JP5632002B2 - エンドグリン抗体 - Google Patents

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Description

本出願は、それらのすべての開示が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、２００９年９月３０日に出願された米国仮出願第６１／２４７，２９０号、並びに２０１０年３月３１日に出願された米国非仮出願第１２／７５１，９０７号の利益を主張する。
とりわけまた、ＣＤ１０５又はｅｄｇ−１としても知られるエンドグリンは、増殖しつつある血管内皮細胞において高レベルで発現する、ホモ二量体のＩ型膜糖タンパク質である（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９５、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：１６２３〜１６３４）。したがって、エンドグリンは、第１に、活性の血管新生を経つつある内皮細胞についての増殖関連マーカーである。しかし、正常組織の血管内皮細胞も、ある程度のエンドグリンを発現させる（Ｂｕｒｒｏｗｓら、前出；Ｗａｎｇら、１９９３、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５４：３６３〜３７０）。ヒトエンドグリンは、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）に特異的に結合することが知られており、エンドグリンについて推測されるアミノ酸配列は、ＴＧＦ−β受容体の一種であるβ−グリカンに対する強い相同性を示す。
エンドグリン（ＥＤＧ）は、内皮細胞及び白血病細胞における増殖関連抗原であるので、腫瘍血管系を減殺する抗体ベースの方法において標的とされている。ＥＤＧの発現は、腫瘍に関連する血管内皮において上方制御され、ＥＤＧは、血管新生に不可欠である。血管新生は、新血管形成をもたらす新たな毛細血管の形成のほか、既存の血管系の維持も包含する。血管新生は、内皮細胞を介する血管基底膜及び間質マトリックスの分解、内皮細胞の遊走、内皮細胞の増殖、並びに内皮細胞による毛細血管ループの形成を含めた、一連の逐次的段階を包含する複雑な過程である。
複数の抗エンドグリン抗体、特に、抗エンドグリンモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）については、説明されている。ｍＡｂであるＳＮ６は、ヒト白血病細胞の細胞膜の糖タンパク質混合物でマウスを免疫化することから生成された抗体である（Ｈａｒｕｔａ及びＳｅｏｎ、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：７８９８〜７９０２）。ＳＮ６は、ヒトエンドグリンを認識するマウスｍＡｂである。ｍＡｂである４４Ｇ４は、ヒト白血病プレＢ細胞の全細胞懸濁液でマウスを免疫化することから生成された抗体である（Ｇｏｕｇｏｓ及びＬｅｔａｒｔｅ、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１９２５〜１９３３；１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８３６１〜８３６４）。４４Ｇ４もまた、ヒトエンドグリンを認識するマウスｍＡｂである。ｍＡｂであるＭＪ７／１８は、炎症したマウス皮膚でラットを免疫化することから生成された抗体である（Ｇｅ及びＢｕｔｃｈｅｒ、１９９４、前出）。ＭＪ７／１８は、マウスエンドグリンを認識するｍＡｂである。ｍＡｂであるＴｅｃ−１１は、ヒト臍帯静脈内皮細胞でマウスを免疫化することから生成された抗体である（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９５、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：１６２３〜１６３４）。Ｔｅｃ−１１は、反応性がヒトエンドグリンに制約されたマウスｍＡｂである。エンドグリンに対する抗体は、血管新生を伴うか、又はこれにより影響を受ける（ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ又はａｆｆｅｃｔｅｄ）多様な疾患及び状態を治療するための療法を開発するのに重要な領域を表す。
血管新生とは、既存の血管から新たな血管が発生する生理学的過程である（Ｖａｒｎｅｒら、Ｃｅｌｌ Ａｄｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９５、３：３６７〜３７４；Ｂｌｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９９０、１０３２：８９〜１１８；Ｗｅｉｄｎｅｒら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．１９９２、８４：１８７５〜１８８７）。血管新生は、正常過程及び病理学的過程のいずれにおいても役割を果たすことが示唆されている。例えば、血管新生過程は、動物の器官及び組織の血管系の発生に関与している。これらの過程はまた、例えば、月経周期、妊娠、及び創傷治癒における一過性の血管新生期にも関与している。他方では、多くの疾患が、制御不能の血管新生に随伴することが知られている。
ある病理学的状態では、罹患組織内の細胞へと十分な血液及び栄養分を供給するための手段として、血管新生が刺激される。これらの病理学的状態の多くは、細胞増殖及び／又は細胞制御の異常を伴う。したがって、血管新生の阻害は、新たな血管の発生を特徴とする疾患を治療するための潜在的に有用な手法である。例えば、血管新生は、血管新生／新血管形成（例えば、黄斑変性、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎障害、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）、関節リウマチ、骨関節炎、並びに多様な形態のがん、充実性腫瘍、及び転移などを特徴とする多様な形態の眼疾患並びに眼以外の疾患を含めた病理学的状態に関与している。
本明細書では、エンドグリンに結合するヒト化抗体又はそれらの抗原結合断片が提供される。このようの抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける精製、検出、診断、及び治療に用いられる。本明細書ではまた、エンドグリンの１又は複数の分子種又は変異体に結合し、且つ、血管新生を阻害する、ヒト化抗体又はそれらの抗原結合断片も提供される。本明細書ではさらに、エンドグリンに結合するヒト化抗体又はそれらの抗原結合断片により、血管新生に随伴する疾患を治療する方法も提供される。
エンドグリンに結合し、本明細書で説明される、ヒト化抗体並びに抗原結合断片を用いて、黄斑変性、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、又は増殖性硝子体網膜症を治療することができる。本明細書では、本明細書で説明される抗体並びに抗原結合断片を投与することにより、黄斑変性、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、又は増殖性硝子体網膜症を治療又は予防する方法が説明される。エンドグリンに結合し、本明細書で説明される、ヒト化抗体並びに抗原結合断片はまた、血管を収縮させ、眼疾患に関連する内皮細胞の増殖を阻害し、出血の症状を消失させ、霧視を治療し、視力低下を抑制し、且つ／又は血管の漏洩を防止することも可能である。本明細書で説明されるヒト化抗体並びに抗原結合断片はまた、黄斑変性、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、又は増殖性硝子体網膜症を治療するための薬物中で用いることもできる。本明細書で説明されるヒト化抗体並びに抗原結合断片はまた、がんを治療するための薬物中で用いることもできる。
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号３として示される軽鎖可変領域とを有する抗体、又はそれらの抗原結合断片が提供される。
本明細書では、エンドグリンに結合する抗体、又はそれらの抗原結合断片であって、アミノ酸配列が配列番号３として示される軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域とを有し；前記重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換；７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換；７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換；７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換；８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）による置換；９４位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）又はグリシン（Ｇ）による置換；１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換；１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換；並びに１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み；且つ、該軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換；３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換；４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換；４６位におけるロイシン（Ｌ）のプロリン（Ｐ）による置換；４７位におけるロイシン（Ｌ）のトリプトファン（Ｗ）による置換；６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換；７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換；７１位におけるフェニルアラニン（Ｆ）のチロシン（Ｙ）による置換；１００位におけるグルタミン（Ｇ）アラニン（Ａ）による置換；並びに１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含む、該抗体、又はそれらの抗原結合断片が提供される。
本明細書では、エンドグリンに結合する抗体、又はそれらの抗原結合断片であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有し、
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号６６のＣＤＲ１、配列番号６７のＣＤＲ２、並びに配列番号６８のＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列、又は１若しくは複数の保存的置換を除き、配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１；
（ｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換を除き、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ２；
（ｉｖ）配列番号４７のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換と；
（ｂ）７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換と；
（ｃ）７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換と；
（ｄ）８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換と；
（ｅ）８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）若しくはロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｆ）９４位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）若しくはグリシン（Ｇ）による置換と
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ３；並びに
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換と；
（ｂ）１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｃ）１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換と
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号５６のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ４を含み；
且つ、前記軽鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号６３のＣＤＲ１、配列番号６４のＣＤＲ２、並びに配列番号６５のＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換と；
（ｂ）３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換と；
（ｃ）４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｄ）５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１；
（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換と；
（ｂ）４６位におけるロイシン（Ｌ）のプロリン（Ｐ）による置換と；
（ｃ）４７位におけるロイシン（Ｌ）のトリプトファン（Ｗ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ２；
（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換と；
（ｂ）７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換と；
（ｂ）７１位におけるフェニルアラニン（Ｆ）のチロシン（Ｙ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ３；並びに
（ｖ）配列番号３５のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１００位におけるグリシン（Ｇ）アラニン（Ａ）による置換と；
（ｂ）１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ４；
を含む、該抗体、又はそれらの抗原結合断片が提供される。
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域とを含む抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書では、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片であって、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域とを含み；前記重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換；７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換；７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換；７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換；８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）による置換；９４位におけるアルギニン（Ｒ）のトレオニン（Ｔ）又はグリシン（Ｇ）による置換；１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換；１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換；並びに１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み；且つ、該軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換；３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換；４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換；４６位におけるプロリン（Ｐ）のロイシン（Ｌ）による置換；４７位におけるトリプトファン（Ｗ）のロイシン（Ｌ）による置換；６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換；７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換；７１位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換；１００位におけるグルタミン（Ｇ）アラニン（Ａ）による置換；並びに１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含む、該抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書では、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号６６のＣＤＲ１、配列番号６７のＣＤＲ２、並びに配列番号６８のＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列、又は１若しくは複数の保存的置換を除き、配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１；
（ｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換を除き、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ２；
（ｉｖ）配列番号４７のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換と；
（ｂ）７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換と；
（ｃ）７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換と；
（ｄ）８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシンによる置換と；
（ｅ）８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）若しくはロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｆ）９４位におけるアルギニン（Ｒ）のトレオニン（Ｔ）若しくはグリシン（Ｇ）による置換と
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ３；並びに
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換と；
（ｂ）１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｃ）１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換と
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号５６のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ４を含み；
且つ、前記軽鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号６３のＣＤＲ１、配列番号６４のＣＤＲ２、並びに配列番号６５のＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換と；
（ｂ）３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換と；
（ｃ）４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｄ）５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１；
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換と；
（ｂ）４６位におけるプロリン（Ｐ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｃ）４７位におけるトリプトファン（Ｗ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ２；
（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換と；
（ｂ）７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換と；
（ｂ）７１位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ３；並びに
（ｖ）配列番号３５のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１００位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換と；
（ｂ）１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ４；
を含む、該抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号９３（ＶＫ１ＡＡ）として示される軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号８９（ＶＨ１Ａ２）として示される重鎖可変領域とを含む抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書では、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片であって、アミノ酸配列が配列番号８９として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３として示される軽鎖可変領域とを含み、
（ｉ）重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）又はセリン（Ｓ）による置換；５１位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５２ｂ位におけるリシン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）又はアスパラギン（Ｑ）による置換；７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み、且つ、
（ｉｉ）軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；１９位におけるアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）による置換；２２位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；４８位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５１位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含む、該抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号８８、８９、９０、９１、又は９２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３、９４、９５、９６、９７、１００、１０２、又は１０３として示される軽鎖可変領域とを含む、請求項２に記載の抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
一態様では、本明細書で説明される抗体並びに抗原結合断片が、ヒト化抗体並びに抗原結合断片であり、且つ、任意のアイソタイプでありうる。本明細書ではまた、ＡＶＩＭＥＲ、ダイアボディー、及び重鎖二量体（ラクダ重鎖構築物及びサメ重鎖構築物を含めた）も包含される。
本明細書では、「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗体断片」、又は「抗体の機能的断片」という用語を互換的に用いて、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１又は複数の断片を指す。このような用語の範囲内に包含される抗体断片の非限定的な例には、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含有する二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬドメイン及びＶＨドメインを含有するＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインを含有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６）；並びに（ｖｉ）単離ＣＤＲが含まれるがこれらに限定されない。加えて、この定義には、単一の重鎖並びに単一の軽鎖を含む「半」抗体も包含される。本明細書にはまた、ダイアボディーなど、単鎖抗体の他の形態も包含される。
抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片（非共有結合により連結されたＦｖ断片並びに共有結合により連結されたＦｖ断片を含めた）、ｓｃＦｖ断片、単鎖結合ポリペプチド、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、又はｄＡｂ断片が含まれるがこれらに限定されない、本明細書で説明される抗原結合断片のうちのいずれかでありうる。非限定的な一実施形態では、抗原結合断片が、場合によって、ヒト抗体のＦｃ部分へとさらに融合されうるｓｃＦｖである。
非限定的な一実施形態では、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号４１、４２、又は４３として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号３、４、又は５として示される軽鎖可変領域とを含む。
非限定的な別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号３として示される軽鎖可変領域とを含む。
非限定的な別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域とを含む。
非限定的な別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号５として示される軽鎖可変領域とを含む。
非限定的な別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号３として示される軽鎖可変領域とを含む。
非限定的な別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域とを含む。
非限定的な別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号５として示される軽鎖可変領域とを含む。
非限定的な別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号４３として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号３として示される軽鎖可変領域とを含む。
非限定的な別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号４３として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域とを含む。
非限定的な別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号４３として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号５として示される軽鎖可変領域とを含む。
さらに別の非限定的な実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片が重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有し、前記重鎖可変領域が、７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換；７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換；８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）若しくはロイシン（Ｌ）による置換；９４位におけるトレオニン（Ｔ）のグリシン（Ｇ）による置換；１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換；１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換；１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み；且つ、前記軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換；３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換；５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換；６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換；７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換；１００位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換；並びに１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含む。
一態様では、本明細書で説明される抗体並びに抗原結合断片を修飾することができる。例えば、一実施形態では、化合物を修飾して、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性、可溶性、バイオアベイラビリティー、又は半減期など、該化合物の薬物動態特性を変化させることができる。このような修飾には、ＰＥＧ化及び／又はグリコシル化が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で説明される抗体並びに抗原結合断片は、従来の手段を用いて、急速送達用又は遅延送達用に製剤化することができる。非限定的な一実施形態では、急速送達が、例えば、静脈内注射を介する。非限定的な別の実施形態では、遅延送達が、例えば、皮下沈着を介する。別の非限定的な実施形態では、送達が、エアゾールによる投与を介して達成される。
本明細書では、本明細書で説明される抗体並びに抗原結合断片と、許容可能な担体又は賦形剤とによる組成物が提供される。
本明細書では、本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（核酸）が提供される。
本明細書で説明される抗体並びにそれらの抗原結合断片を用いて、血管新生に随伴する多様な疾患及び状態、例えば、血管新生／新血管形成（例えば、黄斑変性、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎障害、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）、関節リウマチ、骨関節炎、並びに多様な形態のがん、充実性腫瘍、及び転移を特徴とする多様な形態の眼疾患を治療することができる。加えて、本明細書で説明されるこれらの抗体並びにそれらの抗原結合断片は、血管新生に随伴する疾患及び状態、例えば、血管新生／新血管形成（例えば、黄斑変性、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎障害、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）、関節リウマチ、骨関節炎、並びに多様な形態のがん、充実性腫瘍、及び転移を特徴とする多様な形態の眼疾患並びに眼以外の疾患を予防、治療、又は診断するための薬物製剤においても用いることができる。
本明細書では、患者に組成物を投与することにより、該患者において、エンドグリンに対する宿主免疫反応を誘導する方法であって、該組成物が、それにより特異的に認識されるエピトープに対する有効な宿主免疫反応を誘導する、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片を含む該方法が提供される。
宿主免疫反応は、体液性免疫反応の場合もあり、細胞媒介性免疫反応の場合もある。免疫反応が、体液性免疫反応の場合は、それが、血管新生、血管新生依存性疾患、又は血管新生依存性障害を阻害する、防御性抗体反応でありうる。免疫反応はまた、細胞によるシグナル伝達経路（例えば、Ｓｍａｄによるシグナル伝達）の誘導又は遮断も包含する。血管新生依存性疾患又は血管新生依存性障害は、例えば、血管新生／新血管形成（例えば、黄斑変性、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎障害、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）、関節リウマチ、骨関節炎、多様な形態のがん（原発性腫瘍及び転移）などを特徴とする多様な形態の眼疾患並びに眼以外の疾患でありうる。一実施形態では、防御性抗体反応は血管新生を阻害する。
本明細書では、エンドグリン及び血管新生と関連する、細胞によるシグナル伝達経路に影響を及ぼす方法が提供される。血管新生性細胞を、細胞によるシグナル伝達経路を変化させるのに十分な量の、本明細書で説明される抗体又はその抗原結合断片と（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、又はｅｘ ｖｉｖｏにおいて）接触させることができる。非限定的な一例では、抗体の結合に応答する血管新生性細胞において、Ｓｍａｄ １、５、及び／又は８によるシグナル伝達が、約１．５倍以上阻害される。非限定的な別の例では、Ｓｍａｄ ３レベルが、１．５倍以上増大することから、細胞が休眠状態へと戻りつつあることが示唆される。
本明細書では、本明細書で提供される組成物を患者に投与することにより、対象における血管新生又は血管新生依存性疾患若しくは血管新生依存性障害を阻害する方法が提供される。血管新生性疾患又は血管新生性障害は、以下：血管新生／新血管形成（例えば、黄斑変性、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎障害、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）、関節リウマチ、骨関節炎、並びに多様な形態のがん、充実性腫瘍、及び転移を特徴とする多様な形態の眼疾患並びに眼以外の疾患のうちのいずれかでありうる。一実施形態では、血管新生又は血管新生依存性疾患若しくは血管新生依存性障害を阻害することにより、該疾患又は障害に随伴する症状を緩和する。別の実施形態では、血管新生又は血管新生依存性疾患若しくは血管新生依存性障害を阻害する結果として、腫瘍サイズを縮減するか、腫瘍の増悪を防止するか、細胞増殖を低減するか、アポトーシスを増大させるか、又は患者の生存を延長する。血管新生を阻害する結果として、腫瘍サイズを縮減することもでき、腫瘍の増悪を防止することもできる。該方法は、手術によりがんを切除し、且つ／又はがんを患う患者に、１若しくは複数のさらなる抗がん剤若しくは抗がん治療を投与することもさらに包含しうる。
本明細書では、本明細書で提供される組成物を投与することにより、対象におけるがん又は転移を予防又は治療する方法が提供される。一実施形態では、医薬組成物を投与することにより、治療される対象の寿命が延長される。治療されるがん／腫瘍には充実性腫瘍が含まれ、腫瘍は、原発性腫瘍の場合もあり、転移性腫瘍の場合もある。例示的な充実性腫瘍は、皮膚、黒色腫、肺、膵臓、乳腺、卵巣（ｏｖａｒｙ）、結腸、直腸、胃、甲状腺、喉頭、卵巣（ｏｖａｒｉａｎ）、前立腺、結腸直腸、頭部、頚部、眼、口腔、咽頭、食道、胸部、骨、精巣、リンパ、骨髄、骨、肉腫、腎臓（ｒｅｎａｌ）、汗腺、肝臓、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、脳、例えば、多形性神経膠芽細胞腫などの組織の間から選択される組織又は器官の充実性腫瘍である。非限定的な一例では、充実性腫瘍が、結腸腫瘍、乳房の腫瘍、腎腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、又はこのような腫瘍のうちのいずれかによる転移である。
該方法は、手術によりがんを切除し、且つ／又は１若しくは複数の抗がん剤を投与することもさらに包含しうる。抗がん剤は、医薬組成物の投与の前に投与することもでき、その投与と同時に投与することもでき、又はその投与の後に投与することもできる。抗がん剤は、医薬組成物を投与する前の１週間以内に投与することもでき、医薬組成物を投与した後の１週間以内に投与することもでき、医薬組成物と同日に投与することもできる。抗がん剤を医薬組成物と同日に投与する場合、投与は同時投与でありうる。
本明細書では、手術によりがん／腫瘍を切除し、且つ、抗がん剤又は抗がん治療と、本明細書で提供される組成物とを対象に同時投与することにより、がん又は転移を予防又は治療する方法が提供される。
本明細書では、細胞又は組織を、血管新生を阻害するのに十分な治療有効量の、本明細書で説明される抗体又はその抗原結合断片と接触させることにより血管新生を阻害する方法が提供される。
本明細書では、がん細胞の増殖を阻害するか、又はがん細胞のアポトーシスを引き起こすのに十分な治療有効量の、本明細書で説明される抗体又はその抗原結合断片を接触させることによりがん細胞の増殖を阻害する方法が提供される。
本明細書では、組織を、本明細書で説明される抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含み、接触させるステップが血管新生を阻害する方法が提供される。組織は、培養された組織生検試料の場合もあり、対象の体内に存在する場合もある。
本明細書では、細胞増殖性（例えば、血管新生性）障害を有するか、又はその危険性を示す対象に、該細胞増殖性障害を治療するのに有効な量の、本明細書で提供される組成物を投与することにより、細胞増殖性障害を予防又は治療する方法が提供される。細胞増殖性障害は、例えば、良性又は悪性の充実性腫瘍の場合もあり、良性又は悪性の非充実性腫瘍の場合もあり、且つ、該腫瘍は、転移性腫瘍の場合もあり、非転移性腫瘍の場合もある。治療は、結果として対象の状態を改善する可能性があり、且つ、以下の因子：細胞増殖の減少、細胞数の減少、アポトーシスの増大、又は細胞増殖性障害を含む細胞のうちの少なくとも一部の存続の短縮のうちの１又は複数が生じたかどうかを決定することによりこれを評価することができる。これらの発生のうちの１又は複数は、場合によって、がんの部分的又は完全な消失、並びに患者の生存の延長を結果としてもたらしうる。場合によって、該治療は、抗がん剤又は抗がん治療を対象に投与するステップをさらに含みうる。
本明細書では、患者に治療有効量の、本明細書で提供される組成物を投与することにより、該患者における糖尿病性網膜症、黄斑変性、脈絡膜新血管形成、又は新血管形成性緑内障を治療する方法が提供される。治療は、結果として対象の状態を改善する可能性があり、且つ、以下の因子：黄斑浮腫の縮減、ＣＮＶ面積の減少、又は視覚の鮮明さの増大のうちの１又は複数が生じたかどうかを決定することによりこれを評価することができる。
本明細書で提供される方法では、対象がヒト対象の場合もあり、ヒト以外の対象の場合もある。患者の健康、疾患又は状態の増悪、並びに治療の有効性に応じて、本明細書で提供される組成物並びに抗がん剤又は抗がん治療を、単回投与することもでき、複数回投与することもできる。治療期間の全体にわたり、療法及び治療に対する調整を行うことができる。
組成物は、例えば、皮下注射、皮下注射、硝子体内注射、皮内注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、又は筋肉内注射による投与など、局所投与することもでき、部位内投与することもでき、全身投与することもできる。
加えて、本明細書で説明されるヒト化抗体並びに抗原結合断片はまた、黄斑変性、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、又は増殖性硝子体網膜症を治療するのに知られる療法及び／又は化合物と組み合わせて用いることもできる。このような化合物の例には、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、又はＭａｃｕｇｅｎが含まれるがこれらに限定されない。本明細書で説明される投与方式に加えて、ヒト化抗エンドグリン抗体並びに抗原結合断片は、硝子体内経路を介して投与することもできる。硝子体内投与方式の非限定的な例には、硝子体内注射、並びに硝子体内インプラントの使用が含まれる。
別の態様は、本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片による組成物を投与することにより、対象における慢性炎症性疾患を治療することである。慢性炎症性疾患の非限定的な例には、ＩＢＤ、クローン病、及び潰瘍性大腸炎が含まれる。
別の態様は、本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片による組成物を投与することにより、対象における関節リウマチを治療することである。
別の態様は、本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片による組成物を投与することにより、対象における骨関節炎を治療することである。
関節リウマチ及び／骨関節炎を有する対象の治療は、公表されているガイドラインに従い測定される、適切な範疇のＡＣＲスコアの改善を含め、各種の手段により評価することができる。
本明細書では、本明細書で提供される方法のうちのいずれかの１又は複数の有効性をモニタリングする方法が提供される。可溶性エンドグリンレベルの上昇は、がん患者の生存の短縮と相関している。したがって、一態様では、療法を行う前において、並びに療法を行う間において、可溶性エンドグリンレベルをモニタリングすることができる。したがって、可溶性エンドグリンレベルの低下は、治療レジメンが、患者を治療するのに有効であることの指標でありうる。
本発明の一実施形態は、本発明の障害を治療するための薬物を製剤化するのに、本発明の組成物のうちのいずれかを用いることを意図する。薬物は、治療を必要とする患者／対象の身体的特徴に基づき製剤化することができ、且つ、がん性組織の病期に基づき、単一の製剤に製剤化することもでき、複数の製剤に製剤化することもできる。本発明の薬物は、病院及び診療所への販売に適切な表示であって、対象における、本明細書で説明される障害の治療適応についての該表示を伴う、適切な医薬パッケージにパッケージングすることができる。薬物は、単一のユニットとしてパッケージングすることもでき、複数のユニットとしてパッケージングすることもできる。本発明の医薬組成物の用量及び投与についての指示書は、医薬パッケージ内に組み入れることができる。
本明細書では、診断方法であって、検査される患者に由来する充実性腫瘍又は血漿のがん細胞試料を供給するステップと；該試料において、それらの発現が血管新生阻害剤に対する感受性又は耐性と相関している遺伝子又は遺伝子産物のパネルから選択される少なくとも１つの遺伝子又は遺伝子産物の発現を検出するステップであって、該少なくとも１つの遺伝子又は遺伝子産物が、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＨＩＦ−１α、胎盤細胞増殖因子受容体、及びＣＤ１０５からなる群から選択される１又は複数の遺伝子又は遺伝子産物から選択される該ステップと；該患者試料において検出される少なくとも１つの遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを、血管新生阻害剤に対する感受性又は耐性と相関している少なくとも１つの遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルと比較するステップとを含む該方法が提供される。一実施形態では、血管新生阻害剤が、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、及びエンドグリン阻害剤から選択される。
本明細書では、がん細胞試料又はヒト血漿試料において、血管新生阻害剤に対する感受性又は耐性と相関している遺伝子の発現レベルを検出するためのキットが提供される。一実施形態では、１又は複数の遺伝子が、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＨＩＦ−１α、胎盤細胞増殖因子受容体、及びエンドグリンから選択される。
参照による組込み
別段に言及しない限り、本明細書で言及されるすべての刊行物及び特許出願は、各個別の刊行物又は特許出願が、参照によりその全体において組み込まれることが具体的且つ個別に示唆されたと仮定した場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本出願は、２０１０年３月３０日に作製された、ファイルサイズ６７，８４３キロバイト（ＫＢ）の配列表テキストファイルである「３５８８２−７０６−２０２−ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」として、本明細書と同時に提出されたアミノ酸配列への言及を含有する。上述の配列表は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従い、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
マウスモノクローナル抗体によるキメラＴＲＣ１０５のＶＬ ＣＤＲ（下線を付す）を、ヒト配列であるＯ２−ＶＫ１−３９のフレームワーク領域（ＦＲ）１〜３と、ヒトＪＫ４配列に由来するフレームワーク領域４（配列番号４）（すべて太字）との間に移植した、ヒト化Ｏ２−ＶＫ１−３９可変軽（ＶＬ）鎖を示す図である。Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、ヒトＦＲに対してもたらされうる変異を、配列（配列番号８６で開示される配列）の１、３、４、５、３６、４６、４７、６０、７０、７１、１００、及び１０６位において表示する（ヒト化配列の下部に斜字体で示す）。
マウスモノクローナル抗体によるキメラＴＲＣ１０５のＶＨ ＣＤＲ（下線を付す）を、ヒト配列であるＶＨ３−１５のフレームワーク領域（ＦＲ）１〜３と、ヒトＪＨ４配列に由来するフレームワーク領域４（配列番号４２）（すべて太字）との間に移植した、ヒト化ＶＨ３−１５可変重（ＶＨ）鎖を示す図である。Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、ヒトＦＲに対してもたらされうる１又は複数の変異を、配列（配列番号８７で開示される配列）の４９、７６、７７、７８、８２ａ、８９、９４、１０８、１０９、及び１１３位において表示する（ヒト化配列の下部に斜字体で示す）。
ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５シグナル伝達経路についてのダイアグラムを示す図である。ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５経路（Ａ）は、細胞の増殖及び遊走を阻害する。ＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路（Ｂ）は、内皮細胞の増殖及び遊走を誘導し、ＡＬＫ１によるシグナル伝達にＣＤ１０５（エンドグリン）を必要とする。点線は、不活性経路又は遮断された経路を示唆する。太字の矢印は、シグナル伝達経路に対する刺激を示唆する。
本明細書で説明される、本発明により作製される例示的なマウスＶＫ鎖及びヒト化ＶＫ鎖（掲載の順に、それぞれ、配列番号１〜５）について、アミノ酸配列の配列決定を示す図である。 本明細書で説明される、本発明により作製される例示的なマウスＶＨ鎖及びヒト化ＶＨ鎖（掲載の順に、それぞれ、配列番号３９〜４３）について、アミノ酸配列の配列決定を示す図である
本明細書で説明される、本発明により作製される例示的なマウスＶＫ鎖及びヒト化ＶＫ鎖（掲載の順に、それぞれ、配列番号１及び６９〜７２）について、アミノ酸配列の配列決定を示す図である。 本明細書で説明される、本発明により作製される例示的なマウスＶＨ鎖及びヒト化ＶＨ鎖（掲載の順に、それぞれ、配列番号３９及び７３〜７５）について、アミノ酸配列の配列決定を示す図である。
本明細書で説明される、本発明により作製される例示的なマウスＶＫ鎖及びヒト化ＶＫ鎖及び超ヒト化ＶＫ鎖（掲載の順に、それぞれ、配列番号１、３、及び７０）、並びに例示的なマウスＶＨ鎖及びヒト化ＶＨ鎖及び超ヒト化ＶＨ鎖（掲載の順に、それぞれ、配列番号３９、４１、及び７４）について、アミノ酸配列の配列決定及び比較を示す図である。
競合ＥＬＩＳＡアッセイにおけるエンドグリンに対するヒト化変異体構築物の結合を例示する図である。
ヒト化抗体及びヒト化／脱免疫化抗体を伴う、抗ＣＤ１０５抗体による競合的ＥＬＩＳＡを示す図である。多様な濃度の各抗体を、一定濃度のビオチニル化基準抗ＣＤ１０５抗体（６．２５ｎｇ／ｍｌ）と混合し、且つ、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート上に捕捉されたＣＤ１０５（１００ｎｇ／ｍｌ）に結合させた。結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を介して検出した。プレートリーダー上において、４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、これを、被験抗体濃度と対比してプロットした。 ヒト化抗体及びヒト化／脱免疫化抗体を伴う、抗ＣＤ１０５抗体による競合的ＥＬＩＳＡを示す図である。多様な濃度の各抗体を、一定濃度のビオチニル化基準抗ＣＤ１０５抗体（６．２５ｎｇ／ｍｌ）と混合し、且つ、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート上に捕捉されたＣＤ１０５（１００ｎｇ／ｍｌ）に結合させた。結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を介して検出した。プレートリーダー上において、４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、これを、被験抗体濃度と対比してプロットした。 ヒト化抗体及びヒト化／脱免疫化抗体を伴う、抗ＣＤ１０５抗体による競合的ＥＬＩＳＡを示す図である。多様な濃度の各抗体を、一定濃度のビオチニル化基準抗ＣＤ１０５抗体（６．２５ｎｇ／ｍｌ）と混合し、且つ、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート上に捕捉されたＣＤ１０５（１００ｎｇ／ｍｌ）に結合させた。結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を介して検出した。プレートリーダー上において、４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、これを、被験抗体濃度と対比してプロットした。
ＶＫ２を含有する対照を伴う、変異体ＶＫ１ＡＡＶＨ１Ａについての結合アッセイデータを例示する図である。
ＶＫ１ＡＡＶＨ１Ａ２及びＶＫ２ＡＡＶＨ１Ａ２と比較した、キメラについての結合アッセイデータを例示する図である。
ＶＫ２ＡＡＶＨ１Ｑと比較した、キメラ抗体についての結合アッセイデータを例示する図である。
ＶＫ２ＡＡＶＨ１Ｒと比較した、キメラ抗体についての結合アッセイデータを例示する図である。
ＶＫ１ＡＡＶＨ１Ａ２と比較した、キメラ抗体についての結合アッセイデータを例示する図である。
ＶＫ１ＡＡＶＨ１Ｑと比較した、キメラ抗体についての結合アッセイデータを例示する図である。
ＶＫ１ＡＡＶＨ１Ｒと比較した、キメラ抗体についての結合アッセイデータを例示する図である。
ＶＫ２ＡＡＶＨ１Ａ２と比較した、キメラ抗体についての結合アッセイデータを例示する図である。
太字で且つ下線を付したＣＤＲを伴う、ヒト化脱免疫化リード抗体重鎖可変領域（配列番号８９で開示される配列）を例示する図である。Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、もたらされうる変異を、配列（配列番号１１６で開示される配列）の同定された位置において表示する（ヒト化配列の下部に斜字体で示す）。変異は、単一の突然変異としてもたらすこともでき、複数の突然変異としてもたらすこともでき、且つ、任意に組み合わされた突然変異によりもたらすこともできる。
太字で且つ下線を付したＣＤＲを伴う、ヒト化脱免疫化リード抗体軽鎖可変領域（配列番号９３で開示される配列）を例示する図である。Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、もたらされうる変異を、配列（配列番号１１７で開示される配列）の同定された位置において表示する（ヒト化配列の下部に斜字体で示す）。変異は、単一の突然変異としてもたらすこともでき、複数の突然変異としてもたらすこともでき、且つ、任意に組み合わされた突然変異によりもたらすこともできる。
ｉＴｏｐｅ（商標）を用いる、重鎖可変領域（配列番号４１）についての解析を例示する図である。１アミノ酸ずつの増分による９ｍｅｒのペプチドとして、全配列に及ぶペプチドを調べた。各残基について予測される、９ｍｅｒのコアペプチドのｐ１アンカーとしての、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する結合を、結合スコアが０．５５〜０．６であった場合は「○」により表示し、結合スコアが＞０．６であった場合は「×」により表示する。潜在的な免疫原性ペプチドを含有する領域を「ｉＴｏｐｅ」欄に表示するが、濃いグレーは、高アフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示し、薄いグレーは、中程度のアフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示する。結合が予測されるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の数を、「合計」欄及び「高アフィニティー」欄に示す。生殖細胞系列配列として同定される潜在的なｐ１アンカー残基を「配列」欄の反転文字で示す。 ｉＴｏｐｅ（商標）を用いる、重鎖可変領域（配列番号４１）についての解析を例示する図である。１アミノ酸ずつの増分による９ｍｅｒのペプチドとして、全配列に及ぶペプチドを調べた。各残基について予測される、９ｍｅｒのコアペプチドのｐ１アンカーとしての、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する結合を、結合スコアが０．５５〜０．６であった場合は「○」により表示し、結合スコアが＞０．６であった場合は「×」により表示する。潜在的な免疫原性ペプチドを含有する領域を「ｉＴｏｐｅ」欄に表示するが、濃いグレーは、高アフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示し、薄いグレーは、中程度のアフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示する。結合が予測されるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の数を、「合計」欄及び「高アフィニティー」欄に示す。生殖細胞系列配列として同定される潜在的なｐ１アンカー残基を「配列」欄の反転文字で示す。 ｉＴｏｐｅ（商標）を用いる、重鎖可変領域（配列番号４１）についての解析を例示する図である。１アミノ酸ずつの増分による９ｍｅｒのペプチドとして、全配列に及ぶペプチドを調べた。各残基について予測される、９ｍｅｒのコアペプチドのｐ１アンカーとしての、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する結合を、結合スコアが０．５５〜０．６であった場合は「○」により表示し、結合スコアが＞０．６であった場合は「×」により表示する。潜在的な免疫原性ペプチドを含有する領域を「ｉＴｏｐｅ」欄に表示するが、濃いグレーは、高アフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示し、薄いグレーは、中程度のアフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示する。結合が予測されるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の数を、「合計」欄及び「高アフィニティー」欄に示す。生殖細胞系列配列として同定される潜在的なｐ１アンカー残基を「配列」欄の反転文字で示す。
ｉＴｏｐｅ（商標）を用いる、重鎖可変領域（配列番号１１８）についての解析を例示する図である。１アミノ酸ずつの増分による９ｍｅｒのペプチドとして、全配列に及ぶペプチドを調べた。各残基について予測される、９ｍｅｒのコアペプチドのｐ１アンカーとしての、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する結合を、結合スコアが０．５５〜０．６であった場合は「○」により表示し、結合スコアが＞０．６であった場合は「×」により表示する。潜在的な免疫原性ペプチドを含有する領域を「ｉＴｏｐｅ」欄に表示するが、濃いグレーは、高アフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示し、薄いグレーは、中程度のアフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示する。結合が予測されるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の数を、「合計」欄及び「高アフィニティー」欄に示し、結合に関する差違を示す。生殖細胞系列配列として同定される潜在的なｐ１アンカー残基を「配列」欄の反転文字で示し、変異体内のアミノ酸の差違に枠囲いを施す。
ｉＴｏｐｅ（商標）を用いる、軽鎖可変領域（配列番号３）についての解析を例示する図である。１アミノ酸ずつの増分による９ｍｅｒのペプチドとして、全配列に及ぶペプチドを調べた。各残基について予測される、９ｍｅｒのコアペプチドのｐ１アンカーとしての、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する結合を、結合スコアが０．５５〜０．６であった場合は「○」により表示し、結合スコアが＞０．６であった場合は「×」により表示する。潜在的な免疫原性ペプチドを含有する領域を「ｉＴｏｐｅ」欄に表示するが、濃いグレーは、高アフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示し、薄いグレーは、中程度のアフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示する。結合が予測されるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の数を、「合計」欄及び「高アフィニティー」欄に示す。生殖細胞系列配列として同定される潜在的なｐ１アンカー残基を「配列」欄の反転文字で示す。 ｉＴｏｐｅ（商標）を用いる、軽鎖可変領域（配列番号３）についての解析を例示する図である。１アミノ酸ずつの増分による９ｍｅｒのペプチドとして、全配列に及ぶペプチドを調べた。各残基について予測される、９ｍｅｒのコアペプチドのｐ１アンカーとしての、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する結合を、結合スコアが０．５５〜０．６であった場合は「○」により表示し、結合スコアが＞０．６であった場合は「×」により表示する。潜在的な免疫原性ペプチドを含有する領域を「ｉＴｏｐｅ」欄に表示するが、濃いグレーは、高アフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示し、薄いグレーは、中程度のアフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示する。結合が予測されるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の数を、「合計」欄及び「高アフィニティー」欄に示す。生殖細胞系列配列として同定される潜在的なｐ１アンカー残基を「配列」欄の反転文字で示す。 ｉＴｏｐｅ（商標）を用いる、軽鎖可変領域（配列番号３）についての解析を例示する図である。１アミノ酸ずつの増分による９ｍｅｒのペプチドとして、全配列に及ぶペプチドを調べた。各残基について予測される、９ｍｅｒのコアペプチドのｐ１アンカーとしての、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する結合を、結合スコアが０．５５〜０．６であった場合は「○」により表示し、結合スコアが＞０．６であった場合は「×」により表示する。潜在的な免疫原性ペプチドを含有する領域を「ｉＴｏｐｅ」欄に表示するが、濃いグレーは、高アフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示し、薄いグレーは、中程度のアフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示する。結合が予測されるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の数を、「合計」欄及び「高アフィニティー」欄に示す。生殖細胞系列配列として同定される潜在的なｐ１アンカー残基を「配列」欄の反転文字で示す。
ｉＴｏｐｅ（商標）を用いる、軽鎖可変領域（配列番号１０１）についての解析を例示する図である。１アミノ酸ずつの増分による９ｍｅｒのペプチドとして、全配列に及ぶペプチドを調べた。各残基について予測される、９ｍｅｒのコアペプチドのｐ１アンカーとしての、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する結合を、結合スコアが０．５５〜０．６であった場合は「○」により表示し、結合スコアが＞０．６であった場合は「×」により表示する。潜在的な免疫原性ペプチドを含有する領域を「ｉＴｏｐｅ」欄に表示するが、濃いグレーは、高アフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示し、薄いグレーは、中程度のアフィニティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する乱雑ペプチドを表示する。結合が予測されるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の数を、「合計」欄及び「高アフィニティー」欄に示し、結合に関する差違を示す。生殖細胞系列配列として同定される潜在的なｐ１アンカー残基を「配列」欄の反転文字で示し、変異体内のアミノ酸の差違に枠囲いを施す。
全世界的な集団におけるＭＨＣクラスＩＩアロタイプの頻度、並びに被験集団におけるＭＨＣクラスＩＩアロタイプの頻度を例示する図である。
２０例のドナーに由来するＰＢＭＣを用いる、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）による時間経過を伴うＴ細胞アッセイにおいて、キメラ抗エンドグリン抗体、ヒト化抗エンドグリン抗体であるＶＫ１ＶＨ１、並びにヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体であるＶＫ１ＡＡＶＨ１Ａ２を調べたことを示す図である。被験抗体と共にインキュベートしたＰＢＭＣのバルク培養物から、５、６、７、及び８日目に試料採取し、３Ｈ−チミジンでパルスした。細胞を回収し、放射性物質の取込みを、シンチレーションカウンティングにより測定した。各３連試料について結果を平均し、刺激指数（ＳＩ）へと変換することにより標準化した。キメラ抗体ＴＲＣ１０５（図２４Ａ）、ＶＫ１ＶＨ１（図２４Ｂ）、及びＶＫ１ＡＡＶＨ１Ａ２（図２４Ｃ）について、各ドナーによる各時点のＳＩを示す。ＳＩ≧２の陽性反応を決定するためのカットオフ値を、点線により明示し、有意な反応（スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５）を表示する（＊）。
具体的な製剤又は工程パラメータは、当然ながら変化しうるので、本出願がこれらに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で用いられる用語法は、具体的な実施形態を説明することだけを目的とするものであり、限定を意図するものではないことも理解されたい。さらに、本発明を実施するには、本明細書で説明される方法及び材料と類似又は同等である、多数の方法及び材料を用いうることも理解される。
本出願に従い、当技術分野の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡの技法を用いうる。このような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）］；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（１９９４））］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照されたい。
エンドグリンの活性を調節し、これにより、血管新生を阻害し、且つ／又は微小血管の血管拡張を阻害する、エンドグリンに対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が作製されている。これらのマウスモノクローナル抗体は、それらが全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９２８，６４１号；同第６，２００，５６６号；同第６，１９０，６６０号；及び同第７，０９７，８３６号において説明されている。加えて、これらの抗体のうちの多数について、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性も裏付けられている；エンドグリンに結合するこれらのモノクローナル抗体は、エンドグリンを調節する化合物として、対象の抗体となる。しかし、これらのマウス抗体の投与は、例えば、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の形態における免疫原性を含め、多数の限界を有するので、これらの治療的使用は実施可能ではない。ヒト化抗体を作製して、これらの反応に対処する。
本明細書では、エンドグリンに結合するヒト化抗体であって、それらの特異性を維持及び／又は改善しながらも、免疫原性を低減する該ヒト化抗体が説明される。加えて、本明細書では、マウス抗体に随伴する問題に対処するため、エンドグリンに結合し、且つ、血管新生を低減及び／又は阻害するヒト化抗体であって、それらの特異性を維持及び／又は改善しながらも、免疫原性を低減する該ヒト化抗体が説明される。これらのヒト化エンドグリン抗体は、多様な状態及び疾患を診断及び治療するほか、エンドグリンを精製及び検出するのにも有用である。
Ｉ．抗エンドグリン抗体
本明細書では、エンドグリンに結合するヒト化抗体、並びにそれらの抗原結合断片が提供される。エンドグリンは、既存の血管系を構成し、且つ支持する細胞のほか、新たな血管系の増殖を促進しつつあり、且つその一部となる細胞においても見出されうる。これらの抗体並びに抗原結合断片は、エンドグリンに結合し、これにより、血管新生を阻害し、既存の血管系若しくは既存の血管系の維持を阻害し、且つ／又は微小血管の拡張を阻害することが可能である。本明細書では以後、「抗体（単数又は複数）」という用語への参照を、本明細書で説明される抗原結合断片のうちのいずれかを包含すると考えるものとし、該用語は、必要に応じて互換可能であるものとする。エンドグリンを精製するのにそれらを用いることに加え、これらの抗体は、精製、検出、及び診断する目的のほか、治療する目的にも有用である。本明細書で提供される抗体は、多様な状態及び疾患を治療するための薬物製剤、前記状態及び疾患を治療する方法、並びに検出又は診断の方法に用いることができる。本明細書で用いられる血管新生とは、新たな血管の増殖及び／又は発生（また、新血管形成とも称する）、微小血管の拡張、血管増殖の過剰又は遷延、並びに既存の血管系の維持を包含する。血管新生性状態及び血管新生性疾患とは、血管新生に関連するか、血管新生により引き起こされるか、又は血管新生に随伴する疾患及び状態を指す。このような疾患の非限定的な例には、例えば、血管新生／新血管形成（例えば、黄斑変性、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎障害、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）、関節リウマチ、骨関節炎、並びに多様な形態のがん（原発性腫瘍及び転移）を特徴とする多様な形態の眼疾患が含まれる。
Ａ．抗体についての用語法
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、天然の場合であれ、部分的又は完全な合成により作製された場合であれ、免疫グロブリン（Ｉｇ）を指す。この用語はまた、抗原結合ドメインであるか、又はこれと相同的である結合ドメインを有する任意のポリペプチド又はタンパク質も対象とする。この用語は、以下で説明される用語など、「抗原結合断片」並びに類似の結合断片についての他の互換可能な用語をさらに包含する。また、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体並びに他のヒト化抗体（ＣＤＲ修飾並びにフレームワーク領域修飾を含めた）も、この用語により意図される。
天然抗体並びに天然免疫グロブリンは通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖並びに２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ドルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。各軽鎖は、共有結合による１つのジスルフィド結合を介して重鎖に連結されることが典型的であるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的な間隔を置いた、鎖間ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端部において、可変ドメイン（「ＶＨ」ドメイン）に続いて、複数の定常ドメイン（「ＣＨ」ドメイン）を有する。各軽鎖は、一方の端部における可変ドメイン（「ＶＬ」ドメイン）、並びにその他方の端部における定常ドメイン（「ＣＬ」ドメイン）を有するが、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと並行し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並行する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとのインターフェースを形成すると考えられている。
本明細書で用いられる「合成ポリヌクレオチド」、「合成遺伝子」、又は「合成ポリペプチド」という用語は、対応するポリヌクレオチド配列若しくはその部分、又はアミノ酸配列若しくはその部分が、同等の天然配列と比較して、新規にデザインされているか、新規に合成されているか、又は修飾されている配列に由来することを意味する。合成ポリヌクレオチド（抗体又は抗原結合断片）又は合成遺伝子は、核酸配列又はアミノ酸配列の化学合成が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で知られている方法により調製することができる。合成遺伝子は、アミノ酸レベル又はポリヌクレオチドレベル（又はこれらの両方のレベル）で天然遺伝子とは異なることが典型的であり、合成の発現制御配列との関連で配置されることが典型的である。例えば、合成遺伝子配列は、例えば、１又は複数のアミノ酸又はヌクレオチドの置換、欠失、又は付加により変化しており、これにより、供給源の配列とは異なる、抗体のアミノ酸配列又は配列をコードするポリヌクレオチドを提供する、アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を包含しうる。合成遺伝子のポリヌクレオチド配列は、天然遺伝子と比較して異なるアミノ酸を伴うタンパク質を必ずしもコードしうるわけではない；例えば、それらはまた、異なるコドンではあるが、同じアミノ酸をコードする（すなわち、ヌクレオチドの変化が、アミノ酸レベルではサイレントの突然変異を表す）コドンを組み込む合成ポリヌクレオチド配列も包含しうる。
