías TGF-p/ALKS o TGF-p/ALK1 se pueden usar para analizar el efecto inhibidor y/o estimulante de los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos aquí. Métodos adicionales para el ensayo de señalización celular para las rutas TGF-p/ALKS o TGF-p/ALK1 son conocidos en la técnica y se contemplan en el presente documento.
En una realización no limitante, los anticuerpos pueden evaluarse con respecto a la inhibición de la angiogénesis y la proliferación de células endoteliales. La unión de los anticuerpos anti-endoglina a HUVEC no impide la unión posterior de TGF-p a HUVEC. Por lo tanto, la supresión directa del crecimiento de células endoteliales por los anticuerpos antiendoglina representa uno de los mecanismos subyacentes por los cuales se observan los efectos antiangiogénicos y supresores de tumores in vivo. En otra realización, los anticuerpos pueden evaluarse con respecto al bloqueo de la angiogénesis evitando la fosforilación y/o señalización de Smad1/5/8. CD 105 participa en la promoción de la angiogénesis a través de la señalización del TGF-p/ALK1, que a su vez implica la disminución y/o bloqueo de la fosforilación de las proteínas Smad2/3. En otra realización más, los anticuerpos pueden evaluarse con respecto al bloqueo de la angiogénesis mejorando la fosforilación y/o señalización de Smad2/3.
Los métodos y técnicas para analizar el efecto de bloqueo o inhibidor de los anticuerpos proporcionados aquí en la ruta de señalización de TGF-p/ALK1 y/o la fosforilación de Smad1/5 incluyen, pero no se limitan a, técnicas moleculares conocidas. A modo de ejemplo, la inmunotransferencia Western con anticuerpos específicos para cualquiera de las proteínas en las vías TGF-p/ALK5 o TGF-p/ALK1 puede usarse para determinar el efecto inhibidor y/o estimulante de los anticuerpos anti-endoglina descritos aquí en las vías TGF-p/ALKS o TGF-p/ALK1. De manera similar, la detección de ARNm o la regulación del ARNm para las proteínas involucradas en las vías TGF-p/ALKS o TGF-p/ALK1 se pueden usar para analizar el efecto inhibidor y/o estimulante de los anticuerpos descritos en este documento. Métodos adicionales para el ensayo de señalización celular para las rutas TGF-p/ALK5 o TGF-p/ALK1 son conocidos en la técnica y se contemplan en el presente documento.
La actividad de los anticuerpos anti-endoglina descritos en este documento puede evaluarse usando ensayos reconocidos en la técnica mediante, por ejemplo, ensayos de unión tales como ELISA, ELISA competitivos, resonancia de plasmón superficial y efecto sobre las células HUVEC como se describe con más detalle más adelante.
Métodos de ensayo de adhesión celular
La adhesión celular se puede medir por métodos conocidos por los expertos en la materia. Los ensayos se han descrito anteriormente, por ejemplo, por Lebrin, et al., J. Clin. Invest 1997, 99: 1390-1398. En resumen, se puede permitir que las células se adhieran al sustrato (es decir, un componente ECM) en los pozos recubiertos. Las células no unidas se eliminan mediante lavado, y los sitios de unión no específicos se bloquean mediante incubación con BSA. Las células unidas se tiñen con cristal violeta, y la adhesión celular se cuantifica midiendo la densidad óptica del cristal violeta eluido de las células unidas a una longitud de onda de 600 nm.
Métodos de ensayo de migración celular
Los ensayos para la migración celular se han descrito en la literatura, por ejemplo, por Brooks, et al., J. Clin. Invest 1997, 99: 1390-1398 y los métodos para medir la migración celular son conocidos por los expertos en la materia. En un método para medir la migración celular descrito en este documento, las membranas de las cámaras de migración de transpozo se recubren con sustrato, se lavan los transpozos y los sitios de unión no específicos se bloquean con BSA. Las células tumorales de cultivos subconfluentes se recogen, se lavan y se resuspenden en regulador de migración en presencia o ausencia de anticuerpos de ensayo. Después de que se permite que las células tumorales migren a la parte inferior de las membranas transpozo recubiertas, las células que quedan en el lado superior de la membrana se eliminan y las células que migran hacia el lado inferior se tiñen con cristal violeta. La migración celular se cuantifica por recuentos celulares directos por campo microscópico.
SCID/ratones desnudos
Un método para analizar el crecimiento tumoral utiliza el ratón SCID, como sigue: las células de melanoma M21 subconfluentes humanas se cosechan, lavan y resuspenden en PBS estéril (20 x 106 por ml). Los ratones SCID se inyectan por vía subcutánea con 100 pl de suspensión de células de melanoma humano M21 (2 x 106). Tres días después de la inyección de células tumorales, los ratones no se tratan o se tratan por vía intravenosa o intraperitoneal (por ejemplo, 100 pg/ratón) con una o más composiciones de control o prueba. Los ratones son tratados diariamente durante 24 días. El tamaño del tumor se mide con calibradores y el volumen se estima utilizando la fórmula V = (L x W2)/?, donde V es igual al volumen, L es igual a la longitud y W es igual al ancho.
Un método para analizar el crecimiento tumoral utiliza el ratón desnudo, como sigue: las células tumorales MDA-MB-435 (0.4 x 10 6 células/ratón) en 50 pl de PBS se implantan ortotópicamente en la almohadilla de grasa mamaria de ratones desnudos hembra (cinco a seis semanas de edad). Cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de aproximadamente 50-80 mm3, los ratones se asignaron al azar (al menos 10/grupo) y el tratamiento intravenoso o intraperitoneal con uno o más anticuerpos a 1 pg (0.05 mg/kg) por dosis, 10 pg (0.5 mg/kg), 100 pg (5 mg/kg) o 200 pg (10 mg/kg), o 100 pg de anticuerpo de control en 100 pl de PBS, o vehículo PBS 100 pl dos veces por semana; en algunos estudios, un grupo no tratado también puede ser valorado. El tamaño del tumor se mide con calibradores y el volumen se estima utilizando la fórmula V = (L x W?)/2, donde V es igual al volumen, L es igual a la longitud y W es igual al ancho.
Modelos de ratón singénico BALB/c
Alternativamente, también se pueden utilizar modelos de ratones singénicos BALB/c para evaluar el crecimiento tumoral y la inhibición de los mismos por los anticuerpos o se describen en este documento como es ejemplificado por, por ejemplo, Tsujie et al. J. Oncology, 29: 1087-1094 (2006).
Ratones Quiméricos
Otro ensayo mide la angiogénesis en un ratón quimérico: modelo de humano-ratón y se denomina ensayo de ratón quimérico. El ensayo ha sido descrito en detalle por otros, y además se ha descrito aquí para medir la angiogénesis, la neovascularización y la regresión de los tejidos tumorales. Véase Yan, et al. (1993) J. Clin. Invertir. 91: 986-996.
El ensayo de ratón quimérico es un modelo de ensayo útil para la angiogénesis in vivo porque los injertos de piel trasplantados se parecen mucho histológicamente a la piel humana normal y se está produciendo una neovascularización de tejido completo en donde crecen vasos sanguíneos humanos reales desde la piel humana injertada hacia el tumor humano tejido en la superficie de la piel humana injertada. El origen de la neovascularización en el injerto humano puede demostrarse mediante tinción inmunohistoquímica de la neovasculatura con marcadores de células endoteliales específicas de humanos.
El ensayo quimérico de ratón demuestra la regresión de la neovascularización basada tanto en la cantidad como en el alcance de la regresión del crecimiento de nuevos vasos. Además, es fácil controlar los efectos sobre el crecimiento de cualquier tejido trasplantado sobre la piel injertada, como un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es útil porque hay un control interno para la toxicidad en el sistema de ensayo. El ratón quimérico es expuesto a cualquier reactivo de prueba y, por lo tanto, la salud del ratón es una indicación de toxicidad. Otros modelos animales descritos aquí y conocidos en la técnica también pueden utilizarse en los métodos descritos aquí.
Ensayo de ojo de conejo
Otra medida de angiogénesis es un modelo de ojo de conejo in vivo y se denomina ensayo de ojo de conejo. El ensayo del ojo de conejo ha sido descrito en detalle por otros, y se ha utilizado para medir tanto la angiogénesis como la neovascularización en presencia de inhibidores angiogénicos como lo ejemplifican D'Amato et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 91(9): 4082-4085.
El ensayo de ojo de conejo es un modelo de ensayo reconocido para la angiogénesis in vivo porque el proceso de neovascularización, ejemplificado por vasos sanguíneos de conejo que crecen desde el borde de la córnea hacia la córnea, se visualiza fácilmente a través de la córnea transparente natural del ojo. Además, tanto el alcance como la cantidad de estimulación o inhibición de la neovascularización o la regresión de la neovascularización se pueden controlar fácilmente con el tiempo.
Finalmente, el conejo es expuesto a cualquier reactivo de prueba y, por lo tanto, la salud del conejo es una indicación de toxicidad del reactivo de prueba.
En resumen, se realizan ensayos de la membrana corioalantoidea de pollo (CAM) y se registran los efectos sobre la vasculatura en desarrollo a las 48 horas después de la implantación de un sedimento de carboximetilcelulosa al 0.5% que contiene uno o más compuestos de control o prueba. La neovascularización corneal es inducida por un sedimento implantado de poli(metacrilato de hidroxietilo) (Hydron; Interferon Sciences, New Brunswick, NJ) que contiene 650 ng de la potente proteína angiogénica factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) unido al sucralfato (sulfato de sacarosa y aluminio; Bukh Meditec, Copenhague). La adición de sucralfato al sedimento protege al bFGF de la degradación y proporciona su liberación lenta, produciendo así una angiogénesis agresiva consistente que es más pronunciada que la inducida por bFGF/Hydron solo. La liberación de bFGF de los gránulos que contienen sucralfato/Hydron se puede detectar in vitro hasta 4 días después de que se forman los gránulos en comparación con solo 1 día para los gránulos con Hydron solo. Los gránulos se preparan mezclando 110 pl de solución salina que contiene 12 pg de bFGF recombinante (Takeda, Osaka) con 40 mg de sucralfato; esta suspensión se agrega a 80 pl de Hydron al 12% (p/vol) en etanol. Alícuotas (10 |jl) de esta mezcla se pipetean sobre clavijas de teflón y se dejan secar, produciendo aproximadamente 17 gránulos.
Se implanta un gránulo en los microbolsillos corneales de cada ojo de una coneja blanca de Nueva Zelanda anestesiada, a 2 mm del limbo, seguido de una aplicación tópica única de ungüento de eritromicina en la superficie de la córnea. El examen histológico en días consecutivos demuestra el crecimiento progresivo de los vasos sanguíneos en la córnea hacia el sedimento con solo células inflamatorias raras vistas. Esta respuesta angiogénica no se ve alterada por la supresión inmune severa con irradiación corporal total, y los gránulos con sucralfato solo no inducen angiogénesis. Los vasos nuevos son inducidos principalmente por el bFGF más que por la inflamación. Los animales se alimentan diariamente a partir de 2 días después de la implantación mediante lavado gástrico con uno o más compuestos suspendidos en 0.5% de carboximetilcelulosa o vehículo solo. Los animales inmunosuprimidos reciben radiación corporal total de 6 Gy durante 6 minutos inmediatamente antes de la implantación de los gránulos. Esta dosis de radiación produce una marcada leucocitopenia con >80% de reducción en el recuento de leucocitos para el día 2 y >90% de reducción para el día 3, resultados que son consistentes con los informes anteriores.
Los animales son examinados con una lámpara de hendidura cada dos días de manera enmascarada por el mismo especialista en córnea (M.S.L.). El área de neovascularización corneal se determina midiendo con una retícula la longitud del vaso (L) desde el limbo y el número de horas de reloj (C) del limbo involucrado. Se utiliza una fórmula para determinar el área de un segmento de banda circular: C/12 x 3.1416 [r2-(r-L)2], donde r = 6 mm, el radio medido de la córnea del conejo. Se mide la banda contigua uniforme de neovascularización adyacente al sedimento, por lo tanto, se puede evaluar la inhibición total de la neovascularización.
Ensayos de angiogénesis con tapón de Matrigel en ratones
Para confirmar los efectos de una composición sobre la angiogénesis, se puede usar un ensayo de angiogénesis con tapón Matrigel de ratón. Diversos factores de crecimiento (por ejemplo, IGF-1, bFGF o VEGF) (250 ng) y heparina (0.0025 unidades por/ml) se mezclan con Matrigel reducido en factor de crecimiento como se describió previamente (Montesano, et al., J. Cell Biol. 1983, 97: 1648-1652; Stefansson, et al., J. Biol. Chem. 2000, 276: 8135-8141). Las composiciones descritas en el presente documento o los anticuerpos de control pueden incluirse en las preparaciones de Matrigel utilizando uno o más grupos de dosificación de animales. En experimentos de control, se prepara Matrigel en ausencia de factores de crecimiento. Los ratones se inyectan por vía subcutánea con 0.5 ml de la preparación Matrigel y se dejan incubar durante una semana. Después del período de incubación, se sacrifican los ratones y se extraen quirúrgicamente los tapones Matrigel polimerizados. La angiogénesis dentro de los tapones Matrigel se cuantifica mediante dos métodos establecidos, que incluyen el análisis inmunohistoquímico y el contenido de hemoglobina (Furstenberger, et al., Lancet. 2002, 3: 298-302; Volpert, et al., Cancer Cell 2002, 2(6): 473-83; y Su, et al., Cancer Res.2003, 63: 3585-3592). Para el análisis inmunohistoquímico, los tapones Matrigel se incorporan en OCT, se congelan y se preparan secciones de 4 jm . Las secciones congeladas se fijan en metanol/acetona (1:1). Las secciones congeladas se tiñen con anticuerpo policlonal dirigido a CD31. La angiogénesis se cuantifica mediante recuentos de densidad microvascular dentro de 20 campos microscópicos de alta potencia (200X).
El contenido de hemoglobina se puede cuantificar como se describió previamente (Schnaper, et al., J. Cell Physiol.
1993, 256: 235-246; Montesano, et al., J. Cell Biol. 1983, 97: 1648-1652; Stefansson, et al., J. Biol. Chem. 2000, 276: 8135-8141; and Gigli, et al., J. Immunol. 1986, 100: 1154-1164). Los implantes Matrigel se congelan en hielo seco y se liofilizan durante la noche. Los implantes secos se resuspenden en 0.4 ml de saponina al 1.0% (Calbiochem) durante una hora, y se rompen por pipeteo vigoroso. Las preparaciones se centrifugan a 14.000 Xg durante 15 minutos para eliminar cualquier partícula. La concentración de hemoglobina en el sobrenadante se determina directamente midiendo la absorbancia a 405 nm y se compara con una concentración estándar de hemoglobina purificada.
Métodos de ensayo de crecimiento tumoral
El crecimiento tumoral se puede analizar mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, el modelo de ratón SCID, el modelo de ratón desnudo y los ratones BALB/c con tumores singénicos. Los modelos de ratón SCID para el crecimiento tumoral se llevan a cabo de la siguiente manera: las células de melanoma M21 humanas subconfluentes (o cualquier tipo de célula tumoral deseada) se recogen, se lavan y se resuspenden en PBS estéril (20 x 106 por ml). Los ratones SCID se inyectan por vía subcutánea con 100 j l de suspensión de células de melanoma humano M21 (2 x 106). Tres días después de la inyección de células tumorales, los ratones no se tratan o se tratan intraperitonealmente con un antagonista en los intervalos de dosis deseados. Los ratones son tratados diariamente durante 24 días. El tamaño del tumor se mide con calibradores y el volumen se estima utilizando la fórmula V = (L x W2)/2, donde V es igual al volumen, L es igual a la longitud y W es igual al ancho.
