BR112012007318B1 - Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, composição e uso de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno - Google Patents

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Charles Theuer
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Abstract

anticorpos de endoglina. o presente pedido refere-se a composições de humanizados e humanizada/deimunized anti-endoglina anticorpos e de ligação ao antígeno seus fragmentos. um aspecto refere-se a anticorpos que possuem uma ou mais modificações em pelo menos um resíduo de aminoácido de pelo menos uma das regiões de estrutura da cadeia pesada variável, a variável da cadeia leve, ou ambos. outro aspecto refere-se a anticorpos que se ligam endoglina e inibir a angiogênese. outro aspecto refere-se à deimmunization de anticorpos humanizados para reduzir a imunogenicidade. outro aspecto refere-se à utilização de anticorpos humanizados e humanizada/deimmunized que se ligam endoglina para a detecção, diagnóstico ou tratamento de uma doença ou condição associada com endoglina, angiogénese ou uma combinação destes.

Description

ANTICORPO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DO MESMO, COMPOSIÇÃO E USO DE UM ANTICORPO OU FRAGMENTO DE
LIGAÇÃO DE ANTÍGENO
REFERÊNCIA ANTERIOR
Esse pedido de patente reivindica o direito do pedido provisório U.S. No. 61/247,290, depositado em 30 de Setembro de 2009 e do pedido não provisório U.S. No. 12/751,907, depositado em 31 de Março de 2010, sendo as revelações de todos esses pedidos aqui incorporadas como referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA A endoglina, também conhecida como, inter alia, CD105 ou edg-1, é uma glicoproteína de membrana do tipo I homodimérica que é expressa em níveis elevados na proliferação das células endoteliais vasculares (Burrows et al., 1995, Res. Clin. Câncer. 1:1623-1634). Assim, a endoglina é principalmente um marcador associado à proliferação de células endoteliais submetidas a angiogênese ativa. No entanto, existe alguma expressão de endoglina pelo endotélio vascular dos tecidos normais (Burrows et al, supra; Wang et al, 1993, Int. J. Cancer 54:363-370). A endoglina humana é conhecida por se ligar especificamente ao fator de transformação de crescimento-β (TGF-β), e a sequência de aminoácidos deduzida da endoglina tem grande homologia com o β-glicano, um tipo de receptor de TGF-β. A endoglina (EDG) tem sido alvo de anticorpos baseados em métodos de redução da vasculatura tumoral, como EDG é um antígeno associado à proliferação das células endoteliais e leucemia. A sua expressão é sobrerregulada em tumores associados ao endotélio vascular, e a EDG é essencial para a angiogênese. A angiogênese inclui a formação de novos vasos capilares sanguíneos que conduzem à neovascularização bem como a manutenção da vasculatura existente. É um processo complexo que inclui uma série de etapas sequenciais, incluindo a degradação mediada por células endoteliais de membrana basal e matriz intersticial vascular, a migração de células endoteliais, a proliferação de células endoteliais e formação de capilares por células endoteliais. Vários anticorpos antiendoglina, em particular os anticorpos monoclonais antiendoglina ("mAb"), têm sido descritos. MAb SN6 é um anticorpo gerado a partir de imunização de camundongos com misturas de glicoproteínas de membranas celulares de células de leucemia humana (Haruta e Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7898-7902). SN6 é um murídeo de mAb que reconhece endoglina humana. MAb 44G4 é um anticorpo gerado a partir da imunização de camundongos com suspensões de células inteiras de células pré-B humanas leucêmicas (Gougos e Letarte, 1988, J. Immunol 141:1925-1933; 1990, J. Biol Chem. 265:8361-8364). 44G4 é também um murídeo mAb que reconhece endoglina humana. MAb MJ7/18 é um anticorpo produzido a partir da imunização de ratos com peles inflamadas de camundongo (Ge e Butcher, 1994, supra). MJ7/18 é um mAb que reconhece endoglina de murídeo. MAb Tec-11 é um anticorpo gerado a partir da imunização de camundongos com células endoteliais da veia umbilical humana (Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1:1623-1634). Tec-11 é um murídeo mAb com reatividade limitada a endoglina humana. Anticorpos contra endoglina representam uma importante área para o desenvolvimento de terapias para o tratamento de uma variedade de doenças e condições que envolvem, sendo influenciadas por, ou afetadas por angiogênese.
Angiogênese é um processo fisiológico pelo qual novos vasos sanguíneos se desenvolvem a partir de vasos pré-existentes (Varner, et al., Cell Adh. Commun. 1995, 3:367-374; Blood, et al., Biochim. Biophys. Acta. 1990, 1032:89-118; Weidner, et al., J. Natl. Cancer Inst. 1992, 84:18751887). A angiogênese tem sido sugerida por desempenhar um papel tanto nos processos normais quanto nos patológicos. Por exemplo, processos angiogênicos estão envolvidos no desenvolvimento dos sistemas vasculares de órgãos e tecidos de animais. Esses processos também estão envolvidos nas etapas transitórias da angiogênese, por exemplo, durante o ciclo menstrual, na gravidez e na regeneração de feridas. Por outro lado, diversas doenças estão associadas à angiogênese desregulada.
Em determinadas condições patológicas, a angiogênese é estimulada como um meio para fornecer sangue e nutrientes adequados para as células dentro do tecido afetado. Muitas dessas condições patológicas envolvem proliferação celular anormal e/ou regulação. Portanto, a inibição da angiogênese é uma abordagem potencialmente útil para o tratamento de doenças que são caracterizadas pelo desenvolvimento de novos vasos sanguíneos. Por exemplo, a angiogênese está envolvida em condições patológicas, incluindo: várias formas de doenças oculares e não oculares caracterizadas por angiogênese/neovascularização (por exemplo, degeneração macular, retinopatia diabética), nefropatia diabética, doenças inflamatórias crônicas (por exemplo, DIC), artrite reumatóide, osteoartrite, e várias formas de câncer, tumores sólidos, metástases e semelhantes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Aqui são fornecidos anticorpos humanizados ou seus fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, que se ligam a endoglina. Tais anticorpos têm in vitro e in vivo de purificação, detecção, diagnóstico e utilizações terapêuticas. Aqui também são fornecidos anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo que se ligam a uma ou mais espécies ou variantes de endoglina e inibem a angiogênese. Também são aqui fornecidos métodos de tratamento de doenças associadas a angiogênese com os anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo que se ligam à endoglina.
Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação de antígeno que se ligam à endoglina e são aqui descritos podem ser utilizados para tratar ou prevenir a degeneração macular, NVC, retinopatia diabética, ou vítreorretinopatia proliferativa. Aqui descritos estão métodos de tratamento ou prevenção da degeneração macular, NVC, retinopatia diabética, ou vítreorretinopatia proliferativa através da administração dos anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito. Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação de antígeno que se ligam à endoglina e que são aqui descritos podem também diminuir os vasos sanguíneos, inibir a proliferação de células endoteliais associada com a doença ocular, sintomas evidentes de sangramento, tratar visão turva, fornecer estase de perda de visão, e/ou prevenir a perda dos vasos sanguíneos. Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito podem também ser utilizados em medicamentos para o tratamento de degeneração macular, NVC, retinopatia diabética ou vítreorretinopatia proliferativa. Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito podem também ser utilizados em medicamentos para o tratamento do câncer.
Aqui são fornecidos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, tendo uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 41 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 3.
Aqui são fornecidos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo que se ligam à endoglina, compreendendo uma região variável de cadeia leve que possui uma sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia pesada tendo um conjunto de sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 41, em que: a dita região variável de cadeia pesada compreende ainda uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em uma substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 49; uma substituição de asparagina (N) por serina (S) na posição 76; uma substituição da treonina (T) por arginina (R) na posição 77; uma substituição de leucina (L) por valina (V) na posição 78; uma substituição de asparagina (N) por isoleucina (I) na posição 82a; uma substituição de valina (V) por isoleucina (I) ou leucina (L) na posição 89; uma substituição da treonina (T) por arginina (R) ou glicina (G) na posição 94; uma substituição de leucina (L) por treonina (T) na posição 108; uma substituição de valina (V) por leucina (L) na posição 109, e uma substituição de serina (S) por alanina (A) na posição 113, utilizando o sistema de numeração de Kabat; e a região variável de cadeia leve compreende ainda um ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em uma substituição de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) na posição 1; uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) na posição 3; uma substituição da metionina (M) por leucina (L) na posição 4; uma substituição da treonina (T) por serina (S) na posição 5; uma substituição de tirosina (Y) por fenilalanina (F) na posição 36; uma substituição de leucina (L) por prolina (P) na posição 46; uma substituição de leucina (L) por triptofano (W) na posição 47; uma substituição de serina (S) por valina (V) ou alanina (A) na posição 60; uma substituição de ácido aspártico (D) por serina (S) na posição 70; uma substituição de fenilalanina (F) por tirosina (Y) na posição 71; uma substituição de glutamina (G) por alanina (A) na posição 100, e uma substituição de isoleucina (I) por leucina (L) na posição 106, utilizando o sistema de numeração de Kabat. São aqui fornecidos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos que ligam à endoglina, tendo uma região variável cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a dita região variável de cadeia pesada compreende: (i) um CDR1 de SEQ ID NO: 66, um CDR2 de SEQ ID NO:67, e um CDR3 de SEQ ID NO: 68; (ii) uma cadeia pesada FR1 tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 exceto por uma ou mais substituições conservativas; (iii) uma cadeia pesada FR2 tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 exceto pela substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 49 utilizando o sistema de numeração de Kabat; e (iv) uma cadeia pesada FR3 tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 exceto por uma ou mais substituições do grupo consistindo em: (a) uma substituição de asparagina (N) por serina (S) na posição 76; (b) uma substituição de treonina (T) por arginina (R) na posição 77; (c) uma substituição de leucina (L) por valina (V) na posição 78; (d) uma substituição de asparagina (N) por isoleucina (I) na posição 82a; (e) uma substituição de valina (V) por isoleucina (I) or leucina (L) na posição 89; e (f) uma substituição de treonina (T) por arginina (R) or glicina (G) na posição 94 utilizando o sistema de numeração de Kabat; e (v) uma cadeia pesada FR4 tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56 exceto por uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: (a) uma substituição de leucina (L) por treonina (T) na posição 108; (b) uma substituição de valina (V) por leucina (L) na posição 109; e (c) uma substituição de serina (S) por alanina (A) na posição 113 utilizando o sistema de numeração de Kabat; e a dita região variável de cadeia leve compreende: (i) um CDR1 de SEQ ID NO: 63, um CDR2 de SEQ ID NO: 64, um CDR3 de SEQ ID NO: 65; (ii) uma cadeia leve FR1 tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 exceto por uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: (a) uma substituição de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) na posição 1; (b) uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) na posição 3; (c) uma substituição de methionina (M) por leucina (L) na posição 4; e (d) uma substituição de treonina (T) por serina (S) na posição 5; utilizando o sistema de numeração de Kabat; e (iii) uma cadeia leve FR2 tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 exceto por uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: (a) uma substituição de tirosina (Y) por fenilalanina (F) na posição 36; (b) uma substituição de leucina (L) por prolina (P) na posição 46; e (c) uma substituição de leucina (L) por triptofano (W) na posição 47 utilizando o sistema de numeração de Kabat; e (iv) uma cadeia leve FR3 tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 exceto por uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: (a) uma substituição de serina (S) por valina (V) or alanina (A) na posição 60; (b) uma substituição de ácido aspártico (D) por serina (S) na posição 70; e (b) uma substituição de fenilalanina (F) por tirosina (Y) na posição 71 utilizando o sistema de numeração de Kabat; e (v) uma cadeia leve FR4 tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35 exceto por uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: (a) uma substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 100; e (b) uma substituição de isoleucina (I) por leucina (L) na posição 106 utilizando o sistema de numeração de Kabat.
Aqui é fornecido um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 42 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 4.
Aqui é fornecido um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se ligam à endoglina, compreendendo uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 42, em que: a dita região variável de cadeia pesada compreende ainda uma ou mais modificações selecionadas dentre o grupo consistindo em uma substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 49; uma substituição de asparagina (N) por serina (S) na posição 76; uma substituição da treonina (T) por arginina (R) na posição 77; uma substituição de leucina (L) por valina (V) na posição 7 8; uma substituição de asparagina (N) por isoleucina (I) na posição 82a; uma substituição de valina (V) por isoleucina (I) ou leucina (L) na posição 89; uma substituição de arginina (R) por treonina (T) ou glicina (G) na posição 94; uma substituição de leucina (L) por treonina (T) na posição 108; uma substituição de valina (V) por leucina (L) na posição 109, e uma substituição de serina (S) por alanina (A) na posição 113, utilizando o sistema de numeração de Kabat e da região variável de cadeia leve compreende ainda uma ou mais modificações selecionados a partir do grupo que consiste em uma substituição de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) na posição 1; uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) na posição 3; uma substituição da metionina (M) por leucina (L) na posição 4; uma substituição da treonina (T) por serina (S) na posição 5; uma substituição de tirosina (Y) por fenilalanina (F) na posição 36; uma substituição de prolina (P) por leucina (L) na posição 46; uma substituição de triptofano (W) por leucina (L) na posição 47; uma substituição de serina (S) por valina (V) ou alanina (A) na posição 60; uma substituição de ácido aspártico (D) por serina (S) na posição 70; uma substituição de tirosina (Y) por fenilalanina (F) na posição 71; uma substituição de glutamina (G) por alanina (A) na posição 100, e uma substituição de isoleucina (I) por leucina (L) na posição 106, utilizando o sistema de numeração de Kabat.
Aqui é fornecido um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga à endoglina, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a dita região variável de cadeia pesada compreende: (i) um CDR1 de SEQ ID NO: 66, um CDR2 de SEQ ID NO: 67, e um CDR3 de SEQ ID NO: 68; (ii) uma cadeia pesada FR1 tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44, exceto para uma ou mais substituições conservativas; (iii) uma cadeia pesada FR2 tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, exceto para uma substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 49, utilizando o sistema de numeração Kabat; e (iv) uma cadeia pesada FR3 tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) a substituição de um asparagina (N) por serina (S) na posição 76; (b) uma substituição da treonina (T) por arginina (R) na posição 77; (c) uma substituição de leucina (L) por valina (V) na posição 78; (d) uma substituição de asparagina (N) por isoleucina na posição 82a; (e) uma substituição de valina (V) por isoleucina (I) ou leucina (L) na posição 89, e (f) uma substituição de arginina (R) por treonina (T) ou glicina (G) na posição 94, utilizando o sistema de numeração de Kabat e (v) um FR4 da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) uma substituição de leucina (L) por treonina (T) na posição 108; (b) uma substituição de valina (V) por leucina (L) na posição 109, e (c) uma substituição de serina (S) por alanina (A) na posição 113, utilizando o sistema de numeração de Kabat; e a dita região variável de cadeia leve compreende: (i) uma CDR1 da SEQ ID NO: 63, uma CDR2 da SEQ ID NO: 64, e uma CDR3 da SEQ ID NO: 65; (ii) uma cadeia leve FR1 possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) uma substituição de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) na posição 1; (b) uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) na posição 3; (c) uma substituição da metionina (M) por leucina (L) na posição 4; e (d) uma substituição da treonina (T) por serina (S) na posição 5; utilizando o sistema de numeração de Kabat e (iii) uma cadeia leve FR2 possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) uma substituição de tirosina (Y) por fenilalanina (F) na posição 36; (b) uma substituição de prolina (P) por leucina (L) na posição 46, e (c) uma substituição de triptofano (W) por leucina (L) na posição 47, utilizando o sistema de numeração de Kabat e (iv) uma cadeia leve FR3 possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) uma substituição de serina (S) por valina (V) ou alanina (A) na posição 60; (b) uma substituição de ácido aspártico (D) por serina (S) na posição 70, e (b) uma substituição de tirosina (Y) por fenilalanina (F) na posição 71, utilizando o sistema de numeração de Kabat e (v) uma cadeia leve FR4 possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: (a) uma substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 100, e (b) uma substituição de isoleucina (I) por leucina (L) na posição 106, utilizando o sistema de numeração de Kabat.
Aqui é fornecido um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno dos mesmos, que compreende uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 93 (VK1AA) e uma região variável de cadeia pesada tendo um conjunto de sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 89 (VH1A2).
Aqui é fornecido um anticorpo, fragmento de ligação de antígeno dos mesmos, que se liga à endoglina, compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 89 e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 93, em que: (i) a região variável de cadeia pesada compreende ainda uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em uma substituição de glicina (G) por alanina (A) ou serina (S) na posição 49; uma substituição de alanina (A) por isoleucina (I) na posição 51; uma substituição de lisina (K) por arginina (R) ou asparagina (Q) na posição 52b; uma substituição de leucina (L) por valina (V) em 78 de posição, utilizando o sistema de numeração de Kabat e (ii) a região variável de cadeia leve compreende ainda uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em uma substituição da metionina (M) por leucina (L) na posição 4; uma substituição de alanina (A) por valina (V) na posição 19; uma substituição da treonina (T) por serina (S) na posição 22; uma substituição de alanina (A) por isoleucina (I) na posição 48, e uma substituição de treonina (T) por serina (S) na posição 51 utilizando o sistema de numeração de Kabat.
Aqui é fornecido um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno dos mesmos, da reivindicação 2 compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 88, 89, 90, 91 ou 92, e uma região variável de cadeia leve que possui uma sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 97, 100, 102, ou 103.
Em um aspecto, os anticorpos e fragmento de ligação de antígeno aqui descrito são humanizados e podem ser de qualquer isotipo. Também abrangidos aqui são os AVIMERs, diacorpos e dímeros de cadeia pesada (incluindo construções de cadeia pesada de camelídeos e de tubarão).
Os termos "porção de ligação de antígeno de um anticorpo", "fragmento de ligação de antígeno", " domínio de ligação de antígeno ", "fragmento de anticorpo" ou um "fragmento funcional de um anticorpo" são aqui utilizados indiferentemente para se referir a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Exemplos não limitativos de fragmentos de anticorpo incluídos dentro tais termos incluem, mas não estão limitados a, (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, Cl e Ch1, (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que contém dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de charneira, (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios Vh e Chi, (iv) um fragmento Fv que contém os domínios Vl e Vh de uma única região de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341:544-546.), que contém um domínio Vh e (vi) um CDR isolado. Além disso, são incluídos nesta definição "uma metade" de anticorpos compreendendo uma cadeia única pesada e uma cadeia única leve. Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como diacorpos são também englobados neste documento.
Um fragmento de ligação de antígeno pode ser qualquer um dos aqui descritos, incluindo, mas não limitado a, um fragmento Fab, um Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv (incluindo fragmentos Fv não ligados covalentemente e ligados covalentemente), um fragmento scFv, uma cadeia única ligação de polipeptídeo, um fragmento Fd, um fragmento Fv ou um fragmento dAb. Em uma forma de modalidade não limitativa, o fragmento de ligação de antígeno é um scFv que pode, opcionalmente, ser ainda fundido a uma porção Fc de um anticorpo humano.
Em uma forma de modalidade não limitativa, o fragmento de anticorpo, ou de ligação de antígeno do mesmo que se liga à endoglina compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 41, 42, ou 43, e uma região variável de cadeia leve que possui uma sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 3, 4 ou 5.
Em outra forma de modalidade não limitativa, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 41 e uma região variável de cadeia leve tendo um conjunto de sequência de aminoácidos definido na SEQ ID NO: 3.
Em outra forma de modalidade não limitativa, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 41 e uma região variável de cadeia leve tendo um conjunto de sequência de aminoácidos definido na SEQ ID NO: 4.
Em outra forma de modalidade não limitativa, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 41 e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 5.
Em outra forma de modalidade não limitativa, o anticorpo, ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 42 e uma região variável de cadeia leve tendo um conjunto de sequência de aminoácidos definido na SEQ ID NO: 3.
Em outra forma de modalidade não limitativa, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 42 e uma região variável de cadeia leve tendo um conjunto de sequência de aminoácidos definido na SEQ ID NO: 4.
Em outra forma de modalidade não limitativa, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 42 e uma região variável de cadeia leve tendo um conjunto de sequência de aminoácidos definido na SEQ ID NO: 5.
Em outra forma de modalidade não limitativa, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve possuindo um conjunto de sequência de aminoácidos definido na SEQ ID NO: 3.
Em outra forma de modalidade não limitativa, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 4.
Em outra forma de modalidade não limitativa, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 5.
Em ainda outra forma de modalidade não limitativa, o anticorpo, ou de ligação de antígeno da mesma região variável de cadeia pesada compreende ainda uma ou mais modificações selecionadas de entre o grupo que consiste em: uma substituição de asparagina (N) por serina (S) na posição 76; uma substituição de treonina (T) por arginina (R) na posição 77; uma substituição de asparagina (N) por isoleucina (I) na posição82a; uma substituição de valina (V) por isoleucina (I) ou leucina (L) na posição 89; uma substituição da treonina (T) por glicina (G) na posição 94; uma substituição de leucina (L) por treonina (T) na posição 108; uma substituição de valina (V) por leucina (L) na posição 109, e uma substituição de serina (S) por alanina (A) uma posição 113; e disse região variável de cadeia leve compreende ainda um ou mais modificações selecionados a partir do grupo consistindo de: uma substituição de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) na posição 1; uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) na posição 3; uma substituição da treonina (T) por serina (S) na posição 5; uma substituição de tirosina (Y) por fenilalanina (F) uma posição 36; uma substituição de serina (S) por valina (V) ou alanina (A) na posição 60; uma substituição de ácido aspártico (D) por serina (S) na posição 70; uma substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 100, e uma substituição de isoleucina (I) por leucina (L) na posição 106, utilizando o sistema de numeração de Kabat.
Em um aspecto, os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito podem ser modificados. Por exemplo, em uma forma de modalidade, o composto pode ser modificado para alterar uma propriedade farmacocinética do composto, tais como, por exemplo, estabilidade in vivo, a solubilidade, a biodisponibilidade, ou a meia-vida. Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a, PEGuilação e/ou glicosilação.
Os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito podem ser formulados para uma liberação rápida ou prolongada utilizando meios convencionais. Em uma forma de modalidade não limitativa, uma liberação rápida é feita, por exemplo, por injeção intravenosa. Em outra forma de modalidade não limitativa, a liberação prolongada é feita, por exemplo, por deposição por via subcutânea. Em outra forma de modalidade não limitativa, a liberação é conseguida através de administração por aerossol.
Aqui são fornecidas composições dos anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito e um transportador ou excipiente aceitável.
Aqui são fornecidos polinucleotídeos (ácidos nucléicos) compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito.
Anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos como aqui descritos podem ser usados para tratar várias doenças e condições associadas à angiogênese, por exemplo, várias formas de doenças oculares caracterizadas por angiogênese/neovascularização (por exemplo, degeneração macular, retinopatia diabética), nefropatia diabética, doenças inflamatórias crônicas (por exemplo, DIC), artrite reumatóide, osteoartrite, e várias formas de câncer, tumores sólidos, e metástases. Além disso, estes anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos aqui descritos podem ser usados na formulação de um medicamento para a profilaxia, diagnóstico ou tratamento de doenças e condições associadas com a angiogênese, por exemplo, várias formas de doenças oculares e não oculares caracterizadas por angiogênese/neovascularização (por exemplo, degeneração macular, retinopatia diabética), nefropatia diabética, doenças inflamatórias crônicas (por exemplo, o DIC), artrite reumatóide, osteoartrite, e várias formas de câncer, tumores sólidos, e metástases.
Aqui é fornecido um método para induzir uma resposta imune do hospedeiro em um paciente contra a endoglina, por administração ao paciente de uma composição, em que a composição compreende um anticorpo antiendoglina humanizado ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo que induz uma resposta imune eficaz do hospedeiro contra o epítopo reconhecido especificamente pelo dito anticorpo ou fragmento do mesmo. A resposta imune do hospedeiro pode ser uma resposta imune humoral ou uma resposta imune mediada por células. Se a resposta imune é uma resposta imune humoral, pode ser uma resposta do anticorpo protetor que inibe a angiogênese, uma doença dependente da angiogênese ou um distúrbio angiogênese-dependentes. As respostas imunes também incluem a indução ou bloqueio de vias de sinalização celular (por exemplo, sinalização Smad). A doença ou distúrbio angiogênese-dependentes pode ser, por exemplo, várias formas de doenças oculares e não oculares caracterizadas por angiogênese/neovascularização (por exemplo, degeneração macular, retinopatia diabética), nefropatia diabética, doenças inflamatórias crônicas (por exemplo, DIC), artrite reumatóide, osteoartrite, várias formas de câncer (tumores primários e metástases) e semelhantes. Em uma forma de modalidade, a resposta de anticorpos protetora inibe a angiogênese.
Aqui é fornecido um método de afetar as vias de sinalização celular associadas com a endoglina e a angiogênese. Células angiogênicas podem ser contatadas (in vitro, in vivo ou ex vivo) com um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo aqui descrito, numa quantidade suficiente para alterar as vias de sinalização celular. Em um exemplo não limitativo, em resposta à ligação do anticorpo, a sinalização de Smad 1,5 e/ou 8 é inibida em cerca de 1,5 vezes ou mais em células angiogênicas. Em outro exemplo não limitativo, os níveis de Smad 3 aumentam cerca de 1,5 vezes ou mais, indicando que as células estão regressando a um estado quiescente.
Aqui é fornecido um método para a inibição da angiogênese ou uma doença ou distúrbio angiogênese-dependentes em um indivíduo pela administração de uma composição fornecida aqui a um paciente. A doença ou distúrbio angiogênese-dependentes pode ser uma das seguintes várias formas de doenças oculares e não oculares caracterizadas pela angiogênese/neovascularização (por exemplo, degeneração macular, retinopatia diabética), nefropatia diabética, doenças inflamatórias crônicas (por exemplo DIC), artrite reumatoide, ósteoartrite, e várias formas de câncer, tumores sólidos e metástases. Em uma forma de modalidade, inibir a angiogênese ou uma doença ou distúrbio angiogênese-dependentes alivia os sintomas associados com a doença ou distúrbio. Em outra forma de modalidade, a inibição da angiogênese ou uma doença ou distúrbio angiogênese-dependentes resulta na diminuição do tamanho do tumor, prevenção da progressão do tumor, diminuição da proliferação de células, o aumento da apoptose, ou aumento da sobrevivência de um paciente. A inibição da angiogênese pode resultar na diminuição do tamanho do tumor ou prevenir progressão tumoral. O método pode ainda incluir a remoção cirúrgica de um câncer, e/ou administração de um ou mais agentes anticancerígenos adicionais ou tratamentos em um paciente sofrendo de câncer.
Aqui é fornecido um método de prevenção ou tratamento de um câncer ou metástase em um indivíduo por administração de uma composição aqui fornecida. Em uma forma de modalidade, a administração da composição farmacêutica prolonga a vida do indivíduo a ser tratado. Um câncer/tumor a ser tratado inclui um tumor sólido; um tumor pode ser um tumor primário ou um tumor metastático. Exemplos de tumores sólidos que são de um tecido ou órgão selecionado dentre pele, pulmão, melanoma pâncreas, mama, ovário, cólon, reto, estômago, tireóide, ovário, da laringe, próstata, colo-retal, cabeça, pescoço, olhos, boca, garganta, esôfago, peito, osso, testicular, medula, linfóide, osso, sarcoma, renal, glândulas sudoríparas, fígado, rim, cérebro, por exemplo, glioblastoma multiforme e os tecidos semelhantes. Em um exemplo não limitante, um tumor sólido é um tumor do cólon, um tumor de mama, tumor do rim, um tumor do pulmão, um tumor de próstata, um tumor do ovário, ou metástase de qualquer de tais tumores. O método pode ainda incluir a remoção cirúrgica do câncer e/ou administração de um ou mais agentes anticancerígenos. Um agente anticâncer pode ser administrado antes, concomitante, ou subsequentemente a administração da composição farmacêutica. Um agente anticâncer pode ser administrado dentro de uma semana antes da composição farmacêutica, dentro de uma semana após a composição farmacêutica, ou o agente anticâncer pode ser administrados no mesmo dia que a composição farmacêutica. Se um agente anticâncer é administrado no mesmo dia que a composição farmacêutica, a administração pode ser concomitante.
Aqui é fornecido um método para a prevenção ou tratamento de um câncer ou uma metástase por remoção cirúrgica do câncer/tumor e administração concomitante de um agente anticâncer ou o tratamento e uma composição aqui fornecida a um indivíduo.
Aqui é fornecido um método de inibição da angiogênese, contatando uma célula ou tecido com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como aqui descrito suficiente para inibir a angiogênese.
Aqui é fornecido um método de inibir o crescimento de células cancerosas, contatando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo como aqui descrito suficiente para inibir o crescimento de células cancerosas ou causar apoptose da célula cancerosa.
Aqui é fornecido um método, compreendendo o contato de um tecido com um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo como aqui descrito, em que o contato inibe a angiogênese. O tecido pode ser um tecido cultivado a partir de uma amostra de biópsia ou pode estar presente em um indivíduo.
Aqui é fornecido um método de prevenção ou tratamento de um distúrbio celular proliferativo (por exemplo, angiogênico) por administração em um indivíduo que tenha ou em risco de ter um distúrbio proliferativo das células de uma quantidade eficaz de uma composição aqui fornecida eficaz para tratar o distúrbio celular proliferativo. O distúrbio celular proliferativo pode ser, por exemplo, um tumor benigno ou maligno sólido ou não sólido e o tumor pode ser metastásico ou não metastático. O tratamento pode resultar na melhoria da condição do indivíduo e pode ser avaliado pela determinação se um ou mais dos seguintes fatores ocorreu: decréscimo da proliferação celular, diminuição do número de células, o aumento da apoptose, ou diminuição da sobrevivência de pelo menos uma porção das células compreendendo o distúrbio celular proliferativo. Um ou mais destas ocorrências pode, em alguns casos, resultar na eliminação parcial ou total do câncer e prolongamento da sobrevivência do doente. Opcionalmente, o método pode ainda incluir a administração de um agente anticâncer ou de tratamento para o indivíduo.
Aqui é fornecido um método para tratar a retinopatia diabética, degeneração macular, neovascularização coroidal ou glaucoma neovascular em um paciente, por administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição aqui fornecida. O tratamento pode resultar na melhoria da condição do indivíduo e pode se avaliar por determinar se um ou mais dos seguintes fatores ocorreu: diminuição do edema macular, diminuição das áreas de NVC, ou aumento da acuidade visual.
Nos métodos aqui fornecidos, o indivíduo pode ser um humano ou um sujeito não humano. Composições e o agente anticâncer ou tratamentos aqui fornecidos podem ser administrados uma vez ou várias vezes, dependendo da saúde do paciente, da progressão ou condição da doença, e da eficácia do tratamento. Os ajustes a terapia e tratamentos podem ser feitos durante todo o curso do tratamento.
Composições podem ser administradas localmente, regionalmente ou sistemicamente, tal como, por exemplo, a administração por via subcutânea, subcutânea, intravítrea, intradérmica, intravenosa, injeção intra-arterial, intraperitoneal ou intramuscular.
Além disso, os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito também podem ser usados em combinação com terapias conhecidas e/ou compostos para o tratamento de degeneração macular, NVC, retinopatia diabética ou vítreorretinopatia proliferativa. Exemplos de tais compostos incluem, mas não estão limitados a, o bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), ou Macugen. Para além das vias de administração aqui descritas, os anticorpos antiendoglina humanizados e fragmentos de ligação de antígeno podem ser administrados por vias de intravítreas. Exemplos não limitativos de modos de administração incluem intravítreas injeção intravítrea e o uso de implantes intravítreos.
Outro aspecto é o tratamento de uma doença inflamatória crônica em um indivíduo através da administração de uma composição de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno aqui descrito. Exemplos não limitativos de doenças inflamatórias crônicas incluem a doença de Crohn e colite ulcerativa.
Outro aspecto é o tratamento de artrite reumatóide em um indivíduo por administração de uma composição de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno aqui descrito.
Outro aspecto é o tratamento de ósteoartrite em um sujeito por administração de uma composição de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno aqui descrito. O tratamento de um sujeito com artrite reumatóide e/ou ósteoartrite pode ser avaliada por vários meios, incluindo a melhoria nas categorias adequadas de pontuações ACR medidas de acordo com as diretrizes publicadas.
Aqui é fornecido um método de monitoração da eficácia de um ou mais de qualquer um dos métodos aqui proporcionados. Aumento dos níveis de endoglina solúvel foi correlacionado com a diminuição da sobrevida em pacientes com câncer. Assim, em um aspecto, os níveis de endoglina solúvel podem ser monitorados antes e durante a terapia. Uma diminuição nos níveis de endoglina solúvel pode, portanto, ser uma indicação de que um regime terapêutico é eficaz no tratamento do paciente.
Uma forma de modalidade da presente invenção contempla o uso de qualquer uma das composições da presente invenção para formular um medicamento para o tratamento de um distúrbio do presente invento. Medicamentos podem ser formulados com base nas características físicas do paciente/indivíduo que necessita de tratamento, e pode ser formulado em formulações únicas ou múltiplas com base no estágio do tecido canceroso. Os medicamentos da presente invenção podem ser empacotados em um pacote farmacêutico adequado com etiquetas apropriadas para a distribuição para hospitais e clínicas em que a bula é para a indicação de tratamento de um distúrbio tal como aqui descrita em um sujeito. Medicamentos podem ser embalados como unidades únicas ou múltiplas. Instruções para a dose e administração das composições farmacêuticas da presente invenção podem ser incluídas com os pacotes de produtos farmacêuticos.
Aqui é fornecido um método de diagnóstico para fornecer uma amostra de células cancerosas de um tumor sólido ou plasma de um paciente a ser testado, detectar na amostra a expressão de pelo menos um gene ou produto do gene escolhido a partir de um painel de genes ou produtos de genes cuja expressão tenha sido correlacionada com a sensibilidade ou resistência a um inibidor da angiogênese, em que, pelo menos, um gene ou um produto do gene é escolhido a partir de um ou mais genes ou produtos de genes selecionados de entre o grupo consistindo de VEGF, VEGF receptor, HIF-Ια, receptor do fator de crescimento da placenta, e CD105, e comparando o nível de expressão de pelo menos um gene ou produto do gene detectado na amostra do paciente para um nível de expressão de pelo menos um gene ou produto do gene que tenha sido correlacionado com a sensibilidade ou resistência ao inibidor da angiogênese. Em uma modalidade, o inibidor da angiogênese é escolhido a partir de inibidores de receptores de VEGF, inibidores de VEGF, e inibidores de endoglina.
Aqui é fornecido um kit para a detecção de níveis de expressão de genes que foram correlacionados com a sensibilidade ou resistência a um inibidor da angiogênese em uma amostra de células cancerosas ou de plasma humano. Em uma forma de modalidade, um ou mais genes são selecionados dentre o VEGF, VEGF receptor, HIF-Ια, receptor do fator de crescimento da placenta, e endoglina.
INCORPORAÇÃO COMO REFERÊNCIA
Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nesta especificação são aqui incorporadas por referência na mesma medida como se cada publicação individual ou pedido de patente foi especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência na sua totalidade, a menos que especificamente de outra forma fosse notado. Este aplicativo contém referências a sequências de aminoácidos que tenham sido apresentados simultaneamente em anexo como a sequência de arquivos de texto lista "35882-706-202-SeqList.txt", tamanho do arquivo 67,843 kilobytes (KB), criado em 30 de março de 2010. A listagem de sequências acima mencionada é aqui incorporada por referência na sua totalidade em conformidade com o 37 CFR § 1,52 (e) (5).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1 fornece uma cadeia leve variável (Vl) humanizada O2-Vk1-39 possuindo os TRC105 CDRs Vl (sublinhado) monoclonais murinos quiméricos enxertados entre as regiões de estrutura (FRs) 1-3 da sequência humana O2-Vk1-39 e uma região da estrutura 4 a partir da sequência humana Jk4 (SEQ ID NO: 4) (todos em negrito). Variações que podem ser feitas ao FRs humano são indicadas nas posições 1, 3, 4, 5, 36, 46, 47, 60, 70, 71, 100, e 106 da sequência (sequência revelada na SEQ ID NO: 86) utilizando o sistema de numeração Kabat (mostrado em itálico abaixo da sequência humanizada).
Figura 2 fornece uma cadeia pesada variável (Vh) humanizada VH3-15 tendo o anticorpo monoclonal de murino monoclonal murino quimérico TRC105 Vh CDRs (sublinhada) enxertado entre as regiões de estrutura (FRs) 1-3 da sequência humana VH3-15 e uma região da estrutura 4 a partir da sequência JH4 humana (SEQ ID NO: 42) (todos em negrito). Um ou mais variações que podem ser feitas ao FRs humano são indicadas nas posições 49, 76, 77, 78, 82a, 89, 94, 108, 109, e 113 da sequência (sequência divulgada em SEQ ID NO: 87) utilizando o sistema de numeração de Kabat (mostrado em itálico abaixo da sequência humanizada).
Figura 3 fornece o diagrama da via de sinalização TGF-p/ALK5. A via TGF-p/ALK5 (A) conduz à inibição da proliferação e migração celular. A via TGF-p/ALK1 (B) induz a proliferação de células endoteliais e migração e requer CD105 (endoglina) para ALK1 de sinalização. As linhas pontilhadas indicam vias inativas ou bloqueadas. A seta em negrito indica a estimulação de uma via de sinalização.
Figura 4 fornece um alinhamento de sequência de aminoácidos de camundongo exemplares e cadeias VK humanizadas (SEQ ID NOS 1-5, respectivamente, por ordem de aparecimento) e cadeias Vh (SEQ ID NOS 39-43, respectivamente, por ordem de aparecimento) produzido de acordo com a invenção aqui descrita.
Figura 5 apresenta um alinhamento de sequências de aminoácidos do camundongo exemplar e cadeias super-humanizados VK (SEQ ID NOS 1 e 69-72, respectivamente, em ordem de aparição) e cadeias Vh (SEQ ID 39 e 73-75, respectivamente, na ordem de aparecimento) produzidas de acordo com a invenção aqui descrita.
Figura 6 fornece um alinhamento de sequência de aminoácidos e comparação de camundongo exemplar e cadeias VK humanizadas e super-humanizadas (SEQ ID NOS 1, 3 e 70, respectivamente, por ordem de aparecimento) e cadeias VH (SEQ ID NOS 39, 41 e 74, respectivamente, por ordem de aparecimento) produzido de acordo com a invenção aqui descrita.
Figura 7 ilustra a ligação da variante humanizada construida para endoglina em um ensaio de competição de ELISA.
Figura 8 competição ELISA com anticorpos anti-CD105 humanizados e humanizados/desimunizados. Concentrações variáveis de cada anticorpo foram misturadas com uma concentração fixa de anticorpo biotinilado anti-CD105 de referência (6,25ng/ml) e ligado ao CD105 (100ng/ml) capturado numa placa Nunc Maxisorp. A ligação foi detectada através de estreptavidina-HRP e substrato TMB. Absorvância (OD) a 450nm foi medida em um leitor de placas e esta foi representada graficamente contra a concentração de anticorpo de teste.
Figura 9 ilustra os dados de ensaio de ligação para variante VK1AAVH1A mais VK2 contendo controles.
Figura 10 ilustra os dados de ensaio de ligação para quimérico em comparação com VK1AAVH1A2 e VK2AAVH1A2.
Figura 11 ilustra os dados de ensaio de ligação para quimérico em comparação com VK2AAVH1Q.
Figura 12 ilustra os dados de ensaio de ligação para quimérico em comparação com VK2AAVH1R.
Figura 13 ilustra os dados de ensaio de ligação para quimérico em comparação com VK1AAVH1A2.
Figura 14 ilustra os dados de ensaio de ligação para quimérico em comparação com VK1AAVH1Q.
Figura 15 ilustra os dados de ensaio de ligação para quimérico em comparação com VK1AAVH1R.
Figura 16 ilustra os dados de ensaio de ligação para quimérico em comparação com VK2AAVH1A2.
Figura 17 ilustra a primeira região variável de cadeia pesada humanizada desimunizada com CDRs em negrito e sublinhado (sequência divulgada na SEQ ID NO: 89) .
Variações que podem ser feitas são indicadas nas posições identificadas da sequência utilizando o sistema de numeração de Kabat (sequência revelada em SEQ ID NO: 116) (mostrado em itálico abaixo da sequência humanizada). As variações podem ser feitas como uma única mutação ou como mais do que uma mutação, e variações podem ser feitas com mutações em qualquer combinação.
Figura 18 ilustra a primeira cadeia leve de região variável humanizada desimunizada com CDRs em negrito e sublinhado (sequência divulgada na SEQ ID NO: 93) . Variações que podem ser feitas são indicadas nas posições identificadas da sequência utilizando o sistema de numeração de Kabat (sequência divulgada em SEQ ID NO: 117) (mostrado em itálico abaixo da sequência humanizada). As variações podem ser feitas como uma única mutação ou como mais do que uma mutação, e variações podem ser feitas com mutações em qualquer combinação.
Figura 19 ilustra a análise da cadeia pesada de regiões de (SEQ ID NO: 41) utilizando iTope™. Peptídeos abrangendo toda a sequência foram testados como peptídeos 9mer em incrementos de um aminoácido. A previsão da ligação de cada resíduo como âncora p1 de um peptídeo núcleo 9mer de alelos de MHC de classe II é indicada por um "O" se a ligação teve de resultado de 0,55-0,6 e por um "X" se o resultado de ligação foi >0,6. Regiões contendo peptídeos potencialmente imunogênicos são indicados na coluna "iTope", o cinza escuro indica peptídeos de ligação de MHC de classe II promíscuos de alta afinidade, o cinza claro indica peptídeos de ligação do MHC de classe II promíscuos de afinidade moderada. Os números de alelos de MHC de classe II previstos para ligação são mostrados nas colunas: "total" e "alta afinidade". Resíduos de ancoragem potenciais p1 identificados como sequências germinativas são mostradas no tipo reverso na coluna "Sequência".
Figura 20 ilustra a análise das regiões variantes de variantes da cadeia pesada (SEQ ID NO: 118) usando iTope™. Peptídeos abrangendo toda a sequência foram testados como peptídeos 9mer em incrementos de um aminoácido. A previsão da ligação de cada resíduo como âncora p1 de um peptídeo núcleo 9mer de alelos de MHC de classe II é indicada por um "O" se a ligação teve de resultado de 0,55-0,6 e por um "X" se o resultado de ligação foi > 0,6. Regiões contendo peptídeos potencialmente imunogênicos são indicados na coluna "iTope", o cinza escuro indica peptídeos de ligação de MHC de classe II promíscuos de alta afinidade, o cinza claro indica peptídeos de ligação do MHC de classe II promíscuos de afinidade moderada. Os números de alelos de MHC de classe II previstos para ligação são mostrados nas colunas: "total" e "alta afinidade” e a diferença de ligação é mostrada. Resíduos de ancoragem potenciais p1 identificados como sequências germinativas são mostradas no tipo reverso na coluna "Sequência" e as diferenças de aminoácidos nas variantes são enquadradas.
Figura 21 ilustra a análise das regiões da cadeia leve (SEQ ID NO: 3) utilizando iTope™. Peptídeos abrangendo toda a sequência foram testados como peptídeos 9mer em incrementos de um aminoácido. A previsão da ligação de cada resíduo como âncora p1 de um peptídeo núcleo 9mer de alelos de MHC de classe II é indicada por um "O" se o resultado de ligação teve resultado de 0,55-0,6 e por um "X" se o resultado de ligação foi >0,6. Regiões contendo peptídeos potencialmente imunogênicos são indicados na coluna "iTope", o cinza escuro indica peptídeos de ligação de MHC de classe II promíscuos de alta afinidade, o cinza claro indica peptídeos de ligação do MHC de classe II promíscuos de afinidade moderada. Os números de alelos de MHC de classe II previstos para ligação são mostrados nas colunas: "total" e "alta afinidade”. Resíduos de ancoragem potenciais p1 identificados como sequências germinativas são mostradas no tipo reverso na coluna "Sequência".
Figura 22 ilustra a análise das regiões variantes da cadeia leve (SEQ ID NO: 101) usando iTope™. Peptídeos abrangendo toda a sequência foram testados como peptídeos 9mer em incrementos de um amino-ácido. A previsão da ligação de cada resíduo como âncora p1 de um peptídeo núcleo 9mer de alelos MHC classe II é indicada por um "O" se a ligação teve de resultado de 0,55-0,6 e por um "X" se o resultado de ligação foi >0,6. Regiões contendo peptídeos potencialmente imunogênicos são indicados na coluna "iTope", o cinza escuro indica peptídeos de ligação de MHC de classe II promíscuos de alta afinidade, o cinza claro indica peptídeos de ligação do MHC de classe II promíscuos de afinidade moderada. Os números de alelos de MHC de classe II previstos para ligação são mostrados nas colunas "total" e de "alta afinidade” e a diferença de ligação é mostrada. Resíduos de ancoragem potenciais p1 identificados como sequências germinativas são mostradas no tipo reverso na coluna de "Sequência" e as diferenças de aminoácidos nas variantes são enquadradas.
Figura 23 ilustra a frequência de alótipos de MHC de Classe II na população mundial e da população do estudo.
Figura 24 o anticorpo antiendoglina quimérico, o anticorpo humanizado antiendoglina VK1VH1 e o anticorpo humanizado/desimunizado antiendoglina VK1AAVH1A2 foram testados em EpiScreen™ em duração de ensaios de células T utilizando CMSP de 20 doadores. Culturas a granel de CMSP incubados com anticorpos de teste foram mostradas nos dias 5, 6, 7 e 8, e pulsadas com 3H-timidina. As células foram colhidas e a incorporação de radioatividade medida por contagem de cintilação. Os resultados para cada amostra triplicata foram calculados e normalizados pela conversão de índice de estimulação (SI). O SI para cada ponto de tempo com cada doador é mostrado acima para o anticorpo quimérico TRC105 (Figura 24A), VK1VH1 (Figura 24B) e VK1AAVH1A2 (Figura 24C). O ponto de corte para determinar respostas positivas com uma SIh2 se destaca pela linha pontilhada e respostas significativas (p<0,05 em um teste t de Student) são indicados (*).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Deve ser entendido que esta modalidade não se limita a formulações particulares ou parâmetros de processo, uma vez que estes podem, é claro, variar. É também para ser compreendido que a terminologia utilizada aqui é para a finalidade de descrever apenas formas de modalidade particulares, e não se destina a ser limitativa. Além disso, entende-se que um número de métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos podem ser usados na prática da presente invenção.
Em conformidade com o presente pedido, podem ser empregadas técnicas de biologia molecular convencionais, microbiologia, e de DNA recombinante dentro da arte da técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura. Veja, por exemplo, Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Labocamundongory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Labocamundongory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984), cada um dos quais está especificamente incorporado aqui como referência em sua totalidade.
Os anticorpos monoclonais murinos (mAbs) têm sido elevados contra endoglina o que modula a atividade da endoglina e, assim, inibe a angiogênese e/ou inibe a vasodilatação dos vasos sanguíneos pequenos. Estes anticorpos murinos são descritos em patentes U.S. 5.928.641, 6.200.566, 6.190.660, e 7.097.836 que são aqui incorporadas na sua totalidade. Além disso, o ex vivo e ín vivo em termos de eficiência de um número destes anticorpos foi demonstrada; estes anticorpos monoclonais que se ligam à endoglina são de interesse como compostos de modulação de endoglina. O uso terapêutico destes anticorpos murinos não é viável, contudo, como a sua administração tem um número de limitações, incluindo a imunogenicidade, por exemplo, sob a forma de anticorpos humanos anticamundongo (HAMA). Os anticorpos humanizados são feitos para tratar estas reações.
Os anticorpos humanizados que se ligam à endoglina, que são aqui descritas, exibem imunogenicidade reduzida ao mesmo tempo em que mantêm e/ou melhoram a sua especificidade. Além disso, para resolver os problemas associados com os anticorpos murinos, anticorpos humanizados que se ligam à endoglina diminuem e/ou inibem a angiogênese que são aqui descritos exibem imunogenicidade reduzida ao mesmo tempo em que mantêm e/ou melhoram a sua especificidade. Estes anticorpos humanizados de endoglina são úteis para o diagnóstico e tratamento de várias condições e doenças, bem como para a purificação e detecção de endoglina.
I- OS ANTICORPOS ANTI-ENDOGLINA
Fornecidos aqui estão anticorpos humanizados, e fragmentos de ligação de antígeno que se ligam à endoglina. A endoglina pode ser encontrada em células que compreendem e apoiam a vasculatura existente, bem como células que estão promovendo o crescimento da, e tornando-se parte da, nova vascularização. Estes anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno podem se ligar à endoglina e, assim, inibir a angiogênese, inibir a vasculatura existente ou a manutenção da vasculatura existente, e/ou inibir a dilatação de pequenos vasos. Daqui em diante, uma referência aos termos "anticorpo" ou "anticorpos" é para ser considerada parte integrante de qualquer um dos fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito e os termos são para serem intermutáveis, quando aplicável. Em adição à sua utilização para a purificação de endoglina, estes anticorpos são úteis para a detecção, purificação e fins de diagnóstico, bem como fins terapêuticos. Os anticorpos aqui proporcionados podem ser usados para a formulação de medicamentos para o tratamento de uma variedade de condições e doenças, métodos para o tratamento de tais condições e doenças e métodos de detecção ou diagnóstico. Tal como aqui utilizado, a angiogênese é inclusiva do crescimento e/ou do desenvolvimento de novos vasos sanguíneos (também referido como neovascularização), dilatação dos vasos pequenos excessiva, ou crescimento vascular prolongado, e manutenção da vasculatura existente. Condições e doenças de angiogênese referem-se a essas doenças e condições relacionadas, causadas por, ou associadas com a angiogênese. Exemplos não limitativos de tais doenças incluem, por exemplo, várias formas de doenças oculares caracterizadas por angiogênese/neovascularização (por exemplo, degeneração macular, NVC, retinopatia diabética), nefropatia diabética, doenças inflamatórias crônicas (por exemplo, DIC), artrite reumatóide, ósteoartrite, e várias formas de câncer (tumor primário e metástases).
A. TERMINOLOGIA DOS ANTICORPOS
Tal como aqui utilizado, "anticorpo" se refere a uma imunoglobulina (Ig) de ocorrência natural ou parcial ou totalmente produzido sinteticamente. O termo também abrange qualquer polipeptídeo ou proteína que possui um domínio de ligação que é, ou é homóloga a, um domínio de ligação de antígeno. O termo inclui ainda "fragmentos de ligação de antígeno" e outros termos semelhantes intercambiáveis para fragmentos de ligação tais como os descritos abaixo. Regiões determinantes de complementaridade (CDR) de anticorpos enxertados e outros anticorpos humanizados (incluindo modificações de CDR e modificações na região estrutural) são também contemplados por este termo.
Anticorpos nativos e imunoglobulinas nativas são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, composta de duas cadeias leves (L) idênticos e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está normalmente ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada cadeia pesada e leve também têm pontes dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem numa extremidade um domínio variável ("Vh") seguido por um número de domínios constantes ("CH"). Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade ("VL") e um domínio constante ("CL") na sua outra extremidade, o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e a domínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidos particulares formam uma inteFRace entre os domínios variáveis de cadeia leve e pesada.
Os termos "polinucleotídeo sintético", "gene sintético" ou "polipeptídeo sintético," tal como aqui utilizado, significa que a sequência polinucleotídica correspondente ou parte da mesma, ou sequência de aminoácidos ou parte dele, é derivada, a partir de uma sequência que foi concebida, ou sintetizada de novo, ou modificada, em comparação com um equivalente de ocorrência natural sequência. Polinucleotídeos sintéticos (anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno) ou genes sintéticos podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado à síntese química de ácido nucléico ou sequências de aminoácidos. Genes sintéticos são tipicamente diferentes dos genes que ocorrem naturalmente, quer no nível de aminoácido, ou de polinucleotídeo (ou ambos), e são tipicamente localizadas dentro do contexto de sequências sintéticas de controle de expressão. Por exemplo, sequências de genes sintéticos podem incluir o aminoácido, ou polinucleotídeo, as sequências que foram alteradas, por exemplo, pela substituição, deleção ou adição, de um ou mais, aminoácidos, ou nucleotídeos, proporcionam assim um anticorpo sequência de aminoácidos, ou uma sequência polinucleotídica de codificação que é diferente da sequência fonte. Sequências polinucleotídicas de genes sintéticos podem não necessariamente codificar proteínas com diferentes aminoácidos, em comparação com o gene natural, por exemplo, eles podem também englobar sequências sintéticas polinucleotídicas que incorporam códons diferentes, mas que codificam o mesmo aminoácido (isto é, as alterações de nucleotídeos representam mutações silenciosas em nível de aminoácido).
No que diz respeito aos anticorpos, "domínio variável" refere-se aos domínios variáveis de anticorpos que são utilizados na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para o seu antígeno específico. No entanto, a variabilidade não está distribuída uniformemente ao longo dos domínios variáveis de anticorpos. Pelo contrário, é concentrada em três segmentos chamados regiões hipervariáveis (também conhecido como CDRs) em ambos domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. Porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são chamadas de "regiões de estrutura" ou "FRs." Os domínios variáveis não modificados de cadeias pesada e leve cada um contém quatro FRs (FR1, FR2, FR3 e FR4), em grande parte adotando uma configuração de folhas-β intercaladas com três CDRs, que formam ligações em alça, em alguns casos, com uma parte da estrutura folhas-β. Os CDRs em cada cadeia são mantidos juntos em estreita proximidade pelo FRs e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígeno de anticorpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669).
Os termos "região hipervariável" e "CDR" quando aqui utilizados, referem-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígeno. Os CDRs compreendem os resíduos de aminoácidos a partir de três regiões de sequências que se ligam de uma forma complementar a um antígeno e são conhecidos como CDR1, CDR2 e CDR3 para cada uma das cadeias Vh e Vl. No domínio variável de cadeia leve, os CDRs tipicamente correspondem a cerca de 24-34 resíduos (CDRL1) e 50-56 (CDRL2) e 89-97 (CDRL3), e no domínio variável da cadeia pesada os CDRs tipicamente correspondem a cerca de 31-35 resíduos (CDRH1), 50-65 (CDRH2) e 95-102 (CDRH3) de acordo com Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Entende-se que as CDRs de anticorpos diferentes podem conter inserções, assim, a numeração de aminoácidos pode ser diferente. As contas do sistema de numeração de Kabat para tais inserções com um esquema de numeração que utiliza letras ligadas a resíduos específicos (por exemplo, 27A, 27B, 27C, 27D, 27E e 27F de CDRL1 na cadeia leve) para refletir quaisquer inserções nas numerações entre diferentes anticorpos. Alternativamente, no domínio variável de cadeia leve, os CDRs tipicamente correspondem a cerca de 26-32 resíduos (CDRL1), 50-52 (CDRL2) e 91-96 (CDRL3), e no domínio variável da cadeia pesada, os CDRs tipicamente correspondem aos cerca de 26-32 resíduos (CDRH1), 53-55 (CDRH2) e 96-101 (CDRH3) de acordo com Chothia e Lesk, J. Mol. Biol, 196:901-917 (1987)).
Tal como aqui utilizado, "região estrutural" ou "FR" refere-se a resíduos estruturais de aminoácidos que formam uma parte do receptáculo ou encaixe de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, os resíduos estruturais formam um circuito fechado que é uma parte do receptáculo ou encaixe de ligação de antígeno e os resíduos de aminoácidos na alça podem ou não estar em contato com o antígeno. Regiões de estrutura compreendem geralmente as regiões entre os CDRs. No domínio variável de cadeia leve, o FRs tipicamente correspondem a cerca de 0-23 resíduos (FRL1), 35-49 (FRL2) e 57-88 (FRL3), e 98-109 e no domínio variável da cadeia pesada do FRs tipicamente correspondem a cerca de 0-30 resíduos (FRH1), 36-49 (FRH2) e 66-94 (FRH3), e 103-133 de acordo com Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Como discutido acima, com a numeração Kabat para a cadeia leve, da cadeia pesada também é responsável por inserções de uma maneira semelhante (por exemplo, 35A, 35B de CDRH1 na cadeia pesada). Em alternativa, no domínio variável de cadeia leve, os FRs tipicamente correspondem a cerca de 025 resíduos (FRL1) e 33-49 (FRL2) 53-90 (FRL3), e 97-109 (FRL4), e, no domínio variável de cadeia pesada, o FRs tipicamente correspondem a cerca de 0-25 resíduos (FRH1) e 33-52 (FRH2) e 56-95 (FRH3), e 102-113 (FRH4) de acordo com Chothia e Lesk, J. Mol. Biol, 196: 901-917 (1987)).
Os aminoácidos da alça de um FR podem ser avaliados e determinados por inspeção da estrutura tridimensional de uma cadeia pesada de anticorpo e/ou cadeia leve de anticorpo. A estrutura tridimensional pode ser analisada por posições acessíveis ao solvente de aminoácidos como tais posições são susceptíveis a formar um laço e/ou fornecer contato com o antígeno em um domínio variável do anticorpo. Algumas das posições acessíveis ao solvente podem tolerar diversidade de sequência de aminoácidos e outros (por exemplo, as posições estruturais) são, geralmente, menos diversificados. A estrutura tridimensional do domínio variável de anticorpos pode ser derivada de uma estrutura de cristal ou de modelagem protéica.
Os domínios constantes (Fc) de anticorpos não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas, em vez disso, exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo na dependente de anticorpos toxicidade celular através de interações com, por exemplo, receptores Fc (FCR). Domínios de Fc podem também aumentar a biodisponibilidade de um anticorpo em circulação após a administração a um paciente.
Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias destas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada (Fc) que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas que são denominadas α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de quaisquer espécies de vertebrados podem ser atribuídas a um dos dois tipos claramente distintos, chamado kappa ou ("κ" ou "K") e lambda ou ("λ"), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.
Os termos "porção de ligação de antígeno de um anticorpo", "fragmentos de ligação de antígeno", "domínio de ligação de antígeno", "fragmento de anticorpo" ou um "fragmento funcional de um anticorpo" são aqui utilizados indiferentemente para se referir a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Exemplos não limitativos de fragmentos de anticorpo incluídos dentro tais termos incluem, mas não estão limitados a, (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste no Vl, Vh, Cl e Ch1 domínios, (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que contém dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de charneira, (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios de Vh e Chi, (iv) um fragmento Fv que contém os domínios Vl e Vh de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544 546), que contém um domínio Vh e (vi) um CDR isoladas. Além disso, incluídos nesta definição estão "um meio" anticorpos de cadeia única compreendendo uma cadeia pesada única e uma cadeia leve única. Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como diacorpos são também englobados neste documento.
As metades "F(ab')2" e "Fab'" podem ser produzidas por tratamento de uma Ig com uma protease, tais como a pepsina e a papaína, e incluem fragmentos de anticorpos gerados por digestão de imunoglobulina perto das ligações de dissulfeto que existem entre as regiões de charneira em cada uma das duas cadeias pesadas. Por exemplo, a papaína cliva IgG à montante das ligações de dissulfeto que existem entre as regiões de charneira em cada uma das duas cadeias pesadas para gerar dois fragmentos de anticorpos homólogos em que uma cadeia leve de composto de VL e CL (região constante da cadeia leve), e uma cadeia pesada fragmento composto de Vh e Chyi (γ1) uma região da região constante da cadeia pesada) são ligados nas suas regiões terminais C através de uma ligação de dissulfeto. Cada um destes dois fragmentos de anticorpos homólogos é chamado Fab'. Pepsina cliva também a jusante de IgG das ligações de dissulfeto existentes entre as regiões de charneira em cada uma das duas cadeias pesadas para gerar um fragmento de anticorpo ligeiramente maior do que o fragmento em que os dois acima mencionados Fab' estão ligados na região de charneira. Este fragmento de anticorpo é chamado F(ab')2. O fragmento Fab também contém o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (Ch1) de cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxílico do domínio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteína(s) a partir da região de charneira do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' em que o resíduo de cisteína(s) dos domínios constantes suportam um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas dobradiças entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos. "Fv" se refere a um fragmento de anticorpo que contém um reconhecimento completo de antígeno e um sítio de ligação de antígeno. Esta região consiste de um dímero de um cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em associação, ligação não covalente ou covalente (dissulfeto ligada Fv têm sido descritos na arte, Reiter et al. (1996) Nature Biotechnology 14:1239-1245). É nesta configuração que os três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígeno na superfície do dímero de VH-VL. Coletivamente, uma combinação de um ou mais dos CDRs de cada uma das cadeias VH e VL confere especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Por exemplo, seria ser entendido que, por exemplo, o CDRH3 e CDRL3 poderiam ser suficientes para conferir especificidade de ligação de antígeno de um anticorpo quando transferido para as cadeias VH e VL de um anticorpo receptor ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo e esta combinação de CDRs pode ser testada por afinidade, ligação etc utilizando qualquer uma das técnicas aqui descritas. Mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDR específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora provavelmente uma menor afinidade do que quando combinado com um segundo domínio variável. Além disso, embora os dois domínios de um fragmento Fv (VL e VH), sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos através de métodos recombinantes por um ligante sintético que lhes permite ser feita como uma cadeia de proteína única em que as regiões Vl e Vh formam moléculas monovalentes (conhecida como de cadeia única Fv (scFv);. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; e Osbourn et al (1998) Nat. Biotechnol. 16:778). Tais scFvs também se destinam a ser englobadas no âmbito do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo. Quaisquer sequências Vh e Vl de scFv específico pode ser ligada a uma região Fc das sequências de cDNA ou genômica, a fim de gerar os vetores de expressão que codificam completos Ig (por exemplo, IgG), moléculas ou outros isotipos. Vh e Vl podem também ser utilizados na geração de Fab, Fv ou outros fragmentos de Igs usando química de proteínas ou tecnologia de DNA recombinante.
Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "sfv" compreendem os domínios Vh e Vl de um anticorpo, em que estes domínios estão presentes numa única cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligante de polipeptídeo entre os domínios Vh e Vl que permite que o sFv forme a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Para uma revisão de sFvs ver, por exemplo, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). O termo "AVIMER™" se refere a uma classe de proteínas terapêuticas de origem humana, que não estão relacionadas com os anticorpos e fragmentos de anticorpos, e são compostas por vários modulares e reutilizáveis domínios de ligação, referidos como domínios A (também referido como módulo de classe A, tipo complementar repetição, ou receptor LDL de domínio classe A). Eles foram desenvolvidos a partir dos receptores humanos de domínios extracelulares por in vitro éxon e disposição de fagos (Silverman et al, 2005, Nat Biotechnol 23:1493-1494; Silverman et al, 2006, Nat Biotechnol 24:220). As proteínas resultantes podem conter múltiplos e independentes domínios de ligação que podem exibir afinidade melhorada (em alguns casos, subnanomolar) e especificidade em comparação com um único epítopo de proteínas de ligação. Ver, por exemplo, Pedido dePatente U.S. Publ. N°s 2005/0.221.384, 2005/0.164.301,2005/0.053.973 e 2005/0.089.932, 2005/0.048.512, e 2004/0.175.756, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
Cada um dos 217 domínios A humanos conhecidos compreende ~35 aminoácidos (~4 kDa), e estes domínios estão separados por ligações de em média de cinco aminoácidos de comprimento. Domínios A nativos dobram de forma rápida e eficiente para formar uma estrutura uniforme e estável mediada principalmente através da ligação do cálcio e formação de dissulfeto. Um motivo de estrutura conservada de apenas 12 aminoácidos é necessário para esta estrutura comum. O resultado final é uma cadeia de proteína única contendo múltiplos domínios, cada um dos quais representa uma função separada. Cada domínio das proteínas se liga de forma independente e as contribuições energéticas de cada domínio são aditivas. Estas proteínas foram chamadas de "AVIMERS™" de multímeros de avidez. O termo "diacorpos" se refere a fragmentos pequenos de anticorpo com dois locais de ligação do antígeno, em que fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligada a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (Vh-Vl). Ao utilizar um ligante que é demasiadamente curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação de antígeno. Os diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 6448 (1993).
Polipeptídeos de ligação de antígeno também incluem dímeros de cadeia pesada, tais como, por exemplo, anticorpos de camelídeos e de tubarões. Os anticorpos de camelos e de tubarão compreendem um par homodimérico de duas cadeias de domínios tipo-V e tipo-C (nenhum dos dois tem uma cadeia leve). Uma vez que a região Vh de um dímero de cadeia pesada de IgG em um camelídeo não tem que fazer interações hidrofóbicas com uma cadeia leve, a região na cadeia pesada que, normalmente, contata uma cadeia leve é alterada para resíduos hidrofílicos de aminoácidos de um camelídeo. Domínios Vh de cadeia pesada dímero IgGs são chamadas de domínios Vhh de Ig-NARS de tubarão que compreendem um homodímero de um domínio variável (denominado um domínio V-NAR) e cinco domínios tipo-C constantes (domínios C-NAR). Em camelídeos, a diversidade de repertório de anticorpos é determinada pela CDRs 1, 2 e 3 nas regiões Vh ou Vhh. O CDR3 da região Vhh do camelo é caracterizada pelo seu comprimento relativamente longo, com uma média de 16 aminoácidos (Muyldermans et al, 1994, Protein Engineering 7 (9):. 1129). Isto está em contraste com a CDR3 regiões de anticorpos de muitas outras espécies. Por exemplo, a CDR3 de Vh de camundongo tem uma média de 9 aminoácidos. Bibliotecas de camelídeos derivados de regiões variáveis de anticorpos, que mantêm a diversidade ín vivo das regiões variáveis de um camelídeo, podem ser feitas, por exemplo, os métodos divulgados no Pedido de Patente. U.S. N ° 20050037421.
Formas de anticorpos não humanos "humanizados" (por exemplo, de murino) incluem anticorpos quiméricos que contêm a sequência mínima derivada a partir de uma Ig não humana. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas Igs(receptor de anticorpo) em que um ou mais dos CDRs do receptor são substituídos por CDRs de um anticorpo de uma espécie não humana (anticorpo do doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a desejada especificidade, afinidade e função de ligação. Em alguns casos, um ou mais resíduos de aminoácidos FR da Ig humana são substituídos pelos correspondentes resíduos de aminoácidos não humanos. Além disso, os anticorpos humanizados podem conter resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo do doador. Estas modificações podem ser feitas para refinar o desempenho do anticorpo, se necessário. Um anticorpo humanizado pode compreender substancialmente todo de pelo menos um e, em alguns casos, dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente a totalidade da FRs são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado, opcionalmente, também pode incluir pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986);
Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
Um anticorpo humanizado também inclui anticorpos em que parte ou todos os CDRs da cadeia leve e pesada são derivados de um anticorpo não humano monoclonal, substancialmente todas as porções restantes das regiões variáveis são derivadas da região variável humana (tanto cadeia pesada e leve), e as regiões constantes são derivadas a partir de uma região constante humana. Em uma forma de modalidade, as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 das cadeias pesadas e leves são derivadas de um anticorpo não humano. Em ainda outra modalidade, pelo menos, um CDR (por exemplo, uma CDR3) das cadeias pesada e leve é derivado de um anticorpo não humano. Várias combinações de CDR1, CDR2 e CDR3 podem ser derivadas de um anticorpo não humano e são aqui contempladas. Num exemplo não limitativo, uma ou mais das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cada uma das cadeias pesadas e leves são derivadas de um clone de anticorpo monoclonal quimérico de murino TRC105. O termo "anticorpo monoclonal", tal como aqui utilizado refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto quanto a possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com preparações convencionais (policlonais) de anticorpos, que podem incluir anticorpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não é para ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, U.S. Pat. No. 4, 816, 567). Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais podem ser isolados de bibliotecas de fagos de anticorpos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por exemplo.
Os anticorpos podem ser isolados e purificados a partir do sobrenadante da cultura ou de ascite mencionados acima por precipitação com sulfato de amônio saturado, método de precipitação euglobulina, método do ácido capróico, método do ácido caprílico, cromatografia de troca iônica (DEAE ou DE52), ou cromatografia de afinidade utilizando coluna de anticorpos anti-Ig ou uma coluna de proteína A, G ou L tal como descrito em mais detalhes abaixo.
Anticorpos exemplificativos para utilização nas composições e métodos aqui descritos são moléculas de imunoglobulina intactas, tais como, por exemplo, um anticorpo humanizado ou aquelas porções de uma molécula de Ig humanizada que contêm o sítio de ligação do antígeno (isto é, pacamundongopo) ou uma única cadeia pesada e uma única cadeia leve, incluindo as porções conhecidas na arte como Fab, Fab', F(ab)', F(ab')2, Fd, scFv, um domínio pesado variável, um domínio leve variável, um domínio NAR variável, scFv biespecífico, um Fab2 biespecífico, uma Fab3 triespecífico e um polipeptídeos de cadeia simples de ligação e outros, também referidos como fragmentos de ligação do antígeno. Ao construir uma molécula de imunoglobulina ou seus fragmentos, regiões variáveis ou porções dos mesmos, podem ser fundidas com, ligados a, ou de outro modo unidos a uma ou mais regiões constantes ou porções dos mesmos para produzir qualquer um dos anticorpos ou seus fragmentos aqui descritos. Isto pode ser conseguido em uma variedade de formas conhecidas na técnica, incluindo, mas não limitado a, técnicas de clonagem molecular ou por síntese direta dos ácidos nucléicos que codificam as moléculas. Exemplos de não limitativos de métodos de construção de tais moléculas podem também ser encontrados nos exemplos aqui descritos.
Em uma forma de modalidade exemplar, o pedido contempla uma única cadeia de ligação polipeptídica possuindo uma cadeia pesada de região variável, e/ou uma cadeia leve de região variável, que se ligam à endoglina e têm, opcionalmente, uma região Fc da imunoglobulina. Em uma forma de modalidade exemplar, a aplicação contempla uma única cadeia ligação polipeptídica possuindo uma cadeia pesada de região variável, e/ou uma cadeia leve de região variável, que se liga à endoglina e inibe a angiogênese e tem, opcionalmente, uma região Fc da imunoglobulina. Tal molécula é um fragmento de cadeia única variável tendo opcionalmente a função efetora ou meia-vida aumentada através da presença da região Fc da imunoglobulina. Métodos de preparação de polipeptídeos de cadeia simples de ligação são conhecidos na técnica (por exemplo, Pedido de patente U.S, No. 2005/0.238.646).
Os termos "segmentos de genes da linhagem germinativa" ou "sequências germinativas" se referem aos genes da linhagem germinativa (os gametas haplóides e as células diplóides a partir do qual são formados). O DNA germinativo contém múltiplos segmentos de genes que codificam uma cadeia Ig única pesada ou leve. Estes segmentos de genes são realizados nas células germinativas, mas não pode ser transcrita e traduzida em cadeias pesadas e leves, até que estão dispostas em genes funcionais. Durante a diferenciação de células B na medula óssea, estes segmentos de genes são misturadas aleatoriamente por um sistema dinâmico genético capaz de gerar mais de 108 especificidades. A maioria destes segmentos de genes são publicados e coletados pelo banco de dados da linha germinativa.
Como usado aqui, "imunorreativa" refere-se a agentes de ligação, aos anticorpos ou fragmentos que são específicos para uma sequência de resíduos de aminoácidos ("sítio de ligação" ou "epítopo"), ainda se apresentam reação cruzada com outros peptídeos/proteínas, não são tóxicos para os níveis em que são formuladas para administração para uso humano. O termo "obrigatório" refere-se a uma associação direta entre duas moléculas, devido, por exemplo, a ligação covalente, eletrostática, hidrofóbica e iônica e/ou de hidrogênio, interações em condições fisiológicas, incluindo interações como pontes de sal e de água e pontes quaisquer outros meios convencionais de ligação. O termo "preferencialmente se liga" significa que o agente de ligação liga-se ao sítio de ligação com maior afinidade do que liga sequências de aminoácidos não relacionadas. De preferência, a afinidade seja pelo menos uma vez maior, pelo menos, duas vezes maior, pelo menos três vezes maior, pelo menos quatro vezes maior, pelo menos 5 vezes maior, pelo menos, 6 vezes maior, pelo menos, 7 vezes maior, pelo menos, 8 vezes maior, pelo menos, nove vezes maior, 10 vezes maior, pelo menos 20 vezes maior, pelo menos 30 vezes maior, pelo menos 40 vezes maior, pelo menos 50 vezes maior, pelo menos 60 vezes maior, pelo menos 70 vezes maior, pelo menos 80 vezes maior, pelo menos 90 vezes maior, pelo menos 100 vezes maior, ou pelo menos 1000 vezes maior do que a afinidade do agente de ligação para sequências de aminoácidos independentes. Os termos "imunorreativa" e "preferencialmente se liga" são aqui utilizados indiferentemente.
Tal como aqui utilizado, o termo "afinidade" se refere à constante de equilíbrio da ligação reversível de dois agentes, e é expressa como KD. Afinidade de uma proteína de ligação a um ligante tal como a afinidade de um anticorpo para um epítopo pode ser, por exemplo, desde cerca de 100 nanomolar (nM) a cerca de 0,1 nM, a partir de cerca de 100 nm a cerca de 1 picomolar (pM), ou a partir de cerca 100 nm a cerca de 1 femtomolar (fM). Tal como aqui utilizado, a "avidez" refere-se à resistência de um complexo de dois ou mais agentes de dissociação após a diluição. Afinidades aparentes podem ser determinadas por métodos tais como um ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) ou qualquer outra técnica conhecida para um especialista na técnica. Avidez pode ser determinada por métodos tais como uma análise de Scatchard ou qualquer outra técnica conhecida para um especialista na técnica. "Epítopo" se refere à parte de um antígeno ou outra macromolécula capaz de formar uma interação de ligação com o receptáculo de ligação da região variável de um anticorpo. Tais interações de ligação podem ser manifestadas como um contato intermolecular com um ou mais resíduos de aminoácidos de um ou mais CDRs. Ligação de antígenos pode envolver, por exemplo, um CDR3 ou um par CDR3 ou, em alguns casos, as interações de até todos os seis CDRs das cadeias VH e VL. Um epítopo pode ser uma sequência polipeptídica linear (isto é, "contínuo") ou pode ser composta de sequências de aminoácidos não contíguas (por exemplo, "conformacional" ou "descontínua"). Um anticorpo é capaz de reconhecer uma ou mais sequências de aminoácidos e, portanto, o epítopo pode definir mais do que uma sequência de aminoácido distinta. Epítopos reconhecidos pelos anticorpos podem ser determinados por técnicas de mapeamento de peptídeos e da sequência de análise bem conhecidas de um versado na técnica. Interações de ligação são manifestadas como contatos intermoleculares com um ou mais resíduos de aminoácidos de um CDR. TRC105 é um anticorpo quimérico que tem a mesma sequência de aminoácido variável que o anticorpo de murino descrito como Y4-2F1 ou SN6j em Patentes U.S. N°s 5,928,641; 6.200.566; 6.190.660; e 7.097.836. Epítopos reconhecidos por Y4-2F1 e SN6j e, portanto, TRC105, tinham sido previamente identificadas. O termo "específico" se refere a uma situação em que um anticorpo não mostra qualquer ligação significativa a outras moléculas do que o antígeno contendo o epítopo reconhecido pelo anticorpo. O termo é também aplicável quando, por exemplo, um domínio de ligação de antígeno é específico para um epítopo particular que é transportado por um número de antígenos, caso em que o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que carrega o domínio de ligação do antígeno será capaz de se ligar a os vários antígenos que transportam o epítopo. Os termos "preferencialmente se liga" ou "se liga especificamente" significa que os anticorpos ou seus fragmentos ligam a um epítopo com maior afinidade do que se liga às sequências de aminoácidos não relacionadas e, se reatividade cruzada para outros polipeptídeos que contêm o epítopo, não são tóxicos em os níveis em que eles são formulados para administração para uso humano. Em um aspecto, a afinidade seja pelo menos 1 vez maior, pelo menos, 2 vezes maior, pelo menos 3vezes maior, pelo menos 4 vezes maior, pelo menos 5 vezes maior, pelo menos, 6 vezes maior, em pelo menos 7 vezes maior, pelo menos 8 vezes maior, pelo menos, 9 vezes maior, 10 vezes maior, pelo menos 20 vezes maior, pelo menos 30 vezes maior, pelo menos 40 vezes maior, pelo menos 50 vezes maior, pelo menos, 60 vezes maior, pelo menos 70 vezes maior, pelo menos 80 vezes maior, pelo menos 90 vezes maior, pelo menos 100 vezes maior, ou pelo menos 1000 vezes maior do que a afinidade do anticorpo ou seu fragmento para independentes sequências de aminoácidos. Os termos "imunorreativa", “se liga", "preferencialmente se liga" e "se liga especificamente" são aqui utilizados indiferentemente. O termo "obrigatório" refere-se a uma associação direta entre duas moléculas, devido, por exemplo, a uma ligação covalente, eletrostática, hidrofóbica e iônica e/ou de hidrogênio, interações em condições fisiológicas, e inclui interações com pontes salinas e pontes de água, bem como quaisquer outros meios convencionais de ligação. A frase "substituição de aminoácidos conservativos" se refere a um agrupamento de aminoácidos com base em certas propriedades comuns. Uma forma funcional para definir as propriedades comuns entre aminoácidos individuais é analisar as frequências normalizadas de alterações de aminoácidos entre as proteínas correspondentes de homólogos organismos (Schulz, GE e RH de Schirmer, Principies of Protein Structure, Springer-Verlag). De acordo com tais análises, os grupos de aminoácidos podem ser definidos, nas quais os aminoácidos dentro de um grupo de troca preferencialmente um com o outro, e, portanto, se assemelham mais uns dos outros no seu impacto sobre a estrutura da proteína total (Schulz, G. E. e R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Exemplos de grupos de aminoácidos definidos deste modo incluem: (i) um grupo carregado, consistindo de Glu e Asp, Lys, Arg e His, (ii) um grupo carregado positivamente, consistindo de Lys, Arg e His, (iii) um grupo carregado negativamente, que consiste em Glu e Asp, (iv) um grupo aromático, constituído por Phe, Tyr e Trp, (v) um grupo de anel de azoto, consistindo de His e Trp, (vi) um grande grupo não polar alifático, consistindo de Val, Leu e Ile, (vii) um grupo ligeiramente polar, consistindo de Met e Cys, (viii) um grupo de resíduos pequenos, que consiste em Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln e Pro, (ix) o grupo consistindo de um grupo alifático Val, Leu, Ile, Met e Cys, e (x) um pequeno grupo hidroxilo consiste em Ser e Thr.
Além dos grupos apresentados acima, cada resíduo de aminoácido pode formar o seu próprio grupo, bem como o grupo formado por um aminoácido individual pode ser referido simplesmente por uma e/ou três letras de abreviatura para que o aminoácido comumente usado na técnica, como descrito acima.
Um "resíduo conservado" é um aminoácido que é relativamente constante ao longo de uma gama de proteínas semelhantes. Resíduos conservados frequentemente irão variar apenas por serem substituídos com um aminoácido semelhante, tal como descrito acima para "substituição de aminoácidos conservativa". A letra "x" ou "xaa" tal como utilizada em sequências de aminoácidos aqui se destina a indicar que qualquer um dos vinte aminoácidos que podem ser colocados nesta posição a menos que seja especificamente indicado de outra maneira. Para efeitos de desenho peptidomimético, um "x" ou "xaa" em uma sequência de aminoácidos pode ser substituído por um do aminoácido mimético presente na sequência alvo, ou o aminoácido pode ser substituído por um espaçador de essencialmente de qualquer forma que não inteFRira com a atividade peptidomimético. "Homologia" ou "identidade" ou "semelhança" se refere a similaridade de sequência entre dois peptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucléico. Homologia e identidade podem cada uma ser determinada por comparação de uma posição em cada sequência que pode ser alinhada, para fins de comparação. Quando uma posição equivalente em comparação com as sequências é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são idênticas em que a posição, quando o local equivalente ocupado pelo mesmo ou um resíduo de ácido semelhante amino (por exemplo, similar de natureza estérica e/ou eletrônica), então as moléculas podem ser referidas como homólogas (semelhantes) nessa posição. Expressão como uma percentagem de homologia/identidade ou similaridade refere-se a uma função do número de aminoácidos idênticos ou semelhantes nas posições partilhadas pelas sequências comparadas. Uma sequência que é "não relacionado" ou "não homólogo" partes identidade menos 40%, embora, de preferência inferior a 25% de identidade com uma sequência da presente invenção. Ao comparar duas sequências, a ausência de resíduos (aminoácidos ou ácidos nucleicos) ou presença de resíduos adicionais também diminui a identidade e homologia/similaridade. O termo "homologia" descreve uma comparação baseada matematicamente em sequência de semelhanças que é usada para identificar genes ou proteínas com funções similares ou motivos. As sequências de ácido nucléico (de nucleotídeos, oligonucleotídeos) e de aminoácidos (proteínas) da presente invenção podem ser utilizadas como uma "sequência de consulta" para executar uma pesquisa em bases de dados públicas para, por exemplo, identificar outros membros da família, sequências relacionadas ou homólogas. Estas buscas pode ser realizada utilizando os programas NBLAST e XBlast (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Pesquisas no BLAST de nucleotídeos podem ser realizadas com o programa NBLAST, com pontuação = 100 e comprimento da palavra = 12 para se obter sequências de nucleotídeos homólogos a moléculas de ácido nucléico da invenção. Pesquisas BLAST de aminoácidos podem ser realizadas com o programa XBlast com pontuação = 50 e comprimento de palavra = 3 para se obter sequências de aminoácidos homóloga a moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos espaçados para fins de comparação, BLAST espaçado pode ser utilizado tal como descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17) :3389-3402. Quando se utiliza BLAST e programas BLAST espaçados, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBlast, e BLAST) podem ser usados (ver www.ncbi.nlm.nih.gov).
Tal como aqui utilizado, "identidade" significa a percentagem de resíduos de ácido idênticos de nucleotídeos ou aminoácidos nas posições correspondentes em duas ou mais sequências, quando as sequências estão alinhadas para maximizar a correspondência de sequência, ou seja, tendo em conta as lacunas e inserções. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo, mas não se limitando aos descritos em (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Métodos para determinar identidade são designados para fornecer a maior similaridade entre as sequências testadas. Além disso, métodos para determinar a identidade estão codificados em programas de computador disponíveis publicamente. Métodos de programas de computador para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados a, o pacote do programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) and Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). O programa BLAST X está disponível publicamente pelo NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). O algoritmo bem conhecido de Smith Waterman pode também ser utilizado para determinar a identidade. "Isolado" (utilizado de forma intercambiável com "substancialmente puro") quando aplicado a polipeptídeos significa um polipeptídeo ou uma porção sua que, em virtude da sua origem ou manipulação: (i) está presente numa célula hospedeira como o produto de expressão de uma porção de um vetor de expressão, ou (ii) está ligado a uma proteína ou porção química diferente daquela ao qual está ligado na natureza, ou (iii) não ocorre na natureza, por exemplo, uma proteína que é quimicamente manipulada anexando, ou aRNAionando pelo menos uma porção hidrofóbica para a proteína de modo a que a proteína está numa forma não encontrado na natureza. Por "isolado", significa adicionalmente uma proteína que é: (i) sintetizado quimicamente, ou (ii) expresso numa célula hospedeira e purificado afastado da associação e proteínas contaminantes. O termo geralmente significa um polipeptídeo que foi separado de outras proteínas e ácidos nucléicos com os quais ocorre naturalmente. De preferência, o polipeptídeo é também separado de substâncias tais como anticorpos ou matrizes de gel (poliacrilamida) que são usados para purificar.
Tal como aqui utilizado, os termos "inibitório de angiogênese," "inibição da angiogênese" ou "antiangiogênico" incluem vasculogênese, e significão efetuar uma diminuição na extensão, na quantidade, ou na taxa de neovascularização. Efetuar uma diminuição na extensão, na quantidade, ou na taxa de proliferação das células endoteliais ou migração no tecido é um exemplo específico de inibição da angiogênese. O termo "composição inibitória de angiogênese" se refere a uma composição que inibe a angiogênese mediada por processos tais como a migração de células endoteliais, a proliferação, a formação do tubo e, subsequentemente, condução à inibição da geração de novos vasos sanguíneos a partir dos existentes, e, consequentemente, o afetamento das condições dependentes da angiogênese.
Tal como aqui utilizado, o termo "condição da angiogênese-dependentes" pretende significar uma condição em que o processo de angiogênese ou vasculogênese mantém ou aumenta uma condição patológica ou beneficamente influencia processos fisiológicos normais. Portanto, o tratamento de uma condição de angiogênese dependente em que a angiogênese sustenta uma condição patológica poderia resultar na mitigação da doença, enquanto o tratamento de uma condição de angiogênese dependente em que a angiogênese beneficamente influencia processos fisiológicos normais poderia resultar em, por exemplo, melhoria de um processo normal. A angiogênese é a formação de novos vasos sanguíneos a partir de capilares pré-existentes ou vênulas pós-capilares. A vasculogênese resulta na formação de novos vasos sanguíneos resultantes de angioblastos que são precursores de células endoteliais. Ambos os processos resultam na formação de novos vasos sanguíneos e estão incluídos no significado do termo condições angiogênese-dependentes. O termo "angiogênese" tal como aqui utilizado destina-se a incluir a formação de novo de vasos, tais como o que resultará na vasculogênese, bem como aqueles resultantes de ramificação e surgimento de vasos existentes, capilares e vênulas. A angiogênese também pode ser inclusiva da indução de sinalização de ALK1 e fosforilação de Smad 1/5/8 relacionada e/ou de sinalização. CD105 também é conhecido por ser envolvido na via de sinalização ALK1 e é, portanto, também incluído dentro do significado de angiogênese. "Induzir uma resposta imune do hospedeiro" significa que um paciente experimenta alívio ou redução de sinais ou sintomas de doença, e, especificamente, inclui, sem limitação, o prolongamento da sobrevivência. Em certas formas de realização preferidas dos métodos de acordo com a invenção, uma célula T produtora de CD8+ IFN-γ é ativada para induzir a resposta imune de um linfócito T citotóxico (CTL) no paciente em que foi administrado o antagonista. Em certas formas de modalidade dos métodos de acordo com a invenção, célula T produtora de CD4+IFN-y é ativado para induzir uma resposta imune de células T auxiliar no paciente em que foi administrada a composição. Estas células T ativadas produtoras de CD4+IFN-y (isto é, células T auxiliares) fornecem uma ajuda imunológica necessária (por exemplo, por libertação de citocinas) para induzir e manter não só a CTL, mas também uma resposta humoral imune mediada por células B. Assim, em certas formas de modalidade dos métodos de acordo com a invenção, uma resposta humoral para o antígeno é ativada no paciente em que foi administrada a composição. Em um aspecto, um adjuvante pode ser adicionado à composição para aumentar uma resposta imune. Adjuvantes são bem conhecidos na técnica. A ativação de uma célula T CD8+ e/ou CD4+ significa fazer com que células T tenham a capacidade de produzir citocinas (por exemplo, o IFN-γ) para realmente produzir uma ou mais citocina(s), ou para aumentar a sua produção de uma ou mais citocina(s). "A indução da resposta de CTL" significa fazer com que linfócitos T citotóxicos exponham potencialmente a citotoxicidade antígeno-específica. "Citotoxicidade antígeno-específica" significa citotoxicidade contra uma célula que apresenta um antígeno que está associado com o antígeno associado ao câncer que é maior do que um antígeno que não está associado com um câncer. "Citotoxicidade" refere-se à capacidade do linfócito T citotóxico de matar uma célula-alvo. Citotoxicidade antígeno-específica, pode ser pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes maior, pelo menos cerca de 100 vezes maior, ou mais de citotoxicidade contra uma célula que não apresenta o antígeno não associado com o câncer. Citotoxicidade da célula dependente mediada por anticorpos (CCDA), também inclui a ativação de células assassinas naturais ("células NK") que medeiam a morte celular através da ligação de anticorpos. Os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito podem mediar CCDA através de células NK por meio da ligação de endoglina.
Como usado aqui, os termos "doença proliferativa" e "condição proliferativa" significa qualquer condição patológica ou fisiológica não patológica caracterizada pela proliferação anormal ou indesejável. Os termos "distúrbio celular proliferativo" e "condição celular proliferativa" significa qualquer condição patológica ou não patológica fisiológica caracterizada por proliferação celular aberrante ou indesejável, bem como as condições incluindo as característica da proliferação celular indesejável ou indesejada ou a sobrevivência das células (por exemplo, devido à apoptose deficiente), condições caracterizadas por apoptose deficiente ou aberrante ou deficiente, bem como condições caracterizadas por sobrevivência celular aberrante ou indesejável ou não desejada. O "distúrbio diferenciativo" significa qualquer condição patológica ou não patológica caracterizada pela diferenciação fisiológica anormal ou deficiente.
Distúrbios proliferativos ou diferenciativos passíveis de tratamento incluem doenças e condições fisiológicas não patológicas, benignas e neoplásicas, caracterizadas pelo número de células anormais ou indesejáveis, o crescimento celular ou sobrevivência celular. Tais distúrbios ou condições podem, por conseguinte, constituir um estado de doença e incluem todos os tipos de tumores cancerosos ou processos oncogênicos, tecidos ou células metastáticas malignamente transformadas, tecidos ou órgãos, ou pode ser não patológico, isto é, um desvio do normal, mas que não é tipicamente associado com a doença. Um exemplo específico de uma condição patológica que não pode ser tratada de acordo com o invento é um re-crescimento de tecido de reparação de feridas que resulta em cicatrizes. Células compreendendo o distúrbio proliferativo ou diferenciativo podem ser agregadas em uma massa de células ou serem dispersas. O "tumor sólido" se refere a neoplasias ou metástases que geralmente agregam e formam uma massa. Exemplos específicos incluem tumores viscerais como gástrico ou câncer de cólon, hepatoma, carcinomas venais, pulmão e tumores/câncer cerebrais. Um "tumor não sólido" refere-se a neoplasias do sistema hematopoiético, tal como linfomas, mielomas e leucemias, ou neoplasias que são difusas na natureza, como eles normalmente não formam uma massa sólida. Os exemplos particulares de leucemias incluem, por exemplo, mieloma múltiplo, linfoblástico e mieloblástico, agudo e crônico.
Essas doenças incluem neoplasias ou cânceres, o que pode afetar virtualmente qualquer célula ou tipo de tecido, por exemplo, carcinoma, sarcoma, melanoma, distúrbios metastáticos ou distúrbios neoplásicos hematopoiéticos. Um tumor metastático pode surgir a partir de uma multiplicidade de tipos de tumores primários, incluindo, mas não limitado a de mama, de pulmão, da tireoide, cabeça e de pescoço, de cérebro, linfoide, gastrointestinal (boca, esófago, estômago, intestino delgado, cólon, reto), genital do trato urinário (útero, ovário, colo do útero, bexiga, pênis, testículos, próstata), de rim, de pâncreas, de fígado, de osso, de músculo, de pele, etc.
Carcinomas se referem a neoplasias malignas de tecido epitelial ou endócrino, e incluem os carcinomas do aparelho respiratório, carcinomas do sistema gastrointestinal, carcinomas aparelho geniturinário, carcinomas testiculares, carcinomas de mama, carcinoma de próstata, carcinomas do sistema endócrino e melanomas. Carcinomas exemplares incluem aqueles que formam a partir do colo do útero, pulmão, próstata, mama, cabeça e pescoço, do cólon, fígado e ovário. O termo também inclui carcinosarcomas, por exemplo, que incluem tumores malignos compostos de tecidos carcinomatosos e sarcomatosos. Adenocarcinoma inclui um carcinoma de um tecido glandular, ou em que o tumor forma uma glândula como a estrutura.
Um tecido ocular a ser tratado é, por exemplo, um tecido da retina de um paciente com retinopatia diabética, degeneração macular ou glaucoma neovascular e a angiogênese a ser inibida é a angiogênese do tecido da retina, onde há neovascularização do tecido da retina.
Um tecido canceroso a ser tratado é, por exemplo, um tecido endotelial expressando um nível anormal de endoglina. Tal como aqui utilizado, o termo "células transformadas" refere-se a células que foram convertidas espontaneamente a um estado de crescimento descontrolado, isto é, que adquiriram a capacidade de crescer através de um número indefinido de divisões em cultura. As células transformadas podem ser caracterizadas por termos tais como neoplásica, anaplásico e/ou hiperplásico, com respeito à sua perda de controle do crescimento. Para os fins desta invenção, os termos "fenótipo transformado de células de mamíferos malignas" e "fenótipo transformado" têm a intenção de abranger, mas não se limitar a, qualquer uma das seguintes características fenotípicas associados com a transformação celular de células de mamíferos: imortalização, transformação moFRológica ou do crescimento, e tumorigenicidade, como detectado pelo crescimento prolongado em cultura de células, o crescimento em meios semissólidos, ou o crescimento tumorigênico em animais imunoincompetentes ou singenéico. O termo "antígeno de célula tumoral" é aqui definido como um antígeno que está presente em quantidades mais elevadas de uma célula tumoral ou nos fluidos corporais do que as células tumorais não relacionados, as células normais, ou em fluido corporal normal. A presença de antígeno pode ser testada por qualquer número de ensaios conhecido dos versados na técnica e incluem, sem limitação, seleção negativa e/ou positiva de anticorpos, tais como um ensaio de ELISA, um radioimunoensaio, ou por Western Blot.
Os termos "apoptose" ou "morte celular programada" se refere ao processo fisiológico pelo qual as células indesejáveis ou inúteis são eliminadas durante o desenvolvimento e outros processos biológicos normais. A apoptose é uma modalidade de morte celular que ocorre sob condições fisiológicas normais e a célula é um participante ativo em sua própria morte ("suicídio celular"). É mais frequentemente encontrada durante a renovação celular normal e homeostase do tecido, na embriogênese, na indução e manutenção da tolerância imunológica, no desenvolvimento do sistema nervoso e da atrofia do tecido sistema endócrino dependente. Células em apoptose mostram características moFRológicas e bioquímicas. Esses recursos incluem agregação de cromatina, condensação nuclear e citoplasmática, a partição de citoplasma e núcleo em vesículas de membrana ligadas (corpos apoptóticos), que contêm ribossomos, mitocôndrias e material nuclear moFRologicamente intactos. In vivo, estes corpos apoptóticos são rapidamente reconhecidos e fagocitados por macrófagos, células dendríticas ou células epiteliais adjacentes. Devido a este mecanismo eficaz para a remoção de células apoptóticas in vivo, não é induzida uma resposta inflamatória. In vitro, os corpos apoptóticos, bem como os fragmentos celulares restantes, em última análise incham e finalmente lisam. Nesta Estágio terminal de ensaios in vitro a morte celular foi denominada "necrose secundária." A apoptose pode ser medida por métodos conhecidos dos versados na técnica como a fragmentação do DNA, a exposição de anexina V, a ativação das caspases, a libertação de citocromo c etc. Uma célula que tenha sido induzida a morrer é denominada aqui como um "celular apoptótica". "Agente indutor de apoptose" é aqui definido para induzir a apoptose/morte celular programada, e incluem, por exemplo, irradiação, agentes quimioterapêuticos ou agentes de ligação de receptores, células em que, por exemplo, as células tumorais são induzidas a sofrer a morte celular programada. Exemplos de agentes indutores de apoptose são descritos em mais detalhe abaixo. A apoptose pode ser testada utilizando um padrão de de Ensaio de Apoptose de Anexina V do NIH: Células OVCAR-3 são cultivadas em placas de 6 poços (NUNC) e irradiadas ou tratadas com um antagonista (ou em combinação com outra droga anticâncer) de 4-48 horas, lavadas e coradas com anexina V-FITC (BD-Pharmingen) durante 1 hora. As células são analisadas por citometria de fluxo (Becton-RNAkinson, CellQuest), contrastadas com iodeto de propídio e analisadas novamente no citômetro de fluxo.
B. MÉTODOS PARA FAZER E EXPRESSAR ANTICORPOS ANTIENDOGLINA HUMANIZADOS
Um anticorpo monoclonal quimérico que se liga à endoglina foi desenvolvido. Esse anticorpo foi designado TR105 (também conhecido como c-SN6j).
Em um aspecto, os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos aqui descritos foram criados por humanização das sequências VL e VH do anticorpo monoclonal quimérico TRC105 (SEQ ID NOS. 1 e 39, respectivamente).
Imunoglobulinas humanizadas, incluindo anticorpos humanizados, foram construídas por meio de engenharia genética. Imunoglobulinas mais humanizadas que foram anteriormente descritas têm uma estrutura composta que é idêntica ao da estrutura de uma cadeia de imunoglobulina humana particular (isto é, um aceitador ou do receptor), e três CDRs de uma cadeia de imunoglobulina não humana (isto é, doador). Tal como aqui descrito, a humanização pode também incluir critérios que um número limitado de aminoácidos no quadro de uma cadeia de imunoglobulina humanizada é identificado e escolhido para ser o mesmo que os aminoácidos nessas posições no doador, em vez de no aceitador, a fim de aumentar ou manter a afinidade de um anticorpo que compreende a cadeia de imunoglobulina humanizada. A presente invenção é baseada, em parte, no modelo que duas causas que contribuem para a perda de afinidade em meios anteriores de produção de anticorpos humanizados (utilizando como anticorpos exemplos do camundongo como a fonte de CDRs) são: (1) quando os CDRs do camundongo são combinados com uma estrutura humana, os aminoácidos nas estruturas próximas dos CDRs tornar humano em vez de camundongo. Sem pretender serem limitados pela teoria, estes aminoácidos podem ser ligeiramente distorcer os CDRs (por exemplo, eles podem criar diferentes forças eletrostáticas ou hidrofóbicas do que no anticorpo de camundongo doador, e os CDRs distorcidos pode não tornar eficaz o contatos com o antígeno como os CDRs fazem no anticorpo doador), (2) também, aminoácidos no anticorpo original de camundongo que estão perto de, mas não fazem parte dos, os CDRs (isto é, ainda parte da estrutura), pode fazer contatos com o antígeno que contribuir para afinidade. Estes aminoácidos são perdidos quando o anticorpo humanizado é porque, em geral, todos os aminoácidos são feitas de enquadramento humano. Para contornar estes problemas, e para produzir anticorpos humanizados que têm uma afinidade muito forte para um antígeno desejado, os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação de antígeno podem ser construídos usando um ou mais dos seguintes princípios.
Um princípio não limitante é que, por exemplo, como aceitador, uma estrutura é utilizada a partir de uma imunoglobulina humana particular que é invulgarmente homóloga à imunoglobulina doadora a ser humanizada, ou utilizar uma estrutura de consenso de muitos anticorpos humanos é usado como um aceitador. Por exemplo, a comparação da sequência de uma região de cadeia pesada de camundongo (ou leve) variável contra regiões humanas pesadas (ou leve) variável de um banco de dados (por exemplo, o National BiomeRNAal Research Foundation Protein Identification Resource ou a base de dados sequência da proteína do National Center for Biotechnology Information -NCBI) mostra que a extensão de homologia com diferentes regiões humanas pode variar muito, por exemplo, desde cerca de 40% a cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou superior. Ao escolher como a imunoglobulina aceitadora uma das regiões humanas variável da cadeia pesada que é mais homóloga à região variável da cadeia pesada da imunoglobulina doadora, menos aminoácidos serão alterados na ida da imunoglobulina doadora para a imunoglobulina humanizada. Ao escolher como a imunoglobulina humana aceitadora uma das regiões variáveis de cadeia leve que é mais homóloga à região variável de cadeia leve da imunoglobulina doadora, menos aminoácidos serão alterados na ida da imunoglobulina doadora para a imunoglobulina humanizada. Geralmente, usando tais técnicas, há uma menor possibilidade de mudar um aminoácido próximo de uma ou mais das CDRs, que distorça a sua conformação. Além disso, a forma exata geral de um anticorpo humanizado que compreende a cadeia de imunoglobulina humanizada pode ser mais parecida com a forma do anticorpo doador, reduzindo assim a possibilidade de distorcer os CDRs.
Pode-se também usar cadeias leves e pesadas do mesmo anticorpo humano como sequências aceitadoras, para melhorar a probabilidade de que a luz humanizada e cadeias pesadas façam contatos favoráveis com cada outro. Alternativamente, pode-se também usar cadeias leves e pesadas de diferentes sequências de anticorpos humanos da linha germinativa como sequências aceitadoras; quando tais combinações são utilizadas, pode-se facilmente determinar se o VH e VL ligar um epítopo de interesse utilizando ensaios convencionais (por exemplo, um ELISA). Num exemplo, o anticorpo humano será escolhido em que as sequências das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas, tomadas em conjunto, são em geral mais homólogas à luz dadora e a sequências da região variável de cadeia pesada. Às vezes maior peso vai ser dado à sequência da cadeia pesada. Independentemente da forma como a imunoglobulina aceitadora é escolhida, a maior afinidade pode, em alguns casos, ser conseguida através da seleção de um pequeno número de aminoácidos no âmbito da cadeia de imunoglobulina humanizada para ser o mesmo que os aminoácidos nas posições no doador antes do que no aceitador. Métodos de maturação de afinidade são conhecidos na arte.
Os anticorpos humanizados possuem geralmente pelo menos três vantagens potenciais sobre os anticorpos de camundongo ou quiméricos para utilização em terapia humana. Porque a porção efetora de um anticorpo é humana, isso é acreditado para interagir melhor com as outras partes do sistema imunitário humano (por exemplo, destruir as células alvo de forma mais eficiente pelo complemento dependente de citotoxicidade (CDC) ou anticorpo dependente da citotoxicidade celular (CCDA)). Além disso, o sistema imunológico humano não deve reconhecer a estrutura ou região constante do anticorpo humanizado como estranhos, e, por conseguinte, a resposta de anticorpos contra esse anticorpo injetado deve ser menor do que contra um anticorpo de camundongo totalmente estranho ou um anticorpo quimérico parcialmente externo. Finalmente, os anticorpos de camundongo são conhecidos por ter uma meia-vida em circulação humana que é muito mais curta do que a meia-vida de anticorpos humanos. Os anticorpos humanizados podem, presumivelmente, ter uma meia-vida mais semelhante às que ocorrem naturalmente nos anticorpos humanos, permitindo que doses menores e menos frequentes sejam administradas. A humanização de anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos pode ser realizada através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica e aqui descritos. Do mesmo modo, a produção de anticorpos humanizados pode também ser conseguida através de métodos conhecidos na técnica e aqui descritos. Métodos para modificações de regiões da estrutura são conhecidos na técnica e são aqui contemplados. Seleção de uma ou mais estruturas relevantes a posições de aminoácidos para alteração depende de uma variedade de critérios. Um critério para selecionar as estruturas dos aminoácidos pertinentes para troca pode ser as diferenças relativas de estruturas de resíduos de aminoácidos entre as moléculas doadoras e aceitadoras. Seleção das posições e estruturas pertinentes para troca usando esta abordagem tem a vantagem de evitar qualquer tendência subjetiva na determinação do resíduo ou qualquer viés em contribuição com a afinidade de ligação do CDR pelo resíduo.
Outro critério que pode ser utilizado para determinar as posições de aminoácidos relevantes para troca pode ser, por exemplo, a seleção de resíduos estruturais que são conhecidos por serem importantes ou contribuírem para a conformação de CDR. Por exemplo, resíduos estruturais canônicos são importantes para a conformação de CDR e/ou estrutura. Visar um resíduo de estrutura canônica como uma posição relevante para troca pode ser usado para identificar um resíduo de aminoácido mais compatível em contexto com a sequência associada ao seu doador de CDR. A frequência de um resíduo de aminoácido na posição de uma estrutura particular é outro critério que pode ser usado para a seleção de posições de estruturas relevantes de aminoácidos para mudar. Por exemplo, a comparação da estrutura selecionada, com sequências estruturais de outros na sua subfamília pode revelar resíduos que ocorrem em frequências menores em uma posição ou posições particulares. Posições albergando os resíduos de menos abundantes são igualmente aplicáveis para a seleção como uma troca posição da estrutura da região variável do aceitador.
As posições correspondentes de aminoácidos para troca também podem ser selecionadas, por exemplo, com base na proximidade de um CDR. Em certos contextos, os resíduos de FR podem participar da conformação do CDR e/ou ligação antígeno. Além disso, este critério pode ser igualmente utilizado para dar prioridade às posições relevantes selecionadas por outros critérios aqui descritos. Portanto, a diferenciação entre os resíduos proximais e distais a um ou mais CDRs representa uma forma de reduzir o número de posições relevantes para mudar.
Outros critérios para a seleção relevantes posições de estruturas de aminoácidos a troca a incluem, por exemplo, os resíduos que são conhecidos ou previstos a estar em um espaço tridimensional perto da inteFRace antígeno-CDR ou prevista para modular a atividade do CDR. Da mesma forma, resíduos estruturais que são conhecidos pelos, ou previstos para, os contatos de forma entre o de inteFRace da região variável de cadeia pesada (VH) e leve (VL) podem ser selecionados. Tais posições estruturais podem afetar a conformação e/ou afinidade de um CDR, modulando a ligação de receptáculo do CDR, interação com o antígeno (epítopo) ou interação com a VH e VL. Portanto, a seleção destas posições de aminoácidos para a construção de uma população diversa para o rastreio da atividade de ligação pode ser usada para identificar alterações de estrutura que substituam os resíduos que tenham efeitos prejudiciais sobre a conformação de CDR ou compensar os efeitos prejudiciais de resíduos que ocorrem em qualquer outra parte da estrutura.
Outros resíduos estruturais podem ser selecionados para incluir alterações nas posições de aminoácidos que são inacessíveis ao solvente. Estes resíduos são geralmente enterrados na região variável e são, portanto, capazes de influenciar a conformação da CDR ou interações com a VH e VL. Acessibilidade ao solvente pode ser prevista, por exemplo, a partir da hidrofobicidade relativa do ambiente criado pelas cadeias laterais de aminoácidos do polipeptídeo e/ou por tridimensionais dados estruturais conhecidos. A seguinte seleção de relevantes posições de aminoácidos nas CDRs doadoras, bem como quaisquer posições relevantes de aminoácidos nas regiões de estrutura desejadas para serem variadas, as alterações de aminoácidos em algumas ou todas as posições selecionadas podem ser incorporadas em ácidos nucléicos que codificam a estrutura da região variável e aceitadora de CDRs de doadores. Estruturas ou sequências de CDR alterados podem ser feitos e testados individualmente, ou podem ser sequencial ou simultaneamente combinados e testados. A variabilidade em qualquer ou todas as posições alteradas pode variar de poucos a uma pluralidade de diferentes resíduos de aminoácidos, incluindo todos os vinte aminoácidos de ocorrência natural ou equivalentes funcionais e seus análogos. Em alguns casos, não aminoácidos de ocorrência natural podem também ser considerados e são conhecidos na técnica. A seleção do número e localização das posições de aminoácidos para variar é flexível e pode depender da utilização pretendida e da eficiência desejada para a identificação da região variável alterada, com uma atividade desejável, tais como, substancialmente a mesma afinidade ou maior em comparação com a ligação da região variável do doador. A este respeito, maior será o número de alterações que são incorporadas em uma população da região variável alterada, mais eficiente, é para identificar, pelo menos, uma espécie que exibe uma atividade desejável, por exemplo, substancialmente a mesma ou superior afinidade de ligação como o doador. Alternativamente, quando o utilizador tem dados empíricos ou reais para o efeito de que certos resíduos de aminoácidos ou posições contribuem desproporcionalmente a afinidade de ligação, então pode ser desejável produzir uma população limitada de regiões variáveis alteradas que se concentram em mudanças dentro ou em torno desses resíduos identificados ou posições.
Por exemplo, se CDR enxertados com regiões variáveis são desejados, uma população de grande diversidade de regiões variáveis alteradas pode incluir todas as posições de regiões estruturais não idênticas entre a estrutura do doador e do aceitador e todas as mudanças únicas de posição de aminoácidos no CDR. Alternativamente, uma população de diversidade intermediária pode incluir subconjuntos, por exemplo, de apenas as posições de estruturas proximais não idênticas a serem incorporadas juntamente com todas as mudanças únicas de posição de aminoácidos no CDR para, por exemplo, aumentar a afinidade dos anticorpos humanizados ou seus fragmentos de ligação de antígeno. A diversidade das populações acima pode ser ainda aumentada por, por exemplo, adicionalmente, incluindo todos os de pares de mudanças de posição de aminoácidos no CDR. Em contraste, as populações centradas em resíduos ou posições pré-determinadas, que incorporam os resíduos de variantes com tão pouco ou menos que uma estrutura e/ou um posição de aminoácido no CDR podem similarmente ser construídos para detecção e identificação de uma região variável do anticorpo alterado. Tal como acontece com as populações acima, a diversidade de tais populações concentradas pode ser ainda aumentada pela expansão adicional das posições selecionadas para a mudança para incluir outras posições relevantes em uma ou ambas as regiões de estrutura e do CDR. Existem numerosas outras combinações que variam de poucas mudanças para muitas mudanças em uma ou ambas as regiões de estrutura e dos CDRs que podem adicionalmente ser utilizados, os quais irão resultar numa população de regiões variáveis alteradas que podem ser rastreadas para a identificação de pelo menos uma região alterada variável enxertada no CDR e ter a atividade desejada, por exemplo, atividade obrigatória para endoglina. Os versados na técnica conhecerão, ou podem determinar, que posições selecionadas de resíduos nas estruturas de CDRs ou doadoras, ou subconjuntos, podem ser variadas para produzir uma população para detecção e identificação de um anticorpo alterado da invenção tendo em conta os ensinamentos e orientações aqui fornecidas. Códons codificadores dos aminoácidos são conhecidos na técnica.
Outro método de humanizar anticorpos inclui um método denominado superhumanização. Superhumanização envolve os passos de obtenção de uma sequência polipeptídica de uma região de sujeito variável codificada por um gene do anticorpo não-humano maduro e identificação de um primeiro conjunto de tipos de estrutura canônicos CDR para pelo menos, dois CDRs dentro da região variável não humana anticorpo. Tipos de estruturas canônicas de CDR são os tipos de estrutura designada por Chothia (CITE). Chothia e colegas descobriram que porções críticas dos CDRs de muitos anticorpos adotam conformações quase idênticas ao esqueleto peptíRNAo, apesar de grande diversidade ao nível da sequência de aminoácidos. Por conseguinte, Chothia definiu para cada CDR em cada cadeia de um ou alguns "estruturas canônicas." Cada estrutura canônica especifica principalmente um conjunto de ângulos de torção do esqueleto peptíRNAo de um segmento contíguo de resíduos de aminoácidos que formam um laço.
Após a identificação do tipo de estrutura canônica do CDR, uma biblioteca de sequências polipeptídicas para as regiões de anticorpos humanos de variáveis para anticorpos humanos é também obtida. Esta biblioteca contém sequências para humanos das regiões variáveis da linha germinativa como codificados por segmentos de ácido nucléicos da linha germinativa, e pode incluir sequências de anticorpos humanos maduros. Em qualquer caso, o método inclui a identificação tipos de estrutura canônicas de CDR (isto é, um segundo conjunto de tipos de estrutura canônicas CDR) durante pelo menos dois CDRs para cada sequência dentro da biblioteca de sequências da região variável humana. A partir desta biblioteca é selecionado um subconjunto das sequências candidatas, comparando o primeiro conjunto de tipos de estrutura canônicas de CDR para o segundo conjunto de tipos de estrutura canônicos de CDR (por exemplo, comparando os tipos de estruturas canônicas de CDR de camundongos com tipos de estruturas canônicas de CDR de humanos, em locais correspondentes dentro da região variável) e selecionando as sequências humanas, onde o segundo conjunto de estrutura canônica de CDR é o mesmo que o primeiro conjunto de tipos de estruturas canônicas de CDR para as sequências de CDR, em locais correspondentes no interior das regiões variáveis não humanas e humanas, respectivamente. O método utiliza estas sequências candidatas da região variável humana como uma base para a construção de uma molécula quimérica que inclui pelo menos duas das sequências de CDR da região variável não humana (por exemplo, dos CDRs do camundongo), combinada com as regiões de estrutura a partir da sequência candidatas da região variável humana. O resultado da construção é que o anticorpo quimérico contém cada uma das sequências de CDR não humanas substituídas para cada uma das sequências humanas CDR em locais correspondentes das regiões variáveis de modo a que as sequências estruturais do anticorpo quimérico difere dos candidatos sequências estruturais humanas. A semelhança com os CDRs sujeito de sequências de anticorpos humanos candidatas é avaliado para cada domínio em dois níveis. Primeiramente, conformações tridimensionais idênticas de estrutura principal dos peptídeos do CDR são procuradas. Coordenadas atômicas determinadas experimentalmente dos CDRs sujeito são raramente disponíveis, daí semelhança tridimensional é aproximada por determinação tipos de estrutura canônicas de Chothia das CDRs de indivíduos e excluindo a futura consideração de candidatos que possuam estruturas canônicas diferentes. Secundariamente, o resíduo para resíduo de homologia entre CDRs de indivídups e os candidatos restantes de CDRs humanos é considerado, e o candidato com o maior homologia é escolhido. A escolha da homologia mais elevada é baseada em vários critérios utilizados para classificar regiões variáveis humanas candidatas que têm a mesma estrutura canônica como o indivíduo das regiões variáveis não humanas. O critério para classificar os membros do conjunto selecionado pode ser por identidade de sequência de aminoácidos ou de homologia de aminoácidos ou ambas. A identidade dos aminoácidos é uma pontuação simples de posição por encaixe de posição de resíduos de aminoácidos. A similaridade por homologia de aminoácidos é a posição por semelhança de posição na estrutura do resíduo de característico. A homologia pode ser marcada, por exemplo, de acordo com as tabelas e procedimentos descritos por Henikoff e Henikoff, (1992) matrizes de aminoácidos de substituição a partir de blocos de proteína, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 10915-10919, ou pela série BLOSUM descrita por Henikoff e Henikoff, (1996). As etapas são como se segue: a) determinar as sequências polipeptídicas dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo sujeito. Estes podem ser determinados por qualquer dos vários métodos, tais como sequenciamento de DNA dos respectivos genes após a clonagem de cDNA convencional; sequenciamento de DNA de produtos de clonagem que foram amplificados por reação em cadeia da polimerase a partir de transcritos invertidos ou de DNA da linha de hibridoma sujeito; ou sequenciamento de peptídeo de uma proteína de anticorpo purificado. b) Aplicar o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al, Id.. 1991) com as sequências de cadeia pesada e leve do anticorpo não humano sujeito. Determinar os tipos de estrutura canônica para cada um dos CDRs do anticorpo não humano sujeito. Esta determinação é feita a partir do exame da sequência de peptídeo em função das orientações discutidas em Chothia and Lesk (1987), Chothia et al (1992), Tomlinson et al (1995), Martin and Thornton (1996), and Al-Lazikani et al (1997).
As características salientes da determinação da estrutura canônica para cada um dos CDRs são como se segue. Para a cadeia pesada do CDR1, três tipos de estruturas canônicas são conhecidos atualmente. Atribuição de uma nova sequência é simples, porque cada tipo de estrutura canônica tem um número diferente de resíduos. Como descrito em Al-Lazikani et. al (1997), quando a numeração de Kabat é atribuído à sequência, a numeração de resíduos de 31-35 será a seguinte para as respectivas estruturas canônicas.
Estrutura canônica do tipo 1: 31, 32, 33, 34, 35.
Tipo de estrutura canônica 2: 31, 32, 33, 34, 35, 35a.
Estrutura canônica do tipo 3: 31, 32, 33, 34, 35, 35a, 35b.
Para a cadeia pesada CDR2, quatro tipos de estruturas canônicas são conhecidas atualmente. Várias têm números únicos de resíduos, e são facilmente distinguidas das suas únicas numerações de Kabat das posições 52-56, viz.: Tipo de estrutura canônica 1: 52, 53, 54, 55, 56.
Tipo de estrutura canônica 4: 52, 52a, 52b, 52c, 53, 54, 55, 56.
Tipos de estrutura canônica 2 e 3 para CDR2 de cadeia pesada têm números iguais de resíduos, portanto, devem ser distinguidas por pistas dentro da sua sequência, tal como discutido por Chothia et al (1992). A numeração Kabat do segmento contendo estas pistas é: 52, 52a, 53, 54, 55. O tipo de estrutura canônica 2 tem Pro ou Ser na posição 52a e Gly ou Ser na posição 55, com nenhuma restrição em outras posições. Tipo de estrutura canônica 3 tem Gly, Ser, Asn, Asp ou na posição 54, com nenhuma restrição em outras posições. Esses critérios são suficientes para resolver a atribuição correta na maioria dos casos. Além disso, o quadro de resíduo 71 é vulgarmente Ala, Val, Leu, Ile, Thr ou para o tipo de estrutura canonica 2 e vulgarmente Arg para o tipo de estrutura canônica 3. A cadeia pesada do CDR3 é o mais diversificado de todos os CDRs. Ele é gerado por processos genéticos, alguns de natureza aleatória, única de linfócitos. Consequentemente, as estruturas canônicas para CDR3 têm sido difícil de prever. Em qualquer caso, segmentos de genes humanos da linha germinativa V não codificar qualquer parte do CDR3; porque o gene V final segmentos em posição de Kabat 94, enquanto que as posições 95-102 codificam CDR3. Por estas razões, as estruturas canônicas de CDR3 não são geralmente consideradas na escolha de sequências humanas candidatas.
Para cadeia leve do CDR1, seis tipos de estruturas canônicas são conhecidos atualmente para CDR1 em cadeias kappa. Cada tipo de estrutura canônica tem um número diferente de resíduos, portanto, a atribuição de um tipo de estrutura canônica para uma nova sequência é aparente a partir da numeração de Kabat de posições de resíduos 27-31.
Estrutura canônica do tipo 1: 27, 29, 30, 31.
Tipo de estrutura canônica 2: 27, 28, 29, 30, 31.
Canonical tipo de estrutura 3: 27, 27a, 27b, 27c, 27d, 27e, 27F, 28, 29, 30, 31.
Tipo de estrutura canônica 4: 27, 27a, 27b, 27c, 27d, 27e, 28, 29, 30, 31.
Canonical tipo de estrutura 5, 27, 27a, 27b, 27c, 27d, 28, 29, 30, 31.
Tipo de estrutura canônica 6, 27, 27a, 28, 29, 30, 31.
Para a cadeia leve do CDR2, apenas um tipo de estrutura única canônica é conhecida por CDR2 em cadeias kappa, portanto, salvo excepcionais sequências de anticorpos sujeitos, a atribuição é automática. Para CDR3 de cadeia leve, até seis tipos de estruturas canônicas têm sido descritas para CDR3 em cadeias kappa, mas três destas são raras. As três mais comuns podem ser distinguidas pela sua extensão, refletida na numeração de Kabat das posições de resíduos 91-97: Tipo de estrutura canônica 1: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 (também com um Pro obrigatório na posição 95 e Gln, Asn, ou His na posição 90).
Tipo de estrutura canônica 3: 91, 92, 93, 94, 95, 97.
Tipo de estrutura canônica 5: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 96a, 97.
Depois de identificar os tipos de estruturas canônicas CDR dos anticorpos não humanos do inidívduo, os genes humanos do mesmo tipo de cadeia (pesada ou leve), que têm a mesma combinação de tipos de estruturas canônicas como o anticorpo sujeito são identificados para formar um grupo das sequências humanas candidatas. A maioria destes fragmentos de genes têm sido descobertos e já foram atribuídos a um tipo de estrutura canônica (Chothia et al, 1992, Tomlinson et al, 1995).
Para a cadeia pesada, a conformidade da CDR1 e CDR2 para os tipos de estrutura canônica do camundongo é avaliada, e os genes que não se conformam são excluídos. Para a cadeia leve, a conformidade da CDR1 e CDR2 de cada sequência humana para os tipos de estruturas canônicas do anticorpo sujeito é primeiro avaliado. O potencial de resíduos 89-95 de um gene Vk candidato para formar uma CDR3 do tipo mesma estrutura canônica como o anticorpo sujeito é avaliada, ao colocar uma fusão do gene com uma região J e a aplicação de critérios para determinação do tipo de estrutura CDR canônica do CDR3 com a sequência fundida, e sequências não conformes são excluídas.
Alternativamente, quando um domínio variável do anticorpo sujeito é de um tipo de estrutura canônica não disponível no genoma humano, os genes humanos da linha germinativa V que têm tipos de estrutura canônicas tridimensionalmente semelhantes, mas não idênticas, são consideradas para comparação. Tal circunstância ocorre frequentemente com cadeia em anticorpos murinos de kappa CDR1, incluindo dois dos exemplos descritos abaixo. Todos os 6 possíveis tipos de estrutura canônicas têm sido observados neste CDR de anticorpos murinos, enquanto que o genoma humano codifica apenas os tipos canônicos 2, 3, 4 e 6. Nestas circunstâncias, um tipo de estrutura canônica CDR tem comprimento de resíduos de aminoácidos dentro de dois comprimentos dos resíduos de aminoácidos da sequência não humana do sujeito podem ser selecionadas para a comparação. Por exemplo, onde um tipo de estrutura canônica 1 é encontrada no anticorpo sujeito, as sequências Vk humanas com o tipo de estrutura canônica 2 são utilizadas para comparação. Sempre que um tipo de estrutura canônica 5 é encontrada no anticorpo murino, as sequências de Vk humanas com qualquer tipo de estrutura canônica 3 ou 4 são utilizadas para comparação.
Sequências de anticorpos humanos maduros e reorganizados podem ser consideradas para a comparação de sequência. Tal consideração pode ser garantida sob uma variedade de circunstâncias, incluindo, mas não se limitando a casos em que a sequência humana madura (1) é muito estreita para linha germinativa, (2) não é conhecida a ser imunogênica nos seres humanos; ou (3) contém uma tipso de estruturas canônicas idêntica à do anticorpo sujeito, mas não encontrado na linha germinativa humana.
Para cada um dos genes V candidatos com que satisfaça os tipos de estruturas canônicas, resíduos para a identificação dos resíduos da sequência e/ou homologia com a sequência de sujeito é também avaliada para classificar as sequências humanas candidatas. Por exemplo, os resíduos avaliados são como se segue: (1) Kappa (κ) de cadeia leve de CDR de posições de resíduos de aminoácidos são CDR1 (2632), CDR2 (50-52), CDR3 (91-96), e (2) de cadeia pesada de CDR posições de resíduos de aminoácidos são CDR1 (31-35) e CDR2 (50-60). Além disso, a cadeia pesada de CDR3 posições de resíduos de aminoácidos 95-102 pode também ser considerada . A homologia resíduos-para-resíduos é primeiro marcada pelo número de resíduos de aminoácidos idênticos entre o sujeito e as sequências humanas candidatas. A sequência humana utilizada para a construção posterior de um anticorpo convertido é escolhida entre os 25 por cento dos candidatos com a maior pontuação. Quando apropriado, tal como quando sequências de vários candidatos têm pontuações de identidade semelhantes, a semelhança entre resíduos de aminoácidos não idênticos pode ser adicionalmente considerada como necessária. Encaixes alifático com alifático, aromático com aromático, ou polar com polar entre sujeito e os resíduos de sujeitos são adicionados às pontuações. Num outro exemplo, a avaliação quantitativa de homologia de sequência pode ser realizada utilizando matrizes de substituição com amino ácidos, tais como a matriz BLOSUM62 de Henikoff e Henikoff.