抗体に関する「可変ドメイン」という用語は、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性に関して用いられる抗体の可変ドメインを指す。しかし、その可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたり一様に分布しているわけではない。そうではなくて、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインのいずれにおいても、可変性は、超可変領域（また、ＣＤＲとしても知られる）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのうちのより高度に保存的な部分を、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」と称する。修飾されていない重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、大半がβシートの立体構造をとり、且つ、３つずつのＣＤＲ（該βシート構造を連結するループ、並びに場合によって、該βシート構造の部分を形成する）を散在させる、４つずつのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含有する。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲにより、併せて密接する形で近傍に保持され、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）、６４７〜６６９ページを参照されたい）。
本明細書で用いられる「超可変領域」及び「ＣＤＲ」という用語は、抗原結合の一因となる抗体のアミノ酸残基を指す。ＣＤＲは、相補的な形で抗原に結合する３つの配列領域に由来するアミノ酸残基を含み、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の各々について、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３として知られている。Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）によれば、軽鎖可変ドメインでは、ＣＤＲが、ほぼ、残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、５０〜５６（ＣＤＲＬ２）、及び８９〜９７（ＣＤＲＬ３）に対応することが典型的であり、重鎖可変ドメインでは、ＣＤＲが、ほぼ、残基３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、５０〜６５（ＣＤＲＨ２）、及び９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）に対応することが典型的である。異なる抗体のＣＤＲは、挿入を含有する可能性があり、したがって、アミノ酸の番号付けが異なりうることが理解される。Ｋａｂａｔによる番号付けシステムは、特定の残基に対する添え字（例えば、軽鎖では、ＣＤＲＬ１の２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃ、２７Ｄ、２７Ｅ、及び２７Ｆ）を使用して異なる抗体間における番号付けへの任意の挿入を反映する番号付けスキームで、このような挿入に対処している。代替的に、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７（１９８７）によれば、軽鎖可変ドメインでは、ＣＤＲが、ほぼ、残基２６〜３２（ＣＤＲＬ１）、５０〜５２（ＣＤＲＬ２）、及び９１〜９６（ＣＤＲＬ３）に対応することが典型的であり、重鎖可変ドメインでは、ＣＤＲが、ほぼ、残基２６〜３２（ＣＤＲＨ１）、５３〜５５（ＣＤＲＨ２）、及び９６〜１０１（ＣＤＲＨ３）に対応することが典型的である。
本明細書で用いられる「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」とは、抗原結合ポケット又は抗原結合グルーブの一部を形成するフレームワークのアミノ酸残基を指す。一部の実施形態では、フレームワーク残基が、抗原結合ポケット又は抗原結合グルーブの一部であるループを形成し、このループ内のアミノ酸残基が、抗原と接触する場合も接触しない場合もある。フレームワーク領域は一般に、ＣＤＲ間の領域を構成する。Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）によれば、軽鎖可変ドメインでは、ＦＲが、ほぼ、残基０〜２３（ＦＲＬ１）、３５〜４９（ＦＲＬ２）、５７〜８８（ＦＲＬ３）、及び９８〜１０９に対応することが典型的であり、重鎖可変ドメインでは、ＦＲが、ほぼ、残基０〜３０（ＦＲＨ１）、３６〜４９（ＦＲＨ２）、６６〜９４（ＦＲＨ３）、及び１０３〜１３３に対応することが典型的である。軽鎖のＫａｂａｔによる番号付けについて上記で論じた通り、重鎖への挿入もまた、同様の形で対処されている（例えば、重鎖では、ＣＤＲＨ１の３５Ａ、３５Ｂ）。代替的に、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７（１９８７）によれば、軽鎖可変ドメインでは、ＦＲが、ほぼ、残基０〜２５（ＦＲＬ１）、３３〜４９（ＦＲＬ２）、５３〜９０（ＦＲＬ３）、及び９７〜１０９（ＦＲＬ４）に対応することが典型的であり、重鎖可変ドメインでは、ＦＲが、ほぼ、残基０〜２５（ＦＲＨ１）、３３〜５２（ＦＲＨ２）、５６〜９５（ＦＲＨ３）、及び１０２〜１１３（ＦＲＨ４）に対応することが典型的である。
ＦＲのループアミノ酸は、抗体重鎖及び／又は抗体軽鎖の三次元構造を検討することにより評価及び決定することができる。溶媒に接触可能なアミノ酸位置は、ループを形成し、且つ／又は抗体可変ドメインにおいて抗原を接触させる可能性が高いので、このような位置について三次元構造を解析することができる。溶媒に接触可能な位置のうちのある位置は、アミノ酸の多様性を許容することが可能であり、他の位置（例えば、構造的位置）は一般に、多様性が低度である。抗体可変ドメインの三次元構造は、結晶構造に由来する場合もあり、タンパク質モデリングに由来する場合もある。
抗体の定常ドメイン（Ｆｃドメイン）は、抗体の抗原に対する結合には直接関与せずに、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用を介して、抗体依存性細胞傷害作用への抗体の関与など、各種のエフェクター機能を呈示する。Ｆｃドメインはまた、患者への投与後において循環する抗体のバイオアベイラビリティーも増大させる。
それらの重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。これらは、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかを、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へとさらに分割することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメイン（Ｆｃドメイン）を、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと称する。異なる免疫グロブリンのクラスのサブユニットの構造並びに三次元の立体構造はよく知られている。
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（又は「κ」若しくは「Ｋ」）及びラムダ（又は「λ」）と称する２つの明確に異なる類型のうちの１つに割り当てることができる。
本明細書では、「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗体断片」、又は「抗体の機能的断片」という用語を互換的に用いて、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１又は複数の断片を指す。このような用語の範囲内に包含される抗体断片の非限定的な例には、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含有する二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬドメイン及びＶＨドメインを含有するＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインを含有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６）；並びに（ｖｉ）単離ＣＤＲが含まれるがこれらに限定されない。加えて、この定義には、単一の重鎖並びに単一の軽鎖を含む「半」抗体も包含される。本明細書にはまた、ダイアボディーなど、単鎖抗体の他の形態も包含される。
「Ｆ（ａｂ’）２」部分及び「Ｆａｂ」部分は、Ｉｇを、ペプシン及びパパインなどのプロテアーゼで処理することにより作製することができ、２本の重鎖の各々のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の近傍で免疫グロブリンを消化することにより生成される抗体断片を包含する。例えば、パパインは、２本の重鎖の各々のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流でＩｇＧを切断して、ＶＬ及びＣＬ（軽鎖定常領域）からなる軽鎖と、ＶＨ及びＣＨγ１（重鎖定常領域内のγ１領域）からなる重鎖断片とが、ジスルフィド結合を介してそれらのＣ末端領域で連結されている、２つの相同的な抗体断片を生成させる。これらの２つの相同的な抗体断片の各々を、Ｆａｂ’と称する。ペプシンもまたＩｇＧを切断するが、２本の重鎖の各々のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の下流においてであり、上記で言及した２つのＦａｂ’をヒンジ領域で連結させた、Ｆａｂ’断片よりやや大型の抗体断片を生成させる。この抗体断片を、Ｆ（ａｂ’）２と称する。
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメイン並びに重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域に由来する１又は複数のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端において、数個の残基が付加されていることにより、Ｆａｂ断片とは異なる。本明細書では、Ｆａｂ’−ＳＨを、定常ドメインのシステイン残基（単数又は複数）が、遊離チオール基を保有するＦａｂ’の呼称とする。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元来、それらの間にヒンジ領域のシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製された。また、抗体断片の他の化学的な連結についても知られている。
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含有する抗体断片を指す。この領域は、非共有結合又は共有結合により密に会合する、１つの重鎖可変ドメイン並びに１つの軽鎖可変ドメインによる二量体からなる（当技術分野では、ジスルフィド結合により連結されたＦｖ’が説明されている；Ｒｅｉｔｅｒら（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１２３９〜１２４５）。各可変ドメインの３つずつのＣＤＲが相互作用してこのＶＨ−ＶＬ二量体の表面上における抗原結合部位を規定するのは、この構成においてである。ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の各々に由来するＣＤＲのうちの１又は複数の組合せにより集合的に、該抗体に抗原結合特異性が付与される。例えば、レシピエント抗体又はその抗原結合断片のＶＨ鎖及びＶＬ鎖へと導入される場合なら、ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３でも、抗体に抗原結合特異性を付与するには十分でありうるであろうし、このＣＤＲの組合せを、本明細書で説明される技法のうちのいずれかを用いて、結合、アフィニティーなどについて調べることができることを理解されたい。第２の可変ドメインと組み合わせた場合より低度のアフィニティーにおいてである可能性が高いが、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含む、Ｆｖの半分）もなお、抗原を認識し、これに結合する能力を有する。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬドメイン及びＶＨドメイン）は、個別の遺伝子によりコードされるが、そこにおいてはＶＬ領域及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；Ｂｉｒｄら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３；並びにＯｓｂｏｕｒｎら（１９９８）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７７８）単一のタンパク質鎖としてこれらを作製することを可能にする、合成リンカーを介する組換え法を用いてこれらを接合することもできる。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内にはまた、このようなｓｃＦｖも包含されることが意図される。完全なＩｇ（例えば、ＩｇＧ）分子又は他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成させるためには、特定のｓｃＦｖのうちの任意のＶＨ配列及びＶＬ配列を、Ｆｃ領域のｃＤＮＡ配列又はゲノム配列に連結することができる。ＶＨ配列及びＶＬ配列はまた、タンパク質化学反応法又は組換えＤＮＡ法を用いて、Ｆａｂ、Ｆｖ、又は他のＩｇ断片を生成させるのにも用いることができる。
「単鎖Ｆｖ」抗体断片又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインを、単一のポリペプチド鎖内に存在させる。一部の実施形態では、Ｆｖポリペプチドが、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、該ｓＦｖが、抗原に対する結合に所望される構造を形成することを可能とする。ｓＦｖの総説については、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５ページ（１９９４）を参照されたい。
「ＡＶＩＭＥＲ（商標）」という用語は、ヒト由来の治療用タンパク質のクラスを指すが、抗体並びに抗体断片とは類縁でなく、Ａドメイン（また、クラスＡモジュール、補体型の反復配列、又はＬＤＬ受容体クラスＡドメインとも称する）と称する、複数のモジュール型結合ドメイン並びに再使用可能な結合ドメインからなる。これらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエクソンシャフリング及びファージディスプレイ（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１４９３〜１４９４；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２２０）により、ヒト細胞外受容体ドメインから開発された。結果として得られるタンパク質は、単一のエピトープに結合するタンパク質と比較して、アフィニティー（場合によって、ナノモル未満）及び特異性の改善を呈示しうる、複数の個別の結合ドメインを含有しうる。例えば、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０２２１３８４号；同第２００５／０１６４３０１号；同第２００５／００５３９７３号；及び同第２００５／００８９９３２号；同第２００５／００４８５１２号；及び同第２００４／０１７５７５６号を参照されたい。
既知である２１７のヒトＡドメインの各々は、約３５アミノ酸（約４ｋＤａ）を含み、これらのドメインは、平均５アミノ酸の長さのリンカーにより隔てられている。天然のＡドメインは、主にカルシウム結合並びにジスルフィド結合の形成を介して、迅速且つ効率的に均一で安定的な構造へとフォールドする。この共通の構造に必要とされるのは、わずかに１２アミノ酸の保存的な足場モチーフである。この最終結果として、それらの各々が個別の機能を表す複数のドメインを含有する、単一のタンパク質鎖がもたらされる。これらのタンパク質の各ドメインは個別に結合し、各ドメインのエネルギー的な寄与は相加的である。これらのタンパク質は、アビディティー多量体にちなんで「ＡＶＩＭＥＲ（商標）」と命名された。
「ダイアボディー」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ鎖）において、軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）を含む、２つの抗原結合部位を伴う低分子抗体断片を指す。同じ鎖上の２つのドメイン間における対合を可能とするには短すぎるリンカーを用いることにより、該ドメインを、別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を創出する。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；並びにＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）においてより十分に説明されている。
抗原結合ポリペプチドにはまた、例えば、ラクダ及びサメに由来する抗体などの重鎖二量体も含まれる。ラクダ抗体及びサメ抗体は、Ｖ様ドメイン及びＣ様ドメインの２本の鎖（いずれも軽鎖を有さない）によるホモ二量体対を含む。ラクダにおける重鎖二量体であるＩｇＧのＶＨ領域は、軽鎖と疎水性相互作用する必要がないので、通常なら軽鎖に接触する重鎖の領域を、ラクダにおける親水性アミノ酸残基へと変化させることができる。重鎖二量体によるＩｇＧのＶＨドメインを、ＶＨＨドメインと称する。サメのＩｇ−ＮＡＲは、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲドメインと称する）と、５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲドメイン）によるホモ二量体を含む。ラクダでは、ＶＨ領域又はＶＨＨ領域内のＣＤＲ１、２、及び３により抗体レパートリーの多様性が決定される。ラクダＶＨＨ領域内のＣＤＲ３は、その比較的長い１６アミノ酸の長さを特徴とする（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（９）：１１２９）。これは、他の多くの種の抗体のＣＤＲ３とは対照的である。例えば、マウスＶＨのＣＤＲ３は、平均９アミノ酸である。ラクダ可変領域のｉｎ ｖｉｖｏにおける多様性を維持する、ラクダに由来する抗体可変領域のライブラリーは、例えば、米国特許出願第２００５００３７４２１号で開示される方法により作製することができる。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態には、非ヒトＩｇに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体が含まれる。大部分において、ヒト化抗体は、その中のレシピエントＣＤＲのうちの１又は複数が、所望の特異性、アフィニティー、及び結合機能を有する、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長動物など、ヒト以外の種の抗体（ドナー抗体）に由来するＣＤＲにより置換されているヒトＩｇ（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒトＩｇの１又は複数のＦＲアミノ酸残基も、対応する非ヒトアミノ酸残基により置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含有する場合がある。必要な場合は、これらの修飾を施して、抗体の効能を洗練させることができる。ヒト化抗体は、少なくとも１つであり、場合によっては２つである可変ドメインのうちの実質的に全部を含むことが可能であり、この中の超可変領域のうちの全部又は実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、ＦＲのうちの全部又は実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン配列によるＦＲである。ヒト化抗体は、場合によってまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃ領域のうちの少なくとも一部も包含しうる。詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；並びにＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。
ヒト化抗体はまた、その中の重鎖及び軽鎖のＣＤＲのうちの一部又は全部が、非ヒトモノクローナル抗体に由来し、該可変領域の残りの部分の実質的にすべてが、ヒト可変領域（重鎖可変領域及び軽鎖可変領域）に由来し、定常領域が、ヒト定常領域に由来する抗体も包含する。一実施形態では、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域が、非ヒト抗体に由来する。さらに別の実施形態では、重鎖及び軽鎖のうちの少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）が、非ヒト抗体に由来する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３による多様な組合せが非ヒト抗体に由来することが可能であり、本明細書ではこれらが意図されている。非限定的な一例では、重鎖及び軽鎖の各々のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域のうちの１又は複数が、マウスキメラモノクローナル抗体クローンであるＴＲＣ１０５に由来する。
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかな量で存在しうる可能な天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位を指向するので、高度に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を包含しうる従来の（ポリクローナル）抗体の調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原における単一の決定基を指向する。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるものとしての抗体の特徴を示唆するものであり、何らかの特定の方法による抗体の作製を要請するものとしては見なされないものとする。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）により最初に説明されたハイブリドーマ法により作製することもでき、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により作製することもできる。ある実施形態では、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８（１９９１）；並びにＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９１）において説明されている技法を用いて、ファージ抗体ライブラリーからモノクローナル抗体を単離することもできる。
抗体は、飽和硫酸アンモニウム沈殿、ユーグロビン沈降法、カプロン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ又はＤＥ５２による）、或いは以下でより詳細に説明されるカラムなど、抗Ｉｇカラム又はプロテインＡカラム、プロテインＧカラム、若しくはプロテインＬカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーを介して、上記で言及した培養物上清又は腹水から単離及び精製することができる。
本明細書で説明される組成物及び方法において用いられる例示的な抗体は、例えば、ヒト化抗体などの完全免疫グロブリン分子、又はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、可変ＮＡＲドメイン、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、及び単鎖結合ポリペプチド、並びにまた抗原結合断片とも称される他のポリペプチドなど、当技術分野で知られるヒト化Ｉｇ分子の部分を含めた、抗原結合部位（すなわち、パラトープ）若しくは単一の重鎖並びに単一の軽鎖を含有するヒト化Ｉｇ分子の部分である。免疫グロブリン分子又はその断片を構築する場合は、可変領域又はそれらの部分を、１又は複数の定常領域又はそれらの部分に融合させるか、連結するか、又は他の形で接合して、本明細書で説明される抗体又はそれらの断片のうちのいずれかを作製することができる。これは、分子クローニング法、又は該分子をコードする核酸の直接的な合成が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で知られる各種の方法により達成することができる。また、本明細書で説明される例においても、これらの分子を構築するための、非限定的な例示的方法を見出すことができる。
例示的な一実施形態では、本出願が、エンドグリンに結合し、且つ、場合によって、免疫グロブリンのＦｃ領域を有する重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を有する、単鎖結合ポリペプチドを意図する。例示的な一実施形態では、本出願が、エンドグリンに結合して血管新生を阻害し、且つ、場合によって、免疫グロブリンのＦｃ領域を有する重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を有する、単鎖結合ポリペプチドを意図する。このような分子は、場合によって、免疫グロブリンのＦｃ領域が存在することを介して、エフェクター機能を有するか、又は半減期が延長された、単鎖可変領域断片である。当技術分野では、単鎖結合ポリペプチドを調製する方法が知られている（例えば、米国特許出願第２００５／０２３８６４６号）。
「生殖細胞系列の遺伝子セグメント」又は「生殖細胞系列の配列」という用語は、生殖細胞系列（生殖細胞系列がそれに由来して形成される配偶子並びにこれらの二倍体細胞）に由来する遺伝子を指す。生殖細胞系列のＤＮＡは、単一のＩｇ重鎖又はＩｇ軽鎖をコードする複数の遺伝子セグメントを含有する。これらの遺伝子セグメントは、胚細胞内に保有されるが、それらが機能的遺伝子へと構成されるまでは、重鎖及び軽鎖へと転写及び翻訳される可能性がない。骨髄においてＢ細胞が分化するときに、これらの遺伝子セグメントは、１０８通りを超える特異性を生成させることが可能な動的遺伝子システムにより無作為にシャフリングされる。これらの遺伝子セグメントの大半は、生殖細胞系列のデータベースにより公表及び収集されている。
本明細書で用いられる「免疫反応性」とは、結合剤、抗体又はその断片が、アミノ酸残基の配列（「結合部位」又は「エピトープ」）に特異的であり、さらにまた、他のペプチド／タンパク質と交差反応性であっても、それらをヒトへの投与用に製剤化するレベルでは毒性でないことを指す。「結合」という用語は、例えば、生理学的条件下における共有結合による相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、並びにイオン性相互作用及び／又は水素結合による相互作用に起因する、２つの分子間における直接的な会合を指し、これには、塩架橋及び水架橋などの相互作用、並びに他の任意の従来の結合手段が含まれる。「優先的に結合する」という用語は、結合剤が、非類縁のアミノ酸配列に結合する場合のアフィニティーを超えるアフィニティーで結合部位に結合することを意味する。このようなアフィニティーは、非類縁のアミノ酸配列に対する該結合剤のアフィニティーの少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍であるか、１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍であるか、又は少なくとも１０００倍であることが好ましい。本明細書では、「免疫反応性」という用語と、「優先的に結合する」という用語とを互換的に用いる。
本明細書で用いられる「アフィニティー」という用語は、２つの薬剤の可逆的結合についての平衡定数を指し、ＫＤとして表す。抗体のエピトープに対するアフィニティーなど、結合タンパク質のリガンドに対するアフィニティーは、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）〜約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１ピコモル（ｐＭ）、又は約１００ｎＭ〜約１フェムトモル（ｆＭ）でありうる。本明細書で用いられる「アビディティー」という用語は、２つ以上の薬剤の複合体が、希釈後の解離に対して示す抵抗性を指す。みかけのアフィニティーは、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）、又は当業者によく知られる他の任意の技法などの方法により決定することができる。アビディティーは、スカチャード解析、又は当業者によく知られる他の任意の技法などの方法により決定することができる。
「エピトープ」とは、抗体の可変領域結合ポケットと結合相互作用を形成することが可能な、抗原又は他の高分子の部分を指す。このような結合相互作用は、１又は複数のＣＤＲの１又は複数のアミノ酸残基との分子間接触として顕在化されうる。抗原の結合は、例えば、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のうち、ＣＤＲ３若しくはＣＤＲ３対、又は、場合によって、最大で６つのＣＤＲすべてによる相互作用を伴いうる。エピトープは、直鎖状のペプチド配列（すなわち、「連続」エピトープ）の場合もあり、不連続的なアミノ酸配列（すなわち、「立体構造」エピトープ又は「不連続」エピトープ）の場合もある。抗体は、１又は複数のアミノ酸配列を認識することが可能であり、したがって、エピトープは、複数の異なるアミノ酸配列を規定しうる。抗体により認識されるエピトープは、当業者によく知られるペプチドマッピング法及び配列解析法により決定することができる。結合相互作用は、ＣＤＲのうちの１又は複数のアミノ酸残基との分子間接触として顕在化される。ＴＲＣ１０５は、米国特許第５，９２８，６４１号；同第６，２００，５６６号；同第６，１９０，６６０号；及び同第７，０９７，８３６号においてＹ４−２Ｆ１又はＳＮ６ｊとして説明されたマウス抗体と同じ可変領域のアミノ酸配列を有するキメラ抗体である。Ｙ４−２Ｆ１及びＳＮ６ｊにより認識されるエピトープ、したがって、ＴＲＣ１０５によって認識されるエピトープは、既に同定されている。
「特異的な」という用語は、抗体が、それにより認識されるエピトープを含有する抗原以外の分子に対して著明な結合を示さない状況を指す。この用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが、多数の抗原により保有される特定のエピトープに対して特異的である場合にも適用可能であり、この場合、該抗原結合ドメインを保有する抗体又はその抗原結合断片は、該エピトープを保有する多様な抗原に結合することが可能である。「優先的に結合する」又は「特異的に結合する」という用語は、抗体又はそれらの断片が、非類縁のアミノ酸配列に結合する場合のアフィニティーを超えるアフィニティーでエピトープに結合し、且つ、該エピトープを含有する他のポリペプチドと交差反応性の場合であっても、それらをヒトへの投与使に製剤化するレベルでは毒性でないことを意味する。一態様では、このようなアフィニティーが、非類縁のアミノ酸配列に対する該抗体又はその断片のアフィニティーの少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍であるか、１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍であるか、又は少なくとも１０００倍であることが好ましい。本明細書では、「免疫反応性」、「結合する」、「優先的に結合する」、並びに「特異的に結合する」という用語を互換的に用いる。「結合」という用語は、例えば、生理学的条件下における共有結合による相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、並びにイオン性相互作用及び／又は水素結合による相互作用に起因する、２つの分子間における直接的な会合を指し、これには、塩架橋及び水架橋などの相互作用、並びに従来の他の結合手段が含まれる。
「保存的アミノ酸置換」という語句は、ある共通の特性に基づくアミノ酸の群分けを指す。個々のアミノ酸間における共通の特性を規定する機能的な方法は、同種生物の対応するタンパク質間におけるアミノ酸変化の標準化頻度を解析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．及びＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このような解析によれば、ある群内のアミノ酸が、互いと優先的に交換され、したがって、全体的なタンパク質構造に対するそれらの影響において互いに類似し合うアミノ酸群を規定することができる（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．及びＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このような形で規定されるアミノ酸群の例には、
（ｉ）Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる帯電基
（ｉｉ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる正帯電基
（ｉｉｉ）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる負帯電基
（ｉｖ）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐからなる芳香環基
（ｖ）Ｈｉｓ及びＴｒｐからなる窒素環基
（ｖｉ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる高分子の脂肪族の非極性基
（ｖｉｉ）Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる弱極性基
（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ及びＰｒｏからなる低分子残基
（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる脂肪族基、並びに
（ｘ）Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる低分子のヒドロキシル基
が含まれる。
上記で提示された群に加え、各アミノ酸残基は、その固有の群を形成することが可能であり、個々のアミノ酸により形成される群を、上記で説明した通りに当技術分野で一般的に用いられる、このアミノ酸に対する一文字及び／又は三文字の短縮形により簡潔に指し示すことができる。
「保存的残基」とは、ある範囲にわたる類似のタンパク質を通じて比較的不変であるアミノ酸である。保存的残基の変化は、「保存的アミノ酸置換」について上記で説明した類似のアミノ酸による置換だけによる。
本明細書のアミノ酸配列で用いられる「ｘ」又は「ｘａａ」という文字は、別段に具体的に言及しない限り、２０の標準的アミノ酸のうちのいずれかをこの位置に配置しうることを示唆する。ペプチド模倣体をデザインする目的では、アミノ酸配列中の「ｘ」又は「ｘａａ」を、標的配列中に存在するアミノ酸の模倣体で置換することもでき、該ペプチド模倣体の活性に干渉しない、本質的に任意の形態のスペーサーで該アミノ酸を置換することもできる。
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」とは、２つのペプチド間における配列類似性、又は２つの核酸分子間における配列類似性を指す。比較を目的として配列決定しうる、各配列内の位置を比較することにより、相同性及び同一性の各々を決定することができる。比較される配列内の同等の位置が、同じ塩基又はアミノ酸で占有されている場合は、該分子がその位置で同一であり、同じアミノ酸残基又は類似のアミノ酸残基（例えば、立体的性質及び／又は電子的性質において類似するアミノ酸残基）により同等の部位が占有されている場合は、該分子がその位置で相同である（類似する）と称することができる。相同性／類似性又は同一性の百分率としての表現は、比較される配列により共有される位置において同一であるか又は類似するアミノ酸の数の関数を指す。「非類縁」又は「非相同」である配列が共有する同一性は４０％未満であるが、本発明の配列との同一性は２５％未満であることが好ましい。２つの配列を比較するときはまた、残基（アミノ酸又は核酸）が存在しなくても、過剰な残基が存在しても、同一性及び相同性／類似性が低下する。
「相同性」という用語は、類似の機能又はモチーフを伴う遺伝子又はタンパク質を同定するのに用いられる、数学的計算に基づく配列類似性の比較について述べる。本発明の核酸（ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド）配列及びアミノ酸（タンパク質）配列は、例えば、他のファミリーメンバー、類縁配列、又は相同体を同定する目的で、公共のデータベースに対する検索を実施するための「探索配列」として用いることができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０によるＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）を用いて実施することができる。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るためには、スコア＝１００、ワード長＝１２のＮＢＬＡＳＴプログラムにより、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施することができる。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るためには、スコア＝５０、ワード長＝３のＸＢＬＡＳＴプログラムにより、ＢＬＡＳＴアミノ酸検索を実施することができる。比較を目的として、ギャップを伴う配列決定を行うためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２において説明される通りに、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを使用することができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラム及びＢＬＡＳＴプログラム）のデフォルトのパラメータを用いることができる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。
本明細書で用いられる「同一性」とは、２つ以上の配列を、配列マッチングを最大化するように、すなわち、ギャップ及び挿入を考慮に入れて配列決定するときに、これらの配列の対応する位置において同一なヌクレオチド又はアミノ酸残基の百分率を意味する。同一性は、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ」、Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；並びに「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ」、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ、Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）において説明されている方法が含まれるがこれらに限定されない既知の方法により容易に計算することができる。調べる配列間に最大のマッチを与えるように、同一性を決定する方法をデザインする。さらに、同一性を決定する方法を、一般に入手可能なコンピュータプログラムにより体系化することができる。２つの配列間における同一性を決定するコンピュータプログラムによる方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）；並びにＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７））が含まれるがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ並びに他の供給源（「ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ」、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））から一般に入手可能である。同一性を決定するにはまた、周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎによるアルゴリズムも用いることができる。
ポリペプチドに対して適用される場合の「単離」（「実質的に純粋」と互換的に用いられる）とは、その由来又は操作により、（ｉ）発現ベクターの部分による発現産物として宿主細胞内に存在するか、又は（ｉｉ）天然においてそれが連結されているタンパク質若しくは他の化学的部分以外のタンパク質若しくは他の化学的部分に連結されているか、又は（ｉｉｉ）天然では存在しない、例えば、それが、天然では見出されない形態にあるように、それに少なくとも１つの疎水性部分を添加又は付加することを介して化学的に操作されているタンパク質である、ポリペプチド又はその部分を意味する。「単離」とはさらに、（ｉ）化学的に合成されているタンパク質、又は（ｉｉ）宿主細胞内で発現し、且つ、会合及び夾雑するタンパク質から精製されているタンパク質も意味する。該用語は一般に、天然ではそれが共に存在する他のタンパク質及び核酸から分離されているポリペプチドを意味する。ポリペプチドはまた、それを精製する目的で用いられる抗体又はゲルマトリックス（ポリアクリルアミドゲルマトリックス）などの物質からも分離されていることが好ましい。
本明細書で用いられる「血管新生阻害性」、「血管新生阻害」、又は「抗血管新生」という用語は、血管形成を包含し、新血管形成の程度、量、又は速度を低下させる手段を意味することを意図する。組織における内皮細胞の増殖又は遊走の程度、量、又は速度を低下させることは、血管新生を阻害することの具体例である。
「血管新生阻害性組成物」という用語は、内皮細胞の遊走、増殖、管形成など、血管新生を介する過程を阻害し、その後、既存の血管から新たな血管が形成されることを阻害し、結果として、血管新生依存性状態に影響を及ぼす組成物を指す。
本明細書で用いられる「血管新生依存性状態」とは、血管新生又は血管形成の過程が、病理学的状態を持続若しくは増進させるか、又は正常な生理学的過程に有益な影響を及ぼす状態を意味することを意図する。したがって、血管新生が病理学的状態を持続させている血管新生依存性状態を治療すれば、疾患の緩和が結果としてもたらされうるのに対し、血管新生が正常な生理学的過程に有益な影響を及ぼしている血管新生依存性状態を治療すれば、例えば、正常な過程が増強されうるであろう。
血管新生は、既存の毛細血管又は毛細血管発生後の小血管から新たな血管が形成されることである。血管形成は、内皮細胞の前駆体である血管芽細胞から生じる新たな血管の形成の結果としてもたらされる。いずれの過程も、新たな血管の形成を結果としてもたらし、血管形成依存性状態という用語の意味の範囲内に包含される。本明細書で用いられる「血管新生」という用語は、血管形成から生じる血管のほか、既存の血管である毛細血管及び小血管が分枝及び出芽することから生じる血管などが新規に形成されることを包含することを意図する。血管新生はまた、ＡＬＫ１によるシグナル伝達並びに関連のＳｍａｄ１／５／８のリン酸化並びに／又はこれによるシグナル伝達の誘導も包含しうる。また、ＣＤ１０５も、ＡＬＫ１によるシグナル伝達経路に関与することが知られており、したがってまた、血管新生の意味の範囲内に包含される。
「宿主免疫反応の誘導」とは、患者が、疾病の徴候又は症状の緩和又は軽減を経験することを意味し、限定なしに述べれば、具体的に、生存の延長がこれに含まれる。本発明による方法のある好ましい実施形態では、該アンタゴニストを投与された患者において、ＩＦＮ−γを生成させるＣＤ８＋ Ｔ細胞が活性化されて、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による免疫反応が誘導される。本発明による方法のある実施形態では、該組成物を投与された患者において、ＩＦＮ−γを生成させるＣＤ４＋ Ｔ細胞が活性化されて、ヘルパーＴ細胞による免疫反応が誘導される。これらのＩＦＮ−γを生成させる活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞（すなわち、ヘルパーＴ細胞）は、ＣＴＬだけでなく、Ｂ細胞を介する体液性免疫反応も誘導及び維持するのに必要な免疫的支援（例えば、サイトカインの放出を介する）をもたらす。したがって、本発明による方法のある実施形態では、該組成物を投与された患者において、抗原に対する体液性免疫反応が活性化される。一態様では、該組成物にアジュバントを添加して、免疫反応を増大させることができる。当技術分野ではアジュバントがよく知られている。
ＣＤ８＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞の活性化とは、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）を生成させる能力を有するＴ細胞に、１若しくは複数のサイトカインを実際に生成させるか、又はそれらによる１若しくは複数のサイトカインの生成を増大させることを意味する。「ＣＴＬ反応の誘導」とは、潜在的な細胞傷害性Ｔリンパ球に、抗原特異的な細胞傷害作用を呈示させることを意味する。「抗原特異的な細胞傷害作用」とは、がんと関連する抗原を提示する細胞に対する細胞傷害作用が、がんと関連しない抗原を提示する細胞に対する細胞傷害作用より大きいことを意味する。「細胞傷害作用」とは、細胞傷害性Ｔリンパ球が、標的細胞を死滅させる能力を指す。このような抗原特異的な細胞傷害作用は、がんと関連しない抗原を提示する細胞に対する細胞傷害作用の少なくとも約３倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍以上でありうる。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）はまた、抗体の結合を介して細胞の殺滅を媒介するナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」）の活性化も包含する。本明細書で説明される抗体並びに抗原結合断片は、エンドグリンへの結合を介して、ＮＫ細胞によるＡＤＣＣを媒介しうる。
本明細書で用いられる「増殖性障害」及び「増殖性状態」という用語は、異常な増殖又は望ましくない増殖を特徴とする、任意の病理学的状態又は非病理学的な生理学的状態を意味する。「細胞増殖性障害」及び「細胞増殖性状態」という用語は、異常な細胞増殖又は望ましくない細胞増殖を特徴とする、任意の病理学的状態又は非病理学的な生理学的状態を意味するほか、望ましくない細胞増殖若しくは細胞存続又は有害な細胞増殖若しくは細胞存続（例えば、アポトーシスの欠損に起因する）を特徴とする状態、アポトーシスの欠損又は異常を特徴とする状態、並びに異常であるか、又は望ましくないか、又は有害な細胞存続を特徴とする状態も包含する。「分化障害」という用語は、分化の異常又は欠損を特徴とする任意の病理学的状態又は非病理学的な生理学的状態を意味する。
治療に適する増殖性障害又は分化障害は、異常であるか又は望ましくない細胞数、細胞増殖、又は細胞存続を特徴とする、良性及び新生物性の疾患並びに非病理学的な生理学的状態を包含する。したがって、このような障害又は状態が疾患状態を構成し、且つ、すべての種類のがん性増殖若しくは発癌性過程、転移性組織、又は悪性形質転換細胞、悪性形質転換組織、若しくは悪性形質転換器官を包含する場合もあり、非病理学的である、すなわち、正常からの逸脱が見られるが、典型的に疾患を随伴させるわけではない場合もある。本発明に従って治療しうる非病理学的状態の具体例は、瘢痕を結果としてもたらす、創傷修復に由来する組織の再増殖である。
増殖性障害又は分化障害を含む細胞は、細胞塊に凝集する場合もあり、分散する場合もある。「充実性腫瘍」という用語は、一体に凝集し、且つ、集塊を形成することが典型的な新生物又は転移を指す。具体例には、胃がん又は結腸がん、肝腫、腎癌、肺癌、及び脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ／ｃａｎｃｅｒ）などの悪性腫瘍が含まれる。「非充実性腫瘍」とは、それらが充実性の集塊を形成しないことが典型的であるので、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病など、造血系の新生物又はびまん性の新生物を指す。白血病の具体例には、例えば、急性リンパ芽球性骨髄腫及び慢性リンパ芽球性骨髄腫、急性骨髄芽球性骨髄腫及び慢性骨髄芽球性骨髄腫、並びに急性多発性骨髄腫及び慢性多発性骨髄腫が含まれる。
このような障害には、事実上任意の細胞型又は組織型が罹患しうる新生物又はがん、例えば、癌腫、肉腫、黒色腫、転移性障害、又は造血系の新生物性障害が含まれる。転移性腫瘍は、乳房、肺、甲状腺、頭頚部、脳、リンパ、消化器（口腔、食道、胃、十二指腸、結腸、直腸）、生殖−泌尿器（子宮、卵巣、子宮頚部、膀胱、精巣、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓癌、肝臓、骨、筋肉、皮膚などの腫瘍が含まれるがこれらに限定されない多数の原発性腫瘍型から生じうる。
癌腫とは、上皮組織又は内分泌組織の悪性腫瘍を指し、これらには、呼吸器系癌、消化器系癌、生殖泌尿器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、及び黒色腫が含まれる。例示的な癌腫には、子宮頚部、肺、前立腺、乳腺、頭頚部、結腸、肝臓、及び卵巣から形成される癌腫が含まれる。癌腫という用語はまた、例えば、癌腫性組織及び肉腫性組織からなる悪性腫瘍を包含する癌肉腫も包含する。腺癌腫には、腺状組織の癌腫、又はその中で腫瘍が腺様構造を形成する癌腫が含まれる。
治療される眼組織は、例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性、又は新血管形成性緑内障を有する患者の網膜組織であり、阻害される血管新生は、網膜組織の新血管形成が見られる、網膜組織血管新生である。
治療されるがん性組織は、例えば、異常なレベルのエンドグリンを発現させる内皮組織である。本明細書で用いられる「形質転換細胞」という用語は、無制限の増殖状態へと自発的に転換された細胞、すなわち、細胞が、培養物中で無際限の数の分裂を介して増殖する能力を獲得した状態を指す。形質転換細胞は、それらが増殖の制御を喪失したことに関する、新生物性、退形成性及び／又は過形成性などの用語により特徴付けることができる。本発明の目的では、「悪性哺乳動物細胞の形質転換表現型」及び「形質転換表現型」という用語が、哺乳動物細胞の細胞形質転換と関連する以下の表現型形質：不死化；形態性の形質転換又は増殖性の形質転換；並びに細胞培養物中の増殖の遷延、半固体培地中の増殖の遷延、又は免疫不全の動物又は同系動物における腫瘍形成性増殖により検出される腫瘍原性のうちのいずれかを包含するが、これらに限定されないことを意図する。
本明細書では、「腫瘍細胞抗原」という用語が、非類縁の腫瘍細胞、正常細胞、又は正常体液中において存在するより、腫瘍細胞又は腫瘍性体液においてより高量で存在する抗原として定義される。抗原の存在は、当業者に知られる任意の数のアッセイにより検査することができ、限定なしに述べれば、これらのアッセイには、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラジオイムノアッセイ、又はウェスタンブロットなどを介して、抗体を伴う陰性選択及び／又は陽性選択が含まれる。
「アポトーシス」又は「プログラム細胞死」という用語は、発生並びに他の正常な生物学的過程において、有害細胞又は不要細胞を消失させる生理学的過程を指す。アポトーシスは、正常な生理学的条件下で生じる細胞死の方式であり、細胞は、それ自身の消滅（「細胞による自死」）への能動的な関与体である。アポトーシスは、正常な細胞回転並びに組織のホメオスタシス、胚形成、免疫忍容性の誘導及び維持、神経系の発生、並びに内分泌依存性組織萎縮において見出されることが最も多い。アポトーシスを経つつある細胞は、特徴的な形態的特色及び生化学的特色を示す。これらの特色には、クロマチンの凝集；核及び細胞質の凝縮；リボソーム、形態的に完全なミトコンドリア、並びに核内物質を含有する膜結合小胞（アポトーシス小体）への細胞質及び核の断片化が含まれる。ｉｎ ｖｉｖｏでは、これらのアポトーシス小体が、マクロファージ、樹状細胞、又は隣接する上皮細胞により迅速に認識され、且つ、貪食される。ｉｎ ｖｉｖｏでは、アポトーシス細胞を除去するためのこのように効率的な機構が存在するために、炎症反応が誘発されることはない。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、アポトーシス小体並びに残りの細胞断片が、最終的には腫脹し、ついには溶解する。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞死のこの終末相は、「二次的壊死」と呼ばれている。アポトーシスは、ＤＮＡの断片化、アネキシンＶの曝露量、カスパーゼの活性化、チトクロームｃの放出など、当業者に知られている方法により測定することができる。本明細書では、死滅するように誘導された細胞を、「アポトーシス細胞」と称する。
本明細書では、「アポトーシス誘導剤」を、アポトーシス／プログラム細胞死を誘導する薬剤と定義し、これには、例えば、放射線照射、細胞、例えば、腫瘍細胞を、プログラム細胞死を経るように誘導する化学療法剤又は受容体ライゲーション剤が含まれる。例示的なアポトーシス誘導剤については、以下でより詳細に説明する。
アポトーシスは、標準的なアネキシンＶアポトーシスアッセイを用いて検査することができる：６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）内でＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３細胞を増殖させ、放射線照射を施すか、又は４〜４８時間にわたりアンタゴニスト（又は別の抗がん薬と組み合わせた）で処理し、洗浄し、１時間にわたりアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色する。フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）により細胞を解析し、ヨウ化プロピジウムで対比染色し、フローサイトメトリーにより再度解析する。
Ｂ．ヒト化抗エンドグリン抗体を作製し、発現させる方法
エンドグリンに結合するキメラモノクローナル抗体が開発されている。この抗体は、ＴＲ１０５（また、ｃ−ＳＮ６ｊとしても知られている）と命名されている。
一態様では、キメラモノクローナル抗体であるＴＲＣ１０５抗体のＶＬ配列及びＶＨ配列（それぞれ、配列番号１及び３９）をヒト化することにより、本明細書で説明される抗体並びにそれらの抗原結合断片を創出した。
ヒト化抗体を含めたヒト化免疫グロブリンは、遺伝子操作により構築されている。既に説明されている大半のヒト化免疫グロブリンは、特定のヒト免疫グロブリン鎖（すなわち、アクセプター又はレシピエント）のフレームワークと同一のフレームワークと、非ヒト（すなわちドナー）免疫グロブリン鎖に由来する３つのＣＤＲとを含んでいる。本明細書で説明される通り、ヒト化はまた、ヒト化免疫グロブリン鎖を含む抗体のアフィニティーを増大させるか又は維持するために、それにより、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワーク内の限定された数のアミノ酸を同定し、アクセプターではなくドナーにおけるこれらの位置のアミノ酸と同じアミノ酸であるようにこれらを選択するための基準も包含しうる。
本発明は、ヒト化抗体を作製する先行手段（例として述べると、マウス抗体をＣＤＲの供給源として用いる手段）において、アフィニティーの喪失に寄与する２つの原因が、（１）マウスＣＤＲをヒトフレームワークと組み合わせると、該フレームワーク内の、ＣＤＲに近接するアミノ酸が、マウスアミノ酸ではなく、ヒトアミノ酸となること；理論により拘束されることを意図せずに述べると、これらのアミノ酸の変化は、ＣＤＲをわずかながら歪ませる可能性があること（例えば、アミノ酸の変化は、ドナーのマウス抗体における静電相互作用力又は疎水性相互作用力とは異なる静電相互作用力又は疎水性相互作用力を創出する可能性があり、ＣＤＲがドナー抗体においてもたらした抗原との接触と同程度に有効な接触を、該歪んだＣＤＲはもたらさない可能性があること）であり；（２）また、ＣＤＲに近接するが、その一部ではない（すなわち、やはりフレームワークの一部である）元のマウス抗体内のアミノ酸も抗原と接触し、これがアフィニティーに寄与することである、というモデルに部分的に基づいている。抗体をヒト化すると一般に、フレームワークのアミノ酸がすべてヒトアミノ酸となるため、これらのアミノ酸は失われる。これらの問題を回避し、所望の抗原に対するアフィニティーが極めて強力なヒト化抗体を作製するために、以下の原理のうちの１又は複数を用いて、ヒト化抗体並びにそれらの抗原結合断片を構築することができる。
非限定的な一原理は、例えば、通常とは異なり、ヒト化されるドナー免疫グロブリンと相同である特定のヒト免疫グロブリンに由来するフレームワークをアクセプターとして用いるか、又は多くのヒト抗体に由来するコンセンサスフレームワークをアクセプターとして用いるということである。例えば、マウス重鎖（又は軽鎖）可変領域を、データバンク（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ；又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のタンパク質配列データベース）内のヒト重鎖（又は軽鎖）可変領域と対比すると、異なるヒト領域に対する相同性の程度は、大幅に、例えば、約４０％〜約６０％、約７０％、約８０％以上異なりうることが示される。ドナー免疫グロブリンの重鎖可変領域と最も相同的なヒト重鎖可変領域のうちの１つをアクセプター免疫グロブリンとして選択することにより、ドナー免疫グロブリンからヒト化免疫グロブリンへの移行において変化するアミノ酸が減少する。ドナー免疫グロブリンの軽鎖可変領域と最も相同的なヒト軽鎖可変領域のうちの１つをアクセプター免疫グロブリンとして選択することにより、ドナー免疫グロブリンからヒト化免疫グロブリンへの移行において変化するアミノ酸が減少する。一般に、このような技法を用いると、ＣＤＲのうちの１又は複数に近接するアミノ酸を変化させることによりそれらの立体構造を歪ませる可能性が低減される。さらに、ヒト化免疫グロブリン鎖を含むヒト化抗体全体の正確な形状を、ドナー抗体の形状に、より酷似させることができ、これによってもまた、ＣＤＲを歪ませる可能性が低減される。
また、同じヒト抗体に由来する軽鎖及び重鎖をアクセプター配列として用いて、該ヒト化軽鎖及びヒト化重鎖が互いと好ましい接触をもたらし合う可能性を向上させることもできる。代替的にまた、ヒト生殖細胞系列による異なる抗体配列に由来する軽鎖及び重鎖をアクセプター配列として用いることもでき、このような組合せを用いると、ＶＨ及びＶＬが対象のエピトープに結合するかどうかを、従来のアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて容易に決定することができる。一例では、軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を併せた全体が、ドナーの軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列と極めて相同的となるヒト抗体を選択する。場合によっては、重鎖配列に、より大きな重みをつける。アクセプター免疫グロブリンをどのようにして選択するかとは関わりなく、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワークにおける少数のアミノ酸を、アクセプターではなくドナーにおけるこれらの位置のアミノ酸と同じアミノ酸となるように選択することにより、場合によっては、より高度なアフィニティーを達成することができる。当技術分野では、アフィニティー成熟の方法が知られている。
ヒト化抗体は一般に、ヒト治療に用いるのに、マウス抗体又はキメラ抗体を上回る、少なくとも３つの潜在的な利点を有する。抗体のエフェクター部分がヒト抗体であるため、ヒト化抗体は、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用する（例えば、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）により、より効率的に標的細胞を破壊する）と考えられる。加えて、ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワーク領域又は定常領域を異物としては認識しないはずであり、したがって、このような注射抗体に対する抗体反応は、完全に異物のマウス抗体又は部分的に異物のキメラ抗体に対する抗体反応より低度なはずである。最後に、マウス抗体のヒト循環における半減期は、ヒト抗体の半減期よりはるかに短いことが知られている。ヒト化抗体の半減期は、天然のヒト抗体の半減期により近似しうると推測され、これにより、施される投与をより少数回であり、且つより低頻度とすることができる。
抗体並びにそれらの抗原結合断片のヒト化は、当技術分野において知られており、本明細書でも説明される各種の方法により達成することができる。同様にまた、ヒト化抗体の作製も、当技術分野において知られており、本明細書でも説明される各種の方法により達成することができる。
フレームワーク領域を修飾する方法は、当技術分野において知られており、本明細書でも意図される。変化に関与する１又は複数のフレームワークアミノ酸の位置の選択は、各種の基準に依存する。変化に関与するフレームワークアミノ酸を選択するための１つの基準は、ドナー分子とアクセプター分子とのアミノ酸フレームワーク残基の相対的な差違でありうる。この手法を用いる、変化に関与するフレームワークの位置の選択は、残基の決定における任意の主観的バイアス、又は該残基によるＣＤＲの結合アフィニティーへの寄与における任意のバイアスを回避する利点を有する。
変化に関与するアミノ酸位置を決定するのに用いられうる別の基準は、例えば、ＣＤＲの立体構造にとって重要であるか、又はこれに寄与することが知られているフレームワーク残基の選択でありうる。例えば、カノニカルフレームワーク残基が、ＣＤＲの立体構造及び／又は構造にとって重要である。カノニカルフレームワーク残基を変化に関与する位置として標的化することを用いて、それと関連するドナーＣＤＲ配列に照らして、より適合性のアミノ酸残基を同定することができる。
特定のフレームワーク位置におけるアミノ酸残基の頻度は、変化に関与するフレームワークのアミノ酸位置を選択するのに用いうる別の基準である。例えば、選択されたフレームワークを、そのサブファミリー内の他のフレームワーク配列と比較することにより、１又は複数の特定の位置において低頻度で生じる残基を明らかにすることができる。存在度が低度である残基を保有する位置も同様に、アクセプター可変領域のフレームワークにおいて変化させる位置としての選択に適用可能である。
変化に関与するアミノ酸位置はまた、例えば、ＣＤＲに対する近接性に基づいても選択することができる。ある文脈では、ＦＲ残基が、ＣＤＲの立体構造並びに／又は抗原との結合に関与する可能性がある。さらに、この基準は同様に、本明細書で説明される他の基準によって選択される関与性の位置を優先するのにも用いることができる。したがって、１又は複数のＣＤＲに対して近位の残基と遠位の残基とを差別化することは、変化に関与する位置の数を低減するための一方法を表す。
変化に関与するフレームワークのアミノ酸位置を選択するための他の基準には、例えば、三次元空間において抗原−ＣＤＲ間インターフェースに近接して存在することが知られるか又はそのように予測されている残基、又はＣＤＲの活性を調節することが予測されている残基が含まれる。同様に、重（ＶＨ）鎖可変領域と軽（ＶＬ）鎖可変領域との間のインターフェースにおいて接触を形成することが知られているか、又はそのように予測されているフレームワーク残基も選択することができる。このようなフレームワーク位置は、ＣＤＲ結合ポケット、抗原（エピトープ）との相互作用、又はＶＨ鎖とＶＬ鎖との相互作用を調節することを介して、ＣＤＲの立体構造及び／又はアフィニティーに影響を及ぼしうる。したがって、これらのアミノ酸を選択して、結合活性をスクリーニングするための多様な集団を構築すると、ＣＤＲの立体構造に対して有害な作用を及ぼす残基を置換するか、又はフレームワークの他の位置で生じる残基の有害な作用を補正するフレームワークの変化を同定するのにこれを用いることができる。
変化させるのに選択しうる他のフレームワーク残基には、溶媒と接触不可能であるアミノ酸位置が含まれる。このような残基は一般に、可変領域内に包埋されており、したがって、ＣＤＲの立体構造又はＶＨ鎖とＶＬ鎖との相互作用に影響を及ぼすことが可能である。溶媒との接触可能性は、例えば、ポリペプチドのアミノ酸側鎖により創出される環境の相対的な疎水性から予測することもでき、且つ／又は既知の三次元構造データを介して予測することもできる。
ドナーＣＤＲにおける関与性のアミノ酸位置、並びに変化が所望されるフレームワーク領域内の任意の関与性のアミノ酸位置を選択した後では、選択された位置のうちの一部又は全部におけるアミノ酸変化を、アクセプターの可変領域フレームワーク並びにドナーのＣＤＲをコードする核酸に組み込むことができる。変化させたフレームワーク配列又はＣＤＲ配列は、個別に作製及び検査することもでき、逐次的又は同時的に組み合わせて検査することもできる。
変化させた位置のうちのいずれか又はすべてにおけるばらつきは、２０の天然アミノ酸すべて又はこれらの機能的同等物及び類似体を含め、数個から多数個の異なるアミノ酸残基の範囲にわたりうる。場合によってはまた、非天然アミノ酸も考慮することが可能であり、当技術分野ではこれらが知られている。
変化させるアミノ酸位置の数及び配置の選択は柔軟であり、ドナー可変領域と比較して実質的に同じであるかこれを超える結合アフィニティーなど、所望の活性を有する改変可変領域を同定するのに意図される使用並びにこれに所望される効率に依存しうる。この点では、改変可変領域集団に組み込まれる変化の数が増大するほど、所望の活性、例えば、ドナーと実質的に同じであるか又はこれを超える結合アフィニティーを呈示する少なくとも１つの分子種を同定することがより効率的となる。代替的に、あるアミノ酸残基又はアミノ酸位置が、結合アフィニティーに大きく寄与するような経験的データ又は実際的なデータを使用者が有する場合は、これらの同定された残基又は位置の範囲内又はこれらの近傍における変化に焦点を絞る改変可変領域の限定された集団を作製することが望ましい場合がある。
例えば、ＣＤＲを移植させた可変領域を所望する場合は、改変可変領域の大規模で多様な集団が、ドナーフレームワークとアクセプターフレームワークとの間の、すべての同一でないフレームワーク領域位置と、すべての単一のＣＤＲアミノ酸位置の変化とを包含しうる。代替的に、多様性が中間的な集団には、例えば、ヒト化抗体又は抗原結合断片のアフィニティーを増大させるすべての単一のＣＤＲアミノ酸位置の変化と併せて組み込まれる、同一でない近位のフレームワーク位置だけのサブセットが含まれうる。例えば、すべてのＣＤＲアミノ酸位置の対様変化を加えて組み入れることにより、上記の集団の多様性をさらに増大させることができる。これに対し、１つのフレームワークのアミノ酸位置並びに／又は１つのＣＤＲのアミノ酸位置という少数の位置において変異体残基を組み込む、所定の残基又は位置に焦点を当てる集団も同様に、改変抗体可変領域をスクリーニング及び同定する目的で構築することができる。上記の集団と同様に、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の一方又は両方における他の関与性の位置を包含するように、変化させるのに選択される位置をさらに拡大することにより、このように焦点を絞った集団の多様性をさらに増大させることもできる。数個の変化〜多数個の変化の範囲にわたる多数の他の組合せを、フレームワーク領域及びＣＤＲの一方又は両方でさらに使用することができ、これらのすべてにより、所望の活性、例えば、エンドグリンに対する結合活性を有する、ＣＤＲを移植した少なくとも１つの改変可変領域を同定するのにスクリーニングしうる、改変可変領域の集団が結果としてもたらされる。本明細書で示される教示及び指針を踏まえるなら、当業者は、フレームワーク若しくはドナーＣＤＲにおいて選択された残基位置又はそれらのサブセットのうちのいずれを変化させて、本発明の改変抗体をスクリーニング及び同定するための集団を作製しうるかを知るか、又は決定することができる。当技術分野では、アミノ酸をコードするコドンが知られている。
抗体をヒト化する別の方法には、「超ヒト化」と称する方法が含まれる。超ヒト化は、非ヒト成熟抗体遺伝子によりコードされる対象可変領域のペプチド配列を得るステップと、該非ヒト抗体可変領域内の少なくとも２つのＣＤＲについて、カノニカルＣＤＲ構造型の第１のセットを同定するステップとを伴う。カノニカルＣＤＲ構造型とは、Ｃｈｏｔｈｉａにより命名された構造型（ＣＩＴＥ）である。Ｃｈｏｔｈｉａらは、多くの抗体のＣＤＲの最重要部分が、アミノ酸配列レベルにおける多様性の大きさにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格の立体構造を採用していることを見出した。これにより、Ｃｈｏｔｈｉａは、各鎖における各ＣＤＲについて、１個又は数個の「カノニカル構造」を定義した。各カノニカル構造は、主に、ループを形成するアミノ酸残基の隣接セグメントについて、ペプチド骨格のねじれ角のセットを指定する。
カノニカルＣＤＲ構造型を同定した後ではまた、ヒト抗体のヒト抗体可変領域についてのペプチド配列ライブラリーも得られる。このライブラリーは、ヒト生殖細胞系列の核酸セグメントによりコードされる生殖細胞系列可変領域の配列を含有し、且つ、成熟ヒト抗体配列も包含しうる。いずれの場合にも、該方法は、ヒト可変領域配列のライブラリー内の各配列につき、少なくとも２つずつのＣＤＲのカノニカルＣＤＲ構造型（すなわち、カノニカルＣＤＲ構造型の第２のセット）を同定するステップを包含する。カノニカルＣＤＲ構造型の第１のセットを、カノニカルＣＤＲ構造型の第２のセットと比較（すなわち、マウスカノニカルＣＤＲ構造型を、ヒトカノニカルＣＤＲ構造型と、可変領域内の対応する位置において比較）し、且つ、非ヒト可変領域及びヒト可変領域のそれぞれの内部の対応する位置のＣＤＲ配列について、カノニカルＣＤＲ構造型の第２のセットが、カノニカルＣＤＲ構造型の第１のセットと同じであるヒト配列を選択することにより、このライブラリーから候補配列のサブセットを選択する。該方法は、候補ヒト可変領域配列に由来するフレームワーク領域と組み合わせた、非ヒト可変領域に由来するＣＤＲ配列のうちの（例えば、マウスＣＤＲのうちの）少なくとも２つを包含するキメラ分子を構築するための基盤として、これらの候補ヒト可変領域配列を用いる。構築の結果として、該キメラ抗体のフレームワーク配列は、候補ヒトフレームワーク配列と異なるように、可変領域内の対応する位置において、ヒトＣＤＲ配列の各々を置換する非ヒトＣＤＲ配列の各々を含有する。
各ドメインについて、候補ヒト抗体配列の対象ＣＤＲとの類似性を２つのレベルで評価する。第１に、ＣＤＲペプチド骨格について同一の三次元立体構造が求められる。実験により決定された対象ＣＤＲの原子座標が得られることはまれであり、よって、対象ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａによるカノニカル構造型を決定し、且つ、さらなる考察により、異なるカノニカル構造を保有する候補配列を除外することにより、三次元における類似性を近似する。第２に、対象ＣＤＲと残りのヒト候補ＣＤＲとの残基間相同性を考察し、相同性が最も大きな候補配列を選択する。
最も大きな相同性の選択は、対象の非ヒト可変領域と同じカノニカル構造を有する候補ヒト可変領域をランク付けするのに用いられる各種の基準に基づく。選択されるセットのメンバーをランク付けするための基準は、アミノ酸配列の同一性の場合もあり、アミノ酸の相同性の場合もあり、これらの両方の場合もある。アミノ酸の同一性とは、アミノ酸残基の位置のマッチによる単純な位置のスコアである。アミノ酸の相同性による類似性とは、特徴的な残基構造における位置の類似性による位置のスコアである。相同性は、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）、「Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ８９：１０９１５〜１０９１９により説明されている表及び手順に従いスコア付けすることもでき、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９６）により説明されているＢＬＯＳＵＭシリーズによりスコア付けすることもできる。そのステップは、以下の通りである。
ａ）対象抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を決定する。これらは、従来のｃＤＮＡクローニング後におけるそれぞれの遺伝子に対するＤＮＡ配列決定；ポリメラーゼ連鎖反応により逆転写物から増幅されたクローニング産物、若しくは対象のハイブリドーマ細胞系のＤＮＡに対するＤＮＡ配列決定；又は精製された抗体タンパク質のペプチド配列決定など、複数の方法のうちのいずれかにより決定することができる。
