CN102762227A - 内皮因子抗体 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及人源化的和人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体和其抗原结合片段的组合物。一个方面涉及抗体，所述抗体具有在可变重链、可变轻链或二者的至少一个框架区的至少一个氨基酸残基中的一个或多个修饰。另一个方面涉及抗体，所述抗体结合内皮因子，并抑制血管生成。另一个方面涉及人源化抗体的去免疫化以降低免疫原性。另一个方面涉及人源化的和人源化的/去免疫化的结合内皮因子的抗体用于检测、诊断或治疗与内皮因子、血管生成或其组合有关的疾病或病症的用途。

Description

内皮因子抗体
交叉引用
本申请要求2009年9月30日提交的美国临时申请号61/247,290和2010年3月31日提交的美国非临时申请号12/751,907的权益，它们二者的公开内容通过引用整体并入本文。
背景技术
内皮因子（除了别的以外，也称作CD105或edg-1）是在增殖中的血管内皮细胞中高水平表达的I型同源二聚膜糖蛋白（Burrows等人, 1995, Clin. Cancer Res. 1:1623-1634）。因此，内皮因子主要是进行活跃的血管生成的内皮细胞的增殖相关标志物。但是，内皮因子的有些表达是通过正常组织的血管内皮（Burrows等人, 同上; Wang等人, 1993, Int. J. Cancer 54:363-370）。已知人内皮因子会特异性地结合转化生长因子-β（TGF-β），并且内皮因子的推论氨基酸序列与β-聚糖（TGF-β受体的一种类型）具有强同源性。
在基于抗体的减少肿瘤脉管系统的方法中，已经靶向内皮因子（EDG），因为EDG是在内皮和白血病细胞上的一种增殖相关的抗原。在肿瘤相关的血管内皮中，它的表达被增量调节，且对血管生成而言是必需的。血管生成包括：导致新生血管形成的新毛细血管形成，以及现有脉管系统的维持。它是一个复杂的过程，包括一系列连续步骤，所述步骤包括：血管基膜和间质基质的内皮细胞介导的降解，内皮细胞的迁移，内皮细胞的增殖，以及通过内皮细胞形成毛细血管袢。
已经描述了几种抗-内皮因子抗体，尤其是抗-内皮因子单克隆抗体（“mAb”）。mAb SN6是用人白血病细胞的细胞膜的糖蛋白混合物免疫小鼠所生成的抗体（Haruta和Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7898-7902）。SN6是一种识别人内皮因子的鼠mAb。mAb 44G4是用人前-B白血病细胞的全细胞悬浮液免疫小鼠所生成的抗体（Gougos和Letarte, 1988, J. Immunol. 141:1925-1933; 1990, J. Biol. Chem. 265:8361-8364）。44G4也是一种识别人内皮因子的鼠mAb。mAb MJ7/18是用发炎的小鼠皮肤免疫大鼠所生成的抗体（Ge和Butcher, 1994, 同上）。MJ7/18也是一种识别鼠内皮因子的mAb。mAb Tec-11是用人脐静脉内皮细胞免疫小鼠所生成的抗体（Burrows等人, 1995, Clin. Cancer Res. 1:1623-1634）。Tec-11是一种具有限于人内皮因子的反应性的鼠mAb。针对内皮因子的抗体代表用于治疗多种疾病和病症（它们涉及血管生成，受血管生成的影响）的疗法的发展的一个重要领域。
血管生成是从现有血管形成新血管的生理过程（Varner, 等人, Cell Adh. Commun. 1995, 3:367-374; Blood, 等人, Biochim. Biophys. Acta. 1990, 1032:89-118; Weidner, 等人, J. Natl. Cancer Inst. 1992, 84:1875-1887）。已经提出，血管生成在正常过程和病理过程中都起作用。例如，血管生成过程涉入动物器官和组织的血管系统的发育。这些过程也涉入血管生成的暂时相，例如，在月经周期中，在妊娠中，和在伤口愈合中。另一方面，已知许多疾病与失调的血管生成有关。
在某些病理状态下，血管生成受到刺激，作为为受累组织内的细胞提供充足的血液和营养物供给的方式。许多这样的病理状态包括异常的细胞增殖和/或调节。因此，血管生成的抑制是治疗特征在于新血管形成的疾病的潜在有用方案。例如，血管生成涉入的病理状态包括：不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病和非眼疾病（例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变）、糖尿病肾病、慢性炎性疾病（例如，IBD）、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症、实体瘤和转移灶等。
发明内容
本文提供了一种结合内皮因子的人源化抗体或其抗原结合片段。这样的抗体具有体外和体内纯化、检测、诊断和治疗用途。本文也提供了这样的人源化抗体或其抗原结合片段：其结合内皮因子的一种或多种物质或变体，并抑制血管生成。本文另外提供了用结合内皮因子的人源化抗体或其抗原结合片段治疗血管生成相关疾病的方法。
本文所述的结合内皮因子的人源化抗体和抗原结合片段可以用于治疗或预防黄斑变性、脉络膜新血管生成（CNV）、糖尿病视网膜病变或增生性玻璃体视网膜病变。本文描述了通过施用本文所述的抗体和抗原结合片段来治疗或预防黄斑变性、CNV、糖尿病视网膜病变或增生性玻璃体视网膜病变的方法。本文所述的结合内皮因子的人源化抗体和抗原结合片段也可以收缩血管、抑制与眼病有关的内皮细胞增殖、清除出血的征状、治疗视力模糊、提供视力损失的停滞和/或防止血管的渗漏。本文所述的人源化抗体和抗原结合片段也可以用于药物中，所述药物用于治疗黄斑变性、CNV、糖尿病视网膜病变或增生性玻璃体视网膜病变。本文所述的人源化抗体和抗原结合片段也可以用于治疗癌症用的药物中。
本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其具有：具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。
本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区和具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区，其中，所述重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用丙氨酸（A）置换在位置49处的甘氨酸（G）；用丝氨酸（S）置换在位置76处的天冬酰胺（N）；用精氨酸（R）置换在位置77处的苏氨酸（T）；用缬氨酸（V）置换在位置78处的亮氨酸（L）；用异亮氨酸（I）置换在位置82a处的天冬酰胺（N）；用异亮氨酸（I）或亮氨酸（L）置换在位置89处的缬氨酸（V）；用精氨酸（R）或甘氨酸（G）置换在位置94处的苏氨酸（T）；用苏氨酸（T）置换在位置108处的亮氨酸（L）；用亮氨酸（L）置换在位置109处的缬氨酸（V）；和用丙氨酸（A）置换在位置113处的丝氨酸（S），其中使用Kabat编号系统；且所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用谷氨酰胺（Q）置换在位置1处的天冬氨酸（D）；用缬氨酸（V）置换在位置3处的谷氨酰胺（Q）；用亮氨酸（L）置换在位置4处的甲硫氨酸（M）；用丝氨酸（S）置换在位置5处的苏氨酸（T）；用苯丙氨酸（F）置换在位置36处的酪氨酸（Y）；用脯氨酸（P）置换在位置46处的亮氨酸（L）；用色氨酸（W）置换在位置47处的亮氨酸（L）；用缬氨酸（V）或丙氨酸（A）置换在位置60处的丝氨酸（S）；用丝氨酸（S）置换在位置70处的天冬氨酸（D）；用酪氨酸（Y）置换在位置71处的苯丙氨酸（F）；用丙氨酸（A）置换在位置100处的谷氨酰胺（G）；和用亮氨酸（L）置换在位置106处的异亮氨酸（I），其中使用Kabat编号系统。
本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其具有重链可变区和轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
（i）SEQ ID NO: 66的CDR1、SEQ ID NO: 67的CDR2和SEQ ID NO: 68的CDR3；
（ii）重链FR1，其具有SEQ ID NO: 44的氨基酸序列或包含一个或多个保守置换的SEQ ID NO: 44的氨基酸序列；
（iii）重链FR2，其具有SEQ ID NO: 45的氨基酸序列或包含丙氨酸（A）对位置49处的甘氨酸（G）的置换的SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，其中使用Kabat编号系统；和
（iv）重链FR3，其具有SEQ ID NO: 47的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 47的氨基酸序列：
（a）用丝氨酸（S）置换在位置76处的天冬酰胺（N）；
（b）用精氨酸（R）置换在位置77处的苏氨酸（T）；
（c）用缬氨酸（V）置换在位置78处的亮氨酸（L）；
（d）用异亮氨酸（I）置换在位置82a处的天冬酰胺（N）；
（e）用异亮氨酸（I）或亮氨酸（L）置换在位置89处的缬氨酸（V）；和
（f）用精氨酸（R）或甘氨酸（G）置换在位置94处的苏氨酸（T），其中使用Kabat编号系统；和
（v）重链FR4，其具有SEQ ID NO: 56的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 56的氨基酸序列：
（a）用苏氨酸（T）置换在位置108处的亮氨酸（L）；
（b）用亮氨酸（L）置换在位置109处的缬氨酸（V）；和
（c）用丙氨酸（A）置换在位置113处的丝氨酸（S），其中使用Kabat编号系统；
且所述轻链可变区包含：
（i）SEQ ID NO: 63的CDR1、SEQ ID NO: 64的CDR2和SEQ ID NO: 65的CDR3；
（ii）轻链FR1，其具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列：
（a）用谷氨酰胺（Q）置换在位置1处的天冬氨酸（D）；
（b）用缬氨酸（V）置换在位置3处的谷氨酰胺（Q）；
（c）用亮氨酸（L）置换在位置4处的甲硫氨酸（M）；和
（d）用丝氨酸（S）置换在位置5处的苏氨酸（T）；其中使用Kabat编号系统；和
（iii）轻链FR2，其具有SEQ ID NO: 20的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列：
（a）用苯丙氨酸（F）置换在位置36处的酪氨酸（Y）；
（b）用脯氨酸（P）置换在位置46处的亮氨酸（L）；和
（c）用色氨酸（W）置换在位置47处的亮氨酸（L），其中使用Kabat编号系统；和
（iv）轻链FR3，其具有SEQ ID NO: 28的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 28的氨基酸序列：
（a）用缬氨酸（V）或丙氨酸（A）置换在位置60处的丝氨酸（S）；
（b）用丝氨酸（S）置换在位置70处的天冬氨酸（D）；和
（b）用酪氨酸（Y）置换在位置71处的苯丙氨酸（F），其中使用Kabat编号系统；和
（v）轻链FR4，其具有SEQ ID NO: 35的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 35的氨基酸序列：
（a）用丙氨酸（A）置换在位置100处的甘氨酸（G）；和
（b）用亮氨酸（L）置换在位置106处的异亮氨酸（I），其中使用Kabat编号系统。
本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。
本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区和具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区，其中，所述重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用丙氨酸（A）置换在位置49处的甘氨酸（G）；用丝氨酸（S）置换在位置76处的天冬酰胺（N）；用精氨酸（R）置换在位置77处的苏氨酸（T）；用缬氨酸（V）置换在位置78处的亮氨酸（L）；用异亮氨酸（I）置换在位置82a处的天冬酰胺（N）；用异亮氨酸（I）或亮氨酸（L）置换在位置89处的缬氨酸（V）；用苏氨酸（T）或甘氨酸（G）置换在位置94处的精氨酸（R）；用苏氨酸（T）置换在位置108处的亮氨酸（L）；用亮氨酸（L）置换在位置109处的缬氨酸（V）；和用丙氨酸（A）置换在位置113处的丝氨酸（S），其中使用Kabat编号系统；且所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用谷氨酰胺（Q）置换在位置1处的天冬氨酸（D）；用缬氨酸（V）置换在位置3处的谷氨酰胺（Q）；用亮氨酸（L）置换在位置4处的甲硫氨酸（M）；用丝氨酸（S）置换在位置5处的苏氨酸（T）；用苯丙氨酸（F）置换在位置36处的酪氨酸（Y）；用亮氨酸（L）置换在位置46处的脯氨酸（P）；用亮氨酸（L）置换在位置47处的色氨酸（W）；用缬氨酸（V）或丙氨酸（A）置换在位置60处的丝氨酸（S）；用丝氨酸（S）置换在位置70处的天冬氨酸（D）；用苯丙氨酸（F）置换在位置71处的酪氨酸（Y）；用丙氨酸（A）置换在位置100处的谷氨酰胺（G）；和用亮氨酸（L）置换在位置106处的异亮氨酸（I），其中使用Kabat编号系统。
本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区和轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
（i）SEQ ID NO: 66的CDR1、SEQ ID NO: 67的CDR2和SEQ ID NO: 68的CDR3；
（ii）重链FR1，其具有SEQ ID NO: 44的氨基酸序列或包含一个或多个保守置换的SEQ ID NO: 44的氨基酸序列；
（iii）重链FR2，其具有SEQ ID NO: 45的氨基酸序列或包含丙氨酸（A）对位置49处的甘氨酸（G）的置换的SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，其中使用Kabat编号系统；和
（iv）重链FR3，其具有SEQ ID NO: 47的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 47的氨基酸序列：
（a）用丝氨酸（S）置换在位置76处的天冬酰胺（N）；
（b）用精氨酸（R）置换在位置77处的苏氨酸（T）；
（c）用缬氨酸（V）置换在位置78处的亮氨酸（L）；
（d）用异亮氨酸置换在位置82a处的天冬酰胺（N）；
（e）用异亮氨酸（I）或亮氨酸（L）置换在位置89处的缬氨酸（V）；和
（f）用苏氨酸（T）或甘氨酸（G）置换在位置94处的精氨酸（R），其中使用Kabat编号系统；和
（v）重链FR4，其具有SEQ ID NO: 56的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 56的氨基酸序列：
（a）用苏氨酸（T）置换在位置108处的亮氨酸（L）；
（b）用亮氨酸（L）置换在位置109处的缬氨酸（V）；和
（c）用丙氨酸（A）置换在位置113处的丝氨酸（S），其中使用Kabat编号系统；
且所述轻链可变区包含：
（i）SEQ ID NO: 63的CDR1、SEQ ID NO: 64的CDR2和SEQ ID NO: 65的CDR3；
（ii）轻链FR1，其具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列：
（a）用谷氨酰胺（Q）置换在位置1处的天冬氨酸（D）；
（b）用缬氨酸（V）置换在位置3处的谷氨酰胺（Q）；
（c）用亮氨酸（L）置换在位置4处的甲硫氨酸（M）；和
（d）用丝氨酸（S）置换在位置5处的苏氨酸（T）；其中使用Kabat编号系统；和
（iii）轻链FR2，其具有SEQ ID NO: 21的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列：
（a）用苯丙氨酸（F）置换在位置36处的酪氨酸（Y）；
（b）用亮氨酸（L）置换在位置46处的脯氨酸（P）；和
（c）用亮氨酸（L）置换在位置47处的色氨酸（W），其中使用Kabat编号系统；和
（iv）轻链FR3，其具有SEQ ID NO: 29的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 28的氨基酸序列：
（a）用缬氨酸（V）或丙氨酸（A）置换在位置60处的丝氨酸（S）；
（b）用丝氨酸（S）置换在位置70处的天冬氨酸（D）；和
（b）用苯丙氨酸（F）置换在位置71处的酪氨酸（Y），其中使用Kabat编号系统；和
（v）轻链FR4，其具有SEQ ID NO: 35的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 35的氨基酸序列：
（a）用丙氨酸（A）置换在位置100处的甘氨酸（G）；和
（b）用亮氨酸（L）置换在位置106处的异亮氨酸（I），其中使用Kabat编号系统。
本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的轻链可变区（VK1AA）和具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重链可变区（VH1A2）。
本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中：
（i）所述重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用丙氨酸（A）或丝氨酸（S）置换在位置49处的甘氨酸（G）；用异亮氨酸（I）置换在位置51处的丙氨酸（A）；用精氨酸（R）或天冬酰胺（Q）置换在位置52b处的赖氨酸（K）；用缬氨酸（V）置换在位置78处的亮氨酸（L），其中使用Kabat编号系统；和
（ii）所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用亮氨酸（L）置换在位置4处的甲硫氨酸（M）；用缬氨酸（V）置换在位置19处的丙氨酸（A）；用丝氨酸（S）置换在位置22处的苏氨酸（T）；用异亮氨酸（I）置换在位置48处的丙氨酸（A）；和用丝氨酸（S）置换在位置51处的苏氨酸（T），其中使用Kabat编号系统。
本文提供了根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 88、89、90、91或92所示的氨基酸序列的重链可变区；和具有如SEQ ID NO: 93、94、95、96、97、100、102或103所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个方面，本文所述的抗体和抗原结合片段是人源化的，且可以是任意同种型。在本文中也包括AVIMER、双体和重链二聚体（包括骆驼类和鲨鱼重链构建体）。
术语“抗体的抗原结合部分”、“抗原结合片段”、“抗原-结合域”、“抗体片段”或“抗体的功能片段”在本文中互换地用于表示，抗体的保留特异性地结合抗原的能力的一个或多个片段。被包括在这样的术语内的抗体片段的非限制性实例包括、但不限于：（i）Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；（ii）F(ab')2片段，即含有通过在铰链区处的二硫键相连的2个Fab片段的二价片段；（iii）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iv）Fv片段，其含有抗体的单条臂的VL和VH结构域；（v）dAb片段（Ward等人, (1989) Nature 341:544 546），其含有VH结构域；和（vi）分离的CDR。在该定义中另外包括“一半”抗体，其包括单个重链和单个轻链。在本文中也包括其它形式的单链抗体，诸如双体。
抗原结合片段可以是本文所述的那些中的任一种，包括、但不限于，Fab片段、Fab’、F(ab')2片段、Fv片段（包括非共价地和共价地连接的Fv片段）、scFv片段、单链结合多肽、Fd片段、Fv片段或dAb片段。在一个非限制性实施方案中，所述抗原结合片段是scFv，其可以任选地进一步与抗体的人Fc部分融合。
在一个非限制性实施方案中，所述结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO: 41、42或43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3、4或5所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用丝氨酸（S）置换在位置76处的天冬酰胺（N）；用精氨酸（R）置换在位置77处的苏氨酸（T）；用异亮氨酸（I）置换在位置82a处的天冬酰胺（N）；用异亮氨酸（I）或亮氨酸（L）置换在位置89处的缬氨酸（V）；用甘氨酸（G）置换在位置94处的苏氨酸（T）；用苏氨酸（T）置换在位置108处的亮氨酸（L）；用亮氨酸（L）置换在位置109处的缬氨酸（V）；和用丙氨酸（A）置换在位置113处的丝氨酸（S）；且所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用谷氨酰胺（Q）置换在位置1处的天冬氨酸（D）；用缬氨酸（V）置换在位置3处的谷氨酰胺（Q）；用丝氨酸（S）置换在位置5处的苏氨酸（T）；用苯丙氨酸（F）置换在位置36处的酪氨酸（Y）；用缬氨酸（V）或丙氨酸（A）置换在位置60处的丝氨酸（S）；用丝氨酸（S）置换在位置70处的天冬氨酸（D）；用丙氨酸（A）置换在位置100处的甘氨酸（G）；和用亮氨酸（L）置换在位置106处的异亮氨酸（I），其中使用Kabat编号系统。
在一个方面，可以修饰本文所述的抗体和抗原结合片段。例如，在一个实施方案中，可以修饰所述化合物，以改变所述化合物的药代动力学性质，例如，体内稳定性、溶解度、生物利用度或半衰期。这样的修饰包括、但不限于：聚乙二醇化和/或糖基化。
使用常规方法，可以配制本文所述的抗体和抗原结合片段，用于快速的或长期的递送。在一个非限制性实施方案中，快速递送是，例如，通过静脉内注射。在另一个非限制性实施方案中，长期递送是，例如，通过皮下蓄积。在另一个非限制性实施方案中，通过施用气雾剂来实现递送。
本文提供了本文所述的抗体和抗原结合片段和可接受的载体或赋形剂的组合物。
本文提供了多核苷酸（核酸），其包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
本文所述的抗体和其抗原结合片段可以用于治疗与血管生成有关的多种疾病和病症，例如，不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病（例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变）、糖尿病肾病、慢性炎性疾病（例如，IBD）、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症、实体瘤和转移灶。另外，本文所述的这些抗体和其抗原结合片段可以用于药物制剂中，所述药物制剂用于预防、治疗或诊断与血管生成有关的疾病和病症，例如，不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病和非眼疾病（例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变）、糖尿病肾病、慢性炎性疾病（例如，IBD）、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症、实体瘤和转移灶。
本文提供了一种通过给患者施用组合物来在所述患者中诱导针对内皮因子的宿主免疫应答的方法，其中所述组合物包含人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段，其诱导针对所述抗体或其片段特异性地识别的表位的有效宿主免疫应答。
所述宿主免疫应答可以是体液免疫应答或细胞介导的免疫应答。如果所述免疫应答是体液免疫应答，它可以是抑制血管生成、血管生成依赖性的疾病或血管生成依赖性的障碍的保护性抗体应答。免疫应答也包括细胞信号传递途径（例如Smad信号传递）的诱导或阻断。所述血管生成依赖性的疾病或障碍可以是，例如，不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病和非眼疾病（例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变）、糖尿病肾病、慢性炎性疾病（例如，IBD）、类风湿性关节炎、骨关节炎、不同形式的癌症（原发性肿瘤和转移灶）等。在一个实施方案中，所述保护性的抗体应答会抑制血管生成。
本文提供了一种影响与内皮因子和血管生成有关的细胞信号传递途径的方法。可以使血管生成细胞与足以改变细胞信号传递途径的量的本文所述的抗体或其抗原结合片段接触（体外、体内或离体）。在一个非限制性实施例中，响应于抗体结合，血管生成细胞中的Smad 1、5和/或8信号传递被抑制了约1.5倍或更多。在另一个非限制性实施例中，Smad 3水平增加了约1.5倍或更多，提示细胞正在恢复至静止状态。
本文提供了一种抑制受试者的血管生成或血管生成依赖性的疾病或障碍的方法，其中将本文提供的组合物施用给患者。所述血管生成依赖性的疾病或障碍可以是下述的任一种：不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病和非眼疾病（例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变）、糖尿病肾病、慢性炎性疾病（例如，IBD）、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症、实体瘤和转移灶。在一个实施方案中，抑制血管生成或血管生成依赖性的疾病或障碍会减轻与所述疾病或障碍有关的征状。在另一个实施方案中，抑制血管生成或血管生成依赖性的疾病或障碍会导致：肿瘤大小的减小、肿瘤进展的预防、细胞增殖的减少、细胞凋亡的增加或患者存活期的增加。抑制血管生成可以导致肿瘤大小的减小，或预防肿瘤进展。所述方法可以另外包括：外科手术切除癌症和/或给遭受癌症的患者施用一种或多种额外的抗癌剂或治疗。
本文提供了一种预防或治疗受试者的癌症或转移的方法，其中施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物的施用会延长被治疗的受试者的寿命。要治疗的癌症/肿瘤包括实体瘤；肿瘤可以是原发性肿瘤或转移性肿瘤。示例性的实体瘤属于选自下述的组织或器官：皮肤、黑素瘤、肺、胰腺、乳房、卵巢、结肠、直肠、胃、甲状腺、喉部、卵巢、前列腺、结肠直肠、头部、颈部、眼、嘴、喉、食管、胸部、骨、睾丸、淋巴、骨髓、骨、肉瘤、肾、汗腺、肝、肾、脑（例如多形性胶质母细胞瘤）和类似的组织。在一个非限制性实施例中，实体瘤是结肠肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、肺肿瘤、前列腺癌、卵巢肿瘤或这些肿瘤中任一种的转移灶。
所述方法可以另外包括：外科手术切除癌症，和/或施用一种或多种抗癌剂。可以在施用所述药物组合物之前、同时或之后，施用抗癌剂。可以在所述药物组合物之前一周内、在所述药物组合物之后一周内，施用抗癌剂，或者可以在所述药物组合物同一天施用抗癌剂。如果在所述药物组合物同一天施用抗癌剂，施用可以是并行的。
本文提供了一种预防或治疗癌症或转移的方法，其中外科手术切除癌症/肿瘤，并将抗癌剂或治疗和本文提供的组合物同时施用给受试者。
本文提供了一种抑制血管生成的方法，其中使细胞或组织接触足以抑制血管生成的治疗有效量的本文所述的抗体或其抗原结合片段。
本文提供了一种抑制癌细胞生长的方法，其中接触足以抑制癌细胞生长或造成癌细胞的细胞凋亡的治疗有效量的本文所述的抗体或其抗原结合片段。
本文提供了一种方法，所述方法包括：使组织接触本文所述的抗体或其抗原结合片段，其中接触会抑制血管生成。所述组织可以是培养的组织活组织检查样品，或可以存在于受试者中。
本文提供了一种预防或治疗细胞增殖（例如，血管生成）障碍的方法，其中给具有细胞增殖障碍的受试者或处于该风险中的受试者施用有效量的本文提供的组合物，以有效地治疗细胞增殖障碍。所述细胞增殖障碍可以是，例如良性或恶性实体瘤或非实体瘤，所述肿瘤可以是转移性的或非转移性的。所述治疗可以导致改善受试者的病症，且可以通过确定是否已经发生下述因素中的一个或多个来评估：细胞增殖的减少、细胞数目的减少、细胞凋亡的增加或至少一部分构成细胞增殖障碍的细胞的存活期减小。在某些情况下，这些事件中的一个或多个可能导致癌症的部分或完全消除和患者存活期的延长。任选地，所述方法可以另外包括：给所述受试者施用抗癌剂或治疗。
本文提供了一种治疗患者的糖尿病视网膜病变、黄斑变性、脉络膜新血管生成或新生血管性青光眼的方法，其中给患者施用治疗有效量的本文提供的组合物。所述治疗可以导致改善受试者的病症，且可以通过确定是否已经发生下述因素中的一个或多个来评估：黄斑水肿的减少、CNV面积的减小或视敏度的增加。
在本文提供的方法中，所述受试者可以是人或非人受试者。本文提供的组合物和抗癌剂或治疗可以施用一次或多次，取决于患者的健康、疾病或病症的进展、和治疗的效能。在治疗过程中，可以调节疗法和治疗。
可以局部地（locally）、区域性地（regionally）或全身地施用组合物，例如，通过皮下的、玻璃体内的、真皮内的、静脉内的、动脉内的、腹膜内的或肌肉内的注射来施用。
另外，本文所述的人源化抗体和抗原结合片段也可以与已知的用于治疗黄斑变性、CNV、糖尿病视网膜病变或增生性玻璃体视网膜病变的疗法和/或化合物联合使用。这样的化合物的实例包括、但不限于：贝伐单抗（阿伐他汀®）、ranibizumab（LUCENTIS®）、aflibercept（VEGF-Trap）或Macugen。除了本文所述的施用模式以外，所述人源化的抗-内皮因子抗体和抗原结合片段可以经由玻璃体内途径来施用。玻璃体内施用模式的非限制性实例包括：玻璃体内注射和使用玻璃体内植入物。
另一个方面是，通过施用本文所述的抗体或其抗原结合片段的组合物来治疗受试者的慢性炎性疾病。慢性炎性疾病的非限制性实例包括：IBD、克罗恩病和溃疡性结肠炎。
另一个方面是，通过施用本文所述的抗体或其抗原结合片段的组合物来治疗受试者的类风湿性关节炎。
另一个方面是，通过施用本文所述的抗体或其抗原结合片段的组合物来治疗受试者的骨关节炎。
通过不同的方法，可以评估具有类风湿性关节炎和/或骨关节炎的受试者的治疗，所述方法包括：根据公开的指南测量的ACR评分的适当分类的改善。
本文提供了一种监测本文提供的方法中的任意一种或多种的效能的方法。增加的可溶性内皮因子的水平，已经与癌症患者的降低的存活期相关联。因而，在一个方面，可以在治疗之前和过程中，监测可溶性内皮因子的水平。因此，可溶性内皮因子的水平的降低可以指示，治疗方案有效地治疗患者。
本发明的一个实施方案预见到，本发明的任一种组合物用于配制药物的用途，所述药物用于本发明的障碍。可以基于需要治疗的患者/受试者的身体特征来配制药物，且可以基于例如癌性组织的阶段，配制成单个制剂或多个制剂。可以将本发明的药物包装在具有适当标签的合适药物包中以分配给医院和诊所，其中所述标签是用于指示治疗受试者的本文所述的障碍。药物可以包装成单个或多个单元。在药物包中可以包括关于本发明的组合物的剂量和施用的说明书。
本文提供了一种诊断方法，其中提供来自待测患者的实体瘤的癌细胞或血浆样品，检测至少一种基因或基因产物在样品中的表达，所述基因或基因产物选自其表达已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的基因或基因产物集合，其中所述至少一种基因或基因产物选自下述的一种或多种基因或基因产物：VEGF、VEGF受体、HIF-1α、胎盘生长因子受体和CD105，并对比在患者样品中检测到的至少一种基因或基因产物的表达水平和已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的至少一种基因或基因产物的表达水平。在一个实施方案中，所述血管生成抑制剂选自：VEGF受体抑制剂、VEGF抑制剂和内皮因子抑制剂。
本文提供了一种试剂盒，其用于检测已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的基因在癌细胞或人血浆样品中的表达水平。在一个实施方案中，一种或多种基因是选自：VEGF、VEGF受体、HIF-1α、胎盘生长因子受体和内皮因子。
通过引用并入
在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文中，其程度如同具体地且单个地指出每篇单独的出版物或专利申请通过引用整体并入，除非另外特别指出。本申请含有对氨基酸序列的提及，所述氨基酸序列已经作为序列表文本文件“35882-706-202-SeqList.txt”（文件大小67,843千字节（KB），于2010年3月30日建立）与本文同时呈交。根据37 C.F.R. §1.52(e)(5)，前述序列表通过引用整体并入本文。
附图说明
图1提供了人源化的O2-Vĸ1-39可变（VL）轻链，其具有嫁接在人序列O2-Vĸ1-39的框架区（FR）1-3和来自人Jĸ4序列的框架区4（SEQ ID NO: 4）（都为粗体）之间的单克隆鼠嵌合的TRC105 VL CDR（带有下划线）。在所述序列（在SEQ ID NO: 86中公开的序列）的位置1、3、4、5、36、46、47、60、70、71、100和106处，指示可以对人FR做出的变化（在人源化序列下面以斜体显示），其中使用Kabat编号系统。
图2提供了人源化的VH3-15可变（VH）重链，其具有嫁接在人序列VH3-15的框架区（FR）1-3和人JH4序列的框架区4（SEQ ID NO: 42）（都为粗体）之间的单克隆鼠单克隆鼠嵌合的TRC105 VH CDR（带有下划线）。在所述序列（在SEQ ID NO: 87中公开的序列）的位置49、76、77、78、82a、89、94、108、109和113处，指示可以对人FR做出的一个或多个变化（在人源化序列下面以斜体显示），其中使用Kabat编号系统。
图3提供了TGF-β/ALK5信号传递途径的简图。TGF-β/ALK5途径（A）会导致细胞增殖和迁移的抑制。TGF-β/ALK1途径（B）会诱导内皮细胞增殖和迁移，并需要CD105（内皮因子）进行ALK1信号传递。虚线指示无活性的或阻断的途径。加粗的箭头指示信号传递途径的刺激。
图4提供了根据本文所述的发明生产的示例性的小鼠和人源化的VK链（按照出现次序，分别是SEQ ID NO 1-5）和VH链（按照出现次序，分别是SEQ ID NO 39-43）的氨基酸序列比对。
图5提供了根据本文所述的发明生产的示例性的小鼠和超人源化的VK链（按照出现次序，分别是SEQ ID NO 1和69-72）和VH链（按照出现次序，分别是SEQ ID NO 39和73-75）的氨基酸序列比对。
图6提供了根据本文所述的发明生产的示例性的小鼠和人源化的和超人源化的VK链（按照出现次序，分别是SEQ ID NO 1、3和70）和VH链（按照出现次序，分别是SEQ ID NO 39、41和74）的氨基酸序列比对和对比。
图7解释了在竞争ELISA试验中人源化的变体构建体与内皮因子的结合。
图8. 使用人源化的和人源化的/去免疫化的抗体的抗-CD105竞争ELISA。将不同浓度的每种抗体与固定浓度的生物素化的参照抗-CD105抗体（6.25 ng/ml）相混合，并与CD105（100 ng/ml）结合，所述CD105捕获在Nunc MaxiSorp平板上。通过抗生蛋白链菌素-HRP和TMB底物，检测结合。在平板读数器上测量在450nm的吸光度（OD），并相对于实验抗体浓度绘图。
图9解释了变体VK1AAVH1A + 含有VK2的对照的结合试验数据。
图10解释了嵌合体相对于VK1AAVH1A2和VK2AAVH1A2的结合试验数据。
图11解释了嵌合体相对于VK2AAVH1Q的结合试验数据。
图12解释了嵌合体相对于VK2AAVH1R的结合试验数据。
图13解释了嵌合体相对于VK1AAVH1A2的结合试验数据。
图14解释了嵌合体相对于VK1AAVH1Q的结合试验数据。
图15解释了嵌合体相对于VK1AAVH1R的结合试验数据。
图16解释了嵌合体相对于VK2AAVH1A2的结合试验数据。
图17解释了先导人源化的去免疫化的重链可变区，其中CDR显示为粗体并带有下划线（在SEQ ID NO: 89中公开的序列）。在所述序列（在SEQ ID NO: 116中公开的序列）的鉴定位置处，指出了可以做出的变异（在人源化序列下面以斜体显示），其中使用Kabat编号系统。变异可以作为单突变或作为超过一个突变而产生，且变异可以与突变任意组合地产生。
图18解释了先导人源化的去免疫化的轻链可变区，其中CDR显示为粗体并带有下划线（在SEQ ID NO: 93中公开的序列）。在所述序列（在SEQ ID NO: 117中公开的序列）的鉴定位置处，指出了可以做出的变异（在人源化序列下面以斜体显示），其中使用Kabat编号系统。变异可以作为单突变或作为超过一个突变而产生，且变异可以与突变任意组合地产生。
图19解释了使用iTope™对重链（SEQ ID NO: 41）的区域的分析。以一个氨基酸增量，将跨整个序列的肽测试为9聚体肽。用“O”（如果结合评分是0.55-0.6）和用“X”（如果结合评分>0.6）指示预测的每个残基（作为核心9聚体肽的p1锚）与MHC II类等位基因的结合。在“iTope”列中，指出了含有潜在免疫原性肽的区域，深灰色指示混杂的高亲和力MHC II类结合肽，浅灰色指示混杂的中等亲和力MHC II类结合肽。在“总”和“高亲和力”列中，显示了预测会结合的MHC II类等位基因的数目。在“序列”列的相反类型中，显示了被鉴别为种系序列的潜在p1锚残基。
图20解释了使用iTope™对重链变体（SEQ ID NO: 118）的变体区域的分析。以一个氨基酸增量，将跨整个序列的肽测试为9聚体肽。用“O”（如果结合评分是0.55-0.6）和用“X”（如果结合评分>0.6）指示预测的每个残基（作为核心9聚体肽的p1锚）与MHC II类等位基因的结合。在“iTope”列中，指出了含有潜在免疫原性肽的区域，深灰色指示混杂的高亲和力MHC II类结合肽，浅灰色指示混杂的中等亲和力MHC II类结合肽。在“总”和“高亲和力”列中，显示了预测会结合的MHC II类等位基因的数目，显示了结合的差异。在“序列”列的相反类型中，显示了被鉴别为种系序列的潜在p1锚残基，变体中的氨基酸差异带有框。
图21解释了使用iTope™对轻链（SEQ ID NO: 3）的区域的分析。以一个氨基酸增量，将跨整个序列的肽测试为9聚体肽。用“O”（如果结合评分是0.55-0.6）和用“X”（如果结合评分>0.6）指示预测的每个残基（作为核心9聚体肽的p1锚）与MHC II类等位基因的结合。在“iTope”列中，指出了含有潜在免疫原性肽的区域，深灰色指示混杂的高亲和力MHC II类结合肽，浅灰色指示混杂的中等亲和力MHC II类结合肽。在“总”和“高亲和力”列中，显示了预测会结合的MHC II类等位基因的数目。在“序列”列的相反类型中，显示了被鉴别为种系序列的潜在p1锚残基。
图22解释了使用iTope™对轻链（SEQ ID NO: 101）的变体区域的分析。以一个氨基酸增量，将跨整个序列的肽测试为9聚体肽。用“O”（如果结合评分是0.55-0.6）和用“X”（如果结合评分>0.6）指示预测的每个残基（作为核心9聚体肽的p1锚）与MHC II类等位基因的结合。在“iTope”列中，指出了含有潜在免疫原性肽的区域，深灰色指示混杂的高亲和力MHC II类结合肽，浅灰色指示混杂的中等亲和力MHC II类结合肽。在“总”和“高亲和力”列中，显示了预测会结合的MHC II类等位基因的数目，显示了结合的差异。在“序列”列的相反类型中，显示了被鉴别为种系序列的潜在p1锚残基，变体中的氨基酸差异带有框。
图23解释了MHC II类同种异型在世界人群和研究人群中的频率。
图24使用来自20个供体的PBMC，在EpiScreen™时程T细胞试验中测试了嵌合的抗-内皮因子抗体、人源化的抗-内皮因子抗体VK1VH1和人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体VK1AAVH1A2。在第5、6、7和8天，对与实验抗体一起温育的PBMC主培养物（Bulk culture）取样，并用3H-胸苷脉冲处理。收获细胞，并通过闪烁计数，测量放射性的掺入。取每个一式三份样品的结果的平均值，并通过转化成刺激指数（SI）来标准化。对于嵌合抗体TRC105（图24A）、VK1VH1（图24B）和VK1AAVH1A2（图24C），在上面显示了每种供体的每个时间点的SI。用虚线突出了用于测定SI≥2的阳性应答的截止值，并指出（*）显著的应答（在student氏t-检验中，p<0.05）。
具体实施方式
应当理解，本申请不限于特定制剂或工艺参数，因为这些当然可以变化。还应当理解，在本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，无意进行限制。此外，应当理解，与本文所述的那些类似或等效的许多方法和材料可以用于实践本发明。
根据本申请，可以采用属于本领域技能的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。在本领域中充分解释了这样的技术。参见，例如，Sambrook等人, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”第I-III卷[Ausubel, R. M., 编(1994)]；“Cell Biology: A Laboratory Handbook”第I-III卷[J. E. Celis, 编(1994))]；“Current Protocols in Immunology”第I-III卷[Coligan, J. E., 编(1994)]；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J. Gait编1984)；“Nucleic Acid Hybridization”[B.D. Hames和S.J. Higgins编(1985)]；“Transcription And Translation”[B.D. Hames和S.J. Higgins, 编(1984)]；“Animal Cell Culture”[R.I. Freshney, 编(1986)]；“Immobilized Cells And Enzymes”[IRL Press, (1986)]; B. Perbal, “A Practical Guide To Molecular Cloning”(1984)，它们各自特别地通过引用整体并入本文。
已经针对内皮因子产生了鼠单克隆抗体（mAb），其调节内皮因子活性，并从而抑制血管生成和/或抑制小血管的血管舒张。这些鼠抗体描述在美国专利5,928,641、6,200,566, 6,190,660和7,097,836中，它们特此整体并入。另外，已经证实了许多这样的抗体的离体和体内有效性；这些结合内皮因子的单克隆抗体具有作为调节内皮因子的化合物的利益。但是，这些鼠抗体的治疗用途是不可行的，因为它们的施用具有许多限制，包括，例如，以人抗-小鼠抗体（HAMA）形式时的免疫原性。制备人源化抗体来解决这些反应。
本文描述了结合内皮因子的人源化抗体，其表现出降低的免疫原性，并同时维持和/或提高它们的特异性。另外，为了解决与鼠抗体有关的问题，本文描述了结合内皮因子并减少和/或抑制血管生成的人源化抗体，其表现出降低的免疫原性，并同时维持和/或提高它们的特异性。这些人源化的内皮因子抗体可用于诊断和治疗不同的病症和疾病，以及用于纯化和检测内皮因子。
I. 抗-内皮因子抗体
本文提供了结合内皮因子的人源化抗体和其抗原结合片段。在包含和支持现有脉管系统的细胞以及促进新脉管系统的生长并变成其一部分的细胞上，可以发现内皮因子。这些抗体和抗原结合片段可以结合内皮因子，并从而抑制血管生成、抑制现有脉管系统或现有脉管系统的维持和/或抑制小血管膨胀。在下文中，提及的术语“抗体”应当视作包括本文所述的任一种抗原结合片段，且所述术语在适用之处是可互换的。除了它们用于纯化内皮因子的用途以外，这些抗体可用于纯化、检测和诊断目的以及治疗目的。本文提供的抗体可以用于配制用于治疗多种病症和疾病的药物制剂、治疗所述病症和疾病的方法和检测方法或诊断方法。本文使用的血管生成包括新血管的生长和/或发育（也称作新生血管形成）、小血管的膨胀、过度的或延长的血管生长和现有脉管系统的维持。血管生成病症和疾病表示与血管生成有关、由血管生成造成或伴随血管生成的那些疾病和病症。这样的疾病的非限制性实施例包括，例如，不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病（例如，黄斑变性、CNV、糖尿病视网膜病变）、糖尿病肾病、慢性炎性疾病（例如，IBD）、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症（原发性肿瘤和转移灶）。
A. 抗体术语
本文使用的术语“抗体”表示免疫球蛋白（Ig），无论天然的还是部分地或完全地合成生产的。该术语也涵盖具有结合域的任意多肽或蛋白，所述结合域是抗原结合域或与抗原结合域同源。该术语另外包括“抗原结合片段”和诸如下述的类似结合片段的其它可互换的术语。该术语也包括互补性决定区（CDR）移植的抗体和其它人源化抗体（包括CDR修饰和框架区修饰）。
天然抗体和天然免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由2个相同的轻（L）链2个相同的重（L）链组成。每个轻链通常通过一个共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间存在差异。每个重链和轻链也具有规则分布的链内二硫键。每个重链具有在一个末端处的可变结构域（“VH”），其后是许多恒定结构域（“CH”）。每个轻链具有在一个末端处的可变结构域（“VL”）和在它的另一个末端处的恒定结构域（“CL”）；轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对齐，轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基会形成轻链和重链可变结构域之间的接口。
本文使用的术语“合成的多核苷酸”、“合成的基因”或“合成的多肽”表示，对应的多核苷酸序列或其一部分或氨基酸序列或其一部分源自已经设计的序列，或从新合成，或与等效的天然存在的序列相比被修饰。通过本领域已知的方法，可以制备合成的多核苷酸（抗体或抗原结合片段）或合成的基因，所述方法包括但不限于：核酸或氨基酸序列的化学合成。合成的基因通常在氨基酸或多核苷酸水平（或在两个水平）不同于天然存在的基因，且通常位于合成的表达控制序列的背景内。例如，合成的基因序列可以包括已经改变的氨基酸或多核苷酸序列，例如，通过置换、删除或添加一个或多个氨基酸或核苷酸，从而提供不同于源序列的抗体氨基酸序列或多核苷酸编码序列。与天然的基因相比，合成的基因多核苷酸序列可能不一定编码具有不同氨基酸的蛋白；例如，它们也可以包括合成的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列掺入不同的密码子，但是它们编码相同的氨基酸（即，核苷酸变化代表在氨基酸水平的沉默突变）。
关于抗体，术语“可变结构域”表示，在每个特定抗体与它的特定抗原的结合和特异性中使用的抗体可变结构域。但是，变异性不均匀地分布在抗体的可变结构域中。相反，它集中在3个称作高变区（也称作CDR）的区段中，所述区段在轻链和重链可变结构域中。可变结构域的更高度保守的部分被称作“框架区”或“FR”。未修饰的重链和轻链的可变结构域各自含有4个FR（FR1、FR2、FR3和FR4），它们主要采取β-折叠构型，其间散布着3个CDR，所述CDR形成环，并在某些情况下连接β-折叠结构部分。每个链中的CDR被FR保持紧密靠在一起，并与来自其它链的CDR一起，促进抗体的抗原结合位点的形成（参见Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.（1991）, 第647-669页）。
在本文中使用的术语“高变区”和“CDR”表示，抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。CDR包括来自3个序列区的氨基酸残基，所述序列区以互补方式结合抗原，并被称作CDR1、CDR2和CDR3（对于每个VH和VL链）。根据Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.（1991）），在轻链可变结构域中，CDR通常大致对应着残基24-34（CDRL1）、50-56（CDRL2）和89-97（CDRL3），在重链可变结构域中，CDR通常大致对应着残基残基31-35（CDRH1）、50-65（CDRH2）和95-102（CDRH3）。应当理解，不同抗体的CDR可以含有插入序列，因而氨基酸编号可能不同。Kabat编号系统用下述编号方案来补偿这样的插入序列：所述方案利用与特定残基相连的字母（例如，在轻链中，CDRL1的27A、27B、27C、27D、27E和27F）来反映在不同抗体之间的编号的任何插入。或者，根据Chothia和Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917（1987）），在轻链可变结构域中，CDR通常大致对应着残基26-32（CDRL1）、50-52（CDRL2）和91-96（CDRL3），在重链可变结构域中，CDR通常大致对应着残基26-32（CDRH1）、53-55（CDRH2）和96-101（CDRH3）。
本文使用的“框架区”或“FR”表示，形成抗原结合槽或沟的一部分的框架氨基酸残基。在有些实施方案中，所述框架残基形成环，所述环是抗原结合槽或沟的一部分，且在所述环中的氨基酸残基可以接触或不接触抗原。框架区通常包括在CDR之间的区域。根据Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.（1991）），在轻链可变结构域中，FR通常大致对应着残基0-23（FRL1）、35-49（FRL2）、57-88（FRL3）和98-109，在重链可变结构域中，FR通常大致对应着残基0-30（FRH1）、36-49（FRH2）、66-94（FRH3）和103-133。如上面关于轻链的Kabat编号所讨论的，重链也以类似的方式补偿插入（例如，在重链中，CDRH1的35A、35B）。或者，根据Chothia和Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917（1987）），在轻链可变结构域中，FR通常大致对应着残基0-25（FRL1）、33-49（FRL2）53-90（FRL3）和97-109（FRL4），在重链可变结构域中，FR通常大致对应着残基0-25（FRH1）、33-52（FRH2）、56-95（FRH3）和102-113（FRH4）。
