KR20120108973A - 엔도글린 항체 - Google Patents

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찰스 토이어
막시밀리아노 바스퀘즈
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트라콘 파마수티칼즈, 인코포레이티드
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Abstract

본 출원은 인간화 및 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 및 그의 항원 결합 단편의 조성물에 관한 것이다. 일 측면은 가변 중쇄, 가변 경쇄 또는 이들 둘 모두의 적어도 하나의 프레임워크 영역의 적어도 하나의 아미노산 잔기에 하나 이상의 변형을 갖는 항체에 관한 것이다. 또 다른 측면은 엔도글린에 결합하고 혈관신생을 억제하는 항체에 관한 것이다. 또 다른 측면은 면역원성을 감소시키기 위한 인간화 항체의 탈면역화에 관한 것이다. 또 다른 측면은 엔도글린, 혈관신생 또는 이들의 조합과 관련된 질환 또는 질병의 검출, 진단 또는 치료를 위한 엔도글린에 결합하는 인간화 및 인간화/탈면역화 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

엔도글린 항체{ENDOGLIN ANTIBODIES}
상호 참조
본 출원은 2009년 9월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/247,290호 및 2010년 3월 31일에 출원된 미국 정규 출원 제12/751,907호의 이득을 주장하며, 이들 모두의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
발명의 배경
특히 CD105 또는 edg-1로도 알려진 엔도글린(Endoglin)은 제I형 호모이량체형 막 당단백질로서, 이는 증식 중인 혈관 내피 세포에서 높은 수준으로 발현된다(문헌[Burrows et al, 1995, Clin. Cancer Res. 1:1623-1634]). 따라서, 엔도글린은 능동적인 혈관신생을 겪는 내피 세포에 있어서 주로 증식 관련 마커이다. 그러나, 정상 조직의 혈관 내피에 의한 엔도글린의 약간의 발현이 있다(버로우즈(Burrows) 등의 상기 문헌; 문헌[Wang et al, 1993, Int. J. Cancer 54:363-370]). 인간 엔도글린은 형질전환 성장 인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β)에 특이적으로 결합하는 것으로 공지되어 있으며, 엔도글린의 추정 아미노산 서열은 TGF-β 수용체 유형의 β-글리칸에 대하여 강한 상동성을 갖는다.
엔도글린(EDG)은 종양 맥관구조의 항체 기반 감소 방법에 있어서 표적화되었으며, 이는 EDG가 내피 및 백혈병 세포 상의 증식 관련 항원이기 때문이다. 그의 발현은 종양 관련 혈관 내피에서 상향조절되며, EDG는 혈관신생에 필수적이다. 혈관신생은 기존의 맥관구조의 유지뿐만 아니라 신혈관형성에 이르게 되는 새로운 모세 혈관의 형성도 포함한다. 이것은 혈관 기저막 및 간질 매트릭스의 내피 세포 매개된 분해, 내피 세포의 이동, 내피 세포의 증식, 및 내피 세포에 의한 모세혈관 루프의 형성을 포함하는 일련의 순차적 단계를 포함하는 복잡한 과정이다.
몇몇 항-엔도글린 항체, 특히 항-엔도글린 단클론 항체("mAb")가 개시되었다. mAb SN6은 인간 백혈병 세포의 세포막의 당단백질 혼합물을 이용한 마우스의 면역화에 의해 생성된 항체이다(문헌[Haruta and Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7898-7902]). SN6은 인간 엔도글린을 인식하는 쥐과 mAb이다. mAb 44G4는 인간 프리(pre)-B 백혈병 세포의 전 세포 현탁물을 이용한 마우스의 면역화에 의해 생성된 항체이다(문헌[Gougos and Letarte, 1988, J. Immunol. 141 : 1925-1933]; 문헌[1990, J. Biol. Chem. 265:8361-8364]). 44G4는 또한 인간 엔도글린을 인식하는 쥐과 mAb이다. mAb MJ7/18은 염증이 생긴 마우스 피부를 이용한 래트의 면역화에 의해 생성된 항체이다(문헌[Ge and Butcher, 1994, 상기 문헌]). MJ7/18은 쥐과 엔도글린을 인식하는 mAb이다. mAb Tec-11은 인간 제대 정맥 내피 세포를 이용한 마우스의 면역화에 의해 생성된 항체이다(문헌[Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1 : 1623-1634]). Tec-11은 인간 엔도글린에 제한된 반응성을 갖는 쥐과 mAb이다. 엔도글린에 대한 항체는 혈관신생을 포함하거나, 그에 의해 영향을 받거나, 또는 그에 의해 걸리게 되는 다양한 질환 및 질병의 치료를 위한 요법의 개발에 있어서 중요한 영역을 대표한다.
혈관신생은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 발달하는 생리학적 과정이다(문헌[Varner, et al, Cell Adh. Commun. 1995, 3:367-374]; 문헌[Blood, et al, Biochim. Biophys. Acta. 1990, 1032:89-118]; 문헌[Weidner, et al, J. Natl. Cancer Inst. 1992, 84: 1875-1887]). 혈관신생은 정상적인 과정 및 병리학적 과정 둘 모두에 있어서 그 역할을 하는 것으로 제안되었다. 예를 들어, 혈관신생 과정은 동물 기관 및 조직의 혈관구조의 발달에 연루되어 있다. 이들 과정은 또한 일시적인 혈관신생 시기에, 예를 들어 월경 주기 동안, 임신에, 그리고 창상 치유에 연루되어 있다. 반면에, 다수의 질환이 조절해제된(deregulated) 혈관신생과 관련된 것으로 알려져 있다.
특정한 병리학적 상태에서, 혈관신생은 병에 걸린 조직 내의 세포에 적당한 혈액 및 영양소 공급을 제공하는 수단으로서 촉진된다. 이들 병리학적 상태 중 다수는 이상한 세포 증식 및/또는 조절을 포함한다. 따라서, 혈관신생의 억제는 새로운 혈관 발달을 특징으로 하는 질환을 치료하는 잠재적으로 유용한 접근법이다. 예를 들어, 혈관신생은 하기를 포함하는 병리적 상태에 연루되어 있다: 혈관신생/신혈관형성을 특징으로 하는 안질환 및 비안질환(non-ocular disease)(예를 들어, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 신병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 및 다양한 형태의 암, 고형 종양 및 전이 등.
엔도글린에 결합하는 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다. 그러한 항체는 시험관내 및 생체내 정제, 검출, 진단 및 치료 용도를 갖는다. 엔도글린의 하나 이상의 종 또는 변이체에 결합하여 혈관신생을 억제하는 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 또한 본원에서 제공된다. 엔도글린에 결합하는 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용하여 혈관신생 관련 질환을 치료하는 방법이 추가로 본원에서 제공된다.
엔도글린에 결합하는, 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편을 이용하여 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증, 또는 증식성 초자체 망막병증을 치료 또는 예방할 수 있다. 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편의 투여를 통하여 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증, 또는 증식성 초자체 망막병증을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 개시된다. 엔도글린에 결합하며 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 또한 혈관을 줄어들게 하고/하거나, 안질환과 관련된 내피 세포 증식을 억제하고/하거나, 출혈 증상을 없애고/없애거나, 혼탁 시각을 치료하고/하거나, 실명 정체(stasis of vision loss)를 제공하고/하거나 혈관 누출을 예방할 수 있다. 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 또한 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증 또는 증식성 초자체 망막병증의 치료용 의약에서 사용될 수 있다. 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 또한 암 치료용 의약에서 사용될 수 있다.
서열 번호 41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 갖는, 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 중쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system)을 이용할 경우 49 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환; 76 위치에서 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환; 77 위치에서 아르기닌(R)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 78 위치에서 발린(V)에 의한 루신(L)의 치환; 82a 위치에서 이소루신(I)에 의한 아스파라긴(N)의 치환; 89 위치에서 이소루신(I) 또는 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 94 위치에서 아르기닌(R) 또는 글리신(G)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 108 위치에서 트레오닌(T)에 의한 루신(L)의 치환; 109 위치에서 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 113 위치에서 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함하며, 경쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 1 위치에서 글루타민(Q)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 3 위치에서 발린(V)에 의한 글루타민(Q)의 치환; 4 위치에서 루신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환; 5 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 36 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환; 46 위치에서 프롤린(P)에 의한 루신(L)의 치환; 47 위치에서 트립토판(W)에 의한 루신(L)의 치환; 60 위치에서 발린(V) 또는 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환; 70 위치에서 세린(S)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 71 위치에서 티로신(Y)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환; 100 위치에서 알라닌(A)에 의한 글루타민(G)의 치환; 및 106 위치에서 루신(L)에 의한 이소루신(I)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함한다.
(i) 서열 번호 66의 CDR1, 서열 번호 67의 CDR2, 및 서열 번호 68의 CDR3;
(ii) 서열 번호 44의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 제외한 서열 번호 44의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR1;
(iii) 서열 번호 45의 아미노산 서열 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 49 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환을 제외한 서열 번호 45의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR2; 및
(iv) 서열 번호 47의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 76 위치에서 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환;
(b) 77 위치에서 아르기닌(R)에 의한 트레오닌(T)의 치환;
(c) 78 위치에서 발린(V)에 의한 루신(L)의 치환;
(d) 82a 위치에서 이소루신(I)에 의한 아스파라긴(N)의 치환;
(e) 89 위치에서 이소루신(I) 또는 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 및
(f) 94 위치에서 아르기닌(R) 또는 글리신(G)에 의한 트레오닌(T)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 47의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR3; 및
(v) 서열 번호 56의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 108 위치에서 트레오닌(T)에 의한 루신(L)의 치환;
(b) 109 위치에서 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 및
(c) 113 위치에서 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역과,
(i) 서열 번호 63의 CDR1, 서열 번호 64의 CDR2 및 서열 번호 65의 CDR3;
(ii) 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 1 위치에서 글루타민(Q)에 의한 아스파르트산(D)의 치환;
(b) 3 위치에서 발린(V)에 의한 글루타민(Q)의 치환;
(c) 4 위치에서 루신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환; 및
(d) 5 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR1;
(iii) 서열 번호 20의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 36 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환;
(b) 46 위치에서 프롤린(P)에 의한 루신(L)의 치환; 및
(c) 47 위치에서 트립토판(W)에 의한 루신(L)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR2;
(iv) 서열 번호 28의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 60 위치에서 발린(V) 또는 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환;
(b) 70 위치에서 세린(S)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 및
(b) 71 위치에서 티로신(Y)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR3; 및
(v) 서열 번호 35의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 100 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환; 및
(b) 106 위치에서 루신(L)에 의한 이소루신(I)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
서열 번호 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 중쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 49 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환; 76 위치에서 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환; 77 위치에서 아르기닌(R)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 78 위치에서 발린(V)에 의한 루신(L)의 치환; 82a 위치에서 이소루신(I)에 의한 아스파라긴(N)의 치환; 89 위치에서 이소루신(I) 또는 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 94 위치에서 트레오닌(T) 또는 글리신(G)에 의한 아르기닌(R)의 치환; 108 위치에서 트레오닌(T)에 의한 루신(L)의 치환; 109 위치에서 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 및 113 위치에서 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함하고, 경쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 1 위치에서 글루타민(Q)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 3 위치에서 발린(V)에 의한 글루타민(Q)의 치환; 4 위치에서 루신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환; 5 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 36 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환; 46 위치에서 루신(L)에 의한 프롤린(P)의 치환; 47 위치에서 루신(L)에 의한 트립토판(W)의 치환; 60 위치에서 발린(V) 또는 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환; 70 위치에서 세린(S)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 71 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환; 100 위치에서 알라닌(A)에 의한 글루타민(G)의 치환; 및 106 위치에서 루신(L)에 의한 이소루신(I)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함한다.
(i) 서열 번호 66의 CDR1, 서열 번호 67의 CDR2, 및 서열 번호 68의 CDR3;
(ii) 서열 번호 44의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 제외한 서열 번호 44의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR1;
(iii) 서열 번호 45의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 49 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환을 제외한 서열 번호 45의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR2; 및
(iv) 서열 번호 47의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 76 위치에서 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환;
(b) 77 위치에서 아르기닌(R)에 의한 트레오닌(T)의 치환;
(c) 78 위치에서 발린(V)에 의한 루신(L)의 치환;
(d) 82a 위치에서 이소루신에 의한 아스파라긴(N)의 치환;
(e) 89 위치에서 이소루신(I) 또는 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 및
(f) 94 위치에서 트레오닌(T) 또는 글리신(G)에 의한 아르기닌(R)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 47의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR3; 및
(v) 서열 번호 56의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 108 위치에서 트레오닌(T)에 의한 루신(L)의 치환;
(b) 109 위치에서 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 및
(c) 113 위치에서 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역과,
(i) 서열 번호 63의 CDR1, 서열 번호 64의 CDR2, 및 서열 번호 65의 CDR3;
(ii) 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 1 위치에서 글루타민(Q)에 의한 아스파르트산(D)의 치환;
(b) 3 위치에서 발린(V)에 의한 글루타민(Q)의 치환;
(c) 4 위치에서 루신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환; 및
(d) 5 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR1;
(iii) 서열 번호 21의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 36 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환;
(b) 46 위치에서 루신(L)에 의한 프롤린(P)의 치환; 및
(c) 47 위치에서 루신(L)에 의한 트립토판(W)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR2;
(iv) 서열 번호 29의 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 60 위치에서 발린(V) 또는 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환;
(b) 70 위치에서 세린(S)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 및
(b) 71 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR3; 및
(v) 서열 번호 35의 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 100 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환; 및
(b) 106 위치에서 루신(L)에 의한 이소루신(I)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
서열 번호 93에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VΚ1AA) 및 서열 번호 89에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH1A2)을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
서열 번호 89에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 93에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서,
(i) 중쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 49 위치에서 알라닌(A) 또는 세린(S)에 의한 글리신(G)의 치환; 51 위치에서 이소루신(I)에 의한 알라닌(A)의 치환; 52b 위치에서 아르기닌(R) 또는 아스파라긴(Q)에 의한 리신(K)의 치환; 78 위치에서 발린(V)에 의한 루신(L)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함하고;
(ii) 경쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 4 위치에서 루신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환; 19 위치에서 발린(V)에 의한 알라닌(A)의 치환; 22 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 48 위치에서 이소루신(I)에 의한 알라닌(A)의 치환; 및 51 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함한다.
서열 번호 88, 89, 90, 91 또는 92에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 93, 94, 95, 96, 97, 100, 102 또는 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 청구항 2의 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
일 측면에서, 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은 인간화되며, 임의의 이소타입일 수 있다. 아비머(AVIMER), 다이아바디(diabody), 및 중쇄 이량체(카멜리드(camelid) 및 상어(shark) 중쇄 구성체를 포함함)가 또한 본원에 포함된다.
"항체의 항원 결합 부분", "항원 결합 단편", "항원 결합 도메인", "항체 단편" 또는 "항체의 기능성 단편)이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편을 나타내기 위하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 그러한 용어 내에 포함되는 항체 단편의 비제한적 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지(hinge) 영역에서 디술피드 가교체에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 함유하는 이가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인을 함유하는 Fv 단편; (v) VH 도메인을 함유하는 dAb 단편(문헌[Ward et al, (1989) Nature 341:544 546]); 및 (vi) 단리된 CDR을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 포함하는 "원하프(one-half)" 항체가 이 정의 내에 추가로 포함된다. 다른 형태의 단일쇄 항체, 예컨대 다이아바디가 또한 본원에 포함된다.
항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab', F(ab')2 단편, Fv 단편(비공유 결합 및 공유 결합 Fv 단편을 포함함), scFv 단편, 단일쇄 결합 폴리펩티드, Fd 단편, Fv 단편 또는 dAb 단편을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 본원에 기술된 임의의 것일 수 있다. 비제한적 일 실시양태에서, 항원 결합 단편은 임의로 항체의 인간 Fc 부분에 추가로 융합될 수 있는 scFv이다.
비제한적 일 실시양태에서, 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 41, 42, 또는 43에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 3, 4, 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 43에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 43에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 43에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 76 위치에서 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환; 77 위치에서 아르기닌(R)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 82a 위치에서 이소루신(I)에 의한 아스파라긴(N)의 치환; 89 위치에서 이소루신(I) 또는 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 94 위치에서 글리신(G)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 108 위치에서 트레오닌(T)에 의한 루신(L)의 치환; 109 위치에서 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 및 113 위치에서 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역은 1 위치에서 글루타민(Q)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 3 위치에서 발린(V)에 의한 글루타민(Q)의 치환; 5 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 36 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환; 60 위치에서 발린(V) 또는 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환; 70 위치에서 세린(S)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 100 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환; 및 106 위치에서 루신(L)에 의한 이소루신(I)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함한다.
일 측면에서, 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은 변형될 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 당해 화합물은 예를 들어 생체내 안정성, 용해성, 생체이용성 또는 반감기와 같은 화합물의 약동학적 특성을 변경시키도록 변형될 수 있다. 그러한 변형은 PEG화(PEGylation) 및/또는 글리코실화를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은 통상적인 수단을 이용한 신속 전달 또는 장기간 전달용으로 제형화될 수 있다. 비제한적 일 실시양태에서, 신속 전달은 예를 들어 정맥내 주사에 의한 것이다. 또 다른 비제한적 실시양태에서, 장기간 전달은 피하 침적에 의한 것이다. 또 다른 비제한적 실시양태에서, 전달은 에어로졸에 의한 투여를 통하여 달성된다.
본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편과 허용되는 담체 또는 부형제의 조성물이 본원에서 제공된다.
본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(핵산)가 본원에서 제공된다.
본원에 개시된 항체 및 그의 항원 결합 단편은 혈관신생과 관련된 다양한 질환 및 질병, 예를 들어 혈관신생/신혈관형성을 특징으로 하는 다양한 형태의 안질환(예를 들어, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 신병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 및 다양한 형태의 암, 고형 종양 및 전이의 치료에 사용될 수 있다. 추가로, 본원에 개시된 이들 항체 및 그의 항원 결합 단편은 혈관신생과 관련된 질환 및 질병, 예를 들어 혈관신생/신혈관형성을 특징으로 하는 다양한 형태의 안질환 및 비안질환(예를 들어, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 신병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 및 다양한 형태의 암, 고형 종양 및 전이의 예방, 치료 또는 진단용 의약의 제형에서 사용될 수 있다.
인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프에 대한 효과적인 숙주 면역 반응을 유도하는, 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계에 의해 엔도글린에 대한 환자에 있어서의 숙주 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공된다.
숙주 면역 반응은 체액성 면역 반응 또는 세포 매개 면역 반응일 수 있다. 면역 반응이 체액성 면역 반응일 경우, 이것은 혈관신생, 혈관신생 의존성 질환 또는 혈관신생 의존성 장애를 억제하는 방어적 항체 반응일 수 있다. 면역 반응은 또한 세포 신호전달 경로(예를 들어, Smad 신호전달)의 유도 또는 차단을 포함한다. 혈관신생 의존성 질환 또는 장애는 예를 들어 혈관신생/신혈관형성을 특징으로 하는 다양한 형태의 안질환 및 비안질환 예를 들어, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 신병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 다양한 형태의 암(원발성 종양 및 전이) 등일 수 있다. 일 실시양태에서, 방어적 항체 반응은 혈관신생을 억제한다.
혈관신생 및 엔도글린과 관련된 세포 신호전달 경로에 영향을 주는 방법이 본원에서 제공된다. 혈관신생 세포는 세포 신호전달 경로를 변경하기에 충분한 양의 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉될 수 있다(시험관내, 생체내 또는 생체외). 비제한적 일 실시예에서, Smad 1, 5 및/또는 8의 신호전달은, 혈관신생 세포에서 항체 결합에 반응하여 약 1.5배 이상만큼 억제된다. 또 다른 비제한적 실시예에서, Smad 3의 수준은 약 1.5배 이상만큼 증가하며, 이는 세포가 휴지 상태로 되돌아가고 있음을 나타내는 것이다.
대상체에서 환자에게 본원에 제공된 조성물을 투여하는 단계에 의해 혈관신생 또는 혈관신생 의존성 질환 또는 장애를 억제하는 방법이 본원에서 제공된다. 혈관신생 의존성 질환 또는 장애는 하기 중 임의의 것일 수 있다: 혈관신생/신혈관형성을 특징으로 하는 다양한 형태의 안질환 및 비안질환(예를 들어, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 신병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 및 다양한 형태의 암, 고형 종양 및 전이. 일 실시양태에서, 혈관신생 또는 혈관신생 의존성 질환 또는 장애의 억제는 그 질환 또는 장애와 관련된 증상을 완화시킨다. 또 다른 실시양태에서, 혈관신생 또는 혈관신생 의존성 질환 또는 장애의 억제는 종양 크기를 감소시키거나, 종양 진행을 방지하거나, 세포 증식을 감소시키거나, 아폽토시스(apoptosis)를 증가시키거나, 환자의 생존성을 증가시킨다. 혈관신생의 억제는 종양 크기를 감소시키거나 종양 진행을 방지할 수 있다. 본 방법은 암의 외과적 제거, 및/또는 암을 앓고 있는 환자에게 하나 이상의 추가의 항암제 또는 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
대상체에서 본원에 제공된 조성물을 투여하는 단계에 의해 암 또는 전이를 예방 또는 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 당해 약학 조성물의 투여는 치료되는 대상체의 수명을 연장시킨다. 치료될 암/종양은 고형 종양을 포함하며, 종양은 원발성 종양 또는 전이성 종양일 수 있다. 예시적인 고형 종양으로는 피부 조직, 흑색종 조직, 폐 조직, 췌장 조직, 유방 조직, 난소 조직, 결장 조직, 직장 조직, 위 조직, 갑상선 조직, 후두 조직, 난소 조직, 전립선 조직, 결장직장 조직, 두부 조직, 경부 조직, 안조직, 구강 조직, 인후 조직, 식도 조직, 흉부 조직, 골조직, 고환 조직, 림프계 조직, 골수 조직, 골조직, 육종 조직, 신장 조직, 한선 조직, 간조직, 신장 조직, 뇌조직, 예를 들어 다형성 교아종 조직 등의 조직 중에서 선택된 조직 또는 기관의 것이 있다. 비제한적 일 실시예에서, 고형 종양은 결장 종양, 유방 종양, 신장 종양, 폐 종양, 전립선 종양, 난소 종양, 또는 임의의 그러한 종양의 전이이다.
본 방법은 암의 외과적 제거 및/또는 하나 이상의 항암제의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 항암제는 약학 조성물의 투여 이전에, 상기 투여와 함께, 또는 상기 투여 후에 투여될 수 있다. 항암제는 약학 조성물 전 1주일 이내에, 약학 조성물 후 1주일 이내에 투여될 수 있거나, 항암제는 약학 조성물과 동일자에 투여될 수 있다. 항암제가 약학 조성물과 동일자에 투여될 경우, 투여는 동시적일 수 있다.
암/종양의 외과적 수술 및 항암제 또는 치료제 및 본원에 제공된 조성물의 대상체에의 동시적 투여에 의한 암 또는 전이의 예방 또는 치료 방법이 본원에서 제공된다.
세포 또는 조직을 혈관신생을 억제하기에 충분한 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 치료적 유효량과 접촉시키는 단계에 의해 혈관신생을 억제하는 방법이 본원에서 제공된다.
암세포 성장을 억제하거나 암세포의 아폽토시스를 야기하기에 충분한 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 치료적 유효량과 접촉시키는 단계에 의해 암세포 성장을 억제하는 방법이 본원에서 제공된다.
조직을 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시되며, 여기서, 접촉은 혈관신생을 억제한다. 조직은 배양된 조직 생검체 샘플일 수 있거나 대상체에 존재할 수 있다.
세포 증식성 장애를 갖거나 세포 증식성 장애를 가질 위험이 있는 대상체에게 세포 증식성 장애를 치료하기에 효과적인 본원에 제공된 조성물의 유효량을 투여하는 단계에 의해 세포 증식성(예를 들어, 혈관신생) 장애를 예방 또는 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 세포 증식성 장애는 예를 들어 양성 또는 악성 고형 또는 비고형 종양일 수 있으며, 종양은 전이성 또는 비전이성일 수 있다. 치료는 대상체의 상태를 개선시킬 수 있으며, 하기 요인들 중 하나 이상이 발생했는지를 결정함으로써 평가될 수 있다: 세포 증식 감소, 세포수 감소, 아폽토시스 증가, 또는 세포 증식성 장애를 포함하는 세포의 적어도 일부분의 생존성의 감소. 이러한 발생들 중 하나 이상은 일부의 경우, 암을 부분적으로 또는 전적으로 제거하고 환자의 생존성을 연장시킬 수 있다. 임의로, 본 방법은 항암제 또는 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
환자에게 본원에 제공된 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계에 의해 환자에 있어서 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 맥락막 신혈관형성 또는 신혈관성 녹내장을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 치료는 대상체의 상태를 개선시킬 수 있으며, 하기 요인들 중 하나 이상이 발생했는지를 결정함으로써 평가될 수 있다: 황반 부종 감소, CNV 영역 감소, 또는 시력 증가.
본원에 제공된 방법에서, 대상체는 인간 또는 비인간 대상체일 수 있다. 본원에 제공된 조성물 및 항암제 또는 치료제는 환자의 건강, 질환 또는 질병의 진행, 및 치료제의 효능에 따라 단회 또는 다회 투여될 수 있다. 요법 및 치료에 대한 조정이 치료 코스 전체에 걸쳐 행해질 수 있다.
조성물은 예를 들어 피하, 피하, 초자체내, 피내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 근육내 주사에 의한 투여와 같이 국소 투여되거나, 국부 투여되거나, 전신 투여될 수 있다.
추가로, 본원에 개시된 인간화 항체 및 그의 항원 결합 단편은 또한 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증 또는 증식성 초자체 망막병증의 치료를 위한 공지된 요법 및/또는 화합물과 조합되어 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 예는 베바시주맙(bevacizumab)(아바스틴(AVASTIN)®), 라니비주맙(ranibizumab)(루센티스(LUCENTIS)®), 아플리버셉트(aflibercept)(VEGF-트랩(Trap)), 또는 마쿠겐(Macugen)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에 기술된 투여 양식에 더하여, 인간화 항-엔도글린 항체 및 항원 결합 단편은 초자체내 경로를 통하여 투여될 수 있다. 초자체내 투여 양식의 비제한적 예는 초자체내 주사 및 초자체내 임플란트의 사용을 포함한다.
또 다른 측면은 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편의 조성물을 투여함으로써 대상체에서 만성 염증성 질환을 치료하는 것이다. 만성 염증성 질환의 비제한적 예는 IBD, 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 대장염을 포함한다.
또 다른 측면은 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편의 조성물을 투여함으로써 대상체에서 류마티스 관절염을 치료하는 것이다.
또 다른 측면은 본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편의 조성물을 투여함으로써 대상체에서 골관절염을 치료하는 것이다.
류마티스 관절염 및/또는 골관절염을 갖는 대상체의 치료는 다양한 수단에 의해 평가될 수 있으며, 이는 공개된 지침에 따라 측정할 경우 적절한 카테고리의 ACR 스코어의 개선을 포함한다.
본원에 제공된 방법들 중 임의의 것의 하나 이상의 효능을 모니터링하는 방법이 본원에서 제공된다. 용해성 엔도글린의 증가된 수준은 암 환자에 있어서 생존성 감소와 상관되었다. 따라서, 일 측면에서, 용해성 엔도글린의 수준은 요법 이전 및 요법 동안 모니터링될 수 있다. 따라서, 용해성 엔도글린 수준 감소는 치료적 양생법이 환자 치료에 효과적이라는 한 가지 징후일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태는 본 발명의 장애 치료용 의약의 제형화를 위하여 본 발명의 조성물들 중 임의의 것을 사용하는 것을 고려한다. 의약은 치료를 필요로 하는 환자/대상체의 신체적 특성을 기반으로 하여 제형화될 수 있으며, 암조직의 기(stage)를 기반으로 하여 단일 제형 또는 다중 제형으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 의약은 병원 및 클리닉에의 유통을 위하여 적절한 라벨을 갖는 적합한 의약품 패키지로 패키징될 수 있으며, 여기서, 라벨은 대상체에서 본원에 기술된 바와 같이 장애 치료 징후에 대한 것이다. 의약은 단일 또는 다중 유닛으로 패키징될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량 및 투여에 대한 설명서가 의약품 패키지에 포함될 수 있다.
테스트하고자 하는 환자 유래의 고형 종양의 암세포 또는 혈장의 샘플을 제공하고, 발현이 혈관신생 억제제에 대한 민감성 또는 내성과 상관된 유전자 생성물 또는 유전자의 패널로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현을 샘플에서 검출하고, 환자 샘플에서 검출된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 혈관신생 억제제에 대한 민감성 또는 내성과 상관된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준과 비교하는 진단 방법이 본원에서 제공되며, 여기서, 상기 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물은 VEGF, VEGF 수용체, HIF-1α, 태반 성장 인자 수용체 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 혈관신생 억제제는 VEGF 수용체 억제제, VEGF 억제제 및 엔도글린 억제제로부터 선택된다.
암세포 또는 인간 혈장의 샘플에서 혈관신생 억제제에 대한 민감성 또는 내성과 상관된 유전자의 발현 수준의 검출을 위한 키트가 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 유전자는 VEGF, VEGF 수용체, HIF-1α, 태반 성장 인자 수용체 및 엔도글린으로부터 선택된다.
참고로 포함시킴
본원에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은, 달리 구체적으로 나타내지 않으면 마치 개개의 간행물 또는 특허 출원이 그 전문이 참고로 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 나타내어지는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 본 출원은 2010년 3월 30일에 생성된, 파일 크기가 67,843 킬로바이트(KB)인 서열 목록 텍스트 파일 "35882-706-202-SeqList.txt"로서 본원과 동시에 제출된 아미노산 서열에 대한 참조를 포함한다. 전술한 서열 목록은 37 C.F.R. § 1.52(e)(5)에 따라 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
도 1은 인간 서열 02-VΚ1-39의 프레임워크 영역(framework region, FR) 1-3과 인간 JΚ4 서열(서열 번호 4)(모두 볼드체) 유래의 프레임워크 영역 4 사이에 그래프팅된 단클론 쥐과 키메라 TRC105 VL CDR(밑줄 침)을 갖는 인간화 02-VΚ1-39 가변(VL) 경쇄를 제공한다. 인간 FR에 대하여 행해질 수 있는 변이는 카밧 넘버링 시스템을 이용하면 서열(서열 번호 86에 개시된 서열)의 1, 3, 4, 5, 36, 46, 47, 60, 70, 71, 100, 및 106 위치에 나타내어져 있다(인간화 서열 아래에 이탤릭체로 예시됨).
도 2는 인간 서열 VH3-15의 프레임워크 영역(FR) 1-3과 인간 JH4 서열(서열 번호 42)(모두 볼드체) 유래의 프레임워크 영역 4 사이에 그래프팅된 단클론 쥐과 단클론 쥐과 키메라 TRC105 VH CDR(밑줄 침)을 갖는 인간화 VH3-15 가변(VH) 중쇄를 제공한다. 인간 FR에 대하여 행해질 수 있는 하나 이상의 변이는 카밧 넘버링 시스템을 이용하면 서열(서열 번호 87에 개시된 서열)의 49, 76, 77, 78, 82a, 89, 94, 108, 109, 및 113 위치에 나타내어져 있다(인간화 서열 아래에 이탤릭체로 예시됨).
도 3은 TGF-β/ALK5 신호전달 경로의 다이아그램을 제공한다. TGF-β/ALK5 경로 (A)는 세포 증식 및 이동의 억제에 이르게 된다. TGF-β/ALK1 경로 (B)는 내피 세포 증식 및 이동을 유도하며 ALK1 신호전달을 위하여 CD105(엔도글린)를 필요로 한다. 점선은 불활성 경로 또는 차단된 경로를 나타낸다. 굵은 화살표는 신호전달 경로의 자극을 나타낸다.
도 4는 본원에 기술된 발명에 따라 생성된 예시적인 마우스 및 인간화 VK 사슬(제시된 순서대로 각각 서열 번호 1-5) 및 VH 사슬(제시된 순서대로 각각 서열 번호 39-43)의 아미노산 서열 정렬을 제공한다.
도 5는 본원에 기술된 발명에 따라 생성된 예시적인 마우스 및 수퍼인간화(super-humanized) VK 사슬(제시된 순서대로 각각 서열 번호 1 및 69-72) 및 VH 사슬(제시된 순서대로 각각 서열 번호 39 및 73-75)의 아미노산 서열 정렬을 제공한다.
도 6은 본원에 기술된 발명에 따라 생성된 예시적인 마우스 및 인간화 및 수퍼인간화 VK 사슬(제시된 순서대로 각각 서열 번호 1, 3 및 70) 및 VH 사슬(제시된 순서대로 각각 서열 번호 39, 41 및 74)의 아미노산 서열 정렬 및 비교를 제공한다.
도 7은 경쟁 ELISA 분석법에서 인간화된 변이체형 구성체가 엔도글린에 결합하는 것을 예시한다.
도 8. 인간화 및 인간화/탈면역화(deimmunized) 항체를 이용한 항-CD105 경쟁 ELISA. 다양한 농도의 각각의 항체를 고정된 농도의 비오티닐화 기준 항-CD105 항체(6.25 ng/ml)와 혼합하고, 넝크 맥시소프(넝크 MaxiSorp) 플레이트상에 포획된 CD105(100 ng/ml)에 결합시켰다. 결합은 스트렙타비딘-HRP 및 TMB 기질을 통하여 검출하였다. 450 nm에서의 흡광도(OD)를 플레이트 판독기에서 측정하고, 이를 테스트 항체 농도에 대하여 도시하였다.
도 9는 대조군을 포함하는 VK2 + 변이체형 VΚ1AAVH1A의 결합 분석 데이터를 도시한다.
도 10은 VΚ1AAVH1A2 및 VK2AAVH1A2와 비교한 키메라의 결합 분석 데이터를 도시한다.
도 11은 VK2AAVH1Q와 비교한 키메라의 결합 분석 데이터를 도시한다.
도 12는 VK2AAVH1R과 비교한 키메라의 결합 분석 데이터를 도시한다.
도 13은 VΚ1AAVH1A2와 비교한 키메라의 결합 분석 데이터를 도시한다.
도 14는 VK1AAVH1Q와 비교한 키메라의 결합 분석 데이터를 도시한다.
도 15는 VΚ1AAVH1R과 비교한 키메라의 결합 분석 데이터를 도시한다.
도 16은 VK2AAVH1A2와 비교한 키메라의 결합 분석 데이터를 도시한다.
도 17은 볼드체의 그리고 밑줄이 그어진 CDR을 갖는 리드 인간화 탈면역화 중쇄 가변 영역(서열 번호 89에 개시된 서열)을 도시한다. 만들어질 수 있는 변이는 카밧 넘버링 시스템을 이용하여 확인된 서열 위치에 나타내어진다(서열 번호 116에 개시된 서열)(인간화 서열 아래에 이탤릭체로 예시됨). 변이는 단일 돌연변이로서 또는 하나 초과의 돌연변이로서 만들어질 수 있으며, 변이는 임의의 조합의 돌연변이에 의해 만들어질 수 있다.
도 18은 볼드체의 그리고 밑줄이 그어진 CDR을 갖는 리드 인간화 탈면역화 경쇄 가변 영역(서열 번호 93에 개시된 서열)을 도시한다. 만들어질 수 있는 변이는 카밧 넘버링 시스템을 이용하여 확인된 서열 위치에 나타내어진다(서열 번호 117에 개시된 서열)(인간화 서열 아래에 이탤릭체로 예시됨). 변이는 단일 돌연변이로서 또는 하나 초과의 돌연변이로서 만들어질 수 있으며, 변이는 임의의 조합의 돌연변이에 의해 만들어질 수 있다.
도 19는 아이토프(iTope)TM를 이용한 중쇄(서열 번호 41)의 영역들의 분석을 도시한다. 전체 서열을 스패닝하는(spanning) 펩티드는 하나의 아미노산의 증분으로 9량체(9mer) 펩티드로서 테스트하였다. 코어 9량체 펩티드의 p1 앵커(anchor)로서의 각각의 잔기의, MHC 클래스 II 대립유전자에의 예측된 결합은, 결합 스코어가 0.55-0.6일 경우 "O"로, 그리고 결합 스코어가 >0.6일 경우 "X"로 나타낸다. 잠재적 면역원성 펩티드를 함유하는 영역은 "아이토프" 컬럼에 나타내며, 짙은 회색은 무차별적인 높은 친화도의 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 나타내며, 연한 회색은 무차별적인 중위의 친화도의 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 나타낸다. 결합할 것으로 예측되는 MHC 클래스 II 대립유전자의 수는 "총계" 및 "높은 친화도"의 컬럼에 예시된다. 생식세포계 서열로 확인된 잠재적 p1 앵커 잔기는 "서열" 컬럼에 역의 유형으로 예시된다.
도 20은 아이토프TM를 이용한 중쇄의 변이체(서열 번호 118)의 변이 영역들의 분석을 도시한다. 전체 서열을 스패닝하는 펩티드는 하나의 아미노산의 증분으로 9량체 펩티드로서 테스트하였다. 코어 9량체 펩티드의 p1 앵커로서의 각각의 잔기의, MHC 클래스 II 대립유전자에의 예측된 결합은, 결합 스코어가 0.55-0.6일 경우 "O"로, 그리고 결합 스코어가 >0.6일 경우 "X"로 나타낸다. 잠재적 면역원성 펩티드를 함유하는 영역은 "아이토프" 컬럼에 나타내며, 짙은 회색은 무차별적인 높은 친화도의 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 나타내며, 연한 회색은 무차별적인 중위의 친화도의 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 나타낸다. 결합할 것으로 예측되는 MHC 클래스 II 대립유전자의 수는 "총계" 및 "높은 친화도"의 컬럼에 예시되며, 결합에 대한 차이가 예시된다. 생식세포계 서열로 확인된 잠재적 p1 앵커 잔기는 "서열" 컬럼에 역의 유형으로 예시되며, 변이체에서의 아미노산 차이는 박스로 처리되어 있다.
도 21은 아이토프TM를 이용한 경쇄(서열 번호 3)의 영역들의 분석을 도시한다. 전체 서열을 스패닝하는 펩티드는 하나의 아미노산 증분으로 9량체 펩티드로서 테스트하였다. 코어 9량체 펩티드의 p1 앵커로서의 각각의 잔기의, MHC 클래스 II 대립유전자에의 예측된 결합은, 결합 스코어가 0.55-0.6일 경우 "O"로, 그리고 결합 스코어가 >0.6일 경우 "X"로 나타낸다. 잠재적 면역원성 펩티드를 함유하는 영역은 "아이토프" 컬럼에 나타내며, 짙은 회색은 무차별적인 높은 친화도의 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 나타내며, 연한 회색은 무차별적인 중위의 친화도의 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 나타낸다. 결합할 것으로 예측되는 MHC 클래스 II 대립유전자의 수는 "총계" 및 "높은 친화도"의 컬럼에 예시된다. 생식세포계 서열로 확인된 잠재적 p1 앵커 잔기는 "서열" 컬럼에 역의 유형으로 예시된다.
도 22는 아이토프TM를 이용한 경쇄(서열 번호 101)의 변이 영역들의 분석을 도시한다. 전체 서열을 스패닝하는 펩티드는 하나의 아미노산의 증분으로 9량체 펩티드로서 테스트하였다. 코어 9량체 펩티드의 p1 앵커로서의 각각의 잔기의, MHC 클래스 II 대립유전자에의 예측된 결합은, 결합 스코어가 0.55-0.6일 경우 "O"로, 그리고 결합 스코어가 >0.6일 경우 "X"로 나타낸다. 잠재적 면역원성 펩티드를 함유하는 영역은 "아이토프" 컬럼에 나타내며, 짙은 회색은 무차별적인 높은 친화도의 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 나타내며, 연한 회색은 무차별적인 중위의 친화도의 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 나타낸다. 결합할 것으로 예측되는 MHC 클래스 II 대립유전자의 수는 "총계" 및 "높은 친화도"의 컬럼에 예시되며, 결합에 대한 차이가 예시된다. 생식세포계 서열로 확인된 잠재적 p1 앵커 잔기는 "서열" 컬럼에 역의 유형으로 예시되며, 변이체에서의 아미노산 차이는 박스로 처리되어 있다.
도 23은 세계의 모집단 및 연구 모집단에서의 MHC 클래스 II 알로타입(allotype)의 빈도를 도시한다.
도 24에서는 키메라 항-엔도글린 항체, 인간화 항-엔도글린 항체 VΚ1VH1 및 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 VΚ1AAVH1A2를 20명의 공여자 유래의 PBMC를 이용하여 에피스크린(Episcreen)TM 타임 코스의 T 세포 분석법에서 테스트하였다. 테스트 항체와 함께 인큐베이션한 PBMC의 벌크(bulk) 배양물을 5일, 6일, 7일 및 8일에 샘플링하고, 3H-티미딘으로 펄싱하였다. 세포를 수확하고, 방사능의 혼입을 신틸레이션 카운팅(scintillation counting)에 의해 측정하였다. 각각의 삼중 샘플에 있어서의 결과를 평균하고, 자극 지수(Stimulation Index, SI)로의 환산에 의해 정규화하였다. 각각의 공여자에서의 각각의 시점에 있어서의 SI는 키메라 항체 TRC105(도 24a), VΚ1VH1(도 24b) 및 VΚ1AAVH1A2(도 24c)의 경우 위에 예시된다. SI가 2 이상인 양성 반응 결정에 있어서의 컷오프(cut-off)는 점선에 의해 강조되며, 유의한 반응(스튜던트 t-검정(student's t-test)에서 p<0.05)이 나타내어져 있다(*).
본 출원은 특정 제형 또는 공정 파라미터에 한정되지 않음을 이해하여야 하며, 그 이유는 이들이 물론 다양할 수 있기 때문이다. 본원에서 사용되는 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이며, 한정하고자 하는 것은 아님을 또한 이해하여야 한다. 또한, 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 다수의 방법 및 재료가 본 발명의 실시에서 이용될 수 있음이 이해된다.
본 출원에 따르면, 당업계의 기술 이내의 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다. 그러한 기술은 전적으로 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989)]; 문헌["Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]]; 문헌["Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]]; 문헌["Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]]; 문헌["Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984)]; 문헌["Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]]; 문헌["Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]]; 문헌["Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]]; 문헌["Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]]; 문헌[B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)]을 참조하는데, 이들 각각은 구체적으로 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
쥐과 단클론 항체(mAb)가 엔도글린에 대하여 생성되었으며, 상기 항체는 엔도글린 활성을 조정하고 그에 의해 혈관신생을 억제하고/하거나 소혈관의 혈관 확장을 억제한다. 이들 쥐과 항체는 미국 특허 제5,928,641호, 미국 특허 제6,200,566호, 미국 특허 제6,190,660호, 및 미국 특허 제7,097,836호에 개시되어 있으며, 상기 미국 특허는 그 전문이 본원에 포함된다. 추가로, 다수의 이들 항체의 생체외 및 생체내 효율이 입증되었으며, 엔도글린에 결합하는 이들 단클론 항체는 엔도글린 조정 화합물로서 흥미롭다. 그러나 이들 쥐과 항체의 치료적 사용은 실현가능하지 않으며, 그 이유는 그의 투여가 예를 들어 인간 항-마우스 항체(human anti-mouse antibody, HAMA)의 형태에서의 면역원성을 포함하는 다수의 제한을 갖기 때문이다. 인간화 항체가 이들 반응에 대처하기 위하여 만들어진다.
엔도글린에 결합하는 인간화 항체가 본원에 개시되며, 이는 그의 특이성이 유지되고/되거나 개선되면서 감소된 면역원성을 나타낸다. 추가로, 쥐과 항체와 관련된 문제에 대처하기 위하여, 엔도글린에 결합하여 혈관신생을 감소 및/또는 억제시키는 인간화 항체가 본원에 개시되며, 이는 그의 특이성이 유지되고/되거나 개선되면서 감소된 면역원성을 나타낸다. 이들 인간화 엔도글린 항체는 엔도글린의 정제 및 검출에 유용할 뿐만 아니라 다양한 질병 및 질환의 진단 및 치료에도 유용하다.
I. 항- 엔도글린 항체
엔도글린에 결합하는 인간화 항체 및 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다. 엔도글린은 새로운 맥관구조의 성장을 촉진하고 있는 그리고 그의 일부가 되는 세포뿐만 아니라 기존의 맥관구조를 포함하고 지지하는 세포 상에서도 발견될 수 있다. 이들 항체 및 항원 결합 단편은 엔도글린에 결합하고 그에 의해 혈관신생을 억제하고/하거나, 기존의 맥관구조 또는 기존의 맥관구조의 유지를 억제하고/하거나, 소혈관 확장을 억제할 수 있다. 이하, "항체" 또는 "항체들"이라는 용어의 언급은 본원에 개시된 항원 결합 단편들 중 임의의 것을 포함하는 것으로 간주되어야 하며, 상기 용어는 응용가능할 경우 상호교환가능하다. 이들 항체는, 엔도글린 정제에 있어서의 그의 사용에 더하여, 정제, 검출 및 진단 목적과, 치료 목적에 유용하다. 본원에 제공된 항체는 다양한 질병 및 질환의 치료용의 의약의 제형에 사용될 수 있다. 본원에 사용될 때, 혈관신생은 새로운 혈관의 성장 및/또는 발달(신혈관형성으로도 칭해짐), 소혈관의 확장, 과도한 또는 장기적인 혈관 성장, 및 기존의 맥관구조의 유지를 포함한다. 혈관신생 질병 및 질환은 혈관신생에 관련된, 그에 의해 야기된 또는 그와 관련된 질환 및 질병을 나타낸다. 그러한 질환의 비제한적 예는 예를 들어 혈관신생/신혈관 형성을 특징으로 하는 다양한 형태의 안질환(예를 들어, 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 신병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 및 다양한 형태의 암(원발성 종양 및 전이)을 포함한다.
A. 항체 용어
본원에 사용될 때, "항체"라는 용어는 천연이든지 부분적으로 또는 전적으로 합성 제조된 것이든지간에 면역글로불린(Ig)을 나타낸다. 또한 상기 용어는 항원 결합 도메인이거나 항원 결합 도메인에 대하여 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 커버한다. 상기 용어는 "항원 결합 단편" 및 하기에 기술하는 것과 같은 유사 결합 단편에 대한 다른 상호교환가능한 용어를 추가로 포함한다. 상보성 결정 영역(CDR) 그래프팅된 항체 및 기타 인간화 항체(CDR 변형 및 프레임워크 영역 변형을 포함함)가 이 용어에 의해 또한 고려된다.
천연 항체 및 천연 면역글로불린은 일반적으로 약 150,000 달톤의 헤테로사량체형 당단백질로서, 이는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된다. 각각의 경쇄는 전형적으로 하나의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 디술피드 결합의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄들 사이에서 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 이격된 사슬내 디술피드 가교체를 또한 갖는다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인("VH"), 이어서 다수의 불변 도메인("CH")을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인("VL"), 그리고 그의 다른 말단에 불변 도메인("CL")을 가지며, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 나란히 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 나란히 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 인터페이스(interface)를 형성하는 것으로 여겨진다.
본원에 사용될 때, "합성 폴리뉴클레오티드", "합성 유전자" 또는 "합성 폴리펩티드"라는 용어는 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부, 또는 아미노산 서열 또는 그의 일부가, 동등한 자연 발생 서열과 비교하여 디자인된, 또는 드노보식으로(de novo) 합성된, 또는 변형된 서열로부터 유래됨을 의미한다. 합성 폴리뉴클레오티드 (항체 또는 항원 결합 단편) 또는 합성 유전자는 핵산 또는 아미노산 서열의 화학적 합성을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 합성 유전자는 전형적으로 아미노산, 또는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 수준에서 (또는 이들 둘 모두에서) 자연 발생 유전자와 상이하며, 전형적으로 합성 발현 제어 서열의 정황 내에 위치한다. 예를 들어, 합성 유전자 서열은 예를 들어 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 대체, 결실, 또는 부가에 의해 변화됨으로써 소스(source) 서열과 상이한 항체 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 코딩 서열을 제공하는 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 합성 유전자 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 유전자와 비교하여 상이한 아미노산을 갖는 단백질을 반드시 코딩할 필요는 없을 수도 있으며, 예를 들어, 합성 유전자 폴리뉴클레오티드 서열은 상이한 코돈을 포함하지만 동일한 아미노산을 코딩하는(즉, 뉴클레오티드 변화는 아미노산 수준에서 사일런트(silent) 돌연변이를 나타냄) 합성 폴리뉴클레오티드 서열을 또한 포함할 수 있다.
항체와 관련하여, "가변 도메인"이라는 용어는 각각의 특정 항체의, 그의 특정 항원에 대한 특이성 및 결합에 사용되는 항체의 가변 도메인을 나타낸다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 오히려, 가변성은 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 내의 초가변 영역(CDR로도 공지됨)으로 불리우는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 "프레임워크 영역" 또는 "FR"로 불리운다. 비변형 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 4개의 FR(FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 함유하며, 이는 루프 연결부, 그리고 일부의 경우 β-시트 구조를 형성하는 3개의 CDR이 산재된 β-시트 배열을 주로 채용한다. 각각의 사슬 내의 CDR은 FR에 의해 다른 사슬 유래의 CDR과 함께 결합되어, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669] 참조).
본원에 사용될 때 "초가변 영역" 및 "CDR"이라는 용어는 항원 결합에 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR은 항원에 상보적인 방식으로 결합하는 3개의 서열 영역으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, VH 및 VL 사슬 각각에 있어서 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 공지되어 있다. 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 따르면 경쇄 가변 도메인에 있어서 전형적으로 CDR은 대략적으로 잔기 24-34(CDRL1), 50-56(CDRL2) 및 89-97(CDRL3)에 상응하며, 중쇄 가변 영역에 있어서 전형적으로 CDR은 대략적으로 잔기 31-35(CDRH1), 50-65(CDRH2) 및 95-102(CDRH3)에 상응한다. 상이한 항체의 CDR은 삽입을 포함할 수도 있으며, 따라서 아미노산 넘버링이 상이할 수도 있음이 이해된다. 카밧 넘버링 시스템은 상이한 항체들 사이에서 넘버링에 있어서 임의의 삽입을 반영하기 위하여 특정 잔기에 덧붙여진 문자를 이용하는 넘버링 방법을 이용하여 그러한 삽입을 설명한다(예를 들어, 경쇄 내의 CDRL1의 27A, 27B, 27C, 27D, 27E, 및 27F). 대안적으로, 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol, 196: 901-917 (1987)]에 따르면 경쇄 가변 도메인에 있어서 전형적으로 CDR은 대략적으로 잔기 26-32(CDRL1), 50-52(CDRL2) 및 91-96(CDRL3)에 상응하며, 중쇄 가변 도메인에 있어서 전형적으로 CDR은 대략적으로 잔기 26-32(CDRH1), 53-55(CDRH2) 및 96-101(CDRH3)에 상응한다.
본원에 사용될 때, "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 항원 결합 포켓(pocket) 또는 홈(groove)의 일부분을 형성하는 프레임워크 아미노산 잔기를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 잔기는 항원 결합 포켓 또는 홈의 일부분인 루프를 형성하며, 루프 내의 아미노산 잔기는 항원과 접촉할 수도 있고 접촉하지 않을 수도 있다. 프레임워크 영역은 일반적으로 CDR들 사이의 영역을 포함한다. 문헌[Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 따르면, 경쇄 가변 도메인에 있어서 전형적으로 FR은 대략적으로 잔기 0-23(FRL1), 35-49(FRL2), 57-88(FRL3), 및 98-109에 상응하며 중쇄 가변 도메인에 있어서 전형적으로 FR은 대략적으로 잔기 0-30(FRH1), 36-49(FRH2), 66-94(FRH3), 및 103-133에 상응한다. 경쇄에 대한 카밧 넘버링에서 상기에 논의된 바와 같이, 중쇄가 유사한 방식으로 삽입에 대하여 또한 설명된다(예를 들어, 중쇄 내의 CDRH1의 35A, 35B). 대안적으로, 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol, 196: 901-917 (1987)]에 따르면, 경쇄 가변 도메인에 있어서 전형적으로 FR은 대략적으로 잔기 0-25(FRLl), 33-49(FRL2) 53-90(FRL3), 및 97-109(FRL4)에 상응하며, 중쇄 가변 도메인에 있어서 전형적으로 FR은 대략적으로 잔기 0-25(FRH1), 33-52(FRH2), 56-95(FRH3), 및 102-113(FRH4)에 상응한다.
FR의 루프 아미노산은 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄의 3차원 구조의 조사에 의해 평가 및 결정될 수 있다. 3차원 구조는 용매 접근가능한 아미노산 위치에 대하여 분석될 수 있으며, 그 이유는 그러한 위치가 항체 가변 도메인 내에 항원 접촉부를 제공하고/하거나 루프를 형성할 가능성이 있기 때문이다. 용매 접근가능한 위치들 중 일부는 아미노산 서열 다양성을 견딜 수 있으며, 다른 것(예를 들어, 구조적 위치)은 일반적으로 덜 다양화되어 있다. 항체 가변 도메인의 3차원 구조는 결정 구조 또는 단백질 모델링으로부터 유도될 수 있다.
항체의 불변 도메인(Fc)은 직접적으로 항원에의 항체 결합에 연루되지 않으며, 오히려 예를 들어 Fc 수용체와의 상호작용을 통한 항체 의존성 세포 독성에서의 항체의 참여와 같이 다양한 이펙터(effector) 기능을 나타낸다. Fc 도메인은 환자에게 투여된 후 순환 중 항체의 생체이용성을 또한 증가시킬 수 있다.
면역글로불린은, 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스에 할당될 수 있다. 면역글로불린의 5가지의 주요 클래스, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위클래스(이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인(Fc)은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 칭해진다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 공지되어 있다.
임의의 척추 동물 종 유래의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 하여 카파 또는 ("κ" 또는 "Κ") 및 람다 또는 ("λ")로 칭해지는 2가지의 명백하게 특유한 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
"항체의 항원 결합 부분", "항원 결합 단편", "항원 결합 도메인", "항체 단편" 또는 "항체의 기능성 단편"이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편을 나타내기 위하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 그러한 용어 내에 포함되는 항체 단편의 비제한적 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교체에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 함유하는 이가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 함유하는 Fv 단편; (v) VH 도메인을 함유하는 dAb 단편(문헌[Ward et al, (1989) Nature 341 :544 546]); 및 (vi) 단리된 CDR을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 포함하는 "원하프" 항체가 이 정의 내에 추가로 포함된다. 다른 형태의 단일쇄 항체, 예컨대 다이아바디가 또한 본원에 포함된다.
"F(ab')2" 및 "Fab"' 모이어티는 Ig를 프로테아제, 예컨대 펩신 및 파파인으로 처리함으로써 생성될 수 있으며, 각각의 두 중쇄 내의 힌지 영역들 사이에 존재하는 디술피드 결합 근처에서 면역글로불린을 절단함으로써 생성되는 항체 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 파파인은 각각의 두 중쇄 내의 힌지 영역들 사이에 존재하는 디술피드 결합의 상류에서 IgG를 절단하여 2개의 상동성 항체 단편을 생성하며, 여기서, VL 및 CL(경쇄 불변 영역)로 구성된 경쇄, 및 주왜의 불변 영역 내의 VH 및 CH γ1(γ1) 영역으로 구성된 중쇄 단편은 그의 C 말단 영역에서 디술피드 결합을 통하여 연결된다. 이들 2개의 상동성 항체 단편 각각은 Fab'로 칭해진다. 또한 펩신은 각각의 두 중쇄 내의 힌지 영역들 사이에 존재하는 디술피드 결합의 하류에서 IgG를 절단하여 2개의 전술한 Fab'가 힌지 영역에서 연결된 단편보다 약간 더 큰 항체 단편을 생성한다. 이 항체 단편은 F(ab')2로 칭해진다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역로부터의 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하여 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에서의 몇 개의 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이해지게 된다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 본원에서의 표기이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 Fab' 단편 쌍으로 생성되었으며, 이는 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
"Fv"는 전 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 항체 단편을 나타낸다. 이 영역은 타이트한(tight), 비공유적 또는 공유적 회합 상태의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진다(디술피드 연결된 Fv가 당업계에 기술되었다(문헌[Reiter et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 1239-1245])). 그것은 이러한 배열로 존재하여서 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 규정하도록 상호작용하게 된다. 총체적으로, VH 및 VL 사슬 각각으로부터의 CDR들 중 하나 이상의 조합은 항원 결합 특이성을 항체에 부여한다. 예를 들어, CDRH3 및 CDRL3은 예를 들어 수령 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VH 및 VL 사슬에 전달될 때 항체에 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있으며 CDR들의 이러한 조합은 본원에 기술된 임의의 기술을 이용하여 결합, 친화도 등에 대하여 테스트될 수 있음이 이해된다. 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)도, 비록 제2 가변 도메인과 조합될 때보다 더 낮은 친화도일 가능성이 있을지라도, 항원을 인식하여 그에 결합하는 능력을 갖는다. 더욱이, Fv 단편의 2개의 도메인(VL 및 VH)은 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 상기 도메인들은 이들이 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있으며, 여기서, VL 및 VH 영역은 쌍을 생성하여 일가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로 알려짐)를 형성한다(문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; 문헌[Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; 및 문헌[Osbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:778]). 그러한 scFv는 또한 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포함시키고자 한다. 특정 scFv의 임의의 VH 및 VL 서열은 완전 Ig(예를 들어, IgG) 분자 또는 다른 이소타입을 코딩하는 발현 벡터를 생성하기 위하여 Fc 영역 cDNA 또는 게놈 서열에 연결될 수 있다. 또한 VH 및 VL은 단백질 화학 또는 재조합 DNA 기술 중 어느 하나를 이용한 Ig의 Fab, Fv 또는 다른 단편의 생성에 사용될 수 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 있어서 요망되는 구조를 형성할 수 있게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 대한 개관의 경우, 예를 들어 문헌[Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
"아비머TM"라는 용어는 항체 및 항체 단편과 관련이 없고 A 도메인(클래스 A 모듈(module), 보체형 반복체, 또는 LDL 수용체 클래스 A 도메인으로도 칭해짐)으로 칭해지는 몇몇 모듈형의 재사용가능한 도메인으로 구성된, 인간 기원의 치료 단백질 클래스를 나타낸다. 이는 시험관내 엑손 셔플링(exon shuffling) 및 파지 디스플레이(phage diSp1ay)에 의해 인간 세포외 수용체 도메인으로부터 개발되었다(문헌[Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23: 1493-1494]; 문헌[Silverman et al, 2006, Nat. Biotechnol. 24:220]). 생성된 단백질은 단일 에피토프 결합 단백질과 비교하여 개선된 친화도(일부의 경우, 나노몰 미만의(sub-nanomolar) 친화도) 및 특이성을 나타낼 수 있는 다수의 독립적인 결합 도메인을 함유할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제2005/0221384호, 미국 특허 공개 제2005/0164301호, 미국 특허 공개 제2005/0053973호, 미국 특허 공개 제2005/0089932호, 미국 특허 공개 제2005/0048512호, 및 미국 특허 공개 제2004/0175756호를 참조하는데, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
공지된 217개의 인간 A 도메인 각각은 대략 35개의 아미노산을 포함하며(대략 4 kDa); 이들 도메인은 길이가 평균 5개의 아미노산인 링커에 의해 분리된다. 천연 A 도메인은 주로 칼슘 결합 및 디술피드 형성에 의해 매개되는 균일하고 안정한 구조로 빠르게 그리고 효율적으로 폴딩된다. 단지 12개 아미노산의 보존된 스캐폴드 모티프(scaffold motif)가 이러한 일반적인 구조에 요구된다. 최종 결과는 다수의 도메인을 함유하는 단일 단백질 사슬인데, 상기 도메인 각각은 별도의 기능을 나타낸다. 단백질의 각각의 도메인은 독립적으로 결합하며, 각각의 도메인의 정력적인 기여는 상가적이다. 이들 단백질은 친화성 다량체(avidity multimer)로부터 "아비머TM"로 칭해졌다.
"다이아바디"라는 용어는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내며, 상기 단편은 동일 펩티드 사슬(VH-VL) 내에 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일 사슬 상에서의 두 도메인 사이의 쌍 생성을 허용하기에는 너무 짧은 링커의 사용에 의해, 상기 도메인들은 또 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 쌍을 생성하게 되어 2개의 항원 결합 부위를 생성한다. 다이아바디는 예를 들어 유럽 특허 제404,097호; 국제 특허 공개 제WO 93/11161호; 및 문헌[Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 6448 (1993)]에 더욱 충분히 기술되어 있다.
항원 결합 폴리펩티드는 예를 들어 카멜리드 및 상어 유래의 항체와 같은 중쇄 이량체를 또한 포함한다. 카멜리드 및 상어 항체는 V 유사 및 C 유사 도메인(어느 것도 경쇄를 갖지 않음)의 두 사슬의 호모이량체형 쌍을 포함한다. 카멜리드에 있어서 중쇄 이량체 IgG의 VH 영역은 경쇄와 소수성 상호작용을 만들 필요가 없기 때문에, 보통 경쇄와 접촉하는 중쇄 내의 영역은 카멜리드에 있어서 친수성 아미노산 잔기로 변화된다. 중쇄 이량체 IgG의 VH 도메인은 VHH 도메인으로 칭해진다. 상어 Ig-NAR은 하나의 가변 도메인(V-NAR 도메인이라고 부름) 및 5개의 C 유사 불변 도메인(C-NAR 도메인)의 호모이량체를 포함한다. 카멜리드에 있어서, 항체 레파토리의 다양성은 VH 또는 VHH 영역 내의 CDR 1, 2 및 3에 의해 결정된다. 낙타 VHH 영역 내의 CDR3은 평균 16개의 아미노산인 그의 상대적으로 긴 길이를 특징으로 한다(문헌[Muyldermans et al., 1994, Protein Engineering 7(9): 1129]). 이는 많은 다른 종의 항체의 CDR3 영역과는 대조적이다. 예를 들어, 마우스 VH의 CDR3은 평균 9개의 아미노산을 갖는다. 카멜리드의 가변 영역의 생체내 다양성을 유지하는 카멜리드 유래된 항체 가변 영역의 라이브러리는 예를 들어 미국 특허 출원 제20050037421호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다.
비인간(예를 들어, 쥐과) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 Ig로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체를 포함한다. 대부분, 인간화 항체는 수령체의 CDR들 중 하나 이상이 요망되는 특이성, 친화도 및 결합 기능을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종의 항체(공여체(도너) 항체) 유래의 CDR로 대체된 인간 Ig(수령체 항체)이다. 일부의 경우, 인간 Ig의 하나 이상의 FR 아미노산 잔기는 상응하는 비인간 아미노산 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 함유할 수 있다. 이들 변형은 필요할 경우 항체 성능을 개량하기 위하여 행해질 수 있다. 인간화 항체는 적어도 하나의, 그리고 일부의 경우 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 수 있으며, 여기서, 전부의 또는 실질적으로 전부의 가변 영역은 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 전부의 또는 실질적으로 전부의 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 임의로 인간화 항체는 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분을 또한 포함할 수 있다. 상세사항에 대해서는 문헌[Jones et al, Nature 321 : 522-525 (1986)]; 문헌[Reichmann et al, Nature 332: 323-329 (1988)]; 및 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)]을 참조한다.
인간화 항체는 중쇄 및 경쇄의 CDR의 일부 또는 전부가 비인간 단클론 항체로부터 유래되고, 가변 영역의 실질적으로 모든 남아있는 부분이 인간 가변 영역 (중쇄 및 경쇄 둘 모두)으로부터 유래되고, 불변 영역이 인간 불변 영역으로부터 유래된 항체를 또한 포함한다. 일 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄의 CDR1 CDR2 및 CDR3 영역은 비인간 항체로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄의 적어도 하나의 CDR(예를 들어, CDR3)은 비인간 항체로부터 유래된다. CDR1, CDR2, 및 CDR3의 다양한 조합이 비인간 항체로부터 유래될 수 있으며, 이는 본원에서 고려된다. 비제한적 일 실시예에서, 중쇄 및 경쇄 각각의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 중 하나 이상은 쥐과 키메라 단클론 항체 클론 TRC105로부터 유래된다.
