EA025174B1 - Антитела против эндоглина - Google Patents

Антитела против эндоглина Download PDF

Info

Publication number
EA025174B1
EA025174B1 EA201290173A EA201290173A EA025174B1 EA 025174 B1 EA025174 B1 EA 025174B1 EA 201290173 A EA201290173 A EA 201290173A EA 201290173 A EA201290173 A EA 201290173A EA 025174 B1 EA025174 B1 EA 025174B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
amino acid
antigen
antibodies
variable region
Prior art date
Application number
EA201290173A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201290173A1 (ru
Inventor
Чарльз Теуэр
Максимилиано Васкес
Original Assignee
Тракон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Тракон Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Тракон Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA201290173A1 publication Critical patent/EA201290173A1/ru
Publication of EA025174B1 publication Critical patent/EA025174B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/282—Platinum compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/4045—Indole-alkylamines; Amides thereof, e.g. serotonin, melatonin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/69—Boron compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology
    • G01N2800/164—Retinal disorders, e.g. retinopathy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают эндоглин. Один из аспектов изобретения относится к композиции для лечения связанного с ангиогенезом заболевания, содержащей эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению. Другой аспект относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению. Другой аспект относится к способу лечения связанного с ангиогенезом заболевания, включающему введение композиции по изобретению.

Description

Согласно данному изобретению предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 89, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 93.
Также согласно данному изобретению предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 89, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 93, где указанная вариабельная область тяжелой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены глицина (С) на аланин (А) или серин (§) в положении 49; замены аланина (А) на изолейцин (I) в положении 51; замены лизина (К) на аргинин (К) или аспарагин (О) в положении 52Ь; замены лейцина (Ь) на валин (V) в положении 78 согласно системе нумерации по КаЬа1; и вариабельная область легкой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены метионина (М) на лейцин (Ь) в положении 4; замены аланина (А) на валин (V) в положении 19; замены треонина (Т) на серин (§) в положении 22; замены аланина (А) на изолейцин (I) в положении 48; и замены треонина (Т) на серин (§) в положении 51 согласно системе нумерации по КаЬа1.
В одном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 88, 89, 90, 91 или 92; и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 93, 94, 95, 96, 97, 100, 102 или 103.
В еще одном воплощении антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению представляет собой РаЬ-фрагмент, РаЬ'-фрагмент, Р(аЬ')2-фрагмент, Ρν-фрагмент, 8сРу-фрагмент, одноцепочечный связывающий полипептид, Ρά-фрагмент, вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи или йАЬ-фрагмент.
Кроме того, согласно данному изобретению предложены композиции для лечения заболевания, связанного с ангиогенезом, содержащие эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данной заявке, и приемлемый носитель или эксципиент.
Кроме того, согласно данному изобретению предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке.
В одном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению дополнительно мечены терапевтической меткой, представляющей собой противоопухолевый агент или ингибитор ангиогенеза; репортерной молекулой, представляющей собой фермент, радиоактивную метку, гаптен, флуоресцентную метку, фосфоресцентную молекулу, хемилюминесцентную молекулу, хромофор, люминесцентную молекулу, фотоаффинную молекулу, окрашенную частицу или лиганд; или и тем и другим.
Кроме того, согласно данному изобретению предложен способ лечения связанного с ангиогенезом заболевания у субъекта, включающий введение композиции антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данной заявке.
В одном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данной заявке, мечены терапевтической меткой, представляющей собой противоопухолевый агент или ингибитор ангиогенеза; репортерной молекулой, представляющей собой фермент, радиоактивную метку, гаптен, флуоресцентную метку, фосфоресцентную молекулу, хемилюминесцентную молекулу, хромофор, люминесцентную молекулу, фотоаффинную молекулу, окрашенную частицу или лиганд; или и тем и другим.
В еще одном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляется, когда связанное с ангиогенезом заболевание представляет собой глазное заболевание, характеризующееся ангиогенезом/неоваскуляризацией, диабетическую нефропатию, воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ), ревматоидный артрит, остеоартрит, рак или метастаз.
В более предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретениию осуществляется, когда глазное заболевание представляет собой дегенерацию желтого пятна.
В еще одном более предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляется, когда глазное заболевание представляет собой диабетическую ретинопатию.
В еще одном более предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляется, когда рак представляет собой солидную опухоль.
В еще одном более предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляется, когда рак представляет собой эпителиальную опухоль.
В еще одном более предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляется, когда рак выбран из рака легкого, гинекологической злокачественной опухоли, меланомы, рака
- 2 025174 молочной железы, рака поджелудочной железы, рака яичника, рака матки, колоректального рака, рака предстательной железы, рака почки, рака головы, рака поджелудочной железы, рака печени (гепатоцеллюлярного рака), рака шеи, саркомы, миеломы и лимфомы.
В одном воплощении способ по настоящему изобретению дополнительно включает введение одного или более ингибиторов ангиогенеза.
В предпочтительном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда ингибитор ангиогенеза представляет собой химиотерапевтическое лекарственное средство, ингибитор рецептора УЕОР (фактор роста сосудистого эндотелия), ингибитор УЕОР или их комбинацию.
В одном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляют, когда композицию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента вводят в количестве примерно 0,01, примерно 0,05, примерно 0,1, примерно 0,5, примерно 1, примерно 5, примерно 10, примерно 20, примерно 30, примерно 40, примерно 50, примерно 60, примерно 70, примерно 80, примерно 90, примерно 100, примерно 125, примерно 150, примерно 175 или примерно 200 мг/кг массы тела пациента.
В еще одном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению мечены терапевтической меткой, представляющей собой противоопухолевый агент, где указанный противоопухолевый агент представляет собой токсин, лекарственное средство, фермент, цитокин, радионуклид или фотодинамический агент.
В предпочтительном воплощении вышеуказанный токсин представляет собой цепь А рицина, мутантный экзотоксин Ркеийотоиак, дифтерийный анатоксин, стрептонигрин, боамицин, сапорин, гелонин или антивирусный белок лаконоса.
В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанное лекарственное средство представляет собой даунорубицин, метотрексат или калихеамицин. В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный радионуклид представляет собой радиоактивный металл.
В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный цитокин представляет собой трансформирующий фактор роста (ΤΟΡ)-β, интерлейкин, интерферон или фактор некроза опухоли.
В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный фотодинамический агент представляет собой порфирин или его производное.