通过检查抗体重链和/或抗体轻链的三维结构，可以评估和测定FR的环氨基酸。可以分析三维结构中的溶剂可接近的氨基酸位置，因为这样的位置可能形成环和/或提供在抗体可变结构域中的抗原接触。一些溶剂可接近的位置可以耐受氨基酸序列变化，其它位置（例如，结构位置）通常更少变化。从晶体结构或蛋白建模，可以衍生出抗体可变结构域的三维结构。
抗体的恒定结构域（Fc）不直接参与抗体与抗原的结合，但是相反地表现出不同的效应子功能，诸如通过与例如Fc受体（FcR）的相互作用，抗体参与抗体依赖性的细胞毒性。Fc结构域也可以增加抗体在施用给患者以后在循环中的生物利用度。
根据它们的重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白归入不同的类别。存在5个主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们中的几个可以进一步分成子类（同种型），例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别的免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域（Fc）分别被称作α、δ、ε、γ和 μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
基于它们的恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任意脊椎动物物种的抗体（免疫球蛋白）的“轻链”归入2个明显不同的类型（称作kappa或（“κ”或“K”）和lambda或（“λ”））之一。
术语“抗体的抗原结合部分”、“抗原结合片段”、“抗原结合域”、“抗体片段”或“抗体的功能片段”在本文中互换地用于表示抗体的一个或多个片段，所述片段保留特异性地结合抗原的能力。在这样的术语内包括的抗体片段的非限制性实施例包括、但不限于：（i）Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；（ii）F(ab’)2片段，即含有2个通过在铰链区处的二硫键相连的Fab片段的二价片段；（iii）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iv）含有抗体的单臂的VL和VH结构域的Fv片段；（v）dAb片段（Ward等人,（1989）Nature 341:544 546），其含有VH结构域；和（vi）分离的CDR。在该定义中另外包括含有单个重链和单个轻链的“一半”抗体。在本文中也包括其它形式的单链抗体，诸如双特异抗体。
通过用蛋白酶（诸如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶）处理Ig，可以生产“F(ab’)2”和“Fab'”部分，且包括通过在二硫键附近消化免疫球蛋白所产生的抗体片段，所述二硫键存在于2个重链中的每一个内的铰链区之间。例如，木瓜蛋白酶会在存在于2个重链中的每一个内的铰链区之间的二硫键的上游切割IgG，以产生2个同源的抗体片段，其中由VL和CL组成的轻链（轻链恒定区）和由VH和CH γ 1（γ1）区组成的重链片段（在重链的恒定区中）在它们的C端区域通过二硫键相连。这2个同源的抗体片段中的每一个被称作Fab'。胃蛋白酶也会在存在于2个重链中的每一个内的铰链区之间的二硫键的上游切割IgG，以产生这样的抗体片段：所述片段稍微大于2个上述的Fab'在其中在铰链区处相连的片段。该抗体片段被称作F(ab’)2。
Fab片段也含有轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域（CH1）。Fab' 片段与Fab片段的差别在于，在重链CH1结构域的羧基端处添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本文中表示这样的Fab'：其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离的巯基。F(ab’)2抗体片段最初被生产为Fab'片段对，它们具有在它们之间的铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
“Fv”表示含有完整抗原识别和抗原结合位点的抗体片段。该区域由紧密地非共价或共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成（本领域已经描述了二硫键连接的Fv，Reiter等人（1996）Nature Biotechnology 14:1239-1245）。在该构型中，每个可变结构域的3个CDR相互作用，以限定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。来自每个VH和VL链的一个或多个CDR的组合一起赋予抗体抗原结合特异性。例如，应当理解，例如，当转移至受体抗体的VH和VL链或其抗原结合片段上时，CDRH3和CDRL3足以赋予抗体抗原结合特异性，且可以使用本文所述的任意技术测试该CDR组合的结合、亲和力等。甚至单个可变结构域（或仅包含对抗原特异性的3个CDR的Fv的一半）具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力可能比与第二个可变结构域相组合时更低。此外，尽管Fv片段的2个结构域（VL和VH）由单独的基因编码，使用重组方法，通过合成的连接物可以连接它们，所述连接物使它们能够制成单个蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子（称作单链Fv（scFv）; Bird等人（1988）Science 242:423-426; Huston等人（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；和Osbourn等人（1998）Nat. Biotechnol. 16:778）。在术语抗体的“抗原结合部分”内，也意图包括这样的scFv。可以将特定scFv的任意VH和VL序列连接到Fc区cDNA或基因组序列上，以便制备编码完整Ig（例如，IgG）分子或其它同种型的表达载体。VH和VL也可以用于制备Fab、Fv或Ig的其它片段，其中使用蛋白化学或重组DNA技术。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在有些实施方案中，所述Fv多肽另外包含在VH和VL结构域之间的多肽连接物，其使sFv能够形成抗原结合所希望的结构。关于sFv的综述，参见，例如，Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg和Moore编Springer-Verlag, New York,第269-315页（1994）。
术语“AVIMER™”表示一类人起源的治疗蛋白，它们与抗体和抗体片段无关，由几个模块的且可重复使用的结合域组成，所述结合域称作A-结构域（也称作A类模块、补体型重复序列或LDL-受体类A结构域）。它们通过体外外显子改组和噬菌体展示从人胞外受体结构域发展而成（Silverman等人, 2005, Nat. Biotechnol. 23:1493-1494; Silverman等人, 2006, Nat. Biotechnol. 24:220）。得到的蛋白可以含有多个独立结合域，它们与单表位结合蛋白相比，可以表现出提高的亲和力（在某些情况下，低于纳摩尔）和特异性。参见，例如，美国专利申请公开号2005/0221384、2005/0164301、2005/0053973和2005/0089932、2005/0048512和2004/0175756，它们各自特此通过引用整体并入本文。
已知的217个人A-结构域中的每一个包含约35个氨基酸（约4 kDa）；这些结构域被连接物隔开，所述连接物的长度是平均5个氨基酸。天然A-结构域快速地且有效地折叠成均匀的、稳定的结构，这主要由钙结合和二硫键形成来介导。该共有结构需要仅12个氨基酸的保守支架基序。最终结果是含有多个结构域的单个蛋白链，每个结构域代表单独的功能。所述蛋白的每个结构域独立地结合，且每个结构域的活力贡献是累加的。这些蛋白被称作来自亲合力多聚体的“AVIMERs™”。
术语“双特异抗体”表示具有2个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在相同多肽链（VH-VL）中与轻链可变结构域（VL）相连的重链可变结构域（VH）。通过使用太短而不允许在相同链上的2个结构域之间配对的连接物，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，并建立2个抗原结合位点。双特异抗体更完整地描述在，例如，EP 404,097; WO 93/11161；和Hollinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 6448（1993）。
抗原结合多肽也包括重链二聚体，例如，来自骆驼类（camelids）和鲨鱼的抗体。骆驼类和鲨鱼抗体包括V-样和C-样结构域的2条链的同源二聚体对（都不具有轻链）。因为骆驼类的重链二聚体IgG的VH区不一定与轻链产生疏水相互作用，在骆驼类中，通常接触轻链的重链中的该区域变成亲水氨基酸残基。重链二聚体IgG的VH结构域称作VHH结构域。鲨鱼Ig-NAR包括1个可变结构域（称作V-NAR结构域）和5个C-样恒定结构域（C-NAR结构域）的同源二聚体。在骆驼类中，抗体所有组成部分的多样性由VH或VHH区中的CDR 1、2和3决定。骆驼VHH区中的CDR3的特征在于它的相对长的长度，平均16个氨基酸（Muyldermans等人, 1994, Protein Engineering 7（9）: 1129）。这不同于许多其它物种的抗体的CDR3区。例如，小鼠VH的CDR3具有平均9个氨基酸。通过例如在美国专利申请系列号20050037421中公开的方法，可以制备骆驼类-衍生的抗体可变区（它们维持骆驼类可变区的体内多样性）的文库。
“人源化”形式的非人（例如，鼠）抗体包括：含有源自非人Ig的最小序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是这样的人Ig（受体抗体）：其中受体的一个或多个CDR被来自非人物种（诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物）抗体（供体抗体）的CDR替换，后者具有希望的特异性、亲和力和结合功能。在某些情况下，人Ig的一个或多个FR氨基酸残基被对应的非人氨基酸残基替换。此外，人源化抗体可以含有在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。如果需要的话，可以做出这些修饰，以优化抗体性能。人源化抗体可以包含基本上所有的、或至少1个（且在有些情况下，2个）可变结构域，其中所有或基本上所有的高变区对应非人免疫球蛋白的高变区，所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。所述人源化抗体还可以任选地包括免疫球蛋白恒定区（Fc）的至少一部分，通常人免疫球蛋白的至少一部分。关于细节, 参见Jones等人, Nature 321: 522-525 (1986)；Reichmann等人, Nature 332: 323-329 (1988)；和Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)。
人源化抗体也包括这样的抗体，其中重链和轻链的部分或所有CDR源自非人单克隆抗体，可变区的基本上所有的剩余部分源自人可变区（重链和轻链二者），且恒定区源自人恒定区。在一个实施方案中，重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3区域源自非人抗体。在另一个实施方案中，所述重链和轻链的至少一个CDR（例如，CDR3）源自非人抗体。CDR1、CDR2和CDR3的不同组合可以源自非人抗体，并在本文中预见到。在一个非限制性实施例中，重链和轻链各自的CDR1、CDR2和CDR3区域中的一个或多个源自鼠嵌合的单克隆抗体克隆TRC105。
本文使用的术语“单克隆抗体”表示从基本上同质的抗体群体得到的抗体，即，除了可能以微量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，不同于常规的（多克隆的）抗体制品（它们可以包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体），每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰词“单克隆”指示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体得到，不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，单克隆抗体可以通过Kohler等人, Nature 256:495 (1975)首先描述的杂交瘤方法来制备，或可以通过重组DNA方法（参见，例如，美国专利号4,816,567）来制备。在某些实施方案中，使用例如在Clackson等人, Nature 352:624-628（1991）和Marks等人, J. Mol. Biol. 222:581-597（1991）中所述的技术，可以从噬菌体抗体文库分离出单克隆抗体。
通过饱和硫酸铵沉淀、优球蛋白（euglobulin）沉淀法、己酸方法、辛酸方法、离子交换色谱法（DEAE或DE52）或使用抗-Ig柱或蛋白A、G或L柱的亲和色谱法（诸如下面更详细地描述的那些），可以从上述的培养物上清液或腹水分离和纯化抗体。
用于本文所述的组合物和方法中的示例性抗体是完整的免疫球蛋白分子，例如，人源化抗体，或人源化Ig分子的含有抗原结合位点（即，互补位）或单个重链和单个轻链的那些部分，包括在本领域中称作Fab、Fab’、F(ab)’、F(ab')2、Fd、scFv、可变重结构域、可变轻结构域、可变NAR结构域、双特异性的scFv、双特异性的Fab2、三特异性的Fab3和单链结合多肽的那些部分，和也称作抗原结合片段的其它片段。当构建免疫球蛋白分子或其片段时，可变区或其部分可以与一个或多个恒定区或其部分融合、连接或以其它方式相连，以生成本文所述的任意抗体其片段。这可以以本领域已知的多种方式来实现，包括但不限于：分子克隆技术，或直接合成编码所述分子的核酸。构建这些分子的示例性的非限制性方法也可以参见本文所述的实施例。
在一个示例性的实施方案中，本申请预见到结合内皮因子的单链结合多肽，其具有重链可变区和/或轻链可变区，并任选地具有免疫球蛋白Fc区。在一个示例性的实施方案中，本申请预见到具有重链可变区和/或轻链可变区的单链结合多肽，其结合内皮因子，并抑制血管生成，并任选地具有免疫球蛋白Fc区。这样的分子是单链可变片段，其任选地通过免疫球蛋白Fc区的存在而具有效应子功能或增加的半衰期。制备单链结合多肽的方法是本领域已知的（例如，美国专利申请号2005/0238646）。
术语“种系基因区段”或“种系序列”表示来自所述种系的基因（单倍体配偶子和形成它们的那些二倍体细胞）。种系DNA含有多个编码单个Ig重链或轻链的基因区段。这些基因区段被携带在生殖细胞中，但是在它们排列成功能基因之前，不能被转录和翻译成重链和轻链。在骨髓中的B-细胞分化过程中，这些基因区段被能够产生超过108种特异性的动态遗传系统随机地混乱化。种系数据库公开和收集了这些基因区段中的大部分。
本文使用的“免疫反应性的”表示这样的结合剂、抗体或其片段：它们对氨基酸残基的序列（“结合位点”或“表位”）是特异性的，且如果与其它肽/蛋白具有交叉反应性，则在它们为了施用于人用途而配制的水平是无毒的。术语“结合”表示在生理条件下由于例如共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用而发生的2个分子之间的直接结合，包括相互作用诸如盐桥和水桥和任意其它常规结合方式。术语“优选地结合”是指，与它结合无关的氨基酸序列相比，结合剂以更大的亲和力结合结合位点。优选地，与结合剂对无关的氨基酸序列的亲和力相比，这样的亲和力是至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍。术语“免疫反应性的”和“优选地结合”在本文中可互换地使用。
本文使用的术语“亲和力”表示2种试剂的可逆结合的平衡常数，并表示为KD。结合蛋白对配体的亲和力（诸如抗体对表位的亲和力）可以是，例如，约100纳摩尔（nM）至约0.1 nM、约100 nM至约1皮摩尔（pM）或约100 nM至约1飞摩尔（fM）。本文使用的术语“亲合力”表示，2种或更多种试剂的复合物在稀释以后对解离的抵抗力。通过诸如酶联免疫吸附测定（ELISA）或本领域技术人员熟悉的任意其它技术等方法，可以测定表观亲和力。通过诸如Scatchard分析或本领域技术人员熟悉的任意其它技术等方法，可以测定亲合力。
“表位”表示，抗原或其它大分子的能够与抗体的可变区结合槽形成结合相互作用的部分。这样的结合相互作用可以显示为与一个或多个CDR的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。抗原结合可以涉及，例如，CDR3或CDR3对，或在某些情况下，VH和VL链的多达所有6个CDR的相互作用。表位可以是线性肽序列（即，“连续的”），或可以由不连续的氨基酸序列（即，“构象的”或“不连续的”）组成。抗体可以识别一个或多个氨基酸序列；因此，表位可以限定超过一个独特的氨基酸序列。通过肽作图和本领域技术人员众所周知的序列分析技术，可以测定由抗体识别的表位。结合相互作用显示为与CDR的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。TRC105是一种嵌合抗体，它是与在美国专利号5,928,641、6,200,566、6,190,660和7,097,836中描述为Y4-2F1或SN6j的鼠抗体相同的可变氨基酸序列。以前已经鉴别出Y4-2F1和SN6j识别（因而TRC105也识别）的表位。
术语“特异性的”表示这样的情形：其中抗体不再显示出对除了含有抗体识别的表位的抗原以外的分子的任何显著结合。该术语也适用于这样的情形：例如，抗原结合域对许多抗原携带的特定表位是特异性的，在该情况下，携带抗原结合域的抗体或其抗原结合片段能够结合携带所述表位的不同抗原。术语“优选地结合”或“特异性地结合”是指，与它结合无关的氨基酸序列相比，抗体或其片段以更大的亲和力结合表位，且如果与其它含有所述表位的多肽具有交叉反应性，则在它们为了施用于人用途而配制的水平是无毒的。在一个方面，与抗体或其片段对无关的氨基酸序列的亲和力相比，这样的亲和力是至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍。术语“免疫反应性的”、“结合”、“优选地结合”和“特异性地结合”在本文中可互换地使用。术语“结合”表示在生理条件下由于例如共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用而发生的2个分子之间的直接结合，包括相互作用诸如盐桥和水桥以及任意其它常规结合方式。
短语“保守氨基酸置换”表示，在某些共同性质基础上的氨基酸分类。一种定义单个氨基酸之间的共同性质的有效方法是，分析同源生物体的对应蛋白之间的氨基酸变化的标准化频率（Schulz, G. E.和R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag）。根据这样的分析，可以确定氨基酸组，其中组内氨基酸优先彼此互换，并因此在对总蛋白结构的影响方面彼此最相似（Schulz, G. E.和R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag）。以这种方式定义的氨基酸组的实例包括：
（i）带电荷组，由Glu和Asp、Lys、Arg和His组成，
（ii）带正电荷组，由Lys、Arg和His组成，
（iii）带负电荷组，由Glu和Asp组成，
（iv）芳族组，由Phe、Tyr和Trp组成，
（v）氮环组，由His和Trp组成，
（vi）大脂肪族非极性组，由Val、Leu和Ile组成，
（vii）弱极性组，由Met和Cys组成，
（viii）小残基组，由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro组成，
（ix）脂肪族组，由Val、Leu、Ile、Met和Cys组成，和
（x）小羟基组，由Ser和Thr组成。
除上述组以外，每个氨基酸残基可形成它自己的组，并且由单个氨基酸形成的组可用单字母和/或三字母缩写简单地指代如上所述的本领域中常用的氨基酸。
“保守残基”是在相似蛋白范围内相对不变的氨基酸。通常保守残基将只发生被相似氨基酸置换的变化，如以上关于“保守氨基酸置换”所述。
在本文的氨基酸序列中使用的字母“x”或“xaa”意图表示，20种标准氨基酸中的任一种可以在该位置被替换，除非另外特别指出。为了肽拟似物设计的目的，在氨基酸序列中的“x”或“xaa”可以被在所述靶序列中的氨基酸的拟似物替换，或所述氨基酸可以被不会干扰肽拟似物活性的基本上任意形式的间隔物替换。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性和同一性中的每一个可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述序列为了比较目的而进行比对。当所比较的序列中的等同位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则所述分子在此位置是相同的；当等同位置被相同或相似氨基酸残基（例如在空间和/或电子性质方面相似的）占据时，则所述分子可称作在此位置是同源的（相似的）。同源性/相似性或同一性的百分比表示是指，在所比较的序列共有的位置处的相同或相似的氨基酸的数目的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本发明的序列具有小于40％同一性，尽管优选小于25％同一性。在比较两个序列中，残基（氨基酸或核酸）的缺失或额外残基的存在，也会降低同一性和同源性/相似性。
术语“同源性”描述了基于数学的序列相似性比较，所述序列相似性用来鉴定具有相似功能或基序的基因或蛋白。本发明的核酸（核苷酸、寡核苷酸）和氨基酸（蛋白）序列可以用作“查询序列”，对公共数据库进行搜索，以便例如鉴定其它家族成员、有关序列或同系物。这样的搜索可以用Altschul, 等人(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10的NBLAST和XBLAST程序（2.0版）来进行。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序（分值＝100，字长＝12）来进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以用XBLAST程序（分值＝50，字长＝3）来进行，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得加入空位的比对用于比较目的，可以如在Altschul等人, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402中所述，利用Gapped BLAST。当用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序（例如XBLAST和NBLAST）的默认参数（参见，www.ncbi.nlm.nih.gov）。
本文所用的“同一性”是指，当把两个或两个以上序列进行比对以使序列匹配最大化时，即考虑空位和插入时，在所述序列的相应位置上相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。同一性可通过已知方法容易地计算，所述方法包括、但不限于：以下文献中描述的方法：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., 编, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., 编, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., 和Griffin, H. G., 编, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；和Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 和Devereux, J., 编, M储液ton Press, New York, 1991；以及Carillo, H., 和Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)。设计测定同一性的方法，以给出所测序列之间的最大匹配。此外，测定同一性的方法已被编入公众可得到的计算机程序中。测定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括、但不限于：GCG程序包（Devereux, J., 等人, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)）、BLASTP、BLASTN和FASTA（Altschul, S. F. 等人, J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)和Altschul等人Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）。公众可从NCBI及其它来源得到BLAST X程序（BLAST Manual, Altschul, S., 等人, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., 等人, J. Mol. Biol. 215: 403-410（1990）。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于测定同一性。
当应用于多肽时，“分离的”（与“基本上纯的”可互换地使用）是指多肽或其一部分，其因为它的来源或操作而：（i）存在于宿主细胞中，作为表达载体的一部分的表达产物；或（ii）与它在自然界中相连的那些以外的蛋白或其它化学部分相连；或（iii）在自然界中不存在，例如，如下化学操作的蛋白：向所述蛋白附加或添加至少一个疏水部分，使得所述蛋白处于在自然界中不存在的形式。“分离的”另外表示这样的蛋白，其：（i）是化学合成的；或（ii）在宿主细胞中表达，并从结合的蛋白和污染蛋白中纯化出来。该术语通常是指这样的多肽：其已经与它天然地伴随的其它蛋白和核酸分离开。优选地，所述多肽也与用于纯化它的物质分离，所述物质例如抗体或凝胶基质（聚丙烯酰胺）。
本文使用的术语“血管生成抑制性的”、“抑制血管生成的”或“抗血管生成的”包括血管发生的抑制，且意在表示影响新生血管形成的范围、量或速率的减小。实现内皮细胞增殖或组织迁移的范围、量或速率的减小，是抑制血管生成的具体实例。
术语“血管生成抑制性的组合物”表示这样的组合物：其抑制血管生成介导的过程，诸如内皮细胞迁移、增殖、管形成，并随后导致从现有血管产生新血管的抑制，并从而影响血管生成依赖性的病症。
本文使用的术语“血管生成依赖性的病症”意在表示这样的病症：其中血管生成或血管发生的过程支持或增加病理状态，或有利地影响正常的生理过程。因此，其中血管生成支持病理状态的血管生成依赖性的病症的治疗可能导致疾病的迁移，而其中血管生成有利地影响正常的生理过程的血管生成依赖性的病症的治疗可能导致例如正常过程的增强。
血管生成是从预先存在的毛细血管或毛细血管后微静脉形成新血管。血管发生源自新血管的形成，所述新血管从成血管细胞（它们是内皮细胞前体）产生。两个过程导致新血管形成，并被包括在术语血管生成依赖性的病症的含义中。本文使用的术语“血管生成”意图包括，血管的重新形成，诸如从血管发生产生的血管以及从现有血管、毛细血管和微静脉的分支和生长产生的血管。血管生成也可以包括，诱导ALK1信号传递和有关的Smad 1/5/8磷酸化和/或信号传递。还已知CD105涉入ALK1信号传递途径，因而也被包括在血管生成的含义内。
“诱导宿主免疫应答”是指，患者经历疾病的征象或征状的减轻或减少，具体地包括但不限于生存期的延长。在根据本发明的方法的某些优选的实施方案中，在施用了拮抗剂的患者中，活化生产CD8+ IFN-γ的T细胞，以诱导细胞毒性的T淋巴细胞（CTL）免疫应答。在根据本发明的方法的某些实施方案中，在施用了所述组合物的患者中，活化生产CD4+ IFN-γ的T细胞，以诱导辅助T细胞免疫应答。这些活化的生产CD4+ IFN-γ的T细胞（即，辅助T细胞）会提供必要的免疫学帮助（例如，通过细胞因子的释放），以不仅诱导和维持CTL，而且诱导和维持由B细胞介导的体液免疫应答。因而，在根据本发明的方法的某些实施方案中，在施用了所述组合物的患者中，活化对抗原的体液应答。在一个方面，可以将佐剂加入所述组合物中，以增加免疫应答。佐剂是本领域众所周知的。
CD8+和/或CD4+ T细胞的活化是指，造成具有生产细胞因子（例如，IFN-γ）的能力的T细胞实际上生产一种或多种细胞因子，或增加它们对一种或多种细胞因子的生产。“CTL应答的诱导”是指，造成潜在细胞毒性的T淋巴细胞表现出抗原特异性的细胞毒性。“抗原特异性的细胞毒性”是指，针对呈递与癌症相关抗原有关的抗原的细胞的细胞毒性大于癌症不相关抗原。“细胞毒性”表示细胞毒性的T淋巴细胞的杀死靶细胞的能力。这样的抗原特异性的细胞毒性可以是对不呈递癌症不相关抗原的细胞的细胞毒性的至少约3倍、至少约10倍、至少约100倍或更高。抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性（ADCC）也包括天然杀伤细胞（“NK细胞”）的活化，所述天然杀伤细胞通过抗体结合来介导细胞杀死。本文所述的抗体和抗原结合片段可以通过NK细胞（通过内皮因子的结合）来介导ADCC。
本文使用的术语“增殖障碍”和“增殖病症”是指，特征在于异常的或不希望的增殖的任何病理学的或非病理学的生理状况。术语“细胞增殖障碍”和“细胞增殖病症”是指，特征在于异常的或不希望的细胞增殖的任何病理学的或非病理学的生理状况，以及包括：特征在于不希望的或不需要的细胞增殖或细胞存活（例如，由于有缺陷的细胞凋亡）的病症，特征在于有缺陷的或异常的或有缺陷的细胞凋亡的病症，以及特征在于异常的或不希望的或不需要的细胞存活的病症。术语“分化障碍”是指，特征在于异常的或有缺陷的分化的任何病理学的或非病理学的生理状况。
顺从治疗的增殖或分化障碍包括：特征在于异常的或不希望的细胞数目、细胞生长或细胞存活的良性的和肿瘤性的疾病和非病理性生理状况。这样的障碍或病症因此可以构成疾病状态，且包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，或可以是非病理性的，即，偏离正常，但是通常与疾病无关。根据本发明可以治疗的非病理状况的一个具体实例是，来自创伤修复的组织再生，这会导致瘢痕形成。
包含增殖或分化障碍的细胞可以聚集成细胞团，或是分散的。术语“实体瘤”表示通常聚集在一起并形成块的瘤形成或转移灶。具体实例包括内脏肿瘤，诸如胃癌或结肠癌、肝细胞瘤、肾癌、肺和脑肿瘤/癌症。“非实体瘤”表示：造血系统的瘤形成，诸如淋巴瘤、骨髓瘤和白血病，或在性质上是扩散的瘤形成，因为它们通常不形成实体块。白血病的具体实例包括：例如，急性和慢性淋巴母细胞性白血病、成髓细胞白血病和多发性骨髓瘤。
这样的障碍包括肿瘤或癌症，它们可以影响基本上任意细胞或组织类型，例如，癌、肉瘤、黑素瘤、转移性障碍或造血肿瘤性障碍。转移性肿瘤可以源自多种原发性肿瘤类型，包括但不限于乳房、肺、甲状腺、头颈部、脑、淋巴样、胃肠道（嘴、食道、胃、小肠、结肠、直肠）、泌尿生殖道（子宫、卵巢、宫颈、膀胱、睾丸、阴茎、前列腺）、肾、胰腺、肝、骨、肌肉、皮肤等。
癌表示上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，且包括呼吸系统癌、胃肠道系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。示例性的癌包括：从宫颈、肺、前列腺、乳房、头颈部、结肠、肝和卵巢形成的那些。该术语也包括癌肉瘤，例如，它们包括由癌性和肉瘤性组织组成的恶性肿瘤。腺癌包括腺组织的癌，或其中肿瘤形成腺样结构。
要治疗的眼组织是，例如，具有糖尿病视网膜病变、黄斑变性或新生血管性青光眼的患者的视网膜组织，要抑制的血管生成是视网膜组织血管生成，其中存在视网膜组织的新生血管形成。
要治疗的癌性组织是，例如，表达异常水平的内皮因子的内皮组织。本文使用的术语“转化的细胞”是指，已经自发地转化成无限制生长状态的细胞，即，它们已经获得通过在培养物中无限数目的分裂来生长的能力。在它们生长控制缺失方面，可以用诸如肿瘤性的、间变性的和/或增生性的等术语来表征转化的细胞。为了本发明的目的，术语“恶性哺乳动物细胞的转化表型”和“转化表型”意图包括、但不限于，与哺乳动物细胞的细胞转化有关的任何下述表型特性：永生化、形态或生长转化和致肿瘤性（通过在细胞培养物中的延长生长、在半固体培养基中的生长或在无免疫能力的或同源的动物中的致肿瘤生长来检测）。
术语“肿瘤细胞抗原”在本文中被定义为，与无关的肿瘤细胞、正常细胞或在正常体液中相比，抗原以更高的量存在于肿瘤细胞上或在体液中。通过本领域技术人员已知的任意数目的试验，可以测试抗原存在，所述试验包括但不限于使用抗体的阴性和/或阳性选择，诸如ELISA试验、放射免疫测定或通过蛋白印迹。
术语“细胞凋亡”或“程序化细胞死亡”表示这样的生理过程：在发育和其它正常生物学过程中，通过该过程来消除不希望的或无用的细胞。细胞凋亡是在正常生理条件下发生的细胞死亡模式，细胞是它自身的死亡的主参加者（“细胞自杀”）。它最常见于下述过程中：正常的细胞更新和组织体内稳态、胚胎发生、免疫耐受性的诱导和维持、神经系统的发育和内分泌依赖性的组织萎缩。经历细胞凋亡的细胞表现出特有的形态学和生化特征。这些特征包括：染色质聚集、细胞核和细胞质浓缩、细胞质和细胞核分隔成膜结合的囊泡（凋亡小体，它们含有核糖体）、形态学上完整的线粒体和核质。在体内，这些凋亡小体快速地被巨噬细胞、树突细胞或邻近的上皮细胞识别和吞噬。由于在体内去除凋亡细胞的这种有效机制，不会引起炎症应答。在体外，凋亡小体以及剩余的细胞碎片最终膨胀，并最后裂解。该体外细胞死亡的末期已经被称作“次要坏死”。通过本领域技术人员已知的方法，可以测量细胞凋亡，所述方法如DNA片段化、膜联蛋白V的暴露、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活化、细胞色素C的释放等。已经诱导死亡的细胞在本文中称作“凋亡细胞”。
“细胞凋亡诱导剂”在本文中定义为诱导细胞凋亡/程序化细胞死亡，且包括，例如，辐照、化疗剂或受体连接剂，其中细胞（例如，肿瘤细胞）被诱导经历程序化细胞死亡。在下面更详细地描述了示例性的细胞凋亡诱导剂。
使用标准的膜联蛋白V细胞凋亡试验，可以测试细胞凋亡：在6-孔平板（NUNC）中培养NIH:OVCAR-3细胞，辐照，或用拮抗剂（或与另一种抗癌药相组合）处理4-48小时，洗涤，并用膜联蛋白V-FITC（BD-Pharmingen）染色1小时。通过流式细胞术（Becton-Dickinson, CellQuest）分析细胞，用碘化丙啶复染色，并在流式细胞计中再次分析。
B. 制备和表达人源化的抗-内皮因子抗体的方法
已经开发了结合内皮因子的嵌合的单克隆抗体。该抗体被命名为TR105（也称作c-SN6j）。
在一个方面，通过人源化嵌合的单克隆TRC105抗体的VL和VH序列（分别是SEQ ID NO. 1和39），制备了本文所述的抗体和其抗原结合片段。
借助于基因工程，已经构建了人源化的免疫球蛋白，包括人源化的抗体。以前已经描述的大多数人源化的免疫球蛋白已经包含与特定人免疫球蛋白链（即，接收体或受体）的框架相同的框架和3个来自非人（即，供体）免疫球蛋白链的CDR。本文所述的人源化也可以包括这样的标准：通过所述标准，在人源化的免疫球蛋白链的框架中鉴别出有限数目的氨基酸，并选择为与在供体（而不是接收体）中的那些位置处的氨基酸相同，以便增加或维持包含人源化的免疫球蛋白链的抗体的亲和力。
本发明部分地基于下述模型：即在生产人源化抗体（例如，使用小鼠抗体作为CDR来源）的现有技术中造成亲和力损失的2个促成原因是：（1）当小鼠CDR与人框架相化合时，框架中接近CDR的氨基酸变成人的，而不是小鼠的。无意受理论的约束，这些变化的氨基酸可能轻微的改变CDR（例如，它们可能产生不同于供体小鼠抗体的静电力或疏水力，且改变的-CDR可能不会象在供体抗体中的CDR那样与抗原发生有效接触）；（2）另外，靠近CDR、但不是所述CDR的一部分（即，仍然是框架的一部分）的初始小鼠抗体中的氨基酸可与抗原发生有助于亲和力的接触。当抗体被人源化时，会丧失这些氨基酸，因为所有的框架氨基酸通常都是人的。为了避免这些问题，并且为了产生对期望的抗原具有非常强的亲和力的人源化抗体，采用下列原则中的一条或多条，可以构建人源化抗体和其抗原结合片段。
一条非限制性原则是，例如，采用来自与要人源化的供体免疫球蛋白通常同源的特定人免疫球蛋白的框架作为受体，或者采用来自许多人抗体的共有框架作为受体。例如，数据库（例如，全国生物医学研究基金会蛋白鉴定资源（National Biomedical Research Foundation Protein Identification Resource）或国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的蛋白序列数据库）中的小鼠重链（或轻链）可变区与人重链（或轻链）可变区的序列比较表明，对于不同的人区域，同源性程度变化很大，例如约40%至约60%、约70%、约80%或更高。通过选择与供体免疫球蛋白的重链可变区最同源的人重链可变区之一作为受体免疫球蛋白，在从供体免疫球蛋白变成人源化免疫球蛋白中将会改变更少的氨基酸。通过选择与供体免疫球蛋白的轻链可变区最同源的人轻链可变区之一作为受体免疫球蛋白，在从供体免疫球蛋白变成人源化免疫球蛋白中将会改变更少的氨基酸。通常，使用这样的技术，存在更小的机会来改变一个或多个CDR附近的氨基酸并从而改变它们的构象。此外，包含人源化免疫球蛋白链的人源化抗体的精确总体形状可能更接近类似于供体抗体的形状，由此也减少了使CDR变形的机会。
也可以使用来自与受体序列相同的人抗体的轻链和重链，以提高人源化的轻链和重链彼此发生有利接触的可能性。或者，也可以使用来自与受体序列不同的人抗体种系序列的轻链和重链；当使用这样的组合时，使用常规试验（例如，ELISA），可以容易地确定VH和VL是否结合目标表位。在一个实施例中，将会选择这样的人抗体，其中轻链和重链可变区序列（一并考虑）整体与供体轻链和重链可变区序列最同源。有时，将会更偏重于重链序列。不管怎样选择受体免疫球蛋白，在某些情况下，通过选择人源化免疫球蛋白链框架中的少量氨基酸，使其与供体（而不是受体）中那些位置处的氨基酸相同，可以实现更高的亲和力。亲和力成熟方法是本领域已知的。
就用于人治疗而言，人源化抗体通常具有至少3个优于小鼠或嵌合抗体的潜在优点。因为抗体的效应部分是人的，认为它会与人免疫系统的其它部分更好地相互作用（例如，通过补体依赖性的细胞毒性（CDC）或抗体依赖性的细胞的细胞毒性（ADCC）更有效地破坏靶细胞）。另外，人免疫系统不会将人源化抗体的框架或恒定区识别为外来物，因此针对这样的注射的抗体的抗体应答会小于针对完全外来的小鼠抗体或部分外来的嵌合抗体的抗体应答。最后，已知小鼠抗体在人循环中的半衰期远远短于人抗体的半衰期。据推测，人源化抗体可以具有与天然存在的人抗体更类似的半衰期，这允许施用更小的且更低频率的剂量。
通过本领域已知的和本文描述的多种方法，可以实现抗体和其抗原结合片段的人源化。类似地，通过本领域已知的和本文描述的方法，也可以实现人源化抗体的生产。
修饰框架区的方法是本领域已知的，且在本文中预见到。用以变更的一个或多个有关框架氨基酸位置的选择，取决于多种标准。选择用以改变的有关框架氨基酸的一种标准可以是，在供体分子与受体分子之间在氨基酸框架残基中的相对差异。使用该方案来选择用以变更的有关框架位置，具有避免在残基确定中的任何主观偏差或在残基对CDR结合亲和力的贡献中的任何偏差的优势。
用于确定用以改变的有关氨基酸位置的另一个标准可以是，例如，选择已知是重要的或有助于CDR构象的框架残基。例如，规范的框架残基对于CDR构象和/或结构而言是重要的。规范框架残基作为用以改变的有关位置的靶向，可以用于鉴别在其相关的供体CDR序列背景中更适合的氨基酸残基。
氨基酸残基在特定框架位置处的频率是另一个标准，其可用于选择所要改变的有关框架氨基酸位置。例如，所选框架与其亚家族内的其它框架序列的比较，可以揭示在一个或多个特定位置处以较小频率出现的残基。接纳不太丰富的残基的位置，可类似地适用于选择作为在受体可变区框架中所要变更的位置。
例如，基于与CDR的近似度，也可以选择用以改变的有关氨基酸位置。在某些背景下，FR残基可以参与CDR构象和/或抗原结合。此外，该标准可类似地用于把通过本文所述的其它标准选出的有关位置区分优先次序。因此，区分在一个或多个CDR的近侧和远侧的残基，代表减少所要改变的有关位置的数目的一种方法。
用于选择所要变更的有关氨基酸框架位置的其它标准包括，例如，已知或预测存在于抗原-CDR界面附近的三维空间中的残基，或预测会调节CDR活性的残基。类似地，可选择已知或预测在重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）界面之间形成接触的框架残基。通过调节CDR结合槽、抗原（表位）相互作用或VH和VL相互作用，这样的框架位置可以影响CDR的构象和/或亲和力。因此，选择这些氨基酸位置来构建用于筛选结合活性的不同群体，可以用于鉴别框架变化，所述框架变化替代对CDR构象具有不利影响的残基，或抵偿对框架中别处存在的残基的不利影响。
可选择用于变更的其它框架残基包括溶剂难以接近的氨基酸位置。这样的残基通常隐匿在可变区中，且因此能够影响CDR的构象或VH和VL相互作用。例如，从由多肽的氨基酸侧链和/或由已知的三维结构数据所创造的环境的相对疏水性，可以预测溶剂的可接近性。
在于供体CDR中选择有关氨基酸位置、以及在想要改变的框架区中选择任意有关氨基酸位置之后，可以将在某些或全部所选位置处的氨基酸变化掺入受体可变区框架和供体CDR的编码核酸中。可以单个地制备并测试变更的框架或CDR序列，或者可以顺序地或同时地化合并测试。
在任意或全部变更位置的可变性范围可以是从几个至多个不同氨基酸残基，包括所有二十种天然存在的氨基酸或其功能等价物和类似物。在某些情况下，也可以考虑非天然存在的氨基酸，且是本领域已知的。
用以改变的氨基酸位置的数目及定位的选择是灵活的，且可以取决于用来鉴别具有理想活性（例如相对于供体可变区而言基本相同的或更高的结合亲和力）的变更可变区的预期用途和所想要的效率。在这方面，掺入经变更的可变区群体中的变化的数目越大，则对展示出理想活性（例如，与供体基本相同的或高于供体的结合亲和力）的至少一个物种的鉴别更有效。或者，如果使用者具有关于某些氨基酸残基或位置不均衡地有助于结合亲和力的影响的经验或实际数据，那么可希望产生变更可变区的有限群体，其集中在那些经鉴别的残基或位置之内或周围的变化。
例如，若需要CDR移植的可变区，则经变更的可变区的大的不同的群体可以包括在供体和受体框架与所有单一CDR氨基酸位置变化之间的所有非相同框架区位置。或者，中间差异的群体可以包括子集，例如仅为要与所有单一CDR氨基酸位置变化一起掺入（例如，为了增加人源化抗体或抗原结合片段的亲和力）的近侧非相同框架位置的子集的子集，。例如，通过另外包括所有成对的CDR氨基酸位置变化，可进一步增加上述群体的差异。相比而言，可以类似地进行构建集中在预定残基或位置（其在少至一个框架和/或一个CDR氨基酸残基位置处掺入变体残基）上的群体，用于筛选和鉴别变更的抗体可变区。与上述群体一样，通过另外扩展所选择用以改变的位置，以包括在框架和CDR区中的任一个或两者中的其它有关位置，可以进一步增加这样的集中群体的差异。在可以另外采用的框架区和CDR中的任一个或两者中，存在从很少变化到许多变化的范围的许多其它组合，所有这些组合将产生经变更的可变区群体，可以筛选该群体以鉴别具有所想要活性（例如，对内皮因子的结合活性）的至少一个CDR移植的变更的可变区。基于本文中提供的教导和引导，本领域技术人员应知道或者可确定，在框架或供体CDR或其子集中哪个所选的残基位置可进行改变以产生用于筛选和鉴别本发明的变更的抗体的群体。编码氨基酸的密码子是本领域已知的。
另一种人源化抗体的方法包括称作“超人源化（superhumanization）”的方法。超人源化包括下述步骤：得到由非人成熟抗体基因编码的主题可变区的肽序列，并鉴别在非人抗体可变区内的至少2个CDR的第一组规范CDR结构类型。规范CDR结构类型是通过Chothia（CITE）命名的结构类型。Chothia及其同事发现，许多抗体的CDR的关键部分采用几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平的差异巨大。因此，Chothia为每条链中的每个CDR定义了一个或几个“规范结构”。每个规范结构主要为形成环的氨基酸残基的连续区段指定一组肽主链扭转角。
在鉴定规范CDR结构类型以后，也得到人抗体的人抗体可变区的肽序列文库。该文库含有种系核酸区段编码的人种系可变区序列，且可能包括成熟的人抗体序列。在任一种情况下，所述方法都包括，鉴别出在人可变区序列文库内的每个序列的至少两个CDR的规范CDR结构类型（即，第二组规范CDR结构类型）。如下从该文库中选择出候选序列的子集：通过比较第一组规范CDR结构类型与第二组规范CDR结构类型（即，比较在可变区内的相应位置处的小鼠规范CDR结构类型与人规范CDR结构类型），并选择这样的人序列：其中就分别在非人与人可变区内的相应位置处的CDR序列而言，第二组规范CDR结构与第一组规范CDR结构类型相同。本方法使用这些候选的人可变区序列作为构建嵌合分子的基础，所述嵌合分子包括与来自候选的人可变区序列的构架区结合的来自非人可变区的至少两个CDR序列（例如小鼠CDR）。该构建的结果是，所述嵌合抗体含有在可变区的相应位置处用于置换每个人CDR序列的每个非人CDR序列，使得嵌合抗体的框架序列不同于候选的人框架序列。
在两个水平上评价每个结构域与候选的人抗体序列的主题CDR的相似性。首先，寻找三维构象完全一样的CDR肽主链。试验性确定主题CDR的原子坐标几乎是不可能的，因此如下近似确定三维相似性：确定主题CDR的Chothia规范结构类型，并从进一步分析中排除具有不同规范结构的候选序列。其次，分析主题CDR与剩余的人候选CDR之间的残基对残基的同源性，并选择具有最高同源性的候选序列。
选择最高同源性是基于，用于评级具有与主题非人可变区相同的规范结构的候选人可变区的各种标准。用于评级所选择组的成员的标准，可以是氨基酸序列同一性或氨基酸同源性或两者。氨基酸同一性是通过氨基酸残基的位点对位点匹配得到的简单评分。氨基酸同源性所确定的相似性是特征性的残基结构中的位点对位点的相似性。例如，根据Henikoff和Henikoff，(1992) Amino acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci 89: 10915-10919所描述的表和规程，或通过Henikoff和Henikoff，(1996)所描述的BLOSUM系列，可以对同源性评分。步骤如下：
a）确定出主题抗体的重链和轻链可变结构域的肽序列。可以用几种方法中的任一种方法确定出这些序列，例如在传统cDNA克隆后对各个基因进行DNA测序；对已经通过聚合酶链反应从主题杂交瘤系的逆转录物或DNA扩增得到的克隆产物进行DNA测序；或对纯化的抗体蛋白进行肽测序。
b）将Kabat编号系统（Kabat等，同上，1991）应用于主题非人抗体的重链及轻链序列。确定出主题非人抗体的每一个CDR的规范结构类型。如下完成此确定：根据Chothia和Lesk（1987）、Chothia等人（1992）、Tomlinson等人（1995）、Martin和Thornton（1996）和Al-Lazikani等人（1997）所讨论的指南，检查肽序列。
每一个CDR规范结构确定的显著特点如下。对于重链CDR1，目前已知有三种规范结构类型。对新序列的指定是直截了当的，因为每种规范结构类型具有不同的残基数目。如在Al-Lazikani等人（1997）中所描述的，当将Kabat编号指定给序列时，对于各个规范结构，残基31-35的编号如下：
规范结构类型1: 31、32、33、34、35。
规范结构类型2: 31、32、33、34、35、35a。
规范结构类型3: 31、32、33、34、35、35a、35b。
对于重链CDR2，目前已知有四种规范结构类型。一些结构类型具有独特的残基数目，从它们的位点52-56的独特的Kabat编号，可以将它们轻易地区别开，即：
规范结构类型1: 52、53、54、55、56。
规范结构类型4: 52、52a、52b、52c、53、54、55、56。
重链CDR2的规范结构类型2与3具有相同的残基数目，因此必须通过它们序列内的线索进行区别，如在Chothia等（1992）中所讨论的。含有这些线索的片段的Kabat编号为：52、52a、53、54、55。规范类型2在52a位点为Pro或Ser，在55位点为GLy或Ser，而在其它位点没有限制。规范类型3在54位点为Gly、Ser、Asn或Asp，而在其它位点没有限制。在大多数情况下，这些标准足以进行正确的指定。另外，对于规范类型2，构架残基71通常是Ala、Val、Leu、Ile或Thr，而对于规范类型3，通常是Arg。
重链CDR3是所有CDR中变化最多的一种CDR。它是通过淋巴细胞特有的遗传学过程（一些具有随机性质）所生成。因此，难以预测CDR3的规范结构。在任何情况下，人种系V基因片段都不编码CDR3的任何部分；因为V基因片段终止于Kabat位点94，而位点95至102编码CDR3。因为这些原因，选择候选人序列时通常不考虑CDR3的规范结构。
对于轻链CDR1，在κ链上目前已知有CDR1的六种规范类型结构。每种规范类型结构具有不同的残基数目，因此，从残基位点27-31的Kabat编号，显而易见给新序列指定的规范类型结构。
规范结构类型1: 27、29、30、31。
规范结构类型2: 27、28、29、30、31。
规范结构类型3: 27、27a、27b、27c、27d、27e、27f、28、29、30、31。
规范结构类型4: 27、27a、27b、27c、27d、27e、28、29、30、31。
规范结构类型5: 27、27a、27b、27c、27d、28、29、30、31。
规范结构类型6: 27、27a、28、29、30、31。
对于轻链CDR2，在κ链上已知CDR2只有一种规范结构类型，因此，除了特殊的主题抗体序列外，指定是自动的。对于轻链CDR3，在κ链上已经描述了CDR3的最多到6种规范结构类型，但其中三种是罕见的。三种常见的规范结构类型可以通过它们的长度来区别，反映为残基位点91-97的Kabat编号：
规范结构类型1: 91、92、93、94、95、96、97（在位点95处必须是Pro，在位点90处必须是Gln、Asn或His）。
规范结构类型3: 91、92、93、94、95、97.