본원에 사용될 때, "단클론 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득되는 항체를 나타내며, 즉, 집단에 포함되는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대하여 유도된다. 더욱이, 상이한 결정부위(에피토프)에 대하여 유도된 상이한 항체를 포함할 수 있는 통상적인 (다클론) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대하여 유도된다. "단클론"이라는 수식어는 항체의 특징을 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된 것으로 나타내는 것이며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 파악되어서는 안된다. 예를 들어, 단클론 항체는 문헌[Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음에 기술된 하이브리도마(hybridoma) 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단클론 항체는 예를 들어 문헌[Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 및 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 설명된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
항체는 하기에 더욱 상세하게 기술되는 것과 같은 항-Ig 컬럼 또는 단백질 A, G 또는 L 컬럼, 이온 교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52), 카프릴산법, 카프르산법, 유글로불린 침전법, 또는 포화 황산암모늄 침전법에 의해 상기에 언급된 배양 상청액 또는 복수로부터 단리 및 정제될 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 예시적인 항체로는 온전한 면역글로불린 분자, 예를 들어 인간화 항체 또는 당업계에서 Fab, Fab', F(ab)', F(ab')2, Fd, scFv, 가변 중쇄 도메인, 가변 경쇄 도메인, 가변 NAR 도메인, 2특이성(bi-specific) scFv, 2특이성 Fab2, 3특이성(tri-specific) Fab3으로 공지된 부분을 포함하여 항원 결합 부위(즉, 파라토프(paratope)) 또는 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 함유하는 인간 Ig 분자의 부분 및 단일쇄 결합 폴리펩티드 및 항원 결합 단편으로도 칭해지는 기타의 것이 있다. 면역글로불린 분자 또는 그의 단편을 구성할 때, 가변 영역 또는 그의 일부는 하나 이상의 불변 영역 또는 그의 일부에 융합되거나, 연결되거나 또는 다르게는 접합되어 본원에 개시된 임의의 항체 또는 그의 단편을 생성할 수 있다. 이는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 성취될 수 있으며, 이는 분자 클로닝 기술 또는 당해 분자를 코딩하는 핵산의 직접적인 합성을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 분자를 구성하는 예시적인 비제한적 방법이 본원에 기술된 실시예에서 또한 발견될 수 있다.
예시적인 일 실시양태에서, 본 출원은 엔도글린에 결합하고 임의로 면역글로불린 Fc 영역을 갖는, 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 갖는 단일쇄 결합 폴리펩티드를 고려한다. 예시적인 일 실시양태에서, 본 출원은 엔도글린에 결합하고 혈관신생을 억제하고 임의로 면역글로불린 Fc 영역을 갖는, 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 갖는 단일쇄 결합 폴리펩티드를 고려한다. 그러한 분자는 면역글로불린 Fc 영역의 존재를 통하여 임의로 이펙터 기능 또는 증가된 반감기를 갖는 단일쇄 가변 단편이다. 단일쇄 결합 폴리펩티드의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 출원 제2005/0238646호).
"생식세포계 유전자 세그먼트" 또는 "생식세포계 서열"이라는 용어는 생식세포계(반수체형 생식체 및 그로부터 형성된 이배체 세포) 유래의 유전자를 나타낸다. 생식세포계 DNA는 단일 Ig 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 다중 유전자 세그먼트를 함유한다. 이들 유전자 세그먼트는 생식 세포 내에 보유되지만, 이들이 기능성 유전자로 배열될 때까지는 중쇄 및 경쇄로 전사 및 번역될 수 없다. 골수에서의 B 세포 분화 동안, 이들 유전자 세그먼트는 108 초과의 특이성을 생성할 수 있는 동적 유전자 시스템에 의해 랜덤하게 셔플링된다. 대부분의 이들 유전자 세그먼트는 생식세포계 데이터베이스에 의해 공개 및 수집된다.
본원에 사용될 때, "면역반응성"은 아미노산 잔기의 서열("결합 부위" 또는 "에피토프")에 특이적이지만 다른 펩티드/단백질에 대하여 교차 반응성인 경우 인간에게의 투여용으로 제형화되는 수준에서 독성을 갖지 않는 결합 에이전트(agent), 항체 또는 그의 단편을 나타낸다. "결합"이라는 용어는 예를 들어 생리학적 조건하에서 공유적, 정전기적, 소수성, 및 이온 및/또는 수소 결합적 상호작용으로 인한, 그리고 염 가교 및 수분 가교와 같은 상호작용 및 임의의 기타 통상적인 결합 수단을 포함하는 두 분자 사이의 직접적인 회합을 나타낸다. "우선적으로 결합하는"이라는 용어는 결합 에이전트가 관계없는 아미노산 서열에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 결합 부위에 결합함을 의미한다. 바람직하게는, 그러한 친화도는 관계없는 아미노산 서열에 대한 결합 에이전트의 친화도보다 적어도 1배 더 크거나, 적어도 2배 더 크거나, 적어도 3배 더 크거나, 적어도 4배 더 크거나, 적어도 5배 더 크거나, 적어도 6배 더 크거나, 적어도 7배 더 크거나, 적어도 8배 더 크거나, 적어도 9배 더 크거나, 10배 더 크거나, 적어도 20배 더 크거나, 적어도 30배 더 크거나, 적어도 40배 더 크거나, 적어도 50배 더 크거나, 적어도 60배 더 크거나, 적어도 70배 더 크거나, 적어도 80배 더 크거나, 적어도 90배 더 크거나, 적어도 100배 더 크거나, 적어도 1000배 더 크다. "면역반응성" 및 "우선적으로 결합하는"이라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용될 때, "친화도"라는 용어는 두 에이전트의 가역적 결합에 있어서의 평형 상수를 나타내며, KD로 표현된다. 리간드에의 결합 단백질의 친화도, 예컨대 에피토프에 대한 항체의 친화도는 예를 들어 약 100 나노몰(nM) 내지 약 0.1 nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰(pM), 또는 약 100 nM 내지 약 1 펨토몰(fM)일 수 있다. 본원에 사용될 때, "친화력"이라는 용어는 희석 후 해리에 대한 2가지 이상의 에이전트의 복합체의 내성을 나타낸다. 겉보기 친화도는 효소 결합된 면역흡착 분석법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 또는 당업계의 숙련자에게 친숙한 임의의 기타 기술과 같은 방법에 의해 결정될 수 있다. 친화력은 스캐차드(Scatchard) 분석법 또는 당업계의 숙련자에게 친숙한 임의의 기타 기술과 같은 방법에 의해 결정될 수 있다.
"에피토프"는 항체의 가변 영역 결합 포켓과 결합 상호작용을 형성할 수 있는 항원 또는 다른 거대분자의 부분을 나타낸다. 그러한 결합 상호작용은 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기와의 분자간 접촉으로서 드러날 수 있다. 항원 결합은 예를 들어 CDR3 또는 CDR3 쌍, 또는 일부의 경우 VH 및 VL 사슬의 모든 6개까지의 CDR의 상호작용을 포함할 수 있다. 에피토프는 선형 펩티드 서열일 수 있거나(즉, "연속"), 비연접 아미노산 서열로 구성될 수 있다(즉, "배좌" 또는 "불연속"). 항체는 하나 이상의 아미노산 서열을 인식할 수 있으며, 따라서 에피토프는 하나 초과의 특유한 아미노산 서열을 규정할 수 있다. 항체에 의해 인식되는 에피토프는 당업계의 숙련자에게 공지된 서열 분석 기술 및 펩티드 맵핑(mapping)에 의해 결정될 수 있다. 결합 상호작용은 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기와의 분자간 접촉으로서 드러난다. TRC105는 미국 특허 제5,928,641호; 미국 특허 제6,200,566호; 미국 특허 제6,190,660호; 및 미국 특허 제7,097,836호에서 Y4-2F1 또는 SN6j로서 기술된 쥐과 항체와 동일한 가변 아미노산 서열인 키메라 항체이다. Y4-2F1 및 SN6j, 그리고 그에 따라 TRC105에 의해 인식되는 에피토프는 이전에 확인되었다.
"특이적"이라는 용어는 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 항원 이외에는 항체가 분자에 대한 어떠한 유의한 결합도 나타내지 않는 상황을 나타낸다. 또한 상기 용어는 예를 들어 항원 결합 도메인이 다수의 항원이 지닌 특정 에피토프에 특이적인 경우 적용가능하며, 상기의 경우, 항원 결합 도메인을 지닌 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 그 에피토프를 지닌 다양한 항원에 결합할 수 있다. "우선적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"이라는 용어는 항체 또는 그의 단편이 그가 관계없는 아미노산 서열에 결합하는 것보다 더 큰 친화도로 에피토프에 결합하며, 그 에피토프를 함유하는 다른 폴리펩티드에 대하여 교차 반응성인 경우, 이것이 인간 투여용으로 제형화되는 수준에서 독성을 갖지 않음을 의미한다. 일 측면에서, 그러한 친화도는 관계없는 아미노산 서열에 대한 항체 또는 그의 단편의 친화도보다 적어도 1배 더 크거나, 적어도 2배 더 크거나, 적어도 3배 더 크거나, 적어도 4배 더 크거나, 적어도 5배 더 크거나, 적어도 6배 더 크거나, 적어도 7배 더 크거나, 적어도 8배 더 크거나, 적어도 9배 더 크거나, 10배 더 크거나, 적어도 20배 더 크거나, 적어도 30배 더 크거나, 적어도 40배 더 크거나, 적어도 50배 더 크거나, 적어도 60배 더 크거나, 적어도 70배 더 크거나, 적어도 80배 더 크거나, 적어도 90배 더 크거나, 적어도 100배 더 크거나, 또는 적어도 1000배 더 크다. "면역반응성", "결합하는", "우선적으로 결합하는" 및 "특이적으로 결합하는"이라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. "결합하는"이라는 용어는 예를 들어 생리학적 조건하에서 공유적, 정전기적, 소수성, 및 이온 및/또는 수소 결합적 상호작용으로 인한 두 분자 사이의 직접적인 회합을 나타내며, 염 가교 및 수분 가교와 같은 상호작용과, 임의의 기타 통상적인 결합 수단을 포함한다.
"보존적 아미노산 치환"이라는 어구는 특정한 공통 특성을 기준으로 한 아미노산의 분류를 나타낸다. 개개의 아미노산 사이의 공통 특성을 규정하는 기능적 방식은 상동성 유기체의 상응하는 단백질들 사이의 아미노산 변화의 정규화된 빈도를 분석하는 것이다(문헌[Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag]). 그러한 분석법에 따르면, 아미노산 군은, 군 내의 아미노산이 우선적으로 서로와 교환되고 따라서 전체 단백질 구조에 대한 그의 영향에 있어서 서로와 가장 많이 닮게 될 경우 규정될 수 있다(문헌[(Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag]). 이러한 방식으로 규정된 아미노산 군의 예는 하기를 포함한다:
(i) Glu 및 Asp, Lys, Arg 및 His으로 이루어진 하전되는 군,
(ii) Lys, Arg 및 His으로 이루어진 양으로 하전되는 군,
(iii) Glu 및 Asp로 이루어진 음으로 하전되는 군,
(iv) Phe, Tyr 및 Trp로 이루어진 방향족 군,
(v) His 및 Trp로 이루어진 질소 고리 군,
(vi) Val, Leu 및 Ile로 이루어진 큰 지방족 비극성 군,
(vii) Met 및 Cys로 이루어진 약간 극성인 군,
(viii) Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gin 및 Pro로 이루어진 소형 잔기 군,
(ix) Val, Leu, Ile, Met 및 Cys로 이루어진 지방족 군, 및
(x) Ser 및 Thr로 이루어진 소형 히드록실 군.
상기에 제시된 군에 더하여, 각각의 아미노산 잔기는 그 자신의 군을 형성할 수 있으며, 개개의 아미노산에 의해 형성된 군은 상기에 기술된 바와 같이 당업계에서 일반적으로 사용되는 그 아미노산에 대한 1문자 및/또는 3문자 약어에 의해 단순히 나타내어질 수 있다.
"보존된 잔기"는 일련의 유사 단백질들에 걸쳐 상대적으로 변함이 없는 아미노산이다. 흔히 보존된 잔기는 "보존적 아미노산 치환"에 대하여 상기에 기술된 바와 같이 유사 아미노산으로 대체됨에 의해서만 변한다.
본원에서 아미노산 서열에서 사용되는 "x" 또는 "xaa"라는 문자는 달리 구체적으로 나타내지 않으면 20가지의 표준 아미노산 중 임의의 것이 이 위치에 두어질 수 있음을 나타내고자 하는 것이다. 펩티드 모방체(peptidomimetic) 디자인을 위해서는, 아미노산 서열 내의 "x" 또는 "xaa"는 표적 서열 내에 존재하는 아미노산의 모방체에 의해 대체될 수 있거나, 아미노산은 펩티드 모방체의 활성을 간섭하지 않는 본질적으로 임의의 형태의 스페이서에 의해 대체될 수 있다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 펩티드 사이의 또는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 상동성 및 동일성 각각은 비교를 위하여 정렬될 수 있는 각각의 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교되는 서열들 내의 동등한 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유된다면, 그 분자는 그 위치에서 동일하며; 동등한 부위가 동일하거나 유사한 아미노산 잔기(예를 들어, 입체적 및/또는 전자적 성질이 유사함)에 의해 점유된다면 그 분자는 그 위치에서 상동성인 것으로(유사한 것으로) 나타내어질 수 있다. 상동성/유사성 또는 동일성의 백분율로 표현하는 것은 비교되는 서열들에 의해 공유되는 위치에서의 동일하거나 유사한 아미노산의 수의 함수를 나타낸다. "관계없는" 또는 "비상동성인" 서열은 본 발명의 서열과 40% 미만의 동일성을 공유하지만, 바람직하게는 25% 미만의 동일성을 공유한다. 두 서열의 비교에 있어서, 잔기(아미노산 또는 핵산)의 부재 또는 가외의 잔기의 존재가 동일성 및 상동성/유사성을 또한 감소시킨다.
"상동성"이라는 용어는 유사한 기능 또는 모티프를 갖는 유전자 또는 단백질의 확인에 사용되는 서열 유사성의 수학 기반 비교를 기술한다. 본 발명의 핵산(뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드) 및 아미노산(단백질)은 공개 데이터베이스에 대하여 검색을 수행하여 예를 들어 다른 패밀리 구성원, 관련 서열 또는 상동체를 확인하기 위하여 "질의 서열(query sequence)"로서 사용될 수 있다. 그러한 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색을 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 단어 길이=12를 이용하여 수행하여 본 발명의 핵산 분자에 대하여 상동성인 뉴클레오티드 서열을 획득할 수 있다. BLAST 아미노산 검색을 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어 길이=3을 이용하여 수행하여 본 발명의 단백질 분자에 대하여 상동성인 아미노산 서열을 획득할 수 있다. 비교 목적으로 갭 생성된(gapped) 정렬을 수득하기 위하여, Gapped BLAST를 이용할 수 있으며, 이는 문헌Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389- 3402]에 기술된 바와 같다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 BLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다(www.ncbi.nlm.nih.gov 참조).
본원에 사용될 때, "동일성"은, 서열 매칭이 최대화되도록, 즉, 갭 및 삽입을 고려하여 2개 이상의 서열이 정렬될 때 상기 서열 내의 상응하는 위치에서의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율을 의미한다. 동일성은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있으며, 이는 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; 문헌[Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993]; 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; 문헌[Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987]; 및 문헌[Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]; 및 문헌[Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)]에 기술된 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 동일성을 결정하는 방법은 테스트되는 서열들 사이의 최대 매치를 제공하도록 디자인된다. 게다가, 동일성을 결정하는 방법은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램에서 체계화되어 있다. 두 서열들 사이의 동일성을 결정하는 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 패키지(문헌[Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)]), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(문헌[Altschul, S. F. et al, J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)] 및 문헌[Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)])를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 기타 소스로부터 공개적으로 입수가능하다(문헌[BLAST Manual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894]; 문헌[Altschul, S., et al, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]). 공지된 스미스 워터맨(Smith Waterman) 알고리즘을 동일성 결정에 또한 이용할 수 있다.
폴리펩티드에 적용될 때 "단리된"("실질적으로 순수한"과 상호교환가능하게 사용됨)이라는 것은 그의 기원 또는 조작에 의해서 (i) 발현 벡터의 일부분의 발현 생성물로서 숙주 세포에 존재하거나; (ii) 자연에서는 연결되는 것 이외의 단백질 또는 기타 화학적 모이어티에 연결되거나; (iii) 자연에서는 존재하지 않는, 예를 들어 단백질이 자연에서 발견되지 않는 형태로 존재하도록 적어도 하나의 소수성 모이어티를 단백질에 추가하거나 부가함으로써 화학적으로 조작한 단백질인 폴리펩티드 또는 그의 일부분을 의미한다. 또한 "단리된"이라는 것은 (i) 화학적으로 합성되거나; (ii) 숙주 세포에서 발현되고 회합된 오염 단백질로부터 정제된 단백질을 의미한다. 일반적으로 상기 용어는 폴리펩티드와 함께 자연적으로 나타나는 다른 단백질 및 핵산으로부터 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 그의 정제에 사용되는 항체 또는 겔 매트릭스(폴리아크릴아미드)와 같은 물질로부터 또한 분리된다.
본원에 사용될 때, "혈관신생(angiogenesis) 억제성", "혈관신생 억제" 또는 "항-혈관신생성"이라는 용어는 맥관형성을 포함하며, 신혈관형성(neovascularization)의 정도, 양 또는 속도의 감소를 초래함을 의미하고자 한다. 내피 세포 증식 또는 이동의 정도, 양 또는 속도의 감소 초래는 혈관신생 억제의 특정 예이다.
"혈관신생 억제 조성물"이라는 용어는 혈관신생 매개된 과정, 예컨대 내피 세포 이동, 증식, 관 형성을 억제하여 후속적으로 기존의 것으로부터의 새로운 혈관의 생성의 억제에 이르게 되고 결과적으로 혈관신생 의존성 질병에 영향을 주는 조성물을 나타낸다.
본원에 사용될 때, "혈관신생 의존성 상태"라는 용어는 혈관신생 또는 맥관형성 과정이 병리학적 상태를 지속 또는 증대시키거나, 또는 정상적인 생리학적 과정에 유익하게 영향을 미치는 상태를 의미하고자 한다. 따라서, 혈관신생이 병리학적 상태를 지속시키는 혈관신생 의존성 상태의 처리는 질환을 완화시킬 수 있는 반면, 혈관신생이 정상적인 생리학적 과정에 유익하게 영향을 미치는 혈관신생 의존성 상태의 처리는 예를 들어 정상적인 과정을 향상시킬 수 있다.
혈관신생은 이전에 존재하는 모세혈관 또는 후모세혈관 세정맥으로부터의 새로운 혈관의 형성이다. 맥관형성은 내피 세포 전구체인 혈관아세포로부터 생긴 새로운 혈관의 형성에 의해 생긴다. 둘 모두의 과정은 새로운 혈관 형성으로 이어지며, 혈관신생 의존성 상태의 의미 내에 포함된다. 본원에 사용될 때 "혈관신생"이라는 용어는 기존의 맥관, 모세혈관 및 세정맥의 분지화 및 스프라우팅(sprouting)에서 생기는 것뿐만 아니라 맥관형성에서 생기는 것과 같은 맥관의 드노보식 형성을 포함하고자 한다. 혈관신생은 ALK1 신호전달 및 관 Smad 1/5/8 인산화 및/또는 신호전달의 유도를 또한 포함하는 것일 수 있다. CD105가 또한 ALK1 신호전달 경로에 연루됨이 공지되어 있으며, 따라서 혈관신생의 의미 내에 또한 포함된다.
"숙주 세포 반응을 유도하는"이라는 것은 환자가 병의 징후 또는 증상의 경감 또는 감소를 경험함을 의미하며, 구체적으로는, 제한 없이 생존의 연장을 포함한다. 본 발명에 따른 방법의 특정한 바람직한 실시양태에서, CD8+ IFN-γ 생성 T 세포는 길항제가 투여된 환자에 있어서 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 면역 반응을 유도하도록 활성화된다. 본 발명에 따른 방법의 특정 실시양태에서, CD4+ IFN-γ 생성 T 세포는 당해 조성물이 투여된 환자에 있어서 헬퍼(helper) T 세포 면역 반응을 유도하도록 활성화된다. 이러한 활성화된 CD4+ IFN-γ 생성 T 세포(즉, 헬퍼 T 세포)는 CTL뿐만 아니라 B 세포에 의해 매개되는 체액성 면역 반응도 유도 및 유지하기에 필요한 면역학적 도움(예를 들어, 사이토카인의 방출에 의한 것임)을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법의 특정 실시양태에서, 항원에 대한 체액성 반응이 당해 조성물이 투여된 환자에서 활성화된다. 일 측면에서, 어쥬번트(adjuvant)를 조성물에 첨가하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 어쥬번트는 당업계에 공지되어 있다.
CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포의 활성화는 사이토카인(예를 들어, IFN-γ)을 생성하는 능력을 갖는 T 세포가 실제로 하나 이상의 사이토카인(들)을 생성하게 하거나 또는 그의 하나 이상의 사이토카인(들)의 생성이 증가되게 함을 의미한다. "CTL 반응의 유도"는 잠재적 세포독성 T 림프구가 항원 특이적 세포독성을 나타내게 함을 의미한다. "항원 특이적 세포독성"은 암과 관련되지 않은 항원보다 더 큰 암과 관련된 항원과 관련된 항원 제시 세포에 대한 세포독성을 의미한다. "세포독성"은 세포독성 T 림프구가 표적 세포를 살해하는 능력을 나타낸다. 그러한 항원 특이적 세포독성은 암과 관련되지 않은 항원을 제시하지 않는 세포에 대한 세포독성보다 적어도 약 3배, 적어도 약 10배 더 크거나, 적어도 약 100배 더 크거나 또는 그 이상일 수 있다. 항체 의존성 세포 매개 세포독성(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)은 항체 결합을 통하여 세포 살해를 매개하는 자연 살해 세포(natural killer cell, "NK cell")의 활성화를 또한 포함한다. 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은 엔도글린의 결합을 통하여 NK 세포를 통하여 ADCC를 매개할 수 있다.
본원에 사용될 때, "증식성 장애" 및 "증식성 질병"이라는 용어는 이상한 또는 바람직하지 못한 증식을 특징으로 하는 임의의 병리학적 또는 비병리학적 생리학적 상태를 의미한다. "세포 증식성 장애" 및 "세포 증식성 질병"이라는 용어는 이상한 또는 바람직하지 못한 세포 증식을 특징으로 하는 임의의 병리학적 또는 비병리학적 생리학적 상태를 의미하며, 이는 그 외에도 바람직하지 못하거나 원하지 않는 세포 증식 또는 세포 생존(예를 들어, 결함성 아폽토시스로 인한 것)을 특징으로 하는 질병, 결함있는 또는 이상한 아폽토시스를 특징으로 하는 질병과, 이상한 또는 바람직하지 못한 또는 원하지 않는 세포 생존을 특징으로 하는 질병을 포함한다. "분화성 장애"라는 용어는 이상한 또는 결함있는 분화를 특징으로 하는 임의의 병리학적 또는 비병리학적 생리학적 상태를 의미한다.
치료에 따르는 증식성 또는 분화성 장애는 비정상적인 또는 바람직하지 못한 세포수, 세포 성장 또는 세포 생존을 특징으로 하는, 양성 및 신생물성의 비병리학적 생리학적 상태 및 질환을 포함한다. 따라서 그러한 장애 또는 질병은 질환 상태를 구성할 수 있으며, 모든 유형의 암 성장 또는 발암 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함할 수 있거나, 또는 비병리적일 수 있으며, 즉, 정상으로부터의 일탈일 수 있지만 이는 전형적으로 질환과 관련되지 않는 것일 수 있다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 비병리적 상태의 구체예로는 흉터를 생성하는 창상 복구로부터의 조직 재성장이 있다.
증식성 또는 분화성 장애를 포함하는 세포는 세포 덩어리로 응집되거나 분산될 수 있다. "고형 종양"이라는 용어는 전형적으로 함께 응집되어 덩어리를 형성하는 신생물 형성 또는 전이를 나타낸다. 특정 예는 내장 종양, 예컨대 위암 또는 결장암, 간암, 비날(venal) 암종, 폐 및 뇌 종양/암을 포함한다. "비고형 종양"은 조혈계의 신생물 형성, 예컨대 림프종, 림프종, 골수종 및 백혈병, 또는 신생물 형성을 나타내는데, 이는 사실상 확산되며, 그 이유는 이것이 전형적으로 고형물 덩어리를 형성하지 않기 때문이다. 백혈병의 특정 예는 예를 들어 급성 및 만성 림프아구성, 골수아구성 및 다발성 골수종을 포함한다.
그러한 장애는 사실상 임의의 세포 또는 종양 유형에 영향을 줄 수 있는 신생물 또는 암, 예를 들어 암종, 육종, 흑색종, 전이성 장애 또는 조혈계 신생물 형성성 장애를 포함한다. 전이성 종양은 유방, 폐, 갑상선, 두경부, 뇌, 림프계, 위장(입, 식도, 위, 소장, 결장, 직장), 비뇨생식기(자궁, 난소, 자궁 경부, 방광, 고환, 음경, 전립선), 신장, 췌장, 간, 뼈, 근육, 피부 종양 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 다수의 원발성 종양 유형에서 생길 수 있다.
암종은 상피 또는 내분비 조직의 악성 종양을 나타내며, 호흡기계 암종, 위장계 암종, 비뇨생식기계 암종, 고환 암종, 유방 암종, 전립선 압종, 내분비계 암종 및 흑색종을 포함한다. 예시적인 암종은 자궁경부, 폐, 전립선, 유방, 두경부, 결장, 간 및 난소로부터 형성되는 것을 포함한다. 상기 용어는 또한 암육종을 포함하며, 예를 들어 이는 암종성 및 육종성 조직으로 구성된 악성 종양을 포함한다. 선암은 선 조직의 암종, 또는 종양이 선 유사 구조를 형성한 암종을 포함한다.
치료될 안조직은 예를 들어 당뇨병성 망막병증, 황반 변성 또는 신혈관성 녹내장에 걸린 환자의 망막 조직이며, 억제될 혈관신생은 망막 조직의 신혈관형성이 존재하는 망막 조직 혈관신생이다.
치료될 암성 조직은 예를 들어 비정상적인 수준의 엔도글린을 발현하는 내피 조직이다. 본원에 사용될 때, "형질전환된 세포"라는 용어는 제한되지 않은 성장 상태로 자발적으로 변환된 세포를 나타내며, 즉, 상기 세포는 배양 중 무제한적 횟수의 분열을 통하여 성장하는 능력을 획득하였다. 형질전환된 세포는 그의 성장 조절 상실과 관련하여, 신생물 형성성, 미분화성(anaplastic) 및/또는 과형성성과 같은 용어에 의해 특성화될 수 있다. 본 발명의 목적상, "악성 포유류 세포의 형질전환된 표현형" 및 "형질전환된 표현형"이라는 용어는 세포 배양 중 장기간 성장, 반고형 배지에서의 성장, 또는 면역 부적격 또는 동계 동물에서의 발암성 성장에 의해 검출될 때 포유류 세포의 세포 형질전환과 관련된 하기 표현형 형질 중 임의의 것을 포함하지만, 이에 한정시키고자 하는 것은 아니다: 불사화, 형태적인 또는 성장상의 형질전환, 및 발암성.
본원에서 "종양 세포 항원"이라는 용어는 관계없는 종양 세포, 정상 세포, 또는 정상 체액에서보다 종양 세포 상에 또는 체액에서 더 많은 양으로 존재하는 항원으로 정의된다. 항원의 존재는 당업계의 숙련자에게 공지된 많은 분석법에 의해 테스트될 수 있으며, 이는 제한 없이 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의한, 또는 ELISA 분석법, 방사면역측정법과 같이 항체를 이용한 음성 및/또는 양성 선발을 포함한다.
"아폽토시스" 또는 "세포 예정사(programmed cell death)"라는 용어는 발생 및 기타 정상적인 생물학적 과정 동안 원하지 않는 또는 무익한 세포를 제거하는 생리학적 과정을 나타낸다. 아폽토시스는 정상적인 생리학적 조건하에 일어나는 세포 사멸 양식이며, 세포는 그 자신의 사망에 있어서 능동적인 참가자이다("세포 자살"). 이것은 정상적인 세포 턴오버(turnover) 및 조직 항상성, 배발생, 면역 관용의 유도 및 유지, 신경계의 발생 및 내분비계 의존성 조직 위축 동안 가장 흔히 발견된다. 아폽토시스를 겪고 있는 세포는 특징적인 형태학적 및 생화학적 특징을 나타낸다. 이들 특징은 염색질 응집, 핵 및 세포질 응축, 세포질 및 핵의 막결합 소포 내로의 분배(아폽토시스 소체(apoptotic bodies))를 포함하는데, 상기 막결합 소포는 리보좀, 형태학적으로 온전한 미토콘드리아 및 핵물질을 함유한다. 생체내에서, 이들 아폽토시스 소체는 대식세포, 수지상 세포 또는 인접 상피 세포에 의해 신속하게 인식되어 식균 작용을 받게 된다. 생체내에서의 아폽토시스 세포의 제거에 있어서의 이러한 효율적인 기작으로 인하여, 어떠한 염증 반응도 야기되지 않는다. 시험관내에서, 남아있는 세포뿐만 아니라 아폽토시스 소체도 궁극적으로는 팽윤되고 마침내 용해된다. 시험관내 세포 사멸의 이러한 마지막 시기는 "이차 괴사"로 칭해졌다. 아폽토시스는 당업계의 숙련자에게 공지된 방법, 예컨대 DNA 단편화, 아넥신(Annexin) V의 노출, 카스파아제의 활성화, 사이토크롬 c의 방출 등에 의해 측정될 수 있다. 사멸하도록 유도된 세포는 본원에서 "아폽토시스 세포"로 칭해진다.
본원에서 "아폽토시스 유도제"는 아폽토시스/세포 예정사를 유도하는 것으로 정의되며, 예를 들어, 조사, 화학요법제 또는 수용체 라이게이션제를 포함하며, 여기서, 세포, 예를 들어 종양 세포는 세포 예정사를 겪도록 유도된다. 예시적인 아폽토시스 유도제는 하기에서 더욱 상세하게 기술된다.
아폽토시스는 하기의 표준 아넥신 V 아폽토시스 분석법을 이용하여 테스트될 수 있다: NIH:OVCAR-3 세포를 6웰 플레이트(NUNC))에서 성장시키고, 4-48시간 동안 조사하거나 또는 길항제로(또는 또 다른 항암약과 조합하여) 처리하고, 세척하고, 아넥신 V-FITC(비디-파밍겐(BD-Pharmingen))로 1시간 동안 염색한다. 세포를 유동 세포 측정법(벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson), 셀퀘스트(CellQuest))에 의해 분석하고, 요오드화프로피듐으로 대조염색하고, 유동 세포 측정기에서 다시 분석한다.
B. 인간화 항- 엔도글린 항체의 제조 및 발현 방법
엔도글린에 결합하는 키메라형 단클론 항체가 개발되었다. 이 항체는 TR105로 표기된다(c-SN6j로도 공지됨).
일 측면에서, 본원에 개시된 항체 및 그의 항원 결합 단편은 키메라형 단클론 TRC105 항체의 VL 및 VH 서열(각각 서열 번호 1 및 39)의 인간화에 의해 생성되었다.
인간화 항체를 포함하는 인간화 면역글로불린은 유전자 공학에 의해 구성되었다. 이전에 기술된 대부분의 인간화 면역글로불린은 특정 인간 면역글로불린 사슬(즉, 억셉터(acceptor) 또는 수령체)의 프레임워크와 동일한 프레임워크, 및 비인간(즉, 공여체) 면역글로불린 사슬 유래의 3개의 CDR을 포함하였다. 본원에 기술된 바와 같이, 인간화 면역글로불린 사슬을 포함하는 항체의 친화도를 증가시키거나 유지하기 위하여 인간화는 인간화 면역글로불린 사슬의 프레임워크 내의 제한된 수의 아미노산이 억셉터라기보다는 오히려 공여체 내의 그 위치의 아미노산과 동일한 것으로 확인되어 선택되는 기준를 또한 포함할 수 있다.
부분적으로 본 발명은 인간화 항체를 제조하는 종래의 수단(예로서 CDR의 소스로 마우스 항체를 이용함)에서 친화도의 상실의 2가지의 기여 원인이 (1) 마우스 CDR이 인간 프레임워크와 조합될 때 CDR에 가까운 프레임워크 내의 아미노산은 마우스 대신 인간이 된다는 모델을 기반으로 한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 이들 변화된 아미노산은 CDR을 약간 뒤틀리게 할 수 있으며(예를 들어, 상기 아미노산은 공여체 마우스 항체에서와는 상이한 정전기력 또는 소수성력을 생성할 수 있으며, 뒤틀린 CDR은 CDR이 공여체 항체에서 그러한 것만큼 항원과 효과적으로 접촉하지 못할 수 있음); (2) 또한, CDR에 가깝지만 그의 일부는 아닌 원래의 마우스 항체(즉, 여전히 프레임워크의 일부임) 내의 아미노산은 친화도에 기여하는 항원과의 접촉을 할 수 있다. 이들 아미노산은 항체가 인간화될 때 상실되며, 그 이유는 일반적으로 모든 프레임워크 아미노산이 인간화되기 때문이다. 이들 쟁점을 회피하기 위하여, 그리고 요망되는 항원에 대한 친화도가 매우 강한 인간화 항체를 생성하기 위하여, 인간화 항체 및 그의 항원 결합 단편은 하기 원리들 중 하나 이상을 이용하여 구성될 수 있다.
한 가지 비제한적 원리는 예를 들어 인간화될 공여체 면역글로불린에 대하여 대단히 상동성인 특정 인간 면역글로불린 유래의 프레임워크가 억셉터로서 사용되거나, 많은 인간 항체 유래의 콘센서스(consensus) 프레임워크의 사용이 억셉터로서 사용되는 것이다. 예를 들어, 데이터 은행(예를 들어, 미국 국립 생의학 연구 재단 단백질 확인 재원(National Biomedical Research Foundation Protein Identification Resource) 또는 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 단백질 서열 데이터베이스)에서의 인간 중쇄(또는 경쇄) 가변 영역에 대한 마우스 중쇄(또는 경쇄) 가변 영역의 서열의 비교는 상이한 인간 영역들에 대한 상동성 정도가 크게, 예를 들어 약 40% 내지 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 그보다 많이 다양할 수 있음을 보여준다. 공여체 면역글로불린의 중쇄 가변 영역에 대하여 가장 큰 상동성을 갖는 인간 중쇄 가변 영역들 중 하나를 억셉터 면역글로불린으로 선택함으로써, 공여체 면역글로불린으로부터 인간화 면역글로불린으로 가는 데 있어서 더욱 적은 아미노산이 변화된다. 공여체 면역글로불린의 경쇄 가변 영역에 대하여 가장 큰 상동성을 갖는 인간 경쇄 가변 영역들 중 하나를 억셉터 면역글로불린으로 선택함으로써, 공여체 면역글로불린으로부터 인간화 면역글로불린으로 가는 데 있어서 더욱 적은 아미노산이 변화된다. 일반적으로 그러한 기술을 이용하면 배좌를 뒤틀리게 하는 CDR들 중 하나 이상 근처의 아미노산의 변화 기회가 감소된다. 게다가, 인간화 면역글로불린 사슬을 포함하는 인간화 항체의 정확한 전체 형상은 공여체 항체의 형상과 더욱 가깝게 닮을 수 있고, 그에 의해 CDR의 뒤틀림 기회가 감소된다.
또한 억셉터 서열로서 동일한 인간 항체 유래의 경쇄 및 중쇄를 사용하여, 인간화 경쇄 및 중쇄가 서로와 유리하게 접촉하게 되는 가능성을 향상시킬 수 있다. 대안적으로, 억셉터 서열로서 상이한 인간 항체 생식세포계 서열 유래의 경쇄 및 중쇄를 또한 사용할 수 있으며, 그러한 조합이 이용될 경우, 통상적인 분석법(예를 들어, ELISA)을 이용하여 VH 및 VL이 관심있는 에피토프에 결합하는지를 쉽게 결정할 수 있다. 일 실시예에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열은 함께 취해질 경우 공여체 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열에 대하여 전체적으로 가장 상동성인 인간 항체가 선택된다. 때로 더욱 큰 웨이트(weight)가 중쇄 서열에 주어진다. 억셉터 면역글로불린이 어떻게 선택되는지에 관계없이, 몇몇 경우 인간화 면역글로불린 사슬의 프레임워크 내의 소수의 아미노산이 억셉터라기보다는 오히려 공여체 내의 그 위치의 아미노산과 동일한 것을 선택함으로써 달성될 수 있다. 친화도 성숙 방법이 당업계에 공지되어 있다.
일반적으로 인간화 항체는 인간 요법에 사용하기 위한 마우스 또는 키메라 항체에 비하여 적어도 3가지의 잠재적 이점을 갖는다. 항체의 이펙터 부분이 인간이기 때문에, 이것은 인간 면역계의 다른 부분과 더 잘 상호작용할 것으로 여겨진다(예를 들어, 보체 의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체 의존성 세포 독성(ADCC)에 의해 표적 세포를 더욱 효율적으로 파괴함). 추가로, 인간 면역계는 인간화 항체의 프레임워크 또는 불변 영역을 외래체로서 인식해서는 안되며, 따라서, 그러한 주사된 항체에 대한 항체 반응은 전적으로 외래체인 마우스 항체 또는 부분적으로 외래체인 키메라 항체에 대한 것보다 더 적어야 한다. 마지막으로, 마우스 항체는 인간 항체의 반감기보다 훨씬 더 짧은 인간 순환계 중 반감기를 갖는 것으로 공지되어 있다. 인간화 항체는 아마도 자연 발생 인간 항체와 더 유사한 반감기를 가져서, 더욱 적은 덜한 빈도의 용량이 주어지게 할 수 있다.
따라서, 항체 및 그의 항원 결합 단편의 인간화는 당업계에 공지되고 본원에 기술된 다양한 방법을 통하여 성취될 수 있다. 이와 유사하게, 인간화 항체의 제조는 또한 당업계에 공지되고 본원에 기술된 방법을 통하여 성취될 수 있다.
프레임워크 영역의 변형 방법은 당업계에 공지되어 있으며 본원에서 고려된다. 변경할 하나 이상의 관련 프레임워크 아미노산 위치의 선택은 다양한 기준에 따라 달라진다. 변화시킬 관련 프레임워크 아미노산의 한 가지 선택 기준은 공여체 분자와 억셉터 분자 사이의 아미노산 프레임워크 잔기의 상대적인 차이일 수 있다. 이러한 접근법을 이용하여 변경할 관련 프레임워크 위치의 선택은 잔기 결정에 있어서의 임의의 주관적인 편향 또는 잔기에 의한 CDR 결합 친화도 기여에 있어서의 임의의 편향을 피하는 이점을 갖는다.
변화시킬 관련 아미노산 위치를 결정하는 데 사용될 수 있는 또 다른 기준은 예를 들어 CDR 배좌에 중요하거나 그에 기여하는 것으로 공지된 프레임워크 잔기의 선택일 수 있다. 예를 들어, 변화시킬 관련 위치로서의 정준(canonical) 프레임워크 잔기의 표적화를 이용하여 그의 회합되는 공여체 CDR 서열과 관련하여 더욱 양립가능한 아미노산 잔기를 확인할 수 있다.
특정 프레임워크 위치에서의 아미노산 잔기의 빈도는 변화시킬 관련 프레임워크 아미노산 위치의 선택에 사용될 수 있는 또 다른 기준이다. 예를 들어, 선택된 프레임워크와, 그의 하위패밀리 내의 다른 프레임워크 서열의 비교는 특정 위치 또는 위치들에서 보다 적은 빈도로 나타나는 잔기를 나타낼 수 있다. 덜 풍부한 잔기를 갖는 위치는 억셉터 가변 영역 프레임워크에서 변경시킬 위치로서의 선택에 있어서 유사하게 응용가능하다.
또한 변화시킬 관련 아미노산 위치는 예를 들어 CDR에 대한 근접성을 기반으로 하여 선택될 수 있다. 특정한 정황에서, FR 잔기는 CDR 배좌 및/또는 항원 결합에 참여할 수 있다. 게다가, 이 기준은 본원에 기술된 다른 기준에 의해 선택되는 관련 위치의 우선순위 결정에 유사하게 사용될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 CDR에 대하여 근접한 그리고 원위의 잔기들 사이의 구별은 변화시킬 관련 위치들의 수를 감소시키는 한 가지 방법을 대표한다.
변경시킬 관련 아미노산 프레임워크 위치를 선택하는 다른 기준은 예를 들어 항원-CDR 인터페이스 근처의 3차원 공간 내에 존재하는 것으로 공지되거나 예측되는 또는 CDR 활성을 조정할 것으로 예측되는 잔기를 포함한다. 이와 유사하게, 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 가변 영역 인터페이스 사이의 접촉부를 형성하는 것으로 공지되거나 예측되는 프레임워크 잔기가 선택될 수 있다. 그러한 프레임워크 위치는 CDR 결합 포켓, 항원(에피토프) 상호작용 또는 VH와 VL의 상호작용을 조정함으로써 CDR의 배좌 및/또는 친화도에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 결합 활성의 스크리닝을 위한 다양한 집단을 구성하기 위한 이들 아미노산 위치의 선택은, CDR 배좌에 해로운 영향을 미치는 잔기를 대체하거나 또는 프레임워크 내의 다른 곳에 나타나는 잔기의 해로운 영향을 보상하는 프레임워크 변화를 확인하는 데 사용될 수 있다.
변경용으로 선택될 수 있는 다른 프레임워크 잔기는 용매에 접근할 수 없는 아미노산 위치를 포함한다. 일반적으로 그러한 잔기는 가변 영역에 묻혀 있으며, 따라서 CDR 또는 VH 및 VL 상호작용의 배좌에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어 용매 접근성은 공지된 3차원 구조 데이터에 의해 또는 폴리펩티드의 아미노산 측쇄에 의해 생성된 환경의 상대적인 소수성으로부터 예측될 수 있다.
공여체 CDR 내의 관련 아미노산 위치와, 변화시키고자 하는 프레임워크 영역 내의 임의의 관련 아미노산 위치의 선택 후, 선택된 위치 중 일부 또는 그 전부에서의 아미노산 변화가 억셉터 가변 영역 프레임워크 및 공여체 CDR을 위한 코딩 핵산 내로 포함될 수 있다. 변경된 프레임워크 또는 CDR 서열은 개별적으로 만들어져서 테스트되거나, 순차적으로 또는 동시에 조합되어 테스트될 수 있다.
임의의 또는 모든 변경된 위치의 가변성은 몇 개의 아미노산 잔기로부터 다수의 상이한 아미노산 잔기까지의 범위일 수 있으며, 이는 모든 20가지의 자연 발생 아미노산 또는 그의 기능성 등가체 및 유사체를 포함한다. 일부의 경우, 자연 비발생 아미노산이 또한 고려될 수 있으며, 이는 당업계에 공지되어 있다.
변화시킬 아미노산 위치의 수 및 위치의 선택은 융통성이 있으며, 공여체 가변 영역과 비교하여 실질적으로 동일하거나 더 큰 결합 친화도와 같은 바람직한 활성을 갖는 변경된 가변 영역의 확인을 위한 의도된 용도 및 요망되는 효율에 의존적일 수 있다. 이와 관련하여, 변경되는 가변 영역 집단 내로 포함되는 변화의 수가 더욱 많을 수록 바람직한 활성, 예를 들어 공여체와 실질적으로 동일하거나 더 큰 결합 친화도를 나타내는 적어도 하나의 종을 확인하는 것이 더욱 효율적이게 된다. 대안적으로, 결합 친화도에 불균형하게 기여하는 특정한 아미노산 잔기 또는 위치에 영향을 주는 경험적 데이터 또는 실제 데이터를 사용자가 갖고 있다면, 그러한 확인된 잔기 또는 위치 내의 또는 그 주위의 변화에 초점을 맞춘 변경된 가변 영역의 제한된 집단을 생성하는 것이 바람직할 수 있다.
예를 들어, CDR 그래프팅된 가변 영역이 요망될 경우, 변경된 가변 영역의 큰 다양한 집단은 공여체 및 억셉터 프레임워크 사이의 모든 동일하지 않은 프레임워크 영역 위치 및 모든 단일한 CDR 아미노산 위치 변화를 포함할 수 있다. 대안적으로, 중간의 다양성의 집단은 예를 들어 모든 단일 CDR 아미노산 위치 변화와 함께 포함될 근접한 동일하지 않은 프레임워크 위치만의 하위세트를 포함하여 예를 들어 인간화 항체 또는 항원 결합 단편의 친화도를 증가시킬 수 있다. 상기 집단의 다양성은 예를 들어 모든 쌍 형태의 CDR 아미노산 위치 변화를 추가로 포함시킴으로써 추가로 증가될 수 있다. 이와는 대조적으로, 하나의 프레임워크 및/또는 CDR 아미노산 위치만큼 적은 위치에 변이체형 잔기가 포함된 소정의 잔기 또는 위치에 초점을 맞춘 집단이 변경된 항체 가변 영역의 스크리닝 및 확인용으로 유사하게 구성될 수 있다. 상기 집단에서와 같이, 그러한 초점을 맞춘 집단의 다양성은 프레임워크 및 CDR 영역 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두 내에 다른 관련 위치를 포함시키기 위하여 변화용으로 선택된 위치를 추가로 확장시킴으로써 추가로 증가될 수 있다. 추가로 이용될 수 있는, 프레임워크 영역 및 CDR 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두에서의 몇 개의 변화로부터 다수의 변화까지의 범위의 다수의 다른 조합이 있으며, 이들 모두는 요망되는 활성, 예를 들어 엔도글린에의 결합 활성을 갖는 적어도 하나의 CDR이 그래프팅된 변경된 가변 영역의 확인에 대하여 스크리닝될 수 있는 변경된 가변 영역의 집단을 생성한다. 본원에 제공된 교시 및 지도가 주어진다면, 당업계의 숙련자는 프레임워크 또는 공여체 CDR 내의 어떠한 선택된 잔기 위치 또는 그의 하위세트가 본 발명의 변경된 항체의 스크리닝 및 확인을 위한 집단을 생성하도록 변화될 수 있는지를 알거나, 또는 그를 결정할 수 있다. 아미노산을 코딩하는 코돈은 당업계에 공지되어 있다.
항체를 인간화하는 또 다른 방법은 "수퍼인간화"로 칭해지는 방법을 포함한다. 수퍼인간화는 비인간 성숙 항체 유전자에 의해 코딩되는 대상 가변 영역의 펩티드 서열을 수득하는 단계 및 비인간 항체 가변 영역 내의 적어도 2개의 CDR에 있어서 정준 CDR 구조형의 제1 세트를 확인하는 단계를 포함한다. 정준 CDR 구조형은 초티아(Chothia)에 의해 표기된 구조형이다(CITE). 초티아 및 동료들은 아미노산 서열 수준에서의 큰 다양성에도 불구하고 많은 항체의 CDR의 결정적인 부분이 거의 동일한 펩티드 골격 배좌를 채용함을 발견하였다. 따라서, 초티아는 각각의 사슬에서 하나 또는 몇 개의 "정준 구조"를 각각의 CDR에 대하여 정의하였다. 각각의 정준 구조는 루프를 형성하는 아미노산 잔기의 연접 세그먼트에 있어서 펩티드 골격 비틀림각 세트를 주로 특정한다.
정준 CDR 구조형의 확인 후, 이간 항체에 있어서의 인간 항체 가변 영역의 펩티드 서열의 라이브러리가 또한 수득된다. 이 라이브러리는 생식세포계 핵산 세그먼트에 의해 코딩되는 인간 생식세포계 가변 영역의 서열을 포함하며, 성숙 인간 항체 서열을 포함할 수 있다. 어느 하나의 경우, 본 방법은 인간 가변 영역 서열의 라이브러리 내의 각각의 서열에 있어서 적어도 2개의 CDR에 있어서의 정준 CDR 구조형(즉, 정준 CDR 구조형의 제2 세트)을 확인하는 단계를 포함한다. 정준 CDR 구조형의 제1 세트를 정준 CDR 구조형의 제2 세트와 비교하고(즉, 가변 영역 내의 상응하는 위치에서 마우스 정준 CDR 구조형을 인간 정준 CDR 구조형과 비교), 정준 CDR 구조의 제2 세트가, 각각 비인간 및 인간 가변 영역 내의 상응하는 위치에서 CDR 서열에 있어서의 정준 CDR 구조형의 제1 세트와 동일한 인간 서열을 선택함으로써 이 라이브러리로부터 후소 서열의 하위세트가 선택된다. 본 방법은 후보 인간 가변 영역 서열 유래의 프레임워크 영역과 조합되는 비인간 가변 영역 유래의 CDR 서열들(예를 들어, 마우스 CDR의 것) 중 적어도 2개를 포함하는 키메라 분자를 구성하는 기반으로서 이들 후보 인간 가변 영역 서열을 이용한다. 구성의 결과는, 키메라 항체 내의 프레임워크 서열이 후보 인간 프레임워크 서열과 상이해지도록 가변 영역 내의 상응하는 위치에서 인간 CDR 서열 각각을 치환하는 비인간 CDR 서열 각각을 키메라 항체가 함유하는 것이다.
후보 인간 항체 서열의 대상 CDR에 대한 유사성은 두 수준에서 각각의 도메인에 대하여 평가된다. 일차적으로, CDR 펩티드 골격의 동일한 3차원 배좌가 추구된다. 대상 CDR의 실험적으로 결정된 원자 좌표는 좀처럼 입수가능하지 않으며, 따라서 3차원 유사성은 대상 CDR의 초티아 정준 구조형을 결정하고 상이한 정준 구조를 보유하는 후보를 추가의 고려로부터 배제함으로써 근사치로 계산된다. 이차적으로, 대상 CDR과 남아있는 인간 후보 CDR 사이의 잔기-잔기 상동성이 고려되며, 최고 상동성을 갖는 후보가 선택된다.
최고 상동성의 선택은 대상 비인간 가변 영역과 동일한 정준 구조를 갖는 후보 인간 가변 영역을 등급화하는 데 사용되는 다양한 기준을 기반으로 한다. 선택된 세트의 구성원의 등급화 기준은 아미노산 서열 동일성 또는 아미노산 상동성 또는 이들 둘 모두에 의한 것일 수 있다. 아미노산 동일성은 아미노산 잔기의 위치 매치에 의한 위치의 단순 스코어이다. 아미노산 상동성에 의한 유사성은 특징적인 잔기 구조에서의 위치 유사성에 의한 위치이다. 상동성은 예를 들어 문헌[Henikoff and Henikoff, (1992) Amino acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci 89: 10915-10919]에 기술된 표 및 절차에 따라, 또는 문헌[Henikoff and Henikoff, (1996)]에 기술된 BLOSUM 시리즈에 의해 스코어링될 수 있다. 그 단계는 하기와 같다:
a) 대상 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 펩티드 서열을 결정한다. 상기 서열은 임의의 몇몇 방법, 예컨대 통상적인 cDNA 클로닝 후 각각의 유전자의 DNA 서열결정; 대상 하이브리도마주의 DNA 또는 역전사체로부터의 폴리머라아제 연쇄 반응에 의해 증폭된 클로닝 생성물의 DNA 서열결정; 또는 정제된 항체 단백질의 펩티드 서열결정에 의해 결정될 수 있다.
b) 대상 비인간 항체의 중쇄 및 경쇄 서열에 카밧 넘버링 시스템(문헌[Kabat et al, Id. 1991]을 적용한다. 대상 비인간 항체의 CDR 각각의 정준 구조형을 결정한다. 이 결정은 문헌[Chothia and Lesk (1987)], 문헌[Chothia et al (1992)], 문헌[Tomlinson et al (1995)], 문헌[Martin and Thornton (1996)], 및 문헌[Al-Lazikani et al (1997)]에 논의된 지침에 비추어 펩티드 서열의 조사에 의해 행한다.
각각의 CDR에 있어서의 정준 구조 결정의 두드러진 특징은 하기와 같다. 중쇄 CDR1에 있어서, 3가지의 정준 구조형이 현재 공지되어 있다. 새로운 서열의 할당은 간단하며, 그 이유는 각각의 정준 구조형이 상이한 수의 잔기를 갖기 때문이다. 문헌[Al-Lazikani et. al (1997)]에 기술된 바와 같이, 카밧 넘버링이 서열에 할당될 때, 잔기 31-35의 넘버링은 각각의 정준 구조에 대하여 하기와 같다:
정준 구조형 1: 31, 32, 33, 34, 35.
정준 구조형 2: 31, 32, 33, 34, 35, 35a.
정준 구조형 3: 31, 32, 33, 34, 35, 35a, 35b.
중쇄 CDR2에 있어서, 4가지의 정준 구조형이 현재 공지되어 있다. 몇몇은 유일무이한 수의 잔기를 가지며, 위치 52-56의 그의 유일무이한 카밧 넘버링, 즉 하기로부터 용이하게 구별된다:
정준 구조형 1: 52, 53, 54, 55, 56.
정준 구조형 4: 52, 52a, 52b, 52c, 53, 54, 55, 56.
중쇄 CDR2에 있어서의 정준 구조형 2 및 3은 동일한 수의 잔기를 가지며, 따라서 그의 서열 내의 단서에 의해 구별되어야 하고, 이는 문헌[Chothia et al (1992)]에 논의된 바와 같다. 이들 단서를 포함하는 세그먼트의 카밧 넘버링은 52, 52a, 53, 54, 55이다. 정준 구조형 2는 52a 위치에 Pro 또는 Ser, 그리고 55 위치에 Gly 또는 Ser을 가지며, 이때 다른 위치에서의 제한은 없다. 정준 구조형 3은 54 위치에 Gly, Ser, Asn, 또는 Asp를 가지며, 이때 다른 위치에서의 제한은 없다. 이들 기준은 대부분의 경우 올바른 할당을 결의하기에 충분하다. 추가로, 프레임워크 잔기 71은 정준 구조형 2의 경우 일반적으로 Ala, Val, Leu, He, 또는 Thr이며 정준 구조형 3의 경우 일반적으로 Arg이다.
중쇄 CDR3은 모든 CDR 중 가장 다양하다. 이것은 림프구에 대하여 유일무이한, 랜덤한 성질의 일부인 유전자 프로세스에 의해 생성된다. 그 결과, CDR3에 있어서의 정준 구조는 예측이 어려웠다. 어떠한 경우에서든, 인간 생식세포계 V 유전자 세그먼트는 CDR3의 어떠한 부분도 코딩하지 않으며, 그 이유는 V 유전자 세그먼트는 카밧 위치 94에서 종료되고 반면에 95 위치 내지 102 위치는 CDR3을 코딩하기 때문이다. 이러한 이유로, CDR3의 정준 구조는 일반적으로 후보 인간 서열 선택에 있어서 고려되지 않는다.
경쇄 CDR1에 있어서, 6가지의 정준 구조형이 카파 사슬 내의 CDR1에 대하여 현재 공지되어 있다. 각각의 정준 구조형은 상이한 수의 잔기를 가지며, 따라서 새로운 서열에 정준 구조형을 할당하는 것은 잔기 위치 27-31의 카밧 넘버링으로부터 명백하다.
정준 구조형 1: 27, 29, 30, 31.
정준 구조형 2: 27, 28, 29, 30, 31.
정준 구조형 3: 27, 27a, 27b, 27c, 27d, 27e, 27f, 28, 29, 30, 31.
정준 구조형 4: 27, 27a, 27b, 27c, 27d, 27e, 28, 29, 30, 31.
정준 구조형 5: 27, 27a, 27b, 27c, 27d, 28, 29, 30, 31.
정준 구조형 6: 27, 27a, 28, 29, 30, 31.
경쇄 CDR2에 있어서, 단지 단일 정준 구조형이 카파 사슬 내의 CDR2에 대하여 공지되어 있으며, 따라서 예외적인 대상 항체 서열을 제외하면 할당은 자동적이다. 경쇄 CDR3에 있어서, 최대 6가지의 정준 구조형이 카파 사슬 내의 CDR3에 대하여 기술되었지만, 이들 중 3가지는 희귀하다. 3가지의 일반적인 것은 그의 길이에 의해 구별될 수 있으며, 이는 잔기 위치 91-97의 카밧 넘버링에서 반영된다:
정준 구조형 1: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 (또한 95 위치에 의무적 Pro, 그리고 90 위치에 Gin, Asn, 또는 His를 가짐).
정준 구조형 3: 91, 92, 93, 94, 95, 97.
정준 구조형 5: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 96a, 97.
대상 비인간 항체의 정준 CDR 구조형의 확인 후, 대상 항체와 동일한 조합의 정준 구조형을 갖는 동일 사슬 유형(중쇄 또는 경쇄)의 인간 유전자는 후보 인간 서열 세트를 형성하는 것으로 확인된다. 대부분의 이들 유전자 단편이 발견되었으며, 이미 정준 구조형에 할당되었다(문헌[Chothia et al, 1992], 문헌[Tomlinson et al, 1995]).
중쇄에 있어서, 마우스 정준 구조형에 대한 CDR1 및 CDR2의 부합성이 평가되며, 부합되지 않는 유전자는 배제된다. 경쇄에 있어서, 대상 항체의 정준 구조형에 대한 각각의 인간 서열의 CDR1 및 CDR2의 부합성이 처음에 평가된다. 후보 Vk 유전자의 잔기 89-95rk 대상 항체와 동일한 정준 구조형의 CDR을 형성하는 잠재성은, 상기 유전자와 J 영역의 융합을 단정하고 융합된 서열에 대하여 CDR3 정준 CDR 구조형 결정 기준을 적용함으로써 평가되며, 부합되지 않는 서열은 배제된다.
대안적으로, 대상 항체의 가변 도메인이 인간 게놈에서 이용가능하지 않은 정준 구조형의 것일 때, 3차원적으로 유사한, 그러나 동일한 것은 아닌 정준 구조형을 갖는 인간 생식세포계 V 유전자가 비교용으로 고려된다. 그러한 상황은 하기에 기술된 예들 중 2가지를 포함하는 쥐과 항체에 있어서의 카파 사슬 CDR1에서 흔히 나타난다. 모든 6가지의 가능한 정준 구조형이 쥐과 항체에서 이 CDR에서 관찰되었으며, 반면 인간 게놈은 단지 정준형 2, 3, 4 및 6을 코딩한다. 이러한 상황 하에서, 대상 비인간 서열의 아미노산 잔기의 2개 이내의 길이의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 정준 CDR 구조형이 비교용으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 제1형 정준 구조가 대상 항체에서 발견될 경우, 제2형 정준 구조를 갖는 인간 Vk 서열이 비교에 사용된다. 제5형 정준 구조가 쥐과 항체에서 발견될 경우, 제3형 또는 제4형 정준 구조를 갖는 인간 Vk 서열이 비교에 사용된다.
성숙, 재배열 인간 항체 서열이 서열 비교용으로 고려될 수 있다. 그러한 고려는 성숙 인간 서열이 (1) 생식세포계에 매우 가까울 경우, (2) 인간에 있어서 면역원성이 아닌 것으로 공지된 경우, 또는 (3) 대상 항체의 정준 구조형과 동일하지만 인간 생식세포계에서는 발견되지 않는 정준 구조형을 포함하는 경우를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 다양한 상황하에서 보증될 수 있다.
매칭 정준 구조형을 갖는 후보 V 유전자 각각에 있어서, 대상 서열과의 잔기-잔기 서열 동일성 및/또는 상동성을 또한 평가하여 후보 인간 서열을 등급화한다. 예를 들어, 평가되는 잔기는 하기와 같다: (1) 카파(κ) 경쇄 CDR 아미노산 잔기 위치는 CDR1 (26-32), CDR2 (50-52), CDR3 (91-96)이며; (2) 중쇄 CDR 아미노산 잔기 위치는 CDR1 (31-35) 및 CDR2 (50-60)이다. 추가로, 중쇄 CDR3 아미노산 잔기 위치 95 내지 102가 또한 고려될 수 있다.
잔기-잔기 상동성은 먼저 대상 인간 서열과 후소 인간 서열 사이의 동일한 아미노산 잔기의 수에 의해 스코어링된다. 변환 항체의 후속 구성에 사용되는 인간 서열은 최고 스코어를 갖는 후보의 25% 중에서 선택된다. 적절할 경우, 예컨대 몇몇 후보 서열이 유사한 동일성 스코어를 가질 경우, 동일하지 않은 아미노산 잔기들 사이의 유사성이 필요할 경우 추가로 고려될 수 있다. 대상 잔기와 목적 잔기 사이의 지방족-지방족 매치, 방향족-방향족 매치, 또는 극성-극성 매치가 스코어에 부가된다. 또 다른 실시예에서, 서열 상동성의 정량적 평가가 아미노산 치환 매트릭스, 예컨대 헤니코프 (Henikoff) 및 헤니코프의 BLOSUM62 매트릭스를 이용하여 수행될 수 있다.
CDR3 서열에 대하여 C-말단의 프레임워크 영역의 목적 서열은 공지된 인간 생식세포계 J 세그먼트의 세트로부터 선택될 수 있다. J 펩티드 서열은 상기에 언급된 바와 같이 후보 V 유전자의 평가에 대하여 특정된 스코어링 기준을 이용하여 CDR3과 J가 중첩되는 서열 위치에 대하여 각각의 J 세그먼트에 있어서 잔기-잔기 상동성을 평가함으로써 선택된다. 변환 항체의 후속 구성에 사용되는 J 유전자 세그먼트 펩티드 서열은 최고 스코어를 갖는 후보의 25% 중에서 선택된다.
예로서, 키메라형 가변 사슬은 대상 비인간 서열 유래의 적어도 2개의 CDR 및 후보 인간 서열 유래의 프레임워크 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 키메라형 경쇄는 대상 비인간 서열 유래의 3개의 CDR 및 후보 인간 서열 유래의 프레임워크 서열을 포함한다. 추가의 실시예에서, 키메라형 중쇄는 대상 중쇄의 적어도 2개의 CDR, 및 후보 인간 중쇄의 프레임워크 서열을 포함하거나, 키메라형 중쇄는 대상 중쇄 유래의 각각의 CDR 및 후보 인간 중쇄의 프레임워크 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 키메라형 항체 중쇄는 대상 비인간 서열 유래의 CDR1 및 2와, CDR3의 경우 잔기 50-60과, 후보 인간 중쇄 유래의 CDR의 잔기 61-65를, 후보 인간 서열의 프레임워크 서열과 함께 포함한다. 또 다른 실시예에서, 키메라형 중쇄 서열은 대상 비인간 서열 유래의 각각의 CDR; 대상 서열 유래의 프레임워크 서열 27-30, 및 후보 서열 유래의 프레임워크 서열을 포함한다. 그러나, 모든 경우에, 키메라 항체 분자는 후보 인간 가변량의 프레임워크 서열 내의 것과는 상이한 프레임워크 서열 내의 10개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다.
인간화 항체의 친화도 증가가 요망될 때, 변환 항체의 CDR 내의 잔기는 다른 아미노산으로 추가로 치환될 수 있다. 전형적으로, 중쇄 CDR2를 제외하고서 CDR 내의 4개 이하의 아미노산 잔기가 변화되며, 가장 전형적으로는 CDR 내의 2개 이하의 잔기가 변화되고, 반면에 10개만큼 많은 잔기가 변화될 수도 있다. 친화도의 변화는 통상적인 방법, 예컨대 본원에 기술된 것(예를 들어, BIAcore)에 의해 측정될 수 있다.