В одном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению меченны репортерной молекулой, представляющей собой лиганд, где указанный лиганд представляет собой биотин.
В еще одном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляется, когда антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данной заявке, мечены терапевтической меткой, представляющей собой противоопухолевый агент, где указанный противоопухолевый агент представляет собой токсин, лекарственное средство, фермент, цитокин, радионуклид или фотодинамический агент.
В предпочтительном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда вышеуказанный токсин представляет собой цепь А рицина, мутантный экзотоксин Ркеийотоиак, дифтерийный анатоксин, стрептонигрин, боамицин, сапорин, гелонин или антивирусный белок лаконоса.
В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда указанное лекарственное средство представляет собой даунорубицин, метотрексат или калихеамицин.
В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда указанный радионуклид представляет собой радиоактивный металл.
В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда указанный цитокин представляет собой трансформирующий фактор роста (ΤΟΡ)-β, интерлейкин, интерферон или фактор некроза опухоли.
В еще одном предпочтительном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда указанный фотодинамический агент представляет собой порфирин или его производное.
В еще одном воплощении вышеуказанный способ осуществляется, когда антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению меченны репортерной молекулой, представляющей собой лиганд, где указанный лиганд представляет собой биотин.
Включение посредством ссылки
Все публикации и патентные заявки, упомянутые в этом описании, включены в данное изобретение посредством ссылки в такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и индивидуально указана как включенная посредством ссылки во всей своей полноте, если конкретно не указано иное. Эта заявка содержит ссылки на аминокислотные последовательности, которые приведены вместе с ней в виде текстового файла с перечнем последовательностей 35882-706202-§едЕ18йх1, с размером файла 67843 килобайт (кБ), созданного 30 марта 2010 г. Вышеупомянутый перечень последовательностей тем самым включен посредством ссылки во всей своей полноте в соответствии с § 1.52(е)(5) главы 37 С.Р.К. (Свод федеральных нормативных документов (Сойе о! Рейега1 Кеди1айои8)).
- 3 025174
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлена гуманизированная вариабельная область (Уь) легкой цепи 02-Ук1-39, имеющая СГОК из У[, моноклонального мышиного химерного ТКС105 (подчеркнуты), привитые между каркасными участками (РК) 1-3 человеческой последовательности О2-Ук1-39 и каркасным участком 4 из человеческой последовательности 1к4 (8ЕО ГО N0: 4) (все выделены жирным шрифтом). Вариации, которые могут быть внесены в человеческие РК, отмечены в положениях 1, 3, 4, 5, 36, 46, 47, 60, 70, 71, 100 и 106 данной последовательности (последовательность раскрыта в 8ЕО ГО N0: 86) согласно системе нумерации по КаЬа! (показаны курсивом ниже гуманизированной последовательности).
На фиг. 2 представлена гуманизированная вариабельная область (Ун) тяжелой цепи УН3-15, имеющая СОК из Ун моноклонального мышиного химерного ТКС105 (подчеркнуты), привитые между каркасными участками (РК) 1-3 человеческой последовательности УН3-15 и каркасным участком 4 из человеческой последовательности ГО4 (8Е0 ГО N0: 42) (все выделены жирным шрифтом). Одна или более вариаций, которые могут быть внесены в человеческие РК, отмечены в положениях 49, 76, 77, 78, 82а, 89, 94, 108, 109 и 113 последовательности (последовательность раскрыта в 8Е0 ГО N0: 87) согласно системе нумерации по КаЬа! (показаны курсивом ниже гуманизированной последовательности).
На фиг. 3 представлена диаграмма сигнального пути ТОР-3/ЛЬК5. ТОР-3/ЛЬК5-путь (А) приводит к ингибированию клеточной пролиферации и миграции. ТСР-3/АЬК1-путь (В) индуцирует пролиферацию эндотелиальных клеток и миграцию и требует СГО105 (эндоглин) для передачи сигнала через АЬК1. Пунктирные линии обозначают неактивные или заблокированные пути. Стрелка, выделенная жирным шрифтом, обозначает стимуляцию сигнального пути.
ТСР-3/АЬК5-путь передачи сигнала (А) приводит к ингибированию клеточной пролиферации и миграции. ТСР-3/АЬК1-путь (В) индуцирует пролиферацию эндотелиальных клеток и миграцию и требует СГО105 (эндоглин) для передачи сигнала через АЬК1.
На фиг. 4 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей типичной мышиной и гуманизированных УК-цепей (соответственно 8Е0 ГО N0 1-5, в порядке появления) и Ун-цепей (соответственно 8Е0 ГО N0 39-43, в порядке появления), полученных согласно изобретению, изложенному в данном описании.
На фиг. 5 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей типичной мышиной и супергуманизированных УК-цепей (соответственно 8Е0 ГО N0 1 и 69-72, в порядке появления) и Унцепей (соответственно 8Е0 ГО N0 39 и 73-75, в порядке появления), полученных согласно изобретению, изложенному в данном описании.
На фиг. 6 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей и сравнение типичной мышиной и гуманизированных и супергуманизированных УК-цепей (соответственно 8Е0 ГО N0 1, 3 и 70, в порядке появления) и Ун-цепей (соответственно 8Е0 ГО N0 39, 41 и 74, в порядке появления), полученных согласно изобретению, изложенному в данном описании.
На фиг. 7 проиллюстрировано связывание конструкций гуманизированных вариантов с эндоглином в конкурентном ЕШЗА-анализе.
Фиг. 8. Анти-СЭ105 конкурентный ЕЬ1§А с использованием гуманизированных и гуманизированных/деиммунизированных антител. Каждое антитело в различных концентрациях смешивали с биотинилированным эталонным антителом против СГО105 в фиксированной концентрации (6,25 нг/мл) и осуществляли связывание с СГО105 (100 нг/мл), захваченным на планшете №тс Мах18огр. Связывание определяли с помощью стрептавидин-нКР и субстрата ТМВ. Поглощение (0Ό) при 450 нм измеряли на планшет-ридере и строили график его зависимости от концентрации тестируемого антитела.
На фиг. 9 проиллюстрированы данные анализа связывания для варианта УК1ААУн1А и УК2содержащих контролей.
На фиг. 10 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с УК1ААУША2 и УК2ААУША2.
На фиг. 11 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с УК2ААУШр.
На фиг. 12 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с УК2ААУШК.
На фиг. 13 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с УК1ААУША2.
На фиг. 14 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с УК1ААУШР.
На фиг. 15 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с УК1ААУШК.