规范结构类型5: 91、92、93、94、95、96、96a、97。
在鉴别出主题非人抗体的规范CDR结构类型后，鉴别出具有与主题抗体同样的规范结构类型组合的相同链类型（重链或轻链）的人基因，以形成人序列的候选集合。这些基因片段的绝大多数已经被阐明，并已经被指定到一种规范结构类型（Chothia等人, 1992, Tomlinson等人, 1995）。
对于重链，评价了CDR1和CDR2与小鼠规范结构类型的一致性，排除了不一致的基因。对于轻链，首先评价了每个人序列的CDR1和CDR2与主题抗体的规范结构类型的一致性。如下评价候选的Vκ基因的残基89-95形成与主题抗体一样的规范结构类型的CDR3的能力：使所述基因与J区融合，并将CDR3的规范CDR结构类型的确定标准应用于所述融合的序列，并排除不符合的序列。
或者，当主题抗体的可变结构域具有人基因组所没有的规范结构类型时，则考虑用于比较的是这样的人种系V基因：其具有三维上相似的、但不同的规范结构类型。这样的情况经常出现在鼠抗体的κ链CDR1上，包括下面描述的两个实施例。在鼠抗体的这个CDR处，已经观察到所有6种可能的规范结构类型，而人基因组只编码规范类型2、3、4和6。在这些情况下，可以选择用于比较的是这样的规范CDR结构类型：其具有在主题非人序列的氨基酸残基长度的两倍内的氨基酸残基长度。例如，如果在主题抗体中发现1型规范结构，那么用于比较的是具有规范结构类型2的人Vκ序列。如果在鼠抗体中发现的是5型规范结构，那么用于比较的是具有规范结构类型3或4的人Vκ序列。
成熟的、重排的人抗体序列可被考虑用于序列比较。在多种情况下，可以有这种考虑，所述情况包括但不限定于下述情况：其中，成熟的人序列（1）与种系非常接近；（2）已知在人体内没有免疫原性；或（3）含有与主题抗体相同的的、但在人种系中没有发现的规范结构类型。
对于每一个具有匹配的规范结构类型的候选V基因，也评估与主题序列的残基对残基的序列同一性和/或同源性，以评级候选人序列。例如，评估的残基如下：（1）Kappa（ĸ）轻链CDR氨基酸残基位置是CDR1（26-32）、CDR2（50-52）、CDR3（91-96）；和（2）重链CDR氨基酸残基位置是CDR1（31-35）和CDR2（50-60）。另外，也可以考虑重链CDR3氨基酸残基位置95至102。
首先，通过主题序列与候选人序列之间的相同氨基酸残基的数目，将残基对残基的同源性评分。从最高评分前25％的候选序列中，选出用于随后构建转化抗体的人序列。在适当时，诸如当一些候选序列具有相似的同一性评分时，还可以根据需要另外考虑非一致的氨基酸残基之间的相似性。在评分中添加了主题残基与目标残基之间的脂肪族与脂肪族、芳香族与芳香族或极性与极性的匹配。在另一个实施例中，使用氨基酸置换矩阵，例如Henikoff和Henikoff的BLOSUM62矩阵，可以进行序列同源性的定量评估。
从已知的人种系J片段组中，可以选出CDR3序列的C末端构架区的目标序列。通过使用上面提及的特异地用于评估候选的V基因的评分标准评估每个J片段的残基对残基的同源性（就CDR3与J重叠的序列位点而言），选出J肽序列。从最高评分的前25％候选序列中，选出用于随后构建转化抗体的J基因片段肽序列。
作为一个实例，嵌合的可变链含有来自主题非人序列的至少两个CDR以及来自候选人序列的框架序列。在另一个实施例中，嵌合的轻链含有来自主题非人序列的三个CDR以及来自候选人序列的框架序列。在其它实施例中，嵌合的重链含有含有来自主题重链的至少两个CDR以及来自候选人重链的框架序列，或者，嵌合的重链含有来自主题重链的每一个CDR以及来自候选人重链的框架序列。在另一个实施例中，嵌合抗体重链含有来自主题非人序列的CDR1和2以及CDR3的残基50-60以及来自候选人重链的CDR的残基61-65，以及候选人序列的框架序列。在另一个实施例中，嵌合的重链序列含有来自主题非人序列的每一个CDR；来自主题序列的框架序列27-30，以及来自候选序列的框架序列。然而，在所有情况下，嵌合抗体分子含有的框架序列与候选人可变结构域的框架序列的差异不超过10个氨基酸残基。
当希望增加的人源化抗体的亲和力时，可以额外地用其它氨基酸置换转化抗体的CDR内的残基。通常，改变CDR中的不超过4个氨基酸残基，更通常地，改变CDR中的不超过2个残基，但是重链CDR2除外，这时可以改变多达10个残基。通过常规方法，例如本文所述的那些（例如，Biacore），可以测量亲和力的变化。
在美国专利号6,881,557（它通过引用整体并入本文）中，更详细地描述了超人源化抗体的方法。
使用本领域已知的常规技术，可以构建和生产人源化抗体和抗原结合片段。另外，经常可以大量生产重组制备的抗体，特别当使用高水平表达载体时。
使用本领域已知的常规技术，可以对抗体测序。在一个方面，将一个或多个CDR的氨基酸序列插入合成序列（例如，人抗体（或其抗原结合片段）框架的合成序列）中，以产生这样的人抗体：其会限制用非人抗体治疗人患者时的不利副反应。也可以将一个或多个CDR的氨基酸序列插入合成序列（例如，结合蛋白诸如AVIMER™）中，以产生用于施用给人患者的构建体。根据要治疗的动物的物种，可以改进这样的技术。例如，就兽医学应用而言，可以合成抗体、抗原结合片段或结合蛋白，用于施用给非人动物（例如，灵长类动物、牛、马等）。
在另一个方面，使用本领域公知的技术，诸如在本文中提供和并入的那些技术，可以将编码一个或多个CDR的氨基酸序列的核苷酸插入（例如，通过重组技术）编码抗体、抗原结合片段或结合蛋白的现有多核苷酸的限制性内切核酸酶位点中。
为了表达，表达系统是这样的系统：其利用GS系统（Lonza），使用谷氨酰胺合成酶基因作为选择标记。简而言之，使用GS系统（Lonza），使用谷氨酰胺合成酶基因作为选择标记，通过电穿孔（250V），在CHO细胞中进行转染。在含有10%透析的胎牛血清（FCS，含有2 mM谷氨酰胺）的DMEM（Sigma）中，培养野生型CHO细胞。通过电穿孔，用300µg线性化的DNA，转染6x107 CHO细胞。在电穿孔以后，将细胞重新悬浮于含有谷氨酰胺的DMEM中，涂布在36x96-孔平板（50µl/孔）上，在5% CO2中在37 ℃温育。次日，加入150µl/孔的选择性培养基（没有谷氨酰胺的DMEM）。在大约3周以后，使用无关的抗体作为阴性对照，通过ELISA（参见下面）筛选菌落。在24-孔平板中繁殖生产>20µg/ml的所有菌落，然后在双份T25烧瓶中繁殖。
为了高水平生产，最广泛使用的哺乳动物表达系统是这样的系统：其利用由二氢叶酸还原酶缺陷型（“dhfr-”）中国仓鼠卵巢细胞提供的基因扩增操作。所述系统是技术人员众所周知的。所述系统是基于脱氢叶酸盐还原酶“dhfr”基因，该基因编码DHFR酶，该酶催化脱氢叶酸盐向四氢叶酸盐的转化。为了实现高产量，用含有功能性DHFR基因（以及编码目标蛋白的基因）的表达载体转染dhfr- CHO细胞。在该情况下，目标蛋白是重组抗体重链和/或轻链。
通过增加竞争性DHFR抑制剂甲氨蝶呤（MTX）的量，重组细胞会通过扩增dhfr基因来产生抗性。在标准情况下，采用的扩增单元远远大于dhfr基因的大小，结果共扩增抗体重链-。
当希望大规模生产蛋白（诸如抗体链）时，考虑采用的细胞的表达水平和稳定性。在长期培养中，重组CHO细胞群体在扩增过程中丧失在它们的特异性抗体生产力方面的同质性，即使它们源自单个亲代克隆。
本申请提供了编码本文所述的抗体或抗原结合片段的分离的多核苷酸（核酸）、含有这种多核苷酸的载体以及用于将这种多核苷酸转录和翻译成多肽的宿主细胞和表达系统。
本申请也提供了质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包含至少一个上述的多核苷酸。
本申请也提供了重组宿主细胞，其包含一个或多个上述的构建体。编码本文所述的任意抗体或其抗原结合片段的核酸按照提供的那样自身形成本申请的一个方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段的生产方法也形成本申请的一个方面，所述方法包括：从来源的编码核酸进行表达。通过在适当条件下培养含有所述核酸的重组宿主细胞，可以方便地进行表达。在通过表达来生产以后，使用任意合适的技术，可以分离和/或纯化抗体或抗原结合片段，然后适当地使用。
可以从例如它们的天然环境中，以基本上纯的或同质的形式提供、分离和/或纯化本文所述的特定抗体、抗原结合片段和编码核酸和载体。在核酸的情况下，除了编码具有所需功能的多肽的序列以外，游离的或基本上游离的核酸或基因来源。核酸可以包括DNA或RNA，且可以是完全或部分合成的。纯化方法是本领域众所周知的。
用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。在本领域中可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括：中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仑鼠肾细胞、NS0小鼠骨髓瘤细胞和许多其它细胞。常见的细菌宿主是大肠杆菌。
抗体和抗体片段在原核细胞（诸如大肠杆菌）中的表达在本领域中是非常确定的。关于综述，参见例如Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)。在培养的真核细胞中的表达也是本领域技术人员可利用的，作为生产本文所述的抗体和抗原结合片段的一个选择，最新的综述参见，例如Raff, M.E.（1993）Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. 等人（1995）Curr. Opinion Biotech 6: 553-560，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。
可以选择或构建合适的载体，其含有适当调节的序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标志物基因和适当的其它序列。载体可以是适当的质粒、病毒载体，例如噬菌体或噬粒。关于其它细节，参见，例如，Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 第2版, Sambrook等人, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press。许多已知的核酸操作技术和方法，例如核酸构建体的制备、诱变、测序、将DNA导入细胞中和基因表达以及蛋白的分析，详细描述在：Short Protocols in Molecular Biology, 第2版, Ausubel等人编, John Wiley & Sons, 1992。Sambrook等人和Ausubel等人的方法和公开内容通过引用整体并入本文，且是本领域众所周知的。
因而，另一个方面提供了一种宿主细胞，其含有本文公开的核酸。另一个方面提供了一种方法，所述方法包括：将这样的核酸导入宿主细胞中。所述导入可以采用任何可利用的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包括，例如，磷酸钙转染、DEAE葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其它病毒（例如，牛痘，或者对于昆虫细胞，杆状病毒）的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括，例如，氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。
在导入之后，可以造成或允许核酸的表达，例如通过在基因表达条件下培养宿主细胞。
在一个实施方案中，将核酸整合进宿主细胞的基因组（例如染色体）中。根据标准技术，通过包含促进与基因组的重组的序列，可以促进整合。根据需要，可以初始化Ig增强，以使表达最大化。
本申请也提供了一种方法，所述方法包括：在表达系统中使用上述的构建体，以便表达上述的抗体或其抗原结合片段。
本申请也涉及分离的核酸，诸如重组DNA分子或克隆的基因或其简并变体、突变体、类似物或其片段，它们编码本文所述的结合内皮因子的抗体或抗原结合序列。
在一个方面，本申请提供了一种核酸，其编码本文所述的结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段的重组DNA分子或克隆的基因的完整DNA序列可以可操作地连接到表达控制序列上，后者可以导入适当宿主中。本申请因此延伸至单细胞宿主，所述宿主被抗体的克隆基因或包含编码抗体的VH和/或VL或其部分的DNA序列的重组DNA分子转化。
另一个特征是，本文公开的DNA序列的表达。如本领域众所周知的，可以如下表达DNA序列：将它们可操作地连接至适当表达载体中的表达控制序列上，并采用该表达载体来转化适当的单细胞宿主。
DNA序列与表达控制序列的这种可操作连接当然地包括（如果不是DNA序列的一部分）：在DNA序列上游的正确读码框中，提供起始密码子ATG。
可以以分离的和/或纯化的形式（例如，编码具有所需功能的多肽的多核苷酸以外的来源的游离的或基本上游离的多核苷酸）提供多核苷酸和载体。本文使用的“基本上纯的”和“基本上游离的”表示，含有少于例如约20%或更少外来物、约10%或更少外来物、约5%或更少外来物、约4%或更少外来物、约3%或更少外来物、约2%或更少外来物或约1%或更少外来物的溶液或悬浮液。
多种宿主/表达载体组合可以用于表达本发明的DNA序列。有用的表达载体，例如，可以由染色体的、非染色体的和合成的DNA序列的区段组成。合适的载体包括、但不限于：SV40和已知的细菌质粒的衍生物，例如，大肠杆菌质粒col El、Pcr1、Pbr322、Pmb9和它们的衍生物，质粒诸如RP4；噬菌体DNA，例如，噬菌体λ的众多衍生物，例如，NM989和其它噬菌体DNA，例如，M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒诸如2u质粒或其衍生物；可用于真核细胞中的载体，诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，诸如已经被修饰成采用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒；等。
本文也提供了一种重组宿主细胞，其包含一种或多种多核苷酸构建体。编码本文提供的抗体或抗原结合片段的多核苷酸形成本申请的一个方面，抗体或抗原结合片段的生产方法也形成本申请的一个方面，所述方法包括：从多核苷酸进行表达。例如，通过在适当条件下培养含有所述多核苷酸的重组宿主细胞，可以实现表达。然后使用任意合适的技术，可以分离和/或纯化抗体或抗原结合片段，并适当地使用。
多种表达控制序列（控制可操作地连接到它上的DNA序列的表达的序列）中的任一种可以用于这些载体中，以表达DNA序列。这样的有用的表达控制序列包括，例如，SV40的早期或晚期启动子、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、LTR系统、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸酯激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子（例如，Pho5）、酵母交配因子的启动子和已知控制原核或真核细胞的基因或它们的病毒和它们的不同组合的表达的其它序列。
用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括：细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。在本领域中可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠骨髓瘤细胞和许多其它细胞。一种常见的细菌宿主是，例如，大肠杆菌。
抗体或抗原结合片段在原核细胞（诸如大肠杆菌）中的表达在本领域中是非常确定的。关于综述，参见例如Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)。在培养的真核细胞中的表达也是本领域技术人员可利用的（Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. 等人(1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560）。
多种单细胞宿主细胞也可用于表达DNA序列。这些宿主包括众所周知的真核和原核宿主，诸如在组织培养物中的大肠杆菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、真菌（诸如酵母）和动物细胞（诸如CHO、YB/20、NS0、SP2/0、Rl.l、B-W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞（例如，COS 1、COS 7、BSC1、BSC40和BMT10））、昆虫细胞（例如，Sf9）和人细胞和植物细胞的菌株。
应当理解，并非所有载体、表达控制序列和宿主同样好地起表达DNA序列的功能。也并非所有宿主对相同的表达系统同样好地起作用。但是，无需过多实验，本领域技术人员能够选择适当的载体、表达控制序列和宿主，以实现希望的表达，而不脱离本申请的范围。例如，在选择载体时，必须考虑宿主，因为所述载体必须在所述宿主中发挥功能。还会考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力以及由所述载体编码的任意其它蛋白（诸如抗生素标志物）的表达。本领域普通技术人员可以选择适当的载体、表达控制序列和宿主，以实现希望的表达，而不脱离本申请的范围。例如，例如，在选择载体时，考虑宿主，因为所述载体必须在所述宿主中发挥功能。还可以考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力以及由所述载体编码的任意其它蛋白（诸如抗生素标志物）的表达。
本申请也提供了在本文别处所述的质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，它们包括至少一个上述的多核苷酸。可以选择或构建合适的载体，其含有适当的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、选择标记和适当的其它序列。载体可以是适当的质粒、病毒载体，例如适当的噬菌体、噬粒等。关于其它细节，参见，例如，Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 第2版, Sambrook等人, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press。许多已知的核酸操作技术和方法，例如核酸构建体的制备、诱变、测序、将DNA导入细胞中和基因表达以及蛋白的分析，详细描述在：Short Protocols in Molecular Biology, 第2版, Ausubel等人编, John Wiley & Sons, 1992。Sambrook等人和Ausubel等人的方法和公开内容通过引用整体并入本文。
在选择表达控制序列时，通常考虑多种因素。这些因素包括，例如，系统的相对强度、它的可控性和它与要表达的特定DNA序列或基因的相容性，特别是在潜在二级结构方面。通过考虑例如它们与选择的载体的相容性、它们的分泌特征、它们的正确折叠蛋白的能力、和它们的发酵需要以及由要表达的DNA序列编码的产物对宿主的毒性和表达产物的纯化容易性，选择合适的单细胞宿主。
另一个方面提供了一种宿主细胞，其含有一种或多种本文公开的多核苷酸。另一个方面提供了通过任意可利用的技术将这样的一种或多种多核苷酸导入宿主细胞中的方法。对于真核细胞，合适的技术可以包括，例如，磷酸钙转染、DEAE葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其它病毒（例如，牛痘，或者对于昆虫细胞，杆状病毒）的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括，例如，氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。
在导入之后，可以造成或允许一个或多个多核苷酸的表达，例如通过在从一个或多个多核苷酸表达一种或多种多肽的条件下培养宿主细胞。可以使用可诱导的系统，并通过加入活化剂来诱导表达。
在一个实施方案中，可以将多核苷酸整合进宿主细胞的基因组（例如染色体）中。根据标准技术，通过包含促进与基因组的重组的序列，可以促进整合。在另一个实施方案中，所述核酸维持在宿主细胞中的附加型载体上。
本文提供了这样的方法，所述方法包括：在表达系统中使用上述的构建体，以便表达特定多肽。
考虑到这些和其它因素，本领域技术人员能够构建多种载体/表达控制序列/宿主组合，它们在发酵或大规模动物培养中表达所述DNA序列。
除了克隆以外，或作为克隆的替代，可以重组地/合成地制备编码抗体、抗原结合片段或结合蛋白的多核苷酸。可以将多核苷酸设计成具有抗体、抗原结合片段或结合蛋白的适当密码子。一般而言，如果序列要用于表达，可以选择对于目标宿主而言优选的密码子。可以从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸装配完整多核苷酸，并装配成完整编码序列。参见，例如，Edge, Nature, 292:756 (1981)；Nambair等人, Science, 223:1299 (1984)；Jay等人, J. Biol. Chem., 259:6311 (1984)。
将非天然氨基酸位点特异性地掺入蛋白中的一般方法，参见Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244:182-188（1989年4月）。该方法可以用于产生具有非天然氨基酸的类似物。
如上所述，除了克隆以外，可以合成地制备编码抗体或其抗原结合片段的DNA序列。可以将所述DNA序列设计成具有抗体或抗原结合片段氨基酸序列的适当密码子。一般而言，如果序列要用于表达，可以选择对于目标宿主而言优选的密码子。可以从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸装配完整序列，并装配成完整编码序列。参见，例如，Edge, Nature, 292:756 (1981)；Nambair等人, Science, 223:1299 (1984)；Jay等人, J. Biol. Chem., 259:6311 (1984)，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。
C. 免疫原性的计算机分析
如果需要的话，可以评估本文所述的抗体或其抗原结合片段的免疫原性，并根据需要，去免疫化（即通过改变一个或多个T细胞表位，使所述抗体具有更低的免疫反应性）。通过使用软件和专门的数据库，可以分析在本文所述的人源化的抗-内皮因子抗体和抗原结合片段中存在的免疫原性和T-细胞表位。示例性的软件和数据库包括：由英格兰的Antitope of Cambridge开发的iTope™。iTope™是一种用于分析肽与人MHC II类等位基因的结合的计算机技术。
所述iTope™软件会预测肽与人MHC II类等位基因的结合，并从而提供这样的“潜在T细胞表位”的位置的初步筛选。iTope™软件会预测肽的氨基酸侧链和34个人MHC II类等位基因的结合槽内的特定结合槽之间的有利相互作用。通过计算机产生9聚体肽（它们重叠一个氨基酸，所述氨基酸跨实验抗体可变区序列），获取关键结合残基的位置。可以相对于34个MHC II类同种异型中的每一个，测试每个9聚体肽，并基于它们与MHC II类结合槽的潜在“拟合”和相互作用，进行评分。相对于>50%的MHC II类等位基因产生高平均结合评分（在iTope™评分函数中，>0.55）的肽，被视作潜在T细胞表位。在这样的区域中，分析在MHC II类槽内的肽结合所用的核心9氨基酸序列，以测定MHC II类槽残基（P1、P4、P6、P7和P9）和可能的T细胞受体（TCR）接触残基（P-l、P2、P3、P5、P8）。
在鉴别任何T-细胞表位以后，可以导入氨基酸残基变化、置换、添加和/或删除，以去除鉴别的T-细胞表位。可以做出这样的变化，从而在仍然去除鉴别的表位的同时，保持抗体结构和功能。示例性的变化可以包括、但不限于：保守的氨基酸变化。
利用重组MHC分子与合成肽的可溶性复合物的技术，已经得到应用。这些试剂和方法可以用于鉴定人或实验动物受试者的外周血样中能结合特定MHC-肽复合物的T细胞克隆的存在，但是这些试剂和方法不适于筛选各种MHC同种异型的多种潜在表位。
T细胞活化的生物学测定，提供了一个解读受试肽/蛋白序列引起免疫应答的能力的实用选择。该类方法的实例包括：使用针对细菌蛋白葡萄球菌激酶的T细胞增殖测定，然后用合成肽刺激T细胞系的表位作图。类似地，使用破伤风毒素蛋白的合成肽进行的T细胞增殖试验，已经导致该毒素的免疫显性表位区域的确定。在一个实施方案中，可以如下确定受试蛋白的T-细胞表位：利用分离的人免疫细胞子集，促进它们的体外分化，并在合成的目标肽存在下培养细胞，测量培养的T细胞中任何诱导的增殖。也可以使用其它技术。这样的技术包括，小心地应用细胞分离技术和使用多种细胞因子补充物的细胞培养，以得到所需的免疫细胞子集（树突细胞、CD4+和/或CD8+T细胞）。在另一个实施方案中，可以如下确定T细胞表位在抗体中的存在：将所述抗体加给分离的人免疫细胞子集，并评估它们的体外分化，测量培养的T细胞中任何诱导的增殖。
也可以使用计算机技术来确定多种治疗性蛋白的MHC II类配体。但是，由于诸如需要蛋白水解加工和其它生理步骤（所述步骤导致免疫原性肽体内呈递）等原因，通过基于计算机的方案可定义的整个肽库的子集具有最终的生物学相关性。因而，离体人T-细胞活化试验可以用于确定多肽的蛋白序列中能够支持T细胞活化并因此与该蛋白的免疫原性在生物学上最相关的区域。本文使用的“T-细胞表位”表示这样的氨基酸序列，其能够结合MHC II类、能够刺激T细胞和/或也在与MHC II类的复合物中结合（不必可测得地活化）T细胞。
根据本文提供的方法，测试合成肽或整个抗体的引起体外培养的人T细胞产生增殖反应的能力。所述T细胞存在于外周血单核细胞（PBMC）层内，后者易于通过熟知的方法从全血样本获得。此外，所述PBMC制备物含有生理比例的T细胞和抗原呈递细胞，并因此是在体外进行替代免疫反应的良好材料来源。在这样的试验的操作中，靠近2.0或大于2.0的刺激指数是诱导的增殖的一个有用的度量。但是，刺激指数可能随抗体或其抗原结合片段而异，且可以参照每种抗体或其抗原结合片段和对应的肽文库的基线来建立。在这样的测试的一个实施例中，可以常规地如下衍生出刺激指数（SI）：将所测定的针对受试肽的增殖分值（例如，如果使用例如3H-胸苷掺入，每分钟的放射性计数）除以在未与受试肽接触的细胞中测得的分值。不引起反应的肽可能产生SI＝1.0，而在0.8-1.2的范围内的SI值也可能是常见的。为了确保所记录分值的可信性，可将许多技术方法结合入此类试验的操作中。通常，所有的测定均至少一式三份地进行，并计算平均分值。如果所计算的SI＝＞2.0，则可对三份中的单个分值检查偏离数据的证据。使受试肽以至少两种不同的浓度与细胞接触，并且所述浓度之间一般最少有两倍浓度差异。这样的浓度范围会提供所述试验的动力学范围的偏置，并且在单个时间点（例如在第7天）测定时可能是有用的。在一些试验中，可进行多时程测定，也可以使用在最少两种不同的浓度提供的肽免疫原进行这些测定。同样，在每个试验板中可包括对照肽，其中所述对照肽预期对大多数PBMC供体样本为反应性的。流感血细胞凝集素肽307-319序列PKYVKQNTLKLA（SEQ ID NO: 104）和衣原体HSP 60肽序列KVVDQIKKISKPVQH（SEQ ID NO: 105）是用于这样的试验中的对照肽的实例。替代地，或额外地，所述试验也可以使用有效的完整蛋白抗原如来自Keyhole Limpet的血蓝蛋白，预期所有的PBMC样本对所述抗原会显示明显大于2.0的SI。用于这样的用途的其它对照抗原是本领域众所周知的。
本文公开的方法可以提供抗体或其抗原结合片段的表位图谱，其中所述图谱与可能的MHC同种异型的宽范围相关。所述图谱可以具有足够的代表性，使得可以设计或选择经修饰的蛋白，对于可能施用所述蛋白的患者中的大多数而言，所述蛋白的引起T细胞驱动的免疫应答的能力消失或至少改善。改善可以表示，与未修饰的蛋白相比，免疫应答减少（即，减少的免疫原性）（例如减少了约1.5倍、减少了约2倍、减少了约5倍、减少了约10倍、减少了约20倍、减少了约50倍、减少了约100倍、减少了约200倍、减少了约500倍或更多，或它们中的任意范围）。或者，具有减少的免疫原性的抗体或其抗原结合片段可以表示，与未修饰的蛋白相比，它的引起免疫应答的能力的减少百分比（例如减少了约1%、减少了约2%、减少了约3%、减少了约4%、减少了约5%、减少了约10%、减少了约20%、减少了约50%、减少了约100% 和它们中的任意范围）因此，在筛选方法的实践中，从具有足够免疫多样性的供体库中收集来自原初供体PBMC衍生的T细胞，以提供在人群中至少大于90％的MHC II类库（HLA-DR）的样本。如果欲对给定的合成肽（或抗体）检测原初T细胞应答，在实践中使该肽（或抗体）与源自多个分别供体的PBMC制品接触；对于实践目的而言，供体的数量（或“供体库”大小）不可能小于20个不相关个体，并且供体库中的所有样本根据它们的MHC II类单倍型进行预选择。
本文使用的术语“原初供体”表示以前没有暴露（无论是在环境中、通过疫苗接种，还是通过其它方式，例如，输血）于本文所述的抗体或其抗原结合片段的受试者。
当筛选T-细胞表位时，可以从外周血样本获得T细胞，所述外周血样本来自没有接受所述蛋白治疗的多个不同健康供体。如果需要的话，使用常规试验（诸如ELISA，其使用抗体来鉴别一种或多种多肽的存在与否），可以测试患者血液样品中特定多肽的存在。所述试验使用体外培养的PBMC来进行，其中使用本领域已知的常规方法，并包括，使PBMC与目标蛋白的代表性的合成肽物质（即文库）或整个蛋白（诸如抗体）接触，在合适的温育时间后，测量诱导的T细胞活化，诸如细胞增殖。测定可以通过任意合适的方法来进行，并且可以例如使用H3-胸苷掺入来进行，由此易于通过实验室仪器测定H3在细胞物质中的积累。与在未处理的PBMC样本中看到的相应值相比，可以检查PBMC样品和合成肽的每种组合或整个蛋白的细胞增殖程度。也可参照在用预期具有增殖作用的一种或多种肽或整个蛋白处理以后所看到的增殖反应。关于此，有利地使用具有已知的宽MHC限制性的肽或整个蛋白，尤其是对DP或DQ同种型具有MHC限制的肽表位，尽管本发明不限于这样的限制的肽或蛋白的应用。在上面，例如关于流感血细胞凝集素和衣原体HSP60，已经描述了这样的肽。
在一个非限制性实施例中，使用本文所述的方法，绘制T-细胞表位的图谱，并随后修改。为了促进表位图谱的组装，生产了合成肽的文库。每个肽的长度为15个氨基酸残基，且每个与该系列中的下一个肽重叠12个氨基酸残基，即在该系列中的每个连续肽渐增地添加另外3个氨基酸用于分析。以此方式，肽的任一特定相邻对会反映连续序列的18个氨基酸。在下面的实施例1中例证了使用原初T细胞试验确定T-细胞图谱的一种方法。据提示，通过确定T-细胞图谱的方法鉴别出的每种肽能够结合MHC II类，并以足够的亲和力与至少一种同源TCR结合，从而引起在试验系统中可检测到的增殖爆发。
在另一个非限制性实施例中，评估加工抗体以产生T-细胞表位的可能性，所述生T-细胞表位能够结合MHC II类，并以足够的亲和力与至少一种同源TCR结合，从而引起在试验系统中可检测到的增殖爆发。
以多种方法中的任一种，包括使用重组方法，可以制备本文所述的分子。本文提供的蛋白序列和信息可以用于推论编码氨基酸序列的多核苷酸（DNA）。这可以例如使用计算机软件工具（诸如DNAtar软件套件[DNAtar Inc, Madison, Wis., USA]或类似的工具）来实现。在本文中预见到编码多肽或重要的同系物、变体、截短、延长或它们的进一步修饰的任意这样的多核苷酸。
本文提供了绘制T-细胞表位的图谱（鉴别T-细胞表位）的方法，和修饰所述表位使得被修饰的序列减少（部分地或完全地）T-辅助应答的诱导的方法。修饰包括，在编码修饰的多肽的多核苷酸的密码子中产生的氨基酸置换、删除或插入，以影响类似的变化。编码氨基酸残基的密码子是本领域众所周知的。可能使用重组DNA方法来实现靶序列的定向诱变，许多这样的技术是可得到的、描述在本文中和本领域已知的，诸如描述在上面。一般而言，定位诱变技术是众所周知的。简而言之，采用噬菌体载体，其产生用于寡核苷酸指导的PCR诱变的单链模板。噬菌体载体（例如M13）是可商业得到的，它们的应用通常是本领域众所周知的。类似地，双链质粒也常规地用于定位诱变中，这会消除将目标多核苷酸从噬菌体转移至质粒的步骤。可以使用携带希望的突变序列的合成寡核苷酸引物来指导从该模板体外合成修饰的（希望的突变体）DNA，并使用异源双链体DNA来转化感受态大肠杆菌，用于生长选择和所需克隆的鉴别。或者，可以在PCR反应使一对引物与双链载体的2条单独的链对合，以同时合成具有希望的突变的两条对应互补链。
在一个实施方案中，可以采用Quick Change定位诱变方法，该方法使用质粒DNA模板。使用含有希望的突变的2种合成寡核苷酸引物，可以实现含有插入片段的插入靶基因的质粒模板的PCR扩增。通过诱变级PfuTurbo DNA聚合酶，在温度循环中延长寡核苷酸引物，每种引物与载体的相反链互补。寡核苷酸引物掺入以后，制备含有交错切口的突变质粒。用Dpn I处理扩增的未甲基化的产物，以消化甲基化的亲代DNA模板，并选择用于含有突变的新合成的DNA。由于从大多数大肠杆菌菌株分离出的DNA被dam甲基化，它对Dpn I消化是敏感的，所述Dpn I对甲基化的和半甲基化的DNA是特异性的。将反应产物转化进大肠杆菌的高效率菌株中，以得到含有希望的修饰的质粒。用于将氨基酸修饰导入多肽中的其它方法是本领域众所周知的，且也可以用于本文中。
对所述蛋白的合适修饰可包括，特定残基或残基组合的氨基酸置换。为了消除T-细胞表位，在所预测的氨基酸序列内的合适位点或氨基酸残基处进行氨基酸置换，以实现T-细胞表位活性的减小或消除。在实践中，合适的位点或氨基酸残基优选地等同于在MHC II类结合槽内所提供的口袋之一内结合的氨基酸残基。这样的修饰可能改变在所述肽的所谓的“P1”或“P1锚”位置处在裂缝的第一口袋内的结合。肽的P1锚残基和MHC II类结合槽的第一口袋之间的结合相互作用的质量，被公认为整个肽的总结合亲和力的主要决定因素。在氨基酸序列的该位置的适当置换，通常会掺入不易容纳到所述口袋中的氨基酸残基（例如，置换为更亲水的残基）。所述肽中处于如下位置的氨基酸残基也被考虑到并落入本发明的范围内：所述位置为与在MHC结合裂缝内的其它口袋区域结合的位置。
应当理解，在给定的潜在T-细胞表位内的单个氨基酸修饰代表可以用于消除一个或多个T-细胞表位的途径。可以预见到在单个表位内的修饰组合，且在单独定义的表位彼此重叠的情况下，可能是适当的。此外，氨基酸修饰（在给定的表位内单独地，或在单个表位内组合地）可以发生在非对应于MHC II类结合槽的“口袋残基”的位置，而是在所述氨基酸序列内的任意位点处。基于所述多肽的已知结构特征，参照使用本领域已知且在本文中描述的计算机技术产生的同源结构或结构方法，可以做出修饰。可以考虑恢复变体分子的结构或生物活性的改变（修饰）。此类补偿性改变还可以包括对多肽中的特定氨基酸残基的删除或添加（插入）。另外，可以做出这样的修饰，所述修饰改变分子的结构和/或降低分子的生物活性，并也消除T-细胞表位，从而减少分子的免疫原性。在本文中预见到所有类型的修饰。
从蛋白分子中去除表位的另一种方法是，协同使用本文描绘的原初T细胞活化试验方案以及根据在WO 02/069232（它也通过引用全部并入本文中）中描述的方案开发出的计算机工具。该软件在多肽-MHC II类结合相互作用水平上模拟抗原呈递过程，以提供对任一特定多肽序列的结合分值。对在人群中存在的许多主要MHC II类同种异型，测定这样的分值。由于该方案能够测试任意多肽序列，可以在多肽与MHC II类结合槽相互作用的能力方面预测氨基酸置换、添加或删除的后果。由此，可以设计这样的新序列组合物，其含有减少数目的能够与MHC II类相互作用并从而作为免疫原性的T-细胞表位发挥作用的氨基酸。在使用任一种给定供体样本的生物试验可以评估与最多4种DR同种异型的结合的情况下，计算机方法可同时使用超过40种同种异型测试相同的多肽序列。在实践中，该方案能够指导新序列变体的设计，所述新序列变体在与多种MHC同种异型相互作用的能力方面有所改变。本领域技术人员清楚：置换的多种备选集合可达到去除不需要的表位的目的。但是，认为所得到的序列与本文公开的具体组合物密切同源，并因此落入本申请的范围。
关于表位作图和使用基于生物学的T细胞活化试验任选地重新测试，使用用于鉴别MHC II类配体的计算机工具和缺乏MHC II类配体的序列类似物的设计的组合方案，是本申请的另一种方法和实施方案。根据该实施方案的一般方法包括以下步骤：
i）使用原初T细胞活化试验和合成肽（它们合起来包括目标蛋白序列），鉴别能够活化T细胞的表位区域；
ii）使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合的计算方案，分析在步骤（i）中鉴别出的表位区域，并从而鉴别在表位区域内的MHC II类配体；
iii）使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合的计算方案，鉴别在表位区中所包含的MHC配体的序列类似物，所述序列类似物不再结合MHC II类或以降低的亲和力结合更少数目的MHC同种异型；和任选地，
iv）使用原初T细胞活化试验和合成肽（它们全部或合起来包含在目标蛋白中鉴别的表位区），并在原初T细胞活化试验中与野生型（亲本）序列平行地测试所述序列类似物。
在一个实施方案中，制备修饰的抗体或其抗原结合片段（与未修饰的抗体或其抗原结合片段相比，其表现出降低的免疫原性）的方法包括：在抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列内，鉴别出至少一个T-细胞表位，并修饰在至少一个鉴别出的T-细胞表位内的至少一个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，通过下述方法，生产修饰的抗体或其抗原结合片段（与未修饰的抗体或其抗原结合片段相比，其表现出降低的免疫原性），所述方法包括：在抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列内，鉴别出至少一个T-细胞表位，并修饰在至少一个鉴别出的T-细胞表位内的至少一个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，选择修饰的抗体或其抗原结合片段（与未修饰的抗体或其抗原结合片段相比，其表现出降低的免疫原性）的方法包括：在抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列内，鉴别出至少一个T-细胞表位，修饰在至少一个鉴别出的T-细胞表位内的至少一个氨基酸残基，并选择修饰的抗体或其抗原结合片段，其与未修饰的抗体或其抗原结合片段相比表现出降低的免疫原性。
通过表位区域，可以进一步表征本文所述的T-细胞表位。这样的区域包括表位核心、N-端和C-端。本文使用的“表位核心”表示，T-细胞表位的核心9-聚体氨基酸序列。所述表位核心可以另外包括在N-端和/或C-端上邻近所述核心9-聚体氨基酸序列的0、1、2或3个氨基酸残基。因而，在某些实施方案中，所述表位核心的长度范围可以是约9个氨基酸至约15个氨基酸。
本文使用的“N-端”表示，邻近表位核心的N-端的氨基酸，且包括邻近表位核心的N-端并在其上游的至少1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
本文使用的“C-端”表示邻近表位核心的C-端的氨基酸，且包括邻近表位核心的C-端并在其下游的至少1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有1个或多个修饰。
在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有2个修饰。
在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有3个修饰。
在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有4个修饰。
在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有5个修饰。
在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有6个修饰。
在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有7个修饰。
在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有8个修饰。
在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有9个修饰。
在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有10个修饰。
在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有最多20个修饰。
本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的轻链可变区（VK1AA）和具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重链可变区（VH1A2）。
本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 88、89、90、91和92中的任一个所示的氨基酸序列的重链可变区。
本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 93、94、95、96、97、100、102和103中的任一个所示的氨基酸序列的轻链可变区。
本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中：
（i）所述重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用丙氨酸（A）或丝氨酸（S）置换在位置49处的甘氨酸（G）；用异亮氨酸（I）置换在位置51处的丙氨酸（A）；用精氨酸（R）或天冬酰胺（Q）置换在位置52b处的赖氨酸（K）；用缬氨酸（V）置换在位置78处的亮氨酸（L），其中使用Kabat编号系统；和
（ii）所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用亮氨酸（L）置换在位置4处的甲硫氨酸（M）；用缬氨酸（V）置换在位置19处的丙氨酸（A）；用丝氨酸（S）置换在位置22处的苏氨酸（T）；用异亮氨酸（I）置换在位置48处的丙氨酸（A）；和用丝氨酸（S）置换在位置51处的苏氨酸（T），其中使用Kabat编号系统。
本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 88、89、90、91和92所示的氨基酸序列的重链可变区；和具有如SEQ ID NO: 93、95、96、97、100、102或103所示的氨基酸序列的轻链可变区。
除了前述的实施例和实施方案以外，在本文中预见到修饰的抗体或其抗原结合片段，其具有在一个或多个T-细胞表位中的一个或多个氨基酸修饰。在一个非限制性实施例中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其具有在至少一个T-细胞表位中的至少一个修饰。在另一个非限制性实施例中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其具有在1、2、3、4、5、6或7个本文所述的T-细胞表位的中的至少一个氨基酸修饰。其它非限制性实施例这样的抗体或其抗原结合片段，其具有在超过一个T-细胞表位中的超过一个氨基酸修饰。在本文中预见到在任意数目的上述抗体或其抗原结合片段、T-细胞表位中的氨基酸修饰的任意组合。
T- 细胞表位和同种异型频率
在抗原内发现的单个表位可以优选地由特定MHC II类同种异型来呈现，类似地，在相同抗原内的其它特定表位根本不可能呈现在MHC II类分子上。已经证实，特定表位与特定MCH II类分子的这种关联依赖于个体的MHC II类同种异型。当修饰抗体或其抗原结合片段（为了去除T-细胞表位）时，也可以考虑特定表位与特定同种异型的关联。对于特定同种异型（例如，对于具有某些MHC II类同种异型的特定受试者群体），这样的考虑可以实现抗体或其抗原结合片段的高度特异性的修饰。通过本领域已知的基因分型方法，可以容易地确定一位或多位受试者的MHC II类同种异型，从而容易地鉴别T-细胞表位与给定同种异型的关联，用于在抗体或其抗原结合片段的修饰中进行考虑，定制为该同种异型。在下面的实施例中，更详细地描述了T-细胞表位和MHC II类同种异型之间的关联的鉴别。在本文中预见到修饰的抗体或其抗原结合片段，其具有T-细胞表位修饰，所述修饰定制为关于特定表位所鉴别出的MHC II类关联。
D. 抗-内皮因子抗体
通过本领域技术人员已知的多种方法，包括、例如，重组和化学合成，可以实现编码FR和/或CDR的所有核酸和所有选择的氨基酸位置变化的同时掺入。例如，同时掺入可以如下实现：例如，化学地合成受体可变区的核苷酸序列，与编码供体CDR的核酸融合到一起，并将许多对应的氨基酸密码子掺入在选择出的用于携带可变氨基酸残基的位置处。
本文提供了结合内皮因子的抗体和其抗原结合片段。也提供了这样的抗体和其抗原结合片段，它们结合内皮因子，并抑制（部分地或完全地）或控制/治疗（部分地或完全地）血管生成/新生血管形成、小血管膨胀和/或与过度血管生成有关的疾病。类似地，在抑制或结合内皮因子的含义内，也包括抑制内皮因子功能（例如，信号传递、结合、活化等）。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段通过结合内皮因子来抑制血管生成。本申请也提供了可以用于生产抗体的细胞系、用于生产所述细胞系的方法、用于表达抗体或其抗原结合片段和纯化它们的方法。
可以认识到，使用常规方法（包括，但不限于ELISA），使用本文提供的或本领域已知的试验，可以测试使用本文所述方法制备的特异性地结合内皮因子的抗体和其抗原结合片段的结合内皮因子的能力。使用常规方法,包括但不限于Biacore或表面等离子体共振，也可以测定本文所述抗体的亲和力。
通过人源化TRC105抗体的VH和VL序列，构建出本文所述的抗体及其抗原结合片段。为了实现该人源化，建立并分析了TRC105的VH和VL链的三维模型。然后将VH和VL序列单个地与人种系序列数据库相对比，基于它们与TRC105的VH和VL序列的同源性，从所述数据库中选出人VH和VL序列。为人源化选出的人VL序列是O2/O12（VK1-39）（SEQ ID NO. 2）。O2/O12与TRC105具有65%的序列同一性，所述基因在人种系所有组成部分中高度表达。为人源化选出的人VH序列是VH3-15（SEQ ID NO. 40）。VH3-15与TRC105具有70%的序列同一性，并以合理的频率在人种系所有组成部分中表达。在TRC105的三维模型中，检查在TRC105和人序列之间不同的氨基酸位置，以确定考虑将哪个置换用于修饰。基于三维模型分析的氨基酸选择标准包括、但不限于，例如，与氨基酸有关的空间效应、氨基酸的相关电荷和氨基酸在可变重链和/或轻链内的位置。将为人框架区鉴别和提议的置换掺入O2和VH3-15人框架区中，并将TRC105的CDR移植进对应的O2和VH3-15人框架区中，得到许多人源化抗体或其抗原结合片段。另外，轻链的FR-4源自人J种系序列Jk4。类似地，重链的FR-4源自人J种系序列JH4。
本文描述了结合内皮因子的人源化抗体和抗原结合片段。也本文描述了结合内皮因子并抑制血管生成的人源化抗体和抗原结合片段。如上所述制备本文所述的抗体和抗原结合片段。
抗体和其抗原结合片段可以具有可变重（VH）链、可变轻（VL）链、二者或其结合部分。在一个实施方案中，所述VH链具有如SEQ ID NO: 41-43中的任一个所示的氨基酸序列或其结合部分。这样的VH链可以具有如SEQ ID NO: 44-62中的任一个所示的框架区序列。在另一个实施方案中，所述VL链具有如SEQ ID NO: 3-5中的任一个所示的氨基酸序列或其结合部分。这样的VL链可以具有如SEQ ID NO: 6-38中的任一个所示的框架区序列。
本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区和具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区。
本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区和具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区，其中：所述重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用丙氨酸（A）置换在位置49处的甘氨酸（G）；用丝氨酸（S）置换在位置76处的天冬酰胺（N）；用精氨酸（R）置换在位置77处的苏氨酸（T）；用缬氨酸（V）置换在位置78处的亮氨酸（L）；用异亮氨酸（I）置换在位置82a处的天冬酰胺（N）；用异亮氨酸（I）或亮氨酸（L）置换在位置89处的缬氨酸（V）；用精氨酸（R）或甘氨酸（G）置换在位置94处的苏氨酸（T）；用苏氨酸（T）置换在位置108处的亮氨酸（L）；用亮氨酸（L）置换在位置109处的缬氨酸（V）；和用丙氨酸（A）置换在位置113处的丝氨酸（S），其中使用Kabat编号系统；且所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用谷氨酰胺（Q）置换在位置1处的天冬氨酸（D）；用缬氨酸（V）置换在位置3处的谷氨酰胺（Q）；用亮氨酸（L）置换在位置4处的甲硫氨酸（M）；用丝氨酸（S）置换在位置5处的苏氨酸（T）；用苯丙氨酸（F）置换在位置36处的酪氨酸（Y）；用脯氨酸（P）置换在位置46处的亮氨酸（L）；用色氨酸（W）置换在位置47处的亮氨酸（L）；用缬氨酸（V）或丙氨酸（A）置换在位置60处的丝氨酸（S）；用丝氨酸（S）置换在位置70处的天冬氨酸（D）；用酪氨酸（Y）置换在位置71处的苯丙氨酸（F）；用丙氨酸（A）置换在位置100处的谷氨酰胺（G）；和用亮氨酸（L）置换在位置106处的异亮氨酸（I），其中使用Kabat编号系统。
本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 41、42或43所示的氨基酸序列的重链可变区；和具有如SEQ ID NO: 3、4或5所示的氨基酸序列的轻链可变区。一种抗体或其抗原结合片段可以包含：具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。一种抗体或其抗原结合片段可以包含：具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。一种抗体或其抗原结合片段可以包含：具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的轻链可变区。一种抗体或其抗原结合片段可以包含：具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。一种抗体或其抗原结合片段可以包含：具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。一种抗体或其抗原结合片段可以包含：具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的轻链可变区。一种抗体或其抗原结合片段可以包含：具有如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。一种抗体或其抗原结合片段可以包含：具有如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。一种抗体或其抗原结合片段可以包含：具有如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的轻链可变区。这样的抗体可以结合内皮因子和抑制血管生成。
在任一个这样的实施方案中，所述重链可变区可以另外包含一个或多个选自下述的修饰：用丝氨酸（S）置换在位置76处的天冬酰胺（N）；用精氨酸（R）置换在位置77处的苏氨酸（T）；用异亮氨酸（I）置换在位置82a处的天冬酰胺（N）；用异亮氨酸（I）或亮氨酸（L）置换在位置89处的缬氨酸（V）；用甘氨酸（G）置换在位置94处的苏氨酸（T）；用苏氨酸（T）置换在位置108处的亮氨酸（L）；用亮氨酸（L）置换在位置109处的缬氨酸（V）；和用丙氨酸（A）置换在位置113处的丝氨酸（S）；且所述轻链可变区可以另外包含一个或多个选自下述的修饰：用谷氨酰胺（Q）置换在位置1处的天冬氨酸（D）；用缬氨酸（V）置换在位置3处的谷氨酰胺（Q）；用丝氨酸（S）置换在位置5处的苏氨酸（T）；用苯丙氨酸（F）置换在位置36处的酪氨酸（Y）；用缬氨酸（V）或丙氨酸（A）置换在位置60处的丝氨酸（S）；用丝氨酸（S）置换在位置70处的天冬氨酸（D）；用丙氨酸（A）置换在位置100处的甘氨酸（G）；和用亮氨酸（L）置换在位置106处的异亮氨酸（I），其中使用Kabat编号系统。
本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含：
（i）SEQ ID NO: 66的CDR1、SEQ ID NO: 67的CDR2和SEQ ID NO: 68的CDR3；
（ii）重链FR1，其具有SEQ ID NO: 44的氨基酸序列或包含一个或多个保守置换的SEQ ID NO: 44的氨基酸序列；
（iii）重链FR2，其具有SEQ ID NO: 45的氨基酸序列或包含丙氨酸（A）对位置49处的甘氨酸（G）的置换的SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，其中使用Kabat编号系统；和
（iv）重链FR3，其具有SEQ ID NO: 47的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 47的氨基酸序列：
（a）用丝氨酸（S）置换在位置76处的天冬酰胺（N）；
（b）用精氨酸（R）置换在位置77处的苏氨酸（T）；
（c）用缬氨酸（V）置换在位置78处的亮氨酸（L）；
（d）用异亮氨酸（I）置换在位置82a处的天冬酰胺（N）；
（e）用异亮氨酸（I）或亮氨酸（L）置换在位置89处的缬氨酸（V）；和
（f）用精氨酸（R）或甘氨酸（G）置换在位置94处的苏氨酸（T），其中使用Kabat编号系统；和
（v）重链FR4，其具有SEQ ID NO: 56的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 56的氨基酸序列：
（a）用苏氨酸（T）置换在位置108处的亮氨酸（L）；
（b）用亮氨酸（L）置换在位置109处的缬氨酸（V）；和
（c）用丙氨酸（A）置换在位置113处的丝氨酸（S），其中使用Kabat编号系统；
且所述轻链可变区包含：
（i）SEQ ID NO: 63的CDR1、SEQ ID NO: 64的CDR2和SEQ ID NO: 65的CDR3；
（ii）轻链FR1，其具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列：
（a）用谷氨酰胺（Q）置换在位置1处的天冬氨酸（D）；
（b）用缬氨酸（V）置换在位置3处的谷氨酰胺（Q）；
（c）用亮氨酸（L）置换在位置4处的甲硫氨酸（M）；和
（d）用丝氨酸（S）置换在位置5处的苏氨酸（T）；其中使用Kabat编号系统；和
（iii）轻链FR2，其具有SEQ ID NO: 20的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列：
（a）用苯丙氨酸（F）置换在位置36处的酪氨酸（Y）；
（b）用脯氨酸（P）置换在位置46处的亮氨酸（L）；和
（c）用色氨酸（W）置换在位置47处的亮氨酸（L），其中使用Kabat编号系统；和
（iv）轻链FR3，其具有SEQ ID NO: 28的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 28的氨基酸序列：
（a）用缬氨酸（V）或丙氨酸（A）置换在位置60处的丝氨酸（S）；
（b）用丝氨酸（S）置换在位置70处的天冬氨酸（D）；和
（b）用酪氨酸（Y）置换在位置71处的苯丙氨酸（F），其中使用Kabat编号系统；和
（v）轻链FR4，其具有SEQ ID NO: 35的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 35的氨基酸序列：
（a）用丙氨酸（A）置换在位置100处的甘氨酸（G）；和
（b）用亮氨酸（L）置换在位置106处的异亮氨酸（I），其中使用Kabat编号系统。
本文提供的抗体或其抗原结合片段可以包含：具有在SEQ ID NO: 66中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有在SEQ ID NO: 67中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有在SEQ ID NO: 68中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有在SEQ ID NO: 63中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有在SEQ ID NO: 64中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有在SEQ ID NO: 65中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合内皮因子，并包含：具有在SEQ ID NO: 44中所示的氨基酸序列的重链可变区FR1、具有在SEQ ID NO: 45中所示的氨基酸序列的重链可变区FR2、具有在SEQ ID NO: 47中所示的氨基酸序列的重链可变区FR3、具有在SEQ ID NO: 56中所示的氨基酸序列的重链可变区FR4。