항체를 수퍼인간화하는 방법은 미국 특허 제6,881,557호에 더욱 상세하게 기술되어 있으며, 상기 미국 특허는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
인간화 항체 및 항원 결합 단편은 당업계에 공지된 통상적인 기술을 이용하여 구성 및 생성될 수 있다. 게다가, 흔히 재조합적으로 제조된 항체는 특히 고수준 발현 벡터를 이용할 때 다량으로 생성될 수 있다.
항체는 당업계에 공지된 통상적인 기술을 이용하여 서열결정될 수 있다. 일 측면에서, 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 예를 들어 인간 항체(또는 그의 항원 결합 단편) 프레임워크의 합성 서열 내로 삽입하여, 비인간 항체를 이용한 인간 환자의 치료의 부작용 반응을 제한할 수 있는 인간 항체를 생성한다. 또한 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 아비머TM와 같이 합성 서열 내로, 예를 들어 결합 단백질 내로 삽입하여 인간 환자에게 투여하기 위한 구성체를 생성할 수 있다. 그러한 기술은 치료될 동물의 종에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, 수의학적 용도에 있어서, 항체, 항원 결합 단편 또는 결합 단백질이 비인간(예를 들어, 영장류, 소, 말 등) 투여용으로 합성될 수 있다.
또 다른 측면에서, 당업계에서 인식된 기술, 예컨대 본원에 제공된 그리고 포함된 것을 이용하여, 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 예를 들어 재조합 기술에 의해 항체, 항원 결합 단편 또는 결합 단백질을 코딩하는 기존 폴리뉴클레오티드의 제한 엔도뉴클레아제 부위 내에 삽입할 수 있다.
발현에 있어서, 발현 시스템은 선발가능 마커로서 글루타민 신테타아제 유전자를 사용하는 GS 시스템(론자(Lonza))을 이용하는 것이다. 간략하게는, 선발가능 마커로서 글루타민 신테타아제 유전자를 사용하여 GS 시스템(론자)를 이용하여 전기천공(250 V)에 의해 CHO 세포에서 트랜스펙션을 수행한다. 야생형 CHO 세포는 2 mM 글루타민을 포함하는, 10%의 투석된 송아지 태아 혈청(Fetal Calf Serum, FCS)을 함유하는 DMEM(시그마(Sigma))에서 성장시킨다. 6 x 107개의 CHO 세포를 300 300 μg의 선형화 DNA를 이용하여 전기천공에 의해 트랜스펙션시킨다. 전기천공 후, 세포를 글루타민을 포함하는 DMEM에 재현탁시키고, 36x96웰 플레이트에 도말하고(50 ㎕/웰), 37℃, 5% C02에서 인큐베이션한다. 다음날, 150 ㎕/웰의 선발 배지(글루타민을 포함하지 않는 DMEM)를 첨가한다. 대략 3주 후, 음성 대조군으로서 관계없는 항체를 이용하여 ELISA(하기 참조)에 의해 콜로니를 스크리닝한다. 20 μg/ml 초과를 생성하는 모든 콜로니를 24웰 플레이트 내로, 그 후 이중 T25 플라스크 내로 확장시킨다.
고수준 생성에 있어서 가장 널리 사용되는 포유류 발현 시스템은 디히드로폴레이트 리덕타아제 결핍(dihydrofolate reductase deficient, "dhfr-") 중국 햄스터 난소 세포에 의해 제공되는 유전자 증폭 절차를 이용하는 것이다. 이 시스템은 당업자에게 공지되어 있다. 상기 시스템은 테트라히드로폴레이트로의 데히드로폴레이트의 전환을 촉매하는 DHFR 효소를 코딩하는 데히드로폴레이트 리덕타아제 "dhfr" 유전자를 기반으로 한다. 고생산 달성을 위하여, dhfr- CHO 세포는 요망되는 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 기능성 DHFR 유전자를 포함하는 발현 벡터를 이용하여 트랜스펙션시킨다. 이 경우, 요망되는 단백질은 재조합 항체 중쇄 및/또는 경쇄이다.
경쟁적 DHFR 억제제 메토트렉세이트(MTX)의 양의 증가에 의해, 재조합 세포는 dhfr 유전자를 증폭시킴으로써 내성을 발달시킨다. 표준적인 경우, 이용되는 증폭 단위는 dhfr 유전자의 크기보다 훨씬 더 크며, 그 결과 항체 중쇄가 동시 증폭된다.
단백질, 예컨대 항체 사슬의 대규모 생산이 요망될 경우, 이용되는 세포의 안정성 및 발현 수준 둘 모두가 고려된다. 장기간 배양에 있어서, 재조합 CHO 세포 집단은, 심지어 이것이 단일한 모(parental) 클론으로부터 유래된다 해도, 증폭 동안 그의 특이적 항체 생산성과 관련하여 균질성을 상실한다.
본 출원은 본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드(핵산), 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 그러한 폴리뉴클레오티드를 폴리펩티드로 전사 및 번역하는 발현 시스템을 제공한다.
또한 본 출원은 상기와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태의 구성체를 제공한다.
또한 본 출원은 상기와 같은 하나 이상의 구성체를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본원에 기술된 임의의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산은 본원에 기술된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생성 방법이 그러하듯이 본 출원의 측면을 형성하는데, 본 방법은 그로부터의 코딩 핵산으로부터의 발현을 포함한다. 발현은 편리하게는 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건하에 배양함으로써 달성될 수 있다. 발현에 의한 생성 후, 항체 또는 항원 결합 단편은 임의의 적합한 기술을 이용하여 단리 및/또는 정제되고, 그 후 적절할 경우 사용될 수 있다.
본원에 기술된 특정 항체, 항원 결합 단편 및 코딩 핵산 분자 및 벡터는 예를 들어 그의 자연적인 환경으로부터 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로 단리 및/또는 정제된 것이 제공될 수 있다. 핵산의 경우, 필요한 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 기원의 핵산 또는 유전자는 없거나 실질적으로 없다. 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며, 전적으로 또는 부분적으로 합성일 수 있다. 정제 방법은 당업계에 공지되어 있다.
다양한 상이한 숙주 세포에서의 폴리펩티드의 클로닝 및 발현 시스템이 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아, 포유류 세포, 효모 및 바큘로바이러스(baculovirus) 시스템을 포함한다. 비상동성 폴리펩티드의 발현에 있어서 당업계에서 이용가능한 포유류 세포주는 중국 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 골수종 세포 및 많은 기타의 것을 포함한다. 일반적인 박테리아 숙주는 이. 콜라이(E. coli)이다.
원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이에서의 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에서 잘 확립되어 있다. 개관에 대해서는 예를 들어 문헌[Plueckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)]을 참조한다. 배양 중 진핵 세포에서의 발현도 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편의 생성에 있어서의 옵션으로서 당업계의 숙련자가 이용가능하며, 최근의 개관에 대해서는 예를 들어 문헌[Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576]; 문헌[Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560]을 참조하는데, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
적합한 벡터가 선택되거나 구성될 수 있으며, 이는 프로모터 서열, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절할 경우 기타 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 예를 들어 적절할 경우 파지 또는 파지미드일 수 있다. 추가의 상세사항에 대해서는, 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다. 예를 들어 단백질의 분석, 및 핵산 구성체의 제조, 돌연변이 유발, 서열결정, 세포 내로의 DNA의 도입 및 유전자 발현에 있어서의 핵산의 조작을 위한 많은 공지된 기술 및 프로토콜이 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992]에 상세하게 기술되어 있다. 샘브룩(Sambrook) 등 및 오스벨(Ausubel) 등의 방법에 대한 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함되며, 당업계에 공지되어 있다.
따라서, 추가의 측면은 본원에 개시된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 다른 추가의 측면은 그러한 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 도입은 임의의 이용가능한 기술을 이용할 수 있다. 진핵 세포에 있어서, 적합한 기술은 예를 들어 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE 덱스트란, 전기천공법, 리포좀 매개된 트랜스펙션 및 레트로바이러스 또는 기타 바이러스, 예를 들어 백시니아, 또는 곤충 세포의 경우 바큘로바이러스를 이용한 형질도입을 포함할 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적합한 기술은 예를 들어 염화칼슘 형질전환법, 전기천공법 및 박테리오파지를 이용한 트랜스펙션을 포함할 수 있다.
상기 도입에는 예를 들어 유전자 발현을 위한 조건하에 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터의 발현을 야기하거나 허용하는 것이 뒤따를 수 있다.
일 실시양태에서, 핵산은 숙주 세포의 게놈(예를 들어, 염색체) 내로 통합된다. 통합은 표준 기술에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열의 포함에 의해 촉진될 수 있다. 발현 최대화에 필요할 경우 Ig 향상이 초기화될 수 있다.
또한 본 출원은 상기와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 발현을 위하여 발현 시스템에서 상기에 진술한 구성체를 사용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한 본 출원은 엔도글린에 결합하는 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 서열을 코딩하는 단리된 핵산, 예컨대 재조합 DNA 분자 또는 클로닝된 유전자, 또는 그의 축퇴 변이체, 그의 돌연변이체, 유사체 또는 단편에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 출원은 엔도글린에 결합하는 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편의 재조합 DNA 분자 또는 클로닝된 유전자의 전 DNA 서열은 적절한 숙주 내로 도입될 수 있는 발현 제어 서열에 작동되게 연결될 수 있다. 따라서 그 응용은 항체의 VH 및/또는 VL, 또는 그의 일부를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 클로닝된 유전자 또는 재조합 DNA 분자로 형질전환된 단세포 숙주까지 연장된다.
또 다른 특징은 본원에 개시된 DNA 서열의 발현이다. 당업계에 공지된 바와 같이, DNA 서열은 이를 적절한 발현 벡터 내의 발현 제어 서열에 작동되게 연결하고, 그 발현 벡터를 적절한 단세포 숙주의 형질전환에 이용함으로써 발현될 수 있다.
물론, 발현 제어 서열에의 DNA 서열의 그러한 작동적 연결은, 이미 DNA 서열의 일부가 아닌 경우, 개시 코돈, ATG를 그 DNA 서열의 상류에 올바른 판독 프레임으로 제공하는 것을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 및 벡터는 단리된 및/또는 정제된 형태(예를 들어, 필요한 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 이외의 기원의 폴리뉴클레오티드가 없거나 실질적으로 없음)로 제공될 수 있다. 본원에 사용될 때, "실질적으로 순수한" 및 "실질적으로 없는"은 약 20% 이하의 외래 물질, 약 10% 이하의 외래 물질, 약 5% 이하의 외래 물질, 약 4% 이하의 외래 물질, 약 3% 이하의 외래 물질, 약 2% 이하의 외래 물질, 또는 약 1% 이하의 외래 물질을 함유하는 용액 또는 현탁액을 나타낸다.
매우 다양한 숙주/발현 벡터 조합이 본 발명의 DNA 서열의 발현에 이용될 수 있다. 예를 들어 유용한 발현 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열의 세그먼트로 이루어질 수 있다. 적합한 벡터는 SV40 및 공지된 박테리아 플라스미드의 유도체, 예를 들어, 이. 콜라이 플라스미드 col El, Pcr1, Pbr322, Pmb9 및 그의 유도체, 플라스미드, 예컨대 RP4; 파지 DNA, 예를 들어, 파지 λ의 다수의 유도체, 예를 들어, NM989, 및 기타 파지 DNA, 예를 들어, M13 및 섬유상 단일 가닥 파지 DNA; 효모 플라스미드, 예컨대 2μ 플라스미드 또는 그의 유도체; 진핵 세포에서 유용한 벡터, 예컨대 곤충 또는 포유류 세포에서 유용한 벡터; 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터, 예컨대 파지 DNA 또는 기타 발현 제어 서열을 이용하도록 변형된 플라스미드 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 또한 제공되는 것은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 재조합 숙주 세포이다. 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드로부터의 발현을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 생성 방법이 그러하듯이, 본 출원의 일 측면을 형성한다. 발현은 예를 들어 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건하에 배양함으로써 달성될 수 있다. 그 후 항체 또는 항원 결합 단편은 임의의 적합한 기술을 이용하여 단리 및/또는 정제되고, 적절하게 사용될 수 있다.
임의의 매우 다양한 발현 제어 서열 - 작동적으로 연결된 DNA 서열의 발현을 제어하는 서열 - 이 DNA 서열의 발현을 위하여 이들 벡터에서 사용될 수 있다. 그러한 유용한 발현 제어 서열은 예를 들어 SV40, CMV, 백시니아, 폴리오마 또는 아데노바이러스의 초기 또는 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, LTR 시스템, 파지 λ의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 기타 당분해 효소의 프로모터, 산 포스파타아제의 프로모터(예를 들어, Pho5), 효모 접합 인자, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그의 바이러스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 기타 서열 및 이들의 다양한 조합을 포함한다.
다양한 상이한 숙주 세포에서 폴리펩티드를 클로닝 및 발현하는 시스템은 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아, 포유류 세포, 효모 및 바큘로바이러스 시스템을 포함한다. 비상동성 폴리펩티드의 발현을 위한 당업계에서 이용가능한 포유류 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 골수종 세포 및 다수의 기타의 것을 포함한다. 일반적인 박테리아 숙주는 예를 들어 이. 콜라이일 수 있다.
이. 콜라이와 같은 원핵 세포에서의 항체 또는 항원 결합 단편의 발현은 당업계에서 잘 확립되어 있다. 개관에 대해서는, 예를 들어 문헌[Plueckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)]을 참조한다. 배양 중 진핵 세포에서의 발현을 당업계의 숙련자가 또한 이용가능하다(문헌[Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576]; 문헌[Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560]).
매우 다양한 단세포 숙주 세포가 DNA 서열 발현에 또한 유용하다. 이들 숙주는 공지된 진핵 및 원핵 숙주, 예컨대 효모와 같은 진균류, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 바실루스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 이. 콜라이 스트레인, 진균류, 예컨대 효모, 및 동물 세포, 예컨대 CHO, YB/20, NS0, SP2/0, R1.1, B-W 및 L-M 세포, 아프리카 녹색 원숭이(African Green Monkey) 신장 세포(예를 들어, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, 및 BMT10), 곤충 세포(예를 들어, Sf9), 및 조직 배양물 형태의 인간 세포 및 식물 세포를 포함한다.
모든 벡터, 발현 제어 서열 및 숙주가 DNA 서열 발현에 동일하게 잘 작용하는 것은 아님이 이해된다. 또한 모든 숙주가 동일 발현 시스템에서 동일하게 잘 작용하는 것도 아니다. 그러나, 당업자라면 본 출원의 범주로부터 벗어나지 않고서 요망되는 발현을 성취하기 위하여 과도한 실험 없이 적당한 벡터, 발현 제어 서열 및 숙주를 선택할 수 있다. 예를 들어, 벡터의 선택에 있어서, 숙주가 고려되어야 하며, 그 이유는 벡터가 숙주 내에서 작용하여야 하기 때문이다. 벡터의 카피수(copy number), 그 카피수를 제어하는 능력 및 벡터에 의해 코딩되는 임의의 다른 단백질, 예컨대 항생제 마커의 발현도 고려된다. 당업계의 숙련자라면 본 출원의 범주로부터 벗언지 않고서 요망되는 발현을 성취하기 위하여 적당한 벡터, 발현 제어 서열 및 숙주를 선택할 수 있다. 예를 들어, 벡터의 선텍에 있어서, 숙주가 고려되며 그 이유는 벡터가 숙주 내에서 작용하기 때문이다. 벡터의 카피수, 그 카피수를 제어하는 능력 및 벡터에 의해 코딩되는 임의의 다른 단백질, 예컨대 항생제 마커의 발현도 고려될 수 있다.
또한 본 출원은 상기와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 본원의 다른 곳에 기술된 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태의 구성체를 제공한다. 적합한 벡터가 선택되거나 구성될 수 있으며, 이는 프로모터 서열, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열을 포함하는 적절한 조절 서열, 선발가능 마커 및 적절할 경우 기타 서열을 포함한다. 벡터는 적절할 경우 플라스미드, 바이러스 벡터, 예를 들어 파지, 파지미드 등일 수 있다. 추가의 상세사항에 대해서는, 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다. 예를 들어 핵산 구성체의 제조에 있어서의 핵산의 조작, 돌연변이 유발, 서열결정, 세포 내로의 DNA의 도입 및 유전자 발현과, 단백질의 분석을 위한 다수의 공지된 기술 및 프로토콜이 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992]에 상세하게 기술되어 있다. 샘브룩 등과 오스벨 등의 방법 및 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
발현 제어 서열의 선택에 있어서, 다양한 인자가 보통 고려된다. 이들은 예를 들어 당해 시스템의 상대적인 강도, 그의 제어가능성, 및 발현될 특정 DNA 서열 또는 유전자와의 그의 양립가능성, 특히 잠재적인 이차 구조에 관한 것을 포함한다. 적합한 단세포 숙주는 예를 들어 선택된 벡터와의 그의 양립가능성, 그의 분비 특성, 단백질을 올바르게 폴딩하는 그의 능력, 및 그의 발효 요건과, 발현될 DNA 서열에 의해 코딩되는 생성물의 숙주에 대한 독성, 및 발현 생성물의 정제 용이성의 고려에 의해 선택된다.
추가의 측면은 본원에 개시된 바와 같이 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 다른 추가의 측면은 임의의 이용가능한 기술, 숙주 세포 내로의 그러한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 도입 방법을 제공한다. 진핵 세포에 있어서, 적합한 기술은 예를 들어 인산칼슘 트랜스펙션법, DEAE 덱스트란법, 전기천공법, 리포좀 매개된 트랜스펙션 및 레트로바이러스 또는 기타 바이러스(예를 들어 백시니아) 또는 곤충 세포의 경우 바큘로바이러스를 이용한 형질도입을 포함할 수 있다. 박테리아 세포에 있어서, 적합한 기술은 예를 들어 염화칼슘 형질전환법, 전기천공법 및 박테리오파지를 이용한 트랜스펙션을 포함할 수 있다.
상기 도입에 이어, 예를 들어 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로부터의 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 위한 조건하에서의 숙주 세포의 배양에 의해 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로부터의 발현을 야기하거나 허용할 수 있다. 유도성 시스템이 사용되고, 발현이 활성화제의 첨가에 의해 유도될 수 있다.
일 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈(예를 들어, 염색체) 내로 통합될 수 있다. 통합은 표준 기술에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열의 포함에 의해 촉진될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 핵산은 숙주 세포에서 에피솜 벡터에서 유지된다.
특정 폴리펩티드의 발현을 위하여 박션 시스템에서 상기에 진술한 구성체를 사용하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
이들 및 기타 인자를 고려하면, 당업계의 숙련자는 발효 또는 대규모 동물 배양시에 DNA 서열을 발현하는 다양한 벡터/발현 제어 서열/숙주 조합을 구성할 수 있다.
항체, 항원 결합 단편 또는 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 클로닝되는 것에 더하여 또는 클로닝되는 것이라기보다는 오히려 재조합적으로/합성에 의해 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 항체, 항원 결합 단편 또는 결합 단백질에 있어서의 적절한 코돈을 이용하여 디자인될 수 있다. 일반적으로, 당해 서열이 발현에 사용될 경우 의도된 숙주에 바람직한 코돈이 선택된다. 전 폴리뉴클레오티드는 표준 방법에 의해 제조된 중첩 올리고뉴클레오티드로부터 조립되어 전 코딩 서열로 조립될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Edge, Nature, 292:756 (1981)]; 문헌[Nambair et al, Science, 223: 1299 (1984)]; 문헌[Jay et al, J. Biol. Chem., 259:6311 (1984)]을 참조한다.
단백질 내로 비천연 아미노산을 부위 특이적으로 포함시키는 일반적인 방법이 문헌[Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244: 182-188 (April 1989)]에 기술되어 있다. 이 방법을 이용하여 비천연 아미노산을 갖는 유사체를 생성할 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 DNA 서열은 클로닝되기보다는 오히려 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 DNA 서열은 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열에 대한 적절한 코돈을 이용하여 디자인될 수 있다. 일반적으로, 당해 서열이 발현에 사용될 경우 의도된 숙주에 바람직한 코돈이 선택된다. 전 서열은 표준 방법에 의해 제조된 중첩 올리고뉴클레오티드로부터 조립되어 전 코딩 서열로 조립될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Edge, Nature, 292:756 (1981)]; 문헌[Nambair et al, Science, 223: 1299 (1984)]; 문헌[Jay et al, J. Biol. Chem., 259:6311 (1984)]을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
C. 면역원성의 인 실리코(in silico) 분석
필요할 경우, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 면역원성에 대하여 평가되고, 필요할 경우 탈면역화될 수 있다(즉, 항체는 하나 이상의 T 세포 에피토프의 변경에 의해 면역 반응성이 덜해지도록 만들어짐). 본원에 개시된 인간화 항-엔도글린 항체 및 항원 결합 단편에 존재하는 T 세포 에피토프 및 면역원성의 분석은 소프트웨어 및 특정 데이터베이스의 사용을 통하여 실시될 수 있다. 예시적인 소프트웨어 및 데이터베이스는 영국 캠브리지 소재의 안티토프(Antitope)에 의해 개발된 아이토프TM를 포함한다. 아이토프TM는 인간 MHC 클래스 II 대립유전자에 결합하는 펩티드의 분석을 위한 인 실리코 기술이다.
아이토프TM 소프트웨어는 인간 MHC 클래스 II 대립유전자에의 펩티드 결합을 예측하며 그에 의해 그러한 "잠재적 T 세포 에피토프"의 위치에 대한 처음의 스크린을 제공한다. 아이토프TM 소프트웨어는 34가지의 인간 MHC 클래스 II 대립유전자의 결합 홈 내의 특정 결합 포켓과 펩티드의 아미노산 측쇄 사이의 유리한 상호작용을 예측한다. 핵심 결합 잔기의 위치는 테스트 항체 가변 영역 서열을 스패닝하는 하나의 아미노산이 중첩되는 9량체 펩티드의 인 실리코 생성에 의해 달성된다. 각각의 9량체 펩티드는 34가지의 MHC 클래스 II 알로타입 각각에 대하여 테스트되고 MHC 클래스 II 결합 홈과의 그의 잠재적인 "적합도(fit)" 및 상호작용을 기반으로 하여 스코어링될 수 있다. >50%의 MHC 클래스 II 대립유전자에 대하여 높은 평균 결합 스코어(아이토프TM 스코어링 기능에서 >0.55)를 생성하는 펩티드는 잠재적인 T 세포 에피토프로 간주된다. 그러한 영역에서, MHC 클래스 II 홈 내에서의 펩티드 결합을 위한 9개 아미노산 서열 코어를 분석하여 MHC 클래스 II 포켓 잔기(P1, P4, P6, P7 및 P9) 및 가능한 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 접촉 잔기(P-1, P2, P3, P5, P8)를 결정한다.
임의의 T 세포 에피토프의 확인 후, 아미노산 잔기 변화, 치환, 부가 및/또는 결실을 도입하여 확인된 T 세포 에피토프를 제거할 수 있다. 그러한 변화는 확인된 에피토프를 여전히 제거하면서 항체 구조 및 기능을 보존하도록 행해질 수 있다. 예시적인 변화는 보존적 아미노산 변화를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
합성 펩티드와 조합된 재조합 MHC 분자의 용해성 복합체를 활용하는 기술이 사용되게 되었다. 이들 시약 및 절차는, 특정 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있고 광범위한 다양성의 MHC 알로타입에 대한 다수의 잠재적인 에피토프의 스크리닝용으로 채용되지 않는 인간 또는 실험용 동물 대상체 유래의 말초 혈액 샘플로부터 T 세포 클론의 존재를 확인하는 데 사용될 수 있다.
T 세포 활성화의 생물학적 분석은 면역 반응을 불러일으키는 테스트 펩티드/단백질 서열의 능력의 판독을 제공하는 것에 대한 최상의 실제 옵션으로 남아있다. 이러한 종류의 접근법의 예는 박테리아 단백질 스타필로키나아제에 대한 T 세포 증식 분석, 이어서 T 세포주를 자극하는 합성 펩티드를 사용한 에피토프 맵핑의 사용을 포함한다. 이와 유사하게, 파상풍 독소 단백질의 합성 펩티드를 이용한 T 세포 증식 분석에 의해 상기 독소의 면역우성 에피토프 영역을 규정하였다. 일 실시양태에서, 테스트 단백질 내의 T 세포 에피토프는 인간 면역 세포의 단리된 하위세트를 이용하여 결정될 수 있으며, 이는 그의 시험관내 증식과, 관심있는 합성 펩티드의 존재하에서의 상기 세포의 배양과 배양된 T 세포에서의 임의의 유도된 증식의 측정을 촉진한다. 다른 기술이 또한 사용될 수 있다. 그러한 기술은, 요망되는 면역 세포 하위세트(수지상 세포, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)를 수득하기 위하여 세포 단리 기술을 조심스럽게 적용하고 다수의 사이토카인 보충제를 이용하여 세포를 배양하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 내의 T 세포 에피토프의 존재는 인간 면역 세포의 단리된 하위세트에 항체를 첨가하고, 그의 시험관내 분화를 평가하고, 배양된 T 세포에서의 임의의 유도된 증식을 측정함으로써 결정될 수 있다.
치료적으로 관심있는 다수의 단백질에 대한 MHC 클래스 II 리간드를 규정하는 인 실리코 기술이 또한 이용될 수 있다. 그러나, 생체내에서의 면역원성 펩티드의 제시에 이르게 되는 단백질 분해 프로세싱 및 기타 생리학적 단계에 대한 요건과 같은 이유로, 컴퓨터 기반의 방법에 의해 규정가능한 전 레파토리의 펩티드의 하위세트가 최종적인 생물학적 관련성을 가질 수 있다. 따라서, 생체외 인간 T 세포 활성화 분석법은 T 세포 활성화를 지원할 수 있고 그에 의해 이 단백질에서의 면역원성의 문제와 생물학적으로 가장 관련이 있게 되는, 폴리펩티드의 단백질 서열 내의 영역의 확인에 사용될 수 있다. 본원에 사용될 때, "T 세포 에피토프"는 MHC 클래스 II에 결합할 수 있고/있거나 T 세포를 자극할 수 있고/있거나 또한 (반드시 측정가능하게 활성화될 필요가 없이) MHC 클래스 II와의 복합체 형태의 T 세포에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 나타낸다.
본원에 개시된 방법에 따르면, 합성 펩티드 또는 전 항체는 시험관내에서 배양된 인간 T 세포에서 증식 반응을 불러일으키는 그의 능력에 대하여 테스트된다. T 세포는 전혈 샘플로부터 공지된 수단에 의해 쉽게 수득가능한 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 층 내에 존재한다. 게다가, PBMC 제제는 생리학적 비의 T 세포 및 항원 제시 세포를 포함하며, 따라서 시험관내에서 대리 면역 반응을 함께 행하는 물질의 우수한 소스이다. 그러한 분석의 작동에서, 2.0에 가까운 또는 그를 초과하는 자극 지수가 유도된 증식의 유용한 척도이다. 그러나, 자극 지수는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 따라 상이할 수 있으며, 각각의 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 상응하는 펩티드 라이브러리에 있어서의 기저선을 참고로 하여 확립될 수 있다. 그러한 테스트의 일례에서, 자극 지수(SI)는테스트 펩티드에 대하여 측정된 증식 스코어(예를 들어 3H-티미딘 혼입을 사용할 경우 예를 들어 방사능의 분당 카운트)를 테스트 펩티드와 접촉하지 않은 세포에서 측정된 스코어로 나눔으로써 통상적으로 환산될 수 있다. 반응을 전혀 불러일으키지 않는 펩티드는, 0.8-1.2의 범위의 SI 값이 또한 주목할 만하지 않을 수도 있지만, SI=1.0이 주어질 수 있다. 기록된 스코어에 있어서 신뢰도를 보장하기 위하여 다수의 기술적 절차를 만들어 그러한 분석이 작동되게 할 수 있다. 전형적으로, 모든 결정은 적어도 삼중으로 행해지며, 평균 스코어가 컴퓨터로 계산될 수 있다. 컴퓨터로 계산된 SI=>2.0일 경우, 삼중체의 개개의 스코어는 범위 밖의 데이터의 증거에 대하여 조사될 수 있다. 테스트 펩티드는 적어도 2가지의 상이한 농도로 세포와 접촉되며, 상기 농도는 전형적으로 최소 2배의 농도 차이를 스패닝한다. 그러한 농도 범위는 키네틱 디멘션(kinetic dimension)에 대한 오프셋(off-set)을 분석에 제공하며, 예를 들어 +7일의 단일 시점 결정이 행해지고 있을 경우 유용할 수 있다. 일부 분석에서, 다수의 시간 코스 결정이 행해질 수 있으며, 상기 결정도 두 상이한 농도의 최소로 제공되는 펩티드 면역원을 이용하여 행해질 수 있다. 이와 유사하게, PBMC 공여체 샘플 대다수가 반응성일 것이라고 예상되는 대조군 펩티드의 포함이 각각의 분석 플레이트에 포함될 수 있다. 인플루엔자 헤마글루티닌 펩티드 307-309, 서열 PKYVKQNTLKLA(서열 번호 104); 및 클라미디아(Chlamydia) HSP 60 펩티드 서열 KVVDQIKKISKPVQH(서열 번호 105)이 그러한 분석에서 사용되는 대조군 펩티드의 예이다. 대안적으로, 또는 그에 더하여, 분석은 모든 PBMC 샘플이 2.0보다 유의하게 더 큰 SI를 나타낼 것으로 예상되는 키홀 림펫(Keyhole Limpet) 유래의 헤모시아닌과 같이 강력한 전 단백질 항원을 또한 이용할 수 있다. 그러한 용도를 위한 다른 대조군 항원이 당업계에 공지되어 있다.
본원에 개시된 방법은 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 에피토프 맵을 제공할 수 있으며, 여기서, 상기 맵은 가능한 MHC 알로타입의 광범위한 스펙트럼에 관련된다. 맵은 변형 단백질이 T 세포 구동된 면역 반응을 불러일으키는 능력이 제거되거나 또는 상기 단백질이 투여될 가능성이 있는 환자 대다수에 있어서 적어도 개선될 수 있는 변형 단백질의 디자인 또는 선택을 허용하기에 충분히 표시하는 것일 수 있다. 개선은 비변형 단백질과 비교하여 면역 반응 감소(즉, 감소된 면역원성)를 나타낼 수 있다(예를 들어, 약 1.5배 미만, 약 2배 미만, 약 5배 미만, 약 10배 미만, 약 20배 미만, 약 50배 미만, 약 100배 미만, 약 200배 미만, 약 500배 미만 또는 그 초과로 적은 것, 또는 그 안의 임의의 범위). 대안적으로, 감소된 면역원성을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 비변형 단백질과 비교한 그의 면역 반응 초래 능력의 감소%를 나타낼 수 있다(예를 들어, 약 1% 미만, 약 2% 미만, 약 3% 미만, 약 4% 미만, 약 5% 미만, 약 10% 미만, 약 20% 미만, 약 50% 미만, 약 100% 미만, 및 그 안의 임의의 범위). 따라서, 스크리닝 공정의 실행에 있어서, 나이브(naive) 공여체 유래의 PBMC 유래된 T 세포는, 인간 집단에서 현존하는 MHC 클래스 II 레파토리 (HLA-DR)의 적어도 90% 초과의 샘플을 제공하기에 충분한 면역학적 다양성의 공여체의 풀로부터 수집된다. 주어진 합성 펩티드(또는 항체)에 대하여 나이브 T 세포 반응이 검출될 경우, 실행 중인 펩티드(또는 항체)는 단리 중인 다수의 공여체로부터 유래되는 PBMC 제제와 접촉되며, 공여체의 수(또는 "공여체 풀"의 크기)는 실용적인 목적을 위해 20개 미만의 관련되지 않은 개체일 가능성이 없고, 공여체 풀 중 모든 샘플은 그의 MHC 클래스 II 하플로타입(haplotype)에 따라 사전 선택될 수 있다.
본원에 사용될 때, "나이브 공여체"라는 용어는 환경적으로, 백신접종에 의해, 또는 예를 들어 수혈과 같은 다른 수단에 의해 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 이전에 노출되지 않은 대상체를 나타낸다.
T 세포 에피토프에 대하여 스크리닝할 때, T 세포는 다수의 상이한 건강한, 그러나 당해 단백질을 치료적으로 받지 않은 공여체 유래의 말초 혈액 샘플로부터 제공될 수 있다. 필요할 경우, 환자 혈액 샘플은 하나 이상의 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 확인하기 위하여 항체를 이용하는 ELISA와 같은 통상적인 분석법을 이용하여 특정 폴리펩티드의 존재에 대하여 테스트될 수 있다. 분석은 당업계에 공지된 통상적인 절차를 이용하여 시험관내에서 배양된 PBMC를 이용하여 행해지며, PBMC를 관심있는 단백질을 대표하는 합성 펩티드종(즉, 라이브러리) 또는 전 단백질, 예컨대 항체와 접촉시키는 것, 및 적합한 인큐베이션 기간 후 유도된 T 세포 활성화, 예컨대 세포 증식을 측정하는 것을 포함한다. 측정은 임의의 적합한 수단에 의한 것일 수 있으며, 예를 들어 세포 물질 내로의 H3의 축적이 실험실 기기를 이용하여 쉽게 측정되는 H3-티미딘 혼입을 이용하여 행해질 수도 있다. PBMC 샘플과 합성 펩티드 또는 전 단백질의 각각의 조합에 있어서의 세포 증식 정도는 미처리 PBMC 샘플에서 보이는 것에 대하여 조사될 수 있다. 예상되는 증식 효과가 있는 펩티드 또는 펩티드들 또는 전 단백질로 처리한 후 보이는 증식성 반응을 또한 참조할 수 있다. 이와 관련하여, 공지된 넓은 MHC 제한을 갖는 펩티드 또는 전 단백질, 특히 DP 또는 DQ 이소타입에 대하여 MHC 제한을 갖는 펩티드 에피토프를 사용하는 것이 유리하지만, 본 발명은 그러한 제한된 펩티드 또는 단백질의 사용에 한정되는 것은 아니다. 그러한 펩티드는 예를 들어 인플루엔자 헤마글루티닌 및 클라미디아 HSP60과 관련하여 상기에 기술되었다.
비제한적 일 실시예에서, T 세포 에피토프는 맵핑되고, 후속적으로, 본원에 기술된 방법을 이용하여 변형된다. 에피토프 맵의 조립을 돕기 위하여, 합성 펩티드의 라이브러리가 생성된다. 상기 펩티드 각각은 길이가 15개 아미노산 잔기이며, 각각은 12개 아미노산 잔기만큼 시리즈로 다음 펩티드에 중첩되며, 즉, 시리즈의 각각의 연속 펩티드는 추가의 3개의 아미노산이 분석물에 증가하면서 부가된다. 이러한 방식으로, 펩티드의 임의의 주어진 인접 쌍은 연접 서열의 18개 아미노산을 맵핑하였다. 나이브 T 세포 분석법을 이용하여 T 세포 맵을 규정하는 한 가지 방법이 하기 실시예에 예시되어 있다. T 세포 맵을 규정하는 방법을 통하여 확인된 펩티드들 각각은, 분석 시스템에서 검출 가능한 증식 버스트(burst)를 불러일으키기에 충분한 친화도로 MHC 클래스 II에 결합하여 적어도 하나의 동계 TCR과 맞물릴 수 있는 것으로 제안된다.
또 다른 비제한적 실시예에서, 분석 시스템에서 검출 가능한 증식 버스트를 불러일으키기에 충분한 친화도로 MHC 클래스 II에 결합하여 적어도 하나의 동계 TCR과 맞물리는 T 세포 에피토프를 생성하도록 프로세싱되는 항체의 잠재성이 평가된다.
본원에 기술된 분자는 재조합법의 이용을 포함하는 임의의 몇몇 방법으로 제조될 수 있다. 본원에 제공된 단백질 서열 및 정보를 사용하여 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(DNA)를 추정할 수 있다. 이는 예를 들어 컴퓨터 소프트웨어 툴, 예컨대 디엔에이스타(DNAstar) 소프트웨어 스위트(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 디엔에이스타 인코포레이티드(DNAstar Inc.)] 또는 그와 유사한 것을 이용하여 달성될 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 그러한 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상당한 상동체, 변이체, 절단체(truncation), 연장체(elongation), 또는 추가의 변형체가 본원에서 고려된다.
T 세포 에피토프의 맵핑(확인) 방법 및 에피토프를 변형시켜 변형된 서열이 T-헬퍼 반응의 유도를 (부분적으로 또는 완전히) 감소시키도록 하는 방법이 본원에서 제공된다. 변형은 유사한 변화를 발생시키기 위하여 변형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈에서 만들어지는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈은 당업계에 공지되어 있다. 재조합 DNA법을 이용하여 표적 서열의 지정 돌연변이 유발을 달성하는 것이 가능하며, 본원에 기술된, 그리고 상기에 기술된 것과 같은 당업계에 공지된 많은 그러한 기술이 이용가능하다. 일반적으로, 부위 특이적 돌연변이 유발 기술이 공지되어 있다. 간략하게는, 올리고뉴클레오티드 유도된 PCR 돌연변이 유발을 위한 단일 가닥 주형을 생성하는 박테리오파지 벡터가 이용된다. 파지 벡터(예를 들어, M13)가 구매가능하며, 그의 사용은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 이와 유사하게, 이중 가닥 플라스미드도 부위 지정 돌연변이 유발에 일상적으로 이용되며, 이는 관심있는 포리뉴클레오티드를 파지로부터 플라스미드로 옮기는 단계를 제거한다. 요망되는 돌연변이된 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이 주형으로부터의 변형된 (요망되는 돌연변이) DNA의 시험관내 합성을 유도할 수 있으며, 당해 헤테로이중가닥 DNA는 요망되는 클론의 성장 선발 및 확인을 위하여 적격 이. 콜라이를 형질전환시키는 데 사용된다. 대안적으로, 프라이머 쌍은 PCR 반응에서 요망되는 돌연변이(들)를 갖는 둘 모두의 상응하는 상보성 가닥을 동시에 합성하기 위하여 이중 가닥 벡터의 2개의 별도의 가닥에 어닐링될 수 있다.
일 실시양태에서, 플라스미드 DNA 주형을 이용한 퀵체인지(Quick Change) 부위 지정 돌연변이 유발법이 이용될 수 있다. 인서트의 인서트 표적 유전자를 포함하는 플라스미드 주형의 PCR 증폭은 요망되는 돌연변이를 포함하는 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 성취된다. 벡터의 반대 가닥들에 각각이 상보성인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 돌연변이 유발 등급의 PfuTurbo DNA 폴리머라아제에 의해 온도 사이클링 동안 연장된다. 올리고뉴클레오티드 프라이머의 혼입시에, 스태거드 닉(staggered nick)을 포함하는 돌연변이된 플라스미드가 생성된다. 증폭된 비메틸화 생성물을 Dpn I로 처리하여 메틸화 모 DNA 주형을 절단하고, 돌연변이를 포함하는 새롭게 합성된 DNA에 대하여 선발한다. 대부분의 이. 콜라이 스트레인으로부터 단리된 DNA는 dam 메틸화되어 있기 때문에, 이것은 Dpn I 절단에 민감한데, 상기 Dpn I 절단은 메틸화 및 헤미메틸화 DNA에 특이적이다. 반응 생성물로 이. 콜라이의 고효율 스트레인을 형질전환시켜 요망되는 변형을 포함하는 플라스미드를 수득한다. 폴리펩티드 내로의 아미노산 변형의 추가의 도입 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본원에서 또한 사용될 수 있다.
단백질에 대한 적합한 변형은 특정 잔기들 또는 잔기들의 조합의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. T 세포 에피토프의 제거에 있어서, T 세포 에피토프의 활성의 감소 또는 제거를 달성할 것으로 예측되는 아미노산 서열 내의 적절한 지점 또는 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 행한다. 실제, 적절한 지점 또는 아미노산 잔기는 바람직하게는 MHC 클래스 II 결합 홈 내에 제공된 포켓들 중 하나 내에서의 아미노산 잔기 결합에 해당한다. 그러한 변형은 당해 펩티드의 소위 "P1" 또는 "P1 앵커" 위치에서 클레프트(cleft)의 제1 포켓 내에서의 결합을 변경시킬 수 있다. 펩티드의 P1 앵커 잔기와 MHC 클래스 II 결합 홈의 제1 포켓 사이의 결합 상호작용의 본질은 전 펩티드에 대한 전체 결합 친화도의 주요 결정자인 것으로 인식된다. 아미노산 서열의 이 위치에서의 적절한 치환은 일반적으로 포켓 내에 덜 쉽게 수용되는 아미노산 잔기를 포함시킨다(예를 들어, 더욱 친수성인 잔기로의 치환). MHC 결합 클레프트 내의 다른 포켓 영역 내의 결합과 동등한 위치에서의 펩티드 내의 아미노산 잔기가 또한 고려되며 본 발명의 범주하에 있다.
주어진 잠재적 T 세포 에피토프 내의 단일 아미노산 변형은 하나 이상의 T 세포 에피토프가 제거될 수 있는 한 가지 경로를 나타냄이 이해된다. 단일 에피토프 내의 변형들의 조합이 고려될 수도 있으며, 이는 개별적으로 규정된 에피토프가 서로와 중첩된 상태로 있을 경우 적절할 수 있다. 게다가, 아미노산 변형 (주어진에피토프 내에서 단독으로 또는 단일 에피토프 내에서 조합되어)은 MHC 클래스 II 결합 홈과 관련하여 "포켓 잔기"와 동등하지 않은 위치에서, 그러나 당해 아미노산 서열 내의 임의의 지점에서 행해질 수 있다. 변형은 상동성 구조를 참고로 하여 행해질 수 있거나, 또는 당업계에 공지되고 본원에 기술된 인 실리코 기술을 이용하여 생성된 구조적 방법은 당해 폴리펩티드의 공지된 구조적 특징을 기반으로 할 수 있다. 변화(변형)가 변이체형 분자의 구조 또는 생물학적 활성의 복구에 고려될 수 있다. 그러한 보상적 변화 및 변화들은 폴리펩티드로부터의 특정 아미노산 잔기의 결실 또는 부가(삽입)를 또한 포함할 수 있다. 추가로, 상기 분자의 구조를 변경시키고/시키거나 생물학적 활성을 감소시키고 또한 T 세포 에피토르를 제거함으로써 상기 분자의 면역원성을 감소시키는 변형이 행해질 수 있다. 모든 유형의 변형이 본원에서 고려된다.
단백질 분자로부터 에피토프를 제거하는 추가의 수단은, 본원에 약술된 나이브 T 세포 활성화 분석 방법을 국제 특허 공개 제WO 02/069232호에 기술된 방법에 따라 개발된 인 실리코 툴과 함께 공동으로 사용하는 것인데, 상기 국제 특허 공개도 본원에 참고로 완전히 포함된다. 상기 소프트웨어는 임의의 주어진 폴리펩티드 서열에 있어서 결합 스코어를 제공하기 위하여 폴리펩티드-MHC 클래스 II 결합 상호작용의 수준에서 항원 제시 과정을 시뮬레이션한다. 그러한 스코어는 당해 집단 내에 현존하는 우세한 MHC 클래스 II 알로타입 중 다수에 대하여 결정된다. 이 방법은 임의의 폴리펩티드 서열을 테스트할 수 있기 때문에, 폴리펩티드가 MHC 클래스 II 결합 홈과 상호작용하는 능력과 관련한 아미노산 치환, 부가 또는 결실의 결과는 예측될 수 있다. 결과적으로, 새로운 서열의 조성이 디자인될 될 수 있으며, 이는 MHC 클래스 II와 상호작용하고 그에 의해 면역원성 T 세포 에피토프로서의 기능을 할 수 있는 감소된 수의 아미노산을 포함한다. 임의의 하나의 주어진 공여체 샘플을 사용한 생물학적 분석법이 최대 4가지의 알로타입에의 결합을 평가할 수 있을 경우, 인 실리코 공정은 40가지 초과의 알로타입을 사용하여 동시에 사용하여 동일 폴리펩티드 서열을 테스트할 수 있다. 실제로, 이 접근법은 다수의 MHC 알로타입과 상호작용하는 능력이 변경된 새로운 서열 변이체의 디자인을 유도할 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 요망되지 않는 에피토프를 제거할 목적이 달성된 치환의 다수의 대안적인 세트가 도달될 수 있다. 그러나, 생성된 서열은 본원에 개시된 특정 조성과 밀접하게 상동성인 것으로 인식되며, 따라서 본 출원의 범주 내에 있다.
MHC 클래스 II 리간드가 결여된 서열 유사체의 디자인 및 MHC 클래스 II 리간드의 확인을 위한 인 실리코 툴을 생물학적 기반의 T 세포 활성화 분석법을 임의로 이용한 에피토프 맵핑 및 재테스팅과 함께 사용하는 조합된 접근법이 본 출원의 추가의 방법 및 실시양태이다. 이 실시양태에 따른 일반적인 방법은 하기 단계를 포함한다:
i) 나이브 T 세포 활성화 분석법과 관심있는 단백질 서열을 집합적으로 포함하는 합성 펩티드를 이용하여 T 세포 활성화가 가능한 에피토프 영역을 확인하는 단계;
ii) 상기 펩티드 리간드와 하나 이상의 MHC 알로타입의 결합을 시뮬레이션하여 단계 i)에서 확인된 에피토프 영역을 분석하고 그에 의해 에피토프 영역 내의 MHC 클래스 II 리간드를 확인하는 단계;
iii) 상기 펩티드 리간드와 하나 이상의 MHC 알로타입의 결합을 시뮬레이션하는 컴퓨터 방법을 이용하여 MHC 클래스 II에 더 이상 결합하지 않거나 더욱 적은 수의 MHC 알로타입에 저하된 친화도로 결합하는 에피토프 영역(들) 내에 포함된 MHC 리간드의 서열 유사체를 확인하는 단계; 및 임의로
iv) 나이브 T 세포 활성화 분석법과 관심있는 단백질 내에서 확인된 에피토프 영역을 전적으로 포함하거나 집합적으로 포함하는 합성 펩티드를 사용하여 나이프 T 세포 활성화 분석법에서 서열 유사체를 야생형 (모) 서열과 병행하여 테스트하는 단계.
일 실시양태에서, 비변형 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 비교하여 감소된 면역원성을 나타내는 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법은 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 확인하는 단계, 및 적어도 하나의 확인된 T 세포 에피토프 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변형시키는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 비변형 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 비교하여 감소된 면역원성을 나타내는 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 확인하고, 적어도 하나의 확인된 T 세포 에피토프 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변형시키는 공정에 의해 생성된다.
또 다른 실시양태에서, 비변형 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 비교하여 감소된 면역원성을 나타내는 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 선발 방법은 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 확인하는 단계, 적어도 하나의 확인된 T 세포 에피토프 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변형시키는 단계, 및 비변형 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 비교하여 감소된 면역원성을 나타내는 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 선발하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 T 세포 에피토프는 에피토프의 영역에 의해 추가로 특성화될 수 있다. 그러한 영역은 에피토프 코어, N-말단 및 C-말단을 포함한다. 본원에 사용될 때, "에피토프 코어"는 T 세포 에피토프의 코어 9량체 아미노산 서열을 나타낸다. 에피토프 코어는 N-말단 및/또는 C-말단 상에 코어 9량체 아미노산 서열에 인접한 0, 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 에피토프 코어는 길이가 약 9개 아미노산으로부터 최대 약 15개 아미노산까지의 범위일 수 있다.
본원에 사용될 때, "N-말단"은 에피토프 코어의 N-말단에 인접한 아미노산을 나타내며, 에피토프 코어의 N-말단에 인접하여 그리고 그 상류에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 아미노산을 포함한다.
본원에 사용될 때, "C-말단"은 에피토프 코어의 C-말단에 인접한 아미노산을 나타내며, 에피토프 코어의 C-말단에 인접하여 그리고 그 하류에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 아미노산을 포함한다.
일 실시양태에서, 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하나 이상의 변형을 포함한다.
일 실시양태에서, 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 2개의 변형을 포함한다.
일 실시양태에서, 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 3개의 변형을 포함한다.
일 실시양태에서, 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 4개의 변형을 포함한다.
일 실시양태에서, 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 5개의 변형을 포함한다.
일 실시양태에서, 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 6개의 변형을 포함한다.
일 실시양태에서, 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 7개의 변형을 포함한다.
일 실시양태에서, 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 8개의 변형을 포함한다.
일 실시양태에서, 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 9개의 변형을 포함한다.
일 실시양태에서, 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 10개의 변형을 포함한다.
일 실시양태에서, 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 최대 20개까지의 변형을 포함한다.
서열 번호 93에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VΚ1AA) 및 서열 번호 89에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH1A2)을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
서열 번호 88, 89, 90, 91 및 92 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
서열 번호 93, 94, 95, 96, 97, 100, 102 및 103 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
서열 번호 89에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 93에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서,
(i) 중쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 49 위치에서 알라닌(A) 또는 세린(S)에 의한 글리신(G)의 치환; 51 위치에서 이소루신(I)에 의한 알라닌(A)의 치환; 52b 위치에서 아르기닌(R) 또는 아스파라긴(Q)에 의한 리신(K)의 치환; 78 위치에서 발린(V)에 의한 루신(L)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함하고;
(ii) 경쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 4 위치에서 루신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환; 19 위치에서 발린(V)에 의한 알라닌(A)의 치환; 22 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 48 위치에서 이소루신(I)에 의한 알라닌(A)의 치환; 및 51 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함한다.
서열 번호 88, 89, 90, 91 및 92에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 93, 95, 96, 97, 100, 102 또는 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
전술한 실시예 및 실시양태에 더하여, 하나 이상의 T 세포 에피토프 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 고려된다. 비제한적 일 실시예에서, 적어도 하나의 T 세포 에피토프 내에 적어도 하나의 변형을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다. 또 다른 비제한적 실시예에서, 본원에 기술된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 T 세포 에피토프에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다. 추가의 비제한적 실시예는 하나 초과의 T 세포 에피토프 내에 하나 초과의 아미노산 변형을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 상기에 기술된 T 세포 에피토프, 임의의 수의 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서의 아미노산 변형들의 임의의 조합이 본원에서 고려된다.
T 세포 에피토프 및 알로타입 빈도
항원 내에서 발견되는 개개의 에피토프는 특정 MHC 클래스 II 알로타입에 의해 우선적으로 제시될 수 있으며, 이와 유사하게, 동일 항원 내의 다른 특정 에피토프는 MHC 클래스 II 분자상에서 전혀 제시되지 않을 수도 있다. 특정 에피토프와 특정 MCH 클래스 II 분자의 그러한 회합운 개체의 MHC 클래스 II 알로타입에 의존적인 것으로 밝혀졌다. 특정 에피토프와 특정 알로타입의 회합은 또한 T 세포 에피토프의 제거를 위하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 변형시킬 때 고려될 수 있다. 그러한 고려는 특정 알로타입에 있어서(예를 들어, 특정 MHC 클래스 II 알로타입을 갖는 대상체의 특정 집단에 있어서) 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 고도로 특이적인 변형을 허용할 수 있다. 대상체 또는 대상체들의 MHC 클래스 II 알로타입은 당업계에 공지된 유전자형 결정법에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 따라서 그 알로타입에 대하여 맞추어지는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 변형에서의 고려에 있어서 T 세포 에피토프와 주어진 알로타입의 회합은 용이하게 확인될 수 있다. T 세포 에피토프와 MHC 클래스 II 알로타입 사이의 회합의 확인은 하기 실시예에서 더욱 상세하게 기술되어 있다. 주어진 에피토프에 대하여 확인된 MHC 클래스 II 회합에 대하여 맞추어진 T 세포 에피토프 변형을 갖는 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 고려된다.
D. 항- 엔도글린 항체
모든 FR 및/또는 CDR 코딩 핵산 및 모든 선택된 아미노산 위치에서의 변화의 동시 포함은 당업계의 숙련자에게 공지된 다양한 방법에 의해 성취될 수 있으며, 이는 예를 들어 재조합적 및 화학적 합성을 포함한다. 예를 들어, 동시적 포함은 예를 들어 공여체 CDR 코딩 핵산과 함께 융합되는 억셉터 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하고, 가변 아미노산 잔기를 갖는 것에 대하여 선발된 위치에 복수개의 상응하는 아미노산 코돈을 포함시킴으로써 성취될 수 있다.
엔도글린에 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다. 엔도글린에 결합하며 혈관신생/신혈관형성, 소혈관의 확장 및/또는 과도한 혈관신생과 관련된 질환을 (부분적으로 또는 완전히) 억제하거나 (부분적으로 또는 완전히) 관리/치료하는 항체 및 그의 항원 결합 단편이 또한 제공된다. 이와 유사하게, 엔도글린 기능(예를 들어, 신호전달, 결합, 활성화 등)의 억제는 엔도글린을 억제하거나 엔도글린에 결합한다는 의미 내에 또한 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 엔도글린에의 결합에 의해 혈관신생을 억제한다. 또한 본 출원은 항체의 제조에 사용될 수 있는 세포주, 세포주의 생성 방법, 항체 또는 항원 결합 단편의 발현 및 그의 정제 방법을 제공한다.
본원에 개시된 방법을 이용하여 생성된, 엔도글린에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 단편은 ELISA를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 통상적인 방법을 이용하여 엔도글린에 결합하는 능력에 대하여 본원에 제공되거나 당업계에 공지된 분석법을 이용하여 테스트될 수 있음을 인식할 수 있다. 본원에 개시된 항체의 친화도가 BIAcore 또는 표면 플라스몬 공명을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 통상적인 방법을 이용하여 또한 결정될 수 있다.
본원에 개시된 항체 및 그의 항원 결합 단편은 TRC105 항체의 VH 및 VL 서열의 인간화에 의해 구성되었다. 이러한 인간화의 성취를 위하여, TRC105의 VH 및 VL 사슬의 3차원 모델이 생성 및 분석되었다. 그 후 상기 VH 및 VL 서열은 인간 생식세포계 서열의 데이터베이스와 개별적으로 비교되었는데, 그로부터 인간 VH 및 VL 서열이 TRC105의 VH 및 VL 서열에 대한 그의 상동성을 기반으로 하여 선택되었다. 인간화용으로 선택된 인간 VL 서열은 02/012(VK1-39)(서열 번호 2)였다. 02/012는 TRC105와의 서열 동일성이 65%이며, 상기 유전자는 인간 생식세포계 레파토리에서 고도로 발현된다. 인간화용으로 선택된 인간 VH 서열은 VH3-15(서열 번호 40)였다. VH3-15는 TRC105와의 서열 동일성이 70%이며, 인간 생식세포계 레파토리에서 합리적인 빈도로 발현된다. TRC105와 인간 서열 사이에 상이한 아미노산 위치를 TRC105의 3D 모델로 조사하여 어느 치환을 변형에 고려할지를 결정하였다. 3D 모델 분석을 기반으로 한 아미노산 선택 기준은 예를 들어 아미노산에 관련된 입체 효과, 아미노산의 상대적인 전하, 및 가변 중쇄 및/또는 경쇄 내에서의 아미노산의 위치를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니었다. 인간 프레임워크 영역에 있어서의 확인된 그리고 제안된 치환은 02 및 VH3-15 인간 프레임워크 영역 내로 포함되며, TRC105의 CDR은 상응하는 02 및 VH3-15 인간 프레임워크 영역 내로 그래프팅되어 다수의 인간화 항체 또는 항원 결합 단편이 생성되게 한다. 추가로, 경쇄의 FR-4는 인간 J 생식세포계 서열 Jk4로부터 유래된다. 이와 유사하게, 중쇄의 FR-4는 인간 J 생식세포계 서열 JH4로부터 유래된다.
엔도글린에 결합하는 인간화 항체 및 항원 결합 단편이 본원에 개시된다. 엔도글린에 결합하며 혈관신생을 억제하는 인간화 항체 및 항원 결합 단편이 또한 본원에 개시된다. 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은 상기에 기술한 바와 같이 생성되었다.
항체 및 그의 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH), 가변 경쇄(VL), 이들 둘 모두, 또는 그의 결합 부분을 가질 수 있다. 일 실시양태에서, VH 사슬은 임의의 서열 번호 41-43에 기재된 아미노산 서열, 또는 그의 결합 부분을 갖는다. 그러한 VH 사슬은 임의의 서열 번호 44-62에 기재된 프레임워크 영역 서열을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, VL 사슬은 임의의 서열 번호 3-5에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 결합 부분을 갖는다. 그러한 VL 사슬은 임의의 서열 번호 6-38에 기재된 프레임워크 영역 서열을 가질 수 있다.
서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 중쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 49 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환; 76 위치에서 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환; 77 위치에서 아르기닌(R)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 78 위치에서 발린(V)에 의한 루신(L)의 치환; 82a 위치에서 이소루신(I)에 의한 아스파라긴(N)의 치환; 89 위치에서 이소루신(I) 또는 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 94 위치에서 아르기닌(R) 또는 글리신(G)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 108 위치에서 트레오닌(T)에 의한 루신(L)의 치환; 109 위치에서 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 113 위치에서 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함하며, 경쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 1 위치에서 글루타민(Q)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 3 위치에서 발린(V)에 의한 글루타민(Q)의 치환; 4 위치에서 루신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환; 5 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 36 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환; 46 위치에서 프롤린(P)에 의한 루신(L)의 치환; 47 위치에서 트립토판(W)에 의한 루신(L)의 치환; 60 위치에서 발린(V) 또는 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환; 70 위치에서 세린(S)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 71 위치에서 티로신(Y)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환; 100 위치에서 알라닌(A)에 의한 글루타민(G)의 치환; 및 106 위치에서 루신(L)에 의한 이소루신(I)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
서열 번호 41, 42, 또는 43에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 3, 4, 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 43에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 43에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 43에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 그러한 항체는 엔도글린에 결합하고 혈관신생을 억제할 수 있다.
임의의 그러한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 76 위치에서 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환; 77 위치에서 아르기닌(R)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 82a 위치에서 이소루신(I)에 의한 아스파라긴(N)의 치환; 89 위치에서 이소루신(I) 또는 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 94 위치에서 글리신(G)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 108 위치에서 트레오닌(T)에 의한 루신(L)의 치환; 109 위치에서 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 및 113 위치에서 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함할 수 있으며, 경쇄 가변 영역은 1 위치에서 글루타민(Q)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 3 위치에서 발린(V)에 의한 글루타민(Q)의 치환; 5 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 36 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환; 60 위치에서 발린(V) 또는 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환; 70 위치에서 세린(S)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 100 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환; 및 106 위치에서 루신(L)에 의한 이소루신(I)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함할 수 있다.
(i) 서열 번호 66의 CDR1, 서열 번호 67의 CDR2, 및 서열 번호 68의 CDR3;
(ii) 서열 번호 44의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 제외한 서열 번호 44의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR1;
(iii) 서열 번호 45의 아미노산 서열 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 49 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환을 제외한 서열 번호 45의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR2; 및
(iv) 서열 번호 47의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 76 위치에서 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환;
(b) 77 위치에서 아르기닌(R)에 의한 트레오닌(T)의 치환;
(c) 78 위치에서 발린(V)에 의한 루신(L)의 치환;
(d) 82a 위치에서 이소루신(I)에 의한 아스파라긴(N)의 치환;
(e) 89 위치에서 이소루신(I) 또는 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 및
(f) 94 위치에서 아르기닌(R) 또는 글리신(G)에 의한 트레오닌(T)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 47의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR3; 및
(v) 서열 번호 56의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 108 위치에서 트레오닌(T)에 의한 루신(L)의 치환;
(b) 109 위치에서 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 및
(c) 113 위치에서 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역과,
(i) 서열 번호 63의 CDR1, 서열 번호 64의 CDR2 및 서열 번호 65의 CDR3;
(ii) 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 1 위치에서 글루타민(Q)에 의한 아스파르트산(D)의 치환;
(b) 3 위치에서 발린(V)에 의한 글루타민(Q)의 치환;
(c) 4 위치에서 루신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환; 및
(d) 5 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR1;
(iii) 서열 번호 20의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 36 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환;
(b) 46 위치에서 프롤린(P)에 의한 루신(L)의 치환; 및
(c) 47 위치에서 트립토판(W)에 의한 루신(L)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR2;
(iv) 서열 번호 28의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 60 위치에서 발린(V) 또는 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환;
(b) 70 위치에서 세린(S)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 및
(b) 71 위치에서 티로신(Y)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR3; 및
(v) 서열 번호 35의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 100 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환; 및
(b) 106 위치에서 루신(L)에 의한 이소루신(I)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 66에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 번호 67에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 번호 68에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 번호 63에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 번호 64에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 번호 65에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 엔도글린에 결합하며, 서열 번호 44에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 FR1, 서열 번호 45에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 FR2, 서열 번호 47에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 FR3, 서열 번호 56에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 FR4를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 엔도글린에 결합하며, 서열 번호 44에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 FR1, 서열 번호 46에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 FR2, 서열 번호 48에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 FR3, 서열 번호 56에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 FR4를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 FR1, 서열 번호 20에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 FR2, 서열 번호 28에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 FR3, 및 서열 번호 35에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 FR4를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 엔도글린에 결합하며, 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 FR1, 서열 번호 21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 FR2, 서열 번호 29에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 FR3, 및 서열 번호 35에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 FR4를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 FR1, 서열 번호 21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 FR2, 서열 번호 29에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 FR3, 및 서열 번호 35에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 FR4를 포함한다.
서열 번호 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 중쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 49 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환; 76 위치에서 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환; 77 위치에서 아르기닌(R)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 78 위치에서 발린(V)에 의한 루신(L)의 치환; 82a 위치에서 이소루신(I)에 의한 아스파라긴(N)의 치환; 89 위치에서 이소루신(I) 또는 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 94 위치에서 트레오닌(T) 또는 글리신(G)에 의한 아르기닌(R)의 치환; 108 위치에서 트레오닌(T)에 의한 루신(L)의 치환; 109 위치에서 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 및 113 위치에서 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함하고, 경쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 1 위치에서 글루타민(Q)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 3 위치에서 발린(V)에 의한 글루타민(Q)의 치환; 4 위치에서 루신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환; 5 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 36 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환; 46 위치에서 루신(L)에 의한 프롤린(P)의 치환; 47 위치에서 루신(L)에 의한 트립토판(W)의 치환; 60 위치에서 발린(V) 또는 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환; 70 위치에서 세린(S)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 71 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환; 100 위치에서 알라닌(A)에 의한 글루타민(G)의 치환; 및 106 위치에서 루신(L)에 의한 이소루신(I)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함한다.