ｂ）Ｋａｂａｔによる番号付けシステム（Ｋａｂａｔら、前出、１９９１）を、対象非ヒト抗体の重鎖配列及び軽鎖配列に適用する。対象の非ヒト抗体のＣＤＲの各々について、カノニカル構造型を決定する。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９９２）；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）；Ｍａｒｔｉｎ及びＴｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６）；並びにＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）において論じられている指針に照らしてペプチド配列を検討することにより、この決定を行う。
ＣＤＲの各々についてカノニカル構造を決定することの際立った特色は、以下の通りである。重鎖ＣＤＲ１については、現在のところ、３つのカノニカル構造型が知られている。各カノニカル構造型の残基数が異なるため、新たな配列の割り当ては単純である。Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）において説明されている通り、Ｋａｂａｔによる番号付けを該配列に割り当てる場合、残基３１〜３５に対する番号付けは、それぞれのカノニカル構造について、以下の通りである。
１型のカノニカル構造：３１、３２、３３、３４、３５。
２型のカノニカル構造：３１、３２、３３、３４、３５、３５ａ。
３型のカノニカル構造：３１、３２、３３、３４、３５、３５ａ、３５ｂ。
重鎖ＣＤＲ２については、現在のところ４つのカノニカル構造型が知られている。いくつかの構造型の残基数は固有であり、位置５２〜５６に対するそれらの固有のＫａｂａｔによる番号付けにより容易に識別される、すなわち、
１型のカノニカル構造：５２、５３、５４、５５、５６。
４型のカノニカル構造：５２、５２ａ、５２ｂ、５２ｃ、５３、５４、５５、５６。
重鎖ＣＤＲ２の２型のカノニカル構造の残基数と、重鎖ＣＤＲ２の３型のカノニカル構造の残基数とは等しく、よって、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９９２）により論じられている通り、それらの配列内の鍵残基により識別しなければならない。これらの鍵残基を含有するセグメントに対するＫａｂａｔによる番号付けは、５２、５２ａ、５３、５４、５５である。２型のカノニカル構造は、５２ａ位においてＰｒｏ又はＳｅｒを有し、５５位においてＧｌｙ又はＳｅｒを有し、他の位置においては制約を伴わない。３型のカノニカル構造は、５４位においてＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、又はＡｓｐを有し、他の位置においては制約を伴わない。大半の場合には、適正な割り当てを決定するのにこれらの基準で十分である。加えて、２型のカノニカル構造では、フレームワーク残基７１が一般に、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、又はＴｈｒであり、３型のカノニカル構造では、フレームワーク残基７１が一般に、Ａｒｇである。
重鎖ＣＤＲ３が、ＣＤＲすべてのうちで最も多様である。ＣＤＲ３は、その一部が無作為的な性質である、リンパ球に固有の遺伝子過程により生成される。その結果、ＣＤＲ３のカノニカル構造は、予測が困難である。いずれの場合においても、ヒト生殖細胞系列のＶ遺伝子セグメントは、Ｋａｂａｔによる９４位で終始するが、ＣＤＲ３をコードするのは９５〜１０２位であるため、該Ｖ遺伝子セグメントは、ＣＤＲ３のどの部分もコードしない。これらの理由で、ＣＤＲ３のカノニカル構造は一般に、候補ヒト配列を選択するためには考慮されない。
軽鎖ＣＤＲ１については、カッパ鎖のＣＤＲ１について、現在のところ、６つのカノニカル構造型が知られている。各カノニカル構造型の残基数は異なり、よって、新たな配列に対するカノニカル構造型の割り当ては、残基２７〜３１位に対するＫａｂａｔによる番号付けから明らかである。
１型のカノニカル構造：２７、２９、３０、３１。
２型のカノニカル構造：２７、２８、２９、３０、３１。
３型のカノニカル構造：２７、２７ａ、２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ、２７ｅ、２７ｆ、２８、２９、３０、３１。
４型のカノニカル構造：２７、２７ａ、２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ、２７ｅ、２８、２９、３０、３１。
５型のカノニカル構造：２７、２７ａ、２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ、２８、２９、３０、３１。
６型のカノニカル構造：２７、２７ａ、２８、２９、３０、３１。
軽鎖ＣＤＲ２については、カッパ鎖のＣＤＲ２について知られているカノニカル構造型が１つだけであり、よって、例外的な対象抗体配列を禁じると、割り当ては自動的である。軽鎖ＣＤＲ３については、カッパ鎖のＣＤＲ３について最大６つのカノニカル構造型が説明されているが、これらのうちの３つはまれである。一般的な３つの構造型は、残基９１〜９７位に対するＫａｂａｔによる番号付けに反映されているそれらの長さにより識別することができる。
１型のカノニカル構造：９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７（また、９５位において必須のＰｒｏ、並びに９０位において必須のＧｌｎ、Ａｓｎ、又はＨｉｓも伴う）。
３型のカノニカル構造：９１、９２、９３、９４、９５、９７。
５型のカノニカル構造：９１、９２、９３、９４、９５、９６、９６ａ、９７。
対象非ヒト抗体のカノニカルＣＤＲ構造型を同定した後では、対象抗体と同じ組合せのカノニカル構造型を有する同じ種類の鎖（重鎖又は軽鎖）のヒト遺伝子を同定して、ヒト配列の候補セットを形成する。これらの遺伝子断片の大半は発見されており、既に、カノニカル構造型に割り当てられている（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９９２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９５）。
重鎖では、マウスカノニカル構造型に対するＣＤＲ１及びＣＤＲ２の適合性が評価され、適合しない遺伝子は除外されている。軽鎖では、先ず、対象抗体のカノニカル構造型に対する各ヒト配列のＣＤＲ１及びＣＤＲ２の適合性を評価する。候補Ｖｋ遺伝子のＪ領域との融合体の存在を仮定し、且つ、該融合配列にＣＤＲ３のカノニカルＣＤＲ構造型を決定するための基準を適用することにより、該遺伝子の残基８９〜９５が、対象抗体と同じカノニカル構造型のＣＤＲ３を形成する可能性を評価し、適合しない配列を除外する。
代替的に、対象抗体の可変ドメインが、ヒトゲノム内では得られないカノニカル構造型である場合は、カノニカル構造型が同一ではないが三次元的に類似するヒト生殖細胞系列のＶ遺伝子を、比較のために考慮することができる。以下で説明される例のうちの２つを含め、このような状況は、マウス抗体におけるカッパ鎖ＣＤＲ１について生じることが多い。マウス抗体のこのＣＤＲにおいては、６つの可能なカノニカル構造型のすべてが観察されているが、ヒトゲノムがコードするカノニカル構造は、２、３、４、及び６型だけである。これらの状況では、アミノ酸残基長が、対象非ヒト配列のアミノ酸残基長の２残基以内であるカノニカルＣＤＲ構造型を比較のために選択することができる。例えば、対象の抗体において１型のカノニカル構造が見出される場合は、２型のカノニカル構造を伴うヒトＶｋ配列を比較に用いることができる。マウス抗体において５型のカノニカル構造が見出される場合は、３型又は４型のカノニカル構造を伴うヒトＶｋ配列を比較に用いることができる。
成熟し、再構成されたヒト抗体配列も、配列を比較するのに考慮することができる。このような考慮が保証されうるとすればそれは、成熟ヒト配列が、（１）生殖細胞系列と酷似する場合；（２）ヒトにおいて免疫原性でないことが知られる場合；又は（３）ヒト生殖細胞系列においては見出されないが、対象抗体のカノニカル構造型と同一のカノニカル構造型を含有する場合が含まれるがこれらに限定されない多様な状況下においてであろう。
マッチするカノニカル構造型を伴う候補Ｖ遺伝子の各々についてはまた、対象配列との残基間の配列同一性及び／又は残基間の配列相同性も評価して、該候補ヒト配列をランク付けする。例えば、評価される残基は、以下の通りである：（１）カッパ（κ）軽鎖ＣＤＲのアミノ酸残基位置では、ＣＤＲ１（２６〜３２）、ＣＤＲ２（５０〜５２）、ＣＤＲ３（９１〜９６）が評価され；（２）重鎖ＣＤＲのアミノ酸残基位置では、ＣＤＲ１（３１〜３５）及びＣＤＲ２（５０〜６０）が評価される。加えてまた、重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸残基９５〜１０２位も考慮されうる。
先ず、対象配列と候補ヒト配列との間で同一のアミノ酸残基数により、残基間の相同性をスコア付けする。その後の転換抗体の構築に用いられるヒト配列は、スコアが最高である２５パーセントの候補配列の間から選択する。複数の候補配列の同一性スコアが同等である場合など、適切な場合は、必要に応じて、同一でないアミノ酸残基間における類似性をさらに考慮することができる。スコアには、対象の残基と目的の残基との間における、脂肪族残基対脂肪族残基、芳香族残基対芳香族残基、又は極性残基対極性残基のマッチも加味する。別の例では、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆによるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスなどのアミノ酸置換マトリックスを用いて、配列相同性の定量的評価を実施することができる。
ＣＤＲ３配列のＣ末端におけるフレームワーク領域の目的配列は、既知のヒト生殖細胞系列のＪセグメントのセットから選択することができる。上述の通り、候補Ｖ遺伝子を評価する目的で指定されたスコア付けの基準を用いて、ＣＤＲ３とＪセグメントとが重複する配列位置について、各Ｊセグメントに対する残基間の相同性を評価することにより、Ｊペプチド配列を選択することができる。その後の転換抗体の構築に用いられるＪ遺伝子セグメントのペプチド配列は、スコアが最高である２５パーセントの候補配列の間から選択する。
例として述べると、キメラ可変鎖は、対象の非ヒト配列に由来する少なくとも２つのＣＤＲと、候補ヒト配列に由来するフレームワーク配列とを含有する。別の例では、キメラ軽鎖が、対象の非ヒト配列に由来する３つのＣＤＲと、候補ヒト配列に由来するフレームワーク配列とを含有する。さらなる例では、キメラ重鎖が、対象の重鎖による少なくとも２つのＣＤＲと、候補ヒト重鎖によるフレームワーク配列とを含有するか、又はキメラ重鎖が、対象の重鎖に由来するＣＤＲの各々と、候補ヒト重鎖によるフレームワーク配列とを含有する。さらに別の例では、キメラ抗体の重鎖が、対象の非ヒト配列に由来するＣＤＲ１及び２と、ＣＤＲ３の残基５０〜６０と、候補ヒト重鎖に由来するＣＤＲの残基６１〜６５を、候補ヒト配列のフレームワーク配列と共に含有する。別の例では、キメラ重鎖配列が、対象の非ヒト配列に由来する各ＣＤＲと、対象配列に由来するフレームワーク配列２７〜３０と、候補配列に由来するフレームワーク配列とを含有する。しかし、いずれの場合においても、キメラ抗体分子がそのフレームワーク配列内に含有する、候補ヒト可変領域のフレームワーク配列内のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基は１０以下である。
ヒト化抗体のアフィニティーの増大を所望する場合は、転換抗体のＣＤＲ内の残基を、他のアミノ酸によりさらに置換することができる。最大１０残基を変化させうる重鎖ＣＤＲ２を除き、ＣＤＲ内で変化させるアミノ酸残基は４以下であることが典型的であり、ＣＤＲ内で変化させる残基は２以下であることが最も典型的である。アフィニティーの変化は、本明細書で説明される方法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ法）など、従来の方法により測定することができる。
抗体を超ヒト化する方法は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８８１，５５７号においてより詳細に説明されている。
当技術分野で知られている従来の技法を用いて、ヒト化抗体並びに抗原結合断片を構築及び作製することができる。加えて、特に、高レベルの発現ベクターを使用する場合は、組換えにより調製された抗体を大量に作製しうることが多い。
当技術分野において知られる従来の技法を用いて、抗体を配列決定することができる。一態様では、ＣＤＲのうちの１又は複数のアミノ酸配列を、例えば、ヒト抗体（又はその抗原結合断片）の合成配列に挿入して、非ヒト抗体によりヒト患者を治療することの有害な副作用を制限しうるヒト抗体を創出する。また、ＣＤＲのうちの１又は複数のアミノ酸配列を合成配列、例えば、ＡＶＩＭＥＲ（商標）などの結合タンパク質に挿入して、ヒト患者に投与するための構築物を創出することもできる。治療される動物の種に応じて、このような技法を改変することができる。例えば、獣医学的治療に使用する場合は、抗体、抗原結合断片、又は抗原結合タンパク質を、ヒト以外（例えば、霊長動物、ウシ、ウマなど）の治療用に合成することができる。
別の態様では、本明細書で提供され、且つ、本明細書に組み込まれる技法など、当技術分野で認知されている技法を用いて、例えば、組換え法を介して、ＣＤＲのうちの１又は複数のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを、抗体、抗原結合断片、又は抗原結合タンパク質をコードする既存のポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入することができる。
発現させる場合、発現系は、グルタミンシンターゼ遺伝子を選択マーカーとして用いるＧＳシステム（Ｌｏｎｚａ）を使用する発現系である。略述すると、グルタミンシンターゼ遺伝子を選択マーカーとして用いるＧＳシステム（Ｌｏｎｚａ）を用いる電気穿孔（２５０Ｖ）により、ＣＨＯ細胞へのトランスフェクションを実施する。２ｍＭのグルタミンと共に１０％の透析ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で、野生型のＣＨＯ細胞を増殖させる。電気穿孔により、６×１０７個のＣＨＯ細胞に、直鎖化させたＤＮＡ３００μｇをトランスフェクトする。電気穿孔後、細胞を、グルタミンを伴うＤＭＥＭ中に再懸濁させ、３６×９６ウェルプレート（ウェル１個当たり５０μｌ）へと播種し、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートする。翌日、ウェル１個当たり１５０μｌの選択培地（グルタミンを伴わないＤＭＥＭ）を添加する。約３週間後、非関与抗体を陰性対照として用いるＥＬＩＳＡにより、コロニーをスクリーニングする。＞２０μｇ／ｍｌを生成させるすべてのコロニーを２４ウェルプレートで増殖させ、次いで、２連のＴ２５フラスコで増殖させる。
高レベルで生成させる場合、最も広く用いられている哺乳動物発現系は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損（「ｄｈｆｒ−」）チャイニーズハムスター卵巣細胞によりもたらされる遺伝子増幅手順を使用する発現系である。この発現系は、当業者によく知られている。この系は、ジヒドロ葉酸のテトラヒドロ葉酸への転換を触媒するＤＨＦＲ酵素をコードするジヒドロ葉酸レダクターゼ（「ｄｈｆｒ」）遺伝子に基づく。高量の生成を達成するためには、ｄｈｆｒ− ＣＨＯ細胞に、所望のタンパク質をコードする遺伝子と併せて、機能的なＤＨＦＲ遺伝子を含有する発現ベクターをトランスフェクトする。この場合、所望のタンパク質は、組換え抗体の重鎖及び／又は軽鎖である。
競合的ＤＨＦＲ阻害剤であるメトトレキサート（ＭＴＸ）の量を増大させることにより、組換え細胞は、ｄｈｆｒ遺伝子を増幅することを介して耐性を発生させる。標準的な場合には、使用される増幅単位が、ｄｈｆｒ遺伝子のサイズよりはるかに大きく、その結果、抗体重鎖が共増幅される。
抗体鎖などのタンパク質を大スケールで作製することを所望する場合、発現レベル並びに使用される細胞の安定性の両方を考慮する。長期間にわたる培養では、単一の親クローンから派生する場合であっても、増幅するうちに、組換えＣＨＯ細胞集団が、それらの特異的抗体生成に関する均一性を失う。
本出願は、本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチド（核酸）、このようなポリヌクレオチドを含有するベクター、並びにこのようなポリヌクレオチドをポリペプチドへと転写及び翻訳するための宿主細胞及び発現系を提供する。
本出願はまた、少なくとも１つの上記のポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写カセット、又は発現カセットの形態にある構築物も提供する。
本出願はまた、上記の１又は複数の構築物を含む組換え宿主細胞も提供する。本明細書で説明される抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、コード核酸からの発現を含む該方法が本出願の態様を形成するのと同様に、それ自体として提供される、本明細書で説明される任意の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸も、本出願の態様を形成する。該核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより、発現を達成することができて簡便である。発現を介する作製の後、任意の適切な技法を用いて抗体又は抗原結合断片を単離及び／又は精製することができ、次いで、必要に応じて用いることができる。
本明細書で説明される特異的抗体、抗原結合断片、並びにコード核酸分子及びベクターは、例えば、実質的な純粋形態又は均一形態で、それらの天然の環境から単離及び／又は精製して、提供することができる。核酸の場合は、必要とされる機能を伴うポリペプチドをコードする配列以外の、元の核酸又は遺伝子を含ませずに、又はこれらを実質的に含ませずに、これを提供することができる。核酸は、ＤＮＡを含む場合もあり、ＲＮＡを含む場合もあり、且つ、完全に合成の場合もあり、部分的に合成の場合もある。当技術分野では、精製法がよく知られている。
各種の異なる宿主細胞におけるクローニング系及び発現系がよく知られている。適切な宿主細胞系には、細菌、哺乳動物細胞、酵母系、及びバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドを発現させるための、当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、並びに他の多くの細胞系が含まれる。一般的な細菌宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
当技術分野では、大腸菌などの原核細胞における抗体及び抗体断片の発現が十分に確立されている。総説については、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５〜５５１（１９９１）を参照されたい。また、培養物中の真核細胞における発現も、本明細書で説明される抗体及び抗原結合断片を作製するための選択肢として当業者に利用可能であり、近年における総説については、例えば、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｒａｆｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３〜５７６；Ｔｒｉｌｌ Ｊ．Ｊ．ら（１９９５）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ６：５５３〜５６０を参照されたい。
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、並びに必要に応じた他の配列を含めた、適切な制御配列を含有する適切なベクターを選択又は構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミドの場合もあり、例えば、ファージ又はファージミドなど、ウイルス性の場合もある。さらなる詳細については、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」：２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞内へのＤＮＡの導入並びに遺伝子発現、並びにタンパク質解析において核酸を操作するための多くの既知の技法及びプロトコールについては、「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２において詳細に説明されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら；及びＡｕｓｕｂｅｌらによる方法の開示は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれ、当技術分野においてもよく知られている。
したがって、さらなる態様は、本明細書で開示される核酸を含有する宿主細胞を提供する。またさらなる態様は、このような核酸を宿主細胞へと導入するステップを含む方法を提供する。導入は、任意の利用可能な技法を使用しうる。真核細胞の場合、適切な技法には、例えば、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン法、電気穿孔、リポソームを介するトランスフェクション、並びにレトロウイルス又は他のウイルス、例えば牛痘ウイルス、又は昆虫細胞の場合はバキュロウイルスを用いる形質導入が含まれうる。細菌細胞の場合、適切な技法には、例えば、塩化カルシウムによる形質転換、電気穿孔、並びにバクテリオファージを用いるトランスフェクションが含まれうる。
導入に続き、例えば、遺伝子を発現させるための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を引き起こすか、又はこれを可能とする。
一実施形態では、核酸を、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）内に組み込む。組込みは、標準的な技法に従う、ゲノムの組換えを促進する配列を組み入れることにより促進されうる。必要に応じて、Ｉｇエンハンサーを上流に組み入れることにより、発現を最大化させることができる。
本出願はまた、上記の通りに抗体又はそれらの抗原結合断片を発現させるために、上記で言及した構築物を発現系内で用いるステップを含む方法も提供する。
本出願はまた、エンドグリンに結合する、本明細書で説明される抗体又は抗原結合配列をコードする、組換えＤＮＡ分子若しくはクローニングされた遺伝子、又はそれらの縮重変異体、突然変異体、類似体、又はこれらの断片などの単離核酸にも関する。
一態様では、本出願が、エンドグリンに結合する、本明細書で説明される抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。
さらなる実施形態では、本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片の組換えＤＮＡ分子又はそのクローニングされた遺伝子の完全なＤＮＡ配列を、発現制御配列へと作動的に連結し、これを適切な宿主内に導入することができる。したがって、本出願は、抗体のＶＨ鎖及び／若しくはＶＬ鎖、又はこれらの部分をコードするＤＮＡ配列を含む、クローニングされた遺伝子又は組換えＤＮＡ分子により形質転換された、単細胞宿主へと拡張される。
別の特色は、本明細書で開示されるＤＮＡ配列の発現である。当技術分野においてよく知られている通り、ＤＮＡ配列を適切な発現ベクター内の発現制御配列へと作動的に連結し、且つ、この発現ベクターを使用して適切な単細胞宿主を形質転換することにより、ＤＮＡ配列を発現させることができる。
ＤＮＡ配列を発現制御配列へとこのように作動的に連結することは、当然ながら、既に該ＤＮＡ配列の一部というわけではないにせよ、開始コドンであるＡＴＧを、該ＤＮＡ配列の上流における適正なリーディングフレーム内に施すことを包含する。
ポリヌクレオチド及びベクターは、単離形態及び／又は精製形態（例えば、必要とされる機能を伴うポリペプチドをコードするポリヌクレオチド以外の、元のポリヌクレオチドを含まないか又は実質的に含まない形態）で提供することができる。本明細書で用いられる「実質的に純粋な」並びに「実質的に〜を含まない」とは、例えば、含有する外来物質が約２０％以下であるか、含有する外来物質が約１０％以下であるか、含有する外来物質が約５％以下であるか、含有する外来物質が約４％以下であるか、含有する外来物質が約３％以下であるか、含有する外来物質が約２％以下であるか、又は含有する外来物質が約１％以下である溶液又は懸濁液を指す。
本発明によるＤＮＡ配列を発現させるには、多種多様な宿主／発現ベクターの組合せを使用することができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体のＤＮＡ配列のセグメント、染色体以外のＤＮＡ配列のセグメント、並びに合成ＤＮＡ配列のセグメントからなることが可能である。適切なベクターには、ＳＶ４０ウイルスの派生物；並びに既知の細菌プラスミド、例えば、大腸菌プラスミドであるｃｏｌ Ｅｌ、Ｐｃｒ１、Ｐｂｒ３２２、Ｐｍｂ９、並びにこれらの派生物；ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージλの多数の派生物、例えば、ＮＭ９８９；並びに他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３、並びに繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２ｕプラスミド又はその派生物などの酵母プラスミド；昆虫細胞又は哺乳動物細胞において有用なベクターなど、真核細胞において有用なベクター；ファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を使用するように修飾されたプラスミドなど、プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクターなどが含まれるがこれらに限定されない。
本明細書ではまた、１又は複数のポリヌクレオチド構築物を含む組換え宿主細胞も提供される。抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、ポリヌクレオチドからの発現を含む該方法が本出願の態様を形成するのと同様に、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドも、本出願の態様を形成する。例えば、該ポリヌクレオチドを含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより、発現を達成することができる。次いで、任意の適切な技法を用いて抗体又は抗原結合断片を単離及び／又は精製することができ、必要に応じて用いることができる。
これらのベクターにおいて、任意の多種多様の発現制御配列（それに作動的に連結されたＤＮＡ配列の発現を制御する配列）を用いて、ＤＮＡ配列を発現させることができる。このような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０ウイルス、ＣＭＶウイルス、牛痘ウイルス、ポリオーマウイルス、又はアデノウイルスの早期プロモーター又は後期プロモーター；ｌａｃ系；ｔｒｐ系；ＴＡＣ系；ＴＲＣ系；ＬＴＲ系；ファージλの主要なオペレーター領域及びプロモーター領域；ｆｄコートタンパク質の制御領域；３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の糖分解酵素のプロモーター；酸ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）；酵母接合因子のプロモーター；並びに原核細胞若しくは真核細胞又はそれらのウイルスの遺伝子発現を制御することが知られている他の配列；並びにこれらの各種の組合せが含まれる。
各種の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング系及び発現系がよく知られている。適切な宿主細胞系には、細菌、哺乳動物細胞、酵母系、及びバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドを発現させるための、当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、並びに他の多くの細胞系が含まれる。一般的な細菌宿主は、例えば、大腸菌でありうる。
当技術分野では、大腸菌などの原核細胞における抗体又は抗原結合断片の発現が十分に確立されている。総説については、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５〜５５１（１９９１）を参照されたい。また、培養物中の真核細胞における発現も、当業者に利用可能である（Ｒａｆｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３〜５７６；Ｔｒｉｌｌ Ｊ．Ｊ．ら（１９９５）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ６：５５３〜５６０）。
また、多種多様な単細胞の宿主細胞も、ＤＮＡ配列を発現させるのに有用である。これらの宿主には、大腸菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の菌株；酵母などの真菌；並びに組織培養物中のＣＨＯ細胞、ＹＢ／２０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｒ１．１細胞、Ｂ−Ｗ細胞、及びＬ−Ｍ細胞；アフリカングリーンモンキー腎細胞（例えば、ＣＯＳ １細胞、ＣＯＳ ７細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、及びＢＭＴ１０細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）；及びヒト細胞などの動物細胞；並びに植物細胞など、よく知られた真核生物宿主及び原核生物宿主が含まれる。
すべてのベクター、発現制御配列、及び宿主がＤＮＡ配列を発現させるのに同等に良好に機能するわけではないことが理解されるであろう。すべての宿主が同じ発現系と共に同等に良好に機能するわけでもない。しかし、当業者は、本出願の範囲から逸脱することなく、所望の発現を達成するのに不要な実験を行うことなく、適正なベクター、発現制御配列、及び宿主を選択することができるであろう。例えば、ベクターを選択するときは、その中でベクターが機能しなければならないため、宿主についても考慮しなければならない。また、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、並びに抗生剤マーカーなど、該ベクターによりコードされる他の任意のタンパク質の発現についても考慮する。当業者は、本出願の範囲から逸脱することなく、適正なベクター、発現制御配列、及び宿主を選択して、所望の発現を達成することができる。例えば、ベクターを選択するときは、その中でベクターが機能するため、宿主についても考慮する。また、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、並びに抗生剤マーカーなど、該ベクターによりコードされる他の任意のタンパク質の発現についても考慮する場合がある。
本出願はまた、少なくとも１つの上記のポリヌクレオチドを含む、本明細書の別の箇所で説明されるプラスミド、ベクター、転写カセット、又は発現カセットの形態にある構築物も提供する。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、選択マーカー遺伝子、並びに必要に応じた他の配列を含め、適切な制御配列を含有する適切なベクターを選択又は構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミドの場合もあり、例えば、ファージ、ファージミドなど、ウイルス性の場合もある。さらなる詳細については、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」：２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞内へのＤＮＡの導入並びに遺伝子発現、並びにタンパク質解析において核酸を操作するための多くの既知の技法及びプロトコールについては、「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２において詳細に説明されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら；及びＡｕｓｕｂｅｌらによる方法の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
発現制御配列を選択するときは通常、各種の因子について考慮する。これらには、例えば、系の相対的な強度、その制御可能性、並びに発現させる特定のＤＮＡ配列又は遺伝子とのその適合性、特に、潜在的な二次構造に関するその適合性が含まれる。適切な単細胞宿主は、例えば、選択されるベクターとのそれらの適合性、それらの分泌特徴、タンパク質を適正にフォールドするそれらの能力、並びにそれらの発酵に対する要件のほか、発現させるＤＮＡ配列によりコードされる産物の宿主に対する毒性、並びに発現産物を精製する容易さを考慮することにより選択する。
さらなる態様は、本明細書で開示される１又は複数のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供する。またさらなる態様は、このような１又は複数のポリヌクレオチドを宿主細胞へと導入する方法である、任意の利用可能な技法を提供する。真核細胞の場合、適切な技法には、例えば、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン法、電気穿孔、リポソームを介するトランスフェクション、並びにレトロウイルス又は他のウイルス（例えば牛痘ウイルス）、又は昆虫細胞の場合はバキュロウイルスを用いる形質導入が含まれうる。細菌細胞の場合、適切な技法には、例えば、塩化カルシウムによる形質転換、電気穿孔、並びにバクテリオファージを用いるトランスフェクションが含まれうる。
導入に続き、例えば、１又は複数のポリヌクレオチドから１又は複数のポリペプチドを発現させるための条件下で宿主細胞を培養することにより、１又は複数のポリヌクレオチドからの発現を引き起こすか、又はこれを可能とすることができる。誘導系を使用し、アクチベーターの添加により発現を誘導することができる。
一実施形態では、ポリヌクレオチドを、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）内に組み込むことができる。組込みは、標準的な技法に従う、ゲノムの組換えを促進する配列を組み入れることにより促進されうる。別の実施形態では、宿主細胞内のエピソームベクター上で核酸を維持する。
本明細書では、特定のポリペプチドを発現させるために、上記で言及した構築物を発現系内で用いるステップを包含する方法が提供される。
これらの因子並びに他の因子を考慮すれば、当業者は、発酵により、又は大スケールの動物培養物中において、ＤＮＡ配列を発現させる各種のベクター／発現制御配列／宿主の組合せを構築することができるであろう。
抗体、抗原結合断片、又は抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、クローニングに加えて、又はクローニングではなくて、組換え／合成により調製することができる。抗体、抗原結合断片、又は結合タンパク質に適切なコドンにより、ポリヌクレオチドをデザインすることができる。一般に、その配列が発現に用いられる場合は、意図される宿主に好ましいコドンを選択する。標準的な方法により調製される重複オリゴヌクレオチドから完全なポリヌクレオチドを構築し、完全なコード配列へと構築することができる。例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１（１９８４）を参照されたい。
タンパク質への非天然アミノ酸の部位特異的な組込みの一般的な方法は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｊ．Ｎｏｒｅｎ、Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１８２〜１８８（１９８９年４月）において説明されている。この方法を用いて、非天然アミノ酸を伴う類似体を創出することができる。
上述の通り、抗体またその抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列は、クローニングではなくて、合成により調製することができる。抗体又は抗原結合断片のアミノ酸配列に適切なコドンにより、ＤＮＡ配列をデザインすることができる。一般に、その配列が発現に用いられる場合は、意図される宿主に好ましいコドンを選択する。標準的な方法により調製される重複オリゴヌクレオチドから完全な配列を構築し、完全なコード配列へと構築することができる。例えば、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれるＥｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１（１９８４）を参照されたい。
Ｃ．ｉｎ ｓｉｌｉｃｏにおける免疫原性の解析
必要な場合は、本明細書で説明される抗体又はその抗原結合断片を免疫原性について評価し、必要に応じて脱免疫化する（すなわち、１又は複数のＴ細胞エピトープを変化させることにより、抗体の免疫反応性を低下させる）ことができる。本明細書で説明されるヒト化抗エンドグリン抗体並びに抗原結合断片に存在する免疫原性及びＴ細胞エピトープについての解析は、ソフトウェア並びに特定のデータベースを用いることにより実施することができる。例示的なソフトウェア及びデータベースには、Ｃｍｂｒｉｄｇｅ、ＥｎｇｌａｎｄのＡｎｔｉｔｏｐｅにより開発されたｉＴｏｐｅ（商標）が含まれる。ｉＴｏｐｅ（商標）は、ヒトＭＨＣクラスＩＩの対立遺伝子に対するペプチドの結合を解析するための、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏにおける技術である。
ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアは、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対するペプチドの結合を予測し、これにより、このような「潜在的なＴ細胞エピトープ」の位置についての最初のスクリーンを提供する。ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアは、ペプチドのアミノ酸側鎖と、３４のヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子による結合グルーブ内の特異的な結合ポケットとの好ましい相互作用を予測する。鍵となる結合残基の位置特定は、被験抗体可変領域配列にわたり、１アミノ酸だけ重複する９ｍｅｒのペプチドをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成させることにより達成する。各９ｍｅｒのペプチドは、３４のＭＨＣクラスＩＩアロタイプの各々と対比させて調べることができ、それらのＭＨＣクラスＩＩ結合グルーブとの潜在的な「フィット」及び相互作用に基づきスコア付けすることができる。ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のうちの＞５０％に対して平均結合スコアが高い（ｉＴｏｐｅ（商標）によるスコア付け関数で＞０．５５）ペプチドを、潜在的なＴ細胞エピトープと考える。このような領域において、ＭＨＣクラスＩＩグルーブ内部のペプチド結合のコアとなる９アミノ酸による配列を解析して、ＭＨＣクラスＩＩポケット残基（Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、及びＰ９）、並びにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）との接触が可能な残基（Ｐ−１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ８）を決定する。
任意のＴ細胞エピトープを同定した後で、アミノ酸残基の変化、置換、付加、及び／又は欠失を導入して、同定されたＴ細胞エピトープを除去することができる。同定されたエピトープをなお除去しながら、抗体の構造及び機能を保存するように、このような変化をもたらすことができる。例示的な変化には、保存的アミノ酸変化が含まれるがこれらに限定されない。
組換えＭＨＣ分子を、合成ペプチドと組み合わせた可溶性複合体を利用する技法が用いられるようになった。これらの試薬及び手順を用いて、ヒト対象又は実験動物対象に由来する末梢血試料から、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体に結合することが可能であり、多種多様なＭＨＣアロタイプに対する複数の潜在的なエピトープをスクリーニングするのには適合しないＴ細胞クローンの存在を同定することができる。
Ｔ細胞の活性化についての生物学的アッセイは、依然として、被験ペプチド／タンパク質配列が免疫反応を引き起こす能力についてのリーディングをもたらす最も実践的な選択肢である。この種の手法の例には、細菌タンパク質であるスタフィロキナーゼに対してＴ細胞増殖アッセイを用いた後で、合成ペプチドを用いてＴ細胞系を刺激するエピトープマッピングを行うことが含まれる。同様に、テタヌス毒素タンパク質による合成ペプチドを用いるＴ細胞増殖アッセイの結果として、該毒素の免疫優性エピトープ領域が規定されている。一実施形態では、ヒト免疫細胞の単離サブセットを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるそれらの分化を促進し、対象の合成ペプチドの存在下において該細胞を培養し、該培養されたＴ細胞の増殖が誘導されればそれを測定することにより被験タンパク質内のＴ細胞エピトープを決定することができる。また、他の技法も用いることができる。このような技法は、細胞単離法、並びに複数のサイトカインサプリメントを伴う細胞培養物を適用して、所望の免疫細胞のサブセット（樹状細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を得ることを伴う。別の実施形態では、抗体を、単離されたヒト免疫細胞のサブセットへと添加し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるそれらの分化を評価し、該培養されたＴ細胞の増殖が誘導されるとそれを測定することにより、抗体におけるＴ細胞エピトープの存在を決定することができる。
また、治療的関心の対象である複数のタンパク質に対するＭＨＣクラスＩＩリガンドを規定するｉｎ ｓｉｌｉｃｏにおける技法も使用することができる。しかし、タンパク質分解性のプロセシング並びにｉｎ ｖｉｖｏにおいて免疫原性ペプチドを提示させる他の生理学的段階などのために、コンピュータベースのスキームにより規定可能なペプチドの全レパートリーのサブセットが、最終的な生物学的関与性を有しうる。したがって、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるヒトＴ細胞活性化アッセイを用いて、ポリペプチドのタンパク質配列内で、Ｔ細胞の活性化を支援することが可能であり、これにより、このタンパク質における免疫原性の問題に最も生物学的に関与性の領域を同定することができる。本明細書で用いられる「Ｔ細胞エピトープ」とは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することが可能であり、Ｔ細胞を刺激することが可能であり、且つ／又はＭＨＣクラスＩＩ分子と複合したＴ細胞に結合する（測定可能な形での活性化を必ずしも伴わずに）ことも可能であるアミノ酸配列を指す。
本明細書で開示される方法により、合成ペプチド又は全抗体を、それらが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されるヒトＴ細胞の増殖反応を引き起こす能力について調べる。Ｔ細胞は、よく知られた手段により全血液試料から容易に得られる、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）層内に存在する。さらに、ＰＢＭＣ調製物は、生理学的比率のＴ細胞及び抗原提示細胞を含有し、したがって、それにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるサロゲートの免疫反応をもたらすのに適する材料の供給源である。このようなアッセイを実施するときは、２．０に近接するか、又はこれを超える刺激指数が、増殖の誘導についての有用な測定値である。しかし、この刺激指数は、抗体又はその抗原結合断片に応じて異なる可能性があり、各抗体又はその抗原結合断片、並びに対応するペプチドライブラリーのベースラインとの関連で確立することができる。このような検査の一例では、被験ペプチドに対して測定された増殖スコア（例えば、３Ｈ−チミジンの取込みを用いる場合は、例えば、１分間当たりの放射能カウント）を、被験ペプチドと接触させていない細胞において測定されるスコアで除することにより、刺激指数（ＳＩ）を導出することができて簡便である。反応を引き起こさないペプチドは、ＳＩ＝１．０をもたらしうるが、また、０．８〜１．２の範囲にあるＳＩ値も注意するに及ばない。記録されるスコアの信頼性を保証するためには、多数の技法手順をこのようなアッセイの実施に組み込むことができる。すべての決定を少なくとも３連で行い、平均スコアを計算しうることが典型的である。計算されたＳＩ≧２．０の場合は、三連のうちの個々のスコアを、異常値データの証拠について検証することができる。被験ペプチドを、少なくとも２つの異なる濃度で細胞と接触させるときは、該濃度を、最小で２倍の濃度差の範囲にわたらせることが典型的であろう。このような濃度範囲は、アッセイに反応速度次元のオフセットをもたらし、単一時点における決定を、例えば、７日目に実施する場合に有用でありうる。一部のアッセイでは、時間経過において複数回の決定を行うことも可能であり、これらもまた、最小で２つの異なる濃度で供給されるペプチド免疫原を用いて行うことができる。同様に、それに対してドナーのＰＢＭＣ試料の大半が反応性であると予測される対照ペプチドを各アッセイプレートに組み入れることも可能である。インフルエンザウイルス赤血球凝集素ペプチド３０７〜３０９である配列ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡ (配列番号１０４) 並びにクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属ＨＳＰ ６０ペプチドである配列ＫＶＶＤＱＩＫＫＩＳＫＰＶＱＨ (配列番号１０５)が、このようなアッセイにおいて用いられる対照ペプチドの例である。代替的に、又は加えて、アッセイではまた、それに対してすべてのＰＢＭＣ試料が２．０を著明に超えるＳＩを呈示することが予測されるスカシガイに由来するヘモシアニンなど、強力な全タンパク質抗原も用いうるであろう。当技術分野では、このように用いられる他の対照抗原がよく知られているであろう。
本明細書で開示される方法は、抗体又はそれらの抗原結合断片についてのエピトープマップであって、広範なスペクトルにわたる可能なＭＨＣアロタイプに関与する該エピトープマップを提供しうる。マップは、そのタンパク質が投与される可能性が高い患者の大半について、Ｔ細胞により駆動される免疫反応をそのタンパク質が引き起こす能力を消失させるか、又は少なくとも緩和させうる修飾のデザイン又は選択を可能とするのに十分な程度に代表的でありうる。緩和とは、非修飾タンパク質と比較した免疫反応の低減（すなわち、免疫原性の低減）（例えば、約１．５分の１、約２分の１、約５分の１、約１０分の１、約２０分の１、約５０分の１、約１００分の１、約２００分の１、約５００分の１若しくはこれを超える低減、又はこれらのうちの任意の範囲の低減）を指す場合がある。代替的に、免疫原性を低減された抗体又はそれらの抗原結合断片とは、非修飾タンパク質と比較して、それが免疫反応を誘発する能力の百分率による低減（例えば、約１％の低減、約２％の低減、約３％の低減、約４％の低減、約５％の低減、約１０％の低減、約２０％の低減、約５０％の低減、約１００％の低減、並びにこれらのうちの任意の範囲の低減）を指す場合がある。したがって、スクリーニング工程を実施するときは、ヒト集団内に現存するＭＨＣクラスＩＩ分子のレパートリー（ＨＬＡ−ＤＲ）のうちの少なくとも９０％を超える試料をもたらすのに十分な免疫学的多様性を有するドナーのプールから、ナイーブドナーによるＰＢＭＣ由来Ｔ細胞を回収する。所与の合成ペプチド（又は抗体）に対するナイーブＴ細胞の反応を検出する場合は、実際のペプチド（又は抗体）を、複数のドナーに由来する、単離されたＰＢＭＣ調製物と接触させるが、ドナーの数（又は「ドナープール」のサイズ）は、実際的な目的で、２０未満の非類縁個体ではない可能性が高く、該ドナープール内のすべての試料は、それらのＭＨＣクラスＩＩハプロタイプに従って予め選択することができる。
本明細書で用いられる「ナイーブドナー」という用語は、環境によってであれ、ワクチン接種によってであれ、例えば、輸血など他の手段によってであれ、本明細書で説明される抗体又はそれらの抗原結合断片にいまだ曝露されていない対象を指す。
Ｔ細胞エピトープについてスクリーニングする場合、複数の異なる健康なドナーであるが、治療的にタンパク質を施されてはいないドナーに由来する末梢血試料からＴ細胞を供給することができる。必要な場合は、抗体を用いて１又は複数のポリペプチドの存在又は非存在を同定する、ＥＬＩＳＡなどの従来のアッセイを用いて、患者の血液試料を、特定のポリペプチドの存在について調べることができる。アッセイは、当技術分野で知られる従来の手順を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養されたＰＢＭＣを用いて実施され、且つ、該ＰＢＭＣを、抗体など、対象のタンパク質（すなわち、ライブラリー）又は全タンパク質を表す合成ペプチド分子種と接触させるステップと、適切なインキュベーション期間を追跡するステップと、細胞増殖など、Ｔ細胞活性化の誘導を測定するステップとを伴う。測定は、任意の適切な手段を介することが可能であり、例えば、実験用計器を用いて細胞物質への３Ｈの蓄積が容易に測定される３Ｈ−チミジンの取込みを用いて実施することができる。ＰＢＭＣ試料と合成ペプチド又は全タンパク質との各混合物についての細胞増殖の程度を、非処理ＰＢＭＣ試料中において見られる細胞増殖の程度と比べて検証することができる。また、それらについて増殖作用が予測されている、１若しくは複数のペプチド又は全タンパク質による処理後において見られる増殖反応も参照することができる。この点では、既知の広範なＭＨＣ制限を伴うペプチド又は全タンパク質、並びにとりわけ、ＤＰアイソタイプ又はＤＱアイソタイプに対するＭＨＣ制限を伴うペプチドエピトープを用いることが有利であるが、本発明は、このような制限ペプチド又は制限タンパク質の使用に限定されない。このようなペプチドについては、例えば、インフルエンザウイルス赤血球凝集素ペプチド並びにクラミジア属ＨＳＰ６０ペプチドについて上記で説明した。
非限定的な一例では、Ｔ細胞エピトープをマップし、その後、本明細書で説明される方法を用いてこれらを修飾することができる。エピトープマップの構築を容易とするため、合成ペプチドのライブラリーを作製する。ペプチドの各々は１５アミノ酸残基の長さであり、各々は、連鎖する次のペプチドと１２アミノ酸残基だけ重複する、すなわち、逐次的に連鎖する各ペプチドは、さらなる３アミノ酸を増分として解析に付加する。このようにして、所与の任意の隣接するペプチド対は、１８アミノ酸の連続配列としてマップされる。ナイーブＴ細胞アッセイを用いてＴ細胞マップを規定する一方法を、以下の実施例で例示する。Ｔ細胞マップを規定する方法を介して同定されるペプチドの各々は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、且つ、アッセイシステムにより検出可能な増殖バーストを引き起こすのに十分なアフィニティーで、少なくとも１つの同族ＴＣＲと係合することが可能であることが示唆される。
別の非限定的な例では、抗体がプロセシングされて、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、且つ、アッセイシステムにより検出可能な増殖バーストを引き起こすのに十分なアフィニティーで、少なくとも１つの同族ＴＣＲと係合するＴ細胞エピトープを生成させる可能性を評価する。
本明細書で説明される分子は、組換え法の使用を含めた複数の方法のうちのいずれかにより調製することができる。本明細書で示されるタンパク質の配列及び情報を用いて、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を推測することができる。これは、例えば、ＤＮＡｓｔａｒソフトウェアシリーズ［ＤＮＡｓｔａｒ Ｉｎｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡ］などのコンピュータソフトウェアツール又はこれに類似するコンピュータソフトウェアツールを用いて達成することができる。本明細書では、ポリペプチド又は重要な相同体、変異体、切断型、延伸型、又はこれらのさらなる改変型をコードする任意のこのようなポリヌクレオチドが意図される。
本明細書では、修飾配列が、ヘルパーＴ細胞反応の誘導を（部分的に、又は完全に）低減するように、Ｔ細胞エピトープをマップ（同定）し、且つ、これらのエピトープを修飾する方法が提供される。修飾には、同様の変化を及ぼす修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンにもたらされる、アミノ酸の置換、欠失、又は挿入が含まれる。当技術分野では、アミノ酸残基をコードするコドンがよく知られている。組換えＤＮＡ法を用いて、標的配列を指向する突然変異誘発を達成することが可能であり、本明細書で説明される多くのこのような技法が利用可能であり、当技術分野では、上記で説明した技法などが知られている。一般に、部位特異的突然変異誘発法がよく知られている。略述すると、オリゴヌクレオチドを指向するＰＣＲによる突然変異誘発のための一本鎖鋳型を生成させるバクテリオファージベクターを使用する。ファージベクター（例えば、Ｍ１３）は市販されており、当技術分野では、それらの使用が一般によく知られている。部位指向突然変異誘発ではまた、二本鎖プラスミドも同様に日常的に使用され、これにより、対象のポリヌクレオチドをファージからプラスミドへと導入するステップが廃される。所望の突然変異配列を保有する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、この鋳型からの修飾（所望の突然変異体）ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける合成を誘導することができ、且つ、このヘテロ二重鎖ＤＮＡを用いて、コンピテントの大腸菌を形質転換し、所望のクローンの増殖による選択及び同定を行うことができる。代替的に、プライマー対を二本鎖ベクター鎖の２つの個別の鎖へとアニールさせて、所望の突然変異（単数又は複数）を伴う、対応する相補鎖の両方を、ＰＣＲ反応において同時に合成することができる。
一実施形態では、プラスミドＤＮＡ鋳型を用いる、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ部位指向突然変異誘発法を使用することができる。対象の挿入標的遺伝子を含有するプラスミド鋳型のＰＣＲによる増幅は、所望の突然変異を含有する２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて達成する。各々がベクターの対向鎖と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、突然変異誘発グレードのＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼを介して、温度サイクリングにより伸長させる。オリゴヌクレオチドプライマーを組み込むと、スタガードニックを含有する突然変異プラスミドが生成される。増幅された非メチル化産物をＤｐｎ Ｉで処理して、メチル化親ＤＮＡ鋳型を消化させ、突然変異を含有する新たに合成されたＤＮＡについて選択する。大腸菌株から単離されるＤＮＡは、ＤＡＭメチラーゼによりメチル化されており、メチル化ＤＮＡ及び半メチル化ＤＮＡに特異的であるＤｐｎ Ｉ消化を受け易い。反応生成物を高効率の大腸菌株へと形質転換して、所望の突然変異を含有するプラスミドを得る。当技術分野では、ポリペプチド内にアミノ酸修飾を導入するさらなる方法がよく知られており、これらはまた、本発明でも用いることができる。
タンパク質に適する修飾には、特定の残基又は残基の組合せに対するアミノ酸置換が含まれうる。Ｔ細胞エピトープを消失させるためには、該Ｔ細胞エピトープの活性の低減若しくは消失を達成することが予測されるアミノ酸配列内の適切な地点又はアミノ酸残基においてアミノ酸置換をもたらす。実際には、適切な地点又はアミノ酸残基が、ＭＨＣクラスＩＩ結合グルーブ内に備えられるポケットのうちの１つにおいてアミノ酸残基の結合が生じる地点又はアミノ酸残基と一致することが好ましい。このような修飾は、該クレフトの第１ポケット内で生じる結合を、ペプチドのいわゆる「Ｐ１」位又は「Ｐ１アンカー」位において変化させうる。ペプチドのＰ１アンカー残基と、ＭＨＣクラスＩＩ結合グルーブの第１ポケットとの結合相互作用の質が、全ペプチドの全体的な結合アフィニティーの主要な決定因子であると認められている。一般に、ポケット内への収容がそれほど容易でないアミノ酸残基を組み込む置換（例えば、より親水性の残基への置換）が、アミノ酸配列のこの位置においては適切であろう。また、ペプチド内で、ＭＨＣ結合クレフト内の他のポケット領域における結合位置と一致する位置にあるアミノ酸残基についても考慮し、これらも本発明の範囲内とする。
所与の潜在的なＴ細胞エピトープにおける単一のアミノ酸修飾は、１又は複数のＴ細胞エピトープを消失させうる１つの方途を表す。単一のエピトープにおける修飾の組合せを意図することができるが、これらは、個別に規定されるエピトープが互いと重複する場合に適切でありうる。さらに、ＭＨＣクラスＩＩ結合グルーブとの関連では「ポケット残基」の位置と一致しない位置であるが、該アミノ酸配列内では任意の地点において、アミノ酸の修飾（所与のエピトープ内における単独の修飾、又は単一のエピトープ内における組合せによる修飾）をもたらすこともできる。相同的構造に関して修飾をもたらすこともでき、当技術分野で知られ、且つ、本明細書で説明されるｉｎ ｓｉｌｉｃｏの技法を用いて実施される構造的方法を、ポリペプチドの既知の構造的特徴に基づいて実施することもできる。変化（修飾）は、変異体分子の構造又は生物学的活性を保存することを意図しうる。このような１又は複数の代償的変化にはまた、ポリペプチドに由来する特定のアミノ酸残基の欠失又は付加（挿入）も含まれうる。加えて、分子の構造を変化させ、且つ／又は分子の生物学的活性を低減し、また、Ｔ細胞エピトープも消失させ、これにより、該分子の免疫原性を低減する修飾ももたらすことができる。本明細書では、あらゆる種類の修飾を意図する。
タンパク質分子からエピトープを除去するさらなる手段は、本明細書で概観されるナイーブＴ細胞活性化アッセイのスキームを、参照によりその全体が本明細書にもまた組み込まれる、ＷＯ０２／０６９２３２において説明されるスキームに従い開発されたｉｎ ｓｉｌｉｃｏのツールと併せて、協同的に用いることである。該ソフトウェアは、抗原提示の過程を、ポリペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子間結合相互作用のレベルでシミュレートして、所与の任意のポリペプチド配列の結合スコアを示す。集団内に現存する主要なＭＨＣクラスＩＩアロタイプのうちの多くについて、このようなスコアを決定する。このスキームは、任意のポリペプチド配列を調べることが可能なので、ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ結合グルーブと相互作用する能力に関して、アミノ酸の置換、付加、又は欠失の帰結を予測することができる。結果として、ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用し、これにより、免疫原性のＴ細胞エピトープとして機能することが可能なアミノ酸を、それらの数を低減して含有する新たな配列構成をデザインすることができる。所与の任意の１つのドナー試料を用いる生物学的アッセイでは、評価しうるＤＲアロタイプへの結合が最大４つであるが、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏの過程では、＞４０のアロタイプを同時に用いて同じポリペプチド配列を調べることができる。実際に、この手法は、複数のＭＨＣアロタイプと相互作用するそれらの能力が変化している新たな配列変異体のデザインを方向づけることが可能である。当業者には明らかである通り、そこにおいて望ましくないエピトープを除去する目的を達成するための、複数の代替的な置換のセットももたらすことができるであろう。しかし、結果としてもたらされる配列は、本明細書で開示され、したがって、本出願の範囲内に収まる、特定の組成物と密接に相同であることが認識されるであろう。
ＭＨＣクラスＩＩリガンドを同定し、且つ、ＭＨＣクラスＩＩリガンドを欠く配列類似体をデザインするためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏのツールを、エピトープマッピング、並びに、場合によって、Ｔ細胞活性化についての生物学ベースのアッセイを用いる再検査と協同させて用いる組合せ法が、本出願のさらなる方法及び実施形態である。この実施形態による一般的な方法は、以下のステップ：
ｉ）ナイーブＴ細胞活性化アッセイ、並びに対象のタンパク質配列を集合的に包含する合成ペプチドを用いて、Ｔ細胞を活性化させることが可能なエピトープ領域を同定するステップ、
ｉｉ）ペプチドリガンドの、１又は複数のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレートする計算スキームを用いて、ステップ（ｉ）において同定されたエピトープ領域を解析し、これにより、該エピトープ領域内のＭＨＣクラスＩＩリガンドを同定するステップ、
ｉｉｉ）ペプチドリガンドの、１又は複数のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレートする計算スキームを用いて、ＭＨＣクラスＩＩ分子にはもはや結合しないか、又は結合するＭＨＣアロタイプがより少数であり、これに伴うアフィニティーもより低度であるエピトープ領域（単数又は複数）内に包含されるＭＨＣリガンドの配列類似体を同定ステップ、並びに、場合によって、
ｉｖ）ナイーブＴ細胞活性化アッセイ、並びに対象のタンパク質において同定されるエピトープ領域を全体的に又は集合的に包含する合成ペプチドを用い、ナイーブＴ細胞活性化アッセイにおいて野生型（親）配列と並列的に配列類似体を調べるステップを含む。
一実施形態では、非修飾抗体又はその抗原結合断片と比較して、免疫原性を低減する修飾抗体又はその抗原結合断片を作製する方法が、抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定するステップと、同定された少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を修飾するステップとを含む。
別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定する工程と、同定された少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を修飾する工程とを介して、非修飾抗体又はその抗原結合断片と比較して、免疫原性を低減する修飾抗体又はその抗原結合断片を作製する。
さらに別の実施形態では、非修飾抗体又はその抗原結合断片と比較して、免疫原性を低減する修飾抗体又はその抗原結合断片を選択する方法が、該抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定するステップと、同定された少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を修飾するステップと、非修飾抗体又はその抗原結合断片と比較して、免疫原性を低減する修飾抗体又はその抗原結合断片を選択するステップとを含む。
本明細書で説明されるＴ細胞エピトープは、そのエピトープ領域によりさらに特徴付けることができる。このような領域は、エピトープコア、Ｎ末端、及びＣ末端を包含する。本明細書で用いられる「エピトープコア」とは、Ｔ細胞エピトープのコアとなる９ｍｅｒのアミノ酸配列を指す。該エピトープコアは、Ｎ末端及び／又はＣ末端において、コアとなる９ｍｅｒのアミノ酸配列に隣接する０、１、２、又は３アミノ酸残基をさらに包含しうる。したがって、ある実施形態では、エピトープコアが、約９アミノ酸〜約１５アミノ酸の長さの範囲でありうる。
本明細書で用いられる「Ｎ末端」とは、エピトープコアのＮ末端に隣接するアミノ酸を指し、該エピトープコアのＮ末端に隣接し、且つこれの上流にある、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、又は９アミノ酸を包含する。
本明細書で用いられる「Ｃ末端」とは、エピトープコアのＣ末端に隣接するアミノ酸を指し、該エピトープコアのＣ末端に隣接し、且つこれの下流にある、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、又は９アミノ酸を包含する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、１又は複数の修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、２つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、３つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、４つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、５つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、６つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、７つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、８つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、９つの修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、１０の修飾を含有する。
一実施形態では、修飾抗体、又はその抗原結合断片が、２０までの修飾を含有する。
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号９３（ＶＫ１ＡＡ）として示される軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号８９（ＶＨ１Ａ２）として示される重鎖可変領域とを含む抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号８８、８９、９０、９１、及び９２のいずれか１つとして示される重鎖可変領域を含む抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号９３、９４、９５、９６、９７、１００、１０２、及び１０３のいずれか１つとして示される軽鎖可変領域を含む抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書では、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片であって、アミノ酸配列が配列番号８９として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３として示される軽鎖可変領域とを含み、
（ｉ）重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）又はセリン（Ｓ）による置換；５１位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５２ｂ位におけるリシン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）又はアスパラギン（Ｑ）による置換；７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み、且つ、
（ｉｉ）軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；１９位におけるアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）による置換；２２位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；４８位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；５１位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含む、該抗体、又はそれらの抗原結合断片が提供される。
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号８８、８９、９０、９１及び９２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３、９５、９６、９７、１００、１０２、又は１０３として示される軽鎖可変領域とを含む、抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書では、前述の例及び実施形態に加えて、１又は複数のＴ細胞エピトープにおいて１又は複数のアミノ酸修飾を伴う修飾抗体又はその抗原結合断片を意図する。本明細書の非限定的な一例では、少なくとも１つのＴ細胞エピトープにおいて少なくとも１つの修飾を有する抗体又はそれらの抗原結合断片が提供される。本明細書の非限定的な別の例では、本明細書で説明されるＴ細胞エピトープのうちの１、２、３、４、５、６、又は７つにおいて少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する抗体又はそれらの抗原結合断片が提供される。さらなる非限定的な例は、複数のＴ細胞エピトープにおいて複数のアミノ酸修飾を有する抗体又はそれらの抗原結合断片を包含する。本明細書では、上記で説明した、任意の数の抗体又はそれらの抗原結合断片、Ｔ細胞エピトープにおける任意のアミノ酸修飾の組合せを意図する。
Ｔ細胞エピトープ及びアロタイプの頻度
抗原内に見出される個々のエピトープは、特定のＭＨＣクラスＩＩアロタイプにより優先的に提示される可能性があり、且つ同様に、同じ抗原内の他の特異的なエピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示されない可能性もある。特定のエピトープが、特定のＭＣＨクラスＩＩ分子とこのように会合することは、個体のＭＨＣクラスＩＩアロタイプに依存することが示されている。また、Ｔ細胞エピトープを除去するために、抗体又はそれらの抗原結合断片を修飾するときにも、特定のエピトープの、特定のアロタイプとの会合を考慮する場合がある。このような考慮により、特定のアロタイプ（例えば、あるＭＨＣクラスＩＩアロタイプを有する特定の対象集団）に対して高度に特異的な修飾を、抗体又はその抗原結合断片に対してもたらすことが可能となりうる。１又は複数の対象のＭＨＣクラスＩＩアロタイプは、当技術分野において知られる遺伝子型決定法により容易に決定することができ、これにより、このアロタイプに合わせて抗体又はそれらの抗原結合断片を修飾するときに考慮される、Ｔ細胞エピトープの、所与のアロタイプとの会合を容易に同定することができる。Ｔ細胞エピトープとＭＨＣクラスＩＩアロタイプとの会合を同定することについては、以下の実施例でより詳細に説明される。本明細書では、所与のエピトープについて同定されたＭＨＣクラスＩＩとの会合に合わせてＴ細胞エピトープを修飾した修飾抗体又はそれらの抗原結合断片が意図される。
Ｄ．抗エンドグリン抗体
ＦＲ及び／又はＣＤＲをコードする核酸のすべて、並びに選択されたアミノ酸位置の変化のすべてを同時的に組み込むことは、例えば、組換え及び化学合成を含めた、当業者に知られる各種の方法により達成することができる。例えば、同時的な組込みは、例えば、アクセプター可変領域のヌクレオチド配列を、ドナーＣＤＲをコードする核酸と併せて融合させる形で化学合成し、且つ、変化可能なアミノ酸残基を保有させるために選択した位置に複数の対応するアミノ酸コドンを組み込むことにより達成することができる。
本明細書では、エンドグリンに結合する抗体並びにそれらの抗原結合断片が提供される。また、エンドグリンに結合し、血管新生／新血管形成、微小血管の拡張、並びに／又は過剰な血管新生に随伴する疾患を（部分的に又は完全に）阻害するか、又は（部分的に又は完全に）管理／治療する抗体並びにそれらの抗原結合断片も提供される。同様にまた、エンドグリン機能（例えば、シグナル伝達機能、結合機能、活性化機能など）の阻害も、エンドグリン結合の阻害という意味の範囲内に包含される。さらに別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片が、エンドグリンへの結合を介して血管新生を阻害する。本出願はまた、該抗体を作製するのに用いられうる細胞系、該細胞系を作製する方法、抗体又はそれらの抗原結合断片を発現させ、且つ、これらを精製する方法も提供する。