在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合内皮因子，并包含：具有在SEQ ID NO: 44中所示的氨基酸序列的重链可变区FR1、具有在SEQ ID NO: 46中所示的氨基酸序列的重链可变区FR2、具有在SEQ ID NO: 48中所示的氨基酸序列的重链可变区FR3、具有在SEQ ID NO: 56中所示的氨基酸序列的重链可变区FR4。
在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有在SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR1、具有在SEQ ID NO: 20中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR2、具有在SEQ ID NO: 28中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR3和具有在SEQ ID NO: 35中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR4。
在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合内皮因子，并包含：具有在SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR1、具有在SEQ ID NO: 21中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR2、具有在SEQ ID NO: 29中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR3和具有在SEQ ID NO: 35中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR4。
在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合内皮因子，并包含：具有在SEQ ID NO: 7中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR1、具有在SEQ ID NO: 21中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR2、具有在SEQ ID NO: 29中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR3和具有在SEQ ID NO: 35中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR4。
本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。
本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区和具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区，其中，所述重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用丙氨酸（A）置换在位置49处的甘氨酸（G）；用丝氨酸（S）置换在位置76处的天冬酰胺（N）；用精氨酸（R）置换在位置77处的苏氨酸（T）；用缬氨酸（V）置换在位置78处的亮氨酸（L）；用异亮氨酸（I）置换在位置82a处的天冬酰胺（N）；用异亮氨酸（I）或亮氨酸（L）置换在位置89处的缬氨酸（V）；用苏氨酸（T）或甘氨酸（G）置换在位置94处的精氨酸（R）；用苏氨酸（T）置换在位置108处的亮氨酸（L）；用亮氨酸（L）置换在位置109处的缬氨酸（V）；和用丙氨酸（A）置换在位置113处的丝氨酸（S），其中使用Kabat编号系统；且所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用谷氨酰胺（Q）置换在位置1处的天冬氨酸（D）；用缬氨酸（V）置换在位置3处的谷氨酰胺（Q）；用亮氨酸（L）置换在位置4处的甲硫氨酸（M）；用丝氨酸（S）置换在位置5处的苏氨酸（T）；用苯丙氨酸（F）置换在位置36处的酪氨酸（Y）；用亮氨酸（L）置换在位置46处的脯氨酸（P）；用亮氨酸（L）置换在位置47处的色氨酸（W）；用缬氨酸（V）或丙氨酸（A）置换在位置60处的丝氨酸（S）；用丝氨酸（S）置换在位置70处的天冬氨酸（D）；用苯丙氨酸（F）置换在位置71处的酪氨酸（Y）；用丙氨酸（A）置换在位置100处的谷氨酰胺（G）；和用亮氨酸（L）置换在位置106处的异亮氨酸（I），其中使用Kabat编号系统。
本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区和轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
（i）SEQ ID NO: 66的CDR1、SEQ ID NO: 67的CDR2和SEQ ID NO: 68的CDR3；
（ii）重链FR1，其具有SEQ ID NO: 44的氨基酸序列或包含一个或多个保守置换的SEQ ID NO: 44的氨基酸序列；
（iii）重链FR2，其具有SEQ ID NO: 45的氨基酸序列或包含丙氨酸（A）对位置49处的甘氨酸（G）的置换的SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，其中使用Kabat编号系统；和
（iv）重链FR3，其具有SEQ ID NO: 47的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 47的氨基酸序列：
（a）用丝氨酸（S）置换在位置76处的天冬酰胺（N）；
（b）用精氨酸（R）置换在位置77处的苏氨酸（T）；
（c）用缬氨酸（V）置换在位置78处的亮氨酸（L）；
（d）用异亮氨酸（I）置换在位置82a处的天冬酰胺（N）；
（e）用异亮氨酸（I）或亮氨酸（L）置换在位置89处的缬氨酸（V）；和
（f）用苏氨酸（T）或甘氨酸（G）置换在位置94处的精氨酸（R），其中使用Kabat编号系统；和
（v）重链FR4，其具有SEQ ID NO: 56的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 56的氨基酸序列：
（a）用苏氨酸（T）置换在位置108处的亮氨酸（L）；
（b）用亮氨酸（L）置换在位置109处的缬氨酸（V）；和
（c）用丙氨酸（A）置换在位置113处的丝氨酸（S），其中使用Kabat编号系统；
且所述轻链可变区包含：
（i）SEQ ID NO: 63的CDR1、SEQ ID NO: 64的CDR2和SEQ ID NO: 65的CDR3；
（ii）轻链FR1，其具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列：
（a）用谷氨酰胺（Q）置换在位置1处的天冬氨酸（D）；
（b）用缬氨酸（V）置换在位置3处的谷氨酰胺（Q）；
（c）用亮氨酸（L）置换在位置4处的甲硫氨酸（M）；和
（d）用丝氨酸（S）置换在位置5处的苏氨酸（T）；其中使用Kabat编号系统；和
（iii）轻链FR2，其具有SEQ ID NO: 21的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列：
（a）用苯丙氨酸（F）置换在位置36处的酪氨酸（Y）；
（b）用亮氨酸（L）置换在位置46处的脯氨酸（P）；和
（c）用亮氨酸（L）置换在位置47处的色氨酸（W），其中使用Kabat编号系统；和
（iv）轻链FR3，其具有SEQ ID NO: 29的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 28的氨基酸序列：
（a）用缬氨酸（V）或丙氨酸（A）置换在位置60处的丝氨酸（S）；
（b）用丝氨酸（S）置换在位置70处的天冬氨酸（D）；和
（b）用苯丙氨酸（F）置换在位置71处的酪氨酸（Y），其中使用Kabat编号系统；和
（v）轻链FR4，其具有SEQ ID NO: 35的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 35的氨基酸序列：
（a）用丙氨酸（A）置换在位置100处的甘氨酸（G）；和
（b）用亮氨酸（L）置换在位置106处的异亮氨酸（I），其中使用Kabat编号系统。
可变结构域的主要部分包括3个CDR区域以及它们的插入框架区。所述部分也可以包括：第一和第四框架区中的任一个或二者的至少约50%，所述50% 是第一框架区的C-端50% 和第四框架区的N-端50%。在可变结构域的主要部分的N-端或C-端末端处的其它残基可以是，通常与天然存在的可变结构域区域无关的那些残基。例如，通过重组DNA技术构建本文所述的人源化的内皮因子抗体和抗原结合片段，可以导入由导入的连接物编码的N-或C-端残基，以促进克隆或其它操作步骤。其它操作步骤包括，导入连接物来使可变结构域与其它蛋白序列相连，所述其它蛋白序列包括：免疫球蛋白重链、其它可变结构域（例如在双体的生产中）或在下面更详细地讨论的蛋白标记。
人源化的内皮因子CDR3区域（其具有基本上如本文所述抗体的CDR3区域所示的氨基酸序列）将被负载在允许所述CDR3区域与内皮因子结合的结构中。用于负载CDR3的结构可以是抗体重链或轻链序列或其主要部分，其中所述CDR3区域位于这样的位置：所述位置与由重排的免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR3区域相对应。
在一个非限制性实施例中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其包含可变重链和/或可变轻链，所述可变重链的CDR3具有如SEQ ID NO: 68所示的氨基酸序列，所述可变轻链的CDR3具有如SEQ ID NO: 65所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述可变重链具有如SEQ ID NO: 40所示的氨基酸序列，但是CDR3被置换为如SEQ ID NO: 68所示的CDR3氨基序列。在另一个实施方案中，所述可变轻链具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，但是CDR3被置换为如SEQ ID NO: 65所示的CDR3氨基酸序列。另外，这样的含有CDR3的可变区/链可以包含：例如如上所述的一个或多个FR氨基酸序列（或这样的含有一个或多个额外修饰的FR），其中所述抗体或抗原结合片段在每个VH和VL区域中具有3个CDR和4个FR，具有对内皮因子的特异性结合活性，且能够抑制血管生成。另外，也可以置换在这些可变区内的不同的抗体J区段，用于实现可变区链内的其它变化。
在一个方面，通过进一步替代FR4序列，也可以制备本文所述的可变重链和轻链。
在一个实施方案中，所述重链FR4序列可以置换下述之一：
SEQ ID NO: Kabat-编号 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113
76 来自JH1、JH4或JH5的FRM4 W G Q G T L V T V S S
77 来自JH2的FRM4 W G R G T L V T V S S
78 来自JH3的FRM4 W G Q G T M V T V S S
79 来自JH6的FRM4 W G Q G T T V T V S S
在一个实施方案中，轻链FR4序列可以置换下述之一:
SEQ ID NO Kabat编号 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107
80 JK1 F G Q G T K V E I K
81 JK2 F G Q G T K L E I K
82 JK3 F G P G T K V D I K
83 JK4 F G G G T K V E I K
84 JK5 F G Q G T R L E I K
本文另外提供了人源化形式的抗-内皮因子抗体，或者称作“超人源化的”抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段。这样的超人源化抗体或其抗原结合片段可以包含：具有如SEQ ID NO: 71或72所示的氨基酸序列的轻链可变区和具有如SEQ ID NO: 75所示的氨基酸序列的重链可变区。
在另一个方面，本申请提供了一种人源化抗体，其能够在一定条件下与本文所述的人源化的抗-内皮因子抗体或抗原结合片段竞争，其中在ELISA试验中，与这样的抗体的竞争会阻止至少5%的具有所述抗体的VH和VL序列的抗体与内皮因子结合。
本文提供了中和抗体或抗原结合片段，其结合内皮因子，并调节内皮因子的活性。中和抗体可以例如通过结合内皮因子来抑制血管生成。
人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段使血管生成与阴性对照相比抑制至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍或更大的百分比（%），指示抗体或其抗原结合片段抑制血管生成。人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段使血管生成与阴性对照相比抑制小于2倍的百分比（%），指示抗体或其抗原结合片段不会抑制血管生成。
抗体或抗原结合片段与内皮因子的结合可以部分地（例如5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或它们之间的任意数字）或完全地抑制血管生成。使用体外试验和/或在体内使用本领域公认的试验（诸如本文所述的或本领域以其它方式已知的那些），可以测定抗体或抗原结合片段的中和或抑制活性。
在一个方面，上述的人源化抗体中的任一种的抗原结合片段是如本文所述的Fab、Fab’、Fd、F(ab')2、Fv、scFv、单链结合多肽（例如，具有Fc部分的scFv）或它们的任意其它功能片段。
本文所述的抗体或抗原结合片段可用于在下面更详细地描述的检测或诊断用途。本文所述的抗体或抗原结合片段可用于结合内皮因子，这又可以抑制本文所述的血管生成。
如果需要的话，可以进一步修饰本文所述的抗体或其抗原结合片段，以改变所述抗体的特定性质，同时保留希望的功能。例如，在一个实施方案中，可以修饰所述化合物，以改变所述化合物的药代动力学性质，诸如体内稳定性、溶解度、生物利用度或半衰期。本文所述的抗体或其抗原结合片段可以另外包含治疗部分、可检测部分或二者，用于诊断和/或治疗用途中。
本文所述的抗体或其抗原结合片段也可以用作免疫缀合物。如本文使用的，为了说明书和权利要求书的目的，免疫缀合物表示由根据本发明的人源化的抗-内皮因子抗体或其片段和至少一种治疗标记组成的缀合物。治疗标记包括抗肿瘤试剂和血管生成抑制剂。这样的抗肿瘤试剂是本领域已知的，包括但不限于：毒素、药物、酶、细胞因子、放射性核素、光动力剂和血管生成抑制剂。毒素包括、但不限于：蓖麻蛋白A链、突变型假单胞菌外毒素、白喉类毒素、链黑霉素、博安霉素（boamycin）、皂草素、白树毒素和美洲商陆抗病毒蛋白。药物包括柔红霉素、甲氨蝶呤和卡奇霉素。放射性核素包括放射性金属。细胞因子包括、但不限于：转化生长因子（TGF）-β、白介素、干扰素和肿瘤坏死因子。光动力剂包括、但不限于：卟啉类和它们的衍生物。额外的治疗标记是本领域已知的，且也在本文中预见到。用于使抗-内皮因子mAb或其片段与至少一种抗肿瘤剂复合的方法是本领域技术人员众所周知的（即，Ghetie等人, 1994, Pharmacol. Ther. 63:209-34所综述的抗体缀合物）。这样的方法可以利用几种可使用的用于偶联或连接分子的杂双功能试剂之一。额外的放射性核素与额外的连接分子（诸如治疗和诊断标记）的方法一起在本文中予以另外描述。
使用本领域已知的用于不同目的的技术，例如，通过添加聚乙二醇（PEG），可以修饰抗体或其抗原结合片段。PEG修饰（聚乙二醇化）可以导致下述的一项或多项：提高的循环时间、提高的溶解度、提高的对蛋白酶解的抗性、降低的抗原性和免疫原性、提高的生物利用度、降低的毒性、提高的稳定性和更容易配制（关于综述，参见，Francis等人, International Journal of Hematology 68:1-18, 1998）。
在不含有Fc部分的抗原结合片段的情况下，可以将Fc部分添加（例如，重组地）给所述片段，例如，以增加所述抗原结合片段当施用给患者时在血液中的循环半衰期。适当的Fc区和掺入这样的片段的方法的选择，是本领域已知的。使用本领域已知的常规技术，例如，在美国专利号6,096,871（它通过引用整体并入本文）中描述的技术，可以将IgG的Fc区掺入目标多肽中，从而增加它的循环半衰期，但是不会丧失它的生物活性。可以进一步修饰抗体的Fc部分，以增加所述抗原结合片段当施用给患者时在血液中的循环半衰期。使用本领域的常规方式，例如，在美国专利号7,217,798（它通过引用整体并入本文）中所述的方式，可以测定修饰。
提高基于抗体的融合蛋白在循环中的半衰期的其它方法也是已知的，例如，在美国专利号7,091,321和6,737,056（它们各自通过引用并入本文）中所述的方法。另外，可以生产或表达抗体和其抗原结合片段，使得它们不含有在它们的复杂的N-糖苷-连接的糖链上的岩藻糖。已知从复杂的N-糖苷-连接的糖链去除岩藻糖会增加抗体和抗原结合片段的效应子功能，包括但不限于：抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖性的细胞毒性（CDC）。类似地，可以将结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段在它们的C-端末端连接在源自任意抗体同种型（例如，IgG、IgA、IgE、IgD和IgM）和任意同种型亚类（尤其是IgG1、IgG2b、IgG2a、IgG3和IgG4）的所有或一部分免疫球蛋白重链上。
另外，还可以修饰本文所述的抗体或抗原结合片段，使得它们能够穿过血脑屏障。本文所述的抗体或抗原结合片段的这种修饰允许治疗脑疾病，诸如多形性胶质母细胞瘤（GBM）。在美国专利申请公开2007/0082380（它通过引用整体并入本文）中描述了允许蛋白（诸如抗体或抗原结合片段）穿过血脑屏障的示例性的修饰。
已经证实，免疫球蛋白的糖基化对它们的效应子功能、结构稳定性和从抗体生产细胞分泌的速率具有显著影响（Leatherbarrow等人, Mol. Immunol. 22：407（1985））。负责这些性质的碳水化合物基团通常连接在抗体的恒定（C）区上。例如，IgG的活化补体依赖性的细胞溶解的经典途径的完全能力，需要IgG在CH 2结构域中的天冬酰胺297处的糖基化（Tao和Morrison, J. Immunol. 143:2595（1989））。IgM在CH 3结构域中的天冬酰胺402处的糖基化，是抗体的适当装配和细胞溶解活性所必需的（Muraoka和Shulman, J. Immunol. 142:695（1989））。在IgA抗体的CH 1和CH3结构域中的位置162和419处的糖基化位点的去除，会导致细胞内降解和至少90%的分泌抑制（Taylor和Wall, Mol. Cell. Biol. 8:4197（1988））。另外，可以生产或表达抗体和其抗原结合片段，使得它们不含有在它们的复杂的N-糖苷-连接的糖链上的岩藻糖。已知从复杂的N-糖苷-连接的糖链去除岩藻糖会增加抗体和抗原结合片段的效应子功能，包括但不限于：抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖性的细胞毒性（CDC）。利用本领域已知的分子克隆技术，通过多种系统，可以生产这些“去岩藻糖基化的”抗体和抗原结合片段，包括但不限于转基因动物、转基因植物或细胞系，它们已经遗传地工程化，使得它们不再含有在复杂的N-糖苷-连接的糖链中包含岩藻糖所必须的酶和生化途径（也称作岩藻糖基转移酶敲除的动物、植物或细胞）。可以工程化成岩藻糖基转移酶敲除的细胞的细胞的非限制性实施例包括：CHO细胞、SP2/0细胞、NS0细胞和YB2/0细胞。
还已经观察到免疫球蛋白在可变（V）区中的糖基化。Sox和Hood报道，约20%的人抗体在V区中被糖基化（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66:975（1970））。认为V结构域的糖基化源自N-连接的糖基化信号Asn-Xaa-Ser/Thr在V区序列中的偶然出现，且本领域尚未认为在免疫球蛋白功能中起作用。
在可变结构域框架残基处的糖基化可以改变抗体与抗原的结合相互作用。本发明包括这样的标准：通过所述标准，选择要突变（例如，通过残基的置换、删除或添加）的人源化免疫球蛋白链的框架或CDR中的有限数目的氨基酸，以便增加抗体的亲和力。
通常，通过将一个或多个突变导入V区框架中，通常在邻近一个或多个CDR的区域中和/或在一个或多个框架区中，可以调节结合预定的多肽抗原的亲和力。通常，这样的突变涉及保守氨基酸置换的导入，所述置换会破坏或建立糖基化位点序列，但是基本上不会影响多肽的水疗（hydropathic）结构性质。通常，避免导入脯氨酸残基的突变。在美国专利号6,350,861（它关于糖基化通过引用并入本文）中进一步描述了抗体和其抗原结合片段的糖基化。
可以配制用于短期递送或延长的（长期）递送的抗体或其抗原结合片段。
结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段也可以用于纯化内皮因子和/或检测样品或患者中的内皮因子水平，以检测或诊断在下面更详细地描述的与内皮因子有关的疾病或障碍。
可以测试使用这样的方法制备的结合内皮因子的人源化抗体、抗原结合片段和结合蛋白的结合亲和力、亲合力和中和能力中的一项或多项。有用的人源化抗体、抗原结合片段和结合蛋白可以用于施用给患者，以预防、抑制、控制或治疗与血管生成有关的病症、疾病或障碍。
本文提供了鉴别结合内皮因子的人源化抗体或其抗原结合片段的方法。可以评价抗体和抗原结合片段的结合亲和力、结合速率、解离速率和亲合力中的一项或多项。在一个方面，可以评价抗体的中和内皮因子或其中存在内皮因子结合序列的多肽的活性的能力。使用本领域公认的试验，包括（表面等离子体共振）但不限于：酶联免疫吸附测定（ELISA）、Scatchard分析、BIACORE分析等以及本领域普通技术人员通常使用的和已知的其它试验，可以测量结合亲和力、结合速率、解离速率和亲合力。
使用例如酶联免疫吸附测定（ELISA）、竞争性结合试验、ELISPOT试验或本领域已知的任意其它有用的试验，可以测量抗体与内皮因子的结合和/或测定例如抗体和其抗原结合片段的抑制血管生成的能力。这些试验是本领域普通技术人员通常使用的和众所周知的。
在一个非限制性实施方案中，ELISA试验可以用于测量结合内皮因子的特定抗体或抗原结合片段的结合能力。
诸如ELISA等试验也可以用于鉴别与其它抗体或其抗原结合片段相比表现出增加的对内皮因子的特异性的抗体或其抗原结合片段。诸如ELISA等试验也可以用于鉴别这样的抗体或其抗原结合片段：其结合跨一种或多种多肽的表位和跨一种或多种内皮因子的表位。通过运行平行的ELISA，可以进行特异性试验，在所述ELISA中，在单独的试验室中同时地筛选实验抗体或其抗原结合片段的结合一种或多种表位（在含有内皮因子表位的不同多肽上）的能力，以鉴别结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员熟悉的另一种测量表观结合亲和力的技术是表面等离子体共振技术（在BIACORE 2000系统上分析）（Liljeblad, 等人, Glyco. J. 2000, 17:323-329）。Heeley, R. P., Endocr. Res. 2002, 28:217-229描述了标准测量和传统的结合试验。
也可以测试结合内皮因子的人源化抗体的治疗与血管生成有关的多种疾病和病症的能力，所述疾病和病症例如：不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病（例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变）、糖尿病肾病、慢性炎性疾病（例如，IBD）、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症（原发性肿瘤和转移灶）。本领域技术人员已知的任意合适的试验可以用于监测这种效应。本文描述了几种这样的技术。在一个实施例中，测试本文描述的抗体和抗原结合片段的结合内皮因子的能力。在另一个实施例中，通过表面等离子体共振（SPR），测定本文描述的抗体和抗原结合片段的亲和常数。在另一个实施例中，测定本文描述的抗体和抗原结合片段对血管生成抑制的作用。
II. 组合物
当与可接受的载体或赋形剂相组合时，本文所述的每种化合物可以用作组合物。这样的组合物可用于体外或体内分析，或用于与公开的化合物一起在体内或离体施用给受试者，以治疗受试者。
因而，除了活性成分以外，药物组合物可以包括：药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其它物质。这样的物质应当是无毒的，且不会干扰活性成分的效能。载体或其它物质的精确性质取决于给药途径。
可以如下制备包含目标蛋白（例如，抗体或抗原结合片段）的药物制剂（通过本文所述的方法鉴别）用于贮存：混合具有希望的纯度程度的蛋白和任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂（Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版, Osol, A.编（1980）），制成低压冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂是在采用的剂量和浓度对受体无毒的那些，包括：缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂（诸如十八基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（小于约10个残基）多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水的聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子诸如钠；金属络合物（例如，Zn-蛋白络合物）；和/或非离子型表面活性剂诸如TWEEN®、PLURONICS®或聚乙二醇（PEG）。
可接受的载体是施用的患者在生理上可接受的，并保留与其一起/在其中施用的化合物的治疗性质。可接受的载体和它们的制剂是，且通常描述在，例如，Remington’pharmaceutical Sciences（第18版, A. Gennaro编, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990）。一种示例性的载体是生理盐水。本文使用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的物质、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料，它们涉入主题化合物从一个器官或身体部分的施用部位携带或运输至另一个器官或身体部分，或在体外试验系统中。每种载体是可接受的，其含义是，与制剂的其它成分相容，且对它所施用的受试者无害。可接受的载体也不会改变主题化合物的比活。
在一个方面，本文提供了药学上可接受的或生理上可接受的组合物，包括与药物施用相容的溶剂（水性的或非水性的）、溶液、乳剂、分散介质、包衣剂、等张剂和吸收促进剂或吸收延迟剂。因此，药物组合物或药物制剂表示，适合在受试者中的药用的组合物。药物组合物和制剂包括一定量的本文所述的化合物和药学上或生理上可接受的载体。
可以将组合物配制成与特定给药途径（即，全身的或局部的）相容。因而，组合物包括适合通过不同途径来施用的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一个实施方案中，所述组合物可以另外包括：如果需要的话，可接受的添加剂，以便提高化合物在组合物中的稳定性和/或控制组合物的释放速率。可接受的添加剂不会改变主题化合物的比活。示例性的可接受的添加剂包括、但不限于：糖，诸如甘露醇、山梨醇、葡萄糖、木糖醇、海藻糖、山梨糖、蔗糖、半乳糖、葡聚糖、葡萄糖、果糖、乳糖及其混合物。可接受的添加剂可以与可接受的载体和/或赋形剂（诸如葡萄糖）相组合。或者，示例性的可接受的添加剂包括、但不限于：表面活性剂诸如聚山梨酯20或聚山梨酯80，以增加肽的稳定性和减轻溶液的胶凝。可以将表面活性剂加入组合物中，其量为溶液的0.01%-5%。这样的可接受的添加剂的加入会增加组合物在贮存时的稳定性和半衰期。
可以施用药物组合物，例如，通过注射，包括但不限于：皮下的、玻璃体内的、真皮内的、静脉内的、动脉内的、腹膜内的或肌肉内的注射。在本文中预见到用于每类注射的组合物制剂中的赋形剂和载体。下面的描述仅仅作为实例，无意限制组合物的范围。用于注射的组合物包括，水溶液（在水溶性的情况下）或分散物和无菌粉末，所述粉末用于临时制备无菌注射溶液或分散物。对于静脉内的施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL™（BASF, Parsippany, N.J.）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）和它们的适当混合物的溶剂或分散介质。可以维持流动性，例如，通过使用涂层诸如卵磷脂，通过维持需要的粒度（在分散物的情况下）和通过使用表面活性剂。抗细菌剂和抗真菌剂包括，例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞。可以在组合物中包括等张剂，例如，糖类、多元醇（诸如甘露醇、山梨醇）和氯化钠。可以将得到的溶液包装后原样使用，或低压冻干；所述低压冻干的制品可以在以后在施用之前与无菌溶液相组合。对于静脉内注射或在累及部位处的注射，活性成分可以是肠胃外地可接受的水溶液的形式，所述水溶液是无热原的，且具有合适的pH、等张度和稳定性。本领域的相关技术人员能够熟练地制备合适的溶液，其中使用例如等张媒介物，诸如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸盐化的林格注射液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。可以如下制备无菌注射溶液：将需要量的活性成分掺入适当溶剂中，所述溶剂含有一种或多种上面列举的成分的组合（根据需要），然后过滤除菌。通常，如下制备分散物：将活性成分掺入无菌的媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和来自上面列举的那些的需要的其它成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分和来自以前无菌过滤的溶液的任意额外希望的成分的粉末。
可以通过玻璃体内地、皮下地或通过玻璃体内植入来常规地施用组合物。
可以静脉内地（诸如通过注射例如单位剂量）来常规地施用组合物。为了注射，活性成分可以是肠胃外地可接受的水溶液的形式，所述水溶液是基本上无热原的，且具有合适的pH、等张度和稳定性。可以制备合适的溶液，其中使用例如等张媒介物，诸如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸盐化的林格注射液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。另外，可以通过气雾化来施用组合物（Lahn等人, Aerosolized Anti-T-cell-Receptor Antibodies Are Effective against Airway Inflammation and Hyperreactivity, Int. Arch. Allegery Immuno., 134: 49-55 (2004)）。
在一个实施方案中，低压冻干所述组合物，例如，以增加贮存的贮存期限。当考虑将组合物用于药物或本文提供的任意方法中时，预见到，所述组合物可以是基本上无热原的，使得所述组合物当施用给人患者时不会造成炎症反应或不安全的变态反应。测试组合物的热原和制备基本上无热原的组合物，是本领域普通技术人员容易理解的，且可以使用可商业得到的试剂盒来实现。
可接受的载体可以含有稳定化、增加或延迟吸收或清除的化合物。这样的化合物包括，例如，碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；低分子量蛋白；减少肽的清除或水解的组合物；或赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲剂。延迟吸收的试剂包括，例如，单硬脂酸铝和明胶。也可以使用去污剂来稳定化组合物或增加或减少药物组合物的吸收，包括脂质体载体。为了保护免于消化，可以使化合物与组合物形成复合物，以使它耐受酸性和酶促水解，或可以使化合物在适当耐受性的载体（诸如脂质体）中形成复合物。保护化合物免于消化的方法是本领域已知的（参见，例如，Fix (1996) Pharm Res. 13:1760 1764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119 135；和美国专利号5,391,377，它们描述了用于口服递送治疗剂的液体组合物）。
短语“药学上可接受的”表示这样的分子实体和组合物：当施用给人时，其是生理上可耐受的，且通常不会产生变应性的或类似的不良反应，诸如胃不适、头晕等。
当提及治疗组合物时，术语“单位剂量”表示适合作为人的单位剂量的物理上分离的单位，每个单位含有经计算会产生希望的治疗效果的预定量的活性物质以及需要稀释剂（即，载体或媒介物）。
可以以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效量施用组合物。要施用的量取决于待治疗的受试者、受试者的免疫系统利用活性成分的能力和希望的结合能力的程度。需要施用的活性成分的精确量取决于从业人员的判断，且随每个个体而异。适合初次施用和加强注射的方案也是可变的，但是可以表征为：初次施用，随后以1小时或几小时间隔重复施用后续注射或其它施用。或者，预见到足以维持血液中的浓度的连续静脉内输注。
一个实施方案预见到本文所述组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗本文所述的病症、疾病或障碍。可以基于需要治疗的患者/受试者的身体特征来配制药物，且可以基于病症、疾病或障碍的阶段配制成单个或多个制剂。可以将药物包装在合适的包装中，所述包装具有适合分配给医院和诊所的标签，其中所述标签用于指示治疗具有本文所述疾病的受试者。可以将药物包装成单个或多个单位。可以在下文所述的包装中，包括关于组合物的剂量和施用的说明书。本发明另外涉及上文所述的人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物。
本文提供了人源化抗体和其抗原结合片段（其结合内皮因子，并包括诸如在本文别处所述的那些）的组合物。本文所述的结合内皮因子的人源化抗体和其抗原结合片段可以用于治疗不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病（例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变）、糖尿病肾病、慢性炎性疾病（例如，IBD）、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症（原发性肿瘤和转移灶）。
组合物（本文所述的抗体或抗原结合片段）可以单独施用，或与第二种组合物同时地或顺序地联合施用，这取决于要治疗的病症。在一个实施方案中，第二种治疗性处理是血管生成抑制剂（如本文所述）。当施用2种或更多种组合物时，可以联合地（顺序地或同时地）施用所述组合物。可以在单次剂量或多次剂量中施用组合物。
在本发明的一个实施方案中，将所述组合物配制成不含有热原，使得它们可接受施用给人患者。测试组合物的热原和制备无热原的药物组合物，是本领域普通技术人员所熟知的。
本发明的一个实施方案预见到本发明的任意组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗本发明的障碍。可以基于需要治疗的患者/受试者的身体特征来配制药物，且可以基于障碍配制成单个或多个制剂。可以将本发明的药物包装在合适的药物包装中，所述包装具有适合分配给医院和诊所的标签，其中所述标签用于指示治疗受试者中本文所述的障碍。可以将药物包装成单个或多个单位。可以在药物包装中包括关于本发明的药物组合物的剂量和施用的说明书。
III. 使用方法
本文提供了一种在患者（人或非人）中诱导应答的方法，其中给患者施用优先结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段的组合物。所述抗体所结合的结合位点可以是连续的或构象/不连续的表位。
当患者经历疾病的征象或征状的部分或完全减轻或减少（具体地，包括但不限于生存期的延长和/或视敏度）时，实现本发明的有效应答。可以按月至年来测量预期的无进展存活时间，这取决于预后因素，包括复发的次数、疾病的阶段和其它因素。延长存活期包括但不限于至少1个月（mo）、约至少2个月、约至少3个月、约至少4个月、约至少6个月、约至少1年、约至少2年、约至少3年等的时间。也可以按月至年来测量总存活。或者，有效应答可以是，患者的征状保持静止。在下面更详细地描述了适应症的治疗的其它指示。
本文所述的抗体和抗原结合片段的组合物可以用作非治疗剂（例如，作为亲和纯化试剂）。通常，在一个这样的实施方案中，使用本领域已知的常规方法，将目标蛋白固定化在固相（诸如Sephadex树脂或滤纸）上。使固定化的蛋白接触要纯化的含有目标靶物（或其片段）的样品，然后用合适的溶剂洗涤支持物，所述溶剂会去除样品中除了靶蛋白以外基本上所有的物质，所述靶蛋白结合在固定化的抗体上。最后，用另一种合适的溶剂（诸如甘氨酸缓冲液, pH 5.0）洗涤支持物，所述溶剂将释放出靶蛋白。除了纯化以外，组合物可以用于检测、诊断和治疗与内皮因子和血管生成有关的疾病和障碍。
本文使用的术语“接触”表示，将化合物的溶液或组合物与浸泡来自生物体的多肽、细胞、组织或器官的液体介质加到一起。或者，“接触”表示，将化合物的溶液或组合物与液体（诸如源自生物体的血液、血清或血浆）混合到一起。对于体外用途，组合物还可以包含另一种组分，诸如二甲亚砜（DMSO）。DMSO会促进化合物的摄入或化合物的溶解度。通过利用递送装置，诸如基于吸液管的装置或基于注射器的装置，可以将包含实验化合物的溶液加入浸泡细胞、组织或器官的介质中，或与另一种液体（诸如血液）相混合。对于体内用途，通过例如经由任意合适的装置将组合物施用给患者，可以发生接触；上面已经更详细地描述了含有药学上可接受的赋形剂和载体的组合物。
根据本申请的一个实施方案，“患者”（例如，哺乳动物诸如人或非人动物，诸如灵长类动物、啮齿动物、牛、马、猪、绵羊等）是表现出本文所述的疾病或障碍的一种或多种临床表现和/或征状的哺乳动物。在某些情形中，患者可以是无症状的，且仍然具有所述疾病或障碍的临床表现。可以将抗体或其抗原结合片段缀合到治疗部分上，或是含有治疗部分的融合蛋白。可以将抗体或其抗原结合片段缀合到可检测部分上，或是含有可检测部分的融合蛋白。在一个实施方案中，可以将抗体或其抗原结合片段缀合到治疗部分和可检测部分上。可以将抗体或其抗原结合片段缀合到亲和标签（例如，纯化标签）上，或用亲和标签（例如，纯化标签）重组地工程化。亲和标签（例如，His6标签（SEQ ID NO: 85））在本领域中是常规的。
本文提供的抗体或其抗原结合片段使得，它们可以缀合或连接至治疗部分和/或成像部分或可检测部分和/或亲和标签上。用于缀合或连接多肽的方法是本领域众所周知的。化合物和标记之间的缀合（结合）包括本领域已知的任意方法，包括但不限于：共价和非共价相互作用、化学缀合以及重组技术。
A. 内皮因子的结合和血管生成
内皮因子（CD105）在细胞表面上表达为180 kDa同源二聚体跨膜蛋白。外部结构域以高亲和力（50 nM）结合TGF-β1和-3亚型，且CD105的跨膜和细胞内结构域与β聚糖具有71%序列相似性。人CD105基因位于染色体9q34上（使用荧光原位杂交进行鉴别），编码区含有14个外显子，已经表征了具有结合TGF-β的能力的CD105的2个不同亚型（L和S）。L-CD105由633个氨基酸残基组成，其中47个氨基酸残基在细胞质尾巴中，这不同于S-CD105，后者由600个氨基酸残基组成，其具有14个氨基酸细胞质尾巴。但是，L-CD105是优势形式。CD105在内皮细胞中组成性地磷酸化，主要在丝氨酸和苏氨酸残基上，且该磷酸化是由于在细胞内组成活性的TGF- βRII。TGF- β与CD105的结合导致磷酸化的减量调节，这类似于用蛋白激酶C抑制剂观察到的效应。人CD105氨基酸序列含有位于胞外结构域的暴露区域中的三肽精氨酸-甘氨酸-门冬氨酸（RGD）。RGD肽是在ECM蛋白（诸如纤连蛋白、玻璃体结合蛋白、von Willebrand因子（vWF）、I型胶原和纤维蛋白原）上发现的关键识别结构，且被细胞表面整联蛋白识别。整联蛋白附着已经涉入止血、血栓形成、血管生成和炎症，它们是内皮在其中起关键作用的过程（Duff等人, FASEB J., 17:984-992（2003））。
CD105是TGF-β受体家族的一个成员，其由增殖中的内皮细胞表达。内皮细胞增殖需要正常的CD105水平。CD105表达会被细胞低氧增加（通过低氧诱导因子-1-α（HIF-1-α）的生产），并保护低氧细胞免于细胞凋亡。CD105的几种功能与TGF-β信号传递有关。TGF-β通过异源二聚体受体发信号，所述受体由丝氨酸激酶、受体I（RI）和受体II（RII）组成。TGF-β与受体的外部结构域的结合，会暴露细胞质的RII激酶活性，所述活性会磷酸化TGF-βRI，后者然后可以与下游信号传递物（诸如Smad蛋白）相互作用。CD105形成TGF-β受体复合物的一部分，但是它可以独立地存在于细胞表面上。在许多体外细胞中，CD105会抑制TGF-β信号传递。
CD105也结合其它生长因子，诸如激活蛋白A和骨形态发生蛋白（BMP）-10、-9、-7和-2。TGF-β或其它生长因子配体与CD105的结合，需要至少存在受体RII，且它自己不能结合配体。CD105与受体的结合不会改变它们对配体本身的亲和力。在结合以后，CD105的细胞质结构域被TGF-βRI和TGF-βRII磷酸化；然后TGF-βRI（但是TGF-βRII不会）激酶从受体复合物解离。
CD105表达会抑制TGF-βRII的磷酸化水平，但是增加TGF-βRI的磷酸化水平，导致增加的Smad 2的磷酸化，但是不增加Smad 3的磷酸化。由于Smad 2可以与多种转录因子、辅活化剂和抑制剂相互作用，磷酸化的Smad 2可以起多种信号的积分器的作用，以调节基因转录。因而，CD105会调节TGF-β功能（通过与TGF-βRI和TGF-βRII的相互作用），并修饰下游Smad蛋白的磷酸化。
CD105起调节TGF-β超家族的多种激酶受体复合物的信号传递的作用，包括TGF-β受体（TGF-βR）、激活蛋白受体-样激酶（ALK）和激活蛋白受体。在没有CD105存在下，TGF-β受体的活化会导致SMAD蛋白（SMAD 2和3）的磷酸化，这会抑制内皮细胞生长。但是，TGF-β对CD105的活化会调节SMAD蛋白磷酸化（包括SMAD 1、5和8的磷酸化）。最终结果是TGF-β受体活化对内皮细胞的生长抑制作用的释放（参见图1）。不足令人惊奇的是，抗-CD105抗体或反义寡核苷酸对CD105活化的阻止，会与TGF-β协同地起抑制内皮细胞生长的作用。
CD105启动子的长度是2.6 kb，但是不含有TATA或CAAT转录起始盒。但是，它具有2个富含GC的区域：Sp1、ets、GATA、AP-2、NGF-β和Mad的共有基序，以及TGF-β应答元件。虽然如此，CD105具有相对受限的细胞分布。基础转录水平似乎需要ets位点（在位置-68处）和Sp1位点，但是表达的相对受限（例如，限于内皮细胞）似乎涉及多个调节区，具体地，一个在-1294至-932处，另一个非常接近转录起始位点。CD105被TGF-β增量调节，这已经被证实需要在-37至-29处的Sp1位点，也涉及一个或多个紧靠的在上游的SBE位点，所述位点结合Smads 3和/或4（它们被TGF-β信号传递活化）。低氧是缺血组织和肿瘤的共同特征，且是血管内皮细胞（EC）中的CD105基因表达的有效刺激物。与TGF-β1的组合会增强这样的效应。增量调节的CD105可以在低氧应激下的EC中发挥自我保护作用。
血管EC是CD105的主要来源。其它细胞类型（包括血管平滑肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、前-B和骨髓单核细胞起源的白血病细胞以及红细胞前体）在更低的程度上表达CD105。
CD105涉入血管生成。反义实验已经证实，与TGF-β1组合地抑制HUVEC中CD105表达，会导致体外血管生成的显著抑制，这表明CD105是内皮细胞中的促血管生成组分。CD105在血管生成中的重要作用的其它证据来自CD105敲除的小鼠。没有CD105的小鼠表现出多种血管和心脏缺陷，导致在胚胎早期死亡。在没有CD105的小鼠中观察到的严重血管病损指示，成熟的血管在胚胎外脉管系统中的形成需要CD105，这进一步证实了内皮因子在血管生成中的直接作用。
内皮因子（除了别的以外，也称作CD105或edg-1）是I型同源二聚体膜糖蛋白，其以高水平在增殖中的血管内皮细胞中表达。因而，内皮因子主要是经历活跃的血管生成的内皮细胞的增殖相关的标志物。但是，正常组织的血管内皮可能存在有限的内皮因子表达。已知人内皮因子会特异性地结合转化生长因子-β（TGF-β），推论的内皮因子氨基酸序列与β-聚糖（TGF-β受体的一种类型）具有强同源性。
在基于抗体的减少肿瘤脉管系统的方法中，已经靶向内皮因子（EDG），因为EDG是在内皮和白血病细胞上的增殖相关的抗原。它在肿瘤相关的血管内皮中的表达受到增量调节，EDG是血管生成所必需的。血管生成包括新毛细血管的形成，这会导致新生血管形成以及现有脉管系统的维持。这是一个复杂的过程，该过程包括一系列相继的步骤，包括内皮细胞介导的血管基膜和间质基质的降解、内皮细胞的迁移、内皮细胞的增殖和内皮细胞的毛细血管袢的形成。
本文提供了结合内皮因子的人源化抗体。内皮因子可以存在于：构成和支持现有的脉管系统的细胞上，以及促进新脉管系统的生长并变成新脉管系统的一部分的细胞上。所述抗体可以结合内皮因子，并从而抑制血管生成、抑制现有的脉管系统或现有脉管系统的维持和/或抑制小血管膨胀。除了它们用于纯化内皮因子的用途以外，这些抗体可用于纯化、检测和诊断目的以及治疗目的。本文提供的抗体可以用于配制用于治疗多种病症和疾病的药物、治疗所述病症和疾病的方法和检测方法或诊断方法。
已经产生了针对内皮因子的鼠单克隆抗体（mAb），它们会调节内皮因子活性，并从而抑制血管生成和/或抑制小血管的血管舒张。这些鼠抗体描述在美国专利5,928,641、6,200,566、6,190,660和7,097,836中，它们中的每一篇整体并入本文。另外，已经证实了许多这样的抗体的离体和体内有效性；结合内皮因子的单克隆抗体作为调节内皮因子的化合物是令人感兴趣的。但是，鼠抗体的治疗性应用是不可行的，因为鼠抗体的施用具有许多限制，包括例如人抗-小鼠抗体（HAMA）形式的免疫原性。
“血管生成”在本文中用于包括血管维持和发育的所有方面。因而，血管生成包括：导致新生血管形成的新毛细血管形成，以及现有脉管系统和小血管的维持和控制。血管生成是一个复杂的过程，该过程包括一系列相继的步骤，包括内皮细胞介导的血管基膜和间质基质的降解、内皮细胞的迁移、内皮细胞的增殖和内皮细胞的毛细血管袢的形成。血管生成包括新血管的生长和/或发育（也称作新生血管形成）、小血管的膨胀、过度的或延长的血管生长和现有脉管系统的维持。已知内皮因子参与血管生成的调节，并被认为参与与血管生成的诱导有关的多种生化途径（Duff等人, FASEB J., 17:984-992(2003); Bernabeu等人, J. Cell. Biochem., 102(6):1375-1388(2007)）。
本文使用的术语“血管生成抑制性的”、“抑制血管生成的”或“抗血管生成的”包括血管发生的抑制，且意在表示影响新生血管形成的范围、量或速率的减小。实现内皮细胞增殖或组织迁移的范围、量或速率的减小，是抑制血管生成的具体实例。
术语“血管生成抑制性的组合物”表示这样的组合物：其抑制血管生成介导的过程，诸如内皮细胞迁移、增殖、管形成，并随后导致从现有血管产生新血管的抑制，并从而影响血管生成依赖性的病症。
为了说明书和权利要求书的目的，术语“血管生成相关的疾病”在本文中用于表示人类的某些病理过程，其中血管生成异常地延长。这另外包括：血管生成病症和疾病，诸如与血管生成有关、由血管生成造成或伴随血管生成的那些疾病和病症。这样的疾病的非限制性实例包括：不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病（例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变）、糖尿病肾病、慢性炎性疾病（例如，IBD）、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症和转移。通过结合内皮因子和抑制血管生成，本文所述的抗体和其抗原结合片段可以用于治疗血管生成相关的疾病。
为了说明书和权利要求书的目的，术语“抗血管生成疗法”在本文中用于表示，靶向表达内皮因子（与静止的脉管系统相比，在增殖中的脉管系统上以更高的水平表达）的细胞和/或脉管系统的疗法；这另外包括：针对血管生成（即，导致新生血管形成的新毛细血管形成）的疗法，针对现有脉管系统和/或过度血管生成或血管生长的疗法，针对小血管膨胀的疗法，和针对疾病或病症的疗法（例如，血管靶向疗法）。在本发明内预见到的示例性的疾病或病症包括、但不限于：不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病（例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变）、糖尿病肾病、慢性炎性疾病（例如，IBD）、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症、实体瘤和转移灶。
为了说明书和权利要求书的目的，“特征在于新生血管形成的眼病”在本文中用于表示，由眼的任意部分内的增加的血管生成造成或引起的任意眼病，所述部分包括：视网膜、角膜、瞳孔、虹膜、玻璃体液或房水。这样的疾病包括，例如，年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、非糖尿病视网膜病变、脉络膜新生血管形成（CNV）和视网膜下新生血管形成（SRN或SRNV）和眼的肿瘤。
B. 诊断用途
人源化的抗-内皮因子抗体和其片段可以用于体内和体外检测、诊断和/或监测目的。认为内皮因子会涉入在下面进一步描述的多种疾病和障碍。内皮因子有关的疾病和病症的治疗部分地取决于它们的诊断，本文所述的抗体和其抗原结合片段可用于诊断过量的内皮因子或用于诊断与内皮因子活性有关的疾病和病症。
本文提供了检测样品或受试者中的内皮因子水平的方法，所述方法包括：（i）使本文所述的抗体或其抗原结合片段接触所述样品或受试者，和（ii）检测所述抗体或其抗原结合片段和内皮因子的复合物。
本文提供了一种对血管生成或血管生成的依赖性的疾病或障碍成像或诊断的方法，所述方法包括：使本文所述的抗体或其抗原结合片段的组合物接触样品。所述样品可以是，例如，血液、血清、血浆、血小板、活组织检查液体、脊髓穿刺液体、脑膜和尿。成像或诊断方法可以在体外试验中进行。或者，当通过给患者施用组合物来进行接触时，在体内对血管生成或血管生成的依赖性的疾病或障碍进行成像或诊断。
在一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段另外包含可检测部分。检测可以在体外、在体内或离体地进行。使用抗体或其抗原结合片段来检测和/或测定（定量、定性等）内皮因子的体外试验包括、但不限于：例如，ELISA、RIA和蛋白印迹。可以如下进行内皮因子的体外检测、诊断或监测：从患者得到样品（例如，血液样品），并在例如标准的ELISA试验中测试样品。例如，可以给96-孔微孔滴定板包被本文所述的抗体或其抗原结合片段，洗涤，并用PBS-吐温/BSA包被，以抑制非特异性的结合。可以对血液样品进行系列稀释，并放入双份孔中，与内皮因子的系列稀释标准曲线相对比。在温育和洗涤孔以后，可以加入用生物素标记的抗-内皮因子抗体，随后加入抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶。可以洗涤孔，并加入底物（辣根过氧化物酶），以使平板显影。使用常规平板读数器和软件，可以读出平板。
当在体内进行检测时，通过使用任意常规方式（诸如本文别处描述的那些）施用抗体或其抗原结合片段，可以进行接触。在这样的方法中，样品或受试者中的内皮因子的检测，可以用于诊断与内皮因子活性有关或伴随的疾病或障碍，诸如在本文中描述的那些疾病和障碍。
在内皮因子的体内检测、诊断或监测中，给患者施用结合内皮因子的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段结合在可检测部分上。使用本领域公知的方法，可以使所述可检测部分显影，所述方法例如、但不限于：磁共振成像（MRI），荧光，放射成像，由内窥镜、腹腔镜或血管内的导管（即，通过光活性剂的检测）供给的光源，光扫描，正电子发射断层扫描术（PET）扫描，全体核磁共振（NMR），放射闪烁显像，单光子发射计算机体层摄影术（SPECT），靶向近红外区（NIR）扫描，X-射线，超声，等，诸如描述在例如下述文献中：美国专利号6,096,289、美国专利号7,115,716、美国专利号7,112,412、美国专利申请号20030003048和美国专利申请号20060147379，它们各自通过引用整体并入本文。使用这样的方法来检测化合物的标记也是本领域已知的，且描述在这样的专利和申请中，并通过引用并入本文。可检测部分的显影，可以用于检测、诊断和/或监测与内皮因子和/或血管生成有关的病症或疾病。
使用对希望的靶蛋白（即，内皮因子）特异性的抗体的其它诊断试验是本领域已知的，且在本文中也预见到。
为这些方法所考虑到的非限制性病症、疾病和障碍包括、但不限于与血管生成有关的那些，例如，不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病（例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变）、糖尿病肾病、慢性炎性疾病（例如，IBD）、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症（原发性肿瘤和转移灶）。在这样的疾病的检测、诊断或监测中，给受试患者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段的组合物，所述抗体或其抗原结合片段缀合在可检测部分上。使用本领域公知的方法，诸如上述的那些，可以使所述部分显影。可检测部分的显影，可以用于检测、诊断和/或监测这样的病症和疾病。
对于体外检测方法，要从患者得到的样品包括、但不限于：血液、组织活组织检查样品和来自它们的液体。
因而，本发明提供了针对内皮因子的人源化抗体和其抗原结合片段，它们可用于检测或诊断与疾病或障碍有关的内皮因子水平，潜在地指示对治疗性处理的需要。在某些实施方案中，所述抗体包含本文所述的人源化的抗-内皮因子抗体。在其它实施方案中，所述抗体另外包含第二种试剂。这样的试剂可以是分子或部分，例如，报道分子或可检测标记。用于这样的检测方法的可检测的标记/部分是本领域已知的，并在下面更详细地描述。报道分子是使用试验可以检测到的任意部分。已经缀合到多肽上的报道分子的非限制性实例包括：酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、发磷光的分子、化学发光的分子、生色团、发光的分子、光亲和性分子、有色的颗粒或配体，诸如生物素。可检测的标记包括，由于它们的特殊的功能性质和/或化学特征而可以检测到的化合物和/或元素，它们的使用允许检测到与之相连的多肽和/或在需要时进一步量化。许多适当的可检测的（成像）试剂是本领域已知的，它们与多肽的连接方法也是本领域已知的（参见，例如，美国专利号5,021,236、4,938,948和4,472,509，它们各自通过引用并入本文）。
连接多肽（诸如抗体）与可检测部分的方法是本领域已知的，包括，例如，重组DNA技术（以形成融合蛋白）和缀合（例如，化学缀合）。通过化学缀合或重组工程来制备融合蛋白的方法，是本领域众所周知的。共价地和非共价地连接组分的方法，也是本领域已知的。参见，例如，Williams（1995）Biochemistry 34:1787 1797; Dobeli（1998）Protein Expr. Purif. 12:404-414；和Kroll（1993）DNA Cell. Biol. 12: 441-453。
在某些情况下，可能必须在标记或部分和本文所述的抗体、抗原结合片段或结合蛋白的一个或多个部分之间导入未结构化的多肽连接物区域。连接物可以促进增强的柔性和/或减少任意2个片段之间的位阻。连接物也可以促进每个片段的适当折叠的发生。连接物可以具有天然来源，诸如测得存在于蛋白的2个结构域之间的不规则螺旋中的序列。一种连接物序列是在RNA聚合酶亚基的C-端和N-端结构域之间发现的连接物。天然存在的连接物的其它实例包括：在1CI和LexA蛋白中发现的连接物。
在连接物内，氨基酸序列可以随连接物的特征而变化，所述特征以经验为主地测定，或通过建模来揭示。在选择连接物时的考虑因素包括：连接物的柔性、连接物的电荷和连接物的某些氨基酸在天然存在的亚基中的存在。也可以设计连接物，使得在连接物中的残基接触脱氧核糖核酸（DNA），由此影响结合亲和力或特异性，或与其它蛋白相互作用。在某些情况下，例如，当必须跨亚基之间的更长距离时，或当结构域必须保持特定构型时，所述连接物可以任选地含有额外的折叠的结构域。在有些实施方案中，连接物的设计可以包括结构域的排列，这需要连接物跨相对较短的距离，例如，小于约10埃（Å）。但是，在某些实施方案中，连接物跨多达约50埃的距离。