(i) 서열 번호 66의 CDR1, 서열 번호 67의 CDR2, 및 서열 번호 68의 CDR3;
(ii) 서열 번호 44의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 제외한 서열 번호 44의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR1;
(iii) 서열 번호 45의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 49 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환을 제외한 서열 번호 45의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR2; 및
(iv) 서열 번호 47의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 76 위치에서 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환;
(b) 77 위치에서 아르기닌(R)에 의한 트레오닌(T)의 치환;
(c) 78 위치에서 발린(V)에 의한 루신(L)의 치환;
(d) 82a 위치에서 이소루신에 의한 아스파라긴(N)의 치환;
(e) 89 위치에서 이소루신(I) 또는 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 및
(f) 94 위치에서 트레오닌(T) 또는 글리신(G)에 의한 아르기닌(R)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 47의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR3; 및
(v) 서열 번호 56의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 108 위치에서 트레오닌(T)에 의한 루신(L)의 치환;
(b) 109 위치에서 루신(L)에 의한 발린(V)의 치환; 및
(c) 113 위치에서 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역과,
(i) 서열 번호 63의 CDR1, 서열 번호 64의 CDR2, 및 서열 번호 65의 CDR3;
(ii) 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 1 위치에서 글루타민(Q)에 의한 아스파르트산(D)의 치환;
(b) 3 위치에서 발린(V)에 의한 글루타민(Q)의 치환;
(c) 4 위치에서 루신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환; 및
(d) 5 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR1;
(iii) 서열 번호 21의 아미노산 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 36 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환;
(b) 46 위치에서 루신(L)에 의한 프롤린(P)의 치환; 및
(c) 47 위치에서 루신(L)에 의한 트립토판(W)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR2;
(iv) 서열 번호 29의 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 60 위치에서 발린(V) 또는 알라닌(A)에 의한 세린(S)의 치환;
(b) 70 위치에서 세린(S)에 의한 아스파르트산(D)의 치환; 및
(b) 71 위치에서 페닐알라닌(F)에 의한 티로신(Y)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR3; 및
(v) 서열 번호 35의 서열, 또는 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우
(a) 100 위치에서 알라닌(A)에 의한 글리신(G)의 치환; 및
(b) 106 위치에서 루신(L)에 의한 이소루신(I)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 제외한 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
가변 도메인의 실질적인 부분은 3개의 CDR 영역을 그의 개재 프레임워크 영역과 함께 포함한다. 상기 부분은 적어도 약 50%의 제1 및 제4 프레임워크 영역 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두를 또한 포함할 수 있으며, 상기 50%는 제1 프레임워크 영역의 C-말단 50% 및 제4 프레임워크 영역의 N-말단 50%이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N-말단 또는 C-말단에서의 추가의 잔기는 자연 발생 가변 도메인 영역과 정상적으로 관련되지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 본원에 개시된 인간화 엔도글린 항체 및 그의 항원 결합 단편의 구성체는 클로닝 또는 기타 조작 단계를 돕기 위하여 도입된 링커에 의해 코딩되는 N- 또는 C-말단 잔기의 도입을 생성할 수 있다. 다른 조작 단계는, 하기에서 더욱 상세하게 논의된 바와 같이 단백질 표지, 면역글로불린 중쇄 또는 다른 가변 도메인(예를 들어, 다이아바디의 생성에 있어서)을 포함하는 추가의 단백질 서열에 가변 도메인을 연결시키기 위한 링커의 도입을 포함한다.
실질적으로 본원에 개시된 항체의 CDR3 영역으로서 설명된 아미노산 서열을 갖는 인간화 엔도글린 CDR3은 엔도글린에의 CDR3 영역의 결합을 허용하는 구조로 운반된다. CDR3을 운반하는 구조는 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 그의 실질적인 부분의 것일 수 있으며, 여기서 CDR3은 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 자연 발생 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR3에 상응하는 위치에 위치한다.
비제한적 일 실시예에서, 서열 번호 68에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는 가변 중쇄 및/또는 서열 번호 65에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다. 일 실시양태에서, 가변 중쇄는 서열 번호 68에 기재된 CDR3 아미노산 서열에 의한 CDR3의 치환을 제외한 서열 번호 40에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 가변 경쇄는 서열 번호 65에 기재된 CDR3 아미노산 서열에 의한 CDR3의 치환을 제외한 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 추가로, 그러한 CDR3 함유 가변 영역/사슬은 상기에 기재된, 예를 들어 상기에 기술된 하나 이상의 FR 아미노산 서열(또는 하나 이상의 추가의 변형을 포함하는 그러한 FR)을 포함할 수 있으며, 여기서, 항체 또는 항원 결합 단편은 VH 및 VL 영역 각각에 3개의 CDR 및 4개의 FR을 가지며, 엔도글린에 대하여 특이적 결합 활성을 가지며 혈관신생을 억제할 수 있다. 추가로, 다양한 항체 J 세그먼트가 가변 영역 사슬 내에서의 추가의 변이를 위하여 이들 가변 영역 내에서 또한 치환될 수 있다.
일 측면에서, 본원에 개시된 가변 중쇄 및 경쇄는 FR4 서열의 추가의 대체에 의해 또한 생성될 수 있다. 일 실시양태에서, 중쇄 FR4 서열은 하기 중 하나가 치환될 수 있다:
Figure pct00001
일 실시양태에서, 경쇄 FR 서열은 하기 중 하나가 치환될 수 있다:
Figure pct00002
대안적으로 "수퍼인간화" 항-엔도글린 항체로 명명된 항-엔도글린 항체의 인간화 버전, 또는 그의 항원 결합 단편이 본원에서 추가로 제공되며, 이는 서열 번호 71 또는 72에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 75에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 본원에 개시된 인간화 항-엔도글린 항체 또는 항원 결합과 경쟁할 수 있는 인간화 항체를 제공하는데, 이는 상기 항체의 VH 및 VL 서열을 갖는 항체의 적어도 5%가 ELISA 분석에서의 그러한 항체와의 경쟁에 의해 엔도글린에의 결합이 차단되는 조건하에 경쟁할 수 있다.
엔도글린에 결합하여 엔도글린 활성을 조정하는 중화 항체 또는 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다. 중화 항체는 예를 들어 엔도글린에의 결합에 의해 혈관신생을 억제할 수 있다.
음성 대조군보다 적어도 2배, 적어도 3 배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배의, 또는 그 초과의, 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 의한 혈관신생의 억제율(%)은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 혈관신생을 억제함을 나타낸다. 음성 대조군보다 2배 미만으로 더 큰, 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 혈관신생의 억제율(%)은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 혈관신생을 억제하지 않음을 나타낸다.
엔도글린에의 항체 또는 항원 결합 단편의 결합은 혈관신생을 부분적으로(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 안의 임의의 수) 또는 완전히 억제한다. 항체 또는 항원 결합 단편의 중화 또는 억제 활성은 시험관내 분석법을 이용하여 및/또는 당업계에서 인식된 분석법, 예컨대 본원에 기술되거나 다르게는 당업계에 공지된 것을 이용하여 생체내에서 결정될 수 있다.
일 측면에서, 상기에 기술된 인간화 항체들 중 어느 하나의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', Fd, F(ab')2, Fv, scFv, 단일쇄 결합 폴리펩티드(예를 들어, Fc 부분을 갖는 scFv) 또는 그의 임의의 다른 기능성 단편이며 이는 본원에 기술된 바와 같다.
본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기에 더욱 상세하게 기술되는 검출 또는 진단적 응용에 유용하다. 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편은 엔도글린에의 결합에 유용하며, 이는 다시 혈관 신생을 억제할 수 있는데, 이는 본원에 기술된 바와 같다.
본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 필요할 경우 요망되는 기능성을 유지하면서 항체의 특이적 특성이 변경되도록 추가로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 당해 화합물은 생체내 안정성, 용해성, 생체이용성 또는 반감기와 같은 화합물의 약동학적 특성이 변경되도록 변형시킬 수 있다. 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 진단 및/또는 치료 응용에서 사용하기 위하여 치료적 모이어티, 검출 가능 모이어티 또는 이들 둘 모두를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 면역컨쥬게이트(immunoconjugate)로서 또한 사용될 수 있다. 본원에 사용될 때, 명세서 및 특허청구범위의 목적상, 면역컨쥬게이트는 본 발명에 따른 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 단편 및 적어도 하나의 치료적 표지로 이루어진 컨쥬게이트를 나타낸다. 치료적 표지는 항종양제 및 혈관신생 억제제를 포함한다. 그러한 항종양제는 당업계에 공지되어 있으며, 독소, 약물, 효소, 사이토카인, 방사성 핵종, 광역학적 에이전트(photodynamic agent), 및 혈관신생 억제제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 독소는 리신 A 사슬, 돌연변이형 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소, 디프테리아 톡소이드, 스트렙토니그린, 보아마이신, 사포린, 겔로닌, 및 미국자리공 항바이러스 단백질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 약물은 다우노루비신, 메토트렉세이트 및 칼리케아미신류를 포함한다. 방사성 핵종은 방사성 금속을 포함한다. 사이토카인은 형질전환 성장 인자(TGF)-β, 인터류킨, 인터페론 및 종양 괴사 인자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 광역학적 에이전트는 포르피린 및 그의 유도체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가의 치료적 표지는 당업계에 공지되어 있으며, 본원에서 또한 고려된다. 적어도 하나의 항종양제를 이용한 항-엔도글린 MaB 또는 그의 단편의 복합체화 방법은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다(즉, 문헌[Ghetie et al., 1994, Pharmacol. Ther. 63:209-34]에 개관된 항체 컨쥬게이트). 그러한 방법에서는 분자들의 커플링 또는 연결에 사용되는 몇몇 이용가능한 헤테로2작용성 시약들 중 하나가 이용될 수 있다. 추가의 방사성 핵종, 예컨대 치료적 및 진단적 표지가 분자들을 연결하는 추가의 방법과 함께 본원에 추가로 기술되어 있다.
항체 또는 그의 항원 결합 단편은 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 부가에 의한 것과 같이 다양한 목적을 위하여 당업계에 공지된 기술을 사용하여 변형될 수 있다. PEG 변형(PEG화)은 개선된 순환 시간, 개선된 용해성, 단백질 분해에 대한 개선된 내성, 개선된 항원성 및 면역원성, 개선된 생체이용성, 감소된 독성, 개선된 안정성, 및 더욱 용이한 제형화 중 하나 이상에 이르게 될 수 있다(개관에 대해서는 문헌[Francis et al., International Journal of Hematology 68: 1-18, 1998] 참조).
Fc 부분을 포함하지 않는 항원 결합 단편의 경우, Fc 단편을 (예를 들어 재조합적으로) 상기 부분에 부가하여 예를 들어 환자에게 투여될 때 혈액에서의 순환에 있어서의 항원 결합 단편의반감기를 증가시킬 수 있다. 그러한 단편을 포함시키는 방법 및 적합한 Fc 영역의 선택은 당업계에 공지되어 있다. IgG의 Fc 영역을 관심있는 폴리펩티드 내로 포함시켜서 그의 순환 반감기는 증가시키지만 그의 생물학적 활성은 상실되지 않게 하는 것이 예를 들어 미국 특허 제6,096,871호에 기술된 것과 같은 당업계에 공지된 통상적인 기술을 이용하여 성취될 수 있는데, 상기 미국 특허는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 항체의 Fc 부분은 환자에게 투여될 때 혈액에서의 순환에 있어서 항원 결합 단편의 반감기가 증가되도록 추가로 변형될 수 있다. 변형은 예를 들어 미국 특허 제7,217,798호에 기술된 것과 같은 당업계의 통상적인 수단을 이용하여 결정될 수 있는데, 상기 미국 특허는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
미국 특허 제7,091,321호 및 미국 특허 제6,737,056호에 기술된 것과 같이 순환 중인 항체 기반 융합 단백질의 반감기를 개선시키는 한 가지 방법이 또한 공지되어 있는데, 상기 미국 특허 각각은 본원에 참고로 포함된다. 추가로, 항체 및 그의 항원 결합 단편은 이것이 그의 복합 N-글리코사이드 연결된 당 사슬상의 푸코스를 포함하지 않도록 생성되거나 발현될 수 있다. 복합 N-글리코사이드 연결된 당 사슬로부터의 푸코스의 제거는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 항체 및 항원 결합 단편의 이펙터 기능을 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 이와 유사하게, 엔도글린에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 그의 C-말단에서 임의의 항체 이소타입, 예를 들어 IgG, IgA, IgE, IgD 및 IgM과 임의의 이소타입 하위클래스, 특히 IgG1, IgG2b, IgG2a, IgG3 및 IgG4로부터 유래된 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부에 부착될 수 있다.
추가로, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 이것이 혈뇌 장벽을 가로지를 수 있도록 변형될 수 있다. 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편의 그러한 변형은 뇌질환, 예컨대 다형성 교아종(glioblastoma multiforme, GBM)의 치료를 허용한다. 항체 또는 항원 결합 단편과 같은 단백질이 혈뇌 장벽을 가로지르게 하는 예시적인 변형이 미국 특허 공개 제2007/0082380호에 기술되어 있는데, 상기 미국 특허 공개는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
면역글로불린의 글리코실화는 그의 이펙터 기능, 구조적 안정성, 및 항체 생성 세포로부터의 분비 속도에 유의한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다(문헌[Leatherbarrow et al., Mol. Immunol. 22:407 (1985)]). 이들 특성에 책임이 있는 탄수화물기는 일반적으로 항체의 불변(C) 영역에 부착된다. 예를 들어, CH2 도메인 내의 아스파라긴 297에서의 IgG의 글리코실화는 IgG가 보체 의존성 세포용해의 고전적인 경로를 활성화시키는 전능력에 요구된다(문헌[Tao and Morrison, J. Immunol. 143:2595 (1989)]). CH3 도메인에서의 아스파라긴 402에서의 IgM의 글리코실화는 항체의 적당한 조립 및 세포용해 활성에 필요하다(문헌[Muraoka and Shulman, J. Immunol. 142:695 (1989)]). IgA 항체의 CH1 및 CH3 도메인의 162 및 419 위치로서의 글리코실화 부위의 제거는 세포내 분해 및 적어도 90%의 분비 억제에 이르게 된다(문헌[Taylor and Wall, Mol. Cell. Biol. 8:4197 (1988)]). 추가로, 항체 및 그의 항원 결합 단편은 이것이 그의 복합 N-글리코사이드 연결된 당 사슬상의 푸코스를 포함하지 않도록 생성 또는 발현될 수 있다. 복합 N-글리코사이드 연결된 당 사슬로부터의 푸코스의 제거는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 항체 및 항원 결합 단편의 이펙터 기능을 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 이들 "탈푸소실화된" 항체 및 항원 결합 단편은, 복합 N-글리코사이드 연결된 당 사슬내에 푸코스를 포함하는 것에 필요한 생화학적 경로 및 효소를 더 이상 포함하지 않도록 유전자 조작된 세포주, 트랜스제닉 식물 또는 트랜스제닉 동물(푸코실트랜스퍼라아제 녹아웃(knock-out) 동물, 식물 또는 세포로도 공지됨)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 당업계에 공지된 분자 클로닝 기술을 이용한 다양한 시스템을 통하여 생성될 수 있다. 푸코실트랜스퍼라아제 녹아웃 세포가 되도록 조작될 수 있는 세포의 비제한적 예는 CHO 세포, SP2/0 세포, NSO 세포 및 YB2/0 세포를 포함한다.
가변(V) 영역에서의 면역글로불린의 글리코실화가 또한 관찰되었다. 속스(Sox) 및 후드(Hood)는 약 20%의 인간 항체가 V 영역에서 글리코실화됨을 보고하였다(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66:975 (1970)]). V 도메인의 글리코실화는 V 영역 서열 내의 N-연결된 글리코실화 신호 Asn-Xaa-Ser/Thr의 우발적인 출현에서 생기는 것으로 여겨지며, 당업계에서는 면역글로불린 기능에 그 역할을 하는 것으로는 인식되지 않았다.
가변 도메인 프레임워크 잔기에서의 글리코실화는 항체와 항원의 결합 상호작용을 변경시킬 수 있다. 본 발명은 항체의 친화도 증가를 위하여 인간화 면역글로불린 사슬의 CDR 또는 프레임워크 내의 제한된 수의 아미노산을 선택하여 돌연변이시키는(예를 들어, 잔기의 치환, 결실 또는 부가에 의한 것임) 기준을 포함한다.
일반적으로 소정 폴리펩티드 항원에의 결합 친화도는 전형적으로 하나 이상의 CDR에 인접한 구역에서 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역에서 V 영역 프레임워크 내로 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써 조정될 수 있다. 전형적으로, 그러한 돌연변이는 글리코실화 부위 서열을 파괴 또는 생성하지만 폴리펩티드의 수처리적(hydropathic) 구조 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환의 도입을 포함한다. 전형적으로, 프롤린 잔기를 도입하는 돌연변이는 회피된다. 항체 및 그의 항원 결합 단편의 글리코실화는 미국 특허 제6,350,861호에 추가로 기술되어 있으며, 이는 글리코실화와 관련하여 본원에 참고로 포함된다.
항체 또는 그의 결합 단편은 단기간 전달 또는 연장된(장기간) 전달용으로 제형화될 수 있다.
엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 결합 단편은 또한 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이 엔도글린과 관련된 질환 또는 장애를 검출 또는 진단하기 위하여 샘플 또는 환자에 있어서 엔도글린 수준을 검출하고/하거나 엔도글린의 정제에 사용될 수 있다.
그러한 방법을 이용하여 생성된, 엔도글린에 결합하는 인간화 항체, 항원 결합 단편 및 결합 단백질은 그의 결합 친화도, 친화력 및 중화 능력 중 하나 이상에 대하여 테스트될 수 있다. 유용한 인간화 항체, 항원 결합 단편 및 결합 단백질은 혈관신생과 관련된 질병, 질환 또는 장애의 예방, 억제, 관리 또는 치료를 위하여 환자에게 투여하기 위하여 사용될 수 있다.
엔도글린에 결합하는 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 확인하는 방법이 본원에서 제공된다. 항체 및 항원 결합 단편은 결합 친화성, 회합 속도, 해리 속도 및 친화력 중 하나 이상에 대하여 평가될 수 있다. 일 측면에서, 엔도글린 결합 서열이 존재하는 항체는 엔도글린 또는 폴리펩티드의 활성을 중화시키는 그의 능력에 대하여 평가될 수 있다. 결합 친화성, 회합 속도, 해리 속도 및 친화력의 측정은 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA), 스캐차드 분석법, BIAcore 분석법 등과, 일반적으로 사용되고 당업계의 숙련자에게 공지된 다른 분석법을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 당업계에서 인식된 분석법(표면 플라스몬 공명을 포함함)을 이용하여 성취될 수 있다.
예를 들어 혈관신생을 억제하는 항체 및 그의 항원 결합 단편의 능력 및/또는 엔도글린에의 항체의 결합의 측정치는 예를 들어 효소 결합된 면역 흡착 분석법(ELISA), 경쟁적 결합 분석법, ELISPOT 분석법, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 유용한 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 이들 분석법은 일반적으로 사용되며 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다.
비제한적인 일 실시양태에서, ELISA 분석법을 이용하여 엔도글린에 결합하는 특이적 항체 또는 항원 결합 단편의 결합 능력을 측정할 수 있다.
또한 다른 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 비교하여 엔도글린에 대하여 증가된 특이성을 나타내는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 확인하기 위하여 ELISA와 같은 분석법이 이용될 수 있다. 또한 하나 이상의 폴리펩티드를 가로지르는 그리고 엔도글린의 하나 이상의 종을 가로지르는 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 확인하기 위하여 ELISA와 같은 분석법이 이용될 수 있다. 특이성에 대한 분석은 병행 ELISA를 실행함으로써 행할 수 있으며, 여기서, 테스트 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 엔도글린 에피토프를 포함하는 폴리펩티드의 상이한 종상의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 능력에 대하여 별도의 분석 챔버에서 동시에 스크리닝하여 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 확인한다. 당업계의 숙련자에게 친숙한 겉보기 결합 친화도를 측정하는 또 다른 기술로는 표면 플라스몬 공명 기술이 있다(BIAcore 2000 시스템에서 분석함)(문헌[(Liljeblad, et al., Glyco. J. 2000, 17:323-329]). 표준 측정법 및 전통적인 결합 분석법이 문헌[Heeley, R. P., Endocr. Res. 2002, 28:217-229]에 기술되어 있다.
또한 엔도글린에 대한 인간화 항체는 혈관신생과 관련된 다양한 질환 및 질병, 예를 들어 혈관신생/신혈관형성을 특징으로 하는 다양한 형태의 안질환(예를 들어, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 신병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 및 다양한 형태의 암(원발성 종양 및 전이)을 치료하는 그의 능력에 대하여 분석될 수 있다. 당업계의 숙련자에게 공지된 임의의 적합한 분석법을 이용하여 그러한 효과를 모니터링할 수 있다. 몇몇 그러한 기술이 본원에 개시되어 있다. 일 실시예에서, 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은 엔도글린에 결합하는 그의 능력에 대하여 분석된다. 또 다른 실시예에서, 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편의 친화도 상수는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 결정된다. 또 다른 실시예에서, 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은 혈관신생 억제에 대한 그의 영향에 대하여 분석된다.
II . 조성물
본원에 개시된 화합물 각각은 허용되는 담체 또는 부형제와 조합될 때 조성물로서 사용될 수 있다. 그러한 조성물은 개시된 화합물을 이용하여 대상체를 치료하기 위하여 생체내에서 또는 생체외에서 대상체에게 투여하는 데 유용하거나 시험관내 또는 생체내 분석에 유용하다.
따라서, 약학 조성물은 활성 성분에 더하여 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정제 또는 당업계의 숙련자에게 공지된 기타 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 비독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 간섭하지 않아야 한다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 의존적이다.
본원에 개시된 방법에 의해 확인된 관심있는 단백질, 예를 들어 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 제형은 요망되는 정도의 순도를 갖는 단백질을 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 보관용으로, 동결건조 제형 또는 수성 용액 형태로 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수령체에게 비독성인 것이며, 이는 완충제, 예를 들어 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐 피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)®, 플루로닉스(PLURONICS)® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
허용되는 담체는 투여되는 환자에게 생리학적으로 허용가능하며, 상기 담체와 함께/상기 담체 내에서 투여되는 화합물의 치료적 특성을 유지한다. 허용되는 담체 및 그의 제형은 일반적으로 예를 들어 문헌[Remington' pharmaceutical Sciences (18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990)]에 기술되어 있다. 한 가지 예시적인 담체로는 생리식염수가 있다. 본원에 사용될 때, "약학적으로 허용되는 담체"라는 어구는, 하나의 기관, 또는 신체의 일부의 투여 부위로부터 또 다른 기관, 또는 신체의 일부로 대상 화합물을 운반하거나 수송하는 데 연루된, 또는 시험관내 분석 시스템에 연루된, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 약학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 양립가능하며 이것이 투여되는 대상체에게 유해하지 않다는 의미에서 허용가능하다. 허용되는 담체는 또한 대상 화합물의 비활성을 변경시키지 않아야 한다.
일 측면에서, 의약품 투여와 양립가능한, 용매(수성 또는 비수성), 용액, 에멀션, 분산 매질, 코팅, 등장성의 흡수 촉진제 또는 지연제를 포함하는 약학적으로 허용되는 또는 생리학적으로 허용되는 조성물이 본원에서 제공된다. 따라서 약학 조성물 또는 약학적 제형은 대상체에서 의약품 용도에 적합한 조성물을 나타낸다. 약학 조성물 및 제형은 소정량의 본원에 개시된 화합물 및 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
조성물은 특정 투여 경로(즉, 전신 또는 국소)와 양립가능하도록 제형화될 수 있다. 따라서, 조성물은 다양한 경로에 의해 투여하기에 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 조성물에서의 화합물의 안정성을 향상시키고/시키거나 조성물의 방출 속도를 제어하기 위하여 조성물은 필요할 경우 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 허용되는 첨가제는 대상 화합물의 비활성을 변경시키지 않는다. 예시적인 허용되는 첨가제는 당류, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 자일리톨, 트레할로스, 소르보스, 수크로스, 갈락토스, 덱스트란, 덱스트로스, 프룩토스, 락토스 및 그의 혼합물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 허용되는 첨가제는 허용되는 담체 및/또는 부형제, 예컨대 덱스트로스와 조합될 수 있다. 대안적으로, 예시적인 허용되는 첨가제는, 펩티드의 안정성을 증가시키고 용액의 겔화를 감소시키기 위하여 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 계면활성제는 용액의 0.01% 내지 5%의 양으로 조성물에 첨가될 수 있다. 그러한 허용되는 첨가제의 첨가는 보관 중인 조성물의 안정성 및 반감기를 증가시킨다.
약학 조성물은 예를 들어 주사에 의해 투여될 수 있으며, 이는 피하, 피하, 초자체내, 피내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 근육내 주사를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 각각의 유형의 주사를 위한 조성물의 제형에 사용하기 위한 부형제 및 담체가 본원에서 고려된다. 하기 설명은 단지 예로서 있는 것이며, 조성물의 범주를 한정하고자 하는 것은 아니다. 주사용 조성물은 살균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 살균 분말 및 수성 용액(수용성일 경우) 또는 분산액을 포함한다. 정맥내 투여에 있어서, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, 크레모포르(Cremophor) ELTM(미국 뉴저지주 파시파니 소재의 바스프(BASF)), 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 항균제 및 항진균제는 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살을 포함한다. 등장제, 예를 들어 당류, 폴리알코올류, 예컨대 만니톨, 소르비톨 및 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 생성된 용액은 그대로 사용하기 위한 것으로 패키징될 수 있거나, 동결건조될 수 있으며, 동결건조 제제는 이후에 살균 용액과 조합된 후 투여될 수 있다. 정맥내 주사 또는 고통 부위에서의 주사에 있어서, 활성 성분은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구용으로 허용되는 수성 용액의 형태로 존재한다. 당업계의 관련 숙련자라면 예를 들어 염화나트륨 주사제, 링거 주사제(Ringer's Injection), 락테이트화 링거 주사제와 같이 등장성 비히클을 이용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 보존제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 필요할 경우 포함될 수 있다. 살균 주사가능 용액은 필요할 경우 상기에 열거된 성분들 중 하나 도는 그 조합을 포함하는 적절한 용매 내에 필요량의 활성 성분을 포함시키고, 이어서 여과 살균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 살균 비히클 내로 활성 성분을 포함시킴으로써 제조된다. 살균 주사가능 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조이며, 이는 활성 성분 + 이전에 살균 여과된 그의 용액으로부터의 임의의 추가의 요망되는 성분의 분말을 생성한다.
조성물은 통상적으로 초자체내로 투여되거나, 피하 투여되거나, 초자체내 임플란트를 통하여 투여될 수 있다.
조성물은 예를 들어 단위 용량의 주사에 의한 것과 같이 통상적으로 정맥내로 투여될 수 있다. 주사에 있어서, 활성 성분은 실질적으로 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구용으로 허용되는 수성 용액의 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어 염화나트륨 주사제, 링거 주사제, 락테이트화 링거 주사제와 같이 등장성 비히클을 이용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 필요할 경우, 보존제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 포함될 수 있다. 추가로, 조성물은 에어로졸화를 통하여 투여될 수 있다(문헌[Lahn et al., Aerosolized Anti-T-cell-Receptor Antibodies Are Effective against Airway Inflammation and Hyperreactivity, Int. Arch. Allegery Immuno., 134: 49-55 (2004)]).
일 실시양태에서, 예를 들어 조성물을 동결건조시켜 보관 중 저장 수명을 증가시킨다. 조성물이 본원에 제공된 임의의 방법에서 또는 의약에서 사용하기 위한 것으로 고려될 때, 조성물이 인간 환자에게 투여될 때 염증 반응을 야기하지 않거나 안전하지 않은 알러지 반응을 야기하지 않도록 조성물에는 발열원이 실질적으로 없을 수 있음이 고려된다. 발열원에 대한 조성물의 테스트 및 발열원이 실질적으로 없는 조성물의 제조는 당업계의 숙련자에게 잘 이해되며, 이는 구매가능한 키트를 사용하여 성취될 수 있다.
허용되는 담체는 흡수 또는 청소(clearance)를 안정화하거나, 증가시키거나, 지연시키는 화합물을 포함할 수 있다. 그러한 화합물은 예를 들어 탄수화물, 예컨대 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란; 저분자량 단백질; 펩티드의 청소 또는 가수분해를 감소시키는 조성물; 또는 부형제 또는 기타 안정제 및/또는 완충제를 포함한다. 흡수를 지연시키는 에이전트는 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함한다. 리포좀 담체를 포함하여 약학 조성물의 흡수를 안정화하거나 증가 또는 감소시키기 위하여 세제가 또한 사용될 수 있다. 소화로부터 보호하기 위하여 화합물이 조성물과 복합체를 형성하게 하여 화합물이 산 및 효소적 가수분해에 대하여 내성을 갖도록 할 수 있거나, 화합물은 리포좀과 같은 적절한 내성 담체 내에서 복합체를 형성할 수 있다. 화합물을 소화로부터 보호하는 수단은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 치료제의 경구 전달용 지질 조성물을 설명하는 문헌[Fix (1996) Pharm Res. 13: 1760 1764]; 문헌[Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48: 119 135]; 및 미국 특허 제5,391,377호 참조).
"약학적으로 허용되는"이라는 어구는 인간에게 투여될 때 생리학적으로 견디어질 수 있으며 전형적으로 알러지 반응 또는 유사한 적당치 않은 반응, 예컨대 위 연동 이상항진(gastric upset), 현기증 등을 생성하지 않는 분자 실체(entity) 및 조성물을 나타낸다.
치료 조성물에 관하여 사용될 때 "단위 용량"이라는 용어는 인간에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 나타내며, 각각의 단위는 필요한 희석제, 즉, 담체 또는 비히클과 결부되어 요망되는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 물질을 함유한다.
조성물은 투여 제형과 양립가능한 방식으로, 그리고 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 투여될 양은 치료될 대상체, 활성 성분을 이용하는 대상체의 면역계의 능력, 및 요망되는 결합 용량 정도에 의존적이다. 투여에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 개업의의 판단에 의존적이며, 각각의 개체에 대하여 독특하다. 초회 투여 및 추가 접종에 적합한 양생법이 또한 가변적이지만, 초회 투여, 이어서 후속 주사 또는 기타 투여에 의한 1시간 이상의 시간 간격의 반복 투약이 전형적이다. 대안적으로, 혈중 농도의 유지에 충분한 연속 정맥내 주입이 고려된다.
일 실시양태는 본원에 기술된 질병, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기술된 조성물의 용도를 고려한다. 의약은 치료를 필요로 하는 환자/대상체의 신체적 특징을 기반으로 하여 제형화될 수 있으며, 질병, 질환 또는 장애의 기를 기반으로 하여 단일 제형 또는 다중 제형으로 제형화될 수 있다. 의약은 병원 및 클리닉으로의 유통을 위하여 적절한 라벨을 포함하는 적합한 패키지 내에 패키징될 수 있으며, 여기서, 라벨은 본원에 기술된 질환을 갖는 대상체의 치료에 대한 지시사항에 대한 것이다. 의약은 단일 또는 다중 단위로서 패키징될 수 있다. 조성물의 투여량 및 투여에 대한 설명서가 하기에 기술된 바와 같이 패키지에 포함될 수 있다. 추가로 본 발명은 상기에 기술된 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체의 의약에 관한 것이다.
엔도글린에 결합하고 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같은 것을 포함하는 인간화 항체 및 그의 항원 결합 단편의 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 기술된 바와 같이 엔도글린에 결합하는 인간화 항체 및 그의 항원 결합 단편이 혈관신생/신혈관형성을 특징으로 하는 다양한 형태의 안질환(예를 들어, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 신병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 및 다양한 형태의 암(원발성 종양 및 전이)의 치료에 사용될 수 있다.
조성물(본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편)은 치료될 질병에 따라 동시에 또는 순차적으로, 단독으로 또는 제2 조성물과 조합되어 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 두 번째의 치료적 치료제는 혈관신생 억제제(본원에 기술된 바와 같음)이다. 2가지 이상의 조성물이 투여될 때, 상기 조성물들은 조합되어(순차적으로 또는 동시에) 투여될 수 있다. 조성물은 단회 용량 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 조성물은 인간 환자에게의 투여용으로 허용가능해지도록 발열원이 없도록 제형화된다. 발열원에 대한 조성물의 테스트 및 발열원이 없는 약학 조성물의 제조는 당업계의 숙련자에게 잘 이해된다.
본 발명의 일 실시양태는 본 발명의 장애 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 임의의 조성물의 용도를 고려한다. 의약은 치료를 필요로 하는 환자/대상체의 신체적 특징을 기반으로 하여 제형화될 수 있으며, 장애를 기반으로 하여 단일 제형 또는 다중 제형으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 의약은 병원 및 클리닉으로의 유통을 위하여 적절한 라벨을 포함하는 적합한 패키지 내에 패키징될 수 있으며, 여기서, 라벨은 대상체에서의 본원에 기술된 장애의 치료에 대한 지시사항에 대한 것이다. 의약은 단일 또는 다중 단위로서 패키징될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량 및 투여에 대한 설명서가 의약품 패키지에 포함될 수 있다.
III . 사용 방법
엔도글린에 우선적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 환자에게 투여함으로써 환자(인간 또는 비인간)에 있어서 반응을 유도하는 방법이 본원에서 제공된다. 항체가 결합하는 결합 부위는 연속 또는 배좌적/불연속 에피토프일 수 있다.
본 발명의 효과적인 반응은 환자가 병의 징후 또는 증상의 부분적인 또는 전적인 경감 또는 감소를 경험할 때 달성되며, 구체적으로는 제한 없이 시력 및/또는 생존의 연장을 포함한다. 예상되는 무진행 생존 시간은 재발 횟수, 질환기 및 기타 인자를 포함하는 예후 인자에 따라 개월 내지 연수(year)의 단위로 측정될 수 있다. 생존 연장은 제한 없이 적어도 1개월(mo), 대략 적어도 2개월, 대략 적어도 3개월, 대략 적어도 4개월, 대략 적어도 6개월, 대략 적어도 1년, 대략 적어도 2년, 대략 적어도 3년 등의 시간을 포함한다. 전체 생존은 개월 내지 연수의 단위로 또한 측정될 수 있다. 대안적으로, 효과적인 반응은 환자의 증상이 여전히 정적인 채로인 것일 수 있다. 징후의 치료의 추가의 징후는 하기에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편의 조성물은 비치료제(예를 들어, 친화성 정제 에이전트)로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 그러한 일 실시양태에서, 관심있는 단백질은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용하여 세파덱스(Sephadex) 수지 또는 여과지와 같은 고형상에 고정된다. 고정된 단백질은 정제될 관심있는 표적(또는 그의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉되고, 그 후 지지체는 고정된 항체에 결합된 표적 단백질을 제외하고 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거하기에 적합한 용매로 세척된다. 마지막으로, 지지체는 표적 단백질을 방출시킬, pH 5.0의 글리신 완충제와 같은 또 다른 적합한 용매로 세척된다. 정제에 더하여, 조성물은 엔도글린 및 혈관신생과 관련된 질환 및 장애의 검출, 진단 및 치료법에 사용될 수 있다.
본원에 사용될 때, "접촉시키는"이라는 용어는 화합물의 용액 또는 조성물을 유기체 유래의 폴리펩티드, 세포, 조직 또는 기관을 베이딩(bathing)하는 액체 매질과 함께 첨가하는 것을 나타낸다. 다르게는, "접촉시키는"이라는 것은 화합물의 용액 또는 조성물을 유기체로부터 유래된 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 액체와 함께 혼합하는 것을 나타낸다. 시험관내 응용에 있어서, 조성물은 또 다른 성분, 예컨대 디메틸 술폭시드(DMSO)를 또한 포함할 수 있다. DMSO는 화합물의 흡수 또는 화합물의 용해성을 돕는다. 테스트 화합물을 포함하는 용액은 세포, 조직 또는 기관을 베이딩하는 매질에 첨가되거나, 전달 장치, 예컨대 피펫 기반의 기구 또는 시린지 기반의 기구의 이용에 의해 혈액과 같은 또 다른 액체와 혼합될 수 있다. 생체내 응용에 있어서, 접촉은 예를 들어 임의의 적합한 수단에 의한 조성물의 투여를 통하여 일어날 수 있으며, 약학적으로 허용되는 부형제 및 담체를 포함하는 조성물은 상기에 더욱 상세하게 기술되었다.
본 출원의 일 실시양태에 따른 "환자"(예를 들어, 포유류, 예컨대 인간 또는 비인간 동물, 예컨대 영장류, 설치류, 소, 말, 돼지, 양 등)는 본원에 기술된 질환 또는 장애의 하나 이상의 임상적 증후 발현 및/또는 증상을 나타내는 포유류이다. 특정 상황에서, 환자는 증상이 없을 수도 있지만 여전히 그 질환 또는 장애의 임상적 증후 발현을 갖는다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 치료적 모이어티에 컨쥬게이션되거나 치료적 모이어티를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 검출 가능 모이어티에 컨쥬게이션되거나 검출 가능 모이어티를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 치료적 모이어티 및 검출 가능 모이어티 둘 모두에 컨쥬게이션될 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 친화성 태그(예를 들어, 정제 태그)에 컨쥬게이션되거나 그에 의해 재조합적으로 조작될 수 있다. 예를 들어 His6 태그(서열 번호 85)와 같은 친화성 태그는 당업계에서 통상적이다.
본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 이것이 치료적 모이어티 및/또는 이미징 또는 검출 가능 모이어티 및/또는 친화성 태그에 컨쥬게이션되거나 연결될 수 있는 것이다. 폴리펩티드의 컨쥬게이션 또는 연결 방법은 당업계에 공지되어 있다. 화합물과 표지 사이의 회합(결합)은 당업계에 공지된 임의의 수단을 포함하며, 이는 재조합 기술뿐만 아니라 공유적 및 비공유적 상호작용, 화학적 컨쥬게이션도 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
A. 엔도글린의 결합 및 혈관신생
엔도글린(CD105)은 180 kDa의 호모이량체형 막관통 단백질로서 세포 표면 상에서 발현된다. 그 외부 도메인은 높은 친화도(50 nM)로 TGF-β1 및 -3 이소타입에 결합하며, CD105의 막관통 및 세포내 도메인은 베타글리칸과 71%의 서열 유사성을 공유한다. 인간 CD105 유전자는 염색체 9q34상에 위치하며, 이는 형광 원위치(in situ) 혼성화를 이용하여 확인되고, 코딩 영역은 14개의 엑손을 포함하며, TGF-β에 결합하는 능력을 갖는 CD105의 2가지 상이한 이소타입(L 및 S)이 특성화되었다. L-CD105는 S-CD105와는 반대로 세포질 테일(tail)에 47개 아미노산 잔기를 갖는 633개 아미노산 잔기로 이루어지는데, 상기 S-CD105는 14개 아미노산의 세포질 테일을 갖는 600개 아미노산 잔기로 이루어진다. 그러나, L-CD105가 우세한 형태이다. CD105는 내피 세포에서 주로 세린 및 트레오닌 잔기상에서 구성적으로 인산화되며, 이러한 인산화는 상기 세포 내에서의 구성적 활성 TGF-β RII로 인한 것이다. CD105에의 TGF-β 결합에 의해 인산화가 하향조절되며, 이는 단백질 키나아제 C 억제제에서 보이는 효과와 유사하다. 인간 CD105 아미노산 서열은 세포외 도메인의 노출된 영역에 위치하는 트리펩티드 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)을 포함한다. RGD 펩티드는 피브로넥틴, 비트로넥틴, 본 빌레브란트 인자(von Willebrand factor, vWF), 제I형 콜라겐 및 피브리노겐과 같은 ECM 단백질상에서 발견되는 핵심 인식 구조이며, 세포 표면 인테그린에 의해 인식된다. 인테그린 부착은 내피세포가 중요한 역할을 하는 과정인 항상성, 혈전증, 혈관신생 및 염증에 연구되어 있다(문헌[Duff et al, FASEB J., 17:984-992 (2003)]).
CD105는 증식 중인 내피 세포에 의해 발현되는 TGF-β 수용체 패밀리의 구성원이다. 정상적인 수준의 CD105가 내피 세포 증식에 필요하다. CD105 발현은 저산소증 유도성 인자-1-α(hypoxia-inducible factor-1-α, HIF-1-α)의 생성을 통하여 저산소증 세포에 의해 증가되며, 저산소증 세포를 아폽토시스로부터 보호한다. CD105의 몇몇 기능은 TGF-β 신호전달과 결부된다. TGF-β는 세린 키나아제, 수용체 I(receptor I, RI), 및 수용체 II(RII)로 이루어진 헤테로이량체형 수용체를 통하여 신호전달을 한다. 상기 수용체의 외부 도메인에의 TGF-β의 결합은 TGF-β RI을 인산화시키는 세포질 RII 키나아제 활성이 드러나게 하며, 이는 그 후 Smad 단백질과 같은 하류 신호전달자와 상호작용할 수 있다. CD105는 TGF-β 수용체 복합체의 일부를 형성하지만, 이것은 세포 표면 상에 독립적으로 존재할 수 있다. 시험관내에서 많은 세포에 있어서 CD105는 TGF-β 신호전달을 억제한다.
또한 CD105는 다른 성장 인자, 예컨대 액티빈 A 및 골형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP) -10, -9, -7 및 -2에 결합한다. TGF-β 또는 다른 성장 인자 리간드가 CD105에 결합하는 것은 적어도 수용체 RII의 존재를 필요로 하며, 이것은 혼자서 리간드에 결합할 수는 없다. CD105와 수용체의 회합운 리간드 자신에 대한 그의 친화성을 변경시키지 않는다. 회합시에, CD105의 세포질 도메인은 TGF-β RI 및 TGF-β RII에 의해 인산화되며, 그러면 TGF-β RII가 아닌 TGF-β RI 키나아제가 수용체 복합체로부터 해리된다.
CD105 발현은 TGF-β RII의 인산화 수준을 억제하지만, TGF-β RI의 것은 증가시키며 이는 Smad3이 아닌 Smad2의 인산화를 증가시킨다. Smad 2는 다양한 전사 인자, 보조 활성 인자, 및 억제제와 상호작용할 수 있기 때문에, 인산화된 Smad 2는 유전자 전사를 조정하는 다중 신호의 통합자로서 작용할 수 있다. 따라서, CD105는 TGF-β RI 및 TGF-β RII와의 상호작용을 통하여 TGF-β 기능을 조정하며, 하류 Smad 단백질의 인산화를 변형시킨다.
CD105는 TGF-β 수용체(TGF-βR), 액티빈 수용체 유사 키나아제(activin receptor-like kinase, ALK) 및 액티빈 수용체를 포함하는 TGF-β 수퍼패밀리의 다중 키나아제 수용체 복합체의 신호전달을 조정하는 작용을 한다. CD105의 부재하에서 TGF-β 수용체의 활성화는 내피 세포 성장을 억제하는 SMAD 단백질(SMAD2 및 3)의 인산화로 이어진다. 그러나, TGF-β에 의한 CD105의 활성화는 SMAD 단백질 인산화(SMAD 1, 5 및 8의 인산화를 포함함)를 조정한다. 최종 결과는 내피 세포에 대한 TGF-β 수용체 활성화의 성장 억제 효과의 방출이다(도 3 참조). 놀랍지 않게도, 항-CD105 항체 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 CD105 활성화의 방지는 TGF-β와 상승 작용식으로 작용하여 내피 세포 성장을 억제한다.
CD105 프로모터는 길이가 2.6 kb이지만, TATA 또는 CAAT 전사 개시 박스를 포함하지 않는다. 그러나 이것은 2개의 GC 풍부 영역, Sp1, ets, GATA, AP-2, NGF-β, 및 Mad에 있어서의 콘센서스 모티프와, TGF-β 반응 요소를 갖는다. 그럼에도 불구하고, CD105는 상대적으로 제한된 세포 내 분포를 갖는다. 기저 수준의 전사가 -68 위치의 ets 부위 및 Sp1 부위를 필요로 하는 것으로 보이지만, 예를 들어 내피 세포에의 상대적인 발현 제한은 다중 조절 영역, 특히 -1294 내지 -932에서의 하나 및 전사 개시 부위에 매우 가까운 또 다른 것을 포함하는 것으로 보인다. CD105는 TGF-β에 의해 상향조절되며, 이는 -37 내지 -29에서의 Sp1 부위를 필요로 하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 또한 Smad 3 및/또는 4에 결합하는 하나 이상의 병치된 상류 SBE 부위(이는 TGF-β 신호전달에 의해 활성화됨)를 포함한다. 저산소증은 허혈성 조직 및 종양의 공통된 특징이며, 혈관 내피 세포(EC)에서 CD105 유전자 발현의 강력한 자극자이다. 그러한 효과는 TGF-β1과 조합되면 강화된다. 상향조절된 CD105는 저산소 스트레스하에서 EC에서 자가 보호 역할을 발휘할 수 있다.
혈관 EC는 CD105의 주요 소스이다. 혈관 평활근 세포, 섬유아세포, 대식세포, 전-B 및 골수단구 기원의 백혈병 세포, 및 적혈구 전구체를 포함하는 다른 세포 유형은 CD105를 더욱 적은 정도로 발현한다.
CD15는 혈관신생에 연루되어 있다. 안티센스 실험에 의하면, HUVEC에서의 CD105 발현의 억제가 TGF-β1과 조합되어 시험관내 혈관신생을 두드러지게 억제함이 입증되었으며, 이는 CD105가 내피 세포에서 신생혈관유발(proangiogenic) 성분임을 나타낸다. 혈관신생에 있어서의 CD105의 중요한 역할의 추가의 증거는 CD105 녹아웃 마우스로부터 온다. CD105 널(null) 마우스는 다수의 혈관 및 심장 결함을 나타내어 초기 배형성기에서의 사망에 이르게 된다. CD105 널 마우스에서 관찰되는 중증 혈관 장애는 CD105가 배체외 맥관구조에서의 성숙 혈관의 형성에 필요함을 나타내며, 이는 혈관신생에 있어서의 엔도글린의 직접적인 역할을 추가로 확증하는 것이다.
특히 CD105 또는 edg-1로도 공지된 엔도글린은 제I형 호모이량체형 막 당단백질로서, 이는 증식 중인 혈관 내피 세포에서 높은 수준으로 발현된다. 따라서, 엔도글린은 능동적인 혈관신생을 겪는 내피 세포에 있어서 주로 증식 관련 마커이다. 그러나, 정상 조직의 혈관 내피에 의한 엔도글린의 제한된 발현이 있을 수도 있다. 인간 엔도글린은 형질전환 성장 인자-β(TGF-β)에 특이적으로 결합하는 것으로 공지되어 있으며, 엔도글린의 추정 아미노산 서열은 TGF-β 수용체 유형의 β-글리칸에 대하여 강한 상동성을 갖는다.
엔도글린(EDG)은 종양 맥관구조의 항체 기반 감소 방법에 있어서 표적화되었으며, 이는 EDG가 내피 및 백혈병 세포 상의 증식 관련 항원이기 때문이다. 그의 발현은 종양 관련 혈관 내피에서 상향조절되며, EDG는 혈관신생에 필수적이다. 혈관신생은 기존의 맥관구조의 유지뿐만 아니라 신혈관형성에 이르게 되는 새로운 모세 혈관의 형성도 포함한다. 이것은 혈관 기저막 및 간질 매트릭스의 내피 세포 매개된 분해, 내피 세포의 이동, 내피 세포의 증식, 및 내피 세포에 의한 모세혈관 루프의 형성을 포함하는 일련의 순차적 단계를 포함하는 복잡한 과정이다.
엔도글린에 결합하는 인간화 항체가 본원에서 제공된다. 엔도글린은 새로운 맥관구조의 성장을 촉진하고 있는 그리고 그의 일부가 되는 세포뿐만 아니라 기존의 맥관구조를 포함하고 지지하는 세포 상에서도 발견될 수 있다. 항체는 엔도글린에 결합하고 그에 의해 혈관신생을 억제하고/하거나, 기존의 맥관구조 또는 기존의 맥관구조의 유지를 억제하고/하거나, 소혈관 확장을 억제할 수 있다. 이들 항체는, 엔도글린 정제에 있어서의 그의 사용에 더하여, 정제, 검출 및 진단 목적과, 치료 목적에 유용하다. 본원에 제공된 항체는 다양한 질병 및 질환의 치료용의 의약의 제형, 상기 질병 및 질환의 치료 방법 및 검출 또는 진단 방법에 사용될 수 있다.
쥐과 단클론 항체(mAb)가 엔도글린에 대하여 생성되었으며, 상기 항체는 엔도글린 활성을 조정하고 그에 의해 혈관신생을 억제하고/하거나 소혈관의 혈관 확장을 억제한다. 이들 쥐과 항체는 미국 특허 제5,928,641호, 미국 특허 제6,200,566호, 미국 특허 제6,190,660호, 및 미국 특허 제7,097,836호에 개시되어 있으며, 상기 미국 특허는 그 전문이 본원에 포함된다. 추가로, 다수의 이들 항체의 생체외 및 생체내 효율이 입증되었으며, 엔도글린에 결합하는 단클론 항체는 엔도글린 조정 화합물로서 흥미롭다. 그러나 쥐과 항체의 치료적 사용은 실현가능하지 않으며, 그 이유는 쥐과 항체의 투여가 예를 들어 인간 항-마우스 항체(HAMA)의 형태에서의 면역원성을 포함하는 다수의 제한을 갖기 때문이다.
본원에서 "혈관신생"은 혈관의 유지 및 발생의 모든 측면을 포함하도록 사용된다. 따라서, 혈관신생은 기존의 맥관구조 및 소혈관의 유지 및 제어뿐만 아니라 신혈관형성에 이르게 되는 새로운 모세 혈관의 형성도 포함한다. 혈관신생은 혈관 기저막 및 간질 매트릭스의 내피 세포 매개된 분해, 내피 세포의 이동, 내피 세포의 증식, 및 내피 세포에 의한 모세혈관 루프의 형성을 포함하는 일련의 순차적 단계를 포함하는 복잡한 과정이다. 혈관신생은 새로운 혈관의 성장 및/또는 발달(신혈관형성으로도 칭해짐), 소혈관의 확장, 과도한 또는 장기적인 혈관 성장, 및 기존의 맥관구조의 유지를 포함한다. 엔도글린은 혈관신생의 조절에 연굴된 것으로 공지되어 있으며, 혈관신생 유도에 관련된 다수의 생화학적 경로에 연루된 것으로 여겨진다(문헌[Duff et al., FASEB J., 17:984-992 (2003)]; 문헌[Bernabeu et al, J. Cell. Biochem., 102(6):1375-1388 (2007)]).
본원에 사용될 때, "혈관신생 억제성", "혈관신생 억제" 또는 "항-혈관신생성"이라는 용어는 맥관형성의 억제를 포함하며, 신혈관형성의 정도, 양 또는 속도의 감소에 영향을 줌을 의미하고자 한다. 조직에 있어서의 내피 세포 증식 또는 이동의 정도, 양 또는 속도의 감소 초래는 혈관신생 억제의 특정 예이다.
"혈관신생 억제 조성물"이라는 용어는 혈관신생 매개된 과정, 예컨대 내피 세포 이동, 증식, 관 형성을 억제하여 후속적으로 기존의 것으로부터의 새로운 혈관의 생성의 억제에 이르게 되고 결과적으로 혈관신생 의존성 질병에 영향을 주는 조성물을 나타낸다.
본원에서 "혈관신생 관련 질환"이라는 용어는 본원 및 특허청구범위의 목적상, 혈관신생이 비정상적으로 연장된 인간에 있어서의 특정한 병리학적 과정을 의미하도록 사용된다. 이는 혈관신생에 관련된, 그에 의해 야기된 또는 그와 관련된 질환 및 질병과 같은 혈관신생 질병 및 질환을 추가로 포함한다. 그러한 질환의 비제한적 예는 혈관신생/신혈관형성을 특징으로 하는 다양한 형태의 안질환(예를 들어, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 신병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 및 다양한 형태의 암 및 전이를 포함한다. 본원에 개시된 항체 및 그의 항원 결합 단편은 엔도글린에 결합하고 혈관신생을 억제함으로써 혈관신생 관련 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 "항-혈관신생 요법"이라는 용어는 본원 및 특허청구범위의 목적상, 엔도글린(휴지 맥관구조와 비교할 때 증식 중인 맥관구조상에서 더욱 높은 수준으로 발현됨)을 발현하는 세포 및/또는 맥관구조를 표적으로 하는 요법을 의미하도록 사용되며; 이는 혈관신생(즉, 신혈관형성에 이르게 되는 새로운 모세 혈관의 형성)에 대하여 유도되는 요법, 기존의 맥관구조 및/또는 과도한 혈관형성 또는 혈관 성장에 대하여 유도되는 요법, 소혈관의 확장에 대하여 유도되는 요법, 및 질환 또는 질병에 대하여 유도되는 요법(예를 들어, 혈관 표적화 요법)을 추가로 포함한다. 본 발명 내에서 고려되는 예시적인 질환 또는 질병은 혈관신생/신혈관형성을 특징으로 하는 다양한 형태의 안질환(예를 들어, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 신병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 및 다양한 형태의 암, 고형 종양 및 전이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 "신혈관형성을 특징으로 하는 안질환"은 본원 및 특허청구범위의 목적상, 망막, 각막, 동공, 홍체, 초자체액 또는 안방수를 포함하는 눈의 임의의 부분 내에서 증가된 혈관신생에 의해 야기되거나 증가된 혈관신생으로 이어지는 임의의 안질환을 의미하도록 사용된다. 그러한 질환은 예를 들어 노인성 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 비당뇨병성 망막병증, 맥락막 신혈관형성(CNV) 및 망막하 신혈관형성(subretinal neovascularization, SRN 또는 SRNV) 및 눈의 신생물을 포함한다.
B. 진단적 응용
인간화 항-엔도글린 항체 및 그의 단편이 생체내 및 시험관내 검출, 진단 및/또는 모니터링 목적에 사용될 수 있다. 엔도글린은 하기에 추가로 기술된 바와 같이 다수의 질환 및 장애에 연루된 것으로 여겨진다. 엔도글린 관련 질환 및 질병의 치료는 부분적으로는 그의 진단에 의존적이며, 본원에 개시된 항체 및 그의 항원 결합 단편은 과도한 엔도글린의 진단 또는 엔도글린 활성과 관련된 질환 및 질병의 진단에 유용하다.
(i) 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편을 샘플 또는 대상체와 접촉시키는 단계, 및 (ii) 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 엔도글린의 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 또는 대상체에서 엔도글린의 수준을 검출하는 방법이 본원에서 제공된다.
혈관신생 또는 혈관신생 의존성 질환 또는 장애의 이미징 또는 진단 방법이 본원에서 제공되며, 이는 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 조성물을 샘플과 접촉시키는 단계를 포함한다. 샘플은 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 혈소판, 생검체액, 척추 천자액, 뇌척수막 및 소변일 수 있다. 이미징 또는 진단 방법은 시험관내 분석에서 나타날 수 있다. 대안적으로, 접촉이 조성물의 환자에게의 투여에 의한 것일 때, 혈관신생 또는 혈관신생 의존성 질환 또는 장애가 생체내에서 이미징되거나 진단된다.
일 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 검출 가능 모이어티를 추가로 포함한다. 검출은 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 일어날 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용한 엔도글린의 검출 및/또는 측정(정성화, 정량화 등)에 있어서의 시험관내 분석법은 예를 들어 ELISA, RIA 및 웨스턴 블롯을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 엔도글린의 시험관내 검출, 진단 또는 모니터링은 환자로부터 샘플(예를 들어, 혈액 샘플)을 수득하고, 예를 들어 표준 ELISA 분석법으로 샘플을 테스트하는 것에 의해 일어날 수 있다. 예를 들어, 96웰 미세적정 플레이트를 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로 코팅하고, 세척하고, PBS-트윈(Tween)/BSA로 코팅하여 비특이적 결합을 억제할 수 있다. 혈액 샘플은 연속적으로 희석되고 이중 웰 내애 넣어지며, 이는 엔도글린의 연속 희석된 표준물 곡선과 비교될 수 있다. 웰의 인큐베이션 및 세척 후, 바이오틴으로 표지된 항-엔도글린 항체가 첨가되고, 이어서 스트렙타비딘-알칼리 포스파타아제가 첨가될 수 있다. 웰을 세척하고, 기질(서양 고추냉이 퍼옥시다아제)을 플레이트에 첨가하여 발색시킬 수 있다. 플레이트를 통상적인 플레이트 판독기 및 소프트웨어를 이용하여 판독할 수 있다.
검출이 생체내에서 일어날 때, 접촉은 본원의 다른 곳에 기술된 것과 같은 임의의 통상적인 수단을 이용하여 항체 또는 항원 결합 단편의 투여를 통하여 일어난다. 그러한 방법에서, 샘플 또는 대상체에서의 엔도글린의 검출을 이용하여 본원에 기술된 질환 및 장애와 같은 엔도글린 활성과 관련된 또는 엔도글린 활성과 상관된 질환 또는 장애를 진단할 수 있다.
엔도글린의 생체내 검출, 진단 또는 모니터링에 있어서, 엔도글린에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는데, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 검출 가능 모이어티에 결합되어 있다. 검출 가능 모이어티는 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging, MRI), 형광, 방사성 이미징(radioimaging), 내시경, 복강경 또는 정맥내 카테터에 의해 제공되는 광원(즉, 광활성 에이전트의 검출을 통한 것), 광선주사, 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography, PET) 스캐닝, 전신 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance, NMR), 방사성 섬광계수법(radioscintography), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(single photon emission computed tomography, SPECT), 표적화된 근적외 영역(near infrared region, NIR) 스캐닝, X선, 초음파 등, 예를 들어 미국 특허 제6,096,289호, 미국 특허 제7,115,716호, 미국 특허 제7,112,412호, 미국 특허 출원 제20030003048호 및 미국 특허 출원 제20060147379호에 기술된 것과 같은 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 당업계에서 인식된 방법을 이용하여 가시화될 수 있으며, 상기 미국 특허 및 미국 특허 출원 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 그러한 방법을 이용하여 화합물을 검출하기 위한 표지가 당업계에 또한 공지되어 있으며, 그러한 특허 및 특허 출원에 기술되어 있고, 이는 본원에 참고로 포함된다. 검출 가능 모이어티의 가시화는 엔도글린 및/또는 혈관신생과 관련된 질병 또는 질환의 검출, 진단 및/또는 모니터링을 허용할 수 있다.
요망되는 표적 단백질, 즉, 엔도글린에 특이적인 항체를 이용한 추가의 진단적 분석법이 당업계에 공지되어 있으며, 본원에서 또한 고려된다.
이들 방법에 있어서 고려될 비제한적 질병, 질환 및 장애는 예를 들어 혈관신생/신혈관형성을 특징으로 하는 다양한 안질환(예를 들어, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 신병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 및 다양한 형태의 암(원발성 종양 및 전이)과 같은 혈관신생과 관련된 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러한 질환의 검출, 진단 또는 모니터링에 있어서, 대상 환자는 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 조성물이 투여되며, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 검출 가능 모이어티에 컨쥬게이션된다. 상기 모이어티는 상기에 기술된 것과 같은 당업계에서 인식된 방법을 이용하여 가시화될 수 있다. 검출 가능 모이어티의 가시화는 그러한 질병 및 질환의 검출, 진단 및/또는 모니터링을 허용할 수 있다.
시험관내 검출법에서, 환자로부터 수득될 샘플은 혈액, 조직 생검체 샘플 및 그로부터의 유체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 엔도글린에 대한 인간화 항체 및 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 이는 잠재적으로 치료적 치료에 대한 필요성을 나타내는, 질환 또는 장애와 관련된 엔도글린의 수준을 검출 또는 진단하는 데 유용하다. 특정 실시양태에서, 항체는 본원에 개시된 인간화 항-엔도글린 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체는 제2 에이전트를 추가로 포함한다. 그러한 에이전트는 예를 들어 리포터 분자 또는 검출 가능한 표지와 같은 분자 또는 모이어티일 수 있다. 그러한 검출 방법을 위한 검출 가능한 표지/모이어티는 당업계에 공지되어 있으며, 하기에 더욱 상세하게 기술된다. 리포터 분자는 분석법을 이용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티이다. 폴리펩티드에 컨쥬게이션된 리포터 분자의 비제한적 예는 효소, 방사성 표지, 합텐, 형광 표지, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 발광 분자, 광친화성 분자, 착색된 입자 또는 리간드, 예컨대 바이오틴을 포함한다. 검출 가능한 표지는 그의 특이적 기능적 특성 및/또는 화학적 특징으로 인하여 검출될 수 있는 화합물 및/또는 원소를 포함하며, 그의 사용은 그가 부착된 폴리펩티드가 검출되게 하고/하거나 요망될 경우 추가로 정량화되게 한다. 다수의 적절한 검출 가능(이미징) 에이전트가, 폴리펩티드에의 그의 부착 방법이 그러하듯이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 각각이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,021,236호; 미국 특허 제4,938,948호; 및 미국 특허 제4,472,509호 참조).
폴리펩티드, 예컨대 항체와 검출 가능 모이어티의 연결 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 컨쥬게이션(예를 들어, 화학적 컨쥬게이션) 및 융합 단백질을 형성하는 재조합 DNA 기술을 포함한다. 화학적 컨쥬게이션 또는 재조합적 조작에 의한 융합 단백질의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 성분들을 공유적으로 그리고 비공유적으로 연결하는 방법도 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Williams (1995) Biochemistry 34: 1787 1797]; 문헌[Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414]; 및 문헌[Kroll (1993) DNA Cell. Biol. 12: 441-453]을 참조한다.
일부의 경우, 비절단 폴리펩티드 링커 영역을 표지 또는 모이어티와 본원에 개시된 항체, 항원 결합 단편 또는 결합 단백질의 하나 이상의 부분 사이에 도입하는 것이 필요할 수 있다. 링커는 임의의 두 단편 사이의 입체 장애를 감소시키고/시키거나 향상된 유연성을 도울 수 있다. 또한 링커는 각각의 단편의 적절한 폴딩이 일어나는 것을 도울 수 있다. 링커는 단백질의 두 도메인 사이에 랜덤 코일로 존재하는 것으로 결정된 서열과 같이 천연 기원의 것일 수 있다. 하나의 링커 서열은 RNA 폴리머라아제 서브유닛의 C-말단 도메인과 N-말단 도메인 사이에서 발견되는 링커이다. 자연 발생 링커의 다른 예는 1CI 및 LexA 단백질에서 발견되는 링커를 포함한다.
링커 내에서, 아미노산 서열은 경험적으로 결정되는 또는 모델링으로 나타내어지는 링커의 특징을 기반으로 하여 변화될 수 있다. 링커의 선택에 있어서의 고려사항은 링커의 유연성, 링커의 전하, 및 자연 발생 서브유닛 내의 링커의 일부 아미노산의 존재를 포함한다. 또한 링커는 링커 내의 잔기들이 데옥시리보스 핵산(DNA)와 접촉함으로써 결합 친화성 또는 특이성에 영향을 주거나 다른 단백질과 상호작용하도록 디자인될 수 있다. 서브유닛들 사이의 더욱 긴 거리를 스패닝할 필요가 있을 때 또는 도메인들이 특정 형태로 유지되어야 할 때와 같은 일부의 경우, 링커는 임의로 추가의 폴딩 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커의 디자인은 링커가 상대적으로 짧은 거리, 예를 들어 약 10 옹스트롬(Å) 미만의 거리를 스패닝하는 것을 필요로 하는 도메인의 배열을 포함할 수 있다. 그러나, 특정 실시양태에서, 링커는 최대 약 50 옹스트롬의 거리를 스패닝한다.
링커 내에서, 아미노산 서열은 경험적으로 결정되는 또는 모델링으로 나타내어지는 링커의 특징을 기반으로 하여 변화될 수 있다. 링커의 선택에 있어서의 고려사항은 링커의 유연성, 링커의 전하, 및 자연 발생 서브유닛 내의 링커의 일부 아미노산의 존재를 포함한다. 또한 링커는 링커 내의 잔기들이 DNA와 접촉함으로써 결합 친화성 또는 특이성에 영향을 주거나 다른 단백질과 상호작용하도록 디자인될 수 있다. 서브유닛들 사이의 더욱 긴 거리를 스패닝할 필요가 있을 때 또는 도메인들이 특정 형태로 유지되어야 할 때와 같은 일부의 경우, 링커는 임의로 추가의 폴딩 도메인을 포함할 수 있다.
폴리펩티드(자유 또는 세포 결합된 것)를 비드에 커플링시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 커플링 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 디스플레이하는 세포의 선택 방법이 당업계에 또한 공지되어 있다. 간략하게는, 상자성 폴리스티렌 미세입자닌 구매가능한 것으로서(미국 일리노이주 리버티빌 소재의 스페로테크, 인코포레이티드(Spherotech, Inc.), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)), 이는 작용기로 변형된 또는 다양한 항체 또는 리간드, 예를 들어 아비딘, 스트렙타비딘 또는 바이오틴으로 코팅된 미세입자 표면에 펩티드를 커플링시킨다.