本明細書で説明される方法を用いて生成される、エンドグリンに特異的に結合する抗体並びにそれらの抗原結合断片を、ＥＬＩＳＡが含まれるがこれに限定されない従来の方法を用いる、本明細書で提供されるか、又は当技術分野において知られているアッセイを用いて、エンドグリンに結合する能力について調べることができる。また、本明細書で説明される抗体のアフィニティーも、Ｂｉａｃｏｒｅ又は表面プラズモン共鳴が含まれるがこれらに限定されない従来の方法を用いて決定することができる。
本明細書で説明される抗体並びにそれらの抗原結合断片は、ＴＲＣ１０５抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列をヒト化することにより構築した。このヒト化を達成するために、ＴＲＣ１０５のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の三次元モデルを創出及び解析した。次いで、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖を、ＴＲＣ１０５のＶＨ鎖及びＶＬ鎖とのそれらの相同性に基づいてそこからヒトＶＨ鎖及びＶＬ鎖を選択したヒト生殖細胞系列の配列データベースと個別に比較した。ヒト化するのに選択されたヒトＶＬ配列は、Ｏ２／Ｏ１２（ＶＫ１−３９）（配列番号２）であった。Ｏ２／Ｏ１２は、ＴＲＣ１０５との配列同一性が６５％であり、その遺伝子はヒト生殖細胞系列のレパートリーにおいて高度に発現している。ヒト化するのに選択されたヒトＶＨ配列は、ＶＨ３−１５（配列番号４０）であった。ＶＨ３−１５は、ＴＲＣ１０５との配列同一性が７０％であり、ヒト生殖細胞系列のレパートリーにおいてかなりの頻度で発現している。ＴＲＣ１０５とヒト配列との間で異なっていたアミノ酸位置を、ＴＲＣ１０５の３Ｄモデルにおいて検討し、修飾する場合にどの置換を考慮するかを決定した。３Ｄモデル解析に基づくアミノ酸の選択基準には、例えば、アミノ酸と関連する立体効果、アミノ酸の相対電荷、並びに可変重鎖及び／又は可変軽鎖内のアミノ酸の位置が含まれるがこれらに限定されない。ヒトフレームワーク領域について同定及び提起される置換を、Ｏ２及びＶＨ３−１５のヒトフレームワーク領域に組み込み、ＴＲＣ１０５のＣＤＲを、対応するＯ２及びＶＨ３−１５のヒトフレームワーク領域に移植する結果として、多数のヒト化抗体又は抗原結合断片が得られる。加えて、軽鎖のＦＲ−４は、ヒト生殖細胞系列Ｊセグメントの配列であるＪｋ４から派生させる。同様に、重鎖のＦＲ−４は、ヒト生殖細胞系列Ｊセグメントの配列であるＪＨ４から派生させる。
本明細書では、エンドグリンに結合するヒト化抗体並びに抗原結合断片が説明される。また、エンドグリンに結合し、血管新生を阻害するヒト化抗体並びに抗原結合断片も説明される。本明細書で説明される抗体並びに抗原結合断片は、上記で説明した通りに生成させた。
抗体並びにそれらの抗原結合断片は、可変重（ＶＨ）鎖、可変軽（ＶＬ）鎖、これらの両方、又はこれらの結合部分を有しうる。一実施形態では、ＶＨ鎖が、配列番号４１〜４３のうちのいずれかとして示されるアミノ酸配列、又はこれらの結合部分を有する。このようなＶＨ鎖は、フレームワーク領域配列が配列番号４４〜６２のうちのいずれかとして示されうる。別の実施形態では、ＶＬ鎖が、配列番号３〜５のうちのいずれかとして示されるアミノ酸配列、又はこれらの結合部分を有する。このようなＶＬ鎖のフレームワーク領域配列は、配列番号６〜３８のうちのいずれかとして示されうる。
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号３として示される軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域とを含む、抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書では、抗体、又はその抗原結合断片であって、アミノ酸配列が配列番号３として示される軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域とを有し；重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換；７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換；７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換；７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換；８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）による置換；９４位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）又はグリシン（Ｇ）による置換；１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換；１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換；並びに１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み；且つ、該軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換；３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換；４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換；４６位におけるロイシン（Ｌ）のプロリン（Ｐ）による置換；４７位におけるロイシン（Ｌ）のトリプトファン（Ｗ）による置換；６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換；７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換；７１位におけるフェニルアラニン（Ｆ）のチロシン（Ｙ）による置換；１００位におけるグルタミン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換；並びに１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含む、該抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号４１、４２、又は４３として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号３、４又は５として示される重鎖可変領域とを含む、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片が提供される。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号３として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４１として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号５として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号３として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号５として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４３として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番３として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４３として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域とを含みうる。抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号４３として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号５として示される軽鎖可変領域とを含みうる。このような抗体は、エンドグリンに結合し、血管新生を阻害しうる。
このような実施形態のうちのいずれかでは、重鎖可変領域が、７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換；７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換；８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）による置換；９４位におけるトレオニン（Ｔ）のグリシン（Ｇ）による置換；１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換；１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換；並びに１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含むことが可能であり、且つ、該軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換；３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換；５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換；６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換；７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換；１００位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換；並びに１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含みうる。
本明細書では、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有し、
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号６６のＣＤＲ１、配列番号６７のＣＤＲ２、並びに配列番号６８のＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列、又は１若しくは複数の保存的置換を除き、配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１；
（ｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換を除き、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ２；
（ｉｖ）配列番号４７のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換と；
（ｂ）７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換と；
（ｃ）７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換と；
（ｄ）８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換と；
（ｅ）８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）若しくはロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｆ）９４位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）若しくはグリシン（Ｇ）による置換と
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ３；並びに
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換と；
（ｂ）１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｃ）１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換と
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号５６のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ４を含み；
且つ、前記軽鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号６３のＣＤＲ１、配列番号６４のＣＤＲ２、並びに配列番号６５のＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換と；
（ｂ）３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換と；
（ｃ）４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｄ）５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１；
（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換と；
（ｂ）４６位におけるロイシン（Ｌ）のプロリン（Ｐ）による置換と；
（ｃ）４７位におけるロイシン（Ｌ）のトリプトファン（Ｗ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ２；
（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換と；
（ｂ）７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換と；
（ｂ）７１位におけるフェニルアラニン（Ｆ）のチロシン（Ｙ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ３；並びに
（ｖ）配列番号３５のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１００位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換と；
（ｂ）１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ４；
を含む、該抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号６６として示される重鎖可変領域ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号６７として示される重鎖可変領域ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号６８として示される重鎖可変領域ＣＤＲ３、アミノ酸配列が配列番号６３として示される軽鎖可変領域ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号６４として示される軽鎖可変領域ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号６５として示される軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含みうる。
一実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片がエンドグリンに結合し、且つ、はアミノ酸配列が配列番号４４として示される重鎖可変領域ＦＲ１と、アミノ酸配列が配列番号４５として示される重鎖可変領域ＦＲ２と、アミノ酸配列が配列番号４７として示される重鎖可変領域ＦＲ３と、アミノ酸配列が配列番号５６として示される重鎖可変領域ＦＲ４とを含む。
別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片がエンドグリンに結合し、且つ、アミノ酸配列が配列番号４４として示される重鎖可変領域ＦＲ１と、アミノ酸配列が配列番号４６として示される重鎖可変領域ＦＲ２と、アミノ酸配列が配列番号４８として示される重鎖可変領域ＦＲ３と、アミノ酸配列が配列番号５６として示される重鎖可変領域ＦＲ４とを含む。
別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列が配列番号６として示される軽鎖可変領域ＦＲ１と、アミノ酸配列が配列番号２０として示される軽鎖可変領域ＦＲ２と、アミノ酸配列が配列番号２８として示される軽鎖可変領域ＦＲ３と、アミノ酸配列が配列番号３５として示される軽鎖可変領域ＦＲ４とを含む。
別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片がエンドグリンに結合し、且つ、アミノ酸配列が配列番号６として示される軽鎖可変領域ＦＲ１と、アミノ酸配列が配列番号２１として示される軽鎖可変領域ＦＲ２と、アミノ酸配列が配列番号２９として示される軽鎖可変領域ＦＲ３と、アミノ酸配列が配列番号３５として示される軽鎖可変領域ＦＲ４とを含む。
別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片がエンドグリンに結合し、且つ、アミノ酸配列が配列番号７として示される軽鎖可変領域ＦＲ１と、アミノ酸配列が配列番号２１として示される軽鎖可変領域ＦＲ２と、アミノ酸配列が配列番号２９として示される軽鎖可変領域ＦＲ３と、アミノ酸配列が配列番号３５として示される軽鎖可変領域ＦＲ４とを含む。
本明細書では、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域とを含む抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書では、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片であって、アミノ酸配列が配列番号４として示される軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号４２として示される重鎖可変領域とを有し；前記重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換；７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換；７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換；７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換；８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）による置換；９４位におけるアルギニン（Ｒ）のトレオニン（Ｔ）又はグリシン（Ｇ）による置換；１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換；１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換；並びに１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含み；且つ、該軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換；３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換；４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換；４６位におけるプロリン（Ｐ）のロイシン（Ｌ）による置換；４７位におけるトリプトファン（Ｗ）のロイシン（Ｌ）による置換；６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換；７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換；７１位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換；１００位におけるグルタミン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換；並びに１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換からなる群から選択される１又は複数の修飾をさらに含む、該抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
本明細書では、エンドグリンに結合する抗体、又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号６６のＣＤＲ１、配列番号６７のＣＤＲ２、並びに配列番号６８のＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列、又は１若しくは複数の保存的置換を除き、配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１；
（ｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換を除き、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ２；
（ｉｖ）配列番号４７のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）７６位におけるアスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換と；
（ｂ）７７位におけるトレオニン（Ｔ）のアルギニン（Ｒ）による置換と；
（ｃ）７８位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換と；
（ｄ）８２ａ位におけるアスパラギン（Ｎ）のイソロイシン（Ｉ）による置換と；
（ｅ）８９位におけるバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）若しくはロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｆ）９４位におけるアルギニン（Ｒ）のトレオニン（Ｔ）若しくはグリシン（Ｇ）による置換と
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ３；並びに
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１０８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）による置換と；
（ｂ）１０９位におけるバリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｃ）１１３位におけるセリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換と
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号５６のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ４を含み；
且つ、前記軽鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号６３のＣＤＲ１、配列番号６４のＣＤＲ２、並びに配列番号６５のＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン（Ｑ）による置換と；
（ｂ）３位におけるグルタミン（Ｑ）のバリン（Ｖ）による置換と；
（ｃ）４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｄ）５位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ１；
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）３６位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換と；
（ｂ）４６位におけるプロリン（Ｐ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
（ｃ）４７位におけるトリプトファン（Ｗ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ２；
（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）６０位におけるセリン（Ｓ）のバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）による置換と；
（ｂ）７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換と；
（ｂ）７１位におけるチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ３；並びに
（ｖ）配列番号３５のアミノ酸配列、又はＫａｂａｔによる番号付けシステムを使用する、
（ａ）１００位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換と；
（ｂ）１０６位におけるイソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換と；
からなる群から選択される１若しくは複数の置換を除き、配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ４；
を含む、該抗体、又はその抗原結合断片が提供される。
可変ドメインのうちの実質的部分は、それらに介在するフレームワーク領域と併せて、３つのＣＤＲ領域を包含する。また、該部分は、第１のフレームワーク領域並びに第４のフレームワーク領域の一方又は両方のうちの少なくとも約５０％ずつも包含し、この５０％は、該第１のフレームワーク領域のＣ末端側の５０％、並びに該第４のフレームワーク領域のＮ末端側の５０％である。可変ドメインの実質的部分のＮ末端又はＣ末端におけるさらなる残基は、天然の可変ドメイン領域とは通常関連しない残基でありうる。例えば、組換えＤＮＡ法により作製される、本明細書で説明されるヒト化エンドグリン抗体並びに抗原結合断片の構築は、クローニングステップ又は他の操作ステップを容易にする目的で導入されるリンカーによりコードされるＮ末端残基又はＣ末端残基の導入を結果としてもたらしうる。他の操作ステップには、可変ドメインを、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディーを作製する場合）、又は以下でさらに詳細に論じられるタンパク質標識を含めたさらなるタンパク質配列へと接合するためのリンカーの導入が含まれる。
アミノ酸配列が、本明細書で説明される抗体のＣＤＲ３領域として実質的に示されるヒト化エンドグリンＣＤ３領域は、エンドグリンに対する該ＣＤＲ３領域の結合を可能とする構造内に保有される。ＣＤＲ３を保有する構造とは、該ＣＤＲ３領域が、再構成された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然のＶＨ抗体可変ドメイン及びＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲ３領域に対応する位置に配置される、抗体の重鎖配列若しくは軽鎖配列又はこれらの実質的部分の構造でありうる。
本発明の非限定的な一例では、アミノ酸配列が配列番号６８として示されるＣＤＲ３を有する可変重鎖、並びに／又はアミノ酸配列が配列番号６５として示されるＣＤＲ３を有する可変軽鎖を含有する抗体又はそれらの抗原結合断片が提供される。一実施形態では、可変重鎖のアミノ酸配列が、配列番号６８として示されるＣＤＲ３のアミノ酸配列によるＣＤＲ３の置換を除き、配列番号４０として示される。別の実施形態では、可変軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号６５として示されるＣＤＲ３のアミノ酸配列によるＣＤＲ３の置換を除き、配列番号２として示される。加えて、このようなＣＤＲ３を含有する可変領域／鎖は、例えば、上記で説明した通りに示される１又は複数のＦＲアミノ酸配列（又は１若しくは複数のさらなる修飾を含有するこのようなＦＲ）を含むことが可能であり、この場合、抗体又は抗原結合断片は、ＶＨ領域及びＶＬ領域の各々において３つずつのＣＤＲ並びに４つずつのＦＲを有し、エンドグリンに特異的な結合活性を有し、且つ、血管新生を阻害することが可能である。加えてまた、多様な抗体Ｊセグメントも、これらの可変領域内で置換し、可変領域内のさらなる変化をもたらすことができる。
一態様ではまた、ＦＲ４配列をさらに置換することによって、本明細書で説明される可変重鎖及び可変軽鎖を創出することもできる。一実施形態では、重鎖ＦＲ４配列を、以下の配列うちの１つで置換することができる。
一実施形態では、軽鎖ＦＲ４配列を、以下の配列うちの１つで置換することができる。
さらに本明細書では、代替的に、「超ヒト化」抗エンドグリン抗体又はそれらの抗原結合断片とも称する、抗エンドグリン抗体のヒト化形も提供される。このような超ヒト化抗体又はそれらの抗原結合断片は、アミノ酸配列が配列番号７１又は７２として示される軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号７５として示される重鎖可変領域とを含みうる。
別の態様では、本出願が、そのＶＨ配列及びＶＬ配列を有する抗体のうちの少なくとも５％が、このような抗体との競合によりエンドグリンとの結合を遮断される条件下にあるＥＬＩＳＡアッセイにおいて、本明細書で説明されるヒト化抗エンドグリン抗体又は抗原結合断片と競合することが可能なヒト化抗体を提供する。
本明細書では、エンドグリンに結合し、且つ、エンドグリンの活性を調節する中和抗体又は抗原結合断片が提供される。該中和抗体は、エンドグリンに結合することにより、例えば、血管新生を阻害する。
ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片による血管新生の阻害百分率（％）が、陰性対照の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍であるか、１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍以上である場合は、抗体又はその抗原結合断片が血管新生を阻害することを示唆する。ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片による血管新生阻害百分率（％）が、陰性対照の２倍未満である場合は、抗体又はその抗原結合断片が血管新生を阻害しないことを示唆する。
エンドグリンに対する抗体又は抗原結合断片の結合は、血管新生を部分的に（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又はこれらのうちの任意の数）阻害する場合もあり、完全に阻害する場合もある。抗体又は抗原結合断片の中和活性又は阻害活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて決定することもでき、且つ／又は本明細書で説明されるか、若しくは当技術分野において別の形で知られるアッセイなど、当技術分野において認知されているアッセイを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて決定することもできる。
一態様では、上記で説明したヒト化抗体のうちのいずれか１つの抗原結合断片が、本明細書で説明されるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、単鎖結合ポリペプチド（例えば、Ｆｃ部分を伴うｓｃＦｖ）、又はこれらの他の任意の機能的断片である。
本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片は、以下でより詳細に説明される検出適用又は診断適用において有用である。本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片は、エンドグリンへの結合に有用であり、これにより、本明細書で説明される血管新生を阻害しうる。
本明細書で説明される抗体又はそれらの抗原結合断片は、必要な場合、所望の機能性を保持しながら、該抗体の特異的な特性を変化させるようにさらに修飾することができる。例えば、一実施形態では、化合物を修飾して、ｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性、可溶性、バイオアベイラビリティー、又は半減期など、該化合物の薬物動態特性を変化させることができる。本明細書で説明される抗体又はそれらの抗原結合断片は、診断適用及び／又は治療適用で用いられる、治療用部分、検出可能部分、又はこれらの両方をさらに含みうる。
本明細書で説明される抗体又はそれらの抗原結合断片はまた、免疫コンジュゲートとしても用いることができる。明細書及び特許請求の範囲を目的として本明細書で用いられる免疫コンジュゲートとは、本発明によるヒト化抗エンドグリン抗体又はそれらの断片と、少なくとも１つの治療標識とからなるコンジュゲートを指す。治療標識には、抗腫瘍剤及び抗血管新生阻害剤が含まれる。当技術分野では、このような抗腫瘍剤が知られており、これらには、毒素、薬物、酵素、サイトカイン、放射性核種、光力学療法剤、及び血管新生阻害剤が含まれるがこれらに限定されない。毒素には、リシンＡ鎖、突然変異体のシュードモナス属外毒素、ジフテリアトキソイド、ストレプトニグリン、ボアマイシン、サポリン、ゲロニン、並びにブタクサの抗ウイルス性タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。薬物には、ダウノルビシン、メトトレキサート、及びカリケアマイシンが含まれる。放射性核種には、放射性金属が含まれる。サイトカインには、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）β、インターロイキン、インターフェロン、及び腫瘍壊死因子が含まれるがこれらに限定されない。光力学療法剤には、ポルフィリン並びにそれらの誘導体が含まれるがこれらに限定されない。当技術分野では、さらなる治療用標識が知られており、本明細書でもまた、これらが意図されている。当業者には、抗エンドグリンｍＡｂ又はそれらの断片を、少なくとも１つの抗腫瘍剤と共に複合体化する方法が知られている（すなわち、Ｇｈｅｔｉｅら、１９９４、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６３：２０９〜３４により総説されている抗体コンジュゲート）。このような方法は、分子を結合させるか又は連結するのに用いられる、複数の利用可能なヘテロ二官能性試薬のうちの１つを使用しうる。本明細書ではさらに、治療用標識及び診断用標識などの連結分子についてのさらなる方法と共に、さらなる放射性核種も説明されている。
抗体又はそれらの抗原結合断片は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することによるなど、当技術分野において各種の目的について知られる技法を用いて修飾することができる。ＰＥＧ修飾（ＰＥＧ化）は、循環時間の改善、可溶性の改善、タンパク質分解に対する耐性の改善、抗原性及び免疫原性の低減、バイオアベイラビリティーの改善、毒性の低減、安定性の改善、並びに製剤化の容易さのうちの１又は複数をもたらしうる（総説については、Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ６８：１〜１８、１９９８を参照されたい）。
Ｆｃ部分を含有しない抗原結合断片の場合、該断片にＦｃ部分を付加（例えば、組換えにより）して、例えば、患者に投与された場合の血液循環中における抗原結合断片の半減期を延長することができる。当技術分野では、適切なＦｃ領域の選択、並びにこのような断片を組み込む方法について知られている。その循環における半減期を延長するように、しかし、その生物学的活性は失わないように、対象のポリペプチドにＩｇＧのＦｃ領域を組み込むことは、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる米国特許第６，０９６，８７１号において説明されている技法など、当技術分野で知られている従来の技法を用いて達成することができる。患者に投与されたとき、血液循環中における抗原結合断片の半減期を延長させるように、抗体のＦｃ部分をさらに修飾することができる。修飾は、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる米国特許第７，２１７，７９８号において説明されている手段など、当技術分野における従来の手段を用いて決定することができる。
また、例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０９１，３２１号及び同第６，７３７，０５６号において説明される方法など、循環における抗体ベースの融合タンパク質の半減期を改善する他の方法も知られている。加えて、それらの複合体のＮ−グリコシド結合型糖鎖にフコースが含有されないように、抗体並びにそれらの抗原結合断片を作製するか又は発現させることもできる。複合体のＮ−グリコシド結合型糖鎖からフコースを除去することは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）が含まれるがこれらに限定されない、抗体並びにそれらの抗原結合断片のエフェクター機能を増大させることが知られている。同様に、エンドグリンに結合しうる抗体又はそれらの抗原結合断片を、それらのＣ末端において、任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びＩｇＭ、並びに該アイソタイプのサブクラス、特に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に由来する免疫グロブリン重鎖の全部又は一部に結合させることができる。
加えて、本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片はまた、それらが血液脳関門を越えることが可能となるように修飾することもできる。本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片に対するこのような修飾は、多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）などの脳疾患を治療することを可能とする。抗体又は抗原結合断片などのタンパク質が、血液脳関門を越えることを可能とする例示的な修飾については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／００８２３８０号において説明されている。
免疫グロブリンのグリコシル化は、それらのエフェクター機能、構造的安定性、並びに抗体生成細胞からの分泌速度に対して著明な効果を及ぼすことが示されている（Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：４０７（１９８５））。これらの特性の一因となる炭水化物基は一般に、抗体の定常（Ｃ）領域に結合する。例えば、ＣＨ２ドメインのアスパラギン２９７におけるＩｇＧのグリコシル化はＩｇＧが、補体依存性細胞傷害作用の古典的経路を活性化させる能力を十全化するのに必要とされる（Ｔａｏ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２５９５（１９８９））。ＣＨ３ドメインのアスパラギン４０２におけるＩｇＭのグリコシル化は、抗体の適正な構築並びに細胞溶解活性に必要である（Ｍｕｒａｏｋａ及びＳｈｕｌｍａｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：６９５（１９８９））。ＩｇＡ抗体のＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインにおける１６２位及び４１９位などのグリコシル化部位を除去すると、細胞内分解並びに少なくとも９０％の分泌阻害がもたらされる（Ｔａｙｌｏｒ及びＷａｌｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４１９７（１９８８））。加えて、それらの複合体のＮ−グリコシド結合型糖鎖にフコースが含有されないように、抗体並びにそれらの抗原結合断片を作製するか又は発現させることもできる。複合体のＮ−グリコシド結合型糖鎖からフコースを除去することは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）が含まれるがこれらに限定されない、抗体並びに抗原結合断片のエフェクター機能を増大させることが知られている。これらの「脱フコース化」抗体並びに抗原結合断片は、複合体のＮ−グリコシド結合型糖鎖にフコースが組み入れられるのに必要な酵素経路及び生化学経路をそれらがもはや含有しないように遺伝子操作されたトランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は細胞系（また、フコシルトランスフェラーゼノックアウト動物、フコシルトランスフェラーゼノックアウト植物、フコシルトランスフェラーゼノックアウト細胞としても知られる）が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野において知られている分子クローニング法を使用する各種の系を介して作製することができる。フコシルトランスフェラーゼノックアウト細胞となるように操作されうる細胞の非限定的な例には、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ０細胞、及びＹＢ２／０細胞が含まれる。
また、可変（Ｖ）領域における免疫グロブリンのグリコシル化も観察されている。Ｓｏｘ及びＨｏｏｄは、ヒト抗体のうちの約２０％が、Ｖ領域においてグリコシル化されていることを報告している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６６：９７５（１９７０））。Ｖドメインのグリコシル化は、Ｖ領域配列において、Ｎ結合型グリコシル化シグナルであるＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒが偶然に発生することから生じると考えられているが、当技術分野では、免疫グロブリンの機能において役割を果たすと認識されていない。
可変ドメインのフレームワーク残基におけるグリコシル化は、抗体による抗原との結合相互作用を変化させうる。本発明は、抗体のアフィニティーを増大させる目的で、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワーク又はＣＤＲにおける限定された数のアミノ酸を選択して突然変異させる（例えば、残基の置換、欠失、又は付加により）ための基準を包含する。
一般に、１又は複数の突然変異を、Ｖ領域のフレームワーク、典型的には、１若しくは複数のＣＤＲ領域に隣接する領域、並びに／又は１若しくは複数のフレームワーク領域に導入することにより、所定のポリペプチド抗原に対する結合アフィニティーを調節することができる。このような突然変異は、該ポリペプチドのグリコシル化部位の配列を破壊又は創出するが、疎水性構造特性には実質的に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換の導入を伴うことが典型的である。プロリン残基を導入する突然変異は回避することが典型的である。抗体並びにそれらの抗原結合断片のグリコシル化については、グリコシル化に関する参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３５０，８６１号においてさらに説明されている。
抗体又はそれらの抗原結合断片は、短期送達用に製剤化することもでき、持続（長期）送達用に製剤化することもできる。
以下でより詳細に説明される通り、抗体又はそれらの抗原結合断片はまた、エンドグリンを精製するのにも用いることができ、且つ／又は試料若しくは患者におけるエンドグリンレベルを検出して、エンドグリンと関連する疾患若しくは障害を検出若しくは診断するのにも用いることができる。
このような方法を用いて生成される、エンドグリンに結合するヒト化抗体、抗原結合断片、及び抗原結合タンパク質は、それらの結合アフィニティー、アビディティー、及び中和能のうちの１又は複数について調べることができる。有用なヒト化抗体、抗原結合断片、及び抗原結合タンパク質は、患者に投与して、血管新生に随伴する状態、疾患、又は障害を予防、阻害、管理、又は治療するのに用いることができる。
本明細書では、エンドグリンに結合するヒト化抗体又はそれらの抗原結合断片を同定する方法が提供される。抗体並びに抗原結合断片は、結合アフィニティー、会合速度、解離速度、及びアビディティーのうちの１又は複数について評価することができる。一態様では、抗体を、それらがエンドグリン又はその中にエンドグリン結合配列が存在するポリペプチドの活性を中和する能力について評価することができる。結合アフィニティー、会合速度、解離速度、及びアビディティーの測定は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定アッセイ）、スカチャード解析、ＢＩＡＣＯＲＥ解析などのほか、一般的に用いられ、且つ、当業者に知られている他のアッセイが含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で認知されているアッセイ（表面プラズモン共鳴法）を用いて達成することができる。
エンドグリンに対する抗体の結合、並びに／又は抗体並びにそれらの抗原結合断片が、例えば、血管新生を阻害する能力の測定は、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）、競合的結合アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、又は当技術分野において知られる他の任意の有用なアッセイを用いて決定することができる。これらのアッセイは一般に用いられており、当業者によく知られている。
非限定的な一実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、エンドグリンに結合する特異的な抗体又はそれらの抗原結合断片の結合能を測定することができる。
ＥＬＩＳＡなどのアッセイはまた、他の抗体又はそれらの抗原結合断片と比較して、エンドグリンに対する特異性の増大を呈示する抗体又はそれらの抗原結合断片を同定するのにも用いることができる。ＥＬＩＳＡなどのアッセイはまた、１又は複数のポリペプチドにわたるエピトープ、並びに１又は複数のエンドグリン分子種にわたるエピトープに結合する抗体又はそれらの抗原結合断片を同定するのにも用いることができる。個別のアッセイチャンバーにおいて同時に、被験抗体又はそれらの抗原結合断片を、エンドグリンのエピトープを含有するポリペプチドの異なる分子種における１又は複数のエピトープに結合する能力についてスクリーニングして、エンドグリンに結合する抗体又はそれらの抗原結合断片を同定する並列的ＥＬＩＳＡを行うことにより、特異性アッセイを実施することができる。当業者によく知られる、みかけの結合アフィニティーを測定する別の技法は、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００システムにより解析する）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄら、Ｇｌｙｃｏ．Ｊ．２０００、１７：３２３〜３２９）である。標準的な測定並びに従来の結合アッセイについては、Ｈｅｅｌｅｙ，Ｒ．Ｐ．、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．２００２、２８：２１７〜２２９により説明されている。
エンドグリンに対するヒト化抗体はまた、それらが、血管新生に随伴する多様な疾患及び状態、例えば、血管新生／新血管形成（例えば、黄斑変性、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎障害、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）、関節リウマチ、骨関節炎、並びに多様な形態のがん（原発性腫瘍及び転移）を特徴とする多様な形態の眼疾患を治療する能力についてアッセイすることもできる。当業者に知られている任意の適切なアッセイを用いて、このような効果をモニタリングすることができる。本明細書では、このような技法のうちのいくつかが説明されている。一例では、本明細書で説明される抗体並びに抗原結合断片を、エンドグリンに結合するそれらの能力についてアッセイする。別の例では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、本明細書で説明される抗体並びに抗原結合断片のアフィニティー定数を決定する。さらに別の例では、本明細書で説明される抗体並びに抗原結合断片を、血管新生の阻害に対するそれらの効果についてアッセイする。
ＩＩ．組成物
本明細書で説明される化合物の各々は、許容される担体又は賦形剤と共に組み合わせて、組成物として用いることができる。このような組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏにおいて解析するか、又はｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏにおいて対象に投与して、開示される化合物により対象を治療するのに有用である。
したがって、医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤、又は当業者によく知られる他の物質を包含しうる。このような物質は非毒性であるものとし、有効成分の有効性に干渉しないものとする。担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路に依存する。
本明細書で説明される方法により同定される対象のタンパク質、例えば、抗体又は抗原結合断片を含む医薬製剤は、乾燥凍結製剤又は水溶液の形態で、所望の純度を有する該タンパク質を、生理学的に許容される任意選択の担体、賦形剤、又は安定化剤（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と混合することにより、調製して保存することができる。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、且つ、リン酸、クエン酸、並びに他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含めた、単糖、二糖、並びに他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖；ナトリウムイオンなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＮＩＣＳ（登録商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる担体、賦形剤、又は安定化剤である。
許容される担体は、投与される患者に対して生理学的に許容可能であり、それらと共に／それらにより投与される化合物の治療特性を保持する。許容される担体並びにそれらの製剤は一般に、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０）において説明されている。例示的な１つの担体は、生理学的食塩液である。本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」という語句は、対象化合物を、１つの器官若しくは体内の１つの部分の投与部位から、別の器官若しくは体内の別の部分へと、又はｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイシステムにおいて保有又は移動させることに関与する、液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封入材料など、薬学的に許容される物質、組成物、又は媒体を意味する。各担体は、製剤の他の成分に適合的であり、且つ、それが投与される対象に対して傷害性でないという意味において許容可能である。また、許容される担体は、対象化合物の特異的な活性を変化させることもないものとする。
本発明の一態様では、医薬投与に適合的な溶媒（水性溶媒又は非水性溶媒）、溶液、エマルジョン、分散媒体、コーティング、等張剤並びに吸収促進剤又は吸収遅延剤を含めた、薬学的に許容される組成物又は生理学的に許容される組成物が提供される。したがって、医薬組成物又は医薬製剤とは、対象における医薬使用に適する組成物を指す。医薬組成物及び医薬製剤は、本明細書で説明される量の化合物と、薬学的に許容される担体又は生理学的に許容される担体を包含する。
組成物は、特定の投与経路（すなわち、全身投与経路又は局所投与経路）に適合するように製剤化することができる。したがって、組成物は、各種の経路を介して投与するのに適する担体、希釈剤、又は賦形剤を包含する。
別の実施形態では、組成物中の化合物の安定性を改善するために、且つ／又は組成物の放出速度を制御するために、必要な場合は、該組成物が、許容される添加剤をさらに含みうる。許容される添加剤は、対象化合物の特異的な活性を変化させない。例示的な、許容される添加剤には、マンニトール、ソルビトール、グルコース、キシリトール、トレハロース、ソルボース、スクロース、ガラクトース、デキストラン、デキストロース、フルクトース、ラクトースなどの糖、並びにこれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。許容される添加剤は、デキストロースなど、許容される担体及び／又は賦形剤と組み合わせることができる。代替的に、例示的な、許容される添加剤には、ペプチドとの安定性を増大させ、且つ、溶液のゲル化を減少させる、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０などの界面活性剤が含まれるがこれらに限定されない。界面活性剤は、溶液の０．０１％〜５％の量で組成物に添加することができる。許容されるこのような添加剤の添加は、保管時における組成物の安定性を増大させ、且つ、保管寿命を延長する。
医薬組成物は、例えば、皮下注射、皮下注射、硝子体内注射、皮内注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、又は筋肉内注射が含まれるがこれらに限定されない注射を介して投与することができる。本明細書では、各種の注射用の組成物製剤において用いられる賦形剤及び担体が意図される。以下の説明は、例だけを目的とするものであり、組成物の範囲を限定することを意図しない。注射用組成物には、水性溶液（水に可溶性である場合）又は分散液、並びに滅菌注射溶液又は滅菌注射分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与に適する担体には、生理的食塩液、静菌水であるＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）が含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、並びにこれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒体でありうる。例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、分散液の場合には必要とされる粒子サイズを維持することにより、並びに界面活性剤を用いることにより、流体性を維持することができる。抗菌剤及び抗真菌剤には、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールが含まれる。等張剤、例えば、糖；マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール；並びに塩化ナトリウムを、組成物中に組み入れることができる。結果として得られる溶液は、そのままで用いるようにパッケージ化することもでき、乾燥凍結することもできる；乾燥凍結調製物は、その後の投与前に滅菌溶液と混合することができる。静脈内注射又は罹患部位における注射では、有効成分が、発熱物質を含まず、且つ、ｐＨ、等張性、及び安定性が適切である、非経口投与に許容される水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性媒体を用いて、適切な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、並びに／又は他の添加剤も組み入れることができる。必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つ又はこれらの組合せを伴う適切な溶媒中に必要量で有効成分を組み込み、次いで濾過滅菌することにより、滅菌注射溶液を調製することができる。一般に、基盤となる分散媒体、並びに上記で列挙した成分のうちで必要とされる他の成分を含有する滅菌媒体に有効成分を組み込むことにより、分散液を調製することができる。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、有効成分に、既に滅菌濾過されたその溶液に由来する、任意のさらなる所望の成分を加えた粉末をもたらす真空乾燥及び凍結乾燥である。
組成物は、従来通り、硝子体内投与することもでき、皮下投与することもでき、硝子体内インプラントを介して投与することもできる。
組成物は、従来通り、例えば、単位用量を注射することによるなど、静脈内投与することができる。注射では、有効成分が、発熱物質を実質的に含まず、且つ、ｐＨ、等張性、及び安定性が適切である、非経口投与に許容される水性溶液の形態でありうる。例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性媒体を用いて、適切な溶液を調製することができる。必要に応じて、防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、並びに／又は他の添加剤も組み入れることができる。加えて、組成物は、エアゾール化を介して投与することもできる（Ｌａｈｎら、「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ Ａｎｔｉ−Ｔ−ｃｅｌｌ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔ Ａｉｒｗａｙ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｇｅｒｙ Ｉｍｍｕｎｏ．、１３４：４９〜５５（２００４））。
一実施形態では、組成物を乾燥凍結して、例えば、保存時の保管寿命を延長する。組成物を、薬物又は本明細書で示される方法のうちのいずれかにおいて用いることを考慮する場合、それが、ヒト患者に投与された場合に、炎症反応又は安全でないアレルギー反応を引き起こさないように、該組成物が発熱物質を実質的に含まないことが可能であることを意図する。組成物を発熱物質について検査し、発熱物質を実質的に含まない組成物を調製することは、当業者に十分に理解されており、市販のキットを用いてこれを達成することが可能である。
許容される担体は、吸収又はクリアランスを安定化させるか、増大させるか、又は遅延させる化合物を含有しうる。このような化合物には、例えば、グルコース、スクロース、又はデキストランなどの炭水化物；低分子量のタンパク質；ペプチドのクリアランス若しくは加水分解を低減する組成物；又は賦形剤若しくは他の安定化剤及び／若しくは緩衝剤が含まれる。吸収を遅延させる薬剤には、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンが含まれる。また、洗浄剤も用いて、リポソーム担体を含めた医薬組成物を安定化させることもでき、その吸収を増大又は減少させることもできる。消化から保護するために、化合物を組成物と複合体化させて、それを、酸及び酵素による加水分解に対して耐性とすることもでき、該化合物を、リポソームなど、適切な形で耐性の担体中に複合体化させることもできる。当技術分野では、化合物を消化から保護する手段が知られている（例えば、治療的作用剤の経口送達用液体組成物について記載している、Ｆｉｘ（１９９６）、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１３：１７６０〜１７６４；Ｓａｍａｎｅｎ（１９９６）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１１９〜１３５；並びに米国特許第５，３９１，３７７号を参照されたい）。
「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与されたときに、生理的に忍容され、且つ、急性胃蠕動、めまいなどのアレルギー反応又は同様の望ましくない反応をもたらさないことが典型的である分子的実体及び組成物を指す。
治療用組成物との関連で用いられる「単位用量」という用語は、各単位が、必要とされる希釈剤、すなわち、担体又は媒体と共に所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性物質を含有する、ヒトに対する単位用量として適切な、物理的に個別の単位を指す。
組成物は、用量製剤と適合する形で、且つ、治療有効量で投与することができる。投与される量は、治療される対象、対象の免疫系が有効成分を使用する能力、並びに所望の結合能の程度に依存する。投与されるのに必要とされる有効成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各個人に固有である。また、初回投与及び追加投与に適するレジメンも変化しうるが、初回投与の後、後続の注射又は他の投与を介して、１時間又は複数時間の間隔で反復投与を行うことが典型的である。代替的に、血中濃度を維持するのに十分な持続的静脈内注入も意図される。
一実施形態は、本明細書で説明される組成物を用いて、本明細書で説明される状態、疾患、又は障害を治療するための薬物を作製することを意図する。薬物は、治療を必要とする患者／対象の身体的特徴に基づき製剤化することができ、且つ、状態、疾患、又は障害の病期に基づき、単一の製剤に製剤化することもでき、複数の製剤に製剤化することもできる。薬物は、病院及び診療所への販売に適切な表示であって、本明細書で説明される疾患を有する対象の治療適応についての該表示を伴う、適切な医薬パッケージにパッケージングすることができる。薬物は、単一のユニットとしてパッケージングすることもでき、複数のユニットとしてパッケージングすることもできる。以下で説明される通り、組成物の用量及び投与についての指示書は、パッケージ内に組み入れることができる。本発明は、本明細書の上記で説明したヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片、並びに薬学的に許容される担体による薬物をさらに対象とする。
本明細書では、エンドグリンに結合し、本明細書の別の箇所で説明した物質などの物質を包含するヒト化抗体並びにそれらの抗原結合断片による組成物が提供される。本明細書で説明される、エンドグリンに結合するヒト化抗体並びにそれらの抗原結合断片を用いて、血管新生／新血管形成（例えば、黄斑変性、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎障害、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）、関節リウマチ、骨関節炎、並びに多様な形態のがん（原発性腫瘍及び転移）を特徴とする多様な形態の眼疾患を治療することができる。
組成物（本明細書で説明される抗体又は抗原結合断片）は、単独で投与することもでき、治療される状態に応じて、第２の組成物と組み合わせて同時に投与することもでき、逐次的に投与することもできる。一実施形態では、第２の治療処置が、血管新生阻害剤（本明細書で説明される）である。２つ以上の組成物を投与する場合、組成物は、組合せで（逐次的に又は同時的に）投与することができる。組成物は、単回投与で投与することもでき、複数回投与で投与することもできる。
本発明の一実施形態では、それらがヒト患者への投与について許容されるように、発熱物質を含まないように組成物を製剤化する。組成物を発熱物質について検査し、発熱物質を含まない医薬組成物を調製することは、当業者に十分に理解されている。
本発明の一実施形態は、本発明の組成物のうちのいずれかを用いて、本発明による、障害を治療するための薬物を作製することを意図する。薬物は、治療を必要とする患者／対象の身体的特徴に基づき製剤化することができ、且つ、障害に基づき、単一の製剤に製剤化することもでき、複数の製剤に製剤化することもできる。本発明の薬物は、病院及び診療所への販売に適切な表示であって、対象における、本明細書で説明される障害の治療適応についての該表示を伴う、適切な医薬パッケージにパッケージングすることができる。薬物は、単一のユニットとしてパッケージングすることもでき、複数のユニットとしてパッケージングすることもできる。本発明の医薬組成物の用量及び投与についての指示書は、医薬パッケージ内に組み入れることができる。
ＩＩＩ．使用方法
本明細書では、患者（ヒト又は非ヒト）に、エンドグリンに優先的に結合する抗体又はその抗原結合断片の組成物を投与することによって患者における応答を誘導する方法が提供される。抗体が結合する結合部位は、連続的であってよい、又はコンフォメーション／不連続なエピトープであってよい。
本発明の有効な応答は、患者が疾病の徴候又は症状の部分的な又は完全な軽減又は低下を経験する場合に実現され、詳細には、これらに限定することなく、生存及び／又は視力の延長が挙げられる。予測無増悪生存時間は、再発数、疾患の病期、及び他の因子を含めた予後因子に応じて、数カ月から数年の単位で測定することができる。生存の延長は、これらに限定することなく少なくとも１カ月（ｍｏ）、少なくとも約２ｍｏｓ、少なくとも約３ｍｏｓ、少なくとも約４ｍｏｓ、少なくとも約６ｍｏｓ、少なくとも約１年、少なくとも約２年、少なくとも約３年などの期間が挙げられる。全生存も、数カ月から数年の単位で測定することができる。或いは、有効な応答は、患者の症状に変化がないままであることであってよい。適応症の治療の別の指標は、以下でより詳細に記載されている。
本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片の組成物は、非治療的作用剤として（例えば、親和性精製剤として）使用することができる。一般に、そのような実施形態の１つでは、対象のタンパク質を、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）樹脂又は濾紙などの当技術分野で公知の従来の方法を使用して固相上に固定化する。固定化したタンパク質を、精製される対象の標的（又はその断片）を含有する試料と接触させ、その後、支持体を、固定化された抗体に結合している標的タンパク質を除く試料中の材料の実質的にすべてを除去する適切な溶媒で洗浄する。最終的に、支持体を、グリシン緩衝液、ｐＨ５．０などの標的タンパク質を放出する別の適切な溶媒で洗浄する。組成物は、精製に加えて、エンドグリン及び血管新生を伴う疾患及び障害の検出、診断及び療法ために使用することができる。
本明細書で使用される用語「接触させること」は、化合物の溶液又は組成物と生物体に由来するポリペプチド、細胞、組織又は器官が入っている液体培地を加え合わせることを指す。或いは、「接触させること」は、化合物の溶液又は組成物を、生物体から得られた血液、血清、又は血漿などの液体と混ぜ合わせることを指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの適用に関して、組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの別の構成成分も含んでよい。ＤＭＳＯは、化合物の取込み又は化合物の溶解を容易にする。試験化合物を含む溶液を、細胞、組織又は器官が入っている培地に加えることができる、又は、ピペットベースのデバイス又はシリンジベースのデバイスなどの送達装置を利用することによって、血液などの別の液体と混合することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの適用に関して、接触は、例えば、組成物を任意の適切な手段によって患者に投与することによって起こりうる；薬学的に許容される賦形剤及び担体を伴う組成物は、上でより詳細に記載されている。
本出願の一実施形態による「患者」（例えば、哺乳動物、例えばヒト又は霊長類、げっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどの非ヒト動物など）は、本明細書に記載の疾患又は障害の１又は複数の臨床的な顕在化及び／又は症状を示す哺乳動物である。ある特定の状況では、患者は無症候性でありうるが、それでも疾患又は障害の臨床的な顕在化を有する。抗体又はその抗原結合断片は、治療的部分とコンジュゲートすることができる、又は治療的部分を含有する融合タンパク質であってよい。抗体又はその抗原結合断片は、検出可能部分とコンジュゲートすることができる、又は検出可能部分を含有する融合タンパク質であってよい。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、治療的部分及び検出可能部分の両方とコンジュゲートすることができる。抗体又はその抗原結合断片は、アフィニティータグ（例えば、精製タグ）とコンジュゲートすることができる、又はそれを用いて組換え操作することができる。例えば、Ｈｉｓ６タグ（配列番号８５）などのアフィニティータグは、当技術分野で慣習的なものである。
本明細書において提供される抗体又はその抗原結合断片は、治療的部分及び／又は画像化部分若しくは検出可能部分及び／又はアフィニティータグとコンジュゲート又は連結することができるものである。ポリペプチドをコンジュゲート又は連結するための方法は当技術分野で周知である。化合物と標識との間を結びつけること（結合させること）は、これらに限定されないが、共有結合性の相互作用及び非共有結合性の相互作用、化学的なコンジュゲーション並びに組換え技法を含めた、当技術分野で公知の任意の手段を含む。
Ａ．エンドグリンの結合及び血管新生
エンドグリン（ＣＤ１０５）は、細胞表面で１８０ｋＤａのホモ二量体膜貫通タンパク質として発現される。外部ドメインは、ＴＧＦ−β１アイソフォーム及びＴＧＦ−β−３アイソフォームに高い親和性（５０ｎＭ）で結合し、ＣＤ１０５の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、ベータグリカンと７１％の配列類似性を共有する。ヒトＣＤ１０５遺伝子は、９ｑ３４染色体に位置することが蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して同定され、コード領域は、１４個のエクソンを含有し、ＴＧＦ−βに結合する能力を持つＣＤ１０５の２つの異なるアイソフォーム（Ｌ及びＳ）が特徴付けられている。細胞質尾部に１４アミノ酸を有する６００アミノ酸残基からなるＳ−ＣＤ１０５とは対照的に、Ｌ−ＣＤ１０５は、細胞質尾部に４７アミノ酸残基を有する６３３アミノ酸残基からなる。しかし、Ｌ−ＣＤ１０５が優性型である。ＣＤ１０５は、内皮細胞において、主にセリン残基及びトレオニン残基で構成的にリン酸化されており、このリン酸化は、細胞内の構成的に活性なＴＧＦ−β ＲＩＩによるものである。ＴＧＦ−βがＣＤ１０５に結合することにより、リン酸化が下方制御され、これはプロテインキナーゼＣ阻害剤で見られる効果と同様である。ヒトＣＤ１０５のアミノ酸配列は、細胞外ドメインの露出した領域に位置するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）のトリペプチドを含有する。ＲＧＤペプチドは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、Ｉ型コラーゲン、及びフィブリノーゲンなどのＥＣＭタンパク質において見出される重要な認識構造であり、細胞表面インテグリンによって認識される。インテグリン接着は、内皮が決定的な役割を果たすプロセスである鬱血、血栓症、血管新生及び炎症に関係づけられている（Ｄｕｆｆら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１７：９８４〜９９２（２００３））。
ＣＤ１０５は、増殖している内皮細胞によって発現されるＴＧＦ−β受容体ファミリーのメンバーである。内皮細胞の増殖のために正常なレベルのＣＤ１０５が必要である。ＣＤ１０５の発現は、細胞低酸素症により、低酸素誘導因子−１−α（ＨＩＦ−１−α）が産生されことによって増加し、低酸素の細胞をアポトーシスから保護する。ＣＤ１０５のいくつかの機能は、ＴＧＦ−βシグナル伝達と関連する。ＴＧＦ−βは、セリンキナーゼ、受容体Ｉ型（ＲＩ）及び受容体ＩＩ型（ＲＩＩ）からなるヘテロ二量体受容体を通じてシグナル伝達する。ＴＧＦ−βが受容体の外部ドメインに結合することにより、ＴＧＦ−β ＲＩをリン酸化する細胞質のＲＩＩキナーゼ活性が表に現れ、次いでそれがＳｍａｄタンパク質などの下流のシグナル伝達物質（ｓｉｇｎａｌｅｒ）と相互作用しうる。ＣＤ１０５は、ＴＧＦ−β受容体複合体の一部を形成するが、細胞表面に独立して存在する場合もある。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、多くの細胞において、ＣＤ１０５によってＴＧＦ−βシグナル伝達が抑制される。
ＣＤ１０５は、アクチビンＡ並びに骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−１０、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−７及びＢＭＰ−２などの他の増殖因子にも結合する。ＴＧＦ−β又は他の増殖因子リガンドのＣＤ１０５への結合には、少なくとも受容体ＲＩＩが存在することが必要であり、単独ではリガンドに結合することができない。ＣＤ１０５が受容体に結びつくことによって、リガンド自体に対するそれらの親和性は変化しない。結びついたら、ＣＤ１０５の細胞質ドメインがＴＧＦ−β ＲＩ及びＴＧＦ−β ＲＩＩによってリン酸化される；次に、ＴＧＦ−β ＲＩキナーゼが受容体複合体から解離するが、ＴＧＦ−β ＲＩＩキナーゼは解離しない。