在连接物内，氨基酸序列可以随连接物的特征而变化，所述特征以经验为主地测定，或通过建模来揭示。在选择连接物时的考虑因素包括：连接物的柔性、连接物的电荷和连接物的某些氨基酸在天然存在的亚基中的存在。也可以设计连接物，使得在连接物中的残基接触DNA，由此影响结合亲和力或特异性，或与其它蛋白相互作用。在某些情况下，当必须跨亚基之间的更长距离时，或当结构域必须保持特定构型时，所述连接物可以任选地含有额外的折叠的结构域。
用于将多肽（游离的或细胞结合的）偶联至珠子上的方法是本领域已知的。用于选择偶联的多肽或展示多肽的细胞的方法也是本领域已知的。简而言之，顺磁的聚苯乙烯微粒是可商业得到的（Spherotech, Inc., Libertyville, IL; Invitrogen, Carlsbad, CA），其将肽偶联至微粒表面上，所述微粒表面已经用官能团修饰或用不同的抗体或配体（例如，抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或生物素）包被。
微粒的顺磁性质允许使用磁体将它们从溶液中分离出。当从磁体取下时，可以容易地重新悬浮微粒。可以在试管中将多肽偶连至用聚氨酯层包被的顺磁的聚苯乙烯微粒上。通过与对甲苯磺酰氯反应，活化微粒表面上的羟基（Nilsson K和Mosbach K. “p-Toluenesulfonyl chloride as an activating agent of agarose for the preparation of immobilized affinity ligands and proteins.”Eur. J. Biochem. 1980:112: 397-402）。或者，可以用碳二亚胺活化含有表面羧酸的顺磁的聚苯乙烯微粒，随后偶联至多肽上，在多肽的伯氨基和微粒表面上的羧酸基团之间产生稳定的酰胺键（Nakajima N和Ikade Y, Mechanism of amide formation by carbodiimide for bioconjugation in aqueous media, Bioconjugate Chem. 1995, 6(1): 123-130; Gilles MA, Hudson AQ和Borders CL Jr, Stability of water-soluble carbodiimides in aqueous solution, Anal Biochem. 1990 Feb 1;184(2):244-248; Sehgal D和Vijay IK, a method for the high efficiency of water-soluble carbodiimide-mediated amidation, Anal Biochem. 1994 Apr;218(1):87-91; Szajani B等人, Effects of carbodiimide structure on the immobilization of enzymes, Appl Biochem Biotechnol. 1991 Aug; 30(2): 225-231）。另一种选择是，将生物素化的多肽偶联至顺磁的聚苯乙烯微粒上，所述微粒的表面已经共价地连接抗生蛋白链菌素单层（Argarana CE, Kuntz ID, Birken S, Axel R, Cantor CR. Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene. Nucleic Acids Res. 1986;14(4):1871-82; Pahler A, Hendrickson WA, Gawinowicz Kolks MA, Aragana CE, Cantor CR. Characterization and crystallization of core streptavidin. J Biol Chem 1987:262(29):13933-13937）。
可以将多肽缀合到多种荧光染料、猝灭剂和半抗原诸如荧光素、R-藻红蛋白和生物素上。可以在多肽合成过程中或在已经合成并纯化多肽以后，进行缀合。生物素是一种小（244千道尔顿）维生素，其以高亲和力结合抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素蛋白，且可以被缀合到大多数肽上，而不改变它们的生物活性。使用固定化的抗生蛋白链菌素和抗生物素蛋白亲和凝胶，可以从未标记的多肽中容易地纯化出生物素-标记的多肽，抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白-缀合的探针可以用于检测生物素化的多肽，例如，在ELISA、斑点印迹或蛋白印迹用途中。生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯是生物素化试剂的最常用类型。N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素在生理缓冲液中有效地与伯氨基反应，以形成稳定的酰胺键。多肽具有在N-端处的伯胺，且也可以具有在赖氨酸残基侧链中的几个伯胺，它们可用作用N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素试剂进行标记的靶标。可得到生物素的几种不同的N-羟基琥珀酰亚胺酯，它们具有不同的性质和间隔臂长度（Pierce, Rockford, IL）。磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯试剂是水溶性的，使得反应能够在没有有机溶剂存在下进行。
使用本领域公知的技术（Green, NM, (1975)“Avidin. In Advances in Protein Chemistry.”Academic Press, New York. 29, 85-133; Green, NM, (1971)“The use of bifunctional biotinyl compounds to determine the arrangement of subunits in avidin.”Biochem J. 125, 781-791; Green, NM., (1965)“A spectrophotometric assay for avidin and biotin based on binding of dyes by avidin.”Biochem. J. 94: 23c-24c），使用2-(4’-羟基偶氮苯-2-羧酸)试验，可以估测生物素与多肽的摩尔至摩尔比。可以将几种生物素分子缀合到多肽上，和每个生物素分子可以结合一个抗生物素蛋白分子。生物素-抗生物素蛋白键形成在有机溶剂、极端pH和变性剂中是非常快速的且稳定的。为了量化生物素化，将含有生物素化的多肽的溶液加入2-(4’-羟基偶氮苯-2-羧酸)和抗生物素蛋白的混合物中。因为生物素对抗生物素蛋白具有更高的亲和力，它会替换2-(4’-羟基偶氮苯-2-羧酸)，在500纳米的吸光度成比例地降低。通过测量2-(4’-羟基偶氮苯-2-羧酸)-抗生物素蛋白溶液在加入含有生物素的肽之前和之后的吸光度，可以在单个比色皿中定量在溶液中的生物素的量。通过2-(4’-羟基偶氮苯-2-羧酸)-抗生物素蛋白复合物的消光系数，吸光度的变化与样品中的生物素的量相关联。
或者，可以用荧光部分缀合抗体、抗原结合片段或结合蛋白。使用本领域公知的技术，可以给多肽缀合荧光部分（例如，R-藻红蛋白、异硫氰酸荧光素（FITC）等），所述技术描述在：例如，Glazer, AN和Stryer L. (1984). Trends Biochem. Sci. 9:423-7; Kronick, MN and Grossman, PD (1983) Clin. Chem. 29:1582-6; Lanier, LL和Loken, MR (1984) J. Immunol., 132:151-156; Parks, DR等人(1984) Cytometry 5:159-68; Hardy, RR等人(1983) Nature 306:270-2; Hardy RR等人(1984) J. Exp. Med. 159:1169-88; Kronick, MN (1986) J. Immuno. Meth. 92:1-13; Der-Balian G, Kameda, N和Rowley, G. (1988) Anal. Biochem. 173:59-63。
在一个非限制性实施方案中，可以使抗体或抗原结合片段结合（缀合）用于内皮因子的免疫检测的可检测标记，诸如放射性核素、铁有关的化合物、染料、成像剂或荧光剂，它们可以用于在体外和/或在体内观察抗体与内皮因子的结合。
放射性标记的非限制性实例包括，例如，32P、33P、43K、52Fe、57Co、64Cu、67Ga、67Cu、68Ga、71Ge、75Br、76Br、77Br、77As、77Br、81Rb/81MKr、87MSr、90Y、97Ru、99Tc、100Pd、101Rh、103Pb、105Rh、109Pd、111Ag、111In、113In、119Sb、121Sn、123I、125I、127Cs、128Ba、129Cs、131I、131Cs、143Pr、153Sm、161Tb、166Ho、169Eu、177Lu、186Re、188Re、189Re、191Os、193Pt、194Ir、197Hg、199Au、203Pb、211At、212Pb、212Bi和213Bi。使用抗体成像领域已知的常规化学方法，可以使放射性标记结合到化合物上。放射性标记的化合物可用于体外诊断技术中和体内放射成像技术中和放射免疫疗法中。例如，在体内成像的实例中，可以使抗体和其抗原结合片段与除了放射性同位素以外的成像剂缀合，所述成像剂包括、但不限于磁共振图像增强剂，其中例如，通过螯合基团给抗体分子负载大量顺磁离子。螯合基团的实例包括：EDTA、卟啉、多胺冠醚和聚肟。顺磁离子的实例包括：钆、铁、锰、铼、铕、镧、钬和铽。这样的可检测部分也包括：金属；金属螯合剂；镧系元素；镧系元素螯合剂；放射性金属；放射性金属螯合剂；正电子发射核；微气泡（用于超声）；脂质体；在脂质体或纳米球中微型胶囊化的分子；单晶氧化铁纳米化合物；磁共振成像造影剂；吸光剂、反光剂和/或散光剂；胶态颗粒；荧光团，诸如近红外荧光团。在许多实施方案中，这样的第二官能团/部分是相对较大的，例如，大小为至少25原子质量单位，且在许多情况下，大小可以是至少50、100或250原子质量单位。在某些实施方案中，所述第二官能团是用于螯合金属的螯合物部分，例如，放射性金属或顺磁离子的螯合剂。在实施方案中，它是可用于放射疗法或成像操作的放射性核素的螯合剂。
也可以测试本发明的拮抗剂的调节组织中的血管生成的能力。可以使用本领域技术人员已知的的任意合适的试验来监测这样的效应。在本文中描述了几种这样的技术。
血管生成的一种测量方法是体内兔眼模型，且被称作兔眼试验。其它人已经详细描述了兔眼试验，并进一步已经用于测量在有血管生成抑制剂（诸如沙利度胺）存在下的血管生成和新生血管形成。参见D’Amato等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:4082-4085。
兔眼试验是体内血管生成的非常确定的试验模型，因为通过眼的天然地透明的角膜，可以容易地观察新生血管形成过程，该过程由兔血管从角膜边缘生长进角膜中来证实。另外，可以随时间容易地监测新生血管形成的刺激或抑制的程度和量或新生血管形成的消退。
最后，将兔暴露于任意实验试剂，因此兔的健康指示实验试剂的毒性。
血管生成的另一种试验测量方法是嵌合小鼠:人小鼠模型，并被称作嵌合小鼠试验。其它人已经详细描述了该试验，并进一步在本文中已经描述用于测量血管生成、新生血管形成和肿瘤组织的消退。参见Yan, 等人(1993) J. Clin. Invest. 91:986-996。
嵌合小鼠试验是体内血管生成的有用试验模型，因为移植的皮肤移植物在组织学上非常类似于正常的人皮肤，并且整个组织的新生血管形成正在发生中，其中实际的人血管正在从移植的人皮肤生长进在移植的人皮肤的表面上的人肿瘤组织中。通过用人-特异性的内皮细胞标志物对新脉管系统进行免疫组织化学染色，可以证实新生血管形成在人移植物中的起源。
嵌合小鼠试验会证实新生血管形成的消退，这基于新血管生长的消退的量和程度。此外，可以容易地监测对移植在移植的皮肤上的任意组织（诸如肿瘤组织）的生长的影响。最后，所述试验是有用的，因为在所述试验系统中存在毒性的内部对照。将嵌合小鼠暴露于任意实验试剂，因此小鼠的健康指示毒性。在本文所述的方法中，也可以使用本文描述的和本领域已知的其它动物模型。
C. 使用人源化的内皮因子抗体的治疗
本文提供了预防或治疗与血管生成/新生血管形成、过度血管生成或小血管膨胀有关的一种或多种疾病或障碍的方法，所述方法包括：施用组合物，所述组合物包含本文所述的人源化抗体或抗原结合片段，所述人源化抗体或抗原结合片段结合与所述疾病或障碍有关的内皮因子并防止血管生成，从而预防、治疗、改善或减轻疾病或它的严重性。
本文提供了预防或治疗与血管生成/新生血管形成有关的一种或多种疾病或障碍的方法，所述方法包括：施用组合物，所述组合物包含本文所述的人源化抗体或抗原结合片段，所述人源化抗体或抗原结合片段结合与所述疾病或障碍有关的内皮因子、减少血管生成或防止过度血管生成。
本文使用的“预防”表示预防、征状发作的阻止、与血管生成有关或与内皮因子活性相关的疾病或障碍的进展的预防。本文使用的“抑制”、“治疗”可互换地使用，并表示，例如，征状的停滞、存活期的延长、征状的部分或完全改善以及与血管生成有关的或与内皮因子活性相关的病症、疾病或障碍的部分或完全消除。
可以以治疗有效量将组合物施用给患者，所述治疗有效量会通过以适合任何医学治疗的合理的收益/风险比抑制疾病或障碍（诸如本文所述的与内皮因子有关的那些），有效地产生一些希望的治疗效果。为了将本发明的组合物施用给人患者，可以通过本领域普通技术人员已知的方法来配制组合物。治疗有效量是在器官或组织中至少部分地实现希望的治疗效果或预防效果的量。实现疾病或障碍的预防性和/或治疗性处理所需的人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段的量本身是不固定的。施用的人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段的量可以随疾病的类型、疾病的范围和遭受疾病或障碍的哺乳动物的大小而变化。在一个实施方案中，以上述的组合，将本文描述的两种或更多种人源化的抗-内皮因子抗体施用给患者。组合包括并行地或相继地施用所述抗体。
“施用”在本文中被定义为表示，以导致组合物在患者体内的方式，将组合物提供给患者。这样的施用可以通过任意途径，包括、但不限于：局部地、区域地、或全身地，通过皮下的、玻璃体内的、真皮内的、静脉内的、动脉内的、腹膜内的或肌肉内的施用（例如，注射）。“并行施用”是指，在彼此相距相对较短的时间段内施用；这样的时间段可以是小于2周、小于7天、小于1天，甚至可以同时施用。
可以改变组合物中活性成分的实际剂量水平，从而得到有效地实现特定患者、组合物和给药模式希望的治疗应答且对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种因素，包括采用的具体化合物的活性、给药途径、给药时间、采用的具体化合物的排泄速率、治疗持续时间、其它药物、与采用的特定组合物联合使用的化合物和/或物质、待治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和先前的医疗史以及医学领域众所周知的类似因素。本文所述的抗体和抗原结合片段可以以不同的给药量和在不同的时间范围内施用给患者。非限制性剂量包括约0.01 mg/kg、约0.05 mg/kg、约0.1 mg/kg、约0.5 mg/kg、约1 mg/kg、约5 mg/kg、约10 mg/kg、约20 mg/kg、约30 mg/kg、约40 mg/kg、约50 mg/kg、约60 mg/kg、约70 mg/kg、约80 mg/kg、约90 mg/kg、约100 mg/kg、约125 mg/kg、约150 mg/kg、约175 mg/kg、约200 mg/kg或它们之间的任何整数。另外，可以如下施用抗体或抗原结合片段的所述剂量：每周2次、每周1次、每2周1次、每3周1次、每4周1次、每6周1次、每8周1次、每12周1次或它们之间的任意周组合。也预见到给药循环，例如，每周1次或2次地施用抗体或其抗原结合片段，持续4周，继之以不治疗的2周。在本发明内也预见到额外的给药循环，包括例如：本文描述的剂量和每周循环的不同组合。
“接触”在本文中被定义为，使本文提供的组合物物理地接近本文所述的细胞、器官组织或流体的方式。接触包括本文提供的任意组合物的全身或局部施用，包括但不限于体外、体内和/或离体操作和方法。“组合”和“接触”在本文中可互换地使用，且意图以相同的方式进行定义。
当患者经历疾病的征象或征状的部分或完全减轻或减少（具体地，包括但不限于生存期的延长）时，实现应答。可以按月至年来测量预期的无进展存活时间，这取决于预后因素，包括复发的次数、疾病的阶段和其它因素。延长存活期包括但不限于至少1个月（mo）、约至少2个月、约至少3个月、约至少4个月、约至少6个月、约至少1年、约至少2年、约至少3年或更多的时间。也可以按月至年来测量总存活。患者的征状可以保持静止或可以减少。
具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定和指示需要的组合物的有效量（ED50）。例如，医师或兽医可以从低于实现希望的治疗效果所需要的水平的、在组合物中采用的化合物的剂量开始，并逐渐增加剂量，直到实现希望的效果。或者，剂量可以保持恒定。
通过任意方便的途径，诸如上述的途径，可以将组合物施用给患者。无论选择的给药途径，或通过本领域技术人员已知的其它常规方法，将本发明的化合物（其可以以合适的水合形式使用）和/或组合物配制成可接受的剂型，诸如下述的剂型。
使用本领域已知的方法，例如，化学缀合、共价键或非共价键或重组技术，可以使抗体与治疗部分或可检测的（成像）部分相结合，以产生缀合物或融合蛋白，诸如下面更详细地描述的那些。或者，可以在单独的组合物中组合抗体和/或其它试剂，用于同时或相继施用。
通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学规程，例如，用于测定LD50（50%群体的致死剂量）和ED50（50%群体的治疗有效剂量）的标准规程，可以测定这样的成分的毒性和治疗效果。毒性效果和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为LD50/ED50之比。尽管可以使用表现出毒性副作用的化合物，应当小心地设计将这样的化合物靶向受累组织的部位的递送系统，以便使对健康细胞的潜在损伤最小化，并从而减少副作用。
从细胞培养试验和动物研究得到的数据可以用于配制用于人类的剂量范围。这样的化合物的剂量优选地在几乎不具有毒性或不具有毒性的循环浓度范围（包括ED50）内。所述剂量可以在该范围内随采用的剂型和使用的给药途径而变化。对于在本发明的方法中使用的任意化合物，可以从细胞培养试验初步估测治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量，以实现包括在细胞培养物中测定的IC50（即，实现半数最大抑制的实验化合物的浓度）的循环血浆浓度范围。可以测量在血浆中的水平，例如，通过高效液相色谱法。这样的信息可以用于更准确地测定在人类中有用的剂量。
在许多模型（包括内皮细胞培养物和敲除的敲除的小鼠模型）中，已经确立了内皮因子的促血管生成作用。众所周知内皮和有关的细胞会表达内皮因子（CD105），并且还已经在众多研究、培养物模型和动物模型中证实了内皮因子在血管生成（通常，以及心脏发育）中的作用（Duff等人, FASEB J., 17:984-992(2003); Bernabeu等人, J. Cell. Biochem., 102(6): 1375-1388(2007)；美国专利号7,097,836）。
因而，抑制患病组织中的血管生成的方法会改善疾病的征状，并且，取决于所述疾病，可以促进疾病的痊愈。在一个实施方案中，本发明预见到抑制组织中的血管生成。通过多种方法，诸如本文所述的方法，可以评价组织中的血管生成的程度，并从而评价通过本发明的方法实现的抑制程度。
识别（例如，优先结合）内皮因子上的表位和抑制血管生成的抗体的独特特异性，会为特征在于血管生成（新生血管形成）、小血管膨胀和/或过度血管生成（诸如本文所述的那些）的疾病提供诊断和治疗应用。可以将人源化的抗-内皮因子抗体和其片段施用给受试者诸如哺乳动物（例如，人），所述受试者遭受医学障碍，例如，不同形式的特征在于血管生成/ 新生血管形成的眼疾病（例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变）、糖尿病肾病、慢性炎性疾病（例如，IBD）、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症（原发性肿瘤和转移灶）。本文提供了一种治疗受试者的方法，所述受试者具有特征在于血管生成的眼病，其中施用本文所述的人源化抗体或其片段，它会结合内皮因子并抑制血管生成。本文也提供了一种治疗具有慢性炎性疾病的受试者的方法，其中施用本文所述的人源化抗体或其片段，它会结合内皮因子并抑制血管生成。这样的慢性炎性疾病的实例包括、但不限于：克罗恩病和溃疡性结肠炎。本文另外提供了一种治疗具有糖尿病肾病的受试者的方法，其中施用本文所述的人源化抗体或其片段。本文另外提供了一种治疗具有类风湿性关节炎或骨关节炎的受试者的方法，其中施用本文所述的人源化抗体或其片段。
应当理解，所述抗-内皮因子抗体可以有效地治疗血管生成，在本文中预见到，也可以用一种或多种额外的血管生成抑制剂治疗受试者。
为了说明书和权利要求书的目的，术语“血管生成抑制剂”在本文中用于表示起抑制血管生成的功能的化合物或分子，包括、但不限于：肽、蛋白、酶、多糖、寡核苷酸、DNA、RNA、重组载体和药物。血管生成抑制剂是本领域已知的，在本文中预见到所有类型。化合物和分子的非限制性实例包括：天然的和合成的生物分子，诸如紫杉醇、O-（氯乙酰基-氨基甲酰基）烟霉醇（“TNP-470”或“AGM 1470”）、凝血酶敏感蛋白-1、凝血酶敏感蛋白-2、血管生成抑制因子、人软骨细胞-衍生的血管生成抑制剂（“hCHIAMP”）、软骨-衍生的血管生成抑制剂、血小板因子-4、gro-β、人干扰素诱导蛋白10（“IP10”）、白介素12、Ro 318220、三环癸-9-基黄原酸酯（“D609”）、伊索拉定、8,9-二羟基-7-甲基-苯并[b]喹嗪
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溴化物（“GPA 1734”）、甲羟孕酮、肝素和可的松的组合、葡糖苷酶抑制剂、染料木黄酮、沙利度胺、二氨基-蒽醌、除莠霉素、熊果酸和齐墩果酸。抗体的非限制性实例包括针对诸如VEGF、VEGF受体或内皮因子的不同表位等分子的那些。另外，VEGF受体的小分子抑制剂是已知的，且在本文中预见到。VEGF受体抑制剂的非限制性实例包括贝伐单抗（阿伐他汀®）、ranibizumab（Lucentis）、aflibercept（VEGF-Trap）、舒尼替尼（Sutent）、索拉非尼（Nexavar）、axitinib、培加尼布和pazopanib。
本文所述的抗体和抗原结合片段可以与VEGF受体抑制剂联合地施用，用于本文所述的任一种血管生成有关的病症或疾病的联合治疗。在一个非限制性实施方案中，所述VEGF受体抑制剂是贝伐单抗。贝伐单抗的示例性的剂量是约7.5、约10或约15 mg/kg，每2或3周施用。
在一个非限制性实施方案中，所述VEGF受体抑制剂是ranibizumab。ranibizumab的示例性的眼剂量包括每个月玻璃体内地施用的约0.5 mg。在一个非限制性实施方案中，所述VEGF受体抑制剂是aflibercept（VEGF-Trap）。VEGF-Trap的示例性的剂量包括每2或3周施用的约0.5至约10 mg/kg。VEGF-Trap的示例性的眼剂量包括每个月或每季度玻璃体内地施用的约0.5至约2.0 mg。
在另一个非限制性实施方案中，所述VEGF受体抑制剂是舒尼替尼。舒尼替尼的示例性的方案包括：施用约50 mg 4周，继之以不施用药物的2周。可以循环地或非循环地重复治疗方案。
在另一个非限制性实施方案中，所述VEGF受体抑制剂是索拉非尼。索拉非尼的示例性的剂量包括每天施用的约400 mg。
在另一个非限制性实施方案中，所述VEGF受体抑制剂是axitinib。Axitinib的示例性的剂量包括每天施用2次的约3、约5或约10 mg。
在另一个非限制性实施方案中，所述VEGF受体抑制剂是培加尼布。培加尼布的示例性的剂量包括每6周玻璃体内地施用的约0.3- 约3 mg。
在另一个非限制性实施方案中，所述VEGF受体抑制剂是pazopanib。Pazopanib的示例性的剂量包括每天施用的约200至约1000 mg。
这些VEGF受体抑制剂的多种组合可以与本文所述的抗体和抗原结合片段一起施用。在一个实施方案中，组合可以导致更低剂量的本文所述的抗体或抗原结合片段、VEGF受体抑制剂或二者的应用。这样的剂量改变可以源自本文所述的抗体和抗原结合片段与VEGF受体抑制剂的组合的协同效应。
涉及血管生成的眼病
黄斑变性病和糖尿病视网膜病变
在一个方面，本发明提供了一种治疗患者的糖尿病视网膜病变、黄斑变性、脉络膜新血管生成或新生血管性青光眼的方法，其中给患者施用治疗有效量的本文提供的任一种组合物。
内皮因子是一种与血管生成和胞外基质有关的受体。黄斑变性（AMD）是在负责高清晰度视觉的中央视网膜（称作黄斑）的一部分中的光感受器的丧失。黄斑变性与胞外基质组分和其它碎片在视网膜色素上皮和血管脉络膜指检的膜中的异常沉积有关。该碎片-样物质被称作玻璃疣。通过眼底镜眼检查，观察到玻璃疣。正常的眼可能具有没有玻璃疣的黄斑，而玻璃疣可能大量存在于视网膜周围。在没有任何黄斑视觉损失的情况下，软玻璃疣在黄斑中的存在，被视作早期的AMD。黄斑变性的特征在于脉络膜新血管生成（CNV），即在视网膜的视网膜色素上皮（RPE）层的下面形成异常血管。这些血管突破布鲁赫膜，破坏视网膜色素上皮，出血，并最终造成黄斑瘢痕形成，后者导致深度的中心视觉丧失（盘状瘢痕形成）。
除了其它眼障碍以外，脉络膜新血管生成（CNV）常见于黄斑变性中，且与脉络膜内皮细胞的增殖、胞外基质的过量生产和纤维血管视网膜下膜的形成有关。视网膜色素上皮细胞增殖和血管生成因子的生产似乎会影响脉络膜新血管生成。
糖尿病视网膜病变（DR）是在糖尿病中形成的特征在于过度血管生成的眼病，其原因是毛细血管基底膜增厚和缺少毛细血管的周细胞与内皮细胞之间的接触。周细胞的丧失会增加毛细血管的渗漏，并导致血液-视网膜屏障的破坏。糖尿病视网膜病变是微血管视网膜变化的结果。高血糖症诱导的周细胞死亡和基膜的增厚，会导致血管壁的机能不全。这些破坏会改变血液-视网膜屏障的形成，并也使视网膜血管变得渗透性更高。小血管（诸如眼中的那些）特别易受差的血糖（血液葡萄糖）控制的伤害。葡萄糖和/或果糖的过度积累会破坏视网膜中的微小血管。当受损的血管渗漏液体和脂质到黄斑上时，也可以形成黄斑水肿。这些液体使得黄斑肿胀，后者使视力模糊。该破坏也导致在视网膜处缺氧。
随着疾病进展，在视网膜中的缺氧会刺激沿着视网膜和在澄清的凝胶样玻璃体液（其填充在眼内）中的血管生成。如果不及时治疗，这些新血管可以出血，使视力模糊，并破坏视网膜。纤维血管增殖也可以造成牵引性视网膜脱离。新血管还可以生长进眼前房的角落中，并造成新生血管性青光眼。
增生性玻璃体视网膜病变与在玻璃体膜内以及在视网膜的表面上的细胞膜和纤维变性膜的细胞增殖有关。视网膜色素上皮细胞增殖和迁移常见于该眼病。与增生性玻璃体视网膜病变有关的膜含有胞外基质组分诸如胶原I、II和IV型和纤连蛋白，并逐渐变得纤维化。
在发达国家中，年龄相关性黄斑变性（AMD）和糖尿病视网膜病变是失明的2个主要原因。已经证实，最近批准的大分子LUCENTIS®、阿伐他汀®和MACUGEN®是AMD患者可利用的治疗选择。LUCENTIS®是一种Fab，阿伐他汀®是一种单克隆抗体。它们二者都结合血管内皮生长因子（VEGF），且迄今为止已经表现出最令人惊叹的治疗AMD的结果；但是，仅少数治疗的患者经历视敏度的明显改善。聚焦于除了VEGF以外的靶标上的抗血管生成疗法，可以克服与靶向VEGF途径的试剂有关的一些限制。
本文所述的结合内皮因子的人源化抗体和抗原结合片段可以用于治疗或预防黄斑变性、CNV、糖尿病视网膜病变或增生性玻璃体视网膜病变。本文描述了通过施用本文所述的抗体和抗原结合片段来治疗或预防黄斑变性、CNV、糖尿病视网膜病变或增生性玻璃体视网膜病变的方法。本文所述的结合内皮因子的人源化抗体和抗原结合片段也可以收缩血管、抑制与眼病有关的内皮细胞增殖、清除出血的征状、治疗视力模糊、提供视力损失的停滞和/或防止血管的渗漏。本文所述的人源化抗体和抗原结合片段也可以用于药物中，所述药物用于治疗黄斑变性、CNV、糖尿病视网膜病变或增生性玻璃体视网膜病变。
另外，本文所述的人源化抗体和抗原结合片段也可以与已知的用于治疗黄斑变性、CNV、糖尿病视网膜病变或增生性玻璃体视网膜病变的疗法和/或化合物联合使用。这样的化合物的实例包括、但不限于：贝伐单抗（阿伐他汀®）、ranibizumab（LUCENTIS®）、aflibercept（VEGF-Trap）、舒尼替尼（SUTENT®）、索拉非尼（NEXAVAR®）、axitinib、培加尼布、pazopanib或MACUGEN®。除了本文所述的给药模式以外，可以通过玻璃体内途径施用所述人源化的抗-内皮因子抗体和抗原结合片段。玻璃体内给药模式的非限制性实例包括玻璃体内注射和玻璃体内植入物的使用。
可以评估患者的改善和对治疗的应答性。治疗包括、但不限于：减轻黄斑水肿、CNV面积的减小和视敏度的增加。征状的测量是本领域已知的，且在下面的实施例中进一步描述。
慢性炎性疾病
多种组织或包含机化组织的器官中的任一种可以在疾病状态下支持血管生成，包括皮肤、肌肉、肠、结缔组织、关节、骨等组织，血管可以在血管生成刺激以后侵入所述组织。因而，在一个实施方案中，待治疗的组织是发炎的组织，要抑制的血管生成是发炎的组织血管生成，其中存在发炎的组织的新生血管形成。
炎性肠病
血管生成在炎性肠病（IBD）中起重要作用。IBD是一组肠疾病或病症（包括克罗恩病和溃疡性结肠炎）的概括术语。克罗恩病通常特征在于小肠和大肠的炎症，而溃疡性结肠炎通常局限在结肠。异常的或病理性的血管生成是克罗恩病和溃疡性结肠炎的中心。两种疾病都涉及增加的微血管密度和微血管功能障碍，该血管生成与在两种疾病中发现的组织病理学和炎性循环短暂相关。已知内皮因子在这些组织中表达，且在IBD过程中在血管生成失调中起作用（Chidlow等人, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 293:5-18（2007））。
本文所述的结合内皮因子的人源化抗体和抗原结合片段可以用于治疗IBD。另外，结合内皮因子的人源化抗体和抗原结合片段可以用于治疗克罗恩病或溃疡性结肠炎。所述人源化的抗-内皮因子抗体和抗原结合片段也可以与外科手术和/或已知的IBD、克罗恩病或溃疡性结肠炎疗法联合使用。这样的已知疗法的实例包括、但不限于：氨基水杨酸盐（例如，氨水杨酸）、皮质类固醇（例如，布地奈德、泼尼松等）、抗生素（例如，甲硝唑等）、免疫抑制药（例如，硫唑嘌呤、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、他克莫司和环孢菌素等）和生物药诸如蛋白和抗体（例如，英夫利昔单抗等）。
通过发炎组织的血管生成的减少，可以评估IBD的治疗。通过表征IBD的溃疡性病损的停滞、消退和/或治愈，也可以评估治疗。
糖尿病肾病和肾移植缺血
糖尿病肾病是1型和2型糖尿病的发病和死亡的一种主要原因。它是全世界末期肾病的主要原因。糖尿病肾病的特征在于，由增加的促血管生成因子合成导致的肾小球微血管损伤。这些促血管生成因子会造成增加的内皮细胞增殖和随后的血管生成，且已知内皮因子在慢性肾病中被增量调节。该血管生成导致肾小球的破坏，并最终导致肾衰竭（Zent等人, Seminars in Nephrology, 27(2): 161-171(2007); Roy-Chaudhury等人, Exp. Nephrol., 5:55-60(1997)）。
在肾移植中观察到类似的效应，其导致移植的器官的缺血和衰竭。内皮因子的增量调节在肾中导致增量调节的血管生成和炎症。相反，使用没有内皮因子的小鼠的研究证实了在移植/缺血以后显著减少的肾损伤和增加的器官存活期（Docherty等人, Nephol. Dial. Transplant., 21:2106-2119(2006)）。
本文所述的结合内皮因子的人源化抗体和抗原结合片段可以用于治疗或预防糖尿病肾病、移植以后的肾衰竭和/或移植以后的缺血性肾损伤。
本文描述了通过施用本文所述的抗体和抗原结合片段来治疗或预防糖尿病肾病、移植以后的肾衰竭和/或移植以后的缺血性肾损伤的方法。本文所述的人源化抗体和抗原结合片段也可以用于药物中，所述药物用于治疗糖尿病肾病、移植以后的肾衰竭和/或移植以后的缺血性肾损伤。另外，本文所述的人源化抗体和抗原结合片段也可以与已知的用于治疗糖尿病肾病、移植以后的肾衰竭和/或移植以后的缺血性肾损伤的疗法和/或化合物联合使用。
通过例如肾功能的改善，可以在治疗效能方面评估患者。
类风湿性关节炎和骨关节炎
类风湿性关节炎的特征在于过度血管生成，在这点上得到良好理解。在滑液中发现的炎症和破坏与在周围组织和滑液组织中发现的增加的血管生成直接相关。许多促血管生成因子存在于类风湿性关节炎患者的受累组织中（Koch和Distler, Arthritis Res. & Ther., 9(增刊2): S3, 1-9（2007）。
骨关节炎是一组影响滑膜关节的慢性致残性疾病。血管生成和炎症是该疾病的病理生理学的完整过程，它们会通过多种机理促进关节损伤，所述机理包括但不限于：MMP生产的刺激和软骨内成骨。另外，骨关节炎中的血管生成会进一步诱发神经支配，其形成反馈环，其中每个反馈环继续刺激其它反馈环（Bonnet & Walsh, Rheumatology, 44:7-16（2005））。
本文所述的结合内皮因子的人源化抗体和抗原结合片段可以用于治疗或预防类风湿性关节炎和骨关节炎。本文描述了通过施用本文所述的抗体和抗原结合片段来治疗或预防类风湿性关节炎和骨关节炎的方法。本文所述的人源化抗体和抗原结合片段也可以用于药物中，所述药物用于治疗类风湿性关节炎和骨关节炎。
2种普遍接受的RA在试验中的改善的混合度量是：Paulus标准和美国风湿病学会（American College of Rheumatology）标准（ACR）。Paulus标准被定义为下述4种的改善：触痛的和肿大的关节计数、晨僵、疾病活性的患者评估、疾病活性和红细胞沉降率（ESR）的医师评估。将改善的水平设定为这些变量中的每一个的改善百分比，即Paulus 20分类指示这样的应答者：其已经表现出6个参数中的4个的20%改善。
使用美国风湿病学会（ACR）评分，也可以评估类风湿性关节炎。简而言之，通过下述因素中的5项或更多项在至少2个连续月中的存在，评估用于测定类风湿性关节炎的临床减轻的ACR分类标准：
a. 晨僵< 15分钟；
b. 没有疲劳；
c. 没有关节痛；
d. 没有关节触痛或活动性痛；
e. 没有关节或腱鞘的软组织肿胀；和
f. ESR（韦斯特格伦法）< 30 mm/小时（对于女性）或20 mm/小时（对于男性）。
排除可能发生，包括：活动性脉管炎、心包炎、肋膜炎或肌炎的临床表现，无法解释的近期体重减轻或可归因于类风湿性关节炎的发热会阻止完全临床减轻的指示（Pinals RS, 等人: Arthritis Rheum 24:1308, 1981）。另外，在类风湿性关节炎中的功能状态的ACR分类标准包括基于下述患者能力的分类：
I类：完全能够进行日常生活的惯常活动（自我护理、职业的和业余的）；
II类：能够进行惯常的自我护理和职业活动，但是在业余活动中受限；
III类：能够进行惯常的自我护理活动，但是在职业活动和业余活动中受限；和
IV类：有限的进行惯常自我护理、职业活动和业余活动的能力。
使用ACR评分，也可以评估骨关节炎。使用患者病史、体格检查和实验检查所见，评估髋的骨关节炎的ACR临床分类标准：评估患者的髋痛和下述项目之一：
（1） 小于15度的内髋旋转，和小于或等于45度mm/小时的ESR，或在ESR不可用的情况下，小于或等于115度的髋俯屈；或
（2） 小于15度的内髋旋转，与内髋有关的疼痛，小于或等于60分钟的髋晨僵，且患者超过50岁。
使用病史、体格检查、实验检查所见和放射摄影所见，传统形式是髋痛和下述指征中的2种：ESR小于20 mm/小时，放射摄影股骨和/或髋臼骨赘，或放射摄影关节间隙变窄（上部、轴向和/或中间）。分类树如下：髋痛膝痛结合下述2项：（1）放射摄影股骨和/或髋臼骨赘，或（2）ESR小于或等于20 mm/小时，且放射摄影轴向关节间隙变窄（Altman, R, 等人: Arthritis Rheum 34:505, 1991）。
膝骨关节炎的 ACR 临床分类标准
使用病史和体格检查，使用下述标准，评估膝骨关节炎的ACR临床分类标准：膝痛结合下述中的3项：
（1） 患者超过50岁；
（2） 晨僵小于30分钟；
（3） 主动运动时的摩擦音；
（4） 骨触痛；
（5） 骨膨大；和
（6） 没有可触及的滑膜温。
使用患者病史、体格检查和放射摄影所见，结合下述患者特征之一，可以评估膝痛：（1）患者超过50岁；（2）晨僵小于30分钟；和（3）主动运动时的摩擦音和骨赘。使用病史、体格检查和实验检查所见，结合下述患者特征中的5项，可以评估膝痛：
（1） 患者超过50岁；
（2） 晨僵小于30分钟；
（3） 主动运动时的摩擦音；
（4） 骨触痛；
（5） 骨膨大；
（6） 没有可触及的滑膜温；
（7） ESF小于40 mm/小时；
（8） 类风湿因子（RF）小于1:40；和
（9） 骨关节炎的滑液（SF）征象。
参见，例如，Altman, R, 等人: Arthritis Rheum 29:1039, 1986。
可以如下评估手的骨关节炎的ACR临床分类标准：手的疼痛、酸痛或僵硬，结合下述项目中的3项：（1）下述关节（双手的第二和第三远侧指间关节、第二和第三近侧指间关节和第一腕掌关节）中的2个或更多个的硬组织增大；（2）2个或更多个远侧指间关节的硬组织增大；（3）小于3个肿大的MCP关节；和（4）上面在（1）中列出的关节中的至少一个的畸形。
癌症
CD105与肿瘤血管生成有关，且与正常组织中的内皮相比，在不同肿瘤组织的内皮中被强烈地增量调节。CD105在广范围的肿瘤内皮（包括、例如，结肠癌、乳腺癌、脑癌、肺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肾癌、肝癌、胃癌、头颈癌和宫颈癌）中被增量调节。另外，已知与对应的正常组织相比，在肿瘤内皮中存在更强的CD105表达（Duff等人, FASEB J., 17:984-992(2003); Bernabeu等人, J. Cell. Biochem., 102(6): 1375-1388(2007)；美国专利号7,097,836）。因而，用抗-内皮因子人源化抗体抑制血管生成，代表癌性肿瘤的一种治疗选择。本文所述的结合内皮因子的人源化抗体和抗原结合片段可以用于治疗癌性肿瘤。本文所述的人源化抗体和抗原结合片段也可以用于药物中，所述药物用于治疗癌性肿瘤。
术语“肿瘤”在本文中用于表示表达内皮因子的癌性组织（与相同类型的正常组织的表达相比）。肿瘤可以包括实体瘤和半实体瘤。肿瘤的非限制性实例包括：人白血病，包括非T细胞型（非-T）急性成淋巴细胞性白血病（ALL）、粒单核细胞白血病；和人实体瘤和半实体瘤，它的周围脉管系统表达中等至高水平的内皮因子（与相同类型的正常组织的表达相比），包括血管肉瘤、乳癌、胃癌、结肠癌、霍杰金淋巴瘤、淋巴瘤、多形性胶质母细胞瘤（GBM）、肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、腮腺肿瘤、咽癌、前列腺癌、肝细胞癌、肾癌和直肠乙状结肠癌。
待治疗的癌性组织是，例如，表达异常水平的内皮因子的内皮组织。
在没有肿瘤组织的新生血管形成的情况下，肿瘤组织不会获得需要的营养物，生长减慢，停止额外的生长，退化，并最终变得坏死，导致肿瘤的杀死。本发明提供了抑制肿瘤新生血管形成的方法，其中根据本发明的方法抑制肿瘤血管生成。类似地，本文提供了抑制肿瘤生长的方法，其中实施抑制血管生成的方法。
所述方法对转移灶的形成也是特别有效的，因为它们的形成需要原发性肿瘤的血管生成，所以转移性癌细胞可以离开原发性肿瘤，且它们在第二部位的建立需要新生血管形成来支持转移灶的生长。
应当明白，本发明的“遭受癌症/转移的患者”可以表达突变蛋白（肿瘤相关抗原）或突变基因，且仍然没有疾病的症状。在癌症是结肠癌（它与突变型K-ras蛋白有关）的一个非限制性实施例中，在有些结肠细胞中具有突变型K-ras蛋白的患者是根据本发明的患者，尽管该患者可能仍然没有结肠癌的症状。“疾病的征象或征状”是疾病的临床上识别的表现或指征。
“治疗”遭受癌症的患者是指，在根据本发明的治疗以后，患者的征状部分减轻、完全减轻或保持静止。已经治疗的患者可以表现出征状和/或肿瘤负荷的部分或完全减轻。这意图包括预防、治疗和治愈。在一个非限制性实施例中，治疗遭受高度转移性癌症（例如，乳腺癌）的患者，其中额外的转移没有发生，或与没有接受治疗的患者相比，转移的次数减少。在另一个非限制性实施例中，治疗患者，其中患者的实体癌的大小减小，或与与没有接受治疗的患者相比，实体癌的大小没有增加。在另一个非限制性实施例中，与没有接受治疗的患者的癌细胞的数目相比，治疗的患者中的癌细胞的数目没有增加或减少。也可以将改善定义为，例如，细胞增殖的减少、细胞数目的减少、细胞凋亡的增加和/或受治疗的患者的存活期的增加。
如本文另外使用的，癌症的治疗包括癌性生长或肿瘤的停滞、部分或完全消除。治疗或部分消除包括，例如，生长或肿瘤大小和/或体积的下述倍数减小：诸如约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍或之间的任意倍数减小。类似地，治疗或部分消除可以包括生长或肿瘤大小和/或体积的下述减小百分比：约1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或之间的任意减小百分比。
要在本文所述的方法中治疗的肿瘤或癌症包括、但不限于：肺癌、妇科恶性肿瘤、黑素瘤、乳腺癌、脑癌（例如，多形性胶质母细胞瘤、“GBM”）胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、结直肠癌、前列腺癌、肾癌、头癌、肝癌（肝细胞癌）、子宫癌、颈癌、肾癌（肾细胞癌）、肉瘤、骨髓瘤和淋巴瘤。在一个实施方案中，要治疗的肿瘤是实体瘤或半实体瘤。在另一个实施方案中，要治疗的肿瘤是原发性肿瘤。在另一个实施方案中，要治疗的肿瘤是转移性肿瘤。在一个实施方案中，要治疗的肿瘤或癌症属于上皮起源。在另一个实施方案中，要治疗的癌症是骨髓瘤。在另一个实施方案中，要治疗的癌症是卵巢癌。在另一个实施方案中，要治疗的癌症是肾/肾脏癌。在另一个实施方案中，要治疗的癌症是肝细胞癌/肝癌。
肺癌
在一个方面，本文提供了一种治疗肺癌的方法。最常见的肺癌类型是非小细胞肺癌（NSCLC），其占肺癌的大约80-85%，且分成鳞状细胞癌、腺癌和大细胞未分化癌。小细胞肺癌占肺癌的15-20%。
肺癌分期是癌症从它的原始来源传播的程度的评估。它是影响肺癌的预后和潜在治疗的一个重要因素。非小细胞肺癌被分期为IA（“1A”，最好的预后）至IV（“四”；最差的预后）。如果它被限制在胸部的四分之一，且在单一放射疗法场的范围内，则将小细胞肺癌分类为受限期；否则，它是扩散期。
使用EUS（内窥镜超声）或CT或MRI扫描或在外科手术时，可以对非小细胞肺癌分期，以根据TNM系统分类疾病的程度。这些患者经历分期，作为考虑预后和治疗的过程的一部分。AJCC推荐TNM分期，继之以进一步分型。
原发性肿瘤（T）：TX：不能评估原发性肿瘤，或在痰或支气管肺泡灌洗液中存在恶性细胞，但是在成像或支气管镜检查时看不到；Tis：原位癌。T0：没有原发性肿瘤的证据。T1：肿瘤的最大尺寸小于3 cm，被肺或肺胸膜包围，支气管镜检查证实没有侵入主支气管中。T2：具有下述任一项的肿瘤：大尺寸超过3 cm；延伸进入主支气管（但是距离脊超过2 cm）和阻塞性肺炎（但是未累及整个肺）。T3：具有下述任一项的肿瘤：侵入胸壁、膈、纵隔胸膜或心包壁层；延伸进入主支气管，在脊的2 cm内，但是未累及脊；和整个肺的阻塞性肺炎。T4: 具有下述任一项的肿瘤：侵入纵隔、心脏、大血管、气管、食道、脊椎或脊；在同一叶中的单独的肿瘤结节；和恶性胸腔积液。淋巴结（N）：NX：不能评估淋巴结；N0：未累及淋巴结；N1：转移至同侧支气管周淋巴结或同侧肺门淋巴结；N2：转移至同侧纵隔淋巴结或脊下淋巴结；和N3：转移至下述任一处：同侧锁骨上淋巴结；同侧斜角肌淋巴结；和对侧淋巴结。远端转移（M）：MX：不能评估远端转移；M0：没有远端转移；和M1：存在远端转移。
子宫癌 / 妇科恶性肿瘤
子宫癌可以表示在子宫中发生的几种不同类型的癌中的任一种；即：子宫肉瘤（例如，子宫肌膜或子宫肌层的肉瘤是最常见的平滑肌肉瘤）；子宫内膜癌；和宫颈癌。
在另一个方面，本文提供了一种治疗子宫内膜癌的方法。子宫内膜癌是一种从子宫内膜（子宫的衬里）开始的癌症。子宫和子宫内膜癌的一些实例包括、但不限于：腺癌、腺棘皮瘤、腺鳞状癌、乳头状浆液性腺癌、透明细胞腺癌、子宫肉瘤、间质肉瘤、恶性混合性中胚层肿瘤和平滑肌肉瘤。
在另一个方面，所述方法治疗宫颈癌，优选宫颈上皮中的腺癌。该癌存在2种主要类型：鳞状细胞癌和腺癌。前者占所有宫颈癌的约80-90%，并形成在外宫颈（最靠近阴道的部分）和内宫颈（最靠近子宫的部分）连接处。后者形成在内宫颈的生产粘液的腺细胞中。有些宫颈癌具有这二者的特征，被称作腺鳞状癌或混合癌。
卵巢癌
在另一个方面，本文提供了一种治疗卵巢癌（包括上皮卵巢肿瘤）的方法。
根据在病理报告中得到的肿瘤组织学，对卵巢癌分类。表面上皮-间质肿瘤（也称作卵巢上皮癌）是卵巢癌的最典型的类型。它包括血清肿瘤, 子宫内膜肿瘤和粘液囊腺癌。性索-间质肿瘤（包括生产雌激素的粒层细胞瘤和男性化的塞尔托利-莱迪希细胞瘤或卵巢雄性细胞瘤）占卵巢癌的8%。胚细胞瘤占卵巢肿瘤的大约30%，但是仅占卵巢癌的5%，因为大部分胚细胞瘤是畸胎瘤，且大部分畸胎瘤是良性的。胚细胞瘤倾向于发生在年轻妇女和女孩中。预后取决于胚细胞瘤的具体组织学，但是总体上是良好的。混合瘤含有超过一种上述肿瘤组织学类别的要素。
卵巢癌也可以是继发性癌，即从原发性癌转移至体内别处的结果。常见的原发性癌是乳腺癌和胃肠道癌（在该情况下，卵巢癌是Krukenberg癌）。表面上皮-间质肿瘤可以源自腹膜（腹腔的衬里），在该情况下，卵巢癌相继于原发性的腹膜癌，但是治疗与累及腹膜的原发性表面上皮-间质肿瘤基本上相同。
卵巢癌分期是通过FIGO分期系统，并使用在外科手术以后得到的信息，所述外科手术可以包括经腹全子宫切除术、切除卵巢和输卵管、网膜和骨盆（腹膜）洗出液（用于细胞学）。AJCC阶段与FIGO阶段相同。
I期表示限于一侧或两侧卵巢的卵巢癌：IA–累及一侧卵巢；被膜完整；在卵巢表面上没有肿瘤；在腹水或腹膜洗出液中没有恶性细胞；IB - 累及两侧卵巢；被膜完整；在卵巢表面上没有肿瘤；阴性洗出液；和IC -肿瘤限于卵巢，具有下述任一项：被膜破裂，在卵巢表面上有肿瘤，阳性洗出液。
II期表示骨盆延伸或植入：IIA - 延伸或植入到子宫或输卵管上；阴性洗出液；IIB - 延伸或植入到其它骨盆结构上；阴性洗出液；和IIC - 骨盆延伸或植入，阳性腹膜洗出液。
III期表示在骨盆以外的微小腹膜植入；或限于骨盆，延伸至小肠或网膜: IIIA–超过骨盆的微小腹膜转移灶; IIIB - 超过骨盆的肉眼可见的腹膜转移灶，大小小于2 cm；和IIIC - > 2 cm的超过骨盆的腹膜转移灶，或淋巴结转移灶。
IV期表示远端转移至肝或腹腔以外。
主动脉旁淋巴结转移灶被认为是局部淋巴结（IIIC期）。
在有些实施方案中，本文所述的方法治疗选自下述的卵巢癌：在卵巢中的腺癌，和已经从卵巢转移至腹腔中的腺癌。
黑素瘤
黑素瘤是黑素细胞的一种恶性肿瘤，其主要见于皮肤中，但是也见于肠和眼中（眼色素层黑素瘤）。它是更罕见的皮肤癌类型之一，但是造成皮肤癌相关死亡中的大部分。恶性黑素瘤是由色素细胞（称作黑素细胞）的失控生长造成的一种严重类型的皮肤癌。黑素瘤也包括、但不限于：脉络膜黑素瘤、恶性黑素瘤、皮肤黑素瘤和眼内黑素瘤。
黑素瘤可以分成下述类型：恶性雀斑样痣、恶性雀斑样痣黑素瘤、表面扩散性黑素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤、粘膜黑素瘤、结节性黑素瘤、息肉样黑素瘤、结缔组织增生性黑素瘤、无黑素性黑素瘤、软组织黑素瘤和眼色素层黑素瘤。黑素瘤阶段如下：
0期- 原位黑素瘤（Clark水平I）。
I/II期- 侵入性黑素瘤：T1a：小于1.00 mm原发灶，没有溃疡，Clark水平II-III；T1b：小于1.00 mm原发灶，具有溃疡，或Clark水平IV-V；和T2a：1.00-2.00 mm原发灶，没有溃疡。
II期- 高危性黑素瘤：T2b：1.00-2.00 mm原发灶，具有溃疡；T3a：2.00-4.00 mm原发灶，没有溃疡；T3b：2.00-4.00 mm原发灶，具有溃疡；T4a：4.00 mm或更大的原发灶，没有溃疡；和T4b：4.00 mm或更大的原发灶，具有溃疡。
III期-局部转移：N1：单个阳性淋巴结；N2：2-3个阳性淋巴结或局部皮肤/途径中转移；和N3：4个阳性淋巴结或淋巴结和局部皮肤/途径中转移灶。
IV期- 远端转移：M1a：远端皮肤转移，正常的LDH；M1b：肺转移，正常的LDH；和M1c：其它远端转移或任何远端转移，升高的LDH。
在一个实施方案中，本文所述的方法治疗黑素瘤。
结肠癌和结直肠癌
结直肠癌（也称作结肠癌或大肠癌）包括在结肠、直肠（肛门）和阑尾中的癌性生长。每年全世界有655,000例死亡，它是癌症的第三最常见形式，且是西方世界中癌症相关死亡的第二大主要原因。认为许多结直肠癌源自结肠中的腺瘤性息肉。这些蘑菇样生长通常是良性的，但是有些可能随时间发展成癌。
在另一个实施方案中，可以使用Dukes分类法，基于A-D期来分类结直肠癌。A期表示限于粘膜层的结直肠癌（即，尚未侵入肠壁）。B1期表示延伸进入固有肌层，但是没有穿透它（即，尚未侵入淋巴结）；而B2期癌已经渗入固有肌层，但是没有穿透它（即，尚未侵入淋巴结）。C1期表示延伸进入固有肌层但是没有穿透它的癌症（即，侵入淋巴结）；而C2期表示延伸进入固有肌层并穿透它的癌症（即，侵入淋巴结）。D期表示远端转移性扩散。根据本领域已知的常规方式，也可以使用TNM系统分期结直肠癌。
乳腺癌
存在几类可以通过本文所述的方法来治疗的乳腺癌。原位小叶癌和原位导管癌是这样的乳腺癌：所述乳腺癌已经分别在小叶和导管中形成，但是尚未扩散至乳房周围的脂肪组织或身体的其它区域。浸润性（或侵入性）小叶癌和导管癌是这样的癌：所述癌已经分别在小叶和导管中形成，且已经扩散至乳房的脂肪组织和/或身体的其它部分。在一个方面，本文提供了一种治疗乳腺癌的方法，所述乳腺癌例如在乳腺的导管组织中的导管癌、Her2-和/或ER-和/或PR-的乳腺癌。会从所述方法的治疗获益的其它乳癌是髓样癌、胶体癌、小管癌和炎性乳腺癌。
在一个实施方案中，根据TNM系统对乳腺癌分期。预后与分期的结果紧密相关，在临床试验和临床实践中还使用分期来将患者分配给治疗。
简而言之，用于分期的信息如下：TX：不能评估原发性肿瘤。T0：没有肿瘤的证据。Tis：原位癌，没有侵入；T1：肿瘤是2 cm或更小；T2：肿瘤超过2 cm，但是未超过5 cm；T3：肿瘤超过5 cm；T4：生长进入胸壁或皮肤中的任意大小的肿瘤，或炎性乳腺癌。NX：不能评估附近的淋巴结。N0：癌尚未扩散至局部淋巴结。N1：癌已经扩散至1-3个上颌淋巴结或1个乳房内淋巴结。N2：癌已经扩散至4-9个上颌淋巴结或多个乳房内淋巴结。N3：下述之一适用：癌已经扩散至10个或更多个上颌淋巴结，或癌症已经扩散至锁骨下淋巴结，或癌症已经扩散至锁骨上淋巴结，或癌症累及上颌淋巴结且已经扩散至乳房内淋巴结，或癌症累及4个或更多个上颌淋巴结且在前哨淋巴结活组织检查时在乳房内淋巴结中发现了很小量的癌。MX：不能评估远端扩散（转移）的存在。M0：没有远端扩散。M1：已经扩散至远端器官（不包括锁骨上淋巴结）。
胰腺癌
在另一个方面，本文提供了一种治疗选自下述的胰腺癌的方法：在胰管组织中的上皮样癌和在胰管中的腺癌。最常见的胰腺癌类型是腺癌，其发生于胰管的衬里中。
在一个实施方案中，本文所述的方法治疗胰腺癌。
前列腺癌
在一个其它方面，本文提供了一种治疗选自下述的前列腺癌的方法：腺癌或已经迁移至骨的腺癌。前列腺癌形成在男性的前列腺器官中，所述前列腺器官包围尿道的第一部分。前列腺具有几种细胞类型，但是99%的肿瘤是在负责产生精液的腺细胞中形成的腺癌。
通常使用2个方案来分期前列腺癌。最常见的方案是TNM系统，该系统评价肿瘤的大小、侵入的淋巴结的范围和任何转移（远端扩散）。与许多其它癌一样，经常将它们分成4个阶段（I-IV）。更少使用的另一个方案是Whitmore-Jewett分期。
简而言之，I期疾病是，当因为其它原因（诸如良性前列腺肥厚）切除前列腺组织时，偶然地在小部分样品中发现的癌，且所述细胞与正常细胞非常相似，指检感觉前列腺是正常的。在II期，累及更多的前列腺，且可以感觉到在前列腺内的肿块。在III期，肿瘤已经扩散穿过前列腺囊，且可以在前列腺表面上感觉到肿块。在IV期疾病中，肿瘤已经侵入附近的结构，或已经扩散至淋巴结或其它器官。分级是基于来自活组织检查（Gleason）的细胞内容物和组织结构，所述活组织检查会提供疾病的破坏潜力和最终预后的估测。
在一个实施方案中，本文所述的方法治疗前列腺癌。
头颈癌
头颈癌（例如，口部、喉部、鼻咽部、食管等）表示一组生物学上类似的癌，所述癌源自上呼吸消化道，包括唇、口腔（嘴）、鼻腔、鼻旁窦、咽和喉。大多数头颈癌是鳞状细胞癌，它们源自这些区域的粘膜衬里（上皮）。头颈癌经常扩散至颈部的淋巴结，且这经常是疾病在诊断时的首要（有时唯一）表现。头颈癌与某些环境因素和生活方式危险因素强烈相关，所述因素包括抽烟、饮酒和性传播的人乳头状瘤病毒的某些菌株。控制具有头颈癌的患者仍然是一项艰难的任务。使用本文所述的化合物，可以治疗癌症，例如，下咽癌、喉癌、鼻咽癌、鼻咽癌。
在一个实施方案中，本文所述的方法治疗头颈癌。
肾癌
在另一个方面，本文提供了一种治疗肾癌的方法。肾癌（也称作肾细胞癌症、肾细胞癌、肾腺癌和肾上腺样瘤）是这样的疾病：其中，恶性细胞存在于肾小管的衬里中。肾细胞癌是源自近端肾小管的肾癌的最常见形式。它是成年人中的肾癌的最常见类型，占病例的大约80%。
在一个实施方案中，本文所述的方法治疗肾癌。
肝癌
在另一个方面，本文提供了一种治疗原发性肝癌（从肝中开始的癌症）的方法。原发性肝癌可以发生于成年人和儿童中。肝癌的特征在于恶性肝肿瘤的存在——在肝表面上或内部的肿瘤或生长。它们可以在医学成像中被发现（甚至由于癌症自身以外的不同原因），或可以存在于患者中，作为腹部包块、腹痛、黄疸或一些其它肝功能障碍。存在几类肝癌。
血管瘤：这些是良性肝肿瘤的最常见类型。它们起源于血管。大部分这样的肿瘤不会产生征状，它们不需要治疗。如果它是中度至严重的，有些可能出血，且需要去除。
肝腺瘤: 这些良性上皮肝肿瘤形成在肝中。在大多数情况下，它们位于右肝叶中，且经常单独发现。腺瘤的大小是在1-30 cm范围内。与肝腺瘤有关的征状都与可以造成强烈腹痛的大病灶有关。
局限性结节状增生: 局限性结节状增生（FNH）是第二最常见的肝肿瘤。该肿瘤是先天性动静脉畸形肝细胞应答的结果。该过程是这样的过程：其中肝的所有正常组分都存在，但是它们的呈现模式是异常的。尽管存在这些病症，肝看起来仍然表现在正常范围内。
肝细胞癌: 肝细胞癌（HCC）是最常见的肝癌。它与酒精滥用和乙型肝炎感染有关，且在亚洲特别流行。大部分HCC在通过外科手术切除不可能治愈时才被检测出；不能切除的HCC的全身治疗与小于1年的存活期有关。
在一个实施方案中，本文所述的方法治疗肝癌。
淋巴瘤
淋巴瘤是一类源自免疫系统的淋巴细胞的癌症。它们经常起源于淋巴结，呈现为结节（肿瘤）的扩大。淋巴瘤与淋巴性白血病密切相关，所述淋巴性白血病也源自淋巴细胞，但是通常仅累及循环血液和骨髓（在这里在称作造血的过程中产生血细胞），且通常不形成肿瘤。存在许多类型的淋巴瘤，反过来，淋巴瘤是称作血液肿瘤的一大类疾病的一部分。一些淋巴瘤形式是无痛的（例如小淋巴细胞淋巴瘤），与甚至没有治疗时的长寿命相容，而其它形式是侵袭性的（例如伯基特淋巴瘤），会造成快速恶化和死亡。
WHO分类法（在2001年公开，在2008年更新；http://en.wikipedia.org/wiki/Lymphoma - cite_note-isbn92-832-2411-6-2#cite_note-isbn92-832-2411-6-2）是淋巴瘤的最新分类法，且是基于在“修订的欧美淋巴瘤分类法”（Revised European-American Lymphoma classification，REAL）中公开的基础。该系统通过细胞类型（即，与肿瘤最相似的正常细胞类型）和定义表型特征、分子特征或细胞遗传特征来分组淋巴瘤。存在3个大组：B细胞、T细胞和天然杀伤细胞肿瘤。也认识到其它不太常见的组。何杰金淋巴瘤尽管在WHO（和先前的）分类法中单独考虑，现在被认为是成熟B细胞谱系的淋巴细胞的肿瘤（尽管是明显异常的）。
在一个实施方案中，本文所述的方法治疗淋巴瘤。
肉瘤
肉瘤是结缔组织（骨、软骨、脂肪）的一种癌症，其导致中胚层增殖。
这不同于具有上皮起源（乳房、结肠、胰腺和其它）的癌。但是，由于组织起源的进化理解，术语“肉瘤”有时适用于现在已知源自上皮组织的肿瘤。术语软组织肉瘤被用于描述软组织的肿瘤，所述软组织包括在结缔组织中但是并非源自结缔组织的组分（诸如肌肉和血管）。
基于肉瘤的起源组织的类型，给肉瘤赋予了许多不同的名称。例如，骨肉瘤源自骨，软骨肉瘤源自软骨，平滑肌肉瘤源自平滑肌。肉瘤会攻击所有年龄段的人，但是它们是非常罕见的，占所有癌症病例的仅1%。GIST是肉瘤的最常见形式，在美国每年有大约3000-3500个病例。这与乳腺癌相当，在北美每年有大约200,000个病例。
大约50%的骨肉瘤和20%的软组织肉瘤在低于35岁的人中诊断出。有些肉瘤（诸如平滑肌肉瘤、软骨肉瘤和胃肠道间质肿瘤（GIST））在成年人中比在儿童中更常见。大部分高级骨肉瘤（包括尤因肉瘤和骨肉瘤）在儿童和年轻的成年人中远远更常见。
在一个实施方案中，本文所述的方法治疗肉瘤。
癌
癌是源自上皮细胞的任意恶性癌。癌会侵入周围组织和器官，并可以转移或扩散至淋巴结和其它部位。
象所有瘤形成一样，通过它的组织病理学外观来分类癌。腺癌和鳞状细胞癌（肿瘤的2个常见描述性术语）反映了下述事实：即这些细胞分别可能具有腺状外观或鳞状细胞外观。严重的间变性肿瘤可能是未分化的，所以它们不具有独特的组织学外观（未分化癌）。
有时，通过推定的原发器官（例如，前列腺癌）或假定的起源细胞（肝细胞癌、肾细胞癌）来表示肿瘤。
腺癌是一种源自腺组织的上皮细胞并形成腺状结构的恶性肿瘤。这常见于肺（形成所有肺癌的30-40%）。它见于外围，源自杯状细胞或II型肺泡壁细胞。