미세입자의 상자성 특성은 자석을 이용하면 이것을 용액으로부터 분리시킨다. 상기 미세입자는 자석으로부터 옮겨질 때 용이하게 재현탁될 수 있다. 폴리펩티드는 튜브 내에서 폴리우레탄층으로 코팅된 상자성 폴리스티렌 미세입자에 커플링될 수 있다. 미세입자 표면 상의 히드록시기는 p-톨루엔술포닐 클로라이드와의 반응에 의해 활성화된다(문헌[Nilsson K and Mosbach K. "p-Toluenesulfonyl chloride as an activating agent of agarose for the preparation of immobilized affinity ligands and proteins." Eur. J. Biochem. 1980: 112: 397-402]). 대안적으로, 표면 카르복실산을 포함하는 상자성 폴리스티렌 미세입자는 카르보디이미드에 의해 활성화되고, 이어서 폴리펩티드에 커플링되어 미세입자의 표면 상의 카르복실산기와 폴리펩티드의 일차 아미노기 사이에 안정한 아미드 결합을 생성할 수 있다(문헌[Nakajima N and Ikade Y, Mechanism of amide formation by carbodiimide for bioconjugation in aqueous media, Bioconjugate Chem. 1995, 6(1): 123-130]; 문헌[Gilles MA, Hudson AQ and Borders CL Jr, Stability of water-soluble carbodiimides in aqueous solution, Anal Biochem. 1990 Feb l;184(2):244-248]; 문헌[Sehgal D and Vijay IK, a method for the high efficiency of water-soluble carbodiimide-mediated amidation, Anal Biochem. 1994 Apr;218(l):87-91]; 문헌[Szajani B et al, Effects of carbodiimide structure on the immobilization of enzymes, Appl Biochem Biotechnol. 1991 Aug; 30(2): 225-231]). 또 다른 옵션은, 스트렙타비딘의 단층이 표면에 공유 결합된 상자성 폴리스티렌 미세입자에 바이오티닐화 폴리펩티드를 커플링시키는 것이다(문헌[Argarana CE, Kuntz ID, Birken S, Axel R, Cantor CR. Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene. Nucleic Acids Res. 1986;14(4): 1871-82]; 문헌[Pahler A, Hendrickson WA, Gawinowicz Kolks MA, Aragana CE, Cantor CR. Characterization and crystallization of core streptavidin. J Biol Chem 1987:262(29): 13933- 13937]).
폴리펩티드는 매우 다양한 형광 염료, 켄처(quencher) 및 합텐, 예컨대 플루오레세인, R-피코에리트린, 및 바이오틴에 컨쥬게이션될 수 있다. 컨쥬게이션은 폴리펩티드 합성 동안 또는 폴리펩티드가 합성 및 정제된 후 일어날 수 있다. 바이오틴은 아비딘 및 스트렙타비딘 단백질에 고친화도로 결합하는 작은(244 킬로달톤) 비타민으로서, 대부분의 펩티드에 그의 생물학적 활성을 변경시키지 않고서 컨쥬게이션될 수 있다. 바이오틴 표지된 폴리펩티드는 고정된 스트렙타비딘 및 아비딘 친화성 겔을 이용하여 미표지 폴리펩티드로부터 용이하게 정제되며, 스트렙타비딘 또는 아비딘 컨쥬게이션된 프로브를 사용하여 예를 들어 ELISA, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯 응용에서 바이오티닐화 폴리펩티드를 검출할 수 있다. 바이오틴의 N-히드록시숙신이미드 에스테르가 가장 일반적으로 사용되는 유형의 바이오티닐화제이다. N-히드록시숙신이미드 활성화된 바이오틴은 생리학적 완충제 중 일차 아미노기와 효율적으로 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성한다. 폴리펩티드는 N-말단에 일차 아민을 가지며, 또한 라이신 잔기의 측쇄 내에 몇몇 일차 아민을 가질 수 있으며, 이는 N-히드록시숙신이미드 활성화된 바이오틴 시약을 이용한 표지에 있어서 표적으로서 이용가능하다. 바이오틴의 몇몇 상이한 N-히드록시숙신이미드 에스테르가 이용가능하며, 이는 다양한 특성 및 스페이서 아암 길이를 갖는다(미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스(Pierce). 술포-N-히드록시숙신이미드 에스테르 시약은 수용성이어서, 유기 용매의 부재하에 반응이 수행되는 것을 가능하게 한다.
바이오틴 대 폴리펩티드의 몰 대 몰의 비는 당업계에서 인식되는 기술을 이용하여 2-(4'-히드록시아조벤젠-2-카르복실산) 분석법을 이용하여 개산될 수 있다(문헌[Green, NM, (1975) "Avidin. In Advances in Protein Chemistry." Academic Press, New York. 29, 85-133]; 문헌[Green, NM, (1971) "The use of bifunctional biotinyl compounds to determine the arrangement of subunits in avidin." Biochem J. 125, 781-791]; 문헌[Green, NM., (1965) "A spectrophotometric assay for avidin and biotin based on binding of dyes by avidin." Biochem. J. 94: 23c-24c]). 몇몇 바이오틴 분자는 폴리펩티드에 컨쥬게이션될 수 있으며, 각각의 바이오틴 분자는 하나의 아비딘 분자에 결합할 수 있다. 바이오틴-아비딘 결합 형성은 유기 용매, 극한의 pH 및 변성 시약에서 매우 빠르고 안정하다. 바이오티닐화의 정량화를 위하여, 바이오티닐화 폴리펩티드를 함유하는 용액을 2-(4'-히드록시아조벤젠-2-카르복실산) 및 아비딘의 혼합물에 첨가한다. 바이오틴은 아비딘에 대하여 더욱 높은 친화성을 갖기 때문에, 그는 2-(4'- 히드록시아조벤젠-2-카르복실산)을 치환하며, 500 nm에서의 흡광도는 비례적으로 감소한다. 용액 중 바이오틴의 양은 바이오틴 함유 펩티드의 첨가 전후 2-(4'-히드록시아조벤젠-2-카르복실산)-아비딘 용액의 흡광도를 측정함으로써 단일 큐벳에서 정량화될 수 있다. 흡광도 변화는 2-(4'-히드록시아조벤젠- 2-카르복실산)-아비딘 복합체의 소광 계수에 의해 샘플 중 바이오틴의 양에 관련된다.
대안적으로, 항체, 항원 결합 단편 또는 결합 단백질은 형광 모이어티에 의해 컨쥬게이션될 수 있다. 폴리펩티드를 형광 모이어티(예를 들어, R-피코에리트린, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 등)로 컨쥬게이션하는 것은 예를 들어 문헌[Glazer, AN and Stryer L. (1984). Trends Biochem. Sci. 9:423-7]; 문헌[Kronick, MN and Grossman, PD (1983) Clin. Chem. 29: 1582-6]; 문헌[Lanier, LL and Loken, MR (1984) J. Immunol, 132: 151-156]; 문헌[Parks, DR et al. (1984) Cytometry 5: 159-68]; 문헌[Hardy, RR et al. (1983) Nature 306:270-2]; 문헌[Hardy RR et al. (1984) J. Exp. Med. 159:1169- 88]; 문헌[Kronick, MN (1986) J. Immuno. Meth. 92: 1-13]; 문헌[Der-Balian G, Kameda, N and Rowley, G. (1988) Anal. Biochem. 173:59-63]에 기술된 당업계에서 인식된 기술을 이용하여 성취될 수 있다.
비제한적 일 실시양태에서, 항체, 항원 결합 단편은, 시험관내에서 및/또는 생체내에서 엔도글린에의 항체의 결합을 가시화하기 위하여 사용될 수 있는, 엔도글린의 면역검출을 위한 방사성 핵종, 철 관련 화합물, 염료, 조영제 또는 형광제와 같은 검출 가능한 표지와 회합될 수 있다(그에 컨쥬게이션될 수 있다).
방사성 표지의 비제한적 예는 예를 들어 32P, 33P, 43K, 52Fe, 57Co, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 77Br, 81Rb/81MKr, 87MSr, 90Y, 97Ru, 199Au, 203Pb, 211At, 212Pb, 212Bi 및 213Bi를 포함한다. 방사성 표지는 항체 이미징 기술분야에 공지된 통상적인 화학을 이용하여 화합물에 부착될 수 있다. 방사성 표지된 화합물은 시험관내 진단 기술에서 그리고 생체내 방사성 이미징 기술에서 그리고 방사성면역요법에서 유용하다. 예를 들어, 생체내 이미징의 경우, 항체 및 그의 항원 결합 단편은 방사성 동위원소(들)라기보다는 오히려 조영제에 컨쥬게이션될 수 있으며, 이는 자기 공명 이미지 향상제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니고, 여기서, 예를 들어 항체 분자에는 킬레이팅 그룹을 통하여 다수의 상자성 이온이 로딩된다. 킬레이팅 그룹의 예는 EDTA, 포르피린, 폴리아민 크라운 에테르 및 폴리옥심을 포함한다. 상자성 이온의 예는 가돌리늄, 철, 망간, 레늄, 유로품, 란타늄, 홀뮴 및 페르븀을 포함한다. 그러한 검출 가능 모이어티는 또한 금속; 금속 킬레이팅제; 란탄족; 란탄족 킬레이팅제; 방사성 금속; 방사성 금속 킬레이팅제; 양전자 방출 핵; 미세버블(초음파의 경우); 리포좀; 리포좀 또는 나노구체 내에 미세캡슐화된 분자; 단결정 산화철 나노화합물; 자기 공명 이미징 콘트라스트제(contrast agent); 광 흡수, 반사 및/또는 산란제; 콜로이드성 입자; 형광단, 예컨대 근적외 형광단을 포함한다. 많은 실시양태에서, 그러한 이차 작용체/모이어티는 상대적으로 크며, 예를 들어 크기가 적어도 25 amu이며, 다수의 경우, 크기가 적어도 50, 100 또는 250 amu일 수 있다. 특정 실시양태에서, 이차 작용체는 금속을 킬레이팅하는 킬레이트 모이어티, 예를 들어 방사성 금속 또는 상자성 이온용 킬레이팅제이다. 실시양태들에서, 이것은 방사선 요법 또는 이미징 절차에 유용한 방사성 핵종의 킬레이팅제이다.
본 발명의 길항제가 조직에 있어서 혈관신생을 조정하는 그의 능력에 대하여 또한 분석될 수 있다. 당업계의 숙련자에게 공지된 임의의 적합한 분석법을 이용하여 그러한 효과를 모니터링할 수 있다. 몇몇의 그러한 기술이 본원에 기술되어 있다.
혈관신생을 측정하는 한 가지는 생체내 토끼 눈 모델이며, 이는 토끼 눈 분석으로 칭해진다. 토끼 눈 분석법은 다른 이들에 의해 상세하게 기술되었으며, 또한 혈관신생 억제제, 예컨대 탈리도미드의 존재하에 혈관신생 및 신혈관형성 둘 모두를 측정하는 데 사용되었다. 문헌[D'Amato et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91 :4082-4085]을 참조한다.
토끼 눈 분석법은 생체내 혈관신생에 있어서의 잘 인식된 분석 모델이며, 그 이유는 각막의 가장자리로부터 각막 내로 성장하는 토끼 혈관에 의해 예시되는 신혈관형성 과정이 눈의 자연적으로 투명한 각막을 통하여 쉽게 가시화되기 때문이다. 추가로, 신혈관형성의 촉진 또는 억제 또는 신혈관형성의 퇴화의 정도 및 양 둘 모두는 시간이 지남에 따라 용이하게 모니터링될 수 있다.
마지막으로, 토끼는 임의의 테스트 시약에 노출되며, 따라서 토끼의 건강은 테스트 시약의 독성을 나타내는 것이다.
또 다른 분석법에서는 키메라 마우스:인간 마우스 모델에서의 혈관신생을 측정하며, 이는 키메라 마우스 분석법으로 칭해진다. 이 분석법은 다른 이들에 의해 상세하게 기술되었으며, 종양 조직의 퇴화, 신혈관형성 및 혈관신생의 측정을 위하여 본원에 추가로 기술되었다. 문헌[Yan, et al. (1993) J. Clin. Invest. 91 :986-996]을 참조한다.
키메라 마우스 분석법은 생체내 혈관신생에 있어서 유용한 분석 모델이며, 그 이유는 이식된 피부 이식편이 조직학적으로 정상 인간 피부와 밀접하고 유사하고, 전 조직의 신혈관형성이 일어나고 있기 때문인데, 여기서, 실제 인간 혈관은 그래프팅된 인간 피부의 표면 상에서 그래프팅된 인간 피부로부터 인간 종양 조직 내로 성장하고 있다. 인간 이식편 내로의 신혈관형성의 기점(origin)은 인간 특이적 내피 세포 마커를 이용한 신혈관구조의 면역조직화학적 염색에 의해 입증될 수 있다.
키메라 마우스 분석은 새로운 혈관 성장의 퇴화의 양 및 정도 둘 모두를 기반으로 하여 신혈관형성의 퇴화를 입증한다. 더욱이, 종양 조직과 같은 그래프팅된 피부상에 이식된 임의의 조직의 성장에 대한 영향의 모니터링이 용이하다. 마지막으로, 상기 분석법은 분석 시스템에서 독성에 대한 내부 대조군이 있기 때문에 유용하다. 키메라 마우스는 임의의 테스트 시약에 노출되며, 따라서 마우스의 건강은 독성을 나타내는 것이다. 본원에 기술된 그리고 당업계에 공지된 다른 동물 모델이 본원에 기술된 방법에서 또한 이용될 수 있다.
C. 인간화 엔도글린 항체를 이용한 치료
혈관신생/신혈관형성, 과도한 혈관형성, 또는 소혈관 확장과 관련된 하나 이상의 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법이 본원에서 제공되며, 이는 상기 질환 또는 장애와 관련된 엔도글린에 결합하고 혈관신생을 예방함으로써 상기 질환 또는 그의 중증도를 예방, 치료, 개선 또는 감소시키는, 본원에 개시된 인간화 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
혈관신생/신혈관형성과 관련된 하나 이상의 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법이 본원에서 제공되며, 이는 상기 질환 또는 장애와 관련된 엔도글린에 결합하거나, 혈관신생을 감소시키거나, 과도한 혈관신생을 예방하는, 본원에 개시된 인간화 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 사용될 때, "예방"은 혈관신생과 관련되거나 엔도글린 활성과 상관된 질환 또는 장애의 진행의 예방, 증상의 발병의 예방, 예방법을 나타낸다. 본원에 사용될 때, "예방", "치료" 및 "치료하는"은 상호교환가능하게 사용되며, 예를 들어 증상의 정지, 생존의 연장, 증상의 부분적인 또는 완전한 개선, 및 혈관신생과 관련되거나 엔도글린 활성과 상관된 질병, 질환 또는 장애의 부분적인 또는 완전한 근절을 나타낸다.
조성물은 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 이득/위험 비로, 엔도글린과 관련될 수 있는 본원에 기술된 것과 같은 질환 또는 장애를 억제함으로써 일부의 요망되는 치료 효과를 생성하기에 효과적인 치료적 유효량으로 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 인간 환자에게의 투여에 있어서, 조성물은 당업계의 숙련자에게 공지된 방법에 의해 제형화될 수 있다. 치료적 유효량은 기관 또는 조직에 있어서 요망되는 치료 또는 예방 효과를 적어도 부분적으로 달성하는 양이다. 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료적 치료를 초래하는 데 필요한 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양 그 자체는 고정되어 잇지 않다. 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 투여량은 질환의 유형, 질환의 광범위함, 및 그 질환 또는 장애를 앓고 있는 포유류의 크기에 따라 변할 수 있다. 일 실시양태에서, 본원에 개시된 2가지 이상의 인간화 항-엔도글린 항체가 조합되어 환자에게 투여된다. 병용법은 항체들의 병행 또는 후속 투여를 포함한다.
본원에서 "투여"는 조성물이 환자의 신체 내부에 있게 하는 방식으로 조성물을 환자에게 제공하는 수단으로 정의된다. 그러한 투여는 임의의 경로에 의한 것일 수 있으며, 이는 제한 없이 피하, 초자체내, 피내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 근육내 투여(예를 들어, 주사)에 의한 국소, 국부 또는 전신 투여를 포함한다. "병행 투여"는 서로로부터 상대적으로 짧은 시간 기간 내에 투여하는 것을 의미하며, 그러한 시간 기간은 2주 미만, 7일 미만, 1일 미만일 수 있으며 심지어 동시에 투여될 수 있다.
조성물 중 활성 성분의 실제 투여 수준은 환자에게 유독하지 않고서, 특정 환자, 조성물, 및 투여 양식에 있어서의 요망되는 치료적 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변화될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 인자에 의존적이며, 이는 이용되는 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 이용되는 특정 조성물과 병용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 종합 건강 및 이전의 병력, 및 의학 기술분야에서 공지된 유사 인자를 포함한다. 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은 다양한 투약량으로 그리고 다양한 시간틀에 걸쳐 대상체에게 투여될 수 있다. 비제한적 용량은 약 0.01 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 100 mg/kg, 약 125 mg/kg, 약 150 mg/kg, 약 175 mg/kg, 약 200 mg/kg, 또는 그 사이의 임의의 정수를 포함한다. 추가로, 항체 또는 항원 결합 단편의 용량(들)은 주 2회, 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 6주마다, 8주마다, 12주마다, 또는 그 안의 임의의 주 조합으로 투여될 수 있다. 예를 들어 4주간 주 1회 또는 2회, 이어서 요법 없이 2주의, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 투여와 같은 투약 주기가 또한 고려된다. 예를 들어 본원에 기술된 매주 주기 및 용량의 상이한 조합이 본 발명 내에서 또한 고려된다.
"접촉시키는"은 본원에 제공된 조성물을 본원에 기술된 세포, 기관, 조직 또는 유체와 물리적으로 근접하게 하는 수단으로서 정의된다. 접촉은 본원에 제공된 임의의 조성물의 전신 또는 국소 투여를 포함하며, 제한 없이 시험관내, 생체내 및/또는 생체외 절차 및 방법을 포함한다. "조합하는" 및 "접촉시키는"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 동일한 방식으로 정의됨을 의미한다.
반응은 환자가 병의 징후 또는 증상의 부분적이거나 전적인 경감, 또는 감소를 경험할 때 달성되며, 구체적으로, 제한 없이 생존의 연장을 포함한다. 예상되는 무진행 생존 시간은 재발 횟수, 질환의 기 및 기타 인자를 포함하는 예후 인자에 따라 개월 내지 연수로 측정될 수 있다. 생존 연장은 제한 없이 적어도 1개월(mo), 대략 적어도 2개월(mo), 대략 적어도 3개월, 대략 적어도 4개월, 대략 적어도 6개월, 대략 적어도 1년, 대략 적어도 2년, 대략 적어도 3년 또는 그 초과의 시간을 포함한다. 전체 생존이 또한 개월 내지 연수로 측정될 수 있다. 환자의 증상은 여전히 정지한 채로 남아있을 수 있거나 또는 감소할 수 있다.
당업계의 통상적인 기술을 갖는 의사 또는 수의사는 필요한 조성물의 유효량 (ED50)을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 요망되는 치료적 효과를 달성하기 위하여 필요한 것보다 더 낮은 수준으로 조성물에 이용되는 화합물의 용량을 시작하고, 요망되는 효과가 달성될 때까지 그 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 용량은 일정하게 남아있을 수 있다.
조성물은 상기에 기술된 것과 같은 임의의 통상적인 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 선택된 투여 경로에 관계없이, 적합한 수화 형태 및/또는 조성물로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물은 하기에 기술된 것과 같은 허용되는 투여 형태로 제형화되거나 당업계의 숙련자에게 공지된 다른 통상적인 방법에 의해 제형화된다.
항체는 하기에 더욱 상세하게 기술된 것과 같은 컨쥬게이트 또는 융합 단백질을 생성하기 위하여 예를 들어 화학적 컨쥬게이션, 공유 또는 비공유 결합 또는 재조합 기술과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 치료적 모이어티와 조합되거나 검출 가능(이미징) 모이어티에 조합될 수 있다. 대안적으로, 항체 및/또는 기타 에이전트는 동시 투여 또는 순차적 투여를 위하여 별도의 조성물에서 조합될 수 있다.
그러한 성분의 독성 및 치료 효능은 예를 들어 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)의 결정을 위한, 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며, 이것은 LD50/ED50의 비로서 표현될 수 있다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 건강한 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하고 그에 의해 부작용을 감소시키기 위하여 영향을 받는 조직의 부위에 그러한 화합물을 표적화하는 전달 시스템을 디자인하기 위하여 주의하여야 한다.
세포 배양물 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서의 사용을 위한 투여량의 범위의 표현에 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있으며, 이때 독성은 거의 없거나 전혀 없다. 투여량은 이용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물에 있어서, 치료적 유효 용량은 처음에 세포 배양 분석으로부터 개산될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정될 경우 IC50(즉, 최대 억제의 절반을 달성하는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장중 농도 어레인지(arrange)를 달성하기 위하여 동물 모델에서 표현될 수 있다. 혈장중 수준은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 그러한 정보를 이용하여 인간에서의 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정할 수 있다.
엔도글린의 신생혈관유발 역할은 내피 세포 배양물 및 녹아웃 마우스 모델을 포함하는 다수의 모델에서 확립되었다. 내피 세포 및 관련된 세포는 엔도글린(CD105)을 발현하는 것으로 공지되어 있으며, 일반적으로 심장 발생뿐만 아니라 혈관신생에서의 엔도글린의 역할도 다수의 연구, 배양 모델 및 동물 모델에서 또한 확증되었다(문헌[Duff et al, FASEB J., 17:984-992 (2003)]; 문헌[Bernabeu et al, J. Cell. Biochem., 102(6): 1375-1388 (2007)]; 미국 특허 제7,097,836호).
따라서, 질환에 걸린 조직에서 혈관신생을 억제하는 방법은 그 질환의 증상을 개선시키며, 질환에 따라서는 그 질환의 치료에 기여할 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명은 조직에서의 혈관신생 억제를 고려한다. 조직에서의 혈관신생 정도 및 그에 따라 본 발명에 의해 달성되는 억제 정도는 본원에 기술된 바와 같이 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다.
엔도글린상의 에피토프를 인식하고(예를 들어, 그에 결합하고) 혈관신생을 억제하는 항체의 유일무이한 특이성은 본원에 기술된 바와 같은 혈관신생(신혈관형성), 소혈관 확장 및/또는 과도한 혈관형성을 특징으로 하는 질환에 있어서의 진단 및 치료 용도를 제공한다. 인간화 항-엔도글린 항체 및 그의 단편은 의학적 장애, 예를 들어 혈관신생/신혈관형성을 특징으로 하는 다양한 형태의 안질환(예를 들어, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 신병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 및 다양한 형태의 암(원발성 종양 및 전이)을 앓고 있는 포유류(예를 들어, 인간)와 같은 대상체에 투여될 수 있다. 엔도글린에 결합하고 혈관신생을 억제하는 본원에 개시된 인간화 항체 또는 그의 단편을 투여함으로써 혈관신생을 특징으로 하는 안질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 엔도글린에 결합하고 혈관신생을 억제하는 본원에 개시된 인간화 항체 또는 그의 단편을 투여함으로써 만성 염증성 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 또한 본원에서 제공된다. 그러한 만성 염증성 질환의 예는 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에 개시된 인간화 항체 또는 그의 단편을 투여함으로써 당뇨병성 신병증을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 추가로 본원에서 제공된다. 본원에 개시된 인간화 항체 또는 그의 단편을 투여함으로써 류마티스 관절염 또는 골관절염을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다.
항-엔도글린 항체는 혈관신생 치료에 효과적일 수 있음이 이해되며, 대상체는 하나 이상의 추가의 혈관신생 억제제로 또한 치료될 수 있음이 본원에서 고려된다.
"혈관신생 억제제"라는 용어는 본원 및 특허청구범위의 목적상, 혈관신생을 억제하는 기능을 하는, 펩티드, 단백질, 효소, 다당류, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA, 재조합 벡터, 및 약물을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 화합물 또는 분자를 의미하도록 사용된다. 혈관신생 억제제는 당업계에 공지되어 있으며, 모든 유형이 본원에서 고려된다. 화합물 및 분자의 비제한적 예는 천연 및 합성 생체분자, 예컨대 파클리탁셀, O-(클로로아세틸-카르보밀) 푸마길롤("TNP-470" 또는 "AGM 1470"), 트롬보스폰딘-1, 트롬보스폰딘-2, 안지오스타틴, 혈관신생의 인간 연골세포 유래된 억제제(human chondrocyte-derived inhibitor of angiogenesis, "hCHIAMP"), 연골 유래된 혈관신생 억제제, 혈소판 인자-4, 그로-베타(gro-beta), 인간 인터페론 유도성 단백질 10("IP 10"), 인터류킨 12, 로(Ro) 318220, 트리시클로데칸-9-일 잔테이트("D609"), 이르소글리아딘, 8,9-디히드록시-7-메틸-벤조[b] 퀴놀리지늄 브로마이드("GPA 1734"), 메드록시프로게스테론, 헤파린과 코르티손의 조합물, 글루코시다아제 억제제, 게니스테인, 탈리도마이드, 디아미노-안트라퀴논, 허비마이신, 우르솔산 및 올레아놀산을 포함한다. 항체의 비제한적 예는 엔도글린의 상이한 에피토프들, VEGF 수용체 또는 VEGF와 같은 분자에 대하여 유도된 것을 포함한다. 추가로, VEGF 수용체의 소분자형 억제제가 공지되어 있으며, 본원에서 고려된다. VEGF 수용체 억제제의 비제한적 예는 베바시주맙(아바스틴®), 라니비주맙(루센티스), 아플리버셉트(VEGF-트랩(Trap)), 수니티닙(수텐트(Sutent)), 소라페닙(넥사바르(Nexavar)), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다.
본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은 본원에 기술된 임의의 혈관신생 관련 질병 또는 질환의 병용 요법을 위하여 VEGF 수용체 억제제와 조합되어 투여될 수 있다. 비제한적 일 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 베바시주맙이다. 베바시주맙의 예시적인 투여량은 약 7.5, 약 10, 또는 약 15 mg/kg이며, 이는 2주 또는 3주마다 투여된다.
비제한적 일 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 라니비주맙이다. 라니비주맙의 예시적인 눈 투여량은 약 0.5 mg을 포함하며, 이는 매달 초자체내로 투여된다. 비제한적 일 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 아플리버셉트(VEGF-트랩)이다. VEGF-트랩의 예시적인 눈 투여량은 약 0.5 - 약 10 mg/kg을 포함하며, 이는 2 또는 3주마다 투여된다. VEGF-트랩의 예시적인 눈 투여량은 약 0.5 - 약 2.0 mg을 포함하며, 이는 매달 또는 3개월에 1회 초자체내로 투여된다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 수니티닙이다. 수니티닙의 예시적인 양생법은 4주 동안 약 50 mg을 투여하는 것, 이어서 2주간 약물이 없는 것을 포함한다. 치료 양생법은 주기적인 것 또는 비주기적인 것을 기반으로 하여 반복될 수 있다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 소라페닙이다. 소라페닙의 예시적인 투여량은 약 400 mg을 포함하며, 이는 매일 투여된다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 악시티닙이다. 악시티닙의 예시적인 투여량은 약 3, 약 5, 또는 약 10 mg을 포함하며, 이는 일일 2회 투여된다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 페갑타닙이다. 페갑타닙의 예시적인 투여량은 약 0.3 - 약 3 mg을 포함하며, 이는 6주마다 초자체내로 투여된다.
또 다른 비제한적 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 파조파닙이다. 파조파닙의 예시적인 투여량은 약 200 - 약 1000 mg을 포함하며, 이는 매일 투여된다.
이들 VEGF 수용체 억제제들의 다수의 조합물이 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편과 함께 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 조합물은 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편, VEGF 수용체 억제제 또는 이들 둘 모두에 있어서의 더욱 적은 용량의 사용으로 이어질 수 있다. 투약에서의 그러한 변경은 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편과 VEGF 수용체 억제제의 조합물의 상승 효과에서 생길 수 있다.
혈관신생과 관련된 안질환
황반 변성 상태 및 당뇨병성 망막병증
일 측면에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본원에서 제공되는 임의의 조성물을 환자에게 투여함으로써 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 맥락막 신혈관형성 또는 신혈관성 녹내장을 치료하는 방법을 제공한다.
엔도글린은 혈관신생 및 세포외 매트릭스와 관련된 수용체이다. 황반 변성(AMD)은 높은 정밀도의 시력을 책임지는 황반으로 불리는 중심 망막의 일부 내의 광수용체의 상실이다. 황반의 변성은 망막색소 상피와 혈관성 맥락막 사이의 막 내의 세포외 매트릭스 성분 및 다른 파쇄물의 비정상적인 침적과 관련된다. 상기 파쇄물 유사 물질은 결정체(drusen)로 불린다. 결정체는 안저 눈 검사에 의해 관찰된다. 정상적인 눈은 결정체가 없는 황반을 가질 수 있지만, 결정체는 망막 주변에 풍부할 수 있다. 임의의 황반 시력의 상실의 부재하에 황반 내의 연질 결정체의 존재는 AMD의 초기로 간주된다. 황반 변성은 망막의 망막색소 상피(RPE) 층 아래의 비정상적인 혈관의 발생인 맥락막 신혈관형성(CNV)을 특징으로 한다. 상기 혈관은 브루크(Bruch) 막을 통해 파열하여 망막 착색 상피를 붕괴시키고, 출혈되고, 종국적으로 중심 시력의 현저한 상실(원반 상흔)을 야기하는 황반 상흔을 유발한다.
맥락막 신혈관형성(CNV)은 다른 안질환에 추가로 황반 변성에서 통상적으로 발생하고, 맥락막 내피 세포의 증식, 세포외 매트릭스의 과다생성, 및 섬유혈관성 망막하 막의 형성과 관련된다. 망막색소 상피 세포 증식 및 혈관신생 인자의 생성은 맥락막 신혈관형성을 초래하는 것으로 보인다.
당뇨병성 망막병증(DR)은 모세혈관 기저막의 비후에 의해 당뇨병에서 발생하는 과도한 혈관신생 및 혈관주위세포와 모세혈관의 내피 세포 사이의 접촉 결여를 특징으로 하는 안질환이다. 혈관주위세포의 상실은 모세혈관의 누출을 증가시키고, 혈액-망막 장벽을 파괴한다. 당뇨병성 망막병증은 미세혈관 망막 변화의 결과이다. 고혈당 유발 혈관주위세포 사멸 및 기저막의 비후는 혈관벽의 부전을 야기한다. 상기 손상은 혈액-망막 장벽의 형성을 변경하고, 망막 혈관을 보다 투과성으로 만든다. 소혈관 - 예를 들어 눈 내의 혈관 -은 불량한 혈당(혈중 글루코스) 제어에 특히 취약하다. 글루코스 및/또는 프룩토스의 과도한 축적은 망막 내의 소혈관을 손상시킨다. 또한, 황반 부종은 손상된 혈관이 유체 및 지질을 황반 상에 누출할 때 발생할 수 있다. 상기 유체는 황반 팽윤을 유발하여 시력을 약화시킨다. 또한, 상기 손상은 망막 내의 산소 결여를 야기한다.
질환이 진행됨에 따라, 망막 내의 산소 결여는 망막을 따라 및 눈 내부를 채우는 투명한 겔 초자체에서 혈관신생을 자극한다. 적시의 치료를 실시하지 않으면, 상기 새로운 혈관은 출혈하고, 시력을 흐리게 하고, 망막을 파괴할 수 있다. 또한, 섬유혈관 증식도 견인성 망막 박리를 야기할 수 있다. 새로운 혈관도 눈의 전방각 내로 성장하여 신혈관성 녹내장을 유발할 수 있다.
증식성 초자체 망막병증은 초자체막 내 및 망막의 표면 상의 세포막 및 섬유성 막의 세포성 증식과 관련된다. 망막색소 상피 세포 증식 및 이동은 상기 안질환에서 흔히 발생한다. 증식성 초자체 망막병증과 관련된 막은 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어 제I형, 제II형 및 제IV형 콜라겐 및 피브로넥틴을 함유하고, 점차 섬유화된다.
노인성 황반 변성(AMD) 및 당뇨병성 망막병증은 선진국에서 실명의 2가지의 주요한 원인이다. 거대분자 루센티스®, 아바스틴®, 및 마쿠겐®에 대한 최근의 승인은 AMD 환자가 이용가능한 치료 방법의 옵션을 개선하였다. 루센티스®는 Fab이고, 아바스틴®은 단클론 항체이다. 이들은 모두 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 결합하고, 현재까지 AMD를 치료하는 가장 인상적인 결과를 보여주었지만; 소수의 치료된 환자만이 시력 정밀도의 유의한 개선을 경험한다. VEGF 이외의 다른 표적에 초점을 맞춘 항-혈관신생 요법은 VEGF 경로를 표적화하는 물질과 관련된 몇몇 제한을 극복할 수 있다.
엔도글린에 결합하는, 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증, 또는 증식성 초자체 망막병증의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 및 항원 결합 단편의 투여를 통해 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증, 또는 증식성 초자체 망막병증의 치료 또는 예방 방법이 본원에서 설명된다. 엔도글린에 결합하는, 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 혈관 수축, 안질환과 관련된 내피 세포 증식의 억제, 출혈 증상의 제거, 탁한 시력의 치료, 시력 상실의 정체 제공 및/또는 혈관 누출의 억제를 제공할 수 있다. 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 또한 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증 또는 증식성 초자체 망막병증의 치료용 의약에 사용될 수 있다.
추가로, 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 또한 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증 또는 증식성 초자체 망막병증의 치료를 위한 공지된 요법 및/또는 화합물과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 화합물의 예는 베바치주맙(아바스틴®), 라니비주맙(루센티스®), 아플리베르셉트(VEGF-트랩), 수니티닙(수텐트®), 소라페닙(넥사바르®), 악시티닙, 페갑타닙, 파조파닙 또는 마쿠겐®을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에서 설명되는 투여 방식 이외에, 인간화 항-엔도글린 항체 및 항원 결합 단편은 초자체내 경로를 통해 투여될 수 있다. 초자체내 투여 방식의 비제한적인 예는 초자체내 주사 및 초자체내 임플란트의 사용을 포함한다.
환자는 개선 및 치료에 대한 반응성에 대해 평가될 수 있다. 치료는 황반 부종의 감소, CNV 영역의 감소, 및 시력의 증가를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 증상의 측정은 당업계에 공지된 바와 같이 수행하고, 하기 실시예에서 추가로 설명된다.
만성 염증성 질환
피부, 근육, 내장, 연결 조직, 관절, 뼈 및 혈관이 혈관신생 자극시에 침습할 수 있는 유사한 조직을 비롯하여 임의의 다양한 조직 또는 유기적인 조직으로 이루어진 장기가 질환 상태에서 혈관신생을 지지할 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 치료되는 조직은 염증이 발생한 조직이고, 억제되는 혈관신생은 염증이 발생한 조직의 신생혈관형성이 존재하는 염증이 발생한 조직 혈관신생이다.
염증성 장 질환
혈관신생은 염증성 장 질환(IBD)에서 중요한 역할을 수행한다. IBD는 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하는 장 및 내장 질환 또는 질병의 세트에 대한 포괄적인 용어이다. 크론병은 일반적으로 소장 및 대장의 염증을 특징으로 하며, 반면에 궤양성 대장염은 일반적으로 결장에 국소화된다. 비정상적인 또는 병리학적 혈관신생은 크론병 및 궤양성 대장염 둘 모두에서 중요하다. 두 질환은 미세혈관 밀도의 증가 및 미세혈관 기능이상을 수반하고, 상기 혈관신생은 조직 병상 및 두 질환에서 발견되는 염증성 사이클과 일시적으로 관련된다. 엔도글린은 상기 조직에서 발현되고 IBD 동안 혈관신생의 조절곤란에서 기능하는 것으로 알려져 있다(문헌[Chidlow et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol, 293:5-18 (2007)]).
엔도글린에 결합하는, 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 IBD 치료에 사용될 수 있다. 추가로, 엔도글린에 결합하는 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 크론병 또는 궤양성 대장염의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 인간화 항-엔도글린 항체 및 항원 결합 단편은 수술 및/또는 IBD, 크론병 또는 궤양성 대장염의 공지된 요법제와 조합하여 사용될 수 있다. 상기 요법제의 예는 아미노살리실레이트(예를 들어, 메살라민), 코르티코스테로이드(예를 들어, 부데소나이드, 프레드니손, 등), 항생제(예를 들어, 메트로니디졸 등), 면역억제성 약물(예를 들어, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 타크롤리무스, 및 시클로스포린 등), 및 생물학적 약물, 예를 들어 단백질 및 항체(예를 들어, 인플릭시맙 등)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
IBD의 치료는 염증이 발생한 조직의 혈관형성 감소에 의해 평가될 수 있다. 또한, 치료는 IBD를 특징짓는 궤양성 병변의 정체, 소실, 및/또는 치유에 의해 평가될 수 있다.
당뇨병성 신병증 & 신장 이식 허혈
당뇨병성 신병증은 1형 및 2형 당뇨병 모두에서 이환율 및 사망률의 주요 원인이다. 이것은 전세계적으로 말기 신장병의 주요 원인이다. 당뇨병성 신병증은 신생혈관유발 인자의 합성 증가에 의한 사구체 미세혈관 손상을 특징으로 한다. 상기 신생혈관유발 인자는 내피 세포 증식 및 후속적인 혈관신생의 증가를 유발하고, 엔도글린은 만성 신장병에서 상향조절되는 것으로 알려져 있다. 상기 혈관신생은 사구체의 파괴 및 최종적으로 신부전을 야기한다(문헌[Zent et al., Seminars in Nephrology, 27(2): 161-171 (2007)]; 문헌[Roy-Chaudhury et al., Exp. Nephrol, 5:55-60 (1997)]).
이식된 장기의 허혈 및 부전을 야기하는 신장 이식에서 유사한 효과가 관찰된다. 엔도글린의 상향조절은 신장에서 상향조절된 혈관신생 및 염증 형성을 야기한다. 이와 반대로, 엔도글린이 없는 마우스를 사용한 연구는 이식/허혈 후에 유의하게 감소된 신장 손상 및 장기 생존 증가를 보여주었다(Docherty et al., Nephol. Dial. Transplant., 21 :2106-2119 (2006)).
엔도글린에 결합하는, 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 당뇨병성 신병증, 이식후 신부전, 및/또는 이식후 허혈성 신장 손상의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편의 투여를 통해 당뇨병성 신병증, 이식후 신부전, 및/또는 이식후 허혈성 신장 손상을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에서 설명된다. 또한, 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 당뇨병성 신병증, 이식후 신부전, 및/또는 이식후 허혈성 신장 손상의 치료용 의약에 사용될 수 있다. 추가로, 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 또한 당뇨병성 신병증, 이식후 신부전, 및/또는 이식후 허혈성 신장 손상의 치료를 위한 공지된 요법제 및/또는 화합물과 조합하여 사용될 수 있다.
환자는 치료 효능, 예를 들어 신장 기능의 개선에 대해 평가될 수 있다.
류마티스 관절염 & 골관절염
류마티스 관절염은 과도한 혈관신생을 특징으로 하고, 이에 대해 잘 이해되어 있다. 활액에서 발견되는 염증 및 파괴는 활액 조직 주위 및 내에서 발견되는 혈관신생의 증가와 직접 관련된다. 많은 신생혈관유발 인자는 류마티스 관절염 환자의 이환된 조직에 존재한다(문헌[Koch and Distler, Arthritis Res. & Ther., 9(Suppl. 2): S3, 1-9 (2007)]).
골관절염은 활액 관절에 영향을 주는 일군의 만성 지체장애 질병이다. 혈관신생 및 염증은 질환의 병리생리학에서 필수적인 과정이고, MMP 생산의 자극 및 연골내 골화를 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 기작을 통해 관절 손상에 기여한다. 추가로, 골관절염에서 혈관신생은 추가의 신경분포를 유도하고, 이는 계속 서로를 각각 자극하는 피드백 루프로 발달한다(문헌[Bonnet & Walsh, Rheumatology, 44:7-16 (2005)]).
엔도글린에 결합하는, 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 류마티스 관절염 및 골관절염의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 및 항원 결합 단편의 투여를 통해 류마티스 관절염 및 골관절염을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에서 설명된다. 또한, 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 류마티스 관절염 및 골관절염의 치료용 의약에 사용될 수 있다.
시험에서 RA의 개선에 대해 잘 승인된 2개의 복합 측정법이 존재한다: 파울루스 기준(Paulus Criteria) 및 미국 류마티스 학회 분류 기준(The American College of Rheumatology Criteria) (ACR). 파울루스 기준은 다음 중 4개의 개선으로서 규정된다: 압통 및 붓기가 있는 관절 수, 아침 강직, 질병 활성도에 대한 환자 평가, 질병 활성도에 대한 의사의 평가 및 적혈구 침강 속도(ESR). 개선 수준은 상기 각각의 변수의 개선 비율로서 설정된다. 즉, 파울루스 20 분류는 반응자가 6개의 파라미터 중 4개에서 20% 개선을 보임을 나타낸다.
또한, 류마티스 관절염은 미국 류마티스 학회 분류 기준(ACR) 스코어링을 사용하여 평가될 수 있다. 간략하게는, 류마티스 관절염에서 임상 완화를 결정하기 위한 ACR 분류 기준은 적어도 2개월 연속 존재하는 다음 요인 중의 5개 이상의 존재에 의해 평가된다:
a. 아침 강직 < 15분;
b. 피로 없음;
c. 관절통 없음;
d. 관절 압통 또는 운동 통증 없음;
e. 관절 또는 건초(tendon sheath) 내의 연조직 붓기 없음; 및
f. ESR(웨스터그렌(Westergren) 방법) < 여성에 대해 30 mm/hr 또는 남성에 대해 20 mm/hr.
배제가 발생할 수 있고 다음을 포함한다: 활성 혈관염, 심장막염, 흉막염 또는 근염의 임상 소견, 및 원인불명의 최근의 체중 감소 또는 류마티스 관절염에 의한 발열은 완전한 임상 완화의 지정을 금지할 것이다(문헌[Pinals RS, et al., Arthritis Rheum 24: 1308, 1981]). 추가로, 류마티스 관절염의 기능적 상태의 ACR 분류 기준은 다음과 같은 환자 능력을 기초로 한 분류를 포함한다:
클래스 I: 일상 생활의 통상적인 활동을 완전히 수행할 수 있다(스스로 돌보기, 직업상, 및 여가활동);
클래스 II: 통상적인 스스로 돌보기 및 직업상 활동을 수행할 수 있지만, 여가활동은 제한됨;
클래스 III: 통상적인 스스로 돌보기 활동을 수행할 수 있지만, 직업상 및 여가활동은 제한됨; 및
클래스 IV: 통상적인 스스로 돌보기, 직업상, 및 여가활동의 수행 능력이 제한됨.
또한, 골관절염은 ACR 스코어링을 사용하여 평가될 수 있다. 고관절의 골관절염에 대한 ACR 임상 분류 기준은 환자 병력, 신체 검사 및 실험실 결과를 사용하여 평가하고: 환자는 고관절 통증 및 다음 중의 하나에 대해 평가된다:
(1) 15도 미만의 고관절 내회전 및 45도 mm/hr 이하의 ESR 또는 ESR이 이용가능하지 않을 경우 115도 이하의 고굴 현상; 또는
(2) 15도 미만의 고관절 내회전, 안쪽 고관절과 관련된 통증, 60분 이하 동안의 고관절 아침 강직 및 50세 이상의 환자.
병력, 신체 검사, 실험실 및 방사선 소견을 사용하여, 전통적인 방식은 고관절의 통증 및 다음 증상 중의 2개이다: 20 mm/hr 미만의 ESR, 방사선 사진상 대퇴부 및/또는 관골구 골증식체, 또는 방사선 사진상 관절 간격 감소(상, 축성, 및/또는 내측). 분류 나무는 다음과 같다: (1) 방사선 사진상 대퇴부 및/또는 관골구 골증식체 또는 (2) 20 mm/hr 이하의 ESR 및 방사선 사진상 축성 관절 간격 감소와 관련된 고관절 통증(문헌[Altman, R, et al.: Arthritis Rheum 34:505, 1991]).
무릎의 골관절염에 대한 ACR 임상 분류 기준
무릎의 골관절염에 대한 ACR 임상 분류 기준은 다음 기준을 사용하는 병력 및 신체 검사를 이용하여 평가한다: 다음 중의 3개와 관련된 무릎의 통증:
(1) 50세 이상의 환자;
(2) 30분 이내의 아침 강직;
(3) 활동적인 움직임 시에 마찰음;
(4) 골 압통;
(5) 골 과형성; 및
(6) 활막의 촉진상 열감 없음.
환자 병력, 신체 검사 및 방사선 소견을 이용하여, 무릎의 통증은 다음 환자 특징 중 하나와 연관하여 평가할 수 있다: (1) 50세 이상의 환자; (2) 30분 이내의 아침 강직; 및 (3) 활동적인 움직임 시에 마찰음 및 골증식체. 병력, 신체 검사 및 실험실 결과를 이용하여: 무릎의 통증은 다음 특징 중 5가지와 연관하여 평가할 수 있다:
(1) 50세 이상의 환자;
(2) 30분 이내의 아침 강직;
(3) 활동적인 움직임 시에 마찰음;
(4) 골 압통;
(5) 골 과형성;
(6) 활막의 촉진상 열감 없음;
(7) 40 mm/hr 미만의 ESF;
(8) 1:40 미만의 류마티스 인자(RF); 및
(9) 골관절염의 활액(SF) 징후(예를 들어, 문헌[Altman, R, et al: Arthritis Rheum 29: 1039, 1986] 참조).
손의 골관절염에 대한 ACR 임상 분류 기준은 다음과 같이 평가할 수 있다: 다음 중 3가지와 연관한 손의 통증, 쑤심 또는 강직: (1) 다음 관절 중 2개 이상의 경조직 과형성: 제2 및 제3 원위 지간, 제2 및 제3 근위 지간, 및 양손의 제1 수근중수 관절; (2) 2개 이상의 원위 지간 관절의 경조직 과형성; (3) 3개 미만의 종창이 있는 MCP 관절 및 (4) 상기 (1)에 나열된 적어도 하나의 관절의 변형.
암
CD105는 종양 혈관신생과 연관되고, 정상 조직에 비해 다양한 종양 조직의 내피에서 강하게 상향조절된다. CD105는 다양한 범위의 종양 내피, 예를 들어, 결장, 유방, 뇌, 폐, 전립선, 자궁내막, 신장, 간, 위, 두경부 및 자궁경부암에서 상향조절된다. 추가로, 대응하는 정상 조직보다 종양 내피에서 CD105의 더 강한 발현이 존재한다고 알려져 있다(문헌[Duff et al., FASEB J., 17:984-992 (2003)]; 문헌[Bernabeu et al., J. Cell. Biochem., 102(6): 1375-1388 (2007)]; 미국 특허 7,097,836). 따라서, 항-엔도글린 인간화 항체를 사용한 혈관신생의 억제는 암성 종양의 치료 방법 중의 하나를 나타낸다. 엔도글린에 결합하는, 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 암성 종양의 치료를 위해 사용될 수 있다. 또한, 본원에 개시된 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 암성 종양의 치료용 의약에 사용될 수 있다.
용어 "종양"은 본원에서 엔도글린을 발현하는 암성 조직(동일한 종류의 정상 조직에 의한 발현에 비해)을 의미한다. 종양은 고형 종양 및 반고형 종양을 포함할 수 있다. 종양의 비제한적인 예는 인간 백혈병, 예를 들어 비-T세포형(비-T) 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 골수단구성 백혈병; 및 중등 내지 고 수준의(동일한 종류의 정상 조직에 의한 발현에 비해) 엔도글린을 발현하는 주위 혈관구조를 갖는 인간 고형 및 반고형 종양, 예를 들어 혈관육종, 유방 암종, 위암, 결장 암종, 호지킨 림프종, 림프종, 다형성 교아종(GBM), 폐 암종, 흑색종, 골수종, 림프종, 골육종, 난소 암종, 이하선 종양, 인두 암종, 전립선 암종, 간세포 암종, 신장 암종, 및 직장 S상 결장 암종을 포함한다.
치료할 암성 조직은 예를 들어 비정상적인 수준의 엔도글린을 발현하는 내피 조직이다.
종양 조직의 신혈관형성의 부재 하에, 종양 조직은 필요한 영양분을 얻지 못하고, 성장이 느리고, 추가의 성장이 끝나고, 퇴행하여, 결국 괴사 상태가 되어 종양이 사멸하게 된다. 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 종양 신생혈관형성을 억제함으로써 종양 신생혈관형성을 억제하는 방법을 제공한다. 이와 유사하게, 본 발명은 혈관신생 억제 방법을 실시함으로써 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 이 방법은 전이 암세포의 형성은 전이성 암세포가 원발성 종양을 빠져나가기 위해 원발성 종양의 혈관형성을 필요로 하고 그의 2차 부위에서의 확립은 전이의 성장을 지지하기 위해 신혈관형성을 필요로 하기 때문에 전이의 형성에 대해 특히 효과적이다.
본 발명의 "암/전이로 고통받는 환자"는 돌연변이체 단백질(종양 연관 항원) 또는 돌연변이체 유전자를 발현할 수 있지만, 아직 질환의 증상을 나타내지 않을 수 있음이 이해될 것이다. 암이 결장암(돌연변이체 K-ras 단백질과 관련된)인 비제한적인 일 실시예에서, 결장의 일부 세포에 돌연변이체 K-ras 단백질을 갖는 환자는 환자가 아직 결장암의 증상을 나타내지 않을 수 있다 하더라도 본 발명에 따른 환자이다. "질환의 증후 또는 증상"은 임상적으로 인식되는 소견 또는 질환의 징후이다.
암으로 고통받는 환자의 "치료"는 환자의 증상이 부분적으로 또는 완전히 완화되거나, 또는 본 발명에 따른 치료 후에 정지된 상태로 유지됨을 의미한다. 치료된 환자는 증상 및/또는 종양 부하의 부분적인 또는 완전한 완화를 보일 수 있다. 이것은 예방, 치료 및 치유를 포함하는 것으로 의도된다. 비제한적인 일 실시예에서, 고전이성 암(예를 들어, 유방암)으로 고통받는 환자는 추가의 전이가 발생하지 않거나 치료를 받지 않은 환자에 비해 수가 감소될 경우에 치료된 것이다. 또 다른 비제한적인 예에서, 환자는 환자의 고형 암이 크기가 감소하거나 또는 치료를 받지 않은 환자에 비해 크기가 증가하지 않은 경우에 치료된 것이다. 또 다른 비제한적인 예에서, 치료된 환자의 암 세포의 수는 증가하지 않거나 치료를 받지 않은 환자에 비해 감소된다. 또한, 개선은 예를 들어 세포 증식의 감소, 세포의 수 감소, 세포자멸의 증가 및/또는 치료되는 환자의 생존 증가로서 규정될 수 있다.
본원에서 추가로 사용되는 바와 같이, 암의 치료는 암성 성장 또는 종양의 정지, 부분적인 또는 완전한 제거를 포함한다. 치료 또는 부분적인 제거는 예를 들어 성장 또는 종양 크기 및/또는 부피의 감소 배수, 예를 들어 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 또는 이들 사이의 임의의 감소 배수를 포함한다. 이와 유사하게, 치료 또는 부분적인 제거는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 이들 사이의 임의의 감소 비율의 종양 또는 종양 크기 및/또는 부피의 감소 비율을 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 방법에서 치료되는 종양 또는 암은 폐암, 부인과 악성 종양, 흑색종, 유방암, 뇌암(예를 들어, 다형성 교아종, "GBM"), 췌장암, 난소암, 자궁암, 결장직장암, 전립선암, 신장암, 두부암(head cancer), 간암(간세포암), 자궁암, 경부암(neck cancer), 신장암(신세포암), 육종, 골수종, 및 림프종을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일 실시양태에서, 치료할 종양은 고형 또는 반고형 종양이다. 또 다른 실시양태에서, 치료할 종양은 원발성 종양이다. 또 다른 실시양태에서, 치료할 종양은 전이성 종양이다. 일 실시양태에서, 치료할 종양 또는 암은 상피에서 기원한다. 또 다른 실시양태에서, 치료할 암은 골수종이다. 또 다른 실시양태에서, 치료할 암은 난소암이다. 또 다른 실시양태에서, 치료할 암은 신장암/신암이다. 또 다른 실시양태에서, 치료할 암은 간세포암/간암이다.
폐암
일 측면에서, 본원에서 폐암 치료 방법이 제공된다. 가장 흔한 종류의 폐암은 비-소세포 폐암(NSCLC)으로서, 약 80-85%의 폐암이 이에 해당하고, 평탄 세포 암종, 선암종, 및 대세포 미분화 암종으로 분류된다. 소세포 폐암은 폐암의 15-20%를 차지한다.
폐암 병기는 그의 본래의 시작 부위로부터 암의 확산 정도에 대한 평가이다. 이것은 폐암의 예후 및 잠재적인 치료에 영향을 주는 중요한 인자이다. 비-소세포 폐 암종은 IA("1A"; 가장 우수한 예후) 내지 IV("4"; 가장 나쁜 예후)로 구분된다. 소세포 폐 암종은 단일 방사선 요법 조사 영역의 범위 내에서 가슴의 1/2로 한정될 경우 제한기로 분류되고, 그렇지 않으면 확장기이다.
비-소세포 폐암은 TNM 시스템에 따라 질환의 정도를 분류하기 위해 EUS(내시경 초음파) 또는 CT 또는 MRI 스캔을 사용하여 또는 수술시에 구분될 수 있다. 상기 대상체는 예후 및 치료를 고려한 과정의 일부로서 병기 분류를 거친다. AJCC는 TNM 병기 분류 후에 추가의 분류를 실시할 것으로 권고한다.
원발성 종양(T): TX: 원발성 종양은 평가될 수 없거나, 또는 가래 또는 기관지 폐포 세척액에 악성 세포가 있지만 이미징 또는 기관지경 검사에서 관찰되지 않는다; Tis: 상피내 암종. TO: 원발성 종양의 증거 없음. T1: 폐 또는 폐흉막에 둘러싸이고 기관지경 검사에서 주기관지 내로의 침습이 보이지 않는, 그의 가장 큰 치수가 3 cm 미만의 종양. T2: 다음 중 임의의 종양: 가장 큰 치수가 3 cm 초과; 주기관지 내로 연장됨(그러나, 용골에서 원위의 2 cm 초과), 및 폐쇄성 폐렴(그러나, 전체 폐를 수반하지 않음). T3: 다음 중 임의의 종양: 흉벽, 횡경막, 종격흉막, 또는 벽측 심막의 침습; 용골의 2 cm 내에 주기관지 내로의 연장, 그러나 용골은 수반하지 않음; 및 전체 폐의 폐쇄성 폐렴. T4: 다음 중 임의의 종양: 종격, 심장, 대혈관, 기관, 식도, 척추골, 또는 용골의 침습; 동일 엽 내의 별개의 종양 결절; 및 악성 흉막 삼출. 림프절 (N): NX: 림프절이 평가될 수 없다; NO: 림프절 비수반; N1: 동측 기관지 주위 또는 동측 폐문 림프절로의 전이; N2: 동측 종격 또는 용골하 림프절로의 전이; 및 N3: 임의의 다음으로의 전이: 동측 쇄골상 림프절; 동측 사각근 림프절; 및 대측 림프절. 원격 전이 (M): MX: 원격 전이는 평가될 수 없다; MO: 원격 전이 없음; 및 M1: 원격 전이 존재.
자궁암/부인과 악성 종양
자궁암은 자궁에서 발생하는 임의의 몇몇 상이한 종류의 암, 즉 자궁 육종(예를 들어, 자궁근층, 또는 자궁의 근육층의 육종이 가장 흔한 평활근육종이다); 자궁내막 암; 및 자궁경부 암을 의미할 수 있다.
또 다른 측면에서, 자궁내막 암의 치료 방법에 본원에서 제공된다. 자궁내막 암은 자궁의 내층인 자궁내막에서 시작되는 암이다. 자궁 및 자궁내막의 암의 예의 일부는 선암종, 선극세포종, 선평탄세포 암종, 유두상 장액성 선암종, 투명 세포 선암종, 자궁 육종, 간질 육종, 악성 혼합성 중배엽성 종양, 및 평활근육종을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 측면에서, 방법은 자궁경부 암, 바람직하게는 자궁 경관 상피 내의 선암종을 치료한다. 상기 암의 2개의 주요 종류가 존재한다: 평탄 세포 암종 및 선암종. 전자는 모든 자궁경부 암의 약 80-90%를 구성하고, 외자궁 경관(질에 가장 가까운 부분) 및 내자궁 경관(자궁에 가장 가까운 부분)이 연결되는 부위에서 발생한다. 후자는 내자궁 경관의 점액 생성 선 세포에서 발생한다. 일부 자궁경부 암은 상기 두 암의 특성을 모두 갖고, 선평탄세포 암종 또는 혼합성 암종으로 불린다.
난소암
또 다른 측면에서, 상피 난소 종양을 비롯하여 난소암의 치료 방법이 본원에서 제공된다.
난소암은 병리학 보고서에서 얻은 종양의 조직에 따라 분류된다. 난소 상피 암종으로도 알려진 표면 상피-간질 종양은 가장 전형적인 난소암의 종류이다. 이것은 장액성 종양, 자궁내막양 종양 및 점액성 낭성선암종을 포함한다. 성삭-간질 종양, 예를 들어 에스트로겐 생산 과립층 세포 종양 및 남성화 세르톨리-라이디히(Sertoli-Leydig) 세포 종양 또는 남성화 세포종은 난소암의 8%에 해당한다. 생식세포 종양은 난소 종양의 약 30%를 차지하지만, 난소암에서는 단지 5%만 차지하고, 이것은 대부분의 생식세포 종양은 기형종이고 대부분의 기형종은 양성이기 때문이다. 생식세포 종양은 젊은 여성 및 소녀에서 발생하는 경향이 있다. 예후는 생식세포 종양의 특이적인 조직학에 따라 결정되지만, 전체적으로 양호하다. 혼합형 종양은 상기 클래스의 종양 병력 중의 하나 초과의 요소를 함유한다.
난소암은 또한 신체의 다른 부위에서의 원발성 암으로부터의 전이의 결과인 2차 암일 수 있다. 통상적인 원발성 암은 유방암 및 위장관암이다(이 경우에, 난소암은 크루켄베르크(Krukenberg) 암이다). 표면 상피-간질 종양은 복막(복강의 내층)에서 시작할 수 있고, 이 경우에 난소암은 원발성 복막 암의 2차 암이지만, 치료는 복막을 수반하는 원발성 표면 상피-간질 종양에 대한 치료와 기본적으로 동일하다.
난소암 병기 분류는 FIGO 병기 분류 시스템에 의해 이루어지고, 복식 전 자궁절제술, 난소 및 난관 둘 모두의 제거, 그물막, 및 세포진단을 위한 골반(복막) 세척을 포함할 수 있는, 수술 후에 얻은 정보를 사용한다. AJCC 병기는 FIGO 병기와 동일하다.
병기 I은 난소의 하나 또는 둘 모두에 제한된 난소암을 의미한다: IA - 하나의 난소를 수반한다; 외피 무손상; 난소 표면에 종양 없음; 복수 또는 복막 세척액에 악성 세포 없음; IB - 두 난소를 수반한다; 외피 무손상; 난소 표면에 종양 없음; 음성 세척액; 및 IC - 다음의 임의의 것을 갖는 난소로 제한된 종양: 외피 파열, 난소 표면 상의 종양, 양성 세척액.
병기 II는 골반 연장 또는 착상물을 의미한다: IIA - 자궁 또는 난관 상의 연장 또는 착상물; 음성 세척액; IIB - 다른 골반 구조 상의 연장 또는 착상물; 음성 세척액; 및 IIC - 양성 복막 세척액과 함께 골반 연장 또는 착상물.
병기 III은 골반 외부의; 또는 소장 또는 그물막으로의 연장과 함께 골반에 제한된 현미경적 복막 착상물을 의미한다: IIIA - 골반을 넘은 현미경적 복막 전이; IIIB - 크기가 2 cm 미만인, 골반을 넘은 육안에 의한 복막 전이; 및 IIIC - 2 cm 초과의 골반을 넘은 복막 전이 또는 림프절 전이.
병기 IV는 간으로의 복강 외로의 원격 전이를 의미한다.
대동맥 주위 림프절 전이는 부위 림프절로 간주된다(병기 IIIC).
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 다음으로부터 선택되는 난소암을 치료한다: 난소의 선암종 및 난소로부터 복강 내로 이동한 선암종.
흑색종
흑색종은 주로 피부 및 장 및 눈(포도막 흑색종)에서 발견되는 멜라닌 세포의 악성 종양이다. 이것은 보다 드문 종류의 피부암 중의 하나이지만, 대부분의 피부암 관련 사망을 야기한다. 악성 흑색종은 멜라닌 세포로 불리는 색소 세포의 비제어된 성장에 의해 발생하는 심각한 종류의 피부암이다. 또한, 흑색종은 맥락막 흑색종, 악성 흑색종, 피부 흑색종 및 안내 흑색종을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
흑색종은 다음 종류로 분류될 수 있다: 악성 흑자, 악성 흑자 흑색종, 표재 확장성(superficially spreading) 흑색종, 말단 흑자 흑색종, 점막 흑색종, 결절성 흑색종, 용종양 흑색종, 결체조직 형성 흑색종, 무색소성 흑색종, 연조직 흑색종, 및 포도막 흑색종. 흑색종 병기는 다음과 같다:
병기 0 - 상피내 흑색종(클라크(Clark) 수준 I).
병기 I/II - 침습성 흑색종: T1a: 1.00 mm 미만의 원발성, 궤양 형성 없음, 클라크 수준 II-III; T1b: 1.00 mm 미만의 원발성, 궤양 형성 또는 클라크 수준 IV-V; 및 T2a: 1.00-2.00 mm 원발성, 궤양 형성 없음.
병기 II - 고위험 흑색종: T2b: 1.00-2.00 mm 원발성, 궤양 형성; T3a: 2.00-4.00 mm 원발성, 궤양 형성 없음; T3b: 2.00-4.00 mm 원발성, 궤양 형성; T4a: 4.00 mm 이상의 원발성, 궤양 형성 없음; 및 T4b: 4.00 mm 이상의 원발성, 궤양 형성.
병기 III - 국소 전이: N1: 단일 양성 림프절; N2: 2-3개의 양성 림프절 또는 국소 피부/수송중(in-transit) 전이; 및 N3: 4개의 양성 림프절 또는 림프절 및 국소 피부/수송중 전이.
병기 IV - 원격 전이: M1a: 원위 피부 전이, 정상 LDH; M1b: 폐 전이, 정상 LDH; 및 M1c: LDH가 상승한 다른 원위 전위 또는 임의의 전이.
일 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 흑색종을 치료한다.
결장암 및 결장직장암
결장직장암(결장암 또는 대장암으로도 불림)은 결장, 직장(항문) 및 맹장에서의 암성 성장을 포함한다. 이것은 전세계적으로 매년 655,000명이 사망하는, 서구 사회에서 제3의 가장 흔한 종류의 암이고, 암-관련 사망의 제2의 주요 원인이다. 많은 결장직장암은 결장 내의 선종성 용종으로부터 발생하는 것으로 생각된다. 상기 버섯 형태의 성장은 대체로 양성이지만, 일부는 시간이 경과하면서 암으로 발달할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 병기 A-D를 기초로 하여 결장직장암을 분류하기 위해 듀크(Duke) 분류를 사용할 수 있다. 병기 A는 점막에 제한된(즉, 장벽을 통해 침습되지 않은) 결장직장암을 나타낸다. 병기 B1은 고유근(muscularis propria)으로 연장되지만 이를 통과하지는 않음(즉, 림프절은 침습되지 않음)을 나타내고; 병기 B2 암은 고유근을 통과하지만, 이를 통과하지는 않음(즉, 림프절은 침습되지 않음). 병기 C1은 고유근으로 연장되지만 이를 통과하지는 않는 암(즉, 림프절이 침습됨)을 나타내고; 병기 C2는 고유근으로 연장되고 이를 통과하는 암(즉, 림프절이 침습됨)을 나타낸다. 병기 D는 원격 전이 확산을 나타낸다. 또한, TNM 시스템은 당업계에 공지된 통상적인 수단에 따라 결장직장암의 병기를 분류하기 위해 사용될 수 있다.