Uma sequência de sujeito para a região da estrutura terminal-C a sequência do CDR3 pode ser selecionada a partir do conjunto de segmentos humanos J conhecidos da linha germinativa. A sequência polipeptídica J é selecionada por meio da avaliação da homologia resíduo-resíduo para cada segmento J para as posições de sequência para os quais CDR3 e J se sobrepõem, utilizando os critérios de pontuação especificados para a avaliação de genes V candidatos como mencionado acima. O segmento da sequência polipeptídica do gene J utilizado para a construção posterior de um anticorpo convertido é escolhido entre os 25 por cento dos candidatos com a maior pontuação.
Como um exemplo, a cadeia quimérica variável contém pelo menos dois CDRs de uma sequência não humana sujeito, e sequências de estruturas de uma sequência humana candidata. Num outro exemplo, a cadeia leve quimérica contém três CDRs de uma sequência não humana sujeito e sequências de estruturas a partir de uma sequência humana candidata. Em outros exemplos, uma cadeia pesada quimérica contém pelo menos dois CDRs de uma cadeia pesada sujeito, e a sequência de estrutura de uma cadeia pesada humana candidata, ou um cadeia quimérica pesada contém cada uma de cadeia pesada dos CDRs e sequências estruturais candidatas sujeito de um cadeia pesada humana. Em ainda outro exemplo, uma cadeia pesada de anticorpo quimérico contém CDRs 1 e 2 a partir de uma sequência não humana sujeito e os resíduos 50-60 de CDR3 e os resíduos 61-65 de um de cadeia pesada do CDR humano candidata, juntamente com as sequências estruturais da sequência humana candidata. Num outro exemplo, uma sequência da cadeia pesada quimérica contém cada CDR a partir da sequência não humana do sujeito; estruturas das sequências 27-30 formam a sequência sujeito, e as sequências de enquadramento a partir das sequências candidatas. Em todos os casos, no entanto, a molécula de anticorpo quimérico contém não mais do que 10 resíduos de aminoácidos na sequência de estruturas que diferem dos da sequência de estruturas da ração variável humana candidata.
Quando um aumento da afinidade de um anticorpo humanizado é desejado, os resíduos dentro dos CDRs de um anticorpo convertido podem ser adicionalmente substituídos com outros aminoácidos. Tipicamente, não mais do que quatro resíduos de aminoácidos de uma CDR são alterados, e mais tipicamente não mais do que dois resíduos na CDR serão alterados, com exceção para a cadeia pesada de CDR2, onde tantos como 10 resíduos podem ser alterados. Alterações na afinidade podem ser medidas por métodos convencionais, tais como os aqui descritos (por exemplo, Biacore).
Os métodos de anticorpos super-humanizados são descritos em maior detalhe na Patente U.S. No. 6.881.557 que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
Anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo podem ser construídos e produzidos utilizando técnicas convencionais conhecidas na arte. Além disso, os anticorpos preparados de forma recombinante podem muitas vezes ser produzidos em grandes quantidades, particularmente quando se utiliza vetores de expressão de alto nível.
Os anticorpos podem ser sequenciados utilizando técnicas convencionais conhecidas na arte. Em um aspecto, as sequências de aminoácidos de um ou mais dos CDRs é inserida numa sequência sintética de, por exemplo, uma estrutura de anticorpo humano (ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo) para criar um anticorpo humano que pode limitar as reações colaterais adversas do tratamento de um paciente humano com um anticorpo não humano. As sequências de aminoácidos de um ou mais dos CDRs também podem ser inseridas numa sequência sintética de, por exemplo, uma proteína de ligação tal como uma AVIMER™ para criar um construto para administração em um paciente humano. Tais técnicas podem ser modificadas dependendo da espécie de animal a ser tratado. Por exemplo, para utilizações veterinárias, um anticorpo, fragmento de ligação do antígeno ou proteína de ligação podem ser sintetizados para administração de um não humano (por exemplo, um primata, uma vaca, um cavalo, etc.).
Em outro aspecto, utilizando técnicas reconhecidas na arte, tais como as fornecidas e incorporadas aqui, nucleotídeos que codificam sequências de aminoácidos de um ou mais dos CDRs podem ser inseridos, por exemplo, por técnicas recombinantes em locais de restrição de endonucleases de um polinucleotídeo existente que codifica um anticorpo, fragmento de ligação do antígeno ou proteína de ligação.
Para expressão, um sistema de expressão é aquele que utiliza o sistema GS (Lonza), utilizando um gene da glutamina sintetase como o marcador seleccionável. Resumidamente, uma transfecção é realizada em células CHO por eletroporação (250V) utilizando o sistema GS (Lonza), utilizando o gene da glutamina sintetase como o marcador seleccionável. Células CHO de tipo selvagem são cultivadas em DMEM (Sigma) contendo 10% de soro fetal de vitelo dializado (FCS) com 2mM de glutamina. 6x107 células de CHO são transfectadas com 300pg de DNA linearizado por eletroporação. Após a eletroporação, as células são ressuspensas em DMEM com glutamina e plaqueadas em placas de poços 36x96 (50pl/poço) e incubadas a 37°C em 5% de CO2. No dia seguinte, 150pL/poço de meio seletivo (DMEM sem glutamina) é adicionado. Após cerca de 3 semanas as colônias são rastreados por ELISA (ver abaixo) utilizando um anticorpo irrelevante como controle negativo. Todas as colônias produtoras de >20pg/ml são expandidas em 24 poços e, em seguida, em frascos T25 duplicados.
Para a produção de alto nível, o sistema de expressão de mamífero mais amplamente utilizado é aquele que utiliza o procedimento de amplificação do gene oferecido por di-hidrofolato redutase deficiente ("dhfr") células de ovário de hamster chinês. O sistema é bem conhecido do técnico na arte. O sistema baseia-se no gene da dehidrofolato redutase "dhfr", que codifica a enzima DHFR, que catalisa a conversão de dehidrofolato para tetrahidrofolato. A fim de alcançar a produção elevada, células dhfr de CHO são transfectadas com um vetor de expressão contendo um gene DHFR funcional, juntamente com um gene que codifica uma proteína desejada. Neste caso, a proteína desejada é cadeia pesada e/ou cadeia leve de anticorpo recombinante.
Ao aumentar a quantidade do inibidor competitivo de DHFR do metotrexato (MTX), as células recombinantes desenvolvem resistência por amplificação do gene dhfr. Em casos normais, a unidade de amplificação utilizada é muito maior do que o tamanho do gene dhfr, e como resultado, a cadeia pesada do anticorpo é co-amplificada.
Quando a produção em grande escala da proteína, tal como a cadeia de anticorpo, é desejada, tanto o nível da expressão quanto a estabilidade das células a serem empregadas são levados em consideração. Na cultura de longo prazo, as populações de células de CHO recombinantes perdem homogeneidade no que diz respeito à sua produtividade específica do anticorpo durante a amplificação, embora elas derivem de um único clone parental. O presente pedido proporciona um polinucleotídeo isolado (ácido nucléico) que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como aqui descrito, os vetores que contêm esses polinucleotídeos, e células hospedeiras e sistemas de expressão para transcrição e tradução de tais polinucleotídeos em polipeptídeos. O presente pedido também fornece construções na forma de plasmídeos, vetores, transcrição ou cassetes de expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo conforme descrito acima. O presente pedido também proporciona uma célula hospedeira recombinante que compreende um ou mais construções conforme descrito acima. Um ácido nucléico que codifica qualquer anticorpo ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito, tal como previsto em si, constitui um aspecto do presente pedido, como o faz um método de produção do anticorpo ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito, método esse que compreende a expressão a partir da codificação do ácido nucléico. Expressão pode ser convenientemente conseguida por cultura sob condições apropriadas de células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucléico. Após a produção por expressão, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode ser isolado e/ou purificado utilizando qualquer técnica adequada e, em seguida, usado conforme apropriado.
Anticorpos específicos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, e moléculas de codificação de ácido nucléico e vetores aqui descritos podem ser fornecidos isolados e/ou purificados, por exemplo, a partir do seu ambiente natural, na forma substancialmente pura ou homogênea. No caso do ácido nucléico, livre ou substancialmente livre de ácido nucléico ou genes de origem, diferentes da sequência que codifica um polipeptídeo com a função requerida. O ácido nucléico pode compreender DNA ou RNA e pode ser total ou parcialmente sintético. Métodos de purificação são bem conhecidos na arte.
Sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo numa variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. Células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamíferos, leveduras e sistemas de baculovírus. Linhas celulares de mamífero disponíveis na arte para a expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster chinês, células HeLa, células de rim de hamster bebê e células de mieloma de camundongo NS0 e muitos outros. Um hospedeiro bacteriano comum é a E. coli . A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos em células procarióticas, tais como E. coli está bem estabelecida na arte. Para uma revisão, ver, por exemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). A expressão em células eucarióticas em cultura está também disponível aos técnicos na arte como uma opção para a produção dos anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito, ver para revisões recentes, por exemplo, Raff, ME (1993) Curr. Parecer Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinião Biotech 6: 553-560, cada um dos quais é aqui incorporado como referência na sua totalidade.
Vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, sequências potenciadoras, genes marcadores e outras sequências conforme apropriado. Vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, fago, ou fagemídeos, conforme apropriado. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: um Labocamundongory Manual: 2a edição, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Labocamundongory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucléico, por exemplo, na preparação de construções de ácido nucléico, mutagênese, sequenciação, introdução de DNA em células e expressão gênica, e análise de proteínas, estão descritos em detalhe nos Short Protocols in Molecular Biology, Segunda edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. Os métodos divulgados de Sambrook et al. e Ausubel et al. são aqui incorporados como referência na sua totalidade e são bem conhecidos na arte.
Assim, um aspecto adicional proporciona uma célula hospedeira contendo ácido nucléico tal como aqui descrito. Um aspecto adicional ainda proporciona um método compreendendo a introdução de tal ácido nucléico numa célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, as técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transfecção com fosfato de cálcio, DEAE Dextrano, eletroporação, transfecção mediada por lipossomas e transdução usando retrovírus ou outro vírus, por exemplo, vaccinia ou, para células de inscto, baculovírus. Para células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, a transformação de cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção utilizando bacteriófagos. A introdução pode ser seguida por causar ou permitir a expressão a partir do ácido nucléico, por exemplo, por cultura de células hospedeiras sob condições para expressão do gene.
Em uma forma de realização, o ácido nucléico é integrado no genoma (cromossoma, por exemplo) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrão. Aumentos de Ig podem ser inicializados conforme necessário, para maximizar a expressão. O presente pedido proporciona também um método que compreende utilizar uma construção tal como descrita acima, em um sistema de expressão para expressar os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, conforme relatado acima. O presente pedido refere-se também a ácidos nucléicos isolados, tais como moléculas de DNA recombinante ou genes clonados, ou suas variantes degeneradas, mutantes, análogos, ou seus fragmentos, que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo conforme aqui descrito, que se liga à endoglina.
Em um aspecto, o presente pedido proporciona um ácido nucléico que codifica para um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo conforme aqui descrito, que se liga à endoglina.
Numa modalidade adicional, a sequência de DNA completa da molécula de DNA recombinante ou gene clonado de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo conforme aqui descrito pode ser operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão que pode ser introduzida num hospedeiro apropriado. A aplicação de acordo estende-se a hospedeiros unicelulares transformados com o gene clonado ou molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA que codifica o VH e/ou VL, ou suas porções, do anticorpo.
Outra característica é a expressão das sequências de DNA aqui divulgadas. Como é bem conhecido na arte, as sequências de DNA podem ser expressa ligando-as operativamente a uma sequência de controle de expressão num vetor de expressão adequado e empregando esse vetor de expressão para transformar um hospedeiro unicelular apropriado.
Tal dispositivo de ligação de uma sequência de DNA para uma sequência de controle de expressão é claro, inclui, se não for já parte da sequência de DNA, a provisão de um códon de iniciação, ATG, na estrutura de leitura correta à montante da sequência de DNA.
Polinucleotídeos e vetores podem ser fornecidos em uma forma isolada e/ou uma purificada (por exemplo, livre ou substancialmente livre de polinucleotídeos de origem que não o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com a função requerida). Como aqui utilizado, "substancialmente puro”, e "substancialmente livre” referem-se a uma solução ou suspensão contendo menos do que, por exemplo, cerca de 20% ou menos de material estranho, cerca de 10% ou menos de material estranho, cerca de 5% ou menos de material estranho, cerca de 4% ou menos de material estranho, cerca de 3% ou menos de material estranho, cerca de 2% ou menos de material estranho, ou cerca de 1% ou menos de material estranho.
Uma grande variedade de combinações de vetores de expressão/hospedeiros pode ser empregada para expressar as sequências de DNA da presente invenção. Vetores de expressão úteis podem consistir, por exemplo, de segmentos de sequências de DNA cromossômicas, não-cromossômicas e sintéticas. Vetores adequados incluem, mas não estão limitados a, derivados de SV40 e plasmídeos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmídeos de E. coli col El, Pcr1, pBR322, Pmb9 e seus derivados, plasmídeos tais como RP4; DNAs de fagos, por exemplo, os numerosos derivados do fago λ, por exemplo, NM989, e outros DNAs de fago, por exemplo, M13 e DNA do fago de cadeia simples filamentosa; plasmídeos de levedura, tais como o plasmídeo 2u ou os seus derivados; vetores úteis em células eucarióticas, tais como vetores úteis em células de insecto ou de mamífero; vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNAs de fagos, tais como plasmídeos que foram modificados para empregar DNA de fago ou outras sequências de controle de expressão; e semelhantes.
Também é fornecida aqui uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções de polinucleotídeo. Um polinucleotídeo codificando um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo conforme aqui descrito constitui um aspecto do presente pedido, como o faz um método de produção do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, método esse que compreende a expressão a partir do polinucleotídeo. Expressão pode ser conseguida, por exemplo, por cultura sob condições apropriadas de células hospedeiras recombinantes que contêm o polinucleotídeo. Um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode então ser isolado e/ou purificado utilizando qualquer técnica adequada, e usado como apropriado.
Qualquer um de uma ampla variedade de sequências de controle de sequências de expressão que controlam a expressão de uma sequência de DNA operacionalmente ligada a ela pode ser utilizada nestes vetores para expressar as sequências de DNA. Tais sequências de controle de expressão úteis incluem, por exemplo, os promotores precoces ou tardios do SV40, CMV, vaccinia, adenovírus ou polioma, o sistema lac, o sistema trp, o sistema de TAC, o sistema de TRC, o sistema LTR, o operador principal e regiões promotoras do fago λ, as regiões de controle de proteína de revestimento fd, o promotor para 3-fosfoglicerato-quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase ácida (por exemplo, PHO5), os promotores de fatores de acasalamento da levedura, e outras sequências conhecidas para controlar a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus, e várias combinações destas.
Sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo numa variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. Células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamíferos, leveduras e sistemas de baculovírus. Linhas celulares de mamífero disponíveis na arte para a expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebê, células de mieloma de camundongo NS0 e muitos outros. Um hospedeiro bacteriano comum pode ser, por exemplo, E. Coli. A expressão de anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo em células procarióticas, tais como E. coli, está bem estabelecida na arte. Para uma revisão, ver, por exemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). A expressão em células eucarióticas em cultura está também disponível aos técnicos na arte (Raff, ME (1993) Curr. Opinion Biotech 4: 573-576; Trill JJ et al (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560).
Uma grande variedade de células hospedeiras unicelulares são também úteis para expressar as sequências de DNA. Estes hospedeiros incluem hospedeiros eucarióticos e procarióticos bem conhecidos, tais como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungos tais como leveduras, e células animais, tais como CHO e células de YB/20, NS0, SP2/0, RI.I, B-W e L-M, células renais de macaco verde africano (por exemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, e BMT10), células de inseto (por exemplo, Sf9), e células humanas e células vegetais em cultura de tecidos.
Será entendido que nem todos os vetores, sequências de controle de expressão e hospedeiros irão funcionar igualmente bem para expressar as sequências de DNA. Nem todos os hospedeiros irão funcionar igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. No entanto, um técnico na arte será capaz de selecionar os vetores, as sequências de controle de expressão, e hospedeiros adequados, sem experimentação indevida para realizar a expressão desejada, sem se afastar do âmbito do presente pedido. Por exemplo, na seleção de um vetor, o hospedeiro deve ser considerado, uma vez que o vetor deve funcionar no mesmo. O número do de cópias do vetor, a capacidade de controle desse número de cópias, e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tais como marcadores de antibióticos, serão também considerados. Um técnico na arte habitual pode selecionar os vetores, sequências de controle de expressão, e hospedeiros apropriados para realizar a expressão desejada, sem se afastar do âmbito do presente pedido. Por exemplo, na seleção de um vetor, o hospedeiro é considerado porque o vetor funciona no mesmo. O número de cópias do vetor, a capacidade de controlar o número de cópias, e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tais como marcadores de antibióticos, podem também ser considerados. O presente pedido também fornece construções na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão, conforme descrito em outro lugar no presente pedido que compreenda pelo menos um polinucleotídeo conforme descrito acima. Os vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, sequências potenciadoras, marcadores selecionáveis e outras sequências conforme apropriado. Vetores podem ser plasmídeos virais, por exemplo, fago, fagemídeo, etc, conforme apropriado. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: a Labocamundongory Manual: 2a edição, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Labocamundongory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucléico, por exemplo, na preparação de construções de ácido nucléico, mutagênese, sequenciação, introdução de DNA em células e expressão gênica, e análise de proteínas, estão descritos em detalhe nos Short Protocols, in Molecular Biology, Segunda edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. Os métodos e as divulgações de Sambrook et al. e Ausubel et al. são aqui incorporadas por referência.
Na seleção de uma sequência de controle de expressão, uma variedade de fatores serão normalmente considerados. Estes incluem, por exemplo, a força relativa do sistema, a sua controlabilidade, e a sua compatibilidade com a sequência de DNA particular ou gene a ser expresso, em particular no que diz respeito a estruturas secundárias potenciais. Hospedeiros unicelulares adequados serão selecionados considerando, por exemplo, a sua compatibilidade com o vetor escolhido, as suas características de secreção, a sua capacidade de dobrar proteínas corretamente, e os seus requisitos de fermentação, bem como a toxicidade para o hospedeiro do produto codificado pelas sequências de DNA a serem expressas, e a facilidade de purificação dos produtos de expressão.
Um aspecto adicional proporciona uma célula hospedeira contendo um ou mais polinucleotídeos como aqui revelado. Ademais, um aspecto adicional proporciona um método de introdução de tais um ou mais polinucleotídeos numa célula hospedeira, qualquer que seja a técnica disponível. Para células eucarióticas, as técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transfecção de fosfato de cálcio, DEAEDextran, eletroporação, transfecção mediada por lipossomas e transdução usando retrovírus ou outro vírus (por exemplo vaccinia) ou, para células de insecto, baculovírus. Para células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transformação de cloreto de cálcio, eletroporação, e transfecção utilizando bacteriófagos. A introdução pode ser seguida por causar ou permitir a expressão a partir de um ou mais polinucleotídeos, por exemplo, por cultura de células hospedeiras sob condições para a expressão de um ou mais polipeptídeos de um ou mais polinucleotídeos. Sistemas indutíveis podem ser usados e expressão induzida pela adição de um ativador.
Em uma forma de realização, os polinucleotídeos podem ser integrados no genoma (por exemplo, o cromossoma) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão de sequências que promovem recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrão. Numa outra modalidade, o ácido nucléico é mantido em um vetor epissomal na célula hospedeira.
Os métodos aqui proporcionados incluem o uso de uma construção tal como acima referido, em um sistema de expressão para expressar um polipeptídeo específico.
Considerando estes e outros fatores, um técnico na arte será capaz de construir uma variedade de combinações vetor/sequência de controle de expressão/hospedeiro que irão expressar as sequências de DNA na fermentação ou em cultura animal em grande escala.
Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou uma proteína de ligação pode ser preparado de forma recombinante/sintética em adição, ou em vez de clonado. O polinucleotídeo pode ser concebido com os códons apropriados para o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou uma proteína de ligação. Em geral, um irá selecionar os códons preferidos para um hospedeiro desejado se a sequência for usada para a expressão. O polinucleotídeo completo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos sobrepostos preparados por métodos padrão e agregado em uma sequência completa de codificação. Ver, por exemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al, Science, 223:1299 (1984); Jay et al, J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).
Um método geral para incorporação do sítio específico de aminoácidos não naturais em proteínas é descrito em Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244:182-188 (Abril de 1989). Este método pode ser usado para criar análogos com aminoácidos não naturais.
Como mencionado acima, uma sequência de DNA que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo do mesmo pode ser preparada sinteticamente, em vez de clonada. A sequência de DNA pode ser concebida com os códons apropriados para o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo da sequência de aminoácidos. Em geral, uma irá seleccionar códons preferidos para o hospedeiro pretendido, se a sequência for usada para a expressão. A sequência completa é montada a partir de oligonucleotídeos sobrepostos preparados por métodos padrão e agregada em uma sequência completa de codificação. Ver, por exemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al, Science, 223:1299 (1984); Jay et al, J. Biol.. Chem., 259:6311 (1984), cada um dos quais é aqui incorporado por referência, na sua totalidade.
C. ANÁLISE DE LMUNOGENICIDADE IN SITU
Se necessário, um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo aqui descritos pode ser avaliado para a imunogenicidade e, quando necessário, ser desimunizado (isto é, o anticorpo é feito menos imuno reativo por meio da alteração de um ou mais epítopos de célula T). Análise de imunogenicidade e epítopos de células T presentes nos anticorpos humanizados anti-endoglina ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo conforme aqui descritos podem ser realizados através da utilização de software e bases de dados específicos. Exemplares de software e bancos de dados incluem iTope™ desenvolvido pela Antitope of Cambridge, Inglaterra. iTope™ é uma tecnologia in silico para a análise de peptídeo de ligação aos alelos humanos MHC de classe II. O software iTope™ prediz peptídeos de ligação aos alelos humanos MHC de classe II e assim proporciona uma varredura inicial para a localização de tais "epítopos de células T potenciais." O software ITope ™ prediz interações favoráveis entre as cadeias laterais de aminoácidos de um peptídeo e conjuntos específicos de ligação dentro das estrias de ligação de 34 alelos humanos MHC de classe II. A localização das principais resíduos de ligação é conseguida pela geração in silico de peptídeos que se sobrepõem por um aminoácido 9mer que mede a sequência da região variável do anticorpo de teste. Cada peptídeo 9mer pode ser testado contra cada um dos 34 alótipos MHC de classe II e marcados com base nos seus "ajustes" potenciais e interações com a estria de ligação com MHC de classe II. Os peptídes que produzem uma pontuação média elevada ligação (>0,55 na função de pontuação iTope™) contra >50% dos alelos MHC de classe II são consideradas como potenciais epítopos de células T. Em tais regiões, a sequência de aminoácidos núcleo 9 para ligação do peptídeo na estria do MHC de classe II é analisada para determinar os conjuntos de resíduos de MHC de classe II (P1, P4, P7, P6 e P9) e os possíveis resíduos de contato do receptor de célula T (TCR) (P-1, P2, P3, P5, P8).
Após a identificação de quaisquer epítopos de células T, as alterações de resíduos de aminoácidos, substituições, adições e/ou deleções podem ser introduzidas para remover o epítopo de célula T identificado. Tais alterações podem ser feitas de modo a preservar a estrutura do anticorpo e função enquanto ainda removendo o epitopo identificado. Exemplos de modificações podem incluir, mas não estão limitados a, alterações de aminoácidos conservativas. Técnicas que exploram os complexos solúveis de moléculas de MHC recombinantes em combinação com peptídeos sintéticos entraram em uso. Estes reagentes e procedimentos podem ser usados para identificar a presença de clones de células T a partir de amostras de sangue periférico de sujeitos humanos ou animal experimental que são capazes de se ligar a complexos peptídeos MHC particulares e não estão adaptados para a varredura de epítopos potenciais múltiplos para uma ampla diversidade de alotipos de MHC.
Ensaios biológicos de ativação das células T continuam sendo a melhor opção prática para proporcionar uma leitura da capacidade de uma sequência de peptídeo/proteína de teste para evocar uma resposta imunitária. Exemplos deste tipo de abordagem incluem a utilização de ensaios de proliferação de células T para a proteína bacteriana estafiloquinase, seguido por mapeamento de epítopos utilizando peptídeos sintéticos para estimular linhagens de células T. Do mesmo modo, ensaios de proliferação de células T, utilizando peptídeos sintéticos da proteína toxina do tétano resultaram em definição de regiões de epítopos imunodominantes da toxina. Em uma forma de realização, epítopos de células T em uma proteína de teste podem ser determinados utilizando subconjuntos isolados de células do sistema imunológico humano, promovendo a sua diferenciação in vitro e cultura das células na presença de peptídeos sintéticos de interesse e medição de qualquer proliferação induzida no cultivo de células-T. Outras técnicas podem também ser utilizadas. Tal técnica envolve a aplicação cuidadosa de técnicas de isolamento e cultura de células de células com suplementos múltiplos de citocinas para se obter os subconjuntos de célula imune desejados (células dendríticas, células T CD4+ e/ou CD8+). Numa outra modalidade, a presença de epítopos de células T em um anticorpo pode ser determinada pela adição do anticorpo em subconjuntos isolado células imunitárias de humanos, e avaliação da sua diferenciação ín vitro e medição de qualquer proliferação induzida nas culturas de células T. Técnicas in silico para definir ligantes MHC de classe II para múltiplas proteínas de interesse terapêutico podem também ser utilizadas. No entanto, por razões tais como o requisito de processamento proteolítico e outros passos fisiológicas que conduzem à apresentação de peptídeos imunogénicos ín vivo, um subconjunto de todo o repertório de peptídeos definíveis por em regimes com base em computador podem ter relevância biológica final. Assim, ensaios ex vivo de células T humanas de ativação podem ser utilizados para identificar as regiões dentro da sequência de proteína de um polipeptídeo que são capazes de suportar a ativação de células T e são, assim, mais biologicamente relevantes para o problema da imunogenicidade nesta proteína. Tal como aqui utilizado, "epítopo de célula T" refere-se a uma sequência de aminoácidos que é capaz de se ligar a MHC de classe II, capaz de estimular as células T e/ou também de ligar (sem necessariamente ativação mensurável) células T em complexo com MHC de classe II.
De acordo com um método revelado neste documento, os peptídeos sintéticos ou anticorpos inteiros são testados quanto à sua capacidade de evocar uma resposta proliferativa em células T humanas cultivadas in vitro. As células T estão presentes dentro de uma camada de célula mononuclear de sangue periférico (CMSP) prontamente obteníveis por meios bem conhecidos a partir de amostras de sangue completas. Além disso, a preparação de CMSP contém raios fisiológicas de células T e células apresentando de antígeno e é, portanto, uma boa fonte de materiais com a qual a se conduz uma reação de substituição imune in vitro. Na operação de tal ensaio, um índice de estimulação que se aproxima ou excede 2,0 é uma medida útil da proliferação induzida. No entanto, o índice de estimulação pode ser diferente dependendo do anticorpo, ou do fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e pode ser estabelecido com referência a uma linha de base para cada anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e a uma biblioteca de peptídeos correspondente. Num exemplo de tal teste, o índice de estimulação (SI) pode ser convencionalmente derivado por divisão da pontuação de proliferação (por exemplo, contagens por minuto da radioatividade se utilizando, por exemplo, incorporação de 3H-timidina) medido para o peptídeo de teste pela pontuação medida em células não em contato com um peptídeo de teste. Peptídeos que não evocam nenhuma resposta podem gerar um SI = 1,0, embora os valores de SI no intervalo 0,8-1,2 também possam ser normais. Um certo número de procedimentos técnicos podem ser construídos para a operação de tais ensaios, a fim de assegurar a confiança nas pontuações gravadas. Normalmente todas as determinações são feitas pelo menos em triplicata e a pontuação média deve ser computada. Quando um SI b 2,0 é computado, os resultados individuais da triplicata podem ser examinados para a evidência do dado afastado. Peptídeos de teste são colocados em contato com células em pelo menos duas concentrações diferentes e as concentrações normalmente abrangem uma diferença de concentração mínima de duas vezes. Tal faixa de concentração fornece uma compensação para a dimensão cinética para o ensaio e pode ser útil onde uma determinaçãode um único ponto do tempo, por exemplo, no dia mais 7, está sendo conduzido. Em alguns ensaios, determinações do curso de tempo múltiplas podem ser conduzidas e estas também podem ser feitas usando imunogênio peptídeo fornecido a um mínimo de duas concentrações diferentes. Do mesmo modo a inclusão de peptídeos de controle para os quais existe expectativa de que a maioria das amostras de CMSP de dadores irá gerar resosta deme ser incluídos em cada placa de ensaio. O peptídeo hemaglutinina influenza 307-309, sequência PKYVKQNTLKLA (SEQ ID NO: 104), e o peptídeo Chlamydia HSP 60 sequência KVVDQIKKISKPVQH (SEQ ID NO: 105) são exemplos de peptídeos de controle a serem utilizados em tal ensaio. Alternativamente, ou além disso, os ensaios podem também utilizar um antígeno de proteínas completa potente, tal como hemocianina de keyhole limpet, para o qual todas as amostras de CMSP teria expectativa de exibirem um SI significativamente maior do que 2,0. Outros antígenos de controle para tal utilização são bem conhecido na arte.
Os métodos aqui descritos podem fornecer um mapa de epítopo de anticorpos, ou fragmentos de ligação do antígeno dos mesmos, onde o mapa tem relevância para um amplo espectro de possíveis alotipos de MHC. O mapa pode ser suficientemente representativo para permitir a concepção ou seleção de uma proteína modificada para a qual a capacidade da proteína para evocar uma resposta imune das células T pode ser eliminada ou, pelo menos, melhorada, para a maioria dos pacientes para os quais a proteína é provável de ser administrada. Melhoria pode referir-se a uma redução em uma resposta imune (isto é, imunogenicidade reduzida) em comparação com uma proteína não modificada (por exemplo, cerca de 1,5 vezes menos, cerca de 2 vezes menos, cerca de 5 vezes menos, cerca de 10 vezes menos, cerca de 20 vezes menos, cerca de 50 vezes menos, cerca de 100 vezes menos, cerca de 200 vezes menos, cerca de 500 vezes menos ou mais, ou qualquer faixa aqui referida). Alternativamente, anticorpos, ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, com imunogenicidade reduzida podem referir-se a uma redução percentual na sua capacidade para elicitar uma resposta imunitária em comparação com uma proteína não modificada (por exemplo, cerca de 1% menos, cerca de 2% menos, cerca de 3% menos, cerca de 4% menos, cerca de 5% a menos, cerca de 10% menos, cerca de 20% menos, cerca de 50% menos, cerca de 100% menos, e qualquer faixa aqui referida). Assim, na prática do processo de triagem, células T derivadas de CMSP de doadores naturais são recolhidas a partir de um conjunto de doadores de diversidade imunológica suficiente para proporcionar uma amostra de pelo menos mais do que 90% do repertório de MHC de classe II (HLA-DR) existente na população humana. Onde uma resposta de células T normal é para ser detectado para um peptídeo sintético dado (ou anticorpo), o peptídeo (ou anticorpo), na prática, é colocado em contato com preparações de CMSP derivadas de doadores múltiplos em isolamento; os números de doadores (ou tamanho do "conjunto de doadores") é apenas para fins práticos não suscetível de ser inferior a 20 indivíduos não aparentados e todas as amostras no conjunto de doadores podem ser pré-selecionadas de acordo com os seus haplótipo de MHC de classe II.
Tal como aqui utilizado, o termo "doador normal" refere-se a um sujeito que não tenha sido previamente exposto a anticorpos, ou fragmentos de ligação do antígeno dos mesmos, aqui descrito, quer ambientalmente, por vacinação, ou por outros meios, tais como, por exemplo, transfusões de sangue.
Quando da varredura para epítopos de células T, as células T podem ser fornecidas a partir de uma amostra de sangue periférico a partir de uma multiplicidade de diferentes doadores saudáveis, mas que não estiveram no recebimento da proteína terapêutica. Se necessário, as amostras de sangue do paciente podem ser testadas para a presença de um determinado polipeptídeo utilizando ensaios convencionais, tais como um ELISA que utiliza anticorpos para identificar a presença ou ausência de um ou mais polipeptídeos. O ensaio é conduzido utilizando CMSP cultivados in vitro utilizando procedimentos convencionais conhecidos na arte e envolve o contato do CMSP com espécies de polipeptídeos sintéticos representativos da proteína de interesse (isto é, uma biblioteca), ou uma proteína inteira, tal como um anticorpo e seguido de um adequado período de incubação, medição da ativação induzida de células T tal como proliferação celular. A medição pode ser feita por quaisquer meios adequados e pode, por exemplo, ser conduzida usando incorporação de H3-timidina em que a acumulação de H3 no material celular é prontamente medida utilizando instrumentos labocamundongoriais. O grau de proliferação celular para cada combinação de amostra de CMSP e peptídeo sintético ou proteína inteira pode ser examinado em relação àquele observado em uma amostra não tratada de CMSP. A referência pode também ser feita para a resposta proliferativa observada após tratamento com um peptídeo ou peptídeos ou proteínas inteiras para os quais existe um efeito proliferativo esperado. A este respeito, é vantajoso utilizar um peptídeo ou proteína inteira com conhecida restrição ampla a MHC e especialmente epítopos de peptídeos com restrição de MHC para isotipos DP ou DQ, embora a invenção não esteja limitada ao uso de tais peptídeos restritos ou proteínas. Tais peptídeos têm sido descritos acima, por exemplo, com respeito à influenza hemaglutinina e clamídia HSP60.
Em um exemplo não limitativo, epítopos de células T são mapeados e posteriormente modificados usando os métodos aqui descritos. Para facilitar a montagem de um mapa de epítopo, uma biblioteca de peptídeos sintéticos é produzida. Cada um dos peptídeos é de 15 resíduos de aminoácidos de comprimento e cada um sobrepõem o peptídeo seguinte na série por 12 resíduos de aminoácidos, ou seja, cada peptídeo sucessivo na série incrementalmente aRNAiona mais 3 aminoácidos para a análise. Desta forma, qualquer dado par adjacente de peptídeos mapeia 18 aminoácidos da sequência contígua. Um método para a definição de um mapa de células T utilizando ensaios de células T normais é ilustrado nos Exemplos a seguir. Cada um dos peptídeos identificados através do método para definir um mapa de células-T é sugerido para serem capazes de ligar MHC de classe II e envolver pelo menos um cognato TCR com afinidade suficiente para evocar uma explosão proliferativa detectável no sistema de ensaio.
Num outro exemplo não limitativo, o potencial de um anticorpo a ser processado para gerar epítopos de células T que ligam MHC de classe II e envolver pelo menos um cognato TCR com afinidade suficiente para evocar uma explosão proliferativa detectável no sistema de ensaio é avaliado.
As moléculas aqui descritas podem ser preparadas em qualquer de várias maneiras, incluindo a utilização de métodos recombinantes. As sequências de proteínas e as informações fornecidas aqui podem ser utilizadas para deduzir um polinucleotídeo (DNA) codificando uma sequência de aminoácidos. Isto pode ser conseguido, por exemplo, utilizando ferramentas de software de computador, como o software DNAstar [DNAstar, Inc., Madison, Wisconsin, EUA] ou similar. Qualquer polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos ou homólogos significativos, variantes, truncamentos, alongamentos, ou modificações adicionais dos mesmos, são aqui contemplados.
No presente documento são proporcionados métodos de mapeamento (identificação) de epítopos de células T e modificação dos epítopos de tal forma que a sequência modificada reduz (parcial ou completamente) a indução de uma resposta auxiliando T. Modificação inclui substituições, deleções, ou inserção de aminoácidos feitas em códons de um polinucleotídeo codificando polipeptídeos modificados para afetar alterações semelhantes. Códons que codificam os resíduos de aminoácidos são bem conhecidos na arte. É possível utilizar métodos de DNA recombinante para atingir mutagênese dirigida das sequências alvo e muitas dessas técnicas estão disponíveis neste pedido, e são conhecidos na arte tal como descrita acima. Em geral, a técnica de mutagênese sítio-específica é bem conhecida. Resumidamente, um vetor de bacteriófago, que produz um modelo de cadeia simples para mutagênese PCR dirigida de oligonucleotídeo é empregado. Vetores de fagos (por exemplo, M13) estão comercialmente disponíveis e a sua utilização é geralmente bem conhecida na arte. Do mesmo modo, plasmídeos de fita dupla são também utilizados rotineiramente em mutagênese dirigida in situ, o que elimina o passo de transferência do polinucleotídeo de interesse a partir de um fago para um plasmídeo. Iniciadores oligonucleotíRNAos sintéticos que carregam a sequência mutada desejada podem ser usados para dirigir a síntese in vitro de DNA modificado (mutação desejada) a partir deste modelo e o DNA heteroduplex é usado para transformar E. coli competentes para a selecção de crescimento e identificação dos clones desejados. Alternativamente, um par de iniciadores pode ser anelado a duas fitas separadas de um vetor de cadeia dupla para simultaneamente sintetizar ambas as fitas complementares correspondentes com a(s) mutação(s) desejada(s) numa reação de PCR.
Em uma forma de realização, o método de mutagênese sítio-dirigida de mudança rápida utilizando modelos de DNA de plasmídeo pode ser empregado. A amplificação por PCR do modelo de plasmídeo contendo o gene alvo de inserção do inserto é conseguida utilizando dois iniciadores oligonucleotíRNAos sintéticos que contêm a mutação desejada. Os iniciadores de oligonucleotídeos, cada um complementar às fitas opostas do vetor, são estendidos durante ciclos de temperatura por grau de mutagênese PfuTurbo de DNA polimerase. Na incorporação dos iniciadores de oligonucleotídeos, um plasmídeo mutado contendo entalhes escalonados é gerado. Produtos não metilados amplificados são tratados com DPn I para digerir molde de DNA parental metilado e selecionar para o DNA recentemente sintetizado contendo mutações. Uma vez que o DNA isolado a partir da maior parte da cepa de E. coli é mal metilado, é susceptível à digestão de DPn I, que é específico para DNA metilado e hemimetilado. Os produtos de reação são transformados em cepas de E. coli de alta eficiência para se obter os plasmídeos que contêm as modificações desejadas. Métodos adicionais para a introdução de modificações de aminoácidos num polipeptídeo são bem conhecidos na arte e podem também ser aqui utilizados.
Modificações adequadas para uma proteína podem incluir a substituição de resíduos particulares ou combinações de resíduos de aminoácidos. Para a eliminação dos epítopos de células T, as substituições de aminoácidos são feitas em pontos apropriados ou em resíduos de aminoácidos no interior de uma sequência de aminoácidos prevista para alcançar a redução ou eliminação da atividade do epítopo de células T. Na prática, um ponto apropriado ou resíduo de aminoácido, de preferência equivale a um resíduo de aminoácido de ligação dentro de um dos conjuntos fornecidos dentro da estria de ligação MHC de classe II. Tais modificações podem troca a ligação no interior do primeiro conjunto da fenda na assim chamada posição "P1" ou "âncora P1" do peptídeo. A qualidade da interação de ligação entre o resíduo de âncora P1 do péptido e o primeiro conjunto da estria de ligação de MHC de classe II é reconhecida como sendo um determinante principal da afinidade de ligação global para o peptídeo inteiro. Uma substituição adequada nesta posição da sequência de aminoácidos vai geralmente incorporar um resíduo de aminoácido menos facilmente acomodado no interior do conjunto (por exemplo, substituição para um resíduo mais hidrofílico). Os resíduos de aminoácidos no peptídeo em posições que equivalem à ligação dentro de outras regiões do pacote no interior da fenda de ligação do MHC são também considerados e são abrangidos pelo âmbito da presente invenção.
Entende-se que modificações únicas de aminoácidos dentro de um dado epítopo de célula T potencial representam uma via pela qual um ou mais epítopos de células T podem ser eliminados. Combinações de modificações dentro de um único epítopo podem ser contempladas e podem ser adequads quando epítopos definidos individualmente estão em sobreposição entre si. Além disso, modificações de aminoácidos (quer isoladamente dentro de um dado epítopo ou em combinação dentro de um único epítopo) podem ser feitas em posições não equivalentes aos "resíduos de bolsa" em relação à estria de ligação do MHC de classe II, mas, em qualquer ponto dentro da sequência de aminoácido. As modificações podem ser feitas com referência a uma estrutura homóloga, ou método estrutural produzido utilizando técnicas in silico conhecidas na arte e aqui descritos podem ser baseados em características estruturais conhecidas do polipeptídeo. Uma alteração (modificação) pode ser contemplada para restaurar a estrutura ou a atividade biológica da molécula variante. Tais alterações de compensação e alterações poderão também incluir deleção ou adição (inserção) de resíduos particulares de aminoácidos de um polipéptido. Além disso, podem ser feitas modificações que alteram a estrutura e/ou reduzem a atividade biológica da molécula e também eliminam um epítopo de células T, reduzindo assim a imunogenicidade da molécula. Todos os tipos de modificações são aqui contemplados.
Um meio adicional de remoção de epítopos a partir de moléculas de proteína é a utilização combinada de um método de ensaio de ativação de células T normais tal como descrito aqui em conjunto com uma ferramenta in silico desenvolvida de acordo com o esquema descrito no documento WO 02/069.232, que é também incorporado aqui em sua totalidade, para referência. O software simula o processo de apresentação de antígeno ao nível da interação de ligação polipeptídeo MHC de classe para fornecer uma pontuação de ligação para qualquer sequência polipeptídica dada. Tal pontuação é determinada por muitos dos alotipos de MHC de classe II predominantes existentes na população. Como este esquema é capaz de testar qualquer sequência polipeptídica, as consequências das adições ou deleções de substituições de aminoácidos no que diz respeito à capacidade de um polipeptídeo para interagir com uma estria de ligação de MHC de classe II podem ser previstas. Consequentemente, composições de sequências novas podem ser concebidas, as quais contêm números reduzidos de aminoácidos capazes de interagir com um MHC de classe II e assim funcionar como epítopos de células T imunogênicos. Quando o ensaio biológico utilizando qualquer uma das amostras de doador dadas pode avaliar a ligação a um máximo de quatro alotipos DR, o processo in silico pode testar uma mesma sequência polipeptídica usando acima de 40 alotipos simultaneamente. Na prática, esta abordagem é capaz de dirigir a concepção de variantes da sequência nova que são alterados na sua capacidade para interagir com múltiplos alotipos de MHC. Como será claro para um técnico no assunto, múltiplos conjuntos alternativos de substituições podem atingir o objectivo de remover os epítopos indesejados. As sequências resultantes iriam, contudo, ser reconhecidas por serem estreitamente homólogas com as composições específicas aqui descritas e, portanto, abrangidas pelo âmbito do presente pedido.
Uma abordagem combinada de utilizar uma ferramenta in silico para a identificação de ligantes MHC de classe II e projeto de análogos de sequências que não posssuem ligantes MHC de classe II, em concertação com mapeamento de epítopos e re-teste, opcionalmente, usando ensaios de base biológica de ativação das células T é um método e forma de realização adicionais do presente pedido. O método geral de acordo com esta forma de realização compreende os seguintes passos: i) utilização de ensaios de ativação de células T normais e peptídeos sintéticos abrangendo coletivamente a sequência da proteína de interesse para identificar regiões de epítopo suscetíveis de ativação das células T; ii) utilização de um esquema computacional de simulação da ligação do ligante peptíRNAo com um ou mais alotipos de MHC para analisar as regiões do epítopo identificados no passo (i) e, assim, identificar ligantes de MHC de classe II no interior da região do epítopo; iii) utilização de um esquema computacional de simulação da ligação do ligante peptíRNAo com um ou mais alotipos de MHC para identificar análogos de sequências dos ligantes de MHC englobadas na região do(s) epítopo(s) que já não se ligam a MHC de classe II ou se ligam com afinidade reduzida a um menor número de alotipos de MHC e, opcionalmente, iv) utilização de ensaios de ativação de células T normais e peptídeos sintéticos abrangendo todo ou em conjunto que engloba as regiões do epítopo identificadas dentro da proteína de interesse e teste dos análogos de sequência no ensaio de ativação de células T normais em paralelo com as seqüências de tipo selvagem (parental).
Em uma forma de realização, um método de produzir um anticorpo modificado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, exibindo imunogenicidade reduzida em comparação com um anticorpo não modificado, ou de ligação ao antigénio seu fragmento, compreende identificação de pelo menos um epítopo de célula T dentro da sequência de aminoácidos de um anticorpo, ou de fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e modificação de pelo menos, um resíduo de aminoácido dentro de pelo menos um epítopo de célula T identificada.
Numa outra modalidade, um anticorpo modificado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, exibindo imunogenicidade reduzida em comparação com um anticorpo não modificado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, é produzido por um processo de identificação de, pelo menos, um epítopo de células T no interior da sequência de aminoácidos de um anticorpo, ou de seu fragmento ligação do antígeno, e modificação, pelo menos um resíduo de aminoácido dentro de pelo menos um epítopo de célula T identificado.
Em ainda outra forma de realização, um método de seleção de um anticorpo modificado, ou de um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que apresenta imunogenicidade reduzida em comparação com um anticorpo não modificado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreende identificação de pelo menos um epítopo de célula T dentro da sequência do aminoácido de um anticorpo, ou de um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, modificação de pelo menos, um resíduo de aminoácido dentro de pelo menos um epítopo de célula T identificado, e seleção de um anticorpo modificado, ou de um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que apresenta imunogenicidade reduzida em comparação com um anticorpo inalterado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
Epítopos de células T aqui descritos podem ser ainda caracterizados em função das regiões do epítopo. Tais regiões incluem o núcleo do epítopo, o terminal-N e o terminal-C. Tal como aqui utilizado, "núcleo doepítopo" refere-se ao núcleo 9-mer das sequências de aminoácidos dos epítopos de células T. O núcleo do epítopo pode ainda incluir 0, 1, 2 ou 3 resíduos de aminoácidos adjacentes ao núcleo 9-mer da sequência de aminoácidos no terminal-N e/ou no terminal-C. Assim, o núcleo do epítopo, em certas modalidade, pode variar em comprimento de cerca de 9 aminoácidos até cerca de 15 aminoácidos.
Tal como aqui utilizado, "terminal N" refere-se aos aminoácidos adjacentes ao terminal N do núcleo do epítopo e inclui, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 aminoácidos adjacentes ao e à montante do terminal-N do núcleo do epítopo.
Tal como aqui utilizado, "terminal-C" refere-se aos aminoácidos adjacentes ao terminal-C do núcleo do epítopo e inclui, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 aminoácidos adjacentes ao e à jusante do terminal-C do núcleo do epítopo.
Em uma forma de realização, um anticorpo modificado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, contém uma ou mais modificações.
Em uma forma de realização, um anticorpo modificado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, contém duas modificações.
Em uma forma de realização, um anticorpo modificado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, contém três modificações.
Em uma forma de realização, um anticorpo modificado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, contém quatro modificações.
Em uma forma de realização, um anticorpo modificado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, contém cinco modificações.
Em uma forma de realização, um anticorpo modificado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, contém seis modificações.
Em uma forma de realização, um anticorpo modificado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, contém sete modificações.
Em uma forma de realização, um anticorpo modificado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, contém oito modificações.
Em uma forma de realização, um anticorpo modificado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, contém nove modificações.
Em uma forma de realização, um anticorpo modificado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, contém dez modificações.
Em uma forma de realização, um anticorpo modificado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, contém até vinte modificações. É aqui proporcionado um anticorpo, ou um fragmeno de ligação do antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 93 -(VK1AA) e uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 89 (VH1A2). É aqui proporcionado um anticorpo, ou um fragmeno de ligação do antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como qualquer um de SEQ ID NOS: 88, 89, 90, 91 e 92. É aqui proporcionado um anticorpo, ou um fragmeno de ligação do antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como qualquer um de SEQ ID NOS: 93, 94, 95, 96, 97, 100, 102, e 103. É aqui proporcionado um anticorpo, ou um fragmeno de ligação do antígeno do mesmo, que se liga a endoglina, compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 89 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 93, em que: (i) a região variável da cadeia pesada compreende ainda uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste de uma substituição de glicina (G) por alanina (A) ou serina (S) na posição 49; uma substituição de alanina (A) por isoleucina (I) na posição 51; uma substituição de lisina (K) por arginina (R) ou asparagina (Q) na posição 52b; uma substituição de leucina (L) por valina (V) na posição 78, utilizando o sistema de numeração de Kabat; e (ii) a região variável de cadeia leve compreende ainda uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste de uma substituição da metionina (M) por leucina (L) na posição 4; uma substituição de alanina (A) por valina (V) na posição 19; uma substituição da treonina (T) por serina (S) na posição 22; uma substituição de alanina (a) por isoleucina (I) na posição 48, e uma substituição de treonina (T) por serina (S) na posição 51, utilizando o sistema de numeração de Kabat. É aqui proporcionado um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 88, 89, 90, 91 e 92, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 93, 95, 96, 97, 100, 102, ou 103.
Para além dos exemplos acima mencionados e formas de realização, um anticorpo modificado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, com um ou mais modificações de aminoácidos em um ou mais epítopos de células T são aqui contemplados. Num exemplo não limitativo, aqui proporcionados são anticorpos, ou fragmentos de ligação do antígeno dos mesmos, tendo pelo menos uma modificação em pelo menos um epítopo de células T. Num outro exemplo não limitativo, aqui proporcionados são anticorpos, ou fragmentos de ligação do antígeno dos mesmos, tendo pelo menos uma modificação de aminoácidos em 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos epítopos de células T aqui descritos. Adicionais exemplos não limitativos incluem anticorpos, ou fragmentos de ligação do antígeno dos mesmos, com mais de uma modificação de aminoácidos em mais do que um epítopo de célula T. Qualquer combinação das modificações de aminoácidos em qualquer número de anticorpos, ou fragmentos de ligação do antígeno dos mesmos, epítopos de células T acima descritos são aqui contemplados. EPÍTOPOS DE CÉLULAS T E FREQUÊNCIA DE ALOTIPO Epítopos individuais encontrados em antígenos podem ser preferencialmente apresentados por alotipos de MHC de classe II específicos e, similarmente, outros epítopos específicos no mesmo antígeno podem não ser absolutamente apresentados em moléculas MHC de classe II. Estas associações de epítopos particulares com moléculas MCH de classe II específicas têm sido mostradas como dependentes do alotipo MHC de classe II do indivíduo. A associação de um epítopo específico com um alotipo específico pode também ser considerada quando se modifica anticorpos, ou fragmentos de ligação do antígeno dos mesmos, para a remoção de epítopos de células T. Tais considerações podem permitir a modificação altamente específica de um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, por alotipos específicos (por exemplo, para populações específicas de indivíduos com determinados alotipos de MHC de classe II). O alotipo de MHC de classe II de um sujeito ou sujeitos pode ser facilmente determinado por métodos de genotipagem conhecidos na arte, e a associação de epítopos de células T com o alotipo dado, portanto, facilmente identificado, para consideração em modificação de anticorpos, ou fragmentos de ligação do antígeno dos mesmos, adaptados para o referido alotipo. A identificação das associações entre os epítopos de células T e alotipos de MHC de classe II são descritos em mais detalhe nos exemplos abaixo. São aqui contemplados anticorpos modificados, ou fragmentos de ligação do antígeno dos mesmos, que têm modificações de epítopos de células T adaptadas às associações de MHC de classe II identificadas para os epítopos dados.
D. ANTICORPOS ANTI-ENDOGLINA
Incorporação simultânea de todos os FR e/ou CDR que codificam ácidos nucléicos e de todas as mudanças de posição de aminoácidos selecionadas podem ser conseguidas por uma variedade de métodos conhecidos por técnicos na arte, incluindo, por exemplo, síntese química e recombinação. Por exemplo, incorporação simultânea pode ser realizada por, por exemplo, sintetizando quimicamente a sequência de nucleotídeos para a região variável aceptora, fundidos em conjunto com os doadores de CDR que codificam ácidos nucléicos, e incorporando nas posições selecionadas para abrigar variáveis resíduos de aminoácidos uma pluralidade de códons de aminoácidos correspondentes. São aqui fornecidos anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno do mesmo que se ligam à endoglina. São também proporcionados anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno do mesmo que se ligam à endoglina e inibem (parcialmente ou totalmente) ou administram/tratam (parcialmente ou totalmente) angiogênese/neovascularização, dilatação de pequenos vasos e/ou doenças associadas à angiogênese excessiva. Do mesmo modo, a inibição da função endoglina (por exemplo, de sinalização, ativação, ligação, e semelhantes) também está incluída no âmbito do significado da inibição ou ligação de endoglina. Em ainda outra modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inibe a angiogênese por ligação à endoglina. A aplicação também fornece linhas celulares que podem ser utilizadas para produzir os anticorpos, os métodos para produzir as linhas de células, métodos para expressar anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo e purificação dos mesmos.
Pode-se reconhecer que os anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno do mesmo que se ligam especificamente à endoglina gerados utilizando os métodos aqui descritos podem ser testados usando os ensaios aqui proporcionados ou conhecidos na arte para a capacidade de se ligar à endoglina utilizando métodos convencionais, incluindo, mas não limitado a, ELISA. A afinidade de anticorpos aqui descritos podem também ser determinada utilizando métodos convencionais, incluindo, mas não limitado a, ou Biacore ou ressonância de plasma de superfície.
Os anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito foram construídos por humanização das sequências Vh e Vl do anticorpo TRC105. Para realizar essa humanização, um modelo tridimensional das cadeias VH e VL de TRC105 foi criado e analisado. As sequências VH e VL foram então comparadas individualmente a um banco de dados de sequências de linha germinativa humanas, a partir do qual as sequências VH e VL humanas foram escolhidas com base na sua homologia com as sequências VH e VL de TRC105. A sequência humana VL escolhida para a humanização foi O2/O12 (VK1-39) (SEQ ID NO. 2). O2/O12 tem uma identidade de sequência com TRC105 de 65% e o gene é altamente expresso no repertório da linha germinativa humana. A sequência VH humana escolhida para a humanização foi VH3-15 (SEQ ID NO. 40). VH3-15 tem identidade de sequência com TRC105 de 70%, e é expressa com uma frequência razoável no repertório da linha germinativa humana. As posições de aminoácidos que eram diferentes entre TRC105 e as sequências humanas foram examinadas no modelo 3D de TRC105 para determinar quais as substituições seriam consideradas para a modificação. Critérios de seleção de aminoácidos com base na análise do modelo 3D incluem, mas não se limitam a, por exemplo, efeitos estéricos relacionados com o aminoácido, carga relativa do aminoácido, e localização do aminoácido dentro da cadeia variável pesada e/ou leve. As substituições identificadas e propostas para as regiões da estrutura humana são incorporadas nas regiões de estrutura humana O2 e VH3-15, e os CDRs de TRC105 são enxertados nas regiões de estrutura humana O2 e VH3-15 correspondentes, resultando em um grande número de anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo. Além disso, o FR-4 da cadeia leve é derivado da sequência da linha germinativa J humana Jk4. Similarmente, o FR-4 da cadeia pesada é derivado de sequência da linha germinativa J humana JH4. São aqui descritos anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno do mesmo que se ligam à endoglina. Também são aqui descritos anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno do mesmo que se ligam à endoglina e inibem a angiogênese. Os anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito foram gerados conforme descrito acima.
Anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno do mesmo podem ter uma cadeia variável pesada (Vh), uma cadeia variável leve (VL), ambas, ou porções de ligação das mesmas. Em uma forma de realização, a cadeia Vh tem uma sequência de aminoácidos apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 41-43, ou uma porção de ligação das mesmas. Estas cadeias Vh podem ter sequências das regiões estruturais definidas como qualquer das SEQ ID NOS: 44-62. Numa outra modalidade, a cadeia VL tem uma sequência de aminoácidos apresentada como qualquer das SEQ ID NOS: 3-5, ou uma porção de ligação das mesmas. Tais cadeias VL podem ter sequências das regiões estruturais definidas como qualquer das SEQ ID NOS: 6-38. É aqui proporcionado um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 41. É aqui proporcionado um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 41, em que: a região variável de cadeia pesada compreende ainda um ou mais modificações selecionadas entre o grupo consistindo de uma substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 49; uma substituição de asparagina (N) por serina (S) na posição 76; uma substituição da treonina (T) por arginina (R) na posição 77; uma substituição de leucina (L) por valina (V) na posição 78; uma substituição de asparagina (N) por isoleucina (I) na posição 82a; uma substituição de valina (V) por isoleucina (I) ou leucina (L) na posição 89; uma substituição da treonina (T) por arginina (R) ou glicina (G) na posição 94; uma substituição de leucina (L) por treonina (T) na posição 108; uma substituição de valina (V) por leucina (L) na posição 109, e uma substituição de serina (S) por alanina (A) na posição 113, utilizando o sistema de numeração de Kabat, e a região variável de cadeia leve compreende ainda um ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste de uma substituição de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) na posição 1; uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) na posição 3; uma substituição de metionina (M) por leucina (L) na posição 4; uma substituição da treonina (T) por serina (S) na posição 5; uma substituição de tirosina (Y) por fenilalanina (F) na posição 36; uma substituição de leucina (L) por prolina (P) na posição 46; uma substituição de leucina (L) por triptofano (W) na posição 47; uma substituição de serina (S) por valina (V) ou alanina (A) na posição 60; uma substituição de ácido aspártico (D) por serina (S) na posição 70; uma substituição de fenilalanina (F) de tirosina (Y) na posição 71; uma substituição de glutamina (G) por alanina (A) na posição 100, e uma substituição de isoleucina (I) por leucina (L) na posição 106, utilizando o sistema de numeração de Kabat. É aqui proporcionado um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga à endoglina compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 41, 42, ou 43, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido definida como SEQ ID NO: 3, 4 ou 5. Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, pode compreender uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 41 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 3. Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, pode compreender uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 41 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 4. Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, pode compreender uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 41 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 5. Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, pode compreender uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 42 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 3. Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, pode compreender uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 42 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 4. Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, pode compreender uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 42 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 5. Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, pode compreender uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 3. Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, pode compreender uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 4. Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, pode compreender uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 5. Tais anticorpos podem se ligar à endoglina e inibir a angiogênese.
Em qualquer uma das formas de realização deste tipo, uma região variável de cadeia pesada pode ainda compreender uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo consistindo de: uma substituição de asparagina (N) por serina (S) na posição 76; uma substituição da treonina (T) por arginina (R) na posição 77; uma substituição de asparagina (N) por isoleucina (I) na posição 82a; uma substituição de valina (V) por isoleucina (I) ou leucina (L) na posição 89; uma substituição da treonina (T) por glicina (G) na posição 94; uma substituição de leucina (L) por treonina (T) na posição 108; uma substituição de valina (V) por leucina (L) na posição 109, e uma substituição de serina (S) por alanina (A) uma posição 113, e a região variável de cadeia leve pode ainda compreender uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo consistindo de: uma substituição de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) na posição 1; uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) na posição 3; uma substituição da treonina (T) por serina (S) na posição 5; uma substituição de tirosina (Y) por fenilalanina (F) na posição 36; uma substituição de serina (S) por valina (V) ou alanina (A) na posição 60; uma substituição de ácido aspártico (D) por serina (S) na posição 70; uma substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 100, e uma substituição de isoleucina (I) por leucina (L) na posição 106, utilizando o sistema de numeração de Kabat. É aqui proporcionado um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga à endoglina, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a referida região variável de cadeia pesada compreende: (i) uma CDR1 da SEQ ID NO: 66, uma CDR2 da SEQ ID NO: 67, e uma CDR3 da SEQ ID NO: 68; (ii) um FR1 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, exceto para uma ou mais substituições conservativas; (iii) um FR2 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, exceto para uma substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 49, utilizando o sistema de numeração de Kabat; e (iv) um FR3 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo de: (a) uma substituição de um asparagina (N) por serina (S) na posição 76; (b) uma substituição da treonina (T) por arginina (R) na posição 77; (c) uma substituição de leucina (L) por valina (V) na posição 78; (d) uma substituição de asparagina (N) por isoleucina (I) na posição 82a; (e) uma substituição de valina (V) por isoleucina (I) ou leucina (L) na posição 89, e (f) uma substituição da treonina (T) por arginina (R) ou glicina (G) na posição 94, utilizando o sistema de numeração de Kabat, e (v) um FR4 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo de: (a) uma substituição de leucina (L) por treonina (T) na posição 108; (b) uma substituição de valina (V) por leucina (L) na posição 109, e (c) uma substituição de serina (S) por alanina (A) na posição 113, utilizando o sistema de numeração de Kabat; e a dita região variável de cadeia leve compreende: (i) uma CDR1 da SEQ ID NO: 63, uma CDR2 da SEQ ID NO: 64, e uma CDR3 da SEQ ID NO: 65; (ii) um FR1 de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo de: (a) uma substituição de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) na posição 1; (b) uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) na posição 3; (c) uma substituição da metionina (M) por leucina (L) na posição 4; e (d) uma substituição da treonina (T) por serina (S) na posição 5; utilizando o sistema de numeração de Kabat e (iii) um FR2 de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo de: (a) a substituição de um tirosina (Y) por fenilalanina (F) na posição 36; (b) uma substituição de leucina (L) por prolina (P) na posição 46, e (c) uma substituição de leucina (L) por triptofano (W) na posição 47, utilizando o sistema de numeração de Kabat e (iv) um FR3 de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo de: (a) uma substituição de serina (S) por valina (V) ou alanina (A) na posição 60; (b) uma substituição de ácido aspártico (D) por serina (S) na posição 70, e (c) uma substituição de fenilalanina (F) de tirosina (Y) na posição 71, utilizando o sistema de numeração de Kabat e (v) um FR4 de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo de: (a) uma substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 100, e (b) uma substituição de isoleucina (I) por leucina (L) na posição 106, utilizando o sistema de numeração de Kabat.
Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, proporcionado aqui pode compreender uma região variável CDR1 de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 66, uma região variável CDR2 de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como definido na SEQ ID NO: 67, uma região variável CDR3 de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 68, uma região variável CDR1 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 63, uma região variável CDR2 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 64, e uma região variável CDR3 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 65.
Em uma forma de realização, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, liga-se à endoglina e compreende uma região variável FR1 de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 44; uma região variável FR2 de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como descrito em SEQ ID NO: 45; uma região variável FR3 de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 47; uma região variável FR4 de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 56.
Numa outra modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, liga-se à endoglina e compreende uma região variável FR1 de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 44; uma região variável FR2 de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como descrito em SEQ ID NO: 46; uma região variável FR3 de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 48; uma região variável FR4 de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 56.
Numa outra modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreende uma região variável FR1 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 6; uma região variável FR2 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como definido em SEQ ID NO: 20; uma região variável FR3 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 28, e uma região variável FR4 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 35.
Numa outra modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, liga-se à endoglina e compreende uma região variável FR1 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 6; uma região variável FR2 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como descrito em SEQ ID NO: 21; uma região variável FR3 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma região variável FR4 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 35.
Numa outra modalidade, o anticorpo, ou seu fragemento de ligação do antígeno, liga-se à endoglina e compreende uma região variável FR1 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 7; uma região variável FR2 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como descrito em SEQ ID NO: 21; uma região variável FR3 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma região variável FR4 de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 35. É aqui proporcionado um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 42 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 4. É aqui proporcionado um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga à endoglina, compreendendo uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 42, em que: a referida região variável de cadeia pesada compreende ainda uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste de uma substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 49; uma substituição de asparagina (N) por serina (S) na posição 76; uma substituição da treonina (T) por arginina (R) na posição 77; uma substituição de leucina (L) por valina (V) na posição 78; uma substituição de asparagina (N) por isoleucina (I) na posição 82a; uma substituição de valina (V) por isoleucina (I) ou leucina (L) na posição 89; uma substituição de arginina (R) por treonina (T) ou glicina (G) na posição 94; uma substituição de leucina (L) por treonina (T) na posição 108; uma substituição de valina (V) por leucina (L) na posição 109, e uma substituição de serina (S) por alanina (A) na posição 113, utilizando o sistema de numeração de Kabat; e a região variável de cadeia leve compreende ainda uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste de uma substituição de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) na posição 1; uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) na posição 3, uma substituição da metionina (M) por leucina (L) na posição 4; uma substituição da treonina (T) por serina (S) na posição 5; uma substituição de tirosina (Y) por fenilalanina (F) na posição 36; uma substituição de prolina (P) por leucina (L) na posição 46; uma substituição de triptofano (W) por leucina (L) na posição 47; uma substituição de serina (S) por valina (V) ou alanina (A) na posição 60; uma substituição de ácido aspártico (D) por serina (S) na posição 70; uma substituição de tirosina (Y) por fenilalanina (F) na posição 71; uma substituição de glutamina (G) por alanina (A) na posição 100; e uma substituição de isoleucina (I) por leucina (L) na posição 106, utilizando o sistema de numeração de Kabat. É aqui proporcionado um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga à endoglina, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a referido região variável de cadeia pesada compreende: (i) uma CDR1 da SEQ ID NO: 66, uma CDR2 da SEQ ID NO: 67, e uma CDR3 da SEQ ID NO: 68; (ii) um FR1 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, exceto para uma ou mais substituições conservativas; (iii) um FR2 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, exceto para uma substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 49, utilizando a numeração de Kabat sistema; e (iv) um FR3 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo de: (a) uma substituição de asparagina (N) por serina (S) na posição 76; (b) uma substituição de treonina (T) por arginina (R) na posição 77; (c) uma substituição de leucina (L) por valina (V) na posição 78; (d) uma substituição de asparagina (N) por isoleucina (I) na posição 82a; (e) uma substituição de valina (V) por isoleucina (I) ou leucina (L) na posição 89, e (f) uma substituição de arginina (R) por treonina (T) ou glicina (G) na posição 94, utilizando o sistema de numeração de Kabat e (v) um FR4 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo de: (a) uma substituição de leucina (L) por treonina (T) na posição 108; (b) uma substituição de valina (V) por leucina (L) na posição 109, e (c) uma substituição de serina (S) por alanina (A) na posição 113, utilizando o sistema de numeração de Kabat; e a dita região variável de cadeia leve compreende: (i) uma CDR1 da SEQ ID NO: 63, uma CDR2 da SEQ ID NO: 64, e uma CDR3 da SEQ ID NO: 65; (ii) um FR1 de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo de: (a) uma substituição de ácido aspártico (D) por glutamina (Q) na posição 1; (b) uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) na posição 3; (c) uma substituição da metionina (M) por leucina (L) na posição 4; e (d) uma substituição da treonina (T) por serina (S) na posição 5; utilizando o sistema de numeração de Kabat e (iii) um FR2 de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo de: (a) uma substituição de um tirosina (Y) por fenilalanina (F) na posição 36; (b) uma substituição de prolina (P) por leucina (L) na posição 46, e (c) uma substituição de triptofano (W) por leucina (L) na posição 47, utilizando o sistema de numeração de Kabat e (iv) um FR3 de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo de: (a) uma substituição de serina (S) por valina (V) ou alanina (A) na posição 60; (b) uma substituição de ácido aspártico (D) por serina (S) na posição 70, e (c) uma substituição de tirosina (Y) por fenilalanina (F) na posição 71, utilizando o sistema de numeração de Kabat e (v) um FR4 de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, exceto para uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo de: (a) uma substituição de glicina (G) por alanina (A) na posição 100, e (b) uma substituição de isoleucina (I) por leucina (L) na posição 106, utilizando o sistema de numeração de Kabat.
Uma porção substancial de um domínio variável irá incluir três regiões CDR, em conjunto com as suas regiões estruturais intervenientes. A porção pode também incluir pelo menos cerca de 50% de uma ou ambas as primeira e quarta regiões estruturais, os 50% sendo o terminal-C 50% da primeira região estrutural e o terminal-N 50% da quarta região estrutural. Resíduos adicionais na extremidade terminal-N ou terminal-C da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles que não são normalmente associados com regiões de domínio variável que ocorrem naturalmente. Por exemplo, a construção de anticorpos de endoglina humanizada e fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui produzidos por técnicas de DNA recombinante podem resultar na introdução de terminal-N ou -C de resíduos codificados por editores de ligação introduzidos para facilitar a clonagem ou outros passos de manipulação. Outros passos de manipulação incluem a introdução de editores de ligação para unir domínios variáveis a sequências de proteína adicionais incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou rótulos de proteína como discutido em mais detalhe abaixo.
Regiões CDR3 de endoglina humanizadas que possuem sequências de aminoácidos substancialmente como definidos como nas regiões CDR3 dos anticorpos aqui descritos serão realizados numa estrutura que permite a ligação das regiões CDR3 à endoglina. A estrutura para transportar os CDR3s pode ser de uma sequência de cadeia leve ou pesada do anticorpo ou porção substancial dos mesmos em que as regiões CDR3 estão localizados em locais correspondentes à região CDR3 de domínios variáveis VH e VL de anticorpo de ocorrência natural codificadas por genes de imunoglobulina rearranjados.
Num exemplo não limitativo, são aqui proporcionados anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, contendo uma cadeia pesada variável tendo uma CDR3, que tem uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 68 e/ou uma cadeia leve variável tendo uma CDR3, que tem uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 65. Em uma forma de realização, a variável de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 40 exceto para a substituição do CDR3 pela sequência de CDR3 amino definido como SEQ ID NO: 68. Numa outra modalidade, a cadeia leve variável tem uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 2, com excepção de uma substituição do CDR3 pela sequência de ácido CDR3 amino definido como SEQ ID NO: 65. Além disso, CDR3 tais que contenham regiões/cadeias variáveis podem compreender um ou mais sequências FR de aminoácidos definidas como, por exemplo, descrito acima (ou FRs tais contendo uma ou mais modificações adicionais), onde os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo têm 3 CDRs e 4 FRs em cada uma das regiões VH e VL, têm atividade de ligação específica para endoglina e são capazes de inibir a angiogênese. Além disso, vários segmentos J de anticorpos podem também ser substituídos dentro destas regiões variáveis para a variação adicional dentro das cadeias da região variável.
Em um aspecto, cadeias variáveis pesadas e leves aqui descritas podem também ser criadas através de substituição adicional de sequências FR4. Em uma forma de realização, sequências FR4 de cadeia pesada podem ser substituídas por um dos seguintes: Em uma forma de realização, sequências FR4 de cadeia leve podem ser substituídas por um dos seguintes: Adicionalmente estão contidas neste documento versões humanizadas de anticorpos anti-endoglina alternativamente chamadas de anticorpos "superhumanizados" anti-endoglina ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo. Tais anticorpos superhumanizados, ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, podem compreender uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NOS: 71 ou 72 e uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 75.
Num outro aspecto, o presente pedido proporciona um anticorpo humanizado capaz de competir com um anticorpo anti-endoglina humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo aqui descrito sob condições nas quais pelo menos 5% de um anticorpo possuindo sequências VH e VL do anticorpo é bloqueado a partir da ligação à endoglina por competição com tal anticorpo em um ensaio de ELISA. São aqui fornecidos anticorpos neutralizantes ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo que se ligam à endoglina e modulam a atividade de endoglina. O anticorpo neutralizante pode, por exemplo, inibir a angiogênese por ligação à endoglina. A percentagem (%) de inibição da angiogênese por um anticorpo anti-endoglina humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos seis vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos nove vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes, pelo menos trinta vezes, pelo menos quarenta vezes, pelo menos cinquenta vezes, pelo menos sessenta vezes, ou maior do que os controles negativos são indicativos de que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inibe a angiogênese. Percentagem (%) de inibição da angiogênese por um anticorpo anti-endoglina humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de menos de 2 vezes maior do que os controles negativos é indicativo de que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo não inibe a angiogênese.
A ligação de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo à endoglina pode parcialmente (por exemplo, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98 %, 99%) ou completamente inibir a angiogênese. A atividade de inibição ou neutralização de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode ser determinada usando um ensaio ín vitro e/ou in vivo utilizando ensaios conhecidos na arte, tais como os descritos neste documento ou de outro modo conhecido na arte.
Em um aspecto, o fragmento de ligação do antígeno de qualquer um dos anticorpos humanizados descritos acima, é um Fab, um Fab', um Fd, um F(ab')2, um Fv, um scFv, uma cadeia única de ligação polipeptídica (por exemplo, um scFv com porção de Fc) ou qualquer outro fragmento funcional do mesmo, como aqui descrito.
Os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito são úteis em aplicações de detecção ou de diagnóstico, tal como descrito em mais detalhe abaixo. Os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito são úteis a ligação à endoglina, a qual, por sua vez, pode inibir a angiogênese tal como aqui descrito.
Anticorpos, ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo conforme aqui descritos, podem ser ainda modificados para alterar as propriedades específicas do anticorpo, mantendo a funcionalidade desejada, se necessário. Por exemplo, em uma forma de realização, o composto pode ser modificado para alterar uma propriedade farmacocinética do composto, tais como a estabilidade in vivo, solubilidade, biodisponibilidade, ou meia-vida. Anticorpos, ou fragamentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito, podem ainda compreender uma porção terapêutica, uma porção detectável, ou ambas, para uso em aplicações de diagnóstico e/ou terapêutica.
Anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito podem também ser usados como imunoconjugados. Tal como aqui utilizado, para fins da especificação e reivindicações, os imunoconjugados referem-se a conjugados constituídos dos anticorpos anti-endoglina humanizados ou seus fragmentos de acordo com a presente invenção e com pelo menos uma indicação terapêutica. Indicações terapêuticas incluem agentes antitumorais e inibidores de angiogênese. Tais agentes antitumorais são conhecidos na arte e incluem, mas não se limitam a, toxinas, enzimas, drogas, citocinas, radionuclídeos, agentes fotodinâmicos, e inibidores da angiogênese. Toxinas incluem, mas não estão limitadas a, cadeia de ricina A, exotoxinas mutantes de Pseudomonas, toxóide da difteria, estreptonigrina, boamicina, saporina, gelonina, e proteína antiviral da fitolaca. Drogas incluem metotrexato, daunorrubicina, e calicheamicinas. Radionuclídeos incluem radiometais. As citocinas incluem, mas não estão limitadas a, fator de crescimento transformado (TGF)-p, interleucinas, inteFRerões, e fatores de necrose tumoral. Agentes fotodinâmicos incluem, mas não estão limitados a, poFRirinas e seus derivados. Indicações terapêuticas adicionais são conhecidas na arte e são também aqui contempladas. Os métodos para complexar os anti-endoglina mAbs ou seu fragmento com pelo menos um agente antitumor são bem conhecidos pelos técnicos na arte (isto é, anticorpos conjugados como revisto por Ghetie et al., 1994, Pharmacol. Ther. 63:209 -34). Tais métodos podem utilizar um de vários reagentes disponíveis heterobifuncionais utilizados para acoplamento ou ligando moléculas. Radionuclídeos adicionais são ainda descritos aqui, juntamente com métodos adicionais para moléculas de ligação, tais como indicações terapêuticas e de diagnóstico.
Anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo podem ser modificados usando técnicas conhecidas na arte para vários fins, tais como, por exemplo, por adição de polietileno glicol (PEG). Modificação com PEG (PEGuilação) pode conduzir a um ou mais de tempo de circulação melhorado, solubilidade melhorada, resistência melhorada à proteólise, antigenicidade e imunogenicidade reduzida, biodisponibilidade melhorada, toxicidade reduzida, estabilidade melhorada, e maior facilidade de formulação (para uma revisão ver, Francis et al., International Journal of Hematology 68:1-18, 1998).
No caso de um fragmento de ligação do antígeno que não contém uma porção Fc, uma porção Fc pode ser adicionada (por exemplo, de forma recombinante) ao fragmento, por exemplo, para aumentar à meia-vida do fragmento de ligação do antígeno em circulação no sangue quando administrado a um paciente. A escolha de uma região Fc apropriada e métodos de incorporar tais fragmentos são conhecidos na arte. Incorporando uma região Fc de um IgG em um polipeptídeo de interesse, de modo a aumentar a sua semi-vida circulatória, mas de modo a não perder a sua atividade biológica, pode ser realizada utilizando técnicas convencionais conhecidas na arte, tais como, por exemplo, descrito na patente americana No. 6.096.871, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Porções Fc de anticorpos podem ser ainda modificadas para aumentar à meia-vida do fragmento de ligação do antígeno em circulação no sangue, quando administrado a um paciente. Modificações podem ser determinadas utilizando meios convencionais na arte, tais como, por exemplo, o descrito na patente americana No. 7.217.798, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
Outros métodos para melhorar a meia-vida de proteínas baseados em anticorpos de ligação em circulação são também conhecidos, tais como, por exemplo, o descrito nas patentes americanas N°s 7.091.321 e 6.737.056, cada uma das quais é aqui incorporada por referência. Além disso, os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo podem ser produzidos ou expressados de modo que eles não contenham fucose em suas cadeias complexas de açúcar N-glicósido ligadas. A remoção da fucose a partir das cadeias de açúcar ligada a n-glicosídeo complexa é conhecida por aumentar as funções efetoras dos anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo incluindo, mas não limitado a, citotoxicidade celular anticorpo-dependentes (CCDA) e citotoxicidade complemento-dependentes (CDC). Do mesmo modo, os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo que podem ligar à endoglina podem ser fixados na sua extremidade terminal-C à totalidade ou parte de uma cadeia pesada de imunoglobulina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, eg, IgG, IgA, IgE, IgD e IgM e quaiquer subclasses do isotipo, nomeadamente IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgG4.
Além disso, os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito também podem ser modificados de modo que eles sejam capazes de atravessar a barreira sangue-cérebro. Tal modificação dos anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito permite o tratamento de doenças do cérebro, tais como o glioblastoma multiforme (GBM). Exemplos de modificações para permitir que as proteínas tais como anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo possam atravessar a barreira sangue-cérebro são descritos na publicação do pedido de patente americana 2007/0.082.380 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. A glicosilação de imunoglobulinas tem sido destacada por exibir efeitos significativos sobre as suas funções efetoras, estabilidade estrutural, e taxa de secreção de células produtoras de anticorpo (Leatherbarrow et al., Mol. Immunol. 22:407 (1985)). Os grupos de carboidratos responsáveis por estas propriedades são geralmente ligados às regiões constantes (C) dos anticorpos. Por exemplo, a glicosilação de IgG em asparagina 297 no domínio CH2 é necessária para que a capacidade total de IgG ative a via clássica do complemento-dependente da citólise (Tao e Morrison, J. Immunol. 143:2595 (1989)). A glicosilação de IgM em asparagina 402 no domínio CH3 é necessária para a montagem correta e atividade citolítica do anticorpo (Muraoka e Shulman, J. Immunol. 142:695 (1989)). A remoção de locais de glicosilação, como posições 162 e 419 nos domínios CH1 e CH3 de um anticorpo IgA levou à degradação intracelular e, pelo menos, 90% de inibição da secreção (Taylor e WLLA, Mol. Cell. Biol. 8:4197 (1988)). Além disso, os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo podem ser produzidos ou expressados de modo que eles não contenham fucose em suas cadeias de açúcar ligada a n-glicosídeo complexa. A remoção da fucose a partir das cadeias de açúcar ligada a n-glicosídeo complexa é conhecida por aumentar as funções efetoras dos anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, incluindo, mas não limitado a, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (CCDA) e citotoxicidade complemento-dependente (CDC). Estes anticorpos "defucosilados" ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo podem ser produzidos através de uma variedade de sistemas que utilizam técnicas de clonagem molecular conhecidas na arte, incluindo, mas não limitado a, os animais transgênicos, plantas transgênicas, ou linhas de células que foram geneticamente modificadas de modo que elas já não contenham as enzimas e as vias bioquímicas necessárias para a inclusão de uma fucose nas cadeias de açúcar ligada a n-glicosídeo complexa (também conhecido como animais knock-out fucosiltransferase, plantas, ou células). Exemplos não limitativos de células que podem ser modificadas para serem fucosiltransferase knock-out incluem células CHO, células SP2/0 e células NS0, e células YB2/0. A glicosilação de imunoglobulinas na região variável(V) também tem sido observada. Sox e Hood relataram que cerca de 20% de anticorpos humanos são glicosilados na região V (Proc. Natl. Acad. EUA 66:975 (1970)). Acredita-se que a glicosilação do domínio V surge a partir de ocorrências fortuitas do sinal de glicosilação Asn-Xaa-Ser/Thr N-ligado na sequência da região V e não tem sido reconhecido na arte como desempenhando um papel na função de imunoglobulina. A glicosilação em um resíduo de estrutura de domínio variável pode trocar a interação de ligação do anticorpo com o antígeno. A presente invenção inclui critérios de que um número limitado de aminoácidos na estrutura ou CDRs de uma cadeia de imunoglobulina humanizada são escolhidos para serem mutados (por exemplo, por substituição, deleção ou adição de resíduos), a fim de aumentar a afinidade de um anticorpo.
Afinidade para a ligação de um antígeno de polipeptídeo pré-determinado pode, geralmente, ser modulada através da introdução de uma ou mais mutações no âmbito da região V, tipicamente em áreas adjacentes a uma ou mais CDRs e/ou em uma ou mais regiões de estrutura. Tipicamente, tais mutações envolvem a introdução de substituições conservativas de aminoácidos para destruir ou criar as sequências no local de glicosilação, mas não afetam substancialmente as propriedades estruturais dos polipeptídeos hidropáticos. Tipicamente, as mutações que introduzem um resíduo de prolina são evitadas. A glicosilação de anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo é ainda descrita na patente americana No. 6.350.861, que é aqui incorporada por referência com respeito à glicosilação.
Os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo podem ser formulados em curto prazo ou estendidos (em longo prazo).
Anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, que se ligam à endoglina também podem ser usados para a purificação de endoglina e/ou para detectar níveis de endoglina em uma amostra ou paciente para detectar ou diagnosticar uma doença ou distúrbio associado com endoglina, conforme descrito em mais detalhe abaixo.
Os anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, e proteínas de ligação que se ligam à endoglina geradas utilizando tais métodos podem ser testados para uma ou mais da sua afinidade de ligação, a avidez e capacidade de neutralização. Anticorpos humanizados úteis, ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, e proteínas de ligação podem ser utilizados para administração em um paciente para prevenir, inibir, controlar ou tratar uma doença ou condição/distúrbio associado com angiogênese. São aqui proporcionados métodos de identificação de anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo que se ligam à endoglina. Anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo podem ser avaliados por uma ou mais de afinidade de ligação, taxas de associação, taxas de dissociação e avidez. Em um aspecto, os anticorpos podem ser avaliados quanto à sua capacidade de neutralizar a atividade de endoglina ou um polipéptido no qual a sequência de ligação à endoglina está presente. A medição de afinidade de ligação, taxas de associação, taxas de dissociação e avidez podem ser realizadas utilizando técnicas reconhecidas na arte, incluindo ensaios de ressonância de plasma de superfície, mas não limitado a, um ensaio ELISA, análise Scatchard, análise BIACORE, etc, bem como outros ensaios vulgarmente utilizados e conhecidos pelos técnicos no assunto. A medição da ligação dos anticorpos com a endoglina e/ou a capacidade dos anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, por exemplo, de inibir a angiogênese, pode ser determinada utilizando, por exemplo, um ensaio de ELISA, um competitivo ensaio de ligação, um ensaio ELISPOT, ou qualquer outro ensaio útil conhecido na arte. Estes ensaios são comumente usados e bem conhecidos pelos técnicos no assunto.
Em uma forma de realização não limitativa, um ensaio de ELISA pode ser usado para medir a capacidade de ligação de anticorpos específicos, ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, que se ligam à endoglina.
Ensaios, tais como ELISA, também podem ser usados para identificar anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo que exibem especificidade aumentada para endoglina em comparação com outros anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo. Ensaios, tais como ELISA, também podem ser usados para identificar os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo que se ligam a epítopos em um ou mais polipeptídeos e através de uma ou mais espécies de endoglina. O ensaio de especificidade pode ser conduzido através da execução de ELISAs paralelas em que um anticorpo de teste, ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, são rastreados concorrentemente em câmaras de ensaio separadas para a capacidade de se ligar um ou mais epítopos sobre diferentes espécies de polipeptídeo contendo os epítopos de endoglina para identificar anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo que se ligam à endoglina. Outra técnica para medir a afinidade de ligação, aparentemente familiar para técnicos na arte, é uma técnica de ressonância de plasma de superfície (analisados num sistema de 2000 BIACORE) (Liljeblad, et al., Glyco. J. 2000, 17:323-329). As medidas padrão e tradicionais de ensaios de ligação são descritas por Heeley, RP, Endocr. Res. 2002, 28:217-229.
Os anticorpos humanizados para endoglina também podem ser analisados quanto à sua capacidade para tratar várias doenças e condições associadas com a angiogênese, por exemplo, várias formas de doenças oculares caracterizadas por angiogênese/neovascularização (por exemplo, degeneração macular, retinopatia diabética), nefropatia diabética, doenças inflamatórias crônicas (por exemplo, o DIC), artrite reumatóide, osteoartrite, e várias formas de cancro (tumores primários e metástases). Qualquer ensaio adequado conhecido por um técnico na arte pode ser utilizado para monitorar tais efeitos. Vários destas técnicas são aqui descritas. Num exemplo, os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito são analisados quanto à sua capacidade para se ligar à endoglina. Num outro exemplo, as constantes de afinidade para os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito são determinadas por ressonância de plasma de superfície (SPR). Em ainda outro exemplo, os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito são analisados quanto ao seu efeito sobre a inibição da angiogênese. II. Composições Cada um dos compostos aqui descritos pode ser usado como uma composição quando combinada com um transportador ou excipiente aceitável. Tais composições são úteis para análise ín vitro ou in vivo ou para administração a um sujeito in vivo ou ex vivo para o tratamento do sujeito com os compostos descritos.
Assim, as composições farmacêuticas podem incluir em adição ao ingrediente ativo, um excipiente farmaceuticamente aceitável, transportador, tampão, estabilizador ou outros materiais bem conhecidos pelos técnicos na arte. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem inteFRerir na eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do transportador ou de outro material dependerá da via de administração.
As formulações farmacêuticas compreendendo uma proteína de interesse, por exemplo, um anticorpo ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, identificados pelos métodos aqui descritos que podem ser preparadas para armazenamento pela mistura da proteína possuindo o grau desejado de pureza com opcionais veículos, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed.(1980)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes, ou estabilizadores aceitáveis são aqueles que são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como amônio octadecildimetilbenzil cloreto; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzilo; parabenos alquilo tais como metilo ou parabeno de propilo; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol, e m-cresol); baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos) polipéptidos, proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina ou; monossacáridos, dissacáridos, e outros carboidratos de carbono incluindo glicose, manose, ou dextrinas, agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formador de sal contra-íons tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos Zn-proteína), e/ou agentes tensoativos não iônicos tal como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).
Os veículos aceitáveis são fisiologicamente aceitáveis para o paciente a ser tratado e retem as propriedades terapêuticas dos compostos com/em que é administrado. Veículos aceitáveis e as suas formulações são geralmente descritos em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (18a edição, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990). Um transportador exemplar é solução salina fisiológica. A expressão "portador farmaceuticamente aceitável", tal como aqui utilizada, significa um material veículo farmaceuticamente aceitável, composição ou veículo, tal como um enchimento líquido ou sólido, diluente, excipiente, solvente ou material de encapsulamento, envolvido em carregar ou transportar os compostos em questão a partir do local de administração de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão, ou porção do corpo, ou em um sistema de ensaio ín vitro. Cada transportador é aceitável no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudiciais para um sujeito a quem é administrado. Também não se deve um veículo aceitável alterar a atividade específica dos compostos em questão.
Em um aspecto, são aqui proporcionadas composições farmaceuticamente aceitáveis ou fisiologicamente aceitáveis incluindo solventes (aquoso ou não aquoso), soluções, emulsões, meios de dispersão, revestimentos, isotônicos e absorção que promovem ou atrasam agentes, compatíveis com a administração farmacêutica. As composições farmacêuticas ou formulações farmacêuticas, por conseguinte, referem-se a uma composição adequada para utilização farmacêutica em um sujeito. As composições e formulações farmacêuticas incluem uma quantidade de um composto aqui descrito e um transportador farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável.
As composições podem ser formuladas para serem compatíveis com uma via de administração particular (isto é, sistêmica ou local). Assim, as composições incluem transportadores, diluentes, ou excipientes adequados para a administração por diversas vias.
Em outra forma de realização, as composições podem ainda compreender, se necessário, um aditivo aceitável, a fim de melhorar a estabilidade dos compostos na composição e/ou para controlar a taxa de liberação da composição. Aditivos aceitáveis não alteram a atividade específica dos compostos em questão. Exemplos de aditivos aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, um açúcar tal como manitol, glicose, sorbitol, xilitol, trealose, sorbose, sacarose, galactose, dextrano, dextrose, frutose, lactose e suas misturas. Aditivos aceitáveis podem ser combinados com veículos e/ou excipientes aceitáveis, tais como dextrose. Alternativamente, exemplares de aditivos aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, um agente tensoativo tal como polissorbato 20 ou polissorbato 80 para aumentar a estabilidade do peptídeo e diminuição a gelificação da solução. O suFRactante pode ser adicionado à composição numa quantidade de 0,01% a 5% da solução. A adição de tais aditivos aceitáveis aumenta a estabilidade e a meia-vida da composição no armazenamento. A composição farmacêutica pode ser administrada, por exemplo, por injeção, incluindo, mas não se limitando a subcutânea, intravítrea, intradérmica, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou intramuscular. Excipientes e transportadores para a utilização na formulação de composições para cada tipo de injeção são aqui contempladas. As descrições seguintes são, por exemplo, apenas e não se destinam a limitar o âmbito das composições. As composições para injeção incluem soluções aquosas (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou de dispersão. Para administração intravenosa, os transportadores adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e glicol polietileno líquidos, e afins), e suas misturas adequadas. Fluidez pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerida no caso de dispersão e pela utilização de suFRactantes. Agentes antibacterianos e antifúngicos incluem, por exemplo, parabenos, clorobutanol, ácido ascórbico fenol, e timerosal. Agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como cloreto de manitol, sorbitol, e de sódio podem ser incluídos na composição. As soluções resultantes podem ser empacotadas para utilização ou liofilizadas; a preparação liofilizada pode depois ser combinada com uma solução estéril antes da administração. Para injeção por via intravenosa ou injeção no local da aflição, o ingrediente ativo será na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que é isenta de pirogênios e possui pH adequado, isotonicidade e estabilidade. Os técnicos na arte relevante são bem capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotônicos tais como injeção de cloreto de sódio, injeção de ringer, injeção de lactato de ringer. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme necessário. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação de um ingrediente ativo na quantidade necessária num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o ingrediente ativo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir daqueles acima enumerados. No caso de pós-estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem sob vácuo e liofilização, que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração.
As composições podem ser administradas convencionalmente de forma intravítrea, subcutânea, ou através de implantes intravítreos.
As composições podem ser convencionalmente administradas intravenosamente, tal como por injeção de uma dose unitária, por exemplo. Para injeção, um ingrediente ativo pode estar na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que é substancialmente isenta de pirogênios e possui pH adequado, isotonicidade e estabilidade. Podem-se preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotônicos tais como injeção de cloreto de sódio, injeção de ringer, injecão de lactato de ringer. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme necessário. Além disso, as composições podem ser administradas através de aerossolização (Lahn et al, aerossol anti-receptor de anticorpos de células T são eficazes contra a inflamação das vias aéreas e hiper-responsividade, Int Arch LLAegery Immuno, 134: 49-55 (2004)).
Em uma forma de realização, a composição é liofilizada, por exemplo, para aumentar a vida de prateleira em armazenamento. Quando as composições são consideradas para utilização em medicamentos ou qualquer um dos métodos aqui proporcionados, é contemplado que a composição pode ser substancialmente livre de pirógenos tais que a composição não irá causar uma reação inflamatória ou uma reacção alérgica insegura, quando administrada a um paciente humano. As composições de ensaio para pirogénios e composições substancialmente isentas de pirogénios são bem compreendidas para um técnico da arte e pode ser realizada utilizando kits disponíveis comercialmente.
Veículos aceitáveis podem conter um composto que se estabiliza, aumenta ou atrasa a absorção ou a depuração. Tais compostos incluem, por exemplo, carboidratos de carbono, tais como sacarose, glucose, ou dextranos; proteínas de baixo peso molecular; composições que reduzem a folga ou hidrólise de peptídeos, ou excipientes ou outros estabilizantes e/ou tampões. Agentes que atrasam a absorção incluem, por exemplo, monoesteratos de alumínio e gelatina. Detergentes também podem ser usados para estabilizar ou para aumentar ou diminuir a absorção da composição farmacêutica, incluindo transportadores lipossomais. Para proteger da digestão, o composto pode ser complexado com uma composição para se tornar resistente à hidrólise ácida e enzimática, ou o composto pode ser complexado num transportador adequadamente resistente tal como um lipossoma. Compostos de proteção da digestão são conhecidos na arte (ver, eg, Fix (1996) Pharm Res 13:1760 1764; Samanen (1996) J. Pharm Pharmacol 48:119 135;. E Patente dos EUA No. 5.391.377, descreve composições de lipidos para administração oral de agentes terapêuticos). A expressão "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que são fisiologicamente toleráveis e normalmente não produzem uma reação alérgica inconveniente ou semelhante, tal como perturbações gástricas, tonturas e similares, quando administrados a um ser humano. O termo "dose unitária", quando usado em referência a uma composição terapêutica, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagem unitária para humanos, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de material ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente requerido, isto é, veículo ou transportador.
As composições podem ser administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem, e numa quantidade terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada depende do sujeito a ser tratado, da capacidade do sistema imunitário do sujeito para utilizar o ingrediente ativo, e do grau de capacidade de ligação desejada. Quantidades precisas de ingrediente ativo necessário para ser administrado dependerão do critério do praticante e são peculiares a cada indivíduo. Os regimes adequados para administração inicial e doses de reforço são também variáveis, mas são tipificados por uma administração inicial seguida por doses repetidas a um ou mais intervalos de uma hora por uma injeção subsequente ou outra administração. Alternativamente, as infusões intravenosas contínuas suficientes para manter as concentrações no sangue estão contempladas.
Uma forma de realização contempla a utilização das composições aqui descritas para produzir um medicamento para o tratamento de uma condição, doença ou distúrbio aqui descrito. Medicamentos podem ser formulados com base nas características físicas do paciente/sujeito que necessita de tratamento, e pode ser formulado em formulações únicas ou múltiplas com base na etapa da condição, da doença ou desordem. Medicamentos podem ser empacotados num pacote apropriado, com etiquetas apropriadas para a distribuição para hospitais e clínicas em que o rótulo é para a indicação de tratamento de um sujeito com uma doença aqui descrita. Medicamentos podem ser embalados como unidades únicas ou múltiplas. Instruções para a dosagem e administração das composições podem ser incluídas com os pacotes como descrito abaixo. A invenção é ainda dirigida para medicamentos de um anticorpo anti-endoglina humanizado ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo conforme descrito acima e um transportador farmaceuticamente aceitável. São aqui fornecidas composições de anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo que se ligam à endoglina e incluem aqueles tais como os descritos neste documento. Os anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo que se ligam à endoglina como aqui descritos podem ser utilizados para o tratamento de várias formas de doenças oculares caracterizadas por angiogênese/neovascularização (por exemplo, degeneração macular, retinopatia diabética), nefropatia diabética, doenças inflamatórias crônicas (por exemplo, DIC), artrite reumatóide, osteoartrite, e várias formas de cancro (tumores primários e metástases).
Uma composição (um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo aqui descrito) pode ser administrada isoladamente ou em combinação com uma segunda composição, simultaneamente ou sequencialmente dependentemente da condição a ser tratada. Em uma forma de realização, um segundo tratamento terapêutico é um inibidor da angiogênese (tal como aqui descrito). Quando duas ou mais composições são administradas, as composições podem ser administradas em combinação (ou sequencialmente ou simultaneamente). Uma composição pode ser administrada em uma dose única ou doses múltiplas.
Em uma forma de realização da presente invenção, as composições são formuladas livres de pirogêneos tais que elas são aceitáveis para administração a pacientes humanos. As composições de ensaio para pirógenos e preparação de composições farmacêuticas livres de pirogénios são bem compreendidas para um técnico na arte.
Uma forma de realização da presente invenção contempla o uso de qualquer uma das composições da presente invenção para produzir um medicamento para o tratamento de uma desordem do presente invento. Medicamentos podem ser formulados com base nas características físicas do paciente/sujeito que necessita de tratamento, e podem ser formulados em formulações únicas ou múltiplas com base na desordem. Medicamentos da presente invenção podem ser empacotados num pacote farmacêutico adequado com etiquetas apropriadas para a distribuição para hospitais e clínicas em que o rótulo é para a indicação de tratamento de uma desordem tal como aqui descrita num sujeito. Medicamentos podem ser embalados como unidades únicas ou múltiplas. Instruções para a dosagem e administração das composições farmacêuticas da presente invenção podem ser incluídas com os pacotes de produtos farmacêuticos. III. Métodos de Uso É aqui proporcionado um método de induzir uma resposta de um paciente (humano ou não humano) por administração ao paciente de uma composição de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que preferencialmente se liga à endoglina. O local de ligação ao qual o anticorpo se liga pode ser um epítopo contínuo ou de conformação descontínuo.
Uma resposta eficaz do presente invento é obtida quando o paciente experimenta alívio parcial ou total ou a redução de sinais ou sintomas de doença, e inclui especificamente, sem limitação ou prolongamento, sobrevivência e/ou acuidade visual. A esperada progressão de sobrevida pode ser medida em meses ou anos, dependendo de fatores prognósticos, incluindo o número de recaídas, estágio da doença, e outros fatores. Prolongar a sobrevivência inclui, sem limitação, cerca de pelo menos 1 mês, cerca de pelo menos 2 meses, cerca de pelo menos 3 meses, cerca de pelo menos 4 meses, cerca de pelo menos 6 meses, cerca de pelo menos um ano, cerca de pelo menos 2 anos, cerca de pelo menos 3 anos, etc. A sobrevivência global pode ser também medida em meses ou anos. Alternativamente, uma resposta eficaz pode ser que sintomas de um paciente permaneçam estáticos. Outras indicações de tratamento das indicações são descritos em mais detalhe abaixo.
As composições de anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito podem ser utilizadas como agentes não terapêuticos (por exemplo, como agentes de purificação por afinidade). Geralmente, em uma forma de realização, tal que uma proteína de interesse é imobilizada sobre uma etapa sólida por uma resina tal como resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos convencionais conhecidos na arte. A proteína imobilizada é contatada com uma amostra contendo o alvo de interesse (ou seu fragmento) a ser purificado e, subsequentemente, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra, exceto a proteína alvo, que é ligada ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão de glicina, pH 5,0, que libertará a proteína alvo. Além da purificação, as composições podem ser utilizadas para o diagnóstico, a detecção e a terapia de doenças e desordens associadas com endoglina e angiogênese. O termo "contatando" tal como aqui utilizado refere-se à adição de uma solução ou composição de um composto com um meio líquido que banha os polipeptídeos, células, tecido ou órgão de um organismo. Como alternativa, "contando", refere-se à mistura em conjunto de uma solução ou composição de um composto, com um líquido tal como sangue, soro, plasma ou derivado de um organismo. Para aplicações in vitro, uma composição pode também compreender outro componente, tal como sulfóxido de dimetilo (DMSO). DMSO facilita a absorção dos compostos ou a solubilidade dos compostos. A solução que compreende o composto de teste pode ser adicionada ao meio que banha as células, tecidos ou órgãos, ou misturado com outro líquido, tal como sangue, através da utilização de um equipamento de difusão, tal como um dispositivo baseado em pipeta ou uma seringa. Para aplicações in vivo, colocar em contato pode ocorrer, por exemplo, através da administração de uma composição a um paciente por qualquer meio adequado; composições com excipientes farmaceuticamente aceitáveis e os transportadores foram descritos em mais detalhe acima.
Um "paciente" (por exemplo, um mamífero tal como um ser humano ou um animal não humano, tal como um, roedor primata, vaca, cavalo, porco, ovelhas, etc) de acordo com uma forma de realização do presente pedido, é um mamífero que apresenta uma ou mais manifestações clínicas e/ou sintomas de uma doença ou distúrbio aqui descrito. Em certas situações, o paciente pode ser assintomático e ainda assim ter as manifestações clínicas da doença ou distúrbio. Um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode ser conjugado com uma porção terapêutica ou ser uma proteína de fusão contendo uma porção terapêutica. Um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode ser conjugado com uma porção detectável ou ser uma proteína de fusão contendo uma porção detectável. Em uma forma de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antíegno pode ser conjugado com tanto uma porção terapêutica ou uma porção detectável. Um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode ser conjugado com, ou fabricado de forma recombinante, com um marcador de afinidade (por exemplo, uma etiqueta de purificação). Etiquetas de afinidade, tais como, por exemplo, etiquetas de His6 (SEQ ID NO: 85) são convencionais na arte.
Anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui fornecidos são tais que eles podem ser conjugados ou ligados a uma porção terapêutica e/ou uma imagem ou uma porção detectável e/ou um marcador de afinidade. Métodos para conjugar ou ligar polipeptídeos são bem conhecidos na arte. Associações (ligações) entre os compostos e as etiquetas incluem quaisquer meios conhecidos na arte, incluindo, mas não se limitando a, interações covalentes e não covalentes, conjugação química, bem como técnicas recombinantes. A. A ligação de Endoglina e angiogênese Endoglina (CD105) é expressa na superfície da célula como uma proteína 180 kDa transmembranar homodimérica. O domínio externo liga isoformas TGF- βΐ e -3 com alta afinidade (50 nM), e a transmembrana e os domínios intracelulares de CD105 dividem uma similaridade de sequência com 71% de betaglicam. O gene CD105 humano está localizado no cromossoma 9q34, identificado utilizando hibridização in situ de fluorescência, e a região de codificação contém 14 exons, e duas isoformas diferentes (L e S) de CD105 com capacidade de se ligar a TGF-β foram caracterizados. A L-CD105 consiste em 633 resíduos de aminoácidos com 47 resíduos de aminoácidos na cauda citoplasmática em oposição ao S-CD105, que consiste em 600 resíduos de aminoácidos com uma cauda citoplasmática de 14 aminoácidos. No entanto, a L-CD105 é a forma predominante. CD105 é constitutivamente fosforilados nas células endoteliais, principalmente sobre a serina e treonina, e esta fosforilação é devido ao constitutivamente ativo TGF-β RII dentro da célula. Ligação de TGF-β a CD105 resulta em baixa regulação da fosforilação, semelhante aos efeitos observados com inibidores da proteína quinase C. A sequência CD105 humana de aminoácidos contém o ácido arginina-glicina-aspártico tripéptido (RGD), localizado numa região exposta do domínio extracelular. O péptido RGD é uma estrutura de reconhecimento chave encontrada em proteínas de ECM, tais como fibronectina, vitronectina, factor de von Willebrand (vWF) , colagénio do tipo I, e fibrinogénio e é reconhecido por integrinas na superfície celular. Adesão de integrina tem implicado na hemostasia, trombose, angiogênese e inflamação, processos em que o endotélio desempenha um papel crítico. (Duff et al., ESTÁGIOB J., 17:984-992 (2003)). CD105 é um membro da família de receptores de TGF-β que é expressado por células endoteliais proliferativas. Os níveis normais de CD105 são necessários para a proliferação de células endoteliais. Expressão de CD105 é aumentada por hipóxia celular através da produção do fator induzível 1-a(HIF-1-a) hipóxia e protege as células hipóxicas de apoptose. Diversas funções do CD105 estão associadas com TGF-β de sinalização. Sinais de TGF-β através de receptores heterodiméricos consistem de quinases de serina, receptor I(RI), e receptor de II(RII). A ligação do TGF-β para os domínios externos do receptor desmascara a atividade da quinase citoplásmica RII que fosforila o TGF-β RI, que pode então interagir com sinalizadores à jusante, tais como as proteínas Smad. CD105 faz parte do complexo receptor de TGF-β, mas ele pode existir independentemente na superfície da célula. Em muitas células ín vitro, CD105 suprime sinalização de TGF-β. CD105 também se liga a outros fatores de crescimento tais como ativina A e proteína moFRogenética óssea (BMP) -10, -9, -7 e -2. A ligação de TGF-β ou outros fatores de crescimento para CD105 requer a presença de, pelo menos, o receptor de RII, e não pode ligar ligantes por si só. A associação de CD105 com os receptores não altera a sua afinidade com o ligante. Após a associação, o domínio citoplasmático de CD105 é fosforilado por TGF-β RI e TGF-β RII, em seguida, TGF-β RI, mas não o TGF-β RII, dissocia quinase do complexo receptor.
Expressão de CD105 inibe níveis de fosforilação de TGF-β RII, mas aumenta a de TGF-β RI, resultando em aumento da fosforilação Smad 2, mas não de Smad 3. Uma vez que Smad 2 pode interagir com uma variedade de fatores de transcrição, co-ativadores, e eliminadores, Smad 2 fosforilada pode atuar como um integrador de múltiplos sinais para modular a transcrição do gene. Assim, CD105 modula funções de TGF-β através da interação com TGF-β RI e TGF-β RII e modifica a fosforilação de proteínas à jusante de Smad. CD105 age para modular a sinalização de complexos receptores de quinase múltiplos da supeFRamília TGF-β, incluindo receptores de TGF-β (TGF^R), cinases do tipo receptor de ativina (ALK) e receptores ativina. Na ausência de CD105, a ativação dos de receptores de TGF-β resulta na fosforilação de proteínas SMAD (SMAD 2 e 3) que inibem o crescimento de células endoteliais. No entanto, a ativação do CD105 por TGF-β modula a fosforilação da proteína SMAD (incluindo a fosforilação da SMAD 1, 5 e 8). O resultado final é a liberação dos efeitos inibitórios de crescimento da ativação do receptor de TGF-β em células endoteliais (ver Figura 3). Não surpreendentemente, a prevenção de ativação de CD105 por anticorpo anti-CD105 ou oligonucleótido anti-sentido atua sinergicamente com TGF-β para suprimir o crescimento de células endoteliais. O promotor de CD105 tem 2,6kb de comprimento, mas não contém conjuntos de iniciação de transcrição TATA ou CAAT. No entanto, tem duas regiões ricas em GC, motivos de consenso para SP1, ETS, GATA, AP-2, NGF-β, e Mad, bem como elementos de resposta de TGF-β. No entanto, CD105 tem uma distribuição celular relativamente restrita. O nível basal da transcrição parece requerer um sítio ets na posição -68 e os sítios SP1, mas a restrição relativa de expressão, por exemplo, para as células endoteliais, parece envolver múltiplas regiões reguladoras, em particular, uma em -1294 a -932 e uma outra muito próximo do local de iniciação da transcrição. CD105 é sobre-regulada por TGF-β, e isso tem sido demonstrado requerer um sítio Sp1 a -37 a -29, envolvendo também um ou mais sítios justapostos à montante de SBE de ligação Smads 3 e/ou 4 (que são ativados por sinalização de TGF-β). Hipoxia é uma característica comum dos tecidos isquémicos e tumores, e é um potente estimulante para expressão gênica de CD105 em células endoteliais vasculares (ECS). Tal efeito é potenciado em combinação com TGF-β 1. Os CD105 regulamentados acima podem exercer um papel de autoproteção em ECs sob estresse hipóxico.
Os vasculares EC são a principal fonte de CD105. Outros tipos de células vasculares, incluindo células musculares lisas, fibroblastos, macrófagos, células leucêmicas de origem pré-B e mielomonocítica e precursores eritróides expressam CD105, em menor extensão. CD105 está envolvido na angiogênese. Experiências anti-sentido têm demonstrado que a supressão da expressão de CD105 em HUVEC resulta na inibição acentuada da angiogênese ín vitro em combinação com ΊΌΕ-β1, indicando que CD105 é um componente proangiogênico nas células endoteliais. Outra evidência da importância do papel do CD105 na angiogênese vem de camundongos knockout de CD105. Os camundongos que não possuem CD105 apresentam vários defeitos vasculares e cardíacos, levando à morte em um estágio embrionário. Graves danos vasculares observados em camundongos nulos em CD105 indicam que CD105 é necessário para a formação de vasos sanguíneos maduros na vasculatura extra-embrionária, confirmando ainda mais o papel direto da endoglina na angiogênese. A endoglina, também conhecida como, inter alia, CD105 ou edg-1, é uma glicoproteína de membrana do tipo I homodimérica que é expressada em níveis elevados em células endoteliais vasculares proliferativas. Assim, endoglina é primariamente um marcador de associado à proliferação para as células endoteliais submetidas à atividade angiogênica. No entanto, pode haver expressão limitada de endoglina pelo endotélio vascular dos tecidos normais. Endoglina humana é conhecida por se ligar especificamente ao fator-β (TGF-β) de transformação do crescimento, e a sequência de aminoácidos deduzida de endoglina tem homologia forte para β-glicano, um tipo de receptor de TGF-β. A endoglina (EDG) tem sido alvo de métodos baseados em anticorpos de redução de vasculatura tumoral, uma vez que EDG é um antígeno associado à proliferação nas células endoteliais e de leucemia. A sua expressão é sobre-regulada em associado ao tumor endotélio vascular, e EDG é essencial para a angiogênese. A angiogênese inclui a formação de novos vasos sanguíneos capilares que conduzem à neovascularização, bem como a manutenção da vasculatura existente. É um processo complexo que inclui uma série de passos sequenciais, incluindo a degradação mediada por células endoteliais da membrana basal vascular e matrizes intersticiais, a migração de células endoteliais, a proliferação de células endoteliais, e formação de capilares por células endoteliais. São aqui fornecidos anticorpos humanizados que se ligam à endoglina. Endoglina pode ser encontrada em células que compreendem e apoiam vasculatura existente, bem como células que estão a promover o crescimento de, e tornam-se parte de nova vascularização. Os anticorpos podem se ligar à endoglina e, assim, inibir a angiogênese, inibir a vasculatura existente ou a manutenção da vasculatura existente, e/ou inibir a dilatação de pequenos vasos. Em adição à sua utilização para a purificação de endoglina, estes anticorpos são úteis para a detecção, purificação e fins de diagnóstico, bem como fins terapêuticos. Os anticorpos aqui proporcionados podem ser usados para a formulação de medicamentos para o tratamento de uma variedade de condições e doenças, os métodos para o tratamento de tais condições e doenças e métodos de detecção ou diagnóstico.
Anticorpos monoclonais murinos (mAbs) têm sido levantados contra endoglina, os quais modulam a atividade da endoglina e, assim, inibem a angiogênese e/ou inibem a vasodilatação dos vasos sanguíneos pequenos. Estes anticorpos murinos são descritos nas patentes US 5.928.641, 6.200.566, 6.190.660, e 7.097.836, cada uma das quais é aqui incorporada na sua totalidade. Além disso, eficiência em termos de ex vivo e ín vivo de um número destes anticorpos foi demonstrada; anticorpos monoclonais que se ligam endoglina são de interesse como compostos de modulação de endoglina. A utilização terapêutica de anticorpos murinos não é viável, contudo, como a administração de anticorpos murinos tem um número de limitações, incluindo a imunogenicidade em, por exemplo, sob a forma de anticorpos humanos anticamundongo (HAMA). O termo "angiogenesis" é aqui utilizado para incluir todos os aspectos da manutenção e do desenvolvimento do vaso sanguíneo. Assim, a angiogênese inclui a formação de novos vasos sanguíneos capilares que conduzem à neovascularização, bem como a manutenção e controle da vasculatura existente e pequenos vasos sanguíneos. A angiogênese é um processo complexo que inclui uma série de passos sequenciais, incluindo a degradação mediada por células endoteliais da membrana basal vascular e matrizes intersticiais, a migração de células endoteliais, a proliferação de células endoteliais, e formação de capilares por células endoteliais. A angiogênese inclui o crescimento e/ou o desenvolvimento de novos vasos sanguíneos (também referido como neovascularização), dilatação dos vasos pequenos, crescimento vascular prolongado ou excessivo, e manutenção da vasculatura existente. Endoglina é conhecida por estar envolvida na regulação da angiogênese e acredita-se ser envolvida em várias vias bioquímicas relacionadas com a indução da angiogênese. (Duff et al, FASEB J., 17:984-992 (2003); Bernabeu et al, J. Cell Biochem, 102 (6):1375-1388 (2007)).
Tal como aqui utilizado, os termos "angiogênese inibitória," "inibição da angiogênese" ou "anti-angiogênico" incluem a inibição da vasculogênese, e destinam-se a significar que há uma diminuição no grau, quantidade, ou taxa de neovascularização. Efetuar uma diminuição no grau, quantidade, ou taxa de proliferação das células endoteliais ou migração no tecido é um exemplo específico de inibição da angiogênese. O termo "composição inibitória de angiogênese" refere-se a uma composição que inibe a angiogênese mediando processos tais como a migração de células endoteliais, a proliferação, a formação do tubo e, subsequentemente, conduzindo à inibição da geração de novos vasos sanguíneos a partir de existentes, e, consequentemente, afeta condições dependentes da angiogénese. O termo "doença associada à angiogênese" é aqui utilizado, para fins da especificação e reivindicações, para significar certos processos patológicos em seres humanos, onde a angiogênese é anormalmente prolongada. Este inclui ainda condições de angiogênese e doenças, tais como as doenças e condições relacionadas, causadas por ou associadas com a angiogênese. Exemplos não limitativos de tais doenças incluem várias formas de doenças oculares caracterizadas por angiogênese/neovascularização (por exemplo, degeneração macular, retinopatia diabética), nefropatia diabética, doenças inflamatórias crónicas (por exemplo, DIC), artrite reumatóide, osteoartrite, e várias formas de cancros e metástases. Os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito podem ser usados para tratar uma doença associada à angiogénese por ligação de endoglina e inibição da angiogênese. O termo "terapia anti-angiogênica" é aqui utilizado, para fins da especificação e reivindicações, para significar a terapia dirigida para as células e/ou vasculatura que expressam endoglina (expressada em níveis mais elevados na proliferação da vasculatura, em comparação com vasculatura quiescente); este inclui ainda terapia que é dirigida contra a angiogênese (isto é, a formação de novos vasos sanguíneos capilares que conduzem à neovascularização), a terapia que é dirigida contra vasculatura existente e/ou vascularização excessiva ou terapia de crescimento de vasos sanguíneos, dirigida para a dilatação de pequenos vasos, e terapia dirigida para uma doença ou condição (por exemplo, terapia de segmentação vascular). Exemplos de doenças ou condições contempladas no âmbito do invento incluem, mas não estão limitados a, várias formas de doenças oculares caracterizadas por angiogênese/neovascularização (por exemplo, degeneração macular, retinopatia diabética), nefropatia diabética, doenças inflamatórias crónicas (por exemplo, o DIC), artrite reumatóide, osteoartrite, e várias formas de câncer, tumores sólidos e metástases. A expressão "doença ocular caracterizada por neovascularização" é aqui utilizada, para fins da especificação e reivindicações, para significar qualquer doença ocular causada por, ou resultando em, angiogênese aumentada dentro de qualquer porção do olho, incluindo a retina, córnea pupila, íris, humor vítreo e humor aquoso. Tais doenças incluem, por exemplo, àquelas relacionadas com a idade, a degeneração macular, retinopatia diabética e não diabética, retinopatia, neovascularização coroidal (NVC) e neovascularização sub-retinal (SRN ou SRNV) e neoplasias do olho. B. Aplicações de Diagnóstico Anticorpos anti-endoglina humanizados e fragmentos do mesmo podem ser usados para detecção ín vivo e in vitro, diagnóstico e/ou efeitos de controle. Acredita-se que endoglina está envolvida em várias doenças e distúrbios, como descritos mais abaixo. Tratamento de doenças relacionadas com a endoglina e condições dependentes, em parte, mediante o seu diagnóstico, e os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito são úteis para o diagnóstico de endoglina em excesso ou para o diagnóstico de doenças e condições associadas com a atividade da endoglina. É aqui proporcionado um método de detectar níveis de endoglina em uma amostra ou um sujeito que compreende(i) fazer contato entre um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo aqui descrito com a amostra ou sujeito, e (ii) detecção de um complexo do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e endoglina. É aqui proporcionado um método de imagiologia ou dignóstico de angiogênese ou uma doença ou desordem angiogênica-dependente, compreendendo o contato de uma composição de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo como aqui descrito com uma amostra. A amostra pode ser, por exemplo, sangue, soro, plasma, plaquetas, fluido de biópsia, fluido espinhal, meninges e urina. Método de imagem ou de diagnóstico pode ocorrer em um ensaio in vitro. Alternativamente, quando o contato é por administração da composição a um paciente, a angiogênese ou a doença ou desordem angiogênico-dependente é fotografada ou diagnosticada in vivo.
Em uma forma de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende ainda uma porção detectável. A detecção pode ocorrer in vitro, in vivo ou ex vivo. Ensaios ín vitro para a detecção e/ou determinação (qualificação quantificação, etc), da endoglina com os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, ELISAs, RIAs e western blots. Detecção in vitro, diagnóstico ou monitorização de endoglina pode ocorrer através da obtenção de uma amostra (por exemplo, uma amostra de sangue) de um paciente e testar a amostra em, por exemplo, um ensaio de ELISA padrão. Por exemplo, uma placa de microtitulação de 96 poços pode ser revestida com um anticorpo ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo aqui descrito, lavada e revestida com PBS-Tween/BSA para inibir ligação não específica. A amostra de sangue pode ser diluída em série e colocada em poços duplicados em comparação com uma curva de padrão de endoglina diluída. Após incubação e lavagem dos poços, um anticorpo anti-endoglina marcado com biotina pode ser adicionado, seguida pela adição de estreptavidina-fosfatase alcalina. Os poços podem ser lavados e um substrato (peroxidase de rábano) adicionado para desenvolver a placa. A placa pode ser lida utilizando um leitor de placas convencional e software.
Quando a detecção ocorre in vivo, o contato ocorre através de administração do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo usando quaisquer meios convencionais tais como os descritos neste documento. Em tais métodos, a detecção de endoglina em uma amostra ou um objecto pode ser utilizada para diagnosticar uma doença ou distúrbio associado com, ou correlacionado com a atividade da endoglina tais como as doenças e desordens aqui descritas.
No diagnóstico, detecção ou monitorização de endoglina ín vivo, é administrado em um paciente um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga à endoglina, o qual anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é ligado a uma porção detectável. A porção detectável pode ser visualizada usando técnicas reconhecidas na arte tais como, mas não limitados a, ressonância magnética (RM), fluorescência, radioimagem, fontes de luz fornecidas por endoscópios, laparoscópios, ou cateter intravascular (isto é, através de detecção de agentes fotoactivos), tomografia por emissão de pósitrons (TEP), ressonância magnética nuclear (RMN) de corpo inteiro, tomografia computadorizada (TC), região infravermelho (RI), raios-X, ultra-som, etc, tais como descrito, por exemplo, na patente americana No. 6.096.289, patente US No. 7.115.716, patente US No. 7.112.412, pedido US No. 20030003048 e pedido americano No. 20060147379, cada um dos quais é aqui incorporada na sua totalidade por referência. As indicações para detectar compostos utilizando tais métodos são também conhecidas na arte e descritas em tais patentes e pedidos e são aqui incorporados por referência. A visualização da porção detectável pode permitir a detecção, diagnóstico e/ou monitorização de uma condição ou doença associada com endoglina e/ou a angiogênese.
Ensaios de diagnóstico adicionais que utilizam anticorpos específicos para a proteína alvo desejada, isto é, endoglina, são conhecidos na arte e são também aqui contemplados. Não limitativos as condições, doenças e distúrbios a serem considerados para estes métodos incluem, mas não estão limitados a, aqueles associados com a angiogênese, tais como, por exemplo, várias formas de doenças oculares caracterizadas por angiogênese/neovascularização (por exemplo, degeneração macular, retinopatia diabética, nefropatia diabética, doenças inflamatórias crênicas (por exemplo, o DIC), artrite reumatóide, osteoartrite, e várias formas de cancro, tumores primários e metástases). Na detecção, diagnóstico ou monitorização de tais doenças, o paciente é sujeito à administração de uma composição de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo aqui descrito, o qual anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é conjugado com uma porção detectável. A porção pode ser visualizada usando métodos reconhecidos na arte tais como os descritos acima. A visualização da porção detectável pode permitir a detecção, diagnóstico e/ou monitorização de tais condições e doenças.
Para métodos de detecção in vitro, as amostras a serem obtidas a partir de um paciente incluem, mas não estão limitadas a, sangue, amostras de tecido e fluidos de biópsia.
Assim, a presente invenção proporciona anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo contra a endoglina que são úteis para a detecção ou diagnóstico de níveis de endoglina associados com uma doença ou desordem, potencialmente indicando a necessidade de tratamento terapêutico. Em certas modalidades, os anticorpos compreendem um anticorpo anti-endoglina humanizado aqui descrito. Em outras modalidades o anticorpo compreende ainda um segundo agente. Esse tal agente pode ser uma molécula ou porção, tal como, por exemplo, uma molécula repórter ou um marcador detectável. Marcadores detectáveis para os métodos de detecção são conhecidos na arte e são descritos em mais detalhe abaixo. Moléculas repórter são qualquer porção que pode ser detectada usando um ensaio. Exemplos não limitativos de moléculas repórter que tenham sido conjugadas com polipeptídeos incluem enzimas, marcadores radioativos, haptenos, marcadores fluorescentes, fosforescentes, moléculas quimioluminescentes, cromóforos, moléculas luminescentes, fotoafinidade, moléculas, partículas coloridas ou ligantes, tais como a biotina. Marcadores de detecção incluem compostos e/ou elementos que podem ser detectados, devido às suas propriedades funcionais específicas, e/ou características químicas, a utilização de que permite que o polipeptídeo ao qual eles estejam ligados pode ser detectado, e/ou ainda quantificado, se desejado. Muitos agentes de detecção são conhecidos na técnica, como o método para a sua fixação aos polipeptídeos (ver, por exemplo, Patente dos EUA N°s 5.021.236; 4.938.948; e 4.472.509, cada uma das quais é aqui incorporada por referência).