На фиг. 16 проиллюстрированы данные анализа связывания для химерной конструкции в сравнении с УК2ААУША2.
На фиг. 17 проиллюстрирована преимущественная гуманизированная деиммунизированная вариабельная область тяжелой цепи, где СОК выделены жирным шрифтом и подчеркнуты (последователь- 4 025174 ность, раскрытая в 8ЕС ГО N0: 89). Вариации, которые могут быть сделаны, показаны в идентифицированных положениях последовательности с использованием системы нумерации по КаЬа! (последовательность, раскрытая в 8ЕС ГО N0: 116) (показаны курсивом ниже гуманизированной последовательности). Вариации могут быть сделаны в виде единственной мутации или в виде более чем одной мутации, и вариации могут быть сделаны с использованием мутаций в любой комбинации.
На фиг. 18 проиллюстрирована преимущественная гуманизированная деиммунизированная вариабельная область легкой цепи, где СГОК выделены жирным шрифтом и подчеркнуты (последовательность, раскрытая в 8ЕС ГО N0: 93). Вариации, которые могут быть сделаны, показаны в идентифицированных положениях последовательности с использованием системы нумерации по КаЬа! (последовательность, раскрытая в 8ЕС ГО N0: 117) (показаны курсивом ниже гуманизированной последовательности). Вариации могут быть сделаны в виде единственной мутации или в виде более чем одной мутации, и вариации могут быть сделаны с использованием мутаций в любой комбинации.
На фиг. 19 проиллюстрирован анализ участков тяжелой цепи (8ЕС ГО N0: 41) с использованием Норе™. Пептиды, охватывающие полную последовательность, тестировали в виде 9-мерных пептидов с приращениями в одну аминокислоту. Предсказанное связывание каждого остатка в виде р1 якоря корового 9-мерного пептида с аллелями МНС класса II отмечено как О, если балл за связывание составлял 0,55-0,6, и как X, если балл за связывание составлял более 0,6. Участки, содержащие потенциально иммуногенные пептиды, указаны в колонке ГГоре, темно-серым цветом показаны разнородные, связывающиеся с высокой аффинностью пептиды МНС класса II, светло-серым цветом показаны разнородные (ргот18сиои8), связывающиеся со средней аффинностью пептиды МНС класса II. Число аллелей МНС класса II, для которых предсказано связывание, показано в колонках общее и высокая аффинность. Потенциальные р1 якорные остатки, идентифицированные как зародышевые последовательности, показаны выворотным шрифтом в колонке Последовательность.
На фиг. 20 проиллюстрирован анализ вариантов участков тяжелой цепи (8ЕС ГО N0: 118) с использованием ГГоре™. Пептиды, охватывающие полную последовательность, тестировали в виде 9-мерных пептидов с приращениями в одну аминокислоту. Предсказанное связывание каждого остатка в виде р1 якоря корового 9-мерного пептида с аллелями МНС класса II отмечено как О, если балл за связывание составлял 0,55-0,6, и как X, если балл за связывание составлял более 0,6. Участки, содержащие потенциально иммуногенные пептиды, указаны в колонке ГГоре, темно-серым цветом показаны разнородные, связывающиеся с высокой аффинностью пептиды МНС класса II, светло-серым цветом показаны разнородные, связывающиеся со средней аффинностью пептиды МНС класса II. Число аллелей МНС класса II, для которых предсказано связывание, показано в колонках общее и высокая аффинность, и показана разница в связывании. Потенциальные р1 якорные остатки, идентифицированные как зародышевые последовательности, показаны выворотным шрифтом в колонке Последовательность, и аминокислотные различия в данных вариантах заключены в рамку.
На фиг. 21 проиллюстрирован анализ участков легкой цепи (8ЕС ГО N0: 3) с использованием ГГоре™. Пептиды, охватывающие полную последовательность, тестировали в виде 9-мерных пептидов с приращениями в одну аминокислоту. Предсказанное связывание каждого остатка в виде р1 якоря корового 9-мерного пептида с аллелями МНС класса II отмечено как О, если балл за связывание составлял 0,55-0,6, и как X, если балл за связывание составлял более 0,6. Участки, содержащие потенциально иммуногенные пептиды, указаны в колонке ГГоре, темно-серым цветом показаны разнородные, связывающиеся с высокой аффинностью пептиды МНС класса II, светло-серым цветом показаны разнородные, связывающиеся со средней аффинностью пептиды МНС класса II. Число аллелей МНС класса II, для которых предсказано связывание, показано в колонках суммарно и высокая аффинность.
На фиг. 22 проиллюстрирован анализ вариантов участков легкой цепи (8ЕС ГО N0: 101) с использованием ГГоре™. Пептиды, охватывающие полную последовательность, тестировали в виде 9-мерных пептидов с приращениями в одну аминокислоту. Предсказанное связывание каждого остатка в виде р1 якоря корового 9-мерного пептида с аллелями МНС класса II отмечено как О, если балл за связывание составлял 0,55-0,6, и как X, если балл за связывание составлял более 0,6. Участки, содержащие потенциально иммуногенные пептиды, указаны в колонке ГГоре, темно-серым цветом показаны разнородные, связывающиеся с высокой аффинностью пептиды МНС класса II, светло-серым цветом показаны промискуитентные, связывающиеся со средней аффинностью пептиды МНС класса II. Число аллелей МНС класса II, для которых предсказано связывание, показано в колонках суммарно и высокая аффинность, и показана разница в связывании. Потенциальные р1 якорные остатки, идентифицированные как зародышевые последовательности, показаны выворотным шрифтом в колонке Последовательность, и аминокислотные различия в данных вариантах заключены в рамку.
На фиг. 23 проилллюстрирована частота встречаемости аллотипов МНС класса II у населения мира и в исследуемой популяции.
Фиг. 24. Химерное антитело против эндоглина, гуманизированное антитело против эндоглина УК1УН1 и гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина УК1ЛЛУН1Л2 тестировали в Т-клеточных анализах динамики Ер1§стееи™, используя РВМС от 20 доноров. На 5-е, 6-е, 7-е и 8-е
- 5 025174 сутки отбирали образцы смешанных культур РВМС, инкубированных с тестируемыми антителами, и импульсно обрабатывали 3Н-тимидином. Клетки собирали, и включение радиоактивности измеряли путем подсчета импульсов на сцинтилляционном счетчике. Результаты для каждого взятого в трех повторах образца усредняли и нормализовали путем преобразования в индекс стимуляции (§1). §1 для каждой временной точки с учетом каждого донора показан выше для химерного антитела ТКС105 (фиг. 24А), УК1УН1 (фиг. 24В) и УК1ААУН1А2 (фиг. 24С). Порог отсечения для определения положительных ответов с §1 > 2 выделен пунктирной линией, а значимые ответы (р<0,05 согласно критерию Стьюдента) указаны как (*).