유방암
본원에서 설명되는 방법에 의해 치료될 수 있는 여러 종류의 유방암이 존재한다. 상피내 소엽성 암종 및 상피내 유관 암종은 각각 소엽 및 도관에서 발생하지만, 유방 주위의 지방 조직 또는 신체의 다른 영역으로 전파되지 않은 유방암이다. 침윤 (또는 침습성) 소엽성 및 유관 암종은 각각 소엽 및 도관에서 발생하고, 유방의 지방 조직 및/또는 신체의 다른 부분으로 전파된 암이다. 일 측면에서, 유방암, 예를 들어 유선 내의 유관 조직의 유관 암종, Her2- 및/또는 ER- 및/또는 PR-인 유방암의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 상기 방법에 의한 치료를 통해 개선되는 유방의 다른 암은 수질성 암종, 콜로이드 암종, 관암종, 및 염증성 유방암이다.
일 실시양태에서, 유방암은 TNM 시스템에 따라 병기가 분류된다. 예후는 병기의 결과와 밀접하게 연관되고, 병기는 또한 임상 시험 및 임상 실무 모두에서 환자를 치료 대상으로 할당하기 위해 사용된다.
간략하게는, 병기에 대한 정보는 다음과 같다: TX: 원발성 종양은 평가될 수 없다. T0: 종양의 증거 없음. Tis: 상피내 암종, 침습 없음; T1: 종양은 2 cm 이하이다; T2: 종양은 2 cm 초과 5 cm 이하이다; T3: 종양은 5 cm 초과이다; T4: 흉벽 또는 피부 내로 성장하는 임의의 크기의 종양, 또는 염증성 유방암. NX: 근처의 림프절은 평가될 수 없다. N0: 암은 국부 림프절로 전파되지 않았다. N1: 암은 1 내지 3개의 상악 또는 1개의 내유 림프절로 전파되었다. N2: 암은 4 내지 9개의 상악 림프절 또는 다수의 내유 림프절로 전파되었다. N3: 다음 중의 하나가 적용된다: 암은 10개 이상의 상악 림프절로 전파되었거나, 또는 암은 쇄골(빗장뼈) 하의 림프절로 전파되었거나, 또는 암은 쇄골 위의 림프절로 전파되었거나, 또는 암은 상악 림프절을 수반하고 내유 림프절을 확장하였거나, 또는 암은 4개 이상의 상악 림프절을 수반하고 소량의 암이 전초 림프절 생검 상의 내유 림프절에서 발견된다. MX: 원격 전파(전이)의 존재는 평가될 수 없다. M0: 원격 전파 없음. M1: 원격 장기(쇄골상 림프절 미포함)로의 전파가 발생하였다.
췌장암
또 다른 측면에서, 다음으로부터 선택되는 췌장암의 치료 방법이 본원에서 제공된다: 췌장관 조직 내의 상피 암종 및 췌장관 내의 선암종. 가장 흔한 종류의 췌장암은 선암종이고, 이는 췌장관의 내벽에서 발생한다.
일 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 췌장암을 치료한다.
전립선암
한 다른 측면에서, 다음으로부터 선택되는 전립선암의 치료 방법이 본원에서 제공된다: 선암종 또는 뼈로 이동한 선암종. 전립선암은 남성의 요도의 제1 부분을 둘러싸는 전립선 장기에서 발생한다. 전립선은 여러 세포 종류를 갖지만, 99%의 종양은 정액 생성을 담당하는 선세포에서 발생하는 선암종이다.
전립선암의 병기 분류를 위해 통상 사용되는 2가지의 방식이 존재한다. 가장 통상적인 방식은 TNM 시스템으로서, 이것은 종양의 크기, 수반된 림프절의 정도, 및 임의의 전이(원격 전파)를 평가한다. 많은 다른 암처럼, 이것은 종종 4개의 병기 (I-IV)로 분류된다. 덜 통상적으로 사용되는 다른 방식은 휘트모어-주이트(Whitmore-Jewett) 병기 분류이다.
간략하게는, 병기 I 질환은 전립선 조직이 다른 이유, 예를 들어 양성 전립선 비대로 제거될 때 샘플의 작은 부분에서 우연히 발견되고 세포가 정상 세포와 매우 유사하고, 선이 조사하는 손가락에 정상으로 느껴지는 암이다. 병기 II에서, 보다 많은 전립선이 수반되고, 덩어리가 선 내에서 느껴질 수 있다. 병기 III에서, 종양은 전립선 피막을 통해 전파되고, 덩어리는 선의 표면에서 느낄 수 있다. 병기 IV 질병에서, 종양은 근처 구조를 침범하였거나, 또는 림프절 또는 다른 장기로 전파되었다. 등급 평가는 질병의 파괴 잠재력 및 최종 예후의 추정치를 제공하는 생검으로부터의 세포 내용물 및 조직 구조를 기초로 한다(글리슨(Gleason)).
일 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 전립선암을 치료한다.
두경부암
두경부암(예를 들어, 구강, 후두, 비인두, 식도 등)은 입술, 구강(입), 비강, 부비강, 인두, 및 후두를 포함하는 상부 호흡소화관으로부터 유래되는 생물학상 유사한 암의 군을 의미한다. 대부분의 두경부암은 평탄 세포 암종이고, 상기 병변의 점막 내층(상피)으로부터 비롯된다. 두경부암은 종종 목의 림프절로 전파되고, 이것은 종종 진단시에 질병의 최초의 (및 때로 유일한) 소견이다. 두경부암은 특정 환경 및 생활방식 위험 인자, 예를 들어 흡연, 음주 및 성적 접촉에 의해 전염되는 인간 유두종 바이러스의 특정 균주와 강하에 관련된다. 두경부암이 있는 환자의 관리는 만만치 않은 일이다. 하인두 암, 후두 암, 비인두 암, 인두중앙부 암과 같은 암은 본원에서 설명되는 화합물을 사용하여 치료될 수 있다.
일 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 두경부암을 치료한다.
신장암
또 다른 측면에서, 신장암의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 신장암(신장 세포 암, 신장 세포 암종, 신장 선암종, 및 신세포암종으로도 불림)은 악성 세포가 신장의 세관 내벽에서 발견되는 질병이다. 신장 세포 암종은 근위 신장 세관으로부터 발생하는 신장암의 가장 흔한 형태이다. 이것은 성인의 가장 흔한 종료의 신장암으로서, 약 80%의 환자에서 발견된다.
일 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 신장암을 치료한다.
간암
또 다른 측면에서, 원발성 간암(간에서 시작하는 암)을 치료 방법이 본원에서 제공된다. 원발성 간암은 성인과 아동 모두에서 발생할 수 있다. 간암은 악성 간 종양의 존재 - 간 위에서 또는 간 내에서의 종양 또는 성장을 특징으로 한다. 이것은 의료 이미징에서 발견될 수 있거나(암 자체보다 상이한 원인 때문에), 또는 복부 덩어리, 복부 통증, 황달, 또는 일부 다른 간 기능이상으로서 환자에 존재할 수 있다. 여러 종류의 간암이 존재한다.
혈관종: 이것은 양성 간 종양의 가장 흔한 종류이다. 이것은 혈관에서 시작한다. 대부분의 이들 종양은 증상을 유발하지 않고, 치료를 필요로 하지 않는다. 일부에서 출혈이 일어날 수 있고, 경도 내지 중증일 경우 제거될 필요가 있다.
간선종: 이들 양성 상피 간 종양은 간에서 발생한다. 이는 대부분의 환자에서 우측 간엽에 위치하고, 종종 고립체로서 관찰된다. 선종의 크기는 1 내지 30 cm이다. 간선종과 관련된 증상은 모두 심한 복부 통증을 야기할 수 있는 큰 병변과 관련된다.
국소성 결정 과형성: 국소성 결정 과형성(FNH)은 간의 두 번째로 가장 흔한 종양이다. 상기 종양은 선천적인 동정맥 기형 간세포 반응의 결과이다. 이 과정은 간의 모든 정상적인 구성분이 존재하지만 이들이 제시되는 패턴이 비정상적인 것이다. 상기 질병이 존재하더라도, 간은 계속 정상 범위에서 기능을 수행하는 것으로 보인다.
간세포암: 간세포암(HCC)은 간의 가장 일반적인 암이다. 이것은 알코올 남용 및 B형 간염 감염과 연관되고, 특히 아시아에서 널리 퍼져 있다. 대부분의 HCC는 외과 절제에 의한 치유가 불가능할 때 검출되고; 절제불가능한 HCC의 전신 치료는 1년 미만의 생존과 관련된다.
일 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 간암을 치료한다.
림프종
림프종은 면역계의 림프구에서 유래되는 암의 일종이다. 이들은 종종 림프절에서 시작되고, 림프절의 과형성(종양)으로서 제시된다. 림프종은 림프구에서 유래하지만 일반적으로 순환 혈액 및 골수(여기서 혈액이 조혈로 불리는 과정에 의해 생성된다)만을 수반하고 대체로 종양을 형성하지 않는 림프성 백혈병과 밀접하게 관련된다. 많은 종류의 림프종이 존재하고, 다시 림프종은 혈액 신생물로 불리는 질환의 넓은 군의 일부이다. 몇몇 형태의 림프종은 무통성이고(예를 들어, 소림프구 림프종), 치료를 실시하지 않은 상태에도 오랜 수명을 보이고, 다른 형태는 침습성이고(예를 들어 버킷(Burkitt) 림프종)이고, 빠른 악화 및 사망을 초래한다.
2001에 발간되고 2008년에 업데이트된 WHO 분류 (http://en.wikipedia.org/wiki/Lymphoma - cite_note-isbn92-832-2411-6-2#cite_note-isbn92-832-2411-6-2)는 림프종의 최신 분류이고, "개정판 유럽-미국 림프종 분류(Revised European-American Lymphoma classification, REAL)" 내의 토대를 기반으로 한다. 상기 시스템은 림프종을 세포 종류(즉, 종양에 가장 유사한 정상적인 세포 종류) 및 표현형, 분자 또는 세포유전학적 특징의 규정에 의해 분류한다. 다음과 같은 3개의 큰 군이 존재한다: B 세포, T 세포 및 천연 치사 세포 종양. 다른 덜 통상적인 군도 알려져 있다. 호지킨 림프종은 WHO(및 선행) 분류 내에서 별개로 고려되지만, 현재 성숙 B 세포 계통의 현저히 비정상적인 림프구의 종양으로서 인정되고 있다.
일 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 림프종을 치료한다.
육종
육종은 중배엽 증식을 야기하는 연결 조직(뼈, 연골, 지방)의 암이다.
이것은 상피 기원(유방, 결장, 췌장 등)의 암종과 대조적이다. 그러나, 조직 기원에 대한 점진적인 이해 때문에, 용어 "육종"은 때때로 상피 조직으로부터 발생하는 것으로 현재 알려진 종양에 적용된다. 연조직 육종이라는 용어는 연결 조직 내에 존재하지만 그로부터 유래되지 않은 요소(예를 들어 근육 및 혈관)를 포함하는 연조직의 종양을 설명하기 위해 사용된다.
육종은 이들의 발생하는 조직 종류를 기초로 하여 많은 상이한 명칭으로 제시된다. 예를 들어, 골육종은 뼈로부터 발생하고, 연골육종은 연골로부터 발생하고, 평활근육종은 평활근으로부터 발생한다. 육종은 모든 연령대의 사람들에서 발생하지만, 매우 드물고, 모든 암 환자의 단지 1%만을 차지한다. GIST는 가장 흔한 형태의 육종이고, 미국에서 매년 약 3000-3500명의 환자가 발생한다. 이것은 북미에서 매년 약 200,000명의 환자가 발생하는 유방암과 비교된다.
약 50%의 골 육종 및 20%의 연조직 육종은 35세 이하의 사람에서 진단된다. 일부 육종, 예를 들어 평활근육종, 연골육종, 및 위장관 간질 종양(GIST)은 아동보다 성인에서 더 흔하다. 가장 높은 등급의 골 육종, 예를 들어 유잉(Ewing) 육종 및 골육종은 아동 및 청소년에서 훨씬 더 흔하다.
일 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 육종을 치료한다.
암종
암종은 상피 세포로부터 발생하는 임의의 악성 암이다. 암종은 주변 조직 및 장기를 침습하고, 림프절 및 다른 부위로 전이 또는 전파될 수 있다.
모든 신생물처럼, 암종은 그의 조직병리학적 외관에 의해 분류된다. 종양에 대한 2개의 통상적인 설명 용어인 선암종 및 평탄 세포 암종은 이들 세포가 각각 선세포 또는 평탄 세포 외관을 가질 수 있다는 사실을 반영한다. 심한 역형성 종양은 구별되는 조직학적 외관을 갖지 않도록 미분화될 수 있다(미분화 암종).
때때로, 종양은 추정되는 원발성 장기(예를 들어, 전립선의 암종) 또는 추정되는 기원 세포(간세포 암종, 신세포 암종)에 의해 언급된다.
선암종은 선 조직의 상피 세포에서 유래되고 선 구조를 형성하는 악성 종양이다. 이것은 폐에서 흔하다(모든 폐 암종의 30-40%를 차지함). 이것은 말초에서 발견되고, 배상 세포 또는 II형 폐포세포로부터 발생한다.
평탄 세포 암종은 평탄 화생에 의해 발생한다. 이것은 폐 종양의 20-30%를 차지하고, 대체로 폐문에서 기원한다.
소세포 암종은 거의 확실히 흡연에 의해 발생한다. 이것은 조기에 전이되고, ADH(환자 나트륨 농도를 저하시킴)를 분비할 수 있다.
대세포 미분화 암종은 폐 신생물의 10-15%를 차지한다. 이것은 침습성이고, 미분화 특성 때문에 인식하기가 어렵다. 이것은 폐에서 가장 통상적으로 중요하다.
비부비동 미분화 암종.
일 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 암종을 치료한다.
골수종
다발성 골수종(MM, 골수종, 형질세포 골수종, 또는 오토 칼러(Otto Kahler)의 이름을 딴 칼러(Kahler) 병으로도 알려짐)은 형질세포의 암이다. 이 면역 세포는 골수에서 형성되고, 림프관에 많이 존재하고, 항체를 생산한다. 골수종은 치유불능으로 간주되지만, 완화는 스테로이드, 화학요법제, 탈리도마이드 및 줄기 세포 이식으로 유도될 수 있다. 골수종은 혈액 종양으로 불리는 질병의 넓은 군의 일부이다.
다발성 골수종은 배 중심 후(post-germinal center) B 림프구에서 발생한다. 면역글로불린 중쇄 유전자 (14번 염색체, 로커스 14q32)와 종양유전자(종종 11q13, 4p16.3, 6p21, 16q23 및 20q11) 사이의 염색체 전위가 다발성 골수종 환자에서 빈번하게 관찰된다. 상기 돌연변이는 골수종의 발병기전에서 중요한 개시 사건으로 생각되는 종양유전자의 조절이상을 야기한다. 그 결과는 형질세포 클론의 증식 및 게놈 불안정성이고, 이는 추가의 돌연변이 및 전위를 유발한다. 염색체 14 이상은 모든 골수종 환자의 50%에서 관찰된다. 13번 염색체의 (일부의) 결실도 환자의 약 50%에서 관찰된다.
형질세포에 의한 사이토카인(특히 IL-6)의 생산은 많은 그의 국소 손상, 예를 들어 골다공증을 야기하고, 악성 세포가 성장하는 미세환경을 생성한다. 혈관신생(새로운 혈관의 유인)이 증가한다.
일 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 골수종을 치료한다.
위암
위 또는 위장 암은 위의 임의의 부분에서 발생할 수 있고, 위 전체에 걸쳐 및 다른 장기; 특히 식도, 폐 및 간으로 전파될 수 있다. 위암 때문에 전세계적으로 매년 약 800,000 명이 사망한다.
전이는 위암이 있는 개체의 80-90%에서 발생하고, 초기 병기로 진단된 개체에서 6개월 생존율은 65%이고 후기로 진단된 개체는 15% 미만이다.
위암은 종종 증상을 나타내지 않거나 또는 그의 초기 병기에서 단지 비특이적인 증상만을 야기한다. 증상이 발생할 때까지, 암은 일반적으로 신체의 다른 부분으로 전이되고, 이것은 그의 불량한 예후에 대한 주요 원인 중의 하나이다.
일 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 위암을 치료한다.
갑상선 암
갑상선 신생물 또는 갑상선 암은 대체로 갑상선의 임의의 4개의 종류의 악성 종양을 나타낸다: 유두상, 여포성, 수질성 또는 역형성. 유두상 및 여포성 종양이 가장 흔하다. 이들은 느리게 성장하고 재발할 수 있지만, 일반적으로 45세 이하의 환자에서 치명적이지 않다. 수질성 종양은 갑상선으로 제한될 경우 양호한 예후를 갖고, 전이가 발생할 경우에는 보다 불량한 예후를 갖는다. 역형성 종양은 신속하게 성장하고 요법에 불량하게 반응한다.
갑상선 암은 대체로 정상갑상선 환자에서 발견되지만, 갑상선 기능 항진증 또는 갑상선 기능 저하증의 증상이 크거나 전이성의 잘 분화된 종양과 관련된다. 결절은 20세 이하의 환자에서 발견될 때 특히 우려된다. 상기 나이에서 양성 결절의 발생 가능성은 낮고, 따라서 악성 잠재성이 보다 크다.
갑상선 암은 병리학적 특징에 따라 분류될 수 있다. 다음 변형이 구분될 수 있다(다양한 아형에 대한 분포는 부분적 차이를 보여줄 수 있다): 유두상 갑상선 암(75% 이하); 여포성 갑상선 암(15% 이하); 수질성 갑상선 암(8% 이하); 및 역형성 갑상선 암(5% 미만). 여포성 및 유두상 종류는 "분화된 갑상선 암"으로 분류될 수 있다. 상기 종류는 수질성 및 미분화 종류보다 더 양호한 예후를 갖는다. 갑상선 선종은 갑상선의 양성 신생물이다.
일 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 갑상선 암을 치료한다.
방광암
방광암은 방광의 임의의 여러 종류의 악성 성장을 의미한다. 이것은 비정상 세포가 방광 내에서 제어되지 않으면서 복제되는 질병이다. 방광은 소변을 저장하는, 속이 빈 근육 장기이고; 골반 내에 위치한다. 가장 흔한 형태의 방광암은 방광 내부를 감싸는 세포에서 시작하고, 이행 세포 암종(때때로 요로상피 세포 암종)으로 불린다.
90%의 방광암은 이행 세포 암종이다. 다른 10%는 평탄 세포 암종, 선암종, 육종, 소세포 암종 및 신체의 다른 부위의 암으로부터의 2차 침착물이다.
TNM(종양, 림프절, 및 전이) 병기 시스템에 따라 암의 위치, 크기 및 전파를 분류하기 위해 다음 병기를 사용한다: 병기 0: 암 세포는 방광의 내벽에서만 발견된다. 병기 I: 암 세포는 방광의 내벽을 넘어 층으로 증식하지만 방광의 근육으로는 증식하지 않는다. 병기 II: 암 세포는 방광벽 내의 근육으로 증식하지만 방광을 둘러싼 지방 조직으로는 증식하지 않는다. 병기 III: 암 세포는 방광을 둘러싼 지방 조직 및 전립선, 질, 또는 자궁으로 증식하지만, 림프절 또는 다른 장기로는 증식하지 않는다. 병기 IV: 암 세포는 림프절s, 골반 또는 복벽, 및/또는 다른 장기로 증식한다. 재발: 암 세포는 치료 후에 방광 또는 또 다른 근처 장기에서 재발한다.
방광 TCC는 1997 TNM 시스템에 따라 병기가 분류된다: Ta 비-침습성 유두상 종양; T1 침습성이지만, 근육 방광층까지 멀리는 오지 않음; T2 근육층 내로 침습; T3 근육을 넘어 방광 외부의 지방으로 침습; 및 T4 전립선, 자궁 또는 골반벽과 같은 주위 구조 내로 침습.
일 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 방광암을 치료한다.
본 발명에 따르면, 인간화 엔도글린 항체 또는 그의 단편은 단독으로 또는 활성 또는 불활성 물질과 조합하여 투여될 수 있다. 조합물이 사용될 경우, 본 발명은 인간화 엔도글린 항체 또는 항원 결합 단편 및 활성 또는 불활성 물질의 동시 또는 순차 투여를 고려한다.
본 발명의 화합물은 필요에 따라 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 치료제와 조합 투여될 수 있다: 아드리아마이신, 시클로포스파미드, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 테모졸로마이드, 옥살리플라틴, 베바치주맙, 에르비툭스, 벡티빅스, 소라페닙, 수니티닙, 게피티닙, 에를로티닙, 5-플루오로우라실 (5-FU) 이리노테칸, 토포테칸, 류코보린, 벨케이드(VELCADE)®, 레날리도마이드, 탈리도마이드, 젤로다, 탁소테레 및 본원에서 설명되는 많은 다른 통상적인 암 치료제. 아래에서 나열되는 치료 방식의 목록은 통상적인 치료제를 나타내지만, 본 발명은 본원에서 구체적으로 개시되지 않은 다른 공지된 치료 방식을 포함함을 이해할 것이다.
본원에 사용될 때, "방사선"은 예를 들어 마이크로파, 자외선(UV), 적외선(IR), 또는 알파-, 베타- 또는 감마-방사선을 의미한다. 방사선은 방사선을 전체 신체에 조사하지 않으면서 하나 이상의 종양 부위에 표적화하기 위해 통상적인 기술을 사용하여 "집중되거나" 또는 국소 전달될 수 있다.
일 실시양태에서, 암은 난소암이고, 하나 이상의 치료적 치료는 수술, 화학요법(예를 들어, 독소루비신, 독실, 겜시타빈, 루비테칸, 및 백금 기반 화학요법제, 예를 들어 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴), 멜팔란, 파클리탁셀, 토포이소머라아제 I 억제제, 예를 들어 토포테칸 및 이리노테칸, 탁산 기반 요법, 호르몬, 방사선 요법, 전신 저체온법, 이소플라본 유도체, 예를 들어 페녹소디알, 세포독성 마크롤라이드, 예를 들어 에포틸론, 혈관신생 억제제, 예를 들어 베바치주맙, 신호전달 억제제, 예를 들어 트라스투주맙, 유전자 요법, RNAi 요법, 면역요법, 단클론 항체, 포스파티딜이노시톨 유사 키나아제 억제제, 예를 들어 라파마이신, 또는 이들의 임의의 조합물. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 독실이다. 다른 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 토포테칸이다. 또 다른 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제의 비제한적인 예는 베바치주맙(아바스틴®), 라니비주맙(루센티스®), 아피이베르셉트(VEGF-트랩), 수니티닙(수텐트®), 소라페닙(넥사바르®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다. 본원에 개시된 및 항원 결합 단편과 난소암 요법제의 조합 요법은 또한 요법제의 동시 투여에 따른 상승 효과 때문에 어느 하나의 요법제 또는 둘 모두의 보다 낮은 용량을 제공할 수 있다.
일 실시양태에서, 암은 신/신장암이고, 하나 이상의 치료적 치료는 수술, 화학요법, 수니티닙, 소라페닙, 파조파닙, 아바스틴®, 인터페론-알파, 또는 IL-2이다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 소라페닙이다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 수니티닙이다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 아바스틴®이다. 또 다른 실시양태에서, 조합물은 인간화 항- 엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제의 비제한적인 예는 베바치주맙(아바스틴®), 라니비주맙(루센티스®), 아플리베르셉트(VEGF-트랩), 수니티닙(수텐트®), 소라페닙(넥사바르®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다. 본원에 개시된 및 항원 결합 단편과 신장암 요법제의 조합 요법은 또한 요법제의 동시 투여에 따른 상승 효과 때문에 어느 하나의 요법제 또는 둘 모두의 보다 낮은 용량을 제공할 수 있다.
일 실시양태에서, 암은 골수종이고, 하나 이상의 치료적 치료는 수술, 방사선 요법, 벨케이드®, 레날리도마이드, 또는 탈리도마이드이다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 벨케이드®이다. 임의의 상기 요법제의 투여량은 당업계에 공지되어 있고, 따라서 조합 요법과 조정될 수 있다.
일 실시양태에서, 암은 전립선암이고, 하나 이상의 치료적 치료는 수술, 방사선 요법(예를 들어, 외부 빔 또는 근접 치료), 호르몬 박탈(안드로겐 억제), 열 충격 단백질 90(HSP90) 억제제, 화학요법(예를 들어, 도세탁셀, 백금 기반 화학요법, 예를 들어 시스플라틴, 카르보플라틴, 사트라플라틴 및 옥살리플라틴, 탁산, 에스트라무스틴), 프레드니손 또는 프레드니솔론, 콜레스테롤-저하 약물, 예를 들어 스타틴, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH) 효현제, RNAi 요법, 과립구 대식세포 - 콜로니 자극 인자(GM-CSF)(GVAX로도 알려짐)를 분비하도록 유전적으로 변형된 전체 종양 세포, 또는 이들의 임의의 조합물이다. 또 다른 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제의 비제한적인 예는 베바치주맙(아바스틴®), 라니비주맙(루센티스®), 아플리베르셉트(VEGF-트랩), 수니티닙(수텐트®), 소라페닙(넥사바르®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다.
일 실시양태에서, 암은 폐암이고, 하나 이상의 치료적 치료는 수술, 방사선 요법(예를 들어, 흉부 방사선 요법, 하전 입자를 사용한 방사선 요법, 우라실-테가푸르 및 백금 기반 화학요법(예를 들어, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴 등) 및 비노렐빈, 에를로티닙(타르체바(TARCEVA)®), 게피티닙(이레사(IRESSA)®), 항-표피 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 세툭시맙), 항-혈관 내피 성장 인자 항체(예를 들어, 베바치주맙), 타이로신 키나아제의 소분자 억제제, 폐암 세포 증식에 관련된 단백질의 직접 억제제, 오로라(Aurora) 키나아제 억제제, 레이저 유도 열요법, RNAi 요법, 과립구 대식세포 - 콜로니 자극 인자(GM-CSF)(GVAX로도 알려짐)를 분비하도록 유전적으로 변형된 전체 종양 세포, 또는 이들의 임의의 조합물이다. 추가의 치료적 치료는 탁솔 및 페메트렉세드를 포함한다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 에를로티닙이다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 게피티닙이다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 페메트렉세드이다. 또 다른 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제의 비제한적인 예는 베바치주맙(아바스틴®), 라니비주맙(루센티스®), 아플리베르셉트(VEGF-트랩), 수니티닙(수텐트®), 소라페닙(넥사바르®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다. 임의의 상기 요법제의 투여량은 당업계에 공지되어 있고, 따라서 조합 요법과 조정될 수 있다.
일 실시양태에서, 암은 유방암이고, 하나 이상의 치료적 치료는 수술, 단클론 항체(예를 들어, Her-2 항체, 헤르셉틴), 보조 화학요법, 예를 들어 단제 화학요법 또는 조합 화학요법(예를 들어, 안트라사이클린- 및 탁산-기반 복합 화학요법제, 탁솔, 또는 PMRT을 사용하거나 사용하지 않으면서 내분비 조작을 실시하거나 실시하지 않은 표적 특이적 트라스투주맙, 비노렐빈), 아드리아마이신, 시클로포스파미드, 젤로다, 탁소테레, 선택적 에스트로겐 수용체 조정제, 예를 들어 타목시펜(Tamoxifen) 및 랄록시펜(Raloxifene), 알로스테릭(allosteric) 에스트로겐 수용체 조정제, 예를 들어 트릴로스탄, 방사선(예를 들어, 간질 근접 치료, 맘모사이트(Mammosite) 장치, 3차원 입체 외부 방사선 조사 및 수술중 방사선 요법), 전체적인 신체 합성을 억제하는 아로마타아제 억제제(예를 들어, 아나스트로졸, 엑세메스탄 및 레트로졸), RNAi 요법, 면역억제성 및 항증식성인 라파마이신의 정맥내 유사체, 예를 들어 템시롤리무스(Temsirolimus)(CCI779), 또는 이들의 임의의 조합물이다. 유방암의 3차원 시험관내 조직 배양 모델을 수행하기 위한 방법의 검토는 문헌[Kim et al., Breast Cancer Research Treatment 85(3): 281-91 (2004)]에 기재되어 있다. 이를 테스트하기 위한 다른 생체내 및 시험관내 모델은 알려져 있고, 본원에서 설명되는 항-엔도글린 항체를 테스트하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 탁솔, 및 아바스틴®이다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 아드리아마이신이다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 젤로다이다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 탁소테레이다. 또 다른 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제의 비제한적인 예는 베바치주맙(아바스틴®), 라니비주맙(루센티스®), 아플리베르셉트(VEGF-트랩), 수니티닙(수텐트®), 소라페닙(넥사바르®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙으르 포함한다. 임의의 상기 요법제의 투여량은 당업계에 공지되어 있고, 따라서 조합 요법과 조정될 수 있다.
일 실시양태에서, 암은 결장암이고, 하나 이상의 치료적 치료는 수술, 방사선 요법, 및 화학요법(예를 들어, 5-플루오로우라실, 레바미솔, 류코보린 또는 세무스틴(메틸 CCNU)), N-[2-(디메틸아미노)에틸]아크리딘-4-카르복사미드 및 다른 관련 카르복사미드 항암 약물; 비-토포이소머라아제 II 억제제, 이리노테칸, 리포좀 토포테칸, 항암제의 탁산 클래스(예를 들어, 파클리탁셀 또는 도세탁셀), 잔테논 아세트산 클래스의 화합물(예를 들어, 5,6-디메틸안테논-4-아세트산 PMAA), 라미나린, 부위 선택적 시클릭 AMP 유사체(예를 들어, 8-클로로아데노신 3',5'-시클릭 포스페이트), Cox-2의 피라노인돌 억제제, Cox-2의 카르바졸 억제제, Cox-2의 테트라히드로카르바졸 억제제, Cox-2의 인덴 억제제, NSAIDS의 국소 억제제(예를 들어, 안트라닐산, 아스피린 (5-아세틸살리실산), 아조디살 나트륨, 카르보헤테로시클릭산, 카르프로펜, 클로람부실, 디클로페낙, 펜부펜, 펜클로페낙, 페노프로펜, 플루페남산, 플루르비프로펜, 플루프로펜, 푸로세마이드, 금 나트륨 티오말레이트, 이부프로펜, 인도메타신, 인도프로펜, 케토프로펜, 로나졸락, 록소프로펜, 메클로페남산, 페파남산, 멜팔란, 나프록센, 페니실라민, 페닐아세트산, 프로피온산, 살리실산, 살라조술파피리딘, 술린닥, 톨메틴, 피라졸론 부타존 프로파존 NSAID, 멜록시캄, 옥시캄, 피록시캄, 펠덴, 피록시캄 베타 시클로덱스트란, 테녹시캄, 오토돌락 및 옥사프로진), HER-2/neu의 억제제, RNAi 요법, GM-CSF, 단클론 항체(예를 들어, 항-Her-2/neu 항체, 항-CEA 항체, A33(HB 8779), 100-210(HB 11764) 및 100-310(HB 11028)), 에르비툭스, 벡티빅스, 호르몬 요법, 피리미딘아민, 캄토테신 유도체(예를 들어, CPT- 11), 폴린산 (FA), 겜시타빈, Ara-C, 백금 기반 화학요법제s 예를 들어 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴, cGMP-특이적 포스포디에스테라제 억제제, 또는 이들의 임의의 조합물이다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 5-FU, 류코보린 및 옥살리플라틴의 조합물(FOLFOX)이다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 5-FU, 이리노테칸 및 류코보린의 조합물(IFL)이다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 에르비툭스이다. 일 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 벡티빅스이다. 또 다른 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제의 비제한적인 예는 베바치주맙(아바스틴®), 라니비주맙(루센티스®), 아플리베르셉트(VEGF-트랩), 수니티닙(수텐트®), 소라페닙(넥사바르®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다. 임의의 상기 요법제의 투여량은 당업계에 공지되어 있고, 따라서 조합 요법과 조정될 수 있다.
일 실시양태에서, 암은 췌장암이고, 하나 이상의 치료적 치료는 수술, 방사선 요법(RT), 플루오로우라실(5-FU) 및 RT, 전신 요법, 스텐트 시술(stenting), 겜시타빈(겜자르(GEMZAR)®), 겜시타빈 및 RT, 세툭시맙, 에를로티닙 (타르체바®), 화학방사선, 베바치주맙(아바스틴®), 또는 이들의 임의의 조합물이다. 또 다른 실시양태에서, 조합물은 인간화 항-엔도글린 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제의 비제한적인 예는 베바치주맙(아바스틴®), 라니비주맙(루센티스®), 아플리베르셉트(VEGF-트랩), 수니티닙(수텐트®), 소라페닙(넥사바르®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다.
환자는 치료 요법 전, 동안 및 후를 포함하는 하나 이상의 다중 시점에서 증상에 대해 평가할 수 있다. 치료는 대상체의 질병을 개선할 수 있고, 하나 이상의 다음 인자가 발생하는지 결정함으로써 평가할 수 있다: 종양 크기의 감소, 세포 증식의 감소, 세포의 수 감소, 신혈관형성의 감소, 사멸의 증가, 또는 세포 증식 질환을 이루는 세포의 적어도 일부의 생존 감소. 하나 이상의 상기 인자의 발생은 일부 경우에 암의 부분적인 또는 완전한 제거 및 환자의 생존 연장을 유도할 수 있다. 대안적으로, 말기 암에 대해, 치료는 질병의 정체, 보다 우수한 삶의 질 및/또는 생존의 연장을 유도할 수 있다.
생체마커 평가
특정 유전자는 암에서 증가 또는 감소된 수준에서 발현될 수 있다. 암에서 유전자의 발현 수준의 변화는 암 요법 또는 치료에 대한 내성 또는 민감성을 나타낼 수 있다.
그의 발현이 혈관신생 억제제에 대한 민감성 또는 내성과 상관되는 일군의 유전자로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 검출하기 위한 진단 방법이 본원에서 제공되고, 여기서 하나 이상의 유전자는 VEGF, VEGF 수용체, HIF-1α, 태반 성장 인자 수용체 또는 엔도글린(CD105)이다. 이 방법은 환자 샘플에서 검출되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 혈관신생 억제제에 대한 민감성 또는 내성과 상관되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 비제한적인 일 실시양태에서, 혈관신생 억제제는 인간화 항-엔도글린 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 혈관신생 억제제는 VEGF 수용체 억제제 또는 VEGF 억제제이다.
본원에 사용될 때, 용어 "발현"은 유전자의 발현 검출과 관련하여 사용될 때, 유전자의 전사 검출 및/또는 유전자의 번역 검출을 의미할 수 있다. 유전자의 발현 검출은 유전자의 발현 여부를 능동적으로 결정하는 행위를 의미한다. 이것은 유전자 발현이 대조군에 비해 상향조절되는지, 대조군에 비해 하향조절되는지, 또는 대조군에 비해 변하지 않는지 결정하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 발현 검출 단계는 유전자의 발현이 실제로 상향조절되거나 하향조절될 것을 필요로 하지 않고, 유전자 발현이 변하지 않은 것을 검출하는 것을 또한 포함할 수 있다(즉, 유전자의 발현 부재 또는 유전자 발현의 변화 부재의 검출).
본 발명과 관련하여 평가되는 생체마커는 VEGF 수용체, 태반 성장 인자, HIF-1α 및 엔도글린(CD105)을 포함한다.
생체마커 발현의 평가를 위해, 내피 조직, 종양 세포, 또는 종양 세포에 의해 생산된 단백질 또는 핵산을 함유하는 환자 샘플이 본원에서 설명되고 당업계에 공지된 방법에 사용될 수 있다. 간략하게는, 생체마커의 발현 수준은 샘플, 예를 들어 환자로부터 얻은 종양 생검, 또는 종양으로부터 유래하는 물질을 함유하는 다른 환자 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 소변, 또는 상기 본원에서 설명된 다른 체액 또는 분비물)에서 마커의 양(예를 들어, 절대적인 양 또는 농도)를 평가함으로써 평가될 수 있다. 세포 샘플은 물론 샘플 내의 마커의 양을 평가하기 전에 다양한 공지된 수거 후 예비 및 저장 기술(예를 들어, 핵산 및/또는 단백질 추출, 고정, 저장, 동결, 한외여과, 농축, 증발, 원심분리 등)에 적용될 수 있다. 마찬가지로, 종양 생검도 수거 후 예비 및 저장 기술, 예를 들어 고정에 적용될 수 있다.
그를 발현하는 세포의 표면 상에 제시되는 적어도 하나의 부분을 갖는 생체마커 단백질의 발현을 검출할 수 있다. 마커 단백질 또는 그의 일부가 세포 표면에 노출되는지 결정할 수 있다. 예를 들어, 면역학적 방법을 사용하여 전체 세포 상의 상기 단백질을 검출할 수 있거나, 또는 공지된 컴퓨터 기반 서열 분석 방법을 사용하여 적어도 하나의 세포외 도메인(즉, 분비된 단백질 및 적어도 하나의 세포 표면 도메인을 갖는 단백질 둘 모두 포함)의 존재를 예측할 수 있다. 그를 발현하는 세포의 표면 상에 제시되는 적어도 하나의 모이어티를 갖는 마커 단백질의 발현은 반드시 종양 세포를 용해시키지는 않으면서 검출될 수 있다(예를 들어, 단백질의 세포 표면 도메인과 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여).
생체마커의 발현은 전사된 핵산 또는 단백질의 발현을 검출하기 위해 공지된 매우 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다. 상기 방법의 비제한적인 예는 예를 들어 분비된, 세포 표면, 세포질,또는 핵산 서열의 검출 방법, 단백질 정제 방법, 단백질 기능 또는 활성 분석, 핵산 혼성화 방법, 핵산 역전사 방법, 및 핵산 증폭 방법 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 방법을 포함한다.
샘플로부터 얻은 전사된 폴리뉴클레오티드의 혼합물을 생체마커 핵산의 적어도 일부(예를 들어, 적어도 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 잔기)와 상보성 또는 상동성인 뉴클레오티드가 부착된 기재와 접촉시킬 수 있다. 상보성 또는 상동성인 폴리뉴클레오티드가 기재 상에서 차별적으로 검출 가능한(예를 들어, 상이한 발색단 또는 형광단을 사용하여 검출 가능한, 또는 상이한 선택된 위치에 고정된) 경우에, 다수의 생체마커의 발현 수준은 단일 기재(예를 들어, 선택된 위치에 고정된 폴리뉴클레오티드의 "유전자 칩" 마이크로어레이)를 사용하여 동시에 평가할 수 있다. 한 핵산의 또 다른 핵산과의 혼성화를 포함하는 생체마커 발현을 평가하는 방법을 사용할 때, 혼성화는 엄격한 혼성화 조건 하에 수행될 수 있다.
본 발명의 다수의 생체마커가 본 발명의 방법에 사용될 때, 환자 샘플 내의 각각의 생체마커의 발현 수준은 단일 반응 혼합물에서(즉, 각각의 생체마커에 대해 시약, 예를 들어 상이한 형광 프로브를 사용하여) 또는 하나 이상의 생체마커에 대응하는 개개의 반응 혼합물에서 동일한 종류의 비암성 샘플 내의 다수의 생체마커의 각각의 정상적인 발현 수준과 비교할 수 있다.
정상(즉, 비암성) 인간 조직 내의 생체마커의 발현 수준은 다양한 방식으로 평가될 수 있다. 상기 정상 발현 수준은 비암성으로 보이는 세포의 일부 내의 생체마커의 발현 수준을 평가한 후, 종양 세포의 일부 내의 발현 수준과 정상 발현 수준을 비교함으로써 평가될 수 있다. 추가의 정보가 본원에서 설명되는 방법의 통상적인 수행을 통해 이용가능하기 때문에, 생체마커의 정상 발현에 대한 집단 평균 값을 사용할 수 있다. 대안적으로, 생체마커의 정상 발현 수준은 비암 이환 환자로부터 얻는 환자 샘플, 환자에서 암의 개시가 의심되기 전에 환자로부터 얻는 환자 샘플, 보관된 환자 샘플 등에서 생체마커의 발현을 평가함으로써 결정될 수 있다.
생물학적 샘플에서 생체마커 단백질 또는 핵산의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 예시적인 방법은 테스트 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻고 생물학적 샘플을 폴리펩티드 또는 핵산(예를 들어, mRNA, 게놈 DNA, 또는 cDNA)을 검출할 수 있는 화합물 또는 물질과 접촉시키는 것을 포함한다. 따라서, 검출 방법은 예를 들어 시험관내에서 및 생체내에서 생물학적 샘플에서 mRNA, 단백질, cDNA, 또는 게놈 DNA를 검출하기 위해 사용될 수 있다. mRNA의 검출을 위한 시험관내 기술은 예를 들어 역전사효소 - 폴리머라아제 연쇄 반응(RT-PCR; 예를 들어, 미국 특허 4,683,202 (Mullis, 1987)에 제시된 실험 실시양태), 노던(Northern) 혼성화 및 원위치 혼성화를 포함한다. 시험관내에서 생체마커 단백질을 검출하기 위한 기술은 효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침전 및 면역형광을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 게놈 DNA의 검출을 위한 시험관내 기술은 예를 들어 서던 혼성화를 포함한다. mRNA를 검출하기 위한 생체내 기술은 예를 들어, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR), 정량적 PCR, 노던 혼성화 및 원위치 혼성화를 포함한다. 또한, 생체마커 단백질의 검출을 위한 생체내 기술은 단백질 또는 그의 단편에 대해 작용하는 표지된 항체를 대상체 내로 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체는 대상체 내의 그의 존재 및 위치가 표준 이미징 기술에 의해 검출될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다.
상기 진단 및 소인 분석의 일반적인 원리는 생체마커 및 프로브가 상호작용하고 결합하여 반응 혼성화에서 제거 및/또는 검출될 수 있는 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 적절한 조건 하에 생체마커 및 프로브를 함유할 수 있는 샘플 또는 반응 혼합물의 제조를 포함한다. 상기 분석은 다양한 방법을 사용하여 다양한 방식으로 수행될 수 있다.
또한, 예를 들어 형광 에너지 전달(즉, FET, 예를 들어, 미국 특허 제5,631,169호(라코위츠(Lakowicz) 등); 및 미국 특허 제4,868,103호(스타브리아노포울로스(Stavrianopoulos) 등)) 기술을 이용함으로써 성분(생체마커 또는 프로브)의 추가의 조작 또는 표지를 수행하지 않으면서 생체마커/프로브 복합체 형성을 직접 검출할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 생체마커를 인식하는 프로브의 능력의 결정은 실시간 생체분자 상호작용 분석(BIA; 예를 들어 문헌 [Sjolander, S. and Urbaniczky, C, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345] 및 문헌[Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705] 참조)과 같은 기술을 이용함으로써 둘 모두의 분석 성분(프로브 또는 생체마커)을 표지하지 않으면서 달성할 수 있다. 본원에 사용될 때, "BIA" 또는 "표면 플라스몬 공명"은 임의의 상호작용체를 표지하지 않으면서 상호작용을 실시간으로 연구하기 위한 기술을 나타낸다(예를 들어, BIAcore). 결합 표면에서 질량의 변화(결합 사건을 표시함)는 표면 부근의 광의 굴절률의 변경을 일으키고(표면 플라스몬 공명(SPR)의 광학 현상), 이것은 생물학적 분자들 사이의 실시간 반응의 표시로서 사용될 수 있는 검출 가능한 신호를 생성시킨다.
생체마커의 절대적 발현 수준에 기반한 결정에 대한 대안으로서, 결정은 생체마커의 표준화된 발현 수준에 기반할 수 있다. 발현 수준은 생체마커의 절대적 발현 수준을 그의 발현을 생체마커가 아닌 유전자, 예를 들어, 구성적으로 발현되는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 발현에 비교하여 교정함으로써 표준화된다. 표준화를 위해 적합한 유전자는 하우스키핑 유전자, 예를 들어 액틴 유전자 또는 상피 세포-특이적 유전자를 포함한다. 상기 표준화는 또 다른 샘플, 예를 들어, 비종양 샘플에 대해 하나의 샘플, 예를 들어, 환자 샘플 내에서, 또는 상이한 공급원으로부터의 샘플들 사이에서 발현 수준의 비교를 허용한다.
대안적으로, 발현 수준은 상대적 발현 수준으로서 제공될 수 있다. 생체마커(예를 들어, VEGF 수용체, 태반 성장 인자, Hif-1α 및 엔도글린(CD105))의 상대적 발현 수준을 결정하기 위해, 해당 샘플에 대한 발현 수준의 결정에 앞서 정상 대 암세포 단리물의 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 또는 50개 이상의 샘플에 대해 생체마커의 발현 수준을 결정한다. 다수의 샘플 내에서 유전자 분석된 각각의 유전자의 평균 발현 수준을 결정하고, 이것을 생체마커에 대한 기저선 발현 수준으로서 사용한다. 이어서, 테스트 샘플에 대해 결정된 생체마커의 발현 수준(발현의 절대적 수준)을 그 생체마커에 대해 얻어진 평균 발현 값으로 나눈다. 이것은 상대적 발현 수준을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 생체마커 단백질을 검출한다. 본 발명의 생체마커 단백질을 검출하기 위한 한가지 종류의 물질은 그러한 단백질에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편, 예를 들어, 검출 가능하게 표지된 항체이다. 항체는 다클론 또는 단클론일 수 있다. 무손상 항체, 또는 그의 항원 결합 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, 단일 결합 사슬 폴리펩티드)을 사용할 수 있다. 프로브 또는 항체에 관하여 용어 "표지된"은 검출 가능한 물질을 프로브 또는 항체에 결합시키는(즉, 물리적으로 연결시키는) 프로브 또는 항체의 직접 표지뿐만 아니라, 직접 표지된 또 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접 표지를 포함하도록 의도된다. 간접 표지의 예는 형광 표지된 2차 항체를 사용한 1차 항체의 검출 및 비오틴을 사용한 DNA 프로브의 단부 표지(이것은 형광 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 검출할 수 있다)를 포함한다. 샘플이 주어진 항체에 결합하는 단백질을 함유하는지 결정하기 위해 다양한 방식을 이용할 수 있다. 그러한 방식의 예는 효소 면역분석(EIA), 방사성 면역분석(RIA), 웨스턴 블롯 분석 및 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 숙련된 당업자는 종양 세포가 본 발명의 생체마커를 발현하는지 결정하는데 사용하기 위해 공지된 단백질/항체 검출 방법을 쉽게 채택할 수 있다. 하나 이상의 생체마커를 평가하기 위해 생체마커의 검출을 위한 2가지 이상의 분석의 조합(비제한적인 예는 상기 설명한 것을 포함한다)을 또한 이용할 수 있다.
혈관신생 억제제를 사용한 치료를 위해 암 환자를 선택하는 방법을 또한 본원에서 제공한다. 방법은 환자로부터 암 샘플을 제공하고, 그의 발현이 혈관신생 억제제에 대한 민감성 또는 내성과 상관된 하나 이상의 유전자의 발현을 검출하고, 환자 샘플 내에서 검출된 유전자(들)의 발현 수준을 혈관신생 억제제에 대한 민감성 또는 내성과 상관된 유전자(들)의 발현 수준에 비교하는 것을 포함한다. 혈관신생 억제제에 대한 민감성 또는 내성과 상관된 유전자의 비제한적인 예는 VEGF, VEGF 수용체, HIF-1α, 태반 성장 인자 수용체, 및 엔도글린(CD105)을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 환자는 유전자(들)의 발현이 혈관신생 억제제에 대한 민감성과 상관된 유전자(들)의 발현과 유사한 경우에 혈관신생 억제제의 투여로부터 이익을 얻는 것으로 예측되는 것으로서 선택된다. 비제한적인 일 실시양태에서, 그에 대해 대상체 또는 대상체의 암이 민감성 또는 내성에 대해 테스트되는 혈관신생 억제제는 엔도글린(CD105) 억제제(예를 들어, 인간화 항-엔도글린 항체)이다. 또 다른 실시양태에서, 그에 대해 대상체 또는 대상체의 암이 민감성 또는 내성에 대해 테스트되는 혈관신생 억제제는 VEGF 수용체 억제제 또는 VEGF 억제제이다.
IV . 기능 분석
항체 및 그의 항원 결합 단편을 당업계에 공지된 것 및 본원에 기재된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 시험관내 및 생체내 방법을 이용하여 다양한 기능에 대해 테스트할 수 있다.
CD105 신호전달 및 기능의 분석 방법
CD105(엔도글린)은 증식하는 내피 세포에 의해 발현되는 TGF-β 수용체 패밀리의 구성원이고, 정상 수준의 CD105는 내피 세포 증식을 위해 필요하다. CD105 발현은 저산소증 유도성 인자-1-α(HIF-1-α)의 생산을 통해 세포 저산소증에 의해 증가되고, 저산소증 세포를 사멸로부터 보호한다. CD105는 TGF-β 수퍼패밀리의 다수의 키나아제 수용체 복합체, 예를 들어 TGF-β 수용체(TGF-βR), 액티빈 수용체 유사 키나아제(ALK) 및 액티빈 수용체의 신호전달을 조정하는 역할을 한다. CD105의 부재 하에, TGF-β 수용체의 활성화는 내피 세포 성장을 억제하는 SMAD 단백질의 인산화를 일으킨다. 그러나, TGF-β에 의한 CD105의 활성화는 SMAD 단백질 인산화를 조정한다. 최종 결과는 내피 세포에 대한 TGF-β 수용체 활성화의 성장 억제 효과의 방출이다. 항-CD105 항체에 의한 CD105 활성화의 방지는 내피 세포 성장을 억제하는 TGF-β와 상승 작용식으로 작용한다. TGF-β는 내피 세포에 대해 반대 효과를 보이는 2가지 별개의 제I형 수용체/SMAD 신호전달 경로를 자극할 수 있다. TGF-β/ALK5 신호전달 경로 (A)는 세포 증식 및 이동의 억제를 일으키는 반면, TGF-β/ALK1 경로 (B)는 내피 세포 증식 및 이동을 유도한다. CD105(혈관신생 동안 고도로 발현되는 보조 TGF-β 수용체)는 ALK1 신호전달을 위해 필수적이다. CD105의 부재 하에, TGF-β/ALK5 신호전달이 우세하고, 휴지 내피를 유지한다. 높은 CD105 발현은 ALK1 경로를 자극하고, ALK5 경로를 간접적으로 억제하여, 혈관신생의 활성화 상태를 촉진한다.
비제한적인 일 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및 항원 결합 단편은 TGF-β/ALK1 신호전달 경로를 차단함으로써 혈관신생을 차단한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및 항원 결합 단편은 Smad1/5/8 인산화 및/또는 신호전달을 방지함으로써 혈관신생을 차단한다. CD105는 TGF-β/ALK1의 신호전달을 통해 혈관신생의 촉진에 참여하고, 이것은 다시 Smad2/3 단백질의 인산화의 감소 및/또는 차단을 수반한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및 항원 결합 단편은 Smad2/3 인산화 및/또는 신호전달을 향상시킴으로써 혈관신생을 차단한다. TGF-β/ALK1 신호전달 경로 및/또는 Smad1/5의 인산화에 대한 본원에 제공된 항체 및 항원 결합 단편의 차단 또는 억제 효과를 분석하기 위한 방법 및 기술은 공지된 분자 기술을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 예로서, TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로 내의 임의의 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅을 이용하여 TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로에 대한 본원에 논의된 항체 및 항원 결합 단편의 억제 및/또는 자극 효과를 결정할 수 있다. 이와 유사하게, TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로에 관여하는 단백질에 대한 mRNA의 검출 또는 mRNA의 조절을 이용하여 본원에 논의된 항체 및 항원 결합 단편의 억제 및/또는 자극 효과를 결정할 수 있다. TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로에 대한 세포 신호전달을 분석하기 위한 추가의 방법은 당업계에 공지되어 있고 본원에서 고려된다.
비제한적인 일 실시양태에서, 항체를 혈관신생 및 내피 세포 증식을 억제하는 것에 관하여 평가할 수 있다. HUVEC에 대한 항-엔도글린 항체의 결합은 HUVEC에 대한 TGF-β의 후속적인 결합을 방지하지 않는다. 따라서, 항-엔도글린 항체에 의한 내피 세포 성장의 직접 억제제는 그에 의해 항-혈관신생 및 종양 억제 효과가 생체내에서 관찰되는 근간이 되는 기작 중 하나를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 항체를 Smad1/5/8 인산화 및/또는 신호전달을 방지함으로써 혈관신생을 차단하는 것에 관하여 평가할 수 있다. CD105는 TGF-β/ALK1의 신호전달을 통해 혈관신생의 촉진에 참여하고, 이것은 다시 Smad2/3 단백질의 인산화의 감소 및/또는 차단을 수반한다. 또 다른 실시양태에서, 항체를 Smad2/3 인산화 및/또는 신호전달을 향상시킴으로써 혈관신생을 차단하는 것에 관하여 평가할 수 있다.
TGF-β/ALK1 신호전달 경로 및/또는 Smad1/5의 인산화에 대한 본원에 제공된 항체의 차단 또는 억제 효과를 분석하는 방법 및 기술은 공지된 분자 기술을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 예로서, TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로 내의 임의의 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅을 이용하여 TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로에 대한 본원에 논의된 항- 엔도글린 항체의 억제 및/또는 자극 효과를 결정할 수 있다. 이와 유사하게, TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로에 관여하는 단백질에 대한 mRNA의 검출 또는 mRNA의 조절을 이용하여 본원에 개시된 항체의 억제 및/또는 자극 효과를 결정할 수 있다. TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로에 대한 세포 신호전달을 분석하기 위한 추가의 방법은 당업계에 공지되어 있고 본원에서 고려된다.
본원에 개시된 항-엔도글린 항체의 활성은 본원에서 아래에 보다 상세히 설명하는 당업계에 인정되는 분석을 이용하여, 예를 들어, 결합 분석, 예를 들어 ELISA, 경쟁적 ELISA, 표면 플라스몬 공명, 및 HUVEC 세포에 대한 효과를 이용함으로써 평가할 수 있다.
세포 부착의 분석 방법
세포 부착은 당업자에게 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 분석은 이전에, 예를 들어 문헌[Lebrin, et al., J. Clin. Invest 1997, 99: 1390-1398]에 설명되었다. 간략하게는, 세포를 코팅된 웰 상에서 기재(즉, ECM 성분)에 부착하도록 할 수 있다. 세척에 의해 비-부착된 세포를 제거하고, BSA와 함께 인큐베이션함으로써 비특이적 결합 부위를 차단한다. 부착된 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 부착된 세포로부터 용출된 크리스탈 바이올렛의 광학 밀도를 600 nm의 파장에서 측정함으로써 세포 부착을 정량한다.
세포 이동의 분석 방법
세포 이동에 대한 분석은 예를 들어 문헌[Brooks, et al., J. Clin. Invest 1997, 99: 1390-1398]에 설명되었고, 세포 이동을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 본원에 기재된 하나의 세포 이동 측정 방법에서, 트랜스웰(transwell) 이동 챔버로부터의 막을 기재로 코딩하고, 트랜스웰을 세척하고, 비특이적 결합 부위를 BSA로 차단한다. 서브컨플루언트(sub-confluent) 배양물로부터 종양 세포를 수거하고, 세척하고, 분석 항체의 존재 또는 부재 하에 이동 완충액 내에 재현탁시킨다. 종양 세포가 코팅된 트랜스웰 막의 밑면으로 이동하도록 한 후에, 막의 윗면에 남아있는 세포를 제거하고, 밑면으로 이동하는 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색한다. 이어서, 현미경 시야당 직접적 세포 계수에 의해 세포 이동을 정량한다.
SCID /누드 마우스
종양 성장을 분석하는 한가지 방법은 다음과 같이 SCID 마우스를 이용하는 것이다: 서브컨플루언트 인간 M21 흑색종 세포를 수거하고, 세척하고, 살균 PBS(20 x 106/mL) 내에 재현탁시킨다. SCID 마우스에게 100 ㎕의 M21 인간 흑색종 세포(2 x 106) 현탁액을 피하 주사한다. 종양 세포 주사 3일 후에, 마우스를 처리하지 않거나 하나 이상의 대조군 또는 테스트 조성물로 정맥내 또는 복강내(예를 들어, 100 ㎍/마우스) 처리한다. 마우스를 24일 동안 매일 처리한다. 종양 크기를 캘리퍼스로 측정하고, 부피를 식 V = (L x W2)/2을 이용하여 추정하고, 여기서 V는 부피이고, L은 길이이고, W는 폭이다.
종양 성장을 분석하는 한 가지 방법은 다음과 같이 누드 마우스를 이용하는 것이다: 50 ㎕ PBS 내의 MDA-MB-435 종양 세포(0.4x106 세포/마우스)를 암컷 누드 마우스(5 내지 6주령)의 유방 지방 패드에 동소 이식한다. 종양이 약 50-80 mm3의 평균 부피에 도달했을 때, 마우스를 무작위로 나누고(적어도 10/군), 100 ㎕ PBS 내의 용량당 1 ㎍(0.05 mg/kg), 10 ㎍(0.5 mg/kg), 100 ㎍(5 mg/kg) 또는 200 ㎍(10 mg/kg)의 하나 이상의 항체, 또는 100 ㎍ 대조군 항체, 또는 비히클 PBS 100 ㎕를 사용한 매주 2회의 정맥내 또는 복강내 처리를 개시한다; 일부 연구에서, 비처리군을 또한 평가할 수 있다. 종양 크기를 캘리퍼스로 측정하고, 부피를 식 V = (L x W2)/2을 이용하여 추정하고, 여기서 V는 부피이고, L은 길이이고, W는 폭이다.
BALB /c 동계 마우스 모델
대안적으로, 예를 들어, 문헌[Tsujie et al., Int. J. Oncology, 29: 1087-1094 (2006)]에 예시된 바와 같이 종양 성장 및 본원에 기재된 항체에 의한 그의 억제를 평가하기 위해 BALB/c 동계 마우스 모델을 또한 이용할 수 있다.
키메라 마우스
또 다른 분석은 키메라 마우스:인간 마우스 모델에서 혈관신생을 측정하고, 이를 키메라 마우스 분석으로서 칭한다. 분석은 다른 연구자들에 의해 상세히 설명되었고, 혈관신생, 신혈관형성, 및 종양 조직의 퇴행을 측정하기 위해 본원에서 추가로 설명된다(문헌 [Yan, et al. (1993) J. Clin. Invest. 91:986-996] 참조).
이식된 피부 이식편은 조직학상 정상 인간 피부를 밀접하게 닮았고 실제 인간 혈관이 이식된 인간 피부로부터 이식된 인간 피부의 표면 상에서 인간 종양 조직 내로 성장하는 전체 조직의 신혈관형성이 일어나기 때문에 키메라 마우스 분석은 생체내 혈관신생에 대한 유용한 분석 모델이다. 인간 이식편 내로의 신혈관형성의 기원은 인간-특이적 내피 세포 마커로 신생혈관의 면역조직화학적 염색에 의해 입증할 수 있다.
키메라 마우스 분석은 새로운 혈관 성장의 퇴행의 양 및 정도 모두를 기반으로 하여 신혈관형성의 퇴행을 입증한다. 또한, 이식된 피부 상에서 이식된 임의의 조직, 예를 들어 종양 조직의 성장에 대한 효과를 모니터링하는 것은 쉽다. 마지막으로, 분석 시스템 내에 독성에 대한 내부 대조군이 존재하므로 분석은 유용하다. 키메라 마우스는 임의의 테스트 시약에 노출되고, 따라서 마우스의 건강이 독성을 나타내는 것이다. 본원에 기재된 방법에서, 본원에 기재되고 당업계에 공지된 다른 동물 모델을 또한 이용할 수 있다.
토끼 눈 분석
혈관신생의 또 다른 척도는 생체내 토끼 눈 모델이고, 토끼 눈 분석으로서 칭한다. 문헌 [D'Amato et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(9): 4082-4085]에 예시된 바와 같이 토끼 눈 분석은 다른 연구자들에 의해 상세히 설명되었고, 혈관신생 억제제의 존재 하에 혈관신생 및 신혈관형성 모두를 측정하기 위해 이용되었다.
각막의 가장자리로부터 각막 내로 성장하는 토끼 혈관에 의해 예시되는 신혈관형성 과정이 눈의 자연적으로 투명한 각막을 통해 쉽게 가시화되기 때문에 토끼 눈 분석은 생체내 혈관신생에 대한 인정되는 분석 모델이다. 추가로, 신혈관형성의 자극 또는 억제 또는 신혈관형성의 퇴행의 정도 및 양은 모두 경시적으로 쉽게 모니터링할 수 있다.
마지막으로, 토끼는 임의의 테스트 시약에 노출되고, 따라서 토끼의 건강은 테스트 시약의 독성의 표시이다.
간략하게는, 닭 융모요막(CAM) 분석을 수행하고, 발생하는 혈관 구조에 대한 효과를 하나 이상의 대조군 또는 테스트 화합물을 함유하는 0.5% 카르복시메틸셀룰로스 펠릿의 이식 48시간 후에 기록한다. 각막 신혈관형성은 수크랄페이트(수크로스 알루미늄 술페이트; 부크 메디테크(Bukh Meditec, 코펜하겐))에 결합된 650 ng의 강력한 혈관신생 단백질 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)을 함유하는 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트)(히드론(Hydron); 인터페론 사이언시즈(Interferon Sciences, 미국 뉴저지주 뉴 브룬스위크))의 이식된 펠릿에 의해 유도된다. 수크랄페이트의 펠릿에 대한 첨가는 분해로부터 bFGF를 보호하고, 그의 느린 방출을 제공하여, bFGF / 히드론 단독에 의해 유도되는 것보다 더 현저한 지속적인 침습성 혈관신생을 생성한다. 수크랄페이트/히드론을 함유하는 펠릿으로부터 bFGF의 방출은 히드론 단독 사용시의 펠릿에서의 단지 1일에 비해, 펠릿 형성 후 4일까지 동안 시험관내에서 검출될 수 있다. 펠릿은 12 ㎍의 재조합 bFGF(다케다(Takeda, 일본 오사까))를 함유하는 110 ㎕의 염수와 40 mg의 수크랄페이트를 혼합함으로써 제조되고; 상기 현탁액을 에탄올 내의 80 ㎕의 12%(wt/vol) 히드론에 첨가한다. 이어서, 상기 혼합물의 분취액(10 ㎕)을 피펫으로 테플론(Teflon) peg 상에 옮기고, 건조하여 약 17 펠릿을 생성한다.
펠릿을 마취된 암컷 뉴질랜드 화이트(New Zealand White) 토끼의 각각의 눈의 가장자리로부터 2 mm에 위치한 각막 미세낭 내로 이식한 후, 각막의 표면에 에리쓰로마이신 연고를 1회 국소 도포하였다. 매일 조직학적 검사를 통해, 펠릿을 향해 각막 내로 혈관 성장이 진행됨이 관찰되고, 단지 드문 염증 세포만이 보인다. 상기 혈관신생 반응은 전신 방사선 조사를 사용한 강한 면역 억제제에 의해 변경되지 않고, 수크랄페이트 단독을 사용한 펠릿은 혈관신생을 유도하지 않는다. 새로운 혈관은 염증에 의해서보다는 주로 bFGF에 의해 유도된다. 0.5% 카르복시메틸셀룰로스에 현탁된 하나 이상의 화합물 또는 비히클 단독을 사용한 위 세척에 의해 이식 2일 후부터 매일 동물에게 공급한다. 면역억제된 동물에게 펠릿 이식 직전에 6 Gy의 전신 방사선 조사를 6분 동안 실시한다. 상기 선량의 방사선은 제2일에 백혈구 계수가 >80% 감소, 제3일에 >90% 감소하는 현저한 백혈구 감소증을 야기하고, 이 결과는 이전 보고들과 일치한다.