Alternativamente, los modelos de ratón desnudo, los modelos de ratón SCID y/o los modelos de ratón singénicos BALB/c también se pueden utilizar para evaluar el crecimiento tumoral y la inhibición del mismo por los anticuerpos anti-endoglina humanizados o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento. (Tsujie et al., Int. J. Oncology, 29: 1087-1094 (2006)).
Métodos de ensayo de proliferación celular
La proliferación celular se puede analizar mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. Como se describe en el presente documento, las células endoteliales humanas subconfluentes (HUVEC) se pueden resuspender en un regulador de proliferación que contiene suero bajo (5.0%) en presencia o ausencia de CM (25 j L) de las células ECV o ECVL, y las células endoteliales pueden proliferar durante 24 horas. La proliferación se puede cuantificar midiendo la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial utilizando un kit de ensayo WST-1 disponible en el-merocado (Chemicon). Además, como se describe en el presente documento, la proliferación puede cuantificarse midiendo la incorporación de 3H usando métodos estándar. (She et al., Int. J. Cancer, 108: 251-257 (2004)).
Otros métodos para evaluar la proliferación celular son conocidos en la técnica y se contemplan aquí. Otros ejemplos no limitantes se describen con más detalle en los ejemplos.
Métodos para inducir CDC, ADCC y opsonización
Se han dirigido diversas terapias para aumentar la respuesta inmune natural del cuerpo a las células transformadas. Los métodos efectores convencionales incluyen la citólisis dependiente del complemento ("CDC"), la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos ("ADCC") y la fagocitosis (aclaramiento por el sistema reticuloendotelial después de que la célula diana esté recubierta con inmunoglobulina). Se sabe que en presencia de anticuerpos, ciertas células efectoras, como las células linfoides que tienen receptores unidos a la superficie para las regiones Fc de los anticuerpos, median una reacción de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos ("ADCC") contra las células diana. Por medio de ADCC, estas células efectoras ejercen actividad citolítica contra tales células diana.
Se han demostrado dos tipos de reacciones de ADCC in vitro. En las reacciones clásicas de ADCC, las células efectoras se unen a las células objetivo recubiertas de anticuerpos y posteriormente provocan la citólisis de las células objetivo (AH Greenberg et al., "Characteristics Of The Effector Cells Mediating Cytotoxicity Against Antibody-Coated Target Cells". I., Inmunología, 21, p. 719 (1975)). Esta unión entre el efectory la célula diana resulta de la interacción de la región Fc del anticuerpo que recubre la célula diana y el receptor Fc de la célula efectora. Una desventaja de este tipo de reacción ADCC es que puede verse obstaculizada por complejos circulantes de antígeno-anticuerpo, a menudo asociados con diversas enfermedades, que compiten con el anticuerpo unido a la célula diana por los receptores Fc de las células efectoras (I.C.M. MacLennan, "Competition For Receptors For Immunoglobulin On Cytotoxic Lymphocytes." Clin. Exp. Immunol., 10, p. 275 (1972)). Debido a este inconveniente del ADCC clásico, se ha propuesto un segundo tipo de reacción de ADCC:ADCC dirigida por anticuerpos. En el ADCC dirigido por anticuerpos, el anticuerpo específico del objetivo se une primero a la célula efectora y el complejo resultante se "dirige", a través del anticuerpo, a su antígeno específico en la superficie de la célula diana. Ventajosamente, el ADCC dirigido por anticuerpos puede no verse afectado por la presencia de complejos antígeno-anticuerpo que circulan en el sistema huésped. La interacción entre los anticuerpos y las células efectoras a través de la unión de la región Fc/receptor Fc es normalmente débil. Y, en algunos casos, los anticuerpos no permanecen asociados con las células efectoras durante un período de tiempo suficiente para permitir la lisis de las células diana. En vista de este problema potencial, se han unido anticuerpos a las células efectoras mediante el pretratamiento con polietilenglicol y una mezcla de aceites de ftalato (J.F. Jones and D.M. Segal, "Antibody-Dependent Cell Mediated Cytolysis (ADCC) With Antibody-Coated Effectors: New Methods For Enhancing Antibody Binding And Cytolysis",J. Immunol., 125, pp. 926-33 (1980)). Sin embargo, la aplicabilidad de este método para tratamientos in vivo puede verse disminuida por los efectos tóxicos que cualquier residuo de polietilenglicol y aceite de ftalato en el complejo de células efectoras y anticuerpos puede tener en el cuerpo.
Alternativamente, se ha propuesto un método para mejorar la ADCC dirigida por anticuerpos mediante quimioterapia adyuvante con fármacos citotóxicos (I.R. Mackay et al., "Effect On Natural Killer And Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Of Adjuvant Cytotoxic Chemotherapy Including Melphalan In Breast Cancer",Cancer Immunol. Immunother., 16, págs. 98-100 (1983)). Los ensayos para la prueba de ADCC son bien conocidos en la técnica, como por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,756,097.
Por consiguiente, la presente invención proporciona anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti-endoglina humanizados) que pueden unirse a células que tienen un papel en la neovascularización o angiogénesis que pueden mejorar la fagocitosis y la destrucción de las células y, por lo tanto, mejorar la protección in vivo. También se proporcionan otros anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos que inmunorreaccionan, se unen específicamente, o se unen preferentemente a un sitio de unión o epítopo al que tales anticuerpos pueden unirse y que tienen el mismo efecto.
Los anticuerpos de la invención también pueden ser opsónicos, o exhibir actividad opsónica, para células que tienen un papel en la neovascularización o la angiogénesis (por ejemplo, células endoteliales). Como reconocen los expertos en la técnica, la "actividad opsónica" se refiere a la capacidad de una opsonina (generalmente un anticuerpo o el factor sérico C3b) para unirse a un antígeno o receptor celular para promover la unión del antígeno o receptor celular a un fagocito y por lo tanto mejorar la fagocitosis. Ciertas células se vuelven extremadamente atractivas para los fagocitos como los neutrófilos y los macrófagos cuando se recubren con un anticuerpo opsónico y su tasa de eliminación del torrente sanguíneo aumenta notablemente. La actividad opsónica se puede medir de cualquier manera convencional como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6,610,293.
En otra realización no limitante, un paciente que tiene un trastorno neovascular o un trastorno dependiente de la angiogénesis arroja antígenos/péptidos (por ejemplo, endoglina) de la angiogénesis. Estos antígenos/péptidos pueden ser "antígenos asociados a tumores". A dichos pacientes se les puede administrar un anticuerpo al antígeno/péptido (por ejemplo, endoglina) y pueden iniciar cualquiera de las rutas descritas en el presente documento para inducir CDC, ADCC, opsonización o cualquier otra forma de destrucción mediada por células.
V. Paquetes y kits
En otras realizaciones adicionales, la presente solicitud se refiere a kits para su uso con los compuestos descritos anteriormente. Los anticuerpos humanizados o los fragmentos de unión a antígeno que se unen a la endoglina se pueden proporcionar en un kit. Por lo tanto, los kits comprenderán, en un medio contenedor adecuado, una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la endoglina. El kit puede comprender un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la endoglina en medios contenedores adecuados.
El medio contenedor de los kits generalmente incluirá al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa y/u otro medio contenedor, en donde se puede colocar al menos un polipéptido, y/o preferiblemente, alícuotas adecuadas. Los kits pueden incluir un medio para contener al menos una proteína de fusión, unidad estructural detectable, molécula indicadora y/o cualquier otro recipiente de reactivo en confinamiento cerrado para venta comercial. Dichos recipientes pueden incluir recipientes de plástico inyectados y/o moldeados por soplado en los que se retienen los viales deseados. Los kits también pueden incluir material impreso para el uso de los materiales en el kit.
Los paquetes y kits pueden incluir adicionalmente un agente regulador, un conservante y/o un agente estabilizante en una formulación farmacéutica. Cada componente del kit puede encerrarse dentro de un contenedor individual y todos los diversos contenedores pueden estar dentro de un solo paquete. Los kits de invención pueden diseñarse para almacenamiento en frío o almacenamiento a temperatura ambiente.
Además, las preparaciones pueden contener estabilizadores para aumentar la vida útil de los kits e incluir, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA). Cuando las composiciones se liofilizan, el kit puede contener preparaciones adicionales de soluciones para reconstituir las preparaciones liofilizadas. Las soluciones de reconstitución aceptables son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, solución salina regulada con fosfato (PBS) farmacéuticamente aceptable.
Además, los paquetes o kits proporcionados en el presente documento pueden incluir además cualquiera de las otras unidades estructurales proporcionadas en el presente documento tales como, por ejemplo, una o más moléculas indicadoras y/o una o más unidades estructurales/agentes detectables.
Los paquetes y kits pueden incluir además uno o más componentes para un ensayo, como, por ejemplo, un ensayo ELISA. Las muestras que se analizarán en esta solicitud incluyen, por ejemplo, secciones y secreciones de sangre, plasma y tejidos, orina, linfa y sus productos. Los paquetes y kits pueden incluir además uno o más componentes para la recolección de una muestra (por ejemplo, una jeringa, una copa, un hisopo, etc.).
Los paquetes y kits pueden incluir además una etiqueta que especifica, por ejemplo, una descripción del producto, modo de administración y/o indicación de tratamiento. Los paquetes proporcionados aquí pueden incluir cualquiera de las composiciones como se describe en el presente documento. El paquete puede incluir además una etiqueta para el tratamiento de enfermedades oculares caracterizadas por angiogénesis/neovascularización (por ejemplo, degeneración macular, CNV, retinopatía diabética), nefropatía diabética, una enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo, EII), artritis reumatoide, osteoartritis, una forma de cáncer y sus metástasis.
El término "material de embalaje" se refiere a una estructura física que aloja los componentes del kit. El material de embalaje puede mantener los componentes de forma estéril y puede estar hecho de material comúnmente utilizado para tales fines (por ejemplo, papel, fibra corrugada, vidrio, plástico, papel de aluminio, ampollas, etc.). La etiqueta o el prospecto pueden incluir instrucciones escritas apropiadas. Los kits, por lo tanto, pueden incluir adicionalmente etiquetas o instrucciones para su uso los componentes del kit en cualquier método de la invención. Un kit puede incluir un compuesto en un paquete o dispensador junto con instrucciones para administrar el compuesto en un método descrito en este documento.
La invención proporciona además kits que utilizan los métodos de diagnóstico y ensayos descritos aquí. En algunas realizaciones, un kit según la invención comprende reactivos para la detección de un gen o genes cuyos niveles de expresión se han correlacionado con la sensibilidad o resistencia a un inhibidor de la angiogénesis en una muestra de células cancerosas de un paciente. En algunas realizaciones, el gen o genes se seleccionan de VEGF, receptor de VEGF, HIF-1a, receptor del factor de crecimiento placentario y CD105. En algunas realizaciones, el kit comprende VEGF. En algunas realizaciones, el kit comprende receptor VEGf . En algunas realizaciones, el kit comprende HlF-1a. En algunas realizaciones, el kit comprende receptor del factor de crecimiento placentario. En algunas realizaciones, el kit comprende CD105. En algunas realizaciones, el kit comprende al menos dos de VEGF, receptor de VEGF, HIF-1a, receptor del factor de crecimiento placentario y CD105. En algunas realizaciones, el kit comprende al menos dos genes que se han correlacionado con la sensibilidad a un inhibidor de la angiogénesis. En algunas realizaciones, el kit comprende al menos dos genes que se han correlacionado con la resistencia a un inhibidor de la angiogénesis. En algunas realizaciones, el kit comprende al menos un gen que se ha correlacionado con la sensibilidad a un inhibidor de la angiogénesis y un gen que se ha correlacionado con la resistencia a un inhibidor de la angiogénesis.
En otras realizaciones adicionales, un kit de acuerdo con la invención comprende reactivos para la detección de niveles de expresión de VEGF, receptor de VEGF, HIF-1a, receptor de factor de crecimiento placentario y CD 105 en una muestra de células tumorales de un paciente para ser tratado y una dosis o varias dosis de un inhibidor, que incluyen pero no se limitan a anticuerpos anti-endoglina humanizados o fragmentos de unión a antígeno descritos aquí, en una variedad de formas de dosificación, tales como cápsulas, capsuletas, cápsulas de gel, polvos para suspensión, etc. además se contempla dentro de la invención que el kit que comprende reactivos para la detección de VEGF, receptor de VEGF, HIF-1a, receptor de factor de crecimiento placentario y niveles de expresión de CD 105 en una muestra de células tumorales de un paciente a tratar comprenderá además cualquiera de los realizaciones mencionadas anteriormente de los kits para la administración conjunta de al menos un inhibidor de la angiogénesis adicional.
Las instrucciones pueden incluir instrucciones para practicar cualquiera de los métodos descritos en este documento, incluidos los métodos de tratamiento. Las instrucciones también pueden incluir indicaciones de un punto final clínico satisfactorio o cualquier síntoma adverso que pueda ocurrir, o información adicional requerida por agencias reguladoras como la Food and Drug Administration para su uso en un sujeto humano.
Las instrucciones pueden estar en "material impreso", por ejemplo, en papel o cartón dentro o adherido al kit, o en una etiqueta pegada al kit o material de embalaje, o adherida a un vial o tubo que contiene un componente del equipo. Las instrucciones también se pueden incluir en un medio legible por ordenador, como un disco (disquete o disco duro), CD óptico como CD o DVD-ROM/RAM, cinta magnética, medios de almacenamiento eléctrico como RAM y ROM, punta de IC e híbridos de estos, tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos.
Las realizaciones de los compuestos y métodos de la presente solicitud pretenden ser ilustrativas y no limitantes. Las personas expertas en la técnica pueden realizar modificaciones y variaciones a la luz de las enseñanzas anteriores, específicamente aquellas que pueden pertenecer a alteraciones en los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen al endoglina que rodea las modificaciones descritas mientras se mantiene funcionalmente cerca del nativo con respecto a la unión de endoglina. Por lo tanto, debe entenderse que pueden realizarse cambios en las realizaciones particulares divulgadas que están dentro del alcance de lo que se describe de acuerdo con el Artículo 69 EPC y el Protocolo sobre su interpretación.
Ejemplos
La aplicación puede entenderse mejor por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar más completamente las realizaciones de la invención y, de ninguna manera, deben interpretarse como limitantes del amplio alcance de la aplicación. Si bien ciertas realizaciones de la presente solicitud se han mostrado y descrito aquí, será obvio que tales realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo. Los expertos en la materia pueden experimentar numerosas variaciones, cambios y sustituciones sin apartarse de la invención de conformidad con el Artículo 69 EPC y el Protocolo sobre su interpretación; debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas a las realizaciones descritas en la presente memoria para practicar los métodos descritos en la presente.
Ejemplo 1
Generación y unión de anticuerpos anti-CD105 humanizados y humanizados/desinmunizados
Construcción, expresión y purificación de anticuerpos.
Todos los genes de la región VH y VK humanizados y humanizados/desinmunizados se sintetizaron usando una serie de oligonucleótidos superpuestos que fueron fusionados, ligados y amplificados por PCR para dar regiones V sintéticas de longitud completa. Las variantes ensambladas se clonaron directamente en el sistema de vector de expresión pANT de Antitope Ltd. para cadenas pesadas IgG1 y cadenas livianas kappa.