鳞状细胞癌源自鳞状转移瘤。这占肺肿瘤的20-30%，且通常起源于肺门。
小细胞癌几乎确定地起因于吸烟。它们在早期转移，且可以分泌ADH（降低患者钠浓度）。
大细胞未分化癌占肺肿瘤的10-15%。它们是侵袭性的，且由于未分化性质而难以识别。它们最常见于肺中央。
鼻窦未分化癌。
在一个实施方案中，本文所述的方法治疗癌。
骨髓瘤
多发性骨髓瘤（也称作MM、骨髓瘤、浆细胞性骨髓瘤，或在Otto Kahler以后称作卡勒病）是浆细胞的一种癌症。这些免疫细胞在骨髓中形成，大量存在于在淋巴管中，并生成抗体。认为骨髓瘤是不可治愈的，但是用类固醇、化学疗法、沙利度胺和干细胞移植可以诱导减轻。骨髓瘤是称作血液恶性肿瘤的一大类疾病的一部分。
多发性骨髓瘤形成在后生发中心B淋巴细胞中。经常在具有多发性骨髓瘤的患者中观察到免疫球蛋白重链基因（在第14染色体上，基因座14q32）和癌基因（经常是11q13、4p16.3、6p21、16q23和20q11）之间的染色体易位。该突变导致癌基因的失调，这被认为是骨髓瘤的发病机制中的一个重要启动事件。结果是浆细胞无性系的增殖和导致其它突变和易位的基因组不稳定性。在所有骨髓瘤病例的约50%中，观察到染色体14异常。还在约50%的病例中观察到第13染色体（的部分）的缺失。
浆细胞的细胞因子（特别是IL-6）生产会造成许多它们的局限性破坏（诸如骨质疏松症），并建立恶性细胞在其中茁壮成长的微环境。血管生成（新血管的吸引力）增加。
在一个实施方案中，本文所述的方法治疗骨髓瘤。
胃癌
胃癌可以形成在胃的任意部分，且可以扩散至整个胃和其它器官；尤其是食道、肺和肝。胃癌每年在全世界造成约800,000人死亡。
转移发生于80-90%的具有胃癌的个体中，在早期诊断出的那些中，6个月存活率为65%，在晚期诊断出的那些中，6个月存活率小于15%。
胃癌经常是无症状的，或在它的早期仅造成非特异性的征状。在征状出现的时间之前，胃癌通常已经转移至身体的其它部分，这是它的预后不良的主要原因之一。
在一个实施方案中，本文所述的方法治疗胃癌。
甲状腺癌
甲状腺肿瘤或甲状腺癌通常表示甲状腺的4类恶性肿瘤中的任一种：乳头瘤、滤泡瘤、髓质瘤或间变性瘤。乳头瘤和滤泡瘤是最常见的。它们缓慢地生长，且可能复发，但是通常在45岁以下的患者中不是致命的。髓质瘤具有良好的预后（如果限于甲状腺）和更差的预后（如果发生转移）。间变性瘤快速地生长，且对治疗的应答较差。
甲状腺癌通常见于甲状腺机能正常的患者中，但是甲状腺功能亢进或甲状腺功能减退的征状可能与大的或转移性的良好分化的肿瘤相关。当在低于20岁的那些人中发现它们时，特别关心结节。在该年龄呈现良性结节的可能性更低，因而恶性肿瘤的可能性远远更大。
根据它们的病理学特征，可以分类甲状腺癌。可以区分下述变体（在不同亚型中的分布可能表现出局部差异）：乳头状甲状腺癌（多达75%）；滤泡甲状腺癌（多达15%）；髓质甲状腺癌（多达8%）；和间变性甲状腺癌（小于5%）。滤泡型和乳头型可以一起分类为“分化的甲状腺癌”。这些类型具有比髓质型和未分化型更有利的预后。甲状腺腺瘤是甲状腺的一种良性肿瘤。
在一个实施方案中，本文所述的方法治疗甲状腺癌。
膀胱癌
膀胱癌表示膀胱的几类恶性生长中的任一种。它是这样的疾病：其中，异常细胞在膀胱中没有控制地繁殖。膀胱是一种用于储存尿的空心肌肉器官；它位于骨盆中。膀胱癌的最常见类型起源于衬在膀胱内侧的细胞，且被称作移行细胞癌（有时称作膀胱上皮细胞癌）。
90%的膀胱癌是移行细胞癌。其它10%是鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、小细胞癌和来自体内别处的癌的继发性沉积。
根据TNM（肿瘤、淋巴结和转移）分期系统，使用下述阶段来分类癌的位置、大小和扩散：0期：仅在膀胱衬里上发现癌细胞。I期：癌细胞已经增殖至超过膀胱衬里的层，但是没有增殖至膀胱的肌肉。II期：癌细胞已经增殖至膀胱壁中的肌肉，但是没有增殖至膀胱周围的脂肪组织。III期：癌细胞已经增殖至膀胱周围的脂肪组织和前列腺、阴道或子宫，但是没有增殖至淋巴结或其它器官。IV期：癌细胞已经增殖至淋巴结、骨盆壁或腹壁和/或其它器官。复发：在已经治疗以后，癌已经在膀胱中或在其它附近器官中复发。
根据1997 TNM系统，对膀胱TCC分期：Ta，非侵入性乳头瘤；T1，侵入性，但是没有远至膀胱肌肉层；T2，侵入肌肉层；T3，侵入超过肌肉层，进入膀胱外面的脂肪；和T4，侵入周围结构，如前列腺、子宫或骨盆壁。
在一个实施方案中，本文所述的方法治疗膀胱癌。
根据本发明，人源化的内皮因子抗体或其片段可以单独施用，或与活性剂或惰性剂联合施用。当使用组合时，本发明预见到同时或相继施用人源化的内皮因子抗体或抗原结合片段和活性剂或惰性剂。
根据需要，可以与一种或多种治疗性处理联合地施用本发明的化合物，所述治疗性处理包括、但不限于：阿霉素、环磷酰胺、紫杉醇、培美曲塞、替莫唑胺、奥沙利铂、贝伐单抗、爱必妥、vectibix、索拉非尼、舒尼替尼、吉非替尼、厄洛替尼、5-氟尿嘧啶（5-FU）、伊立替康、托泊替康、亚叶酸、VELCADE®、来那度胺、沙利度胺、希罗达、泰素帝和本文所述的许多其它常规癌症疗法。应当理解，下面列出的治疗方案的列表代表常规疗法，但是本发明包括在本文中没有具体公开的其它已知的治疗方案。
本文使用的“辐射”表示，例如，微波、紫外线（UV）、红外线（IR）或α-、β-或γ-辐射。使用常规技术，可以“集中”或局部地递送辐射，以将辐射靶向一个或多个肿瘤部位，而不辐射整体身体。
在一个实施方案中，所述癌症是卵巢癌，所述一种或多种额外的治疗性处理是外科手术、化学疗法（例如，多柔比星、Doxil、吉西他滨、卢比替康和基于铂的化学疗法诸如顺铂、卡铂和奥沙利铂）、美法仑、紫杉醇、拓扑异构酶I抑制剂诸如托泊替康和伊立替康、基于紫杉烷的疗法、激素、辐射疗法、全身低温、异衍生物诸如苯妥帝尔（Phenoxodial）、细胞毒性的大环内酯类诸如埃博霉素、血管生成抑制剂诸如贝伐单抗、信号转导抑制剂诸如曲妥单抗、基因疗法、RNAi疗法、免疫疗法、单克隆抗体、磷脂酰肌醇样激酶抑制剂诸如雷帕霉素或它们的任意组合。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和Doxil。在另一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和托泊替康。在另一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和VEGF受体抑制剂。VEGF受体抑制剂的非限制性实例包括：贝伐单抗（阿伐他汀®）、ranibizumab（LUCENTIS®）、aflibercept（VEGF-Trap）、舒尼替尼（SUTENT®）、索拉非尼（NEXAVAR®）、axitinib、培加尼布和pazopanib。本文所述的抗体和抗原结合片段与卵巢癌疗法的联合治疗也可以提供任一种疗法或二者的更低剂量，这是由于共同施用所述疗法的协同效应。
在一个实施方案中，所述癌症是肾癌，且所述一种或多种治疗性处理是外科手术、化学疗法、舒尼替尼、索拉非尼、pazopanib、阿伐他汀®、干扰素-α或IL-2。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和索拉非尼。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和舒尼替尼。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和阿伐他汀®。在另一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和VEGF受体抑制剂。VEGF受体抑制剂的非限制性实例包括：贝伐单抗（阿伐他汀®）、ranibizumab（LUCENTIS®）、aflibercept（VEGF-Trap）、舒尼替尼（SUTENT®）、索拉非尼（NEXAVAR®）、axitinib、培加尼布和pazopanib。本文所述的抗体和抗原结合片段与肾癌疗法的联合治疗也可以提供任一种疗法或二者的更低剂量，这是由于共同施用所述疗法的协同效应。
在一个实施方案中，所述癌症是骨髓瘤，且所述一种或多种治疗性处理是外科手术、放射疗法、VELCADE®、lenalidomide或沙利度胺。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和VELCADE®。这些疗法中的任一种的剂量是本领域已知的，且可以在联合治疗中相应地进行调节。
在一个实施方案中，所述癌症是前列腺癌，且所述一种或多种治疗性处理是外科手术、放射疗法（例如，外线束或近距离放射疗法）、激素剥夺（雄激素抑制）、热休克蛋白90（HSP90）抑制剂、化学疗法（例如，多西他赛、基于铂的化学疗法诸如顺铂、卡铂、沙铂和奥沙利铂、紫杉烷、雌莫司汀）、泼尼松或泼尼松龙、降低胆固醇的药物诸如他汀类药物、促黄体激素-释放激素（LHRH）激动剂、RNAi疗法、遗传修饰成分泌粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子（GM-CSF）的全肿瘤细胞（也称作GVAX）或它们的任意组合。在另一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和VEGF受体抑制剂。VEGF受体抑制剂的非限制性实例包括：贝伐单抗（阿伐他汀®）、ranibizumab（LUCENTIS®）、aflibercept（VEGF-Trap）、舒尼替尼（SUTENT®）、索拉非尼（NEXAVAR®）、axitinib、培加尼布和pazopanib。
在一个实施方案中，所述癌症是肺癌，且所述一种或多种治疗性处理是外科手术、放射疗法（例如，胸放射疗法、使用带电颗粒的辐射疗法、尿嘧啶-替加氟和基于铂的化学疗法（例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂等）和长春瑞滨、厄洛替尼（TARCEVA®）、吉非替尼（IRESSA®）、抗-表皮生长因子受体抗体（例如，西妥昔单抗）、抗-血管内皮生长因子抗体（例如，贝伐单抗）、酪氨酸激酶的小分子抑制剂、在肺癌细胞增殖中涉及的蛋白的直接抑制剂、极光激酶抑制剂、激光诱导的温热疗法、RNAi疗法、遗传修饰成分泌粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子（GM-CSF）的全肿瘤细胞（也称作GVAX）或它们的任意组合。额外的治疗性处理包括泰素或培美曲塞。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和厄洛替尼。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和吉非替尼。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和培美曲塞。在另一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和VEGF受体抑制剂。VEGF受体抑制剂的非限制性实例包括：贝伐单抗（阿伐他汀®）、ranibizumab（LUCENTIS®）、aflibercept（VEGF-Trap）、舒尼替尼（SUTENT®）、索拉非尼（NEXAVAR®）、axitinib、培加尼布和pazopanib。这些疗法中的任一种的剂量是本领域已知的，且可以在联合治疗中相应地进行调节。
在一个实施方案中，所述癌症是乳腺癌，且所述一种或多种治疗性处理是外科手术、单克隆抗体（例如，Her-2抗体、赫赛汀）、辅助化学疗法诸如单一试剂化学疗法或联合化学疗法（例如，基于蒽环类抗生素的和基于紫杉烷的多种化学疗法、泰素或靶物-特异性的曲妥单抗（有或没有内分泌操作，有或没有PMRT）、长春瑞滨）、阿霉素、环磷酰胺、希罗达、泰素帝、选择性的雌激素受体调节剂诸如他莫昔芬和雷洛昔芬、变构的雌激素受体调节剂诸如曲洛司坦、辐射（例如，间质近距离放射疗法、球囊装置、三维共形外辐射和外科手术中的放射疗法）、抑制全身合成的芳香酶抑制剂（例如，阿那曲唑、依西美坦和来曲唑）、RNAi疗法、免疫抑制性的和抗增殖的雷帕霉素的静脉内类似物诸如坦罗莫司（CCI779）或它们的任意组合。用于进行乳腺癌的三维体外组织培养模型的方法的综述，描述在：Kim等人, Breast Cancer Research Treatment 85（3）: 281-91（2004）。用于测试癌症的其它体内和体外模型是已知的，且可以用于测试本文所述的抗-内皮因子抗体。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段、泰素和阿伐他汀®。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和阿霉素。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和希罗达。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和泰索帝。在另一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和VEGF受体抑制剂。VEGF受体抑制剂的非限制性实例包括：贝伐单抗（阿伐他汀®）、ranibizumab（LUCENTIS®）、aflibercept（VEGF-Trap）、舒尼替尼（SUTENT®）、索拉非尼（NEXAVAR®）、axitinib、培加尼布和pazopanib。这些疗法中的任一种的剂量是本领域已知的，且可以在联合治疗中相应地进行调节。
在一个实施方案中，所述癌症是结肠癌，且所述一种或多种治疗性处理是外科手术、辐射疗法和化学疗法（例如，5-氟尿嘧啶、左旋咪唑、亚叶酸或司莫司汀（甲基CCNU））、N-[2-（二甲氨基）乙基]吖啶-4-羧酰胺和其它有关的羧酰胺抗癌药；非-拓扑异构酶II抑制剂、伊立替康、脂质体托泊替康、紫杉烷类抗癌剂（例如，紫杉醇或多西他赛）、呫吨酮醋酸类化合物（例如，5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸PMAA）、昆布多糖、位点-选择性的环AMP类似物（例如，8-氯腺苷3',5'-环磷酸盐）、Cox-2的吡喃并吲哚抑制剂、Cox-2的咔唑抑制剂、Cox-2的四氢咔唑抑制剂、Cox-2的茚抑制剂、NSAIDS的局限抑制剂（例如，邻氨基苯甲酸、阿司匹林（5-阿司匹林）、奥柳氮钠、碳杂环酸、卡洛芬、苯丁酸氮芥、双氯苯胺酚乙酸、芬布芬、芬氯酸、非诺洛芬、氟芬那酸、氟比洛芬、氟洛芬、呋塞米、金硫丁二钠、布洛芬、吲哚美辛、吲哚洛芬、酮洛芬、氯那唑酸、洛索洛芬、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美法仑、萘普生、青霉胺、苯乙酸、丙酸、水杨酸、柳氮磺吡啶、舒林酸、托美丁、布他酮保泰松扑灭津NSAID、美洛昔康、昔康类、吡罗昔康、费啶、吡罗昔康β环葡聚糖、替诺昔康、依托度酸和奥沙普秦）、HER-2/neu的抑制剂、RNAi疗法、GM-CSF、单克隆抗体（例如，抗-Her-2/neu抗体、抗-CEA抗体、A33（HB 8779）、100-210（HB 11764）和100-310（HB 11028））、爱必妥、vectibix、激素疗法、嘧啶胺类、喜树碱衍生物（例如，CPT- 11）、亚叶酸（FA）、吉西他滨、Ara-C、基于铂的化学疗法诸如顺铂、卡铂和奥沙利铂、cGMP-特异性的磷酸二酯酶抑制剂或它们的任意组合。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段与5-FU、亚叶酸钙和奥沙利铂的组合（FOLFOX）。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段与5-FU、伊立替康和亚叶酸钙的组合（IFL）。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和爱必妥。在一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和vectibix。在另一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和VEGF受体抑制剂。VEGF受体抑制剂的非限制性实例包括：贝伐单抗（阿伐他汀®）、ranibizumab（LUCENTIS®）、aflibercept（VEGF-Trap）、舒尼替尼（SUTENT®）、索拉非尼（NEXAVAR®）、axitinib、培加尼布和pazopanib。这些疗法中的任一种的剂量是本领域已知的，且可以在联合治疗中相应地进行调节。
在一个实施方案中，所述癌症是胰腺癌，且所述一种或多种治疗性处理是外科手术、辐射疗法（RT）、氟尿嘧啶（5-FU）和RT、全身疗法、支架、吉西他滨（GEMZAR®）、吉西他滨和RT、西妥昔单抗、厄洛替尼（TARCEVA®）、放化疗、贝伐单抗（阿伐他汀®）或它们的任意组合。在另一个实施方案中，所述组合是人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段和VEGF受体抑制剂。VEGF受体抑制剂的非限制性实例包括：贝伐单抗（阿伐他汀®）、ranibizumab（LUCENTIS®）、aflibercept（VEGF-Trap）、舒尼替尼（SUTENT®）、索拉非尼（NEXAVAR®）、axitinib、培加尼布和pazopanib。
可以在一个或多个不同的时间点，包括在治疗方案之前、过程中和之后，关于征状对患者进行评估。治疗可以导致改善受试者的病症，且可以通过测定是否已经发生下述因素中的一项或多项来进行评估：肿瘤大小的减小、细胞增殖的减少、细胞数目的减少、新生血管形成的减少、细胞凋亡的增加、或至少一部分构成细胞增殖障碍的细胞的存活期减小。在某些情况下，这些事件中的一个或多个可能导致癌症的部分或完全消除和患者存活期的延长。或者，对于末期癌症，治疗可能导致疾病的停滞、更好的生活质量和/或存活期的延长。
生物标志物评估
某些基因可以在癌症中以增加的或降低的水平表达。在癌症中的基因表达水平的变化，可以指示对癌症疗法或治疗的抗性或敏感性。
本文提供了一种用于检测至少一个基因的表达的诊断方法，所述基因选自其表达已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的基因库，其中所述至少一个基因是：VEGF、VEGF受体、HIF-1α、胎盘生长因子受体或内皮因子（CD105）。所述方法可以另外包括下述步骤：对比在患者样品中检测到的至少一个基因的表达水平与已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的至少一个基因的表达水平。在一个非限制性实施方案中，所述血管生成抑制剂是人源化的抗-内皮因子抗体。在另一个实施方案中，所述血管生成抑制剂是VEGF受体抑制剂或VEGF抑制剂。
当与检测基因的表达结合使用时，本文使用的术语“表达”可以表示，检测基因的转录和/或检测基因的翻译。“检测基因的表达”表示，主动测定基因是否表达的行为。这可以包括：测定基因表达是否相对于对照被增量调节、相对于对照被减量调节或相对于对照没有变化。因此，检测表达的步骤不要求基因的表达实际上被增量调节或减量调节，而是相反，也可以包括检测基因的表达没有变化（即，检测到基因没有表达或基因的表达没有变化）。
结合本发明要评估的生物标志物包括：VEGF受体、胎盘生长因子、HIF-1α和内皮因子（CD105）。
为了评估生物标志物表达，可以在本文所述的和本领域进一步已知的方法中使用患者样品，所述患者样品含有内皮组织、肿瘤细胞或由肿瘤细胞生成的蛋白或核酸。简而言之，通过评估样品中标志物的数量（例如，绝对量或浓度），可以评估生物标志物的表达水平，所述样品是例如，从患者获得的肿瘤活检物，或含有肿瘤衍生物的其它患者样品（例如，血液、血清、尿或上文所述的其它体液或排泄物）。当然，在评估样品中的标志物数量之前，可用多种众所周知的收集后制备和贮藏技术（如核酸和/或蛋白提取、固定、贮藏、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等）处理细胞样品。同样地，也可用收集后制备和储存技术（例如，固定）处理肿瘤活检物。
可以检测生物标志物蛋白的表达，所述生物标志物蛋白的至少一部分在表达该蛋白的细胞的表面上展示。可以测定标志物蛋白或其部分是否暴露于细胞表面上。例如，可用免疫学方法检测全细胞上的这种蛋白，或用众所周知的基于计算机的序列分析方法来预测至少一个胞外结构域（即，包括分泌型蛋白和具有至少一个细胞表面结构域的蛋白）的存在。无需裂解肿瘤细胞，即可检测具有至少一部分在表达该蛋白的细胞的表面上展示的标志物蛋白的表达（例如，使用与蛋白的细胞表面结构域特异性结合的标记抗体）。
通过用于检测转录的核酸或蛋白的表达的多种众所周知的方法中的任一种，可以评估生物标志物的表达。这样的方法的非限制性实例包括，例如，用于检测分泌型蛋白、细胞表面蛋白、胞质蛋白或核蛋白的免疫学方法、蛋白纯化方法、蛋白功能或活性试验、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法或本领域已知的任意其它方法。
可以使获得自样品的转录的多核苷酸的混合物和基质接触，所述基质上固定有与生物标志物核酸的至少一部分（例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500个或更多的核苷酸残基）互补或同源的多核苷酸。如果在基质上可以差别地检测互补的或同源的多核苷酸（例如，使用不同的发色团或荧光团或固定在不同的选定位置而可检测），那么使用单一基质（例如，固定在所选择位置的多核苷酸的“基因芯片”微阵列）就可同时评估多种生物标志物的表达水平。当使用包括将一种核酸与另一种核酸杂交的评估生物标志物表达的方法时，可以在严格杂交条件下进行杂交。
当多种本发明的生物标志物用于本发明的方法中时，可将患者样品中每种生物标志物的表达水平与相同类型的非癌性样品中的多种生物标志物各自的正常表达水平比较，所述非癌性样品是在单独的反应混合物中（即，对于每种生物标志物，使用试剂，诸如不同的荧光探针）或在相应于一种或多种生物标志物的单个反应混合物中。
可用不同的方法来评估正常的（即，非癌性的）人组织中的生物标志物的表达水平。通过评估看来是非癌性的的细胞的一部分中生物标志物的表达水平，然后将该正常表达水平与肿瘤细胞的一部分中的表达水平相对比，可以评估该正常表达水平。作为可获得自常规进行的本文所述方法的结果的其它信息，可以使用生物标志物的正常表达的群体平均值。或者，通过评估下述样品中的生物标志物的表达，可以测定生物标志物的正常表达水平：获得自非癌症患者的患者样品，在患者的疑似癌症发作之前从所述患者获得的样品，来自存档的患者样品的样品等。
用于监测生物标志物蛋白或核酸在生物样品中的存在与否的示例方法包括：从实验受试者获得生物样品，使所述生物样品接触能检测多肽或核酸（例如，mRNA、基因组DNA或cDNA）的化合物或试剂。因而，所述检测方法用于检测mRNA、蛋白、cDNA或基因组DNA，例如，在体外和体内的生物样品中。mRNA的体外检测技术包括，例如，逆转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR；例如，在Mullis, 1987, 美国专利号4,683,202中阐述的实验实施方案）、RNA印迹杂交和原位杂交。生物标志物蛋白的体外检测技术包括、但不限于：酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白印迹、免疫沉淀和免疫荧光。基因组DNA的体外检测技术包括，例如，DNA印迹杂交。mRNA的体内检测技术包括，例如，聚合酶链式反应（PCR）、定量PCR、RNA印迹杂交和原位杂交。另外，生物标志物蛋白的体内检测技术包括：向受试者导入针对蛋白或其片段的标记的抗体。例如，可以用放射性标志物来标记抗体，通过标准成像技术可以检测其在受试者中的存在与位置。
这样的诊断和预后测定的一般原理包括：在适当的条件下制备可能含有生物标志物和探针的样品或反应混合物，并持续足以使生物标志物和探针相互作用并结合的时间，从而在反应混合物中形成复合物，所述复合物可被除去和/或检测到。使用多种方法，可以以多种方式进行这些测定。
不通过进一步操作或标记任一种成分（生物标志物或探针），也可以直接检测生物标志物/探针复合物形成，例如通过利用荧光能量转移技术（即，FET，参见例如，Lakowicz等人, 美国专利号5,631,169；和Stavrianopoulos, 等人, 美国专利号4,868,103）。
在另一个实施方案中，不标记任一种测定组分（探针或生物标志物），利用诸如实时生物分子相互作用分析（BIA；参见，例如，Sjolander, S.和Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345和Szabo等人, 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705）等技术，可以测定探针的识别生物标志物的能力。本文使用的“BIA”或“表面等离子体共振”表示，不通过标记任何相互作用物而实时研究生物特异性的相互作用的技术（例如，BIAcore）。在结合表面处的质量的改变（指示结合事件）会导致近表面处的光折射率的改变（表面等离子体共振（SPR）的光学现象），这会产生可检测的信号，所述信号可以用作生物分子之间的实时反应的指示。
作为进行基于生物标志物的绝对表达水平的测定的替代方案，测定可以基于生物标志物的标准化的表达水平。通过如下校正生物标志物绝对表达水平，标准化表达水平：比较其表达与不作为生物标志物的基因（例如，组成性地表达的持家基因）的表达。用来标准化的合适基因包括：持家基因，诸如肌动蛋白基因或上皮细胞特异性的基因。该标准化允许比较一个样品（如患者样品）与另一个样品（如非肿瘤样品）中的表达水平，或不同来源样品之间的表达水平。
或者，可以将表达水平提供为相对表达水平。为了测定生物标志物（例如，VEGF受体、胎盘生长因子、Hif-1α和内皮因子（CD105））的相对表达水平，在测定所考虑的样品的表达水平之前，测定10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、或50个或更多个正常样品相对于癌细胞分离物的生物标志物表达水平。测定更大量样品中每个测定基因的平均表达水平，并将其用作生物标志物的基线表达水平。然后，将实验样品所测得的生物标志物表达水平（绝对表达水平）除以该生物标志物所得的平均表达值。这会提供相对表达水平。
在本发明的另一个实施方案中，检测生物标志物蛋白。用于检测本发明的生物标志物蛋白的一类试剂是，能与这样的蛋白或其片段结合的抗体，例如，可检测地标记的抗体。抗体可以是多克隆的或单克隆的。可以使用完整的抗体或其抗原结合片段（例如，Fab、F(ab')2、Fv、scFv、单个结合链多肽）。关于探针或抗体，术语“标记的”意在包括，通过把可检测物质与探针或抗体偶联（即，物理地连接）而直接标记所述探针或抗体，以及通过与直接标记的另一种试剂的反应性而间接标记所述探针或抗体。间接标记的实例包括：利用荧光地标记的第二抗体检测第一抗体，和用生物素末端标记DNA探针，使得它可以用荧光地标记的抗生蛋白链菌素检测到。可以用多种形式来测定样品是否含有与给定抗体结合的蛋白。所述形式的实例包括、但不限于：酶免疫测定（EIA）、放射免疫测定（RIA）、蛋白印迹分析以及酶联免疫吸附测定（ELISA）。本领域技术人员可以容易地改变已知的蛋白/抗体检测方法，用于测定肿瘤细胞是否表达本发明的生物标志物。也可以使用两种或更多种用于检测生物标志物的试验（非限制性实例包括上述的那些）的组合来评估一种或多种生物标志物。
本文也提供了一种选择癌症患者用于血管生成抑制剂治疗的方法。所述方法包括：提供来自患者的癌症样品，检测一个或多个基因的表达，所述基因的表达已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联，对比在患者样品中检测到的一个或多个基因的表达水平和已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的一个或多个基因的表达水平。已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的基因的非限制性实例包括：VEGF、VEGF受体、HIF-1α、胎盘生长因子受体和内皮因子（CD105）。在另一个实施方案中，如果所述一个或多个基因的表达类似于已经与对血管生成抑制剂的敏感性相关联的一个或多个基因的表达，则将患者选择为预测会受益于血管生成抑制剂的施用。在一个非限制性实施方案中，用于测试所述受试者或所述受试者的癌症对它的敏感性或抗性的血管生成抑制剂是内皮因子（CD105）抑制剂（例如，人源化的抗-内皮因子抗体）。在另一个实施方案中，用于测试所述受试者或所述受试者的癌症对它的敏感性或抗性的血管生成抑制剂是VEGF受体抑制剂或VEGF抑制剂。
IV. 功能试验
使用多种体外和体内方法，包括、但不限于本领域已知的那些和本文描述的那些，可以测试抗体及其抗原结合片段的多种功能。
测定CD105信号传递和功能的方法
CD105（内皮因子）是TGF-β受体家族的一个成员，其由增殖中的内皮细胞表达。内皮细胞增殖需要正常的CD105水平。CD105表达会被细胞低氧增加（通过低氧诱导因子-1-α（HIF-1-α）的生产），并保护低氧细胞免于细胞凋亡。CD105的作用是，调节TGF-β超家族的多种激酶受体复合物的信号传递，所述TGF-β超家族包括TGF-β受体（TGF-βR）、激活素受体-样激酶（ALK）和激活素受体。在没有CD105存在下，TGF-β受体的活化会导致SMAD蛋白的磷酸化，后者会抑制内皮细胞生长。但是，TGF-β对CD105的活化会调节SMAD蛋白磷酸化。最终结果是，TGF-β受体活化的生长抑制作用在内皮细胞上的释放。抗-CD105抗体对CD105活化的阻止，与TGF-β协同地起抑制内皮细胞生长的作用。TGF-β可以刺激在内皮细胞中具有相反作用的2种独特的I型受体/SMAD信号传递途径。TGF-β/ALK5信号传递途径（A）会导致细胞增殖和迁移的抑制，而TGF-β/ALK1途径（B）会诱导内皮细胞增殖和迁移。在血管生成过程中高度表达的CD105（一种辅助性的TGF-β受体）是ALK1信号传递所必需的。在没有CD105存在下，TGF-β/ALK5信号传递占优势，并维持静止的内皮。高CD105表达会刺激ALK1途径，并间接地抑制ALK5信号传递，从而促进血管生成的活化状态。
在一个非限制性实施方案中，本文提供的抗体和抗原结合片段会通过阻断TGF-β/ALK1信号传递途径来阻断血管生成。在另一个实施方案中，本文提供的抗体和抗原结合片段会通过阻止Smad1/5/8磷酸化和/或信号传递来阻断血管生成。CD105通过TGF-β/ALK1的信号传递来参与血管生成的促进，后者又涉及Smad2/3蛋白的磷酸化的减少和/或阻断。在另一个实施方案中，本文提供的抗体和抗原结合片段通过增强Smad2/3磷酸化和/或信号传递来阻断血管生成。用于测定本文提供的抗体和抗原结合片段对TGF-β/ALK1信号传递途径和/或Smad1/5的磷酸化的阻断或抑制作用的方法和技术包括、但不限于：已知的分子技术。作为实例，使用对TGF-β/ALK5或TGF-β/ALK1途径中的任一种蛋白特异性的抗体的蛋白印迹法，可以用于测定本文公开的抗体和抗原结合片段对TGF-β/ALK5或TGF-β/ALK1途径的抑制作用和/或刺激作用。类似地，在TGF-β/ALK5或TGF-β/ALK1途径中涉及的蛋白的mRNA的检测或mRNA的调节，可以用于测定本文公开的抗体和抗原结合片段的抑制作用和/或刺激作用。用于测定TGF-β/ALK5或TGF-β/ALK1途径的细胞信号传递的其它方法是本领域已知的，且在本文中预见到。
在一个非限制性实施方案中，可以关于抑制血管生成和内皮细胞增殖来评估所述抗体。抗-内皮因子抗体与HUVEC的结合不会阻止TGF-β与HUVEC的随后结合。因而，抗-内皮因子抗体对内皮细胞生长的直接抑制，代表在体内观察到的抗血管生成效应和肿瘤抑制效应的根本机制之一。在另一个实施方案中，可以关于阻断血管生成（通过阻止Smad1/5/8磷酸化和/或信号传递）来评估抗体。CD105通过TGF-β/ALK1的信号传递而参与促进血管生成，所述信号传递又涉及Smad2/3蛋白的磷酸化的减少和/或阻断。在另一个实施方案中，可以关于阻断血管生成（通过增强Smad2/3磷酸化和/或信号传递）来评估抗体。
用于测定本文提供的抗体对TGF-β/ALK1信号传递途径和/或Smad1/5的磷酸化的阻断或抑制作用的方法和技术包括、但不限于：已知的分子技术。作为实例，使用对TGF-β/ALK5或TGF-β/ALK1途径中的任一种蛋白特异性的抗体的蛋白印迹法，可以用于测定本文公开的抗-内皮因子抗体对TGF-β/ALK5或TGF-β/ALK1途径的抑制作用和/或刺激作用。类似地，在TGF-β/ALK5或TGF-β/ALK1途径中涉及的蛋白的mRNA的检测或mRNA的调节，可以用于测定本文公开的抗体的抑制作用和/或刺激作用。用于测定TGF-β/ALK5或TGF-β/ALK1途径的细胞信号传递的其它方法是本领域已知的，且在本文中预见到。
使用本领域公知的试验，通过例如结合试验诸如ELISA、竞争性ELISA、表面等离子体共振和对HUVEC细胞的影响（在下面更详细地描述），可以评估本文公开的抗-内皮因子抗体的活性。
测定细胞附着的方法
通过本领域技术人员已知的方法，可以测量细胞附着。以前已经描述了试验，参见例如，Lebrin, 等人, J. Clin. Invest 1997, 99:1390-1398。简而言之，可以使细胞附着在基质（即，ECM组分）上，所述基质在包被的孔上。通过洗涤，去除未附着的细胞，通过与BSA一起温育，阻断非特异性的结合位点。用结晶紫对附着的细胞染色，并通过在600 nm波长测量从附着的细胞洗脱的结晶紫的光密度，定量细胞附着。
测定细胞迁移的方法
细胞迁移试验已经被描述在文献中，例如，Brooks, 等人, J. Clin. Invest 1997, 99:1390-1398，用于测量细胞迁移的方法是本领域技术人员已知的。在本文所述的一种测量细胞迁移的方法中，用底物包被来自透明孔（Transwell）迁移室的膜，洗涤透明孔，并用BSA封闭非特异性的结合位点。收获来自分汇合培养物的肿瘤细胞，洗涤，并在有或没有试验抗体存在下重新悬浮于迁移缓冲液中。在允许肿瘤细胞迁移至包被的透明孔膜的下侧以后，去除剩余在膜上侧的细胞，并用结晶紫将迁移至下侧的细胞染色。然后通过每个显微场的直接细胞计数，定量细胞迁移。
SCID / 裸鼠
用于测定肿瘤生长的一种方法如下使用SCID小鼠：收获亚汇合的人M21黑素瘤细胞，洗涤，重新悬浮于无菌的PBS中（20 x 106/mL）。给SCID小鼠皮下地注射100µL M21人黑素瘤细胞（2 x 106）悬浮液。在肿瘤细胞注射以后3天，不治疗小鼠，或用一种或多种对照或实验组合物静脉内地或腹膜内地治疗小鼠（例如，100µg/小鼠）。每天治疗小鼠，持续24天。使用测径器测量肿瘤大小，并使用公式V = （L x W2）/2估测体积，其中V等于体积，L等于长度，W等于宽度。
用于测定肿瘤生长的一种方法如下使用裸鼠：将在50µl PBS中的MDA-MB-435肿瘤细胞（0.4×106细胞/小鼠）正位地植入雌性裸鼠（5-6周龄）的乳房脂肪垫中。当肿瘤达到大约50-80 mm3的平均体积时，将小鼠随机化（至少10只/组），并开始使用下述剂量的一种或多种抗体的静脉内或腹膜内治疗，每周2次：在100 μl PBS中的1µg（0.05 mg/kg）/剂、10µg（0.5 mg/kg）、100µg（5 mg/kg）或200µg（10 mg/kg）或100 μg对照抗体，或媒介物PBS 100µl。在有些研究中，也可以评价未治疗组。使用测径器测量肿瘤大小，并使用公式V = （L x W2）/2估测体积，其中V等于体积，L等于长度，W等于宽度。
BALB/c同源小鼠模型
或者，也可以使用BALB/c同源小鼠模型来评估肿瘤生长和本文所述抗体对肿瘤生长的抑制，如例如Tsujie等人, Int. J. Oncology, 29: 1087-1094（2006）所例证的。
嵌合小鼠
另一个试验测量嵌合小鼠:人小鼠模型中的血管生成，并被称作嵌合小鼠试验。所述试验已经由其他人进行了详细描述，并进一步已经在本文中描述用于测量血管生成、新生血管形成和肿瘤组织的消退。参见Yan, 等人（1993）J. Clin. Invest. 91:986-996。
嵌合小鼠试验是体内血管生成的有用的试验模型，因为移植的皮肤移植物在组织学上非常类似于正常的人皮肤，且整个组织的新生血管形成正在发生中，其中实际的人血管正在从移植的人皮肤生长进在移植的人皮肤的表面上的人肿瘤组织中。通过用人特异性的内皮细胞标志物对新血管系统的免疫组织化学染色，可以证实新生血管形成在人移植物中的起源。
嵌合小鼠试验会证实新生血管形成的消退，这基于新血管生长的量和消退程度。此外，可以容易地监测对移植在移植的皮肤上的任何组织（诸如肿瘤组织）的生长的影响。最后，所述试验是有用的，因为在所述试验系统中存在毒性的内部对照。将嵌合小鼠暴露于任何实验试剂，此后小鼠的健康会指示毒性。本文所述的和本领域已知的其它动物模型也可以用于本文所述的方法中。
兔眼试验
血管生成的另一种度量是体内兔眼模型，并被称作兔眼试验。所述兔眼试验已经由其他人进行了详细描述，并已经被用于测量在有血管生成抑制剂存在下的血管生成和新生血管形成，如D’Amato等人（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91（9）: 4082-4085所例证的。
兔眼试验是公认的体内血管生成的试验模型，因为通过眼的天然透明角膜，可以容易地观察新生血管形成过程，该过程由兔血管从角膜边缘向角膜中的生长来证实。另外，可以容易地随时间监测新生血管形成的刺激或抑制的程度和量或新生血管形成的消退。
最后，将兔暴露于任何实验试剂，此后兔的健康会指示实验试剂的毒性。
简而言之，进行鸡绒毛尿囊膜（CAM）试验，在植入含有一种或多种对照或实验化合物的0.5%羧甲纤维素团粒以后48小时，记录对发育中的脉管系统的影响。由植入的聚（甲基丙烯酸羟乙酯）的团粒（Hydron; Interferon Sciences, New Brunswick, NJ）诱导角膜新生血管化，所述团粒含有650 ng与硫糖铝（蔗糖硫酸铝; Bukh Meditec, Copenhagen）结合的有效的血管生成蛋白碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。硫糖铝向团粒中的添加，会保护bFGF免于降解，并提供它的缓慢释放，从而生成一致的侵袭性血管生成，其比单独的bFGF / Hydron诱导的血管生成更显著。在形成团粒以后多达4天，可以在体外检测到bFGF从含有硫糖铝/Hydron的团粒的释放，与此相比，对于只含有Hydron的团粒，仅1天。如下制备团粒：混合110µl含有12µg重组bFGF（Takeda, Osaka）的盐水和40 mg硫糖铝；将该悬浮液加入80µl在乙醇中的12% （wt/vol）Hydron中。然后将该混合物的等分试样（10µl）吸量到特氟隆椿（Teflon pegs）上，并允许干燥，生成大约17个团粒。
将团粒植入麻醉的雌性新西兰白兔的每只眼的角膜微袋中，离边缘2 mm，随后在角膜的表面上单次局部施用红霉素软膏。连续几天的组织学检查证实了角膜中向团粒的渐进性血管生长，仅观察到罕见的炎症细胞。使用全身辐照的严重免疫抑制不会改变该血管生成应答，只含有硫糖铝的团粒不会诱导血管生成。新血管主要由bFGF（而不是炎症）诱导。从植入以后2天，每天通过胃灌洗给动物饲喂悬浮于0.5% 羧甲纤维素中的一种或多种化合物或单独的媒介物。在即将植入团粒之前，免疫抑制的动物接受6辐射吸收剂量单位（Gy）的全身辐射6分钟。该剂量的辐射会导致显著的白血球减少，在第2天之前白细胞计数减少>80%，在第3天之前白细胞计数减少>90%，所述结果与以前的报道相一致。
相同的角膜专科医生（M.S.L.）每隔日以掩蔽方式用裂隙灯检查动物。通过用分划板测量血管离边缘的长度（L）和涉及的边缘的时钟小时数（C），确定角膜新生血管形成的面积。使用公式来确定环形带段的面积：C/12 x 3.1416 [r2 - (r - L)2]，其中r = 6 mm，即测量的兔角膜的半径。测量邻近团粒的新生血管形成的均匀连续带，因而，可以评估新生血管形成的总抑制。
小鼠基质胶塞血管生成试验
为了证实组合物对血管生成的影响，可以使用小鼠基质胶塞血管生成试验。将不同的生长因子（例如，IGF-1、bFGF或VEGF）（250 ng）和肝素（0.0025单位/mL）与以前所述的生长因子还原的基质胶相混合（Montesano, 等人, J. Cell Biol. 1983, 97:1648-1652; Stefansson, 等人, J. Biol. Chem. 2000, 276:8135-8141）。可以将本文所述的组合物或对照抗体包含在基质胶制品中，其中使用动物的一个或多个剂量组。在对照实验中，在没有生长因子存在下，制备基质胶。给小鼠皮下地注射0.5 mL基质胶制品，并温育1周。在温育时段以后，处死小鼠，通过外科手术取出聚合的基质胶塞。通过2种确定的方法（包括免疫组织化学分析和血红蛋白含量），定量在基质胶塞内的血管生成（Furstenberger, 等人, Lancet. 2002, 3:298-302; Volpert, 等人, Cancer Cell 2002, 2（6）:473-83；和Su, 等人, Cancer Res. 2003, 63:3585-3592）。对于免疫组织化学分析，将基质胶塞嵌入OCT中，快速冷冻，并制备4µm切片。在甲醇/丙酮（1:1）中固定冷冻的切片。用针对CD31的多克隆抗体，将冷冻的切片染色。通过在20高倍（200X）显微场内的微血管密度计数，定量血管生成。
可以如以前所述，定量血红蛋白含量（Schnaper, 等人, J. Cell Physiol. 1993, 256:235-246; Montesano, 等人, J. Cell Biol. 1983, 97:1648-1652; Stefansson, 等人, J. Biol. Chem. 2000, 276:8135-8141；和Gigli, 等人, J. Immunol. 1986, 100:1154-1164）。在干冰上快速冷冻基质胶植入物，并低压冻干过夜。将干燥的植入物重新悬浮于0.4 mL 1.0% 皂苷（Calbiochem）中1小时，并通过剧烈吸液来破碎。在14,000 X g离心制品15分钟，以去除任何颗粒。然后通过在405 nm测量吸光度，并与纯化的血红蛋白的标准浓度相对比，直接地测定上清液中的血红蛋白浓度。
测定肿瘤生长的方法
通过本领域技术人员已知的方法，例如，SCID小鼠模型、裸鼠模型和具有同源肿瘤的BALB/c小鼠，可以测定肿瘤生长。如下实现用于肿瘤生长的SCID小鼠模型：收获亚汇合的人M21黑素瘤细胞（或任意希望的肿瘤细胞类型），洗涤，并重新悬浮于无菌的PBS（20 x 106/mL）中。给SCID小鼠皮下地注射100µL M21人黑素瘤细胞（2 x 106）悬浮液。在肿瘤细胞注射以后3天，不治疗小鼠，或用在希望的剂量范围内的拮抗剂腹膜内地治疗小鼠。每天治疗小鼠，持续24天。使用测径器测量肿瘤大小，并使用公式V = （L x W2）/2估测体积，其中V等于体积，L等于长度，W等于宽度。
或者，也可以使用裸鼠模型、SCID小鼠模型和/或BALB/c同源小鼠模型来评估肿瘤生长和本文所述的人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段对肿瘤的抑制（Tsujie等人, Int. J. Oncology, 29: 1087-1094（2006））。
测定细胞增殖的方法
通过本领域技术人员已知的方法，可以测定细胞增殖。可以将本文所述的亚汇合的人内皮细胞（HUVEC）重新悬浮于含有低（5.0%）血清的增殖缓冲液（在有或没有来自ECV或ECVL细胞的CM（25µL）存在下）中，并允许内皮细胞增殖24小时。通过使用可商业得到的WST-1试验试剂盒（Chemicon）测量线粒体脱氢酶活性，可以定量增殖。另外，通过使用标准方法测量3H掺入（She等人, Int. J. Cancer, 108: 251-257（2004）），可以定量本文所述的增殖。
评估细胞增殖的其它方法是本领域已知的，且在本文中预见到。在实施例中更详细地描述了其它非限制性实例。
诱导CDC、ADCC和调理素作用的方法
不同的疗法已经指向增强身体对转化的细胞的天然免疫应答。常规的效应物方法包括补体依赖性的细胞溶解（“CDC”）、抗体依赖性的细胞的细胞毒性（“ADCC”）和吞噬作用（在免疫球蛋白包被靶细胞以后，网状内皮系统进行清除）。已知，在抗体存在下，某些效应细胞（诸如具有表面结合的、抗体Fc区的受体的淋巴样细胞）会介导针对靶细胞的抗体依赖性的细胞的细胞毒性（“ADCC”）反应。借助于ADCC，这些效应细胞发挥针对这样的靶细胞的细胞溶解活性。
已经在体外证实了两类ADCC反应。在经典的ADCC反应中，效应细胞结合到抗体包被的靶细胞上，随后造成靶细胞的细胞溶解（A. H. Greenberg等人, “Characteristics Of The Effector Cells Mediating Cytotoxicity Against Antibody-Coated Target Cells,”I., Immunology, 21,第719页（1975））。效应细胞和靶细胞之间的这种结合，源自包被靶细胞的抗体的Fc区和效应细胞的Fc受体之间的相互作用。这类ADCC反应的一个缺点是，它可受到循环的抗原-抗体复合物的阻碍，所述复合物经常与不同的疾病有关，它们与靶细胞结合的抗体竞争效应细胞的Fc受体（I. C. M. MacLennan, “Competition For Receptors For Immunoglobulin On Cytotoxic Lymphocytes,”Clin. Exp. Immunol., 10,第275页（1972））。由于经典的ADCC的这种缺点，已经提出第二类ADCC反应，即抗体指导的ADCC。在抗体指导的ADCC中，首先使靶物特异性的抗体与效应细胞结合，然后使得到的复合物通过抗体“指向”在靶细胞表面上的它的特异性抗原。有利地，抗体指导的ADCC可能不受在宿主系统中循环的抗原-抗体复合物的存在的影响。通过Fc区/Fc受体结合实现的抗体和效应细胞之间的相互作用通常较弱。并且，在某些情况下，抗体不会保持与效应细胞结合足以允许靶细胞裂解的时间段。考虑到该潜在的问题，必须使用聚乙二醇和邻苯二甲酸酯油混合物进行预处理，使抗体结合效应细胞（J. F. Jones和D. M. Segal, “Antibody-Dependent Cell Mediated Cytolysis (ADCC) With Antibody-Coated Effectors: New Methods For Enhancing Antibody Binding And Cytolysis,”J. Immunol., 125,第926-33页（1980））。但是，在抗体-效应细胞复合物上的任何聚乙二醇和邻苯二甲酸酯油残余物可能具有的对身体的毒效应，可能减少该方法用于体内治疗的适用性。
或者，已经提出了通过使用细胞毒性药物的辅助化学疗法来增强抗体指导的ADCC的方法（I. R. Mackay等人, “Effect On Natural Killer And Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Of Adjuvant Cytotoxic Chemotherapy Including Melphalan In Breast Cancer,”Cancer Immunol. Immunother., 16,第98-100页（1983））。用于测试ADCC的试验是本领域众所周知的，例如，美国专利号5,756,097。
因此，本发明提供了抗体（例如，人源化的抗-内皮因子抗体），所述抗体可以结合在新生血管形成或血管生成中起作用的细胞，或所述抗体可以增强所述细胞的吞噬作用和杀死，从而增强体内保护。也提供了具有相同效应的其它抗体和其功能片段，它们特异性地结合或优先结合这样的抗体可以结合的结合位点或表位，或可与其发生免疫反应。
本发明的抗体也可以是在新生血管形成或血管生成中起作用的细胞（例如，内皮细胞）的调理素，或表现出调理素活性。本领域技术人员会认识到，“调理素活性”表示调理素（通常是抗体或血清因子C3b）的下述能力：所述调理素结合抗原或细胞受体，以促进抗原或细胞受体与吞噬细胞的结合，并从而增强吞噬作用。当被调理素抗体包被时，某些细胞会变得对吞噬细胞（诸如嗜中性粒细胞和巨噬细胞）非常有吸引力，且它们从血流中的清除速率会显著增加。以例如在美国专利号6,610,293中所述的任意常规方式，可以测量调理素活性。
在另一个非限制性实施方案中，具有新生血管障碍或血管生成依赖性的障碍的患者会从血管生成脱落抗原/肽（例如，内皮因子）。这些抗原/肽可以是“肿瘤相关抗原”。可以给这样的患者全身地施用针对所述抗原/肽（例如，内皮因子）的抗体，且可以开始本文所述的任意途径，以诱导CDC、ADCC、调理素作用或任意其它形式的细胞介导的杀死。
V. 包装和试剂盒
在其它实施方案中，本申请涉及与上述化合物一起使用的试剂盒。可以在试剂盒中提供结合内皮因子的人源化抗体或抗原结合片段。所述试剂盒因而包括在合适的容器装置中的组合物，所述组合物包含结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段。所述试剂盒可以包括在合适的容器装置中的结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段。
所述试剂盒的容器装置通常包括至少一个管形瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其它容器装置，其中可以放置至少一种多肽，和/或优选地，适当地等分。所述试剂盒可以包括用于容纳至少一种融合蛋白、可检测部分、报告分子的装置和/或任意其它试剂容器，其在用于商业销售的密闭范围内。这样的容器可以包括注射剂和/或吹模制的塑料容器，其中保留希望的管形瓶。试剂盒也可以包括关于使用试剂盒中的物质的印制材料。
包装和试剂盒可以额外地包括在药物制剂中的缓冲剂、防腐剂和/或稳定剂。可以将试剂盒的每种组分包封在单个容器中，且所有不同的容器可以在单个包装内。可以将本发明的试剂盒设计成用于冷藏或室温贮存。
另外，所述制品可以含有稳定剂，以增加试剂盒的贮存期限，所述稳定剂包括，例如，牛血清白蛋白（BSA）。在低压冻干组合物的情况下，所述试剂盒可以含有其它溶液制品，以重构低压冻干的制品。可接受的重构溶液是本领域众所周知的，且包括，例如，药学上可接受的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
另外，本文提供的包装或试剂盒可以另外包括：本文提供的其它部分中的任一种，例如，一种或多种报告分子和/或一种或多种可检测部分/试剂。
包装和试剂盒可以另外包括：一种或多种用于试验（例如，ELISA试验）的组分。本申请中要测试的样品包括，例如，血液、血浆和组织切片和分泌物、尿、淋巴和它们的产物。包装和试剂盒可以另外包括：一种或多种用于收集样品的组件（例如，注射器、杯子、拭子等）。
包装和试剂盒可以另外包括：标签，所述标签指示例如产品描述、给药模式和/或治疗适应症。本文提供的包装可以包括本文所述的任意组合物。所述包装可以另外包括：用于治疗下述病症的标签：特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病（例如，黄斑变性、CNV、糖尿病视网膜病变）、糖尿病肾病、慢性炎性疾病（例如，IBD）、类风湿性关节炎、骨关节炎、癌症形式和它们的转移灶。
术语“包装材料”是指容纳试剂盒组分的物理结构。包装材料可保持成分无菌，并可由通常用于此目的材料（例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿等）制成。标签或包装说明书可包括适当的书面说明。因此，本发明的试剂盒还可包括标签或使用说明书，用于以本发明的任何方法使用试剂盒组分。试剂盒可包含处于包装或分散装置中的化合物，以及关于在本文所述的方法中施用所述化合物的说明书。
本发明另外提供了利用本文所述的诊断方法和试验的试剂盒。在有些实施方案中，根据本发明的试剂盒包含用于检测一个或多个基因的试剂，所述基因的表达水平已经与对来自患者的癌细胞样品中的血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联。在有些实施方案中，所述一个或多个基因选自VEGF、VEGF受体、HIF-1α、胎盘生长因子受体和CD105。在有些实施方案中，所述试剂盒包含VEGF。在有些实施方案中，所述试剂盒包含VEGF受体。在有些实施方案中，所述试剂盒包含HIF-1α。在有些实施方案中，所述试剂盒包含胎盘生长因子受体。在有些实施方案中，所述试剂盒包含CD105。在有些实施方案中，所述试剂盒包含VEGF、VEGF受体、HIF-1α、胎盘生长因子受体和CD105中的至少2种。在有些实施方案中，所述试剂盒包含至少2个已经与对血管生成抑制剂的敏感性相关联的基因。在有些实施方案中，所述试剂盒包含至少2个已经与对血管生成抑制剂的抗性相关联的基因。在有些实施方案中，所述试剂盒包含至少一个已经与对血管生成抑制剂的敏感性相关联的基因和一个已经与对血管生成抑制剂的抗性相关联的基因。
在其它实施方案中，根据本发明的试剂盒包含：用于检测来自待治疗的患者的肿瘤细胞样品中的VEGF、VEGF受体、HIF-1α、胎盘生长因子受体和CD105表达水平的试剂；和一个或多个剂量的抑制剂，包括但不限于本文所述的人源化的抗-内皮因子抗体或抗原结合片段，所述抑制剂在多种剂型中，诸如胶囊、囊片、凝胶帽、用于悬浮的粉末等。在本发明内另外预见到，含有用于检测来自待治疗的患者的肿瘤细胞样品中的VEGF、VEGF受体、HIF-1α、胎盘生长因子受体和CD105表达水平的试剂的试剂盒，另外包含试剂盒的任一个前述实施方案，用于与至少一种额外的血管生成抑制剂共同施用。
说明可包括用于实施本文所述的任何方法（包括治疗方法）的说明。说明还可包括对于满意的临床终点或可能发生的任何不良症状的指示，或管理机构如FDA对用于人患者要求的其它信息。
说明可以是在“印刷品”上，如在纸或薄纸板（在试剂盒中或附在试剂盒上）上，或在标签上，所述标签贴在试剂盒或包装材料上或粘贴在含有试剂盒组分的管形瓶或试管上。说明还可被包括在计算机可读介质上，例如磁盘(软盘或硬盘)、光学CD如CD-或DVD-ROM/RAM、磁带、电子储存介质如RAM和ROM、IC接头和它们的杂合体如磁/光储存介质。
本申请的化合物和方法的实施方案意图是例证性的，而不是限制性的。本领域技术人员考虑到上面的教导（特别是可能与抗体或抗原结合片段中的改变有关的那些，所述抗体或抗原结合片段结合在描述的修饰周围的内皮因子，同时在内皮因子的结合方面维持在功能上几乎天然的），可以做出修改和变化。因此，应当理解，可以在公开的具体实施方案中做出变化，它们仍然在描述的本发明的范围内。
实施例
参考下面的非限制性实施例，可以更好地理解本申请，所述实施例作为本申请的示例性实施方案而提供。提供下述实施例，以便更充分地例证本发明的实施方案，但是，不应解释为限制本申请的宽范围。尽管在本文中已经证实和描述了本申请的某些实施方案，显而易见，这样的实施方案仅作为实施例而提供。本领域技术人员可以做出许多变化、改变和置换，而不脱离本发明；应当理解，对本文所述的实施方案的不同改变可以用于实践本文所述的方法。
实施例1
抗-CD105人源化的和人源化的/去免疫化的抗体的制备和结合
抗体的构建、表达和纯化
使用一系列重叠的寡核苷酸，合成了所有人源化的和人源化的/去免疫化的VH和VK区域基因，将它们退火、连接，并进行PCR扩增，得到全长合成的V区域。然后将装配的变体直接地克隆进Antitope Ltd.的pANT表达载体系统中（对于IgG1重链和κ轻链而言）。
通过电穿孔，将人源化的重链和轻链的所有组合（即，共4对）和人源化的/去免疫化的重链和轻链的所有组合（即，共24对）稳定地转染进NS0细胞中，并使用200 nM甲氨蝶呤（Sigma目录号M8407）进行选择。使用IgG1 ELISA，测试每种构建体的甲氨蝶呤抗性菌落的IgG表达水平。选择最好的表达系，并在液氮下冷冻。对于所有变体，实现了成功的转染和克隆选择，人源化的和人源化的/去免疫化的抗体变体在饱和的静置培养物中的表达水平如表1所示。
然后，在蛋白A琼脂糖柱（GE Healthcare目录号110034-93）上从NS0细胞培养上清液中纯化出24种IgG1变体，并使用消光系数Ec（ 0.l% ）= 1.62（基于预测的氨基酸序列），通过OD280nm进行定量。纯化出大约500µg每种抗体变体，并通过还原性SDS-PAGE，分析先导变体。简而言之，对先导抗体变体的还原性SDS-PAGE凝胶进行考马斯蓝染色。将1µg每种样品装载上NuPage 4-12% Bis-Tris凝胶（Invitrogen目录号NP0322BOX），并在200 V泳动30分钟。标志物是Bio-Rad Precision +（目录号161-073）。观察到与重链和轻链的预测大小相对应的条带，在任何泳道中没有任何污染的迹象（数据未显示）。
ELISA 方法
使用ELISA来测定人源化的和人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体与内皮因子的结合。简而言之，根据下述步骤，进行ELISA：
1. 以100 μl/孔，用MAB9811-01（多克隆抗-内皮因子抗体，在PBS中，1500 ng/ml）包被Nunc Maxisorp平板。用密封器覆盖平板，并在4 ℃温育过夜（16-24小时）。
2. 用200 μL PBS（没有吐温）洗涤平板2次。
3. 加入200 μl/孔的BSA封闭溶液（1% BSA），并在室温温育60分钟。
4. 使用BioTek平板洗涤器，用含有吐温的PBS（PBS-T）洗涤平板3次。
5. 加入100 μl/孔的CD105（R&D Systems目录1097-EN，在含有0.1% BSA的PBS-T中，100 ng/ml），并在室温温育60分钟。
6. 使用BioTek平板洗涤器用PBS-T洗涤平板3次。
7. 在实验孔中：加入100 μl/孔的在20、10、4、2、1、0.5和0.2 ng/ml（在含有0.1% BSA的PBS-T中稀释）的抗-内皮因子抗体，并在室温温育60分钟。在阴性对照孔中：加入100 μl/孔的同种型匹配的对照抗体。
8. 使用BioTek平板洗涤器用PBS-T洗涤平板3次。
9. 向所有孔中加入100 μl/孔的与HRP（Jackson Immunoresearch）缀合的山羊抗-人IgG（在含有0.1% BSA的PBS-T中1:10000稀释）；在室温温育30-60分钟。
10. 使用BioTek平板洗涤器用PBS-T洗涤平板5次。