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что данная заявка не ограничивается конкретными композициями или параметрами способов, поскольку они, разумеется, могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в данной заявке терминология применяется только для описания конкретных воплощений и не предназначена для ограничения. Кроме того, очевидно, что различные способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данной заявке, могут быть использованы при практическом осуществлении настоящих изобретений.
Согласно настоящей заявке могут быть использованы традиционные методы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантных ДНК, известные в данной области техники. Такие методы подробно разъяснены в литературе; см., например, §атЬтоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЪотаЮгу Мапиа1 (1989); Сштеп! Рто1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду Уо1итек Ι-ΙΙΙ [АикиЬе1, К.М., ей. (1994)]; Се11 Вю1оду: А ЬаЬогаЮгу НапйЬоок Уо1итек Ι-ΙΙΙ |1. Е. СеЙ8, ей. (1994))]; СиггеЩ Рго1осо1к ίη 1ттипо1оду Уо1итек 1111 [Сойдап, ί. Е., ей. (1994)]; Ойдопис1еоййе §уп1йек1к (М.1. Сай ей. 1984); Ыис1ею Ашй НуЪпШ/айоп [Β.Ό. Натек & §.1. Шддшк ейк. (1985)]; Тгапкспрйоп Апй Тгапк1а1юп [Β.Ό. Натек & §.1. Шддшк, ейк. (1984)]; Ашта1 Се11 СиЙиге [Κ.Ι. Ртекйпеу, ей. (1986)]; йптоЫП/ей Се11к Апй Еп/утек [ШЬ Ргекк, (1986)]; В. РегЬа1, А Ргасйса1 Сшйе То Мо1еси1аг С1отп§ (1984); каждый из которых конкретно включен в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.
Были получены мышиные моноклональные антитела (тАЬ) против эндоглина, которые модулируют активность эндоглина и посредством этого ингибируют ангиогенез и/или ингибируют вазодилатацию малых кровеносных сосудов. Эти мышиные антитела описаны в патентах США 5928641, 6200566, 6190660 и 7097836, которые таким образом включены во всей своей полноте. Кроме того, была продемонстрирована эффективность ех У1уо и ш У1уо некоторых таких антител; моноклональные антитела, которые связывают эндоглин, представляют интерес в качестве эндоглин-модулирующих соединений. Однако терапевтическое применение этих мышиных антител является недопустимым, поскольку их введение имеет ряд ограничений, включая иммуногенность, например, в форме человеческих антимышиных антител (НАМА). Гуманизированные антитела призваны устранить эти реакции.
В данной заявке описаны гуманизированные антитела, связывающие эндоглин, которые демонстрируют сниженную иммуногенность при сохранении и/или улучшении их специфичности. Кроме того, для устранения проблем, ассоциированных с мышиными антителами, в данной заявке описаны гуманизированные антитела, связывающие эндоглин и уменьшающие и/или ингибирующие ангиогенез, которые демонстрируют сниженную иммуногенность при сохранении и/или улучшении их специфичности. Эти гуманизированные антитела против эндоглина полезны для диагностики и лечения различных состояний и заболеваний, а также для очистки и детекции эндоглина.
Ι. Антитела против эндоглина.
Согласно данному изобретению предложены гуманизированные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин. Эндоглин можно обнаружить на клетках, которые содержат и поддерживают существующую сосудистую сеть, а также в клетках, которые стимулируют рост новой сосудистой сети и становятся ее частью. Эти антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут связывать эндоглин и тем самым ингибировать ангиогенез, ингибировать существующую сосудистую сеть или поддержание существующей сосудистой сети и/или ингибировать дилатацию малых сосудов. В дальнейшем в этом документе ссылку на термины антитело или антитела следует рассматривать как включающую любой из антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, и такие термины являются взаимозаменяемыми, где это применимо. В дополнение к их применению для очистки эндоглина, эти антитела полезны для очистки, детекции и диагностических целей, а также терапевтических целей. Антитела, предложенные в данной заявке, могут быть использованы для изготовления лекарственных средств для лечения различных состояний и заболеваний, в способах лечения указанных состояний и заболеваний и способах детекции или диагностики. Как использовано в данной заявке, ангиогенез вовлечен в рост и/или развитие новых кровеносных сосудов (что также обозначается как неоваскуляризация), дилатацию малых сосудов, чрезмерный или продолжительный рост сосудов и поддержание существующей сосудистой сети. Ангиогенные состояния и заболевания относятся к таким заболеваниям и состояниям, которые связаны с ангиогенезом, вызваны ангиогенезом или ассоциированы с ангиогенезом. Неограничивающие примеры таких заболеваний включают, например, различные формы глазных заболеваний, характеризующихся ангиогенезом/неоваскуляризацией (например, дегенерацию желтого пятна, СЫУ, диабетическую ретинопатию), диабетическую нефропатию, хронические воспалительные заболе- 6 025174 вания (например, ΙΒΏ), ревматоидный артрит, остеоартрит и различные формы рака (первичные опухоли и метастазы).
А. Терминология по антителам.
Как использовано в данной заявке, термин антитело относится к иммуноглобулину (1д), независимо от того, является ли он природным или получен частично или полностью синтетическим путем. Термин также охватывает любой полипептид или белок, имеющий связывающий домен, который представляет собой антигенсвязывающий домен или гомологичен ему. Кроме того, данный термин включает в себя антигенсвязывающие фрагменты и другие взаимозаменяемые термины для сходных связывающих фрагментов, таких как описано ниже. Антитела с привитыми участками, определяющими комплементарность (СОР) (от англ. сотр1етеи1агу беЮпппипд гедюик), и другие гуманизированные антитела (включая модификации СОК и модификации каркасных участков) также охвачены этим термином.
Нативные антитела и нативные иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (Ъ) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. В типичном случае каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как количество дисульфидных связей варьируется среди тяжелых цепей иммуноглобулинов различных изотипов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (Ун), за которым следует ряд константных доменов (Сн). Каждая легкая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (Уь) и константный домен (Сь) на своем другом конце; константный домен легкой цепи соответствует первому константному домену тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи соответствует вариабельному домену тяжелой цепи. Полагают, что определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей.