Todas las combinaciones de cadenas pesadas y ligeras humanizadas (es decir, un total de 4 emparejamientos) y combinaciones de cadenas pesadas y ligeras humanizadas/desinmunizadas (es decir, un total de 24 emparejamientos) se transfectaron de manera estable en células NS0 mediante electroporación y se seleccionaron usando metotrexato 200 nM (Sigma Cat. No. M8407). Las colonias resistentes al metotrexato para cada construcción se analizaron para determinar los niveles de expresión de IgG usando un ELISA IgG1. Las mejores líneas de expresión fueron seleccionadas y congeladas bajo nitrógeno líquido. Latransfección exitosa y la selección de clones se lograron para todas las variantes y los niveles de expresión de las variantes de anticuerpos humanizados y humanizados/desinmunizados en cultivos estáticos saturados se muestran en la Tabla 1.
Por lo tanto, se purificaron veinticuatro variantes de IgG1 a partir de sobrenadantes de cultivo de células NS0 en una columna de Sepharose de Proteína A (GE Healthcare Cat. No. 110034-93) y se cuantificaron por OD280nm usando un coeficiente de extinción, Ec(0.1%) = 1.62, basado en la secuencia de aminoácidos predicha. Se purificaron aproximadamente 500 |jg de cada variante de anticuerpo y se analizaron las variantes candidatas reduciendo SDS-PAGE. En resumen, el gel de SDS-PAGE reductor teñido con azul de Coomassie de variantes de anticuerpos candidatas. Se cargó 1 |jg de cada muestra en un gel NuPage 4-12% Bis-Tris (Invitrogen Cat. No. NP0322BOX) y se ejecutó a 200 V durante 30 minutos. El marcadorfue Bio-Rad Precision Plus (Cat. No. 161-073). Se observaron bandas correspondientes a los tamaños predichos de las cadenas pesadas y ligeras sin evidencia de contaminación en ningún carril (datos no mostrados).
Metodología ELISA
Se usó un ELISA para analizar la unión de los anticuerpos anti-endoglina humanizados y humanizados/desinmunizados a la endoglina. En resumen, se realizó un ELISA de acuerdo con los siguientes pasos:
I. Cubrir una placa Nunc Maxisorp con MAB9811-01 (anticuerpo policlonal anti-endoglina) a 1500 ng/ml en PBS, 100 jl/pozo. Cubrir la placa con un sellador e incubar durante la noche (16-24 horas) a 4°C.
2. Lavar la placa 2X con -200 j l de PBS (sin Tween).
3. Agregar 200 jl/pozo de solución de bloqueo de BSA (BSA al 1%) e incubar 60 minutos a temperatura ambiente.
4. Lavar la placa 3X con PBS que contiene Tween (PBS-T) usando el lavador de placas BioTek.
5. Agregar 100 jl/pozo de CD105 (R&D Systems Cat 1097-EN) a 100 ng/ml en PBS-T con 0.1% de BSA e incubar 60 minutos a temperatura ambiente.
6. Lavar la placa 3X con PBS-T usando el lavador de placas BioTek.
7. En los pozos de prueba: agregar 100 jl/pozo de anticuerpos anti-endoglina a 20, 10, 4, 2, 1, 0.5 y 0.2 ng/ml (diluido en PBS-T con 0.1% de BSA) e incubar 60 minutos a temperatura ambiente. En pozos de control negativo: agregar 100 jl/pozo de anticuerpo de control de isotipo compatible.
8. Lavar la placa 3X con PBS-T usando el lavador de placas BioTek.
9. Agregar 100 jl/pozo de cabra anti-IgG humana conjugada a HRP (Jackson Immunoresearch), diluida 1:10000 en PBS-T con 0.1% de BSA a todos los pozos; incubar 30-60 minutos a temperatura ambiente.
10. Lavar la placa 5X con PBS-T usando el lavador de placas BioTek.
I I . Agregar 100 jl/pozo de solución de sustrato TMB e incubar sin cubrir en la oscuridad durante 15 minutos.
12. Detener la reacción mediante la adición de 100 jl/pozo de solución de parada TMB.
Las muestras se procesan por triplicado y se lee la densidad óptica para construir una curva estándar y determinar la constante de unión. El análisis estadístico se realiza utilizando la prueba t de Student u otra prueba estándar.
ELISA de competición
Los anticuerpos se ensayaron en un ELISA de competición para la unión a CD 105 contra anti-CD 105 quimérico biotinilado. En resumen, se biotiniló anti-CD 105 quimérico usando un kit de microbiotinilación (Sigma, No de catálogo BTAG-1KT) según las instrucciones del fabricante. Las placas de microtitulación de fondo plano Nunc Immuno MaxiSorp de 96 pozos se revistieron con CD105 antihumano de ratón (Southern Biotechnologies, Catálogo No. 9811­ 01) a 1.5 ug/ml en solución salina regulada con fosfato (PBS) durante la noche a 4°C. Al día siguiente, se añadieron 100 ng/ml de CD105 humano (R&D Systems, catálogo No. 1097-EN) en PBS/BSA al 2% a la placa prerrecubierta y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se mezclaron concentraciones variables de anticuerpos anti-CD 105 quiméricos, humanizados o humanizados/desinmunizados (4 ug/ml a 0.0018 ug/ml en diluciones triples) con una concentración fija de anticuerpo anti-CD 105 quimérico biotinilado (6.25 ng/ml) y se agrega a la placa. La unión del anticuerpo quimérico biotinilado se detectó a través de estreptavidina-HRP (Sigma, catálogo No. S5512) y sustrato TMB (Sigma, catálogo No. T0440). Los valores de OD450 nm se midieron en un lector de placa Dynex MRXTCII. Los resultados del análisis de la competencia se ilustran en las Figuras 7 y 8. Las curvas se ajustaron a través de la porción de línea recta de cada gráfica de absorbancia contra la concentración de la muestra logarítmica y las ecuaciones de las líneas se usaron para calcular las concentraciones de humanizado o humanizado/anticuerpo desinmunizado requerido para inhibir la unión del anticuerpo quimérico biotinilado a CD105 en un 50% (IC50). Para permitir comparaciones dentro de y entre experimentos, los valores de IC50 de las variantes humanizadas o humanizadas/desinmunizadas se normalizaron contra el anticuerpo de referencia que se incluyó en cada placa para dar un valor para la diferencia de multiplicidad. Los valores de IC50 son relativos al anti-CD105 quimérico y son representativos de tres experimentos. Los datos resumidos de ELISA se presentan en la Tabla 1 e incluyen niveles de expresión de anticuerpos (jg/m l) tal como se ensayaron en cultivos estáticos saturados.
Tabla 1. Características de las variantes de anticuerpos humanizados y humanizados/desinmunizados. Los valores de IC50 son relativos al anticuerpo quimérico anti-endoglina y son representativos de tres experimentos. Los niveles de expresión de anticuerpos (jg/m l) se analizaron en cultivos estáticos saturados. El nivel de desinmunización está representado por una escala arbitraria basada en la ubicación en los epítopos de las mutaciones.
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Ejemplo 2
Análisis BIAcore (resonancia plasmática superficial: SPR) de la unión de anticuerpos anti-endoglina humanizados y humanizados/desinmunizados
La afinidad de los anticuerpos se puede evaluar usando, por ejemplo, análisis BIAcore usando protocolos estándar. En resumen, la proteína A se acopla químicamente a un chip BIAcore CM5, con la cantidad de proteína A inmovilizada correspondiente a -2000 RU. Los pasos posteriores se realizan en un regulador de funcionamiento de HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, TWe En al 0.05%, pH = 7,4, a 25 grados Celsius usando una velocidad de recopilación de datos de 10 Hz. La proteína inmovilizada A en el chip BIAcore captura el anticuerpo anti-endoglina (10 nM) a una velocidad de flujo de 10 uL/min: típicamente, los tiempos de captura de 20, 40 y 80 segundos permiten la captura de densidades de anticuerpos correspondientes a 130 RU, 330RU y 570 RU, respectivamente. Los ciclos de arranque se realizan utilizando un regulador en funcionamiento a una velocidad de flujo de 40 uL/min, un tiempo de contacto de 90 segundos y un tiempo de disociación de 90 segundos. Los ciclos de muestra se realizan usando endoglina recombinante a concentraciones que varían de 0 a 40 nM. La endoglina se pasa sobre el chip BIAcore que contiene el anticuerpo capturado a una velocidad de flujo de 40 uL/min con un tiempo de contacto de 525 segundos y un tiempo de disociación de 2500 segundos. Típicamente, se realizan ocho ciclos de muestra en cada densidad de captura de anticuerpos. La regeneración del chip se lleva a cabo usando glicina 10 mM pH = 1.7. El análisis de datos se realiza utilizando el software de evaluación BIAcore T100 v1.1. Las señales generadas usando chips BIAcore con diferentes densidades de anticuerpos capturados se comparan y los datos generados en ausencia de endoglina recombinante se utilizan para ajustar la señal en blanco del ensayo. Para ajustar los datos, se permite que el Rmax flote para tener en cuenta la variación en los niveles de captura de cada anticuerpo en cada ciclo. Los datos de cada densidad de captura se ajustan simultáneamente durante el análisis de cada anticuerpo. Los datos de BIAcore se presentan en la Tabla 2 para anticuerpos anti-endoglina quiméricos, humanizados y humanizados/desinmunizados, incluidos ka (1/Ms), kd (1/s), Kd (M) y Chi2 (RU2).
Tabla 2. Datos de unión de BIAcore para el anticuerpo anti-endoglina quimérico, el anticuerpo anti-endoglina humanizado VK1VH1 y los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados VK1AAVH1R, VK1AAVH1Q y VK1AAVKVH1A2.
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Ejemplo 3
Avidez de anticuerpos y número de epítopos disponibles en células que expresan endoglina.
La avidez de anticuerpos y el número de epítopos disponibles en las células que expresan endoglina se pueden evaluar utilizando análisis de gráfica Scatchard usando protocolos estándar.
En resumen, se llevan a cabo análisis de gráficos de Scatchard de la unión directa de anticuerpos anti-endoglina humanizados radiomarcados a células de leucemia KM-3 que expresan endoglina y HUVEC proliferantes subconfluentes. Los anticuerpos anti-endoglina purificados se radiomarcan individualmente con 125I usando Iodo-Gen y de acuerdo con métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Los anticuerpos anti-endoglina humanizados radiomarcados se analizan para determinar el número medio de átomos de yodo por molécula de IgG. Los experimentos de titulación se llevan a cabo utilizando una cantidad fija (0.1 |jg) de cada mAb marcado con 125I e incrementos en serie de 2 veces de células HUVEC que expresan endoglina para determinar la actividad de unión al antígeno. El análisis de gráfica de Scatchard de los datos de unión se lleva a cabo según métodos conocidos. Mediante este análisis, se estima una constante de equilibrio y un número máximo promedio de mAb unido/célula.
Ejemplo 4
Ensayo de inmunoprecipitación Western para la actividad de anticuerpos anti-endoglina
La capacidad de los anticuerpos anti-endoglina humanizados para modificar la señalización intracelular en las células endoteliales en proliferación que expresan CD 105 puede analizarse mediante transferencias Western para detectar la fosforilación de las proteínas implicadas en la ruta de señalización de CD105.
Se realizan análisis de inmunotransferencia Western para identificar Smad1/5/8 o Smad2/3 fosforilados de acuerdo con técnicas de inmunotransferencia Western conocidas en células endoteliales no transfectadas. Los anticuerpos primarios contra Smadl fosforilado, Smad2, Smad5, Id1 (Santa Cruz) y endoglina son utilizados para detectar moléculas en muestras. La detección se realiza por quimioluminiscencia mejorada (ECL).
Ejemplo 5
Inhibición del crecimiento de HUVEC y ensayo de incorporación de 3H-timidina
Hay varios ensayos disponibles para evaluar la inhibición del crecimiento celular.
En un ejemplo, la línea celular HUVEC E6/E7 P3-17 se cultivó en medio EBM2 con suplementos (Lonza-Clonetics) que contenían suero de ternera fetal al 5%. Las células se cultivaron en matraces de 75 cm2 (Falcon, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) en una incubadora de CO2 a 37°C en condiciones subconfluentes. Las células se separan incubando con solución salina equilibrada de Hanks con EDTA 15 mM en regulador HEPES 25 mM, pH = 7.3, a 37°C durante 15 min. Después de lavar dos veces con PBS helado, las células se resuspenden en medio de crecimiento de células endoteliales a una concentración de 25.000 células/ml. En experimentos adicionales, las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se suspenden y se cultivan en un medio de crecimiento de células endoteliales libre de FBS y extractos de cerebro bovino. Se siembra una alícuota de 200 j l de suspensión celular que contiene 2.500 células en cada pozo de placas de cultivo de 96 pozos. Las células se cultivan a 37°C en una incubadora de CO2 durante la noche antes de 100 pg/ml de anticuerpo anti-endoglina humanizado VK1AAVH1A2 o se añaden IgG o PBS de control por triplicado. Las placas de cultivo se mantienen en la incubadora durante 72 horas, durante las cuales los medios frescos y el anticuerpo anti-endoglina humanizado, la IgG de control o PBS se reemplazan cada 24 horas. Se agrega 3H-timidina (1 jC i) a cada pozo y las placas se incuban durante 20 h. Las células se lavan con PBS seguido de tratamiento con 100 jl/pozo de tripsina-EDTA (0.05% de tripsina, 0.53 mM de EDTA) a 37°C durante 15 min. Las células se cosechan en filtros de fibra de vidrio (Wallac Printed FiltermatA) utilizando Harvester 96 (TOMTEC, Hamden, CT) y se determina la radioactividad 3H en un contador de centelleo y luminiscencia líquido Trilux 1540 MicroBeta (Wallac, Turku, Finlandia). En un segundo ejemplo, las células utilizadas fueron un cultivo primario de células HUVEC, HUVEC 2517C, el anticuerpo humanizado TRC105 inhibió el crecimiento de la línea celular HUVEC E6/E7 y el cultivo primario HUVEC, HUVEC 2517C derivado de un solo donante, en comparación con el anticuerpo control y PBS (Tabla 3).
Células E6/E7
Tabla 3. Inhibición del crecimiento de células endoteliales humanas por el anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado VK1AAVH1A2.
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Ejemplo 6
Ensayo para la inhibición de la migración celular por anticuerpos anti-endoglina
La migración (quimioquinesis) como medida de la proliferación celular y la activación se mide usando una cámara Boyden.
En resumen, la migración celular se evalúa como sigue: un filtro de nucleoporos Costar (poro de 8 mm) se reviste con fibronectina durante la noche a 4°C. La cámara se lava con solución salina regulada con fosfato (PBS) y la cámara inferior se llena con DMEM con o sin suero y con o sin TGF-p3. Las células se tripsinizan y se suspenden a una concentración final de 50.000 células/ml en DMEM con anticuerpo anti-endoglina. Se agrega una alícuota de 150 pl de la suspensión celular a la cámara superior y se incuba a 37°C. Después de 16 horas, las células se lavan y la superficie superior se limpia para eliminar las células que no migran. Las membranas se fijan en metanol, se lavan con agua, se tiñen y se cuenta el número de células presentes en la superficie inferior.
Ejemplo 7
Ensayo de ADCC para anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados
Los anticuerpos anti-endoglina descritos en el presente documento pueden evaluarse con respecto a su capacidad para unirse a células asesinas naturales (NK) activadas por IL-2 e inducir citotoxicidad mediada por células (ADCC) dependiente de anticuerpos de HUVEC usando, por ejemplo, los siguientes protocolos.