ＣＤ１０５の発現により、ＴＧＦ−β ＲＩＩのリン酸化のレベルが阻害されるが、ＴＧＦ−β ＲＩのリン酸化のレベルは増加し、その結果、Ｓｍａｄ２のリン酸化が増加するが、Ｓｍａｄ３のリン酸化は増加しない。Ｓｍａｄ２は種々の転写因子、コアクチベーター、及び抑制因子と相互作用しうるので、リン酸化されたＳｍａｄ２は、多数のシグナルのインテグレーターとしての機能を果たして遺伝子の転写を調節しうる。したがって、ＣＤ１０５によりＴＧＦ−β ＲＩとＴＧＦ−β ＲＩＩが相互作用することによってＴＧＦ−βの機能が調節され、下流のＳｍａｄタンパク質のリン酸化が修飾される。
ＣＤ１０５は、ＴＧＦ−β受容体（ＴＧＦ−βＲ）、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）及びアクチビン受容体を含めた、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの多数のキナーゼ受容体複合体のシグナル伝達を調節するように作用する。ＣＤ１０５がないと、ＴＧＦ−β受容体が活性化されることによって、内皮細胞の成長を阻害するＳＭＡＤタンパク質（ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３）がリン酸化される。しかし、ＴＧＦ−βによってＣＤ１０５が活性化されることにより、ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化（ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ８のリン酸化を含む）が調節される。最終結果は、ＴＧＦ−β受容体の活性化による内皮細胞に対する成長阻害性の効果が放出されることである（図３参照）。驚くことではないが、抗ＣＤ１０５抗体又はアンチセンスオリゴヌクレオチドによってＣＤ１０５の活性化を阻止することは、ＴＧＦ−βと相乗的に作用して、内皮細胞の成長を抑制する。
ＣＤ１０５プロモーターは、長さ２．６ｋｂであるが、ＴＡＴＡ転写開始ボックス又はＣＡＡＴ転写開始ボックスを含有しない。しかし、ＣＤ１０５プロモーターは、２つのＧＣリッチ領域、Ｓｐ１に対するコンセンサスモチーフ、ｅｔｓ、ＧＡＴＡ、ＡＰ−２、ＮＧＦ−β、及びＭａｄ、並びにＴＧＦ−β反応エレメントを有する。それにもかかわらず、ＣＤ１０５は、比較的限られた細胞分布を有する。基礎レベルの転写には、−６８位のｅｔｓ部位及びＳｐ１部位が必要であると思われるが、例えば、内皮細胞に対する発現の相対的な制限には、多数の制御領域、具体的には、−１２９４〜−９３２における制御領域、及び転写開始部位に非常に近い別の制御領域が関与すると思われる。ＣＤ１０５は、ＴＧＦ−βによって上方制御され、これにより、−３７〜−２９におけるＳｐ１部位が必要であることが示されており、１又は複数の並置された上流のＳＢＥ部位結合性Ｓｍａｄ３及び／又はＳｍａｄ４（ＴＧＦ−βシグナル伝達によって活性化される）も関与している。低酸素症は、虚血組織及び腫瘍の一般的な特徴であり、血管内皮細胞（ＥＣ）におけるＣＤ１０５の遺伝子発現に対する強力な刺激因子である。そのような効果は、ＴＧＦ−β１と相まって強化される。上方制御されたＣＤ１０５は、ＥＣにおいて、低酸素ストレス下で自己防御的役割を発揮しうる。
血管ＥＣは、ＣＤ１０５の主要な供給源である。血管の平滑筋細胞、線維芽細胞、マクロファージ、プレＢ起源の白血病細胞、骨髄単球起源の白血病細胞、及び赤血球前駆体を含めた他の細胞型は、ＣＤ１０５を、より少ない程度に発現する。
ＣＤ１０５は、血管新生に関与する。アンチセンス実験により、ＨＵＶＥＣにおいてＣＤ１０５の発現を抑制することにより、ＴＧＦ−β１と相まってｉｎ ｖｉｔｒｏの血管新生が顕著に阻害され、それによってＣＤ１０５が内皮細胞における血管新生促進性の構成成分であることが示されたことが実証された。血管新生におけるＣＤ１０５の重要な役割の別の証拠は、ＣＤ１０５ノックアウトマウスによってもたらされる。ＣＤ１０５ヌルマウスは、胚形成期の初期での死亡につながる多数の血管の欠陥及び心臓の欠陥を示す。ＣＤ１０５ヌルマウスにおいて観察された重篤な血管の機能障害により、ＣＤ１０５が、胚体外脈管構造における成熟血管の形成のために必要であることが示され、血管形成におけるエンドグリンの直接的な役割がさらに確認されている。
とりわけまた、ＣＤ１０５又はｅｄｇ−１としても知られるエンドグリンは、増殖しつつある血管内皮細胞において高レベルで発現する、ホモ二量体のＩ型膜糖タンパク質である。したがって、エンドグリンは、第１に、活性の血管新生を経つつある内皮細胞についての増殖関連マーカーである。しかし、正常組織の血管内皮細胞によりエンドグリンの発現は制限されうる。ヒトエンドグリンは、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）に特異的に結合することが知られており、エンドグリンについて推測されるアミノ酸配列は、ＴＧＦ−β受容体の一種であるβ−グリカンに対する強い相同性を示す。
エンドグリン（ＥＤＧ）は、内皮細胞及び白血病細胞における増殖関連抗原であるので、腫瘍血管系を減殺する抗体ベースの方法において標的とされている。ＥＤＧの発現は、腫瘍に関連する血管内皮において上方制御され、ＥＤＧは、血管新生に不可欠である。血管新生は、新血管形成をもたらす新たな毛細血管の形成のほか、既存の血管系の維持も包含する。血管新生は、内皮細胞を介する血管基底膜及び間質マトリックスの分解、内皮細胞の遊走、内皮細胞の増殖、並びに内皮細胞による毛細血管ループの形成を含めた、一連の逐次的段階を包含する複雑な過程である。
本明細書では、エンドグリンに結合するヒト化抗体が提供される。エンドグリンは、現存する脈管構造を含み、それを支持する細胞並びに新しい脈管構造の成長を促進し、その一部になっている細胞において見出すことができる。抗体をエンドグリンに結合させ、それによって血管新生を阻害すること、現存する脈管構造又は現存する脈管構造の維持を阻害すること、及び／又は小血管の拡張を阻害することができる。エンドグリンを精製するためのそれらの使用に加えて、これらの抗体は、精製、検出及び診断的な目的並びに治療目的のために有用である。本明細書において提供される抗体は、種々の状態及び疾患を治療するための医薬品の製剤化、前記状態及び疾患を治療するための方法、並びに検出又は診断の方法に使用することができる。
エンドグリンの活性を調節し、これにより、血管新生を阻害し、且つ／又は微小血管の血管拡張を阻害する、エンドグリンに対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が作製されている。これらのマウスモノクローナル抗体は、それらの各々が全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９２８，６４１号；同第６，２００，５６６号；同第６，１９０，６６０号；及び同第７，０９７，８３６号において説明されている。加えて、これらの抗体のうちの多数について、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性も裏付けられている；エンドグリンに結合するモノクローナル抗体は、エンドグリンを調節する化合物として、対象の抗体となる。しかし、マウス抗体の投与は、例えば、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の形態における免疫原性を含め、多数の限界を有するので、マウス抗体の治療的使用は実施可能ではない。
「血管新生」は、本明細書では、血管の維持及び発生のすべての態様を包含するために使用される。したがって、血管新生は、新血管形成につながる新しい毛細血管の形成並びに現存する脈管構造及び小血管の維持及び調節を包含する。血管新生は、血管基底膜及び間質マトリックスの、内皮細胞に媒介される分解、内皮細胞の遊走、内皮細胞の増殖、及び内皮細胞による毛細管のループの形成を含めた一連の逐次的なステップを含む複雑なプロセスである。血管新生は、新しい血管の成長及び／又は発生（新血管形成とも称される）、小血管の拡張、過剰な又は延長された血管の成長、及び現存する脈管構造の維持を含む。エンドグリンは、血管新生の制御に関与することが公知であり、血管新生の誘導に関連する多数の生化学的な経路に関与すると考えられている。（Ｄｕｆｆら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１７：９８４〜９９２（２００３）；Ｂｅｒｎａｂｅｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２（６）：１３７５〜１３８８（２００７））。
本明細書で使用される用語「血管新生阻害」、「血管新生を阻害すること」又は「抗血管新生」は、脈管形成を阻害することを包含し、新血管形成の程度、量、又は速度の減少に影響を及ぼすことを意味するものとする。組織における内皮細胞の増殖又は遊走の程度、量、又は速度を減少させる効果は、血管新生を阻害することの特定の例である。
用語「血管新生阻害性組成物」は、内皮細胞の遊走、増殖、管形成などの血管新生に媒介されるプロセスを阻害し、その後、現存する血管から新しい血管が生成することを阻害し、したがって血管新生依存性の状態に影響を及ぼす組成物を指す。
用語「血管新生を伴う疾患」は、本明細書では、本明細書及び特許請求の範囲の目的に関して、血管新生が異常に延長されているヒトにおけるある特定の病理学的なプロセスを意味するために使用される。これは、さらに、血管新生に関連する、それによって引き起こされる、又はそれを伴う疾患及び状態などの血管新生の状態及び疾患を包含する。そのような疾患の非限定的な例としては、血管新生／新血管形成を特徴とする様々な形態の眼疾患（例えば、黄斑変性症、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎症、慢性の炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）、関節リウマチ、変形性関節症、並びに、様々な形態のがん及び転移が挙げられる。本明細書に記載の抗体及びその抗原結合断片を使用して、エンドグリンに結合させ、血管新生を阻害することによって、血管新生を伴う疾患を治療することができる。
用語「抗血管新生療法」は、本明細書では、本明細書及び特許請求の範囲の目的に関して、エンドグリンを発現している（静止状態の脈管構造と比較して、増殖している脈管構造においてより高いレベルで発現される）細胞及び／又は脈管構造を標的とする療法を意味するために使用される；これは、さらに、血管新生（すなわち、新血管形成につながる新しい毛細血管の形成）を対象とする療法、現存する脈管構造及び／又は過剰な血管化又は血管成長を対象とする療法、小血管の拡張を対象とする療法、並びに疾患又は状態を対象とする療法（例えば、血管ターゲティング療法）を包含する。本発明の範囲内で考えられている例示的な疾患又は状態としては、これらに限定されないが、血管新生／新血管形成を特徴とする様々な形態の眼疾患（例えば、黄斑変性症、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎症、慢性の炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）、関節リウマチ、変形性関節症、並びに、様々な形態のがん、充実性腫瘍及び転移が挙げられる。
「新血管形成を特徴とする眼疾患」は、本明細書では、本明細書及び特許請求の範囲の目的に関して、網膜、角膜、瞳孔、虹彩、硝子体液又は房水を含めた眼の任意の部分内での血管新生の増加によって引き起こされる、又はその結果として生じる任意の眼疾患を意味するために使用される。そのような疾患としては、例えば、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、非糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）及び網膜下新血管形成（ＳＲＮ又はＳＲＮＶ）及び眼の新生物が挙げられる。
Ｂ．診断への適用
ヒト化抗エンドグリン抗体及びその断片は、ｉｎ ｖｉｖｏで、及びｉｎ ｖｉｔｒｏで検出、診断及び／又はモニターするために使用することができる。エンドグリンは、下でさらに記載されている通り、多数の疾患及び障害に関与すると考えられている。エンドグリン関連疾患及び状態の治療は、一部において、それらの診断に左右され、本明細書に記載の抗体及びその抗原結合断片は、過剰なエンドグリンを診断するため、又はエンドグリン活性を伴う疾患及び状態を診断するために有用である。
本明細書では、試料又は対象におけるエンドグリンのレベルを検出する方法であって、（ｉ）本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片を試料又は対象と接触させるステップと、（ｉｉ）抗体又はその抗原結合断片とエンドグリンの複合体を検出するステップとを含む上記方法が提供される。
本明細書では、血管新生又は血管新生依存性の疾患又は障害を画像化又は診断する方法であって、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片の組成物を試料と接触させるステップを含む上記方法が提供される。試料は、例えば、血液、血清、血漿、血小板、生検液、脊髄穿刺液、髄膜及び尿であってよい。画像化又は診断の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて起こりうる。或いは、接触させるステップが、組成物を患者に投与することによる場合、血管新生又は血管新生依存性の疾患又は障害は、ｉｎ ｖｉｖｏで画像化又は診断される。
一実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、検出可能部分をさらに含む。検出は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで起こりうる。抗体又はその抗原結合断片を用いてエンドグリンを検出及び／又は決定（数量化、定性化など）するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイとしては、これらに限らないが、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びウェスタンブロットが挙げられる。エンドグリンのｉｎ ｖｉｔｒｏで検出、診断又はモニターすることは、患者から試料（例えば、血液試料）を得、試料を、例えば、標準のＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験することによって起こりうる。例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートを本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片でコーティングし、洗浄し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡでコーティングして非特異的な結合を阻害することができる。血液試料を段階的に希釈し、ウェルに２連で置き、エンドグリンの段階的に希釈した検量線と比較することができる。ウェルをインキュベートし、洗浄した後、ビオチンで標識された抗エンドグリン抗体を加え、その後ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを加えることができる。ウェルを洗浄し、基質（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を加えてプレートを展開した。プレートは、従来のプレートリーダー及びソフトウェアを使用して読み取ることができる。
検出がｉｎ ｖｉｖｏで起こる場合、接触は、本明細書の他の箇所に記載のものなどの任意の従来の手段を使用して抗体又は抗原結合断片を投与することによって起こる。そのような方法では、試料又は対象におけるエンドグリンの検出を使用して、本明細書に記載の疾患及び障害などのエンドグリンの活性に付随する、又はそれと相関する疾患又は障害を診断することができる。
エンドグリンをｉｎ ｖｉｖｏで検出、診断又はモニターすることにおいて、患者に、検出可能部分と結合させた、エンドグリンに結合する抗体又は抗原結合断片を投与する。検出可能部分は、当技術分野で認められている方法、例えば、これらに限定されないが、例えば、それぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０９６，２８９号、米国特許第７，１１５，７１６号、米国特許第７，１１２，４１２号、米国特許出願第２００３０００３０４８号及び米国特許出願第２００６０１４７３７９号に記載の、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、蛍光、放射性イメージング、内視鏡、腹腔鏡、又は血管内カテーテルから供給される光源（すなわち、光活動性作用剤を検出することによる）、フォトスキャニング、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）走査、全身核磁気共鳴（ＮＭＲ）、ラジオシンチグラフィー、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、標的化近赤外領域（ＮＩＲ）走査、Ｘ線、超音波などを使用して可視化することができる。そのような方法を使用して化合物を検出するための標識も当技術分野で公知であり、そのような特許及び出願に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。検出可能部分を可視化することにより、エンドグリン及び／又は血管新生に付随する状態又は疾患を検出、診断、及び／又はモニターすることが可能になりうる。
所望の標的タンパク質、すなわち、エンドグリンに特異的な抗体を利用する追加的な診断アッセイが当技術分野で公知であり、本明細書においても考えられている。
これらの方法に対して考えられる非限定的な状態、疾患及び障害としては、これらに限定されないが、血管新生に付随する状態、疾患及び障害、例えば、血管新生／新血管形成を特徴とする様々な形態の眼疾患（例えば、黄斑変性症、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎症、慢性の炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）、関節リウマチ、変形性関節症、並びに、様々な形態のがん（原発腫瘍及び転移）などが挙げられる。そのような疾患を検出、診断又はモニターすることにおいて、対象患者に、検出可能部分とコンジュゲートした本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片の組成物を投与する。部分は、例えば上記のものなどの当技術分野で認められている方法を使用して可視化することができる。検出可能部分を可視化することにより、そのような状態及び疾患を検出、診断、及び／又はモニターすることが可能になりうる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出方法のために、患者から得る試料としては、これらに限定されないが、血液、組織生検試料及びそれから得られる体液が挙げられる。
したがって、本発明は、治療的な治療の必要性が潜在的に示されている疾患又は障害に関連づけられるエンドグリンのレベルを検出又は診断するために有用な、エンドグリンに対するヒト化抗体及びその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、本明細書に記載のヒト化抗エンドグリン抗体を含む。他の実施形態では、抗体は、第２の作用剤をさらに含む。そのような作用剤は、例えば、レポーター分子又は検出可能な標識などの分子又は部分であってよい。そのような検出方法のための検出可能な標識／部分が当技術分野で公知であり、以下に、より詳細に記載されている。レポーター分子は、アッセイを使用して検出することができる任意の部分であってよい。ポリペプチドとコンジュゲートしているレポーター分子の非限定的な例としては、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、有色粒子又はビオチンなどのリガンドが挙げられる。検出可能な標識としては、それらの特異的な機能的性質、及び／又は化学的特性によって検出することができる化合物及び／又はエレメントが挙げられ、それを使用することにより、それが付着しているポリペプチドを検出すること、及び／又は、望ましい場合には、さらに数量化することが可能になる。多くの適切な検出可能な（画像化）作用剤が当技術分野で公知であり、同様にそれらをポリペプチドに付着させるための方法も当技術分野で公知である（例えば、そのそれぞれが、これによって参照により組み込まれる、米国特許第５，０２１，２３６号；同第４，９３８，９４８号；及び同第４，４７２，５０９号を参照されたい）。
抗体などのポリペプチドと検出可能な部分をつなぐ方法は当技術分野で公知であり、それらとしては、例えば、融合タンパク質を形成するための組換えＤＮＡ技術及びコンジュゲーション（例えば、化学的なコンジュゲーション）が挙げられる。化学的なコンジュゲーション又は組換え操作によって融合タンパク質を調製するための方法は、当技術分野で周知である。構成成分を共有結合的に連結する方法及び非共有結合的に連結する方法も当技術分野で公知である。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１７８７〜１７９７；Ｄｏｂｅｌｉ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２：４０４〜４１４；及びＫｒｏｌｌ（１９９３）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：４４１〜４５３を参照されたい。
ある場合には、標識又は部分と本明細書に記載の抗体、抗原結合断片又は結合性タンパク質の１又は複数の部分との間に構造化されていないポリペプチドリンカー領域を導入することが必要でありうる。リンカーにより、柔軟性を増強すること、及び／又は任意の２つの断片間の立体的な障害を低下させることを容易にすることができる。リンカーにより、各断片の適切な折りたたみが生じることも容易にすることができる。リンカーは、タンパク質の２つのドメイン間のランダムコイルに存在することが決定された配列などの天然起源のものであってよい。１つのリンカー配列は、ＲＮＡポリメラーゼサブユニットのＣ末端ドメインとＮ末端ドメインとの間に見出されるリンカーである。天然に存在するリンカーの他の例としては、１ＣＩタンパク質及びＬｅｘＡタンパク質に見出されるリンカーが挙げられる。
リンカー内で、アミノ酸配列は、経験的に決定された、又はモデリングによって明らかになったリンカーの特性に基づいて変動してよい。リンカーの選択において考慮すべき事柄としては、リンカーの柔軟性、リンカーの電荷及び天然に存在するサブユニットにおけるリンカーのいくつかのアミノ酸の存在が挙げられる。リンカーは、リンカー内の残基がデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）と接触し、それによって結合親和性又は特異性に影響を及ぼすように、又は他のタンパク質と相互作用するように設計することもできる。ある場合、例えばサブユニット間でより長い距離にわたることが必要である場合、又はドメインが特定の立体配置に保持されなければならない場合などでは、リンカーは、場合によって、追加的な折りたたまれたドメインを含有してよい。一部の実施形態では、リンカーの設計は、リンカーが比較的短い距離、例えば、約１０オングストローム（Å）未満にわたることを必要とするドメインの配置が必要とされうる。しかし、ある特定の実施形態では、リンカーは、最大で約５０オングストロームの距離にわたる。
リンカー内で、アミノ酸配列は、経験的に決定された、又はモデリングによって明らかになったリンカーの特性に基づいて変動してよい。リンカーの選択において考慮すべき事柄としては、リンカーの柔軟性、リンカーの電荷及び天然に存在するサブユニットにおけるリンカーのいくつかのアミノ酸の存在が挙げられる。リンカーは、リンカー内の残基がＤＮＡと接触し、それによって結合親和性又は特異性に影響を及ぼすように、又は他のタンパク質と相互作用するように設計することもできる。ある場合、サブユニット間でより長い距離にわたることが必要である場合、又はドメインが特定の立体配置に保持されなければならない場合などでは、リンカーは、場合によって、追加的な折りたたまれたドメインを含有してよい。
ポリペプチド（遊離の又は細胞に結合した）とビーズをカップリングさせるための方法が当技術分野で公知である。カップリングされたポリペプチド又はポリペプチドを提示している細胞を選択するための方法も当技術分野で公知である。簡単に述べると、ペプチドを、官能基で修飾された、又は、例えば、アビジン、ストレプトアビジン又はビオチンなどの様々な抗体又はリガンドでコーティングされた微小粒子の表面とカップリングさせる常磁性のポリスチレン微小粒子が市販されている（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ、ＩＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。
微小粒子が常磁性であることにより、磁石を使用してそれらを溶液から分離することが可能になる。微小粒子は、磁石から除去したら、容易に再懸濁させることができる。ポリペプチドを、チューブ内で、ポリウレタン層でコーティングされた常磁性のポリスチレン微小粒子にカップリングすることができる。微小粒子の表面上のヒドロキシ基は、ｐ−トルエンスルホニルクロリドとの反応によって活性化される（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｋ及びＭｏｓｂａｃｈ Ｋ．「ｐ−Ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｓ ａｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｏｆ ａｇａｒｏｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０：１１２：３９７〜４０２）。或いは、表面にカルボン酸を含有する常磁性のポリスチレン微小粒子は、カルボジイミドを用いて活性化し、その後ポリペプチドとカップリングし、ポリペプチドの第一級アミノ基と微小粒子の表面上のカルボン酸基との間の安定なアミド結合をもたらすことができる（Ｎａｋａｊｉｍａ Ｎ及びＩｋａｄｅ Ｙ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｍｉｄｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｆｏｒ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｍｅｄｉａ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９５，６（１）：１２３〜１３０；Ｇｉｌｌｅｓ ＭＡ，Ｈｕｄｓｏｎ ＡＱ及びＢｏｒｄｅｒｓ ＣＬ Ｊｒ，Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０ Ｆｅｂ １；１８４（２）：２４４〜２４８；Ｓｅｈｇａｌ Ｄ及びＶｉｊａｙ ＩＫ，ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｉｄａｔｉｏｎ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４ Ａｐｒ；２１８（１）：８７〜９１；Ｓｚａｊａｎｉ Ｂら，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１ Ａｕｇ；３０（２）：２２５〜２３１）。別の選択肢は、ビオチン化したポリペプチドを、表面にストレプトアビジンの単分子膜が共有結合している常磁性のポリスチレン微粒子とカップリングすることである。（Ａｒｇａｒａｎａ ＣＥ，Ｋｕｎｔｚ ＩＤ，Ｂｉｒｋｅｎ Ｓ，Ａｘｅｌ Ｒ，Ｃａｎｔｏｒ ＣＲ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｇｅｎｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８６；１４（４）：１８７１〜８２；Ｐａｈｌｅｒ Ａ，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ＷＡ，Ｇａｗｉｎｏｗｉｃｚ Ｋｏｌｋｓ ＭＡ，Ａｒａｇａｎａ ＣＥ，Ｃａｎｔｏｒ ＣＲ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８７：２６２（２９）：１３９３３〜１３９３７）。
ポリペプチドは、フルオレセイン、Ｒ−フィコエリトリン及びビオチンなどの多種多様な蛍光色素、クエンチャー及びハプテンとコンジュゲートすることができる。コンジュゲーションは、ポリペプチド合成の間に、又はポリペプチドが合成され、精製された後のいずれかで起こりうる。ビオチンは、アビジンタンパク質及びストレプトアビジンタンパク質に高い親和性で結合する小さな（２４４キロダルトン）ビタミンであり、大部分のペプチドと、それらの生物活性を変化させることなくコンジュゲートすることができる。ビオチン標識されたポリペプチドは、固定化したストレプトアビジン及びアビジンアフィニティーゲルを使用して、並びにビオチン化したポリペプチドを検出するために使用することができるストレプトアビジン又はアビジンをコンジュゲートしたプローブを使用して、例えば、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット又はウェスタンブロットの適用において、標識されていないポリペプチドから容易に精製される。ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、最も一般的に使用される種類のビオチン化剤である。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによって活性化されたビオチンは、生理的緩衝液中の第一級アミノ基と効率的に反応して安定なアミド結合を形成する。ポリペプチドはＮ末端に第一級アミンを有し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたビオチン試薬を用いて標識するための標的として利用可能なリシン残基の側鎖にもいくつかの第一級アミンを有してよい。様々な性質及びスペーサーアームの長さを有するいくつかの異なるビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが入手可能である（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル試薬は水溶性であり、それにより、有機溶媒を用いずに反応を行うことが可能である。
ビオチンとポリペプチドのモル間の比率は、当技術分野で認められている技法を使用して、２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）アッセイを使用して推定することができる（Ｇｒｅｅｎ，ＮＭ，（１９７５）「Ａｖｉｄｉｎ．Ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．２９，８５〜１３３；Ｇｒｅｅｎ，ＮＭ，（１９７１）「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｔｉｎｙｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｉｎ ａｖｉｄｉｎ．」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１２５，７８１〜７９１；Ｇｒｅｅｎ，ＮＭ．，（１９６５）「Ａ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｖｉｄｉｎ ａｎｄ ｂｉｏｔｉｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｄｙｅｓ ｂｙ ａｖｉｄｉｎ．」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．９４：２３ｃ−２４ｃ）。いくつかのビオチン分子は、ポリペプチドとコンジュゲートすることができ、各ビオチン分子をアビジンの分子１つに結合させることができる。ビオチン−アビジン結合の形成は非常に急速であり、有機溶媒、極度のｐＨ及び変性試薬において安定である。ビオチン化を定量化するために、ビオチン化したポリペプチドを含有する溶液を、２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）及びアビジンの混合物に加える。ビオチンは、アビジンに対する高い親和性を有するので、２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）に取って代わり、５００ナノメートルにおける吸収が比例して減少する。溶液中のビオチンの量は、単一のキュベットにおいて、ビオチンを含有するペプチドを加える前、及び加えた後に２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）−アビジン溶液の吸収を測定することによって定量化することができる。吸収の変化を、２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）−アビジン複合体の吸光計数によって試料中のビオチンの量に関連づける。
或いは、蛍光部分（例えば、Ｒ−フィコエリトリン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）など）を有する蛍光部分コンジュゲートポリペプチドとコンジュゲートすることができる抗体、抗原結合断片又は結合性タンパク質は、例えば、Ｇｌａｚｅｒ，ＡＮ及びＳｔｒｙｅｒ Ｌ．（１９８４）．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．９：４２３〜７；Ｋｒｏｎｉｃｋ，ＭＮ及びＧｒｏｓｓｍａｎ，ＰＤ（１９８３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２９：１５８２〜６；Ｌａｎｉｅｒ，ＬＬ及びＬｏｋｅｎ，ＭＲ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３２：１５１〜１５６；Ｐａｒｋｓ，ＤＲら（１９８４）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ５：１５９〜６８；Ｈａｒｄｙ，ＲＲら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０６：２７０〜２；Ｈａｒｄｙ ＲＲら（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９：１１６９〜８８；Ｋｒｏｎｉｃｋ，ＭＮ（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．９２：１〜１３；Ｄｅｒ−Ｂａｌｉａｎ Ｇ，Ｋａｍｅｄａ，Ｎ及びＲｏｗｌｅｙ，Ｇ．（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７３：５９〜６３に記載の当技術分野で認められた技法を使用して実現することができる。
１つの非限定的な実施形態では、抗体の抗原結合断片は、抗体のエンドグリンへの結合をｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで可視化するために使用することができる、放射性核種、鉄関連化合物、色素、画像化剤又はエンドグリンを免疫検出するための蛍光剤などの検出可能な標識と結びつける（コンジュゲートする）ことができる。
放射標識の非限定的な例としては、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７１Ｇｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７７Ａｓ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ／８１ＭＫｒ、８７ＭＳｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１００Ｐｄ、１０１Ｒｈ、１０３Ｐｂ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１９Ｓｂ、１２１Ｓｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２８Ｂａ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３１Ｃｓ、１４３Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９１Ｏｓ、１９３Ｐｔ、１９４Ｉｒ、１９７Ｈｇ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ及び２１３Ｂｉが挙げられる。放射標識は、抗体画像化の技術分野で公知の従来の化学作用を使用して化合物に付着させることができる。放射標識された化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断技法及びｉｎ ｖｉｖｏ放射線画像法（ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ）の技法及び放射免疫療法において有用である。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化の例では、抗体及びその抗原結合断片は、放射性同位元素（単数又は複数）ではなく、これらに限定されないが、磁気共鳴画像強調剤を含めた画像化剤とコンジュゲートすることができ、ここでは例えばキレート化基によって抗体分子に多数の常磁性イオンが負荷される。キレート化基の例としては、ＥＤＴＡ、ポルフィリン、ポリアミンクラウンエーテル及びポリオキシム（ｐｏｌｙｏｘｉｍｅ）が挙げられる。常磁性イオンの例としては、ガドリニウム、鉄、マンガン、レニウム、ユウロピウム、ランタン、ホルミウム及びフェルビウム（ｆｅｒｂｉｕｍ）が挙げられる。そのような検出可能な部分としては、金属；金属キレート化剤；ランタニド；ランタニドキレート化剤；放射性金属（ｒａｄｉｏｍｅｔａｌ）；放射性金属キレート化剤（ｒａｄｉｏｍｅｔａｌ ｃｈｅｌａｔｏｒ）；陽電子放出核；微小気泡（超音波用）；リポソーム；リポソーム又はナノスフェア中にマイクロカプセル化された分子；単結晶の酸化鉄ナノ化合物；磁気共鳴画像法用造影剤；光吸収剤、光反射剤及び／又は光散乱剤；コロイド粒子；近赤外フルオロフォアなどのフルオロフォアも挙げられる。多くの実施形態では、そのような副次的な機能基／部分は比較的大きい、例えば、サイズが少なくとも２５ａｍｕであり、多くの場合サイズが少なくとも５０ａｍｕ、１００ａｍｕ又は２５０ａｍｕであってよい。ある特定の実施形態では、副次的な機能基は金属をキレート化するためのキレート部分、例えば、放射性金属（ｒａｄｉｏｍｅｔａｌ）のためのキレート化剤又は常磁性イオンである。複数の実施形態において、副次的な機能基は、照射療法又は画像化の手順のために有用な放射性核種のためのキレート化剤である。
本発明のアンタゴニストは、組織における血管新生を調節するそれらの能力についてもアッセイすることができる。当業者に公知の任意の適切なアッセイを使用して、そのような効果をモニターすることができる。いくつかのそのような技法は、本明細書に記載されている。
血管新生の１つの尺度は、ｉｎ ｖｉｖｏウサギの眼モデルであり、これはウサギの眼アッセイと称される。ウサギの眼アッセイは他者によって詳細に記載されており、さらに、サリドマイドなどの血管新生の阻害剤の存在下で血管新生及び新血管形成を測定するために使用されている。Ｄ’Ａｍａｔｏら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：４０８２〜４０８５を参照されたい。
ウサギの眼アッセイは、角膜の縁から角膜内に成長しているウサギの血管によって例証される新血管形成プロセスが、天然に透明な眼の角膜を通して容易に可視化されるので、ｉｎ ｖｉｖｏでの血管新生についてのよく認識されたアッセイモデルである。さらに、新血管形成の刺激若しくは阻害又は新血管形成の退縮の程度及び量の両方を、ある期間にわたって容易にモニターすることができる。
最後に、ウサギを任意の試験試薬に曝露させ、その結果、ウサギの健康を試験試薬の毒性の指標にする。
別のアッセイでは、キメラマウス：ヒトのマウスモデルにおける血管新生を測定し、これは、キメラマウスアッセイと称される。血管新生、新血管形成及び腫瘍組織の退縮を測定するためのアッセイは、他者によって詳細に記載されており、さらに本明細書に記載されている。Ｙａｎ，ら（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：９８６〜９９６を参照されたい。
キメラマウスアッセイは、移植された皮膚グラフトが正常なヒトの皮膚と組織学的によく似ており、実際のヒトの血管が、グラフティングされたヒトの皮膚から、グラフティングされたヒトの皮膚の表面上のヒトの腫瘍組織内に成長しているところで全組織の新血管形成が起こるので、ｉｎ ｖｉｖｏ血管新生に対する有用なアッセイモデルである。ヒトグラフトへの新血管形成の起点は、新脈管構造（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）をヒト特異的な内皮細胞マーカーで免疫組織化学的染色することによって実証することができる。
キメラマウスアッセイにより、新しい血管の成長の退縮の量及び程度の両方に基づいて新血管形成の退縮が実証される。さらに、腫瘍組織などの、グラフティングされた皮膚に移植された任意の組織の成長に対する影響をモニターすることが容易である。最後に、アッセイシステムにおいて毒性についての内部標準があるので、アッセイは有用である。キメラマウスを任意の試験試薬に曝露させ、その結果マウスの健康を毒性の指標にする。本明細書に記載の、及び当技術分野で公知の他の動物モデルも、本明細書に記載の方法において利用することができる。
Ｃ．ヒト化エンドグリン抗体を用いた治療
本明細書では、血管新生／新血管形成、過剰な血管化、又は小血管の拡張に付随する１又は複数の疾患又は障害を予防又は治療する方法であって、疾患又は障害に関連づけられるエンドグリンに結合する本明細書に記載のヒト化抗体又は抗原結合断片を含む組成物を投与するステップと、血管新生を妨げ、それによって疾患又はその重症度を予防する、治療する、寛解させる、又は緩和するステップとを含む上記方法が提供される。
本明細書では、１又は複数の血管新生／新血管形成を伴う疾患又は障害を予防又は治療する方法であって、疾患又は障害に関連づけられるエンドグリンに結合し、血管新生を減少させる又は過剰な血管新生を妨げる本明細書に記載のヒト化抗体又は抗原結合断片を含む組成物を投与するステップを含む上記方法が提供される。
本明細書で使用される、「予防」は、予防法、症状の発症を予防すること、血管新生に付随する、又はエンドグリン活性と相関する疾患又は障害の進行を予防することを指す。本明細書で使用される「阻害」、「治療」及び「治療すること」は互換的に使用され、例えば、症状の停滞、生存の延長、部分的な又は完全な症状の寛解、及び血管新生に付随する、又はエンドグリン活性と相関する状態、疾患又は障害の部分的な又は完全な根絶を指す。
組成物は、エンドグリンと関連づけることができる本明細書に記載の疾患又は障害を阻害することによっていくつかの所望の治療効果をもたらすために有効な治療有効量で、任意の医学的処置に適用可能な妥当なリスク対効果比で患者に投与することができる。本組成物をヒト患者に投与するために、組成物を当業者に公知の方法体系によって製剤化することができる。治療有効量は、器官又は組織において所望の治療効果又は予防効果を少なくとも部分的に実現する量である。疾患又は障害の予防及び／又は治療的な治療をもたらすために必要なヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片の量は、それ自体は固定されていない。投与されるヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片の量は、疾患の種類、疾患の広範さ及び疾患又は障害に罹患している哺乳動物のサイズに伴って変動してよい。一実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗エンドグリン抗体の２種以上を組み合わせて患者に投与する。組合せは、抗体に随伴して投与すること、又は抗体の後に投与することを含む。
「投与すること」は、本明細書では、組成物を、結果として組成物が患者の体内に存在するように患者に提供する手段と定義される。そのような投与は、これらに限定することなく、皮下投与、硝子体内投与、皮内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は筋肉内投与（例えば、注入）による局所的、局部的又は全身的な投与を含めた任意の経路によってよい。「同時発生的な投与」は、互いの投与から比較的短い期間内に投与することを意味する；そのような期間は、２週間未満、７日未満、１日未満であってよく、同時にさえ投与してよい。
組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、特定の患者、組成物、及び投与形態について、患者に対して有毒になることなく所望の治療反応を実現するために有効なある量の活性成分を得るために変動してよい。選択された投薬レベルは、使用する特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排出速度、治療の持続時間、使用する特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康及び以前の病歴、同様に医学の分野で周知の因子を含めた種々の因子に左右される。本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片は、様々な投薬量で、様々な時間枠にわたって対象に投与することができる。非限定的な用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約１２５ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ、約１７５ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、又はその間の任意の整数を含む。さらに、抗体又は抗原結合断片の用量（単数又は複数）は、週２回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、６週間ごと、８週間ごと、１２週間ごと、又はその中の週の任意の組合せで投与することができる。例えば、抗体又はその抗原結合断片を４週間にわたって、週１回又は週２回投与し、その後２週間は療法なし、などの投薬サイクルも考えられている。追加的な投薬サイクルとしては、例えば、本明細書に記載の用量及び週ごとのサイクルの異なる組合せも、本発明の範囲内で考えられている。
「接触させること」は、本明細書では、本明細書において提供される組成物を、本明細書に記載の細胞、器官、組織又は体液に物理的に近接させる手段と定義される。接触させることは、本明細書において提供される組成物のいずれかを全身的に、又は局所的に投与することを包含し、これらに限定することなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｅｘ ｖｉｖｏでの手順及び方法を包含する。「混ぜ合わせること」及び「接触させること」は本明細書では互換的に使用され、同じように定義されるものとする。
応答は、患者が疾病の徴候又は症状の部分的な又は完全な軽減、又は低下、及び詳細には、これに限定することなく、生存の延長を経験する場合に実現される。予測無増悪生存時間は、再発数、疾患の病期、及び他の因子を含めた予後因子に応じて数カ月から数年の単位で測定することができる。生存の延長としては、これらに限定することなく、少なくとも１カ月（ｍｏ）、少なくとも約２カ月（ｍｏｓ．）、少なくとも約３ｍｏｓ．、少なくとも約４ｍｏｓ．、少なくとも約６ｍｏｓ．、少なくとも約１年、少なくとも約２年、少なくとも約３年、又はそれ以上の時間が挙げられる。全生存も、数カ月から数年の単位で測定することができる。患者の症状は、変化がないままであってよい、又は減少してよい。
当技術分野における通常の技術を有する医師又は獣医師は、必要な組成物の有効量（ＥＤ５０）を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、組成物中に使用する化合物の用量を、所望の治療効果を実現するために必要なレベルよりも低いレベルで開始することができ、所望の効果が実現されるまで徐々に投与量を増加させることができる。或いは、用量を一定に保つことができる。
組成物は、例えば上記のものなどの任意の都合のよい経路によって患者に投与することができる。選択された投与経路にかかわらず、適切な水和物の形態で、及び／又は組成物で使用することができる本発明の化合物を、下記のように又は当業者に公知の他の従来の方法によって、許容できる剤形に製剤化する。
抗体は、例えば、化学的なコンジュゲーション、共有結合若しくは非共有結合、又は下でより詳細に記載されているようなコンジュゲート若しくは融合タンパク質を創出するための組換え技法などの当技術分野で公知の方法を使用して、治療的部分又は検出可能な（画像化）部分と組み合わせることができる。或いは、抗体及び／又は他の作用剤は、組み合わせて、同時に又は逐次的に投与するための別々の組成物にすることができる。
そのような成分の毒性及び治療効果を、細胞培養物又は実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための標準の薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。毒性の副作用を示す化合物を使用することができるが、健康な細胞に対する潜在的な損傷を最小限にし、それによって、副作用を低下させるために、そのような化合物を、患部組織の部位にターゲティングする送達系を設計するように注意を払うべきである。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒトにおいて使用するための様々な投与量の策定において使用することができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんどなく、又は毒性なく、ＥＤ５０を含む様々な循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用する剤形及び利用する投与経路に応じて、この範囲内で変動してよい。本発明の方法において使用する任意の化合物について、最初に細胞培養アッセイから治療有効量を推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養物において決定されたＩＣ５０（すなわち、最大半量の阻害が実現される試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度アレンジが実現されるように策定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
エンドグリンの血管新生促進性の役割は、内皮細胞培養モデル及びノックアウトマウスモデルを含めた多くのモデルにおいて確立されている。内皮細胞及び関連する細胞がエンドグリン（ＣＤ１０５）を発現することが周知であり、一般に、血管新生におけるエンドグリンの役割、並びに心臓の発達が、多数の研究、培養モデル及び動物モデルにおいて確認されている。（Ｄｕｆｆら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１７：９８４〜９９２（２００３）；Ｂｅｒｎａｂｅｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２（６）：１３７５〜１３８８（２００７）；米国特許第７，０９７，８３６号）。
したがって、疾患組織における血管新生を阻害する方法は、疾患の症状を改善し、疾患によっては疾患のケアに寄与しうる。一実施形態では、本発明では、組織における血管新生を阻害することが考えられている。組織における血管新生の程度、したがって本方法によって実現される阻害の程度は、本明細書に記載されているような種々の方法によって評価することができる。
エンドグリン上のエピトープを認識し（例えば、それに結合し）、血管新生を阻害する抗体の独特の特異性により、本明細書に記載のような血管新生（新血管形成）、小血管の拡張、及び／又は過剰な血管化を特徴とする疾患に対する診断的使用及び治療的使用が提供される。ヒト化抗エンドグリン抗体及びその断片を、医学的障害、例えば、血管新生／新血管形成を特徴とする様々な形態の眼疾患（例えば、黄斑変性症、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎症、慢性の炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）、関節リウマチ、変形性関節症、並びに、様々な形態のがん（原発腫瘍及び転移）に罹患している哺乳動物（例えば、ヒト）などの対象に投与することができる。本明細書では、血管新生を特徴とする眼疾患を有する対象を、エンドグリンに結合し、血管新生を阻害する本明細書に記載のヒト化抗体又はその断片を投与することによって治療するための方法が提供される。本明細書では、慢性の炎症性疾患を有する対象を、エンドグリンに結合し、血管新生を阻害する本明細書に記載のヒト化抗体又はその断片を投与することによって治療するための方法も提供される。そのような慢性の炎症性疾患の例としては、これらに限定されないが、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。さらに、本明細書では、糖尿病性腎症を有する対象を、本明細書に記載のヒト化抗体又はその断片を投与することによって治療するための方法が提供される。本明細書では、関節リウマチ又は変形性関節症を有する対象を、本明細書に記載のヒト化抗体又はその断片を投与することによって治療するための方法が提供される。
血管新生を治療するために抗エンドグリン抗体が有効でありうることが理解されると思われ、本明細書では、対象を、１又は複数の追加的な血管新生阻害剤を用いて治療することもできることが考えられている。
用語「血管新生阻害剤」は、本明細書では、本明細書及び特許請求の範囲の目的に関して、これらに限定されないが、血管新生を阻害するように機能するペプチド、タンパク質、酵素、多糖、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、組換えベクター及び薬物を含めた化合物又は分子を意味するために使用される。血管新生阻害剤は、当技術分野で公知であり、本明細書ではすべての種類が考えられている。化合物及び分子の非限定的な例としては、天然の生体分子及び合成の生体分子、例えば、パクリタキセル、Ｏ−（クロロアセチル−カルボミル）フマギロール（「ＴＮＰ−４７０」又は「ＡＧＭ１４７０」）、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、アンジオスタチン、ヒト軟骨細胞に由来する血管新生阻害剤（「ｈＣＨＩＡＭＰ」）、軟骨に由来する血管新生阻害剤、血小板因子−４、ｇｒｏ−ベータ、ヒトインターフェロン誘導性タンパク質１０（「ＩＰ１０」）、インターロイキン１２、Ｒｏ３１８２２０、トリシクロデカン−９−イルキサンテート（「Ｄ６０９」）、イルソグラジン、８，９−ジヒドロキシ−７−メチル−ベンゾ［ｂ］キノリニジウムブロミド（「ＧＰＡ１７３４」）、メドロキシプロゲステロン、ヘパリン及びコルチゾンの組合せ、グルコシダーゼ阻害剤、ゲニステイン、サリドマイド、ジアミノ−アントラキノン、ハービマイシン、ウルソール酸及びオレアノール酸が挙げられる。抗体の非限定的な例としては、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、又はエンドグリンの別のエピトープなどの分子を対象とする抗体が挙げられる。さらに、ＶＥＧＦ受容体の小分子阻害剤が公知であり、本明細書において考えられている。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非限定的な例としては、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、アフリバーセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブが挙げられる。
本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片は、本明細書に記載の血管新生に関連する任意の状態又は疾患の併用療法のためにＶＥＧＦ受容体阻害剤と組み合わせて投与することができる。１つの非限定的な実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤は、ベバシズマブである。ベバシズマブについての例示的な投与量は、２週間ごと又は３週間ごとに約７．５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５ｍｇ／ｋｇの投与である。
１つの非限定的な実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤は、ラニビズマブである。ラニビズマブについての例示的な眼の投与量としては、月に１回、硝子体内に約０．５ｍｇの投与が挙げられる。１つの非限定的な実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤は、アフリバーセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）である。ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐについての例示的な投与量としては、２週間ごと又は３週間ごとに約０．５〜約１０ｍｇ／ｋｇの投与が挙げられる。ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐについての例示的な投与量としては、月に１回又は年に４回、硝子体内に約０．５〜約２．０ｍｇの投与が挙げられる。
別の非限定的な実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤は、スニチニブである。スニチニブについての例示的なレジメンとしては、約５０ｍｇを４週間投与し、その後２週間は薬物を投与しないものが挙げられる。治療レジメンは、周期的ベース又は非周期的ベースで繰り返すことができる。
別の非限定的な実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤は、ソラフェニブである。ソラフェニブについての例示的な投与量としては、毎日約４００ｍｇの投与が挙げられる。
別の非限定的な実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤は、アキシチニブである。アキシチニブについての例示的な投与量としては、１日２回、約３ｍｇ、約５ｍｇ、又は約１０ｍｇの投与が挙げられる。
別の非限定的な実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤は、ペガプタニブである。ペガプタニブについての例示的な投与量としては、６週間ごとに硝子体内に約０．３〜約３ｍｇの投与が挙げられる。
さらに別の非限定的な実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤は、パゾパニブである。パゾパニブについての例示的な投与量としては、毎日約２００〜約１０００ｍｇの投与が挙げられる。
これらのＶＥＧＦ受容体阻害剤の多数の組合せを、本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片と一緒に投与することができる。一実施形態では、組み合わせることにより、本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、又はその両方を、より低い用量で使用することができる。そのような投薬における変化は、本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片とＶＥＧＦ受容体阻害剤を組み合わせることの相乗効果に起因しうる。
血管新生を伴う眼の状態
黄斑変性症の状態及び糖尿病性網膜症
一態様では、本発明は、患者における糖尿病性網膜症、黄斑変性症、脈絡膜血管新生又は血管新生緑内障を、患者に、治療有効量の本明細書において提供される任意の組成物を投与することによって治療するための方法を提供する。
エンドグリンは、血管新生及び細胞外マトリックスに関連づけられる受容体である。黄斑変性症（ＡＭＤ）は、高視力に関与する、黄斑と称される中心の網膜の部分内の光受容体が喪失するものである。黄斑の変性は、細胞外マトリックスの構成成分及び他の壊死組織片が、網膜色素上皮と血管の多い脈絡膜との間の膜内に異常に沈着することを伴う。この壊死組織片様物質はドルーゼンと称される。ドルーゼンは、眼底検査で観察される。正常な眼は、ドルーゼンを含まない黄斑を有しうるが、ドルーゼンは網膜の周辺において豊富でありうる。いかなる黄斑視覚の喪失もなく黄斑に柔らかいドルーゼンが存在することは、ＡＭＤの初期と見なされる。黄斑変性症は、網膜の網膜色素上皮（ＲＰＥ）層の真下に異常な血管が発生する脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を特徴とする。これらの血管がブルッフ膜を突き破り、網膜色素がある上皮が破壊され、出血し、最終的に黄斑の瘢痕が引き起こされ、それにより中心視覚が極めて大きく喪失される（円盤状瘢痕）。
脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）は、他の眼障害に加えて、黄斑変性症において一般に起こり、脈絡膜内皮細胞の増殖、細胞外マトリックスの過剰産生及び血管結合組織性網膜下膜の形成を伴う。網膜色素上皮細胞の増殖及び血管新生因子の産生は、脈絡膜血管新生に影響を及ぼすと思われる。
糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、糖尿病において、毛細管の基底膜の肥厚及び毛細血管の周皮細胞と内皮細胞の接触の欠乏に起因して発生する、過剰な血管新生を特徴とする眼障害である。周皮細胞が喪失することにより、毛細血管の漏出が増加し、血液網膜関門の崩壊に至る。糖尿病性網膜症は、網膜微小血管が変化した結果である。高血圧に誘導される周皮細胞死及び基底膜の肥厚は、血管壁の機能不全につながる。これらの損傷により、血液網膜関門の形成が変化し、また、網膜血管の浸透性が増す。眼内のものなどの小血管は、特に不十分な血糖（血中ブドウ糖）調節を受け易い。グルコース及び／又はフルクトースが過剰に集積することにより、網膜内のごく小さな血管が損傷を受ける。損傷を受けた血管から体液及び脂質が黄斑に漏出する場合、黄斑浮腫も発生する恐れがある。これらの体液により、視覚をぼやけさせる黄斑の腫れが生じる。この損傷により、網膜における酸素の欠乏も生じる。
疾患が進行するにつれて、網膜内の酸素の不足により、網膜に沿って、及び眼の内側を満たす透明なゲル様の硝子体液内で血管新生が刺激される。時を得た治療なしでは、これらの新しい血管は出血し、視覚をくもらせ、網膜を破壊する恐れがある。血管結合組織の増殖により、牽引性網膜剥離も引き起こされる可能性がある。新しい血管は、前側の眼房の角度にも成長し、血管新生緑内障を引き起こす可能性がある。
増殖性の硝子体網膜症は、硝子体膜内及び網膜の表面上の細胞膜及び線維性膜の細胞増殖を伴う。網膜色素上皮細胞の増殖及び遊走は、この眼障害に共通している。増殖性の硝子体網膜症に関連する膜は、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲン及びフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスの構成成分を含有し、次第に線維性になる。
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び糖尿病性網膜症は、先進国における失明の２つの主な原因である。巨大分子ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）及びＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）が最近認可されたことにより、ＡＭＤ患者に対して利用可能な治療の選択肢が改善された。ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）は、Ｆａｂであり、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）は、モノクローナル抗体である。これらはどちらも、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合し、現在まで、ＡＭＤを治療する最も印象的な結果が実証されている；しかし、治療された患者のうちの少数のみが、視力の有意な改善を経験している。ＶＥＧＦ以外の標的に焦点を合わせている抗血管新生療法により、ＶＥＧＦ経路を標的とする作用剤に伴う限界のいくつかが克服されうる。
本明細書に記載の、エンドグリンに結合するヒト化抗体及び抗原結合断片を使用して、黄斑変性症、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、又は増殖性の硝子体網膜症を治療又は予防することができる。黄斑変性症、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、又は増殖性の硝子体網膜症を、本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片を投与することによって治療又は予防する方法が本明細書に記載されている。本明細書に記載の、エンドグリンに結合するヒト化抗体及び抗原結合断片により、血管を縮小し、眼疾患に伴う内皮細胞の増殖を阻害し、出血の症状を消し、視覚のくもりを治療し、視力喪失の停滞をもたらし、且つ／又は、血管の漏出妨げることもできる。本明細書に記載のヒト化抗体及び抗原結合断片は、黄斑変性症、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症又は増殖性の硝子体網膜症を治療するための医薬品にも使用することができる。
さらに、本明細書に記載のヒト化抗体及び抗原結合断片は、黄斑変性症、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症又は増殖性の硝子体網膜症を治療するための公知の療法及び／又は化合物と組み合わせて使用することもできる。そのような化合物の例としては、これらに限定されないが、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、アフリバーセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ、パゾパニブ又はＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）が挙げられる。本明細書に記載の投与形式に加えて、ヒト化抗エンドグリン抗体及び抗原結合断片は、硝子体内経路によって投与することができる。硝子体内への投与形式の非限定的な例としては、硝子体内への注入及び硝子体内へのインプラントの使用が挙げられる。
患者を、改善及び治療への応答性について評価することができる。治療としては、これらに限定されないが、黄斑浮腫を減少させること、ＣＮＶの領域を減少させること、及び視力を増加させることが挙げられる。症状の測定は当技術分野で公知の通りであり、下記の実施例にさらに記載されている。
慢性の炎症性疾患
血管新生の刺激で血管が浸潤する可能性がある皮膚、筋肉、腸、結合組織、関節、骨などの組織を含めた、組織化された組織で構成される種々の組織又は器官のいずれによっても、疾患状態において血管新生が支持されうる。したがって、一実施形態では、治療される組織は、炎症組織であり、阻害される血管新生は、炎症組織の新血管形成がある炎症組織の血管新生である。
炎症性腸疾患
血管新生は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）において重要な役割を果たす。ＩＢＤは、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含めた、腸及び腸の疾患又は状態のセットについての包括的な用語である。クローン病は、一般には小腸及び大腸の炎症を特徴とし、一方、潰瘍性大腸炎は、一般には、結腸に局在している。異常な、又は病理学的な血管新生はクローン病及び潰瘍性大腸炎の両方の中核をなす。どちらの疾患も、微小血管密度の増加及び微小血管の機能障害を伴い、この血管新生は、どちらの疾患にも見られる組織病理及び炎症性サイクルと時間的に関連する。エンドグリンは、これらの組織において発現されること、及びＩＢＤの間の血管新生の調節不全において役割を果たすことが公知である。（Ｃｈｉｄｌｏｗら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２９３：５〜１８（２００７））。
本明細書に記載の、エンドグリンに結合するヒト化抗体及び抗原結合断片を使用して、ＩＢＤを治療することができる。さらに、エンドグリンに結合するヒト化抗体及び抗原結合断片は、クローン病又は潰瘍性大腸炎を治療するために使用することができる。ヒト化抗エンドグリン抗体及び抗原結合断片は、ＩＢＤ、クローン病又は潰瘍性大腸炎に対する外科手術及び／又は公知の療法と組み合わせて使用することもできる。そのような公知の療法の例としては、これらに限定されないが、アミノサリチル酸（例えば、Ｍｅｓａｌａｍｉｎｅ）、コルチコステロイド（例えば、ブデソニド、プレドニゾンなど）、抗生物質（例えば、メトロニジゾール（ｍｅｔｒｏｎｉｄｉｚｏｌｅ）など）、免疫抑制薬（例えば、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）及びシクロスポリンなど）及びタンパク質及び抗体などの生物学的製剤（例えば、インフリキシマブなど）が挙げられる。
ＩＢＤの治療は、炎症組織の血管化の減少によって評価することができる。治療は、ＩＢＤを特徴付ける潰瘍性病変の停滞、消散、及び／又は治癒によっても評価することができる。
糖尿病性腎症＆腎移植虚血
糖尿病性腎症は、１型糖尿病患者及び２型糖尿病患者の両方の罹患率及び死亡率の主要な原因である。糖尿病性腎症は、世界的に、末期の腎疾患の主な原因である。糖尿病性腎症は、血管新生促進性因子の合成が増加することによって糸球体微小血管が傷害を受けることを特徴とする。これらの血管新生促進性因子により、内皮細胞の増殖の増加及びその後の血管新生が引き起こされ、また、慢性の腎疾患ではエンドグリンが上方制御されていることが公知である。この血管新生により、糸球体が破壊され、最終的に腎不全になる（Ｚｅｎｔら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，２７（２）：１６１〜１７１（２００７）；Ｒｏｙ−Ｃｈａｕｄｈｕｒｙら、Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，５：５５〜６０（１９９７））。
同様の影響が、腎移植において見られ、それにより、移植された器官の虚血及び不全が生じる。エンドグリンが上方制御されることにより、腎臓における血管新生及び炎症が上方制御される。逆に、エンドグリンヌルマウスを用いた試験により、移植／虚血後に腎臓の損傷の有意な低下及び器官の生存の増加が示された。（Ｄｏｃｈｅｒｔｙら、Ｎｅｐｈｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，２１：２１０６〜２１１９（２００６））。
本明細書に記載の、エンドグリンに結合するヒト化抗体及び抗原結合断片を使用して、糖尿病性腎症、移植後の腎不全及び／又は移植後の虚血性の腎臓の傷害を治療又は予防することができる。
本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片を投与することによって、糖尿病性腎症、移植後の腎不全及び／又は移植後の虚血性の腎臓の傷害を治療又は予防する方法が本明細書に記載されている。本明細書に記載のヒト化抗体及び抗原結合断片は、糖尿病性腎症、移植後の腎不全及び／又は移植後の虚血性の腎臓の傷害を治療するための医薬品に使用することもできる。さらに、本明細書に記載のヒト化抗体及び抗原結合断片は、糖尿病性腎症、移植後の腎不全及び／又は移植後の虚血性の腎臓の傷害を治療するための公知の療法及び／又は化合物と組み合わせて使用することもできる。
患者を、治療の効力について、例えば、腎機能における改善によって評価することができる。
関節リウマチ＆変形性関節症
関節リウマチは、過剰な血管新生を特徴とし、この点についてはよく理解されている。滑液おいて見出される炎症及び破壊は、滑液組織の周囲及び滑液組織内に見出される血管新生の増加に直接関連する。多数の血管新生促進性因子が、関節リウマチ患者の患部組織内に存在する（Ｋｏｃｈ及びＤｉｓｔｌｅｒ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．＆Ｔｈｅｒ．，９（付録２）：Ｓ３，１〜９（２００７）。
変形性関節症は、滑液関節に影響を及ぼす慢性の不能状態のグループである。血管新生及び炎症は、疾患の病態生理において不可欠なプロセスであり、これらは、これらに限定されないが、ＭＭＰ産生及び軟骨内骨化の刺激を含めた種々の機構を通じて関節の損傷に寄与する。さらに、変形性関節症における血管新生により、さらなる神経支配が誘導され、それが、それぞれが他のものを刺激し続けるフィードバックループに発展する（Ｂｏｎｎｅｔ＆Ｗａｌｓｈ，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，４４：７〜１６（２００５））。
本明細書に記載の、エンドグリンに結合するヒト化抗体及び抗原結合断片を使用して、関節リウマチ及び変形性関節症を治療又は予防することができる。本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片を投与することによって、関節リウマチ及び変形性関節症を治療又は予防する方法が本明細書に記載されている。本明細書に記載のヒト化抗体及び抗原結合断片は、関節リウマチ及び変形性関節症を治療するための医薬品に使用することもできる。