Термины синтетический полинуклеотид, синтетический ген или синтетический полипептид, как использовано в данной заявке, означают, что соответствующая полинуклеотидная последовательность или ее участок, либо аминокислотная последовательность или ее участок, происходит из последовательности, которая была сконструирован, или синтезирована бе ηονο, или модифицирована по сравнению с эквивалентной природной последовательностью. Синтетические полинуклеотиды (антитела или антигенсвязывающие фрагменты) или синтетические гены могут быть получены способами, известными в данной области, включая, но не ограничиваясь этим, химический синтез нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей. Синтетические гены обычно отличаются от природных генов либо на аминокислотном, либо на полинуклеотидном уровне (или на обоих уровнях) и обычно расположены в контексте синтетических последовательностей, контролирующих экспрессию. Например, синтетические генные последовательности могут включать аминокислотные или полинуклеотидные последовательности, которые были изменены, например, путем замены, делеции или добавления одной или более аминокислот либо одного или более нуклеотидов, посредством чего обеспечивают аминокислотную последовательность или полинуклеотидную кодирующую последовательность антитела, которая отличается от исходной последовательности. По сравнению с природным геном, синтетические генные полинуклеотидные последовательности не обязательно могут кодировать белки с различными аминокислотами; например, они также могут охватывать синтетические полинуклеотидные последовательности, которые включают разные кодоны, но которые кодируют одну и ту же аминокислоту (т.е. нуклеотидные изменения представляют собой молчащие мутации на аминокислотном уровне).
Что касается антител, то термин вариабельный домен относится к вариабельным доменам антител, которые используются в связывании и определяют специфичность каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность неравномерно распределена в пределах вариабельных доменов антител. Точнее, она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными участками (также известными как СОК), в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные участки вариабельных доменов называются каркасными участками или РК. Каждый из вариабельных доменов немодифицированных тяжелой и легкой цепей содержит четыре РК (РК1, РК2, РК3 и РК4), в основном имеющие β-складчатую конфигурацию, разделенные тремя СОК, которые образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях образующие часть βскладчатой структуры. СОК в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга благодаря РК-участкам и вместе с СОК другой цепи участвуют в формировании антигенсвязывающего участка антител (см. КаЬа1 е1 а1., Зесщепсек οί РгоЮтк οί Иммунологический 1и1еге81, 51П Еб. РиЫю НеаНН 8еМсе, Ναΐίοηαΐ 1и51Ии1е5 οί НеаНН, ВеШекба, Мб. (1991), с. 647-669).
Термины гипервариабельный участок и СОК, когда они используются в данной заявке, относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание с антигеном. СОК содержат аминокислотные остатки из трех участков последовательности, которые связываются комплементарным образом с антигеном и известны как СОК1, СОК2 и СОК3 для каждой из Ун- и Уъ-цепей. В вариабельном домене легкой цепи СОК обычно соответствуют приблизительно остаткам 24-34 (СОКЫ), 50-56 (СОКЬ2) и 89-97 (СОКЬЗ), а в вариабельном домене тяжелой цепи СОК обычно соответствуют прибли- 7 025174 зительно остаткам 31-35 (СОКН1), 50-65 (СОКН2) и 95-102 (СОКН3) в соответствии с КаЬа! с1 а1., §есщспссз οί Рго1еш8 οί 1ттиио1одюа1 1и1ете81, 5ΐΗ Ей. РиЬйс НеаНЬ 8ету1се, Ναΐίοηαΐ 1и8Й1и1е8 οί НеаЙЬ, Ве(Незйа. Мй. (1991). Следует понимать, что СОК различных антител могут содержать вставки, поэтому нумерация аминокислот может отличаться. Система нумерации по КаЬа! учитывает такие вставки, используя схему нумерации, согласно которой к конкретным остаткам добавляют буквы (например, 27А, 27В, 27С, 270, 27Е и 27Р из СОКЕ1 в легкой цепи), чтобы показать любые вставки в нумерациях среди разных антител. Альтернативно, в соответствии с СЬоЙиа аий Ьезк, 1. Мо1. Βίο1., 196: 901-917 (1987), в вариабельном домене легкой цепи СОК обычно соответствуют приблизительно остаткам 26-32 (СОКЕ1), 50-52 (СОКЬ2) и 91-96 (СОКЬ3), а в вариабельном домене тяжелой цепи СОК обычно соответствуют приблизительно остаткам 26-32 (СОКН1), 53-55 (СОКН2) и 96-101 (СОКН3).
Как использовано в данной заявке, каркасный участок или РК относится к каркасным аминокислотным остаткам, которые образуют часть антигенсвязывающего кармана или углубления. В некоторых воплощениях каркасные остатки образуют петлю, которая является частью антигенсвязывающего кармана или углубления, и аминокислотные остатки в этой петле могут контактировать или не контактировать с антигеном. Каркасные участки обычно представляют собой участки, расположенные между СОК. В вариабельном домене легкой цепи РК обычно соответствуют приблизительно остаткам 0-23 (РКЫ), 35-49 (РКЬ2), 57-88 (РКЬ3) и 98-109, а в вариабельном домене тяжелой цепи РК обычно соответствуют приблизительно остаткам 0-30 (РКН1), 36-49 (РКН2), 66-94 (РКН3) и 103-133 в соответствии с КаЬа! е1 а1., Бесщепсез οί Рто1еш8 οί 1ттиио1одюа1 йЦегеЦ 51й Ей. РиЬйс НеаЙЬ 8егуюе, Ν;·ιΙίοπ;·ι1 1и8Й1и1е8 οί НеаЙк ВеШезйа, Мй. (1991). Как обсуждалось выше в отношении нумерации по КаЬа! для легкой цепи, в тяжелой цепи также аналогичным образом учитываются вставки (например, 35 А, 35В из СОКН1 в тяжелой цепи). Альтернативно, в соответствии с СЬоЙиа аий Ьезк, 1. Мо1. Βίο1., 196: 901-917 (1987), в вариабельном домене легкой цепи РК обычно соответствуют приблизительно остаткам 0-25 (РКЬ1), 3349 (РКЬ2) 53-90 (РКЬ3) и 97-109 (РКЬ4), а в вариабельном домене тяжелой цепи РК обычно соответствуют приблизительно остаткам 0-25 (РКН1), 33-52 (РКН2), 56-95 (РКН3) и 102-113 (РКН4).