Aislamiento de NK y generación de células NK activadas por IL-2
Las PBMC se aíslan y se dejan reposar durante 24 horas a 4°C en RPMI con FBS al 10%. Las PBMC se colocan luego en RPMI con FBS al 2% (volumen total = 50 ml), y 10 ml de la suspensión celular se colocan en una placa de Petri. Las PBMC se incuban durante 2 horas a 37°C y se recogen las células no adherentes. Las células NK se cultivan a 8 x 106/ml con 1000 U/ml de IL-2 durante 48 horas, seguido de un cultivo normal durante 5-8 días antes de su uso en un ensayo de ADCC.
Citotoxicidad y ensayos de ADCC
Las células NK se raspan del cultivo y se recogen en un tubo cónico de 50 ml. Las células se lavan una vez con medio RPMI completo y se centrifugan a 1200 rpm durante 10 minutos. Las células NK se resuspenden luego en 5 ml de medio RPMI completo y se cuentan. Antes de realizar el ensayo, el recuento de células NK se normaliza a una relación efector: objetivo de 10:1. Las células NK normalizadas se colocan en placas y se añaden 10 pL de anticuerpo antiendoglina en los pozos designados y se incuban durante 30 minutos a 37°C. Las muestras de control incluyen poblaciones de células no tratadas o tratadas con anticuerpos de control. Todas las muestras y controles se prueban por quintuplicado.
Se recogen células diana de interés (células HUVEC), se lavan, se centrifugan a 1200 rpm durante 10 minutos y se resuspenden en 5 ml de medio RPMI completo. Las células objetivo se lavan nuevamente y se resuspenden en RPMI sin suero a una concentración final de 1 x 106 células/ml. Luego, las células objetivo se marcan con una concentración final de 5 pg/ml de Calceína AM durante 1 hora a 37°C, seguido de dos lavados con medio RPMI completo. Las células objetivo se resuspenden y se agregan a los pozos de las células NK. La combinación célula diana/célula NK se incuba a 37°C durante 4 horas. Después de la incubación, las placas se hacen girar a 1200 rpm durante 5 minutos y las células se lavan y se resuspenden en DPBS. La fluorescencia se lee usando Excitación/Emisión de 450/530 nm y la emisión es una medida de la muerte celular mediada por los anticuerpos. La intensidad de fluorescencia media y la desviación estándar se calculan y se utilizan para calcular el % de ADCC de acuerdo con la siguiente fórmula:
% ADCC = 100% * [(fmuestra-fmedio) — (fcontrol isotipo-fTriton)],
dónde:
fmuestra = fluorescencia media en pozos que contienen anticuerpo anti-endoglina
fmedio = fluorescencia media en pozos que contienen medios sin anticuerpo
fcontroi isotipo = fluorescencia media en pozos que contienen IgG de control de isotipo
frriton = fluorescencia media en pozos que contienen detergente Triton (para inducir lisis en células diana)
El anticuerpo VK1AAVH1A2 humanizado/desinmunizado demostró una ADCC dependiente de la dosis de HUVEC que fue significativamente mayor que el anticuerpo de control de isotipo (Tabla 4A y 4B). Obsérvese que los experimentos resumidos en la Tabla 4A y 4B se realizaron con células NK de donantes separados.
Tabla 4A. ADCC del anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado VK1AAVH1A2 versus IgG de control de isotipo compatible en células HUVEC.
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Tabla 4B. ADCC del anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado VK1AAVH1A2 frente a la IgG de control de isotipo compatible en células HUVEC
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Ejemplo 8
Efecto de los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados en un modelo murino de neovascularización coroidea
El efecto de los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados se puede evaluar en un modelo murino de neovascularización coroidea.
En resumen, se anestesian ratones C57BL/6 de 4 a 5 semanas de edad con clorhidrato de ketamina (100 mg/kg) y se dilatan las pupilas con tropicamida al 1% (Alcon Laboratories, Inc. Fort Worth, TX). Se administran tres quemaduras de una fotocoagulación con láser de diodo de 532 nm (tamaño de punto de 75 pm, duración de 01 segundo, 120 mW) a cada retina utilizando el sistema de suministro de lámpara de hendidura de un fotocoagulador (OcuLight; Iridex, Mountain View, CA) y un cubreobjetos de mano como lente de contacto. Las quemaduras se realizan en las posiciones 9, 12 y 3 en punto del polo posterior de la retina. La producción de una burbuja en el momento del láser, que indica la ruptura de la membrana de Bruch, es un factor importante para obtener la neovascularización conoidea (NVC); así, solo las quemaduras en las que se produce una burbuja se incluyen en el estudio.
Se realizan cuatro experimentos independientes para investigar el efecto de las inyecciones intraoculares en el día 0 después de la ruptura de la membrana de Bruch. Los ratones en el Grupo 1 reciben una inyección intraocular de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 5 |jg de un anticuerpo anti-endoglina o un fragmento de unión a antígeno en 1 jL de PBS en un ojo y 1 jL de PBS en el otro ojo. Los ratones del grupo 2 reciben una inyección intraocular de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 10 jg de anticuerpo anti-endoglina o fragmento de unión a antígeno en 1 j l de PBS en un ojo y 1 j l de PBS en el ojo asociado. Los ratones del grupo 3 reciben una inyección intraocular de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 jg de anticuerpo anti-endoglina o fragmento de unión a antígeno en un ojo y 1 jL de PBS en el ojo asociado. El grupo 4 recibe PBS en ambos ojos.
Después de 14 días, los ratones se anestesian y se perfunden con dextrano marcado con fluoresceína (2 x 106 peso molecular promedio, Sigma-Aldrich) y se preparan montajes planos coroidales. En resumen, se extraen los ojos, se fijan durante 1 hora en formol regulado con fosfato al 10%, y se extraen la córnea y el cristalino. La retina completa se diseca cuidadosamente de la copa ocular, se realizan cortes radiales desde el borde de la ocular hasta el ecuador en los cuatro cuadrantes, y la retina se monta de forma plana en medio de montaje acuoso (Aquamount; BDH, Poole, Reino Unido). Las monturas planas se examinan mediante microscopía de fluorescencia (Axioskop; Carl Zeiss Meditec, Thornwood, NY), y las imágenes se digitalizan con una cámara de video en color de tres dispositivos acoplados a carga (CCD) (1K-TU40A, Toshiba, Tokio, Japón). El software de análisis de imágenes Frame Grabberse utiliza para medir el área de cada lesión de CNV. Las comparaciones estadísticas se realizan utilizando ANOVA con la corrección de Dunnett para comparaciones múltiples.
Ejemplo 9
Terapia antiangiogénica de tumores preformados de cáncer de mama humano en piel humana injertados en ratones SCID
El efecto de los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados descritos en el presente documento puede evaluarse con respecto a su efecto antiangiogénico sobre tumores de cáncer de mama humano preformados crecidos en piel humana injertada en ratones SCID.
En resumen, las células MCF-7 (8x106 células en 0.1 ml de PBS) se trasplantan intradérmicamente en piel humana de grosor completo injertada en ratones SCID cuando los injertos no mostraron signos de inflamación, contracción o rechazo. Los ratones no se tratan hasta que aparecen tumores palpables distintos (de 3 a 6 mm de diámetro en la mayoría de los casos). Los ratones con tumores distintos se dividen en grupos para los estudios terapéuticos. El anticuerpo monoclonal anti-endoglina (mAb) humanizado/desinmunizado y una IgG de control con isotipo se diluyen con PBS estéril que contiene albúmina de suero de ratón (concentración final al 0.05%). Para la terapia con anticuerpos, se administra por vía intravenosa (i.v.) a través de la vena de la cola de ratones, 1 a 20 mg/kg de anticuerpo anti-endoglina o IgG de control. La administración se proporciona cada dos o tres días.
Durante el tratamiento, los ratones se controlan diariamente para determinar el tamaño del tumor y la morbilidad. Los ratones se pesan dos veces por semana usando una balanza electrónica (OHAUS™ Modelo GT210). El tamaño del tumor se mide tres veces por semana usando un calibrador electrónico (calibrador PRO-MAX de 6 pulgadas; Fowler Co., Newton, Mass.) conectado a una ordenador usando el software OptoDemo™ (Fowler Co.). Los diámetros medidos del tumor se convierten en volúmenes tumorales usando la siguiente fórmula: V = longitud x ancho x altura x pi/6. El análisis estadístico de los datos para la comparación de diferentes grupos de ratones se lleva a cabo utilizando la prueba t de Student.
Ejemplo 10
Modelo de ratón de cáncer de ovario
Para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados, o sus fragmentos de unión a antígeno, para tratar el cáncer de ovario, se puede usar una línea celular de cáncer de ovario en SCID o ratones desnudos.
En resumen, las células de cáncer de ovario se implantan en SCID o ratones desnudos para generar tumores de ovario. Los grupos de ratones con tumores establecidos son tratados por administración i.v. de dosis crecientes (a partir de 1.8 mg/kg de peso corporal) de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado o IgG de control. El tratamiento se realiza 2 o 3 veces por semana. Se puede usar un inhibidor de VEGF y/u otro agente anticancerígeno en algunos o en todos los grupos. Se monitorizan los ratones y se mide el crecimiento tumoral 2 o 3 veces por semana.
Ejemplo 11
Modelo de ratón de cáncer colorrectal
Para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados, o sus fragmentos de unión a antígeno, para tratar el cáncer colorrectal, se puede usar una línea celular de cáncer colorrectal en ratones SCID, desnudos o inmunocompetentes.
En resumen, las células de cáncer colorrectal se implantan en SCID, ratones desnudos o inmunocompetentes para generar tumores colorrectales. Los grupos de ratones con tumores establecidos son tratados por administración i.v. de dosis crecientes (a partir de 1.8 mg/kg de peso corporal) de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado o IgG de control. El tratamiento se realiza 2 o 3 veces por semana. Se puede usar un inhibidor de VEGF y/u otro agente anticancerígeno en algunos o en todos los grupos. Se monitorizan los ratones y se mide el crecimiento tumoral 2 o 3 veces por semana. Se pueden obtener imágenes de los tumores mediante una prueba de imagen estándar, que incluye PET y ultrasonido. Los tumores tratados se pueden explantar para evaluar las vías de señalización intracelular o la vascularización mediante inmunohistoquímica.
Ejemplo 12
Modelo de ratón de cáncer de riñón
Para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados o sus fragmentos de unión a antígeno para tratar el cáncer de riñón, se usa una línea celular de cáncer de riñón en SCID o ratones desnudos.
En resumen, las células de cáncer de riñón se implantan en SCID o ratones desnudos para generar tumores de riñón. Los grupos de ratones con tumores establecidos son tratados por administración i.v. de dosis crecientes (a partir de 1.8 |jg/g de peso corporal) de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado o IgG de control. El tratamiento se realiza a intervalos de 3 días para las primeras tres inyecciones y en un intervalo de 7 días para la cuarta inyección. Se puede usar un inhibidor de VEGF y/u otro agente anticancerígeno en algunos o en todos los grupos. Los ratones se controlan y el crecimiento tumoral se mide a través del sacrificio de animales semanalmente.
Ejemplo 13
Modelo de ratón de mieloma
Para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados o sus fragmentos de unión a antígeno para tratar el mieloma, se usa una línea celular de mieloma en ratones SCID o desnudos.
En resumen, las células de cáncer de mieloma se implantan en SCID o ratones desnudos para generar tumores de mieloma. Los grupos de ratones con tumores establecidos son tratados por administración i.v. de dosis crecientes (a partir de 1.8 mg/kg de peso corporal) de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado o IgG de control. El tratamiento se realiza 2 o 3 veces por semana. Se puede usar un inhibidor de VEGF y/u otro agente anticancerígeno en algunos o en todos los grupos. Se monitorizan los ratones y se mide el crecimiento tumoral 2 o 3 veces por semana.
Ejemplo 14
Modelo de ratón de sarcoma
Para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados o sus fragmentos de unión al antígeno para tratar el sarcoma, se usa una línea celular de sarcoma en SCID o ratones desnudos.
En resumen, las células de cáncer de sarcoma se implantan en SCID o ratones desnudos para generar tumores de sarcoma. Los grupos de ratones con tumores establecidos son tratados por administración i.v. de dosis crecientes (a partir de 1.8 mg/kg de peso corporal) de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado o IgG de control. El tratamiento se realiza 2 o 3 veces por semana. Se puede usar un inhibidor de VEGF y/u otro agente anticancerígeno en algunos o en todos los grupos. Se monitorizan los ratones y se mide el crecimiento tumoral 2 o 3 veces por semana.
Ejemplo 15
Modelo de ratón de cáncer de mama
Para determinar la capacidad de un anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado para tratar el cáncer de mama, se usa una línea celular de cáncer de mama en SCID o ratones desnudos.
En resumen, las células de cáncer de mama se implantan en SCID o ratones desnudos para generar tumores de mama. Los grupos de ratones con tumores establecidos son tratados por administración i.v. de dosis crecientes (a partir de 1.8 mg/kg de peso corporal) de un anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado. Los animales de control reciben una IgG de control. El tratamiento se realiza 2 o 3 veces por semana. Se puede usar un inhibidor de VEGF y/u otro agente anticancerígeno en algunos o en todos los grupos. Se monitorizan los ratones y se mide el crecimiento tumoral de 2 a 3 veces por semana.
Ejemplo 16
Ensayo clínico de terapia combinada para el cáncer colorrectal
Este ejemplo describe un estudio aleatorizado, ciego, controlado con placebo, multicéntrico, de fase 2 diseñado para proporcionar una evaluación preliminar de la seguridad y la eficacia de un anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado en pacientes con cáncer colorrectal. Aproximadamente 100-aproximadamente 800 pacientes son reclutados, con aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo de tratamiento y aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo placebo. El ensayo consistirá en la administración de dosis repetidas intravenosas de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado a aproximadamente 0.1-aproximadamente 20 mg/kg o placebo cada una, dos o tres semanas durante 6-10 ciclos. Se puede usar un inhibidor de VEGF y/u otro agente anticancerígeno en todos los grupos. El período de tiempo del estudio se estima en aproximadamente 6 meses a aproximadamente 5 años, con una terapia continua para los respondedores como se indica al final del estudio inicial. Las medidas de resultado adicionales son las siguientes:
Medida de resultado primaria: tasa de respuesta global. Un objetivo del estudio es demostrar un aumento de la supervivencia libre de progresión en un 35% con el anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado.
Las medidas de resultado secundarias que pueden evaluarse incluyen la tasa de respuesta global, la duración de la respuesta, la supervivencia general, los eventos adversos graves y no graves. Por ejemplo, un tratamiento puede prevenir la progresión de la enfermedad (es decir, estasis) o puede resultar en una mejora. Alternativamente, o además, se pueden medir otros objetivos con respecto a uno o más de los siguientes: disminución de la carga tumoral, disminución de la vascularización, reducción de los efectos secundarios, disminución de las reacciones adversas y/o aumento del cumplimiento del paciente.