Os métodos de junção de polipeptídeos, tais como anticorpos com porções detectáveis são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, tecnologia de DNA recombinante para formar proteínas de fusão e de conjugação (por exemplo, a conjugação química). Métodos para a preparação de proteínas de fusão por conjugação química ou engenharia recombinante são bem conhecidos na técnica. Os métodos que ligam os componentes covalentemente e não- covalentemente também são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Williams (1995) Bioquímica 34:1787 1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414; e Kroll (1993) DNA celular. Biol. 12: 441-453.
Pode ser necessário, em alguns casos, introduzir uma região de ligação de polipepitídeo não estruturado entre um marcador ou um meio e uma ou mais porções dos anticorpos, fragmentos de ligação do antígeno ou proteínas de ligação, aqui descritos. O ligante pode facilitar uma maior flexibilidade, e/ou reduzir o impedimento estérico entre quaisquer dois fragmentos. O ligante pode também facilitar a ocorrência da velocidade apropriada em cada fragmento. O ligante pode ser de origem natural, tais como uma sequência determinada entre dois domínios de uma proteína. Uma sequência ligante é o vinculador encontrado entre os domínios de uma subunidade terminal-C e terminal-N do RNA polimerase. Outros exemplos de ligantes que ocorrem naturalmente, incluem ligantes encontrados nas proteínas 1CI e LexA.
Em um ligante, uma sequência de aminoácidos pode ser variada de acordo com a função das suas características, determinado empiricamente ou como constado por modelagem. Considerações na escolha de um ligante incluem sua flexibilidade, sua carga, e presença de alguns aminoácidos do ligante nas subunidades que ocorrem naturalmente. O ligante pode também ser concebido de modo que os resíduos de ácido nucleico entrem em contato com a desoxirribose (DNA), influenciando assim a afinidade de ligação ou especificidade, ou para interagir com outras proteínas. Em alguns casos, como quando é necessário compreender uma distância maior entre as subunidades, ou quando os domínios devem ser realizados em uma configuração específica, o ligante pode, opcionalmente, conter um domínio adicional dobrado. Em algumas das configurações, o desenho de um ligante pode envolver um arranjo de domínios que exige que o ligante abranja uma distância relativamente curta, por exemplo, menos do que cerca de 10 Angstroms (Ã). No entanto, em certas configurações, os ligantes abrangem uma distância de até cerca de 50 Angstroms.
Em um ligante, a sequência de aminoácidos pode ser variada em função das características do mesmo, determinado empiricamente ou como constado por modelagem. Considerações na escolha de um ligante incluem sua flexibilidade, sua carga, e na presença de alguns aminoácidos do ligante nas subunidades que ocorrem naturalmente. O ligante pode também ser concebido de modo que os resíduos de contato no DNA vinculador influenciem a afinidade de ligação ou especificidade, ou para interagir com outras proteínas. Em alguns casos, quando é necessário compreender uma distância maior entre as subunidades, ou quando os domínios devem ser realizados em uma configuração especifica, o ligante pode conter, opcionalmente, um domínio adicional dobrado. Métodos para acoplamento de polipeptídeos (livre ou ligado à célula) a esferas são conhecidos na técnica. Métodos para selecionar polipeptídeos acoplados ou células que apresentem um polipeptídeo são também conhecidos na técnica. Resumidamente, micropartículas paramagnéticas de poliestireno estão disponíveis comercialmente (Spherotech, Inc., Libertyville, IL; Invitrogen, Carlsbad, CA) em que o par de peptídeos teve as superfícies de micropartículas modificadas com grupos funcionais ou revestido com vários anticorpos ou ligantes, tais como, por exemplo, avidina, estreptavidina ou biotina. A propriedade paramagnética de micropartículas permite que elas sejam separadas da solução utilizando um ímã. As micropartículas podem ser facilmente re-suspensas quando o ímã é removido. Os polipeptídeos podem ser acoplados às micropartículas paramagnéticas de poliestireno revestidas com uma camada de poliuretano em um tubo. Os grupos hidroxi na superfície de micropartículas são ativados pela reação com cloreto de p-toluenossulfonil (Nilsson K e Mosbach K. "cloreto de p-toluenossulfonil como um agente ativador de agarose para a preparação de ligantes de afinidade imobilizados e de proteínas." Eur. J. Biochem. 1980:112: 397-402). Alternativamente, micropartículas paramagnéticas do poliestireno contendo ácido carboxílico na superfície pode ser ativado com uma carboDICmida, seguido por acoplamento a um polipeptídeo, resultando em uma ligação amida estável entre um grupo amino primário no polipeptídeo e os grupos de ácido carboxílico sobre a superfície das micropartículas (Nakajima N and Ikade Y, Mecanismo de formação de amida por carboDICmida por bioconjugação em meio aquoso, Bioconjugação Química. 1995, 6(1): 123-130; Gilles MA, Hudson AQ and Borders CL Jr, Estabilidade da carboDICmida solúveis em água, numa solução aquosa, Anal Bioquimica. 1990 Feb 1;184(2):244-248; Sehgal D and Vijay IK, um metédo para a medição da alta eficiência de amidação da carboDICmida solúveis em água, Anal Biochem. 1994 Apr;218(1):87-91; Szajani B et al, Efeitos da estrutura de carboDICmida na imobilização de enzimas, Appl Bioquímica Biotecnologia. 1991 Aug; 30(2): 225-231). Outra opção é para o par de polipeptídeos biotinilados às micropartículas paramagnéticas de poliestireno cujas superfícies têm sido ligadas de forma covalente com uma monocamada de estreptavidina. (Argarana CE, Kuntz ID, Birken S, Axel R, Cantor CR clonagem molecular e a sequência de nucleótidos do gene de estreptavidina Nucleic Acids Res. 1986; 14 (4) :1871-82; Pahler A, Hendrickson WA, Gawinowicz Kolks MA , Aragana CE, Cantor CR Caracterização. e cristalização do núcleo de estreptavidina. J Biol Chem 1987:262 (29) :13933-13937).
Polipeptídeos podem ser conjugados com uma grande variedade de corantes fluorescentes, supressores e haptenos, tais como fluoresceína, R-ficoeritrina, e biotina. A conjugação pode ocorrer durante a síntese do polipeptídeo ou após sua sintetização e purificação. A biotina é uma pequena vitamina (244 quilodaltons) que se liga com alta afinidade às proteínas avidina e estreptavidina e podem ser conjugadas com a maioria dos peptídeos, sem alterar suas atividades biológicas. Os polipeptídeos marcados de biotina são facilmente purificados a partir de polipeptídeos não marcados utilizando estreptavidina imobilizada e géis avidina por afinidade, e estreptavidina ou avidina conjugados por sondas podem ser utilizadas para detectar polipeptídeos biotinilados em, por exemplo, ELISA, dot blot ou aplicações de Western blot. Ésteres N-hidroxi-succinimida de biotina são o tipo mais usado de agente de biotinilação. N-hidroxissuccinimida ativados de biotinas reagem eficientemente com grupos amino primários em tampões fisiológicos para formar ligações amida estáveis. Polipeptídeos têm aminas primárias no terminal-N e pode também ter várias aminas primárias na cadeia lateral de resíduos de lisina que estão disponíveis como alvos para marcação com reagentes N-hidroxissuccinimida-ativados de biotina. Várias ésteres de biotina diferentes de N-hidroxissuccinimida estão disponíveis, com propriedades variadas e comprimento do braço espaçador (Pierce, Rockford, IL). Os reagentes sulfo-N-hidroxisuccinimida são solúveis em água, permitindo que as reações sejam realizadas na ausência de solventes orgânicos. A proporção molar de biotina para polipeptídeo pode ser estimada usando um ensaio ácido 2-(4'- Hidroxiazobenzeneo-2-carboxílico) usando técnicas reconhecidas na arte (Green, NM, (1975) "Avanços na proteína avidina. química "Editora acadêmica, New York 29, 85-133;. Green, NM, (1971)"). o uso de compostos biotinil bifuncionais para determinar o arranjo de subunidades de avidina "Biochem J. 125, 781-791;. Green, NM, (1965) "ensaio espectrofotométrico um para a avidina e biotina com base na ligação de corantes por avidina." J. Biochem 94: 23c-24c). A formação da ligação biotina-avidina é muito rápida e estável em solventes orgânicos, de pH extremos e de reagentes de desnaturação. Para quantificar a biotinilação, uma solução contendo o polipeptídeo biotinilado é adicionada a uma mistura de ácido 2- (4'Hidroxiazobenzeno-2-carboxílico) e avidina. Por causa da biotina possui uma maior afinidade para a avidina, ela desloca o ácido 2-(4'-Hidroxiazobenzeno-2-carboxílico) e a absorvância a 500 nanômetros diminui proporcionalmente. A quantidade de biotina em uma solução pode ser quantificada em uma única cubeta através da medição da absorvância do ácido 2-(4'-Hidroxiazobenzeno-2-carboxílico)-avidina solução antes e após a adição do peptídeo contendo biotina. A alteração na absorvância relaciona-se com a quantidade de biotina na amostra pelo coeficiente de extinção do complexo ácido 2-(4'-Hidroxiazobenzeno-2-carboxílico)-avidina.
Alternativamente, um anticorpo, um fragmento de ligação do antígeno ou uma proteína de ligação podem ser conjugados com uma porção fluorescente através da conjugação polipeptídica (por exemplo, R-ficoeritrina, isotiocianato de fluoresceína (FITC), etc) e podem ser realizadas utilizando reconhecidas técnicas descritas em, por exemplo, Glazer, AN e Stryer L. (1984). Trends Biochem. Sci. 9:423-7; Kronick, MN e Grossman, PD (1983) Clin. Chem. 29:1582-6; Lanier, LL e Loken, MR (1984) J. Immunol, 132:151-156;. Parks, DR et al. (1984) Citometria 5:159-68; Hardy, RR et al. (1983) Nature 306:270-2; Hardy RR et al. (1984) J. Exp.. Med. 159:1169-88; Kronick, MN (1986) J. Immuno. Meth. 92:1-13; Der-Balian G, Kameda, N e Rowley, G. Anal (1988). Biochem. 173:59-63.
Em uma modalidade não limitativa, um anticorpo do fragmento de ligação do antígeno pode ser associado (conjugado com) a um marcador de detecção, tal como um radionuclídeo, composto de ferro, um corante, um agente de imagem ou um agente fluorescente para imunodetecção de endoglina que pode ser usado para visualizar ligação dos anticorpos a endoglina ín vitro e/ou in vivo.
Exemplos não limitativos de marcadores radioativos incluem, por exemplo, 32P, 33P, 43K, 52Fe, 57Co, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 77Br, 81Rb/81MKr, 87MSr, 90Y, 97Ru, 99Tc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 111In, 113In, 119Sb, 121Sn, 123I, 125I, 127Cs, 128Ba, 129Cs, 131I, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169Eu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 191Os, 193Pt, 194Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb, 211At, 212Pb, 212Bi e 213Bi. Marcadores radioativos podem ser ligados a compostos utilizando a química convencional conhecida de imagens de anticorpo. Os compostos radiomarcados são úteis em técnicas de diagnóstico ín vitro, em técnicas de radioimagem in vivo e em radioimunoterapia. Por exemplo, no caso de imagem in vivo, os anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno podem ser conjugados com um agente de imagem em vez de um radioisótopo(s), incluindo, mas não limitado a um agente reforçado de imagem por ressonância magnética, em que, por exemplo, uma molécula de anticorpo é carregada com um grande número de íons paramagnéticos, através de grupos quelantes. Exemplos de grupos quelantes incluem EDTA, poFRirinas, éteres de coroa e poliaminas e polioximas. Exemplos de íons paramagnéticos incluem gadolínio, ferro, manganês, rénio, európio, lantânio, hólmio e ferbium. Tais porções detectáveis também incluem: metais; quelantes de metais; lantanídeos; quelantes lantanídeos; radiometais; quelantes radiometal; pósitron emissor de núcleos; microbolhas (para ecografia); lipossomas; moléculas microencapsulados em lipossomas ou nanoesferas; nanocompósitos monocristalinos de óxido de ferro, agentes de contraste para ressonância magnética; luz absorvendo, refletindo e/ou agentes de dispersão; partículas coloidais; fluoróforos, como fluoróforos próximo do infravermelho. Em muitas modalidades, como funcionalidade secundária do meio será relativamente grande, por exemplo, pelo menos, 25 amu em tamanho, e em muitos casos, pode ser pelo menos 50, 100 ou 250 amu em tamanho. Em certas modalidades, a funcionalidade secundária é uma porção de quelato para de um metal quelante, por exemplo, um quelante de um íon ou radiometal paramagnético. Em certa modalidade, é um quelante de um radionuclídeo útil para os procedimentos de radioterapia ou de imagem.
Os antagonistas da invenção também podem ser testados quanto à sua capacidade para modular a angiogênese num tecido. Qualquer teste adequado conhecido por um especialista pode ser utilizado para monitorar tais efeitos. Vários dessas técnicas são aqui descritos.
Uma medida da angiogênese é o modelo olho de coelho in vivo, e é referido como o teste de olho de coelho. O teste do olho de coelho foi descrito em detalhe por outros, e ainda tem sido utilizada para medir ambas angiogênese e neovascularização na presença de inibidores angiogênicos, tais como talidomida. Ver D'Amato et al. (1994) Proc. Natl.
Acad. Sci. 91:4082-4085. O teste do olho do coelho é um modelo de teste bem reconhecido para a angiogênese in vivo, pois o processo neovascularização, exemplificado por crescentes vasos sanguíneos de coelho a partir do aro da córnea para a córnea, é facilmente visualizado através da córnea naturalmente transparente do olho. Além disso, tanto a extensão como a quantidade de estímulo ou inibição da neovascularização ou regressão da neovascularização podem ser facilmente monitorados ao longo do tempo.
Finalmente, o coelho é exposto a qualquer reagente de teste, e, por conseguinte, a saúde do coelho é uma indicação de toxicidade do reagente de teste.
Outro teste mede a angiogênese no camundongo quimérico: modelo de camundongo humano e é referido como o teste de camundongo quimérico. O teste foi descrito em detalhe por outros, e ainda foi aqui descrito para medir angiogênese, neovascularização e a regressão dos tecidos tumorais. Ver Yan, et al. (1993) J. Clin. Invest. 91:98699 6. O teste do camundongo quimérico é um modelo útil de teste para a angiogênese ín vivo, porque os enxertos cutâneos transplantados se assemelham histologicamente da pele humana normal e toda a neovascularização do tecido está ocorrendo nos vasos sanguíneos humanos e estão crescendo a partir da pele humana enxertada no tecido do tumor, na superfície da pele humana enxertada. A origem da neovascularização no enxerto humano pode ser demonstrada por coloração imuno-histoquímica da neovascularização com marcadores específicos de células endoteliais humanas. O teste do camundongo quimérico mostra a regressão da neovascularização com base tanto na quantidade como na extensão da regressão do crescimento de novos vasos. Além disso, é fácil monitorar os efeitos sobre o crescimento de qualquer tecido transplantado em cima da pele enxertada, tal como um tecido do tumor. Finalmente, o teste é útil porque existe um controle interno para a toxicidade no sistema de teste. O camundongo quimérico é exposto a qualquer reagente do teste e, portanto, a saúde do camundongo é uma indicação de toxicidade. Outros modelos animais aqui descritos e conhecidos na técnica podem também ser utilizados nos métodos aqui descritos. C. Tratamento com Anticorpos humanizados endoglina São fornecidos aqui métodos de prevenção ou tratamento de uma ou mais doenças ou distúrbios associados com angiogênese/neovascularização, vascularização excessiva, ou dilatação de pequenos vasos envolvendo a administração de uma composição compreendendo um anticorpo humanizado ou fragmentos de ligação de antígenos aqui descritos que se ligam a endoglina associado com a doença ou desordem e impede angiogênese, impedindo assim, tratar, melhorar, ou diminuindo a doença ou a sua gravidade. São fornecidos aqui métodos de prevenção ou tratamento de uma ou mais doenças ou distúrbios associados com angiogênese/neovascularização compreendendo a administração de uma composição envolvendo um anticorpo humanizado ou de fragmento de ligação do antígeno aqui descrito que se liga a endoglina associado com a doença ou desordem, diminui angiogênese ou impede angiogênese excessiva.
Tal como aqui utilizado, "prevenção" refere-se à profilaxia, a prevenção do início dos sintomas, a prevenção da progressão de uma doença ou distúrbio associado à angiogênese ou correlacionado com a atividade da endoglina. A "inibição", "Tratamento" e "o tratamento" são utilizados alternadamente e referem-se, por exemplo, a estase de sintomas, o prolongamento da sobrevivência, melhoria parcial ou completa dos sintomas, e erradiação total ou parcial de uma condição, doença ou distúrbio associado à angiogênese ou correlacionado com a atividade da endoglina.
As composições podem ser administradas a um paciente em uma quantidade terapêutica efetiva, que são efetivos para a produção de algum efeito terapêutico desejado pela doença de um inibidor ou desordem tal como aqui descrito, que pode ser associada com a endoglina, com uma relação benefício/risco razoável, aplicável a qualquer tratamento médico. Para a administração das presentes composições a pacientes humanos, as composições podem ser formuladas por metodologia conhecida por um especialista na técnica. Uma quantidade terapeuticamente efetiva é uma quantidade que atinge, pelo menos parcialmente, o efeito terapêutico desejado ou profilático em um órgão ou tecido. A quantidade de um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo necessário para levar a prevenção e/ou tratamento terapêutico de uma doença ou distúrbio não é fixo, por si só. A quantidade de anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo administrado pode variar com o tipo de doença, extensão da doença, e do tamanho do mamífero que sofra da doença ou desordem. Em certa modalidade, dois ou mais anticorpos humanizados anti-endoglina aqui descritos são administrados em combinação a um paciente. A combinação inclui a administração concomitante ou subsequente dos anticorpos. O termo "administrando" é aqui definido como um meio fornecendo a composição para o paciente de uma maneira que resulte na composição estar dentro do corpo do paciente. Tal administração pode ser por qualquer via, incluindo, sem limitação, localmente, regionalmente ou sistemicamente, por via subcutânea, intravítrea, intradérmica, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, ou de administração intramuscular (por exemplo, injeção). A "administração concomitante" significa administração dentro de um período de tempo relativamente curto um do outro; período de tempo tal, pode ser menos do que 2 semanas, menos de 7 dias, menos de 1 dia e poderia mesmo ser administrado simultaneamente.
Os níveis reais de dosagem das substâncias ativas nas composições podem variar de modo a obter a quantidade do ingrediente ativo que seja efetivo para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente específico, da composição, e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto em particular utilizado, a via de administração, o tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular a ser empregue, a duração do tratamento, outras drogas, os compostos e/ou materiais usados em combinação com a composição particular empregado, a idade, sexo, peso, condição, estado geral de saúde, da história médica anterior do paciente a ser tratado e fatores semelhantes bem conhecidos na meRNAina. Os anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno aqui descrito podem ser administrados a um paciente em quantidades de dosagem e ao longo vários períodos de tempo diferentes. Não limitativos inclui doses de cerca de 0,01mg/kg, cerca de 0,05mg/kg, cerca de 0,1mg/kg, cerca de 0,5mg/kg, cerca de 1mg/kg, cerca de 5mg/kg, cerca de 10mg/kg, cerca de 20mg/kg, cerca de 30mg/kg, cerca de 40mg/kg, cerca de 50mg/kg, cerca de 60mg/kg, cerca de 70mg/kg, cerca de 80mg/kg, cerca de 90mg/kg, cerca de 100mg/kg , cerca de 125mg/kg, cerca de 150mg/kg, cerca de 175mg/kg, cerca de 200mg/kg, ou qualquer número inteiro entre os dois. Além disso, a dose(s) de anticorpo ou fragmento de ligação do antígeno podem ser administrados duas vezes por semana, semanalmente, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada 4 semanas, a cada 6 semanas, a cada 8 semanas, a cada 12 semanas, ou qualquer combinação de semana nele contidas. Ciclos de dosagem são também contemplados, tais como, por exemplo, a administração de anticorpos ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo uma ou duas vezes por semana durante 4 semanas, seguido de duas semanas sem terapia. Ciclos de administração adicionais, incluindo, por exemplo, diferentes combinações das doses semanais e ciclos aqui descritos são também contemplados no invento. "Contatando" é aqui definido como um meio de levar uma composição tal como aqui proporcionada na proximidade física com uma célula, órgão, tecido ou fluido como aqui descrito. Entrar em contato engloba a administração sistêmica ou local de qualquer uma das composições aqui fornecidas e inclui, sem limitação, in vitro, in vivo e/ou procedimentos e métodos ex vivo. "Combinação" e "entrar em contato" são utilizados alternadamente aqui e se destinam a ser definido da mesma maneira.
Uma resposta é alcançada quando o paciente experimenta alívio parcial ou total, ou a redução de sinais ou sintomas de doença e, especificamente, inclui, sem limitação, o prolongamento da sobrevivência. O previsto tempo de sobrevivência pode ser medido em meses ou anos, dependendo de fatores prognósticos, incluindo o número de recaídas, estágio da doença, e outros fatores. Prolongar a sobrevivência inclue, sem limitação, tempos de pelo menos 1 mês, cerca de pelo menos 2 meses, cerca de pelo menos 3meses, cerca de pelo menos 4 meses, cerca de pelo menos 6 meses, cerca de pelo menos 1 ano, cerca de pelo menos 2 anos, cerca de pelo menos 3 anos, ou mais. A sobrevivência global pode também ser medida em meses ou anos. Os sintomas do paciente podem permanecer estáticos ou podem diminuir.
Um médico ou veterinário tendo conhecimentos na técnica podem prontamente determinar e prescrever a quantidade efetiva (ED50) da composição requerida. Por exemplo, o médico ou veterinário podia iniciar com doses dos compostos empregues na composição em níveis mais baixos do que o requerido para atingir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que efeito desejado seja alcançado. Alternativamente, uma dose pode permanecer constante.
As composições podem ser administradas a um paciente por qualquer via conveniente, tal como foi descrito acima. Independentemente da via de administração selecionada, os compostos do presente invento que pode ser utilizados sob uma forma hidratada apropriada, e/ou as composições, são formulados em formas de dosagem aceitáveis tais como descrito abaixo ou através de outros métodos convencionais conhecidos dos peritos na técnica.
Os anticorpos podem ser combinados com uma porção terapêutica ou a uma porção (imagem) detectável utilizando métodos conhecidos na técnica tais como, por exemplo, a conjugação química, ligações covalentes ou não covalentes ou técnicas recombinantes para criar conjugados ou proteínas de fusão tal como descrito mais detalhadamente abaixo. Alternativamente, anticorpos e/ou outros agentes podem ser combinados em composições separadas para administração simultânea ou sequencial. A toxicidade e eficácia terapêutica do composto podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou em experimentos utilizando animais, por exemplo, para a determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% dos da população). A razão de dose entre efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão de LD50/ED50. Enquanto os compostos que exibem efeitos tóxicos secundários podem ser utilizados, deve ser tomado cuidado ao criar um sistema de liberação que tem como alvo tais compostos para o local do tecido afetado, a fim de minimizar danos potenciais para as células saudáveis e, desse modo, reduzir os efeitos colaterais.
Os dados obtidos a partir de ensaios em cultura de células e experiências em animais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagem para utilização em seres humanos. A dosagem destes compostos situa-se, de preferência, dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto usado no método da invenção, a dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em animais para atingir uma concentração plasmática circulante que inclui o IC50 (isto é, a concentração do composto de ensaio que consegue uma inibição semi-máxima) como determinada em cultura celular. Níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta peFRormance. Tal informação pode ser utilizada para determinar com mais precisão as doses úteis em humanos. O papel pró-angiogênico da endoglina foi estabelecida em diversos modelos, incluindo a cultura de células endoteliais e modelos knock-out do camundongo. O endotélio e as células associadas são bem conhecidos para exprimir endoglina (CD105), bem como o papel da endoglina na angiogênese, em geral, bem como o desenvolvimento cardíaco também foi confirmada em numerosos estudos, modelos de cultura e em modelos animais. (Duff et al, ESTÁGIOB J., 17:984-992 (2003); Bernabeu et al, J. Cell Biochem, 102 (6): 1375-1388 (2007); Patente dos EUA No. 7.097.836).
Assim, métodos que inibem a angiogênese num tecido doente melhoram os sintomas da doença e, dependendo da doença, podem contribuir para a sua cura. Em uma modalidade, a invenção contempla a inibição da angiogênese num tecido. A extensão da angiogênese num tecido, e, por conseguinte, a extensão da inibição realizada pelos presentes métodos, pode ser avaliada por uma variedade de métodos, tais como são aqui descritos. A especificidade exclusiva dos anticorpos que reconhecem (por exemplo, se ligam) um epítopo na endoglina, inibe a angiogênese e proporciona utilizações de diagnóstico e usos terapêuticos para doenças caracterizadas por angiogênese (neovascularização), dilatação de pequenos vasos, e/ou vascularização excessiva tal como aqui descrito. Anticorpos humanizados anti-endoglina e seus fragmentos podem ser administrados a um individuo tal como um mamífero (por exemplo, um humano), que sofre de uma desordem médica, por exemplo, várias formas de doenças oculares caracterizadas por angiogênese/neovascularização (por exemplo, degeneração macular, diabética retinopatia), nefropatia diabética, doenças inflamatórias crônicas (por exemplo, o DIC), artrite reumatóide, osteoartrite, e várias formas de câncer (tumores primários e metástases). É contido neste documento um método para o tratamento de um individuo que tem uma doença ocular caracterizada por angiogênese pela administração de um anticorpo humanizado ou seu fragmento que se liga a endoglina e inibe a angiogênese. Aqui também é fornecido um método para o tratamento de um indivíduo que tem uma doença inflamatória crônica pela administração de um anticorpo humanizado ou seu fragmento aqui descrito, que se liga a endoglina e inibe a angiogênese. Exemplos de tais doenças inflamatórias crônicas incluem, mas não estão limitados a, doença de Crohn e colite ulcerativa. Além disso, é presentemente proporcionado um método para o tratamento de um indivíduo que tem nefropatia diabética pela administração de um anticorpo humanizado ou seu fragmento aqui descrito. Aqui é fornecido um método para o tratamento de um sujeito que tem a artrite reumatóide ou osteoartrite pela administração de um anticorpo humanizado ou seu fragmento aqui descrito.
Pode-se compreender que os anticorpos anti-endoglina podem ser eficazes para o tratamento de angiogênese, isso é contemplado neste documento em que um indivíduo também pode ser tratado com um ou mais inibidores adicionais da angiogênese. O termo "inibidor de angiogênese" é aqui utilizado, para fins da especificação e sustentações, para significar um composto ou molécula incluindo, mas não se limitam a, peptídeos, proteínas, enzimas, polissacarídeos, oligonucleótideos, DNA, RNA, vetores recombinantes, e drogas cuja função é inibir a angiogênese. Inibidores de angiogênese são conhecidos na técnica e todos os tipos são aqui contemplados. Exemplos não limitativos de compostos e moléculas incluem biomoléculas naturais e sintéticas tais como paclitaxel, O-(cloroacetil-carbomil) fumagilol ("TNP-470" ou "AGM 1470"), trombospondina-1, trombospondina-2, angiostatina, condrócitos humanos derivado de inibidor da angiogênese ("hCHIAMP"), a cartilagem derivado do inibidor angiogênico, fator-4 de plaquetas, gro-beta, a proteína induzível humana Interferon 10 ("IP10"), interleucina 12, Ro 318.220, triciclodecan-9-il xantato ("D609"), irsogladine, brometo de 8,9-di-hidroxi-7-metil-benzo [b] quinolizina ("GPA 1734"), medroxiprogesterona, uma combinação de heparina e de cortisona, os inibidores de glucosidase, genisteína, talidomida, diaminoantraquinona, herbimicina, ácido ursólico e ácido oleanólico. Exemplos não limitativos de anticorpos incluem direcionadamente moléculas tais como VEGF, VEGF receptor, ou epítopos diferentes de endoglina. Além disso, pequenos inibidores moleculares de VEGF receptor são conhecidos e aqui contemplados. Não-limitantes exemplos de inibidores dos receptores de VEGF incluem o bevacizumab (AVASTIN®), o ranibizumab (Lucentis), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar), axitinibe, pegaptanib e pazopanib.
Os anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno, aqui descritos podem ser administrados em combinação com inibidores de receptores de VEGF para a terapia de combinação de quaisquer condições relacionadas com angiogênese ou doenças aqui descritas. Em certa modalidade não limitativa, o inibidor do receptor do VEGF é bevacizumab. A posologia exemplar para bevacizumab são cerca de 7,5, cerca de 10 ou cerca de 15 mg/kg, administradas a cada 2 ou 3 semanas.
Em certa modalidade não limitativa, o inibidor do receptor do VEGF é ranibizumab. As dosagens oculares para ranibizumab incluem cerca de 0,5mg, administrados intravítrea mensalmente. Em certa modalidade não limitativa, o inibidor do receptor do VEGF é aflibercept (VEGF-Trap). Dosagens para o VEGF-Trap incluem cerca de 0,5 a cerca de 10 mg/kg administradas a cada 2 ou 3 semanas. Dosagens oculares exemplares para VEGF-Trap incluem cerca de 0,5 a cerca de 2,0 mg administrado diretamente no olho mensal ou trimestralmente.
Em outra modalidade não limitativa, o inibidor do receptor do VEGF é sunitinib. Regimes exemplares para sunitinib incluem cerca de 50 mg administradas durante 4 semanas, seguido de 2 semanas de nenhuma droga. Os regimes terapêuticos podem ser repetidos numa base cíclica ou acíclica.
Em outra modalidade não limitativa, o inibidor do receptor do VEGF é sorafenib. As dosagens exemplares para sorafenib incluem cerca de 400 mg administrados diariamente.
Em outra modalidade não limitativa do inibidor do receptor do VEGF é axitinib. As dosagens exemplares para axitinib incluem cerca de 3, 5 ou 10 mg administrada duas vezes por dia.
Em outra forma de mobilidade não limitativa do inibidor do receptor do VEGF é pegaptanib. As dosagens exemplares para pegaptanib incluem cerca de 0,3 a 3mg administrados diretamente no olho a cada 6 semanas.
Em ainda outra modalidade não limitativa, o inibidor do receptor do VEGF é pazopanib. As dosagens exemplares para pazopanib incluem cerca de 200 a 1000 mg administrado diariamente. Múltiplas combinações destes inibidores de receptores de VEGF podem ser administradas com anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno, aqui descritos. Em uma modalidade, as combinações podem resultar na utilização de doses mais baixas para os anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno, aqui descritos, os inibidores dos receptores de VEGF, ou ambos. Tal alteração na dosagem pode resultar de efeitos sinérgicos com a combinação dos anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno, aqui descritos, com os inibidores dos receptores de VEGF.
CONDIÇÕES OCULARES ENVOLVENDO ANGIOGÊNESE
CONDIÇÕES DE DEGENERAÇÃO OCULAR MACULAR E RETINOPATIA
DIABÉTICA
Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para tratar a retinopatia diabética, degeneração macular, neovascularização coroidal ou glaucoma neovascular em um paciente, pela administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de qualquer uma das composições aqui proporcionadas. A endoglina é um receptor associado com a angiogênese e a matriz extracelular. A degeneração macular (DM) é a perda de fotorreceptores na porção da retina central, denominada mácula, responsável pela acuidade de alta visão. A degeneração da mácula é associada com a deposição anormal de componentes da matriz extracelular e outros resíduos na membrana entre o epitélio pigmentado da retina e a coroide vascular. Este material residual é denominada drusa. A drusa é observada com um exame oftalmológico de fundo de olho. Olhos normais podem ter máculas livres de drusas, ainda que a drusa possa ser abundante na periferia da retina. A presença de drusas moles na mácula, na ausência de qualquer perda de visão macular, é considerada um estágio precoce da DMRI. A degeneração macular é caracterizada por neovascularização coroidal (NVC), o desenvolvimento de vasos sanguíneos anormais sob a camada pigmentada do epitélio da retina (EPR). Estes vasos rompem a membrana de Bruch, interrompendo o epitélio pigmentado da retina, hemorragia e, eventualmente, causam cicatrizes maculares- o que resulta em perda profunda da visão central (cicatriz disciforme). A neovascularização coroidal (NVC) normalmente ocorre na degeneração macular, além de outros distúrbios oculares e está associado com a proliferação de células endoteliais da coróide, a superprodução de matriz extracelular e formação de uma membrana fibrovascular sub-retiniana. A proliferação de células do epitélio pigmentado da retina e da produção de fatores angiogênicos surge para efetuar neovascularização coroidal. A retinopatia diabética (RD) é uma doença ocular caracterizada por angiogênese excessiva que se desenvolve em pacientes com diabetes devido ao espessamento das membranas capilares basais e falta de contato entre pericitos e as células endoteliais dos capilares. A perda de pericitos aumenta o vazamento dos capilares e conduz a ruptura da barreira sangue-retina. A retinopatia diabética é o resultado de alterações microvasculares da retina. A hiperglicemia induzida pela morte dos pericitos e o espessamento da membrana basal leva à incompetência das paredes vasculares. Estes danos alteram a formação da barreira sangue-retina e também fazem os vasos sanguíneos da retina se tornar mais permeáveis. Pequenos vasos sanguíneos, tais como aqueles no olho são especialmente vulneráveis ao controle de baixo açúcar no sangue (glicose no sangue). Uma acumulação excessiva de danos de glicose e/ou frutose os minúsculos vasos sanguíneos na retina. Edema macular pode também desenvolver-se quando os vasos sanguíneos danificados vazam fluidos e lipídios para a mácula. Estes fluidos fazem a mácula inchar, o que embaça a visão. Este dano também resulta em falta de oxigênio na retina. À medida que a doença progride, a falta de oxigênio na retina estimula a angiogênese ao longo da retina e no espaço livre, humor vítreo semelhante ao gel que preenche o interior do olho. Sem tratamento adequado, estes novos vasos sanguíneos podem sangrar, a visão de nuvem e destruir a retina. A proliferação fibrovascular também pode causar descolamento de retina tracional. Os novos vasos sanguíneos pode também crescer para o ângulo da câmara anterior do olho e causar glaucoma neovascular.
Vitreorretinopatia proliferativa está associado com a proliferação celular das membranas celulares e fibróticas no interior das membranas vítreas e sobre as superfícies da retina. A proliferação de células pigmentadas do epitélio da retina e da migração é comum com este distúrbio ocular. As membranas associadas com vitreorretinopatia proliferativa contem componentes da matriz extracelular, tais como os tipos de colágeno I, II e IV e fibronectina e tornam-se, progressivamente, fibrótica. A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) e retinopatia diabética são as duas principais causas de cegueira nos países desenvolvidos. A aprovação recente das macromoléculas LUCENTIS®, AVASTIN®, e MACUGEN® melhoraram as opções de tratamento disponíveis para pacientes com DMRI. LUCENTIS® é um Fab e AVASTIN® é um anticorpo monoclonal. Eles se ligam ao fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e têm demonstrado os resultados mais impressionantes até agora ao tratar DMRI, no entanto, apenas uma minoria dos pacientes tratados experimenta uma melhoria significativa na acuidade visual. A terapia anti-angiogênico centrada sobre um alvo diferente de VEGF pode ultrapassar algumas das limitações associadas com agentes que têm como alvo a via de VEGF.
Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno que se ligam a endoglina podem ser utilizados para tratar ou prevenir a degeneração macular, NVC, retinopatia diabética, ou vitreorretinopatia proliferativa. Aqui são descritos métodos de tratamento ou prevenção da degeneração macular, NVC, retinopatia diabética, ou vítreorretinopatia proliferativa através da administração dos anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno. Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno que se ligam a endoglina pode também diminuir os vasos sanguíneos, inibir a proliferação de células endoteliais associada com a doença ocular, sintomas evidentes de sangramento, tratar a visão turva, fornecer estase de perda de visão, e/ou prevenir a perda dos vasos sanguíneos. Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno podem também ser utilizados em medicamentos para o tratamento de degeneração macular, NVC, retinopatia diabética ou vitreorretinopatia proliferativa.
Além disso, os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno, aqui descritos, também podem ser usados em combinação com terapias conhecidas e/ou compostos para o tratamento de degeneração macular, NVC, retinopatia diabética ou vitreorretinopatia proliferativa. Exemplos de tais compostos incluem, mas não estão limitados a, o bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCENTIS®), retinopatia aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), os compostos de sorafenib para o tratamento de degeneração macular, CNV, diabético ou proliferação vitreorretiniana. Exemplos de tais compostos incluem, mas não estão limitados a, bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib, pazopanib ou MACUGEN®. Para além dos modos de administração aqui descritos, os anticorpos humanizados anti-endoglina e fragmentos de ligação do antígeno podem ser administrados por vias intravítreas. Exemplos não limitativos de modos de administração incluem injeção intravítreas e o uso de implantes intravítreos.
Os pacientes podem ser avaliados pela melhoria e capacidade de resposta ao tratamento. O tratamento inclui, mas não está limitado a, diminuição do edema macular, diminuição das áreas de NVC e aumento da acuidade visual. As medições de sintomas são tal como conhecido na técnica e são ainda descritos nos exemplos abaixo.
DOENÇAS INFLAMATÓRIAS CRÔNICAS
Qualquer um de uma variedade de tecidos ou órgãos compostos de tecidos organizados pode suportar a angiogênese em condições de doença, incluindo, pele, tecido intestinal muscular, conjuntivo, articulações, ossos e do tecido como na qual os vasos sanguíneos podem invadir e proporcionar estímulos angiogênicos. Assim, em certa modalidade, um tecido a ser tratado é um tecido inflamado e a angiogênese a ser inibida é a angiogênese do tecido inflamado, onde há neovascularização de tecido inflamado.
ENTEROPATIAS INFLAMATÓRIAS A angiogênese desempenha um papel importante na doença inflamatória do intestino(DIC). DIC é um termo geral do conjunto do intestino e doenças intestinais ou condições incluindo doença de Crohn e colite ulcerativa. Doença de Crohn é tipicamente caracterizada pela inflamação do intestino delgado e grosso, enquanto que a colite ulcerosa é geralmente localizada no cólon. A angiogênese anormal ou patológica é central tanto para a doença de Crohn como para a colite ulcerativa. Ambas as doenças envolvem aumento da densidade e disfunção microvascular e essa angiogênese é temporalmente relacionado com o tecido da patologia e os ciclos inflamatórios encontrados em ambas as doenças. A endoglina é conhecida por ser expressa nestes tecidos e para desempenhar um papel na desregulação da angiogênese durante DIC. (Chidlow et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Physiol Fígado., 293:5-18 (2007)).
Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno que se ligam a endoglina e são aqui descritos podem ser usados para tratar a DIC. Além disso, os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno que se ligam a endoglina podem ser usados para o tratamento da doença de Crohn e colite ulcerativa. Os anticorpos humanizados anti-endoglina e fragmentos de ligação do antígeno pode também ser utilizado em combinação com a cirurgia e/ou terapias conhecidas para a DIC, doença de Crohn ou colite ulcerosa. Exemplos de tais terapias conhecidas incluem, mas não estão limitados a, aminosalicilatos (por exemplo, Mesalamine), corticoesteróides (por exemplo, budesonida, prednisona, etc), antibióticos (por exemplo, metronidizole, etc), drogas imunossupressoras (por exemplo, azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, tacrolimus e ciclosporina, etc), e drogas biológicas tais como proteínas e anticorpos (por exemplo, infliximab, etc.) O tratamento de DIC pode ser avaliado pela vascularização diminuída do tecido inflamado. O tratamento pode também ser avaliado por estase, resolução e/ou cura de lesões ulcerativas que caracterizam a DIC.
NEFROPATIA DIABÉTICA E ISQUEMIA DE TRANSPLANTE RENAL A nefropatia diabética é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em ambos os tipos diabéticos: 1 e 2. É a principal causa do estágio final da doença renal em todo o mundo. A nefropatia diabética é caracterizada por lesão glomerular microvascular devido ao aumento da síntese de fatores pró-angiogênicos. Esses fatores pró-angiogênicos causam a proliferação de células endoteliais e aumentam a angiogênese, e a endoglina é conhecida por ser regulada em doença renal crônica. Este angiogênese resulta na destruição dos glomérulos e, finalmente, insuficiência renal. (Zent et al, Seminars in Nephrology, 27 (2):161-171 (2007); Roy-Chaudhury et al, Exp Nephrol, 5:55-60 (1997)).
Efeitos semelhantes são vistos em transplante renal resultando em isquemia e falha do órgão transplantado. A regulação positiva induzida pelos resultados da endoglina a angiogênese e inflamação no rim. Por outro lado, estudos com endoglina em camundongos mostram significativamente redução da lesão renal após o transplante/isquemia e sobrevivência órgão aumentada. (Docherty et al., Nephol. Dial. Transplante., 21:2106-2119 (2006)).
Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno que se ligam a endoglina e são aqui descritos podem ser utilizados para tratar ou prevenir a nefropatia diabética, insuficiência renal após o transplante, e/ou lesão renal isquêmica após o transplante.
Descritos a seguir são os métodos de tratamento ou prevenção de nefropatia diabética, insuficiência renal após o transplante, e/ou lesão renal isquêmica após o transplante através da administração dos anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno, aqui descritos. Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno, aqui descritos, podem também ser utilizados em medicamentos para o tratamento da nefropatia diabética, insuficiência renal após o transplante, e/ou lesão renal isquêmica após o transplante. Além disso, os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno aqui descrito também podem ser usados em combinação com terapias conhecidas e/ou compostos para o tratamento da nefropatia diabética, insuficiência renal após o transplante, e/ou lesão renal isquêmica após o transplante.
Os pacientes podem ser avaliados no que diz respeito à eficácia do tratamento, por exemplo, melhoria da função renal.
ARTRITE REUMATÓIDE E OSTEOARTRITE A artrite reumatóide é caracterizada por angiogênese excessiva, e é bem compreendida, a este respeito. A inflamação e destruição encontradas nos líquidos sinoviais estão diretamente relacionadas com a angiogênese e o aumento nos tecidos sinoviais circundantes encontrados. Numerosos fatores pró-angiogênicos estão presentes nos tecidos afetados de doentes com artrite reumatóide. (Koch e Distler, Arthritis & Ther Res, 9 (supl. 2): S3, 1-9 (2007). A osteoartrite é um grupo de condições crônicas incapacitantes que afeta as articulações sinoviais. A angiogênese e inflamação são processos integrais na patofisiologia da doença, e que contribuem para a lesão articular através de uma variedade de mecanismos, incluindo, mas não limitado a, estimulação da produção de MMP e ossificação endocondral. Além disso, a angiogênese na osteoartrite induz inervação complementares, que se desenvolve em um circuito de retroalimentação onde cada um continua a estimular o outro. (Bonnet & Walsh, Reumatologia, 44:7-16 (2005)).
Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno que se ligam a endoglina e são aqui descritos podem ser utilizados para tratar ou prevenir a artrite reumatóide e osteoartrite. São descritos a seguir, os métodos de tratamento ou prevenção de artrite reumatóide e osteoartrite através da administração dos anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno, aqui descritos. Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno, aqui descritos, podem também ser utilizados em medicamentos para o tratamento da artrite reumatóide e osteoartrite.
Duas medidas compostas de melhoria da RA bem aceitas em estudos são: os Critérios de Paulus e do Colégio Americano de Reumatologia Critérios (ACR). O critérios de Paulus está definido como melhora em 4 dos a seguir: do concurso e número de articulações inchadas, rigidez matinal, avaliação do paciente da atividade da doença, avaliação médica da atividade da doença e taxa de velocidade de sedimentação de eritrócitos (SE). O nível de melhoria é definido como uma melhoria percentual de cada uma destas variáveis, ou seja, um Paulus 20 indica uma classificação de resposta com melhoria de 20% em 4 dos 6 parâmetros. A artrite reumatóide também pode ser avaliada através Faculdade Americana de Reumatologia Scoring (ACR). Resumidamente, critérios de classificação do ACR para a determinação da remissão clínica em artrite reumatóide é avaliada pela presença de 5 ou mais dos seguintes fatores presentes pelo menos dois meses consecutivos: a. rigidez matinal <15 minutos; b. Sem fadiga; c. Sem dor nas articulações; d. Sem sensibilidade articular ou dor ao movimento; e. Não tecidos moles nas articulações ou bainhas dos tendões e f. SE (método de Westergren) <30mm/hora para o sexo feminino ou 20mm/hora para o sexo masculino.
As exclusões podem ocorrer e incluem: as manifestações clínicas da vasculite ativa, pericardite pleurite, ou miosite, e perda de peso inexplicável recente ou febre atribuíveis à artrite reumatóide proibirão a denominação de remissão clínica completa (Pinals RS, et.al.: Artrite Reumatpide 24: 1308,1981). Além disso, critérios de classificação do ACR do estado funcional na Artrite Reumatóide inclui a classificação com base nas habilidades de doentes: Classe I: Completamente capaz de realizar atividades habituais da vida diária (autocuidado, profissional e atividades livres);
Classe II: Capaz de executar atividades usuais do auto-cuidado e profissional, mas limitada em atividades livres;
Classe III: Capaz de executar habituais atividades de autocuidado, mas limitada em atividades vocacionais e atividades livres e Classe IV: capacidade limitada para realizar atividades usuais do auto-cuidado, profissional, e atividades livres. A osteoartrite também pode ser avaliada através de pontuação ACR. Critérios clínicos de classificaçãos do ACR para osteoartrite do quadril é avaliada utilizando o histórico do paciente, exame físico e achados labocamundongoriais: a paciente é avaliada para a dor no quadril e uma das seguintes opções: (1) a viação do quadril interno, de menos de 15 graus e SE inferior ou igual a 45 graus mm/hora ou flexão do quadril inferior ou igual a 115 graus se SE não está disponível; ou (2) viação do quadril interno, de menos do que 15 graus, dor associada com o quadril interno, rigidez matinal da anca para menos do que ou igual a 60 minutos e o paciente tem mais de 50 anos de idade.
Usando a história, exame físico, achados labocamundongoriais e radiográficos, formato tradicional é a dor no quadril e duas das seguintes indicações: SE inferior a 20 mm/hora, osteófitos radiográficos femorais e/ou acetabular, ou estreitamento do espaço articular radiográfico (superior, axial, e/ou medial). Uma árvore de classificação é o seguinte: dor na anca, em associação com (1) radiográficas osteófitos femorais e/ou acetabular ou (2) SE inferior ou igual a 20 mm/hora e estreitamento do espaço radiográfica axial comum (Altman, R, et al:. Artrite Reumatóide 34:505, 1991).
CRITÉRIOS CLÍNICOS DE CLASSIFICAÇÃO ACR DE OSTEOARTRITE DO JOELHO
Critérios clínicos de classificação ACR para osteoartrite do joelho é avaliada através de histórico e exame físico, utilizando os seguintes critérios: dor no joelho em conexão com três (3) dos seguintes: (1) a paciente com mais de 50 anos de idade; (2) menos de 30 minutos de rigidez matinal; (3) Crepitação em movimento ativo; (4) ternura óssea; (5) alargamento ósseo, e (6) o calor não palpável da membrana sinovial.
Usando o histórico do paciente, exame físico e radiográfico, a dor no joelho pode ser avaliada em relação com uma das características do paciente a seguir: (1) a paciente é mais de 50 anos de idade; (2) menos de 30 minutos de rigidez matinal; e (3) Crepitação em movimento ativo e osteófitos. Usando o histórico, exame físico e laboritorial: dor no joelho pode ser avaliada em ligação com cinco (5) das seguintes características: (1) a paciente com mais de 50 anos de idade; (2) menos de 30 minutos de rigidez matinal; (3) Crepitação em movimento ativo; (4) ternura óssea; (5) alargamento ósseo; (6) Não aquecimento palpável da membrana sinovial; (7) ESF é inferior a 40 mm/hora; (8) Fator reumatóide (FR) de menos de 1:40, e (9) Sinais de osteoartrite em líquido sinovial (LS).
Ver, por exemplo, Altman, Ret al:. Artrite Reumatóide 29:1039, 1986.
Critérios clínicos de classificação ACR para osteoartrite da mão pode ser avaliada pelos seguintes: aflição, dor ou rigidez na mão em conexão com três (3) dos seguintes: (1) o alargamento do tecido duro de duas ou mais das seguintes junções (segundo e terceiro interfalângica distal), segunda e terceira interfalângica proximal, e as primeiras articulações carpo de ambas as mãos, (2) o alargamento do tecido duro de dois ou mais articulações interfalângicas distais; (3) menos de três articulações inchadas MCP e (4) deformidade de, pelo menos, uma das articulações listada acima em (1).
CÂNCER CD105 está associada com a angiogênese em tumor e é fortemente sobre-regulada no endotélio dos vários tecidos tumorais comparado com os tecidos normais. CD105 é sobre-regulada em uma ampla gama do endotélio do tumor, incluindo, por exemplo, do cólon, mama, cérebro, pulmão, próstata, endométrio, rim, fígado, estômago, cabeça e pescoço e câncer cervical. Além disso, sabe-se que não há mais forte expressão de CD105 no tumor do endotélio correspondentes nos tecidos normais. (Duff et al, ESTÁGIOB J., 17:984-992 (2003); Bernabeu et al, J. Cell Biochem, 102(6): 1375-1388 (2007); Patente dos EUA No. 7.097.836). Assim, a inibição da angiogênese com anticorpos humanizados anti-endoglina representa a opção de tratamento para tumores cancerosos. Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno que se ligam a endoglina e são aqui descritos podem ser usados para tratar tumores cancerosos. Os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação do antígeno, aqui descritos, podem também ser utilizados em medicamentos para o tratamento de tumores cancerosos. O termo "tumor" é aqui utilizado para se referir a um tecido canceroso expressando a endoglina (em comparação com a expressão por tecido normal do mesmo tipo). Os tumores podem incluir tumores sólidos e semi-sólidos. Exemplos não limitativos de tumores incluem leucemias humanas, incluindo o tipo de célula não T de leucemia linfoblástica aguda (LLA), mielomonocítica leucemia; e tumores sólidos humanos e semi-sólidos, com a sua vasculatura circundante que expressam endoglina em níveis moderados a elevados (em comparação com a expressão por tecido normal do mesmo tipo), incluindo angiosarcoma, carcinoma da mama, câncer do estômago, carcinoma do cólon, linfoma de Hodgkin, linfomas, o glioblastoma multiforme (GBM), carcinoma do pulmão, melanoma, mieloma, linfoma, osteossarcoma, carcinoma de ovário, tumor de parótida, carcinoma da faringe, carcinoma da próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma renal, carcinoma retossigmóide.
Um tecido canceroso a ser tratado consiste, por exemplo, de um tecido endotelial expressando um nível anormal de endoglina.
Na ausência de neovascularização do tecido do tumor, o tecido tumoral não obtem os nutrientes necessários, retardando o crescimento, cessando o crescimento adicional, regridindo e, finalmente, torna-se necrótico resultando em morte do tumor. A presente invenção proporciona um método de inibição da neovascularização do tumor por inibição da angiogênese de acordo com os presentes métodos. Da mesma forma, a invenção proporciona um método de inibir o crescimento do tumor pela pratica dos métodos inibidores da angiogênese.
Os métodos são também particularmente eficazes contra a formação de metástases porque a sua formação requer a vascularização de um tumor primário de modo que as células cancerosas metastáticas possam sair do tumor primário e se fixarem em um local secundário requerendo neovascularização para suportar o crescimento das metástases. É de se notar que um "paciente que sofre de um cancer/metástase" pode expressar uma proteína mutante (antígeno associado ao tumor) ou um gene mutante e ainda não ser sintomático da doença. Em um exemplo não limitativo, onde o câncer é o câncer do cólon (a qual está associada com a proteína mutante K-ras), um paciente com uma proteína mutante K-ras em algumas células do cólon é um paciente de acordo com a invenção, embora que o paciente possa ainda não ser sintomático para câncer de cólon. "Sinais ou sintomas de doença" são clinicamente reconhecimentos, manifestações ou indicações da doença.
Pelo "tratamento" entende-se que os sintomas um paciente que sofre de câncer estão parcial ou totalmente aliviados, ou permanecem com tratamento estático de acordo com a invenção. Um paciente que foi tratado pode apresentar uma diminuição parcial ou total dos sintomas e/ou carga tumoral. Este se destina a englobar a terapia, profilaxia e cura. Em um exemplo não limitativo, uma paciente sofrendo de um câncer altamente metastático (por exemplo, câncer da mama) é tratado em que a metástase adicional ou não ocorre, ou é em número reduzido, em comparação com uma paciente que não recebeu o tratamento. Num outro exemplo não limitativo, uma paciente é tratado em que o câncer sólido do paciente ou reduziu no tamanho ou não aumenta em tamanho, em comparação com um paciente que não recebe o tratamento. Em ainda outro exemplo não limitativo, o número de células cancerosas em um paciente tratado, não aumenta ou é reduzido em comparação com o número de células cancerosas em um paciente que não recebe o tratamento. A melhoria pode também ser definida, por exemplo, como a diminuição da proliferação de células, a diminuição do número de células, o aumento apoptose, e/ou maior sobrevida do paciente a ser tratado.
Tal como será aqui utilizado, o tratamento de câncer inclui estase, a eliminação total ou parcial do crescimento canceroso ou tumor. Tratamento ou parcial eliminação inclui, por exemplo, uma redução da velocidade de crescimento ou tamanho e/ou volume do tumor tal como cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, ou qualquer redução da velocidade entre os mesmos. Do mesmo modo, tratamento ou a eliminação parcial pode incluir uma redução percentual do crescimento ou tamanho e/ou volume do tumor de cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou qualquer redução percentual no entre os mesmos.
Um tumor ou câncer a ser tratado pelos métodos aqui descritos incluem, mas não está limitado a, um câncer de pulmão, uma doença ginecológica maligna, um melanoma, um câncer da mama, um câncer do cérebro (por exemplo, glioblastoma multiforme, "GBM"), um câncer pancreático, um câncer de ovário, um câncer no útero, um câncer colorretal, um câncer de próstata, um câncer de rim, um câncer de fígado (carcinoma hepatocelular), um câncer de útero, um câncer no pescoço, um câncer de rim (carcinoma de células renais), um sarcoma, um mieloma, e linfoma. Em uma forma de realização, um tumor a ser tratado é um tumor sólido ou semi-sólido. Numa outra modalidade, um tumor a ser tratado é um tumor primário. Numa outra modalidade, um tumor a ser tratado é um tumor metastático. Em outra modalidade, um tumor ou câncer a ser tratado é de origem epitelial. Numa outra modalidade, o câncer a ser tratado consiste em mieloma. Numa outra modalidade, o câncer a ser tratado é o câncer de ovário. Numa outra modalidade, o câncer a ser tratado consiste em câncer de rim/renal. Em ainda outra modalidade, o câncer a ser tratado consiste câncer hepatocelular/fígado.
CÂNCER DE PULMÃO
Em um aspecto, é proporcionado neste documento um método para tratar o câncer de pulmão. O tipo mais comum de câncer de pulmão é o câncer de pulmão de células não pequenas (CPNPC), que representa cerca de 80 a 85% dos cânceres do pulmão e está dividido em carcinomas espinocelulares, adenocarcinomas e carcinomas de grandes células indiferenciadas. Câncer de pulmão em pequenas células responde por 15 a 20% dos cancros do pulmão.
Estadiamento do câncer de pulmão é uma avaliação do grau de disseminação do câncer a partir de sua fonte original. É um fator importante que afeta o prognóstico potencial do tratamento de câncer de pulmão. Carcinoma nas células não pequenas do pulmão é observado a partir de IA ("um A", prognóstico melhor) a IV ("quatro"; pior prognóstico). Carcinoma de pequenas células do pulmão é classificado como a etapa limitada se está confinado a uma metade do peito e dentro do âmbito de um campo de radioterapia único, caso contrário, é etapa extensa. Células não pequenas do pulmão podem ser observadas com USE (ultrassom endoscópico) ou tomografia computadorizada ou ressonância magnética ou a cirurgia para classificar a extensão da doença de acordo com o sistema TNM. Estes indivíduos sofrem de paragem como parte do processo de considerar prognóstico e tratamento. A AJCC recomenda o estadiamento TNM seguido por agrupamento adicional. O tumor primário (T): TX: O tumor primário não pode ser avaliado, ou se há células malignas no escarro ou lavado broncoalveolar, mas não visto na imagem ou broncoscopia; Tis: carcinoma in situ. T0: Não há evidência de tumor primário. T1: Tumor menor que 3cm em sua maior dimensão, rodeado por pulmão ou pleura visceral e sem invasão broncoscópico no brônquio principal. T2: Um tumor com qualquer um de: mais de 3 cm em sua maior dimensão; se estendendo até o brônquio principal (mas mais de 2 cm da carina) e pneumonite obstrutiva (mas não envolvendo todo o pulmão). T3: Um tumor com qualquer um de: invasão da parede toráxica, diafragma, pleura mediastinal ou pericárdio parietal; se estendendo até o brônquio principal, no espaço de 2 cm da carina, mas não envolvendo a carina e pneumonite obstrutiva de todo o pulmão. T4: Um tumor com qualquer um de: invasão do mediastino, coração, grandes vasos, traquéia, esôfago, vértebras, ou carina; separados nódulos tumorais no mesmo lobo e derrame pleural maligno. Os linfonodos (N): NX: Linfonodos não podem ser avaliados; N0: Sem linfonodos envolvidos; N1: metástases para linfonodos ipsilaterais peribrônquicos ou ipsilateral hilares; N2: Metástases para linfonodos mediastinais ipsilaterais ou subcarinal, e N3: metástase para qualquer um de: linfonodos supraclaviculares ipsilaterais; linfonodos ipsilaterais escaleno, e linfonodos contralaterais. Metástases à distância (M): MX: metástase à distância não pode ser avaliada; M0: Ausência de metástases à distância, e M1: metástase à distância está presente.
CÂNCER DE ÚTERO/MALIGNICIDADE GINECOLÓGICA Câncer uterino pode se referir a qualquer um dos vários diferentes tipos de câncer que ocorrem no útero, especialmente: sarcomas uterinos (por exemplo, os sarcomas do miométrio, ou camada muscular do útero, são mais comumente leiomiossarcomas); de endométrio; e câncer cervical.
Num outro aspecto, é proporcionado aqui um método para tratar o câncer do endométrio. O câncer endometrial é um câncer que começa no endométrio, revestimento interno do útero. Alguns dos exemplos do câncer do útero e do endométrio incluem, mas não estão limitados a, adenocarcinomas, adenoacanthomas, carcinomas adenoescamosos, adenocarcinomas papilar serosos, adenocarcinomas de células claras, sarcomas uterinos, sarcomas estromais, tumores mesodérmicos mistos malignos e leiomiossarcomas.
Em outro aspecto, o método trata câncer cervical, de preferência um adenocarcinoma no colo do útero epitelial. Existem dois tipos principais desse câncer: carcinoma de células escamosas e adenocarcinomas. O primeiro constitui cerca de 80 a 90% de todos os cânceres cervicais e se desenvolve onde a ectocérvice (porção mais próxima da vagina) e a endocérvice (porção mais próxima do útero) se unem. O último desenvolve nas células produtoras de muco das glândulas da endocérvice. Alguns tipos de câncer do colo do útero têm características de ambos e são chamados carcinomas adenoescamosos ou carcinomas mistos.
CÂNCER DE OVÁRIO
Num outro aspecto, neste documento é proporcionado um método de tratamento do câncer do ovário, incluindo tumores epiteliais do ovário. O câncer de ovário é classificado segundo a histologia do tumor, obtida em um relatório de patologia. Da superfície do tumor epitelial-estromal, também conhecido como carcinoma epitelial do ovário, é o tipo mais comum de cancer do ovário. Ele inclui tumor seroso, tumor endometrióide e cistadenocarcinoma mucinoso. Tumor do cordão sexual-estromal, incluindo produção de estrogênio pelo tumor de células granulares e tumor virilizante de células Sertoli-Leydig ou arrhenoblastoma, é responsável por 8% dos cânceres de ovário. Relatos de tumor de células germinativas em aproximadamente 30% dos tumores de ovário, mas apenas 5% dos cânceres de ovário devido a maioria dos tumores de células germinativas são teratomas e a maioria dos teratomas são tumores benignos. Tumor de células germinativas tende a ocorrer em mulheres jovens e meninas. O prognóstico depende da histologia específica do tumor de células germinativas, mas no geral é favorável. Tumores mistos contem elementos de mais do que uma das classes histológica do tumor acima. O câncer ovariano pode também ser um câncer secundário, resultado da metástase de um câncer primário em outras partes do corpo. Cânceres primários comuns são: câncer de mama e câncer gastrointestinal (caso em que o câncer de ovário é o câncer Krukenberg). O tumor da superfície epitelial-estromal pode ser originado no peritônio (o revestimento da cavidade abdominal), neste caso o câncer de ovário é secundário para o câncer peritoneal primário, mas o tratamento é basicamente o mesmo que para a superfície do tumor primário epitelial-estromal envolvendo o peritônio.