２つの広く認められている、治験におけるＲＡの改善の複合尺度は、Ｐａｕｌｕｓ Ｃｒｉｔｅｒｉａ及び米国リウマチ学会の基準（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ（ＡＣＲ））である。Ｐａｕｌｕｓ Ｃｒｉｔｅｒｉａは、以下のうち４つにおける改善と定義される：圧痛関節数、腫脹関節数、朝のこわばり、患者による疾患活動性の評価、医師による疾患活動性及び赤血球沈降速度（ＥＳＲ）の範囲の評価。改善のレベルは、これらの変数のそれぞれの改善の百分率として設定される、すなわちＰａｕｌｕｓ２０の分類は、６つのパラメータのうち４つにおいて２０％の改善が示された応答者を示す。
関節リウマチは、米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（ＡＣＲ））スコアリングを使用して評価することもできる。簡単に述べると、関節リウマチにおける臨床的な寛解を決定するためのＡＣＲ分類基準（ＡＣＲ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒａ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）は、少なくとも以下の因子のうち５つ以上が２カ月間連続して存在することによって評価される：
ａ．朝のこわばり＜１５分間であること；
ｂ．疲労感がないこと；
ｃ．関節痛がないこと；
ｄ．関節圧痛又は運動時痛がないこと；
ｅ．関節又は腱鞘に軟組織の腫脹がないこと；及び
ｆ．ＥＳＲ（Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ法）女性で＜３０ｍｍ／時間、男性で２０ｍｍ／時間であること。
除外が生じ得、それは、活動性の血管炎の臨床症状である心膜炎、胸膜炎又は筋炎及び原因不明の最近の体重減少、又は関節リウマチに起因しうる発熱がある場合は完全な臨床的寛解としてはならないことを含む（Ｐｉｎａｌｓ ＲＳら：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２４：１３０８，１９８１）。さらに、関節リウマチの機能状態のＡＣＲ分類基準（ＡＣＲ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｔｕｓ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）は、以下の患者の能力に基づいた分類を含む：
クラスＩ：日常生活動作を完全にこなせる（日常の自分の身の回りの世話、職場での機能性、趣味・スポーツなどの活動性）；
クラスＩＩ：日常の自分の身の回りの世話及び職場での機能性は果たせるが、趣味・スポーツなどの活動性は限定される；
クラスＩＩＩ：日常の自分の身の回りの世話はできるが、職場での機能性、趣味・スポーツなどの活動性は限定される；及び
クラスＩＶ：日常の自分の身の回りの世話、職場での機能性、趣味・スポーツなどの活動性が限定される。
変形性関節症は、ＡＣＲスコアリングを使用して評価することもできる。変形性股関節症のＡＣＲの臨床的分類基準（ＡＣＲ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｐ）は、患者の病歴、理学的検査及び検査所見を利用して評価する：患者は、股関節痛及び以下のうち１つについて評価される：
（１）股関節の内旋が１５度未満且つＥＳＲが４５度ｍｍ／時以下、若しくは、ＥＳＲが入手できない場合は股関節屈曲が１１５度以下；又は
（２）股関節の内旋が１５度未満、股関節の内旋に伴う痛み、股関節の朝のこわばりが６０分以下、且つ患者が５０歳を超えている。
病歴、理学的検査、検査所見及びＸ線検査所見を使用して、伝統的な形式は、股関節痛及び以下の指標のうちの２つである：ＥＳＲが２０ｍｍ／時未満、Ｘ線検査による大腿の骨棘及び／若しくは臼蓋の骨棘、又はＸ線検査による関節腔の狭小化（上位の、軸方向の、及び／又は内側の）。分類木は以下の通りである：（１）Ｘ線検査による大腿の骨棘及び／若しくは臼蓋の骨棘又は（２）ＥＳＲが２０ｍｍ／時以下且つＸ線検査による軸方向の関節腔の狭小化と合併した股関節痛（Ａｌｔｍａｎ，Ｒら：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３４：５０５，１９９１）。
変形性膝関節症のＡＣＲの臨床的分類基準（ＡＣＲ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｋｎｅｅ）
変形性膝関節症のＡＣＲの臨床的分類基準は、病歴及び理学的検査を使用して、以下の判断基準を利用して評価する：以下のうち３つを伴う膝の痛み：
（１）患者が５０歳を超えている；
（２）３０分未満の朝のこわばり；
（３）活発な運動時の捻髪音；
（４）骨圧痛；
（５）骨肥大；及び
（６）触知できる滑膜の熱感なし。
患者の病歴、理学的検査及びＸ線検査の所見を使用して、以下の患者の特性のうち１つを伴う膝の痛みを評価することができる：（１）患者が５０歳を超えている；（２）３０分未満の朝のこわばり；及び（３）活発な運動時の捻髪音及び骨棘。病歴、理学的検査及び検査所見を使用して、以下の特性のうち５つを伴う膝の痛みを評価することができる：
（１）患者が５０歳を超えている；
（２）３０分未満の朝のこわばり；
（３）活発な運動時の捻髪音；
（４）骨圧痛；
（５）骨肥大；
（６）触知できる滑膜の熱感なし；
（７）ＥＳＦが４０ｍｍ／時未満である；
（８）リウマチ因子（ＲＦ）がの１：４０未満である；及び
（９）変形性関節症の滑液（ＳＦ）の徴候。
例えば、Ａｌｔｍａｎ，Ｒら：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２９：１０３９，１９８６を参照されたい。
変形性手関節症のＡＣＲの臨床的分類基準（ＡＣＲ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｎｄ）は、以下の通り評価することができる：以下のうち３つを伴う手の痛み、うずく痛み又は凝り：（１）以下の関節のうち２つ以上の、硬組織の肥大（両手の第２遠位指節間関節、第３遠位指節間関節、第２近位指節間関節、第３近位指節間関節、及び第１手根中手骨関節；（２）２つ以上の遠位指節間関節の硬組織の肥大；（３）３つ未満の腫脹したＭＣＰ関節及び（４）上の（１）において列挙されている関節の少なくとも１つの変形。
がん
ＣＤ１０５は、腫瘍血管新生と関連し、様々な腫瘍組織の内皮において、正常組織の内皮と比較して強力に上方制御されている。ＣＤ１０５は、例えば、結腸、乳、脳、肺、前立腺、子宮内膜、腎臓、肝臓、胃、頭頚部及び子宮頚部のがんを含めた広範囲の腫瘍の内皮において上方制御されている。さらに、ＣＤ１０５が、腫瘍の内皮において、対応する正常組織よりも強力に発現されていることが公知である。（Ｄｕｆｆら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１７：９８４〜９９２（２００３）；Ｂｅｒｎａｂｅｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２（６）：１３７５〜１３８８（２００７）；米国特許第７，０９７，８３６号）。したがって、抗エンドグリンヒト化抗体を用いて血管新生を阻害することは、がん性腫瘍に対する治療の選択肢になる。本明細書に記載の、エンドグリンに結合するヒト化抗体及び抗原結合断片を使用して、がん性腫瘍を治療することができる。本明細書に記載のヒト化抗体及び抗原結合断片は、がん性腫瘍を治療するための医薬品に使用することもできる。
用語「腫瘍」は、本明細書では、エンドグリンを発現しているがん性組織（同じ種類の正常な組織による発現と比較して）を指すために使用される。腫瘍は、充実性腫瘍及び半充実性腫瘍を含んでよい。腫瘍の非限定的な例としては、非Ｔ細胞型（非Ｔ）急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄単球性白血病を含めたヒト白血病；並びに、血管肉腫、乳癌、胃がん、結腸癌、ホジキンリンパ腫、リンパ腫、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、肺癌、黒色腫、骨髄腫、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、耳下腺腫瘍、咽頭癌、前立腺癌、肝細胞癌、腎癌及び直腸Ｓ字結腸癌を含めた、その周囲の脈管構造でエンドグリンが中〜高レベルで発現されている（同じ種類の正常な組織による発現と比較して）ヒト充実性腫瘍及び半充実性腫瘍が挙げられる。
治療されるがん性組織は、例えば、異常なレベルのエンドグリンを発現している内皮組織である。
腫瘍組織の新血管形成がされないと、腫瘍組織は必要な栄養分を得られず、成長が遅くなり、さらなる成長が止まり、退行し、最終的に壊死性になり、その結果、腫瘍が死滅する。本発明は、本方法に従って腫瘍血管新生を阻害することによって腫瘍の新血管形成を阻害する方法を提供する。同様に、本発明は、血管新生を阻害する方法を実施することによって腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。
この方法は、転移の形成に対しても、それらの形成には、転移性のがん細胞が原発腫瘍に存在することができるように原発腫瘍が血管化することが必要であり、且つ続発性の部位において転移性のがん細胞が確立されるには、転移の成長を支持するために新血管形成が必要であるので、特に有効である。
本発明の「がん／転移に罹患している患者」は、突然変異タンパク質（腫瘍関連抗原）又は突然変異遺伝子を発現していながら、まだ疾患の症状が出ていない可能性があることが理解されよう。がんが結腸がん（突然変異Ｋ−Ｒａｓタンパク質と関連する）である１つの非限定的な例では、結腸のいくつかの細胞において突然変異Ｋ−Ｒａｓタンパク質を有する患者は、たとえその患者に、まだ結腸がんの症状が出ていない可能性があっても、本発明による患者である。「疾病の徴候又は症状」は、臨床的に認識される疾患の顕在化又は表示である。
がんに罹患している患者を「治療すること」は、本発明に従って治療した後、患者の症状が部分的に又は完全に緩和された、又は変化がないままであることを意味する。治療されている患者は、症状及び／又は腫瘍の負荷の部分的な又は完全な軽減を示す可能性がある。治療することは、予防法、療法及びケアを包含するものとする。１つの非限定的な例では、高転移性のがん（例えば、乳がん）に罹患している患者は、追加的な転移が起こらないか、又はその数が治療を受けない患者と比較して低下する場合に、治療されている。別の非限定的な例では、患者は、治療を受けない患者と比較して、患者の充実性がんのサイズが低下するか、又はサイズが増加しない場合に、治療されている。さらに別の非限定的な例では、治療される患者におけるがん細胞の数は、治療を受けない患者におけるがん細胞の数と比較して増加しないか、又は低下する。改善は、例えば、治療されている患者の細胞増殖の減少、細胞数の減少、アポトーシスの増加、及び／又は生存の増加として定義することもできる。
本明細書においてさらに使用されるように、がんの治療は、がん性増殖物又は腫瘍の停滞、部分的な消失又は完全な消失を含む。治療又は部分的な消失は、例えば、増殖物又は腫瘍のサイズ及び／又は体積が何分の１か低下すること、例えば約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約１０分の１、約２０分の１、約５０分の１、又は、その間の任意の数分の１低下することを含む。同様に、治療又は部分的な消失は、増殖物又は腫瘍のサイズ及び／又は体積の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はその間の任意の百分率が低下する、百分率の低下を含んでよい。
本明細書に記載の方法において治療される腫瘍又はがんとしては、これらに限定されないが、肺がん、婦人科悪性腫瘍、黒色腫、乳がん、脳腫瘍（例えば、多形神経膠芽腫、「ＧＢＭ」）、膵がん、卵巣がん、子宮がん、結腸直腸がん、前立腺がん、腎がん、頭部がん、肝がん（肝細胞がん）、子宮がん、頚部がん、腎がん（腎細胞がん）、肉腫、骨髄腫及びリンパ腫が挙げられる。一実施形態では、治療される腫瘍は、充実性腫瘍又は半充実性腫瘍である。別の実施形態では、治療される腫瘍は、原発腫瘍である。別の実施形態では、治療される腫瘍は、転移性腫瘍である。一実施形態では、治療される腫瘍又はがんは上皮起源である。別の実施形態では、治療されるがんは骨髄腫である。別の実施形態では、治療されるがんは卵巣がんである。別の実施形態では、治療されるがんは腎がん（ｋｉｄｎｅｙ／ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）である。さらに別の実施形態では、治療されるがんは肝細胞がん／肝がんである。
肺がん
一態様では、本明細書において、肺がんを治療する方法が提供される。大部分の一般的な種類の肺がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）であり、それは肺がんのおよそ８０〜８５％を占め、扁平上皮癌、腺癌及び大細胞未分化癌に分けられる。小細胞肺がんは、肺がんの１５〜２０％を占める。
肺がんの病期分類は、がんの、その最初の源からの拡散の度合いの評価である。これは、肺がんの予後及び潜在的な治療に影響を及ぼす重要な因子である。非小細胞肺癌は、ＩＡ（「１Ａ」；最良の予後）からＩＶ（「４」；最悪の予後）までに病期分類される。小細胞肺癌は、それが胸部の片方に限局されている場合、限局期に分類され、単独の照射療法の領域の範囲内である；そうでなければ、それは進展期である。
非小細胞肺がんは、ＥＵＳ（超音波内視鏡検査）又はＣＴスキャン若しくはＭＲＩスキャンを使用して、又は外科手術時に病期分類して、ＴＮＭ系に従って疾患の程度を分類することができる。これらの対象は、予後及び治療の考察のプロセスの一部として病期分類を受ける。ＡＪＣＣは、ＴＮＭ病期分類の後にさらにグループ分けすることを推奨している。
原発腫瘍（Ｔ）：ＴＸ：原発腫瘍の評価が不可能、又は喀痰若しくは気管支肺胞の洗浄液中に悪性細胞があるが画像化又は気管支鏡検査ではそれが見られない；Ｔｉｓ：上皮内癌。Ｔ０：原発腫瘍を認めない。Ｔ１：腫瘍の最大径が３ｃｍ未満であり、肺又は臓側胸膜で囲まれている、且つ気管支鏡検査上、主気管支への浸潤がない。Ｔ２：以下のいずれかを有する腫瘍：３ｃｍを超える最大径；主気管支への進展（しかし、気管分岐部より２ｃｍ離れている）及び閉塞性肺臓炎（しかし肺全体に及ばない）。Ｔ３：以下のいずれかを有する腫瘍：胸壁、横隔膜、縦隔胸膜、又は壁側心膜への浸潤；気管分岐部の２ｃｍ以内であるが気管分岐部に及ばない、主気管支への進展；及び肺全体の閉塞性肺臓炎。Ｔ４：以下のいずれかを有する腫瘍：縦隔、心臓、大血管、気管、食道、椎骨、又は気管分岐部への浸潤；同一の肺葉内の別の腫瘍小結節；及び悪性胸水。リンパ節（Ｎ）：ＮＸ：リンパ節の評価が不可能；Ｎ０：リンパ節に及んでいない；Ｎ１：同側気管支周囲リンパ節又は同側肺門リンパ節への転移；Ｎ２：同側縦隔リンパ節又は気管支分岐部リンパ節への転移；及びＮ３：以下のいずれかへの転移：同側鎖骨上リンパ節；同側斜角筋リンパ節；及び対側リンパ節。遠隔転移（Ｍ）：ＭＸ：遠隔転移の評価が不可能；Ｍ０：遠隔転移なし；及びＭ１：遠隔転移が存在する。
子宮がん／婦人科悪性腫瘍
子宮がんは、子宮において生じるいくつかの異なる種類のがん、すなわち：子宮肉腫（例えば、子宮筋又は子宮筋層の肉腫が最も一般的な平滑筋肉腫である）；子宮体がん；及び子宮頚がんのいずれかを指しうる。
別の態様では、本明細書において、子宮内膜がんを治療する方法が提供される。子宮体がんは、子宮の内壁である子宮内膜から出発するがんである。子宮がん及び子宮内膜がんの例のいくつかとしては、これらに限定されないが、腺癌、腺棘細胞腫、腺扁平上皮癌、乳頭状漿液性腺癌、明細胞腺癌、子宮肉腫、間質肉腫、悪性混合中胚葉腫瘍及び平滑筋肉腫が挙げられる。
別の態様では、この方法により、子宮頚がん、好ましくは子宮頚部上皮腺癌を治療する。このがんには２つの主要な種類、扁平上皮癌及び腺癌が存在する。前者は、全子宮頚がんの約８０〜９０％を構成し、子宮頚外部（ｅｃｔｏｃｅｒｖｉｘ）（膣に最も近い部分）及び子宮頚内膜（子宮に最も近い部分）がつながる場所で発生する。後者は、子宮頚内膜の粘液産生腺細胞で発生する。いくつかの子宮頚がんは、これらの両方の特性を有し、腺扁平上皮癌又は混合癌と称される。
卵巣がん
別の態様では、本明細書において、上皮性卵巣腫瘍を含めた卵巣がんを治療する方法が提供される。
卵巣がんは、病理報告で得られた腫瘍の組織学的検査所見によって分類される。表層上皮性・間質性腫瘍、は上皮性卵巣がんとしても公知であり、最も典型的な種類の卵巣がんである。これは、漿液性腫瘍、類内膜腫瘍及び粘液性嚢胞腺癌を含む。エストロゲンを産生する顆粒膜細胞腫及び男性化作用のあるセルトリライディッヒ細胞腫又は男化腫瘍を含めた性索間質腫瘍は、卵巣がんの８％を占める。胚細胞性腫瘍は、卵巣腫瘍のおよそ３０％を占めるが、大部分の胚細胞性腫瘍が奇形腫であり、大部分の奇形腫が良性であるので、卵巣がんに占める割合はわずか５％である。胚細胞性腫瘍は、若い女性及び少女において生じる傾向がある。予後は、胚細胞性腫瘍の特定の組織学的検査所見に左右されるが、全体的に順調である。混合腫瘍は、上記の腫瘍組織学的検査所見のクラスの２つ以上のエレメントを含有する。
卵巣がんは、体内の他の場所の原発がんから転移した結果の二次がんであってもよい。一般的な原発がんは乳がん及び胃腸がんである（その場合、卵巣がんは、クルーケンベルクがんである）。表層上皮性・間質性腫瘍は、腹膜（腹腔の内壁）において生じ得、その場合、卵巣がんは原発性腹膜がんに続発するが、治療は、腹膜に及ぶ原発性表層上皮性・間質性腫瘍に対するものと基本的に同じである。
卵巣がんの病期分類は、ＦＩＧＯ病期分類系によるものであり、且つ腹式子宮全摘術、両方の卵巣及び卵管の除去、細胞診のための網及び骨盤（腹膜）洗液を含んでよい外科的処置後に得られた情報を使用する。ＡＪＣＣ病期は、ＦＩＧＯ病期と同じである。
Ｉ期は、卵巣の片方又は両方に限定されている卵巣がんを指す：ＩＡ−片方の卵巣に及ぶ；被膜が損なわれていない；卵巣表面の腫瘍なし；腹水又は腹膜洗液中に悪性細胞なし；ＩＢ−両方の卵巣に及ぶ；被膜が損なわれていない；卵巣表面の腫瘍なし；洗液陰性；及びＩＣ−以下のいずれかを有する卵巣に限定されている腫瘍：被膜破綻、卵巣表面の腫瘍、洗液陽性。
ＩＩ期は、骨盤内への進展又は移植性転移（ｉｍｐｌａｎｔ）を指す：ＩＩＡ−子宮又は卵管への進展又は移植性転移（ｉｍｐｌａｎｔ）；洗液陰性；ＩＩＢ−他の骨盤内構造への進展又は移植性転移（ｉｍｐｌａｎｔ）；洗液陰性；及びＩＩＣ−腹膜洗液陽性を伴う骨盤内への進展又は移植性転移（ｉｍｐｌａｎｔ）
ＩＩＩ期は、顕微鏡レベルで骨盤外の腹膜移植性転移（ｉｍｐｌａｎｔ）があること；又は骨盤に限定されているが、小腸又は大綱への進展を伴うことを指す：ＩＩＩＡ−顕微鏡レベルの骨盤を越えた腹膜転移；ＩＩＩＢ−サイズが２ｃｍ未満の肉眼で見える骨盤を越えた腹膜転移；及びＩＩＩＣ−＞２ｃｍの骨盤を越えた腹膜転移、又はリンパ節転移。
ＩＶ期は、肝臓又は腹膜腔の外側への遠隔転移を指す。
傍大動脈リンパ節転移は、所属リンパ節（ＩＩＩ期Ｃ）と見なされる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法により、以下から選択される卵巣がんを治療する：卵巣内の腺癌及び卵巣から腹腔内に移動した腺癌。
悪性黒色腫
黒色腫は、主に皮膚において見出されるが、腸及び眼（ぶどう膜黒色腫）においても見出されるメラニン形成細胞の悪性腫瘍である。黒色腫は珍しい種類の皮膚がんの１つであるが、大多数の皮膚がんに関連した死亡を引き起こす。悪性黒色腫は、メラニン形成細胞と称される色素細胞の制御されない成長によって引き起こされる重篤な種類の皮膚がんである。黒色腫としては、これらに限定されないが、脈絡膜黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫及び眼内黒色腫も挙げられる。
黒色腫は、以下の種類に分けることができる：悪性黒子、悪性黒子黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節性黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、無色素性黒色腫、軟組織黒色腫及びぶどう膜黒色腫。黒色腫の病期は、以下の通りである：
０期−上皮内黒色腫（ＣｌａｒｋレベルＩ）。
Ｉ／ＩＩ期−侵襲的な黒色腫：Ｔ１ａ：１．００ｍｍ未満、原発性、潰瘍なし、ＣｌａｒｋレベルＩＩ〜ＩＩＩ；Ｔ１ｂ：１．００ｍｍ未満、原発性、潰瘍あり、又はＣｌａｒｋレベルＩＶ〜Ｖ；及びＴ２ａ：１．００〜２．００ｍｍ、原発性、潰瘍なし。
ＩＩ期−危険性が高い黒色腫：Ｔ２ｂ：１．００〜２．００ｍｍ、原発性、潰瘍あり；Ｔ３ａ：２．００〜４．００ｍｍ、原発性、潰瘍なし；Ｔ３ｂ：２．００〜４．００ｍｍ、原発性、潰瘍あり；Ｔ４ａ：４．００ｍｍ以上、原発性、潰瘍なし；及びＴ４ｂ：４．００ｍｍ以上、原発性、潰瘍あり。
ＩＩＩ期−領域転移：Ｎ１：単一のリンパ節陽性；Ｎ２：２〜３個のリンパ節陽性又は局部の皮膚／ｉｎ−ｔｒａｎｓｉｔ転移；及びＮ３：４個のリンパ節陽性又はリンパ節及び局部の皮膚／ｉｎ ｔｒａｎｓｉｔ転移。
ＩＶ期−遠隔転移：Ｍ１ａ：皮膚への遠隔転移、ＬＤＨ正常；Ｍ１ｂ：肺転移、ＬＤＨ正常；及びＭ１ｃ：他の遠隔転移又はＬＤＨの上昇を伴う任意の遠隔転移。
一実施形態では、本明細書に記載の方法により、黒色腫を治療する。
結腸がん及び結腸直腸がん
結腸直腸がん（結腸がん又は大腸がんとも称される）は、結腸、直腸（肛門）及び虫垂におけるがん性増殖物を含む。結腸直腸がんは、世界で１年当たり６５５，０００件の死亡を伴う、西欧諸国において３番目に多いがんの形態であり、がんに関連した死亡の第２の主な原因である。多くの結腸直腸がんは、結腸内の腺腫性ポリープから生じると考えられている。これらのキノコ様の成長は通常は良性であるが、そのいくつかは、ある期間にわたってがんに発展する可能性がある。
別の実施形態では、デュークス分類（Ｄｕｋｅｓ分類）を使用して、結腸直腸がんをＡ〜Ｄ期に基づいて分類することができる。Ａ期は、粘膜に限定されている（言い換えると、腸壁を通って浸潤していない）結腸直腸がんを指す。Ｂ１期は、固有筋層に進展しているが、それを貫通していない（言い換えると、リンパ節に浸潤していない）ことを指す；一方、Ｂ２期のがんは、固有筋層を貫通しているが、それを貫通していない（言い換えると、リンパ節に浸潤していない）。Ｃ１期は、固有筋層に進展するが、それを貫通していない（言い換えると、リンパ節に及んでいる）がんを指す；一方、Ｃ２期は、固有筋層に進展し、それを貫通している（言い換えると、リンパ節に及んでいる）がんを指す。Ｄ期は、遠隔転移拡散を指す。当技術分野で公知の従来の手段に従って、ＴＮＭ系を使用して結腸直腸がんを病期分類することもできる。
乳がん
乳がんには本明細書に記載の方法によって治療することができるいくつかの種類がある。非浸潤性小葉癌及び非浸潤性乳管癌は、それぞれ小葉及び管において発生した乳がんであるが、乳房を取り囲む脂肪組織又は体の他の領域に拡散していない。侵入性の（浸潤性の）小葉癌及び腺管癌は、それぞれ小葉及び管において発生したがんであり、乳房の脂肪組織及び／又は体の他の部分に拡散している。一態様では、本明細書において、乳腺内の管組織における腺管癌、Ｈｅｒ２−及び／又はＥＲ−及び／又はＰＲ−である乳がんなどの乳がんを治療する方法が提供される。この方法によって治療することが有効であると思われる他の乳がんは、髄様癌、膠様癌、管状癌及び炎症性乳がんである。
一実施形態では、乳がんは、ＴＮＭ系に従って病期分類される。予後は、病期分類の結果に密接に関連づけられ、病期分類は、患者を、臨床試験及び臨床診察の両方における治療に割り当てるためにも使用する。
簡単に述べると、病期分類のための情報は以下の通りである：ＴＸ：原発腫瘍の評価が不可能。Ｔ０：腫瘍を認めない。Ｔｉｓ：上皮内癌、浸潤なし；Ｔ１：腫瘍が２ｃｍ以下である；Ｔ２：腫瘍が２ｃｍを超えるが５ｃｍ以下である；Ｔ３：腫瘍が５ｃｍを超える；Ｔ４：任意のサイズの腫瘍が胸壁又は皮膚に成長している、又は炎症性乳がん。ＮＸ：近くのリンパ節の評価が不可能であるＮ０：がんが所属リンパ節に拡散していない。Ｎ１：がんが１〜３個の上顎リンパ節又は１つの内胸リンパ節に拡散している；Ｎ２：がんが４〜９個の上顎リンパ節又は多数の内胸リンパ節に拡散している；Ｎ３：以下のうち１つがあてはまる：がんが１０個以上の上顎リンパ節に拡散している、又はがんが鎖骨（ｃｌａｖｉｃｌｅ）（鎖骨（ｃｏｌｌａｒ ｂｏｎｅ））下のリンパ節に拡散している、又はがんが鎖骨（ｃｌａｖｉｃｌｅ）上のリンパ節に拡散している、又はがんが上顎リンパ節に及び、内胸リンパ節に拡大している、又はがんが４個以上の上顎リンパ節に及び、ごく少量のがんがセンチネルリンパ節生検材料の内胸リンパ節に見られる。ＭＸ：遠隔拡散（転移）の存在の評価が不可能である。Ｍ０：遠隔拡散なし。Ｍ１：遠隔臓器（鎖骨上リンパ節を含まない）への拡散が生じている。
膵がん
別の態様では、本明細書において、以下から選択される膵がんを治療する方法が提供される：膵管組織上皮癌及び膵管腺癌。大部分の一般的な種類の膵がんは、膵管の内壁において生じる腺癌である。
一実施形態では、本明細書に記載の方法により、膵がんを治療する。
前立腺がん
１つの他の態様では、本明細書において、以下から選択される前立腺がんを治療する方法が提供される：腺癌又は骨に移動した腺癌。男性の尿道基部を取り囲む前立腺器官において生じた前立腺がん。前立腺は、いくつかの細胞型を有するが、腫瘍の９９％は、精液の生成に関与する腺細胞において発生する腺癌である。
前立腺がんを病期分類するために一般に使用される２つのスキームがある。最も一般的なものは腫瘍のサイズ、リンパ節に及んだ程度及び任意の転移（遠隔拡散）を評価するＴＮＭ系である。多くの他のがんと同様に、これらは多くの場合、４つの病期（Ｉ〜ＩＶ）にグループ分けされる。一般的ではないが使用される別のスキームは、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔ病期分類である。
簡単に述べると、Ｉ期の疾患は、良性の前立腺肥大などの他の理由で前立腺組織を取り出した際に試料のごく一部において偶発的に見出されるがんであり、細胞は通常の細胞とよく似ており、腺は、検査している指には正常に感じられる。ＩＩ期では、より多くの前立腺に及び、腺内にしこりが感じられうる。ＩＩＩ期では、腫瘍が前立腺被膜に拡散し、腺の表面にしこりが感じられうる。ＩＶ期の疾患では、腫瘍は近くの構造に浸潤している、又は、リンパ節又は他の器官に拡散している。等級付けは、破壊的な潜在的な、及び最終の疾患の予後の推定値を提供する生検材料（Ｇｌｅａｓｏｎ）に由来する細胞内含有量及び組織構造に基づく。
一実施形態では、本明細書に記載の方法により、前立腺がんを治療する。
頭頚部がん
頭頚部がん（例えば、口腔がん、喉頭がん、鼻咽頭がん、食道がんなど）は、唇、口腔（口）、鼻腔、副鼻腔、咽頭及び喉頭を含めた上気道消化管に由来する生物学的に類似したがんのグループを指す。大部分の頭頚部がんは、これらの領域の粘膜の内壁（上皮）に由来する扁平上皮癌である。頭頚部がんは、多くの場合、頚部リンパ節に拡散し、これは多くの場合、診断時の疾患の最初の（及び時には唯一の）顕在化である。頭頚部がんは、タバコ喫煙、アルコールの消費及びある特定の系統の性感染するヒトパピローマウイルスを含めた、ある特定の環境危険因子及び生活習慣の危険因子と強力に関連づけられる。頭頚部がんの患者の管理は手ごわい課題のままである。下咽頭がん、喉頭がん、鼻咽頭がん、中咽頭がんなどのがんは、本明細書に記載の化合物を使用して治療することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の方法により、頭部がん又は頚部がんを治療する。
腎がん
別の態様では、本明細書において、腎がんを治療する方法が提供される。腎がん（腎細胞がん、腎細胞癌、腎腺癌及び副腎腫とも称される）は、悪性細胞が腎臓の細管の内壁に見出される疾患である。腎細胞癌は、近位尿細管から生じる腎がんの最も一般的な形態である。これは、最も一般的な種類の腎がんであり、成人において、症例のおよそ８０％の原因である。
一実施形態では、本明細書に記載の方法により、腎がんを治療する。
肝がん
別の態様では、本明細書において、原発性の肝がん（肝臓で発生するがん）を治療する方法が提供される。原発性肝がんは、成人及び小児のどちらにおいても生じうる。肝がんは、悪性肝腫瘍−肝臓の表面又は内部の腫瘍又は増殖物が存在することを特徴とする。これらは、医用画像において発見されうる（がん自体とは異なる理由であっても）、又は患者に、腹部腫瘤、腹痛、黄疸、又はいくつかの他の肝機能障害として現れる可能性がある。肝がんにはいくつかの種類がある。
血管腫：これらは最も一般的な種類の良性の肝腫瘍である。これらは血管から出発する。これらの腫瘍の大部分は症状を引き起こさず、これらに治療は必要ない。いくつかは、出血する場合があり、軽度〜重篤である場合、除去する必要がある。
肝腺腫：これらの良性の肝上皮腫瘍は、肝臓において発生する。肝腺腫は、ほとんどの場合、肝右葉に位置し、頻繁に孤立して見られる。腺腫のサイズは１〜３０ｃｍにわたる。肝腺腫に伴う症状はすべて、激しい腹痛を引き起こす恐れがある大きな病変を伴う。
限局性結節性過形成：限局性結節性過形成（ＦＮＨ）は、２番目に多い肝臓の腫瘍である。この腫瘍は、先天性動静脈奇形の肝細胞の応答の結果である。このプロセスでは、正常な肝臓の構成物がすべて存在するが、それらが存在するパターンが異常である。これらの状態が存在するにもかかわらず、肝臓はなお正常な範囲で機能すると思われる。
肝細胞がん：肝細胞がん（ＨＣＣ）は、最も一般的な肝臓のがんである。肝細胞がんは、アルコールの乱用及びＢ型肝炎への感染に伴い、特にアジアで流行している。大多数のＨＣＣは、検出される時には外科的切除によるケアが不可能である；切除不可能なＨＣＣを全身的に治療することには、１年未満の生存が伴う。
一実施形態では、本明細書に記載の方法により、肝がんを治療する。
リンパ腫
リンパ腫は、免疫系のリンパ球において生じる種類のがんである。リンパ腫は、多くの場合、リンパ節に生じ、節の肥大（腫瘍）として存在している。リンパ腫は、同様にリンパ球において生じるが、一般には循環血液及び骨髄（造血と称されるプロセスで血液細胞が生成される場所）にのみ及び、通常腫瘍を形成しないリンパ性白血病と密接に関連する。リンパ腫には多くの種類があり、同様に、リンパ腫は血液腫瘍と称される疾患の広範なグループの一部である。リンパ腫のいくつかの形態は無痛性であり（例えば小リンパ球性リンパ腫）、治療なしでさえも長寿命に適合するが、一方他の形態は攻撃的であり（例えばバーキットリンパ腫）、急速な悪化及び死亡を引き起こす。
２００１年に公開され、２００８年に更新されたＷＨＯ分類；ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ−ｃｉｔｅ＿ｎｏｔｅ−ｉｓｂｎ９２−８３２−２４１１−６−２＃ｃｉｔｅ＿ｎｏｔｅ−ｉｓｂｎ９２−８３２−２４１１−６−２が最新のリンパ腫の分類であり、「Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎａｎ−Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａｍａ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｎ（ＲＥＡＬ）」に提示されている基礎に基づく。このシステムでは、リンパ腫を細胞型によってグループ分けし（すなわち、腫瘍に最も似ている正常細胞型）、表現型、分子特性又は細胞遺伝学的特性を定義している。Ｂ細胞腫瘍、Ｔ細胞腫瘍及び天然のキラー細胞腫瘍の３つの大きなグループがある。他のあまり一般的でないグループも認識されている。ホジキンリンパ腫は、ＷＨＯ（及び前述の）分類では別に考えられていたが、現在は、たとえ著しく異常であっても、成熟Ｂ細胞系列のリンパ球の腫瘍であると認識されている。
一実施形態では、本明細書に記載の方法により、リンパ腫を治療する。
肉腫
肉腫は、中胚葉の増殖を生じさせる結合組織（骨、軟骨、脂肪）のがんである。
これは、上皮起源（乳房、結腸、膵臓、及びその他）である癌腫とは対照的である。しかし、組織起源の理解が引き出されることにより、用語「肉腫」は、時には上皮組織から生じることが現在公知である腫瘍に適用される。用語、軟部肉腫は、結合組織内にあるが、それ由来ではないエレメントを含む軟組織（筋肉及び血管など）の腫瘍を説明するために使用される。
肉腫には、それらが生じる組織の種類に基づいて、いくつもの異なる名称が与えられている。例えば、骨から生じる骨肉腫（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、軟骨から生じる軟骨肉腫及び平滑筋から生じる平滑筋肉腫。肉腫はすべての年齢層の人を襲うが、これらは非常にまれであり、がんの全症例に占める割合は１％のみである。ＧＩＳＴは、肉腫の最も一般的な形態であり、米国において１年当たりおよそ３０００〜３５００件の症例がある。これは、北アメリカにおいて１年当たりおよそ２００，０００件の症例を有する乳がんと比較するべきである。
骨肉腫（ｂｏｎｅ ｓａｒｃｏｍａ）のおよそ５０％及び軟部肉腫の２０％は、３５歳未満の人において診断される。平滑筋肉腫、軟骨肉腫及び消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）などのいくつかの肉腫は、小児よりも成人において一般的である。ユーイング肉腫及び骨肉腫（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）を含めた最も悪性度が高い骨肉腫（ｂｏｎｅ ｓａｒｃｏｍａ）は、小児及び若年成人においてはるかに一般的である。
一実施形態では、本明細書に記載の方法により、肉腫を治療する。
癌腫
癌腫は、上皮細胞から生じる任意の悪性のがんである。癌腫は、周囲の組織及び器官に浸潤し、リンパ節及び他の部位に転移又は拡散する可能性がある。
癌腫は、すべての新形成と同様に、その病理組織学的外観によって分類される。腫瘍についての２つの一般的な記述的な用語である腺癌及び扁平上皮癌は、これらの細胞が、それぞれ腺細胞又は扁平上皮細胞の外観を有しうるという事実を反映している。したがって極度の退形成腫瘍は、別個の組織学的外観を有さない未分化の状態でありうる（未分化癌）。
時には、腫瘍は原発性の仮定器官（例えば、前立腺癌）又は起源である推定上の細胞（肝細胞癌、腎細胞癌）によって称される。
腺癌は、腺組織の上皮細胞に由来する悪性腫瘍であり、腺構造を形成している。腺癌は、肺において一般的である（全肺癌の３０〜４０％を構成している）。腺癌は、末梢性に見出され、杯細胞又はＩＩ型肺胞細胞から生じている。
扁平上皮癌は、扁平上皮化生から生じる。これは、肺腫瘍の２０〜３０パーセントを占め、通常、門部起源である。
小細胞癌は、ほぼ確実に喫煙に起因する。これらは初期に転移し、ＡＤＨを分泌しうる（患者のナトリウム濃度を低減させる）。
大細胞未分化癌は、肺新生物の１０〜１５パーセントを占める。これらは攻撃的であり、未分化の性質であるので、認識することが難しい。これらは最も一般的に肺の中心に位置する。
副鼻腔未分化癌
一実施形態では、本明細書に記載の方法により、癌腫を治療する。
骨髄腫
多発性骨髄腫（ＭＭ、骨髄腫、形質細胞骨髄腫として、又はＯｔｔｏ Ｋａｈｌｅｒにちなんでカーラー病としても公知である）は、血漿細胞のがんである。これらの免疫細胞は、骨髄において形成され、リンパ管に多発し、抗体を産生する。骨髄腫は、不治であると見なされているが、ステロイド、化学療法、サリドマイド及び幹細胞移植を用いて寛解を誘導することができる。骨髄腫は血液悪性腫瘍と称される疾患の広範なグループの一部である。
多発性骨髄腫は、胚中心後のＢリンパ球において発生する。免疫グロブリン重鎖遺伝子（第１４染色体、遺伝子座１４ｑ３２上）と癌遺伝子（多くの場合、１１ｑ１３、４ｐ１６．３、６ｐ２１、１６ｑ２３及び２０ｑ１１）との間の染色体移行は、多発性骨髄腫の患者において頻繁に観察される。この突然変異により、骨髄腫の発病において重要な最初の事象であると考えられている癌遺伝子の調節不全が生じる。その結果、血漿細胞クローンが増殖し、ゲノムが不安定性になり、それにより、さらなる突然変異及び移行が生じる。第１４染色体の異常が、骨髄腫の全症例の約５０％において観察される。第１３染色体の（一部の）欠失も、症例の約５０％において観察される。
血漿細胞によってサイトカイン（特にＩＬ−６）が産生されることにより、骨粗鬆症などのそれらの局所的な損傷の大半が引き起こされ、悪性細胞がよく育つ微小環境が創出される。血管新生（新しい血管が誘引されること）が増加する。
一実施形態では、本明細書に記載の方法により、骨髄腫を治療する。
胃がん
胃がん（Ｓｔｏｍａｃｈ ｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）は、胃の任意の一部分において発生する可能性があり、胃全体にわたって、及び他の器官、特に、食道、肺及び肝臓に拡散する恐れがある。胃がんにより、世界で１年当たり約８００．０００件の死亡が引き起こされている。
胃がんの個体の８０〜９０％において転移が生じ、初期に診断された胃がんの個体の６カ月生存率は６５％であり、後期に診断された胃がんの個体の６カ月生存率は１５％未満である。
胃がんは、多くの場合、無症候性である、又はその初期に非特異的な症状のみを引き起こす。症状が生じる時には、がんは一般に体の他の部分に転移しており、それがその予後不良の主要な理由の１つである。
一実施形態では、本明細書に記載の方法により、胃がんを治療する。
甲状腺がん
甲状腺腫又は甲状腺がんは、通常は、４種類の甲状腺の悪性腫瘍：乳頭腫瘍、濾胞腫瘍、髄様腫瘍又は未分化腫瘍のいずれかを指す。乳頭腫瘍及び濾胞腫瘍が最も一般的である。これらは、ゆっくりと成長し、再発する可能性があるが、一般に４５歳未満の患者では致死的なものではない。髄様腫瘍は、甲状腺に限られている場合、良好な予後を有し、転移が起こる場合、不良な予後を有する。退形成腫瘍は、成長が早く、療法に対する応答が不十分である。
甲状腺がんは、通常、甲状腺機能正常の患者に見出されるが、甲状腺機能亢進症又は甲状腺機能低下症の症状は、大きな、又は転移性の高分化腫瘍に伴う可能性がある。これらが２０歳未満で見出される場合、小結節が特に懸念される。この年齢において良性の小結節が現れる可能性は低く、したがって、悪性腫瘍の潜在性がはるかに大きい。
甲状腺がんは、それらの病理学的特性に従って分類することができる。以下の変異体を区別することができる（様々な亜型にわたる分布により、局部的な変動が示されうる）：甲状腺乳頭がん（最大７５％）；甲状腺濾胞がん（最大１５％）；甲状腺髄様がん（最大８％）；及び甲状腺未分化がん（５％未満）。濾胞性型及び乳頭型はともに「分化型甲状腺がん」に分類することができる。これらの型は、髄質型及び未分化型よりも好都合な予後を有する。甲状腺腺腫は、甲状腺の良性の新生物である。
一実施形態では、本明細書に記載の方法により、甲状腺がんを治療する。
膀胱がん
膀胱がんは、いくつかの種類の膀胱の悪性増殖物のいずれかを指す。膀胱がんは、膀胱において異常な細胞が制御されずに繁殖する疾患である。膀胱は、尿を蓄積する、中空の筋肉の器官である；膀胱は、骨盤に位置する。最も一般的な種類の膀胱がんは、膀胱の内側の細胞内壁から始まり、移行上皮癌（時には尿路上皮細胞癌）と称される。
膀胱がんの９０％が移行上皮癌である。他の１０％は扁平上皮癌、腺癌、肉腫、小細胞癌及び体内の他の場所のがんに由来する二次的な沈着物である。
以下の病期分類を使用して、場所、サイズ及びがんの拡散を、ＴＮＭ（腫瘍、リンパ節及び転移）病期分類系に従って分類する：０期：がん細胞が膀胱の内壁においてのみ見出される。Ｉ期：がん細胞が膀胱の内壁を越えて層にまで増殖しているが、膀胱の筋肉までは増殖していない。ＩＩ期：がん細胞が膀胱壁の筋肉にまで増殖しているが、膀胱を取り囲む脂肪組織までは増殖していない。ＩＩＩ期：がん細胞が膀胱を取り囲む脂肪組織にまで増殖している、且つ前立腺、膣、又は子宮にまで増殖しているが、リンパ節又は他の器官までは増殖していない。ＩＶ期：がん細胞がリンパ節、骨盤内又は腹壁、及び／又は他の器官にまで増殖している。再発：治療された後に、がんが膀胱において、又は別の近くの器官において再発している。
膀胱ＴＣＣは、１９９７ＴＮＭ系に従って病期分類される：Ｔａ 非浸潤的な乳頭の腫瘍；Ｔ１ 浸潤しているが、筋肉の膀胱層までは浸潤しない；Ｔ２ 筋層まで浸潤している；Ｔ３ 筋肉を越えて膀胱の外側の脂肪まで浸潤している；及びＴ４ 前立腺、子宮又は骨盤壁のような周囲の構造まで浸潤している。
一実施形態では、本明細書に記載の方法により、膀胱がんを治療する。
本発明に従って、ヒト化エンドグリン抗体又はその断片は、単独で、又は活性な作用剤又は不活性な作用剤と組み合わせて投与することができる。組合せを使用する場合、本発明では、ヒト化エンドグリン抗体又は抗原結合断片及び活性な作用剤又は不活性な作用剤を同時に又は逐次的に投与することが考えられている。
本発明の化合物は、必要に応じて、これらに限定されないが、アドリアマイシン、シクロホスファミド、パクリタキセル、ペメトレキセド、テモゾロミド、オキサリプラチン、ベバシズマブ、アービタックス、ベクチビックス、ソラフェニブ、スニチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）イリノテカン、トポテカン、ロイコボリン、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、レナリドマイド、サリドマイド、ゼローダ、タキソテレ及び本明細書に記載の多くの他の従来のがん療法を含めた１又は複数の治療的な治療と組み合わせて投与することができる。以下に列挙されている治療レジメンの一覧表は従来の療法を表すが、本発明は、本明細書に詳細には開示されていない他の公知の治療レジメンを包含することが理解されよう。
本明細書で使用される「放射線」は、例えば、マイクロ波、紫外線（ＵＶ）、赤外線（ＩＲ）、又はアルファ線、ベータ線若しくはガンマ線を指す。放射線は、従来の技法を使用して、標的放射線を、全身に照射することなく、１又は複数の腫瘍部位に「集中させる」又は局所的に送達することができる。
一実施形態では、がんは卵巣がんであり、１又は複数の治療的な治療は外科手術、化学療法（例えば、ドキソルビシン、ドキシル、ゲムシタビン、Ｒｕｂｉｔｅｃａｎ並びにシスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンなどの白金ベースの化学療法）、メルファラン、パクリタキセル、トポテカン及びイリノテカンなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤、タキサンベースの療法、ホルモン、放射線療法、全身体温低下、フェノクソディオールなどのイソフラボン誘導体、エポチロンなどの細胞毒性マクロライド、ベバシズマブなどの血管新生阻害剤、トラスツズマブなどのシグナルトランスダクション阻害剤、遺伝子療法、ＲＮＡｉ療法、免疫療法、モノクローナル抗体、ラパマイシンなどのホスファチジルイノシトール様キナーゼ阻害剤、又はそれらの任意の組合せである。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とドキシルである。別の実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とトポテカンである。さらに別の実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とＶＥＧＦ受容体阻害剤である。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非限定的な例としては、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、アフリバーセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブが挙げられる。本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片と卵巣がん療法の併用療法によっても、療法の同時発生的な投与による相乗効果に起因して、いずれかの療法、又はその両方をより低い用量にすることができる。
一実施形態では、がんは腎がん（ｒｅｎａｌ／ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）であり、１又は複数の治療的な治療は、外科手術、化学療法、スニチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、インターフェロン−アルファ、又はＩＬ−２である。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とソラフェニブである。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とスニチニブである。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）である。さらに別の実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とＶＥＧＦ受容体阻害剤である。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非限定的な例としては、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、アフリバーセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブが挙げられる。本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片と腎がん療法の併用療法によっても、療法の同時発生的な投与による相乗効果に起因して、いずれかの療法、又はその両方をより低い用量にすることができる。
一実施形態では、がんは骨髄腫であり、１又は複数の治療的な治療は、外科手術、照射療法、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、レナリドマイド、又はサリドマイドである。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）である。任意のこれらの療法の投与量は、当技術分野で公知であり、併用療法を用いて、適宜調整することができる。
一実施形態では、がんは前立腺がんであり、１又は複数の治療的な治療は外科手術、照射療法（例えば、外照射又は密封小線源治療）、ホルモン欠乏（アンドロゲン抑制）、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）阻害剤、化学療法（例えば、ドセタキセル、白金ベースの化学療法、例えばシスプラチン、カルボプラチン、サトラプラチン及びオキサリプラチン、タキサン、エストラムスチンなど）、プレドニゾン又はプレドニゾロン、コレステロース降下薬、例えばスタチンなど、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、ＲＮＡｉ療法、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（ＧＶＡＸとしても公知）を分泌するように遺伝子改変された全腫瘍細胞、又はそれらの任意の組合せである。さらに別の実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とＶＥＧＦ受容体阻害剤である。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非限定的な例としては、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、アフリバーセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブが挙げられる。
一実施形態では、がんは肺がんであり、１又は複数の治療的な治療は外科手術、照射療法（例えば、荷電した粒子を用いた胸部照射療法、放射線療法、ウラシル−テガフール及び白金ベースの化学療法（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなど）及びビノレルビン、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、抗上皮増殖因子受容体抗体（例えば、セツキシマブ）、抗血管内皮増殖因子抗体（例えば、ベバシズマブ）、チロシンキナーゼの小分子阻害剤、肺がん細胞の増殖に関与するタンパク質の直接阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、レーザー誘起温熱療法、ＲＮＡｉ療法、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（ＧＶＡＸとしても公知）を分泌するように遺伝子改変された全腫瘍細胞、又はそれらの任意の組合せである。追加的な治療的な治療としては、タキソール及びペメトレキセドが挙げられる。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とエルロチニブである。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とゲフィチニブである。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とペメトレキセドである。さらに別の実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とＶＥＧＦ受容体阻害剤である。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非限定的な例としては、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、アフリバーセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブが挙げられる。任意のこれらの療法の投与量は、当技術分野で公知であり、併用療法を用いて、適宜調整することができる。
一実施形態では、がんは乳がんであり、１又は複数の治療的な治療は、外科手術、モノクローナル抗体（例えば、Ｈｅｒ−２抗体、ハーセプチン）、アジュバント化学療法、例えば単剤化学療法又は併用化学療法（例えば、アントラサイクリンベースの多剤化学療法及びタキサンベースの多剤化学療法、タキソール、又はＰＭＲＴを伴う、又は伴わない、内分泌操作を伴う、又は伴わない標的特異的なトラスツズマブ、ビノレルビン）など、アドリアマイシン、シクロホスファミド、ゼローダ、タキソテレ、タモキシフェン及びラロキシフェンなどの選択的なエストロゲン受容体モジュレーター、トリロスタンなどのアロステリックなエストロゲン受容体モジュレーター、放射線（例えば、組織内密封小線源治療、Ｍａｍｍｏｓｉｔｅデバイス、３次元等角外照射及び術中照射）、全身合成を抑制するアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、エキセメスタン及びレトロゾール）、ＲＮＡｉ療法、免疫抑制性且つ抗増殖性であるラパマイシンの静脈内類似体、例えばテムシロリムス（ＣＣＩ７７９）など、又はそれらの任意の組合せである。乳がんの３次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ組織培養物モデルを行うための方法についての総説は、Ｋｉｍら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ８５（３）：２８１〜９１（２００４）に記載されている。がんを試験するための他のｉｎ ｖｉｖｏモデル及びｉｎ ｖｉｔｒｏモデルが公知であり、本明細書に記載の抗エンドグリン抗体を試験するために使用することができる。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片、タキソール及びＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）である。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とアドリアマイシンである。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とゼローダである。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とタキソテレである。さらに別の実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とＶＥＧＦ受容体阻害剤である。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非限定的な例としては、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、アフリバーセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブが挙げられる。任意のこれらの療法の投与量は、当技術分野で公知であり、併用療法を用いて、適宜調整することができる。
一実施形態では、がんは結腸がんであり、１又は複数の治療的な治療は、外科手術、放射線療法及び化学療法（例えば、５−フルオロウラシル、レバミソール、ロイコボリン又はセムスチン（メチルＣＣＮＵ））、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］アクリジン−４−カルボキサミド及び他の関連するカルボキサミド抗がん薬；非トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、イリノテカン、リポソームトポテカン、タキサンクラスの抗がん剤（例えば、パクリタキセル又はドセタキセル）、キサンテノン酢酸クラスの化合物（例えば、５，６−ジメチルアンテノン（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｎｔｈｅｎｏｎｅ）−４−酢酸ＰＭＡＡ）、ラミナリン、部位選択的なサイクリックＡＭＰ類似体（例えば、８−クロロアデノシン３’，５’−サイクリックホスフェート）、Ｃｏｘ−２のピラノインドール阻害剤、Ｃｏｘ−２のカルバゾール阻害剤、Ｃｏｘ−２のテトラヒドロカルバゾール阻害剤、Ｃｏｘ−２のインデン阻害剤、ＮＳＡＩＤＳの局在型の阻害剤（例えば、アンスラニル酸、アスピリン（５−アセチルサリチル酸）、アゾジサールナトリウム（ａｚｏｄｉｓａｌ ｓｏｄｉｕｍ）、カルボ複素環酸（ｃａｒｂｏｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ａｃｉｄ）、カルプロフェン、クロラムブシル、ジクロフェナク、フェンブフェン、フェンクロフェナック、フェノプロフェン、フルフェナム酸、フルルビプロフェン、フルプロフェン、フロセミド、金チオリンゴ酸ナトリウム、イブプロフェン、インドメタシン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ロナゾラク、ロキソプロフェン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、メルファラン、ナプロキセン、ペニシラミン、フェニル酢酸、プロピオン酸、サリチル酸、サラゾスルファピリジン、スリンダク、トルメチン、ピラゾロンブタゾンプロパゾンＮＳＡＩＤ、メロキシカム、オキシカム、ピロキシカム、フェルデン、ピロキシカムベータシクロデキストラン、テノキシカム、エトドラク及びオキサプロジン）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕの阻害剤、ＲＮＡｉ療法、ＧＭ−ＣＳＦ、モノクローナル抗体（例えば、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体、抗ＣＥＡ抗体、Ａ３３（ＨＢ８７７９）、１００〜２１０（ＨＢ１１７６４）及び１００〜３１０（ＨＢ１１０２８））、アービタックス、ベクチビックス、ホルモン療法、ピリミジンアミン、カンプトテシン誘導体（例えば、ＣＰＴ−１１）、フォリン酸（ＦＡ）、ゲムシタビン、Ａｒａ−Ｃ、白金ベースの化学療法、例えばシスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンなど、ｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ阻害剤、又はそれらの任意の組合せである。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片と５−ＦＵ、ロイコボリン及びオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）の組合せである。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片と５−ＦＵ、イリノテカン及びロイコボリン（ＩＦＬ）の組合せである。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とアービタックスである。一実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とベクチビックスである。さらに別の実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とＶＥＧＦ受容体阻害剤である。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非限定的な例としては、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、アフリバーセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブが挙げられる。任意のこれらの療法の投与量は、当技術分野で公知であり、併用療法を用いて、適宜調整することができる。
一実施形態では、がんは膵がんであり、１又は複数の治療的な治療は、外科手術、放射線療法（ＲＴ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）及びＲＴ、全身性の療法、ステント挿入、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ゲムシタビン及びＲＴ、セツキシマブ、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、化学放射線、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、又はそれらの任意の組合せである。さらに別の実施形態では、組合せは、ヒト化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片とＶＥＧＦ受容体阻害剤である。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非限定的な例としては、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、アフリバーセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブが挙げられる。
治療レジメンの前、その間、及びその後を含めた１又は複数の多数の時点で症状について患者を評価することができる。治療の結果、対象の状態が改善される可能性があり、それを、以下の因子の１又は複数が生じているかどうかを決定することによって評価することができる：腫瘍サイズの減少、細胞増殖の減少、細胞数の減少、新血管形成の減少、アポトーシスの増加、又は細胞増殖性障害を含む細胞の少なくとも一部分の生存の減少。これらの１又は複数が出現することにより、ある場合では、がんの部分的な又は完全な消失及び患者の生存の延長がもたらされる可能性がある。或いは、末期がんについては、治療により、疾患の停滞、より良い生活の質及び／又は生存の延長がもたらされる可能性がある。
バイオマーカーの評価
ある特定の遺伝子は、がんにおいてその発現レベルが増加又は減少している可能性がある。がんにおける遺伝子の発現レベルの変化は、がんの療法又は治療に対する耐性又は感受性を示す可能性がある。
本明細書では、それらの発現が血管新生阻害剤に対する感受性又は耐性と相関している遺伝子のパネルから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出するための診断方法であって、少なくとも１つの遺伝子が：ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＨＩＦ−１α、胎盤細胞増殖因子受容体又はエンドグリン（ＣＤ１０５）である上記方法が提供される。この方法は、患者試料において検出される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを、血管新生阻害剤に対する感受性又は耐性と相関している少なくとも１つの遺伝子の発現レベルと比較するステップをさらに含んでよい。１つの非限定的な実施形態では、血管新生阻害剤は、ヒト化抗エンドグリン抗体である。別の実施形態では、血管新生阻害剤は、ＶＥＧＦ受容体阻害剤又はＶＥＧＦ阻害剤である。
本明細書で使用される用語「発現」は、遺伝子の発現を検出することに関して使用される場合、遺伝子の転写を検出すること、及び／又は遺伝子の翻訳を検出することを指しうる。遺伝子の発現を検出することは、遺伝子が発現しているか否かを積極的に決定する行為を指す。これは、遺伝子発現が、対照と比較して上方制御されているかどうか、対照と比較し下方制御されているかどうか、又は対照と比較して変化していないかどうかを決定することを含んでよい。したがって、発現を検出するステップは、遺伝子の発現が実際に上方制御又は下方制御されていることを必要とせず、それよりも、遺伝子の発現が変化していないことを検出すること（すなわち、遺伝子の発現又は遺伝子の発現の変化が検出されないこと）を含んでもよい。
本発明に関連して評価されるバイオマーカーとしては、ＶＥＧＦ受容体、胎盤細胞増殖因子、ＨＩＦ−１α及びエンドグリン（ＣＤ１０５）が挙げられる。
本明細書に記載され、当技術分野でさらに公知の方法において、バイオマーカーの発現を評価するために、内皮組織、腫瘍細胞、又は腫瘍細胞によって産生されるタンパク質若しくは核酸を含有する患者試料を使用することができる。簡単に述べると、バイオマーカーの発現レベルを、試料、例えば、患者から得た腫瘍の生検材料、又は腫瘍に由来する材料を含有する他の患者試料（例えば、本明細書において上記されている血液、血清、尿、又は他の体液又は排泄物）におけるマーカーの量（例えば、絶対量又は濃度）を評価することによって評価することができる。細胞試料は当然、試料中のマーカーの量を評価する前に種々の周知の採取後調製技法及び貯蔵技法（例えば、核酸及び／又はタンパク質の抽出、固定、貯蔵、凍結、限外濾過、濃度、蒸発、遠心分離など）に供す。同様に、腫瘍生検材料も、採取後調製技法及び貯蔵技法、例えば、固定に供すことができる。
それを発現する細胞の表面に提示される少なくとも１つの部分を有するバイオマーカータンパク質の発現を検出することができる。マーカータンパク質又はその部分が細胞表面に露出しているかどうかを決定することができる。例えば、免疫学的方法を使用して、細胞全体のそのようなタンパク質を検出することができる、又は周知のコンピュータベースの配列解析方法を使用して、少なくとも１つの細胞外ドメイン（すなわち、分泌タンパク質及び少なくとも１つの細胞表面ドメインを有するタンパク質の両方を含む）の存在を予測することができる。それを発現する細胞の表面に提示される少なくとも１つの部分を有するマーカータンパク質の発現は、必ずしも腫瘍細胞を溶解することなく（例えば、タンパク質の細胞表面ドメインに特異的に結合する標識された抗体を使用して）検出することができる。
バイオマーカーの発現は、転写された核酸又はタンパク質の発現を検出するための多種多様な周知の方法のいずれかによって評価することができる。そのような方法の非限定的な例としては、例えば、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞質タンパク質、又は核タンパク質を検出するための免疫学的方法、タンパク質の精製方法、タンパク質の機能アッセイ又は活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション方法、核酸の逆転写方法及び核酸の増幅方法又は当技術分野で公知の任意の他の方法が挙げられる。
試料から得られた、転写されたポリヌクレオチドの混合物を、バイオマーカー核酸の少なくとも一部分（例えば、少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、５００、又はそれ以上のヌクレオチド残基）と相補的又は相同的なポリヌクレオチドを固定した基材と接触させることができる。相補的又は相同的であるポリヌクレオチドを基材上で示差的に検出することが可能である場合（例えば、異なる発色団又はフルオロフォアを使用して検出可能である、又は異なる選択された位置に固定される）、単一の基材（例えば、選択された位置に固定されたポリヌクレオチドの「遺伝子チップ」マイクロアレイ）を使用して複数のバイオマーカーの発現レベルを同時に評価することができる。１つの核酸と別の核酸のハイブリダイゼーションを伴う、バイオマーカーの発現を評価する方法を使用する場合、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施することができる。
本発明の方法において本発明の複数のバイオマーカーを使用する場合、患者試料中の各バイオマーカーの発現レベルを、同じ種類の非がん性試料中の複数のバイオマーカーのそれぞれの発現の正常なレベルと、単一反応混合物において（すなわち、各バイオマーカーに対する異なる蛍光プローブなどの試薬を使用して）、又はバイオマーカーの１又は複数に対応する個々の反応混合物において比較することができる。
正常な（すなわち、非がん性の）ヒト組織におけるバイオマーカーの発現レベルは、種々のやり方で評価することができる。この正常なレベルの発現は、非がん性であると思われる細胞の一部におけるバイオマーカーの発現レベルを評価し、次いで発現の正常なレベルを腫瘍細胞の一部における発現レベルと比較することによって評価することができる。本明細書に記載の方法をルーチン的に実施することによって、さらなる情報が利用可能になるので、バイオマーカーの正常な発現の集団平均値を使用することができる。或いは、バイオマーカーの発現の正常なレベルは、がんを患っていない患者から得た患者試料、患者における疑わしいがんが発症する前に患者から得た患者試料、保管されている患者試料、などにおけるバイオマーカーの発現を評価することによって決定することができる。
生体試料中のバイオマーカータンパク質又は核酸の存在又は非存在を検出するための典型的な方法は、試験対象から生体試料を得るステップと、生体試料をポリペプチド又は核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はｃＤＮＡ）を検出することができる化合物又は作用剤と接触させるステップとを含む。したがって、この検出方法を使用して、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ並びにｉｎ ｖｉｖｏで生体試料中のｍＲＮＡ、タンパク質、ｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを検出することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡを検出するための技法としては、例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ；例えば、Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に記載の実験的な実施形態）、ノーザンハイブリダイゼーション及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでバイオマーカータンパク質を検出するための技法としては、これらに限定されないが、酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光法が挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでゲノムＤＮＡを検出するための技法としては、例えば、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。ｉｎ ｖｉｖｏでｍＲＮＡを検出するための技法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ、ノーザンハイブリダイゼーション及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでバイオマーカータンパク質を検出するための技法としては、タンパク質又はその断片を対象とする標識された抗体を対象に導入することが挙げられる。例えば、抗体は、対象におけるその存在及び場所を、標準の画像化技法によって検出することができる放射性マーカーで標識することができる。
そのような診断アッセイ及び予後判定アッセイの一般的な原理は、バイオマーカーを含有する可能性がある試料又は反応混合物及びプローブを適切な条件下で、反応混合物中でバイオマーカーとプローブが相互作用し、結合し、したがって、取り出し、且つ／又は検出することができる複合体を形成することを可能にするために十分な時間調製することを含む。これらのアッセイは、種々の方法を使用して、様々なやり方で行うことができる。
バイオマーカー／プローブ複合体の形成は、構成成分（バイオマーカー又はプローブ）のいずれもさらに操作又は標識することなく、例えば蛍光エネルギー転移（すなわち、ＦＥＴ、例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；及びＳｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照されたい）の技法を利用することによって直接検出することも可能である。
別の実施形態では、バイオマーカーを認識するプローブの能力の決定を、アッセイの構成成分（プローブ又はバイオマーカー）のいずれも標識化せずに、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ；例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．及びＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．，１９９１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８〜２３４５及びＳｚａｂｏら、１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９〜７０５を参照されたい）などの技術を利用することによって実現することができる。本明細書で使用される「ＢＩＡ」又は「表面プラズモン共鳴」は、生体特異的な相互作用をリアルタイムで、相互作用物のいずれも標識化せずに試験するための技術を指す（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。結合表面における質量の変化（結合事象を示す）により、表面近くの光の屈折率が変化し（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）、それにより、生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用することができる検出可能なシグナルがもたらされる。
バイオマーカーの絶対的な発現レベルに基づいて決定する代わりに、決定は、バイオマーカーの正規化された発現レベルに基づいてよい。発現レベルは、バイオマーカーの絶対的な発現レベルについて、その発現をバイオマーカーではない遺伝子、例えば、構成的に発現されているハウスキーピング遺伝子の発現と比較することによって補正することによって正規化する。正規化するために適した遺伝子としては、アクチン遺伝子、又は上皮細胞特異的な遺伝子などのハウスキーピング遺伝子が挙げられる。この正規化により、１つの試料、例えば患者試料と別の試料、例えば非腫瘍試料において、又は種々の供給源の試料間で発現レベルを比較することが可能になる。
或いは、発現レベルは、相対的な発現レベルとしてもたらされうる。バイオマーカー（例えば、ＶＥＧＦ受容体、胎盤細胞増殖因子、Ｈｉｆ−１α及びエンドグリン（ＣＤ１０５））の相対的な発現レベルを決定するために、問題の試料の発現レベルを決定する前に、正常な細胞単離物とがん細胞単離物を対照させて１０以上の、２０以上の、３０以上の、４０以上の、又は５０以上の試料のバイオマーカーの発現レベルを決定する。より大きな数の試料においてアッセイした遺伝子のそれぞれの発現レベルの平均を決定し、これをバイオマーカーの発現レベルの基線として使用する。次いで、試験試料について決定されたバイオマーカーの発現レベル（発現の絶対的なレベル）をバイオマーカーについて得られた平均発現値で割る。これにより、相対的な発現レベルがもたらされる。
本発明の別の実施形態では、バイオマーカータンパク質を検出する。バイオマーカータンパク質を検出するための本発明の作用剤の１種類は、例えば、検出可能に標識された抗体などの、そのようなタンパク質又はその断片に結合することができる抗体である。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってよい。インタクトな抗体又はその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、一本鎖ポリペプチド）を使用することができる。用語「標識された」は、プローブ又は抗体に関しては、検出可能な物質をプローブ又は抗体にカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）によってプローブ又は抗体を直接標識すること、並びに直接標識された別の試薬との反応性によってプローブ又は抗体を間接的に標識することを包含するものとする。間接的に標識することの例としては、蛍光標識された二次抗体を使用して一次抗体を検出すること、及びＤＮＡプローブを、蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することができるように、ビオチンで末端標識することが挙げられる。試料が、所与の抗体に結合するタンパク質を含有するかどうかを決定するために様々な形式を使用することができる。そのような形式の例としては、これらに限定されないが、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット分析及び酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。当業者は、腫瘍細胞が本発明のバイオマーカーを発現するかどうかを決定することにおいて使用するために、公知のタンパク質／抗体の検出方法を容易に適応させることができる。バイオマーカーを検出するための２種以上アッセイの組合せ（非限定的な例としては上記のアッセイが挙げられる）を使用して１又は複数のバイオマーカーを評価することもできる。