Ejemplo 17
Ensayo clínico de terapia combinada para mieloma
Este ejemplo describe un estudio aleatorizado, ciego, controlado con placebo, multicéntrico, de fase 2 diseñado para proporcionar una evaluación preliminar de la seguridad y la eficacia de la combinación de anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados con bortezomib en pacientes con mieloma. Aproximadamente 100-aproximadamente 800 pacientes son reclutados, con aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo de tratamiento y aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo placebo. El ensayo consistirá en la administración de dosis repetidas intravenosas de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado a aproximadamente 1-aproximadamente 20 mg/kg o placebo cada una, dos o tres semanas combinadas con bortezomib a aproximadamente 1.3 mg/kg semanalmente. El período de tiempo del estudio se estima en aproximadamente 6 meses a aproximadamente 5 años, con una terapia continua para los respondedores como se indica al final del estudio inicial. Las medidas de resultado adicionales son las siguientes:
Medida de resultado primaria: tasa de respuesta global. Uno de los objetivos del estudio es demostrar un aumento de la tasa de respuesta global de aproximadamente 40% con bortezomib más placebo a aproximadamente 60% (o más) con bortezomib más anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado.
Las medidas de resultado secundarias que pueden evaluarse incluyen la duración de la respuesta, supervivencia libre de progresión, supervivencia general, eventos adversos graves y no graves. Por ejemplo, un tratamiento puede prevenir la progresión de la enfermedad (es decir, estasis) o puede resultar en una mejora. Alternativamente, o además, se pueden medir otros objetivos con respecto a uno o más de los siguientes: disminución de la carga tumoral, disminución de la vascularización, reducción de los efectos secundarios, disminución de las reacciones adversas y/o aumento del cumplimiento del paciente.
Ejemplo 18
Ensayo clínico de terapia combinada para el cáncer de riñón
Este ejemplo describe un estudio aleatorizado, ciego, controlado con placebo, multicéntrico, de fase 2 diseñado para proporcionar una evaluación preliminar de la seguridad y la eficacia de combinar anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados con sunitinib (Sutent®) en pacientes con cáncer de células renales (cáncer de riñón). Aproximadamente 100-aproximadamente 800 pacientes son reclutados, con aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo de tratamiento y aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo placebo. El ensayo consistirá en la administración de dosis repetidas intravenosas de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado a aproximadamente 0.1-aproximadamente 20 mg/kg o placebo cada una, dos o tres semanas combinadas con sunitinib a aproximadamente 5-aproximadamente 50 mg administrados diariamente durante 4 semanas, con 2 semanas de descanso antes de repetir el ciclo de dosificación de 4 semanas. El período de tiempo del estudio se estima en aproximadamente 6 meses, aproximadamente 5 años, con una terapia continua para los respondedores como se indica al final del estudio inicial. Las medidas de resultado adicionales son las siguientes:
Medida de resultado primaria: supervivencia libre de progresión. Un objetivo del estudio es demostrar un aumento en la supervivencia libre de progresión de aproximadamente 9-13 meses en el variante de sunitinib más placebo a aproximadamente 14-18 meses (o más) en el variante de sunitinib más anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado.
Las medidas de resultado secundarias que pueden evaluarse incluyen la tasa de respuesta, la duración de la respuesta, el tiempo hasta la progresión del tumor, la supervivencia general, los eventos adversos graves y no graves. Por ejemplo, un tratamiento puede prevenir la progresión de la enfermedad (es decir, estasis) o puede resultar en una mejora. Alternativamente, o además, se pueden medir otros objetivos con respecto a uno o más de los siguientes: disminución de la carga tumoral, disminución de la vascularización, reducción de los efectos secundarios, disminución de las reacciones adversas y/o aumento del cumplimiento del paciente.
Ejemplo 19
Ensayo clínico de terapia combinada para el cáncer hepatocelular
Este ejemplo describe un estudio aleatorizado, ciego, controlado con placebo, multicéntrico, de fase 2 diseñado para proporcionar una evaluación preliminar de la seguridad y la eficacia de combinar anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados con sorafenib (NEXAVAR®) en pacientes con cáncer hepatocelular (cáncer de hígado) aproximadamente 100-aproximadamente 800 pacientes son reclutados, con aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo de tratamiento y aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo placebo. El ensayo consistirá en la administración de dosis repetidas intravenosas de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado a aproximadamente 0.1-aproximadamente 20 mg/kg o placebo cada una, dos o tres semanas combinadas con sorafenib a aproximadamente 400 mg al día durante 3-6 ciclos o hasta la progresión El período de tiempo del estudio se estima en aproximadamente 6 meses a aproximadamente 5 años, con una terapia continua para los respondedores como se indica al final del estudio inicial. Las medidas de resultado adicionales son las siguientes:
Medidas de resultado primarias: supervivencia libre de progresión. Un objetivo del estudio es demostrar un aumento en la supervivencia libre de progresión de aproximadamente 3-9 meses en el variante de sorafenib más placebo a aproximadamente 6-12 meses (o más) en el variante de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado sorafenib más.
Las medidas de resultado secundarias que pueden evaluarse incluyen la duración de la respuesta, el tiempo hasta la progresión del tumor, la supervivencia general, los eventos adversos graves y no graves. Por ejemplo, un tratamiento puede prevenir la progresión de la enfermedad (es decir, estasis) o puede resultar en una mejora. Alternativamente, o además, se pueden medir otros objetivos con respecto a uno o más de los siguientes: disminución de la carga tumoral, disminución de la vascularización, reducción de los efectos secundarios, disminución de las reacciones adversas y/o aumento del cumplimiento del paciente.
Ejemplo 20
Ensayo clínico de terapia combinada para el cáncer de riñón
Este ejemplo describe un estudio aleatorizado, ciego, controlado con placebo, multicéntrico, de fase 2 diseñado para proporcionar una evaluación preliminar de la seguridad y la eficacia de la combinación de anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados con bevacizumab (AVASTIN®) en pacientes con cáncer de células renales (cáncer de riñón). Aproximadamente 100-aproximadamente 800 pacientes son reclutados, con aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo de tratamiento y aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo placebo. El ensayo consistirá en la administración de dosis repetidas intravenosas de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado a aproximadamente 0.1-aproximadamente 20 mg/kg o placebo cada una, dos o tres semanas combinadas con bevacizumab a aproximadamente 7.5, aproximadamente 10, o aproximadamente 15 mg/kg administrado por vía intravenosa cada dos semanas. El período de tiempo del estudio se estima en aproximadamente 6 meses a aproximadamente 5 años, con un tratamiento continuo para los respondedores positivos como se indica al final del estudio inicial. Las medidas de resultado adicionales son las siguientes:
Medida de resultado primaria: supervivencia libre de progresión. Uno de los objetivos del estudio es demostrar un aumento en la supervivencia libre de progresión de aproximadamente 8-12 meses en el variante de bevacizumab más placebo a aproximadamente 13-18 meses (o más) en el variante de bevacizumab más anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado.
Las medidas de resultado secundarias que pueden evaluarse incluyen la tasa de respuesta global, la duración de la respuesta, el tiempo hasta la progresión del tumor, la supervivencia general, los eventos adversos graves y no graves. Por ejemplo, un tratamiento puede prevenir la progresión de la enfermedad (es decir, estasis) o puede resultar en una mejora. Alternativamente, o además, se pueden medir otros objetivos con respecto a uno o más de los siguientes: disminución de la carga tumoral, disminución de la vascularización, reducción de los efectos secundarios, disminución de las reacciones adversas y/o aumento del cumplimiento del paciente.
Ejemplo 21
Ensayo clínico de terapia combinada para el cáncer de ovario
Este ejemplo describe un estudio aleatorizado, ciego, controlado con placebo, multicéntrico, de fase 2 diseñado para proporcionar una evaluación preliminar de la seguridad y la eficacia de combinar el anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado con Doxil® en pacientes con cáncer de ovario. Aproximadamente 100-aproximadamente 800 pacientes son reclutados, con aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo de tratamiento y aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo placebo. El ensayo consistirá en la administración de dosis repetidas intravenosas de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado a aproximadamente 0.1-aproximadamente 20 mg/kg o placebo cada una, dos o cuatro semanas en combinación con Doxil a aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/m2 administrado una vez cada 4 semanas. El período de tiempo del estudio se estima en 6 meses a aproximadamente 5 años, con terapia continua para los respondedores como se indica al final del estudio inicial. Las medidas de resultado adicionales son las siguientes:
Medida de resultado primaria: supervivencia libre de progresión. Un objetivo del estudio es demostrar un aumento en la supervivencia libre de progresión de aproximadamente 3-6 meses en el variante de Doxil® plus placebo a aproximadamente 4-12 meses (o más) en el variante de anticuerpo anti-endoglin humanizado/desinmunizado Doxil® plus.
Las medidas de resultado secundarias que pueden evaluarse incluyen la duración de la respuesta, el tiempo hasta la progresión del tumor, la supervivencia general, los eventos adversos graves y no graves. Por ejemplo, un tratamiento puede prevenir la progresión de la enfermedad (es decir, estasis) o puede resultar en una mejora. Alternativamente, o además, se pueden medir otros objetivos con respecto a uno o más de los siguientes: disminución de la carga tumoral, disminución de la vascularización, reducción de los efectos secundarios, disminución de las reacciones adversas y/o aumento del cumplimiento del paciente.
Ejemplo 22
Ensayo clínico de terapia combinada basada en platino para el cáncer de ovario
Este ejemplo describe un estudio aleatorizado, ciego, controlado con placebo, multicéntrico, de fase 2 diseñado para proporcionar una evaluación preliminar de la seguridad y la eficacia de combinar anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados con quimioterapia basada en platino en pacientes con cáncer de ovario. Aproximadamente 100-aproximadamente 800 pacientes son reclutados, con aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo de tratamiento y aproximadamente 50-aproximadamente 400 pacientes asignados a un grupo placebo. El ensayo consistirá en la administración de dosis repetidas intravenosas de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado a aproximadamente 0.1-aproximadamente 20 mg/kg o placebo cada una, dos o tres semanas combinadas con un régimen de quimioterapia basada en platino (por ejemplo, carboplatino y paclitaxel) por infusión intravenosa con cursos que se repiten a lo largo del estudio. El período de tiempo del estudio se estima en aproximadamente 6 meses, aproximadamente 5 años, con una terapia continua para los respondedores como se indica al final del estudio inicial. Las medidas de resultado adicionales son las siguientes:
Medida de resultado primaria: supervivencia libre de progresión. Un objetivo del estudio es demostrar un aumento en la supervivencia libre de progresión de aproximadamente 12-18 meses en el variante de topotecan más placebo a aproximadamente 12-24 meses (o más) en quimioterapia basada en platino más variante de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado.
Las medidas de resultado secundarias que pueden evaluarse incluyen la duración de la respuesta, el tiempo hasta la progresión del tumor, la supervivencia general, los eventos adversos graves y no graves. Por ejemplo, un tratamiento puede prevenir la progresión de la enfermedad (es decir, estasis) o puede resultar en una mejora. Alternativamente, o además, se pueden medir otros objetivos con respecto a uno o más de los siguientes: disminución de la carga tumoral, disminución de la vascularización, reducción de los efectos secundarios, disminución de las reacciones adversas y/o aumento del cumplimiento del paciente.
Ejemplo 23
Uso de anticuerpos anti-endoglina para el tratamiento de la retinopatía diabética.
Diseño del estudio
Para evaluar la actividad biológica de múltiples inyecciones intravítreas de anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados en pacientes con edema macular diabético clínicamente significativo (EMD) y para informar cualquier evento adverso asociado, se inicia un estudio piloto de centro único, abierto, con aumento de la dosis. Los pacientes con EMD que involucran el centro de la mácula y la agudeza visual mejor corregida (BCVA) en el ojo del estudio entre 20/40 y 20/400 son reclutados.
Tratamiento de estudio
Los pacientes elegibles se asignan aleatoriamente en una proporción 1:1 para recibir tres inyecciones intravítreas de anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados (aproximadamente 0.25 a 2.5 mg por cada inyección) administrados mensualmente y las observaciones continúan hasta el mes 24. Puntos finales primarios son la frecuencia y la gravedad de los eventos adversos oculares y sistémicos. Los puntos finales secundarios son 1) la mejor evaluación visual corregida según lo evaluado con el cuadro de Estudio de Retinopatía Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS), con el uso de un protocolo estandarizado de refracción y prueba a una distancia de prueba inicial de 2 m y 2) medición del espesor de la retina portomografía de coherencia óptica. El médico evaluador desconoce la asignación de tratamiento del paciente; el médico que administra la inyección conoce la asignación de tratamiento del paciente con respecto al anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado o el tratamiento simulado, pero desconoce la dosis del anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado. Otro personal en cada sitio de estudio (excepto aquellos que ayudan con las inyecciones), los pacientes y el personal del centro de lectura central desconocen la asignación de tratamiento del paciente.
Análisis de eficacia y seguridad
Los análisis de eficacia se realizan por intención de tratar entre todos los pacientes con el uso de un método de última observación realizada para los datos faltantes. Para todas las comparaciones por pares, el modelo estadístico se ajusta para la puntuación inicial de la agudeza visual (<55 letras vs. >55 letras). Las comparaciones entre grupos para puntos finales dicotómicos se realizan con el uso de la prueba de chi-cuadrado de Cochran. El cambio desde la agudeza visual basal se analiza con el uso de modelos de análisis de varianza. Para los puntos finales de las características de la lesión, se utilizan modelos de análisis de covarianza que se ajustan al valor de referencia. El procedimiento de comparación múltiple Hochberg-Bonferroni se utiliza para ajustar las dos comparaciones de tratamiento por pares para el punto final primario. Los análisis de seguridad incluyen a todos los pacientes tratados.
Conclusión
Los anticuerpos anti-endoglina humanizados serán una terapia bien tolerada para pacientes con EMD. Este estudio piloto demuestra que la terapia con anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados tiene el potencial de mantener o mejorar la agudeza visual mejor corregida y reducir el grosor de la retina en pacientes con EMD clínicamente significativo involucrado en el centro.
Ejemplo 24
Ensayo clínico de anticuerpos anti-endoglina y degeneración macular relacionada con la edad
Diseño del estudio
En múltiples sitios en los Estados Unidos, los pacientes se inscribieron en un estudio prospectivo, aleatorizado, doble ciego, controlado con simulación, de 2 años, sobre la seguridad y la eficacia de las inyecciones intravítreas repetidas de anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados entre pacientes con neovascularización coroidea asociada con degeneración macular relacionada con la edad. El análisis primario de eficacia se realiza a los 12 meses. El punto final de eficacia principal es la proporción de pacientes que habían perdido menos de 15 letras (aproximadamente 3 líneas) desde la agudeza visual inicial, según lo evaluado con el cuadro de Estudio de Retinopatía Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS), con el uso de refracción estandarizada y protocolo de prueba a una distancia de prueba inicial de 2 m. La elegibilidad de las lesiones es confirmada por un centro de lectura central independiente con el uso de criterios estandarizados y calificadores capacitados que desconocen las asignaciones de tratamiento de los pacientes. Los pacientes dan su consentimiento informado por escrito antes de determinar su elegibilidad completa. La evaluación puede durar hasta 28 días.
Para ser incluidos en el estudio, los pacientes deben tener al menos 50 años de edad; tener una agudeza visual mejor corregida de 20/40 a 20/320 (equivalente de Snellen determinado con el uso de una tabla ETDRS); tienen neovascularización coroidea primaria o recurrente asociada con la degeneración macular relacionada con la edad, que involucra el centro foveal; tienen un tipo de lesión que se evaluó con el uso de angiografía con fluoresceína y fotografía de fondo de ojo como mínimamente clásica u oculta sin neovascularización coroidea clásica; tienen un tamaño máximo de lesión de 12 áreas del disco óptico (1 área del disco óptico equivale a 2.54 mm2 sobre la base de 1 diámetro del disco óptico de 1.8 mm), con neovascularización que compone el 50% o más de la lesión completa; y tienen la presunción de una progresión reciente de la enfermedad, como lo demuestra la sangre observable, la pérdida de visión reciente o un aumento reciente en el diámetro lineal más grande de una lesión de 10% o más. No existen criterios de exclusión con respecto a enfermedades cardiovasculares, cerebrovasculares o periféricas preexistentes.