11. 加入100 μl/孔的TMB底物溶液，并在暗处无遮盖地温育15分钟。
12. 通过加入100 μl/孔的TMB停止溶液，停止反应。
一式三份地运行样品，并读出光密度，以构建标准曲线，并测定结合常数。使用Student氏t-检验或另一种标准检验，进行统计分析。
竞争 ELISA
在竞争ELISA中，相对于生物素化的嵌合的抗-CD105，测试了所述抗体与CD105的结合。简而言之，按照生产商的说明书，使用微-生物素化试剂盒（Sigma, 目录号BTAG-1KT），生物素化嵌合的抗-CD105。用在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的1.5µg/mL的小鼠抗-人CD105（Southern Biotechnologies, 目录号9811-01），在4 ℃包被Nunc Immuno MaxiSorp 96-孔平底微孔滴定板过夜。次日，将在PBS/2% BSA中的100 ng/ml人CD105（R&D Systems, 目录号1097-EN）加入预包被的平板中，并在室温温育1小时。将不同浓度的嵌合的、人源化的或人源化的/去免疫化的抗-CD105抗体（4µg/mL至0.0018µg/mL，3倍稀释度）与固定浓度的生物素化的嵌合的抗-CD105抗体（6.25 ng/ml）相混合，并加入平板中。通过抗生蛋白链菌素-HRP（Sigma, 目录号S5512）和TMB底物（Sigma, 目录号T0440），检测生物素化的嵌合抗体的结合。在Dynex MRX TCII平板读数器上，测量OD450 nm值。竞争分析的结果如图7和8所示。通过吸光度相对于样品浓度对数的每个图的直线部分，拟合曲线，并使用所述直线的方程式，计算使生物素化的嵌合抗体与CD105的结合抑制50%所需的人源化的或人源化的/去免疫化的抗体的浓度（IC50）。为了便于在实验内和实验之间的对比，相对于在每个平板上包括的参照抗体，将人源化的或人源化的/去免疫化的变体的IC50值标准化，得到差异倍数值。IC50值是相对于嵌合的抗-CD105，且代表3个实验。总结的ELISA数据显示在表1中，并包括在饱和的静置培养物中测得的抗体表达水平（µg/ml）。
构建体 相对IC50 表达水平（µg/ml） 去免疫水平
VK1VH1 1.51 10.2 n/a
VK1VH2 1.15 12.9 n/a
VK2VH1 0.93 11.1 n/a
VK2VH2 1.19 15.8 n/a
VK2AAVH1A 0.79 10.8 ++++
VK2AAVH1A2 0.99 6.6 ++++++
VK2AAVH1Q 0.76 7.5 +++++
VK2AAVH1R 0.61 10.0 +++++
VK2AAVH1S 1.27 9.7 ++++
VK2ASVH1A 1.41 6.6 +++
VK2ASVH1A2 0.85 5.9 +++++
VK2ASVH1Q 1.04 8.7 ++++
VK2ASVH1R 1.02 7.9 ++++
VK2ASVH1S 1.31 8.8 +++
VK2SAVH1A 0.49 7.5 +++
VK2SAVH1A2 0.84 10.3 +++++
VK2SAVH1Q 0.87 11.5 ++++
VK2SAVH1R 0.77 8.8 ++++
VK2SAVH1S 0.96 34.6 +++
VK2SSVH1A 1.06 9.7 ++
VK2SSVH1A2 1.03 17.4 ++++
VK2SSVH1Q 1.21 14.7 +++
VK2SSVH1R 0.62 13.7 +++
VK2SSVH1S 1.21 16.2 +++
VK1AAVH1A 2.52 6.9 ++++
VK1AAVH1A2 1.12 13.5 ++++++
VK1AAVH1Q 1.30 7.6 +++++
VK1AAVH1R 1.05 11.5 +++++
表1. 人源化的和人源化的/去免疫化的抗体变体的特征。IC50值是相对于嵌合的抗-内皮因子抗体，且代表3个实验。在饱和的静置培养物中测定抗体表达水平（µg/ml）。基于突变的表位的位置，用任意比例尺表示去免疫水平。
实施例2
人源化的和人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体结合的BIAcore（表面等离子体共振: SPR）分析
使用例如BIAcore分析，使用标准的方案，可以评估抗体的亲和力。简而言之，将蛋白A化学偶联至BIAcore CM5芯片上，其中固定化的蛋白A的量对应着~2000 RU。使用10 Hz数据收集速率，在10mM HEPES、150 mM NaCL、3 mM EDTA、0.05% TWEEN的运行缓冲液pH = 7.4中，在25摄氏度，进行后续步骤。以10 uL/min流速，用固定化在BIAcore芯片上的蛋白A捕获抗-内皮因子抗体（10 nM）：通常，20、40和80秒的捕获时间允许捕获分别与130 RU、330RU和570 RU相对应的抗体密度。使用运行缓冲液进行启动循环，流速为40 uL/min，接触时间为90秒，解离时间为90秒。使用浓度范围为0-40 nM的重组内皮因子进行样品循环。使内皮因子穿过含有捕获的抗体的BIAcore芯片，流速为40 uL/min，接触时间为525秒，解离时间为2500秒。在每个抗体捕获密度，通常进行8个样品循环。使用10mM甘氨酸pH = 1.7，进行芯片的再生。使用BIAcore T100评价软件v1.1，进行数据分析。对比使用含有不同的捕获的抗体密度的BIAcore芯片产生的信号，并使用在没有重组内皮因子存在下产生的数据来调节试验内的空白信号。为了拟合数据，允许Rmax浮动，以补偿每个循环中的每种抗体的捕获水平的变化。在分析每种抗体的过程中，同时拟合来自每种捕获密度的数据。嵌合的、人源化的和人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的BIAcore数据显示在表2中，包括ka（1/Ms）、kd（1/s）、KD（M）和Chi2（RU2）。
Figure 976265DEST_PATH_IMAGE002
表2. 嵌合的抗-内皮因子抗体、人源化的抗-内皮因子抗体VK1VH1和人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体VK1AAVH1R、VK1AAVH1Q和VK1AAVKVH1A2的BIAcore结合数据。
实施例3
抗体亲合力和在表达内皮因子的细胞上可利用的表位的数目
使用斯卡恰特作图分析，使用标准方案，可以评估抗体亲合力和在表达内皮因子的细胞上可利用的表位的数目。
简而言之，进行放射性标记的人源化的抗-内皮因子抗体与表达内皮因子的KM-3白血病细胞和亚汇合的增殖中的HUVEC的直接结合的斯卡恰特作图分析。使用Iodo-Gen，并根据本领域技术人员已知的标准方法，用125I单个地放射性地标记纯化的抗-内皮因子抗体。关于每个IgG分子中的平均碘原子数，测定放射性标记的人源化的抗-内皮因子抗体。使用固定量（0.1 μg）的每种125I-标记的mAb和2倍系列增量的表达内皮因子的HUVEC细胞，进行滴定实验，以测定抗原结合活性。根据已知的方法，进行结合数据的斯卡恰特作图分析。通过该分析，估测平衡常数和每个细胞结合的mAb的平均最大数目。
实施例4
抗-内皮因子抗体活性的蛋白印迹试验
通过蛋白印迹，可以测试人源化的抗-内皮因子抗体的改变表达CD105的增殖的内皮细胞中的细胞内信号传递的能力，以检测在CD105信号传递途径中涉及的蛋白的磷酸化。
根据已知的蛋白印迹技术，在未转染的内皮细胞中进行蛋白印迹分析，以鉴别磷酸化的Smad1/5/8或Smad2/3。使用针对磷酸化的Smad1、Smad2、Smad5、Id1（Santa Cruz）和内皮因子的第一抗体，检测样品中的分子。通过增强的化学发光（ECL），进行检测。
实施例5
HUVEC生长的抑制和3H-胸苷掺入试验
许多试验可用于评估细胞生长的抑制。
在一个实施例中，在含有补充物（Lonza-Clonetics，包含5% 胎牛血清）的EBM2培养基中，培养HUVEC细胞系E6/E7 P3-17。在CO2培养箱中，在37 ℃，在亚汇合的条件下，在75-cm2烧瓶（Falcon, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ）中培养细胞。通过用汉克平衡盐溶液（含有15 mM EDTA，在25 mM HEPES缓冲液pH=7.3中）在37 ℃温育15 min，使细胞脱离。用冰冷的PBS洗涤2次以后，以25,000细胞/mL的浓度，将细胞重新悬浮于内皮细胞生长培养基中。在其它实验中，在不含有FBS和牛脑提取物的内皮细胞生长培养基中，悬浮和培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。将含有2,500个细胞的细胞悬浮液的200 μl等分试样接种至96-孔培养板的每个孔中。在CO2培养箱中在37 ℃培养细胞过夜，然后一式三份地加入100 ug/mL人源化的抗-内皮因子抗体VK1AAVH1A2、对照IgG或PBS。将培养板在培养箱中保持72小时，在这期间，每24小时更换新鲜培养基和人源化的抗-内皮因子抗体、对照IgG或PBS。将3H-胸苷（1 μCi）加入每个孔中，将平板温育20小时。用PBS洗涤细胞，随后用100 μl/孔的胰蛋白酶-EDTA（0.05% 胰蛋白酶, 0.53 mM EDTA）在37 ℃处理15 min。使用Harvester 96（TOMTEC, Hamden, CT），将细胞收获到玻璃纤维过滤器（Wallac Printed FiltermatA）上，并在Trilux 1540 MicroBeta液体闪烁和发光计数器（Wallac, Turku, 芬兰）中测定3H-放射性。在第二个实施例中，使用的细胞是HUVEC细胞的原代培养物（HUVEC 2517C），与抗体对照和PBS相比，人源化的TRC105抗体抑制了HUVEC细胞系E6/E7和原代HUVEC培养物（源自单个供体的HUVEC 2517C）的生长（表3）。
E6/E7细胞
条件 每分钟的平均计数 标准差 相对于PBS的抑制百分比
PBS 18320 173 --
对照IgG 18061 172 0.9
嵌合的 14452 1348 20.7
人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体VK1AAVH1A2 14025 983 23.1
表3. 人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体VK1AAVH1A2对人内皮细胞生长的抑制。
实施例6
抗-内皮因子抗体的细胞迁移抑制试验
使用博伊登室来测量迁移（化学激活），作为细胞增殖和活化的度量。
简而言之，如下评估细胞迁移：在4℃用纤连蛋白包被Costar核孔滤纸（8 mm孔）过夜。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤该室，用DMEM（有或没有血清，有或没有TGF-β3）填充下室。用胰蛋白酶处理细胞，并以50,000细胞/ml的终浓度悬浮于含有抗-内皮因子抗体的DMEM中。将细胞悬浮液的150 μl等分试样加入上室中，并在37 ℃温育。在16小时以后，洗涤细胞，擦干上表面，以去除未迁移的细胞。在甲醇中固定膜，用水洗涤，染色，并计数在下表面上存在的细胞的数目。
实施例7
人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的ADCC试验
使用例如下述的方案，可以关于它们的结合IL-2活化的天然杀伤（NK）细胞和诱导HUVEC的抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性（ADCC）的能力，评估本文所述的抗-内皮因子抗体。
NK 分离和 IL-2 活化的 NK 细胞的产生
分离外周血单核细胞（PBMC），并在含有10% FBS的RPMI中在4 ℃静置24小时。然后将PBMC放入含有2% FBS的RPMI中（总体积= 50 mL），将10mL细胞悬浮液在培养皿中铺平板。在37 ℃温育PBMC 2小时，收集未贴壁的细胞。以8 X 106/mL，用1000 U/mL的IL-2培养NK细胞48小时，随后正常培养5-8天，然后用于ADCC试验中。
细胞毒性和 ADCC 试验
从培养物中刮出NK细胞，并收集在50mL锥形管中。用RPMI完全培养基洗涤细胞1次，并在1200 rpm离心10分钟。然后将NK细胞重新悬浮于5mL RPMI完全培养基中，并计数。在进行试验之前，将NK细胞计数标准化为10:1的效应物:靶物之比。将标准化的NK细胞铺平板，并将10 μL抗-内皮因子抗体加入指定的孔中，在37 ℃温育30分钟。对照样品包括未处理的或对照抗体处理过的细胞群体。一式三份地测试所有样品和对照。
收集目标靶细胞（HUVEC细胞），洗涤，在1200 rpm离心10分钟，并重新悬浮于5 mL RPMI完全培养基中。再次洗涤靶细胞，并重新悬浮于无血清的RPMI中，至1 x 106细胞/mL的终浓度。然后用终浓度为5ug/mL的钙黄绿素AM在37℃标记靶细胞1小时，随后用RPMI完全培养基洗涤2次。然后重新悬浮靶细胞，并加入NK细胞孔中。在37℃温育靶细胞/NK细胞组合4小时。温育以后，在1200 rpm离心平板5分钟，洗涤细胞，并重新悬浮于DPBS中。使用450/530 nm的激发/发射，读出荧光，所述发射是由抗体介导的细胞杀死的度量。计算出平均荧光强度和标准差，并用于根据下式计算% ADCC：
% ADCC = 100% * [（f样品-f培养基）-（f同种型对照-fTriton）]，
其中：
f样品= 含有抗-内皮因子抗体的孔中的平均荧光
f培养基= 含有无抗体培养基的孔中的平均荧光
f同种型对照= 含有同种型对照IgG的孔中的平均荧光
fTriton = 含有Triton去污剂（用于裂解靶细胞）的孔中的平均荧光
人源化的/去免疫化的抗体VK1AAVH1A2表现出HUVEC的剂量依赖性的ADCC，其显著大于同种型对照抗体（表4A和4B）。应当指出，用来自单独供体的NK细胞进行在表4A和4B中总结的实验。
实验条件 HUVEC的ADCC（%） 标准差
同种型对照（2 ug/mL） 3.4 4.7
VK1AAVH1A2（0.4 ug/mL） 14.6 2.1
VK1AAVH1A2（0.08 ug/mL） 14.6 2.1
VK1AAVH1A2（0.016 ug/mL） 12.6 4.1
VK1AAVH1A2（0.0032 ug/mL） 8.4 4.1
VK1AAVH1A2（0.00064 ug/mL） 7.6 2.0
表4A. 人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体VK1AAVH1A2相对于同种型匹配的对照IgG对HUVEC细胞的ADCC。
实验条件 HUVEC的ADCC（%） 标准差
同种型对照（2 ug/mL） 21.4 2.5
VK1AAVH1A2（2.0 ug/mL） 44.8 4.2
VK1AAVH1A2（0.4 ug/mL） 38.5 7.7
VK1AAVH1A2（0.08 ug/mL） 31.5 3.2
VK1AAVH1A2（0.016 ug/mL） 23.3 8.0
VK1AAVH1A2（0.0032 ug/mL） 21.2 5.8
表4B. 人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体VK1AAVH1A2相对于同种型匹配的对照IgG对HUVEC细胞的ADCC。
实施例8
人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体对脉络膜新生血管形成的鼠模型的影响
可以在脉络膜新生血管形成的鼠模型中评估人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的影响。
简而言之，用盐酸氯胺酮（100 mg/kg）麻醉4-5周龄的C57BL/6小鼠，用1% 托吡卡胺（Alcon Laboratories, Inc Fort Worth, TX）扩大瞳孔。使用视网膜凝固器和便携式盖玻片（作为接触镜）的裂隙灯递送系统（OcuLight;Iridex, Mountain View, CA），将3次532-nm二极管激光光凝术烧伤（75-pm斑点大小，01-秒持续时间，120 mW）递送至每个视网膜。在视网膜的后极的9、12和3点钟位置进行烧伤。在发射激光时气泡的产生（这指示布鲁赫膜的破裂），是得到脉络膜新生血管形成（CNV）的一项重要因素；因而，在该研究中仅包括在其中产生气泡的烧伤。
进行了4项独立实验，以研究在布鲁赫膜破裂以后第0天时眼内注射的影响。给第1组小鼠的一只眼施用约0.5至约5 μg抗-内皮因子抗体或抗原结合片段在1 μL PBS中的眼内注射液，给另一只眼施用1 μL PBS，给第2组小鼠的一只眼施用约1.5至约10 μg抗-内皮因子抗体或抗原结合片段在1 μL PBS中的眼内注射液，给另一只眼施用1 μL PBS。给第3组小鼠的一只眼施用约5至约25 μg抗-内皮因子抗体或抗原结合片段的眼内注射液，给另一只眼施用1 μL PBS。第4组的双眼接受PBS。
14天以后，麻醉小鼠，灌注荧光素-标记的葡聚糖（2 x l06平均分子量, Sigma-Aldrich），并准备脉络膜展平计数。简而言之，取出眼，在10% 磷酸盐缓冲的福尔马林中固定1小时，并取出角膜和晶状体。从视杯小心地解剖整个视网膜，从视杯的边缘向在所有4个象限中的赤道做出放射状切口，将视网膜展平固定在水性封固介质（Aquamount; BDH, Poole, UK）中。通过荧光显微术（Axioskop; Carl Zeiss Meditec,Thornwood, NY），检查展平计数，并用3电荷耦合器件（CCD）彩色摄像机（1K-TU40A, Toshiba, Tokyo, Japan）对图像数字化。使用帧接收器图像-分析软件来测量每个CNV病灶的面积。对于多次对比，使用具有Dunnett氏校正的ANOVA进行统计对比。
实施例9
在移植到SCID小鼠中的人皮肤中进行的人乳腺癌肿瘤的抗血管生成疗法
可以关于它们对在移植到SCID小鼠中的人皮肤中预形成的人乳腺癌肿瘤的抗血管生成作用，评估本文所述的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的作用。
简而言之，当移植物没有表现出炎症、收缩或排斥的征象时，将MCF-7细胞（8 x 106细胞，在0.1 ml PBS中）真皮内地移植到人全层皮肤（其移植入SCID小鼠中）中。在出现明显的可触知的肿瘤（在大多数情况下，直径为3-6 mm）之前，不治疗小鼠。将具有明显肿瘤的小鼠分组，用于治疗研究。用含有小鼠血清白蛋白（0.05% 终浓度）的无菌PBS，稀释人源化的/去免疫化的抗-内皮因子单克隆抗体（mAb）和同种型匹配的对照IgG。对于抗体疗法，通过小鼠的尾静脉，静脉内地（i.v.）施用1-20 mg/kg抗-内皮因子抗体或对照IgG。每2-3天进行给药。
在治疗期间，每天监测小鼠的肿瘤大小和发病率。使用电子天平（OHAUS™GT210型），每周称量小鼠2次。使用OptoDemo™软件（Fowler Co.），使用与电脑相连的电子测径器（PRO-MAX 6英寸测径器; Fowler Co., Newton, Mass.），每周测量肿瘤大小3次。使用下式，将测量的肿瘤直径转化成肿瘤体积：V=长度x宽度x高度x pi/6。使用Student氏t-检验，进行数据的统计分析，用于对比不同的小鼠组。
实施例10
卵巢癌的小鼠模型
为了测定人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段的治疗卵巢癌的能力，可以在SCID或裸鼠中使用卵巢癌细胞系。
简而言之，将卵巢癌细胞植入SCID或裸鼠中，以产生卵巢肿瘤。通过静脉内施用递增剂量（从1.8 mg/kg体重开始）的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体或对照IgG，治疗携带建立的肿瘤的小鼠组。每周进行治疗2或3次。可以在一些或所有组中使用VEGF抑制剂和/或其它抗癌剂。监测小鼠，并测量肿瘤生长，每周2或3次。
实施例11
结直肠癌的小鼠模型
为了测定人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段的治疗结直肠癌的能力，可以在SCID、裸鼠或免疫感受态小鼠中使用结直肠癌细胞系。
简而言之，将结直肠癌细胞植入SCID、裸鼠或免疫感受态小鼠中，以产生结肠直肠肿瘤。通过静脉内施用递增剂量（从1.8 mg/kg体重开始）的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体或对照IgG，治疗携带建立的肿瘤的小鼠组。每周进行治疗2或3次。可以在一些或所有组中使用VEGF抑制剂和/或其它抗癌剂。监测小鼠，并测量肿瘤生长，每周2或3次。通过标准的成像试验，包括PET和超声，可以对肿瘤成像。可以外植治疗过的肿瘤，以通过免疫组织化学评估细胞内信号传递途径或血管分布。
实施例12
肾癌的小鼠模型
为了测定人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段的治疗肾癌的能力，可以在SCID或裸鼠中使用肾癌细胞系。
简而言之，将肾癌细胞植入SCID或裸鼠中，以产生肾肿瘤。通过静脉内施用递增剂量（从1.8 mg/kg体重开始）的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体或对照IgG，治疗携带建立的肿瘤的小鼠组。对于前3次注射，以3天间隔进行治疗，对于第四次注射，以7天间隔进行治疗。可以在一些或所有组中使用VEGF抑制剂和/或其它抗癌剂。监测小鼠，并每周通过处死动物来测量肿瘤生长。
实施例13
骨髓瘤的小鼠模型
为了测定人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段的治疗骨髓瘤的能力，可以在SCID或裸鼠中使用骨髓瘤细胞系。
简而言之，将骨髓瘤癌细胞植入SCID或裸鼠中，以产生骨髓瘤肿瘤。通过静脉内施用递增剂量（从1.8 mg/kg体重开始）的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体或对照IgG，治疗携带建立的肿瘤的小鼠组。每周进行治疗2或3次。可以在一些或所有组中使用VEGF抑制剂和/或其它抗癌剂。监测小鼠，并测量肿瘤生长，每周2或3次。
实施例14
肉瘤的小鼠模型
为了测定人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段的治疗肉瘤的能力，在SCID或裸鼠中使用肉瘤细胞系。
简而言之，将肉瘤癌细胞植入SCID或裸鼠中，以产生肉瘤肿瘤。通过静脉内施用递增剂量（从1.8 mg/kg体重开始）的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体或对照IgG，治疗携带建立的肿瘤的小鼠组。每周进行治疗2或3次。可以在一些或所有组中使用VEGF抑制剂和/或其它抗癌剂。监测小鼠，并测量肿瘤生长，每周2或3次。
实施例15
乳腺癌的小鼠模型
为了测定人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的治疗乳腺癌的能力，在SCID或裸鼠中使用乳腺癌细胞系。
简而言之，将乳腺癌细胞植入SCID或裸鼠中，以产生乳腺肿瘤。通过静脉内施用递增剂量（从1.8 mg/kg体重开始）的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体，治疗携带建立的肿瘤的小鼠组。给对照动物施用对照IgG。每周进行治疗2或3次。可以在一些或所有组中使用VEGF抑制剂和/或其它抗癌剂。监测小鼠，并测量肿瘤生长，每周2-3次。
实施例16
结直肠癌的联合治疗临床试验
该实施例描述了随机化的、盲性的、安慰剂对照的、多中心的、II期研究，所述研究被设计为提供人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体在结直肠癌患者中的安全性和效能的初步评估。招募了大约为约100至约800位患者，将约50至约400位患者分配至治疗组，将约50至约400位患者分配至安慰剂组。所述试验包括：每1、2或3周，静脉内施用重复剂量的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体（约0.1至约20 mg/kg）或安慰剂，持续6-10个循环。可以在所有组中使用VEGF抑制剂和/或其它抗癌剂。估测的研究时间范围是约6个月至约5年，在初步研究结束时，如指示的对应答者进行后续疗法。额外的结果度量如下：
主要结果度量：总应答率。研究的一个目标是证实，人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体使无进展存活增加了35%。
可以评估的次要结果度量包括：总应答率、应答持续时间、总存活率、严重的和不严重的不利事件。例如，治疗可以阻止疾病的进展（即，停滞），或可以导致改善。替代地或额外地，可以关于下述的一项或多项，测量其它目的：肿瘤负荷减小、血管形成减少、副作用减少、不良反应减少和/或患者顺应性增加。
实施例17
骨髓瘤的联合治疗临床试验
该实施例描述了随机化的、盲性的、安慰剂对照的、多中心的、II期研究，所述研究被设计为提供在骨髓瘤患者中组合人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体和硼替佐米的安全性和效能的初步评估。招募了大约为约100至约800位患者，将约50至约400位患者分配至治疗组，将约50至约400位患者分配至安慰剂组。所述试验包括：每1、2或3周，静脉内施用重复剂量的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体（约1至约20 mg/kg）或安慰剂，与此相组合，每周施用约1.3 mg/kg的硼替佐米。估测的研究时间范围是约6个月至约5年，在初步研究结束时，如指示的对应答者进行后续疗法。额外的结果度量如下：
主要结果度量：总应答率。研究的一个目标是证实，总应答率从使用硼替佐米+ 安慰剂时的约40%增加至使用硼替佐米+ 人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体时的约60%（或更高）。
可以评估的次要结果度量包括：应答持续时间、无进展存活、总存活率、严重的和不严重的不利事件。例如，治疗可以阻止疾病的进展（即，停滞），或可以导致改善。替代地或额外地，可以关于下述的一项或多项，测量其它目的：肿瘤负荷减小、血管形成减少、副作用减少、不良反应减少和/或患者顺应性增加。
实施例18
肾癌的联合治疗临床试验
该实施例描述了随机化的、盲性的、安慰剂对照的、多中心的、II期研究，所述研究被设计为提供在具有肾细胞癌（肾癌）的患者中组合人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体和舒尼替尼（Sutent®）的安全性和效能的初步评估。招募了大约为约100至约800位患者，将约50至约400位患者分配至治疗组，将约50至约400位患者分配至安慰剂组。所述试验包括：每1、2或3周，静脉内施用重复剂量的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体（约0.1至约20 mg/kg）或安慰剂，与此相组合，每天施用约5至约50 mg的舒尼替尼，持续4周，在重复4周剂量循环之前停药2周。估测的研究时间范围是约6个月至约5年，在初步研究结束时，如指示的对应答者进行后续疗法。额外的结果度量如下：
主要结果度量：无进展存活。研究的一个目标是证实，无进展存活从舒尼替尼+ 安慰剂组中的约9-13个月增加至舒尼替尼+ 人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体组中的约14-18个月（或更多）。
可以评估的次要结果度量包括：应答率、应答持续时间、肿瘤进展时间、总存活率、严重的和不严重的不利事件。例如，治疗可以阻止疾病的进展（即，停滞），或可以导致改善。替代地或额外地，可以关于下述的一项或多项，测量其它目的：肿瘤负荷减小、血管形成（vascularity）减少、副作用减少、不良反应减少和/或患者顺应性增加。
实施例19
肝细胞癌的联合治疗临床试验
该实施例描述了随机化的、盲性的、安慰剂对照的、多中心的、II期研究，所述研究被设计为提供在具有肝细胞癌（肝癌）的患者中组合人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体和索拉非尼（NEXAVAR®）的安全性和效能的初步评估。招募了大约为约100至约800位患者，将约50至约400位患者分配至治疗组，将约50至约400位患者分配至安慰剂组。所述试验包括：每1、2或3周，静脉内施用重复剂量的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体（约0.1至约20 mg/kg）或安慰剂，与此相组合，每天施用约400mg的索拉非尼，持续3-6个循环，或直到进展。估测的研究时间范围是约6个月至约5年，在初步研究结束时，如指示的对应答者进行后续疗法。额外的结果度量如下：
主要结果度量：无进展存活。研究的一个目标是证实，无进展存活从索拉非尼+ 安慰剂组中的约3-9个月增加至索拉非尼+ 人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体组中的约6-12个月（或更多）。
可以评估的次要结果度量包括：应答持续时间、肿瘤进展时间、总存活率、严重的和不严重的不利事件。例如，治疗可以阻止疾病的进展（即，停滞），或可以导致改善。替代地或额外地，可以关于下述的一项或多项，测量其它目的：肿瘤负荷减小、血管形成减少、副作用减少、不良反应减少和/或患者顺应性增加。
实施例20
肾癌的联合治疗临床试验
该实施例描述了随机化的、盲性的、安慰剂对照的、多中心的、II期研究，所述研究被设计为提供在具有肾细胞癌（肾癌）的患者中组合人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体和贝伐单抗（阿伐他汀®）的安全性和效能的初步评估。招募了大约为约100至约800位患者，将约50至约400位患者分配至治疗组，将约50至约400位患者分配至安慰剂组。所述试验包括：每1、2或3周，静脉内施用重复剂量的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体（约0.1至约20 mg/kg）或安慰剂，与此相组合，每2周静脉内地施用约7.5、约10或约15 mg/kg的贝伐单抗。估测的研究时间范围是约6个月至约5年，在初步研究结束时，如指示的对应答者进行后续疗法。额外的结果度量如下：
主要结果度量：无进展存活。研究的一个目标是证实，无进展存活从贝伐单抗+ 安慰剂组中的约8-12个月增加至贝伐单抗+ 人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体组中的约13-18个月（或更多）。
可以评估的次要结果度量包括：总应答率、应答持续时间、肿瘤进展时间、总存活率、严重的和不严重的不利事件。例如，治疗可以阻止疾病的进展（即，停滞），或可以导致改善。替代地或额外地，可以关于下述的一项或多项，测量其它目的：肿瘤负荷减小、血管形成减少、副作用减少、不良反应减少和/或患者顺应性增加。
实施例21
卵巢癌的联合治疗临床试验
该实施例描述了随机化的、盲性的、安慰剂对照的、多中心的、II期研究，所述研究被设计为提供在具有卵巢癌的患者中组合人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体和Doxil®的安全性和效能的初步评估。招募了大约为约100至约800位患者，将约50至约400位患者分配至治疗组，将约50至约400位患者分配至安慰剂组。所述试验包括：每1、2或4周，静脉内施用重复剂量的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体（约0.1至约20 mg/kg）或安慰剂，与此相组合，每4周1次地施用约5至约50 mg/m2的Doxil。估测的研究时间范围是约6个月至约5年，在初步研究结束时，如指示的对应答者进行后续疗法。额外的结果度量如下：
主要结果度量：无进展存活。研究的一个目标是证实，无进展存活从Doxil®+ 安慰剂组中的约3-6个月增加至Doxil®+ 人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体组中的约4-12个月（或更多）。
可以评估的次要结果度量包括：应答持续时间、肿瘤进展时间、总存活率、严重的和不严重的不利事件。例如，治疗可以阻止疾病的进展（即，停滞），或可以导致改善。替代地或额外地，可以关于下述的一项或多项，测量其它目的：肿瘤负荷减小、血管形成减少、副作用减少、不良反应减少和/或患者顺应性增加。
实施例22
卵巢癌的基于铂的联合治疗临床试验
该实施例描述了随机化的、盲性的、安慰剂对照的、多中心的、II期研究，所述研究被设计为提供在具有卵巢癌的患者中组合人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体和基于铂的化学疗法的安全性和效能的初步评估。招募了大约为约100至约800位患者，将约50至约400位患者分配至治疗组，将约50至约400位患者分配至安慰剂组。所述试验包括：每1、2或3周，静脉内施用重复剂量的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体（约0.1至约20 mg/kg）或安慰剂，与此相组合，通过静脉内输注进行基于铂的化疗方案（例如，卡铂和紫杉醇），在研究过程中重复该疗程。估测的研究时间范围是约6个月至约5年，在初步研究结束时，如指示的对应答者进行后续疗法。额外的结果度量如下：
主要结果度量：无进展存活。研究的一个目标是证实，无进展存活从托泊替康+ 安慰剂组中的约12-18个月增加至基于铂的化学疗法+ 人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体组中的约12-24个月（或更多）。
可以评估的次要结果度量包括：应答持续时间、肿瘤进展时间、总存活率、严重的和不严重的不利事件。例如，治疗可以阻止疾病的进展（即，停滞），或可以导致改善。替代地或额外地，可以关于下述的一项或多项，测量其它目的：肿瘤负荷减小、血管形成减少、副作用减少、不良反应减少和/或患者顺应性增加。
实施例23
抗-内皮因子抗体用于治疗糖尿病视网膜病变的用途
研究设计
为了评价在具有涉及中心的临床上显著的糖尿病黄斑水肿（DME）的患者中多次玻璃体内注射人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的生物活性和报告任何有关的不利事件，启动了单中心的、标签公开的、剂量递增的初步研究。招募了这样的患者：其具有涉及黄斑中心的DME，并在研究的眼中具有在20/40至20/400之间的最佳矫正视敏度（BCVA）。
研究治疗
以1:1比例随机分配合格的患者，以接受每月施用的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的3次玻璃体内注射（每次注射约0.25至2.5 mg），继续观察至第24个月。主要终点是眼的和全身的不利事件的频率和严重性。次要终点是：1）使用早期治疗糖尿病视网膜病变研究（ETDRS）图表评估的最佳矫正视力评估，其中使用在2 m起始实验距离的标准化的折射和试验方案，和2）通过光学相干体层摄影术测量视网膜厚度。评价医师不知道患者的治疗分配；施用注射的医师知道患者的治疗分配（关于人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体或假治疗），但是不知道人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的剂量。在每个研究点的其它人员（除了辅助注射的那些人员以外）、患者和在重要读出中心（central reading center）的人员不知道患者的治疗分配。
效能和安全性分析
对于漏失数据，使用末次观测值结转（last-observation-carried- forward）方法，在所有患者中进行基于治疗目的的效能分析。对于所有配对对比，为视敏度的基线评分（<55字母相对于
Figure 693685DEST_PATH_IMAGE003
55字母）调节统计模型。使用Cochran卡方检验，进行二叉终点的组之间对比。使用方差分析模型，分析离开基线视敏度的变化。对于病灶特征的终点，使用协方差分析模型调节基线值。使用Hochberg-Bonferroni多重比较操作来调节主要终点的2个配对治疗对比。安全性分析包括所有治疗过的患者。
结论
对于具有DME的患者而言，人源化的抗-内皮因子抗体是良好耐受的疗法。该初步研究证实，人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体疗法具有在涉及中心的临床上显著的DME的患者中维持或改善最佳矫正视敏度和减小视网膜厚度的潜力。
实施例24
抗-内皮因子抗体和年龄相关性黄斑变性的临床试验
研究设计
在美国的多个地方招募患者，在具有与年龄相关性黄斑变性有关的脉络膜新生血管形成的患者中进行重复玻璃体内注射人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的安全性和效能的2年的、有希望的、随机化的、双盲的、假对照的研究。在12个月时进行主要效能分析。主要效能终点是，已经从基线视敏度丧失少于15字母（大约3行）的患者的比例，这使用早期治疗糖尿病视网膜病变研究（ETDRS）图表来评估，使用在2 m起始实验距离处的标准化的折射和试验方案。由独立的重要读出中心证实病灶的合格性，其中使用标准化的标准和受过训练的分类人员（grader），所述分类人员不知道患者的治疗分配。在测定他们的完全合格性之前，患者提供书面的知情同意书。筛选可能持续长达28天。
为了被包括在该研究中，患者必须是至少50岁；具有20/40至20/320（使用ETDRS图表测得的Snellen等效指标）的最佳矫正视敏度；具有与年龄相关性黄斑变性有关的原发性或复发性脉络膜新生血管形成，涉及中央凹（foveal center）；具有一种类型的病灶，其已经使用荧光素血管造影术和眼底照相术评估为最低程度经典的或隐藏的没有经典的脉络膜新生血管形成；具有12个视盘面积（1个视盘面积等于2.54 mm2，这基于1.8 mm的1个视盘直径）的最大病灶尺寸，其中新生血管形成构成整个病灶的50%或更多；和具有假定的最新疾病进展，这通过可观察到的血液、最近视力损失或最近病灶增加了10%或更多的最大直线直径来证实。没有关于预先存在的心血管的、脑血管的或外周血管的病症的排除标准。
第一研究
50至500位具有AMD的患者（50至500只眼）将在多个地方参与该研究。以1:1:1比例随机分配合格的患者，在一只眼中每月（在23至37天内）接受人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体（剂量为约0.25 mg至2.5 mg）或假注射，持续2年（24次注射）。评价医师不知道患者的治疗分配；施用注射的医师知道患者的治疗分配（关于人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体或假治疗），但是不知道人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的剂量。在每个研究点的其它人员（除了辅助注射的那些人员以外）、患者和在重要读出中心的人员不知道患者的治疗分配。如果研究眼中的脉络膜新生血管形成变成大部分是经典的，则允许干预疗法（例如，维替泊芬光动力学疗法）。
作为治疗的第一步，患者接受全眼检查，以建立眼健康的基线。眼检查包括：间接检眼镜检查法、裂隙灯活组织显微镜检查、周边视网膜检查、眼内压测量、视敏度（独立的和最佳校正的）征候学、眼底照相术、荧光素血管造影术、光学相干体层摄影术、视网膜电描记术和A型扫描测量。
在初步检查以后，将如上所述的玻璃体内注射施用给患者的表现出AMD的受累眼。如果双眼都受累，可以单独地治疗它们。用眼用溶液注射待治疗的眼。
治疗后，在第1天、第2天、第7天、第15天、第30天和第60天，和此后2年每个月，检查患者的眼。因为复发的可能性，患者应当在此后以每个月为基础返回进行定期检查。在每个检查日，监测患者的玻璃质液化。另外，使用具有巩膜压陷的间接检眼镜检查法，监测患者的后玻璃体脱离。最后，通过周边视网膜检查、光学相干体层摄影术和荧光素血管造影图片，连续地监测患者呈现的AMD的程度，以监测视网膜下积液、血液、渗出物、RPE脱离、囊性视网膜变化的存在，或灰绿色视网膜下新生血管膜的存在。如果观察到复发新生血管形成的迹象，可能需要额外的治疗。可以每周或每月施用额外的治疗。在一个优选的实施方案中，在初次治疗以后，间隔1-6个月进行后续治疗。
对于漏失数据，使用末次观测值结转方法，在所有患者中进行基于治疗目的的效能分析。对于所有配对对比，为视敏度的基线评分（<55字母相对于
Figure 528042DEST_PATH_IMAGE003
55字母）和脉络膜新生血管形成亚型（最低程度经典的相对于隐藏的没有经典的疾病）调节统计模型。使用Cochran卡方检验，进行二叉终点的组之间对比。使用方差分析模型，分析离开基线视敏度的变化。对于病灶特征的终点，使用协方差分析模型调节基线值。使用Hochberg-Bonferroni多重比较操作来调节主要终点的2个配对治疗对比。安全性分析包括所有治疗过的患者。
第二研究
根据第一研究的方法（参见上面），如下治疗表现出年龄相关性黄斑变性的患者：玻璃体内注射（1）单独的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体，（2）单独的ranibizumab，（3）在相同的组合物或不同的组合物中的与ranibizumab相组合的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体，或（4）对照抗体，以减少或防止新生血管形成、黄斑疾病和视网膜损伤的发展。
结论
对于具有AMD的患者而言，人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体是良好耐受的疗法。该临床试验证实，人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体疗法具有在具有AMD的患者中维持或改善最佳矫正视敏度和减少脉络膜新生血管形成的潜力。此外，与ranibizumab以及人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体和ranibizumab疗法的组合相比，人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体会表现出优良活性，并表现出与任一种单独抗体相比增加的活性。
实施例25
在食蟹猴中的全身毒理学
在研究中使用食蟹猴，以研究人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的全身毒理学。
简而言之，每周给猴施用10.0 mg/kg、30.0 mg/kg或100.0 mg/kg的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体，持续3周。以相同的时间表，给安慰剂动物施用没有抗体的适当溶液。所述剂量作为静脉内快速推注在30-60分钟施用，并在每个剂量水平施用至少6只动物。通过下述指征中的一项或多项，评估毒理学：体重测量、基础生理学临床测量、系列血清化学、血液学评价和组织病理学评价。
实施例26
与贝伐单抗相组合时在食蟹猴中的全身毒理学
在研究中使用食蟹猴，以研究与ranibizumab（LUCENTIS®）相组合的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的全身毒理学。
简而言之，每周给猴施用与约10 mg/kg至100 mg/kg的贝伐单抗相组合的10.0 mg/kg、30.0 mg/kg或100.0 mg/kg的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体，持续3周。其它动物接受人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体或单独的贝伐单抗。以相同的时间表，给安慰剂动物施用没有抗体的适当溶液。所述剂量作为静脉内快速推注在30-60分钟施用，并在每个剂量水平施用至少6只动物。通过下述指征中的一项或多项，评估毒理学：体重测量、基础生理学临床测量、系列血清化学、血液学评价和组织病理学评价。
实施例27
在食蟹猴中的局部毒理学研究
在研究中使用食蟹猴，以研究人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的局部毒理学。
简而言之，每周通过玻璃体内注射，给猴施用0.25、1.25和2.5 mg人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体，持续6周。以相同的时间表，给安慰剂动物施用没有抗体的适当溶液。所述剂量作为玻璃体内注射施用，并在每个剂量水平施用至少6只动物。通过下述指征中的一项或多项，评估毒理学：体重测量、基础生理学临床测量、系列血清化学、血液学评价和组织病理学评价。
局部毒理学研究的组合
在研究中使用食蟹猴，以研究与ranibizumab（LUCENTIS®）相组合的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体当通过玻璃体内注射施用时的毒理学。
简而言之，每周通过玻璃体内注射，给猴施用0.25、1.25和2.5 mg人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体和0.5 mg ranibizumab（LUCENTIS®），持续6周。其它动物在相同的剂量和时间表接受任一种单独的抗体。以相同的时间表，给安慰剂动物施用没有抗体的适当溶液。所述剂量作为玻璃体内注射施用，并在每个剂量水平施用至少6只动物。通过下述指征中的一项或多项，评估毒理学：体重测量、基础生理学临床测量、系列血清化学、血液学评价和组织病理学评价。
实施例28
出芽试验
可以在出芽的三维体外模型中测试血管生成。
从脐带分离出HUVEC，并在3℃和5% CO2下，在补充了10% 胎牛血清（FBS）（GIBCO, Carlsbad, CA）和内皮细胞生长添加物（ECGS）（BD Biosciences, Bedford, MA）的M199中培养。将第2-4代HUVEC用于所有实验（第0代是原代培养物）。在37℃和5% CO2下，在补充了10% FBS的DMEM（GIBCO, Carlsbad, CA）中常规地培养肺成纤维细胞（LF），并在P10和P15之间使用。也可以使用可从ATCC得到的其它成纤维细胞系。
制备细胞
在M199/10% FBS/Pen-Strep（1: 100）中繁殖HUVEC和成纤维细胞1-2天，然后珠连（beading）。对于HUVEC，在珠连前一天，将培养基更换为EGM-2（Clonetics, Walkersville, MD）。对于成纤维细胞，在包埋前一天，将培养基更换为EGM-2。珠连需要大约400 HUVEC/珠子。以20,000细胞/孔，将成纤维细胞用于24-孔板。也可以使用96-孔板，相应地按比例变化数量。
Cytodex 3珠子制备
例如，可以在试验中使用Cytodex 3微载体珠子（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）。
在室温（RT），在50-ml试管中，在50 ml PBS（pH = 7.4）中，水合和溶胀干燥的珠子（0.5 g）至少3小时，并把它置于振荡器上。
允许珠子沉降（约15 min）。抛弃上清液，在新鲜的PBS（50 ml）中洗涤珠子几分钟。
抛弃洗涤PBS，用新鲜的PBS替换：
将珠子悬浮液置于硅化处理的玻璃瓶（来自例如，Windshield Wiper或Sigrnacote）中。在115℃高压灭菌珠子15 min，然后在4℃储存。
试剂
纤维蛋白原溶液
通过将2 mg/ml纤维蛋白原溶解DPBS（在37 ℃水浴中）中，制备纤维蛋白原溶液。然后通过反转试管（而不是涡旋），混合该溶液。可以测定可凝结的蛋白的百分比，并相应地调节。然后使所述溶液通过0.22-µm过滤器，以除菌。
抑肽酶
可以在去离子水（DI）中以4 U/ml重构低压冻干的抑肽酶，并无菌过滤。制备各为1 ml的等分试样，并在-20℃储存。
凝血酶
在无菌水中以50 U/ml重构凝血酶。制备0.5 ml的等分试样，并在-20℃储存。
用HUVEC包被珠子（第1天）
用胰蛋白酶处理HUVEC细胞。允许珠子沉降（不离心），抽吸上清液，在1 ml温的EGM-2培养基中简单地洗涤珠子。在FACS试管中，将珠子（2500）与在1.5 ml温的EGM-2培养基中的1 x 106 HUVEC混合，并垂直放入培养箱（其对于大约10个孔而言足够；如果需要，进行放大）中。
在37℃温育混合物4小时，每20 min反转和混合试管（在珠连以后，珠子应当看起来象微型高尔夫球，这指示足够用于出芽的包被）。
在4小时以后，将包被的珠子转移至T25组织培养瓶（Falcon, Bedford, MA），并在37℃和5% CO2下在5 ml EGM-2培养基中温育过夜。
将包被的珠子包埋在纤维蛋白凝胶中（第0天）
如上所述，制备2.0 mg/ml纤维蛋白原溶液，将0.15单位/ml的抑肽酶加入纤维蛋白原溶液中。
将包被的珠子转移至15 mL锥形管，并使珠子沉降。
将珠子重新悬浮于1 ml EGM-2培养基中，并转移至1.5-ml离心试管。用1 ml EGM-2培养基洗涤珠子3次，通过用P1000吸液管缓慢地上下抽吸进行混合。在盖玻片上计数珠子，并以500珠子/ml的浓度重新悬浮于纤维蛋白原溶液中。
将凝血酶（0.625单位/ml）加入24-孔板的每个孔中。将纤维蛋白原/珠子悬浮液（0.5 ml）加入每个孔，对于每个孔，更换吸液管尖头。
通过轻轻地上下抽吸约4-5次，混合凝血酶和纤维蛋白原/珠子；避免在纤维蛋白凝胶中产生气泡。在没有抗体或一种或多种对照抗体存在下，处理对照样品。用单独的抗-内皮因子抗体、单独的抗-VEGF抗体或它们的组合，处理实验样品。可以测试试剂的多个浓度。使纤维蛋白原/珠子溶液在室温凝结5分钟，然后在37℃/ 5% CO2凝结15 min。重要的是，在凝结的前5 min内不要扰动平板，以使对纤维蛋白的剪切最小化，所述剪切可以导致减少的出芽。
将EGM-2（1 mL）逐滴加入每个孔中。以20,000细胞/孔的浓度，将肺成纤维细胞接种到凝块的上面。每隔天用新鲜的EGM-2培养基替换培养基，直到达到希望的生长。
当形成纤维蛋白凝胶时，可能在凝胶中存在微小的气泡；它们将在3-4天内消失。出芽将出现在第2天至第4天之间。腔形成在大约第4-5天开始，且芽继续伸长。新形成的管在大约第4-6天开始分支。到第6-7天，微血管样结构开始与邻近的管融合（anastomose）；增加珠子/孔的数目会导致更早的融合。通过标准技术，测量出芽距离。
实施例29
体外血管生成芽的免疫细胞化学
为了内皮细胞（EC）核染色，用1 X PBS洗涤纤维蛋白凝胶2次，然后在2%多聚甲醛中固定过夜。在用1 X PBS洗涤另外2次以后，然后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma, St. Louis, MO）对凝胶染色。
为了免疫染色，首先通过用10X胰蛋白酶简单地处理凝胶，去除肺成纤维细胞（LF）。一旦去除所有成纤维细胞，立即用血清停止消化。然后用1X HBSS（Cellgro, Herndon, VA）充分地洗涤凝胶。然后在10% 福尔马林中固定培养物10分钟，并用0.5% Triton X-100渗透化处理5分钟。用在PBS中的5% BSA溶液阻断非特异性结合2小时。
以在封闭缓冲液中的1/100稀释度，使用第一抗体，并在4 ℃温育过夜。充分洗涤以后，通过在1/1000稀释度的物种-特异性的Alexa Fluor 488-缀合的或Alexa Fluor 568-缀合的第二抗体（Molecular Probes, Carlsbad, CA），检测结合的抗体。同种型-特异性的未结合的抗体用作对照。如果发生高背景，可以降低第一抗体或第二抗体的浓度，如果必要的话，可以增加温育和/或洗涤时间。以0.2µM的浓度，用TRITC-鬼笔环肽（Sigma, St. Louis, MO）对F-肌动蛋白染色。
在与数字照相机连接的IX70 Olympus显微镜上，捕获相差图像和荧光图像。在双光子Carl Zeiss MicroImaging LSM 510 Meta显微镜上，捕获荧光Z-系列图像堆，并用Metamorph软件（Universal Imaging Corporation, Downingtown PA）编译成三维表现。因而，可以容易地检测不同标志物的表达。
可以捕获沿着培养物的z-轴的荧光光学图像堆，以建立血管的三维表现。用DAPI（绿色）对核染色，并用波形蛋白（橙色）对血管壁染色。宽的空心腔是明显可见的，周围是单层内皮细胞。这些图像证实，在体外试验中存在的腔是细胞间的（不是细胞内的）裂缝，正如在基质胶（Matrigel）试验中经常看到的。此外，可以证实，HUVEC是极化的，因为它们具有顶膜（朝向腔）和基底膜（在富含胶原IV的基膜和纤维蛋白凝胶附近）。
实施例30
食蟹猴中脉络膜新生血管形成的抑制
在成年食蟹猴中评价了本文所述组合物对激光诱导的脉络膜新血管生成的影响。
在该实验中，通过静脉内注射或玻璃体内注射，施用：（1）单独的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体，（2）单独的抗-VEGF抗体，（3）在相同的组合物或不同的组合物中与抗-VEGF抗体组合的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体，或（4）对照抗体。每只动物接受9或10次对每个视网膜的激光烧伤，在即将开始治疗之前，和在激光处理后15、20和29天，通过荧光素血管造影术，评估活跃的脉络膜新生血管病灶的发展。从激光损伤之前1周开始，每周1次地静脉内地施用组合物。从激光损伤之前1周开始，或在激光损伤后马上、2周（在此时，活跃的CNV病灶已经形成），每2周进行玻璃体内注射1次。从激光损伤之前1周开始，对照动物接受每周1次静脉内的或每2周1次玻璃体内的安慰剂注射。
通过荧光素血管造影术，观察CNV病灶，并根据标准规程分级。
实施例31
损伤诱导的角膜新生血管形成的抑制
通过在间质内放置3根尼龙缝线，或通过角膜上皮的化学损伤（NaOH）和机械清创术，在雄性C57BL/6小鼠中诱导角膜新生血管形成。进行多个实验，其中腹膜内地施用下述抗体1次，或在即将损伤之前或损伤之后不久的多个时间点施用：（1）单独的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体，（2）单独的抗-VEGF抗体，（3）在相同的组合物或不同的组合物中与单独的抗-VEGF抗体组合的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体，或（4）对照抗体。
通过裂隙灯显微镜检查和组织学评价，评价角膜新生血管的生长。用内皮细胞特异性的荧光素缀合的凝集素标记脉管系统，并使用PECAM免疫组织化学，在角膜平置（flat-mounts）中以及在横切片（cross section）中评价新生血管形成。使用裂隙灯显微镜检查，评价角膜水肿的存在，并在横切片中测量角膜厚度；角膜厚度的增加会反映水肿的量。通过分别使用HEMA-3或大鼠抗-小鼠F4/80单克隆抗体染色横切片，测定多形核白细胞（PMN）和巨噬细胞的数目。
实施例32
人源化的抗-内皮因子抗体中的T-细胞表位的鉴别
通过iTopeTM分析，测试了人源化的可变区的序列。人源化的可变区序列被分成重叠的9-l5聚体肽。使用iTopeTM，分析可变区序列与人MHC II类（潜在T细胞表位）的混杂的（promiscuous）高亲和力结合，所述iTopeTM是一种计算机（in silico）分析工具，其通过计算分析来测定肽对MHC II类的亲和力。通过iTopeTM分析测得具有潜在T细胞表位的最低频率的序列被鉴别为用于产生人源化抗体的先导物。通过包括突变，可以重新设计选择的人源化的可变区序列，以便去除潜在T细胞表位。使用iTopeTM来设计突变，以减少或消除MHC II类结合。或者，可以在潜在T细胞表位部位处替换种系人序列，或可以替换替代性的序列。
图19-23显示了9聚体肽与人源化的抗-内皮因子抗体的预测结合，所述抗体含有在图4所示的轻链HuVK_v0和重链HuVH_v0。
实施例33
抗-CD105人源化的/去免疫化的抗体的设计
本实施例描述了治疗性的单克隆的人源化的-去免疫化的抗体的设计，所述抗体靶向人CD105，表现出减少的免疫原性。
通过iTope™，进一步分析使用iTopeTM鉴别出的混杂的高亲和力MHC II类结合序列（参见实施例31），以便鉴别出在关键的MHC II类槽（pocket）位置处会减少或消除肽与MHC II类的结合的氨基酸置换。由于所有序列重叠的CDR，也考虑了变化的CDR位置（潜在的抗原接触残基）和原始和替换氨基酸的物理化学特征。TCR接触残基和在主要结合槽（参与肽/MHC II类-TCR相互作用的稳定化）之外的残基也被考虑用于替换。
在VHVl中，完全位于CDR2内且从残基51处开始的9-聚体肽被鉴别为混杂的高亲和力MHC II类结合肽。用于消除MHC II类结合的最成功的方法是，靶向9-聚体的第一个氨基酸（槽1或p1位置），其中疏水侧链的去除或亲水侧链的替换会消除MHC II类结合。但是，这类氨基酸基团替换并不能总是成功地保留抗体亲和力，因此也评估单独的或组合的第二个槽位置（p4、p6、p7或p9）。iTope™分析揭示，靶向该肽的p4位置，预测通过将K52b改变为Q或R会显著减少MHC II类结合，同时预测用A替换在p1处的I51会完全去除结合（表5）。
Figure 280097DEST_PATH_IMAGE004
表5: 使用iTope™分析置换对VHVl的免疫原性区域的影响。在“序列”列中，核心9-聚体肽带有下划线，且置换用粗体突出显示。侧接残基没有下划线。用“O”（如果结合评分是0.55-0.6）和用“X”（如果结合评分>0.6）指示预测的每种核心9-聚体肽与每种MHC II类等位基因的结合。在“总”和“高亲和力”列中，显示了预测会结合的MHC II类等位基因的数目。表5按照出现次序分别公开了SEQ ID NO 106-109。