本明細書では、血管新生阻害剤を用いて治療するためにがん患者を選択する方法も提供される。この方法は、患者に由来するがん試料を準備するステップと、それらの発現が血管新生阻害剤に対する感受性又は耐性と相関している１又は複数の遺伝子の発現を検出するステップと、患者試料において検出される遺伝子（単数又は複数）の発現レベルを、血管新生阻害剤に対する感受性又は耐性と相関している遺伝子（単数又は複数）の発現レベルと比較するステップとを含む。血管新生阻害剤に対する感受性又は耐性と相関している遺伝子の非限定的な例としては、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＨＩＦ−１α、胎盤細胞増殖因子受容体及びエンドグリン（ＣＤ１０５）が挙げられる。別の実施形態では、遺伝子（単数又は複数）の発現が、血管新生阻害剤に対する感受性と相関している遺伝子（単数又は複数）の発現と同様である場合に、血管新生阻害剤を投与することが有効であることが予測されているとして患者を選択する。１つの非限定的な実施形態では、対象又は対象のがんを受性又は耐性について試験する血管新生阻害剤は、エンドグリン（ＣＤ１０５）阻害剤（例えば、ヒト化抗エンドグリン抗体）である。別の実施形態では、対象又は対象のがんを感受性又は耐性について試験する血管新生阻害剤は、ＶＥＧＦ受容体阻害剤又はＶＥＧＦ阻害剤である。
ＩＶ．機能アッセイ
抗体及びその抗原結合断片は、当技術分野で公知の方法及び本明細書に記載される方法を含むが、これらに限定されない様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ方法を使用して様々な機能について試験することが可能である。
ＣＤ１０５シグナル伝達及び機能をアッセイする方法
ＣＤ１０５（エンドグリン）は、増殖している内皮細胞により発現されるＴＧＦ−β受容体ファミリーのメンバーであり、内皮細胞増殖には正常レベルのＣＤ１０５が必要である。ＣＤ１０５発現は、低酸素誘導因子−１−α（ＨＩＦ−１−α）の産生を通じて細胞低酸素症により増加し、低酸素細胞をアポトーシスから保護する。ＣＤ１０５は、ＴＧＦ−β受容体（ＴＧＦ−βＲ）、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）及びアクチビン受容体を含む、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの複数のキナーゼ受容体複合体のシグナル伝達を調節する働きをする。ＣＤ１０５の非存在下では、ＴＧＦ−β受容体の活性化によりＳＭＡＤタンパク質がリン酸化され、内皮細胞増殖を阻害する。しかし、ＴＧＦ−βによるＣＤ１０５の活性化によりＳＭＡＤタンパク質リン酸化は調節される。その最終結果は、内皮細胞に対するＴＧＦ−β受容体活性化の増殖阻害効果の放出である。抗ＣＤ１０５抗体によるＣＤ１０５活性化の防止はＴＧＦ−βと相乗的に作用して、内皮細胞増殖を抑制する。ＴＧＦ−βは、内皮細胞において正反対の効果を有する２つの異なるＩ型受容体／ＳＭＡＤシグナル伝達経路を刺激することが可能である。ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５シグナル伝達経路（Ａ）は細胞増殖及び遊走を阻害し、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路（Ｂ）は内皮細胞増殖及び遊走を誘導する。アクセサリーＴＧＦ−β受容体であるＣＤ１０５は、血管新生中に高度に発現されるが、ＡＬＫ１シグナル伝達には不可欠である。ＣＤ１０５の非存在下では、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５シグナル伝達が優勢であり、静止状態の内皮を維持する。高ＣＤ１０５発現はＡＬＫ１経路を刺激しＡＬＫ５シグナル伝達を間接的に阻害し、したがって血管新生の活性化状態を促進する。
一非限定的実施形態では、本明細書に提供される抗体及び抗原結合断片は、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ１シグナル伝達経路をブロックすることにより血管新生をブロックする。別の実施形態では、本明細書に提供される抗体及び抗原結合断片は、Ｓｍａｄ１／５／８リン酸化及び／又はシグナル伝達を妨げることにより血管新生をブロックする。ＣＤ１０５は、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ１のシグナル伝達を通じて血管新生の促進に関与し、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ１のシグナル伝達は今度はＳｍａｄ２／３タンパク質のリン酸化の減少及び／又は遮断を伴う。さらに別の実施形態では、本明細書に提供される抗体及び抗原結合断片は、Ｓｍａｄ２／３リン酸化及び／又はシグナル伝達を増強することにより血管新生をブロックする。ＴＧＦ−β／ＡＬＫ１シグナル伝達経路及び／又はＳｍａｄ１／５のリン酸化に対する本明細書に提供される抗体及び抗原結合断片のブロッキング又は阻害効果をアッセイする方法及び技法には、公知の分子技法が含まれるが、これらに限定されない。例として、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５又はＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路におけるタンパク質のうちのいずれかに特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングを使用して、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５又はＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路に対する本明細書で開示された抗体及び抗原結合断片の阻害及び／又は刺激効果を判定することが可能である。同様に、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５又はＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路に関与するタンパク質のｍＲＮＡの検出又は前記ｍＲＮＡの調節を使用して、本明細書で開示された抗体及び抗原結合断片の阻害及び／又は刺激効果をアッセイすることが可能である。ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５又はＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路の細胞シグナル伝達をアッセイするための追加の方法は当技術分野では公知であり、本明細書で企図されている。
一非限定的実施形態では、前記抗体は、血管新生及び内皮細胞増殖を阻害することに関して評価することが可能である。抗エンドグリン抗体がＨＵＶＥＣに結合しても、それに続くＴＧＦ−βのＨＵＶＥＣへの結合が妨げられることはない。したがって、抗エンドグリン抗体による内皮細胞増殖の直接抑制は、抗血管新生及び腫瘍抑制効果がｉｎ ｖｉｖｏで観察される根底にある機序の１つを表す。別の実施形態では、前記抗体は、Ｓｍａｄ１／５／８リン酸化及び／又はシグナル伝達を妨げることにより血管新生をブロックすることに関して評価することが可能である。ＣＤ１０５は、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ１のシグナル伝達を通じて血管新生の促進に関与し、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ１のシグナル伝達は今度はＳｍａｄ２／３タンパク質のリン酸化の減少及び／又は遮断を伴う。さらに別の実施形態では、前記抗体は、Ｓｍａｄ２／３リン酸化及び／又はシグナル伝達を増強することにより血管新生をブロックすることに関して評価することが可能である。
ＴＧＦ−β／ＡＬＫ１シグナル伝達経路及び／又はＳｍａｄ１／５のリン酸化に対する本明細書に提供される抗体のブロッキング又は阻害効果をアッセイする方法及び技法には、公知の分子技法が含まれるが、これらに限定されない。例として、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５又はＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路におけるタンパク質のうちのいずれかに特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングを使用して、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５又はＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路に対する本明細書で開示された抗エンドグリン抗体の阻害及び／又は刺激効果を判定することが可能である。同様に、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５又はＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路に関与するタンパク質のｍＲＮＡの検出又は前記ｍＲＮＡの調節を使用して、本明細書で開示された抗体の阻害及び／又は刺激効果をアッセイすることが可能である。ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５又はＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路の細胞シグナル伝達をアッセイするための追加の方法は当技術分野では公知であり、本明細書で企図されている。
本明細書に開示される抗エンドグリン抗体の活性は、例えば、下にさらに詳細に記載されるＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴及びＨＵＶＥＣ細胞に対する効果などの結合アッセイによる当技術分野で承認されているアッセイを使用して評価することが可能である。
細胞接着をアッセイする方法
細胞接着は、当業者には公知である方法により測定することが可能である。アッセイは、例えば、Ｌｅｂｒｉｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ１９９７、９９：１３９０〜１３９８により既に記載されている。手短に言えば、細胞は被膜されたウェル上の基質（すなわち、ＥＣＭ成分）に接着させることが可能である。非付着細胞は洗浄することにより取り除かれ、非特異的結合部位は、ＢＳＡと一緒にインキュベートすることによりブロックされる。付着した細胞はクリスタルバイオレットを用いて染色され、付着した細胞から溶出したクリスタルバイオレットの光学密度を波長６００ｎｍで測定することにより細胞接着は定量される。
細胞遊走をアッセイする方法
細胞遊走のアッセイは、例えば、Ｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １９９７、９９：１３９０〜１３９８により文献に既に記載されており、細胞遊走を測定するための方法は当業者には公知である。本明細書に記載される細胞遊走を測定するための一方法では、トランスウェル遊走チャンバーからの膜は基質で被膜され、トランスウェルは洗浄され、非特異的結合部位はＢＳＡでブロックされる。サブコンフルエント培養液由来の腫瘍細胞は収穫され、洗浄され、アッセイ抗体の存在下又は非存在下で遊走緩衝液に再懸濁される。腫瘍細胞を被膜されたトランスウェル膜の下面に遊走させた後、膜の天面上に残っている細胞を取り除き、下面に遊走する細胞はクリスタルバイオレットを用いて染色する。次に、細胞遊走は、顕微鏡視野あたりの直接細胞計数により定量される。
ＳＣＩＤ／ヌードマウス
腫瘍増殖をアッセイするための一方法は以下の通りにＳＣＩＤマウスを使用する。サブコンフルエントヒトＭ２１メラノーマ細胞は収穫され、洗浄され、無菌ＰＢＳ中に再懸濁される（ｍＬあたり２０×１０６）。ＳＣＩＤマウスは１００μＬのＭ２１ヒトメラノーマ細胞（２×１０６）懸濁液を皮下に注射される。腫瘍細胞注射の３日後、マウスは未処置のまま又は１若しくは複数の対照若しくは試験組成物を静脈内に若しくは腹腔内に（例えば、１００μｇ／マウス）処置される。前記マウスは２４日間毎日処置される。腫瘍サイズはキャリパーを用いて測定され、体積は式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２（Ｖはその体積に等しく、Ｌはその長さに等しく、Ｗはその幅に等しい）を使用して推定される。
腫瘍増殖をアッセイするための一方法は以下の通りにヌードマウスを使用する。５０μｌ ＰＢＳ中のＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞（０．４×１０６細胞／マウス）は、メスヌードマウス（生後５〜６週間）の乳房脂肪体に同所性に移植される。腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３の平均体積に到達すると、マウスはランダム化され（少なくとも１０／群）、用量あたり１μｇ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、１００μｇ（５ｍｇ／ｋｇ）若しくは２００μｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）の１若しくは複数の抗体、又は１００μｌのＰＢＳ若しくは溶媒ＰＢＳ１００μｌ中１００μｇ対照抗体を用いた週あたり２回の静脈内又は腹腔内処置が開始され、一部の研究では、未処置群も評価することが可能である。腫瘍サイズはキャリパーを用いて測定され、体積は式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２（Ｖはその体積に等しく、Ｌはその長さに等しく、Ｗはその幅に等しい）を使用して推定される。
ＢＡＬＢ／ｃ同系マウスモデル
代わりに、ＢＡＬＢ／ｃ同系マウスモデルを利用して、腫瘍増殖及び本明細書に記載される抗体による又は、例えば、Ｔｓｕｊｉｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２９：１０８７〜１０９４（２００６）により例証される抗体によるその阻害を評価することも可能である。
キメラマウス
別のアッセイはキメラマウス、すなわちヒトマウスモデルにおいて血管新生を測定し、キメラマウスアッセイと呼ばれる。腫瘍組織の血管新生、新血管形成及び後退を測定するアッセイは他の者により詳細に記載されており、本明細書でさらに記載されている。Ｙａｎら、（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、９１：９８６〜９９６を参照されたい。
キメラマウスアッセイはｉｎ ｖｉｖｏ血管新生のための有用なアッセイモデルである。なぜならば、移植された皮膚移植片は組織学的に正常なヒト皮膚によく似ており、全組織の新血管形成は実際のヒト血管が移植されたヒト皮膚の表面で移植されたヒト皮膚からヒト腫瘍組織中に成長しているところで起きているからである。ヒト移植片への新血管形成の起源は、ヒト特異的内皮細胞マーカーを用いて新血管形成を免疫組織学化学的に染色することにより示すことが可能である。
キメラマウスアッセイは、新しい血管成長の量と後退の程度の両方に基づいて新血管形成の後退を示す。さらに、腫瘍組織などの移植された皮膚上に移植された任意の組織の増殖に対する効果をモニターするのは容易である。最後に、前記アッセイシステムには毒性についての内部標準が存在するので前記アッセイは有用である。キメラマウスは任意の試薬に曝露され、したがって、マウスの健康が毒性の指標になる。本明細書に記載され当技術分野で公知の他の動物モデルも本明細書に記載される方法において利用することが可能である。
ウサギの眼アッセイ
血管新生のもう１つの尺度は、ｉｎ ｖｉｖｏウサギの眼モデルであり、ウサギの眼アッセイと呼ばれる。ウサギの眼アッセイは他の者により詳細に記載されており、Ｄ’Ａｍａｔｏら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１（９）：４０８２〜４０８５により例示されているように、血管新生阻害剤の存在下で血管新生と新血管形成の両方を測定するのに使用されてきた。
ウサギの眼アッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏ血管新生の承認されたアッセイモデルである。なぜならば、新血管形成プロセスは、角膜の縁から角膜内へのウサギ血管の成長により例証されるが、目の天然では透明な角膜を通じて容易に可視化されるからである。さらに、新血管形成の刺激若しくは阻害の程度も量も又は新血管形成の後退の程度も量も、長い時間をかけて容易にモニターすることが可能である。
最後に、ウサギは任意の試薬に曝露され、したがって、ウサギの健康は前記試薬の毒性の指標となる。
手短に言えば、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイが実施され、１若しくは複数の対照又は試験化合物を含有する０．５％カルボキシルメチルセルロースペレットの移植後４８時間で発生中の脈管構造に対する効果が記録される。角膜新血管形成は、スクラルファート（ショ糖硫酸アルミニウム；Ｂｕｋｈ Ｍｅｄｉｔｅｃ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）に結合している６５０ｎｇの強力な血管新生タンパク質塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有するポリ（ヒドロキシエチルメタクリル酸）（Ｈｙｄｒｏｎ；Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）の移植されたペレットにより誘導される。前記ペレットにスクラルファートを添加すると、ｂＦＧＦを分解から保護しその徐放を提供し、したがって、ｂＦＧＦ／Ｈｙｄｒｏｎ単独により誘導される血管新生よりも明白である一貫した活動的な血管新生を生じる。スクラルファート／Ｈｙｄｒｏｎを含有するペレットからのｂＦＧＦの放出は、Ｈｙｄｒｏｎ単独を用いたペレットのわずか１日と比べて、ペレットが形成された後の最大４日間ｉｎ ｖｉｔｒｏで検出することが可能である。ペレットは、１２μｇの組換えｂＦＧＦ（Ｔａｋｅｄａ、Ｏｓａｋａ）を含有する１１０μｌの生理食塩水を４０ｍｇのスクラルファートと混合することにより作製され；この懸濁液はエタノール中１２％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｈｙｄｒｏｎの８０μｌに添加される。次に、この混合液のアリコット（１０μｌ）をピペットでＴｅｆｌｏｎペッグ上に移し、乾燥させて約１７のペレットを作製する。
ペレットは、麻酔をかけられたメスニュージーランドホワイトウサギの各眼の縁から２ｍｍの角膜マイクロポケットに移植され、続いて角膜の表面にエリスロマイシン軟膏を単回局所投与する。連日の組織学的検査により、ペレットに向かう角膜への進行的な血管成長が示され、炎症細胞が見られるのはごくまれである。この血管新生応答は、全身照射を用いた重度の免疫抑制によって変わることはなく、スクラルファート単独を用いたペレットは血管新生を誘導しない。新しい血管は、炎症によってではなくむしろ主にｂＦＧＦにより誘導される。前記動物は、０．５％カルボキシメチルセルロースに懸濁された１若しくは複数の化合物又は溶媒単独を用いた胃洗浄による移植の２日後から毎日餌を与えられる。免疫抑制された動物は、前記ペレットの移植直前６分間６Ｇｙの全身照射を受ける。この放射線量により、著しい白血球減少が生じ、白血球数は２日までに＞８０％減少、３日目までに＞９０％減少し、これは以前の報告と一致する結果であった。
動物は、同一の角膜専門家（Ｍ．Ｓ．Ｌ．）により一日おきにマスクされた形で細隙灯を用いて検査される。角膜新血管形成の面積は、縁からの血管長（Ｌ）及び関与する縁の実働時間数（Ｃ）を、レチクルを用いて測定することにより決定される。式：Ｃ／１２×３．１４１６［ｒ２−（ｒ−Ｌ）２］（ｒ＝６ｍｍ、ウサギ角膜の測定された半径）を使用して円形帯の部分の面積を決定する。前記ペレットに隣接する新血管形成の均一な連続帯が測定され、したがって、新血管形成の全阻害を評価することが可能になる。
マウスマトリゲルプラグ血管新生アッセイ
血管新生に対する組成物の効果を確認するためには、マウスマトリゲルプラグ血管新生アッセイを使用することが可能である。様々な増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦ）（２５０ｎｇ）及びヘパリン（０．００２５ユニットｐｅｒ／ｍＬ）を既に記載されている増殖因子減少マトリゲルと混ぜ合わせる（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８３、９７：１６４８〜１６５２；Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００、２７６：８１３５〜８１４１）。本明細書に記載される組成物又は対照抗体は、１又は複数の動物用量群を利用するマトリゲル調製物に含めることが可能である。対照実験では、マトリゲルは増殖因子の非存在下で調製される。マウスは、０．５ｍＬのマトリゲル調製物を皮下に注射され、１週間インキュベートさせる。インキュベーション期間に続いて、前記マウスは屠殺され重合したマトリゲルプラグは外科的に取り除かれる。マトリゲルプラグ内の血管新生は、免疫組織化学的解析及びヘモグロビン含量を含む２つの確立した方法により定量される（Ｆｕｒｓｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ．２００２、３：２９８〜３０２；Ｖｏｌｐｅｒｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２００２、２（６）：４７３〜８３；及びＳｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３、６３：３５８５〜３５９２）。免疫組織化学的解析では、マトリゲルプラグはＯＣＴに包埋され、スナップ凍結され、４μｍ切片が調製される。凍結切片はメタノール／アセトン（１対１）中で固定される。凍結切片は、ＣＤ３１に向けられたポリクローナル抗体で染色される。血管新生は、２０高出力（２００×）顕微鏡視野内の微小血管密度計数により定量される。
ヘモグロビン含量は既に記載されている通りに定量することが可能である（Ｓｃｈｎａｐｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９３、２５６：２３５〜２４６；Ｍｏｎｔｅｓａｎｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８３、９７：１６４８〜１６５２；Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００、２７６：８１３５〜８１４１；及びＧｉｇｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６、１００：１１５４〜１１６４）。マトリゲル移植片はドライアイス上でスナップ凍結され、一晩凍結乾燥される。乾燥移植片は０．４ｍＬの１．０％サポニン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に１時間再懸濁され、勢いよくピペッティングすることにより破壊される。前記調製物は１４，０００×ｇで１５分間遠心分離されて、いかなる微粒子も取り除かれる。次に上清中のヘモグロビンの濃度は、４０５ｎｍで吸光度を測定することにより直接決定され、精製されたヘモグロビンの標準濃度と比較される。
腫瘍増殖をアッセイする方法
腫瘍増殖は、当業者に公知である方法、例えば、ＳＣＩＤマウスモデル、ヌードマウスモデル及び同系腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスによりアッセイすることが可能である。腫瘍増殖のＳＣＩＤマウスモデルは以下の通りに実施される。サブコンフルエントヒトＭ２１メラノーマ細胞（又は任意の所望の腫瘍細胞型）は収穫され、洗浄され、無菌ＰＢＳに再懸濁される（ｍＬあたり２０×１０６）。ＳＣＩＤマウスは１００μＬのＭ２１ヒトメラノーマ細胞（２×１０６）懸濁液を皮下に注射される。腫瘍細胞注入の３日後、マウスは未処置のまま又はアンタゴニストを所望の用量範囲で腹腔内に処置される。前記マウスは２４日間毎日処置される。腫瘍サイズはキャリパーを用いて測定され、体積は式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２（Ｖはその体積に等しく、Ｌはその長さに等しく、Ｗはその幅に等しい）を使用して推定される。
代わりに、ヌードマウスモデル、ＳＣＩＤマウスモデル及び／又はＢＡＬＢ／ｃ同系マウスモデルを利用して、腫瘍増殖及び本明細書に記載されるヒト化抗エンドグリン抗体による又は抗原結合断片よるその阻害を評価することも可能である（Ｔｓｕｊｉｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２９：１０８７〜１０９４（２００６））。
細胞増殖をアッセイする方法
細胞増殖は当業者に公知である方法によりアッセイすることが可能である。本明細書に記載されるように、サブコンフルエントヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ＥＣＶ又はＥＣＶＬ細胞由来のＣＭ（２５μＬ）の存在又は非存在下で低（５．０％）血清を含有する増殖緩衝液に再懸濁し、内皮細胞を２４時間増殖させることが可能である。増殖は、市販のＷＳＴ−１アッセイキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用してミトコンドリアデハイドロゲナーゼ活性を測定することにより定量することが可能である。本明細書に記載されるように、増殖は、標準法を使用して３Ｈ取込みを測定することにより定量することも可能である（Ｓｈｅら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１０８：２５１〜２５７（２００４））。
細胞増殖を評価する他の方法は当技術分野では公知であり、本明細書で企図されている。追加の非限定的例は実施例においてさらに詳細に記載されている。
ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及びオプソニン化を誘導する方法
様々な療法が、形質転換された細胞に対する身体の自然免疫応答を増強することに向けられてきた。従来のエフェクター法には、補体依存性細胞溶解（「ＣＤＣ」）、抗体依存性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）及び食作用（標的細胞に免疫グロブリンが被膜された後の細網内皮系による排除）が含まれる。抗体の存在下では、抗体のＦｃ領域に対する表面結合受容体を有するリンパ球細胞などのある種のエフェクター細胞が、標的細胞に対して抗体依存性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）反応を媒介することは公知である。ＡＤＣＣによって、これらのエフェクター細胞は、そのような標的細胞に対して細胞溶解活性を発揮する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでは２種類のＡＤＣＣ反応が実証されている。古典的ＡＤＣＣ反応では、エフェクター細胞は抗体被膜標的細胞に付着し、続いて標的細胞の細胞溶解を引き起こす（Ａ．Ｈ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、「抗体被膜標的細胞に対して細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞の特徴（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｍｅｄｉａｔｉｎｇ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｃｏａｔｅｄ Ｔａｒｇｅｔ Ｃｅｌｌｓ）」Ｉ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２１、ｐ．７１９（１９７５））。エフェクターと標的細胞間のこの付着は、標的細胞を被膜する抗体のＦｃ領域とエフェクター細胞のＦｃ受容体の相互作用から生じる。この種類のＡＤＣＣ反応の１つの不利な点は、この反応が、エフェクター細胞のＦｃ受容体を巡って標的細胞結合抗体と競合する様々な疾患を伴うことが多い循環する抗原抗体複合体により妨げられうることである（Ｉ．Ｃ．Ｍ．ＭａｃＬｅｎｎａｎ、「細胞傷害性リンパ球上での免疫グロブリンの受容体を巡る競合（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｏｎ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）」、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０、ｐ．２７５（１９７２））。古典的ＡＤＣＣのこのような欠点のせいで、第二の種類のＡＤＣＣ反応、すなわち、抗体指向ＡＤＣＣが提唱されてきた。抗体指向ＡＤＣＣでは、標的特異的抗体は先ずエフェクター細胞に付着し、次に得られた複合体が、前記抗体を介して、標的細胞表面上のその特異的抗原に「向けられる」。有利には、抗体指向ＡＤＣＣは、宿主系において循環している抗原抗体複合体の存在により影響されない可能性がある。Ｆｃ領域／Ｆｃ受容体付着を介した抗体とエフェクター細胞の相互作用は、通常は弱い。さらに、一部の例では、抗体は、標的細胞の溶解を許すのに十分な期間エフェクター細胞に会合したままではいない。この潜在的な問題を考慮して、抗体は、ポリエチレングリコール及びフタル酸油の混合物を用いた前処理を使用してエフェクター細胞に付着されてきた（Ｊ．Ｆ．Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｓｅｇａｌ、「抗体被膜エフェクターを用いた抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）：抗体結合及び細胞溶解を増強するための新しい方法（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ（ＡＤＣＣ） Ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｃｏａｔｅｄ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ：Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２５、ｐｐ．９２６〜３３（１９８０））。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏ治療のためのこの方法の適用性は、抗体エフェクター細胞複合体上のいかなるポリエチレングリコール及びフタル酸油残渣でも身体に対して及ぼしうるその毒性効果により減少する可能性がある。
代わりに、細胞傷害性薬物を用いたアジュバンド化学療法により抗体指向ＡＤＣＣを増強するための方法が提唱されてきた（Ｉ．Ｒ．Ｍａｃｋａｙら、「乳がんにおけるメルファランを含むアジュバンド細胞傷害性化学療法のナチュラルキラー及び抗体依存性細胞傷害に対する効果（Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｍｅｌｐｈａｌａｎ Ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅ）」、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、１６、ｐｐ．９８〜１００（１９８３））。ＡＤＣＣについて試験するためのアッセイは、例えば、米国特許第５，７５６，０９７号など、当技術分野では周知である。
したがって、本発明は、新血管形成又は血管新生において役割を有する細胞に結合することができる抗体で、前記細胞の食作用及び死滅を増強しそれによってｉｎ ｖｉｖｏで保護を増強することができる抗体（例えば、ヒト化抗エンドグリン抗体）を提供する。そのような抗体が結合することができ同じ効果を有する結合部位又はエピトープと免疫反応する、すなわち、特異的に結合する又は優先的に結合する他の抗体及びその機能的断片も提供される。
本発明の抗体は、新血管形成又は血管新生において役割を有する細胞（例えば、内皮細胞）に対してオプソニンである又はオプソニン活性を示すことも可能である。当業者であれば認識しているように、「オプソニン活性」とは、抗原又は細胞受容体に結合して、食細胞への前記抗原又は細胞受容体の付着を促進しそれによって食作用を増強するオプソニン（一般に、抗体又は血清因子Ｃ３ｂのどちらか）の能力のことである。ある種の細胞は、オプソニン抗体で被膜されると好中球及びマクロファージなどの食細胞にとり極めて誘引性になり、血流からのその排除速度は著しく増強される。オプソニン活性は、例えば、米国特許第６，６１０，２９３号に記載されているいかなる従来の方法でも測定しうる。
別の非限定的実施形態では、新血管障害又は血管新生依存性障害を有する患者は、血管新生から抗原／ペプチド（例えば、エンドグリン）を流す。これらの抗原／ペプチドは「腫瘍関連抗原」でありうる。そのような患者は、抗原／ペプチド（例えば、エンドグリン）に対する抗体を全身投与されることが可能であり、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、オプソニン化又は細胞媒介死滅の他の任意の形態を誘導するために本明細書に記載される経路のうちのいずれでも開始することが可能である。
Ｖ．パッケージ及びキット
さらに追加の実施形態では、本出願は、上記の化合物を用いる使用のためのキットに関する。エンドグリンに結合するヒト化抗体又は抗原結合断片をキットで提供することが可能である。したがって、前記キットは、適切な容器手段で、エンドグリンに結合する抗体又はその抗原結合断片を含む組成物を含むことになる。前記キットは、適切な容器手段でエンドグリンに結合する抗体又はその抗原結合断片を含みうる。
前記キットの容器手段は、少なくとも１つのポリペプチドを入れる、及び／又は好ましくは適切にアリコットすることが可能な少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、注射器及び／又は他の容器手段を一般に含むことになる。前記キットは、少なくとも１つの融合タンパク質、検出可能成分、レポーター分子及び／又は市販用に密封された他の任意の試薬容器を含有するための手段を含むことが可能である。そのような容器は、注射及び／又は所望のバイアルが保持されるブロー成形プラスチック容器を含みうる。キットは、前記キット中の材料の使用のための印刷物も含むことが可能である。
パッケージ及びキットは、さらに緩衝剤、保存剤及び／又は安定化剤を医薬製剤中に含むことが可能である。前記キットの各成分は個々の容器内に封入されることが可能であり、様々な容器のすべてが単一パッケージ内に存在することが可能である。発明キットは冷温貯蔵又は室温貯蔵用に設計することが可能である。
さらに、前記調製物はキットの有効期間を増加させ、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む安定化剤を含有することが可能である。組成物が凍結乾燥される場合は、キットは凍結乾燥調製物を再構成するための溶液の調製物をさらに含有することが可能である。許容可能な再構成溶液は当技術分野では周知であり、例えば、薬学的に許容されるリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。
さらに、本明細書に提供されるパッケージ又はキットは、例えば、１若しくは複数のレポーター分子及び／又は１若しくは複数の検出可能成分／作用物質などの本明細書に提供されるその他の成分のいずれでもさらに含むことが可能である。
パッケージ及びキットは、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイなどのアッセイのための１又は複数の成分をさらに含むことが可能である。本出願において試験される試料には、例えば、血液、血漿及び組織切片並びに分泌物、尿、リンパ液及びその生成物が含まれる。パッケージ及びキットは、試料を収集するための１又は複数の成分（例えば、注射器、カップ、スワブ等）をさらに含むことが可能である。
パッケージ及びキットは、例えば、製品説明、投与様式及び／又は治療の指示を明記するラベルをさらに含むことが可能である。本明細書に提供されるパッケージは、本明細書に記載される組成物のうちのいずれでも含むことが可能である。前記パッケージは、血管新生／新血管形成により特徴付けられる眼疾患（例えば、黄斑変性、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎障害、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）、関節リウマチ、変形性関節症、がんの一種及びがん転移を治療するためのラベルをさらに含むことが可能である。
用語「包装材料」とは、キットの成分を収納する物理的構造体のことである。包装材料は成分を無菌で維持することが可能であり、そのような目的に一般に使用されている材料（例えば、紙、段ボール線維、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル等）で作製することが可能である。ラベル又は添付文書は適切に書かれた使用説明書を含むことが可能である。したがって、キットは、本発明のいかなる方法においてもキット成分を使用するためのラベル又は使用説明書をさらに含むことが可能である。キットは、パックされた又はディスペンサー内の化合物を、本明細書に記載される方法で前記化合物を投与するための使用説明書と一緒に含むことが可能である。
本発明は、本明細書に記載される診断法及びアッセイを利用するキットをさらに提供する。いくつかの実施形態では、本発明に従ったキットは、その発現レベルが患者由来のがん細胞の試料中の血管新生阻害剤に対する感受性又は耐性と相関していた遺伝子（単数又は複数）を検出するために試薬を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子（単数又は複数）は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＨＩＦ−１α、胎盤細胞増殖因子受容体及びＣＤ１０５から選択される。いくつかの実施形態では、前記キットはＶＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、前記キットはＶＥＧＦ受容体を含む。いくつかの実施形態では、前記キットはＨＩＦ−１αを含む。いくつかの実施形態では、前記キットは胎盤細胞増殖因子受容体を含む。いくつかの実施形態では、前記キットはＣＤ１０５を含む。いくつかの実施形態では、前記キットはＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＨＩＦ−１α、胎盤細胞増殖因子受容体及びＣＤ１０５のうちの少なくとも２つを含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、血管新生阻害剤に対する感受性と相関していた少なくとも２つの遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、血管新生阻害剤に対する耐性と相関していた少なくとも２つの遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、血管新生阻害剤に対する感受性と相関していた少なくとも１つの遺伝子及び血管新生阻害剤に対する耐性と相関していた１つの遺伝子を含む。
さらに追加の実施形態では、本発明に従ったキットは、治療される患者由来の腫瘍細胞の試料中においてＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＨＩＦ−１α、胎盤細胞増殖因子受容体及びＣＤ１０５発現レベルを検出するための試薬、並びに本明細書に記載されるヒト化抗エンドグリン抗体又は抗原結合断片を含むがこれらに限定されない阻害剤の用量（単数又は複数）を、カプセル、カプレット、ジェルカップ、懸濁用の粉末等などの種々の剤形で含む。治療される患者由来の腫瘍細胞の試料中においてＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＨＩＦ−１α、胎盤細胞増殖因子受容体及びＣＤ１０５発現レベルを検出するための試薬を含むキットは、少なくとも１つの追加の血管新生阻害剤の同時投与のためのキットの前述の実施形態のうちのいずれかをさらに含むことになることは本発明内においてさらに企図されている。
使用説明書は、治療法を含む本明細書に記載される方法のうちのいずれかを実行するための指示書を含むことが可能である。使用説明書は、十分な臨床エンドポイント又は起こりうるどんな有害な症状も又はヒト対象に使用するための食品医薬品局などの規制当局により要求される追加の情報の表示をさらに含むことが可能である。
前記使用説明書は、「印刷物」上、例えば、キット内の若しくはキットに添付された紙若しくは厚紙上に、或いはキット若しくは包装材料に添付された、又はキットの成分を含有するバイアル若しくはチューブに貼り付けられたラベル上にあってもよい。使用説明書は、ディスク（フロッピー（登録商標）ディスク又はハードディスク）、ＣＤ−若しくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭなどの光学ＣＤ、磁気テープ、ＲＡＭ及びＲＯＭなどの電気記憶媒体、ＩＣチップ並びに磁気／光学記憶媒体などのこれらのハイブリッドなどのコンピュータ読み取り可能媒体上にさらに含まれていてもよい。
本出願の化合物及び方法の実施形態は、説明的であることを目的とし限定するものではない。当業者であれば、上記教唆、特に記載された改変物を取り囲むエンドグリンに結合する抗体又は抗原結合断片の改変に関連する可能性がある教唆に照らして、エンドグリンの結合に関して天然に近い機能性を維持しつつ改変及び変動を加えることができる。したがって、記載されていることの範囲内にある開示された特定の実施形態において変化を加えうることは理解されるべきである。
本出願は以下の非限定的実施例を参照することによりさらによく理解されうるものであり、これら実施例は本出願の例となる実施形態として提供されている。以下の実施例は、本発明の実施形態をさらに完全に説明するために提供されるものであるが、決して本出願の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本出願のある種の実施形態が本明細書に示され記載されてきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されることは明白である。本発明から逸脱することなく当業者は数多くの変動、変化及び置換物を思い付くことがある。本明細書に記載される実施形態の様々な代替物を本明細書に記載される方法を実行する際に用いうることは理解されるべきである。
（例１）
抗ＣＤ１０５ヒト化及びヒト化／脱免疫化抗体の作製及び結合
抗体の構築、発現及び精製
変性され、ライゲートされ、ＰＣＲ増幅されて完全長合成Ｖ領域を与える一連の重複オリゴヌクレオチドを使用して、ヒト化及びヒト化／脱免疫化ＶＨ及びＶＫ領域遺伝子はすべて合成された。次に、組み立てられたバリアントは、ＩｇＧ１重鎖及びカッパ軽鎖のためのＡｎｔｉｔｏｐｅ社製ｐＡＮＴ発現ベクターシステムに直接クローニングされた。
ヒト化重及び軽鎖の組合せ（すなわち、計４対合）並びにヒト化／脱免疫化重及び軽鎖の組合せ（すなわち、計２４対合）すべてが、エレクトロポレーションを介してＮＳ０細胞に安定的にトランスフェクトされ、２００ｎＭメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ８４０７）を使用して選択された。構築物ごとのメトトレキサート耐性コロニーは、ＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡを使用してＩｇＧ発現レベルについて試験された。最もよく発現している系統が選択され、液体窒素下で凍結された。成功したトランスフェクション及びクローン選択はすべてのバリアントについて達成され、飽和静置培養物中のヒト化及びヒト化／脱免疫化抗体バリアントの発現レベルは表１に示されている。
したがって、２４のＩｇＧ１バリアントは、プロテインＡセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１１００３４−９３）上でＮＳ０細胞培養上清から精製され、予想されるアミノ酸配列に基づいて、消衰係数、Ｅｃ（０．１％）＝１．６２を使用してＯＤ２８０ｎｍにより定量された。約５００μｇの各抗体バリアントが精製され、主なバリアントは還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された。手短に言えば、クーマシーブルーが主な抗体バリアントの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを染色した。１μｇの各試料はＮｕＰａｇｅ ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０３２２ＢＯＸ）上に充填され２００Ｖで３０分間流された。マーカーはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ（カタログ番号１６１−０７３）であった。予想されるサイズの重及び軽鎖に対応するバンドが観察され、どのレーンでもどんな汚染の証拠もなかった（データは示されていない）。
ＥＬＩＳＡ法
ＥＬＩＳＡを使用して、ヒト化及びヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体のエンドグリンへの結合をアッセイした。手短に言えば、ＥＬＩＳＡは、以下のステップに従って実施された。
１．Ｎｕｎｃ ＭａｘｉｓｏｒｐプレートをＰＢＳ中１５００ｎｇ／ｍｌのＭＡＢ９８１１−０１（ポリクローナル抗エンドグリン抗体）を用いて１００μｌ／ウェルで被膜する。プレートをシール材で覆い、４℃で一晩（１６〜２４時間）インキュベートする。
２．プレートを２００μｌのＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎなし）で２回洗浄する。
３．２００μｌ／ウェルのＢＳＡブロッキング溶液（１％ＢＳＡ）を添加し、室温で６０分間インキュベートする。
４．ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーを使用してＴｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）を含有するＰＢＳを用いてプレートを３回洗浄する。
５．０．１％ＢＳＡを有するＰＢＳ−Ｔ中１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ１０５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１０９７−ＥＮ）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で６０分インキュベートする。
６．ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーを使用してＰＢＳ−Ｔを用いてプレートを３回洗浄する。
７．試験ウェルでは、２０、１０、４、２、１、０．５及び０．２ｎｇ／ｍｌ（０．１％ＢＳＡを有するＰＢＳ−Ｔ中に希釈される）の抗エンドグリン抗体を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で６０分インキュベートする。陰性対照ウェルでは、アイソタイプ適合対照抗体を１００μｌ／ウェルで添加する。
８．ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーを使用してＰＢＳ−Ｔを用いてプレートを３回洗浄する。
９．０．１％ＢＳＡを有するＰＢＳ−Ｔ中１対１００００に希釈されたＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）にコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧを１００μｌ／ウェルですべてのウェルに添加し、室温で３０〜６０分インキュベートする。
１０．ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーを使用してＰＢＳ−Ｔを用いてプレートを５回洗浄する。
１１．ＴＭＢ基質溶液の１００μｌ／ウェルを添加し、暗所で１５分間覆いなしでインキュベートする。
１２．ＴＭＢ停止溶液の１００μｌ／ウェルを添加することにより反応を停止する。
試料は３通り流され、光学密度を読み取って標準曲線を構築し結合定数を決定する。統計的解析は、スチューデントｔ−検定又は他の標準検定を使用して行われる。
競合ＥＬＩＳＡ
抗体は、競合ＥＬＩＳＡにおいてビオチン化キメラ抗ＣＤ１０５に対するＣＤ１０５への結合について試験された。手短に言えば、キメラ抗ＣＤ１０５は、製造業者の使用説明書に従ってマイクロビオチン化キット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＢＴＡＧ−１ＫＴ）を使用してビオチン化された。Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェル平底マイクロタイタープレートは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１．５μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ１０５（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号９８１１−０１）を用いて４℃で一晩被膜された。次の日、ＰＢＳ／２％ＢＳＡ中１００ｎｇ／ｍｌヒトＣＤ１０５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１０９７−ＥＮ）は、前被膜されたプレートに添加され、室温で１時間インキュベートされた。変化する濃度のキメラ、ヒト化又はヒト化／脱免疫化抗ＣＤ１０５抗体のいずれか（３倍希釈液中４μｇ／ｍＬから０．００１８μｇ／ｍＬ）は、固定された濃度のビオチン化キメラ抗ＣＤ１０５抗体（６．２５ｎｇ／ｍｌ）と混合され、プレートに添加された。ビオチン化キメラ抗体の結合は、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ５５１２）及びＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０４４０）を介して検出された。ＯＤ４５０ｎｍ値は、Ｄｙｎｅｒ ＭＲＸ ＴＣＩＩプレート読取り機上で測定された。競合解析の結果は図７及び８に図示されている。曲線は、対数試料濃度に対するそれぞれの吸光度プロットの直線部分を通してフィットされ、前記直線の方程式を使用して、ビオチン化キメラ抗体のＣＤ１０５への結合を５０％阻害するのに必要なヒト化又はヒト化／脱免疫化抗体の濃度（ＩＣ５０）を計算した。実験内及び実験間の比較を可能にするために、ヒト化又はヒト化／脱免疫化バリアントのＩＣ５０値は、倍差の値を与えるために各プレート上に含まれた基準抗体に対して正規化された。ＩＣ５０値はキメラ抗ＣＤ１０５に相対的であり３つの実験を代表している。要約ＥＬＩＳＡデータは表１に示されており、飽和静置培養においてアッセイされた抗体発現レベル（μｇ／ｍｌ）を含む。
（例２）
ヒト化及びヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体結合のＢＩＡｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴：ＳＰＲ）解析
抗体のアフィニティーは、例えば、標準プロトコールを使用するＢＩＡｃｏｒｅ解析を使用して評価することが可能である。手短に言えば、プロテインＡはＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５チップに化学的にカップリングされ、約２０００ＲＵに対応する量のプロテインＡが固定化される。その後のステップは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ、ｐＨ＝７．４のランニング緩衝液において２５℃で１０Ｈｚデータ収集速度を使用して実施される。抗エンドグリン抗体（１０ｎＭ）は、ＢＩＡｃｏｒｅチップ上の固定化されたプロテインＡにより１０μＬ／分の流速で捕捉され、典型的には、２０、４０及び８０秒の捕捉時間で、それぞれ１３０ＲＵ、３３０ＲＵ及び５７０ＲＵに相当する抗体密度の捕捉が可能になる。起動サイクルは、流速４０μＬ／分、接触時間９０秒及び解離時間９０秒でランニング緩衝液を使用して実施される。試料サイクルは、０から４０ｎＭの範囲の濃度で組換えエンドグリンを使用して実施される。エンドグリンは、流速４０μＬ／分、接触時間５２５秒及び解離時間２５００秒で捕捉された抗体を含有するＢＩＡｃｏｒｅチップ全体を通される。８試料サイクルは、典型的には各抗体捕捉密度で実施される。前記チップの再生は、１０ｍＭグリシン ｐＨ＝１．７を使用して実現される。データ解析は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアｖ１．１を使用して実施される。捕捉抗体密度が異なるＢＩＡｃｏｒｅチップを使用して生じるシグナルは比較され、組換えエンドグリン非存在下で生じるデータを使用してアッセイ内ブランクシグナルについて調整する。データのフィッティングでは、Ｒｍａｘは、各サイクルにおける各抗体の捕捉レベルの変動を説明するために浮遊させる。各捕捉密度からのデータは、各抗体の解析中に同時にフィットさせる。ＢＩＡｃｏｒｅデータは、Ｋａ（１／Ｍｓ）、Ｋｄ（１／ｓ）、ＫＤ（Ｍ）及びＣｈｉ２（ＲＵ２）を含むキメラ、ヒト化及びヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体について表２に示されている。
（例３）
エンドグリン発現細胞上の利用可能なエピトープの抗体結合活性及び数
エンドグリン発現細胞上の利用可能なエピトープの抗体結合活性及び数は、標準プロトコールを使用するＳｃａｔｃｈａｒｄプロット解析を利用して評価することが可能である。
手短に言えば、放射性標識されたヒト化抗エンドグリン抗体の、エンドグリン発現ＫＭ−３白血病細胞及びサブコンフルエント増殖ＨＵＶＥＣへの直接結合のＳｃａｔｃｈａｒｄプロット解析が実施される。精製された抗エンドグリン抗体は、Ｉｏｄｏ−Ｇｅｎを使用し当業者には公知の標準法に従って１２５Ｉで個々に放射標識される。放射標識されたヒト化抗エンドグリン抗体は、ＩｇＧ分子あたりのヨウ素原子の平均数についてアッセイされる。一定量（０．１μｇ）の各１２５Ｉ標識ｍＡｂ及びエンドグリン発現ＨＵＶＥＣ細胞の２倍連続増加を使用して滴定実験は実施されて、抗原結合活性を決定する。結合データのＳｃａｔｃｈａｒｄプロットの解析は、公知の方法に従って実施される。ｍＡｂ結合細胞の平衡定数及び平均最大数はこの解析により推定される。
（例４）
抗エンドグリン抗体活性のウェスタンブロットアッセイ
ＣＤ１０５を発現する増殖している内皮細胞において細胞内シグナル伝達を改変するヒト化抗エンドグリン抗体の能力は、ＣＤ１０５シグナル伝達経路に関与しているタンパク質のリン酸化を検出するウェスタンブロットを介してアッセイすることが可能である。
非トランスフェクト内皮細胞における公知のウェスタンブロッティング法に従って、リン酸化されたＳｍａｄ１／５／８又はＳｍａｄ２／３を同定するウェスタンブロット解析が実施される。リン酸化されたＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ５、Ｉｄｌ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）及びエンドグリンに対する一次抗体を利用して試料中の分子を検出する。検出は増強された化学発光（ＥＣＬ）により実施される。
（例５）
ＨＵＶＥＣ増殖の阻害及び３Ｈチミジン取込みアッセイ
細胞増殖の阻害を評価するためにはいくつかのアッセイが利用可能である。
一例では、ＨＵＶＥＣ細胞系Ｅ６／Ｅ７ Ｐ３−１７が、５％ウシ胎児血清を含有するサプリメントを有するＥＢＭ２培地（Ｌｏｎｚａ−Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）において培養された。細胞は、サブコンフルエント条件下、ＣＯ２インキュベーター中３７℃、７５ｃｍ２フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）内で培養された。細胞は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中１５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．３を有するハンクス平衡塩類溶液と一緒に、３７℃で１５分間インキュベートすることにより剥離される。氷冷ＰＢＳで２回洗浄後、細胞は、内皮細胞増殖培養液に濃度２５，０００細胞／ｍＬで再懸濁される。追加実験では、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はＦＢＳ及びウシ脳抽出物のない内皮細胞増殖培養液に懸濁され培養される。２，５００細胞を含有する細胞懸濁液の２００μｌアリコットは、９６ウェル培養プレートの各ウェルに播種される。細胞はＣＯ２インキュベーター中３７℃で一晩培養され、その後１００μｇ／ｍＬのヒト化抗エンドグリン抗体ＶＫ１ＡＡＶＨ１Ａ２又は対照ＩｇＧ又はＰＢＳが３通りに添加される。培養プレートはインキュベーター中に７２時間置かれ、その間新鮮な培養液及びヒト化抗エンドグリン抗体、対照ＩｇＧ又はＰＢＳは２４時間ごとに取り換えられる。３Ｈチミジン（１μＣｉ）は各ウェルに添加され、プレートは２０時間インキュベートされる。細胞はＰＢＳで洗浄され、続いて３７℃で１５分間、１００μｌ／ウェルトリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％トリプシン、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて処置される。細胞は、Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ９６（ＴＯＭＴＥＣ、Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ）を使用してガラス繊維フィルター（Ｗａｌｌａｃ Ｐｒｉｎｔｅｄ ＦｉｌｔｅｒｍａｔＡ）上に収穫され、３Ｈ放射活性は、Ｔｒｉｌｕｘ１５４０ＭｉｃｒｏＢｅｔａ液体シンチレーション及び発光カウンター（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）において決定される。第二の例では、使用された細胞は、ＨＵＶＥＣ細胞の初代培養物、ＨＵＶＥＣ２５１７Ｃであり、ヒト化ＴＲＣ１０５抗体は、抗体対照及びＰＢＳと比べて、ＨＵＶＥＣ細胞系Ｅ６／Ｅ７及び単一ドナー由来の初代ＨＵＶＥＣ培養物、ＨＵＶＥＣ２５１７Ｃの増殖を阻害した（表３）。
（例６）
抗エンドグリン抗体による細胞遊走の阻害のアッセイ
細胞増殖及び活性化の尺度としての遊走（ケモキネシス）は、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを使用して測定される。
手短に言えば、細胞遊走は次の通りに評価される。Ｃｏｓｔａｒヌクレオポアフィルター（８ｍｍポア）は４℃で一晩、フィブロネクチンで被膜される。チャンバーはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、下部チャンバーは、血清と一緒に又はなしで及びＴＧＦ−β３と一緒に又はなしで、ＤＭＥＭで満たされた。細胞はトリプシン処理され、抗エンドグリン抗体を有するＤＭＥＭ中５０，０００細胞／ｍｌの最終濃度で懸濁される。細胞懸濁液の１５０μｌアリコットは上部チャンバーに添加され、３７℃でインキュベートされる。１６時間後、細胞は洗浄され上面は拭かれて非遊走細胞は取り除かれる。膜はメタノール中で固定され、水で洗浄され、染色され下面に存在する細胞の数が計数される。
（例７）
ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体のＡＤＣＣアッセイ
本明細書に記載される抗エンドグリン抗体は、ＩＬ−２活性化されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に結合し、ＨＵＶＥＣの抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するその能力に関して、例えば、以下のプロトコールを使用して評価することが可能である。
ＮＫ単離及びＩＬ−２活性化されたＮＫ細胞の作製
ＰＢＭＣは単離され、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ中４℃で２４時間静止させる。次に、ＰＢＭＣは２％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ中に置かれ（全容積＝５０ｍＬ）、１０ｍＬの細胞懸濁液はペトリ皿に蒔かれる。ＰＢＭＣは３７℃で２時間インキュベートされ、非付着細胞は収集される。ＮＫ細胞は１０００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２と一緒に４８時間、８×１０６／ｍＬで培養され、ＡＤＣＣアッセイにおいて使用する前に５〜８日間通常培養される。
細胞傷害及びＡＤＣＣアッセイ
ＮＫ細胞は培養物からこすり取られ、５０ｍＬ円錐管に収集される。細胞はＲＰＭＩ完全培地で１度洗浄され、１２００ｒｐｍで１０分間回転させる。次に、ＮＫ細胞は５ｍＬ ＲＰＭＩ完全培地に再懸濁され計数される。前記アッセイを実施するに先立って、ＮＫ細胞計数は、１０対１のエフェクター対標的比に正規化される。正規化されたＮＫ細胞は蒔かれ、１０μＬの抗エンドグリン抗体は指定されたウェルに添加され、３７℃で３０分間インキュベートされる。対照試料には、非処置又は対照抗体処置された細胞集団が含まれる。試料及び対照はすべて５通りに試験される。
対象の標的細胞は収集され（ＨＵＶＥＣ細胞）、洗浄され、１２００ｒｐｍで１０分間回転され、５ｍＬ ＲＰＭＩ完全培地に再懸濁される。標的細胞は再び洗浄され、最終濃度１×１０６細胞／ｍＬまで無血清ＲＰＭＩに再懸濁される。次に、標的細胞は、最終濃度５μｇ／ｍＬのＣａｌｃｅｉｎ ＡＭを用いて３７℃で１時間標識され、続いてＲＰＭＩ完全培地で２度洗浄される。その後、標的細胞は再懸濁され、ＮＫ細胞ウェルに添加される。標的細胞／ＮＫ細胞組合せは３７℃で４時間インキュベートされる。インキュベーション後、プレートは１２００ｒｐｍで５分間回転され、細胞は洗浄されＤＰＢＳに再懸濁される。蛍光は、４５０／５３０ｎｍの励起／発光を使用して読み取られ、発光は抗体により媒介される細胞死滅の尺度である。平均蛍光強度及び標準偏差が計算され、これを使用して以下の式に従って％ＡＤＣＣが計算される。
％ＡＤＣＣ＝１００％＊［（ｆｓａｍｐｌｅ−ｆｍｅｄｉａ）−（ｆｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ−ｆＴｒｉｔｏｎ）］、
ｆｓａｍｐｌｅ＝抗エンドグリン抗体を含有するウェル中の平均蛍光
ｆｍｅｄｉａ＝抗体のない培地を含有するウェル中の平均蛍光
ｆｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ＝アイソタイプ対照ＩｇＧを含有するウェル中の平均蛍光
ｆＴｒｉｔｏｎ＝Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（標的細胞を溶解するため）を含有するウェル中の平均蛍光
ヒト化／脱免疫化抗体ＶＫ１ＡＡＶＨ１Ａ２は、アイソタイプ対照抗体よりも著しく大きなＨＵＶＥＣの用量依存性ＡＤＣＣを実証した（表４Ａ及び４Ｂ）。表４Ａ及び４Ｂに要約されている実験は別々のドナー由来のＮＫ細胞を用いて実施されたことに注目されたい。

（例８）
脈絡膜血管新生のマウスモデルに対するヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の効果
ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の効果は、脈絡膜血管新生のマウスモデルにおいて評価することが可能である。
手短に言えば、生後４から５週間のＣ５７ＢＬ／６マウスは塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔され、瞳孔は１％トロピカミド（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）で散大される。５３２ｎｍダイオードレーザー光凝固（７５ｐｍスポットサイズ、０１秒間、１２０ｍＷ）の３つの火傷が、光凝固装置のスリットランプ送達システム（ＯｃｕＬｉｇｈｔ；Ｉｒｉｄｅｘ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｖｉｅｗ、ＣＡ）及びコンタクトレンズとしての手で支えられたカバースリップを使用して各網膜に送達される。火傷は、網膜の後極の９、１２及び３時の位置で実施される。レーザー処置時間のバブル生成は、ブルッフ膜の断裂を示しているが、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を得るのに重要な要因であり、したがって、バブルが生成される火傷のみが研究に含まれる。
ブルッフ膜の断裂後０日目の眼球内注射の効果を調べるために４つの独立した実験が実施される。群１のマウスは、１つの眼に１μＬのＰＢＳ中約０．５から約５μｇの抗エンドグリン抗体又は抗原結合断片の、他眼には１μＬのＰＢＳの眼球内注射を与えられる。群２マウスは、１つの眼に１μＬのＰＢＳ中約１．５から約１０μｇの抗エンドグリン抗体又は抗原結合断片の、他眼には１μＬのＰＢＳの眼球内注射を与えられる。群３マウスは、１つの眼に約５から約２５μｇの抗エンドグリン抗体又は抗原結合断片の、他眼には１μＬのＰＢＳの眼球内注射を与えられる。群４は両眼にＰＢＳを受ける。
１４日後、マウスは麻酔され、蛍光標識デキストラン（２×１０６平均分子量、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて灌流され、脈絡膜フラットマウントが調製される。手短に言えば、眼球が取り除かれ、１０％リン酸緩衝ホルマリン中で１時間固定され、角膜及び水晶体が取り除かれる。全網膜は眼杯から慎重に解体され、正目が４つの四分円すべてにおいて眼杯の縁から赤道まで作製され、網膜は水性封入剤（Ａｑｕａｍｏｕｎｔ；ＢＤＨ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）中でフラットマウントされる。フラットマウントは蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｄｉｔｅｃ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）により調査され、画像は、３電荷結合素子（ＣＣＤ）カラービデオカメラ（ＩＫ−ＴＵ４０Ａ、Ｔｏｓｈｉｂａ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてデジタル化される。フレームグラバー画像解析ソフトウェアを使用して、各ＣＮＶ病変の面積を測定する。複数の比較のためのダネット補正を有するＡＮＯＶＡを使用して統計的比較が行われる。
（例９）
ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト皮膚における前もって形作られたヒト乳がん腫瘍の抗血管新生療法
本明細書に記載されるヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の効果は、ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト皮膚において増殖した前もって形作られたヒト乳がん腫瘍に対するその抗血管新生効果に関して評価することが可能である。
手短に言えば、ＭＣＦ−７細胞（０．１ｍｌ ＰＢＳ中８×１０６細胞）は、移植片が炎症、収縮又は拒絶反応の兆候を全く示さないときに、ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト全層皮膚の皮内に移植される。マウスは、明確な触知可能な腫瘍（大半の場合に径３から６ｍｍ）が現れるまで未処置にしておく。明確な腫瘍を有するマウスは、治療研究のために群に分けられる。ヒト化／脱免疫化抗エンドグリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びアイソタイプ適合対照ＩｇＧは、マウス血清アルブミン（０．０５％最終濃度）を含有する無菌ＰＢＳを用いて希釈される。抗体療法では、１から２０ｍｇ／ｋｇ抗エンドグリン抗体又は対照ＩｇＧがマウスの尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）に投与される。前記投与は２日から３日ごとに与えられる。
処置中、マウスは腫瘍サイズ及び病的状態について毎日モニターされる。マウスは電子天秤（ＯＨＡＵＳ（商標）Ｍｏｄｅｌ ＧＴ２１０）を使用して週２回体重を測られる。腫瘍サイズは、ＯｐｔｏＤｅｍｏ（商標）ソフトウェア（Ｆｏｗｌｅｒ Ｃｏ．）を使用するコンピュータに接続された電子キャリパー（ＰＲＯ−ＭＡＸ６インチキャリパー；Ｆｏｗｌｅｒ Ｃｏ．、Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）を使用して週３回測定される。測定された腫瘍径は、次の式：Ｖ＝長さ×幅×高さ×ｐｉ／６を使用して腫瘍体積に変換される。マウスの異なる群の比較のためのデータの統計的解析は、スチューデントｔ−検定を使用して実施される。
（例１０）
卵巣がんのマウスモデル
ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片の卵巣がんを治療する能力を判定するために、卵巣がん細胞系を、ＳＣＩＤ又はヌードマウスにおいて使用することが可能である。
手短に言えば、卵巣がん細胞はＳＣＩＤ又はヌードマウスに移植されて、卵巣腫瘍を発生させる。確立した腫瘍を坦持するマウスの群は、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又は対照ＩｇＧの漸増用量（１．８ｍｇ／ｋｇ体重で開始する）を静脈内投与することにより処置される。処置は週あたり２又は３回実施される。ＶＥＧＦ阻害剤及び／又は他の抗がん剤は、一部の又はすべての群において使用してもよい。マウスはモニターされ、腫瘍増殖は週あたり２又は３回測定される。
（例１１）
結腸直腸がんのマウスモデル
ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片の結腸直腸がんを治療する能力を判定するために、結腸直腸がん細胞系を、ＳＣＩＤ、ヌード又は免疫適格性マウスにおいて使用することが可能である。
手短に言えば、結腸直腸がん細胞はＳＣＩＤ、ヌード又は免疫適格性マウスに移植されて、結腸直腸腫瘍を発生させる。確立した腫瘍を坦持するマウスの群は、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又は対照ＩｇＧの漸増用量（１．８ｍｇ／ｋｇ体重で開始する）を静脈内投与することにより処置される。処置は週あたり２又は３回実施される。ＶＥＧＦ阻害剤及び／又は他の抗がん剤は、一部の又はすべての群において使用してもよい。マウスはモニターされ、腫瘍増殖は週あたり２又は３回測定される。腫瘍は、ＰＥＴ及び超音波を含む標準画像検査により撮像しうる。処置された腫瘍は、免疫組織化学により細胞内シグナル伝達経路又は血管分布状態を評価するために外植されうる。
（例１２）
腎がんのマウスモデル
ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片の腎がんを治療する能力を判定するために、腎がん細胞系を、ＳＣＩＤ又はヌードマウスにおいて使用する。
手短に言えば、腎がん細胞はＳＣＩＤ又はヌードマウスに移植されて、腎腫瘍を発生させる。確立した腫瘍を坦持するマウスの群は、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又は対照ＩｇＧの漸増用量（１．８μｇ／ｇ体重で開始する）を静脈内投与することにより処置される。処置は、最初の３回の注射は３日間の間隔で、第４回の注射は７日間の間隔で実施される。ＶＥＧＦ阻害剤及び／又は他の抗がん剤は、一部の又はすべての群において使用してもよい。マウスはモニターされ、腫瘍増殖は週１回の頻度で動物の屠殺を介して測定される。
（例１３）
骨髄腫のマウスモデル
ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片の骨髄腫を治療する能力を判定するために、骨髄腫細胞系を、ＳＣＩＤ又はヌードマウスにおいて使用する。
手短に言えば、骨髄がん細胞はＳＣＩＤ又はヌードマウスに移植されて、骨髄腫を発生させる。確立した腫瘍を坦持するマウスの群は、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又は対照ＩｇＧの漸増用量（１．８ｍｇ／ｋｇ体重で開始する）を静脈内投与することにより処置される。処置は週あたり２又は３回実施される。ＶＥＧＦ阻害剤及び／又は他の抗がん剤は、一部の又はすべての群において使用してもよい。マウスはモニターされ、腫瘍増殖は週あたり２又は３回測定される。
（例１４）
肉腫のマウスモデル
ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はその抗原結合断片の肉腫を治療する能力を判定するために、肉腫細胞系を、ＳＣＩＤ又はヌードマウスにおいて使用する。
手短に言えば、肉腫細胞はＳＣＩＤ又はヌードマウスに移植されて、肉腫を発生させる。確立した腫瘍を坦持するマウスの群は、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又は対照ＩｇＧの漸増用量（１．８ｍｇ／ｋｇ体重で開始する）を静脈内投与することにより処置される。処置は週あたり２又は３回実施される。ＶＥＧＦ阻害剤及び／又は他の抗がん剤は、一部の又はすべての群において使用してもよい。マウスはモニターされ、腫瘍増殖は週あたり２又は３回測定される。