Primer estudio
Cincuenta a 500 pacientes (50 a 500 ojos) con AMD participarán en el estudio en múltiples sitios. Los pacientes elegibles se asignan aleatoriamente en una proporción 1:1:1 para recibir anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados a una dosis de aproximadamente 0.25 mg a 2.5 mg o una inyección simulada mensual (dentro de 23 a 37 días) durante 2 años (24 inyecciones) en un ojo. El médico evaluador desconoce la asignación de tratamiento del paciente; el médico que administra la inyección conoce la asignación de tratamiento del paciente con respecto al anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado o el tratamiento simulado, pero desconoce la dosis del anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado. Otro personal en cada sitio de estudio (excepto aquellos que asisten con las inyecciones), los pacientes y el personal del centro de lectura central desconocen la asignación de tratamiento del paciente. La terapia de intervención (por ejemplo, terapia fotodinámica con verteporfina) está permitida si la neovascularización coroidea en el ojo del estudio se vuelve predominantemente clásica.
Como primer paso del tratamiento, los pacientes deben recibir un examen oftálmico completo para establecer una línea de base de salud ocular. El examen oftalmológico incluye oftalmoscopia indirecta, biomicroscopía con lámpara de hendidura, examen de retina periférico, mediciones de presión intraocular, sintomatología de agudeza visual (sin ayuda y mejor corregida), fotografía de fondo de ojo, angiografía con fluoresceína, tomografía de coherencia óptica, electrorretinografía y mediciones de exploración A.
Después del examen preliminar, se administra una inyección intravítrea como se describe anteriormente al ojo afectado de un paciente que manifiesta DMAE. Si ambos ojos están afectados, pueden tratarse por separado. El ojo por tratar se inyecta con una solución oftálmica.
Después del tratamiento, los ojos de los pacientes deben examinarse los días uno (1), dos (2), siete (7), quince (15), treinta (30) y sesenta (60) y cada mes a partir de entonces 2 años. Debido a la posibilidad de recurrencia, los pacientes deben regresar para exámenes periódicos mensualmente a partir de entonces. En cada día de examen, el paciente es monitorizado por licuefacción vítrea. Además, los pacientes son monitorizados por desprendimientos vítreos posteriores mediante oftalmoscopia indirecta con depresión esclerótica. Finalmente, la extensión de la DMAE presentada por los pacientes se monitoriza continuamente a través de exámenes periódicos de retina, tomografía de coherencia óptica y angiogramas de fluoresceína para monitorizar la presencia de líquido subrretina, sangre, exudados, desprendimiento de RPE, cambios de retina quísticos o la presencia de membrana neovascular subretiniana verde grisácea. Se pueden requerir tratamientos adicionales si se observan indicios de neovascularización recurrente. Se pueden administrar tratamientos adicionales semanalmente o mensualmente. En un ejemplo preferido, un tratamiento inicial es seguido por tratamientos subsecuentes entre 1-6 meses de diferencia.
Los análisis de eficacia se realizan por intención de tratar entre todos los pacientes con el uso de un método de última observación realizada para los datos faltantes. Para todas las comparaciones por pares, el modelo estadístico se ajusta para la puntuación inicial de la agudeza visual (<55 letras vs. >55 letras) y el subtipo de neovascularización coroidea (mínimamente clásico versus oculto sin enfermedad clásica). Las comparaciones entre grupos para puntos finales dicotómicos se realizan con el uso de la prueba de chi-cuadrado de Cochran. El cambio desde la agudeza visual basal se analiza con el uso de modelos de análisis de varianza. Para los puntos finales de las características de la lesión, se utilizan modelos de análisis de covarianza que se ajustan al valor de referencia. El procedimiento de comparación múltiple Hochberg-Bonferroni se utiliza para ajustar las dos comparaciones de tratamiento por pares para el punto final primario. Los análisis de seguridad incluyen a todos los pacientes tratados.
Segundo estudio
Los pacientes que manifiestan degeneración macular relacionada con la edad se tratan de acuerdo con los métodos del primer estudio (véase arriba) con una inyección intravítrea de (1) anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado solo, (2) ranibizumab solo, (3) anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado en combinación con ranibizumab en la misma composición o diferentes composiciones o (4) anticuerpo de control para reducir o prevenir el desarrollo de neovascularización, enfermedad macular y daño de retina.
Conclusión
Los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados serán una terapia bien tolerada para pacientes con AMD. Este ensayo clínico demuestra que la terapia con anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados tiene el potencial de mantener o mejorar la agudeza visual mejor corregida y reducir la neovascularización coroidea en pacientes con AMD. Además, los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados demostrarán una actividad superior en comparación con el ranibizumab y la combinación de anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados y la terapia con ranibizumab y demostrarán una mayor actividad frente a cualquier anticuerpo solo.
Ejemplo 25
Toxicología sistémica en monos Cynomolgus
Se utilizan monos Cynomolgus en un estudio para abordar la toxicología sistémica de los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados.
En resumen, los monos se dosifican semanalmente durante tres semanas con 10.0 mg/kg, 30.0 mg/kg o 100.0 mg/kg del anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado. Los animales placebo se dosifican en el mismo horario con una solución apropiada en ausencia de anticuerpos. Las dosis se administran como un bolo intravenoso durante 30 a 60 minutos y se dosifican al menos seis animales en cada nivel de dosis. La toxicología se evalúa mediante una o más de las siguientes indicaciones: mediciones de peso corporal, mediciones clínicas fisiológicas básicas, química sérica en serie, evaluaciones hematológicas y evaluaciones histopatológicas.
Ejemplo 26
Toxicología sistémica en combinación con bevacizumab en monos Cynomolgus
Se utilizan monos Cynomolgus en un estudio para abordar la toxicología sistémica de los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados en combinación con ranibizumab (LUCENTIS®).
En resumen, los monos se dosifican semanalmente durante tres semanas con 10.0 mg/kg, 30.0 mg/kg o 100.0 mg/kg del anticuerpo anti-endoglin humanizado/desinmunizado en combinación con aproximadamente 10 mg/kg a 100 mg/kg de bevacizumab Otros animales reciben anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados o bevacizumab solo. Los animales placebo se dosifican en el mismo horario con una solución apropiada en ausencia de anticuerpos. Las dosis se administran como un bolo intravenoso durante 30 a 60 minutos y se dosifican al menos seis animales en cada nivel de dosis. La toxicología se evalúa mediante una o más de las siguientes indicaciones: mediciones de peso corporal, mediciones clínicas fisiológicas básicas, química sérica en serie, evaluaciones hematológicas y evaluaciones histopatológicas.
Ejemplo 27
Estudio regional de toxicología en monos Cynomolgus
Se utilizan monos Cynomolgus en un estudio para abordar la toxicología regional de los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados.
En resumen, los monos se dosifican por inyección intravítrea semanalmente durante seis semanas con 0.25, 1.25 y 2.5 mg de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado. Los animales placebo se dosifican en el mismo horario con una solución apropiada en ausencia de anticuerpos. Las dosis se administran como inyecciones intravítreas y se dosifican al menos seis animales en cada nivel de dosis. La toxicología se evalúa mediante una o más de las siguientes indicaciones: mediciones de peso corporal, mediciones clínicas fisiológicas básicas, química sérica en serie, evaluaciones hematológicas y evaluaciones histopatológicas.
Estudio combinado de toxicología regional
Se utilizan monos Cynomolgus en un estudio para abordar la toxicología de los anticuerpos anti-endoglina humanizados/desinmunizados en combinación con ranibizumab (LUCENTIS®) cuando se administran mediante inyección intravítrea.
En resumen, los monos se dosifican por inyección intravítrea semanalmente durante seis semanas con 0.25, 1.25 y 2.5 mg de anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado y 0.5 mg de ranibizumab (LUCENTIS®). Otros animales reciben cualquier anticuerpo solo, a la misma dosis y horario. Los animales placebo se dosifican en el mismo horario con una solución apropiada en ausencia de anticuerpos. Las dosis se administran como inyecciones intravítreas y se dosifican al menos seis animales en cada nivel de dosis. La toxicología se evalúa mediante una o más de las siguientes indicaciones: mediciones de peso corporal, mediciones clínicas fisiológicas básicas, química sérica en serie, evaluaciones hematológicas y evaluaciones histopatológicas.
Ejemplo 28
Ensayos de brotación
La angiogénesis se puede probar en un modelo tridimensional in vitro de brotación. Los HUVEC se aíslan de los cordones umbilicales y se cultivan en M199 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) (GIBCO, Carlsbad, CA) y suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS) (BD Biosciences, Bedford, MA) a 3°C y 5% CO2, los Pases 2 a 4 HUVEC se utilizan para todos los experimentos (el paso 0 es el cultivo primario). Los fibroblastos de pulmón (LF) se cultivan habitualmente en DMEM (GIBCO, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de FBS a 37°C y 5% de CO2 y se utilizan entre P10 y P15. También se pueden usar otras líneas de fibroblastos, obtenibles de ATCC.
Preparación de las células
HUVEC y fibroblastos se expanden en M199/10% FBS/Pen-Strep (1:100) 1 a 2 días antes de la formación de gránulos. Para HUVEC, el medio se cambia a EGM-2 (Clonetics, Walkersville, MD) el día antes de la formación de gránulos. Para los fibroblastos, el medio se cambia a EGM-2 el día antes de la inclusión. La formación de gránulos requiere aproximadamente 400 HUVEC por gránulo. Los fibroblastos se usan a 20.000 células por pozo para una placa de 24 pozos. Las placas de noventa y seis pozos también se pueden usar con cantidades escaladas en concordancia.
Preparación de gránulos con Citodex 3
Se pueden usar gránulos de microportadores Cytodex 3, por ejemplo, en el ensayo (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Los gránulos secos (0.5 g) se hidratan y se hinchan en 50 ml de PBS (pH = 7.4) durante al menos 3 horas a temperatura ambiente (RT) en un tubo de 50 ml y se colocan en un balancín.
Los gránulos se dejan sedimentar (aproximadamente 15 min). El sobrenadante se desecha y los gránulos se lavan durante unos minutos en PBS fresco (50 ml).
El PBS de lavado se desecha y se reemplaza con PBS nuevo:
La suspensión de gránulos se coloca en una botella de vidrio siliconado (por ejemplo, Windshield Wiper o Sigrnacote). Los gránulos se esterilizan en autoclave durante 15 minutos a 115°C y luego se almacenan a 4°C.
Reactivos
Solución de fibrinógeno
Se prepara una solución de fibrinógeno disolviendo 2 mg/ml de fibrinógeno en DPBS en un baño de agua a 37°C. La solución se mezcla invirtiendo el tubo en lugar de agitar en vórtex. El porcentaje de proteína coagulable se puede determinar y ajustar en concordancia. La solución luego se pasa a través de un filtro de 0.22 pm para esterilizar. Aprotinina
La aprotinina liofilizada se puede reconstituir a 4 U/ml en agua DI y se puede esterilizar por filtración. Se hacen alícuotas de 1 ml cada una y se almacenan a -20°C.
Trombina
La trombina se reconstituye en agua estéril a 50 U/ml. Se hacen alícuotas de 0.5 ml y se almacenan a -20°C.
Recubrimiento de los gránulos con HUVEC (Día 1)
Las células HUVEC se tripsinizan. Se dejan sedimentar los gránulos (no se centrifugan), se aspira el sobrenadante y se lavan brevemente los gránulos en 1 ml de medio EGM-2 caliente. Los gránulos (2500) se mezclan con 1 x 106 HUVEC en 1.5 ml de medio EGM-2 tibio en un tubo FACS y se colocan verticalmente en la incubadora. (Esto será suficiente para aproximadamente 10 pozos; ampliar si es necesario).
La mezcla se incuba durante 4 horas a 37°C, invirtiendo y mezclando el tubo cada 20 min. (los gránulos deben verse como pelotas de minigolf después de la formación de los gránulos, lo que indica que hay suficiente recubrimiento para brotar).
Después de 4 horas, los gránulos recubiertos se transfieren a un matraz de cultivo de tejidos T25 (Falcon, Bedford, MA) y se incuban durante la noche en 5 ml de medio EGM-2 a 37°C y 5% de CO2.
Incrustación de gránulos recubiertas en gel de fibrina (Día 0)
Se prepara una solución de fibrinógeno de 2.0 mg/ml como se describe anteriormente y se añaden 0.15 unidades/ml de aprotinina a la solución de fibrinógeno.
Los gránulos recubiertos se transfieren a un tubo cónico de 15 ml y los gránulos se dejan sedimentar.
Los gránulos se resuspenden en 1 ml de medio EGM-2 y se transfieren a un tubo de centrífuga de 1.5 ml. Los gránulos se lavan tres veces con 1 ml de medio EGM-2, mezclándolas pipeteando lentamente con una pipeta P1000. Los gránulos se cuentan en un cubreobjetos y se resuspenden en una solución de fibrinógeno a una concentración de 500 gránulos/ml.
Se añade trombina (0.625 unidades/ml) a cada pozo de una placa de 24 pozos. La suspensión de fibrinógeno/cordón (0.5 ml) a cada pozo cambia la punta de la pipeta para cada pozo.
La trombina y el fibrinógeno/gránulos se mezclan pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente de cuatro a cinco veces; se evita crear burbujas en el gel de fibrina. Las muestras de control se tratan en ausencia de anticuerpos o uno o más anticuerpos de control. Las muestras de prueba se tratan con anticuerpos anti-endoglina solos, anticuerpos anti-VEGF solos, o una combinación de los mismos. Se pueden probar múltiples concentraciones de agentes. La solución de fibrinógeno/gránulo se deja coagular durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego a 37°C/5% de CO2 durante 15 minutos. Es importante que la placa no se altere durante los primeros 5 minutos de coagulación para minimizar el cizallamiento de la fibrina, lo que puede reducir la brotación.
Se añade EGM-2 (1 ml) a cada pozo de forma gota a gota. Los fibroblastos de pulmón se siembran en la parte superior del coágulo a una concentración de 20.000 células/pozo. Se reemplaza el medio de cultivo con medio EGM-2 fresco cada dos días hasta lograr el crecimiento deseado.
Cuando se forma el gel de fibrina, pueden estar presentes pequeñas burbujas en el gel; desaparecerán en 3 a 4 días. El brote debe ser evidente entre los días 2 y 4. La formación de lumen comienza alrededor del día 4 al 5 y los brotes continúan alargándose. Los tubos recién formados comienzan a ramificarse alrededor del día 4 al 6. Para el día 6 al 7, las estructuras en forma de microvasos comienzan a anastomarse con tubos adyacentes; aumentar el número de gránulos por pozo produce una anastomosis más temprana. La distancia de brotación se mide mediante técnicas estándar.
Ejemplo 29
Inmunocitoquímica de brotes angiogénicos in vitro
Para la tinción de núcleos de células endoteliales (CE), los geles de fibrina se lavan dos veces con 1 X PBS y luego se fijan durante la noche en paraformaldehído al 2%. Después de dos lavados más con 1 X PBS, los geles se tiñen con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Sigma, St. Louis, MO).