抗体/抗原复合物的晶体结构提示，I51可能很少接触抗原；但是，在该位置的I至A的基团变化（用于破坏p1锚位置的置换）会影响CDR的总构象。因此，也包括了在K52b（p4锚位置）处的相对保守的变化，因为该残基被暴露于溶剂，但是不可能接触抗原。最后，也设计了位于CDR之外的额外突变（G49至A或S），以评估对肽/MHC II类/TCR相互作用的去稳定化作用。表6列出了构建的人源化的和人源化的/去免疫化的变体VH区域；在构建体的后面指出了对应的核苷酸和氨基酸序列的SEQ ID NO。
表6
构建体名称 母体序列 氨基酸置换 SEQ ID NO
VH1 VHV1 N/A 42
VH2 VHV2 N/A 43
VK1 VKV1 N/A 4
VK2 VKV2 N/A 5
VH1A2 VHV1 I51A 89
VH1Q VHV1 K52bQ 90
VH1R VHV1 K52bR 91
VH1S VHV1 G49S 92
VH1A VHV1 G49A 88
VK2AA VKV2 V19A + I48A 94
VK2AS VKV2 V19A + T51S 95
VK2SA VKV2 T22S + I48A 96
VK2SS VKV2 T22S + T51S 97
VK1AA VKV1 V19A + I48A 93
VK1AS VKV1 V19A + T51S 102
VK1SA VKV1 T22S + I48A 103
VK1SS VKV1 T22S + T51S 100
在VKV2和VKV1中鉴别出2种混杂的高亲和力MHC II类结合肽。第一种（具有在V19处的p1锚）与CDR1部分地重叠，第二种（具有在I48处的p1锚）与CDR2重叠。两个p1锚都位于CDR之外，且被靶向突变为A，这可能完全去除MHC II类结合（表7）。但是，这2个残基都可能参与维持CDR 1和2的构象；因此，设计了显著减少MHC II类结合的额外突变（表7）。在两种情况下，p4残基被靶向从T突变为S。T22S也位于CDR之外，且其影响CDR构象的可能性比V19A更低。T51位于CDR2内；但是，来自与抗原形成复合物的抗体的晶体结构的证据提示，该残基很少接触抗原。表6列出了构建的人源化的和人源化的/去免疫化的VK区域。
表7: 使用iTope™分析置换对VKV2或VKV1的免疫原性区域的影响。在“序列”列中，核心9-聚体肽带有下划线，且置换用粗体突出显示。侧接残基没有下划线。用“O”（如果结合评分是0.55-0.6）和用“X”（如果结合评分>0.6）指示预测的每种核心9-聚体肽与每种MHC II类等位基因的结合。在“总”和“高亲和力”列中，显示了预测会结合的MHC II类等位基因的数目。表7按照出现次序分别公开了SEQ ID NO 110-115。
实施例34
本实施例描述了筛选T-细胞表位的抗-内皮因子抗体的方法。MHC、多肽和T细胞受体（TCR）之间的相互作用会提供T细胞识别的抗原特异性的结构基础。T细胞增殖试验会测试从抗体加工成的多肽与MHC的结合和TCR对MHC/多肽复合物的识别。本实施例的体外T细胞增殖试验包括刺激外周血单核细胞（PBMC），其含有抗原呈递细胞（APC）和T细胞。使用完整的抗-内皮因子抗体，在体外进行刺激。使用3H-胸苷（3H -Thy），测量受刺激的T细胞增殖，并使用洗涤的固定化的细胞的闪烁计数，评估掺入的3H–Thy的存在。
使用一系列重叠寡核苷酸，合成所有人源化的和人源化的/去免疫化的VH和VK区域基因，将它们退火、连接，并进行PCR扩增，得到全长合成的V区域。然后将装配的变体直接地克隆进Antitope Ltd.的pANT表达载体系统中（对于IgG1重链和κ轻链而言）。
抗体的纯化
通过蛋白A色谱法，从哺乳动物培养物的上清液纯化出抗-内皮因子抗体。使用PBS pH = 7.4，进行缓冲液更换和蛋白浓缩。使用Sephacryl S200柱（GE Healthcare, AMersham, UK），通过尺寸排阻色谱法进一步纯化抗-内皮因子抗体。收集主峰，过滤除菌，并使用Endosafe-PTS（Charles River, Margate, UK）证实具有< 5 EU/mg的内毒素水平。在4摄氏度保存纯化的抗体。使用计算的摩尔消光系数，通过紫外吸收，测定终浓度，其中A280 1.0 = 1.62 mg/mL。然后在AIMV培养基中将每种抗体稀释至100 ug/mL。
供体 PBMC 的制备和选择
根据Addenbrooke医院当地研究伦理委员会（Addenbrooke’s Hospital Local Research Ethics Committee）给予的批准，从获得自英国国家输血服务中心（UK National Blood Transfusion Service）（Addenbrooke’s Hospital, Cambridge, UK）的健康群体供体血沉棕黄层（buffy coats）（来自在24小时内抽吸的血液）中分离出外周血单核细胞（PBMC）。通过Lymphoprep（Axis-shield, Dundee, Scotland）密度离心，从血沉棕黄层中分离出PBMC，并使用CD8+ RossetteSep™（StemCell Technologies, Inc.）去除CD8+ T细胞。通过使用Biotest基于HLA SSP-PCR的组织分型试剂盒（Biotest, Landsteinerstraβe, Denmark）鉴别出HLA-DR单元型，表征供体。对于阳性对照，测定针对对照抗原钥孔戚血蓝素（KLH）（Pierce, Rockford, IL, USA）的T细胞应答。然后在液氮中冷冻和保存PBMC备用。当需要使用时，在37 ℃水浴中快速地融化细胞，然后转移至10 ml预温热的AIM V培养基中。
选择20个供体的组群，以最佳地代表在世界人群中表达的HLA-DR同种异型的数目和频率。针对在世界人群中表达的同种异型分析在所述组群中表达的同种异型，揭示实现了>80%的覆盖度，并较好地代表了所有主要HLA-DR等位基因（在世界人群中表达的频率>5%的单个同种异型）。在图23中提供了供体单元型的总结，并相对于在世界人群中存在的相应值对比了在研究中使用的供体同种异型的频率。
将来自每种供体的PBMC融化，计数，并评估生存力。复苏细胞，并重新悬浮于AIMV培养基中至4-6 x106 PBMC/mL。对于每种供体，建立主培养物（bulk cultures），其中将共1 mL增殖细胞储液（stock）加入24-孔板中。将共1 mL每种稀释的实验样品加入PBMC中，得到50 ug/mL的抗体样品终浓度。对于每种供体，也包括阳性对照（用100 ug/mL KLH温育的细胞）和阴性对照（仅用培养基温育的细胞）。对于前4种供体，包括额外的对照，以测试实验样品对T细胞应答的调节，其中将实验样品和KLH加入PBMC。这些样品与单独的KLH的对比可以用于评估实验样品对增殖的影响。在37摄氏度、5% 二氧化碳，将培养物培养共8天。在第5、6、7和8天，将每个孔中的细胞轻轻地重新悬浮，并将3个100 uL等分试样转移至圆底96孔板的单个孔中。用在100 uL AIMV培养基中的1 μCi 3[H]-Thy（Perkin Elmer, Waltham, MA）脉冲处理培养物，并温育另外18小时，然后使用TomTec Mach III细胞收获器收获到过滤垫上。在paralux低背景计数模式，通过在微量培养板β计数器（Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, USA）上的Meltilex™（Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, USA）闪烁计数，测定每个孔的每分钟的计数（cpm）。
将结果表示为刺激指数，其中如下得出所述刺激指数（SI）：将针对实验抗-内皮因子抗体测得的增殖评分（例如每分钟的放射性计数）除以在未接触实验抗-内皮因子抗体的细胞中测得的评分。对照孔的所有基础cpm都大于150 cpm的试验最小阈值。
对于增殖试验，以前已经建立了等于或大于2的刺激指数（SI）（SI≥2）的经验阈值，其中诱导大于该阈值的增殖应答的样品被视作阳性的（在包括的情况下，突出了边界SI≥1.90）。广泛的试验开发和以前的研究已经证实，这是实现最大灵敏度而又不检测到大量假阳性应答的最小信噪阈值。阳性应答由下述的统计和经验阈值来定义：
1. 使用不成对双样品student氏t-检验，通过相对于培养基对照孔对比实验孔的cpm，得到的应答显著性（p<0.05）。
2. 大于2的刺激指数（SI≥2），其中SI = 实验孔的平均值（cpm）/培养基对照孔的平均值（cpm）。
另外，通过计算来自重复培养物的原始数据的变异系数和标准差（SD），评估试验内变动。
使用抗-内皮因子抗体的EpiScreen时程增殖试验的结果显示在图24中，并以表格形式进行了总结（表8）。嵌合抗体在20个供体中的4个（研究组群的20%）中刺激了应答，并且，尽管2个供体应答是在边界处（对于供体11和17，分别是1.92和1.95），它们明显不同于背景（p<0.05）。人源化抗体VK1VH1在20个供体中的2个（研究组群的10%）中刺激了应答，包括明显不同于背景（p<0.05）一个边界应答（供体20的1.91）。值得注意的是，供体11和20都对这两种抗体做出应答，提示存在共有的T细胞表位。相反，在研究组群中的供体都没有对去免疫化的抗-内皮因子抗体VK1AA VH1A2做出阳性应答。使用对照抗原KLH的结果表明，在阳性和阴性结果之间存在良好关联，这指示在试验中的高再现性水平。
表8. T细胞刺激（作为免疫原性的量度）诱导了含有抗-内皮因子抗体和KLH的培养物，其中“P*”指示大于基线的边界刺激，“P”指示大于2的刺激指数。
实施例35
EpiScreen ™ T 细胞表位作图
EpiScreen™是一种离体技术，其用于测量完整抗体中的T细胞表位，或用于绘制这样的T细胞表位的序列位置的图谱，如下面更详细的描述的。
EpiScreen 供体选择
根据Addenbrooke医院当地研究伦理委员会给予的批准，从获得自英国国家输血服务中心（Addenbrooke’s Hospital, Cambridge, UK）的健康群体供体血沉棕黄层（来自在24小时内抽吸的血液）中分离出外周血单核细胞（PBMC）。通过Lymphoprep（Axis-shield, Dundee, Scotland）密度离心，从血沉棕黄层中分离出PBMC，并使用CD8+ RossetteSep™（StemCell Technologies, Inc.）去除CD8+ T细胞。通过使用Biotest基于HLA SSP-PCR的组织分型试剂盒（Biotest, Landsteinerstraβe, Denmark）鉴别出HLA-DR单元型，表征供体。对于阳性对照，测定针对对照抗原例如钥孔戚血蓝素（KLH）（Pierce, Rockford, IL, USA）的T细胞应答。选择54个供体的组群，以最佳地代表在世界人群中表达的HLA-DR同种异型的数目和频率。针对在世界人群中表达的同种异型分析在所述组群中表达的同种异型，揭示实现了>80%的覆盖度，并较好地代表了所有主要HLA-DR等位基因（在世界人群中表达的频率>5%的单个同种异型）。提供了供体单元型的总结，并相对于在世界人群中存在的相应值对比了在研究中使用的供体同种异型的频率。
供体细节和单元型。在2个独立实验中，测试了对KLH的供体应答（SI）。在新鲜分离的PBMC上进行实验1，并在当前的研究中重新测试抗体。在两个实验中没有产生相同结果（即，阳性的或阴性的）的应答被突出显示。从分析中排除具有极低基础cpm（<150cpm）的供体。
EpiScreen 分析 : 增殖试验
使用EpiScreen™来测试源自嵌合的、人源化的和人源化的/去免疫化的抗体的序列的重叠肽。设计了重叠肽。与1 x 14-聚体和1 x 11-聚体一起，合成了一系列重叠12个氨基酸的128 x 15-聚体肽，并用于刺激源自51个健康供体组群的外周血单核细胞（PBMC），其中使用EpiScreen™T细胞表位作图。在重复的培养物中测试单个肽，并使用T细胞增殖试验来评估应答，以鉴别表位的精确位置。将来自每种供体的PBMC融化，计数，并评估生存力。在室温AIM V培养基（Invitrogen, Carlsbad, California）中复苏细胞，然后将细胞密度调节至2.5x106 PBMC/ml（增殖细胞储液）。将肽溶解在DMSO（Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）中，至10mM的终浓度。然后通过在AIM V培养基至稀释至5 μM的终浓度，制备肽培养物储液。对于每种肽和每种供体，通过将100 μL肽培养物储液加入在平底96孔板中的l00 μl增殖细胞储液中，建立一式六份培养物。也一式六份地建立阳性和阴性对照培养物。共9 x 96孔板用于每种供体，每个平板足以测试15种肽，其中在一式六份中具有一个阴性对照（单独的载体）。在最终的平板上，加入阳性对照。
将培养物培养共6天，然后向每个孔中加入0.5 μCi 3[H]-胸苷（Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, USA）。将培养物培养另外18小时，然后使用TomTec Mach III细胞收获器收获到过滤垫上。在paralux低背景计数模式，通过在微量培养板β计数器（Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, USA）上的Meltilex™（Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, USA）闪烁计数，测定每个孔的每分钟的计数（cpm）。
对于增殖试验，以前已经建立了等于或大于2的刺激指数（SI）（SI≥2）的经验阈值，其中诱导大于该阈值的增殖应答的样品被视作阳性的（在包括的情况下，突出了边界SI≥1.90）。广泛的试验开发和以前的研究已经证实，这是实现最大灵敏度而又不检测到大量假阳性应答的最小信噪阈值。阳性应答由下述的统计和经验阈值来定义：
1. 使用不成对双样品student氏t-检验，通过相对于培养基对照孔对比实验孔的cpm，得到的应答显著性（p<0.05）。
2. 大于2的刺激指数（SI≥2），其中SI = 实验孔的平均值（cpm）/培养基对照孔的平均值（cpm）。
另外，通过计算来自重复培养物的原始数据的变异系数和标准差（SD），评估试验内变动。
在一式六份培养物中建立增殖试验（“未调节的数据”）。为了确保试验内变异性较低，还在去除最大和最小cpm值以后分析了数据（“调节的数据”），并使用2个数据集对比了供体应答的SI。准备了来自调节的和未调节的数据集的供体SI的细节。通过计算在研究中针对所有肽的应答的平均频率+ 2 x SD（背景应答率），鉴别出T细胞表位。诱导大于该阈值的增殖的任意肽都被视作含有T细胞表位。
肽的计算机 iTope ™分析
使用Antitope的预测iTope™软件，分析在增殖试验中阳性的肽的序列。该软件会预测肽的氨基酸侧链和在MHC II类结合沟内的特定结合槽之间的有利相互作用。通过产生10-聚体肽（所述肽重叠1个氨基酸，其跨长肽序列），测定关键结合残基的位置。针对Antitope的MHC II类同种异型数据库，测试每种10-聚体，并基于它们与MHC II类分子的拟合和相互作用进行评分。针对大量等位基因产生高结合评分的肽被视作含有核心9聚体。
T 细胞表位的鉴别
成功地合成了使用上述的EpiScreen™分析鉴别出的所有肽，用于针对51个健康供体（最初选出了54个供体；由于低基础cpm，即，低于150cpm的截止值，可能从分析中排除供体）进行测试。由针对任意给定肽产生SI≥2的显著（p<0.05）应答的供体来定义阳性应答。也包括边界应答（SI≥1.90的显著（p<0.05）应答）。对比来自未调节的和调节的数据分析的结果，以确保试验内变异性较低，并且阳性应答不是单个孔中的假增殖的结果。来自每个分析的结果在方法之间几乎没有表现出差异；结果，使用调节的数据分析，编译T细胞表位图谱。准备了来自未调节的和调节的分析的供体刺激指数。通过计算在研究中针对所有肽的应答的平均频率+ 2 x标准差（称作‘背景应答率’），鉴别出T细胞表位。这被计算为5.6%，且是在3个或更多个供体中诱导阳性应答的等同值。诱导大于该阈值的增殖应答的肽都被视作含有T细胞表位。
使用 EpiScreenTM 对先导变体进行免疫原性测试
使用EpiScreenTM时程T细胞试验，纯化出先导变体，并与野生型多肽相对比。根据HLA同种异型的表达，从如上所述的供体文库中选出代表世界人群的大量健康供体。用每种蛋白在含有2-4x106 CD8+ T细胞剥夺的PBMC的单独主培养物中刺激供体。在第5-8天，从主培养物取出重复样品（T细胞（T blasts）），并与IL-2分泌（ELISPOT）一起评估增殖。为了进一步验证野生型和变体之间的评估，给研究组群补充来自EpiScreen™T细胞表位作图研究的对应供体（条件是足够数目的CD8+ T细胞剥夺的PBMC）。
为了证实免疫原性在先导变体中的缺失，如下通过EpiScreen™时程T细胞试验来分析T细胞免疫原性：
(i) 使用来自健康供体的血沉棕黄层（对世界人群具有>80% DRB1同种异型覆盖度）来分离PBMC，其含有生理水平的APC和CD4+ T细胞；
(ii) 相对于包括钥孔戚血蓝素（一种有效的新抗原）在内的阳性对照抗原，测试每种供体；
(iii) 剥夺CD8+ T细胞，以排除MHC I类限制的T细胞应答的检测；
(iv) 将先导变体和野生型多肽相对于彼此进行对比，以评价活化T细胞CD4+ T细胞的相对能力；
(v) 使用以前验证过的试验参数来分析数据，其中具有由包括统计和频率分析在内的额外信息支持SI> 2的阳性应答；
(vi) 来自EpiScreen™时程T细胞试验的数据会提供关于针对单个分子的T细胞应答的量级和动力学的信息；
(vii) 将来自产生阳性应答的供体的任何剩余PBMC存档，并可用于重复试验研究；和
(viii) 评估供体同种异型和对野生型多肽的应答与对变体先导物的任何应答之间的关联。
可以以其它形式实施或其它方式实现本发明的方面，而不脱离其精神或基本特征。因此，在例证的所有方面考虑本公开内容，且不是限制性的，意图在其中包括落入等效方案的含义和范围内的所有变化。
实施例36
抗-内皮因子抗体的交叉反应性
已经证实，抗-内皮因子抗体与来自人和小鼠的内皮细胞具有交叉反应性（Matsuno等人, 1999）。根据Haruta等人, 1986的方法，通过放射免疫测定（RIA），测试了人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的结合人和人和鼠内皮的能力。简而言之，使用Iodo-Gen，并根据本领域技术人员已知的标准方法，用125I单个地放射性地标记纯化的抗-内皮因子抗体。测定放射性标记的人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体的每个IgG分子的平均碘原子数。通过测试在人和鼠内皮细胞的培养物上的抗-内皮因子抗体或同种型匹配的对照IgG，对比每分钟的计数。使用FITC标记的抗-内皮因子抗体，也可以证实与亚汇合的鼠和人内皮细胞的结合，并根据Matsuno等人, 1999的方法通过Becton Dickinson FACScan进行分析，以对比平均荧光强度。通过放射性标记的抗-内皮因子抗体在携带同源肿瘤的小鼠中的生物分布成像，也可以证实与鼠内皮的结合。简而言之，给免疫活性（immunocompetent）小鼠移植同源4T1乳腺癌。允许肿瘤生长至可触及的大小，并用螯合到放射性同位素（诸如64Cu）上的抗体治疗动物。通过放射自显影术或PET扫描，分析标记的抗-内皮因子抗体在携带肿瘤的BALB/c小鼠中的分布，并与类似地标记的同种型对照抗体的分布相对比。相对于在实体器官和血液中的摄入，报道了标记的抗体的肿瘤摄入。
序列表
<110> THEUER, CHARLES
<120> 内皮因子抗体
<130> 35882-706.202
<140>
<141>
<150> 12/570,918
<151> 2009-09-30
<150> 61/247,290
<151> 2009-09-30
<160> 118
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 106
<212> PRT
<213> 小鼠属的种
<400> 1
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 5
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 7
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 7
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 8
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 8
Gln Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 9
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 10
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 10
Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 11
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 11
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 12
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 12
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 13
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 13
Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 14
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 14
Asp Ile Gln Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 15
Gln Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 16
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 16
Gln Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 17
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 17
Gln Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 18
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 18
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 19
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 19
Gln Ile Gln Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 20
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 21
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 22
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 23
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 24
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 25
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 26
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 27
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 28
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 28
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 29
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 29
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 30
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 30
Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 31
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 31
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 32
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 32
Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 33
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 33
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 34
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 34
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 35
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 36
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 37
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 38
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 39
<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠属
<400> 39
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 115
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 45
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
1 5 10
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 46
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 47
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr
20 25 30
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 48
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg
20 25 30
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 49
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr
20 25 30
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 50
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr
20 25 30
<210> 51
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 51
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Arg Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr
20 25 30
<210> 52
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 52
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Ile Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr
20 25 30
<210> 53
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 53
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Ile Tyr Tyr Cys Thr Thr
20 25 30
<210> 54
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 54
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Leu Tyr Tyr Cys Thr Thr
20 25 30
<210> 55
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 55
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gly
20 25 30
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 56
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 57
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 58
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 59
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 60
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 61
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 62
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠属
<400> 63
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠属
<400> 64
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠属
<400> 65
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠属
<400> 66
Asp Ala Trp Met Asp
1 5
<210> 67
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠属
<400> 67
Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠属
<400> 68
Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser
1 5
<210> 69
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 70
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 70
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 71
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 71
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 72
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 72
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 73
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 74
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 75
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 76
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 77
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 78
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 79
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 80
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 81
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 82
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
1 5 10
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 83
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 84
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的6xHis tag
<400> 85
His His His His His His
1 5
<210> 86
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Asp或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Gln或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Met或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Thr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> Tyr或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> Pro或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (46)..(46)
<223> Trp或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> Ser, Val或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (69)..(69)
<223> Asp或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (70)..(70)
<223> Tyr或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (99)..(99)
<223> Gly或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (105)..(105)
<223> Ile或Leu
<400> 86
Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Xaa Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa Xaa Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Xaa Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Xaa Xaa Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Val Glu Xaa Lys
100 105
<210> 87
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (49)..(49)
<223> Gly或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (79)..(79)
<223> Asn或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (80)..(80)
<223> Thr或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (81)..(81)
<223> Leu或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (86)..(86)
<223> Asn或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (95)..(95)
<223> Val, Ile或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (100)..(100)
<223> Arg, Thr或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (113)..(113)
<223> Leu或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (114)..(114)
<223> Val或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (118)..(118)
<223> Ser或Ala
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Xaa Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Tyr Leu Gln Met Xaa Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Xaa Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Xaa Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Xaa Xaa Thr Val Ser Xaa
115
<210> 88
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的VH_v1(A) 多肽
<400> 88
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 89
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的VH_v1(A2) 多肽
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ala Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 90
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的VH_v1(Q) 多肽
<400> 90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Arg Ser Gln Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 91
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的VH_v1(R) 多肽
<400> 91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Arg Ser Arg Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 92
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的VH_v1(S) 多肽
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 93
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的VK_v1(AA) 多肽
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ala Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 94
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的VK_v2(AA) 多肽
<400> 94
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ala Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 95
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的VK_v2(AA) 多肽
<400> 95
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 96
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的VK_v2(SA) 多肽
<400> 96
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ala Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 97
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的VK_v2(SS) 多肽
<400> 97
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 98
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的IgG1(m3)_恒定区多肽
<400> 98
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 99
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的CK_恒定区多肽
<400> 99
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 100
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的97具有L4M 多肽
<400> 100
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 101
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 101
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Pro Trp Ile Tyr
1 5 10 15
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
20 25 30
<210> 102
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的95具有L4M 多肽
<400> 102
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 103
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的96具有L4M 多肽
<400> 103
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ala Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 104
<211> 12
<212> PRT
<213> 流感病毒A型
<400> 104
Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala
1 5 10
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知序列的描述： 衣原体属 HSP 60肽
<400> 105
Lys Val Val Asp Gln Ile Lys Lys Ile Ser Lys Pro Val Gln His
1 5 10 15
<210> 106
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 106
Trp Val Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr
1 5 10
<210> 107
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 107
Trp Val Gly Glu Ile Arg Ser Gln Ala Ser Asn His Ala Thr
1 5 10
<210> 108
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 108
Trp Val Gly Glu Ile Arg Ser Arg Ala Ser Asn His Ala Thr
1 5 10
<210> 109
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 109
Trp Val Gly Glu Ala Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr
1 5 10
<210> 110
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 110
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val
1 5 10
<210> 111
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 111
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val
1 5 10
<210> 112
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 112
Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val
1 5 10
<210> 113
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 113
Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
1 5 10
<210> 114
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 114
Pro Trp Ile Tyr Ala Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
1 5 10
<210> 115
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 115
Pro Trp Ala Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
1 5 10
<210> 116
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (49)..(49)
<223> Gly, Ala或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (51)..(51)
<223> Ala或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (54)..(54)
<223> Lys, Gln或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (81)..(81)
<223> Leu或Val
<400> 116
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Xaa Glu Xaa Arg Ser Xaa Ala Ser Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Xaa Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 117
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> Thr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (47)..(47)
<223> Ala或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (50)..(50)
<223> Thr或Ser
<400> 117
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Xaa Thr Ile Xaa Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Xaa Tyr
35 40 45
Ala Xaa Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 118
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 118
Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn Val Tyr Leu Gln Met
1 5 10 15
Asn Ser Leu Lys Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp
20 25 30
Ser Trp

Claims (22)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的轻链可变区。
2.一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中：
所述重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用丙氨酸（A）或丝氨酸（S）置换在位置49处的甘氨酸（G）；用异亮氨酸（I）置换在位置51处的丙氨酸（A）；用精氨酸（R）或天冬酰胺（Q）置换在位置52b处的赖氨酸（K）；用缬氨酸（V）置换在位置78处的亮氨酸（L），其中使用Kabat编号系统；和
所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰：用亮氨酸（L）置换在位置4处的甲硫氨酸（M）；用缬氨酸（V）置换在位置19处的丙氨酸（A）；用丝氨酸（S）置换在位置22处的苏氨酸（T）；用异亮氨酸（I）置换在位置48处的丙氨酸（A）；和用丝氨酸（S）置换在位置51处的苏氨酸（T），其中使用Kabat编号系统。
3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQ ID NO: 88、89、90、91或92所示的氨基酸序列的重链可变区；和具有如SEQ ID NO: 93、94、95、96、97、100、102或103所示的氨基酸序列的轻链可变区。
4.根据权利要求1所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv片段、单链结合多肽、Fd片段、可变重链、可变轻链或dAb片段。
5.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段和可接受的载体或赋形剂。
6.一种核酸，其包含编码根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其被治疗标记、诊断标记或二者进一步标记。
8.一种治疗受试者的血管生成有关疾病的方法，所述方法包括：施用根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段的组合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段被治疗标记、可检测标记或二者标记。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述血管生成有关疾病是：特征在于血管生成/新生血管形成的眼病、糖尿病肾病、IBD、类风湿性关节炎、骨关节炎、癌症或转移。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述眼病是黄斑变性。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述眼病是糖尿病视网膜病变。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症是基于上皮的肿瘤。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症选自：肺癌、妇科恶性肿瘤、黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、结直肠癌、前列腺癌、肾癌、头部癌症、胰腺癌、肝癌（肝细胞癌）、子宫癌、颈部癌症、肾癌（肾细胞癌）、肉瘤、骨髓瘤和淋巴瘤。
16.根据权利要求8所述的方法，所述方法另外包括：施用一种或多种血管生成抑制剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述血管生成抑制剂是化学疗法、VEGF受体抑制剂、VEGF抑制剂或其组合。
18.根据权利要求8所述的方法，其中以约0.01 mg/kg、约0.05 mg/kg、约0.1 mg/kg、约0.5 mg/kg、约1 mg/kg、约5 mg/kg、约10 mg/kg、约20 mg/kg、约30 mg/kg、约40 mg/kg、约50 mg/kg、约60 mg/kg、约70 mg/kg、约80 mg/kg、约90 mg/kg、约100 mg/kg、约125 mg/kg、约150 mg/kg、约175 mg/kg或约200 mg/kg的量，施用抗体或其抗原结合片段的组合物。
19.一种诊断方法，其包括：
a）提供来自待测患者的实体瘤的癌细胞或血浆样品；
b）检测至少一种基因或基因产物在样品中的表达，所述基因或基因产物选自其表达已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的基因或基因产物集合，其中所述至少一种基因或基因产物选自下述的一种或多种基因或基因产物：VEGF、VEGF受体、HIF-1α、胎盘生长因子受体和CD105；和
c）对比在患者样品中检测到的至少一种基因或基因产物的表达水平和已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的至少一种基因或基因产物的表达水平。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述血管生成抑制剂选自：VEGF受体抑制剂、VEGF抑制剂和内皮因子抑制剂。
21.一种试剂盒，其包含用于检测已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的一个或多个基因在癌细胞或人血浆样品中的表达水平的试剂，所述基因选自：VEGF、VEGF受体、HIF-1α、胎盘生长因子受体和内皮因子。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述试剂盒含有抗体或其抗原结合片段。
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