Петлевые аминокислоты РК могут быть оценены и определены в результате изучения трехмерной структуры тяжелой цепи антитела и/или легкой цепи антитела. Трехмерную структуру можно проанализировать в отношении доступных для растворителя аминокислотных положений, поскольку такие положения, вероятно, образуют петлю и/или обеспечивают контакт с антигеном в вариабельном домене антитела. Некоторые из этих доступных для растворителя положений могут допускать разнообразие в аминокислотной последовательности, а другие (например, структурные положения), как правило, являются менее разнообразными. Трехмерная структура вариабельного домена антитела может быть определена на основании кристаллической структуры или белкового моделирования.
Константные домены (Рс) антител не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но демонстрируют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности посредством взаимодействий, например, с Рс-рецепторами (РсК). Рс-домены также могут увеличивать биодоступность антитела в кровотоке после введения пациенту.
В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена своих тяжелых цепей иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов: 1дА, 1§О, 1дЕ, 1§С и 1дМ, и некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА1 и 1дА2. Константные домены тяжелой цепи (Рс), которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются соответственно α, δ, ε, γ и μ. Хорошо известны субъединичные структуры и трехмерные конфигурации иммуноглобулинов различных классов.
Легкие цепи антител (иммуноглобулинов) из любого вида позвоночных могут быть отнесены к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа или (к или К) и лямбда или (λ), на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов.
Термины антигенсвязывающий участок антитела, антигенсвязывающий фрагмент, антигенсвязывающий домен, фрагмент антитела или функциональный фрагмент антитела используются в данной заявке взаимозаменяемо для обозначения одного или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Неограничивающие примеры фрагментов антитела, охватываемых такими терминами, включают, но не ограничиваются этим, (1) РаЬ-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из Уь-, УН-, Сь- и Сш-доменов; (2) Р(аЬ')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два РаЬ-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (3) Рй-фрагмент, состоящий из УН- и Сш-доменов; (4) Ру-фрагмент, содержащий Уь- и УН-домены одного плеча антитела; (5) йАЬ (однодоменное антитело) фрагмент (^атй е1 а1. (1989) №1ите, 341: 544-546), который содержит УН-домен; и (6) выделенный СОК. Кроме того, в это определение включены половинки антител, содержащие одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. Другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела, также охвачены данным описанием.
Группировки Р(аЬ')2 и РаЬ' могут быть получены путем обработки 1д протеазой, такой как пепсин и папаин, и включают фрагменты антитела, полученные в результате переваривания иммуноглобу- 8 025174 лина вблизи дисульфидных связей, находящихся между шарнирными областями в каждой из этих двух тяжелых цепей. Например, папаин расщепляет 1дО выше дисульфидных связей, находящихся между шарнирными областями в каждой из этих двух тяжелых цепей, с образованием двух гомологичных фрагментов антитела, в которых легкая цепь, состоящая из У|, и Сь (константная область легкой цепи), и фрагмент тяжелой цепи, состоящий из Ун и Сну1 (γ1 область в константной области тяжелой цепи), соединены по их С-концевым областям посредством дисульфидной связи. Каждый из этих двух гомологичных фрагментов антитела называется РаЬ'. Пепсин также расщепляет 1дО ниже дисульфидных связей, находящихся между шарнирными областями в каждой из этих двух тяжелых цепей, с образованием фрагмента антитела несколько большего размера по сравнению с фрагментом, в котором два вышеупомянутых РаЬ' соединены в шарнирной области. Этот фрагмент антитела называется Р(аЬ')2.
РаЬ-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (Сн1) тяжелой цепи. РаЬ'-фрагменты отличаются от РаЬ-фрагментов тем, что на карбоксильном конце Сн1домена тяжелой цепи добавлено несколько остатков, включающих один или более цистеинов из шарнирной области антитела. В данной заявке РаЬ'-8н представляет собой обозначение для РаЬ', в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несут свободную тиольную группу. Р(аЬ')2-фрагменты антитела первоначально были получены в виде пар РаЬ'-фрагментов, которые содержат между собой шарнирные цистеины. Также известны и другие химические сочетания фрагментов антитела.
Ρν относится к фрагменту антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий участок. Этот участок состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, которые находятся в тесной нековалентной или ковалентной ассоциации (в данной области были описаны Ρν, соединенные дисульфидными связями, Кейег е! а1. (1996) №Диге Вю!есНпо1оду, 14: 1239-1245). Его конфигурация такова, что три СБК каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего участка на поверхности димера УнУь. В совокупности, комбинация одного или более СЭР из каждой из Ун- и Уь-цепей придает антигенсвязывающую специфичность антителу. Например, будет очевидно, что, например, СБКнЗ и СБКЕ3 могут быть достаточными для придания антигенсвязывающей специфичности антителу, когда они перенесены на Ун- и Уъ-цепи реципиентного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и эта комбинация СЭР может быть протестирована в отношении связывания, аффинности и т.д. с использованием любого из методов, описанных в данной заявке. Даже единичный вариабельный домен (или половина Ρν, содержащая только три СЭР, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя вероятно с меньшей аффинностью, чем когда он объединен со вторым вариабельным доменом. Кроме того, несмотря на то, что два домена Ρν-фрагмента (Уь и Ун) кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных методов посредством синтетического линкера, который позволяет получить их в виде единой белковой цепи, в которой Уь- и Ун-области объединяются в пару с образованием одновалентной молекулы (известной как одноцепочечный Ρν (δεΡν); ВНб е! а1. (1988) §с1епее, 242: 423-426; ни81оп е! а1. (1988) Ргос. ЫаИ. Асаб. δει. υδΑ, 85: 5879-5883 и ОкЬоигп е! а1. (1998) ΝηΙ. Вю!есНпо1., 16: 778). Также подразумевается, что такие δεΡν охватываются термином антигенсвязывающий участок антитела. Любые последовательности Ун И Уъ конкретного бсЕу могут быть связаны с кДНК или геномными последовательностями Ρс-области с целью создания экспрессирующих векторов, кодирующих полные молекулы 1д (например, 1дО) или другие изотипы. Ун И Уь также могут быть использованы в создании ΡаЬ, Ρν или других фрагментов 1д с использованием либо методов белковой химии, либо технологии рекомбинантных ДНК.