Estadiamento do câncer de ovário é pelo sistema de estadiamento FIGO e usa informações obtidas após a cirurgia, que podem incluir uma histerectomia abdominal total, remoção de ambos os ovários e das trompas de Falópio, omento e lavagens pélvica (peritoneal) para citologia. O estágio AJCC é o mesmo que o estágio FIGO.
Estágio I refere-se ao câncer de ovário limitado a um ou ambos os ovários: IA- envolve um ovário; cápsula intacta, sem tumor na superfície ovariana, sem células malignas na ascite ou lavagens peritoneais; IB- envolvem ambos os ovários; cápsula intacta; nenhum tumor na superfície ovariana; lavagens negativas; e IC- tumor limitado aos ovários com qualquer um dos seguintes: cápsula rompida, tumor na superfície do ovário, lavagens positivas.
Estágio II se refere à extensão pélvica ou implantes: IIA- extensão ou implantes na parede do útero ou tuba uterina; lavagens negativas; IIB- extensão ou implantes para outras estruturas pélvicas; lavagens negativos; IIC-extensão pélvica ou implantes com lavado peritoneal positivo.
Estágio III se refere a implantes peritoneais microscópicos fora da pelve, ou limitados à pelve com extensão ao intestino delgado ou omento: IIIA - metástases peritoneais microscópicas fora da pelve; IIIB - metástases peritoneais macroscópicas além da pelve inferior a 2cm de tamanho, e IIIC - metástases peritoneais fora da pelve de 2cm ou metástases linfonodais.
Estágio IV se refere a metástases remotas ao fígado ou no exterior da cavidade peritoneal.
Metástases para linfonodos para-aórticos são considerados nódulos linfáticos regionais (Estágio IIIC).
Em algumas modalidades, dos métodos aqui descritos tratam um câncer de ovário selecionado a partir do seguinte: um adenocarcinoma do ovário ou um adenocarcinoma que migrou a partir do ovário na cavidade abdominal.
MELANOMA
Um melanoma é um tumor maligno dos melanócitos que são encontrados predominantemente na pele como também no intestino e nos olhos (melanoma uveal). É um dos tipos mais raros do câncer de pele, mas provoca a maioria dos óbitos por câncer de pele relacionado. O melanoma maligno é um tipo grave de câncer de pele causada pelo crescimento descontrolado de células pigmentadas, chamadas melanócitos. Melanomas também incluem, mas não estão limitados a, um melanoma de coróide, melanomas malignos, melanomas e melanomas intra-oculares.
Melanoma pode ser dividido nos seguintes tipos: lentigo maligno, lLentigo maligno melanoma, Superficialmente espalhando melanoma, melanoma acrolentiginoso, melanoma de mucosa, melanoma nodular, melanoma polipóide, melanoma desmoplásico, melanoma amelanótico, melanoma do tecido mole e melanoma uveal. Estágios de melanoma são como se segue: Estágio 0 - melanoma in situ (nível de Clark I).
Estágio I/II - melanoma invasivo: T1a: primário menor que 1,00mm, sem ulceração, nível de Clark II-III; T1b: primário menor que 1,00mm, com ulceração ou nível de Clark IV-V, e T2a: primário de 1,00 a 2,00mm, sem ulceração.
Estágio II - Melanoma de Alto Risco: T2b: primário de 1,00 a 2,00mm, com ulceração; T3a: primário de 2,00 a 4,00mm, sem ulceração; T3b: primário de 2,00 a 4,00mm, com ulceração; T4a: primária de 4,00mm ou mais sem ulceração; T4b: primária de 4,00mm ou mais com ulceração.
Estágio III - Metástase Regional: N1: único linfonodo positivo; N2: 2 a 3 nódulos linfáticos positivos ou pele regionais/em trânsito metástases e N3: 4 linfonodos positivos ou linfonodo e pele regionais/metástases em trânsito.
Estágio IV - Metástases à distância: M1a: metástase cutânea à distância, LDH normal; M1a: Metástase de pulmão, LDH normal e M1c: metástases a outras distâncias ou metástases a qualquer distância com LDH elevado.
Em uma modalidade, os métodos aqui descritos tratam de um melanoma.
CÂNCER DE CÓLON E CÂNCER COLORRETAL O câncer colorretal (câncer de cólon ou também chamado de câncer de intestino grosso) inclui tumores cancerosos no cólon, reto (ânus) e apêndice. Com 655.000 mortes no mundo por ano, é a terceira forma mais comum de câncer e a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo ocidental. Muitos cânceres colorretais surgiram a partir de pólipos adenomatosos no cólon. Estes crescimentos de cogumelos são geralmente benignos, mas alguns podem se transformar em câncer com o tempo.
Numa outra modalidade, a classificação de Dukes pode ser usada para classificar o câncer colorretal baseado nos estágios A-D. Estágio A se refere à cancer colorretal que é limitado à mucosa (isto é, não tenha invadido através da parede do intestino). O estágio B1 se refere à estendimento da própria musculatura, mas não penetrando através dele (ou seja, os linfonodos não foram invadidos), enquanto no estágio B2, o câncer penetrando na própria musculatura, mas não penetrando através dela (ou seja, os linfonodos não foram invadidos). Estágio C1 se refere ao câncer que se estende até a própria musculatura, mas não penetrando através dele (ou seja, os gânglios linfáticos estão envolvidos), o estágio C2 se refere a câncer que se estende até a própria musculatura e penetra através dele (ou seja, os gânglios linfáticos estão envolvidos). Estágio D refere-se a remota disseminação metastática. O sistema TNM pode também ser utilizado para o estágio do câncer colorretal segundo meios convencionais conhecidos na técnica.
CÂNCER DE MAMA
Existem vários tipos de câncer de mama que podem ser tratados pelos métodos aqui descritos. O carcinoma lobular in situ e carcinoma dutal in situ são cânceres de mama que se desenvolveram nos lóbulos e ductos, respectivamente, mas não se espalharam para o tecido adiposo ao redor da mama ou para outras áreas do corpo. Carcinoma lobular e ductal são cânceres que se desenvolveram nos lóbulos e ductos, respectivamente, e se espalharam para qualquer tecido adiposo na mama e/ou outras partes do corpo. Em um aspecto, um método de tratamento do câncer mama é contido neste documento, tais como de um carcinoma ductal no duto de tecido em uma glândula mamária, um câncer da mama que é Her2- e/ou ER- e/ou PR-. Outros cânceres da mama que se beneficiariam do tratamento através dos métodos são carcinomas medulares, carcinomas coloides, carcinomas tubulares e câncer inflamatório da mama.
Em uma modalidade, o câncer de mama é testado segundo o sistema TNM. O prognóstico está intimamente ligado aos resultados do teste, o estágio é também utilizado para alocar pacientes para tratamentos tanto em estudos clínicos como em prática clínica.
Resumidamente, a informação para teste é como se segue: TX: tumor primário não pode ser avaliado. T0: Não há evidência de tumor. Tis: carcinoma in situ, sem invasão; T1: Tumor é de 2 cm ou menos; T2: Tumor é mais do que 2 cm, mas não mais de 5 cm; T3: Tumor é mais do que 5 cm; T4: Tumor de qualquer tamanho crescente na parede torácica ou pele, ou câncer de mama inflamatório. NX: Os gânglios linfáticos regionais não podem ser avaliados N0: câncer não se espalhou para os linfonodos regionais. N1: câncer se espalhou para 1 a 3 do maxilar ou um nódulo linfático mamário interno N2: câncer se espalhou de 4 para 9 nódulos linfáticos maxilares ou múltiplos linfonodos mamários internos N3: uma das seguintes situações: câncer se espalhou para 10 ou mais gânglios linfáticos do maxilar, ou câncer se espalhou para os linfonodos sob a clavícula (clavícula), ou o câncer se espalhou para os gânglios linfáticos acima da clavícula, ou câncer envolve os linfonodos e ampliou os linfonodos mamários internos, ou câncer envolve 4 ou mais gânglios linfáticos do maxilar, e quantidades ínfimas de câncer são encontradas nos linfonodos mamários internos na biopsia linfonodo sentinela. MX: presença de propagação remota (metástase) não pode ser avaliada. M0: sem propagação remota. M1: o espalhamento para órgãos distantes (não incluindo o linfonodo supraclavicular) ocorreu.
CÂNCER DE PÂNCREAS
Um outro aspecto que está contido aqui é o método de tratamento do câncer pancreático selecionado a partir do seguinte: um carcinoma epitelial no duto do tecido pancreático e um adenocarcinoma em um duto pancreático. O tipo mais comum de câncer pancreático é um adenocarcinoma, que ocorre no revestimento do canal pancreático.
Em uma modalidade, os métodos aqui descritos tratam o câncer pancreático.
CÂNCER DE PRÓSTATA
Em um outro aspecto é fornecido aqui um método para tratar câncer da próstata selecionado a partir do seguinte: um adenocarcinoma ou um adenocarcinoma que tenha migrado para o osso. O câncer da próstata se desenvolve no orgão próstata dos homens, que circunda a primeira parte da uretra. A próstata tem vários tipos de células, mas 99% dos tumores são adenocarcinomas que se desenvolvem nas células glandulares responsáveis para a geração de fluido seminal.
Existem dois esquemas comumente utilizados no estágio do câncer de próstata. O mais comum é o sistema TNM, que avalia o tamanho do tumor, a extensão dos gânglios linfáticos envolvidos, e qualquer metástase (propagação remota). Como acontece com muitos outros cânceres, estes são frequentemente agrupados em quatro estágios (I-IV).
Outro esquema, utilizado com menor frequência, é o estágio Whitmore-Jewett.
Resumidamente, no estágio I da doença o câncer se encontra incidentalmente em uma pequena parte da amostra quando o tecido da próstata foi removido por outras razões, tais como a hipertrofia prostática benigna, e as células se assemelham a células normais e a glândula parece normal ao exame do toque. No estágio II, mais da próstata está envolvida e uma protuberância pode ser sentida no interior da glândula. No estágio III, o tumor se estende através da cápsula prostática e o nódulo pode ser sentido na superfície da glândula. No estágio IV da doença, o tumor invadiu estruturas vizinhas, ou se espalhou para os linfonodos ou outros órgãos. A classificação é baseada no conteúdo celular e na arquitetura dos tecidos a partir das biópsias (Gleason), que fornece uma estimativa do prognóstico potencial destrutivo final da doença.
Em uma modalidade, os métodos aqui descritos tratam o câncer da próstata.
CÂNCER DE CABEÇA E PESCOÇO Cânceres de cabeça e pescoço (por exemplo, oral, laringe, nasofaringe, esôfago, etc), referem-se a um grupo de cânceres biologicamente similares provenientes do trato aerodigestivo superior, incluindo o lábio, a cavidade oral (boca), a cavidade nasal, os seios paranasais, a faringe e a laringe. A maioria dos cânceres de cabeça e pescoço são carcinomas de células escamosas, proveniente da mucosa (epitélio) dessas regiões. O câncer de cabeça e pescoço, muitas vezes se espalham nos nódulos linfáticos do pescoço, isso muitas vezes é a primeira (e às vezes apenas) manifestação da doença no momento do diagnóstico. Câncer de cabeça e pescoço está fortemente associado a certos fatores ambientais e risco de vida, incluindo tabagismo, consumo de álcool e certas cepas do vírus do papiloma humano, sexualmente transmissível. Tratamento de pacientes com câncer de cabeça e pescoço ainda é uma tarefa formidável. Cânceres, tais como, câncer de hipofaringe, câncer da laringe, câncer da nasofaringe, o câncer da orofaringe, podem ser tratados utilizando os compostos aqui descritos.
Em uma modalidade, os métodos aqui descritos tratam o câncer de cabeça ou pescoço.
CÂNCER DE RIM
Num outro aspecto, aqui é fornecido um método para o tratamento de câncer de rim. O câncer renal (também chamado o câncer das células renais, carcinoma de células renais, adenocarcinoma renal, hipernefroma) é uma doença em que as células malignas são encontradas no revestimento dos túbulos no rim. O carcinoma de células renais é a forma mais comum de câncer de rim resultante do túbulo proximal renal. Este é o tipo mais comum de câncer renal em adultos, responsável por aproximadamente 80% dos casos.
Em uma modalidade, os métodos aqui descritos tratam o câncer do rim.
CÂNCER DE FÍGADO
Num outro aspecto, neste documento é fornecido um método para o tratamento de câncer hepático primário (câncer que começa no fígado). Câncer hepático primário pode ocorrer tanto em adultos como em crianças. O câncer de fígado é caracterizado pela presença de tumores hepáticos malignos - tumores ou crescimentos sobre ou no fígado. Eles podem ser descobertos na imagiologia médica (mesmo para um razão diferente do que o próprio câncer), ou pode estar presente em pacientes com uma massa abdominal, dor abdominal, icterícia, ou alguma outra disfunção hepática. Existem vários tipos de câncer de fígado.
Hemangiomas: Estes são os tipos mais comuns de tumores benignos do fígado. Eles começam nos vasos sanguíneos. A maioria destes tumores é assintomática, eles não necessitam de tratamento. Alguns podem sangrar e precisam ser removidos se forem leves a graves.
Adenomas hepáticos: Estes tumores benignos epiteliais do fígado se desenvolvem no fígado. Eles são, na maioria dos casos, localizados no lobo hepático direito e são frequentemente vistos como solitários. O tamanho dos adenomas está no intervalo de 1 a 30cm. Os sintomas associados com adenomas são todos associados com grandes lesões que podem causar dor abdominal intensa.
Hiperplasia nodular focal: hiperplasia nodular focal (HNF) é o segundo tumor mais comum do fígado. Este tumor é o resultado da reação dos hepatócitos de mal formação arteriovenosas congênitas. Este processo é um no qual todos os componentes normais do fígado estão presentes, mas o padrão através da qual eles são apresentados é anormal. Mesmo que essas condições ainda existam, o fígado parece funcionar na faixa normal.
Carcinoma hepatocelular: o câncer hepatocelular (CHC) é o câncer mais comum do fígado. Ele está associado ao abuso de álcool e hepatite B e é particularmente dominante na Ásia. A maioria dos CHC são detectados no momento em que cura através ressecção cirúrgica não é possível; tratamento sistêmico de CHC não operável está associada com a sobrevivência de menos de um ano.
Em uma modalidade, os métodos aqui descritos tratam o câncer do fígado.
LINFOMA O linfoma é um tipo de câncer originário dos linfócitos do sistema imunológico. Eles frequentemente têm origem nos gânglios linfáticos, que se apresentam como uma ampliação do nódulo (um tumor). Os linfomas são intimamente relacionados com leucemias linfóides, que também se originam em linfócitos, mas tipicamente envolvem apenas no sangue circulante da medula óssea (onde as células sanguíneas são geradas por um processo denominado hematopoese) e não formam usualmente tumores. Existem muitos tipos de linfomas, e por sua vez, os linfomas são uma parte do grupo amplo de doenças chamadas neoplasias hematológicas. Algumas formas de linfoma são indolentes (por exemplo, pequeno linfoma linfocítico), compatível com uma vida longa, mesmo sem tratamento, enquanto outras formas são agressivas (por exemplo, do linfoma de Burkitt), causando deterioração rápida e morte. A classificação da WHO, publicado em 2001 e atualizado em 2008; http://en.wikipedia.org/wiki/Lymphoma-cite_note-isbn92-832-2411-6-2#cite_note-isbn92-832-2411-6-2 é a última classificação de linfoma e baseia-se sobre as bases estabelecidas no âmbito da "classificação de linfoma da revista americano europeia" (REAL). Esse linfoma do grupo de sistema do tipo de célula (isto é, o tipo de célula normal que mais se assemelha ao tumor) e fenotípicos definidos, características moleculares ou cito genética. Existem três grandes grupos: o de células B, células T, e células tumorais assassinas naturais. Outros grupos menos comuns também são reconhecidos. O linfoma de Hodgkin, embora seja considerado separadamente dentro da classificação da WHO (e precedente), é agora reconhecido como sendo um tumor, embora nitidamente anormais, os linfócitos da linhagem de células b maduras.
Em uma modalidade, os métodos aqui descritos tratam o linfoma.
SARCOMA
Um sarcoma é um câncer do tecido conjuntivo (osso, cartilagem, gordura), resultando em proliferação do mesoderma.
Isto está em contraste com os carcinomas, que são de origem epitelial (mama, cólon, pâncreas, e outros). No entanto, devido à evolução do tecido de origem, o termo "sarcoma" é aplicado às vezes a tumores agora conhecidos provenientes a partir de tecido epitelial. O termo sarcoma dos tecidos moles é usado para descrever os tumores de tecidos moles, que inclui elementos que estão no tecido conjuntivo, mas não derivado dele (tal como os músculos e os vasos sanguíneos).
Os sarcomas recebem um número de nomes diferentes, com base no tipo de tecido a partir do qual se desenvolvem. Por exemplo, osteossarcoma surge a partir do osso, condrossarcoma surge a partir de cartilagem, e leiomiossarcoma surge a partir do músculo liso. Sarcomas são graves em todas as faixas etárias, mas são muito raros, representando apenas 1% dos casos de câncer. TEGI é a forma mais comum de sarcoma, com cerca de 3000 a 3500 casos por ano nos Estados Unidos. Isto deve ser comparado com câncer de mama, com cerca de 200.000 casos por ano, na América do Norte.
Aproximadamente 50% dos sarcomas ósseos e 20% dos sarcomas dos tecidos moles são diagnosticados em pessoas com idade inferior a 35 anos. Alguns sarcomas, como leiomiossarcoma, condrossarcoma, tumor estromal gastrointestinal (TEGI), são mais comuns em adultos do que em crianças. Maior parte da série de sarcomas ósseos, incluindo sarcoma de Ewing osteossarcoma, que são muito mais comuns em crianças e jovens adultos.
Em uma modalidade, os métodos aqui descritos tratam o sarcoma.
CARCINOMA
Um carcinoma é qualquer câncer maligno que surge a partir de células epiteliais. Os carcinomas invadem os tecidos circundantes e órgãos e podem ocasionar metástase, ou disseminação para linfonodos e outros locais.
Carcinoma, como toda neoplasia, é classificado pela sua aparência histopatológica. O adenocarcinoma e o carcinoma de células escamosas são dois termos descritivos comuns para os tumores que refletem o fato de que essas células podem ter aparências de células glandulares ou escamosas, respectivamente. Tumores severamente anaplásicos podem ser tão indiferenciados que eles não têm uma aparência distinta histológica (carcinoma indiferenciado).
Por vezes, um tumor é referido pelo principal órgão presumível (por exemplo, carcinoma da próstata) ou a suposta célula de origem (carcinoma hepatocelular, carcinoma da celula renal).
Adenocarcinoma é um tumor maligno originado nas células epiteliais de tecido glandular e na formação das estruturas glandulares. Isto é comum no pulmão (formando 30 a 40% de todos os carcinomas do pulmão). Pode ser encontrada perifericamente, surgindo a partir de células caliciformes ou pneumócitos tipo II. O carcinoma de células escamosas resulta da metaplasia escamosa. Isto representa cerca de 20 a 30 por cento de tumores pulmonares e geralmente é de origem hilar.
Carcinoma de pequenas células é quase certamente devido ao tabagismo. Estes metastatizam precocemente, e podem secretar ADH (diminuição da concentração de sódio do paciente).
Os carcinomas de grandes células não diferenciadas representam 10 a 15 por cento das neoplasias pulmonares. Estes são agressivos e de difícil reconhecimento, devido à sua natureza não diferenciada. Estes são mais comumente no centro do pulmão.
Carcinoma indiferenciado nasossinusal.
Em uma modalidade, os métodos aqui descritos para tratamento de um carcinoma.
MIELOMA O mieloma múltiplo (também conhecido como MM, mieloma, plasma celular de mieloma, ou como doença de Kahler após Otto Kahler) é o câncer das células plasmáticas. Estas células imunes são formadas na medula óssea, são numerosas em vasos linfáticos e produzem anticorpos. O mieloma é considerado incurável, mas remissões podem ser induzidas com esteróides, quimioterapia, talidomida e transplantes de células-tronco. O mieloma é parte do amplo grupo de doenças chamadas de doenças hematológicas malignas.
Mieloma múltiplo desenvolve-se nos centros B pós-germinais dos linfócitos. Uma translocação cromossômica entre o gene da cadeia pesada de imunoglobulina (no cromossomo XIV, lócus 14q32) e um oncogene (muitas vezes 11q13, 4p16.3, 6p21, 16q23 20q11) é freqüentemente observada em pacientes com mieloma múltiplo. Esta mutação resulta em desregulação do oncogene que se pensa ser um acontecimento importante na patogênese de início do mieloma. O resultado é a proliferação de um clone de células de plasma e a instabilidade genômica que leva a mutações adicionais e translocações. A anormalidade no cromossomo 14 é observada em cerca de 50% de todos os casos de mieloma. A supressão (de partes) do décimo terceiro cromossomo também é observada em cerca de 50% dos casos.
Produção de citocinas (especialmente IL-6) pela célula de plasma provoca grande parte de seus danos localizados, tais como a osteoporose e cria um microambiente em que as células malignas florescem. A angiogênese (a atração de novos vasos sanguíneos) é aumentada.
Em uma modalidade, os métodos aqui descritos tratam o mieloma.
CÂNCER DE ESTÔMAGO O câncer de estômago ou gástrico pode desenvolver-se em qualquer parte do estômago e pode espalhar-se ao longo do estômago para outros órgãos, particularmente o esôfago, pulmão e fígado. O câncer de estômago causa cerca de 800.000 mortes no mundo por ano. A metástase ocorre em 80 a 90% dos indivíduos com câncer de estômago, com uma taxa de sobrevida de seis meses em uma taxa de 65% dos que foram diagnosticados nos estágios iniciais e menos de 15% dos que foram diagnosticados nos estágios tardios. O câncer de estômago é muitas vezes assintomático ou causa apenas sintomas inespecíficos em seus estágios iniciais. Como os sintomas ocorrerem no tempo, o câncer geralmente tem metástase para outras partes do corpo, uma das principais razões para o seu prognóstico reservado.
Em uma modalidade, os métodos aqui descritos tratam o câncer do estômago.
CÂNCER DE TIREÓIDE
Neoplasias da tireóide ou câncer de tireóide normalmente se referem a qualquer um dos quatro tipos de tumores malignos da glândula tireóide: papilar, folicular, medular ou anaplásico. Tumores papilares e foliculares são os mais comuns. Eles crescem lentamente e podem reaparecer, mas não são, geralmente, fatais em pacientes com menos de 45 anos de idade. Tumores medulares têm um bom prognóstico, se restringem à glândula tireóide e um pior prognóstico se a metástase ocorre. Tumores anaplásicos são de crescimento rápido e respondem mal ao tratamento. Câncer de tireóide é geralmente encontrado em um paciente eutireóideo, mas os sintomas de hipertiroidismo ou hipotiroidismo podem ser associados a um grande ou metastático tumor bem definido. Os nódulos merecem particular atenção quando são encontrados em pessoas com menos de 20 anos de idade. A apresentação de nódulos benignos nesta idade é menos provável, e assim o potencial para malignidade é muito maior. Cânceres de tireóide podem ser classificados de acordo com suas características patológicas. As seguintes variantes podem ser distinguidas (distribuição por vários subtipos podem apresentar variação regional): carcinoma papilífero de tireóide (até 75%), carcinoma folicular da tireóide (até 15%), carcinoma medular da tiróide (até 8%) e câncer anaplásico da tireóide (menos de 5%). Os tipos folicular e papilar bem podem ser classificados como "câncer diferenciado de tireóide". Esses tipos têm o prognóstico mais favorável do que os tipos medular e não diferenciados. Adenoma de tireóide é um tumor benigno da glândula tireóide.
Em uma modalidade, os métodos aqui descritos tratam o câncer da tiróide.
CÂNCER DE BEXIGA O câncer de bexiga se refere a qualquer um dos vários tipos de tumores malignos da bexiga urinária. É uma doença em que as células anormais multiplicam-se sem controle na bexiga. A bexiga é um órgão muscular oco que armazena a urina e que está localizado na pélvis. O tipo mais comum de câncer de bexiga começa em células do revestimento interior da bexiga e é denominado carcinoma de células transicionais (carcinoma de células, por vezes, urotelial). 90% dos cânceres de bexiga são carcinomas de células transicionais. Os outros 10% são carcinomas de células escamosas, adenocarcinoma, sarcoma, carcinoma de células pequenas e depósitos secundários de cânceres em outras partes do corpo.
Os estágios seguintes são utilizados para classificar a localização, tamanho e propagação do câncer, de acordo com o TNM (tumor, linfonodo e metástase) sistema de estadiamento: Estágio 0: As células cancerosas são encontradas apenas no revestimento interno da bexiga. Estágio I: As células cancerosas proliferam para além da camada de revestimento interno da bexiga urinária, mas não para os músculos da bexiga urinária. Estágio II: As células cancerosas proliferam para os músculos da parede da bexiga, mas não para o tecido adiposo que rodeia a bexiga urinária. Estágio III: As células cancerosas proliferam para o tecido adiposo em torno da bexiga urinária e para a glândula da próstata, vagina ou útero, mas não para os nódulos linfáticos ou de outros órgãos. Estágio IV: as células cancerosas se proliferaram para os linfonodos, parede pélvica ou abdominal e/ou outros órgãos. Recorrência: Câncer tem recorrência na bexiga urinária ou em outro órgão próximo depois de terem sido tratados. TCC da bexiga é realizado de acordo com o sistema TNM de 1997: Tumor papilar não-invasivo Ta; T1 invasivo, mas não tão longe como a camada muscular da bexiga; T2 invasiva dentro da camada muscular; T3 invasiva para além do músculo na gordura e fora da bexiga, e T4 invasiva em estruturas vizinhas, como o de próstata, útero ou da parede pélvica.
Em uma modalidade, os métodos aqui descritos tratam o câncer de bexiga.
De acordo com a invenção, os anticorpos humanizados endoglina ou seus fragmentos podem ser administrados isoladamente ou em combinação com agentes ativos ou inativos. Quando as combinações são utilizadas, a invenção contempla a administração simultânea ou sequencial dos anticorpos humanizados endoglina ou fragmentos de ligação do antígeno e os agentes ativos ou inativos.
Os compostos da presente invenção podem ser, conforme necessário, administrados em combinação com um ou mais tratamentos terapêuticos, incluindo, mas não limitado a, adriamicina, ciclofosfamida, paclitaxel, pemetrexed, a temozolomida, oxaliplatina, bevacizumab, Erbitux, Vectibix, sorafenib, sunitinib, gefitinib, erlotinib, 5-fluorouracil (5-FU) irinotecano, o topotecano, leucovorina, VELCADE®, a lenalidomida, a talidomida, o xeloda, taxotere e muitas outras terapias convencionais aqui descritas. Seria de compreensão que a listagem de regimes terapêuticos listados abaixo represente terapias convencionais, mas a presente invenção abrange outros regimes terapêuticos conhecidos que não são especificamente aqui revelados.
Como aqui utilizado, a "radiação" se refere a, por exemplo, microondas, raios ultravioleta (UV), infravermelho (IR), ou radiação alfa, beta ou gama. A radiação pode ser "focada" ou implantada a nível local utilizando técnicas convencionais para alvejar a radiação para o local de um ou mais tumores sem irradiação de todo o corpo.
Em uma modalidade, o câncer é o câncer de ovário e um ou mais tratamentos terapêuticos é a cirurgia, quimioterapia (por exemplo, doxorrubicina, doxil, gemcitabina, Rubitecan, e platina baseada em quimioterapêuticos tais como a cisplatina, carboplatina e oxaliplatina), melfalano, paclitaxel, inibidores da topoisomerase I tais como o topotecano e irinotecano, terapia baseada em taxane, hormonas, terapia de radiação, hipotermia do corpo inteiro, derivados de isoflavona, tais como Phenoxodial, macrólidos citotóxicos tais como, epotilonas, inibidores de angiogênese tais como bevacizumab, inibidores de transdução de sinal, tais como a terapia gênica, trastuzumab, terapia RNAi, imunoterapia, anticorpos monoclonais, inibidores da quinase semelhante a fosfatidilinositol, tais como a rapamicina, ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade a combinação é um anticorpo anti-endoglina humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e doxil. Em outra modalidade, a combinação é um anticorpo anti-endoglina humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e topotecano. Em ainda outra modalidade, a combinação é um anticorpo anti-endoglina humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e um inibidor do receptor do VEGF. Exemplos não-limitantes de inibidores dos receptores de VEGF incluem o bevacizumab (AVASTIN®), o ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib e pazopanib. A combinação da terapia dos anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno aqui descritos com as terapias do câncer ovariano pode também ser fornecida para doses mais baixas de qualquer terapia, ou ambos, devido a um efeito sinérgico da co-administração das terapias.
Em uma modalidade, o câncer é renal/câncer de rim e um ou mais tratamentos terapêuticos é a cirurgia, quimioterapia, sunitinib, sorafenib, pazopanib, AVASTIN®, alfa-interferon, ou IL-2. Em uma modalidade, a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e sorafenib. Em certa modalidade, a combinação é um anticorpo humanizado antiendoglina ou do fragmento de ligação de antígeno do mesmo e sunitinib. Em uma modalidade, a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e AVASTIN®. Em ainda outra modalidade, a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e um inibidor do receptor do VEGF. Exemplos não limitantes de inibidores dos receptores de VEGF incluiem o bevacizumab (AVASTIN®), o ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib e pazopanib. A terapia de combinação dos anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno aqui descritas com as terapias do câncer renal, podem também prever doses mais baixas de qualquer terapia, ou ambos, devido a um efeito sinérgico da co-administração das terapias.
Em uma modalidade, o câncer é o mieloma e um ou mais tratamentos terapêuticos é cirurgia, radioterapia, VELCADE®, lenalidomida, ou talidomida. Em uma forma de realização a combinação é um anticorpo anti-endoglina humanizado ou de fragmento de ligação de antígeno do mesmo e VELCADE®. As doses para qualquer uma destas terapias são conhecidas na técnica e pode ser ajustado com a terapia de combinação em conformidade.
Em uma modalidade, o câncer é o câncer da próstata e um ou mais tratamentos terapêuticos é cirurgia, radioterapia (por exemplo, o feixe externo ou braquiterapia), privação hormonal (supressão de androgênio), inibidores de proteína de choque térmico 90 (HSP90), quimioterapia (por exemplo, o docetaxel, quimioterapia baseada em platina como a cisplatina, carboplatina, satraplatin, e oxaliplatina, taxano, estramustina), prednisona ou prednisolona, drogas redutoras de colesterol como estatinas, agonistas de liberação do hormônio luteinizante (LHRH), terapia RNAi, células tumorais inteiros geneticamente modificadas para secretar macrófagos e granulócitos- fator estimulador de colônias (GM-CSF) (também conhecido como GVAX), ou qualquer combinação destes. Em ainda outra modalidade, a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e um inibidor do receptor do VEGF. Exemplos não limitantes de inibidores dos receptores de VEGF incluiem o bevacizumab (AVASTIN®), o ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib e pazopanib.
Numa forma de realização, o câncer é o câncer do pulmão e um ou mais tratamentos terapêuticos é a cirurgia, radioterapia (radioterapia, por exemplo, torácica, a terapia de radiação com partículas carregadas, uracil-tegafur e quimioterapia baseada em platina (por exemplo, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, etc.) e vinorelbina, erlotinib (TARCEVA®), Gefitinib (IRESSA®), fator de anti-crescimento epidérmico do receptor de anticorpos (por exemplo, Cetuximab), fator anti-vasculares de crescimento endotelial dos anticorpos (por exemplo, bevacizumab), os inibidores de moléculas pequenas de tirosina-quinases, inibidores diretos de proteínas envolvidas na proliferação de células cancerosas do pulmão, inibidores Aurora quinase, laser induzido por termoterapia, terapia RNAi, as células tumorais inteiras geneticamente modificadas para secretar macrófagos e granulócitos- fator estimulador de colônias (GM-CSF) (também conhecido como GVAX), ou qualquer combinação dos mesmos. Tratamentos terapêuticos adicionais incluem Taxol e pemetrexed. Em uma modalidade, combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e erlotinib. Em uma modalidade, a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e gefitinib. Em certa modalidade a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e pemetrexed. Em ainda uma outra modalidade, a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e um inibidor do receptor do VEGF. Exemplos não limitantes de inibidores dos receptores de VEGF incluiem o bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib e pazopanib. As doses para qualquer uma destas terapias são conhecidas na técnica e podem ser ajustadas com a terapia de combinação em conformidade.
Em uma modalidade, o câncer é o câncer da mama e dos um ou mais tratamentos terapêuticos é a cirurgia, os anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos Her-2, Herceptin), quimioterapia adjuvante como um agente único de quimioterapia ou quimioterapia de combinação (por exemplo, antraciclina e taxano baseada em poliquimoterapias, taxol, ou alvo específico trastuzumab com ou sem manipulação do sistema endócrino, com ou sem PMRT, vinorelbine), adriamicina, ciclofosfamida, xeloda, taxotere, receptores seletivos moduladores de estrogênio, tais como tamoxifeno e raloxifeno, moduladores alostéricos dos receptores de estrogênio, tais como Trilostane, a radiação (por exemplo, braquiterapia intersticial, aparelho Mammosite, radiação externa conformada tridimensionalmente e radioterapia intra-operatória), inibidores da aromatase que suprem a síntese total do corpo (por exemplo, anastrozol, exemestano e letrozol), terapia RNAi, análogos intravenosos da rapamicina que é imunossupressora e anti-proliferativa, tais como Temsirolimus (CCI779), ou qualquer combinação destes. Uma revisão de métodos para a realização tridimensional em modelos in vitro para tecidos da cultura de câncer de mama são descritos por Kim et al, Pesquisa de Tratamento do Câncer de mama 85 (3):. 281-91 (2004). Outros modelos in vivo e in vitro para teste de cânceres são conhecidos e podem ser utilizados para testar anticorpos anti-endoglina aqui descritos. Em certa modalidade a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, taxol, e AVASTIN®. Em certa modalidade a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e adriamicina. Em certa modalidade a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e xeloda. Em certa modalidade a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e taxotere. Em ainda outra modalidade, a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e um inibidor do receptor do VEGF. Exemplos não limitantes de inibidores dos receptores de VEGF incluiem o bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib e pazopanib. As doses para qualquer uma destas terapias são conhecidas na técnica e podem ser ajustadas com a terapia de combinação em conformidade.
Em certa modalidade, o câncer é o câncer do cólon e um ou mais tratamentos terapêuticos é a cirurgia, terapia de radiação e quimioterapia (por exemplo, 5-fluorouracil levamisole, leucovorin ou semustine (metil CCNU)), N-[2- (dimetilamina) etil] acridina-4-carboxamida e outros produtos fármacos anticancerígenos de carboxamida; não inibidores da topoisomerase II, irinotecano, topotecano lipossomal, agentes anticancerígenos da classe de taxane (por exemplo, o paclitaxel ou docetaxel), um composto da classe do ácido xanthenone acético (por exemplo, 5,6-dimetilantenone-4-acético PMAA), laminarina, sítios seletivos análogos ao AMP cíclico (por exemplo, 8-cloroadenosina 3',5'-fosfato cíclico), inibidores piranoindol de Cox-2, inibidores de carbazole de Cox-2, inibidores de tetrahidrocarbazol de Cox-2, inibidores de indeno de Cox-2, inibidores localizados de AINEs (por exemplo, ácidos antranílicos, aspirina (ácido 5-acetilsalicílico), sódio azodisal, ácidos heterocarboxílicos, carprofeno, clorambucil, diclofenaco, fenbufeno, fenclofenac, fenoprofeno, ácido flufenâmico, flurbiprofeno, fluprofen, furosemida, ouro thiomalate de sódio, ibuprofeno, indometacina, indoprofeno, cetoprofeno, lonazolac, Loxoprofen, ácido mQLAofenâmico, ácido mefanamic, melfalano, naproxeno, penicilamina, ácidos fenilacético, ácidos proprionico, ácidos salicílicos, salazosulfapiridina, sulindac, tolmetina, propazona NSAID e pirazolona butazona, meloxicam, oxicams, piroxicam, Feldene, piroxicam beta ciclodextrano, tenoxicam, etodolac, e oxaprozina),um inibidor de HER-2/neu, terapia RNAi, GM-CSF, os anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos anti-Her-2/neu, anticorpos anti-CEA, A33 (HB 8779) e 100210 (HB 11764) e 100-310 (HB 11028)), erbitux, vectibix, terapia hormonal, pirimidineaminas, derivados de camptotecina (por exemplo, CPT-11), ácido folínico (AF), gemcitabina, Ara-C, quimioterapêuticos platina-baseados tais como a cisplatina, carboplatina e oxaliplatina , inibidor específico cGMP da fosfodiesterase, ou qualquer combinação destes. Em certa modalidade a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e uma combinação de 5-FU, leucovorin e oxaliplatina (FOLFOX). Em uma modalidade a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e uma combinação de 5-FU, irinotecano e leucovorina (IFL). Em uma modalidade a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e erbitux. Em uma modalidade a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e um vectibix. Em ainda uma outra modalidade, a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo e um inibidor do receptor do VEGF. Exemplos não limitantes de inibidores dos receptores de VEGF incluem o bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®) , sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib e pazopanib. As doses para qualquer uma destas terapias são conhecidas na técnica e pode ser ajustadas com a terapia de combinação em conformidade.
Em certa modalidade, o câncer é o câncer do pâncreas e um dos ou mais tratamentos terapêuticos é cirurgia, terapia de radiação (TR), fluorouracil (5-FU) e RT, terapia sistêmica, stent, gemcitabina (GEMZAR®), gemcitabina e RT cetuximab, erlotinib (TARCEVA®), quimioradioterapia, bevacizumab (AVASTIN®), ou qualquer combinação destes. Em ainda uma outra modalidade, a combinação é um anticorpo humanizado anti-endoglina ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo e um inibidor do receptor do VEGF. Exemplos não limitantes de inibidores dos receptores de VEGF incluem o bevacizumab (AVASTIN®), ranibizumab (LUCENTIS®), aflibercept (VEGF-Trap), sunitinib (SUTENT®), sorafenib (NEXAVAR®), axitinib, pegaptanib e pazopanib.
Os pacientes podem ser avaliados no que diz respeito aos sintomas em um ou mais momentos que incluem, antes, durante, e após os regimes de tratamento. O tratamento pode ocasionar melhoria da condição do indivíduo e pode ser avaliada pela determinação se um ou mais dos seguintes fatores ocorreram: diminuição do tamanho do tumor, diminuição da proliferação de células, diminuição do número de células, diminuição da neovascularização, aumento da apoptose, ou diminuição da sobrevivência de pelo menos uma parte das células que constituem o distúrbio de proliferação celular. Uma ou mais destas ocorrências pode, em alguns casos, resultar na eliminação parcial ou total do câncer e prolongamento da sobrevivência do doente.
Alternativamente, para cânceres em estágio terminal, o tratamento pode resultar em estase da doença, melhoria da qualidade de vida e/ou o prolongamento da sobrevivência.
AVALIAÇÃO DE BIOMARCADORES
Certos genes podem ser expressos em níveis aumentados ou diminuídos de cânceres. Alterações nos níveis de expressão dos genes do câncer podem ser indicativos de resistência ou sensibilidade a uma terapia contra o câncer ou de tratamento. É presentemente fornecido um método de diagnóstico para detectar a expressão do gene escolhido a partir de um painel de genes cuja expressão tem sido correlacionada com a sensibilidade ou resistência a um inibidor da angiogênese, em que o gene, pelo menos é: VEGF, VEGF receptor, HIF-Ια, receptor do fator de crescimento da placenta ou endoglina (CD105). O método pode ainda incluir o passo de comparação do nível de expressão de pelo menos um gene detectado na amostra do paciente para um nível de expressão de pelo menos um gene que tem sido correlacionado com a sensibilidade ou resistência ao inibidor da angiogênese. Em uma modalidade não limitativa, o inibidor de angiogênese é um anticorpo humanizado anti-endoglina. Numa outra modalidade, o inibidor da angiogênese é um inibidor do receptor do VEGF ou um inibidor de VEGF.
Tal como aqui utilizado, o termo "expressão", quando utilizado em ligação com a detecção da expressão de um gene, pode referir-se à detecção de transcrição do gene e/ou para a detecção de tradução do gene. Para detectar a expressão de um gene refere-se ao ato de ativamente determinar se um gene é expresso ou não. Isto pode incluir determinar se a expressão do gene é regulada positivamente, em comparação com um controle, reprimida em comparação com um controle, ou inalterada em relação a um controle. Portanto, o estágio de detecção da expressão não requer que a expressão do gene na verdade seja regulada positivamente ou reprimida, mas em vez disso, pode também incluir a detecção de que a expressão do gene não foi alterada (isto é, a não detecção de expressão do gene ou nenhuma alteração na expressão do gene).
Biomarcadores para serem avaliados em relação a presente invenção incluem um VEGF receptor, fator de crescimento da placenta, HIF-Ια e endoglina (CD105).
Para a avaliação da expressão de biomarcadores, as amostras do paciente contendo tecido endotelial, células tumorais, ou proteínas ou ácidos nucleicos produzidos por células de tumor, pode ser utilizada em métodos aqui descritos e ainda conhecidos na técnica. Resumidamente, o nível de expressão do marcador pode ser avaliado através da avaliação da quantidade (por exemplo, quantidade absoluta ou concentração) do marcador numa amostra, por exemplo, biópsia do tumor obtido a partir de um paciente, ou outro material de amostra de paciente contendo derivado do tumor (por exemplo, sangue, urina, soro ou outros fluidos corporais ou excreções como aqui descrito acima). A amostra de células pode, é claro, ser submetido a uma variedade de técnicas bem conhecidos de pós-recolha preparativa e armazenamento (por exemplo, ácido nucleico e/ou de extração de proteína, fixação, armazenamento, congelamento, ultrafiltração, concentração, evaporação, centrifugação, etc.) antes da avaliação da quantidade de marcador presente na amostra. Da mesma forma, a biópsias do tumor também pode ser submetida a pós-recolha preparativa e técnicas de armazenamento, por exemplo, a fixação.
Pode-se detectar a expressão de proteínas de biomarcadores tendo pelo menos uma porção que é exibida sobre a superfície de células que a exprimem. Pode-se determinar uma proteína marcadora, ou uma porção da mesma, que é exposta na superfície da célula. Por exemplo, métodos imunológicos podem ser usados para detectar tais proteínas nas células inteiras, ou métodos bem conhecidos de análise por computador com base na sequência podem ser usados para predizer a presença de, pelo menos, um domínio extracelular (isto é, incluindo ambas as proteínas secretadas e proteínas que têm pelo menos domínio de superfície celular). A expressão de uma proteína marcadora tendo pelo menos uma porção que é exibida na superfície de uma célula expressa pode ser detectada sem necessariamente ocorrer lise da célula de tumor (por exemplo, utilizando um anticorpo classificado que se liga especificamente com um domínio de superfície celular da proteína).
Expressões dos biomarcadores podem ser avaliadas por qualquer um de uma ampla variedade de métodos bem conhecidos para a detecção de expressão de um ácido nucleico ou proteína transcrita. Exemplos não limitativos de tais métodos incluem, por exemplo, os métodos imunológicos para a detecção de secretado, na superfície celular, proteínas citoplasmáticas, ou nuclear, métodos de purificação de proteínas, função da proteína ou ensaios de atividade, os métodos de hibridação de ácidos nucleicos, métodos de transcriptase reversa de ácidos nucleicos e métodos de amplificação de ácidos nucleicos ou qualquer outro método conhecido na arte.
Uma mistura de polinucleótidos transcritos obtidos a partir da amostra pode ser contatada com um substrato tendo fixado o mesmo polinucleótido complementar ou homólogo com pelo menos uma porção (por exemplo, pelo menos 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500, ou mais resíduos de nucleotídeos) de biomarcadores de um ácido nucleico. Se os polinucleótidos complementares a, ou homóloga com, são diferencialmente detectados sobre o substrato (por exemplo, detectável usando cromóforos diferentes ou fluoróforos, ou fixado a diferentes posições selecionadas), então os níveis de expressão de uma pluralidade de biomarcadores podem ser avaliados simultaneamente utilizando um único substrato (por exemplo, um "gene chip" microarranjo de polinucleotídeos fixado em posições selecionadas). Quando um método para avaliar a expressão de biomarcadores é utilizado que envolve a hibridação de ácido nucleico com outro, a hibridação pode ser realizada sob condições de hibridação rigorosas.
Quando uma pluralidade de biomarcadores da invenção é utilizada nos métodos da invenção, o nível de expressão de cada amostra de biomarcador do paciente pode ser comparado com o nível normal de expressão de cada um da pluralidade de biomarcadores de amostras não cancerosas do mesmo tipo, tanto em uma única mistura da reação (isto é, os reagentes usando, tais como diferentes sondas fluorescentes, para cada biomarcador) ou em misturas de reação individuais correspondentes a um ou mais dos biomarcadores. O nível de expressão de um biomarcador normal (por exemplo, não cancerosas) de tecido humano pode ser avaliado de diversas maneiras. Este nível normal de expressão pode ser avaliado através da avaliação do nível de expressão do biomarcador em uma porção de células que parece ser não cancerosas e, em seguida comparando o nível normal de expressão com o nível de expressão em uma porção das células tumorais. Como informação adicional, torna-se disponível como um resultado do desempenho de rotina dos métodos aqui descritos, a população média de valores para a expressão normal dos biomarcadores podendo ser usados. Alternativamente, o nível normal de expressão de um biomarcador pode ser determinada através da avaliação da expressão do biomarcador em uma amostra do paciente obtido a partir de um paciente não-câncer-aflito, a partir de um amostra do paciente obtido a partir de um paciente antes do início da suspeita de câncer no paciente, a partir de amostras de doentes arquivados e semelhantes.
Um método exemplar para detecção da presença ou ausência de um biomarcador de proteína de ou ácido nucleico numa amostra biológica envolvendo a obtenção de uma amostra biológica a partir de um indivíduo de teste e constatando a amostra biológica com um composto ou um agente capaz de detectar o polipéptideo ou ácido nucleico (por exemplo, mRNA, DNA genómico, ou cDNA). Os métodos de detecção podem, assim, ser utilizados para detectar mRNA, proteínas, cDNA, ou DNA genômico, por exemplo, numa amostra biológica in vitro bem como in vivo. Nas técnicas in vitro para detecção de mRNA incluem, por exemplo, transcriptase reversa- reação em cadeia da polimerase (RT-PCR; por exemplo, a modalidade experimental estabelecido no Mullis, 1987, Pat dos EUA No. 4.683.202.), hibridização do norte e in situ hibridização. Técnicas ín vitro para detecção de um biomarcador de proteína incluem, mas não estão limitados a, enzima ligada a imunoabsorção (ELISA), borrões ocidentais, imunoprecipitações e imunofluorescência. Nas técnicas in vitro para detecção de DNA genómico incluem, por exemplo, hibridizações do sul. Nas técnicas in vivo para a detecção de mRNA incluem, por exemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR quantitativo, hibridizações do norte e nas hibridizações in situ. Além disso, em técnicas para a detecção in vivo de um biomarcador de proteína incluem a introdução de um anticorpo caracterizado dirigido contra a proteína ou seu fragmento em um individuo. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado com um marcador radioativo, cuja presença e localização em um indivíduo pode ser detectada por técnicas de imagem padrão. O princípio geral de tais ensaios de diagnóstico e prognóstico envolvem a preparação de uma amostra ou mistura de reação que pode conter um biomarcador e uma sonda, sob condições adequadas e durante um tempo suficiente para permitir que o biomarcador e sonda interajam e se liguem, formando assim um complexo que pode ser removido e/ou detectado na mistura reacional. Estes ensaios podem ser realizados numa variedade de maneiras, utilizando uma variedade de métodos. É também possível detectar diretamente o biomarcador/sonda formando um complexo sem manipulação adicional ou marcação de qualquer um dos componentes de imunoabsorção (biomarcador ou sonda), por exemplo, utilizando a técnica de transferência de energia de fluorescência (isto é, FET, ver, por exemplo, Lakowicz et al, Patente dos EUA No. 5.631.169; e Stavrianopoulos, et al, Patente dos EUA No. 4.868.103).
Numa outra modalidade, a determinação da capacidade de uma sonda para reconhecer um biomarcador pode ser realizada sem a marcação de qualquer um dos componentes de ensaio (sonda ou biomarcador), utilizando uma tecnologia, como análises em tempo real de Interação Biomolecular (BIA; ver, eg, Sjolander, S. e Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 e Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Tal como aqui utilizado, "BIA" ou "ressonância de plasma de superfície" referem-se a uma tecnologia para estudar interações bioespecificas em tempo real, sem marcar qualquer um dos interagentes (por exemplo, BIAcore). As alterações na massa na superfície de ligação (indicativa de um evento de ligação) resultam em alterações do índice de refração da luz próximo da superfície (o fenômeno ótico de plasma de superfície de ressonância (PSR)), resultando em um sinal detectável que pode ser usado como uma indicação de tempo real das reações biológicas entre moléculas.
Como uma alternativa para fazer determinações baseadas no nível de expressão absoluta do biomarcador, as determinações podem basear-se no nível de expressão normalizada do biomarcador. Os níveis de expressão são normalizados, corrigindo o nível de expressão absoluto de um biomarcador comparando a sua expressão a expressão de um gene que não é um biomarcador, por exemplo, um gene de limpeza que é constitutivamente expresso. Genes adequados para a normalização incluem genes de manutenção, tais como o gene da actina, ou genes específicos de células epiteliais. Esta normalização permite a comparação do nível de expressão de uma amostra, por exemplo, uma amostra do paciente a outra amostra, por exemplo, uma amostra não tumor, ou entre as amostras de diferentes fontes.
Alternativamente, o nível de expressão pode ser fornecido como o nível de expressão relativo. Para determinar o nível de expressão relativo de uma biomarcador (por exemplo, VEGF receptor, fator de crescimento da placenta, HIF-Ια e endoglina de imunoabsorção (CD105)), o nível de expressão do marcador é determinada para 10 ou mais, 20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou mais, ou 50 ou mais amostras de célula normal versus células cancerosas isoladas antes da determinação do nível de expressão, para a amostra em questão. O nível de expressão médio de cada um dos genes testados no maior número de amostras é determinado e este é utilizado como referência de nível de expressão para o biomarcador. O nível de expressão do biomarcador determinado para a amostra de teste (nível absoluto de expressão) é então dividido pelo valor de expressão médio obtido para o biomarcador. Isto proporciona o nível de expressão relativo.
Em outra modalidade presente na invenção, um biomarcador de proteína é detectado. Um tipo de agente para a detecção de biomarcador de proteína da invenção é um anticorpo capaz de se ligar a tal proteína ou seu fragmento, tal como, por exemplo, um anticorpo marcado de forma detectável. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais. Um anticorpo intacto, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo (por exemplo, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, a cadeia de ligação polipeptídica única) pode ser usado. O termo "marcado", no que diz respeito à sonda ou anticorpo, destina-se a abranger a marcação direta da sonda ou por acoplamento do anticorpo (isto é, fisicamente ligando) uma substância detectável com a sonda ou o anticorpo, bem como marcação indireta da sonda ou anticorpo pela reatividade com outro reagente que está diretamente marcado. Exemplos de marcação indireta incluem a detecção de um anticorpo primário, utilizando um anticorpo secundário marcado por fluorescência e extremidade marcada de uma sonda de DNA com biotina tal que pode ser detectado com estreptavidina marcado por fluorescência. Uma variedade de formatos podem ser empregues para determinar se uma amostra contém uma proteína que se liga a um dado anticorpo. Exemplos de tais formatos incluem, mas não estão limitados a, imunoensaio enzimático (EIA), radioimunoensaio (RIA), análise de Western blot e enzima ligada ensaio imuno (ELISA). Um especialista na técnica pode prontamente adaptar conhecidos métodos de detecção de proteína/anticorpo para utilização na determinação se as células tumorais expressam um biomarcador da presente invenção. Uma combinação de dois ou mais dos ensaios para a detecção de biomarcadores (exemplos não limitativos incluem os descritos acima) podem também ser utilizados para avaliar um ou mais marcadores.
Neste documento também é fornecido um método de seleção de um paciente com câncer para o tratamento com um inibidor da angiogênese. O método compreende fornecer uma amostra das células cancerosas do paciente, a detecção da expressão de um ou mais genes cuja expressão tem sido correlacionada com a sensibilidade ou resistência a um inibidor da angiogênese, a comparação do nível de expressão do gene ou genes detectados na amostra do paciente com um nível de expressão do gene ou genes que tenham sido correlacionados com a sensibilidade ou resistência ao inibidor da angiogênese. Exemplos não limitativos de genes que foram correlacionados com a sensibilidade ou resistência ao inibidor da angiogênese incluem VEGF, VEGF receptor, HIF-Ια, receptor do fator de crescimento da placenta, e endoglina (CD105). Numa modalidade adicional, um paciente é selecionado como sendo previsto para ser beneficiar da administração do inibidor da angiogênese se a expressão do gene ou genes for semelhante à expressão do gene ou genes que tenham sido correlacionadas com a sensibilidade para inibição de angiogênese. Em uma modalidade não limitativa, o inibidor de angiogênese para a qual o individuo ou células cancerosas do individuo são testadas para a sensibilidade ou resistência é um inibidor endoglina (CD105) (por exemplo, anticorpos humanizados anti-endoglina). Numa outra modalidade, o inibidor da angiogênese para a qual o individuo ou células cancerosas do individuo são testadas para a sensibilidade ou resistência é uma inibidor do receptor do VEGF ou uma inibidor de VEGF.
IV. ENSAIOS FUNCIONAIS
Os anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno do mesmo podem ser testados para uma variedade de funções, usando uma variedade de ensaios ín vitro e em métodos in vivo, incluindo, mas não se limitando aos conhecidos na técnica e aqui descritos. MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA SINALIZAÇÃO E FUNÇÃO DO CD105 CD105 (endoglina) é um membro da família de receptores de TGF-β que é expresso pela proliferação de células endoteliais, e níveis normais de CD105 são necessários para a proliferação de células endoteliais. A expressão CD105 é aumentada por hipóxia celular através da produção de hipoxia induzida do fator-1-α (HIF-1-α) e protege as células hipóxicas de apoptose. Atos de CD105 para modular a sinalização de complexos de multiplos receptores da superfamília quinase TGF-β, incluindo receptores de TGF-β (TGF-βΕ), receptores semelhantes de ativina como quinases (ALK) e receptores de ativina. Na ausência de CD105, a ativação dos resultados de receptores TGF-β na fosforilação de proteínas SMAD que inibem o crescimento de células endoteliais. No entanto, a ativação do CD105 por TGF-β modulam a fosforilação da proteína SMAD. O resultado final é a liberação dos efeitos inibitórios de crescimento de ativação de receptores TGF-β em células endoteliais. Prevenção da ativação de CD105 por anticorpo anti-CD105 agem sinergicamente com TGF-β para suprimir o crescimento de células endoteliais. TGF-β pode estimular dois tipos distintos de receptor I/SMAD de sinalização vias com efeitos opostos nas células endoteliais. A via de sinalização TGF-β/ALK5 (A) conduz à inibição da proliferação e migração celular, enquanto que a via TGF-β/ALKl· (B) induz a proliferação de células endoteliais e da migração. CD105, um receptor acessório de TGF-β, altamente expresso durante a angiognese, é essencial para sinalizaçao de ALK1. Na ausência de CD105, a sinalização TGF^/ALK5 é predominante e mantém endotélio quiescente. Alta expressão de CD105 estimula a via ALK1 e indiretamente inibe a sinalização de ALK5, promovendo assim o estado de ativação da angiogênese.
Em uma modalidade não limitativa, os anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno contidos aqui bloqueiam angiogênese através do bloqueio da via de sinalização TGF-β/ALKl. Em outra modalidade os anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno aqui fornecidos bloqueiam a angiogênese, impedindo a fosforilação Smad1/5/8 e/ou a sinalização. CD105 participa na promoção da angiogênese através de sinalização do TGF-e/ALKl, que por sua vez envolve a diminuição e/ou bloqueio da fosforilação de proteínas Smad2/3. Em ainda outra modalidade, os anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno aqui fornecidos bloqueiam a angiogênese, aumentando a fosforilação Smad2/3 e/ou a sinalização. Métodos e técnicas para a análise do bloqueio ou efeito inibitório dos anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno aqui fornecidos na via de sinalização TGF-e/ALKl e/ou a fosforilação da Smad1/5 incluem, mas não estão limitados a, conhecidas técnicas moleculares. A título de exemplo, western blotting com anticorpos específicos para qualquer uma das proteínas nas vias TGF-e/ALK5 ou TGF-β/ALK1 podem ser utilizadas para determinar a inibição e/ou efeito estimulador dos anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno aqui divulgadas nas vias TGF-e/ALK5 ou TGE-e/ALK1. Da mesma forma, a detecção de mRNA ou regulação do mRNA para as proteínas envolvidas na via TGF-e/ALK5 ou TGF-e/ALKl podem ser utilizadas para analisar o efeito inibitório e/ou estimulador dos anticorpos e fragmentos de ligação do antígeno aqui divulgado. Métodos adicionais para a sinalização celular para as vias TGF-e/ALK5 ou TGF-p/ALK1 são conhecidos na técnica e são aqui contempladas.
Em uma modalidade não limitativa, os anticorpos podem ser avaliados no que diz respeito à inibição da angiogênese e a proliferação de células endoteliais. A ligação dos anticorpos anti-endoglina com HUVECs não impedem a ligação subsequente de TGF-β com HUVECs. Assim, a supressão direta do crescimento celular endotelial por anticorpos anti-endoglina representa um dos mecanismos fundamentais pelo qual os efeitos angiogênicos e tumor-supressivo são observados ín vivo. Em outra modalidade os anticorpos podem ser avaliados em relação ao bloqueio da angiogênese prevenindo a fosforilação de Smad1/5/8 e/ou a sinalização. CD105 participa na promoção da angiogênese através da sinalização do TGF-e/ALK1, que por sua vez envolve a diminuição e/ou bloqueio da fosforilação de proteínas Smad2/3. Em ainda outra modalidade, os anticorpos podem ser avaliados em relação ao bloqueio da angiogênese, aumentando a fosforilação de Smad2/3 e / ou de sinalização. Métodos e técnicas para análise do bloqueio ou o efeito inibitório dos anticorpos aqui fornecidos na via de sinalização de TGF-e/ALK1 e/ou a fosforilação da Smad1/5 incluem, mas não estão limitados a, conhecidas técnicas moleculares. A título de exemplo, western blotting com anticorpos específicos para qualquer uma das proteínas nas vias TGF^/ALK5 ou TGF^/ALK1 podem ser utilizadas para determinar o efeito inibitório e/ou estimulador dos anticorpos anti-endoglina aqui divulgado nas vias TGF-β/AL^ ou TGF^/ALK1. Da mesma forma, a detecção de mRNA ou regulação do mRNA nas proteínas envolvidas na via TGF- e/ALK5 ou TGF-p/ALKl podem ser utilizadas para analisar o efeito inibitório e/ou estimulador dos anticorpos aqui descritos. Métodos adicionais de sinalização para o ensaio celular nas vias TGF-p/ALK5 ou TGF-p/ALKl são conhecidos na arte e são aqui contempladas. A atividade dos anticorpos anti-endoglina aqui descritas podem ser avaliadas utilizando testes reconhecidos na técnica por, por exemplo, testes de ligação ELISAs, ELISAs competitivos, ressonância de plasma de superfície e efeito sobre as células HUVEC como descrito em mais detalhe abaixo.
MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA ADESÃO CELULAR A adesão celular pode ser medida por métodos conhecidos pelos especialistas. Testes foram descritos anteriormente, por exemplo, por Lebrin, et al., J. Clin. Invest 1997, 99:1390-1398. Resumidamente, as células podem aderir ao substrato (isto é, um componente de ECM) em cavidades revestidas. Celulas não fixas são removidas por lavagem, e sítios de ligação não-específicos são bloqueadas por incubação com BSA. As células ligadas são coradas com cristal de violeta, e a adesão celular é quantificada pela medição da densidade óptica de cristal de violeta eluído a partir de células ligadas a um comprimento de onda de 600 nm.
MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA MIGRAÇÃO DE CÉLULAS
Os ensaios para a migração de células têm sido descritas na literatura, por exemplo, por Brooks, et al., J. Clin. Invest 1997, 99:1390-1398 e métodos de medição para a migração de células são conhecidos pelos especialistas . Em um método para medir a migração celular aqui descritos, as membranas das câmaras Transwell de migração são revestidas com o substrato, o transwells lavado, e os sitios de ligação não específicos bloqueados com BSA. As células tumorais de subconfluentes culturas são colhidas, lavadas e ressuspensas em tampão de migração na presença ou ausência de anticorpos do teste. Depois que as células tumorais puderem migrar para o lado de baixo das membranas revestidas Transwell, as células restantes no lado de cima da membrana são removidas e as células que migram para o lado inferior são coradas com cristal de violeta. A migração celular é então quantificada por contagem direta de células por campo microscópico.
SCID/CAMUNDONGO NU
Um método para dosar o crescimento do tumor utiliza camundongo SCID, como se segue: células subconfluentes de melanoma humano M21 são colhidas, lavadas e ressuspensas em PBS estéril (20x106 por mL). É injetado subcutaneamente a suspenção com 100gL de células M21 de melanoma humano (2x106) no camundongo SCID. Três dias após a injeção de células de tumor, os camundongos são ou não tratados ou tratados por via intravenosa ou intraperitoneal (por exemplo, 100 gg/camundongo) com um ou mais controles ou composições de teste. Os camundongos são tratados diariamente durante 24 dias. O tamanho do tumor é medido com compassos de calibre e o volume é estimado utilizando a fórmula V=(LxW2)/2, em que V é igual ao volume, L é igual ao comprimento, e W é igual à largura.