동물을 동일한 각막 전문가(M.S.L.)가 격일로 맹검 방식으로 슬릿 램프로 조사한다. 각막 신혈관형성의 영역은 가장자리로부터의 혈관 길이(L) 및 관련 가장자리의 시계 시침의 수(C)를 십자선으로 측정함으로써 결정된다. 원형 밴드 부분의 영역을 결정하기 위해 다음 식을 사용한다:
C/12 x 3.1416 [r2 - (r - L)2]
여기서, r = 6 mm로서, 토끼 각막의 측정된 반경이다. 펠릿에 인접한 신혈관형성의 균일한 연속적인 밴드가 측정되고, 따라서, 신혈관형성의 총 억제를 평가할 수 있다.
마우스 매트리겔 플러그( Matrigel Pug ) 혈관신생 분석
혈관신생에 대한 조성물의 효과를 확인하기 위해, 마우스 매트리겔 플러그 혈관신생 분석을 사용할 수 있다. 다양한 성장 인자(예를 들어, IGF-1, bFGF 또는 VEGF)(250 ng) 및 헤파린(0.0025 단위/mL)를 문헌[Montesano, et al., J. Cell Biol. 1983, 97: 1648-1652]; 문헌[Stefansson, et al., J. Biol. Chem. 2000, 276:8135-8141]에 기재된 바와 같은 성장 인자 감소 매트리겔과 혼합한다. 본원에 기재된 조성물 또는 대조군 항체가 하나 이상의 동물 투여군을 사용하여 매트리겔 제제에 포함될 수 있다. 대조군 실험에서, 매트리겔은 성장 인자의 부재하에 제조된다. 마우스에게 0.5 mL의 매트리겔 제제를 피하 주사하고, 1주일 동인 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 후에, 마우스를 희생시키고, 중합화된 매트리겔 플러그를 수술에 의해 제거한다. 매트리겔 플러그 내의 혈관신생은 면역조직화학 분석 및 헤모글로빈 함량을 포합하는 2개의 확립된 방법에 의해 정량한다(문헌[Furstenberger, et al., Lancet. 2002, 3:298-302]; 문헌[Volpert, et al., Cancer Cell 2002, 2(6):473-83]; 및 문헌[Su, et al., Cancer Res. 2003, 63:3585-3592]). 면역조직화학 분석을 위해, 매트리겔 플러그를 OCT에 포매하고, 급속 냉동하고, 4 ㎛ 절편을 제조하였다. 냉동된 절편을 메탄올/아세톤(1:1)에 고정시킨다. 냉동된 절편을 CD31에 대해 작용하는 다클론 항체로 염색한다. 혈관신생은 20 고성능(200X) 현미경 시야 내의 미세혈관 밀도 계수에 의해 정량한다.
헤모글로빈 함량은 이전에 문헌에 기재된 바와 같이 정량할 수 있다(문헌[Schnaper, et al., J. Cell Physiol. 1993, 256:235-246]; 문헌[Montesano, et al., J. Cell Biol. 1983, 97: 1648-1652]; 문헌[Stefansson, et al., J. Biol. Chem. 2000, 276:8135-8141]; 및 문헌[Gigli, et al., J. Immunol. 1986, 100:1154-1164]). 매트리겔 임플란트를 드라이 아이스 상에서 급속 냉동하고, 하룻밤 동결건조한다. 건조된 임플란트를 1시간 동안 0.4 mL의 1.0% 사포닌(칼바이오켐(Calbiochem)) 내에 재현탁하고, 피펫으로 격렬하게 흔들어 붕괴시킨다. 제제를 15분 동안 14,000 X g에서 원심분리하여 임의의 입자를 제거한다. 이어서, 상청액 내의 헤모글로빈의 농도를 405 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 직접 결정하고, 정제된 헤모글로빈의 표준 농도와 비교한다
종양 성장 분석 방법
종양 성장을 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 SCID 마우스 모델, 누드 마우스 모델, 및 동계 종양이 있는 BALB/c 마우스에 의해 분석할 수 있다. 종양 성장에 대한 SCID 마우스 모델을 다음과 같이 수행한다: 서브컨플루언트 인간 M21 흑색종 세포(또는 임의의 목적하는 종양 세포 종류)를 수거하고, 세척하고,살균 PBS(20 x 106 per mL) 내에 재현탁시킨다. SCID 마우스에게 100 ㎕ M21 인간 흑색종 세포(2 x 106) 현탁액을 피하 주사한다. 종양 세포 주사 3일 후에, 마우스를 처리하지 않거나 또는 요구되는 용량 범위로 길항제로 복강내 처리한다. 마우스를 24일 동안 매일 처리한다. 종양 크기를 캘리퍼스로 측정하고, 부피를 식 V = (L x W2)/2을 이용하여 추정하고, 여기서 V는 부피이고, L은 길이이고, W는 폭이다.
대안적으로, 종양 성장 및 본원에 기재된 인간화 항-엔도글린 항체 또는 항원 결합 단편에 의한 그의 억제를 평가하기 위해 누드 마우스 모델, SCID 마우스 모델 및/또는 BALB/c 동계 마우스 모델을 또한 이용할 수 있다.(문헌[Tsujie et al., Int. J. Oncology, 29: 1087-1094 (2006)).
세포 증식 분석 방법
세포 증식을 당업자에게 공지된 방법에 의해 분석할 수 있다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 서브컨플루언트 인간 내피 세포(HUVEC)를 ECV 또는 ECVL 세포로부터의 CM(25 ㎕)의 존재 또는 부재 하에 낮은(5.0%) 혈청을 함유하는 증식 버퍼에 재현탁하고, 내피 세포를 24시간 동안 증식시킬 수 있다. 증식은 상업적으로 입수가능한 WST-1 분석 키트(케미콘(Chemicon))를 사용하여 미토콘드리아 데히드로게나아제 활성을 측정함으로써 정량할 수 있다. 또한, 본원에서 설명되는 바와 같이, 증식은 표준 방법을 사용하여 3H 혼입을 측정함으로써 정량될 수 있다(문헌[She et al., Int. J. Cancer, 108: 251-257 (2004)]).
세포 증식을 평가하기 위한 다른 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본원에서 고려된다. 추가의 비제한적인 예를 실시예에서 보다 상세하게 설명한다.
CDC , ADCC 및 옵소닌 작용 ( opsonization ) 유도 방법
다양한 요법이 형질전환된 세포에 대한 신체의 천연 면역 반응을 증강시키기 위해 시행되었다. 통상적인 이펙터 방법은 보체 의존성 세포 용해("CDC"), 항체 의존성 세포성 세포독성("ADCC") 및 포식작용(표적 세포를 면역글로불린으로 코팅한 후, 망상내피계에 의한 제거)을 포함한다. 항체의 존재 하에, 특정 이펙터 세포, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 대한 표면 결합된 수용체를 갖는 림프계 세포가 표적 세포에 대한 항체 의존성 세포독성("ADCC") 반응을 매개함이 알려져 있다. ADCC에 의해, 상기 이펙터 세포는 상기 표적 세포에 대한 세포용해 활성을 발휘한다.
두 가지 종류의 ADCC 반응이 시험관내에서 입증되었다. 전통적인 ADCC 반응에서, 이펙터 세포는 항체-코팅 표적 세포에 부착한 후, 표적 세포의 세포용해를 야기한다(A. H. Greenberg et al., "Characteristics Of The Effector Cells Mediating Cytotoxicity Against Antibody-Coated Target Cells." I., Immunology, 21, p. 719 (1975)). 상기 이펙터와 표적 세포 사이의 부착은 표적 세포를 코팅한 항체의 Fc 영역과 이펙터 세포의 Fc 수용체 사이의 상호작용에 의해 이루어진다. 상기 종류의 ADCC 반응의 한 가지 단점은 이 반응이 이펙터 세포의 Fc 수용체에 대해 표적 세포 결합 항체와 경쟁하는, 종종 다양한 질환과 관련된 순환하는 항원-항체 복합체에 의해 방해될 수 있다는 점이다(문헌[I. C. M. MacLennan, "Competition For Receptors For Immunoglobulin On Cytotoxic Lymphocytes," Clin. Exp. Immunol., 10, p. 275 (1972)]). 상기 전통적인 ADCC의 단점 때문에, 제2 종류의 ADCC 반응 - 항체 작용 ADCC -이 제안되었다. 항체 작용 ADCC에서, 표적 특이적 항체가 먼저 이펙터 세포에 부착되고, 이어서 생성되는 복합체는 항체를 통해 표적 세포 표면 상의 그의 특이적 항원에 대해 "작용"한다. 유리하게는, 항체 작용 ADCC는 숙주 시험관내에서 순환하는 항원-항체 복합체의 존재에 의해 영향받지 않을 수 있다. Fc 영역/Fc 수용체 부착을 통한 항체 및 이펙터 세포 사이의 상호작용은 정상적으로는 약하다. 그리고, 일부 경우에, 항체는 표적 세포의 용해를 허용하기에 충분한 시간 동안 이펙터 세포와 회합된 상태로 유지되지 않는다. 상기와 같은 잠재적인 문제에 비추어, 항체는 폴리에틸렌 글리콜 및 프탈레이트 오일의 혼합물을 사용한 전처리를 사용하여 이펙터 세포에 부착되었다(문헌[J. F. Jones and D. M. Segal, "Antibody-Dependent Cell Mediated Cyto lysis (ADCC) With Antibody-Coated Effectors: New Methods For Enhancing Antibody Binding And Cytolysis," J. Immunol, 125, pp. 926-33 (1980)]). 그러나, 상기 방법의 생체내 치료에 대한 응용성은 임의의 폴리에틸렌 글리콜 및 항체-이펙터 세포 복합체 상의 프탈레이트 오일 잔류물이 신체에 대해 가질 수 있는 독성 효과에 의해 감소될 수 있다.
대안적으로, 세포독성 약물을 사용한 보조 화학요법에 의해 항체 작용 ADCC를 향상시키는 방법이 제안되었다(문헌[I. R. Mackay et al., "Effect On Natural Killer And Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Of Adjuvant Cytotoxic Chemotherapy Including Melphalan In Breast Cancer," Cancer Immunol. Immunother., 16, pp. 98-100 (1983)]). ADCC의 테스트를 위한 분석은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,756,097호).
따라서, 본 발명은 포식작용 및 세포의 사멸을 향상시켜 생체내에서 보호를 향상시킬 수 있는, 신혈관형성 또는 혈관신생에서 기능을 수행하는 세포에 결합할 수 있는 항체(예를 들어, 인간화 항-엔도글린 항체)를 제공한다. 또한, 상기 항체가 결합할 수 있고 동일한 효과를 갖는 결합 부위 또는 에피토프에 면역반응하거나, 특이적으로 결합하거나 또는 우선적으로 결합하는 다른 항체 및 그의 기능적 단편이 제공된다.
또한, 본 발명의 항체는 신혈관형성 또는 혈관신생에서 기능하는 세포(예를 들어, 내피 세포)에 대해 옵소닌 작용성이거나, 또는 옵소닌 작용 활성을 보일 수 있다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, "옵소닌 작용 활성"은 포식세포에 대한 항원 또는 세포 수용체의 부착을 촉진하고 이에 의해 포식작용을 향상시키기 위해 항원 또는 세포 수용체에 결합하는 옵소닌(일반적으로 항체 또는 혈청 인자 C3b)의 능력을 의미한다. 특정 세포는 옵소닌 작용 항체로 코팅시에 포식세포, 예를 들어 호중구 및 대식세포에 매우 고도로 유인되고, 그의 혈류로부터의 소실 속도가 놀라울 정도로 향상된다. 옵소닌 작용 활성은 예를 들어 미국 특허 제6,610,293호에 기재된 바와 같은 임의의 통상적인 방식으로 측정될 수 있다.
또 다른 비제한적인 실시양태에서, 신생혈관 질환 또는 혈관신생 의존적 질환이 있는 환자는 혈관신생으로부터 항원/펩티드(예를 들어, 엔도글린)를 배출한다. 이들 항원/펩티드는 "종양 관련 항원"일 수 있다. 그러한 환자에는 항원/펩티드(예를 들어, 엔도글린)에 대한 항체를 전신적으로 투여할 수 있고, CDC, ADCC, 옵소닌 작용, 또는 세포 매개 사멸의 임의의 다른 형태를 유도하기 위해 본원에서 설명되는 바와 같이 임의의 경로를 개시할 수 있다.
V. 패키지 및 키트
추가의 실시양태에서, 본원은 상기 설명한 화합물을 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 엔도글린에 결합하는 인간화 항체 또는 항원 결합 단편이 키트에 제공될 수 있다. 따라서, 키트는 적합한 용기 수단에, 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 것이다. 키트는 적합한 용기 수단에 엔도글린에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
키트의 용기 수단은 일반적으로 적어도 하나의 폴리펩티드가 배치되고/되거나 바람직하게는 적합하게 분취된 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 시린지 및/또는 다른 용기 수단을 포함할 것이다. 키트는 상업적으로 시판하기 위해 잘 밀폐된 적어도 하나의 융합 단백질, 검출 가능한 모이어티, 리포터 분자, 및/또는 임의의 다른 시약 용기를 보유하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 상기 용기는 요구되는 바이알이 보유되는 주사 및/또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 키트 내의 물질을 사용하기 위한 인쇄된 물질을 포함할 수 있다.
포장 및 키트는 추가로 약학적 제형에 완충제, 보존제 및/또는 안정화제를 포함할 수 있다. 키트의 각각의 성분은 개개의 용기 내에 봉입될 수 있고, 모든 다양한 용기는 단일 포장 내에 포장될 수 있다. 본 발명의 키트는 냉장 저장 또는 실온 저장을 위해 디자인될 수 있다.
추가로, 제제는 키트의 저장 수명을 증가시키기 위해 안정화제를 함유할 수 있고, 예를 들어 소 혈청 알부민(BSA)을 포함한다. 조성물이 동결건조될 경우, 키트는 동결건조된 제제를 재구성하기 위한 용액 제제를 추가로 함유할 수 있다. 허용되는 재구성 용액은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 약학적으로 허용되는 포스페이트 완충 염수(PBS)를 포함한다.
추가로, 본원에서 설명되는 포장 또는 키트는 예를 들어, 하나 이상의 리포터 분자 및/또는 하나 이상의 검출 가능한 모이어티/물질과 같은, 본원에서 제공되는 임의의 다른 모이어티를 추가로 포함할 수 있다.
포장 및 키트는 예를 들어 ELISA 분석을 위한 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 테스트되는 샘플은 예를 들어, 혈액, 혈장 및 조직 절편 및 분비물, 소변, 림프 및 이의 제품을 포함한다. 포장 및 키트는 샘플의 수거를 위한 하나 이상의 성분(예를 들어, 시린지, 컵, 면봉 등)을 추가로 포함할 수 있다.
포장 및 키트는 예를 들어 제품 설명, 투여 방식 및/또는 치료 적응증을 명시하는 라벨을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 포장은 본원에서 설명되는 바와 같은 임의의 조성물을 포함할 수 있다. 포장은 혈관신생/신혈관형성을 특징으로 하는 안질환(예를 들어, 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 신병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 암의 형태 및 이들의 전이를 치료하기 위한 라벨을 추가로 포함할 수 있다.
용어 "포장재"는 키트의 성분을 수용하는 물리적 구조체를 의미한다. 포장재는 성분을 살균 상태로 유지할 수 있고, 상기 목적을 위해 통상 사용되는 물질(예를 들어, 종이, 주름진 섬유, 유리, 플라스틱, 호일, 앰퓰 등)로 제조될 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 적절한 사용 설명서를 포함할 수 있다. 따라서, 키트는 본 발명의 임의의 방법에서 키트 성분을 사용하기 위한 라벨 또는 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 화합물을 본원에서 설명되는 방법에서 투여하기 위한 설명서와 함께 팩 또는 분배기에 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명은 본원에서 설명되는 진단 방법 및 분석에서 이용되는 키트를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 키트는 그의 발현 수준이 환자로부터의 암 세포의 샘플에서 혈관신생 억제제에 대한 민감성 또는 내성과 상관된 유전자 또는 유전자들의 검출을 위한 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 또는 유전자들은 VEGF, VEGF 수용체, HIF-1α, 태반 성장 인자 수용체, 및 CD105로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 키트는 VEGF를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 VEGF 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 HIF-1α를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 태반 성장 인자 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 CD105를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 VEGF, VEGF 수용체, HIF-1α, 태반 성장 인자 수용체 및 CD105 중의 적어도 2개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 혈관신생 억제제에 대한 민감성과 상관된 적어도 2개의 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 혈관신생 억제제에 대한 내성과 상관된 적어도 2개의 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 혈관신생 억제제에 대한 민감성과 상관된 하나 이상의 유전자 및 혈관신생 억제제에 대한 내성과 상관된 하나 이상의 유전자를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 키트는 치료되는 환자로부터의 종양 세포의 샘플에서 VEGF, VEGF 수용체, HIF-1α, 태반 성장 인자 수용체, 및 CD105 발현 수준의 검출을 위한 시약; 및 캡슐, 당의정, 겔 캡(gel cap), 현탁용 분말 등과 같은 다양한 투여 형태의 본원에서 설명되는 인간화 항-엔도글린 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는 억제제를 포함한다. 치료되는 환자로부터의 종양 세포의 샘플에서 VEGF, VEGF 수용체, HIF-1α, 태반 성장 인자 수용체, 및 CD105 발현 수준의 검출을 위한 시약을 포함하는 키트가 적어도 하나의 추가의 혈관신생 억제제의 동시투여를 위한 키트의 상기한 임의의 실시양태를 추가로 포함함이 본 발명에서 추가로 고려된다.
설명서는 치료 방법을 포함하는 본원에서 설명되는 임의의 방법의 실행을 위한 설명을 포함할 수 있다. 설명서는 만족스러운 임상 종말점 또는 발생할 수 있는 임의의 유해한 증상의 표시, 또는 인간 대상체에 대해 사용하기 위해 규제 당국, 예를 들어 미국 식품의약청(Food and Drug Administration)에서 요구하는 추가의 정보를 추가로 포함할 수 있다.
설명서는 "인쇄된 물질" 상에, 예를 들어 키트 내 또는 키트에 부착된 종이 상에 또는 카드보드 상에, 또는 키트 또는 포장재에 고정된 또는 키트의 성분을 함유하는 바이알 또는 관에 부착된 라벨 상에 위치할 수 있다. 설명서는 추가로 컴퓨터 판독가능 매체, 예를 들어 디스크(플로피 디스켓 또는 하드 디스크), 광학 CD, 예를 들어 CD- 또는 DVD-ROM/RAM, 자기 테이프, 전자적 저장 매체, 예를 들어 RAM 및 ROM, IC 팁 및 이들의 혼성체, 예를 들어 자기/광학 저장 매체에 포함될 수 있다.
본원의 화합물 및 방법의 실시양태는 단지 예시를 위한 것으로서, 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 상기 교시내용에 비추어 변경 및 변화, 구체적으로 엔도글린의 결합에 대한 거의 천연 기능을 유지하면서 설명된 변형을 포함하는 엔도글린에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에의 변경에 관한 것일 수 있는 것이 당업자에 의해 이루질 수 있다. 따라서, 설명되는 범위 내에 포함되는 특정 실시양태에서 변화가 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예
본 출원은 본 출원의 예시적 실시양태로서 제공된 하기의 비제한적 실시예를 참고로 하여 더욱 잘 이해될 수 있다. 하기 실시예는 본 발명의 실시양태를 더욱 충분히 예시하기 위하여 제시되지만, 어떠한 방식으로든 본 출원의 광범위한 범주를 제한하는 것으로 파악되어서는 안된다. 본 출원의 특정 실시양태가 본원에 예시되고 기술되었지만, 그러한 실시양태는 예로서만 제공됨이 명백하다. 다수의 변동, 변화 및 치환이 본 발명으로부터 벗어나지 않고서 당업계의 숙련자에게 나타날 수 있으며, 본원에 기술된 실시양태에 대한 다양한 대안이 본원에 기술된 방법의 실행에서 이용될 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예 1
항- CD105 인간화 및 인간화/ 탈면역화 항체의 생성 및 결합
항체의 구성, 발현 및 정제
모든 인간화 및 인간화/탈면역화 VH 및 VK 영역 유전자를 일련의 중첩 올리고뉴클레오티드를 사용하여 합성하였는데, 상기 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고, 라이게이션하고 PCR 증폭시켜 전장 합성 V 영역을 생성하였다. 그 후 조립된 변이체를 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄를 위한 안티토프 리미티드(Antitope Ltd.)의 pANT 발현 벡터 시스템 내로 직접적으로 클로닝하였다.
모든 인간화 중쇄 및 경쇄의 조합(즉, 총 4가지의 쌍) 및 인간화/탈면역화 중쇄 및 경쇄의 조합(즉, 총 24가지의 쌍)은 전기천공을 통하여 NS0 내로 트랜스펙션시키고, 200 nM의 메토트렉세이트(시그마 카탈로그 번호 M8407)를 이용하여 선발하였다. 각각의 구성체에 있어서의 메토트렉세이트 내성 콜로니를 IgG1 ELISA를 이용하여 IgG 발현 수준에 대하여 테스트하였다. 최상의 발현주를 선발하고, 액체 질소하에 냉동시켰다. 성공적인 트랜스펙션 및 클론 선발이 모든 변이체에 대하여 달성되었으며, 포화 정적 배양물 중 인간화 및 인간화/탈면역화 항체 변이체의 발현 수준이 표 1에 예시되어 있다.
따라서 24가지의 IgG1 변이체를 단백질 A 세파로스 컬럼(지이 헬스케어(GE Healthcare) 카탈로그 번호 110034-93)에서 NS0 세포 배양물 상청액으로부터 정제하고, 예측된 아미노산 서열을 기반으로 하여, 소광 계수 Ec(0.1%) = 1.62를 이용하여 OD280nm에 의해 정량하였다. 대략 500 ㎍의 각각의 항체 변이체를 정제하고 SDS-PAGE를 환원하여 리드 변이체를 분석하였다. 간략하게는, 리드 항체 변이체의 환원 SDS-PAGE 겔을 쿠마시 블루 염색하였다. 1 ㎍의 각 샘플을 NuPage 4-12% 비스-트리스(Bis-Tris) 겔(인비트로겐 카탈로그 번호 NP0322BOX)에 로딩하고 30분 동안 200 V에서 진행시켰다. 마커는 바이오-라드 프리시젼 플러스(Bio-Rad Precision Plus)(카탈로그 번호 161-073)였다. 중쇄 및 경쇄의 예측된 크기에 상응하는 밴드가 어떠한 레인에서도 어떠한 오염의 증거도 없이 관찰되었다(데이터를 예시하지 않음).
ELISA 법
엔도글린에 대한 인간화 및 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 결합을 분석하기 위하여 ELISA를 이용하였다. 간략하게는, ELISA를 하기 단계에 따라 수행하였다:
1. PBS, 100 ㎕/웰 내의 1500 ng/ml의 MAB9811-01(다클론 항-엔도글린 항체)로 넝크 맥시소르프(Nunc Maxisorp) 플레이트를 코팅하였다. 플레이트를 실러로 덮고 4℃에서 하룻밤(16-24 시간) 인큐베이션하였다.
2. 플레이트를 200 ㎕의 PBS(트윈 없음)로 2회 세척하였다.
3. 200 ㎕/웰의 BSA 차단 용액(% BSA)을 첨가하고 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다.
4. 바이오텍(BioTek) 플레이트 세척기를 이용하여 트윈을 함유한 PBS(PBS-T)로 플레이트를 3회 세척한다.
5. 0.1% BSA를 포함하는 PBS-T 중의 100 ng/ml의 CD105(알앤디 시스템즈(R&D Systems) 카탈로그 1097-EN)를 100 ㎕/웰 첨가하고 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다.
6. 바이오텍 플레이트 세척기를 이용하여 PBS-T로 플레이트를 3회 세척하였다.
7. 테스트 웰에 20, 10, 4,2, 1, 0.5 및 0.2 ng/ml(0.1% BSA를 포함하는 PBS-T에 희석시킴)의 항-엔도글린 항체 100 ㎕/웰을 첨가하고 실온에서 60분 인큐베이션하였다. 음성 대조군 웰에 100 ㎕/웰의 이소타입 매칭 대조군 항체를 첨가하였다.
8. 바이오텍 플레이트 세척기를 이용하여 PBS-T로 플레이트를 3회 세척하였다.
9. 모든 웰에 0.1% BSA를 포함하는 PBS-T에 1:10000으로 희석시킨, HRPDP 컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG(잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)) 100 ㎕/웰을 첨가하고, 실온에서 30-60분 인큐베이션하였다.
10. 바이오텍 플레이트 세척기를 이용하여 PBS-T로 플레이트를 5회 세척하였다.
11. TMB 기질 용액 100 ㎕/웰을 첨가하고 15분 동안 암실에서 덮지 않고 인큐베이션하였다.
12. TMB 정지 용액 100 ㎕/웰을 첨가하여 반응을 정지시켰다.
경쟁 ELISA
샘플은 삼중으로 실행하며 광학 밀도를 판독하여 표준 곡선을 구성하여 결합 상수를 결정하였다. 통계 분석은 스튜던트 t-검정 또는 또 다른 표준 검정을 이용하여 행하였다.
바이오티닐화 키메라 항-CD105에 대한 CD105에의 결합에 대해 경쟁 ELISA에서 항체를 테스트하였다. 간략하게는, 키메라 항-CD105를 제조업자의 설명서에 따라 마이크로바이오티닐화 키트(시그마(Simga), 카탈로그 번호 BTAG-1KT)를 이용하여 바이오티닐화하였다. 넝크 이뮤노 맥시소르프 96웰 평탄-바닥 미세적정 플레이트를 4℃에서 하룻밤 인산염 완충 염수(PBS) 중의 1.5 ㎍/mL의 마우스 항-인간 CD105(서던 바이오테크놀로지스(Southern Biotechnologies), 카탈로그 번호 9811-01)로 코팅하였다. 다음날, PBS/2% BSA 중의 100 ng/ml 인간 CD105(알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 1097-EN)를 사전코팅된 플레이트에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 변화하는 농도의 키메라, 인간화 또는 인간화/탈면역화 항-CD105 항체(3배 희석물 중 4 ㎍/mL 내지 0.0018 ㎍/mL)를 고정된 농도의 바이오티닐화 키메라 항-CD105 항체(6.25 ng/ml)와 혼합하였으며 플레이트에 첨가하였다. 바이오티닐화 키메라 항체의 결합은 스트렙타비딘-HRP(시그마, 카탈로그 번호 S5512)와 TMB 기질(시그마, 카탈로그 번호 T0440)을 통해 검출하였다. OD450 nm 값을 다이넥스(Dynex) MRX TCII 플레이트 판독기에서 측정하였다. 경쟁 분석의 결과는 도 7과 도 8에 예시된다. 곡선은 로그 샘플 농도에 대한 흡광도의 그래프의 각각의 직선 부분을 통해 피팅시켰으며 선의 식을 이용하여 CD105에의 바이오티닐화 키메라 항체 결합을 50%만큼 억제하는 데 필요한 인간화 또는 인간화/탈면역화 항체의 농도를 계산하였다(IC50). 실험내 그리고 실험간의 비교를 허용하기 위하여, 인간화 또는 인간화/탈면역화 변이체의 IC50 값을 배수 차이를 위한 값을 제공하기 위해 각 플레이트에 포함된 기준 항체에 대해 정규화하였다. IC50 값은 키메라 항-CD105에 대해 상대적이며 3회 실험을 나타낸다. 요약 ELISA 데이터가 표 1에 제시되며 이는 포화 정적 배양에서 분석된 항체 발현 수준(㎍/ml)을 포함한다.
Figure pct00003
실시예 2
인간화 및 인간화/ 탈면역화 항- 엔도글린 항체 결합의 BIAcore(표면 플라스몬 공명: SPR ) 분석
항체의 친화성은 예를 들어, 표준 프로토콜을 이용하여 BIAcore 분석을 이용하여 평가할 수 있다. 간략하게는, 단백질 A를 BIAcore CM5 칩에 화학적으로 커플링시키며, 고정된 단백질 A의 양은 대략 2000 RU에 상응한다. 후속 단계는 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 트윈, pH = 7.4의 진행 완충액에서, 10 Hz 데이터 수집 속도를 이용하여 25℃에서 수행한다. 항-엔도글린 항체(10 nM)는 BIAcore 칩 상의 고정된 단백질 A에 의해 10 ㎕/분 유속에서 포획되며, 전형적으로, 20, 40 및 80초의 포획 시간은 각각 130 RU, 330 RU, 및 570 RU에 상응하는 항체 밀도의 포획을 허용한다. 시작 사이클은 40 ㎕/분의 유속, 90초의 접촉 시간, 및 90초의 해리 시간에서 진행 완충액을 이용하여 수행한다. 샘플 사이클은 0 내지 40 nM 범위의 농도에서 재조합 엔도글린을 이용하여 수행한다. 엔도글린을 525초의 접촉 시간과 2500초의 해리 시간으로 40 ㎕/분의 유속으로 포획된 항체를 함유한 BIAcore 칩에 통과시킨다. 8회의 샘플 사이클을 전형적으로 각 항체 포획 밀도에서 수행한다. 칩의 재생은 10 mM 글리신 pH = 1.7을 이용하여 성취한다. 데이터 분석은 BIAcore T100 평가 소프트웨어 v1.1을 이용하여 수행한다. 상이한 포획 항체 밀도를 가진 BIAcore 칩을 이용하여 생성된 신호를 비교하고 재조합 엔도글린의 부재하에서 생성된 데이터를 이용하여 분석내 블랭크 신호에 대해 조정한다. 데이터의 피팅을 위하여, Rmax를 각 사이클 내의 각 항체의 포획 수준에서의 변화를 설명하도록 플로팅한다. 각 포획 밀도로부터의 데이터를 각 항체의 분석 동안 동시에 피팅한다. BIAcore 데이터는 ka(1/Ms), kd(1/s), KD(M) 및 Chi2(RU2)를 비롯한, 키메라, 인간화 및 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체에 대해 표 2에 제시되어 있다.
Figure pct00004
실시예 3
항체 친화력 및 엔도글린 발현 세포 상의 이용가능한 에피토프의 수
항체 친화력 및 엔도글린 발현 세포 상의 이용가능한 에피토프의 수는 표준 프로토콜을 이용하여 스캐차드 플롯 분석을 이용하여 평가할 수 있다.
간략하게는, 엔도글린-발현 KM-3 백혈구 세포 및 서브컨플루언트 증식 HUVEC에의 방사성 표지된 인간화 항-엔도글린 항체의 직접적 결합의 스캐차드 플롯 분석을 실시한다. 정제된 항-엔도글린 항체는 요오도-젠(Iodo-Gen)을 이용하여 당업자에게 알려진 표준 방법에 따라 125I로 개별적으로 방사성 표지한다. 방사성 표지된 인간화 항-엔도글린 항체를 IgG 분자당 요오드 원자의 평균 수에 대해 분석한다. 적정 실험은 항원 결합 활성을 결정하기 위하여 고정된 양(0.1 ㎍)의 각각의 125I-표지 mAb 및 2배 연속 증분의 엔도글린 발현 HUVEC 세포를 이용하여 실시한다. 결합 데이터의 스캐차드 플롯의 분석은 공지된 방법에 따라 실시한다. 평형 상수 및 mAb 결합/세포의 최대 평균 수는 이 분석에 의해 추정한다.
실시예 4
항- 엔도글린 항체 활성에 대한 웨스턴 블롯 분석
인간화 항-엔도글린 항체가 CD105를 발현하는 증식 내피 세포에서 세포내 신호전달을 변경하는 능력은 웨스턴 블롯을 통해 분석하여 CD105 신호전달 경로에 관련된 단백질의 인산화를 검출할 수 있다.
웨스턴 블롯 분석을 실시하여 비형질감염 내피 세포에서 공지된 웨스턴 블롯팅 기술에 따라 인산화 Smad1/5/8 또는 Smad2/3을 확인한다. 인산화된 Smad1, Smad2, Smad5, Id1(산타 크루즈(Santa Cruz)) 및 엔도글린에 대한 일차 항체를 이용하여 샘플 내의 분자를 검출한다. 검출은 향상된 화학발광(ECL)에 의해 수행한다.
실시예 5
HUVEC 성장의 억제 및 3 H- 티미딘 혼입 분석
세포 성장의 억제를 평가하기 위해 많은 분석이 이용가능하다.
하나의 예에서는, HUVEC 세포주 E6/E7 P3-17을 5% 소 태아 혈청을 함유한 보충제(론자-클로네틱스(Lonza-Clonetics))를 가진 EBM2 배지에서 배양하였다. 세포를 서브컨플루언트 조건하에서 37℃의 CO2 인큐베이터에서 75 cm2 플라스크(팔콘(Falcon), 벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)에서 배양하였다. 25 mM HEPES 완충액, pH = 7.3 중의 15 mM EDTA를 가진 행크 균형 염 용액(Hank's balanced salt solution)과 함께 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 세포를 탈착시킨다. 빙냉 PBS로 2회 세척한 후, 세포를 25,000개의 세포/mL의 농도로 내피 세포 성장 배지에 재현탁시킨다. 추가 실험에서는, 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 현탁시키고 FBS와 소 뇌 추출물이 없는 내피 세포 성장 배지에서 배양한다. 2,500개 세포를 함유한 세포 현탁액 200 ㎕ 분액을 96웰 배양 플레이트의 각 웰에 접종한다. 세포를 하룻밤 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양한 후 100 ㎍/mL의 인간화 항-엔도글린 항체 VK1AAVH1A2 또는, 대조군 IgG 또는 PBS를 삼중으로 첨가한다. 배양 플레이트를 72시간 동안 인큐베이터에서 유지하며, 그 동안 새로운 배지와 인간화 항-엔도글린 항체, 대조군 IgG 또는 PBS를 24시간마다 교체한다. 3H-티미딘(1 μCi)을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 20시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 PBS로 세척한 후 37℃에서 15분 동안 100 ㎕/웰의 트립신-EDTA(0.05% 트립신, 0.53 mM EDTA)로 처리한다. 하베스터(Harvester) 96(미국 코네티컷주 햄덴 소재의 톰텍(TOMTEC))을 이용하여 세포를 유리 섬유 필터 상에 수집하고(월락 프린티드 필터매트에이(Wallac Printed FiltermatA) 3H-방사능을 트리룩스(Trilux) 1540 마이크로베타 액체 신틸레이션 및 발광 카운터(MicroBeta Liquid Scintillation and Luminescence Counter)(월락 , 핀란드 투르쿠)에서 측정한다. 두 번째 예에서, 이용한 세포는 HUVEC 세포의 일차 배양물, HUVEC 2517C였으며, 인간화 TRC105 항체는 HUVEC 세포주 E6/E7 및 단일 공여체로부터 유래된 일차 HUVEC 배양물, HUVEC 2517C의 성장을, 항체 대조군 및 PBS와 비교하여, 억제하였다(표 3).
Figure pct00005
실시예 6
항- 엔도글린 항체에 의한 세포 이동의 억제 분석
세포 증식 및 활성화의 척도로서 이동(화학운동성)을 보이덴(Boyden) 챔버를 이용하여 측정한다.
간략하게는, 세포 이동은 다음과 같이 평가한다: 코스타(Costar) 뉴클레오포어(nucleopore) 필터(8 mm 기공)를 하룻밤 4℃에서 피브로넥틴으로 코팅한다. 챔버를 인산염 완충 염수(PBS)로 세척하고 하부 챔버를 혈청이 있거나 없으며 TGF-P3이 있거나 없는 DMEM으로 충전하였다. 세포를 트립신처리하고 항-엔도글린 항체를 포함하는 DMEM 중에 50,000개의 세포/ml의 최종 농도로 현탁시킨다. 세포 현탁액의 150 ㎕ 분액을 상부 챔버에 첨가하고 37℃에서 인큐베이션한다. 16시간 후, 세포를 세척하고 상부 표면을 닦아내어 비이동 세포를 제거한다. 막을 메탄올에서 고정시키고, 물로 세척하고, 염색하고, 하부 표면 상에 존재하는 세포의 수를 계수한다.
실시예 7
인간화/ 탈면역화 항- 엔도글린 항체에 대한 ADCC 분석
본원에 개시된 항-엔도글린 항체는 IL-2 활성화 자연 살해(NK) 세포에 결합하는 그들의 능력 및 HUVEC의 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 유도하는 능력에 관하여, 예를 들어, 하기 프로토콜을 이용하여 평가할 수 있다.
NK 단리 및 IL -2 활성화 NK 세포의 생성
PBMC를 단리하고 24시간 동안 10% FBS를 포함하는 RPMI에서 4℃에서 둔다.
그 후 PBMC를 2% FBS를 포함하는 RPMI(총 부피 = 50 mL)에 두고, 1O mL의 세포 현탁액을 페트리디쉬에 도말한다. PBMC를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고 비부착 세포를 수집한다. NK 세포를 48시간 동안 1000 U/mL IL-2와 함께 8 x 106/mL로 인큐베이션한 후, 5-8일 동안 정상 배양한 후 ADCC 분석에 사용한다.
세포독성 및 ADCC 분석
NK 세포를 배양물로부터 긁어내고 50 mL 코니칼 튜브내에 수집한다. 세포를 RPMI 완전 배지로 한 번 세척하고 10분 동안 1200 rpm에서 회전시킨다. 그 후 NK 세포를 5 mL RPMI 완전 배지에서 재현탁시키고 계수한다. 분석을 실시하기 전에, NK 세포 카운트를 10:1의 이펙터:표적 비에 대해 정규화한다. 정규화된 NK 세포를 도말하고 10 ㎕의 항-엔도글린 항체를 지정된 웰에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 대조군 샘플은 미처리 또는 대조군 항체 처리 세포 집단을 포함한다. 모든 샘플과 대조군은 오중으로 테스트한다.
관심있는 표적 세포를 수집하고(HUVEC 세포), 세척하고, 10분 동안 1200 rpm에서 회전시키고, 5 mL RPMI 완전 배지에 재현탁시킨다. 표적 세포를 다시 세척하고 무혈청 RPMI에서 1 X 106개의 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시킨다. 이어서 표적 세포를 5 ㎍/mL 칼세인(Calcein) AM의 최종 농도로 1시간 동안 37℃에서 표지한 후, RPMI 완전 배지로 2회 세척하였다. 이어서 표적 세포를 재현탁하고 NK 세포 웰에 첨가한다. 표적 세포/NK 세포 조합을 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 플레이트를 5분 동안 1200 rpm에서 회전시키고 세포를 세척하고 DPBS에 재현탁시킨다. 450/530 nm의 여기/방출을 이용하여 형광을 판독하며 방출은 항체에 의해 매개된 세포 사멸의 척도이다. 평균 형광 강도 및 표준 편차를 계산하여 다음 식에 따라 %ADCC를 계산한다:
% ADCC = 100% * [(f샘플-f배지)-(f이소타입 대조군- f트리톤)],
여기서,
f샘플 = 항-엔도글린 항체를 함유한 웰에서의 평균 형광
f배지 = 항체를 포함하지 않는 배지를 함유한 웰에서의 평균 형광
f이소타입 대조군 = 이소타입 대조군 IgG를 함유한 웰에서의 평균 형광
f트리톤 = (표적 세포를 용해하기 위하여) 트리톤 세제를 함유한 웰에서의 평균 형광
인간화/탈면역화 항체 VK1AAVH1A2는 이소타입 대조군 항체보다 상당히 큰, HUVEC의 용량 의존적 ADCC를 입증하였다(표 4a 및 4b). 표 4a와 4b에 요약된 실험은 별도의 공여체로부터의 NK 세포를 이용하여 실시하였음을 주목한다.
Figure pct00006
실시예 8
맥락막 신혈관형성의 쥐과 모델에 대한 인간화/ 탈면역화 항- 엔도글린 항체의 영향
인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 효과를 맥락막 신혈관형성의 쥐과 모델에서 평가할 수 있다.
간략하게는, 4 내지 5주령의 C57BL/6 마우스를 케타민 염산염(100 mg/kg)으로 마취시키고 1% 트로피카미드(알콘 래보러토리즈, 인코포레이티드(Alcon Laboratories, Inc), 미국 텍사수즈 포트워스)로 동공을 확장시킨다. 광응고기의 슬릿 램프 전달 시스템(오큐라이트(OcuLight); 이리덱스(Iridex), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰) 및 콘택트렌즈로서의 핸드헬드(handheld) 커버슬립을 이용하여 532 nm 다이오드 레이저 광응고(75 pm의 스팟 크기, 01초의 기간, 120 mW)의 3회 화상을 각 망막에 전달한다. 화상은 망막의 후극부의 9, 12 및 3시 위치에서 수행한다. 브루크 막의 파열을 나타내는, 레이저 조사시의 버블 생성은 맥락막 신혈관형성(CNV)을 수득하는 데 있어서 중요한 인자이며; 따라서 버블이 생성되는 화상만을 연구에 포함시킨다.
4회의 독립적인 실험을 수행하여 브루크 막의 파열 후 0일에 안내 주사의 효과를 조사한다. 1군의 마우스에게 1 ㎕의 PBS 중의 약 0.5 내지 약 5 ㎍의 항-엔도글린 항체 또는 항원 결합 단편의 안내 주사를 한 눈에 그리고 1 ㎕의 PBS의 안내 주사를 옆 눈에 제공한다. 2군 마우스에게는 1 ㎕의 PBS 중의 약 1.5 내지 약 10 ㎍의 항-엔도글린 항체 또는 항원 결합 단편의 안내 주사를 한 눈에 그리고 1 ㎕의 PBS의 안내 주사를 옆 눈에 제공한다. 3군 마우스에게는 약 5 내지 약 25 ㎍의 항-엔도글린 항체 또는 항원 결합 단편의 안내 주사를 한 눈에 그리고 1 ㎕의 PBS의 안내 주사를 옆 눈에 제공한다. 4군은 두 눈 모두에 PBS를 제공한다.
14일 후, 마우스를 마취시키고 플루오레세인 표지된 덱스트란(2 x 106의 평균 분자량, 시그마-알드리치)을 관류시키고 맥락막의 평탄 마운트를 준비한다. 간략하게는, 눈을 제거하고, 1시간 동안 10% 인산염 완충 포르말린에서 고정하고, 각막과 수정체를 제거한다. 전체 망막을 조심스럽게 안배로부터 잘라내고, 안배의 가장자리로부터 모든 4 사분면 내의 적도까지 반지름 절단을 만들고, 망막을 수성 마운팅 매질(아쿠아마운트(Aquamount); 비디에이치(BDH), 영국 풀)내에 평탄하게 마운팅한다. 평탄 마운트(Flat mount)를 형광 현미경(악시오스코프(Axioskop); 칼 자이스 메디텍(Carl Zeiss Meditec), 미국 뉴욕주 톤우드)으로 검사하고, 3 전하 결합 소자(three charge-coupled device, CCD) 컬러 비디오카메라(1K-TU40A, 도시바(Toshiba), 일본 도쿄)를 이용하여 이미지를 디지털화한다. 프레임 그래버(Frame grabber) 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 각각의 CNV 병변의 면적을 측정한다. 통계 분석은 다수의 비교를 위하여 던넷트 교정(Dunnett's correction)을 이용한 ANOVA를 이용하여 행한다.
실시예 9
SCID 마우스 내로 그래프팅된 인간 피부에서의 사전형성된 인간 유방암 종양의 항-혈관신생 치료법
본원에 개시된 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 효과는 SCID 마우스 내로 그래프팅된 인간 피부에서 성장한 사전형성된 인간 유방암 종양에 대한 그들의 항-혈관신생 영향에 관하여 평가할 수 있다.
간략하게는, 이식편이 염증, 수축 또는 거부 징후를 전혀 나타내지 않았을 때 SCID 마우스 내로 그래프팅된 인간 전체 두께 피부 내로 F-7 세포(0.1 ml PBS 중에 8x106개의 세포)를 피내 이식한다. 특유한 감지할 수 있는 종양(대부분의 경우에 직경이 3 내지 6 mm)이 나타날 때까지 마우스를 처리하지 않고 둔다. 특유한 종양을 가진 마우스를 치료 연구를 위해 군으로 나눈다. 인간화/탈면역화 항-엔도글린 단클론 항체(mAb) 및 이소타입 매치된 대조군 IgG를 마우스 혈청 알부민(0.05% 최종 농도)을 함유한 살균 PBS로 희석한다. 항체 요법에 있어서, 1 내지 20 mg/kg의 항-엔도글린 항체 또는 대조군 IgG를 마우스의 꼬리 정맥을 통해 정맥내로(i.v.) 투여한다. 투여는 2 내지 3일마다 주어진다.
처리 동안, 마우스를 종양 크기와 이환율에 대해 매일 모니터링한다. 마우스는 전자 저울(오하우스(OHAUS)TM 모델 GT210)을 이용하여 1주일에 2회 칭량한다. 종양 크기는 옵토데모(OptoDemo)TM 소프트웨어(파울러 컴퍼니(Fowler Co.))를 이용하여 컴퓨터에 연결된 전자 캘리퍼스(프로-맥스(PRO-MAX) 6인치 캘리퍼스; 파울러 컴퍼니, 미국 매사추세츠주 뉴튼)를 이용하여 1주일에 3회 측정한다. 측정된 종양 직경을 다음 식을 이용하여 종양 부피로 환산한다: V=길이 x 폭 x 높이 x pi/6. 상이한 마우스군의 비교를 위한 데이터의 통계 분석은 스튜던트 t-검정을 이용하여 실시한다.
실시예 10
난소암의 마우스 모델
인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 난소암을 치료하는 능력을 결정하기 위하여, 난소암 세포주를 SCID 또는 누드 마우스에서 이용할 수 있다.
간략하게는, 난소암 세포를 SCID 또는 누드 마우스 내로 임플란트하여 난소 종양을 생성한다. 확립된 종양을 보유한 마우스군을 증가하는 용량(체중 1 kg당 1.8 mg에서 시작함)의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 또는 대조군 IgG의 i.v. 투여에 의해 처리한다. 처리는 1주일에 2 또는 3회 수행한다. VEGF 억제제 및/또는 다른 항암제를 일부 군 또는 모든 군에서 사용할 수 있다. 마우스를 모니터링하고 종양 성장을 1주일에 2 또는 3회 측정한다.
실시예 11
결장직장암의 마우스 모델
인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 결장직장암을 치료하는 능력을 결정하기 위하여, 결장직장암 세포주를 SCID, 누드 또는 면역적격 마우스에서 이용할 수 있다.
간략하게는, 결장직장암 세포를 SCID, 누드 또는 면역적격 마우스 내로 임플란트하여 결장직장 종양을 생성한다. 확립된 종양을 보유한 마우스 군을 증가하는 용량(체중 1 kg당 1.8 mg에서 시작함)의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 또는 대조군 IgG의 i.v. 투여에 의해 처리한다. 처리는 1주일에 2 또는 3회 수행한다. VEGF 억제제 및/또는 다른 항암제를 일부 군 또는 모든 군에서 사용할 수 있다. 마우스를 모니터링하고 종양 성장을 1주일에 2 또는 3회 측정한다. 종양은 PET 및 초음파를 비롯한 표준 이미징 테스트에 의해 이미징할 수 있다. 처리된 종양은 면역조직화학에 의해 세포내 신호전달 경로 또는 혈관질을 평가하기 위해 외식할 수 있다.
실시예 12
신장암의 마우스 모델
인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 신장암을 치료하는 능력을 결정하기 위하여, 신장암 세포주를 SCID 또는 누드 마우스에서 이용할 수 있다.
간략하게는, 신장암 세포를 SCID, 또는 누드 마우스 내로 임플란트하여 신장 종양을 생성한다. 확립된 종양을 보유한 마우스 군을 증가하는 용량(체중 1 kg당 1.8 ㎍에서 시작함)의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 또는 대조군 IgG의 i.v. 투여에 의해 처리한다. 처리는 처음 3회 주사의 경우 3일 간격으로 그리고 네 번째 주사의 경우 7일 간격으로 수행한다. VEGF 억제제 및/또는 다른 항암제를 일부 군 또는 모든 군에서 사용할 수 있다. 마우스를 모니터링하고 종양 성장을 주 단위로 동물의 희생을 통해 측정한다.
실시예 13
골수종의 마우스 모델
인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 골수종을 치료하는 능력을 결정하기 위하여, 골수종 세포주를 SCID 또는 누드 마우스에서 이용한다.
간략하게는, 골수종 암세포를 SCID, 또는 누드 마우스 내로 임플란트하여 골수종 종양을 생성한다. 확립된 종양을 보유한 마우스 군을 증가하는 용량(체중 1 kg당 1.8 mg에서 시작함)의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 또는 대조군 IgG의 i.v. 투여에 의해 처리한다. 처리는 1주일에 2 또는 3회 실시한다. VEGF 억제제 및/또는 다른 항암제를 일부 군 또는 모든 군에서 사용할 수 있다. 마우스를 모니터링하고 종양 성장을 주마다 2 또는 3회 측정한다.
실시예 14
육종의 마우스 모델
인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 육종을 치료하는 능력을 결정하기 위하여, 육종 세포주를 SCID 또는 누드 마우스에서 이용한다.
간략하게는, 육종 암세포를 SCID, 또는 누드 마우스 내로 임플란트하여 육종 종양을 생성한다. 확립된 종양을 보유한 마우스 군을 증가하는 용량(체중 1 kg당 1.8 mg에서 시작함)의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 또는 대조군 IgG의 i.v. 투여에 의해 처리한다. 처리는 1주일에 2 또는 3회 수행한다. VEGF 억제제 및/또는 다른 항암제를 일부 군 또는 모든 군에서 사용할 수 있다. 마우스를 모니터링하고 종양 성장을 주마다 2 또는 3회 측정한다.
실시예 15
유방암의 마우스 모델
인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 유방암을 치료하는 능력을 결정하기 위하여, 유방암 세포주를 SCID 또는 누드 마우스에서 이용한다.
간략하게는, 유방암 세포를 SCID, 또는 누드 마우스 내로 임플란트하여 유방 종양을 생성한다. 확립된 종양을 보유한 마우스 군을 증가하는 용량(체중 1kg당 1.8 mg에서 시작함)의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 i.v. 투여에 의해 처리한다. 대조군 동물에 대조군 IgG를 투여한다. 처리는 1주일에 2 또는 3회 실시한다. VEGF 억제제 및/또는 다른 항암제를 일부 군 또는 모든 군에서 사용할 수 있다. 마우스를 모니터링하고 종양 성장을 주마다 2 또는 3회 측정한다.
실시예 16
결장직장암에 대한 병용 요법의 임상 시험
본 실시예는 결장직장암을 가진 환자에서 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 안전성과 효능의 예비 평가를 제공하기 위하여 디자인된 무작위, 맹검, 위약 대조, 다중센터, 2상 연구를 설명한다. 대략 약 100 내지 약 800명의 환자를 등록시키며, 약 50 내지 약 400명의 환자는 처리군에 할당하고 약 50 내지 약 400명의 환자는 위약군에 할당한다. 시험은 6-10 사이클 동안 1주, 2주 또는 3주마다 약 0.1 내지 약 20 mg/kg의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 정맥내 반복 용량 또는 위약의 투여로 이루어진다. VEGF 억제제 및/또는 다른 항암제를 모든 군에 사용할 수 있다. 연구의 시간틀은 약 6개월 내지 약 5년으로 추정되며, 초기 연구의 마지막에 나타낸 바와 같이 반응자들에 대한 요법을 계속한다. 추가의 결과 척도는 다음과 같다:
일차 결과 척도: 전체 반응율. 연구의 한 가지 목표는 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체에서 무진행 생존율이 35%만큼 증가하는 것을 입증하는 것이다.
평가할 수 있는 이차 결과 척도는 전체 반응율, 반응 기간, 전체 생존율, 심각한 및 심각하지 않은 부작용을 포함한다. 예를 들어, 처리는 질환의 진행을 방지할 수 있거나(즉, 정지) 또는 개선할 수 있다. 다르게는, 또는 추가로, 다른 목표는 다음 중 하나 이상에 대해 측정할 수 있다: 종양 부하량 감소, 혈관질 감소, 부작용 감소, 역반응 감소, 및/또는 환자의 순응도의 증가.
실시예 17
골수종에 대한 병용 요법의 임상 시험
본 실시예는 골수종을 가진 환자에서 보르테조밉과 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 조합의 안전성과 효능의 예비 평가를 제공하기 위하여 디자인된 무작위, 맹검, 위약 대조, 다중센터, 2상 연구를 설명한다. 대략 약 100 내지 약 800명의 환자를 등록시키며, 약 50 내지 약 400명의 환자는 처리군에 할당하고 약 50 내지 약 400명의 환자는 위약군에 할당한다. 시험은 매주 약 1.3 mg/kg의 보르테조밉과 조합된, 1주, 2주 또는 3주마다 약 1 내지 약 20 mg/kg의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 정맥내 반복 용량 또는 위약의 투여로 이루어진다. 연구의 시간틀은 약 6개월 내지 약 5년으로 추정되며, 초기 연구의 마지막에 나타낸 바와 같이 반응자들에 대한 요법을 계속한다. 추가의 결과 척도는 다음과 같다:
일차 결과 척도: 전체 반응율. 연구의 한 가지 목표는 보르테조밉과 위약에서의 약 40%로부터 보르테조밉과 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체에서의 약 60%로 전체 반응률이 증가하는 것을 입증하는 것이다.
평가할 수 있는 이차 결과 척도는 반응 기간, 무진행 생존율, 전체 생존율, 심각한 및 심각하지 않은 부작용을 포함한다. 예를 들어, 처리는 질환의 진행을 방지할 수 있거나(즉, 정지) 또는 개선시킬 수 있다. 다르게는, 또는 추가로, 다른 목표는 다음 중 하나 이상에 대해 측정할 수 있다: 종양 부하량 감소, 혈관질 감소, 부작용 감소, 역반응 감소, 및/또는 환자의 순응도의 증가.
실시예 18
신장암에 대한 병용 요법의 임상 시험
본 실시예는 신장 세포 암(신장암)을 가진 환자에서 수니티닙(수텐트®)과 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 조합의 안전성과 효능의 예비 평가를 제공하기 위하여 디자인된 무작위, 맹검, 위약 대조, 다중센터, 2상 연구를 설명한다. 대략 약 100 내지 약 800명의 환자를 등록시키며, 약 50 내지 약 400명의 환자는 처리군에 할당하고 약 50 내지 약 400명의 환자는 위약군에 할당한다. 시험은 4주 투여 사이클을 반복하기 전에 2주간 중단하여, 4주 동안 매일 투여되는 약 5 내지 약 50 mg의 수니티닙과 조합된, 1주, 2주 또는 3주 마다 약 0.1 내지 약 20 mg/kg의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 정맥내 반복 용량 또는 위약의 투여로 이루어진다. 연구의 시간틀은 약 6개월 내지 약 5년으로 추정되며, 초기 연구의 마지막에 나타낸 바와 같이 반응자들에 대한 요법을 계속한다. 추가의 결과 척도는 다음과 같다:
일차 결과 척도: 무진행 생존율. 연구의 한 가지 목표는 수니티닙과 위약 부문에서의 약 9 내지 13개월로부터 수니티닙과 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 부문에서의 약 14 내지 18개월(또는 그 이상)로 무진행 생존율이 증가하는 것을 입증하는 것이다.
평가할 수 있는 이차 결과 척도는 반응률, 반응 기간, 종양 진행까지의 시간, 전체 생존율, 심각한 및 심각하지 않은 부작용을 포함한다. 예를 들어, 처리는 질환의 진행을 방지할 수 있거나(즉, 정지) 또는 개선시킬 수 있다. 다르게는, 또는 추가로, 다른 목표는 다음 중 하나 이상에 대해 측정할 수 있다: 종양 부하량 감소, 혈관질 감소, 부작용 감소, 역반응 감소, 및/또는 환자의 순응도의 증가.
실시예 19
간세포암에 대한 병용 요법의 임상 시험
본 실시예는 간세포암(간암)을 가진 환자에서 소라페닙(넥사바르®)과 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 조합의 안전성과 효능의 예비 평가를 제공하기 위하여 디자인된 무작위, 맹검, 위약 대조, 다중센터, 2상 연구를 설명한다. 대략 약 100 내지 약 800명의 환자를 등록시키며, 약 50 내지 약 400명의 환자는 처리군에 할당하고 약 50 내지 약 400명의 환자는 위약군에 할당한다. 시험은 3-6 사이클동안 또는 진행할 때까지 매일 약 400 mg의 소라페닙과 조합된, 1주, 2주 또는 3주 마다 약 0.1 내지 약 20 mg/kg의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 정맥내 반복 용량 또는 위약의 투여로 이루어진다. 연구의 시간틀은 약 6개월 내지 약 5년으로 추정되며, 초기 연구의 마지막에 나타낸 바와 같이 반응자들에 대한 요법을 계속한다. 추가의 결과 척도는 다음과 같다:
일차 결과 척도: 무진행 생존율. 연구의 한 가지 목표는 소라페닙과 위약 부문에서의 약 3 내지 9개월로부터 소라페닙과 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 부문에서의 약 6 내지 12개월(또는 그 이상)로 무진행 생존율이 증가하는 것을 입증하는 것이다.
평가할 수 있는 이차 결과 척도는 반응 기간, 종양 진행까지의 시간, 전체 생존율, 심각한 및 심각하지 않은 부작용을 포함한다. 예를 들어, 처리는 질환의 진행을 방지할 수 있거나(즉, 정지) 또는 개선시킬 수 있다. 다르게는, 또는 추가로, 다른 목표는 다음 중 하나 이상에 대해 측정할 수 있다: 종양 부하량 감소, 혈관질 감소, 부작용 감소, 역반응 감소, 및/또는 환자의 순응도의 증가.
실시예 20
신장암에 대한 병용 요법의 임상 시험
본 실시예는 신장 세포암(신장암)을 가진 환자에서 베바시주맙(아바스틴®)과 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 조합의 안전성과 효능의 예비 평가를 제공하기 위하여 디자인된 무작위, 맹검, 위약 대조, 다중센터, 2상 연구를 설명한다. 대략 약 100 내지 약 800명의 환자를 등록시키며, 약 50 내지 약 400명의 환자는 처리군에 할당하고 약 50 내지 약 400명의 환자는 위약군에 할당한다. 시험은 2주마다 정맥내로 투여된 약 7.5, 약 10, 또는 약 15 mg/kg의 베바시주맙과 조합된, 1주, 2주 또는 3주 마다 약 0.1 내지 약 20 mg/kg의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 정맥내 반복 용량 또는 위약의 투여로 이루어진다. 연구의 시간틀은 약 6개월 내지 약 5년으로 추정되며, 초기 연구의 마지막에 나타낸 바와 같이 양성 반응자들에 대해 요법을 계속한다. 추가의 결과 척도는 다음과 같다:
일차 결과 척도: 무진행 생존율. 연구의 한 가지 목표는 베바시주맙과 위약 부문에서의 약 8 내지 12개월로부터 베바시주맙과 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 부문에서의 약 13 내지 18개월(또는 그 이상)로 무진행 생존율이 증가하는 것을 입증하는 것이다.
평가할 수 있는 이차 결과 척도는 전체 반응율, 반응 기간, 종양 진행까지의 시간, 전체 생존율, 심각한 및 심각하지 않은 부작용을 포함한다. 예를 들어, 처리는 질환의 진행을 방지할 수 있거나(즉, 정지) 또는 개선시킬 수 있다. 다르게는, 또는 추가로, 다른 목표는 다음 중 하나 이상에 대해 측정할 수 있다: 종양 부하량 감소, 혈관질 감소, 부작용 감소, 역반응 감소, 및/또는 환자의 순응도의 증가.
실시예 21
난소암에 대한 병용 요법의 임상 시험
본 실시예는 난소암을 가진 환자에서 독실(Doxil)®과 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 조합의 안전성과 효능의 예비 평가를 제공하기 위하여 디자인된 무작위, 맹검, 위약 대조, 다중센터, 2상 연구를 설명한다. 대략 약 100 내지 약 800명의 환자를 등록시키며, 약 50 내지 약 400명의 환자는 처리군에 할당하고 약 50 내지 약 400명의 환자는 위약군에 할당한다. 시험은 4주마다 한번 투여되는 약 5 내지 약 50 mg/m2의 독실과 조합된, 1주, 2주 또는 4주 마다 약 0.1 내지 약 20 mg/kg의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 정맥내 반복 용량 또는 위약의 투여로 이루어진다. 연구의 시간틀은 약 6개월 내지 약 5년으로 추정되며, 초기 연구의 마지막에 나타낸 바와 같이 반응자들에 대해 요법을 계속한다. 추가의 결과 척도는 다음과 같다:
일차 결과 척도: 무진행 생존율. 연구의 한 가지 목표는 독실®과 위약 부문에서의 약 3 내지 6개월로부터 독실®과 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 부문에서의 약 4 내지 12개월(또는 그 이상)로 무진행 생존율이 증가하는 것을 입증하는 것이다.
평가할 수 있는 이차 결과 척도는 반응 기간, 종양 진행까지의 시간, 전체 생존율, 심각한 및 심각하지 않은 부작용을 포함한다. 예를 들어, 처리는 질환의 진행을 방지할 수 있거나(즉, 정지) 또는 개선시킬 수 있다. 다르게는, 또는 추가로, 다른 목표는 다음 중 하나 이상에 대해 측정할 수 있다: 종양 부하량 감소, 혈관질 감소, 부작용 감소, 역반응 감소, 및/또는 환자의 순응도의 증가.
실시예 22
난소암에 대한 백금 기반 병용 요법의 임상 시험
본 실시예는 난소암을 가진 환자에서 백금 기반 화학요법과 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 조합의 안전성과 효능의 예비 평가를 제공하기 위하여 디자인된 무작위, 맹검, 위약 대조, 다중센터, 2상 연구를 설명한다. 대략 약 100 내지 약 800명의 환자를 등록시키며, 약 50 내지 약 400명의 환자는 처리군에 할당하고 약 50 내지 약 400명의 환자는 위약군에 할당한다. 시험은 연구 전체에 걸쳐 코스를 반복하면서, 정맥내 주입에 의한 백금 기반 화학요법 양생법(예를 들어, 카르보플라틴과 파클리탁셀)과 조합된, 1주, 2주 또는 3주마다 약 0.1 내지 약 20 mg/kg의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 정맥내 반복 용량 또는 위약의 투여로 이루어진다. 연구의 시간틀은 약 6개월 내지 약 5년으로 추정되며, 초기 연구의 마지막에 나타낸 바와 같이 반응자들에 대해 요법을 계속한다. 추가의 결과 척도는 다음과 같다:
일차 결과 척도: 무진행 생존율. 연구의 한 가지 목표는 토포테칸과 위약 부문에서의 약 12 내지 18개월로부터 백금 기반 화학요법과 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 부문에서의 약 12 내지 24개월(또는 그 이상)로 무진행 생존율이 증가하는 것을 입증하는 것이다.
평가할 수 있는 이차 결과 척도는 반응 기간, 종양 진행까지의 시간, 전체 생존율, 심각한 및 심각하지 않은 부작용을 포함한다. 예를 들어, 처리는 질환의 진행을 방지할 수 있거나(즉, 정지) 또는 개선시킬 수 있다. 다르게는, 또는 추가로, 다른 목표는 다음 중 하나 이상에 대해 측정할 수 있다: 종양 부하량 감소, 혈관질 감소, 부작용 감소, 역반응 감소, 및/또는 환자의 순응도의 증가.
실시예 23
당뇨병성 망막병증의 치료를 위한 항- 엔도글린 항체의 용도
연구 디자인
센터 수반된 임상적으로 유의한 당뇨병성 황반 부종(DME)을 가진 환자에서 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 다중 안내 주사의 생물학성 활성을 평가하기 위해 그리고 임의의 관련된 부작용을 보고하기 위하여, 단일 센터, 개방 표지, 용량 상승 파일럿 연구를 시작한다. 황반의 중앙에 수반된 DME 및 20/40 내지 20/400 사이의 연구 눈에서 최상 교정 시력(BCVA)을 가진 환자를 등록시킨다.