Одноцепочечные Ρν или δΡν антительные фрагменты содержат Ун- и Уъ-домены антитела, где эти домены находятся в одной полипептидной цепи. В некоторых воплощениях полипептид Ρν дополнительно содержит полипептидный линкер между Ун- и Уъ-доменами, который позволяет δΡν образовывать желаемую структуру для связывания с антигеном. Обзор δΡν см., например, у Р1иск1Нип в ТНе РНагтасо1оду о! Мопос1опа1 Αηί^Ьоб^еδ, Уо1. 113, ΚоδеηЬи^д апб Мооге ебδ., δρ^^пде^-Уе^1ад, №ν Уогк, р. 269-315 (1994).
Термин АВИМЕР™ относится к классу терапевтических белков человеческого происхождения, которые не относятся к антителам и фрагментам антител и состоят из нескольких модульных и многократно используемых связывающих доменов, обозначенных как А-домены (также известных как модуль класса А, повтор комплементарного типа или домен класса А рецептора ЕБЬ (липопротеины низкой плотности)). Они были разработаны на основе человеческих внеклеточных рецепторных доменов с помощью перетасовки экзонов ίη уйго и фагового дисплея (Ыкегтап е! а1., 2005, Ν;·ιΙ. Вю!есНпо1. 23: 14931494; δί1\Όηη;·ιη е! а1., 2006, Ν!. Вю!есНпо1. 24: 220). Полученные белки могут содержать многочисленные независимые связывающие домены, которые могут демонстрировать улучшенную аффинность (в некоторых случаях, на субнаномолярном уровне) и специфичность по сравнению с белками, связывающими один эпитоп; см., например, публикации заявок на патент США №№ 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0053973 и 2005/0089932, 2005/0048512 и 2004/0175756, каждая из которых таким образом включена в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.
Каждый из известных 217 А-доменов человека содержит примерно 35 аминокислот (примерно 4
- 9 025174 кДа); и эти домены отделены друг от друга линкерами, длина которых в среднем составляет пять аминокислот. Нативные А-домены быстро и эффективно сворачиваются в однородную стабильную структуру, достигаемую главным образом посредством связывания с кальцием и образования дисульфидных связей. Для такой общей структуры необходим консервативный каркасный мотив лишь из 12 аминокислот. Конечным результатом является одиночная белковая цепь, содержащая многочисленные домены, каждый из которых осуществляет отдельную функцию. Каждый домен этих белков связывает независимо, и энергетические вклады каждого домена суммируются. Эти белки были названы АВИМЕРами™, исходя из авидности мультимеров.
Термин диатела относится к небольшим фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими участками, причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (УН), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (УЪ) в одной и той же полипептидной цепи (УН-УЪ). В результате использования линкера, который является слишком коротким для образования пары между двумя доменами в одной и той же цепи, эти домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих участка. Более полно диатела описаны, например, в ЕР 404097; АО 93/11161 и НоШидег е! а1., Ргос. ЫаП. Асай. δοί. И8А, 90: 6444-6448(1993).
Антигенсвязывающие полипептиды также включают димеры тяжелых цепей, такие как, например, антитела верблюдов и акул. Верблюжьи и акульи антитела содержат гомодимерную пару двух цепей из У-подобного и С-подобного доменов (ни одна из которых не имеет легкой цепи). Поскольку УН-область 1дС у верблюдов, представляющего собой димер тяжелых цепей, не должна вступать в гидрофобные взаимодействия с легкой цепью, эта область в тяжелой цепи, которая обычно контактирует с легкой цепью, у верблюда подвергается замене на гидрофильные аминокислотные остатки. УН-домены 1§О в виде димера тяжелых цепей называются УНН-доменами. Акульи Ιβ-ΝΑΕ (новые антигенные рецепторы усатой акулы-няньки; от англ. ишье 8Йагк (иете) аийдеи гесерЮгД содержат гомодимер одного вариабельного домена (названного доменом У-ΝΑΚ) и пяти С-подобных константных доменов (доменов С-ΝΑΚ). Разнообразие репертуара антител у верблюдов определяется СЭР. 1, 2 и 3 в УН- или УНН-областях. СЭР3 в УНН-области верблюда характеризуется своей относительно большой длиной, в среднем составляющей 16 аминокислот (Миу1йегтап8 е! а1., 1994, Рго1ет Еидтеегшд 7(9): 1129). Это отличает его от СЭР3участков антител многих других видов. Например, СЭР3 из УН мыши имеет в среднем 9 аминокислот. Библиотеки вариабельных областей верблюжьих антител, которые поддерживают разнообразие ίη νίνο вариабельных областей верблюда, могут быть созданы, например, методами, описанными в заявке на патент США с серийным № 20050037421.
Гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител включают химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из нечеловеческого 1д. В основном, гуманизированные антитела представляют собой человеческие 1д (реципиентное антитело), в которых один или более СЭР реципиента заменены на СЭР антитела (донорного антитела) из видов, не относящихся к человеку, таких как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, имеющего желаемую специфичность, аффинность и связывающую функцию. В некоторых случаях один или более аминокислотных остатков РР человеческого 1д заменяют на соответствующие нечеловеческие аминокислотные остатки. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации могут быть сделаны с целью улучшения функциональных характеристик антител, если будет необходимо. Гуманизированное антитело может содержать, по существу, все или по меньшей мере один и в некоторых случаях два вариабельных домена, в которых все или по существу все гипервариабельные участки соответствуют участкам нечеловеческого иммуноглобулина и все или по существу все РР представляют собой участки последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело возможно также может включать по меньшей мере часть константной области (Рс) иммуноглобулина, обычно человеческого иммуноглобулина. Для подробной информации см. 1опе8 е! а1., №йиге 321: 522-525 (1986); РеюЬтапп е! а1., Уинге 332: 323-329 (1988) и Рге§1а, Сигг. Ор. 81гисБ Βίο1., 2: 593-596 (1992).
Гуманизированное антитело также включает антитела, в которых часть или все СЭР тяжелой и легкой цепи происходят из нечеловеческого моноклонального антитела, при этом, по существу, все остальные участки вариабельных областей происходят из человеческой вариабельной области (как тяжелой, так и легкой цепи), и константные области происходят из человеческой константной области. В одном воплощении участки СЭР1, СЭР2 и СЭР3 тяжелой и легкой цепей происходят из нечеловеческого антитела. В еще одном другом воплощении по меньшей мере один СЭР (например, СЭР3) тяжелой и легкой цепей происходит из нечеловеческого антитела. Различные комбинации СЭР1. СЭР2 и СЭР3 могут происходить из нечеловеческого антитела и рассматриваются в данной заявке. В одном неограничивающем примере один или более участков СЭРЕ СЭР2 и СЭР3 каждой тяжелой и легкой цепей происходят из клона мышиного химерного моноклонального антитела ТРС105.