Um método para dosar o crescimento do tumor utiliza o camundongo nu, como se segue: as células tumorais MDA-MB-435 (0,4x106 células/camundongo) em 50gL de PBS são ortotipicamente implantadas na gordura mamária dos camundongos fêmeas nus (5 a 6 semanas de idade). Quando os tumores atingiram um volume médio de cerca de 50 a 80 mm3, camundongos são randomizados (pelo menos 10/grupo) e o tratados por via intravenosa ou intraperitoneal com um ou mais anticorpos em 1pg(0,05 mg/kg) por dose, 10pg(0,5 mg/kg), 100pg(5 mg/kg) ou 200pg(10mg/kg), ou 100pg de anticorpo de controle em ΙΟΟμΙ de PBS, ou ΙΟΟμΙ de PBS sendo iniciado duas vezes por semana; em alguns estudos, um grupo não tratado também pode ser avaliado. O tamanho do tumor é medido com compassos de calibre e o volume é estimado utilizando a fórmula V = (LxW2)/2, em que V é igual ao volume, L é igual ao comprimento, e W é igual à largura.
BALB/MODELOS SINGÊNICOS COM CAMUNDONGOS
Alternativamente, BALB/modelos singênicos com camundongos também pode ser utilizado para avaliar o crescimento do tumor ou até mesmo inibição pelos anticorpos aqui descrito como exemplificado por, por exemplo, Tsujie et al., Int. J. Oncologia: 29 1087-1094 (2006).
CAMUNDONGOS QUIMÉRICOS
Outro teste mede angiogênese em um camundongo quimérico: modelo de camundongo humano e é referido como teste do camundongo quimérico. O teste foi descrito em detalhe por outros, e ainda mais foi aqui descrito para medir a angiogênese, neovascularização e regressão dos tecidos tumorais. Ver Yan, et al. (1993) J. Clin. Invest. 91:986-996. O teste do camundongo quimérico é um modelo de teste útil para a angiogênese ín vivo, porque os enxertos de pele transplantados se assemelham histologicamente a pele humana normal e a neovascularização de todo tecido estando ocorrendo em efetivos vasos sanguíneos humanos e estão crescendo a partir da pele enxertada no tecido do tumor humano, na superfície da pele humana enxertada. A origem da neovascularização no enxerto humano pode ser demonstrada por coloração imuno-histoquímica da neovasculatura com marcadores específicos de células endoteliais humanas. O teste do camundongo quimérico demonstra regressão da neovascularização com base tanto na quantidade quanto na extensão da regressão do crescimento de novos vasos. Além disso, é fácil para monitorar os efeitos sobre o crescimento de qualquer tecido transplantado em cima da pele enxertada, tal como um tecido do tumor. Finalmente, o teste é útil porque existe um controle interno para a toxicidade no sistema de teste. O camundongo quimérico é exposto a qualquer reagente de teste e, portanto, a saúde do camundongo é uma indicação de toxicidade. Outros modelos animais aqui descritos e conhecidos na técnica podem também ser utilizados nos métodos aqui descritos.
TESTE OLHO DE COELHO
Outra medida da angiogênese é um modelo in vivo olho de coelho e é referido como o teste olho de coelho. O teste do olho do coelho foi descrito em detalhe por outros, e tem sido utilizado para medir tanto angiogênese como a neovascularização na presença de inibidores angiogênicos como exemplificado por D'Amato et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 91 (9): 4082-4085. O teste olho de coelho é um modelo reconhecido para análise da angiogênese in vivo porque o processo de neovascularização, exemplificado por vasos sanguíneos de coelho crescentes da borda da córnea para a córnea, é facilmente visualizada através da córnea naturalmente transparente do olho. Além disso, tanto a extensão como a quantidade de estimulação ou inibição da neovascularização ou regressão da neovascularização pode ser facilmente monitoradas ao longo do tempo.
Finalmente, o coelho é exposto a qualquer reagente de teste, e, por conseguinte, a saúde do coelho é uma indicação de toxicidade do reagente de teste.
Resumidamente, a membrana corioalantóide do frango (MCF) são testes realizados e os efeitos sobre o desenvolvimento da vasculatura são registrados após 48 horas do implante de um pellet de 0,5% carboximetilcelulose contendo um ou mais controles ou compostos de teste. A neovascularização da córnea é induzida por um pellet implantado de poli (metacrilato de hidroxietilo) (Hydron; Interferon Sciences, New Brunswick, NJ) contendo 650 ng do potente fator angiogênico de crescimento da proteina do fibroblasto básico (bFGF) ligado ao sucralfato (sulfato de alumínio de sacarose; Bukh Meditec , Copenhaga). A adição de sucralfato ao pellet protege o bFGF de degradação e prevê a sua lenta liberação, produzindo assim a angiogênese agressiva e consistente que é mais evidente do que a induzida por bFGF/Hydron sozinho. Liberação de bFGF a partir de grânulos contendo sucralfato/Hydron pode ser detectada ín vitro, por até 4 dias após os pellets serem formados em comparação com apenas um dia de pellets com Hydron sozinho. Os pellets são produzidos misturando 110gL de solução salina contendo 12gg de bFGF recombinante (Takeda, Osaka) com 40mg de sucralfato; esta suspensão é adicionada a 80μL de 12%(peso/vol) Hydron em etanol. Aliquotas (10μΕ) desta mistura são então pipetadas em pinos de Teflon e deixa-se secar, produzindo aproximadamente 17 pelletes.
Um pellet é implantado nas microbolsas da córnea de cada olho anestesiado de um coelho fêmea branco da Nova Zelândia, a partir de 2mm do limbo, seguido por uma única aplicação tópica de pomada eritromicina sobre a superfície da córnea. O exame histológico em dias consecutivos demonstra o crescimento progressivo dos vasos sanguineos dentro da córnea para o pellet com apenas raras células inflamatórias observadas. Esta resposta angiogênica não é alterada pela severa supressão imunológica com irradiação total corporal, e pellets com sucralfato por si só não induzem a angiogênese. Novos vasos são primariamente induzidos pelo bFGF, em vez de por inflamação. Os animais são alimentados diariamente a partir de 2 dias após o implantação por lavagem gástrica com um ou mais compostos suspensos em 0,5% de carboximetilcelulose ou em veículo sozinho. Animais imunodeprimidos recebem radiação corporal total de 6 Gy durante 6 minutos, imediatamente antes da implantação dos pelletes. Esta dose de radiação resulta em leucocitopenia acentuada com uma redução >80% na contagem de leucócitos no dia 2 e redução >90% no dia 3, os resultados são consistentes com relatos anteriores.
Os animais são examinados com uma lâmpada de fenda em dias alternados de maneira mascarada pela mesma especialista da córnea (M.S.L.). A área de neovascularização da córnea é determinada pela medição com uma retícula do comprimento do vaso (L) do limbo e do número de horas de relógio (C) do limbo envolvidos. Uma fórmula é utilizada para determinar a área de um segmento de banda circular: C/12x3,1416[r2-(R-L)2], onde r= 6mm, o raio medido da córnea de coelho. A banda uniforme contígua de neovascularização adjacente ao pellete é medida, assim, a inibição total da neovascularização pode ser avaliada.
ENSAIOS TAMPÃO DE ANGIOGÊNESE SOBRE MATRIGEL EM
CAMUNDONGO
Para confirmar os efeitos de uma composição na angiogênese, um ensaio tampão de angiogênese sobre matrigel em camundongo pode ser usado. Vários fatores de crescimento (por exemplo, IGF-1, bFGF ou VEGF) (250 ng) e heparina (0,0025 unidades por mL) são misturados com o fator de crescimento reduzido do Matrigel como anteriormente descrito (Montesano, et al, J. Cell Biol 1983, 97:1648- 1652; Stefansson, et al, J. Biol. Chem. 2000, 276:8135- 8141). As composições aqui descritas ou anticorpos de controle podem ser incluídos nas preparações de Matrigel utilizando um ou mais grupos de dosagem de animais. Nos experimentos de controle, o Matrigel é preparado na ausência de fatores de crescimento. Nos camundongos é injetado por via subcutânea 0,5 mL da preparação de Matrigel e deixa-se incubar durante uma semana. Após o período de incubação, os camundongos são sacrificados e os tampões de Matrigel polimerizados cirurgicamente removidos. A angiogênese nos tampões de Matrigel é quantificada por dois métodos estabelecidos, incluindo a análise imuno-histoquímica e conteúdo de hemoglobina (Furstenberger, et al., Lancet. 2002, 3:298-302; Volpert, et al, Câncer Célula 2002, 2 (6) :473-83,.. E Su, et al, Câncer Res. 2003, 63:3585-3592). Para a análise da imuno-histoquímica, os tampões de Matrigel que são incorporados em OCT, são rapidamente congelados e preparados em seções de 4 gm. Seções congeladas são fixadas em metanol/acetona (1:1). Seções congeladas são coradas com anticorpo policlonal dirigido para CD31. A angiogênese é quantificada pela contagem de densidade microvascular em 20 campos microscópicos de alta potência (200x).
Conteúdo de hemoglobina pode ser quantificado tal como descrito anteriormente (Schnaper, et al., J. Cell Physiol. 1993, 256:235-246; Montesano, et al, J. Cell Biol.. 1983, 97:1648-1652; Stefansson, et al., J. Biol. Chem. 2000, 276:8135-8141; e Gigli, et al, J. Immunol. 1986, 100:1154-1164). Os implantes de Matrigel são rapidamente congelados em gelo seco e liofilizados durante a noite. Os implantes secos são ressuspensos em 0,4mL de 1,0% de saponina (Calbiochem) durante uma hora, e interrompido por vigorosa pipetagem. As preparações são centrifugadas a 14.000Xg durante 15 minutos para remover quaisquer partículas. A concentração de hemoglobina no sobrenadante é então determinada diretamente medindo a absorbância a 405nm e comparada com uma concentração padrão de hemoglobina purificada.
MÉTODOS DE ENSAIO DE CRESCIMENTO DE TUMOR
Crescimento do tumor pode ser ensaiado por métodos conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, o modelo de camundongo SCID, o modelo de camundongo nu e camundongos BALB/c com tumores singênicos. Modelos de camundongo SCID para o crescimento do tumor são realizados como se segue: células de melanoma humanas M21 subconfluente (ou qualquer tipo de célula de tumor desejado) são colhidas, lavadas e ressuspensas em PBS estéril (20x106 por mL). É injetado subcutaneamente nos camundongos SCID um suspensão de 100pL de células de melanoma humanas M21 (2 x 106). Três dias após a injeção de células de tumor, os camundongos são intraperitonealmente não tratados ou tratados com um antagonista nas faixas de dose desejadas. Os camundongos são tratados diariamente durante 24 dias. O tamanho do tumor é medido com calibradores e o volume estimado utilizando a fórmula V = (LxW2)/2, onde V é igual ao volume, L é igual ao comprimento, e W é igual à largura.
Em alternativa, modelos de camundongos nus, modelos de camundongo SCID e/ou modelos de camundongo BALB/c singênicos também podem ser utilizados para avaliar o crescimento do tumor e a inibição do mesmo pelos anticorpos anti-endoglina humanizados ou fragmentos de ligação do antígeno aqui descrito. (Tsujie et al, Int. J. Oncology, 29: 1087-1094 (2006)).
MÉTODOS DE ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS A proliferação celular pode ser ensaiada por métodos conhecidos dos versados na técnica. Como aqui descrito, células endoteliais humanas subconfluentes (CEHSs) podem ser ressuspensas em tampão de proliferação contendo pouco (5,0%) de soro, na presença ou ausência de CM (25pL) de ECV ou células ECVL e células endoteliais permitidas a proliferar durante 24 horas. Proliferação pode ser quantificada medindo a atividade de desidrogenase mitocondrial usando um kit de ensaio comercialmente disponível WST-1 (Chemicon). Além disso, como aqui descrito, a proliferação pode ser quantificada por medição da incorporação 3H utilizando métodos padrões. (She et al, Int. J. Cancer, 108: 251-257 (2004)).
Outros métodos de avaliação da proliferação de células são conhecidos na arte e estão contemplados neste documento. Outros exemplos não limitativos são descritos em mais detalhes nos exemplos.
MÉTODOS DE INDUÇÃO DO CDC, CCDA E OPSONIZAÇÃO Várias terapias têm sido direcionadas para aumentar a resposta imune natural do corpo para células transformadas. Os métodos efetores clássicos incluem citólise dependente do complemento (“CDC”), citotoxicidade celular dependente de anticorpo (“CCDA”) e fagocitose (separação por sistema reticuloendotelial após a célula alvo ser revestida com imunoglobulinas). Sabe-se que na presença de anticorpos, certas células efetoras, tais como as células linfóides têm receptores acoplados nas superfícies das regiões Fc dos anticorpos, mediando uma reação de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (“CCDA”) contra células-alvo. Por meio de CCDA, estas células efetoras exercem atividade citolítica contra tais células-alvo.
Dois tipos de reações CCDA têm sido demonstrados ín vitro. Em reações CCDA clássicas, as células efetoras se fixam às células-alvo revestidas com anticorpo e subsequentemente causam citólise das células-alvo (AH Greenberg et al.,”Characteristics Of The Effector Cells Mediating Cytotoxicity Against Antibody-Coated Target Cells.” I., Immunology, 21, p. 719 (1975)). Esta fixação entre células efetora e alvo resulta da interação da região Fc do anticorpo revestindo a célula-alvo e do receptor Fc da célula efetora. Uma desvantagem deste tipo de reação CCDA é que ela pode ser dificultada pela circulação de complexos antígeno-anticorpo, muitas vezes associada com várias doenças, que competem com o anticorpo ligado da célula-alvo pelos receptores Fc das células efetoras (I. C. M. MacLennan, “Competition For Receptors For Immunoglobulin On Cytotoxic Lymphocytes,” Clin. Exp. Immunol., 10, p. 275 (1972)). Devido a esta desvantagem do CCDA clássico, um segundo tipo de reação CCDA - CCDA anticorpo- dirigida- tem sido proposto. Em CCDA - anticorpo-dirigida, o anticorpo específico alvo é primeiro fixado a célula efetora e o complexo resultante é então "dirigido", através do anticorpo, para seu antígeno específico na superfície da célula-alvo. Vantajosamente, CCDA anticorpo-dirigida não pode ser afetado pela presença de complexos de antígeno-anticorpo que circulam no sistema hospedeiro. A interação entre os anticorpos e as células efetoras através da ligação da região Fc/receptor Fc é normalmente fraca. E, em alguns casos, os anticorpos não permanecem associados com células efetoras, durante um período de tempo suficiente para permitir a lise de células-alvo. Tendo em vista este problema potencial, os anticorpos têm sido ligados às células efetoras utilizando pré-tratamento com polietilenoglicol e uma mistura de óleos ftalatos (J. F. Jones and D. M. Segal, "Antibody-Dependent Cell Mediated Cytolysis (CCDA) With Antibody-Coated Effectors: New Methods For Enhancing Antibody Binding And Cytolysis," J. Immunol., 125, pp 926-33 (1980)). A aplicabilidade deste método para tratamentos ín vivo, no entanto, pode ser diminuída pelos efeitos tóxicos que qualquer resíduo de polietilenoglicol e óleo ftalato sobre o complexo da célula efetora do anticorpo possa ter sobre o corpo.
Alternativamente, um método tem sido proposto para aumentar a CCDA dirigida por anticorpo através de quimioterapia adjuvante com drogas citotóxicas (I. R. Mackay et al., “Effect On Natural Killer And Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Of Adjuvant Cytotoxic Chemotherapy Including Melphalan In Breast Cancer,” Cancer Immunol. Immunother., 16, pp 98-100 (1983)). Os ensaios para testes para CCDA são bem conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, Patente Norte-americana No. 5.756.097.
Por conseguinte, a presente invenção proporciona anticorpos (por exemplo, anticorpos anti-endoglina humanizados) que podem se ligar as células tendo um papel na neovascularização ou angiogênese que pode aumentar a fagocitose e morte das células e, assim, aumentar a proteção in vivo. Também são fornecidos outros anticorpos e fragmentos funcionais dos mesmos que imunorreagem, especificamente se ligam a, ou preferencialmente se ligam a um epítopo ou sítio de ligação a que tais anticorpos podem se ligar e que têm o mesmo efeito.
Os anticorpos da invenção podem também ser opsônicos, ou apresentam uma atividade opsônica, para células que têm um papel na neovascularização ou angiogênese (por exemplo, células endoteliais). Como aqueles versados na técnica reconhecem, “atividade opsônica” se refere à capacidade de uma opsonina (em geral, ou um anticorpo ou fator de soro C3b) para se ligar a um antígeno ou receptor de célula para promover a fixação do antígeno ou receptor de célula em um fagócito e, assim, aumentar a fagocitose. Certas células tornam-se extremamente atraentes para os fagócitos, tais como neutrófilos e macrófagos, quando revestidos com um anticorpo opsônico e sua taxa de separação da corrente sanguínea é notavelmente melhorada. Atividade opsônica pode ser medida de qualquer maneira convencional, como descrito, por exemplo, na Patente Norte-Americana No. 6.610.293.
Em uma modalidade não limitativa, um paciente possuindo um distúrbio neovascular ou um transtorno da angiogênese dependente lança antígenos/peptídeos (por exemplo, endoglina) a partir da angiogênese. Estes antígenos/peptídeos podem ser “antígenos associados a tumores”. Tais pacientes podem ser sistemicamente administrados com um anticorpo para o antígeno/peptídeo (por exemplo, endoglina) e pode iniciar qualquer caminho aqui descrito para induzir CDC, CCDA, opsonização ou qualquer outra forma de extermínio mediada por células.
V. EMBALAGENS E KITS
Ainda em modalidades adicionais, o presente pedido de patente diz respeito a kits para utilização com os compostos descritos acima. Os anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno que ligam endoglina podem ser fornecidos em um kit. Os kits compreendem assim, em um recipiente adequado, uma composição compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que liga endoglina. O kit pode compreender um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga a endoglina em recipiente adequado.
Os meios contentores dos kits incluem geralmente, pelo menos, um frasco, tubo de ensaio, balão, frasco, seringa e/ou outros meios contentores, no qual o polipeptídeo pode ser colocado, e/ou, de preferência, adequadamente aliquotados. Os kits podem incluir um meio contendo pelo menos uma proteína de fusão, porção detectável, molécula repórter e/ou qualquer outro recipiente de reagente em confinamento para a venda comercial. Tais recipientes podem incluir a injeção e/ou recipientes de plástico moldados por sopro em que os frascos desejados são retidos. Kits também podem incluir material impresso para o uso dos materiais no kit.
Embalagens e kits podem incluir adicionalmente um agente tampão, um conservante e/ou um agente estabilizante em uma formulação farmacêutica. Cada componente do kit pode ser colocado dentro de um recipiente individual e todos os vários recipientes podem estar dentro de uma única embalagem. Kits da invenção podem ser projetados para o armazenamento refrigerado ou armazenamento à temperatura ambiente.
Além disso, as preparações podem conter estabilizadores para aumentar a vida de prateleira dos kits e incluem, por exemplo, albumina de soro bovino (ASB). Quando as composições são liofilizadas, o kit pode conter outras preparações de soluções para reconstituir as preparações liofilizadas. As soluções de reconstituição aceitáveis são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, salino tamponado com fosfato farmaceuticamente aceitável (STF).
Além disso, as embalagens ou kits fornecidos aqui pode ainda incluir qualquer uma das outras porções aqui fornecidas tal como, por exemplo, uma ou mais moléculas repórter e/ou uma ou mais porções detectáveis ou agentes.
Embalagens e kits podem ainda incluir um ou mais componentes para um ensaio, tais como, por exemplo, um ensaio de ELISA. As amostras a serem testadas nesta aplicação incluem, por exemplo, sangue, plasma, seções de tecido e secreções, urina, linfa e produtos dos mesmos. Embalagens e kits podem ainda incluir um ou mais componentes para a coleta de uma amostra (por exemplo, uma seringa, uma chávena, uma zaragatoa, etc).
Embalagens e kits podem ainda incluir um rótulo especificando, por exemplo, uma descrição do produto, modo de administração e/ou a indicação de tratamento. Embalagens aqui fornecidas podem incluir qualquer uma das composições, conforme aqui descrito. A embalagem pode ainda incluir uma etiqueta para o tratamento de doenças oculares caracterizadas por angiogênese/neovascularização (por exemplo, degeneração macular, NVC, retinopatia diabética), nefropatia diabética, uma doença inflamatória crônica (por exemplo, o DIC), artrite reumatóide, osteoartrite, formas de câncer e as suas metástases. O termo "material de embalagem" se refere a uma carcaça de estrutura física dos componentes do kit. O material de embalagem pode manter os componentes estéreis e pode ser feita de um material vulgarmente utilizado para esses fins (por exemplo, papel, fibras enrugadas, vidro, plástico, lâminas, ampolas, etc.) A inserção de rótulo ou embalagem pode incluir instruções escritas apropriadas. Kits, portanto, pode adicionalmente incluir rótulos ou instruções para a utilização dos componentes do kit, em qualquer método da invenção. Um kit pode incluir um composto numa embalagem, ou dispensador juntamente com instruções para a administração do composto em um método aqui descrito. A invenção ainda fornece kits que utilizam os métodos de diagnóstico e ensaios aqui descritos. Em algumas modalidades, um kit de acordo com a invenção compreende os reagentes para a detecção de um gene ou genes cujos níveis de expressão foram correlacionados com a sensibilidade ou resistência a um inibidor da angiogênese em uma amostra de células cancerosas de um paciente. Em algumas modalidades, o gene ou genes são selecionados a partir de VEGF, VEGF receptor, HIF-Ια, receptor do fator de crescimento da placenta e CD105. Em algumas modalidades, o kit compreende VEGF. Em algumas modalidades, o kit compreende o VEGF receptor. Em algumas modalidades, o kit compreende HIF-1a. Em algumas modalidades, o kit compreende o receptor do fator de crescimento da placenta. Em algumas modalidades, o kit compreende CD105. Em algumas modalidades, o kit compreende pelo menos dois de: VEGF, VEGF receptor, HIF-1a, receptor do fator de crescimento da placenta e CD105. Em algumas modalidades, o kit compreende pelo menos dois genes que foram correlacionados com sensibilidade a um inibidor da angiogênese. Em algumas modalidades, o kit compreende pelo menos dois genes que foram correlacionadas com a resistência a um inibidor da angiogênese. Em algumas modalidades, o kit compreende pelo menos um gene que tem sido correlacionado com a sensibilidade a um inibidor da angiogênese e um gene que tem sido correlacionado com a resistência a um inibidor da angiogênese.
Em ainda outras modalidades, um kit de acordo com a invenção compreende os reagentes para a detecção de VEGF, VEGF receptor, HIF-Ια, receptor do fator de crescimento da placenta e níveis de expressão CD105 em uma amostra de células tumorais de um paciente a ser tratado; e uma dose ou doses de um inibidor, incluindo, mas não se limitam a anticorpos anti-endoglina humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito, numa variedade de formas de dosagem, tais como cápsulas, pílulas, cápsulas gelatinosas, pós para suspensão, etc. Ainda é contemplado no âmbito do invento que o kit compreendendo os reagentes para a detecção de VEGF, VEGF receptor, HIF-Ια, receptor do fator de crescimento da placenta, e os níveis de expressão CD105 em uma amostra de células tumorais de um paciente a ser tratado irão ainda compreender qualquer uma das modalidades acima mencionadas dos kits para a coadministração de pelo menos um inibidor da angiogênese adicional.
Instruções podem incluir instruções para a prática de qualquer um dos métodos aqui descritos, incluindo os métodos de tratamento. Instruções podem adicionalmente incluir indicações de um desfecho clínico satisfatório ou quaisquer sintomas adversos que podem ocorrer, ou informações adicionais necessárias pelos órgãos reguladores, como a FDA (Food and Drug Administration) para uso em um indivíduo humano.
As instruções podem estar em "matéria impressa", por exemplo, em papel ou papelão, dentro ou fixada ao kit, ou numa etiqueta fixada ao kit ou ao material de embalagem, ou ligado a um frasco ou tubo contendo um componente do kit. As instruções podem ainda ser incluídas em um meio legível em computador, tal como um disco (disquete ou disco rígido), CD óptico, tais como CD ou DVD-ROM/RAM, fita magnética, mídia de armazenamento elétricos tais como memória RAM e ROM, terminal IC e híbridos destes, tais como meios magnéticos/ópticos de armazenamento.
As formas de realização dos compostos e métodos da presente invenção são destinadas para ser ilustrativos e não limitativos. Modificações e variações podem ser feitas por pessoas versadas na técnica à luz dos ensinamentos acima, especificamente aqueles que podem referir-se a alterações nos fragmentos de anticorpos ou de ligação de antígeno que se ligam à endoglina em torno das modificações descritas, enquanto mantém a funcionalidade nativa em relação à ligação de endoglina. Por conseguinte, deve ser entendido que as alterações podem ser feitas nas formas de realização nas modalidades particulares decorridas que estão dentro do escopo do que é descrito.
EXEMPLOS A aplicação pode ser melhor compreendida com referência aos seguintes exemplos não limitativos, que são fornecidos como formas de realização exemplares da aplicação. Os exemplos a seguir são apresentados a fim de ilustrar mais completamente as modalidades do invento e não devem de modo algum ser entendido, no entanto, como limitando o escopo do relatório. Enquanto certas modalidades da presente invenção têm sido mostradas e descritas aqui, será óbvio que tais modalidades são fornecidas apenas como exemplo. Inúmeras variações, mudanças e substituições podem ocorrer para aqueles versados na técnica sem sair da invenção; deve ser entendido que várias alternativas para as modalidades descritas aqui podem ser empregadas na prática dos métodos descritos aqui. EXEMPLO 1 Geração e ligação de anticorpos Anti-CD105 humanizados e anticorpos humanizados/desimunizados Construção, expressão e purificação de anticorpos Todo o gene humanizado e humanizado/desimunizado das regiões VK e VH foram sintetizados utilizando uma série de oligonucleótideos sobrepostos que foram recozidos, ligados e amplificados por PCR para dar comprimento total das regiões V sintéticas. As variantes montadas foram então clonadas diretamente no sistema de vetor de expressão Antitope Ltd.'s pANT para IgG1 cadeias pesadas e cadeias leves kappa.
Todas as combinações de cadeias pesada e leve humanizadas (isto é, um total de 4 pares) e combinações de cadeias pesada e leve humanizadas/desimunizadas (isto é, um total de 24 emparelhamentos) foram estavelmente transfectados em células NS0 através de eletroporação e selecionadas usando 200 nM de metotrexato (Cat Sigma. N° M8407). Para cada colônia resistente à metotrexato foram testados níveis de expressão IgG utilizando um IgG1 ELISA. As melhores linhas de expressão foram selecionadas e congeladas sob nitrogênio líquido. Transfecção e seleção de clones de sucesso foram alcançadas para todas as variantes e níveis de expressão de anticorpos variantes humanizados e humanizados/desimunizados em culturas estática saturadas são mostrados na Tabela 1.
Foram vinte e quatro variantes IgG1, portanto, purificados a partir de sobrenadantes de culturas celulares NS0 sobre uma coluna de sefarose de proteína A (GE Cat Healthcare. No. 110.034-93) e quantificados por OD280nm usando um coeficiente de extinção, EC(0.1%)= 1,62, com base na sequência de aminoácido previsto. Aproximadamente 500gg de cada anticorpo variante foi purificado e variantes de chumbo foram analisadas por redução SDS-PAGE. Resumidamente, a redução de mancha azul Coomassie de SDS-PAGE em gel de anticorpos variantes. 1gg de cada amostra foi carregada em um gel NuPag 4-12% Bis-Tris (Cat Invitrogen. No. NP0322BOX) e executada a 200V durante 30 minutos. O marcador foi Bio-Rad Precision Plus (Cat. No. 161-073). AS bandas correspondentes aos tamanhos previstos das cadeias pesadas e leves foram observadas sem evidência de qualquer contaminação, em qualquer pista (dados não mostrados).
Metodologia ELISA
Um ELISA foi utilizado para ensaio de ligação de anticorpos anti-endoglina humanizado e humanizado/desimunizado com endoglina. Resumidamente, um teste de ELISA foi realizado de acordo com os seguintes passos: 1. Revestimento de uma placa Nunc Maxisorp com MAB9811-01 (anticorpo anti-endoglina policlonal) em 1500ng/ml de PBS em 100 gL/cavidade. Cobrir a placa com um selador e incubar durante a noite (16-24 horas) a 4°C. 2. Lava-se a placa 2X com - 200gL de PBS (sem Tween). 3. Adicionar 200 μΐ/cavidade de solução de bloqueio de BSA (1% de BSA) e incubar 60 minutos à temperatura ambiente. 4. Lavar a placa 3x com PBS contendo Tween (PBS-T), utilizando o lavador de placas Biotek. 5. Adicionar 100 μΐ/cavidade de CD105 (Sistemas R e D Cat 1097-PT), a 100 ng/ml em PBS-T com BSA 0,1% e incubar 60 minutos à temperatura ambiente. 6. Lavar a placa 3x com PBS-T utilizando o lavador de placas Biotek. 7. Nas cavidades de teste: adicionar 100 μΐ/cavidade de anticorpos anti-endoglina em 20, 10, 4, 2, 1, 0,5 e 0,2ng/ml (diluído em PBS-T com 0,1% de BSA) e incubar 60 minutos à temperatura ambiente. Em cavidades de controle negativo: adicionar 100 μΐ/cavidade de isótopos emparelhados do anticorpo correspondente. 8. Lavar a placa 3x com PBS-T usando o lavador de placas Biotek. 9. Adicionar 100 μΐ/cavidade de Goat anti-IgG humana conjugado com HRP (Jackson Immunoresearch), diluído 1:10000 em PBS-T com BSA 0,1% para todas as cavidades; incubar 30 a 60 minutos à temperatura ambiente. 10. Lavar a placa de 5X com PBS-T usando o lavador de placas Biotek. 11. Adicionar 100 μΐ/cavidade de solução de substrato TMB e incubar descoberta no escuro durante 15 minutos. 12. Parar a reação por adição de 100 μL/cavidade de solução parada TMB.
Amostras são executadas em triplicata e a densidade óptica é lida para a construção de uma curva padrão e determinação da constante de ligação. A análise estatística é realizada usando o teste t de Student ou outro teste padrão.
COMPETIÇÃO ELISA
Os anticorpos foram testados em um ELISA de competição para a ligação de CD105 contra biotinilado quimérico anti-CD105. Resumidamente, o quimérico anti-CD105 foi biotinilado usando um kit de micro-biotinilação (Sigma, Catalog No. BTAG-1KT), seguindo as instruções do fabricante. Placas de microtitulação de 96 cavidades de fundo plano Nunc Immuno Maxisorp foram revestidas com CD105 anti-humana de camundongo (Southern Biotechnologies Catalog, No. 9811-01) a 1,5 pg/mL em tampão salino de fosfato (PBS) durante a noite a 4°C. No dia seguinte, 100ng/ml de CD105 humano (Sistemas R e D, Catalog No. 1097-EN) em PBS/2% BSA foi adicionado à placa pré-revestida e incubada à temperatura ambiente durante 1 hora. Variando concentrações tanto de anticorpos anti-CD105 quimérico, humanizados ou humanizados/desimunizado (4 pg/mL a 0,0018 pg/mL em três diluições) foram misturados com uma concentração fixa de anticorpo anti-CD105 quimérica biotinilado (6,25 ng / ml) e adicionados à placa. A ligação do anticorpo quimérico biotinilado foi detectada através de estreptavidina-HRP (Sigma, catálogo No. S5512) e do substrato TMB (Sigma, catálogo No. T0440). Os valores OD450nm foram medidos num leitor de placas MRX Dynex TCII. Os resultados da análise de competição são ilustrados nas Figuras 7 e 8. As curvas foram ajustadas através da parte da linha reta de cada um dos gráficos de absorbância contra o log da concentração de amostra e as equações das linhas foram utilizadas para calcular as concentrações de anticorpos humanizado ou humanizado/desimunizados necessárias para inibir a ligação do anticorpo quimérico biotinilado em CD105 em 50% (IC50). Para permitir as comparações com e entre os experimentos, os valores de IC50 de variantes humanizados ou humanizados/desimunizados foram normalizados contra o anticorpo de referência que foi incluído em cada placa para dar um valor para a diferença de velocidade. Valores de IC50 são relativos à anti-CD105 quimérico e são representativos de três experiências. Dados resumidos de ELISA são apresentados na Tabela 1 e incluem os níveis de expressão de anticorpos (pg/ml) como dosados em culturas saturadas estáticas.
Tabela 1. Características de variantes de anticorpos humanizados e humanizados/desimunizados. Valores de IC50 são relativos ao anticorpo anti-endoglina quimérico e são representativos de três experiências. Os níveis de expressão de anticorpos (pg/ml) foram ensaiados em culturas saturadas estáticas. O nível de desimunização é representado por uma escala arbitrária com base na localização nos epítopos das mutações. EXEMPLO 2 Análise BIAcore (Ressonância Plasma de Superfície -RPS) de ligação de anticorpo anti-endoglina Humanizado e humanizado/desimunizado Afinidade de anticorpos pode ser avaliada utilizando, por exemplo, a análise BIAcore utilizando protocolos padrões. Resumidamente, a proteína A é quimicamente acoplada a um chip CM5 BIAcore, com a quantidade de proteína A imobilizada correspondente a ~2000 RU. Os passos subsequentes são realizados em um tampão de execução de 10mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05% de Tween, pH = 7,4, a 25°C usando uma taxa recolha de dados de 10 Hz. O anticorpo anti-endoglina (10 nM) é capturado a uma taxa de fluxo de 10 uL/min pela proteína imobilizada A sobre o chip de BIAcore: tipicamente, tempos de captura de 20, 40 e 80 segundos permitem a captura de densidades de anticorpo correspondente a 130 RU, 330RU e 570 RU, respectivamente. Ciclos de iniciação são realizados utilizando tampão de execução a uma taxa de fluxo de 40 uL/min, um tempo de contato de 90 segundos e um tempo de dissociação de 90 segundos. Ciclos de amostra são realizados utilizando endoglina recombinante em concentrações que variam de 0 a 40 nM. Endoglina é feita passar sobre o chip BIAcore contendo anticorpo capturado a uma taxa de fluxo dede 40 uL/min com um tempo de contato de 525 segundos e tempo de dissociação de 2500 segundos. Oito ciclos de amostra são tipicamente realizados em cada densidade de regeneração de captura de anticorpo do chip usando 10 mM de glicina com pH=1,7. A análise dos dados é realizada usando software de avaliação de sinais BIAcore T100 v1.1 gerados usando chips BIAcore com que diferentes densidades de anticorpos capturados são comparados e os dados gerados na ausência de endoglina recombinante são usados para ajustar o sinal em branco de intra-ensaio. Para o ajuste dos dados, o Rmax é permitido flutuar para contabilizar a variação dos níveis de captura de cada anticorpo em cada ciclo. Os dados de cada densidade de captura são ajustados simultaneamente durante a análise de cada anticorpo. Dados BIAcore são apresentados na Tabela 2 para anticorpos anti-endoglina quiméricos, humanizados e humanizados/desimunizados, incluindo ka (1/Ms), kd (1/s), KD (M) e Chi2 (RU2).
Tabela 2. Dados de ligação BIAcore para anticorpo anti-endoglina quimérico, anticorpo anti-endoglina humanizado VK1VH e anticorpos anti-endoglina humanizados/desimunizados VK1AAVH1R, VK1AAVH1Q e VK1AAVKVH1A2. EXEMPLO 3 Avidez de anticorpos e o número de epítopos disponíveis em células que expressam endoglina Avidez dos anticorpos e o número de epítopos disponíveis em células que expressam endoglina podem ser avaliados utilizando análises de gráfico Scatchard utilizando protocolos padrões.
Em resumo, as análises de gráfico Scatchard de ligação direta de anticorpos anti-endoglina radiomarcados humanizados para células de leucemia que expressam endoglina KM-3 e proliferação HUVECs subconfluentes são realizadas. Os anticorpos anti-endoglina purificados são individualmente radiomarcados com 125I utilizando GEN-Iodo e de acordo com métodos padrão conhecidos pelos versados na técnica. Os anticorpos anti-endoglina humanizados radiomarcados são ensaiados para o número médio de átomos de iodo por molécula de IgG. Experiências de titulação são realizadas usando uma quantidade fixa (0,1 pg) de cada mAb 125I-rotulado e 2 vezes em série de incrementos de células que expressam endoglina HUVEC para determinar a atividade de ligação do antígeno. Análise de gráfico Scatchard dos dados ligação é realizada de acordo com métodos conhecidos. Uma constante de equilíbrio e um número médio máximo de mAb ligado/célula são estimadas por esta análise. EXEMPLO 4 Ensaio de Western Blot para atividade de anticorpo anti-endoglina A capacidade de anticorpos anti-endoglina humanizados para modificar a sinalização intracelular em proliferação de células endoteliais que expressam CD105 pode ser ensaiada através de Western Blots para detectar a fosforilação das proteínas envolvidas na via de sinalização de CD105.
Análises de Western blot são realizadas para identificar Smad1/5/8 ou Smad2/3 fosforilados de acordo com conhecidos técnicas Western Blotting em células endoteliais não transfectadas. Anticorpos primários contra Smad1, Smad2, Smad5, ID1 (Santa Cruz) fosforilados e endoglina são utilizados para detectar moléculas nas amostras. A detecção é realizada por quimioluminescência aumentada (QLA). EXEMPLO 5 A inibição do crescimento HUVEC e ensaio de incorporação de 3H-timidina Um número de ensaios está disponível para avaliar a inibição do crescimento celular.
Num exemplo, a linha de células HUVEC E6/E7 P3-17 foi cultivada em meios de EBM2 com suplementos (Lonza- Clonetics), contendo soro de vitela fetal a 5%. As células foram cultivadas em balões de 75-cm2 (Falcon, Becton-RNAkinson, Franklin Lakes, NJ) numa incubadora de CO2 a 37°C sob condições de subconfluência. Células são separadas por incubação com solução salina equilibrada Hanks com 15 mM de EDTA em tampão HEPES 25mM, ph= 7,3 a 37°C durante 15 min. Depois de lavar duas vezes com PBS frio, as células são ressuspensas em um meio de crescimento de células endoteliais a uma concentração de 25.000 células/mL. Em experiências adicionais, as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) são suspensas e cultivadas num meio de crescimento de células endoteliais livre de FBS e extratos de cérebro bovino. Uma alíquota de 200μ1 de suspensão de células contendo 2.500 células é semeada a cada placa de cultura de 96 cavidades. As células são cultivadas a 37°C numa incubadora de CO2 durante a noite antes de serem adicionadas em triplicata de 100 ug/mL de anticorpo anti-endoglina humanizado VK1AAVH1A2 ou IgG de controle ou PBS. As placas de cultura são mantidas na incubadora durante 72 horas, durante o qual meios frescos e anticorpo anti-endoglina humanizado, IgG de controle ou PBS são substituídos a cada 24h. A 3H-timidina (1 μθί) é adicionada em cada cavidade e as placas são incubadas durante 20 horas. As células são lavadas com PBS, seguido por tratamento com 100 μΐ/cavidade de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina, 0,53 mM de EDTA) a 37°C durante 15 min. Células são colhidas em filtros de fibra de vidro (Wallac impresso FiltermatA) usando Harvester 96 (TOMTEC,HDMRIen, CT) e 3H-radioativa é determinada numa cintilação líquida Trilux 1540 MicroBeta e contador de luminescência (Wallac, Turku, Finlândia). Num segundo exemplo, as células utilizadas foram uma cultura primária de células HUVEC, HUVEC 2517C, anticorpo humanizado TRC105 inibiu o crescimento da linha de células HUVEC E6/E7 e a cultura primária HUVEC, derivado HUVEC 2517C de um único doador, em comparação com o anticorpo de controle e PBS (Tabela 3). Células E6/E7 Tabela 3. A inibição do crescimento de células endoteliais humanas por anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado VK1AAVH1A2. EXEMPLO 6 Ensaio para a inibição da migração celular por Anticorpos Anti-endoglina A migração (quimiocinese) como uma medida da proliferação celular e ativação é medida usando uma câmara de Boyden.
Resumidamente, a migração celular é avaliada como se segue: um filtro Costar Nucleopore (poro 8mm) é revestido com fibronectina durante a noite a 4°C. A câmara é lavada com tampão de fosfato salino (PBS) e a câmara inferior foi preenchida com DMEM com ou sem soro e com ou sem TGF-ββ. As células são tripsinisadas e suspensas a uma concentração final de 50.000 células/ml em DMEM com anticorpo anti-endoglina. Uma alíquota de 150 pL da suspensão de células é adicionada à câmara superior e incubadas a 37°C. Após 16h, as células são lavadas e a superfície superior é limpa para remover as células não-migratórias. As membranas são fixadas em metanol, lavada com água, tingidas e o número de células presentes na superfície inferior são contadas. EXEMPLO 7 Ensaio CCDA para anticorpos anti-endoglina humanizados/Desimunizados Os anticorpos anti-endoglina aqui descritos podem ser avaliados com relação à sua capacidade para se ligar a células assassinas naturais (NK) IL-2 ativadas e para induzir citotoxicidade dependente de anticorpo mediada por células (CCDA) de HUVECs utilizando, por exemplo, os protocolos que se seguem.
Isolamento NK e Geração de células IL-2 NK ativadas CMSP são isolados e deixa-se repousar durante 24 horas a 4°C em RPMI com 10% de FBS. CMSP são, em seguida, colocados em meio RPMI com 2% de FBS (volume total = 50 mL), e 10 ml da suspensão de células são plaqueadas numa placa de Petri. CMSP são incubadas durante 2 horas a 37°C e as células não aderentes são coletadas. As células NK são cultivadas a 8x106/ml com 1000U/mL de IL-2 durante 48 horas, seguido por cultura normal durante 5 a 8 dias antes da utilização em um ensaio de CCDA.
Ensaios de citotoxicidade e CCDA Células NK são raspadas a partir da cultura e recolhidas num tubo cônico de 50 mL. As células são lavadas uma vez com meio completo de RPMI e centrifugadas a 1200rpm durante 10 minutos. As células NK são então ressuspensas em 5mL de meio completo de RPMI e contadas. Antes de se efetuar o ensaio, a contagem de célula NK é normalizada para um efetor: alvo proporção de 10:1. Células NK normalizadas são banhadas e 10μ1 de anticorpo antiendoglina são adicionados em cavidades designadas e incubadas durante 30 minutos a 37°C.
As amostras de controle incluem populações de células não tratadas ou de controle de anticorpo tratadas. Todas as amostras e controles são testados em quintuplicidade. Células alvo de interesse são recolhidas (células HUVEC), lavadas, centrifugadas a 1200rpm durante 10 minutos e ressuspensas em 5ml de meio completo de RPMI. As células alvo são lavadas de novo e ressuspensas em soro RPMI livre para uma concentração final de 1x106células/ml. As células alvo são então rotuladas com uma concentração final de 5μg/mL de calceína AM durante 1 hora a 37°C, seguido por duas lavagens com os meios completos de RPMI. As células alvo são então ressuspensas e adicionadas às cavidades de células NK. A combinação de células alvo/células NK é incubada a 37°C durante 4 horas. Após a incubação, as placas são centrifugadas a 1200rpm durante 5 minutos e as células são lavadas e ressuspensas em DPBS. A fluorescência é lida utilizando excitação/emissão de 450/530 nm e a emissão é uma medida da morte celular mediada pelos anticorpos. A intensidade média de fluorescência e desvio padrão são calculados e usados para calcular % de CCDA de acordo com a seguinte fórmula: %CCDA = 100%* [(f amostra fmedia) (fisotipo de controle fTriton)], onde: famostra = média de fluorescência em cavidades contendo anticorpo anti-endoglina fmedia = média de fluorescência em cavidades contendo meio sem o anticorpo fisotipo de controle = fluorescência média em cavidades contendo isotipo IgG de controle fTriton = média de fluorescência em cavidades contendo detergente Triton (para lisar células alvo) Anticorpo VK1AAVH1A2 humanizado/desimunizado demonstrou dose-dependente CCDA de HUVECs que era significantemente maior do que isotipo de anticorpo de controle (Tabela 4A e 4B). Observe os experimentos resumidos na Tabela 4A e 4B realizados com células NK de doadores diferentes.
Tabela 4A. CCDA de anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado VK1AAVH1A2 versus isotipo compatível com IgG de controle em celular HUVEC.
Tabela 4B. CCDA de anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado VK1AAVH1A2 versus isotipo compatível com IgG de controle em celular HUVEC. EXEMPLO 8 Efeito de anticorpos entiendoglina humanizados/Desimunizados sobre um modelo murinho Neovascularização coroidal O efeito de anticorpos antiendoglina humanizados/desimunizados pode ser avaliado em um modelo murino de neovascularização coroidal.
Resumidamente, os camundongos C57BL/6 com idade de 4 a 5 semanas são anestesiados com cloridrato de cetamina (100mg/kg) e as pupilas dilatadas com tropicamida a 1% (Alcon Labocamundongories, Inc Fort Worth, TX). Três queimaduras de fotocoagulação de laser de diodo 532nm (75pm-tamanho do local, 01 segundos de duração, 120 mW) são distribuídas a cada retina utilizando o sistema de distribuição de lâmpada de fenda de um fotocoagulador (OcuLight; IRIDEX, Mountain View, CA) e uma lamela de mão como uma lente de contato. As queimaduras são realizadas nas posições 9, 12 e 3 horas do polo posterior da retina. A produção de uma bolha, no momento do laser, o que indica a ruptura da membrana de Bruch, que é um importante fator na obtenção de neovascularização coroidal (CNV); assim, apenas queimaduras em que uma bolha é produzida são incluídas no estudo.
Quatro experiências independentes são realizadas para investigar o efeito das injeções intra-oculares no dia 0 após a ruptura da membrana de Bruch. Os camundongos do Grupo 1 recebem uma injeção intra-ocular de cerca de 0,5 a cerca de 5 pg de um anticorpo anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno em 1 pL de PBS em um olho e 1 pL de PBS no outro olho. Nos camundongos do Grupo 2 são dadas uma injeção intra-ocular de cerca de 1,5 a cerca de 10 pg de anticorpo anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno em 1 pL de PBS em um olho e 1 pL de PBS no outro olho. Aos camundongos do Grupo 3 são dadas uma injeção intra-ocular de cerca de 5 a cerca de 25 pg de anticorpo anti-endoglina ou fragmento de ligação de antígeno em um olho e 1 pL de PBS no outro olho. O grupo 4 recebe PBS em ambos os olhos.
Após 14 dias, os camundongos são anestesiados e aspergidos com dextrano marcado com fluoresceína (2 x 106 peso molecular médio, Sigma-Aldrich) e montagens planas da coróide são preparadas. Resumidamente, os olhos são removidos, fixados durante 1 hora em 10% de tampão fosfato de formalina, e a córnea e a lente são removidas. A retina inteira é cuidadosamente dissecada a partir do ocular, cortes radiais são feitos a partir da borda do ocular do equador em todos os quatro quadrantes, e a retina é preparada planarmente em meio de preparação aquoso (Aquamount; BDH, Poole, UK). Preparações planas são examinadas por microscopia de fluorescência (Axioskop; Carl Zeiss Meditec, Thornwood, NY), e as imagens são digitalizadas com câmera de vídeo colorida com três dispositivos de carga acoplada (CCD) (1K-TU40A, Toshiba,Tóquio, Japão). O software de análise de captura de imagem é usado para medir a área de cada lesão CNV. As comparações estatísticas são feitas utilizando ANOVA com correção de Dunnett para múltiplas comparações. EXEMPLO 9 Terapia anti-angiogênica de tumores de câncer de mama humano pré-formados na pele humana enxertados em camundongos SCID O efeito dos anticorpos anti-endoglina humanizados/desimunizados aqui descrito podem ser apreciado em relação ao seu efeito anti-angiogênico em tumores de câncer de mama humano pré-formados crescidos na pele humana e enxertados em camundongos SCID.
Resumidamente, células MCF-7 (8x106 células em 0,1 ml de PBS) são transplantadas intradermicamente em espessura total de pele humana enxertadas em camundongos SCID, quando os enxertos não mostraram sinais de inflamação, contração ou rejeição. Os camundongos são deixados sem tratamento, até distintos tumores palpáveis (3 a 6 mm de diâmetro, na maioria dos casos) aparecerem. Os camundongos com tumores distintos são divididos em grupos para estudos terapêuticos. Anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado monoclonal (mAb) e um isotipo correspondente IgG de controle são diluídos com PBS estéril contendo albumina de soro de camundongo (0,05% concentração final). Para a terapia de anticorpos, de 1 a 20 mg/kg de anticorpo anti-endoglina ou IgG de controle é administrada por via intravenosa (VI) através da veia da cauda de camundongos. A administração é dada cada dois a três dias.
Durante o tratamento, os camundongos são monitorados diariamente para o tamanho do tumor e de morbidade. Os camundongos são pesados duas vezes por semana utilizando uma balança electrónica (OhausTM Modelo GT210). O tamanho do tumor é medido três vezes por semana usando um paquímetro eletrônico (PRO-MAX de calibre de 6 polegadas; Fowler Co., Newton, MA) ligado a um computador usando software OptoDemo™ (Fowler Co.). As medidas dos diâmetros do tumor são convertidas em volumes tumorais utilizando a seguinte fórmula: V= comprimento x largura x altura x pi/6. A análise estatística dos dados para a comparação de diferentes grupos de camundongos é realizada utilizando teste t de Student. EXEMPLO 10 Modelo de camundongo de câncer do ovário Para determinar a capacidade do anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado, ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, para o tratamento de câncer do ovário, uma linha de células cancerosas do ovário pode ser usada em camundongos SCID ou ratos.
Em resumo, as células de câncer de ovário são implantadas em camundongos imunodeficientes ou nus para gerar tumores de ovário. Grupos de ratinhos portadores de tumores estabelecidos são tratados por administração VI de doses crescentes (a partir de 1,8 peso corporal mg/kg) de anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado ou IgG de controle. O tratamento é realizado 2 ou 3 vezes por semana. Um inibidor de VEGF e/ou agente anticancerígeno pode ser utilizado em alguns ou em todos os grupos. Os ratinhos são monitorados e o crescimento do tumor é medido de 2 ou 3 vezes por semana. EXEMPLO 11 Modelo do camundongo de Câncer Colorretal Para determinar a capacidade do anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado, ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, para tratar o câncer colorretal, uma linha celular de câncer colorretal pode ser usado em camundongos SCID, nus ou imunocompetentes.
Em resumo, as células de câncer colorretal são implantadas em camundongos imunodeficientes, nus ou imunocompetente para gerar tumores colorretais. Grupos de ratinhos portadores de tumores estabelecidos são tratados por administração VI de doses crescentes (a partir de 1,8 mg de peso corporal/kg) de anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado ou IgG de controle. O tratamento é realizado 2 ou 3 vezes por semana. Um inibidor de VEGF e/ou agente anticancerígeno pode ser utilizado em alguns ou em todos os grupos. Os ratinhos são monitorados e crescimento do tumor é medido de 2 ou 3 vezes por semana. Os tumores podem ser visualizados por imagem de teste padrão, incluindo PET e ultrassom. Os tumores tratados pode ser explantados para avaliar vias de sinalização intracelular ou vascularização por imuno-histoquímica. EXEMPLO 12 Modelo do camundongo de câncer do rim Para determinar a capacidade anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo para o tratamento de câncer do rim, uma linha de células de câncer do rim é usada em camundongos SCID ou nus.
Resumidamente, as células cancerosas renais são implantadas em ratinhos SCID ou nus para gerar tumores de rim. Grupos de ratinhos portadores de tumores estabelecidos são tratados por administração VI de doses crescentes (a partir de 1,8 pg/g de peso corporal) de anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado ou IgG de controle. O tratamento é realizado com intervalo de 3 dias para as primeiras três injeções e em um intervalo de 7 dias para a quarta injeção. Um inibidor de VEGF e/ou outros agentes anticancerígenos podem ser utilizados em alguns ou em todos os grupos. Os ratinhos são monitorados e crescimento do tumor é medido através de sacrifício de animais em uma base semanal. EXEMPLO 13 Modelo do camundongo de Mieloma Para determinar a capacidade anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo para o tratamento do mieloma, uma linha celular de mieloma é usada em ratinhos SCID ou nus.
Resumidamente, as células cancerosas de mieloma são implantadas em ratinhos SCID ou nus para gerar tumores de mieloma. Grupos de ratinhos portadores de tumores estabelecidos são tratados por administração VI de doses crescentes (a partir de 1,8 mg/kg de peso corporal) anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado ou IgG de controle. O tratamento é realizado 2 ou 3 vezes por semana. Um inibidor de VEGF e/ou agente anticancerígeno pode ser utilizado em alguns ou em todos os grupos. Os ratinhos são monitorados e o crescimento do tumor é medido de 2 ou 3 vezes por semana. EXEMPLO 14 Modelo do camundongo de Sarcoma Para determinar a capacidade anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo para o tratamento do sarcoma, uma linha de células de sarcoma é usado em ratinhos SCID ou nus.
Resumidamente, as células do câncer de Sarcoma são implantadas em ratinhos SCID ou nus para gerar tumores de sarcoma. Grupos de ratinhos portadores de tumores estabelecidos são tratados por administração VI de doses crescentes (a partir de 1,8 mg/kg de peso corporal) de anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado ou IgG de controle. O tratamento é realizado 2 ou 3 vezes por semana. Um inibidor de VEGF e/ou agente anticancerígeno pode ser utilizado em alguns ou em todos os grupos. Os ratinhos são monitorados e o crescimento do tumor é medido de 2 ou 3 vezes por semana. EXEMPLO 15 Modelo do camundongo do câncer de mama Para determinar a capacidade anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo para o tratamento do câncer de mama, uma linha de células de câncer de mama é usada em ratinhos SCID ou nus.
Em resumo, as células de câncer de mama são implantados em camundongos imunodeficientes ou nus para gerar tumores de mama. Grupos de ratinhos portadores de tumores estabelecidos são tratados por administração VI de doses crescentes (a partir de 1,8 mg/kg de peso corporal) anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado. Os animais de controle são administrados com uma IgG de controle. O tratamento é realizado 2 ou 3 vezes por semana. Um inibidor de VEGF e/ou agente anticancerígeno pode ser utilizado em alguns ou em todos os grupos. Os ratinhos são monitorados e crescimento do tumor é medido de 2 a 3 vezes por semana. EXEMPLO 16 Ensaio clínico da terapia de combinação para o câncer colorretal Este exemplo descreve um estudo randomizado, cego, controlado com placebo, multicêntrico, fase 2 projetado para fornecer uma avaliação preliminar da segurança e eficácia de um anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado em pacientes com câncer colorretal. Aproximadamente cerca de 100 a cerca de 800 pacientes estão inscritos, com cerca de 50 a cerca de 400 pacientes sendo atribuídos a um grupo de tratamento e cerca de 50 a cerca de 400 pacientes distribuídos para um grupo do placebo. A triagem irá consistir na administração de doses intravenosas repetidas de anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado em cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg ou placebo a cada uma, duas ou três semanas para 6 a 10 ciclos. Um inibidor de VEGF e/ou agente anticancerígeno pode ser utilizado em todos os grupos. O período de tempo do estudo é estimado em cerca de 6 meses a cerca de 5 anos, com a terapia continuada para aos que responderam ao tratamento como indicado no final do estudo inicial. Medidas adicionais de resultados são como segue: Resultado primário: taxa de resposta global. Um dos objetivos do estudo é demonstrar um aumento de sobrevida livre de progressão em 35% com anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado.
Medidas de resultado secundárias que podem ser avaliados incluem a taxa de resposta global, a duração de resposta, a sobrevida global, eventos adversos graves e não graves. Por exemplo, um tratamento pode evitar a progressão da doença (isto é, a estase), ou podem resultar em uma melhoria. Como alternativa ou, além disso, outros objetivos podem ser medidos com respeito a um ou mais dos seguintes: diminuição da carga tumoral, diminuição da vascularização, os efeitos colaterais reduzidos, diminuição das reações adversas e/ou aumento da complacência do paciente. EXEMPLO 17 Ensaio clínico da terapia de combinação para o mieloma Este exemplo descreve um estudo randomizado, cego, controlado com placebo, multicêntrico, fase 2 projetado para fornecer uma avaliação preliminar da segurança e da eficácia da combinação do anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado com bortezomibe em pacientes com mieloma.
Aproximadamente cerca de 100 a cerca de 800 pacientes estão inscritos, com cerca de 50 a cerca de 400 pacientes sendo atribuído a um grupo de tratamento e cerca de 50 a cerca de 400 pacientes distribuídos para um grupo de placebo. A triagem consistirá na administração de doses intravenosas de repetição de anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado em cerca de 1 a cerca de 20 mg/kg ou placebo a cada uma, duas ou três semanas combinado com bortezomibe em de 1,3 mg/kg semanalmente. O período de tempo do estudo é estimado em cerca de 6 meses a cerca de 5 anos, com a terapia continuada para aos que responderam ao tratamento como indicado no final do estudo inicial. Medidas adicionais de resultado são como segue: Resultado primário: taxa de resposta global. Um dos objetivos do estudo é demonstrar um aumento de taxa de resposta global de cerca de 40% com bortezomibe mais placebo mais em cerca de 60% (ou mais) com bortezomibe mais anticorpos anti-endoglina humanizado/desimunizado.
Medidas de resultado secundárias que podem ser avaliados incluem tempo de evolução da resposta, sobrevivência livre, a sobrevida global, eventos adversos graves e não graves. Por exemplo, um tratamento pode evitar a progressão da doença (isto é, a estase), ou podem resultar em uma melhoria. Como alternativa ou, além disso, outros objetivos podem ser medidos com respeito a um ou mais dos seguintes: diminuição da carga tumoral, diminuição da vascularização, os efeitos colaterais reduzidos, diminuição das reações adversas e/ou aumento da complacência do paciente. EXEMPLO 18 Ensaio clínico da terapia de combinação para o câncer de rim Este exemplo descreve um estudo randomizado, cego, controlado com placebo, multicêntrico, fase 2 projetado para fornecer uma avaliação preliminar da segurança e da eficácia da combinação de anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado com sunitinib (Sutent®) em pacientes com células de câncer renal (câncer de rim). Aproximadamente cerca de 100 a cerca de 800 pacientes estão inscritos, com cerca de 50 a cerca de 400 pacientes sendo atribuído a um grupo de tratamento e cerca de 50 a cerca de 400 pacientes atribuídos a um grupo de placebo. A triagem consistirá na administração intravenosa de repetidas doses de anti-endoglina humanizado/desimunizado em cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg ou placebo a cada uma, duas ou três semanas combinados com sunitinib em cerca de 5 a cerca de 50 mg administrados diariamente durante 4 semanas, com 2 semanas de folga antes da repetição do ciclo de 4 semanas de dosagem. O período de tempo do estudo é estimado em cerca de 6 meses a cerca de 5 anos, com a continuação da terapêutica para os que responderam ao tratamento como indicado no final do estudo inicial. Medidas adicionais de resultado são como segue: Resultado primário: sobrevida livre de progressão. Um dos objetivos do estudo é demonstrar um aumento na sobrevida livre de progressão de cerca de 9 a 13 meses em sunitinib mais placebo para cerca de 14 a 18 meses (ou mais) em sunitinib mais anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado.
Medidas de resultado secundárias que podem ser avaliados incluem a taxa de resposta, duração da resposta, tempo para progressão do tumor, a sobrevida global, eventos adversos graves e não graves. Por exemplo, um tratamento pode evitar a progressão da doença (isto é, a estase), ou podem resultar em uma melhoria. Como alternativa ou, além disso, outros objetivos podem ser medidos com respeito a um ou mais dos seguintes: diminuição da carga tumoral, diminuição da vascularização, os efeitos colaterais reduzidos, diminuição das reações adversas e/ou aumento da complacência do paciente. EXEMPLO 19 Ensaio clínico da terapia de combinação para o câncer hepatocelular Este exemplo descreve um estudo randomizado, cego, controlado com placebo, multicêntrico, fase 2 projetado para fornecer uma avaliação preliminar da segurança e da eficácia da combinação de anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado com sorafenib (NEXAVAR®) em pacientes com carcinoma hepatocelular (câncer de fígado). Aproximadamente cerca de 100 a cerca de 800 pacientes estão inscritos, com cerca de 50 a cerca de 400 pacientes sendo atribuídos a um grupo de tratamento e cerca de 50 a cerca de 400 pacientes atribuídos a um grupo de placebo. A traigem consistirá na administração intravenosa de repetidas doses de anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado em cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg ou placebo a cada uma, duas ou três semanas, combinadas com sorafenib em cerca de 400mg por dia durante 3 a 6 ciclos ou até a progressão. O prazo do estudo é estimada em cerca de 6 meses a cerca de 5 ano, com a terapia continuada para os que responderam ao tratamento como indicado no final do estudo inicial.