Para la inmunotinción, se eliminan primero los fibroblastos de pulmón (LF) mediante un breve tratamiento de los geles con 10X de tripsina. La digestión se detiene con suero tan pronto como se eliminan todos los fibroblastos. Luego, los geles se lavan abundantemente con HBSS, IX (Cellgro, Herndon, VA). Más adelante, los cultivos se fijan durante 10 minutos en formalina al 10% y se permeabilizan con Triton X-100 al 0.5% durante 5 minutos. La unión no específica se bloquea con una solución de b Sa al 5% en PBS durante 2 horas.
Los anticuerpos primarios se usan a una dilución de 1/100 en regulador de bloqueo y se incuban durante la noche a 4°C. Después de un lavado exhaustivo, el anticuerpo unido se detecta mediante anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 568 específicos de la especie a una dilución 1/1000 (Molecular Probes, Carlsbad, CA). Los anticuerpos no vinculantes específicos de isotipo se usan como control. Si se produce un fondo elevado, la concentración de anticuerpo primario o secundario puede reducirse y, si es necesario, pueden aumentarse los tiempos de incubación y/o lavado. La F-actina se tiñe con TRITC-faloidina (Sigma, St. Louis, MO) a una concentración de 0.2 |jM.
Las imágenes de contraste de fase y fluorescentes se capturan con un microscopio Olympus IX70 junto con una cámara digital. Los apilamientos de imágenes fluorescentes de la serie Z se capturan en un microscopio de doble fotón Carl Zeiss Microlmaging LSM 510 Meta y se compilan en representaciones tridimensionales con el software Metamorph (Universal Imaging Corporation, Downingtown PA). Por lo tanto, la expresión de diversos marcadores se puede detectar fácilmente.
Se pueden capturar apilamientos de imágenes ópticas fluorescentes a lo largo del eje z de los cultivos para crear representaciones 3D de los vasos. Los núcleos se tiñen con DAPI (verde) y las paredes de los vasos se tiñen con vimentina (naranja). Los lúmenes anchos y huecos son claramente visibles, rodeados por una sola capa de células endoteliales. Estas imágenes confirman que los lúmenes presentes en el ensayo in vitro son rendijas intercelulares y no intracelulares, como se ve a menudo en los ensayos de Matrigel. Además, se puede confirmar que los HUVEC están polarizados, ya que tienen una membrana apical, frente a la luz, y una membrana basal, colocada sobre una membrana basal rica en colágeno IV y el gel de fibrina.
Ejemplo 30
Supresión de la neovascularización coroidea en monos Cynomolgus
El efecto de las composiciones descritas en el presente documento sobre la neovascularización coroidea inducida por láser se evalúa en monos cynomolgus adultos.
En este experimento, se administran (1) anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado solo, (2) anticuerpo anti-VEGF solo, (3) anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado en combinación con anticuerpo anti-VEGF en la misma composición o en diferentes composiciones o (4) anticuerpos de control mediante inyección intravenosa o intravítrea. Cada animal recibe nueve o diez quemaduras con láser en cada retina, y el desarrollo de lesiones neovasculares coroidales activas se evalúa mediante angiografía con fluoresceína, una vez antes del inicio del tratamiento y 15, 20 y 29 días después del tratamiento con láser. Las composiciones se administran por vía intravenosa una vez por semana, comenzando una semana antes de la lesión por láser. Las inyecciones intravítreas se realizan una vez cada dos semanas, comenzando una semana antes del láser, o una vez, dos semanas después del láser, momento en el cual ya se han formado lesiones activas de CNV. Los animales de control reciben inyecciones semanales intravenosas o quincenales de placebo, comenzando una semana antes del láser.
Las lesiones de CNV se visualizan mediante angiografía con fluoresceína y se clasifican según los procedimientos estándar.
Ejemplo 31
Inhibición de la neovascularización corneal inducida por lesiones
La neovascularización corneal se induce en ratones machos C57BL/6 mediante la colocación intraestromal de 3 suturas de nylon, o por lesión química (NaOH) y desbridamiento mecánico del epitelio corneal. Se realizan múltiples experimentos en los que (1) anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado solo, (2) anticuerpo anti-VEGF solo, (3) anticuerpo anti-endoglina humanizado/desinmunizado en combinación con anticuerpo anti-VEGF solo en la misma composición o diferentes composiciones o (4) anticuerpos de control se administran intraperitonealmente una vez o en múltiples puntos de tiempo inmediatamente antes o después de la lesión.
El crecimiento de los neovasos corneales se evalúa mediante microscopía con lámpara de hendidura y evaluación histológica. La vasculatura se marca con una lectina conjugada con fluoresceína específica de células endoteliales, y se evalúa la neovascularización en montajes planos corneales, así como en secciones transversales usando inmunohistoquímica PECAM. La presencia de edema corneal se evalúa mediante microscopía con lámpara de hendidura y el grosor corneal se mide en secciones transversales; los aumentos en el grosor corneal reflejan la cantidad de edema. Los números de leucocitos polimorfonucleares (PMN) y macrófagos se determinan mediante tinción de secciones transversales con HEMA-3 o anticuerpo monoclonal anti-ratón F4/80 de rata, respectivamente.
Ejemplo 32
Identificación de epítopos de células T en anticuerpos anti-endoglina humanizados
Se probaron secuencias de regiones variables humanizadas mediante análisis iTope™. Las secuencias de la región variable humanizada se dividieron en péptidos superpuestos de 9-15-mero. Las secuencias de la región variable se analizaron para determinar la unión promiscua de alta afinidad al MHC humano clase II (epítopos potenciales de células T) usando iTope™, una herramienta analítica in silico que determina la afinidad de los péptidos por el MHC Clase II mediante análisis computacional. Las secuencias con las frecuencias más bajas de epítopos potenciales de células T del análisis iTope™ se identifican como derivaciones para la generación de un anticuerpo humanizado. Las secuencias de región variable humanizadas seleccionadas pueden rediseñarse mediante la inclusión de mutaciones para eliminar los posibles epítopos de células T. Las mutaciones están diseñadas con iTope™ para reducir o eliminar la unión de MHC clase II. Alternativamente, las secuencias humanas de la línea germinal pueden sustituirse en sitios de epítopos potenciales de células T o pueden sustituirse secuencias alternativas.
Las Figuras 19-23 presentan la unión prevista de péptidos 9-mero para el anticuerpo anti-endoglina humanizado que contiene la cadena liviana HuVK_v0 y la cadena pesada HuVH_v0, observada en la Figura 4.
Ejemplo 33
Diseño de anticuerpos anti-CD105 humanizados/desinmunizados
Este ejemplo describe el diseño de anticuerpos terapéuticos monoclonales humanizados y desinmunizados dirigidos a CD 105 humano que exhiben inmunogenicidad reducida.
Las secuencias promiscuas de unión de MHC de clase II de alta afinidad identificadas usando iTope™ (véase el Ejemplo 31) fueron analizadas adicionalmente por iTope™ para identificar sustituciones de aminoácidos en posiciones clave de bolsillo de MHC de clase II que reducirían o eliminarían la unión de péptidos a MHC clase II dado que todas las secuencias se superponen a las CDR, también se consideró la ubicación de los cambios en la CDR (posibles residuos de contacto con el antígeno) y las características fisicoquímicas de los aminoácidos originales y de reemplazo. Los residuos de contacto con TCR y los residuos fuera del surco de unión principal implicados en la estabilización de las interacciones péptido/MHC clase II-TCR también se consideraron para reemplazo.
En VHV1, se identificó un péptido de 9-mero que se encuentra completamente dentro de CDR2 y que comienza en el residuo 51 como un péptido de unión a MHC de clase II de alta afinidad promiscuo. El método más exitoso para la eliminación de la unión de MHC de clase II es apuntar al primer aminoácido del 9-mero (la posición de bolsillo 1 o p1) donde la eliminación de la cadena lateral hidrófoba o el reemplazo con una cadena lateral hidrófila elimina la clase de MHC II vinculante. Sin embargo, este tipo de reemplazo radical de aminoácidos puede no ser siempre exitoso para retener la afinidad del anticuerpo, por lo tanto, también se evaluaron las posiciones secundarias de bolsillo (p4, p6, p7 o p9), solas o en combinación. El análisis iTope™ reveló que se predice que atacar la posición p4 de este péptido cambiando K52b a Q o R reducirá significativamente la unión de MHC de clase II, mientras que se predice que el reemplazo de 151 en p1 con A eliminará completamente la unión (Tabla 5).
Tablas
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Tabla 5: Análisis del efecto de las sustituciones en la región inmunogénica de VHVI usando iTopeTM. El péptido núcleo 9-mero está subrayado en la columna "secuencia" y las sustituciones están resaltadas en negrita. Los residuos flanqueantes no están subrayados. La unión pronosticada de cada péptido central de 9-mero a cada alelo MHC de clase II se indica con "O" si la puntuación de unión fue de 0.55-0.6 y "X" si la puntuación de unión fue >0.6. Los números de alelos MHC de clase II que se unen se muestran en las columnas "total" y "alta afinidad". La Tabla 5 describe la SEQ ID NOS 106-109, respectivamente, en orden de aparición.
Las estructuras cristalinas de los complejos de anticuerpo/antígeno sugieren que 151 pueden entrar en contacto con el antígeno con poca frecuencia; sin embargo, un cambio radical de I a A (una sustitución para interrumpir una posición de anclaje p1) en esta posición podría afectar la conformación general de la CDR. Por lo tanto, también se incluyeron cambios relativamente conservadores en K52b (posición de anclaje p4) ya que este residuo es expuesto al solvente pero puede no entrar en contacto con el antígeno. Finalmente, también se diseñaron mutaciones adicionales que se encuentran fuera de la CDR (G49 a A o S) para evaluar el efecto desestabilizador sobre las interacciones péptido/MHC clase II/TCR. La Tabla 6 enumera las regiones VH humanizadas y humanizadas/desinmunizadas variantes que se construyeron; las SEQ ID NOS para las secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes se indican junto a los constructos.
Tabla 6
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Se identificaron dos péptidos promiscuos de unión a MHC de clase II de alta afinidad en VKV2 y VKV1. El primero, con un ancla p1 en V19, se superpone parcialmente a CDR1 y el segundo, con un ancla p1 en 148, se superpone a CDR2. Ambos anclajes p1 se encuentran fuera de las CDR y fueron dirigidos por mutación a A, lo que puede eliminar completamente la unión de MHC de clase II (Tabla 7). Sin embargo, ambos residuos pueden estar involucrados en el mantenimiento de las conformaciones de las CDR 1 y 2; por lo tanto, se diseñaron mutaciones adicionales que redujeron significativamente la unión de MHC de clase II (Tabla 7). En ambos casos, los residuos de p4 fueron atacados por la mutación de T a S. T22S también se encuentra fuera de la CDR y es menos probable que afecte la conformación de CDR que V19A. T51 se encuentra dentro de CDR2; sin embargo, la evidencia de las estructuras cristalinas de los anticuerpos complejados con el antígeno sugiere que este residuo rara vez entra en contacto con el antígeno. La Tabla 6 enumera las regiones VK humanizadas y humanizadas/desinmunizadas que se construyeron.
Tabla 7
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Tabla 7: Análisis del efecto de las sustituciones en las regiones inmunogénicas de VKV2 o VKV1 usando iTope™. El péptido núcleo 9-mero está subrayado en la columna "secuencia" y las sustituciones están resaltadas en negrita. Los residuos flanqueantes no están subrayados. La unión pronosticada de cada péptido central de 9-mero a cada alelo MHC de clase II se indica con "O" si la puntuación de unión fue de 0.55-0.6 y "X" si la puntuación de unión fue >0.6. Los números de alelos MHC de clase II que se unen se muestran en las columnas "total" y "alta afinidad". La Tabla 7 describe la SEQ ID NOS 110-115, respectivamente, en orden de aparición.
Ejemplo 34
Este ejemplo describe un método de selección de anticuerpos anti-endoglina para epítopos de células T. La interacción entre el MHC, el polipéptido y el receptor de células T (TCR) proporciona la base estructural para la especificidad antigénica del reconocimiento de células T. Los ensayos de proliferación de células T prueban la unión de polipéptidos procesados a partir de anticuerpos contra MHC y el reconocimiento de complejos de MHC/polipéptido por el TCR. Los ensayos de proliferación de células T in vitro del presente ejemplo, implican la estimulación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), que contienen células presentadoras de antígeno (APC) y células T. La estimulación se realiza in vitro usando anticuerpos anti-endoglina intactos. La proliferación de células T estimuladas se mide usando 3H-timidina (3H-Thy) y la presencia de 3H-Thy incorporado se evalúa usando el recuento de centelleo de células fijas lavadas.
Todos los genes de la región VH y VK humanizados y humanizados/desinmunizados se sintetizaron usando una serie de oligonucleótidos superpuestos que fueron fusionados, ligados y amplificados por PCR para dar regiones V sintéticas de longitud completa. Las variantes ensambladas se clonaron directamente en el sistema de vector de expresión pANT de Antitope Ltd. para cadenas pesadas IgG1 y cadenas livianas kappa.
Purificación de anticuerpos
Los anticuerpos anti-endoglina se purificaron a partir de los sobrenadantes de cultivos de mamíferos por cromatografía de proteína A. El intercambio de regulador y la concentración de proteína se realizaron usando PBS pH = 7.4. El anticuerpo anti-endoglina se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna Sephacryl S200 (GE Healthcare, AMersham, Reino Unido). El pico principal se recoge, se esteriliza por filtración y se muestra que tiene niveles de endotoxina <5 EU/mg usando un Endosafe-PTS (Charles River, Margate, Reino Unido). Los anticuerpos purificados se almacenan a 4 grados centígrados. Las concentraciones finales se determinaron por absorción UV usando coeficientes de extinción molar calculados, donde A280 1.0 = 1.62 mg/ml. Luego, cada anticuerpo se diluyó a 100 ug/ml en medio de cultivo AIMV.
Preparación y selección de PBMC donante
Se aíslan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de capas leucocíticas de donantes sanos de la comunidad (de sangre extraída en 24 horas) que se obtienen del UK National Blood Transfusion Service (Addenbrooke's Hospital, Cambridge, Reino Unido) de acuerdo con la aprobación otorgada por Addenbrooke's Hospital Local Research Ethics Committee. Las PBMC se aíslan de las capas leucocíticas mediante centrifugación de densidad Lymphoprep (Axis-shield, Dundee, Escocia) y las células T CD8+ se agotan usando RossetteSep™ CD8+ (StemCell Technologies, Inc.). Los donantes se caracterizan por identificar haplotipos HLA-DR utilizando un kit de tipificación de tejidos basado en Biotest HLA SSP-PCR (Biotest, Landsteinerstrape, Dinamarca). Las respuestas de las células T a un antígeno de control, Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH) (Pierce, Rockford, IL, Estados Unidos) se determinan para un control positivo. Las PBMC se congelaron y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta que se requirió. Cuando se requiere para su uso, las células se descongelan rápidamente en un baño de agua a 37°C antes de transferirlas a 10 ml de medio AIM V precalentado.
Se selecciona una cohorte de 20 donantes para representar mejor el número y la frecuencia de los alotipos HLA-DR expresados en la población mundial. El análisis de los alotipos expresados en la cohorte frente a los expresados en la población mundial reveló que se alcanza una cobertura de >80% y que todos los alelos principales de HLA-DR (alotipos individuales con una frecuencia >5% expresados en la población mundial) están bien representados. En la Figura 23 se proporciona un resumen de los haplotipos de los donantes, y se realiza una comparación de la frecuencia de los alotipos de los donantes utilizados en el estudio con los presentes en la población mundial.