연구 처리
자격이 되는 환자를 매월 투여되는 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체(약 0.25 내지 2.5 mg/주사)의 3회 안내 주사를 받도록 1:1 비로 무작위로 할당하고 24개월까지 관찰을 계속한다. 일차 종점은 눈 및 전신 부작용의 빈도와 중증도이다. 2차 종점은 1) 표준화된 굴절력 및 2 m의 출발 테스트 거리에서의 테스트 프로토콜을 이용하여, 초기 치료 당뇨병성 망막병증 연구(ETDRS) 차트로 평가할 때 최상의 교정된 시력 평가 및 2) 광학 코히어런스(optical coherence) 단층촬영에 의한 망막 두께의 측정이다. 평가 의사는 환자의 처리 할당을 모르며; 주사를 투여하는 의사는 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 또는 샴 처리에 관한 환자의 처리 할당을 알지만 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 용량을 모른다. 각 연구 위치에서 다른 인원(주사를 보조하는 사람 제외), 환자, 및 중앙 판독 센터의 인원은 환자의 처리 할당을 모른다.
효능 및 안전성 분석
효능 분석은 결측 데이터에 대해 최종 관찰 선행 대체법(last-observation-carried-forward method)을 이용하여 모든 환자에서 치료 의향 분석을 기반으로 하여 수행한다. 모든 쌍방식 비교를 위해, 통계 모델은 시력에 대해 기저선 스코어에 대해 조정한다(<55 문자 대 ≥55 문자). 2분법 종점에 있어서의 군 사이의 비교는 코크란 카이 스퀘어(Cochran chi-square) 검정을 이용하여 수행한다. 기저선 시력으로부터의 변화는 분산 분석 모델을 이용하여 분석한다. 병변 특징에 대한 종점을 위해서, 기저선 값에 대해 조정하는 공분산분석 모델을 이용한다. 호치베르그-본페로니(Hochberg-Bonferroni) 다중-비교 절차를 이용하여 일차 종점에 대한 두 가지의 쌍방식 처리 비교를 위해 조정한다. 안전성 분석은 모든 처리된 환자를 포함한다.
결론
인간화 항-엔도글린 항체는 DME를 가진 환자를 위한 잘 용인되는 요법일 것이다. 이 파일럿 연구는 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 요법이 최상의 교정 시력을 유지하거나 개선하고 센터 수반된 임상적으로 유의한 DME를 가진 환자에서 망막 두께를 감소시킬 잠재력을 가짐을 입증한다.
실시예 24
항- 엔도글린 항체 및 노인성 황반 변성 연구 디자인의 임상 시험
미국의 여러 장소에서, 환자들이 노인성 황반 변성과 관련된 맥락막 신혈관형성을 가진 환자 중에서 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 반복된 안내 주사의 안전성과 효능의 2년의 유망한 무작위, 이중맹검, 샴-대조된 연구에 환자를 등록한다. 일차 효능 분석은 12개월에 수행한다. 일차 효능 종점은 표준 굴절률 및 2 m의 출발 테스트 거리에서의 테스트 프로토콜을 이용하여, 초기 치료 당뇨병성 망막병증 연구(ETDRS) 차트로 평가할 때, 기저선 시력으로부터 15 문자 미만(대략 3줄)을 소실한 환자의 비율이다. 병변의 적임성은 표준화된 기준과 환자의 처리 할당을 모르는 훈련된 선발자를 이용하여 독립적인 중앙 판독 센터에 의해 확인한다. 환자는 그들의 완전한 적임성의 결정 전에 동의서를 제공한다. 스크리닝은 최장 28일까지 지속될 수 있다.
이 연구에 포함되기 위해, 환자는 적어도 50세이어야 하며; 20/40 내지 20/320의 최상의 교정 시력(ETDRS 차트를 이용하여 결정된 스넬렌 등가물(Snellen equivalent))을 가지며; 중심와 중앙을 포함하는, 노인성 황반 변성과 관련된 원발성 또는 재발성 맥락막 신혈관형성을 가지며; 플루오레세인 혈관조영촬영 및 안저촬영을 이용하여 최소한으로 고전적이거나 고전적인 맥락막 신혈관형성이 없는 오컬트(occult)인 것으로 평가된 병변 유형을 가지며; 최대 병변 크기가 12 시신경원판(optic-disk) 영역(1 시신경원판 영역은 1.8 mm의 1 시신경원판 직경을 기반으로 하면 2.54 mm2 임)이며, 신혈관형성은 전체 병변의 50% 이상을 차지하며; 관찰가능한 혈액, 최근의 시력 손실, 또는 병변의 최대 선형 직경의 10% 이상의 최근의 증가에 의해 명백하듯이, 질환의 최근의 진행이 추정되었다. 기존의 심혈관, 뇌혈관, 또는 말초 혈관 상태에 관한 배제 기준은 없다.
1차 연구
AMD를 가진 50 내지 500명의 환자(50 내지 500개의 눈)가 여러 곳에서 연구에 참여할 것이다. 적임 환자는 한 눈에 2년 동안 약 0.25 mg 내지 2.5 mg의 용량의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 또는 샴 주사를 매월(23 내지 37일 이내) 받도록 1:1:1 비로 무작위로 할당한다. 평가 의사는 환자의 처리 할당을 모르며; 주사를 투여하는 의사는 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 또는 샴 처리에 관한 환자의 처리 할당을 알지만 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 용량을 모른다. 각 연구 위치의 다른 인원(주사를 보조하는 인원 제외), 환자, 및 중앙 판독 센터의 인원은 환자의 처리 할당을 모른다. 만일 연구 눈에서 맥락막 신혈관형성이 대부분 고전적이 되면 개입 요법(예를 들어, 베르테포르핀 광역학적 요법)이 허용된다.
처리의 첫 단계로서, 환자는 눈 건강의 기저선을 확립하기 위해 완전한 안과 검사를 받는다. 안과 검사는 간접 검안경검사, 세극등 생체검경, 주변부 망막 검사, 안압 측정, 시력(육안 및 최상의 교정) 징후학, 안저 촬영, 플루오레세인 혈관조영촬영, 광간섭단층촬영, 망막전도기록 및 A-스캔 측정을 포함한다.
예비 검사 후, 상기에 개시한 안내 주사를 AMD를 나타내는 환자의 눈에 제공한다. 만일 두 눈 모두가 병에 걸리면, 그들은 별도로 처리할 수 있다. 처리할 눈은 안과 용액을 주사한다.
처리 후, 환자의 눈을 2년 동안 1일, 2일, 7일, 15일, 30일 및 60일 그리고 그 후 매월 검사한다. 재발 가능성 때문에, 환자는 그 후 1개월마다 주기적인 검사를 위해 와야 한다. 각 검사날에 환자를 초자체 액화에 대해 모니터링한다. 추가로, 환자는 공막 누르기를 이용한 간접검안경검사를 이용하여 후 초자체 박리에 대해 모니터링한다. 마지막으로, 환자에 의해 제시된 AMD의 정도를 주기적인 망막 검사, 광간섭 단층촬영 및 플루오레세인 혈관조영촬영을 통해 연속적으로 모니터링하여 망막하 액, 혈액, 삼출물, RPE 탈착, 낭종성 망막 변화의 존재, 또는 회색을 띠는 녹색 망막하 신혈관형성 막의 존재에 대해 모니터링한다. 만일 재발성 신혈관형성의 징후가 관찰되면 추가 처리가 요구될 수 있다. 추가 처리는 매주 또는 매월 주어질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 초기 처리는 1-6개월 떨어진 후속 처리가 뒤따른다.
효능 분석은 결측 데이터에 대한 최종 관찰 선행 대체법을 이용하여 모든 환자 중에서 치료 의향을 기반으로 하여 수행한다. 모든 쌍방식 비교를 위해, 통계 모델은 시력(<55 문자 대 ≥55 문자)에 대한 기저선 스코어 및 맥락막 신혈관형성의 하위유형(최소한으로 고전적인 것 대 고전적 질환이 없는 오컬트)에 대해 조정한다. 2분법 종점에 있어서의 군 사이의 비교는 코크란 카이 스퀘어 검정을 이용하여 수행한다. 기저선 시력으로부터의 변화는 분산 분석 모델을 이용하여 분석한다. 병변 특징에 대한 종점에 있어서, 기저선 값에 대해 조정하는 공분산분석 모델을 이용한다. 호치베르그-본페로니 다중 비교 절차를 이용하여 일차 종점에 있어서의 두 가지의 쌍방식 처리 비교를 위해 조정한다. 안전성 분석은 모든 처리된 환자를 포함한다.
2차 연구
노인성 황반 변성이 나타난 환자는 (1) 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 단독, (2) 라니비주맙 단독, (3) 동일 조성물 또는 상이한 조성물 형태의, 라니비주맙과 조합된 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 또는 (4) 대조군 항체의 초자체내 주사를 이용하여 첫 번째 연구(상기 참조)의 방법에 따라 치료하여 신혈관형성, 황반 질환, 및 망막 손상의 발병을 감소 또는 예방한다.
결론
인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체는 AMD를 가진 환자에 있어서 잘 용인되는 요법이다. 이 임상 시험은 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 요법이 AMD를 가진 환자에 있어서 최상의 교정된 시력을 유지하거나 개선시키고 맥락막 신혈관형성을 감소시키는 잠재력을 가짐을 입증한다. 또한, 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체는 라니비주맙과 비교하여 그리고 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 및 라니비주맙의 병용 요법과 비교하여 탁월한 활성을 보이며, 어느 하나의 항체 단독에 대하여 증가된 활성을 보인다.
실시예 25
사이노몰거스 원숭이(Cynomolgus Monkey)에서의 전신 독성
인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 전신 독성을 검토하기 위하여 사이노몰거스 원숭이를 연구에서 이용한다.
간략하게는, 원숭이에게 10.0 mg/kg, 30.0 mg/kg 또는 100.0 mg/kg의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체를 3주 동안 매주 투약한다. 위약 동물에게는 항체의 부재하에서 적절한 용액을 동일 스케쥴로 투약한다. 용량은 30 내지 60분에 걸쳐 정맥내 볼루스로서 투여하며, 적어도 6마리의 동물에게 각각의 용량 수준으로 투약한다. 독성은 하기 표시 중 하나 이상을 통하여 평가한다: 체중 측정, 기본적인 생리학적 임상 측정, 연속적 혈청 화학, 혈액학적 평가 및 조직병리학적 평가.
실시예 26
사이노몰거스 원숭이에서 베바시주맙과의 조합물에서의 전신 독성
라니비주맙(루센티스®)과 조합된 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 전신 독성을 검토하기 위하여 사이노몰거스 원숭이를 연구에서 이용한다.
간략하게는, 원숭이에게 약 10 mg/kg 내지 100 mg/kg의 베바시주맙과 조합된 10.0 mg/kg, 30.0 mg/kg 또는 100.0 mg/kg의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체를 3주 동안 매주 투약한다. 다른 동물은 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 또는 베바시주맙 단독을 받는다. 위약 동물에게는 항체의 부재하에서 적절한 용액을 동일 스케쥴로 투약한다. 용량은 30 내지 60분에 걸쳐 정맥내 볼루스로서 투여하며, 적어도 6마리의 동물에게 각각의 용량 수준으로 투약한다. 독성은 하기 표시 중 하나 이상을 통하여 평가한다: 체중 측정, 기본적인 생리학적 임상 측정, 연속적 혈청 화학, 혈액학적 평가 및 조직병리학적 평가.
실시예 27
사이노몰거스 원숭이에서의 국부적 독성 연구
인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 국부적 독성을 검토하기 위하여 사이노몰거스 원숭이를 연구에서 이용한다.
간략하게는, 원숭이에게 0.25, 1.25 및 2.5 mg/kg의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체를 초자체내 주사에 의해 6주 동안 매주 투약한다. 위약 동물에게는 항체의 부재하에서 적절한 용액을 동일 스케쥴로 투약한다. 용량은 초자체내 주사액으로서 투여하며, 적어도 6마리의 동물에게 각각의 용량 수준으로 투약한다. 독성은 하기 표시 중 하나 이상을 통하여 평가한다: 체중 측정, 기본적인 생리학적 임상 측정, 연속적 혈청 화학, 혈액학적 평가 및 조직병리학적 평가.
조합물의 국부적 독성 연구
초자체내 주사에 의해 주어질 때 라니비주맙(루센티스®)과 조합된 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체의 전신 독성을 검토하기 위하여 사이노몰거스 원숭이를 연구에서 이용한다.
간략하게는, 원숭이에게 0.25, 1.25 및 2.5 mg/kg의 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 및 0.5 mg의 라니비주맙(루센티스®)을 초자체내 주사에 의해 6주 동안 매주 투약한다. 다른 동물은 항체 단독을 동일 용량 및 스케쥴로 받는다. 위약 동물에게는 항체의 부재하에서 적절한 용액을 동일 스케쥴로 투약한다. 용량은 초자체내 주사액으로서 투여하며 적어도 6마리의 동물에게 각각의 용량 수준으로 투약한다. 독성은 하기 표시 중 하나 이상을 통하여 평가한다: 체중 측정, 기본적인 생리학적 임상 측정, 연속적 혈청 화학, 혈액학적 평가 및 조직병리학적 평가.
실시예 28
스프라우팅 분석
혈관신생은 스프라우팅의 3차원 시험관내 모델에서 테스트할 수 있다. HUVEC를 제대로부터 단리하고, 3℃ 및 5% C02에서 10% 소 태아 혈청(FBS)(깁코(GIBCO), 미국 캘리포니아주 칼스바드) 및 내피 세포 성장 보충제(endothelial cell growth supplement, ECGS)(비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 미국 매사추세츠주 베드포드)가 보충된 M199에서 성장시키고, 2 내지 4계대의 HUVEC를 모든 실험에 사용한다(0계대는 일차 배양물임). 폐 섬유아세포(Lung fibroblast, LF)는 37℃ 및 5% C02에서 10% FBS가 보충된 DMEM(깁코, 미국 캘리포니아주 칼스바드)에서 통상적으로 성장시키고, P10과 P15 사이에서 이용한다. ATCC로부터 획득가능한 다른 섬유아세포주도 사용할 수 있다.
세포 준비
HUVEC 및 섬유아세포를 비딩하기 1 내지 2일 전에 M199/10% FBS/Pen-Strep(1:100)에서 확장시킨다. HUVEC에 있어서, 배지는 비딩 전날 EGM-2(클로네틱스, 미국 메릴랜드주 워커스빌)로 바꾼다. 섬유아세포에 있어서, 배지는 포매 전날 EGM-2로 바꾼다. 비딩은 비드당 대략 400개의 HUVEC를 필요로 한다. 섬유아세포는 24웰 플레이트에 있어서 웰당 20,000개의 세포로 사용한다. 96웰 플레이트도 그에 따라 비례하는 양으로 사용할 수 있다.
사이토덱스 ( Cytodex ) 3 비드 준비
예를 들어 사이토덱스 3 마이크로캐리어 비드를 사용할 수 있다(아머샴 파마시아 바이오테크, 미국 뉴저지주 피스카타웨이).
50 ml 튜브에서 실온(RT)에서 적어도 3시간 동안 50 ml PBS (pH = 7.4)에서 건조 비드(0.5 g)를 수화 및 팽윤시키고, 이것을 로커(rocker)상에 둔다.
비드를 침강시킨다(약 15분). 상청액을 버리고, 비드를 새로운 PBS(50 ml)에서 수분 동안 세척한다.
세척 PBS를 버리고, 새로운 PBS로 교환한다.
비드 현탁액을 실리콘 처리된 유리병(예를 들어, 윈드쉴드 와이퍼(Windshield Wiper) 또는 시그르나코트(Sigrnacote)로부터의 것)에 넣는다. 비드를 115℃에서 15분 동안 오토클레이브함으로써 살균하고, 그 후 4℃에서 보관한다.
시약
피브리노겐 용액
피브리노겐 용액을 37℃ 수조에서 DPBS에 2 mg/ml의 피브리노겐을 용해시킴으로써 제조한다. 그 후 용액은 와동시키기보다는 오히려 튜브를 거꾸로 함으로써 혼합한다. 그에 따라 응결가능 단백질의 백분율을 결정하고 조정할 수 있다. 그 후 용액을 0.22 ㎛ 필터에 통과시켜 살균한다.
아프로티닌
동결건조 아프로티닌을 DI수에서 4 U/ml로 재구성하고, 살균 여과할 수 있다. 각각 1 mL의 분액을 제조하고 -20℃에서 보관한다.
트롬빈
트롬빈을 살균수에서 50 U/ml로 재구성한다. 0.5 ml의 분액을 제조하고 -20℃에서 보관한다.
HUVEC 를 이용한 비드의 코팅(1일)
HUVEC 세포를 트립신 처리한다. 비드를 침강시키고(원심분리하지 않음), 상청액을 흡인하고, 비드를 1 ml의 따뜻한 EGM-2 배지에서 간단히 세척한다. 비드(2500)를 FACS 튜브에서 1.5 ml의 따뜻한 EGM-2 배지에서 1 x 106개의 HUVEC와 혼합하고, 인큐베이터 내에 수직으로 둔다. (이는 대략 10개의 웰에 있어서 충분하며; 필요할 경우 확대함).
상기 혼합물은 20분마다 거꾸로 하여 혼합하면서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한다. (비드는 비딩 후 미니 골프공과 유사하여야 하는데, 이는 스프라우팅을 위한 충분한 코팅을 나타냄).
4시간 후, 코팅된 비드를 T25 조직 배양 플라스크(팔콘, 미국 매사추세츠주 베드포드)로 옮기고, 5 ml의 EGM-2 배지에서 37℃ 및 5% C02에서 하룻밤 인큐베이션한다.
피브린 겔로의 코팅 비드의 포매(0일)
2.0 mg/ml의 피브리노겐 용액을 상기에 기술한 바와 같이 제조하고, 0.15 U/ml의 아프로티닌을 피브리노겐 용액에 첨가한다.
코팅 비드를 15 mL 코니칼 튜브로 옮기고, 비드를 침강시킨다.
비드를 1 ml의 EGM-2 배지에 재현탁시키고, 1.5 ml의 원심분리 튜브로 옮긴다. 비드는 P1000 피펫으로 서서히 아래위로 피펫팅함으로써 혼합하면서 1 ml의 EGM-2 배지로 3회 세척한다. 비드를 커버슬립 상에서 계수하고, 500개의 비드/ml의 농도로 피브리노겐 용액에 재현탁시킨다.
트롬빈(0.625 U/ml)을 24웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가한다. 각각의 웰에의 피브리노겐/비드 현탁액(0.5 ml)은 각각의 웰에 대하여 피펫을 교환한다.
트롬빈 및 피브리노겐/비드는 약 4 내지 5회 약하게 아래위로 피펫팅함으로써 혼합하고, 피브린 겔에서의 버블 생성을 회피한다. 대조군 샘플은 항체의 부재하에 또는 하나 이상의 대조군 항체에서 처리한다. 테스트 샘플은 항-엔도글린 항체 단독, 항-VEGF 항체 단독, 또는 이들의 조합으로 처리한다. 다수의 농도의 에이전트를 테스트할 수 있다. 피브리노겐/비드 용액을 실온에서 5분 동안, 그리고 그 후 37℃ / 5% C02에서 15분 동안 응결시킨다. 플레이트는 스프라우팅을 감소시킬 수 있는 피브린 전단을 최소화하기 위하여 처음 5분의 응결 동안 건드리지 않는 것이 중요하다.
EGM-2(1 mL)를 적가식으로 각각의 웰에 첨가한다. 폐 섬유아세포를 20,000개의 세포/웰의 농도로 응결물의 상부상에 접종한다. 요망되는 성장이 달성될 때까지 배양 배지를 하루 걸러 한 번씩 새로운 EGM-2 배지로 교체한다.
피브린 겔이 형성될 경우, 작은 버블이 겔 내에 존재할 수도 있으며, 상기 버블은 3 내지 4일 후에 사라진다. 스프라우팅은 2일과 4일 사이에 명백하여야 한다. 내강 형성이 대략 4 내지 5일에 시작되며, 스프라우트가 계속하여 연장한다. 새롭게 형성된 관은 대략 4 내지 6일에 분지화되기 시작한다. 6 내지 7일까지는 미세혈관 유사 구조가 인접 관과 접합되기 시작하며, 웰당 비드수의 증가는 더욱 이른 접합으로 이어진다. 스프라우팅 거리는 표준 기술에 의해 측정된다.
실시예 29
시험관내에서의 혈관신생 스프라우트의 면역세포화학적 분석
내피 세포(EC) 핵 염색에 있어서, 피브린 겔을 1X PBS로 2회 세척하고, 그 후 2% 파라포름알데히드에서 하룻밤 고정시킨다. 1X PBS를 이용하여 2회 더 세척한 후, 겔을 그 후 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(시그마, 미국 미주리주 세인트루이스)로 염색한다.
면역염색에 있어서, 폐 섬유아세포(LF)는 먼저 겔을 10X 트립신으로 간단히 처리하여 제거한다. 모든 섬유아세포를 제거하자마자 혈청으로 소화를 중지시킨다. 그 후 겔을 1X HBSS(셀그로(Cellgro), 미국 버지니아주 헌돈)로 광범위하게 세척한다. 그 후 배양물을 10% 포르말린에서 10분 동안 고정하고, 0.5% 트리톤 X-100을 5분 동안 침투시킨다. 비특이적 결합을 PBS중 5% BSA의 용액으로 2시간 동안 차단시킨다.
일차 항체를 차단 완충액 중 1/100의 희석으로 사용하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시킨다. 광범위한 세척 후, 결합된 항체를 1/1000 희석의 종 특이적 알렉스 플루오르(Alexa Fluor) 488 컨쥬게이션된 또는 알렉사 플루오르 568 컨쥬게이션된 이차 항체(몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes, 미국 캘리포니아주 칼스바드)로 검출한다. 이소타입 특이적 비결합 항체를 대조군으로 사용한다. 높은 백그라운드가 나타날 경우, 일차 또는 이차 항체의 농도는 감소시킬 수 있으며, 필요할 경우 인큐베이션 및/또는 세척 시간을 증가시킬 수 있다. F-액틴을 0.2 μM의 농도의 TRITC-팔로이딘(시그마, 미국 미주리주 세인트루이스)으로 염색한다.
위상차 및 형광 이미지를 디지털 카메라와 결합된 IX70 올림푸스(Olympus) 현미경에서 포획한다. 형광 Z 시리즈 이미지 스택(stack)을 2광자 칼 자이스 마이크로이미징(Carl Zeiss Microimaging) LSM 510 메타(Meta) 현미경에서 포착하고, 메타모프(Metamorph) 소프트웨어(유니버셜 이미징 코포레이션(Universal Imaging Corporation, 미국 펜실베이니아주 다우닝타운)를 이용하여 3차원 렌더링(rendering)으로 컴파일링한다. 따라서, 다양한 마커의 발현은 쉽게 검출될 수 있다.
배양물의 z 축과 함께인 형광 광학 이미지 스택을 포착하여 혈관의 3D 묘사를 생성한다. 핵은 DAPI로 염색되고(녹색), 혈관벽은 비멘틴에 대하여 염색된다(오렌지색). 넓은 중공 내강이 명백하게 보이며, 이는 내피 세포의 단층으로 둘러싸여 있다. 이들 이미지는 시험관내 분석물에 존재하는 내강이 매트리겔 분석에서 흔히 보이는 바와 같이 세포내 슬릿이 아니며 세포간 내강임을 확인해 준다. 더욱이, HUVEC는 제IV형 콜라겐 풍부 기저막 및 피브린 겔에 대하여 놓고 내강 및 기저막에 대면하는 첨단박을 갖는다는 점에서 HUVEC가 분극됨을 확인할 수 있다.
실시예 30
사이노몰거스 원숭이에서의 맥락막 신혈관형성의 억제
레이저로 유발한 맥락막 신혈관형성에 대한 본원에 개시된 조성물의 영향을 성체 사이노몰거스 원숭이에서 평가한다.
이 실험에서, (1) 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 단독, (2) 항-VEGF 항체 단독, (3) 동일 조성물 또는 상이한 조성물 형태의 항-VEGF 항체와 조합된 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 또는 (4) 대조군 항체를 정맥내 또는 초자체내 주사에 의해 투여한다. 각각의 동물은 각각의 망막에 대하여 9회 또는 10회의 레이저에 의한 화상을 받으며, 활성 맥락막 신혈관 병변의 발달은, 처리 개시 전 그리고 레이저 처리 후 15일, 20일 및 29일에 1회 플루오레세인 혈관조영촬영에 의해 평가한다. 조성물은 레이저 손상 1주일 전에 시작하여 주당 1회 정맥내 투여한다. 초자체내 주사는 레이저 1주일 전에 시작하여 2주마다 1회, 또는 레이저 2주 후 1회 하는데, 이 시점에서 활성 CNV 병변이 이미 형성되었다. 대조군 동물은 레이저 1주일 전에 시작하여 위약의 초자체내 주사를 2주마다 또는 매주 정맥 주사를 받는다.
CNV 병변은 플루오레세인 혈관조영촬영에 의해 가시화하고, 표준 절차에 따라 등급화한다.
실시예 31
손상에 의해 유발된 각막 신혈관형성의 억제
각막 신혈관형성은 3개의 나일론 봉합사의 기질내 배치에 의해 또는 화학적 손상 (NaOH) 및 각막 상피의 기계적 절제에 의해 수컷 C57BL/6 마우스에서 유도한다. 다수의 실험을 행하며, 여기서, (1) 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 단독, (2) 항-VEGF 항체 단독, (3) 동일 조성물 또는 상이한 조성물 형태의 항-VEGF 항체 단독과 조합된 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체 또는 (4) 대조군 항체를 손상 직전 또는 직후 다수의 시점에서 또는 1회 복강내 투여한다.
각막 신혈관의 성장을 슬릿 램프 현미경 검사 및 조직학적 평가에 의해 평가한다. 맥관구조는 내피 세포 특이적인 플루오레세인 컨쥬게이션된 렉틴으로 표지하고, 신혈관형성을 PECAM 면역조직화학적 방법을 이용하여 단면에서뿐만 아니라 각막 평탄 마운트에서도 평가한다. 슬릿 램프 현미경 검사를 이용하여 각막 부종의 존재를 평가하고, 각막 두께를 단면에서 측정하는데, 각막 두께의 증가는 부종의 양을 반영한다. 다형핵 백혈구(polymorphonuclear leukocyte, PMN) 및 대식세포의 수를 각각 HEMA-3 또는 래트 항-마우스 F4/80 단클론 항체를 이용하여 단면을 염색함으로써 결정한다.
실시예 32
인간화 항- 엔도글린 항체에서의 T 세포 에피토프의 확인
인간화 가변 영역의 서열을 아이토프TM 분석에 의해 테스트하였다. 인간화 가변 영역 서열을 중첩 9량체-15량체 펩티드로 나누었다. 가변 영역 서열은 컴퓨터 분석에 의해 MHC 클래스 II에 대한 펩티드의 친화도를 결정하는 인 실리코 분석 툴인 아이토프TM를 이용하여 인간 MHC 클래스 II(잠재적인 T 세포 에피토프)에의 뒤섞인 고친화도 결합에 대하여 분석하였다. 아이토프TM 분석으로부터의, 최저 빈도의 잠재적인 T 세포 에피토프를 갖는 서열을 인간화 항체의 생성을 위한 리드로서 확인한다. 선택된 인간화 가변 영역 서열은 잠재적인 T 세포 에피토프의 제거를 위하여 돌연변이의 포함을 통하여 재디자인할 수 있다. 돌연변이를 아이토프TM를 이용하여 디자인하여 MHC 클래스 II 결합을 감소시키거나 제거한다. 대안적으로, 생식세포계 인간 서열이 잠재적인 T 세포 에피토프 부위에서 치환될 수 있거나 또는 대안적인 서열이 치환될 수 있다.
도 19 내지 도 23은 도 4에 나타낸 경쇄 HuVK_vO 및 중쇄 HuVH_vO을 포함하는 인간화 항-엔도글린 항체에 있어서의 9량체 펩티드의 예측된 결합을 나타낸다.
실시예 33
항- CD105 인간화/ 탈면역화 항체의 디자인
이 실시예는 감소된 면역원성을 나타내는, 인간 CD105를 표적화하는 치료적 단클론 인간화 탈면역화 항체의 디자인을 설명한다.
아이토프TM를 이용하여 확인한 뒤섞인 고친화도 MHC 클래스 II 결합 서열(실시예 31 참조)은, MHC 클래스 II에의 펩티드 결합을 감소시키거나 제거하는, 주요 MHC 클래스 II 포켓 위치에서의 아미노산 치환을 확인하기 위하여 아이토프TM에 의해 추가로 분석하였다. 모든 서열이 CDR과 중첩되기 때문에, CDR의 변화 위치(잠재적인 항원 접촉 잔기) 및 원래 아미노산 및 대체 아미노산의 물리화학적 특성을 또한 고려하였다. 펩티드/MHC 클래스 II-TCR 상호작용의 안정화에 연루된 주요 결합 홈 외부의 잔기 및 TCR 접촉 잔기를 대체용으로 또한 고려하였다.
VHV1에서, 완전히 CDR 내에 있는 그리고 잔기 51에서 출발하는 9량체 펩티드를 뒤섞인 고친화도 MHC 클래스 II 결합 펩티드로서 확인하였다. MHC 클래스 II 결합의 가장 성공적인 제거 방법은, 9량체의 첫 번째 아미노산(포켓 1 또는 P1 위치)을 표적화하는 것이며, 여기서, 소수성 측쇄의 제거 또는 친수성 측쇄에 의한 대체가 MHC 클래스 II 결합을 제거한다. 그러나, 이러한 유형의 라디칼 아미노산 대체는 항체 친화성의 유지에 있어서 항상 성공적일 수는 없으며, 따라서, 단독의 또는 조합된 이차 포켓 위치(p4, p6, p7 또는 p9)를 또한 평가하였다. 아이토프TM 분석은 K52b를 Q 또는 R로 변화시킴에 의한 이 펩티드의 p4 위치의 표적화가 MHC 클래스 II 결합을 유의하게 감소시키는 것으로 예측되는 반면, p1 위치에서 I51을 A로 대체하는 것은 결합을 전적으로 제거하는 것으로 예측됨을 나타냈다(표 5).
항체/항원 복합체의 결정구조는 I51이 드물게 항원과 접촉할 수 있지만, 이 위치에서의 I의 A로의 라디칼 변화(p1 앵커 위치를 파괴하는 치환)는 CDR의 전체 배좌에 영향을 줄 수 있음을 시사한다. 따라서, K52b(p4 앵커 위치)에서의 상대적으로 보존적 변화를 또한 포함시켰으며, 그 이유는 이 잔기가 용매에 노출되지만 항원과 접촉할 수 없기 때문이다. 마지막으로, CDR 외부에 있는 추가의 돌연변이를 또한 디자인하여 (G49가 A 또는 S로) 펩티드/MHC 클래스 II/TCR 상호작용에 대한 불안정화 영향을 평가하였다. 표 6에는 구성한 인간화 및 인간화/탈면역화 변이체형 VH 영역이 열거되어 있으며, 상응하는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 서열 번호가 그 구성체 다음에 나타내어져 있다.
Figure pct00008
2개의 뒤섞인 고친화도 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 VKV2 및 VKV1에서 확인하였다. V19에서 p1 앵커를 포함하는 첫 번째의 것은 CDR1과 부분적으로 중첩되며, I48에서 p1 앵커를 포함하는 두 번째의 것은 CDR2와 중첩된다. 둘 모두의 p1 앵커는 CDR 외부에 있으며, A로의 돌연변이의 표적이 되었는데, 이는 MHC 클래스 II 결합을 완전히 제거할 수 있다(표 7). 그러나, 둘 모두의 이들 잔기는 CDR1 및 2의 배좌의 유지에 연루될 수 있으며, 따라서 MHC 클래스 II 결합을 유의하게 감소시키는 추가의 돌연변이를 디자인하였다(표 7). 둘 모두의 경우, p4 잔기가 T의 S로의 돌연변이의 표적이 되었다. T22S는 또한 CDR 외부에 있으며, V19A보다 CDR 배좌에 영향을 미칠 가능성이 더 적다. T51은 CDR2 내부에 있지만, 항원과 복합체를 형성한 항체의 결정 구조로부터의 증가는 이 잔기가 항원과 좀처럼 접촉하지 않음을 시사한다. 표 6에는 구성한 인간화 및 인간화/탈면역화 VK 영역이 열거되어 있다.
Figure pct00009
실시예 34
이 실시예는 T 세포 에피토프에 대한 항-엔도글린 항체의 스크리닝 방법을 설명한다. MHC, 폴리펩티드 및 T 세포 수용체(TCR) 사이의 상호작용은 항원의 T 세포 인식 특이성에 대한 구조적인 기초를 제공한다. T 세포 증식 분석에서는 항체로부터 프로세싱된 폴리펩티드가 MHC에 결합하는 것 및 TCR이 MHC/폴리펩티드 복합체를 인식하는 것을 테스트한다. 본 실시예의 T 세포 증식 분석은 항원 제시 세포(APC) 및 T 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 자극을 수반한다. 자극은 온전한 항-엔도글린 항체를 이용하여 시험관내에서 행한다. 자극된 T 세포 증식은 3H-티미딘(3H-Thy)을 이용하여 측정하며, 혼입된 3H-Thy의 존재는 세척한 고정 세포의 섬광 계수를 이용하여 평가한다.
모든 인간화 및 인간화/탈면역화 VH 및 VK 영역 유전자를 일련의 중첩 올리고뉴클레오티드를 이용하여 합성하였는데, 상기 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고, 라이게이션하고, PCR 증폭시켜 전장 합성 V 영역을 생성하였다. 그 후 조립된 변이체를 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄를 위한 안티토프 리미티드의 pANT 발현 벡터 시스템 내로 직접적으로 클로닝하였다.
항체의 정제
항-엔도글린 항체를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 포유류 배양물의 상청액으로부터 정제하였다. 완충액 교환 및 단백질 농축을 pH=7.4의 PBS를 사용하여 행하였다. 항-엔도글린 항체는 세파크릴(Sephacryl) S200 컬럼(지이 헬스케어, 영국 아머샴)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 주요 피크를 수집하고, 필터 살균하였더니 엔도세이프-PTS(Endosafe-PTS)(찰스 리버(Charles River), 영국 마게이트)를 사용할 경우 내독소 수준이 <5 EU/mg인 것으로 밝혀졌다. 정제된 항체를 4℃에서 보관한다. 최종 농도는 계산된 몰 소광 계수를 이용하여 UV 흡광도에 의해 결정하였으며, 여기서, A280 1.0 = 1.62 mg/mL이다. 그 후 각각의 항체를 AIMV 배양 배지에서 100 ㎍/mL로 희석시켰다.
공여자 PBMC 의 준비 및 선택
에덴브룩 병원 연구 윤리 위원회(Addenbrooke's Hospital Local Research Ethics Committee)의 승인에 따라 영국 국립 수혈 서비스(UK National Blood Transfusion Service, 에덴브룩(Addenbrooke) 병원, 영국 캠브리지))로부터 얻은 건강한 지역사회 공여자의 연막(buffy coat)(채혈시로부터 24시간내)으로부터 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 단리하였다. PBMC를 림포프렙(Lymphoprep)(액시스-쉴드(Axis-shield, 스코틀랜드 던디)) 밀도 원심분리에 의해 연막으로부터 단리하고, CD8+ T 세포를 CD8+ 로제트셉(RossetteSep)™(스템셀 테크놀로지스, 인코포레이티드(StemCell Technologies, Inc.))을 사용하여 고갈시켰다. 공여자는 바이오테스트(Biotest) HLA SSP-PCR 기반 조직형 결정 키트(바이오테스트, 덴마크 란트슈타이너스트라쎄))를 사용하여 HLA-DR 할로타입을 확인함으로써 특성화하였다. 대조군 항원, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Haemocyanin, KLH)(피어스 (미국 록포드))에 대한 T 세포 반응을 양성 대조군에 대해 결정하였다. 그 후 PBMC를 냉동시키고, 필요할 때까지 액체 질소에서 보관하였다. 사용에 필요할 때, 세포를 37℃의 수조에서 신속하게 해동시킨 후 10 ml의 사전 가온 AIM V 배지로 옮겼다.
세계 인구에서 발현되는 20명의 공여자의 코호트(cohort)를 HLA-DR 동종이인자형의 수 및 빈도를 최적으로 제시하기 위해 선택하였다. 세계 인구에서 발현되는 것에 비교하여 코호트에서 발현되는 동종이인자형을 분석함으로써, >80%의 적용 범위가 달성되고, 모든 주요 HLA-DR 대립유전자(세계 인구에서 >5%의 빈도로 발현되는 개개의 동종이인자형)가 잘 제시되는 것으로 밝혀졌다. 공여자 할로타입의 요약이 도 23에 제공되어 있으며, 본 연구에서 사용된 공여체 동종이인자형의 빈도 대 세계 인구에 존재하는 빈도를 비교하였다.
각각의 공여자로부터의 PBMC를 해동하고, 계수하고, 생존력을 평가하였다. 세포를 소생시키고, AIM V 배양 배지에서 4-6x106 PBMC/mL로 재현탁하였다. 각각의 공여자 있어서, 벌크 배양을 확립하였으며, 여기서, 총 1 mL의 증식 세포 원액을 24웰 플레이트에 첨가하였다. 총 1 mL의 각각의 희석 테스트 샘플을 PBMC에 첨가하여 항체 샘플당 50 ㎍/mL의 최종 농도를 생성하였다. 각각의 공여자에 있어서, 양성 대조군(100 ㎍/mL의 KLH와 함께 인큐베이션한 세포) 및 음성 대조군(단지 배양 배지와 함께 인큐베이션한 세포)를 또한 포함시켰다. 처음 4개의 공여자에 있어서, 추가의 대조군을 포함시켜 테스트 샘플에 의한 T 세포 반응의 조정에 대하여 테스트하였으며, 여기서 테스트 샘플 및 KLH를 PBMC에 첨가하였다. 이들 샘플과 KLH 단독의 비교를 이용하여 증식에 대한 테스트 샘플의 영향을 평가할 수 있다. 배양물을 37℃, 5% 이산화탄소에서 총 8일 동안 인큐베이션하였다. 5, 6, 7 및 8일에, 각각의 웰 내의 세포를 온화하게 재현탁시키고, 3개의 100 ㎕ 분액을 둥근 바닥 96웰 플레이트의 개개의 웰로 옮겼다. 배양물을 100 ㎕ AIMV 배양 배지 중 1 μCi3[H]-티미딘(퍼킨 엘머(Perkin Elmer)®, 미국 매사추세츠주 월담)으로 펄스하고, 톰텍 마흐(TomTec Mach) 세포 수거기를 이용하여 필터 매트상에 수확하기 전에 추가로 18시간 동안 인큐베이션한다. 각각의 웰에 대한 분당 계수(cpm)는 파라룩스(paralux), 저백그라운드 계수 방식으로 마이크로플레이트 베타 계수기(Microplate Beta Counter)(퍼킨 엘머®, 미국 매사추세츠주 월담) 상에서 멜티렉스(Meltilex)™(퍼킨 엘머®, 미국 매사추세츠주 월담) 섬광 계수에 의해 결정하였다.
결과를 자극 지수로 표현하며, 여기서, 자극 지수(SI)는 테스트 항-엔도글린 항체에 대하여 측정한 증식 스코어(예를 들어, 방사능의 분당 계수)를 테스트 항-엔도글린 항체와 접촉시키지 않은 세포에서 측정된 스코어로 나눔으로써 유도된다. 대조군 웰에 있어서의 모든 기저 cpm은 150 cpm의 최소 역치보다 크다.
증식 분석을 위해, 2 이상의 자극 지수(SI)(SI≥2)의 실험 역치가 이전에 확립되었고, 이에 의해 상기 역치 이상으로 증식 반응을 유도하는 샘플은 양성으로 간주되었다(포함되는 경우, 경계선 SI≥1.90을 강조함). 광범위 분석 개발 및 이전의 연구는 이것이 매우 많은 위양성 반응을 검출하지 않으면서 최대 민감성을 허용하기 위한 최대 신호 대 노이즈 역치임을 보여주었다. 양성 반응은 다음과 같은 통계적 및 실험적 역치에 의해 규정된다:
1. 독립적인 2개의 샘플의 스튜던트 t-검정을 사용하여 배지 대조군 웰에 대해 테스트 웰의 cpm을 비교함으로써 얻은 반응의 유의성(p<0.05).
2. 2 초과의 자극 지수(SI≥), 여기서 SI = 테스트 웰의 평균(cpm)/배지 대조 웰의 평균(cpm).
또한, 분석내 변동은 복제 배양물로부터의 원 데이터의 변이 계수 및 표준 편차(SD)를 계산함으로써 평가하였다.
항-엔도글린 항체를 이용한 에피스크린 타임 코스 증식 분석에 있어서의 결과가 도 24에 예시되어 있으며, 이는 표 형태로 요약되어 있다(표 8). 키메라 항체는 20명의 공여자 중 4명(연구 코호트의 20%)에서 반응을 자극하였으며, 공여자 반응들 중 2명이 경계선이었음에도 불구하고(각각 공여자 11 및 17에 있어서 1.92 및 1.95) 이는 백그라운드로부터 유의하게 상이하였다(p<0.05). 인간화 항체 VK1VH1은 20명의 공여자 중 2명(연구 코호트의 10%)에서 반응을 자극하였으며, 이는 백그라운드로부터 유의하게 상이한(p<0.05) 경계선 반응(공여자 20에 있어서 1.91)을 포함하였다. 공여자 11 및 20은 이들 항체 둘 모두에 반응하였음이 주목할 만한데, 이는 공유된 T 세포 에피토프가 존재할 수 있음을 시사하는 것이다. 이와는 대조적으로, 연구 코호트 내의 공여자 중 어느 것도 탈면역화 항-엔도글린 항체 VK1AA VH1A2에 대하여 양성으로 반응하지 않았다. 대조군 항원 KLH에서의 결과는 양성 결과와 음성 결과 사이에 우수한 연관성이 있음을 보여주며, 이는 본 분석에서의 높은 수준의 재현 가능성을 나타내는 것이다.
Figure pct00010
실시예 35
에피스크린 ™ T 세포 에피토프 맵핑
에피스크린™은 아래에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같은, 전체 항체에서 T 세포 에피토프의 측정을 위한 또는 상기 T 세포 에피토프의 서열 위치를 맵핑하기 위한 생체외 기술이다.
에피스크린 공여자 선택
에덴브룩 지방 병원 연구 윤리 위원회의 승인에 따라 영국 국립 수혈 서비스(에덴브룩 병원, 영국 캠브리지)로부터 얻은 건강한 지역사회 공여자의 연막(채혈시로부터 24시간내)으로부터 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 단리하였다. PBMC를 림포프렙(액시스-쉴드, 스코틀랜드 던디) 밀도 원심분리에 의해 연막으로부터 단리하고, CD8+ T 세포를 CD8+ 로제트셉™(스템셀 테크놀로지스, 인코포레이티드)을 사용하여 고갈시켰다. 공여자는 바이오테스트 HLA SSP-PCR 기반 조직형 결정 키트(바이오테스(덴마크 란트슈타이너스트라쎄)를 사용하여 HLA-DR 할로타입을 확인함으로써 특성화하였다. 대조군 항원, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)(피어스(미국 록포드))에 대한 T 세포 반응을 또한 양성 대조군에 대해 결정하였다. 세계 인구에서 발현되는 54명의 공여자의 코호트를 HLA-DR 동종이인자형의 수 및 빈도를 최적으로 제시하기 위해 선택하였다. 세계 인구에서 발현되는 것에 비교하여 코호트에서 발현되는 동종이인자형을 분석함으로써, >80%의 적용 범위가 달성되고, 모든 주요 HLA-DR 대립유전자(세계 인구에서 >5%의 빈도로 발현되는 개개의 동종이인자형)가 잘 제시되는 것으로 밝혀졌다. 공여자 할로타입의 요약이 제공되고, 본 연구에서 사용된 공여자 동종이인자형의 빈도 대 세계 인구에 존재하는 빈도를 비교하였다.
공여자 상세사항 및 할로타입. KLH에 대한 공여자 반응(SI)은 2개의 독립적인 실험에서 테스트하였다. 테스트 1은 새로 단리된 PBMC에 대해 수행하고, 항체는 본 연구에서 재테스트한다. 두 테스트에서 동일한 결과를 생성하지 않은 반응(즉, 양성 또는 음성)은 강조되었다. 매우 낮은 기저 cpm(<150cpm)을 보이는 공여자는 분석에서 배제하였다.
에피스크린 분석: 증식 분석
키메라, 인간화 및 인간화/탈면역화 항체의 서열로부터 유래된 중첩 펩티드를 테스트하기 위해 에피스크린™을 사용하였다. 중첩 펩티드를 디자인하였다. 12개의 아미노산이 중첩는 일련의 128 x 15량체 펩티드를 1 x 14량체 및 1 x 11량체로 함께 합성하고, 에피스크린™ T 세포 에피토프 맵핑을 사용하여 51명의 건강한 공여자의 코호트로부터 유래된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 자극하기 위해 사용하였다. 개개의 펩티드를 복제 배양물에서 테스트하고, 에피토프의 정확한 위치를 확인하기 위해 T 세포 증식 분석을 사용하여 반응을 평가하였다. 각각의 공여자로부터의 PBMC를 해동하고, 계수하고, 생존력에 대해 평가하였다. 세포 밀도를 2.5x106 PBMC/ml(증식 세포 원액)로 조정하기 전에 세포를 실온의 AIM V 배양 배지(인비트로겐(미국 캘리포니아주 칼스바드)에서 재생시켰다. 펩티드를 10 mM의 최종 농도로 DMSO(시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스)에 용해시켰다. 이어서, AIM V 배양 배지 내로 5 μM의 최종 농도로 희석함으로써 펩티드 배양 원액을 제조하였다. 각각의 펩티드 및 각각의 공여자에 대해, 평탄 바닥 96웰 플레이트 내의 100 ㎕의 증식 세포 원액에 100 ㎕의 펩티드 배양 원액을 첨가함으로써 육중 배양물을 확립하였다. 양성 및 음성 대조군 배양물도 육중으로 확립하였다. 총 9 x 96웰 플레이트를 각각의 공여자에 대해 사용하였고, 각각의 플레이트는 육중체 내의 하나의 음성 대조군(담체 단독)로 15개의 펩티드를 테스트하는데 충분하였다. 최종 플레이트에 대해 양성 대조군을 첨가하였다.
0.5 μCi3[H]-티미딘(퍼킨 엘머®, 미국 매사추세츠주 월담)을 각각의 웰에 첨가하기 전에 배양물을 총 6일 동안 인큐베이션하였다. 톰텍 마흐 III 세포 수거기를 사용하여 필터 매트 상에서 수거하기 전에 배양물을 추가로 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰에 대한 분당 계수(cpm)는 파라룩스, 저백그라운드 계수 방식으로 마이크로플레이트 베타 계수기(퍼킨 엘머®, 미국 매사추세츠주 월담) 상에서 멜티렉스™(퍼킨 엘머®, 미국 매사추세츠주 월담) 섬광 계수에 의해 결정하였다.
증식 분석을 위해, 2 이상의 자극 지수(SI)(SI≥2)의 실험 역치가 이전에 확립되었고, 이에 의해 상기 역치 이상으로 증식 반응을 유도하는 샘플은 양성으로 간주되었다(포함되는 경우, 경계선 SI≥1.90을 강조함). 광범위 분석 개발 및 이전의 연구는 이것이 매우 많은 위양성 반응을 검출하지 않으면서 최대 민감성을 허용하기 위한 최대 신호 대 노이즈 역치임을 보여주었다. 양성 반응은 다음과 같은 통계적 및 실험적 역치에 의해 규정된다:
1. 독립적인 2개의 샘플의 스튜던트 t-검정을 사용하여 배지 대조군 웰에 대해 테스트 웰의 cpm을 비교함으로써 얻은 반응의 유의성(p<0.05).
2. 2 초과의 자극 지수(SI≥), 여기서 SI = 테스트 웰의 평균(cpm)/배지 대조군 웰의 평균(cpm).
또한, 분석내 변동은 복제 배양물로부터의 원 데이터의 변이 계수 및 표준 편차(SD)를 계산함으로써 평가하였다.
증식 분석은 육중 배양물("비조정된 데이터")에서 시작하였다. 분석내 변동이 낮음을 보장하기 위해, 데이터는 또한 최대 및 최소 cpm 값을 제거한 후에 분석하였고("조정된 데이터"), 공여자 반응의 SI를 두 데이터 세트를 사용하여 비교하였다. 조정된 및 비조정된 데이터 세트 모두로부터의 공여자 SI의 상세한 내용을 작성하였다. T 세포 에피토프는 연구 내의 모든 펩티드에 대한 평균 반응 빈도 + 2 x SD(백그라운드 반응률)를 계산함으로써 확인하였다. 상기 역치 이상의 증식을 유도한 임의의 펩티드(들)는 T 세포 에피토프를 함유한 것으로 간주되었다.
펩티드의 인 실리코 아이토프 ™ 분석
증식 분석에서 양성인 펩티드의 서열은 안티토프의 예측 아이토프™ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 상기 소프트웨어는 펩티드의 아미노산 측쇄와 MHC 클래스 II 결합 홈 내의 특이적인 결합 포켓 사이의 유리한 상호작용을 예측한다. 핵심 결합 잔기의 위치는 긴 펩티드 서열에 스패닝하는 하나의 아미노산이 중첩되는 10량체(10-mer) 펩티드를 생성함으로써 결정하였다. 각각의 10량체는 MHC 클래스 II 동종이인자형의 안티토프의 데이터베이스에 대해 테스트하고, 그의 적합성 및 MHC 클래스 II 분자와의 상호작용을 기반으로 하여 스코어링하였다. 매우 많은 대립유전자에 대해 높은 결합 스코어를 생성하는 펩티드는 코어 9량체를 함유하는 것으로 간주되었다.
T 세포 에피토프의 확인
상기한 에피스크린™ 분석을 사용하여 확인된 모든 펩티드는 51명의 건강한 공여자(54명의 공여자가 원래 선택되었고; 공여자는 낮은 기저 cpm, 즉, 150 cpm의 컷오프 값 미만 때문에 분석으로부터 제외될 수 있다)에 대한 테스트를 위해 성공적으로 합성되었다. 양성 반응은 임의의 제시된 펩티드에 대해 SI≥2를 갖는 유의한(p<0.05) 반응을 생성하는 공여자로 규정되었다. 경계선 반응(SI≥1.90을 갖는 유의한(p<0.05) 반응)도 포함되었다. 분석내 변동이 낮고 양성 반응이 개개의 웰 내의 거짓 증식의 결과가 아님을 보장하기 위해 비조정된 및 조정된 데이터 분석으로부터의 결과를 비교하였다. 각각의 분석의 결과는 방법 사이에 거의 차이가 없음을 보여주었고, 따라서, T 세포 에피토프 지도를 조정된 데이터 분석을 사용하여 편집하였다. 비조정된 및 조정된 분석으로부터의 공여자 자극 지수를 작성하였다. T 세포 에피토프는 연구 내의 모든 펩티드에 대한 평균 반응 빈도 + 2 x 표준 편차('백그라운드 반응률'로 칭함)을 계산함으로써 확인하였다. 이것은 5.6%로 계산되었고, 3명 이상의 공여자에서 양성 반응을 유도한다는 것과 같은 의미이다. 상기 역치 이상의 증식 반응을 유도하는 펩티드는 T 세포 에피토프를 함유하는 것으로 간주되었다.
에피스크린 ™을 이용한 리드 변이체의 면역원성 테스트
리드 변이체를 정제하고, 에피스크린™ 시간 코스 T 세포 분석을 사용하여 야생형 폴리펩티드에 대해 비교하였다. HLA 동종이인자형의 발현에 따라 세계 인구를 대표하는 매우 많은 건강한 공여자를 상기한 바와 같은 공여자 라이브러리로부터 선택하였다. 공여자를 2-4x106 CD8+ T 세포 고갈된 PBMC를 함유하는 별개의 벌크 배양물 내에서 각각의 단백질로 자극하였다. 복제 샘플(T 모세포의)을 5-8일에 벌크 배양물로부터 제거하고, IL-2 분비와 함께 증식(엘리스폿(ELISPOT))을 평가하였다. 야생형과 변이체 사이의 평가를 추가로 확인하기 위해서, 연구 코호트를 에피스크린™ T 세포 에피토프 맵핑 연구로부터의 반응 공여자로 보충하였다(충분한 수의 CD8+ T 세포 고갈 PBMC가 유지된다면).
리드 변이체에서 면역원성의 상실을 확인하기 위해, 에피스크린™ 시간 코스 T 세포 분석에 의한 T 세포 면역원성의 분석을 다음과 같이 착수하였다:
(i) 건강한 공여자(세계 인구에 대한 >80% DRB1 동종이인자형 적용 범위)로부터 연막을 사용하여 APC 및 CD4+ T 세포의 생리학적 수준을 함유하는 PBMC를 단리하고;
(ii) 각각의 공여자를 키홀 림펫 헤모시아닌(강력한 신생항원)을 포함하는 양성 대조군 항원에 대해 테스트하고;
(iii) CD8+ T 세포를 MHC 클래스 I 제한된 T 세포 반응의 검출을 배제하기 위해 고갈시키고;
(iv) T 세포 CD4+ T 세포를 활성화하는 상대적인 능력을 평가하기 위해 리드 변이체 및 야생형 폴리펩티드를 서로에 대해 비교하고;
(v) 통계적 및 빈도 분석을 포함하는 추가의 정보에 의해 지지되는 SI>2의 양성 반응을 보이는 이전에 확인된 분석 파라미터를 사용하여 데이터를 분석하고;
(vi) 에피스크린™ 시간 코스 T 세포 분석의 데이터는 개개의 분자에 대한 T 세포 반응의 규모 및 반응 속도에 대한 정보를 제공하고;
(vii) 양성 반응을 생성하는 공여자로부터의 임의의 잔여 PBMC는 보관하고, 반복 테스트 연구에 사용하기 위해 이용될 수 있고;
(viii) 공여자 동종이인자형과 야생형 폴리펩티드에 대한 반응 및 리드 변이체에 대한 임의의 반응 사이의 관련성을 평가하였다.
본 발명의 측면은 그의 사상 또는 본질적인 특징을 벗어나지 않으면서 다른 형태로 구체화되거나 또는 다른 방식으로 실시될 수 있다. 따라서, 본원의 개시내용은 모든 측면에서 제한하는 것이 아닌 예시적인 것으로서 간주되어야 하고, 등가물의 의미 및 범위 내에 해당하는 모든 변화는 본원에 포함되는 것으로 의도된다.
실시예 36
항- 엔도글린 항체의 교차 반응성
항-엔도글린 항체는 인간 및 마우스로부터의 내피 세포와 교차 반응성인 것으로 입증되었다(문헌[Matsuno et al., 1999]). 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체는 문헌[Haruta et al., 1986]의 방법에 따라 방사성 면역분석(RIA)에 의해 인간 및 쥐과 내피에 결합하는 그의 능력에 대해 테스트하였다. 간략하게는, 정제된 항-엔도글린 항체를 당업계에 공지된 표준 방법에 따라 요오도-젠을 사용하여 125I로 개별적으로 방사성 표지하였다. 방사성 표지된 인간화/탈면역화 항-엔도글린 항체를 IgG 분자당 요오드 원자의 평균 수에 대해 분석하였다. 인간 및 쥐과 내피 세포의 배양물에 대한 항-엔도글린 항체 또는 이소타입 매칭된 대조군 IgG를 테스트함으로써 분당 계수를 비교하였다. 서브컨플루언트 쥐과 및 인간 내피 세포에 대한 결합도 FITC 표지된 항-엔도글린 항체를 사용하여 입증할 수 있고, 문헌[Matsuno et al., 1999]의 방법에 따라 평균 형광 강도를 비교하기 위해 벡톤 디킨슨 FACScan에 의해 분석하였다. 쥐과 내피에 대한 결합도 동계 종양을 보유하는 마우스에서 방사성 표지된 항-엔도글린 항체의 생체분포를 이미징함으로써 입증할 수 있다. 간략하게는, 면역적격 마우스에게 동계 4T1 유방 암종을 임플란트하였다. 종양을 감지할 수 있는 크기로 성장시키고, 동물을 방사성 동위원소, 예를 들어 64Cu에 킬레이팅된 항체로 처리하였다. 자가조직 방사선 촬영 또는 PET 스캐닝에 의한 종양 보유 BALB/c 마우스에서 표지된 항-엔도글린 항체의 분포를 유사하게 표지된 이소타입 제어된 항체의 분포와 비교하였다. 표지된 항체의 종양 흡수를 고형 기관 및 혈액 내의 흡수에 대하여 기록하였다.
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polypeptide <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Thr Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 1 5 10 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 47 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 47 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr 20 25 30 <210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 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Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 71 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 71 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 72 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 72 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr 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of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 79 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 80 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 81 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 1 5 10 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 85 <211> 6 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MOD_RES <222> (114)..(114) <223> Val or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (118)..(118) <223> Ser or Ala <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Xaa Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Tyr Leu Gln Met Xaa Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Xaa Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Xaa Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Xaa Xaa Thr Val Ser Xaa 115 <210> 88 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic VH_v1(A) polypeptide <400> 88 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 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110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 90 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic VH_v1(Q) polypeptide <400> 90 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Arg Ser Gln Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 91 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic VH_v1(R) polypeptide <400> 91 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Arg Ser Arg Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 92 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic VH_v1(S) polypeptide <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 93 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic VK_v1(AA) polypeptide <400> 93 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ala Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 94 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic VK_v2(AA) polypeptide <400> 94 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ala Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 95 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic VK_v2(AA) polypeptide <400> 95 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 96 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic VK_v2(SA) polypeptide <400> 96 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ala Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 97 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic VK_v2(SS) polypeptide <400> 97 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 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Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 99 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic CK_constant_region polypeptide <400> 99 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 100 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 97 with L4M polypeptide <400> 100 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 101 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 101 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Pro Trp Ile Tyr 1 5 10 15 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 20 25 30 <210> 102 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 95 with L4M polypeptide <400> 102 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 103 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 96 with L4M polypeptide <400> 103 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ala Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 104 <211> 12 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 104 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala 1 5 10 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Chlamydia HSP 60 peptide <400> 105 Lys Val Val Asp Gln Ile Lys Lys Ile Ser Lys Pro Val Gln His 1 5 10 15 <210> 106 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 106 Trp Val Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr 1 5 10 <210> 107 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 107 Trp Val Gly Glu Ile Arg Ser Gln Ala Ser Asn His Ala Thr 1 5 10 <210> 108 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 108 Trp Val Gly Glu Ile Arg Ser Arg Ala Ser Asn His Ala Thr 1 5 10 <210> 109 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 109 Trp Val Gly Glu Ala Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr 1 5 10 <210> 110 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 110 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val 1 5 10 <210> 111 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 111 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val 1 5 10 <210> 112 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 112 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val 1 5 10 <210> 113 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 113 Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 1 5 10 <210> 114 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 114 Pro Trp Ile Tyr Ala Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 1 5 10 <210> 115 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 115 Pro Trp Ala Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 1 5 10 <210> 116 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(49) <223> Gly, Ala or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (51)..(51) <223> Ala or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(54) <223> Lys, Gln or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> Leu or Val <400> 116 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Xaa Glu Xaa Arg Ser Xaa Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Xaa Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 117 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Ala or Val <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Thr or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (47)..(47) <223> Ala or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (50)..(50) <223> Thr or Ser <400> 117 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Xaa Thr Ile Xaa Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Xaa Tyr 35 40 45 Ala Xaa Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 118 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 118 Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn Val Tyr Leu Gln Met 1 5 10 15 Asn Ser Leu Lys Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp 20 25 30 Ser Trp

Claims (22)

  1. 서열 번호 89에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 93에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 엔도글린에 결합하고, 서열 번호 89에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 93에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서,
    상기 중쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system)을 이용할 경우 49 위치에서 알라닌(A) 또는 세린(S)에 의한 글리신(G)의 치환; 51 위치에서 이소루신(I)에 의한 알라닌(A)의 치환; 52b 위치에서 아르기닌(R) 또는 아스파라긴(Q)에 의한 리신(K)의 치환; 78 위치에서 발린(V)에 의한 루신(L)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함하고,
    상기 경쇄 가변 영역은 카밧 넘버링 시스템을 이용할 경우 4 위치에서 루신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환; 19 위치에서 발린(V)에 의한 알라닌(A)의 치환; 22 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환; 48 위치에서 이소루신(I)에 의한 알라닌(A)의 치환; 및 51 위치에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, 서열 번호 88, 89, 90, 91 또는 92에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 93, 94, 95, 96, 97, 100, 102 또는 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, scFv 단편, 단일쇄 결합 폴리펩티드, Fd 단편, 가변 중쇄, 가변 경쇄 또는 dAb 단편인 항원 결합 단편.
  5. 제1항의 항체 또는 항원 결합 단편 및 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  6. 제1항의 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  7. 제1항에 있어서, 치료적 표지, 진단적 표지 또는 이들 둘 모두로 추가로 표지된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제1항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈관신생(angiogenesis) 관련 질환을 치료하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 치료적 표지, 검출 가능한 표지 또는 이들 둘 모두로 표지된 것인 치료 방법.
  10. 제8항에 있어서, 혈관신생 관련 질환이 혈관신생(angiogenesis)/신혈관형성(neovascularization)을 특징으로 하는 안질환, 당뇨병성 신병증, IBD, 류마티스 관절염, 골관절염, 암 또는 전이인 치료 방법.
  11. 제10항에 있어서, 안질환이 황반 변성인 치료 방법.
  12. 제10항에 있어서, 안질환이 당뇨병성 망막병증인 치료 방법.
  13. 제10항에 있어서, 암이 고형 종양인 치료 방법.
  14. 제10항에 있어서, 암이 상피계 종양인 치료 방법.
  15. 제10항에 있어서, 암이 폐암, 부인과 악성종양, 흑색종, 유방암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 결장직장암, 전립선암, 신장암, 두부암(head cancer), 췌장암, 간암(간세포암), 자궁암, 경부암(neck cancer), 신장암(신세포암), 육종, 골수종 및 림프종으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  16. 제8항에 있어서, 하나 이상의 혈관신생 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 치료 방법.
  17. 제16항에 있어서, 혈관신생 억제제가 화학요법제, VEGF 수용체 억제제, VEGF 억제제 또는 이들의 조합인 치료 방법.
  18. 제8항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 조성물을 약 0.01 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 100 mg/kg, 약 125 mg/kg, 약 150 mg/kg, 약 175 mg/kg 또는 약 200 mg/kg의 양으로 투여하는 것인 치료 방법.
  19. a) 테스트하고자 하는 환자 유래의 혈장 또는 고형 종양의 암세포의 샘플을 제공하는 단계;
    b) 발현이 혈관신생 억제제에 대한 민감성 또는 내성과 상관된 유전자 또는 유전자 생성물의 패널로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현을 샘플에서 검출하는 단계로서, 상기 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물이 VEGF, VEGF 수용체, HIF-1α, 태반 성장 인자 수용체 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물로부터 선택되는 것인 단계; 및
    c) 환자 샘플에서 검출된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을, 혈관신생 억제제에 대한 민감성 또는 내성과 상관된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준과 비교하는 단계
    를 포함하는 진단 방법.
  20. 제19항에 있어서, 혈관신생 억제제가 VEGF 수용체 억제제, VEGF 억제제 및 엔도글린 억제제로부터 선택되는 것인 진단 방법.
  21. 암세포 또는 인간 혈장의 샘플에서 VEGF, VEGF 수용체, HIF-1α, 태반 성장 인자 수용체 및 엔도글린으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 혈관신생 억제제에 대한 민감성 또는 내성과 상관된 발현 수준의 검출을 위한 시약을 포함하는 키트.
  22. 제21항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키트.
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