Medidas de resultados adicionais são como se segue: Principais medidas de resultado: livre de progressão de sobrevivência. Um dos objetivos do estudo é demonstrar um aumento na sobrevida livre de progressão de cerca de 3 a 9 meses em sorafenib mais placebo para cerca de 6 a 12 meses (ou mais) em sorafenib mais anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado.
Medidas de resultado secundárias que podem ser avaliados incluem a duração da resposta, tempo para progressão do tumor, a sobrevida global, eventos adversos graves e não graves. Por exemplo, um tratamento pode evitar a progressão da doença (isto é, a estase), ou podem resultar em uma melhoria. Como alternativa ou, além disso, outros objetivos podem ser medidos com respeito a um ou mais dos seguinte: diminuição da carga tumoral, diminuição da vascularização, os efeitos colaterais reduzidos, diminuição das reações adversas e/ou umento da complacência do paciente. EXEMPLO 20 Ensaio clínico da terapia de combinação para o câncer do rim Este exemplo descreve um estudo randomizado, cego, controlado com placebo, multicêntrico, fase 2 projetado para fornecer uma avaliação preliminar da segurança e da eficácia da combinação anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado com bevacizumab (AVASTIN®) em pacientes com células de câncer renal (câncer de rim). Aproximadamente cerca de 100 a cerca de 800 pacientes estão inscritos, com cerca de 50 a cerca de 400 pacientes sendo atribuídos a um grupo de tratamento e cerca de 50 a cerca de 400 pacientes atribuídos a um grupo de placebo. A triagem consistirá na administração intravenosa de repetidas doses de anticorpo anti-endoglina humanizado/desimunizado em cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg ou placebo a cada uma, duas ou três semanas combinados com bevacizumab em cerca de 7,5, em cerca de 10, ou cerca de 15 mg/kg administrada por via intravenosa a cada duas semanas. O período de tempo do estudo é estimado em cerca de 6 meses a cerca de 5 anos, com a terapia continuada para os que responderam ao tratamento como indicado no final do estudo inicial. Medidas adicionais de resultado são como segue: Resultado primário: sobrevida livre de progressão. Um dos objetivos do estudo é demonstrar um aumento da sobrevivência livre de progressão de cerca de 8 a 12 meses no grupo de bevacizumab mais placebo em cerca de 13 a 18 meses (ou mais) no grupo de bevacizumab mais anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado.
Medidas de resultado secundárias que podem ser avaliados incluem a taxa de resposta global, a duração de resposta, tempo para progressão do tumor, a sobrevida global, eventos adversos graves e não graves. Por exemplo, um tratamento pode evitar a progressão da doença (isto é, a estase), ou podem resultar em uma melhoria. Como alternativa ou, além disso, outros objetivos podem ser medidos com respeito a um ou mais dos seguintes: diminuição da carga tumoral, diminuição da vascularização, reduzido de efeitos secundários, diminuição das reações adversas e/ou aumento da complacência do paciente. EXEMPLO 21 Ensaio clínico da terapia de combinação para o câncer de ovário Este exemplo descreve um estudo randomizado, cego, controlado com placebo, multicêntrico, fase 2 projetado para fornecer uma avaliação preliminar da segurança e da eficácia da combinação anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado com DOXIL® em pacientes com câncer de ovário. Aproximadamente cerca de 100 a cerca de 800 pacientes estão inscritos, com cerca de 50 a cerca de 400 pacientes sendo atribuídos a um grupo de tratamento e cerca de 50 a cerca de 400 pacientes distribuídos para um grupo de placebo. A triagem consistirá na administração de doses intravenosas de repetição de anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado em cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg ou placebo a cada uma, duas ou quatro semanas combinados com DOXIL em cerca de 5 a cerca de 50 mg/m2, administrada uma vez em cada 4 semanas. O prazo do estudo é estimado em cerca de 6 meses a 5 anos, com a continuação da terapia para os que responderam ao tratamento como indicado no final do estudo inicial. Outras medidas de resultado são como se segue: Resultado primário: sobrevida livre de progressão. Um dos objetivos do estudo é demonstrar um aumento da sobrevivência livre de progressão de cerca de 3 a 6 meses no DOXIL® mais grupo placebo para cerca de 4 a 12 meses (ou mais) no DOXIL® mais anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado.
Medidas de resultado secundárias que podem ser avaliados incluem a duração da resposta, tempo para progressão do tumor, a sobrevida global, eventos adversos graves e não graves. Por exemplo, um tratamento pode evitar a progressão da doença (isto é, a estase), ou podem resultar em uma melhoria. Como alternativa ou, além disso, outros objetivos podem ser medidos com respeito a um ou mais dos seguintes: diminuiu peso do tumor, diminuição da vascularização, os efeitos secundários reduzidos, diminuição das reações adversas e/ou aumento da complacência do paciente. EXEMPLO 22 Ensaio clínico de terapia de combinação baseada em platina para câncer de ovário Este exemplo descreve um estudo randomizado, cego, controlado com placebo, multicêntrico, fase 2 projetado para fornecer uma avaliação preliminar da segurança e da eficácia da combinação anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado com quimioterapia baseada em platina em pacientes com câncer de ovário. Aproximadamente cerca de 100 a cerca de 800 pacientes estão inscritos, com cerca de 50 a cerca de 400 pacientes sendo atribuídos a um grupo de tratamento e cerca de 50 a cerca de 400 pacientes atribuídos a um grupo de placebo. A experiência consistirá na administração de doses intravenosas de repetição de anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado em cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg ou placebo a cada uma, duas ou três semanas em combinação com um regime de quimioterapia baseada em platina (por exemplo, carboplatina, e paclitaxel) por infusão intravenosa com cursos de repetição ao longo do estudo. O período de tempo do estudo é estimado em cerca de 6 meses a cerca de 5 anos, com a continuação do tratamento para os que responderam ao tratamento como indicado no final do estudo inicial. Medidas adicionais de resultado são como segue: Resultado primário: sobrevida livre de progressão. Um dos objetivos do estudo é demonstrar um aumento da sobrevivência livre de progressão de cerca de 12 a 18 meses, no topotecano mais placebo para cerca de 12 a 24 meses (ou mais) em quimioterapia baseada em platina mais anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado.
Medidas de resultado secundárias que podem ser avaliados incluem a duração da resposta, tempo para progressão do tumor, a sobrevida global, eventos adversos graves e não graves. Por exemplo, um tratamento pode evitar a progressão da doença (isto é, a estase), ou podem resultar em uma melhoria. Como alternativa ou, além disso, outros objetivos podem ser medidos com respeito a um ou mais dos seguinte: diminuição da carga tumoral, diminuição da vascularização, os efeitos colaterais reduzidos, diminuição de reações adversas e/ou aumento da complacência do paciente. EXEMPLO 23 O uso de anticorpo antiendoglina para o tratamento da retinopatia diabética Desenho do Estudo Para avaliar a atividade biológica de múltiplas injeções intravítreas de anticorpo antiendoglina em pacientes com núcleo envolvendo clinicamente um significativo edema macular diabético (EMD) e relatar os eventos adversos associados com um único núcleo, aberto marcado, de dose escalada para iniciar o estudo piloto. Pacientes com DME envolvendo o centro da mácula e melhor acuidade visual corrigida (AVCC) no olho de estudo, entre 20/40 e 20/400 estão matriculados.
Estudo de Tratamento Pacientes elegíveis são distribuídos aleatoriamente numa proporção de 1:1 para receber três injecções intravítrea de anticorpos antiendoglina humanizado/desimunizado (cerca de 0,25 a 2,5 mg por cada injeção) administrada mensalmente e observações são continuadas até o 24 mês. Pontos finais primários são: a frequência e a severidade ocular e eventos adversos sistêmicos. Os desfechos secundários são: 1) melhor avaliação visual corrigida, avaliada com o gráfico de Estudo de Tratamento da Retinopatia Diabética Inicial (ETRDI), com o uso de refração padronizada e protocolo de teste em uma distância de teste inicialde 2 metros e 2) medição da espessura da retina por tomografia de coerência óptica. 0 médico avaliador não tem conhecimento da atribuição de tratamento do paciente, o médico que administra a injeção está ciente da atribuição de tratamento do paciente em relação ao anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado ou tratamento placebo, mas não tem conhecimento da dose do anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado. Outras pessoas em cada local de estudo (exceto para ajudar aqueles com injeções), pacientes e pessoas no núcleo de leitura central não estão cientes da atribuição de tratamento do paciente.
As análises de eficácia e segurança As análises de eficácia são realizadas com base na intenção de tratar entre todos os pacientes com a utilização de um método de última observação prorrogada para os dados em falta. Para todos os pares de comparações, o modelo estatístico é ajustado para pontuação da acuidade visual (com menos de 55 letras versus 55 letras).
Comparações entre grupos de pontos finais dicotômicos são realizadas com o uso do teste qui-quadrado de Cochran. Mudança da referência de acuidade visual é analisada com o uso de modelos de análise de variância. Nos pontos finais para as características da lesão, os modelos de ajuste de análise de covariância para o valor de referência são usados. 0 procedimento de múltipla comparação de Hochberg-Bonferroni é utilizado para ajustar as comparações dos dois pares de tratamento para o ponto final primário. As análises de segurança incluem todos os pacientes tratados.
Conclusão Os Anticorpos antiendoglina humanizados/desimunizados serão uma terapia bem tolerada para pacientes com DME. Este estudo piloto demonstra que a terapia de anticorpos antiendoglina humanizado/desimunizado tem o potencial para manter ou melhorar a acuidade visual e reduzir a espessura da retina em pacientes com núcleo envolvido clinicamente significativo DME. EXEMPLO 24 Ensaio Clínico de anticorpos antiendoglina e degeneração macular relacionada à idade Desenho do Estudo Em vários locais nos Estados Unidos, os pacientes são incluídos em um estudo de 2 anos, prospectivo, aleatório, duplo-cego, controlado com placebo da segurança e eficácia de repetidas injeção intravítreas de anticorpos antiendoglina humanizado/desimunizado em pacientes com neovascularização coroidal associada com a degeneração macular relacionada à idade. A análise de eficácia primária é realizada em 12 meses. O ponto final de eficácia primária é a proporção de pacientes que tinham perdido menos de 15 letras (aproximadamente 3 linhas) de acuidade visual de referência, como avaliado com o gráfico do Estudo de Tratamento da Retinopatia Diabética Inicial (ETRDI), com o uso de refração padronizada e protocolo de teste a uma distância de teste a partir de 2m. A elegibilidade de lesões é confirmada por um núcleo de leitura central independente, com a utilização critérios de padronizado e avaliadores treinados, que desconhecem as atribuições dos tratamentos dos pacientes. Pacientes fornecem consentimento informado por escrito antes da determinação de sua elegibilidade plena. A triagem pode durar 28 dias.
Para serem incluídos no estudo, os pacientes devem ter no mínimo 50 anos de idade; ter uma melhor acuidade visual corrigida de 20/40 a 20/320 (equivalente Snellen determinada com a utilização de um gráfico de ETDRS); ter neovascularização coroidal primária ou recorrente associada com a degeneração macular relacionada à idade, envolvendo o núcleo foveal; ter um tipo de lesão que tinha sido avaliada com o uso de angiografia com fluoresceína e fotografia de fundo como minimamente clássica ou oculta sem neovascularização coroidal clássica; ter uma lesão de tamanho máximo de 12 áreas de disco óptico (1 área de disco óptico igual a 2,54 mm2 com base em 1 diâmetro de disco óptico de 1,8 mm), com composição de neovascularização de 50% ou mais de toda a lesão; e que tenha presumido recente progressão da doença, como evidenciado pelo sangue observável, perda de visão recente, ou um recente aumento no maior diâmetro linear de uma lesão de 10% ou mais. Não existem critérios de exclusão em relação condições preexistentes cardiovasculares, cerebrovasculares ou vasculares periféricas.
Primeiro Estudo Cinquenta a 500 pacientes (50 a 500 olhos) com a DMRI participarão do estudo em vários locais. Os pacientes elegíveis são distribuídos aleatoriamente numa relação 1:1:1 para receber anticorpos antiendoglina humanizado/desimunizado a uma dose de cerca de 0,25 mg a 2,5 mg ou uma simulação de injeção mensal (dentro de 23 a 37 dias) por 2 anos (24 injeções) em um olho. O médico avaliadador não tem conhecimento da atribuição de tratamento do paciente, o médico que administra a injeção está ciente de atribuição de tratamento do paciente quanto ao anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado ou tratamento placebo, mas não tem conhecimento da dose de anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado. Outro pessoal em cada local de estudo (exceto para ajudar aqueles com injeções), pacientes e pessoal no núcleo de leitura central não estão cientes da atribuição de tratamento do paciente. Terapia de intervenção (por exemplo, terapia verteporfina fotodinâmica) é permitida se a neovascularização de coróide no olho de estudo torna-se predominantemente clássica.
Como o primeiro passo de tratamento, os pacientes receberão um exame oftalmológico completo para estabelecer uma referência da saúde ocular. O exame oftalmológico inclui oftalmoscopia indireta, biomicroscopia com lâmpada de fenda, o exame da retina periférica, medições da pressão intraocular, acuidade visual sintomatologia (sem ajuda e com a melhor corrigida), retinografia colorida, angiografia fluoresceínica, tomografia de coerência óptica, eletrorretinografia e medições de A-scan.
Após o exame preliminar, uma injeção intravítrea como descrito acima é dada ao olho afetado de um paciente manifestando DMRI. Se ambos os olhos são afetados, eles podem ser tratados separadamente. O olho a ser tratado é injetado com uma solução oftálmica.
Após o tratamento, os olhos dos pacientes serão examinados nos dias um (1), dois (2), sete (7), quinze (15), trinta (30) e sessenta (60) e todos os meses, subsequentemente, durante 2 anos. Por causa da possibilidade de recorrência, os pacientes devem retornar para exames periódicos em uma base mensal. Em cada dia de análise, o paciente é monitorado para liquefação vítrea. Além disso, os pacientes são monitorados para destacamentos vítreos posterior utilizando oftalmoscopia indireta com depressão escleral. Finalmente, a extensão da DMRI apresentada pelo paciente é continuamente monitorada através de exames periódicos da retina, de tomografia de coerência óptica e angiografia com fluoresceína para monitorar a presença de fluido subretinal, sangue, exudatos, descolamento do EPR, alterações do cístico de retina, ou a presença de membrana neovascular subretinal verde acinzentado. Tratamentos adicionais podem ser necessários se indícios de recorrência de neovascularização são observados. Tratamentos adicionais podem ser dados em base semanal ou mensal. Numa modalidade preferida, um tratamento inicial é seguido por tratamentos subsequentes entre 1 a 6 meses de intervalo.
As análises de eficácia são realizadas com base na intenção de tratar entre todos os pacientes com a utilização de um método de última observação prorrogado para os dados em falta. Para todos os pares de comparações, o modelo estatístico é ajustado para pontuação para a acuidade visual (com menos de 55 letras versus b 55 letras) e subtipo de neovascularização de coróide (minimamente clássico versus oculto com nenhuma doença clássica). Entre grupos de comparações de pontos finais dicotômicos são realizados com o uso do teste qui-quadrado de Cochran. Alterações a partir da referência de acuidade visual são analisadas com o uso de modelos de análise de variância.
Para os pontos finais para as características da lesão, modelos de análise de covariância de ajuste para o valor de referência são usados. O procedimento de múltipla comparação de Hochberg-Bonferroni é utilizado para ajustar para as comparações dos dois pares de tratamento para o ponto final primário. As análises de segurança incluem todos os pacientes tratados.
Segundo estudo Pacientes manifestando degeneração macular relacionada à idade são tratados de acordo com métodos de primeiro estudo (ver acima) com uma injeção intravítrea de (1) anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado individualmente, (2) ranibizumab individualmente, (3) anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado em combinação com ranibizumab na mesma composição ou composições diferentes ou (4) anticorpo de controle para reduzir ou evitar o desenvolvimento de neovascularização, doença macular e danos na retina.
Conclusão Anticorpos antiendoglina humanizado/desimunizado será uma terapia bem tolerada para pacientes com DMRI. Este ensaio clínico demonstra que terapia do anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado tem o potencial para manter ou melhorar a acuidade visual e reduzir neovascularização de coróide em pacientes com DMRI. Além disso, anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado irá demonstrar a atividade superior em comparação com ranibizumab e com a combinação de terapia de anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado e ranibizumab e irá demonstrar o aumento da atividade contra um anticorpo individualmente. EXEMPLO 25 Toxicologia sistêmica em macacos cynomolgus Macacos Cynomolgus são utilizados em um estudo para a toxicologia sistêmica de anticorpos antiendoglina humanizado/desimunizado.
Resumidamente, os macacos são medicados semanalmente durante três semanas com 10,0 mg/kg, 30,0 mg/kg ou 100,0 mg/kg de anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado. Animais são medicados com placebo no mesmo cronograma com uma solução adequada, na ausência de anticorpo. As doses são administradas via intravenosa em bolus durante 30 a 60 minutos e, pelo menos, seis animais são medicados em cada nível de dose.
Toxicologia é avaliada através de uma ou mais das seguintes indicações: medições de peso corporal, medidas fisiológicas básicas clínicas, química soro serial, avaliações hematológicas e avaliações histopatológicas. EXEMPLO 26 Toxicologia sistêmica em combinação com bevacizumab em macacos Cynomolgus Macacos Cynomolgus são utilizados em um estudo para a toxicologia sistêmica de anticorpos antiendoglina humanizado/desimunizado em combinação com o ranibizumab (LUCENTIS®).
Resumidamente, os macacos são medicados semanalmente durante três semanas com 10,0 mg/kg, 30,0 mg/kg ou 100,0 mg/kg do anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado em combinação com cerca de 10 mg/kg para 100 mg/kg de bevacizumab. Outros animais receberam anticorpos antiendoglina humanizado/desimunizado ou bevacizumab individualmente. Animais são medicados com placebo no mesmo esquema, com uma solução adequada, na ausência de anticorpo. As doses são administradas por via intravenosa em bolus por mais de 30 a 60 minutos e, pelo menos, seis animais são medicados em cada nível de dose. A toxicologia é avaliada através de uma ou mais das seguintes indicações: medições de peso corporal, medidas fisiológicas básicas clínicas, química soro serial, avaliações hematológicas e avaliações histopatológicas. EXEMPLO 27 Estudo de Toxicologia Regional em macacos Cynomolgus Macacos Cynomolgus são utilizados em um estudo para a toxicologia regional de anticorpos antiendoglina humanizado/desimunizado.
Resumidamente, os macacos são medicados por injeção intravítrea semanal durante seis semanas com 0,25, 1,25 e 2,5 mg de anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado. Animais são medicados com placebo no mesmo cronograma com uma solução adequada, na ausência de anticorpo. As doses são administradas como injeções intravítreas e pelo menos seis animais são medicados em cada nível de dose. A toxicologia é avaliada através de uma ou mais das seguintes indicações: medições de peso corporal, medidas fisiológicas básicas clínicas, química soro serial, avaliações hematológicas e avaliações histopatológicas.
Estudo de toxicologia de combinação regional Macacos Cynomolgus são utilizados em um estudo para a toxicologia de anticorpos antiendoglina humanizado/desimunizado em combinação com o ranibizumab (LUCENTIS®) quando administrado por injeção intravítrea.
Resumidamente, os macacos são medicados por injeção intravítrea semanal durante seis semanas com 0,25, 1,25 e 2,5 mg de anticorpos antiendoglina humanizado/desimunizado e 0,5 mg de ranibizumab (LUCENTIS®).
Outros animais recebem um anticorpo sindividualmente, com a mesma dose e cronograma. Placebo em animais é dosado no mesmo cronograma com uma solução adequada na ausência de anticorpo. As doses são administradas como injeções intravítreas e pelo menos seis animais são dosados para cada dose. Toxicologia é avaliada através de uma ou mais das seguintes indicações: medidas de peso corporal, medidas fisiológicas básicas clínicas, química de soro de série, avaliações hematológicas e avaliações histopatológicas. EXEMPLO 28 Ensaios de germinação Angiogênese pode ser testada em um modelo tridimensional in vitro de germinação. HUVECs são isolados a partir de cordões umbilicais e cultivadas em M199 suplementado com 10% de soro de bovino fetal (SBF) (GIBCO, Carlsbad, CA) e suplemento de crescimento de células endoteliais (SCCE) (BD Biosciences,Bedford, MA) a 3°C e 5% de CO2, a parte 2 a 4 de HUVEC são utilizadas para todas as experiências (a parte 0 sendo a cultura primária). Fibroblastos de pulmão (FP) são rotineiramente cultivados em DMEM (GIBCO, Carlsbad,CA) suplementado com 10% de FBS a 37°C e 5% de CO2 e usado entre P10 e P15. Outras linhas de fibroblastos, obteníveis a partir de ATCC, podem também ser utilizadas.
Preparando as células HUVEC e fibroblastos são expandidos em 10% de M199 de FBS/Pen-Strep (1: 100) em 1 a 2 dias antes da aplicação. Para HUVEC, o meio é mudado para EGM-2 (Clonetics, Walkersville, MD) um dia antes da aplicação. Para fibroblastos, o meio é mudado para EGM-2 no dia anterior a incorporação. A contagem requer aproximadamente 400 HUVEC por grânulo. Os fibroblastos são utilizados em 20.000 células por cavidade para uma placa de 24 cavidades. Placas de noventa e seis cavidades podem também ser usadas com quantidades dimensionadas em conformidade.
Preparação do grânulo Cytodex 3 Grânulos microcarreadores Cytodex 3, por exemplo, podem ser usados no ensaio (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Grânulos secos (0,5 g) são hidratados e inchados em 50 ml de PBS (pH = 7,4) durante pelo menos 3 horas à temperatura ambiente (TA) em um tubo de 50 ml e colocados sobre um balancim.
Os grânulos são deixadas assentar (cerca de 15 min). O sobrenadante é descartado e os grânulos são lavados durante alguns minutos em PBS fresco (50 ml). O PBS lavado é descartado e substituído com PBS fresco: A suspensão de grânulos é colocada num frasco de vidro siliconado (a partir de limpador de para brisas, por exemplo, ou Sigrnacote). Os grânulos são esterilizados por autoclave durante 15 min a 115°C e depois armazenados a 4°C.
Reagentes Solução de fibrinogênio Uma solução de fibrinogênio é feita por dissolução de 2 mg/ml de fibrinogênio em DPBS em banho-maria a 37°C. A solução é então misturada invertendo o tubo, em vez de vórtex. A percentagem de proteína de coagulação pode ser determinada e ajustada em conformidade. A solução é então passada através de um filtro de 0,22pm para esterilizar.
Aprotinina Aprotinina liofilizada pode ser reconstituída a 4U/ml em água Dl e esterilizada por filtração. Alíquotas de 1ml cada são feitas e armazenadas a -20°C.
Trombina A trombina é reconstituída em água estéril a 50 U/ml. Alíquotas de 0,5 ml são feitas e armazenadas a -20°C.
Revestimento dos grânulos com HUVEC (dia 1) Células HUVEC são tripsinizadas. Grânulos são deixados assentar (não centrifugar), o sobrenadante é aspirado, e os grânulos são brevemente lavados em 1 ml em meio EGM-2 quente. Grânulos (2500) são misturados com 1x106 de HUVEC em 1,5 ml de meio EGM-2 quente em um tubo de FACS e colocado verticalmente na incubadora. (Este será o suficiente para cerca de 10 cavidades; escalar se necessário). A mistura é incubada durante 4 horas a 37°C, invertendo e misturando o tubo a cada 20 min. (grânulos devem ser semelhantes a bolas de mini-golfe após granulação que indica revestimento suficiente para germinação).
Após 4 horas, os grânulos revestidos são transferidos para um frasco de cultura de tecido T25 (Falcon, Bedford, MA) e incubados durante a noite em 5 ml de meio EGM-2 a 37°C e 5% de CO2.
Incorporação de grânulos revestidos em gel de fibrina (dia 0) Uma solução de fibrinogênio 2,0 mg/ml é preparada como descrito acima e 0,15 Unidades/ml de aprotinina são adicionados à solução de fibrinogênio.
Grânulos revestidos são transferidos para um tubo cônico de 15 ml e os grânulos são deixados assentar.
Grânulos são ressuspensos em 1 ml de meio EGM-2 e transferidos para um tubo de centrífuga de 1,5 ml. Os grânulos são lavados três vezes com 1 ml de meio EGM-2, misturando por pipetagem para cima e para baixo lentamente com uma pipeta P1000. Os grânulos são contados em uma lamela e ressuspensos em uma solução de fibrinogênio a uma concentração de 500 grânulos/ml.
Trombina (0,625 Unidades/ml) é adicionada a cada cavidade de uma placa de 24 cavidades. O fibrinogênio/suspensão de grânulos (0,5 ml) a cada cavidade mudando a ponta da pipeta para cada cavidade. A trombina e o fibrinogênio/grânulos são misturados pipetando para cima e para baixo suavemente cerca de quatro a cinco vezes; evitando a criação de bolhas no gel de fibrina. A amostra de controle são tratadas na ausência de anticorpos ou um ou mais anticorpos de controle. As amostras de teste são tratadas com anticorpos antiendoglina por si só, anticorpos anti-VEGF individualmente, ou uma combinação dos mesmos. Múltiplas concentrações de agentes podem ser testadas. A solução de fibrinogênio/grânulo é deixada coagular durante 5 minutos à temperatura ambiente e depois a 37°C e 5% de CO2 durante 15 min. É importante que a placa não seja perturbada durante os 5 min antes de coagulação para minimizar o cisalhamento de fibrina, o que pode resultar na reduzida germinação. EGM-2 (1ml) é adicionado a cada cavidade de maneira gota a gota. Fibroblastos de pulmão são semeados no topo do coágulo, a uma concentração de 20.000 células/cavidade. Substitue-se o meio de cultura com meio fresco de EGM-2 em dias alternados até que o crescimento desejado seja alcançado.
Quando o gel de fibrina é formado, pequenas bolhas podem estar presentes no gel, elas irão desaparecer em 3 a 4 dias. A germinação deve ser aparente entre o dia 2 e 4. A formação de lúmen começa por volta de 4 dias a 5 e brotos continuam a alongar. Tubos recém-formados começam a ramificar por volta do dia 4 a 6. Nos dias 6 a 7, as estruturas semelhantes a microvasos começam a anastomosar com tubos adjacentes, aumentando o número de grânulos por cavidade resultando em anastomose previamente. A distância de germinação é medida por técnicas convencionais. EXEMPLO 29 Imunocitoquímica de brotos Angiogênicos in Vitro Para coloração de núcleos de células endoteliais (CE), géis de fibrina são lavadas duas vezes com 1 X PBS e então fixados durante a noite em paraformaldeído a 2%. Após duas lavagens com mais 1 X PBS, em seguida, os géis são corados com 4',6-diamidine-2-fenilindol (DAPI) (Sigma, St. Louis, MO).
Por imunomarcação, fibroblastos de pulmão (FP) são primeiro removidos através de um tratamento breve dos géis com 10X tripsina. A digestão é parada com soro logo que todos os fibroblastos são removidos. Os géis são, em seguida, lavados extensivamente com HBSS, 1X (Cellgro, Herndon, VA). As culturas são então fixadas durante 10 minutos em 10% formalina e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 durante 5 minutos. A ligação não específica é bloqueada com uma solução de BSA a 5% em PBS durante 2 horas.
Anticorpos primários são utilizados a uma diluição 1/100 em tampão de bloqueio e incubadas durante a noite a 4°C. Após lavagem extensiva, o anticorpo ligado é detectado por espécies específicas Alexa Fluor 488-conjugado ou Alexa Fluor 568-anticorpos secundários conjugados a uma diluição 1/1000 (Molecular Probes, Carlsbad, CA). Isotipos específicos de anticorpos não ligantes são utilizados como controle. Se alto fundo ocorre, a concentração do anticorpo primário ou secundário pode ser reduzida e, se necessário, incubação e/ou tempos de lavagem pode ser aumentados. F-actina é corada com TRITC-faloidina (Sigma, St. Louis, MO) a uma concentração de 0,2 μΜ.
Contraste de fase e imagens fluorescentes são capturados em um microscópio Olympus IX70 acoplado com uma câmera digital. Pilhas de imagens fluorescentes de série Z são capturadas em um de dois fótons de microscópio Carl Zeiss Microlmaging LSM Meta 510 e compilados em renderizações tridimensionais com software Metamorph (Universal Imaging Corporation, Downingtown PA). Assim, a expressão de vários marcadores pode ser facilmente detectada.
Pilhas de imagens ópticas fluorescentes ao longo do eixo z das culturas podem ser capturadas para criar representações em 3D dos vasos. Os núcleos são marcados pelo DAPI (verde), e paredes do vaso são manchadas com vimentina (laranja). Amplamente, lumens ocos são claramente visíveis, cercado por uma única camada de células endoteliais. Estas imagens confirmam que os lúmens presentes no ensaio ín vitro são fendas intercelulares e não intracelular como é visto frequentemente em ensaios Matrigel. Além disso, pode ser confirmado que as HUVECs são polarizadas, em que eles têm uma membrana apical, de frente para o lúmen, e uma membrana basal, diferente a uma membrana baseada em colágeno IV-rico e o gel de fibrina. EXEMPLO 30 Supressão da neovascularização coroidal em macacos Cynomolgus O efeito das composições aqui descritas em neovascularização coroidal induzida por laser é avaliado em macacos cynomolgus adultos.
Nesta experiência, (1) anticorpos antiendoglina humanizado/desimunizado sozinhos, (2) anticorpo anti-VEGF sozinho, (3) anticorpos antiendoglina humanizado/desimunizado em combinação com anticorpo anti-VEGF na mesma composição ou composições diferentes ou (4) anticorpo de controle sendo administrado por injeção intravenosa ou intravítrea. Cada animal recebe nove ou dez queimaduras a laser em cada retina, e o desenvolvimento de lesões ativas neovasculares coroidal é avaliado por angiografia fluorescente, uma vez antes do início do tratamento e 15, 20 e 29 dias pós-tratamento a laser. As composições são administradas por via intravenosa uma vez por semana, começando uma semana antes da lesão a laser. Injeções intravítreas são feitas uma vez a cada duas semanas começando uma semana antes do laser, ou uma vez, duas semanas após o laser, momento em que as lesões ativas NVC já foram formadas. Os animais de controle recebem semanalmente injeções intravenosas ou quinzenalmente intravítrea de placebo, começando uma semana antes do laser.
Lesões NVC são visualizadas pela angiografia fluorescente e classificados de acordo com procedimentos padrões. EXEMPLO 31 A inibição da Neovascularização da Córnea Induzida por Lesão A neovascularização da corneana é induzida em camundongos machos C57BL/6 pela colocação intraestromal de 3 suturas de nylon, ou por lesão química (NaOH) e desbridamento mecânica do epitélio da córnea. Múltiplas experiências são conduzidas em que (1) anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado sozinho, (2) anticorpo anti-VEGF sozinho, (3) anticorpo antiendoglina humanizado/desimunizado em combinação com anticorpo anti-VEGF sozinho na mesma composição ou composições diferentes ou (4) anticorpo de controle é administrado por via intraperitoneal uma vez ou em múltiplos pontos de tempo imediatamente antes ou após a lesão.
O crescimento de neovasos da córnea é avaliado por uma microscopia lâmpada de fenda e avaliação histológica. A vasculatura é marcada com uma lectina de célula endotelial específica fluoresceína conjugada, e neovascularização da córnea é avaliada em montagens plana, bem como em seções transversais usando imunohistoquímica PECAM. A presença de edema da córnea é avaliada, usando microscopia com lâmpada de fenda, e a espessura da córnea é medida em seções transversais; aumentos na espessura corneana refletem a quantidade de edema. Os números de leucócitos polimofornucleares (PMN) e macrófagos são determinados por coloração das seções transversais com HEMA-3 ou anticorpo monoclonal anti-camundongo de camundongo F4/80, respectivamente. EXEMPLO 32 Identificação de epitopos de células T em anticorpo anti-endoglina humanizado Sequências de regiões variáveis humanizadas foram testadas por análise de iTopeTM. Sequências da região variável humanizada foram divididas em sobreposição de 9 a 15mer peptídeos. As sequências da região variável foram analisadas para alta afinidade de ligação promíscua para MHC humana de classe II (epítopos de células T potenciais) utilizando iTopeTM, uma ferramenta analítica in silico que determina a afinidade de peptídeos para MHC de classe II por análise computacional. Sequências com as frequências mais baixas de epítopos de células T potenciais a partir da análise iTopeTM são identificadas como direcionadores para geração de um anticorpo humanizado. As sequências da região variável humanizada podem redesenhar através da inclusão de mutações de modo a remover os epítopos de células T potenciais. Mutações são projetadas usando a iTopeTM para reduzir ou eliminar MHC de classe II de ligação. Alternativamente, gérmen de linha de sequências humanas pode ser substituído em locais de epítopos de células T potenciais ou sequências alternativas podem ser substituídas.
Figuras 19-23 apresentam a ligação predita de peptídeos 9mer para o anticorpo antiendoglina humanizado contendo a cadeia leve HuVK_v0 e a cadeia pesada HuVH_v0, observado na Figura 4. EXEMPLO 33 Projeto de anticorpos humanizados/desimunizados Anti- CD105 Este exemplo descreve a concepção de anticorpos terapêuticos monoclonais humanizados/desimunizado alvejando CD105 humanos que exibem imunogenicidade reduzida. A promíscua alta afinidade do MHC classe II ligando sequências identificadas utilizando iTopeTM (ver Exemplo 31) foi ainda analisada por iTopeTM a fim de identificar as substituições de aminoácidos em posições de bolsa na chave de MHC de classe II que reduzem ou eliminam peptídeo ligando ao MHC de classe II. Uma vez em que todas as sequências CDRs sobrepostas, foram consideradas alterações do local de CDR (resíduos de antígeno de contatos potenciais) e as características físico-químicas dos aminoácidos original e substituído. Resíduos de contato de TCR e resíduos fora do principal sulco de ligação envolvidos na estabilização de peptídeos/MHC de classe II -interações TCR foram também considerados para substituição.
Em VHVl, um peptídeo de 9mer estando completamente dentro de CDR2 e começando no resíduo 51 foi identificado como uma elevada afinidade promíscua MHC de classe II ligando o peptídeo. O mais bem sucedido método para a eliminação de MHC de classe II de ligação é para atingir o primeiro aminoácido de 9-mer (a posição de bolsa 1 ou p1) onde a remoção da cadeia lateral hidrofóbica ou de substituição com uma cadeia lateral hidrofílica elimina a ligação MHC classe II. No entanto, este tipo de substituição do radical aminoácido pode não ser sempre bem sucedida em manter a afinidade do anticorpo, portanto, posições de bolsa secundárias (p4, P7, p6 ou p9) , sozinhas ou em combinação, foram também avaliadas. Análise iTope™ revelou que a segmentação da posição p4 deste peptídeo, alterando de K52b a Q ou R é predita para reduzir significativamente a ligação de MHC de classe II, enquanto a substituição de 151 de pl com A é predita para remover ligação inteiramente (Tabela 5).
Tabela 5 Tabela 5: Análise do efeito de substituições na região imunogênica de VHV1 usando iTope™. 0 núcleo do peptídeo de 9mer é sublinhado na coluna "sequência" e as substituições são destacadas em negrito. Resíduos flanqueadores não estão sublinhados. A previsão da ligação de cada núcleo de peptídeo de 9mer para cada alelo de MHC de classe II é indicada por "0" se o resultado de ligação foi 0,55 a 0,6 e "X" se o resultado de ligação foi >0,6. Os números de alelos de MHC de classe II preditos para ligar são mostrados nas colunas "total" e "alta afinidade".
Tabela 5 divulga SEQ ID NOS 106 a 109, respectivamente, por ordem de aparecimento.
Estruturas cristalinas de complexos anticorpo/antígeno sugerem que I51 pode com pouca frequência estar em contato com o antígeno, no entanto, uma mudança de radical de I a A (uma substituição para interromper uma posição âncora p1) nesta posição poderia afetar a conformação global do CDR. Portanto, alterações relativamente conservadoras em K52b (posição âncora p4) também foram incluídas uma vez que este resíduo é exposto a solvente, mas não pode entrar em contato com antígeno. Finalmente, as mutações adicionais fora da CDR foram também concebidas (G49 para A ou S) para avaliar o efeito desestabilizador sobre interações do peptídeo/MHC de classe II/TCR. A Tabela 6 relaciona regiões VH variantes humanizadas e humanizadas/desimunizadas que foram construídas; as SEQ ID NOS para as sequências de nucleotídeos correspondentes e sequências de aminoácidos estão indicadas ao lado das construções.
Tabela 6 Dois MHC de classe II promíscuas de alta afinidade ligando peptídeos foram identificadas em VKV2 e VKV1. O primeiro, com uma âncora p1 em V19, sobrepõe parcialmente CDR1 e o segundo, com uma âncora p1 na I48, sobrepõe CDR2. Ambas as âncoras p1 estão fora dos CDRs e foram alvejados por mutação a A, o que pode remover completamente a ligação de MHC de classe II (Tabela 7) . No entanto, ambos estes resíduos podem estar envolvidos na manutenção das conformações de CDRs 1 e 2 e, portanto, mutações adicionais foram designadas reduziram significativamente a ligação MHC de classe II (Tabela 7). Em ambos os casos, resíduos p4 foram alvo por mutação de T para S. T22S também se encontra fora da CDR e é menos suscetível de afetar a conformação de CDR em comparação V19A. T51 está dentro CDR2; no entanto, evidências de estruturas cristalinas de anticorpos complexados com antígeno sugere que este resíduo raramente constata o antígeno. A Tabela 6 lista as regiões VK humanizadas e humanizadas/desimunizadas que foram construídas.
Tabela 7: A análise do efeito de substituições nas regiões imunogênicas de VKV2 ou VKV1 usando iTope™. 0 núcleo de peptídeo de 9mer é sublinhado na coluna "sequência" e as substituições são destacadas em negrito. Resíduos flanqueadores não estão sublinhados. A ligação predita de cada núcleo de peptídeo 9mer para cada alelo de MHC de classe II é indicada por "0" se o resultado de ligação foi de 0,55 a 0,6 e "X" se o resultado de ligação foi >0,6. Os números de alelos de MHC de classe II preditos para ligação são mostrados nas colunas "total" e "alta afinidade". Tabela 7 divulga SEQ ID NOS 110 a 115, respectivamente, em ordem de aparecimento. EXEMPLO 34 Este exemplo descreve um método de triagem de anticorpos antiendoglina para epítopos de células T. A interação entre MHC, polipeptídeo e o receptor de células de T (TCR) fornece a base estrutural para o antígeno específico de reconhecimento de células T. Ensaios de proliferação de células T testa a ligação de polipeptídeos processados a partir de anticorpos com MHC e o reconhecimento de MHC/complexos polipeptídeos pelo TCR. Ensaios de proliferação de células T in vitro do presente exemplo, envolve a estimulação de células mononucleares do sangue periférico (CMSPs), contendo as células que apresentam antígeno (APCs) e células T. A estimulação é realizada in vitro, utilizando anticorpos antiendoglina intactos. Proliferação de célula T estimulada é medida usando 3H-timidina (3H-Thy) e a presença de 3H-Thy incorporada é avaliada através da contagem de cintilação de células lavadas fixadas.
Todos os genes das regiões VH e VK humanizadas e humanizadas/desimunizadas foram sintetizados utilizando uma série de oligonucletídeos sobrepostos que foram recozidos, ligados e amplificados por PCR para dar regiões sintéticas de comprimento completo V. As variantes montadas foram então clonadas diretamente no sistema de expressão de vetor Antitope Ltd.'s pANT para cadeias pesadas IgG1 e leves kappa.
Purificação dos Anticorpos Anticorpos antiendoglina foram purificados a partir dos sobrenadantes de culturas de mamíferos por cromatografia da proteína A. Troca de tampão e a concentração de proteína foi feita usando PBS pH=7,4. Anticorpo antiendoglina foi ainda purificado por cromatografia de exclusão de tamanho utilizando uma coluna Sephacryl S200 (GE Healthcare, Amersham, UK). O pico principal é recolhido, esterilizado por filtração e demonstrado que têm níveis de endotoxina <5 UE/mg usando um Endosafe-PTS (Charles River, Margate, UK). Os anticorpos purificados são armazenados a 4°C. As concentrações finais foram determinadas por absorção de UV utilizando coeficientes de extinção molar calculados, onde A280 1,0=1,62 mg/mL. Cada anticorpo foi então diluído para 100ug/mL em meio de cultura AIMV.
Preparação e seleção de doador CMSP Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) são isoladas a partir de uma comunidade doadora tampão (a partir de sangue extraído dentro de 24 horas), que são obtidos a partir do Serviço Nacional de Transfusão de Sangue do Reino Unido (Hospital de Addenbrooke, em Cambridge, UK) de acordo com a aprovação concedida pelo Hospital Local de Ética em Pesquisa Addenbrooke. CMSP são isoladas a partir de tampão por centrifugação de densidade Lymphoprep (Axis-Shield, Dundee, Escócia) e células CD8+T são esgotadas usando CD8+RossetteSepTM (StemCell Technologies, Inc.). Os doadores são caracterizados pela identificação haplótipos HLA-DR utilizando um tipo de kit Biotest HLA SSP-PCR (Biotest, Landsteinerstrape, Dinamarca). As respostas das células T a um antígeno de controle, “Keyhole Limpet Haemocyanin” (KLH) (Pierce, Rockford, IL, EUA) são determinadas para um controle positivo. CMSP foram então congeladas e armazenadas em nitrogênio líquido até serem necessárias. Quando necessárias para o uso, as células são descongeladas rapidamente em um banho de água a 37°C antes de transferir para 10 ml de meio AIM V pré-aquecido.
Um grupo de 20 doadores é selecionado para melhor representar o número e a frequência de alótipos HLA-DR expressados na população mundial. Análise dos alótipos expressados no grupo contra aqueles expressos na população mundial revelou que a cobertura >80% é alcançada e que todos os principais alelos HLA-DR (alótipos individuais com uma frequência >5%, expressos na população mundial) estão bem representados. Um resumo de haplótipos doadores é fornecido na Figura 23, e uma comparação da frequência de alótipos doadores utilizada no estudo versus aqueles presentes em população mundial é feita. CMSPs de cada doador são descongeladas, contadas e a viabilidade avaliada. As células foram revividas e ressuspensas em meio de cultura AIMV para 4 a 6x106 CMSP/mL. Para cada doador, o volume culturas foi estabelecido em que um total de 1mL de linhagem de proliferação celular foi adicionada a uma placa de 24 cavidades. Um total de 1mL de cada amostra de diluída de teste foi adicionada à CMSP para dar uma concentração final de 50 ug/mL por amostra de anticorpo. Para cada doador, um controle positivo (células incubadas com 100 qg/mL de KLH) e um controle negativo (células incubadas com meio de cultura apenas) foram também incluídos. Para os primeiros 4 doadores, um controle adicional foi incluído para testar a modulação de respostas de células T pelas amostras de teste, onde a amostra de teste e KLH foram adicionados à CMSP. Comparação destas amostras com KLH por si só pode ser usado para avaliar os efeitos das amostras de ensaio sobre a proliferação. As culturas foram incubadas durante um total de 8 dias a 37 graus Celsius, com dióxido de carbono a 5%. Nos dias 5, 6, 7 e 8, as células em cada cavidade são suavemente ressuspensas e três alíquotas de 100 pL são transferidas para cavidades individuais de uma placa de fundo redondo com 96 cavidades. As culturas são pulsadas com 1pCi 3[H]-Thy (Perkin Elmer, Waltham, MA) em 100uL de meio de cultura AIMV e incubadas durante mais 18 horas antes da colheita para elemento filtrante utilizando um colhedor de células TomTec Mach III. Contagens por minuto (cpm) para cada cavidade são determinadas por contagem de cintilação MeltilexTM(Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, EUA) em um contador de microplaca Beta (Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, EUA) em paralux, modo de contagem de fundo baixo.
Os resultados são expressos como índices de estimulação, onde o índice de estimulação (IE) é derivado por divisão da pontuação de proliferação (contagens por minuto, por exemplo, de radioatividade), medida no anticorpo antiendoglina de teste pela pontuação medida em células que não estão em contato com um anticorpo antiendoglina de teste. Todo o cpm basal para as cavidades de controle estão acima do limite mínimo para doseamento de 150 cpm.
Para ensaios de proliferação, um limiar empírico de um índice de estimulação (IE) igual ou maior do que 2 (IE>2) foi previamente estabelecido através do qual as amostras induzem respostas proliferativas que acima deste limiar são considerados positivos (onde incluiu, fronteira de IEsk1,90 são destaque). Desenvolvimento do ensaio extensivo e estudos anteriores mostraram que este é o sinal mínimo de limite de ruído, permitindo o máximo de sensibilidade sem detectar grandes números de falsas respostas positivas. Respostas positivas são definidas pela seguinte estatística e limites empíricos: 1. Significância (p<0,05) da resposta pela comparação de cpm de cavidades de teste contra o meio de cavidades de controle utilizando duas amostra não pareadas do teste t- de Student. 2. Índice de estimulação maior do que 2 (IE> 2), onde IE= meio de cavidades de teste (cpm)/meio de cavidades de controle (cpm).
Além disso, a variação intra-ensaio é avaliada por cálculo do coeficiente de variância e desvio padrão (DP) dos dados brutos de culturas idênticas.
Resultados para ensaio de proliferação do curso de tempo EpiScreen com o anticorpo antiendoglina são mostrados na Figura 24 e resumidos na forma de quadro (Quadro 8). O anticorpo quimérico estimulou respostas em 4 de 20 doadores (20% do grupo estudo) e, embora duas das respostas dos doadores fossem limítrofes (1,92 e 1,95 para os doadores 11 e 17, respectivamente), foram significativamente diferente do histórico (p<0,05). O anticorpo humanizado VK1VH1 estimulou respostas em 2 de 20 doadores (10% do estudo de grupo), incluindo uma resposta limítrofe (1,91 para doador 20) que foi significativamente diferente do histórico (p<0,05). É de notar que doadores 11 e 20 responderam a ambos estes anticorpos sugerindo que poderia haver um epítopo de célula T partilhada. Em contraste, nenhum dos doadores no grupo de estudo respondeu positivamente ao anticorpo antiendoglina desimunizado VK1AA VH1A2. Os resultados com o antígeno de controle KLH mostraram que houve uma boa correlação entre os resultados positivos e negativos, indicando um elevado nível de reprodutibilidade no ensaio.
Tabela 8. As células T de estimulação, como uma medida de imunogenicidade, a cultura induzida com anticorpos antiendoglina e KLH, onde "P*" indica fronteira de estimulação acima do normal e "P" indica um índice de estimulação superior a 2. EXEMPLO 35 Mapeamento de epitopo de célula T EpiScreen™ EpiScreen™ é uma tecnologia ex vivo para a medição de epítopos de células T, em todo anticorpo ou para mapear a localização da sequência de epítopos de células T tais como descrito em mais detalhes abaixo.
Seleção do doador EpiScreen Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) são isoladas a partir de comunidade saudável doadora tampão (a partir de sangue extraído dentro de 24 horas), que são obtidos a partir do Serviço Nacional de Transfusão de Sangue do Reino Unido (Hospital de Addenbrooke, em Cambridge, UK) de acordo com a aprovação concedida pelo Hospital Local de Ética em Pesquisa Addenbrooke. CMSP são isoladas a partir de tampão por centrifugação de densidade Lymphoprep (Axis-Shield, Dundee, Escócia) e células T CD8 + são esgotadas usando CD8 + RossetteSepTM (StemCell Technologies, Inc.). Os doadores são caracterizados pela identificação haplótipos HLA-DR utilizando um tipo de kit Biotest HLA SSP-PCR (Biotest, Landsteinerstrape, Dinamarca). As respostas das células T a um antígeno de controle, Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH) (Pierce, Rockford, IL, EUA) são determinadas para um controle positivo. O grupo de 54 doadores é selecionado para representar melhor o número e frequência de alótipos HLA-DR expressa na população mundial. Análise dos alótipos expressa no grupo contra aquelas expressas na população mundial revelou que a cobertura >80% é alcançadq e que todos os principais alelos HLA-DR (alótipos individuais com uma frequência >5%, expresso em toda a população mundial) estão bem representados. Um resumo de haplótipos doadores é fornecido, e uma comparação com as frequências de alotipos doadores utilizados no estudo versus aqueles presentes na população mundial é feita.
Detalhes de doadores e haplótipos. Respostas dos doadores (IE) para KLH são testadas em dois experimentos independentes. Teste 1 é executado em CMSP recentemente isoladas e um anticorpo é o re-teste no estudo atual. As respostas que não produzem o mesmo resultado (isto é, positivo ou negativo) em ambos os testes são destacadas. Doadores com muito baixo cpm basal (<150cpm) são excluídos da análise.
Análise EpiScreen: ensaios de proliferação EpiScreen™ é usado para testar os peptídeos sobrepostos derivados da sequência de anticorpos quiméricos, humanizados e humanizados/desimunizados. Peptídeos sobrepostos são projetados. Uma série de peptídeos de 128 x 15 meros sobrepostos por 12 aminoácidos são sintetizados em conjunto com 1 x 14 meros e 1 x 11 meros utilizados para estimular as células mononucleares do sangue periférico (CMSP) derivadas de um grupo de 51 doadores saudáveis, utilizando mapeamento EpiScreen™ de epítopos de célula T. Peptídeos individuais são testados em replicadas culturas e as respostas são avaliadas utilizando ensaios de proliferação de células T para identificar a localização precisa de epítopos. CMSP de cada doador são descongeladas, contadas e avaliadas para viabilidade. As células são revividas em meio de cultura AIM V à temperatura ambiente (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) antes de ajustar a densidade celular para 2.5xl06 CMSP/ml (linhagem de proliferação de células).Os peptídeos são dissolvidos em DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) para uma concentração final de 10 mM. Estoques de cultura de peptídeos são então preparados por diluição em meio de cultura AIM V a uma concentração final de 5 μΜ. Para cada peptídeo e cada doador, culturas seis vezes duplicadas são estabelecidas por adição de 100 μΐ da linhagem de cultura de peptídeos para 100 μΐ de linhagem de proliferação celular em uma placa de fundo plano de 96 cavidades. Culturas de controle positivas e negativas também são estabelecidas em hexaplicata. Um total de 9 x 96 placas de cavidades são utilizadas para cada doador, e cada placa é suficiente para testar 15 peptídeos com um controle negativo (carreador individual) seis vezes duplicado. Na placa final, um controle positivo é adicionado.
As culturas são incubadas durante um total de 6 dias antes de se adicionar 0,5 MCi 3[ H]-Timidina (Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, EUA) a cada cavidade. As culturas são incubadas durante mais de 18 horas antes da colheita para elemento filtrante utilizando um TomTec Mach III de colheita de células. Contagens por minuto (cpm) para cada cavidade são determinadas por Meltilex™ (Perkin Elmer □, Waltham, Massachusetts, EUA) em um Contador de Microplaca Beta (Perkin Elmer™, Waltham, Massachusetts, EUA) em paralux, modo de contagem de fundo baixo.
Para ensaios de proliferação, um limiar empírico de um índice de estimulação (IE) igual ou maior do que 2 (IEÚ2), foi previamente estabelecido através do qual as amostras induzem respostas proliferativas que acima deste limiar são consideradas positivas (onde incluídas, fronteiras com IEsbl,90 são destacadas). O desenvolvimento do ensaio extensivo e estudos anteriores mostraram que este é o sinal mínimo de limite de ruído, permitindo o máximo de sensibilidade sem detectar grandes números de falsas respostas positivas. Respostas positivas são definidas pela seguinte estatística e limites empíricos: 1. Significância (p<0,05) da resposta pela comparação cpm de cavidades de teste contra o meio de cavidades de controle utilizando duas amostra não pareadas do teste t de Student. 2. Índice de estimulação maior do que 2 (IE> 2), onde IE= meio de cavidades de teste (cpm)/meio de cavidades de controle (cpm).
Além disso, a variação intra-ensaio é avaliada por cálculo do coeficiente de variância e desvio padrão (DP) dos dados brutos de culturas idênticas.
Ensaios de proliferação são criados em culturas duplicadas seis vezes (“Dados não ajustados”). Para assegurar que a variabilidade intra-ensaio seja baixa, os dados são também analisados após a remoção dos valores máximo e mínimo de cpm (“dados ajustados”) e o IE de respostas dos doadores são comparados usando ambos os dados conjuntos. Detalhes do IEs dos doadores a partir de ambos os conjuntos de dados tanto ajustados e não ajustados são preparados. Epítopos de células T são identificados através do cálculo da frequência média das respostas a todos os peptídeos no estudo +2 x SD (histórico de taxa de resposta). Qualquer peptídeo(s) que induz a proliferação acima deste limiar é considerado contendo um epítopo de célula T.
Análise de Peptídeos in Silico iTope™ As sequências de peptídeos que são positivos no ensaio de proliferação são analisados usando software preditor de antitopo ITopeTM. Este software prediz interações favoráveis entre cadeias laterais de aminoácidos e bolsas específicos de ligação de peptídeos com o sulco de ligação de MCH de classe II. A localização dos principais resíduos de ligação é determinada através da geração de peptídeos de 10-mer que são sobrepostos por um aminoácido que abrange uma sequência de peptídeo longa. Cada 10-mer é testado contra o banco de dados Antitope de alotipos MHC de classe II e baseado no seu ajuste e interações com as moléculas de MHC de classe II. Peptídeos que produziram uma pontuação elevada de ligação contra um grande número de alelos são considerados por conter o núcleo de 9mer.
Identificação de epítopos de células T
Todos os peptídeos identificados utilizando o análise EpiScreenTM descrita acima são com sucesso sintetizados para serem testados contra 51 doadores saudáveis (54 doadores são originalmente selecionados; doadores podem ser excluídos da análise devido à baixa cpm basal, isto é, abaixo do ponto de corte de valor de 150cpm). Respostas positivas são definidas pelos doadores que produziram uma resposta (p<0,05) significativa com um IE>2 a qualquer peptídeo dado. Respostas de fronteira (uma resposta (p<0,05) significativa com um IE>1,90) também estão incluídas. As saídas da análise de dados não ajustados e ajustados são comparadas para assegurar que a variabilidade intra-ensaio é baixa e que respostas positivas não são o resultado de falsa proliferação em cavidades individuais. Os resultados de cada análise mostraram pouca diferença entre os métodos, consequentemente, o mapa de epítopo de célula T é compilado utilizando a análise de dados ajustada. Índices de estimulação de doador de ambas as análises não ajustadas e ajustadas são preparados. Epítopos de célula T são identificados através do cálculo da frequência média das respostas a todos os peptídeos em estudo mais duas vezes o desvio padrão (denominado “histórica taxa de resposta”). Este é calculado para ser de 5,6% e é o equivalente para induzir uma resposta positiva em três ou mais doadores. Os peptídeos que induzem respostas proliferativas acima desse limiar são considerados por conter um epítopo de célula T.
Teste de ímunogenícídade de variantes de chumbo usando EpiScreen™ Variantes de chumbo são purificados e comparados com o polipeptídeo do tipo selvagem usando ensaios de proliferação do curso de tempo de células T EpiScreen . Um grande número de doadores saudáveis que representa a população mundial de acordo com a expressão de alotipos HLA é selecionado a partir de uma biblioteca de doador, como descrito acima. Os doadores são estimulados com cada proteína em volumes de culturas separados contendo 2 a 4x106 células T CD8+ de CMSP empobrecido. Amostras replicadas (de blastos T) são removidas dos volumes de culturas nos dias 5 a 8, a proliferação e, juntamente com a secreção de IL-2 (ELISPOT) é avaliada. Para validação adicional a avaliação entre o tipo selvagem e variantes, o grupo de estudo é complementado com doadores de resposta a partir do estudo do mapeamento de células T EpiScreenTM de epítopos (fornecido um número suficiente de células T CD8+ de CMSP empobrecido remanescente). A fim de confirmar a perda de imunogenicidade em variantes de chumbo, uma análise da imunogenicidade com ensaios de célula T por de tempo de curso EpiScreenTM é realizado como se segue: (i) tampão de doadores saudáveis, (com >80% de cobertura alotípicas DRB1 para a população mundial) são usados para isolar CMSP que contêm níveis fisiológicos de APC e células T CD4+; (ii) cada doador é testado contra os antígenos de controle positivo, incluindo keyhole limpet haemocyanin (um potente neoantígeno); (iii) as células CD8 + T estão esgotadas para excluir a detecção de resposta de MHC de classe I das células T restritas; (iv) variantes de chumbo e polipeptídeos de tipo selvagem são comparados uns contra os outros para avaliar capacidade relativa para ativar células T CD4+ de células T; (v) os dados são analisados utilizando os parâmetros de ensaio previamente validados com respostas positivas de IE>2 apoiada por informações adicionais, incluindo estatística e análise de frequência; (vi) os dados dos ensaios do tempo de curso EpiScreenTM de células T fornece informações sobre a magnitude e cinética de respostas de células T, para moléculas individuais; (vii) qualquer CMSP restante de doadores que produzem respostas positivas é arquivado e é disponível para uso em estudos de ensaio de repetição, e (VIII) é efetuada uma avaliação de associação entre alotipo doador e respostas de polipeptídeo do tipo selvagem e quaisquer respostas às ligações variantes.
Aspectos da presente invenção podem ser incorporados em outras formas ou realizados em outras formas sem se afastar do espírito ou características essenciais do mesmo. A presente divulgação é, por conseguinte, para ser considerada como em todos os aspectos ilustrados e não restritivos, e todas as alterações que vêm dentro do significado e gama de equivalência se destinam a ser abrangido aqui. EXEMPLO 36 Reatividade cruzada de anticorpos Antiendoglina Anticorpo antiendoglina tem sido demonstrado ser reativo cruzado com células endoteliais de humano e de camundongo (Matsuno et al, 1999). Anticorpos antiendoglina humanizados/desimunizados são testados quanto à sua capacidade para se ligar ao endotélio humano e murino pelo ensaio radioiumuno (ERI) de acordo com o método de Haruta et al, 1986. Resumidamente, anticorpos antiendoglina purificados são individualmente radiomarcados com 125I utilizando iodo-gen e de acordo com métodos padrões conhecidos dos versados na técnica. Os radiomarcados anticorpos antiendoglina humanizados/desimunizados são ensaiados quanto ao número médio de átomos de iodo por molécula de IgG. As contagens por minutos são comparadas pelo teste de anticorpos antiendoglina ou isotipo IgG de controle encontrados em culturas de células endoteliais humanas e de murino. A ligação das células endoteliais subconfluentes de murino e humano podem também ser demonstradas usando anticorpos antiendoglina marcados com FITC e analisados por Becton RNAkinson FACScan para a comparação da intensidade de fluorescência média de acordo com o método de Matsuno et al, 1999. A ligação do endotélio murino pode também ser demonstrada pela imagem da biodistribuição do anticorpo antiendoglina radiomarcado em camundongos portadores de tumores singênicos.
Resumidamente, os camundongos imunocompetentes são implantados com carcinomas da mama 4T1 singênicos. Os tumores são deixados crescer até o tamanho palpável e animais são tratados com anticorpo quelado a um radioisótopo, tal como 64Cu. A distribuição de anticorpo antiendoglina rotulado em grânulos de tumor BALB/c em camundongos por varredura autorradiografia ou PET é comparada com a distribuição similar de anticorpo controlado isotipo marcado. A captação tumoral de anticorpo marcado é relatada em relação à absorção de órgãos sólidos e do sangue.
REIVINDICAÇÕES

Claims (18)

1. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga à endoglina, caracterizado pelo fato de que compreende: uma região variável de cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 89, e uma região variável da cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 93, 94, 95 ou 96; uma região variável de cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 90, e uma região variável da cadeia leve possuindo uma sequência e aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 93 ou 94; ou uma região variável de cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 91, e uma região variável da cadeia leve possuindo uma sequência e aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 93 ou 94.
2. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 89, e uma região variável da cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 93.
3. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 89, e uma região variável da cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 94, 95 ou 96.
4. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação de antígeno é um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um fragmento scFv, ou polipeptídeo de ligação com cadeia única.
5. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença relacionada com a angiogênese num indivíduo.
6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato do anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo ser marcado com um rótulo terapêutico, um rótulo detectável, ou ambos.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a doença relacionada com a angiogênese é uma doença ocular caracterizada por angiogênese/neovascularização.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a doença ocular é degeneração macular.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a degeneração macular compreende degeneração macular relacionada a idade.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a doença ocular é retinopatia diabética.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a doença relacionada com a angiogênese é um câncer ou uma metástase do mesmo.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o câncer ou a metástase do mesmo é um tumor sólido.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o câncer ou a metástase do mesmo é de base epitelial.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir de um câncer de pulmão, um melanoma, um câncer de mama, um câncer no pâncreas, um câncer ovariano, um câncer uterino, um câncer colorretal, um câncer de próstata, um câncer de rim, um câncer da cabeça, um câncer de fígado, um câncer no pescoço, um sarcoma, um mieloma, um câncer cerebral, e um linfoma.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o câncer cerebral é um glioblastoma multiforme.
16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 15, caracterizado pelo fato de ser para uso em combinação com um ou mais inibidores de angiogênese.
17. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação do antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um transportador aceitável ou excipiente.
18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato da composição farmacêutica compreender ainda um ou mais inibidores de angiogênese.
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