（例１５）
乳がんのマウスモデル
ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の乳がんを治療する能力を判定するために、乳がん細胞系を、ＳＣＩＤ又はヌードマウスにおいて使用する。
手短に言えば、乳がん細胞はＳＣＩＤ又はヌードマウスに移植されて、乳房腫瘍を発生させる。確立した腫瘍を坦持するマウスの群は、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の漸増用量（１．８ｍｇ／ｋｇ体重で開始する）を静脈内投与することにより処置される。対照動物は対照ＩｇＧを投与される。処置は週あたり２又は３回実施される。ＶＥＧＦ阻害剤及び／又は他の抗がん剤は、一部の又はすべての群において使用してもよい。マウスはモニターされ、腫瘍増殖は週あたり２又は３回測定される。
（例１６）
結腸直腸がんに対する組合せ療法の臨床試験
本実施例は、結腸直腸がん患者においてヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の安全性及び有効性の予備評価を提供する目的の無作為化、盲検、プラセボ対照、多施設、第二相試験を説明する。約１００〜約８００患者が登録され、約５０〜約４００患者が治療群に割り当てられ、約５０〜約４００患者がプラセボ群に割り当てられる。治験は、６〜１０サイクルで毎週、隔週又は３週間ごとの約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇのヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はプラセボの静脈内反復用量の投与からなる。ＶＥＧＦ阻害剤及び／又は他の抗がん剤は、すべての群において使用してもよい。研究の時間枠は、約６カ月から約５年で評価され、最初の研究の終了時に示されるレスポンダーでは治療が続行される。追加の評価項目は以下の通りである。
主要な評価項目：奏効率。研究の１つの目標は、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体を用いて無憎悪生存率の３５％の増加を実証することである。
評価することが可能な二次評価項目には、奏効率、応答の持続時間、全生存、重篤及び非重篤有害事象が含まれる。例えば、治療が疾患の進行を妨げることがあり（すなわち、停滞）、又は好転をもたらすことがある。代わりに、又はさらに、以下の：腫瘍量の減少、血管分布の減少、副作用の減少、有害反応の減少及び／又は患者コンプライアンスの増加のうちの１又は複数に関して他の目標を測定することが可能である。
（例１７）
骨髄腫に対する組合せ療法の臨床試験
本実施例は、骨髄腫患者においてヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体とボルテゾミブを組み合わせた安全性及び有効性の予備評価を提供する目的の無作為化、盲検、プラセボ対照、多施設、第二相試験を説明する。約１００〜約８００患者が登録され、約５０〜約４００患者が治療群に割り当てられ、約５０〜約４００患者がプラセボ群に割り当てられる。治験は、毎週約１．３ｍｇ／ｋｇのボルテゾミブと組み合わせた、毎週、隔週又は３週間ごとの約１〜約２０ｍｇ／ｋｇのヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はプラセボの静脈内反復用量の投与からなる。研究の時間枠は、約６カ月から約５年で評価され、最初の研究の終了時に示されるレスポンダーでは治療が続行される。追加の評価項目は以下の通りである。
主要な評価項目：奏効率。研究の１つの目標は、ボルテゾミブとプラセボを用いた約４０％からボルテゾミブとヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体を用いた約６０％（又はそれ以上）への奏効率の増加を実証することである。
評価することが可能な二次評価項目には、応答の持続時間、無憎悪生存率、全生存、重篤及び非重篤有害事象が含まれる。例えば、治療が疾患の進行を妨げることがあり（すなわち、停滞）、又は好転をもたらすことがある。代わりに、又はさらに、以下の：腫瘍量の減少、血管分布の減少、副作用の減少、有害反応の減少及び／又は患者コンプライアンスの増加のうちの１又は複数に関して他の目標を測定することが可能である。
（例１８）
腎がんに対する組合せ療法の臨床試験
本実施例は、腎細胞がん（腎がん）患者においてヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体とスニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））を組み合わせた安全性及び有効性の予備評価を提供する目的の無作為化、盲検、プラセボ対照、多施設、第二相試験を説明する。約１００〜約８００患者が登録され、約５０〜約４００患者が治療群に割り当てられ、約５０〜約４００患者がプラセボ群に割り当てられる。治験は、４週間の投与サイクルを繰り返すのに先立って２週間オフにして４週間毎日投与される約５〜約５０ｍｇのスニチニブと組み合わせた、毎週、隔週又は３週間ごとの約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇのヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はプラセボの静脈内反復用量の投与からなる。研究の時間枠は、約６カ月から約５年で評価され、最初の研究の終了時に示されるレスポンダーでは治療が続行される。追加の評価項目は以下の通りである。
主要な評価項目：無憎悪生存率。研究の１つの目標は、スニチニブとプラセボ群における約９〜１３カ月からスニチニブとヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体群における約１４〜１８カ月（又はそれ以上）までの無憎悪生存率の増加を実証することである。
評価することが可能な二次評価項目には、奏効率、応答の持続時間、腫瘍進行までの時間、全生存、重篤及び非重篤有害事象が含まれる。例えば、治療が疾患の進行を妨げることがあり（すなわち、停滞）、又は好転をもたらすことがある。代わりに、又はさらに、以下の：腫瘍量の減少、血管分布の減少、副作用の減少、有害反応の減少及び／又は患者コンプライアンスの増加のうちの１又は複数に関して他の目標を測定することが可能である。
（例１９）
肝細胞がんに対する組合せ療法の臨床試験
本実施例は、肝細胞がん（肝がん）患者においてヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体とソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））を組み合わせた安全性及び有効性の予備評価を提供する目的の無作為化、盲検、プラセボ対照、多施設、第二相試験を説明する。約１００〜約８００患者が登録され、約５０〜約４００患者が治療群に割り当てられ、約５０〜約４００患者がプラセボ群に割り当てられる。治験は、３〜６サイクルで又は進行まで毎日約４００ｍｇのソラフェニブと組み合わせた、毎週、隔週又は３週間ごとの約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇのヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はプラセボの静脈内反復用量の投与からなる。研究の時間枠は、約６カ月から約５年で評価され、最初の研究の終了時に示されるレスポンダーでは治療が続行される。追加の評価項目は以下の通りである。
主要な評価項目：無憎悪生存率。研究の１つの目標は、ソラフェニブとプラセボ群における約３〜９カ月からソラフェニブとヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体群における約６〜１２カ月（又はそれ以上）までの無憎悪生存率の増加を実証することである。
評価することが可能な二次評価項目には、応答の持続時間、腫瘍進行までの時間、全生存、重篤及び非重篤有害事象が含まれる。例えば、治療が疾患の進行を妨げることがあり（すなわち、停滞）、又は好転をもたらすことがある。代わりに、又はさらに、以下の：腫瘍量の減少、血管分布の減少、副作用の減少、有害反応の減少及び／又は患者コンプライアンスの増加のうちの１又は複数に関して他の目標を測定することが可能である。
（例２０）
腎がんに対する組合せ療法の臨床試験
本実施例は、腎細胞がん（腎がん）患者においてヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体とベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））を組み合わせた安全性及び有効性の予備評価を提供する目的の無作為化、盲検、プラセボ対照、多施設、第二相試験を説明する。約１００〜約８００患者が登録され、約５０〜約４００患者が治療群に割り当てられ、約５０〜約４００患者がプラセボ群に割り当てられる。治験は、隔週で静脈内に投与される約７．５、約１０又は約１５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブと組み合わせた、毎週、隔週又は３週間ごとの約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇのヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はプラセボの静脈内反復用量の投与からなる。研究の時間枠は、約６カ月から約５年で評価され、最初の研究の終了時に示される陽性レスポンダーでは治療が続行される。追加の評価項目は以下の通りである。
主要な評価項目：無憎悪生存率。研究の１つの目標は、ベバシズマブとプラセボ群における約８〜１２カ月からベバシズマブとヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体群における約１３〜１８カ月（又はそれ以上）までの無憎悪生存率の増加を実証することである。
評価することが可能な二次評価項目には、奏効率、応答の持続時間、腫瘍進行までの時間、全生存、重篤及び非重篤有害事象が含まれる。例えば、治療が疾患の進行を妨げることがあり（すなわち、停滞）、又は好転をもたらすことがある。代わりに、又はさらに、以下の：腫瘍量の減少、血管分布の減少、副作用の減少、有害反応の減少及び／又は患者コンプライアンスの増加のうちの１又は複数に関して他の目標を測定することが可能である。
（例２１）
卵巣がんに対する組合せ療法の臨床試験
本実施例は、卵巣がん患者においてヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体とＤｏｘｉｌ（登録商標）を組み合わせた安全性及び有効性の予備評価を提供する目的の無作為化、盲検、プラセボ対照、多施設、第二相試験を説明する。約１００〜約８００患者が登録され、約５０〜約４００患者が治療群に割り当てられ、約５０〜約４００患者がプラセボ群に割り当てられる。治験は、４週間ごとに１回投与される約５から約５０ｍｇ／ｍ２のドキシルと組み合わせた、毎週、隔週又は４週間ごとの約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇのヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はプラセボの静脈内反復用量の投与からなる。研究の時間枠は、６カ月から約５年で評価され、最初の研究の終了時に示されるレスポンダーでは治療が続行される。追加の評価項目は以下の通りである。
主要な評価項目：無憎悪生存率。研究の１つの目標は、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）とプラセボ群における約３〜６カ月からＤｏｘｉｌ（登録商標）とヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体群における約４〜１２カ月（又はそれ以上）までの無憎悪生存率の増加を実証することである。
評価することが可能な二次評価項目には、応答の持続時間、腫瘍進行までの時間、全生存、重篤及び非重篤有害事象が含まれる。例えば、治療が疾患の進行を妨げることがあり（すなわち、停滞）、又は好転をもたらすことがある。代わりに、又はさらに、以下の：腫瘍量の減少、血管分布の減少、副作用の減少、有害反応の減少及び／又は患者コンプライアンスの増加のうちの１又は複数に関して他の目標を測定することが可能である。
（例２２）
卵巣がんに対する白金ベースの組合せ療法の臨床試験
本実施例は、卵巣がん患者においてヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体と白金ベースの化学療法を組み合わせた安全性及び有効性の予備評価を提供する目的の無作為化、盲検、プラセボ対照、多施設、第二相試験を説明する。約１００〜約８００患者が登録され、約５０〜約４００患者が治療群に割り当てられ、約５０〜約４００患者がプラセボ群に割り当てられる。治験は、研究中ずっと過程が繰り返される、静脈内注入による白金ベースの化学療法計画（例えば、カルボプラチン及びパクリタキセル）と組み合わせた、毎週、隔週又は３週間ごとの約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇのヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はプラセボの静脈内反復用量の投与からなる。研究の時間枠は、約６カ月から約５年で評価され、最初の研究の終了時に示されるレスポンダーでは治療が続行される。追加の評価項目は以下の通りである。
主要な評価項目：無憎悪生存率。研究の１つの目標は、トポテカンとプラセボ群における約１２〜１８カ月から白金ベースの化学療法とヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体群における約１２〜２４カ月（又はそれ以上）までの無憎悪生存率の増加を実証することである。
評価することが可能な二次評価項目には、応答の持続時間、腫瘍進行までの時間、全生存、重篤及び非重篤有害事象が含まれる。例えば、治療が疾患の進行を妨げることがあり（すなわち、停滞）、又は好転をもたらすことがある。代わりに、又はさらに、以下の：腫瘍量の減少、血管分布の減少、副作用の減少、有害反応の減少及び／又は患者コンプライアンスの増加のうちの１又は複数に関して他の目標を測定することが可能である。
（例２３）
糖尿病性網膜症の治療のための抗エンドグリン抗体の使用
研究設計
施設関与の臨床的に重大な糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）の患者においてヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の複数硝子体内注射の生物学的活性を評価するために、及び関連するいかなる有害事象をも報告するために、単一施設、非盲検、用量漸増予備研究が開始される。２０／４０と２０／４００の間の研究眼における網膜黄斑の中心及び最高矯正視力（ＢＣＶＡ）を伴うＤＭＥの患者が登録される。
試験治療
好適な患者は、毎月投与されるヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体（各注射あたり約０．２５から２．５ｍｇ）の３回の硝子体内注射を受けるよう１対１の比で無作為に割り当てられ、観察は月２４まで続行される。主要エンドポイントは眼球及び全身有害事象の頻度及び重症度である。二次エンドポイントは、１）２ｍの開始試験距離で標準化された屈折及び試験プロトコールを使用する、早期治療糖尿病性網膜症研究（ＥＴＤＲＳ）チャートを用いて評価される最高補正視覚評価、並びに２）光干渉断層撮影による網膜厚の測定である。評価する医師は患者の試験治療割付を知らず、注射を施す医師はヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はシャム処置に関して患者の試験治療割付は知っているが、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の用量は知らない。各研究場所の他の職員（注射を手伝う職員を除く）、患者及び中央リーディング施設の職員は患者の試験治療割付を知らない。
有効性及び安全性解析
有効性解析は、欠失データに最終観察引き延ばし補完法（ｌａｓｔ−ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ−ｃａｒｒｉｅｄ−ｆｏｒｗａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ）を使用してすべての患者間で治療企図に基づいて実施される。すべてのペアワイズ比較では、統計的モデルは、視力に対するベースラインスコア（＜５５文字対≧５５文字）に合わせて調整される。二分エンドポイントについての群間比較は、コクランカイ二乗検定を使用して実施される。ベースライン視力からの変化は、分散分析モデルを使用して解析される。病変特徴についてのエンドポイントでは、ベースライン値に合わせて調整する分散分析モデルが使用される。ホッホバーグ−ボンフェローニ多重比較法を使用して、主要エンドポイントについて２つのペアワイズ治療比較を調整する。安全性解析には治療を受けた全患者が含まれる。
結論
ヒト化抗エンドグリン抗体は、ＤＭＥの患者には十分耐容性の療法になる。この予備実験は、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体療法が、施設関与の臨床的に重大なＤＭＥの患者において最高矯正視力を維持する又は改善し、網膜厚を減少する可能性を有することを実証している。
（例２４）
抗エンドグリン抗体及び加齢性黄斑変性の臨床試験
研究設計
合衆国の複数の場所で、加齢性黄斑変性に伴う脈絡膜血管新生の患者間でのヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の反復硝子体内注射の安全性及び有効性についての２年、前向き、無作為化、二重盲検、シャム対照研究に患者は登録される。主要有効性解析は１２カ月で実施される。主要有効性エンドポイントは、２ｍの開始試験距離で標準化された屈折及び試験プロトコールを使用して、早期治療糖尿病性網膜症研究（ＥＴＤＲＳ）チャートを用いて評価されるベースライン視力から１５文字未満（約３行）を失った患者の割合である。病変の適格性は、標準化された基準及び患者の治療割付を知らない訓練されたグレーダーを使用して、独立した中央リーディング施設により確かめられる。患者は、彼らの完全な適格性を決定する前に書面によるインフォームドコンセントを提出する。スクリーニングは、２８日間も続くことがある。
研究に含まれるためには、患者は少なくとも５０歳であり；２０／４０から２０／３２０の最高矯正視力を有し（ＥＴＤＲＳチャートを使用して決定されたスネレン等価視力）；中心窩に関連して、加齢性黄斑変性に伴う原発性又は再発性脈絡膜血管新生を有する；蛍光眼底撮影法及び眼底撮影法を使用して、最小限古典的又は古典的脈絡膜血管新生のない潜在的として評価されたことのあるような類の病変を有する；１２視神経乳頭面積の最大病変サイズ（１視神経径１．８ｍｍに基づいて１視神経乳頭面積は２．５４ｍｍ２に等しい）を有し、新血管形成が全病変の５０％又はそれ以上をなす；並びに観察可能な血液により証拠だてられる推定される疾患の最近の進行、最近の視力喪失又は病変最大線径の１０％若しくはそれ以上の最近の増加を有しなければならない。既存の心血管、脳血管又は末梢血管状態に関して除外基準は存在しない。
第一研究
５０から５００のＡＭＤ患者（５０から５００の眼球）が複数の場所で研究に参加することになる。適格患者は、１つの目で２年間（２４注射）毎月（２３日から３７日以内）約０．２５ｍｇから２．５ｍｇの用量のヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はシャム注射を受けるように１対１対１比で無作為に割り付けられる。評価する医師は患者の試験治療割付を知らず、注射を施す医師はヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はシャム処置に関する患者の試験治療割付は知っているが、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の用量は知らない。各研究場所の他の職員（注射を手伝う職員を除く）、患者及び中央リーディング施設の職員は患者の試験治療割付を知らない。研究眼における脈絡膜血管新生が優勢に古典的である場合は、介入療法（例えば、ベルテポルフィン光線力学的療法）が与えられる。
治療の第一ステップとして、患者は完全な眼科検査を受けて眼の健康のベースラインを確立することになる。眼科検査には、倒像眼底検査、細隙灯顕微鏡検査、周辺部網膜検査、眼内圧検査、視力（助力なし及び最高補正）症状学、眼底撮影、蛍光眼底撮影、光干渉断層撮影、網膜電図検査並びにＡスキャン検査が含まれる。
予備検査に続いて、上記の硝子体内注射は、ＡＭＤを示している患者の患眼に与えられる。両眼が冒されている場合には、別々に治療されうる。治療される眼には、点眼液を注入される。
処置後、患者の眼は、１日目（１）、２日目（２）、７日目（７）、１５日目（１５）、３０日目（３０）及び６０日目（６０）及びその後２年間毎月検査を受けることになる。再発の可能性があるために、患者はその後毎月定期検査のために戻ってくるほうがよい。各検査日に、患者は硝子体液化についてモニターされる。さらに、患者は、強膜圧迫法を用いる倒像眼底検査を使用して後部硝子体剥離についてモニターされる。最後に、患者が示すＡＭＤの程度は、定期的網膜検査、光干渉断層撮影及び蛍光血管造影を通じて絶えずモニターされて、網膜下液、血液、滲出液、ＲＰＥ剥離、嚢胞性網膜変化の存在又は灰色がかった緑色網膜下新生血管膜の存在についてモニターする。再発新血管形成の兆候が観察される場合は、追加の処置が必要になることがある。追加の処置は、週１回又は月１回与えられうる。好ましい実施形態では、最初の処置に続いて、１〜６カ月間離れてそれに続く処置が行われる。
有効性解析は、欠失データに最終観察引き延ばし補完法を使用してすべての患者間で治療企図に基づいて実施される。すべてのペアワイズ比較では、統計的モデルは、視力に対するベースラインスコア（＜５５文字対≧５５文字）及び脈絡膜血管新生のサブタイプ（最小限古典的対古典的疾患のない潜在的）に合わせて調整される。二分エンドポイントについての群間比較は、コクランカイ二乗検定を使用して実施される。ベースライン視力からの変化は、分散分析モデルを使用して解析される。病変特徴についてのエンドポイントでは、ベースライン値に合わせて調整する分散分析モデルが使用される。ホッホバーグ−ボンフェローニ多重比較法を使用して、主要エンドポイントについて２つのペアワイズ治療比較を調整する。安全性解析には治療を受けた全患者が含まれる。
第二研究
加齢性黄斑変性を示している患者は、新血管形成、黄斑疾患及び網膜障害の発生を減少する若しくは予防するために、第一研究（上記参照）の方法に従って、（１）ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体単独、（２）ラニビズマブ単独、（３）同じ組成で若しくは異なる組成で、ラニビズマブと組み合わせたヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体、又は（４）対照抗体の硝子体内注射を用いて治療される。
結論
ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体は、ＡＭＤの患者には十分耐容性の療法になる。この臨床試験は、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体療法が、ＡＭＤ患者において最高矯正視力を維持する又は改善し、脈絡膜血管新生を減少する可能性を有することを実証している。さらに、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体は、ラニビズマブと比べて優れた活性を示すことになり、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体とラニビズマブ療法を組み合わせれば、どちらかの抗体単独に対して活性が増加することを示すことになる。
（例２５）
カニクイザルにおける全身毒性
ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の全身毒性に取り組みための研究においてカニクイザルが利用される。
手短に言えば、サルは、１０．０ｍｇ／ｋｇ、３０．０ｍｇ／ｋｇ又は１００．０ｍｇ／ｋｇのヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体を３週間毎週投与される。プラセボ動物は、抗体の非存在の適切な溶液を用いて同じスケジュールで投与される。前記用量は３０から６０分かけて静脈内ボーラスとして投与され、少なくとも６匹の動物は各用量レベルで投与される。毒性は、以下の指標：体重測定、基本的生理学的臨床測定、シリアル血清化学、血液学的評価及び病理組織学的評価のうちの１又は複数を介して評価される。
（例２６）
カニクイザルにおけるベバシズマブとの組合せにおける全身毒性
ベバシズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））との組み合わせたヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の全身毒性に取り組みための研究においてカニクイザルが利用される。
手短に言えば、サルは、約１０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇのベバシズマブと組み合わせた１０．０ｍｇ／ｋｇ、３０．０ｍｇ／ｋｇ又は１００．０ｍｇ／ｋｇのヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体を３週間毎週投与される。他の動物は、ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又はベバシズマブどちらかを単独で受ける。プラセボ動物は、抗体の非存在の適切な溶液を用いて同じスケジュールで投与される。前記用量は３０から６０分かけて静脈内ボーラスとして投与され、少なくとも６匹の動物は各用量レベルで投与される。毒性は、以下の指標：体重測定、基本的生理学的臨床測定、シリアル血清化学、血液学的評価及び病理組織学的評価のうちの１又は複数を介して評価される。
（例２７）
カニクイザルにおける局所的毒性研究
ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の局所的毒性に取り組みための研究においてカニクイザルが利用される。
手短に言えば、サルは、０．２５、１．２５及び２．５ｍｇのヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体を６週間毎週硝子体内注射により投与される。プラセボ動物は、抗体の非存在の適切な溶液を用いて同じスケジュールで投与される。前記用量は硝子体内注射として投与され、少なくとも６匹の動物は各用量レベルで投与される。毒性は、以下の指標：体重測定、基本的生理学的臨床測定、シリアル血清化学、血液学的評価及び病理組織学的評価のうちの１又は複数を介して評価される。
組合せ局所的毒性研究
硝子体内注射により与えられた場合のラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））と組み合わせたヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体の毒性に取り組むための研究においてカニクイザルが利用される。
手短に言えば、サルは、０．２５、１．２５及び２．５ｍｇのヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体並びに０．５ｍｇのラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））を６週間毎週硝子体内注射により投与される。他の動物は、同じ用量及びスケジュールでいずれかの抗体を単独で受ける。プラセボ動物は、抗体の非存在の適切な溶液を用いて同じスケジュールで投与される。前記用量は硝子体内注射として投与され、少なくとも６匹の動物は各用量レベルで投与される。毒性は、以下の指標：体重測定、基本的生理学的臨床測定、シリアル血清化学、血液学的評価及び病理組織学的評価のうちの１又は複数を介して評価される。
（例２８）
出芽アッセイ
血管新生は出芽の三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて試験することが可能である。ＨＵＶＥＣは、臍帯から単離され、１０％牛胎仔血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及び内皮細胞増殖サプリメント（ＥＣＧＳ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を補充されたＭ１９９において３℃、５％ＣＯ２で増殖され、継代２から４のＨＵＶＥＣがすべての実験では使用される（継代０は初代培養物である）。肺線維芽細胞（ＬＦ）は１０％ＦＢＳを補充されたＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において３７℃、５％ＣＯ２で規定通りに増殖され、Ｐ１０とＰ１５の間で使用される。ＡＴＣＣから得られる他の線維芽細胞系も使用することが可能である。
細胞を調製する
ＨＵＶＥＣ及び線維芽細胞は、ビーディングの１から２日前にＭ１９９／１０％ＦＢＳ／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（１対１００）中で展開させる。ＨＵＶＥＣでは、ビーディングの前日に培地をＥＧＭ−２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に交換する。ビーディングには、ビーズあたり約４００ＨＵＶＥＣが必要である。線維芽細胞は、２４ウェルプレートではウェルあたり２０，０００細胞で使用される。９６ウェルプレートも、それに従って量をスケール変更して使用することが可能である。
Ｃｙｔｏｄｅｘ３ビーズ調製
例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアビーズをアッセイにおいて使用することが可能である（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。
乾燥ビーズ（０．５ｇ）は、５０ｍｌチューブ中室温（ＲＴ）で少なくとも３時間５０ｍｌ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で水和され膨潤され、ロッカーの上に置かれる。
ビーズは沈降させる（約１５分）。上清は破棄され、ビーズは新鮮なＰＢＳ（５０ｍｌ）中で数分間洗浄される。
洗浄ＰＢＳは破棄され、新鮮なＰＢＳで置き換えられる。
ビーズ懸濁液はシリコン処理されたガラス瓶（例えば、Ｗｉｎｄｓｈｉｅｌｄ Ｗｉｐｅｒ又はＳｉｇｍａｃｏｔｅ製）に入れられる。ビーズは１１５℃で１５分間加圧減菌することにより減菌され、次に４℃で保存される。
試薬
フィブリノーゲン溶液
フィブリノーゲン溶液は、３７℃水浴中ＤＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲンを溶解することにより作製される。次に、溶液はボルテックスするのではなくチューブを反転させて混合させる。凝固可能なタンパク質の割合を決定し、それに従って調整することが可能である。次に、溶液は０．２２μｍフィルターを通して無菌化する。
アプロチニン
凍結乾燥させたアプロチニンは、ＤＩ水中４Ｕ／ｍｌで再構成し、無菌濾過することが可能である。１ｍｌのアリコットはそれぞれ作製し、−２０℃で保存される。
トロンビン
トロンビンは、減菌水中５０Ｕ／ｍｌで再構成される。０．５ｍｌのアリコットが作製され、−２０℃で保存される。
ビーズをＨＵＶＥＣで被膜する（１日目）
ＨＵＶＥＣはトリプシン処理される。ビーズは沈降させ（遠心分離しない）、上清は吸引され、ビーズは１ｍｌの温かいＥＧＭ−２培養液中で手短に洗浄される。ビーズ（２５００）は、ＦＡＣＳチューブにおいて１．５ｍｌの温かいＥＧＭ−２培養液中で１×１０６ＨＵＶＥＣと混合され、インキュベーター中に垂直に置かれる。（約１０ウェルにはこれで十分である。必要であればスケールアップする）。
前記混合物は３７℃で４時間インキュベートされ、チューブは２０分ごとに反転させ混合する。（ビーディング後、ビーズは微小なゴルフボールのように見えるはずであり、それは出芽のための被膜が十分であることを示している）。
４時間後、被膜されたビーズはＴ２５組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移され、３７℃、５％ＣＯ２で５ｍｌのＥＧＭ−２培養液中一晩インキュベートされる。
被膜されたビーズをフィブリンゲルに包埋する（０日目）
２．０ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン溶液は上記の通りに調製され、０．１５ユニット／ｍｌのアプロチニンがフィブリノーゲン溶液に添加される。
被膜されたビーズは１５ｍＬの円錐管に移され、ビーズは沈降させる。
ビーズは１ｍｌのＥＧＭ−２培養液に再懸濁され、１．５ｍｌの遠心管に移される。ビーズは１ｍｌのＥＧＭ−２培養液を用いて３回洗浄され、Ｐ１０００ピペットを用いて上下にゆっくりピペッティングすることにより混合させる。ビーズはカバーガラス上で計数し、５００ビーズ／ｍｌの濃度でフィブリノーゲン溶液に再懸濁される。
トロンビン（０．６２５ユニット／ｍｌ）は、２４ウェルプレートの各ウェルに添加される。フィブリノーゲン／ビーズ懸濁液（０．５ｍｌ）は、ウェルごとにピペットチップを交換して各ウェルに添加される。
前記トロンビンと前記フィブリノーゲン／ビーズは、約４から５回上下にゆっくりとピペッティングすることにより混合させ、フィブリンゲル中に泡ができるのを避ける。対照試料は抗体又は１若しくは複数の対照抗体の非存在下で処置される。試験試料は、抗エンドグリン抗体単独、抗ＶＥＧＦ抗体単独、又はその組み合わせを用いて処置される。複数の濃度の作用物質を試験することが可能である。フィブリノーゲン／ビーズ溶液は室温で５分間、次に３７℃／５％ＣＯ２で１５分間凝固させる。出芽を減少することがあるので、フィブリンを剪断するのを最小限に抑えるために最初の５分間はプレートを乱さないことが重要である。
ＥＧＭ−２（１ｍＬ）は、液滴の形で各ウェルに添加される。肺線維芽細胞は、２０，０００細胞／ウェルの濃度で前記血塊の上に播種される。所望の増殖が達成されるまで隔日で培養液を新鮮なＥＧＭ−２培養液と交換する。
フィブリンゲルが形成されると、ゲル中に微小泡が存在することがある。この微小泡は３から４日で消滅する。出芽は２日目と４日目の間で明らかになるはずである。管腔形成が４日目から５日目あたりで始まり、芽は伸長し続ける。新たに形成された管は４日目から６日目あたりで分枝し始める。６日目から７日目までに、微小血管様構造物が隣接する管と吻合し始め、ウェルあたりのビーズの数を増やすと吻合はそれだけ早くなる。出芽距離は標準法により測定される。
（例２９）
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血管新生出芽の免疫細胞化学
内皮細胞（ＥＣ）核染色では、フィブリンゲルは１×ＰＢＳで２回洗浄され、次に、２％パラホルムアルデヒド中で一晩固定される。１×ＰＢＳでさらに２回洗浄後、次に、ゲルは、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて染色される。
免疫染色では、肺線維芽細胞（ＬＦ）は、先ず１０×トリプシンを用いたゲルの手短な処置を通して取り除かれる。消化は、線維芽細胞がすべて取り除かれるとすぐに血清を用いて停止される。次に、ゲルはＨＢＳＳ、１×（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）を用いて広範に洗浄される。次に、培養物は１０％ホルマリン中で１０分間固定され、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて５分間透過処理される。非特異的結合は、ＰＢＳ中５％ＢＳＡの溶液を用いて２時間ブロックされる。
一次抗体は、ブロッキング緩衝液中１／１００希釈で使用され、４℃で一晩インキュベートされる。広範な洗浄後、結合している抗体は、１／１０００希釈の種特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８−コンジュゲートされた又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８−コンジュゲートされた二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により検出される。アイソタイプ特異的非結合抗体は対照として使用される。高バックグラウンドが生じた場合、一次又は二次抗体の濃度は下げることが可能であり、必要であれば、インキュベーション及び／又は洗浄時間を増やすことが可能である。Ｆ−アクチンは、０．２μＭの濃度のＴＲＩＴＣ−ファロイジン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて染色される。
位相差及び蛍光画像は、デジタルカメラと連結したＩＸ７０ Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡上で捕捉される。蛍光Ｚシリーズ画像スタックは、２光子Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ ＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ顕微鏡上で捕捉され、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを用いて三次元レンダリングに編集される（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ ＰＡ）。このように、様々なマーカーの発現は容易に検出することが可能である。
培養物のｚ軸方向の蛍光光学画像スタックを捕捉して、血管の３Ｄ表示を作製することが可能である。核はＤＡＰＩ（緑色）により染色され、血管壁はビメンチン（オレンジ色）に染色される。広い中空管腔が、内皮細胞の単一層に取り囲まれてはっきりと見える。これらの画像により、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ中に存在する管腔が細胞間スリットであり、マトリゲルアッセイにおいて見られることが多い細胞内スリットではないことが確証される。さらに、ＨＵＶＥＣは、管腔に向かい合っている頂端膜並びにコラーゲンＩＶリッチ基底膜及びフィブリンゲルに並置している基底膜を有しているので、分極していることを確証することが可能である。
（例３０）
カニクイザルにおける脈絡膜血管新生の抑制
レーザー誘導脈絡膜血管新生に対する本明細書に記載される組成物の効果が、成獣カニクイザルにおいて評価される。
この実験では、（１）ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体単独、（２）抗ＶＥＧＦ抗体単独、（３）同じ組成若しくは異なる組成で抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせたヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又は（４）対照抗体が、静脈内若しくは硝子体内注射により投与される。各動物は各網膜に９から１０のレーザー火傷を受け、活発な脈絡膜血管新生病変の成長が、処置の開始前に一度及びレーザー処置の１５、２０及び２９日後に蛍光眼底撮影により評価される。組成物は、レーザー損傷の１週間前に始まって、週あたり１回静脈内に投与される。硝子体内注射は、レーザーの１週間前に始まって２週間ごとに１回、又はレーザーに続く２週間に１回行われ、その時点で活発なＣＮＶ病変は既に形成されている。対照動物は、レーザーの１週間前に始まって、プラセボの毎週の静脈内又は隔週の硝子体内注射を受ける。
ＣＮＶ病変は、蛍光眼底撮影により可視化され、標準法に従って類別される。
（例３１）
損傷誘導角膜血管新生の阻害
角膜血管新生は、３ナイロン縫合糸の基質内配置により、又は角膜上皮の化学的損傷（ＮａＯＨ）及び機械的デブリドマンにより、オスＣ５７ＢＬ／６マウスに誘導される。（１）ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体単独、（２）抗ＶＥＧＦ抗体単独、（３）同じ組成若しくは異なる組成で抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせたヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体又は（４）対照抗体が、損傷直前又は直後に１回又は複数の時点で腹腔内に投与される複数の実験が行われる。
角膜新生血管の成長は、細隙灯顕微鏡検査及び組織学的評価により評価される。脈管構造は内皮細胞特異的蛍光コンジュゲートレクチンで標識され、新血管形成は、ＰＥＣＡＭ免疫組織化学を使用して角膜フラットマウントの他にも断面において評価される。細隙灯顕微鏡検査を使用して角膜浮腫の存在が評価され、角膜厚みは断面において測定され、角膜の厚みの増加は浮腫の量を反映する。多核白血球（ＰＭＮ）及びマクロファージの数は、それぞれ断面をＨＥＭＡ−３又はラット抗マウスＦ４／８０モノクローナル抗体で染色することにより決定される。
（例３２）
ヒト化抗エンドグリン抗体におけるＴ細胞エピトープの同定
ヒト化可変領域の配列が、ｉＴｏｐｅ（商標）解析により試験された。ヒト化可変領域配列は重複する９〜１５ｍｅｒペプチドに分割された。可変領域配列は、コンピュータ分析によるＭＨＣクラスＩＩに対するペプチドのアフィニティーを決定するｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析ツールであるｉＴｏｐｅ（商標）を使用してヒトＭＨＣクラスＩＩ（潜在的Ｔ細胞エピトープ）への乱雑な高アフィニティー結合について解析された。ｉＴｏｐｅ（商標）解析からの潜在的Ｔ細胞エピトープの頻度が最も低い配列は、ヒト化抗体の作製のためのリードとして同定される。選択されたヒト化可変領域配列は、潜在的Ｔ細胞エピトープを取り除くために変異の包含を通じて再設計されうる。変異は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減少する又は除去するためにｉＴｏｐｅ（商標）を使用して設計される。代わりに、生殖系列ヒト配列は、潜在的Ｔ細胞エピトープの部位で置換することが可能であり、又は代わりの配列が置換されうる。
図１９〜２３は、図４に記述される軽鎖ＨｕＶＫ＿ｖ０と重鎖ＨｕＶＨ＿ｖ０を含有するヒト化抗エンドグリン抗体について９ｍｅｒペプチドの予想される結合を表している。
（例３３）
抗ＣＤ１０５ヒト化／脱免疫化抗体の設計
本例は、減少した免疫原性を示すヒトＣＤ１０５を標的にする治療モノクローナルヒト化脱免疫化抗体の設計を説明する。
ｉＴｏｐｅ（商標）を使用して同定された乱雑な高アフィニティーＭＨＣクラスＩＩ結合配列（例３１参照）は、ペプチドのＭＨＣクラスＩＩへの結合を減少する又は除去すると考えられるキーとなるＭＨＣクラスＩＩポケット位置でのアミノ酸置換を同定するためにｉＴｏｐｅ（商標）によりさらに解析された。すべての配列がＣＤＲに重なっていたために、変化（潜在的抗原接触残基）のＣＤＲ位置並びに元の及び置換アミノ酸の物理化学的特徴も検討された。ＴＣＲ接触並びにペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ−ＴＣＲ相互作用の安定化に関与する主要結合グルーブの外側の残基も置換について検討された。
ＶＨＶ１では、完全にＣＤＲ内部にあり残基５１で開始する９−ｍｅｒペプチドは、乱雑な高アフィニティーＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドとして同定された。ＭＨＣクラスＩＩ結合の除去の最も成功した方法は、疎水性側鎖を除去する又は親水性側鎖で置換するとＭＨＣクラスＩＩ結合が取り除かれる９−ｍｅｒの最初のアミノ酸（ポケット１又はｐ１位）を標的にすることである。しかし、この種の根本的なアミノ酸置換は抗体アフィニティーを保持するのに必ずしも成功しないことがあり、したがって、二次ポケット位置（ｐ４、ｐ６、ｐ７又はｐ９）も、単独で又は組み合わせて評価された。ｉＴｏｐｅ（商標）解析により、Ｋ５２ｂをＱ又はＲに変えることによりこのペプチドのｐ４位を標的にすると、ＭＨＣクラスＩＩ結合が著しく減少すると予想され、ｐ１でＩ５１をＡで置き換えると結合を完全に取り除くと予想されることが明らかになった（表５）。
抗体／抗原複合体の結晶構造は、Ｉ５１は抗原とまれに接触しうるが、この位置でのＩからＡへの根本的変化（ｐ１アンカー位を破壊するための置換）はＣＤＲの全体的立体構造に影響を与える可能性があることを示唆している。したがって、この残基が溶媒曝露であり抗原と接触しないことがあるために、Ｋ５２ｂ（ｐ４アンカー位）での比較的保存された変化も含まれた。最後に、ＣＤＲの外側にある追加の変異も、ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ／ＴＣＲ相互作用に対する不安定化効果を評価するために設計された（Ｇ４９からＡ又はＳ）。表６は、構築されたヒト化及びヒト化／脱免疫化バリアントＶＨ領域を収載している。対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列の配列番号は、構築物の隣に示されている。
２つの乱雑な高アフィニティーＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドがＶＫＶ２及びＶＫＶ１において同定された。第一のＶ１９にｐ１アンカーを有するペプチドはＣＤＲ１に部分的に重なっており、第二のＩ４８にｐ１アンカーを有するペプチドはＣＤＲ２に重なっている。両ｐ１アンカーはＣＤＲの外側にあり、Ａへの変異によって標的にされており、この変異はＭＨＣクラスＩＩ結合を完全に取り除きうる（表７）。しかし、これらの残基は両方ともＣＤＲ１及び２の立体構造の維持に関与している可能性があり、したがって、ＭＨＣクラスＩＩ結合を著しく減少させる追加の変異が設計された（表７）。どちらの場合も、ｐ４残基は、ＴのＳへの変異により標的にされた。Ｔ２２ＳもＣＤＲの外側にあり、Ｖ１９ＡよりもＣＤＲ立体構造に影響を与える可能性は少ない。Ｔ５１はＣＤＲ２の内側にあるが、抗原と複合体化している抗体の結晶構造からの証拠によれば、この残基は抗原とはめったに接触しないことが示唆される。表６は、構築されたヒト化及びヒト化／脱免疫化ＶＫ領域を収載している。
（例３４）
この例は、Ｔ細胞エピトープを求めて抗エンドグリン抗体をスクリーニングする方法を説明している。ＭＨＣ、ポリペプチド及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）間の相互作用は、Ｔ細胞認識の抗原特異性に構造基盤を与える。Ｔ細胞増殖アッセイは、抗体からプロセッシングされるポリペプチドのＭＨＣへの結合及びＴＣＲによるＭＨＣ／ポリペプチド複合体の認識を試験する。本例のｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞増殖アッセイでは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞を含有する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を刺激する。刺激は、無傷の抗エンドグリン抗体を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。刺激されたＴ細胞増殖は３Ｈチミジン（３Ｈ−Ｔｈｙ）を使用して測定され、取り込まれた３Ｈ−Ｔｈｙの存在は洗浄され固定された細胞のシンチレーション測定を使用して評価される。
ヒト化及びヒト化／脱免疫化ＶＨ及びＶＫ領域遺伝子のすべては、アニールされ、ライゲートされ、ＰＣＲ増幅されて完全長合成Ｖ領域を与える一連の重複するオリゴヌクレオチドを使用して合成された。次に、組み立てられたバリアントは、ＩｇＧ重鎖及びカッパ軽鎖のためのＡｎｔｉｔｏｐｅ社のｐＡＮＴ発現ベクターシステムに直接クローニングされた。
抗体の精製
抗エンドグリン抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーにより、哺乳動物培養物の上清から精製された。緩衝液交換及びタンパク質濃度は、ＰＢＳ ｐＨ＝７．４を使用して行われた。抗エンドグリン抗体は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＡＭｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製された。主要ピークは収集され、フィルター減菌され、Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｍａｒｇａｔｅ、ＵＫ）を使用して内毒素レベル＜５ＥＵ／ｍｇを有することが明らかにされた。精製された抗体は４℃で保存される。最終濃度は、計算されたモル吸光係数を使用してＵＶ吸収により決定され、Ａ２８０ １．０＝１．６２ｍｇ／ｍＬであった。次に、各抗体はＡＩＭＶ培養液で１００μｇ／ｍＬまで希釈された。
ドナーＰＢＭＣの調製及び選択
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ病院地域研究倫理委員会により与えられた認可に従って英国国立輸血サービス（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋ病院、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から得られる健康なコミュニティードナーバフィーコート（２４時間以内の採血由来）から単離される。ＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）密度遠心分離によりバフィーコートから単離され、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ８＋ＲｏｓｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して枯渇される。ドナーは、Ｂｉｏｔｅｓｔ ＨＬＡ ＳＳＰ−ＰＣＲベースの組織分類キット（Ｂｉｏｔｅｓｔ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒｓｔｒａβｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用してＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを同定することにより特徴付けられる。対照抗原のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に対するＴ細胞応答が、陽性対照について判定される。次に、ＰＢＭＣは凍結され必要となるまで液体窒素中で保存された。使用するのに必要になると、細胞は３７℃の水浴中で急速に解凍され、その後１０ｍｌの予め温められたＡＩＭ Ｖ培地に移される。
世界人口に現れるＨＬＡ−ＤＲアロタイプの数及び頻度を最もよく代表する２０ドナーのコホートが選択される。世界人口に現れるアロタイプに対するコホートに現れるアロタイプの解析により、＞８０％のカバレッジが達成されており、主要ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子はすべて（＞５％の頻度で世界人口に現れる個々のアロタイプ）が十分代表されていることが明らかにされた。ドナーハプロタイプの要約は図２３に与えられており、本研究で使用されるドナーアロタイプ対世界人口に存在するアロタイプの頻度の比較が行われる。
各ドナー由来のＰＢＭＣは解凍され、計数され、生存率評価される。細胞は生き返らせ、４〜６×１０６ＰＢＭＣ／ｍＬまでＡＩＭＶ培養液に再懸濁させた。ドナーごとに、合計で１ｍＬ増殖細胞保存液が２４ウェルプレートに添加されるバルク培養液が確立された。合計で１ｍＬの各希釈試験試料は、抗体試料あたり５０μｇ／ｍＬの最終濃度になるまでＰＢＭＣに添加された。ドナーごとに、陽性対照（１００μｇ／ｍＬ ＫＬＨと一緒にインキュベートされた細胞）及び陰性対照（培養液のみと一緒にインキュベートされた細胞）も含まれた。最初の４ドナーでは、試験試料によるＴ細胞応答の調節について試験するために追加の対照が含まれ、ここでは試験試料及びＫＬＨがＰＢＭＣに添加された。これらの試料とＫＬＨ単独との比較を使用して、増殖に対する試験試料の効果を評価することが可能である。培養物は、３７℃で合計８日間５％ＣＯ２と一緒にインキュベートされた。５、６、７及び８日目、各ウェル中の細胞はゆっくりと再懸濁され、３つの１００μＬアリコットは丸底９６ウェルプレートの個別のウェルに移される。培養物は１００μＬ ＡＩＭＶ培養液中１μＣｉ３［Ｈ］−Ｔｈｙ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と一緒にパルスされ、さらに１８時間インキュベートされて、その後ＴｏｍＴｅｃ ＭａｃｈＩＩＩ細胞収穫器を使用してフィルターマット上に収穫される。ウェルごとの分あたり計数（ｃｐｍ）は、パラルクス低バックグラウンド計数モードのＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｂｅｔａ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）上での、Ｍｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）シンチレーション計数により決定される。
結果は、刺激指数として表され、刺激指数（ＳＩ）は、試験抗エンドグリン抗体に合わせて測定された増殖スコア（例えば、分あたりの放射能のカウント）を、試験抗エンドグリン抗体を接触させなかった細胞で測定されたスコアで割ることにより導かれる。対照ウェルの全基本ｃｐｍは、１５０ｃｐｍのアッセイの最小閾値より上である。
増殖アッセイでは、２に等しい又はよりも大きい刺激指数（ＳＩ）（ＳＩ≧２）の経験的閾値は既に確立されており、それによりこの閾値より上の増殖応答を誘導する試料は陽性と見なされる（ここでは、ボーダーラインＳＩ≧１．９０は強調されている、が含まれている）。広範なアッセイ開発及び既往研究により、これは多数の偽陽性応答を検出せずに最大感度を可能にするノイズ閾値の最小シグナルであることが明らかにされている。陽性応答は、以下の統計的経験的閾値により定義される。
１．不対２試料スチューデントｔ−検定を使用してメディアム対照ウェルに対して試験ウェルのｃｐｍを比較することによる応答の有意性（ｐ＜０．０５）。
２．２より大きな刺激指数（ＳＩ≧２）、ＳＩ＝試験ウェルの平均（ｃｐｍ）／平均メディア対照ウェル（ｃｐｍ）。
さらに、アッセイ内変動は、同型培養物からの生データの変異係数及び標準偏差（ＳＤ）を計算することにより評価される。
抗エンドグリン抗体を用いるＥｐｉＳｃｒｅｅｎ時間経過増殖アッセイの結果は図２４に示されており、表形式で要約されている（表８）。キメラ抗体は２０ドナーのうちの４ドナー（研究コホートの２０％）において応答を刺激し、ドナー応答のうちの２つはボーダーラインであったが（ドナー１１及び１７でそれぞれ１．９２及び１．９５）、バックグラウンドとは有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。ヒト化抗体ＶＫ１ＶＨ１は、バックグラウンドとは有意に異なっている（ｐ＜０．０５）１つのボーダーライン応答（ドナー２０で１．９１）を含む２０ドナーのうちの２ドナー（研究コホートの１０％）において応答を刺激した。ドナー１１及び２０がこれらの抗体の両方に応答し、共有されたＴ細胞エピトープが存在しうることを示唆していることは注目に値する。これとは対照的に、研究コホート中のドナーは一人も脱免疫化抗エンドグリン抗体ＶＫ１ＡＡＶＨ１Ａ２に陽性応答しなかった。対照抗原ＫＬＨを用いた結果は、陽性結果と陰性結果の間には良好な相関関係が存在していたことを明らかにしており、アッセイにおける高レベルの再現性を示している。
（例３５）
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピング
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）は、全抗体におけるＴ細胞エピトープの測定のための又は下により詳細に記載されているようなＴ細胞エピトープの配列位置をマッピングするためのｅｘ ｖｉｖｏ技術である。
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎドナー選択
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ病院地域研究倫理委員会により与えられた認可に従って英国国立輸血サービス（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋ病院、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から得られる健康なコミュニティードナーバフィーコート（２４時間以内の採血由来）から単離される。ＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）密度遠心分離によりバフィーコートから単離され、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ８＋ＲｏｓｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して枯渇される。ドナーは、Ｂｉｏｔｅｓｔ ＨＬＡ ＳＳＰ−ＰＣＲベースの組織分類キット（Ｂｉｏｔｅｓｔ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒｓｔｒａβｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用してＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを同定することにより特徴付けられる。対照抗原、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）に対するＴ細胞応答も陽性対照について判定される。世界人口に現れるＨＬＡ−ＤＲアロタイプの数及び頻度を最もよく代表する５４ドナーのコホートが選択される。世界人口に現れるアロタイプに対するコホートに現れるアロタイプの解析により、＞８０％のカバレッジが達成されており、主要ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子はすべて（＞５％の頻度で世界人口に現れる個々のアロタイプ）が十分代表されていることが明らかにされた。ドナーハプロタイプの要約が提供されており、本研究で使用されるドナーアロタイプ対世界人口に存在するアロタイプの頻度の比較が行われる。
ドナー詳細及びハプロタイプ。ＫＬＨに対するドナー応答（ＳＩ）は２つの独立した実験において試験される。試験１は新たに単離されたＰＢＭＣで実施され、抗体は現試験では再試験である。両方の試験において同じ結果（すなわち、陽性又は陰性）を生まない応答は強調されている。基礎ｃｐｍが非常に低い（＜１５０ｃｐｍ）ドナーは解析から除外される。
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ解析：増殖アッセイ
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）を使用して、キメラ、ヒト化及びヒト化／脱免疫化抗体の配列由来の重複ペプチドを試験する。重複ペプチドは設計される。１２アミノ酸重なっている一連の１２８×１５ｍｅｒペプチドは、１×１４ｍｅｒ及び１×１１ｍｅｒと一緒に合成され、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングを使用して５１人の健康なドナーのコホート由来の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を刺激するのに使用される。個々のペプチドは同型培養物において試験され、応答はＴ細胞増殖アッセイを使用して評価され、エピトープの正確な位置を同定する。各ドナー由来のＰＢＭＣは解凍され、計数され、生存率について評価される。細胞は室温のＡＩＭ Ｖ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で生き返らせ、その後細胞密度を２．５×１０６ＰＢＭＣ／ｍｌ（増殖細胞保存液）に調整する。ペプチドは最終濃度１０ｍＭまでＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）中に溶解させる。次に、ペプチド培養保存液は、最終濃度５μＭまでＡＩＭ Ｖ培養液に希釈することにより調製される。ペプチドごとに及びドナーごとに、平底９６ウェルプレートにおいて１００μｌのペプチド培養保存液を１００μｌの増殖細胞保存液に添加することにより、６通りの培養物が確立される。陽性対照培養物も陰性対照培養物も６通りに確立する。ドナーごとに合計で９×９６ウェルプレートが使用され、各プレートで１つの陰性対照（担体のみ）を用いて１５ペプチドを６通りに試験するのに十分である。最後のプレート上では、陽性対照が添加される。
培養物は合計で６日間インキュベートされ、その後０．５μＣｉ３［Ｈ］−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）が各ウェルに添加される。培養物はさらに１８時間インキュベートされ、その後ＴｏｍＴｅｃ ＭａｃｈＩＩＩ細胞収穫器を使用してフィルターマット上に収穫される。ウェルごとの分あたりの計数（ｃｐｍ）は、パラルクス低バックグラウンド計数モードのＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｂｅｔａ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）上での、Ｍｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）シンチレーション計数により決定される。
増殖アッセイでは、２に等しい又はよりも大きい刺激指数（ＳＩ）（ＳＩ≧２）の経験的閾値は既に確立されており、それによりこの閾値より上の増殖応答を誘導する試料は陽性と見なされる（ここでは、ボーダーラインＳＩ≧１．９０は強調されている、が含まれている）。広範なアッセイ開発及び既往研究により、これは多数の偽陽性応答を検出せずに最大感度を可能にするノイズ閾値の最小シグナルであることが明らかにされている。陽性応答は、以下の統計的経験的閾値により定義される。
１．不対２試料スチューデントｔ−検定を使用してメディアム対照ウェルに対する試験ウェルのｃｐｍを比較することによる応答の有意性（ｐ＜０．０５）。
２．２より大きな刺激指数（ＳＩ≧２）、ＳＩ＝試験ウェルの平均（ｃｐｍ）／平均メディア対照ウェル（ｃｐｍ）。
さらに、アッセイ内変動は、同型培養物からの生データの変異係数及び標準偏差（ＳＤ）を計算することにより評価される。
増殖アッセイは６通りの培養物において開始される（「調整されていないデータ」）。アッセイ内可変性が低いことを確かめるために、データは最大及び最小ｃｐｍ値（「調整されたデータ」）を除いた後も解析され、ドナー応答のＳＩは両方のデータセットを使用して比較される。調整されたデータセットと非調整データセット両方由来のドナーＳＩの詳細が作成される。Ｔ細胞エピトープは、本研究におけるすべてのペプチドに対する応答の平均頻度＋２×ＳＤ（バックグラウンド応答速度）を計算することにより同定される。この閾値より上の増殖を誘導するどんなペプチド（単数又は複数）もＴ細胞エピトープを含有すると見なされる。
ペプチドのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｉＴｏｐｅ（商標）解析
増殖アッセイで陽性であるペプチドの配列は、Ａｎｔｉｔｏｐｅ社の予測ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアを使用して解析される。このソフトウェアは、ペプチドのアミノ酸側鎖とＭＨＣクラスＩＩ結合グルーブ内の特異的結合ポケット間の有利な相互作用を予測する。キーとなる結合残基の位置は、１つのアミノ酸が重なり長いペプチド配列にまたがる１０ｍｅｒペプチドを作製することにより決定される。各１０ｍｅｒは、ＭＨＣクラスＩＩアロタイプのＡｎｔｉｔｏｐｅ社のデータベースに対して試験され、ＭＨＣクラスＩＩ分子とのそのフィット及び相互作用に基づいてスコア化される。多数の対立遺伝子に対して高結合スコアを生じたペプチドはコア９ｍｅｒを含有すると見なされる。
Ｔ細胞エピトープの同定
上記のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）解析を使用して同定されるペプチドはすべて、５１人の健康なドナーに対して試験するために首尾よく合成される（５４人のドナーが最初に選択される；ドナーは、低基礎ｃｐｍ、すなわち、１５０ｃｐｍのカットオフ値よりも下であるために解析から除外されうる）。陽性応答は任意のペプチドに対してＳＩ≧２の有意な（ｐ＜０．０５）応答を生じたドナーにより定義される。ボーダーライン応答（ＳＩ≧１．９０の有意な（ｐ＜０．０５）応答）も含まれる。非調整及び調整されたデータ解析からの出力は、アッセイ内可変性が低いこと及び陽性応答は個々のウェルの偽増殖の結果ではないことを確かめるために比較される。各解析からの結果は方法間でほとんど差を示さず、したがって、Ｔ細胞エピトープマップは調整されたデータ解析を使用して編集される。非調整と調整された解析の両方からのドナー刺激指数が作成される。Ｔ細胞エピトープは、本研究におけるすべてのペプチドに対する応答の平均頻度及び標準偏差の２倍（「バックグラウンド応答速度」と呼ばれる）を計算することにより同定される。これは５．６％であると計算され、３人又はそれ以上のドナーにおいて陽性応答を誘導する等価物である。この閾値より上の増殖応答を誘導するペプチドは、Ｔ細胞エピトープを含有すると見なされる。
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）を使用するリードバリアントの免疫原性試験
リードバリアントは精製され、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）時間経過Ｔ細胞アッセイを使用して野生型ポリペプチドに対して比較される。ＨＬＡアロタイプの発現に従って世界人口を代表する多数の健康なドナーは、上記の通りにドナーライブラリーから選択される。ドナーは、２〜４×１０６ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣを含有する別々のバルク培養物において各タンパク質を用いて刺激される。同型培養物（Ｔ芽球の）は５〜８日目にバルク培養物から取り除かれ、ＩＬ−２分泌（ＥＬＩＳＰＯＴ）と一緒の増殖が評価される。野生型とバリアント間の評価をさらに検証するために、研究コホートは、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピング研究由来の応答ドナーを補充される（提供された十分な数のＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣが残っている）。
リードバリアントにおける免疫原性の消失を確認するために、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）時間経過Ｔ細胞アッセイによるＴ細胞免疫原性の解析が以下の通りに着手される。
（ｉ）健康なドナー由来のバフィーコート（世界人口に対して＞８０％ＤＲＢＩアロタイプカバレッジを有する）を使用して、生理学的レベルのＡＰＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣを単離する；
（ｉｉ）各ドナーは、キーホールリンペットヘモシアニン（強力なネオ抗原）を含む陽性対照抗原に対して試験される；
（ｉｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞応答の検出を排除するために枯渇される；
（ｉｖ）リードバリアント及び野生型ポリペプチドは、Ｔ細胞ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する相対的能力を評価するために互いに対して比較される；
（ｖ）データは、統計的及び頻度解析を含む追加の情報により支持されるＳＩ＞２の陽性応答を有する既に確認されたアッセイパラメータを使用して解析される；
（ｖｉ）ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）時間経過Ｔ細胞アッセイからのデータは、個々の分子に対するＴ細胞応答の大きさ及び速度論に関する情報を提供する；
（ｖｉｉ）陽性応答を生じるドナー由来のどんな残っているＰＢＭＣも記録され、繰返し試験研究において使用するために利用可能である；
（ｖｉｉｉ）ドナーアロタイプと野生型ポリペプチドに対する応答及びバリアントリードに対する任意の応答間の関連について評価が行われる。
本発明の態様は、その精神又は本質的特徴から逸脱することなく、他の形で具体化される又は他の方法で実施されうる。したがって、本開示は、すべての態様において例示的であり限定的ではないと見なされるべきであり、等価である意味及び範囲内に入る変化はすべてその中に包含されることが意図されている。
（例３６）
抗エンドグリン抗体の交差反応性
抗エンドグリン抗体は、ヒト及びマウス由来の内皮細胞と交差反応性であることが実証されている（Ｍａｔｓｕｎｏら、１９９９）。ヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体は、Ｈａｒｕｔａら、１９８６の方法に従って放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）により、ヒト及びマウス内皮に結合するその能力について試験される。手短に言えば、精製された抗エンドグリン抗体は、Ｉｎｄｏ−Ｇｅｎを使用し、当業者に公知の標準法に従って１２５Ｉで個別に放射標識される。放射標識されたヒト化／脱免疫化抗エンドグリン抗体は、ＩｇＧ分子あたりのヨード原子の平均数についてアッセイされる。分あたりの計数は、ヒト及びマウス内皮細胞の培養物上で抗エンドグリン抗体又はアイソタイプ適合対照ＩｇＧを試験することにより比較される。サブコンフルエントマウス及びヒト内皮細胞への結合も、Ｍａｔｓｕｎｏら、１９９９の方法に従ってＦＩＴＣ標識抗エンドグリン抗体を使用して実証され、平均蛍光強度を比較するＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎにより分析もされうる。マウス内皮への結合も、同系腫瘍を坦持するマウスにおいて放射標識された抗エンドグリン抗体の体内分布を画像化することにより実証しうる。手短に言えば、免疫適格性マウスは、同系４Ｔ１乳癌を移植させる。腫瘍は触知可能なサイズにまで増殖させ、動物は、６４Ｃｕなどの放射性同位体にキレート化させた抗体を用いて処置される。オートラジオグラフィー又はＰＥＴスキャニングによる腫瘍坦持ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける標識された抗エンドグリン抗体の分布は、類似の標識されたアイソタイプ対照抗体の分布と比較される。標識された抗体の腫瘍取込みは固形臓器及び血液中の取込みに関連することが報告されている。

Claims (16)

  1. アミノ酸配列が配列番号８９として示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列が配列番号９３として示される軽鎖可変領域とを含む抗体又はその抗原結合断片。
  2. Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、又は単鎖結合ポリペプチドである、請求項１に記載の抗原結合断片。
  3. 請求項１に記載の抗体又は抗原結合断片と、許容される担体又は賦形剤とを含む組成物。
  4. 請求項１に記載の抗体又は抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  5. 治療用標識、診断用標識、又はこれらの両方によりさらに標識されている、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  6. 血管新生関連疾患の治療用医薬製造における、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。
  7. 前記抗体又はその抗原結合断片が、治療用標識、診断用標識、又はこれらの両方により標識されている、請求項６に記載の使用。
  8. 血管新生関連疾患が、血管新生／新血管形成、糖尿病性腎障害、ＩＢＤ、関節リウマチ、骨関節炎、がん、又は転移を特徴とする眼疾患である、請求項６に記載の使用。
  9. 眼疾患が、黄斑変性である、請求項８に記載の使用。
  10. 眼疾患が、糖尿病性網膜症である、請求項８に記載の使用。
  11. がんが、充実性腫瘍である、請求項８に記載の使用。
  12. がんが、上皮ベースの腫瘍である、請求項８に記載の使用。
  13. がんが、肺がん、婦人科悪性腫瘍、黒色腫、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、結腸直腸がん、前立腺がん、腎がん、頭部がん、膵臓がん、肝がん（肝細胞がん）、子宮がん、頚部がん、腎がん（腎細胞がん）、肉腫、骨髄腫、及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項８に記載の使用。
  14. 医薬が１又は複数の血管新生阻害剤をさらに含む、請求項６に記載の使用。
  15. 血管新生阻害剤が、化学療法、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、又はこれらの組合せである、請求項１４に記載の使用。
  16. 医薬が、前記抗体又はその抗原結合断片が０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、又は２００ｍｇ／ｋｇの量で投与されるために製造される、請求項６に記載の使用。
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