Las PBMC de cada donante se descongelan, se cuentan y se evalúa la viabilidad. Las células fueron revividas y resuspendidas en medio de cultivo AIMV a 4-6 x106 PBMC/ml. Para cada donante, se establecieron cultivos en masa en los que se añadió un total de 1 ml de reserva de células de proliferación a una placa de 24 pozos. Se añadió un total de 1 ml de cada muestra de prueba diluida a la PBMC para dar una concentración final de 50 ug/ml por muestra de anticuerpo. Para cada donante, también se incluyeron un control positivo (células incubadas con 100 pg/ml de KLH) y un control negativo (células incubadas solo con medios de cultivo). Para los primeros 4 donantes, se incluyó un control adicional para evaluar la modulación de las respuestas de las células T por parte de los individuos de prueba, donde se agregaron la muestra de prueba y KLH al PBMC. La comparación de estas muestras con KLH solo puede usarse para evaluar los efectos de las muestras de prueba sobre la proliferación. Los cultivos se incubaron durante un total de 8 días a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. En los días 5, 6, 7 y 8, las células en cada pozo se resuspenden suavemente y se transfierieron tres alícuotas de 100 pl a pozos individuales de una placa de 96 pozos de fondo redondo. Los cultivos se pulsan con 1 pCi 3[H]-Thy (Perkin Elmer, Waltham, MA) en 100 pl de medio de cultivo AIMV y se incuban durante 18 horas más antes de cosechar en esterillas de filtro usando un recolector de células TomTec Mach III. Los recuentos por minuto (cpm) para cada pozo se determinan mediante recuento de centelleo Meltilex™ (Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos) en un contador de microplacas Beta (Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos) en modo de recuento de fondo bajo paralux .
Los resultados se expresan como índices de estimulación, donde el índice de estimulación (SI) se deriva por división de la puntuación de proliferación (por ejemplo, recuentos por minuto de radioactividad) medido al anticuerpo antiendoglina de prueba por la puntuación medida en células no contactadas con una prueba de anticuerpos antiendoglina. Todas las cpm basales para los pozos de control están por encima del umbral mínimo para el ensayo de 150 cpm.
Para los ensayos de proliferación, se ha establecido previamente un umbral empírico de un índice de estimulación (SI) igual o superior a 2 (SI>2) mediante el cual las muestras que inducen respuestas proliferativas por encima de este umbral se consideran positivas (si se incluyen, límites SI >1.90 están resaltados). El extenso desarrollo de ensayos y estudios previos han demostrado que este es el umbral mínimo de señal a ruido que permite la máxima sensibilidad sin detectar grandes cantidades de respuestas falsas positivas. Las respuestas positivas se definen mediante los siguientes umbrales estadísticos y empíricos:
1. Significado (p<0.05) de la respuesta al comparar las cpm de los pozos de prueba con los pozos de control medio usando la prueba t de Student de dos muestras no emparejadas.
2. Índice de estimulación mayor que 2 (SI>2), donde SI = media de los pozos de prueba (cpm)/media de los pozos de control (cpm).
Además, la variación intraensayo se evalúa calculando el coeficiente de varianza y la desviación estándar (DE) de los datos brutos de los cultivos replicados.
Los resultados para el ensayo de proliferación de curso de tiempo EpiScreen con los anticuerpos anti-endoglina se muestran en la Figura 24 y se resumen en forma tabular (Tabla 8). El anticuerpo quimérico estimuló las respuestas en 4 de 20 donantes (20% de la cohorte del estudio) y, aunque dos de las respuestas de los donantes estaban en el límite (1.92 y 1.95 para los donantes 11 y 17, respectivamente), fueron significativamente diferentes del fondo (p<0.05). El anticuerpo humanizado VK1VH1 estimuló las respuestas en 2 de 20 donantes (10% de la cohorte del estudio) incluyendo una respuesta límite (1.91 para el donante 20) que fue significativamente diferente del fondo (p<0.05). Es de destacar que los donantes 11 y 20 respondieron a ambos anticuerpos, lo que sugiere que podría haber un epítopo de células T compartido. En contraste, ninguno de los donantes en la cohorte del estudio respondió positivamente al anticuerpo anti-endoglina desinmunizado VK1AA VH1A2. Los resultados con el antígeno de control k Lh muestran que hubo una buena correlación entre los resultados positivos y negativos, lo que indica un alto nivel de reproducibilidad en el ensayo.
Tabla 8. La estimulación de células T, como una medida de inmunogenicidad, indujo el cultivo con anticuerpos antiendoglina y KLH, donde "P*" indica estimulación límite por encima del valor basal y "P" indica un índice de estimulación mayor que 2.
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Ejemplo 35
Mapeo de epítopos de células T EpiScreen™
EpiScreen™ es una tecnología ex vivo para la medición de epítopos de células T en anticuerpos completos o para mapear la ubicación de la secuencia de dichos epítopos de células T como se describe con más detalle más adelante.
Selección de donantes EpiScreen
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aíslan de las capas leucocitarias de donantes sanos de la comunidad (de sangre extraída en 24 horas) que se obtienen del UK National Blood Transfusion Service (Addenbrooke's Hospital, Cambridge, Reino Unido) de acuerdo con la aprobación otorgada por Addenbrooke's Hospital Local Research Ethics Committee. Las PBMC se aíslan de las capas leucocíticas mediante centrifugación por densidad Lymphoprep (Axis-shield, Dundee, Escocia) y las células T CD8+ se agotan usando RossetteSep™ CD8+ (StemCell Technologies, Inc.). Los donantes se caracterizan por identificar haplotipos HLA-DR utilizando un kit de tipificación de tejidos basado en Biotest HLA SSP-PCR (Biotest, Landsteinerstrape, Dinamarca). Las respuestas de las células T a un antígeno de control, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH) (Pierce, Rockford, Estados Unidos) también se determinan para un control positivo. Se selecciona una cohorte de 54 donantes para representar mejor el número y la frecuencia de los alotipos HLA-DR expresados en la población mundial. El análisis de los alotipos expresados en la cohorte frente a los expresados en la población mundial reveló que se alcanza una cobertura de >80% y que todos los alelos principales de HLA-DR (alotipos individuales con una frecuencia >5% expresados en la población mundial) están bien representados. Se proporciona un resumen de los haplotipos de los donantes y se realiza una comparación de la frecuencia de los alotipos de los donantes utilizados en el estudio con los presentes en la población mundial.
Detalles del donante y haplotipos. Las respuestas de los donantes (SI) a KLH se prueban en dos experimentos independientes. La prueba 1 se realiza en PBMC recién aisladas y un anticuerpo es la nueva prueba en el estudio actual. Se resaltan las respuestas que no produjeron el mismo resultado (es decir, positivo o negativo) en ambas pruebas. Los donantes con cpm basal muy bajo (<150 cpm) están excluidos del análisis.
Análisis EpiScreen: Ensayos de proliferación
Se usa EpiScreen™ para probar péptidos superpuestos derivados de la secuencia de anticuerpos quiméricos, humanizados y humanizados/desinmunizados. Los péptidos superpuestos son diseñados. Una serie de 128 x 15-mero péptidos superpuestos por 12 aminoácidos se sintetizan junto con 1 x 14-mero y 1 x 11-mero y se utilizan para estimular las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) derivadas de una cohorte de 51 donantes sanos que usan mapeo de epítopos de células T EpiScreen™. Los péptidos individuales se prueban en cultivos replicados y las respuestas se evalúan utilizando ensayos de proliferación de células T para identificar la ubicación precisa de los epítopos. Las PBMC de cada donante se descongelan, cuentan y evalúan para determinar su viabilidad. Las células se reviven en medio de cultivo AIM V a temperatura ambiente (Invitrogen, Carlsbad, California) antes de ajustar la densidad celular a 2.5x106 PBMC/ml (stock de células de proliferación). Los péptidos se disuelven en DMSO (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Estados Unidos) hasta una concentración final de 10 mM. Las reservas de cultivo de péptidos se preparan luego diluyendo en medio de cultivo AIM V hasta una concentración final de 5 pM. Para cada péptido y cada donante, los cultivos sextuplicados se establecen mediante la adición de 100 pl de las reservas de cultivo de péptidos a 100 pl de stock de células de proliferación en una placa de 96 pozos de fondo plano. Los cultivos de control positivo y negativo también se establecen en sextuplicado. Se utiliza un total de 9 x 96 placas para cada donante, y cada placa es suficiente para analizar 15 péptidos con un control negativo (solo transportador) en sextuplicado. En la placa final, se agrega un control positivo.
Los cultivos se incuban durante un total de 6 días antes de agregar 0.5 |jCi3[H]-T¡m¡dina (Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos) a cada pocillo. Los cultivos se incuban durante 18 horas más antes de cosechar sobre almohadillas de filtro usando un recolector de células TomTec Mach III. Los recuentos por minuto (cpm) para cada pozo se determinan mediante recuento de centelleo Meltilex™ (Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos) en un contador de microplacas Beta (Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos) en modo de recuento de fondo bajo paralux .
Para los ensayos de proliferación, se ha establecido previamente un umbral empírico de un índice de estimulación (SI) igual o superior a 2 (SI>2) por el cual las muestras que inducen respuestas proliferativas por encima de este umbral se consideran positivas (si se incluyen, SI límite > .90 están resaltados). El extenso desarrollo de ensayos y estudios previos han demostrado que este es el umbral mínimo de señal a ruido que permite la máxima sensibilidad sin detectar grandes cantidades de respuestas falsas positivas. Las respuestas positivas se definen mediante los siguientes umbrales estadísticos y empíricos:
1. Significado (p<0.05) de la respuesta al comparar las cpm de los pozos de prueba con los pozos de control medio usando la prueba t de Student de dos muestras no emparejadas.
2. Índice de estimulación mayor que 2 (SI>2), donde SI = media de los pozos de prueba (cpm)/media de los pozos de control (cpm).
Además, la variación intraensayo se evalúa calculando el coeficiente de varianza y la desviación estándar (DE) de los datos brutos de los cultivos replicados.
Los ensayos de proliferación se establecen en cultivos sextuplicados ("datos no ajustados"). Para garantizar que la variabilidad intraensayo sea baja, los datos también se analizan después de eliminar los valores máximos y mínimos de cpm ("datos ajustados") y el SI de las respuestas de los donantes se comparan utilizando ambos conjuntos de datos. Se preparan detalles de los SI de donantes de conjuntos de datos ajustados y no ajustados. Los epítopos de células T se identifican calculando la frecuencia promedio de respuestas a todos los péptidos en el estudio 2 x SD (tasa de respuesta de fondo). Se considera que cualquier péptido(s) que indujo la proliferación por encima de este umbral contiene un epítopo de células T.
Análisis de péptidos en Silico iTope™
Las secuencias de péptidos que son positivas en el ensayo de proliferación se analizan usando el software predictivo iTope™ de Antitope. Este software predice interacciones favorables entre las cadenas laterales de aminoácidos del péptido y los bolsillos de unión específicos dentro del surco de unión de MHC de clase II. La ubicación de los residuos de unión clave se determina generando péptidos de 10-mero que se solapan con un aminoácido que abarca la secuencia del péptido largo. Cada 10-mero se prueba con la base de datos de Antitope de alotipos de MHC de clase II y se califica en función de su ajuste e interacciones con las moléculas de MHC de clase II. Se considera que los péptidos que produjeron una alta puntuación de unión contra un gran número de alelos contienen el núcleo 9-mero.
Identificación de epítopos de células T
Todos los péptidos identificados usando el Análisis EpiScreen™ descrito anteriormente se sintetizan con éxito para la prueba contra 51 donantes sanos (se seleccionaron originalmente 54 donantes; los donantes pueden ser excluidos del análisis debido a bajas cpm basales, es decir, por debajo del valor de corte de 150 cpm). Las respuestas positivas son definidas por los donantes que producen una respuesta significativa (p<0.05) con un SI>2 a cualquier péptido dado. También se incluyen las respuestas límite (una respuesta significativa (p<0.05) con un SI>1.90). Los resultados de los análisis de datos ajustados y no ajustados se comparan para garantizar que la variabilidad intraensayo sea baja y que las respuestas positivas no sean el resultado de la proliferación espuria en pozos individuales. Los resultados de cada análisis mostraron poca diferencia entre los métodos; en concordancia, el mapa del epítopo de células T se compila utilizando el análisis de datos ajustado. Se preparan índices de estimulación de donantes de análisis ajustados y no ajustados. Los epítopos de células T se identifican calculando la frecuencia promedio de las respuestas a todos los péptidos en el estudio más el doble de la desviación estándar (denominada "tasa de respuesta de fondo"). Se calcula que es del 5.6% y es el equivalente a inducir una respuesta positiva en tres o más donantes. Se considera que los péptidos que inducen respuestas proliferativas por encima de este umbral contienen un epítopo de células T.
Prueba de inmunogenicidad de variantes candidatas con EpiScreen™
Las variantes candidatas se purifican y se comparan con el polipéptido de tipo salvaje usando ensayos de células T de curso de tiempo EpiScreen™. Una gran cantidad de donantes sanos que representan a la población mundial según la expresión de los alotipos HLA se seleccionan de una biblioteca de donantes como se describe anteriormente. Los donantes se estimulan con cada proteína en cultivos a granel separados que contienen PBMC 2-4x106 CD8+ de células T empobrecidas. Se extraen muestras replicadas (de blastos T) de cultivos en masa en los días 5-8, y se evalúa la

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 89, y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93, 94, 95 o 96; una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 90, y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93 o 94; o una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 91, y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93 o 94.
2. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 89 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 93.
3. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 89; y una región variable de la cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 94, 95 o 96.
4. Un fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento scFv o un polipéptido de unión de cadena simple.
5. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis en un sujeto.
6. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso como se reivindica en la reivindicación 5, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está marcado con una etiqueta terapéutica, una etiqueta detectable o ambas.
7. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso como se reivindica en la reivindicación 5, en donde la enfermedad relacionada con la angiogénesis es una enfermedad ocular caracterizada por angiogénesis/neovascularización.
8. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso como se reivindica en la reivindicación 7, en donde la enfermedad ocular es degeneración macular.
9. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso como se reivindica en la reivindicación 8, en donde la degeneración macular es degeneración macular relacionada con la edad.
10. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso como se reivindica en la reivindicación 7, en donde la enfermedad ocular es la retinopatía diabética.
11. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso como se reivindica en la reivindicación 5, en donde la enfermedad relacionada con la angiogénesis es un cáncer o una metástasis del mismo.
12. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso como se reivindica en la reivindicación 11, en donde el cáncer o metástasis del mismo es un tumor sólido.
13. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso como se reivindica en la reivindicación 11, en donde el cáncer o una metástasis del mismo es de origen epitelial.
14. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso como se reivindica en la reivindicación 11, en donde el cáncer o metástasis del mismo se selecciona de un cáncer de pulmón, un melanoma, un cáncer de mama, un cáncer de páncreas, un cáncer de ovario, un cáncer uterino, un cáncer colorrectal, un cáncer de próstata, un cáncer de riñón, un cáncer de cabeza, un cáncer de hígado, un cáncer de cuello, un sarcoma, un mieloma, un cáncer de cerebro y un linfoma.
15. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso como se reivindica en la reivindicación 14, en donde el cáncer de cerebro es un glioblastoma multiforme.
16. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 5-15, para uso en combinación con uno o más inhibidores de la angiogénesis.
17. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un vehículo o excipiente aceptable.
18. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 17, en la que la composición farmacéutica comprende además uno o más inhibidores de la angiogénesis.
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