Термин моноклональное антитело, как использовано в данной заявке, относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т. е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными,
- 10 025174 направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в противоположность препаратам традиционных (поликлональных) антител, которые могут включать различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Определение моноклональное указывает на характер антитела, полученного, по существу, из гомогенной популяции антител, и не следует истолковывать как требующее получения антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным в КоЫет е! а1., №Дигс. 256: 495 (1975), или могут быть получены методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). В некоторых воплощениях моноклональные антитела можно выделить из фаговых библиотек антител с использованием методик, описанных, например, в С1аск§ои е! а1., Ма1иге, 352: 624-628 (1991) и Маткк е! а1., 1. Мо1. ΒίοΙ., 222: 581-597 (1991).
Антитела могут быть выделены и очищены из культурального супернатанта или асцитов, как упомянуто выше, путем осаждения насыщенным сульфатом аммония, методом эуглобулинового осаждения, методом с использованием капроновой кислоты, методом с использованием каприловой кислоты, с помощью ионообменной хроматографии (ΌΕΑΕ или ΌΕ52) или аффинной хроматографии с использованием анти-1д-колонки или колонки с белком Α, О или Ь, таких как описано более подробно ниже.
Типичными антителами для применения в композициях и способах, описанных в данной заявке, являются интактные иммуноглобулиновые молекулы, такие как, например, гуманизированное антитело или те участки молекулы гуманизированного 1д, которые содержат антигенсвязывающий сайт (т.е. паратоп) или одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, в том числе те участки, которые известны в данной области как РаЬ, РаЬ', Р(аЬ)', Р(аЬ')2, Рб, 8сРу, вариабельный домен тяжелой цепи, вариабельный домен легкой цепи, вариабельный ΝΑΚ-домен, биспецифический 8сРу, биспецифический РаЬ2, триспецифический РаЬ3 и одноцепочечные связывающие полипептиды, и другие, которые также обозначаются как антигенсвязывающие фрагменты. При конструировании иммуноглобулиновой молекулы или ее фрагментов вариабельные области или их участки могут быть слиты, соединены или иным образом присоединены к одной или более константным областям или их участкам с получением любого из антител или их фрагментов, описанных в данной заявке. Это может быть осуществлено различными методами, известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, методы молекулярного клонирования или прямой синтез нуклеиновых кислот, кодирующих данные молекулы. Типичные неограничивающие способы конструирования этих молекул также можно найти в примерах, описанных в данной заявке.
В одном типичном воплощении в заявке предложен одноцепочечный связывающий полипептид, имеющий вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, который связывает эндоглин и возможно имеет Рс-область иммуноглобулина. В одном типичном воплощении в заявке предложен одноцепочечный связывающий полипептид, имеющий вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, который связывает эндоглин и ингибирует ангиогенез и возможно имеет Рс-область иммуноглобулина. Такая молекула представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент, возможно обладающий эффекторной функцией или имеющий увеличенный период полувыведения благодаря присутствию Рс-области иммуноглобулина. Способы получения одноцепочечных связывающих полипептидов известны в данной области (например, заявка на патент США № 2005/0238646).
Термины генные сегменты зародышевой линии или последовательности зародышевой линии относятся к генам из зародышевой линии (гаплоидные гаметы и те диплоидные клетки, из которых они образуются). Зародышевая ДНК содержит множество генных сегментов, которые кодируют одну тяжелую или легкую цепь 1д. Эти генные сегменты содержатся в зародышевых клетках, но они не могут транскрибироваться и транслироваться в тяжелые и легкие цепи, пока не будут организованы в функциональные гены. В процессе дифференцировки В-клеток в костном мозге эти генные сегменты случайным образом перетасовываются под действием динамической генетической системы, способной генерировать более 108 видов специфичности. Данные о большей части этих генных сегментов опубликованы и собраны в базах данных по зародышевым линиям.
Как использовано в данной заявке, иммунореактивный относится к связывающим агентам, антителам или их фрагментам, которые специфичны к последовательности аминокислотных остатков (сайт связывания или эпитоп), и даже если обладают перекрестной реактивностью в отношении других пептидов/белков, являются нетоксичными в концентрациях, приготовленных для введения людям. Термин связывание относится к непосредственной ассоциации двух молекул вследствие, например, ковалентных, электростатических, гидрофобных и ионных взаимодействий и/или взаимодействий на основе водородных связей в физиологических условиях и включающих такие взаимодействия, как солевые мостики и водные мостики, и любые другие традиционные способы связывания. Термин предпочтительно связывается означает, что связывающий агент связывается с сайтом связывания с более высокой аффинностью, чем он связывается с неродственными аминокислотными последовательностями. Предпочтительно, чтобы такая аффинность была по меньшей мере в 1 раз выше, по меньшей мере в 2 раза выше, по меньшей мере в 3 раза выше, по меньшей мере в 4 раза выше, по меньшей мере в 5 раз выше, по меньшей мере в 6 раз выше, по меньшей мере в 7 раз выше, по меньшей мере в 8 раз выше, по меньшей
- 11 025174 мере в 9 раз выше, 10 раз выше, по меньшей мере в 20 раз выше, по меньшей мере в 30 раз выше, по меньшей мере в 40 раз выше, по меньшей мере в 50 раз выше, по меньшей мере в 60 раз выше, по меньшей мере в 70 раз выше, по меньшей мере в 80 раз выше, по меньшей мере в 90 раз выше, по меньшей мере в 100 раз выше или по меньшей мере в 1000 раз выше, чем аффинность связывающего агента в отношении неродственных аминокислотных последовательностей. Термины иммунореактивный и предпочтительно связывается используются в данной заявке взаимозаменяемо.
Как использовано в данной заявке, термин аффинность относится к константе равновесия для обратимого связывания двух агентов и выражается в виде Кс. Аффинность связывания белка с лигандом, такая как аффинность антитела в отношении эпитопа, может составлять, например, от примерно 100 до примерно 0,1 нМ, от примерно 100 нМ до примерно 1 пМ или от примерно 100 нМ до примерно 1 фМ. Как использовано в данной заявке, термин авидность относится к устойчивости комплекса из двух или более агентов к диссоциации после разведения. Кажущиеся аффинности могут быть определены такими способами, как иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЬ1§А), или любым другим методом, известным специалисту в данной области. Авидности могут быть определены такими методами, как анализ Скэтчарда, или любым другим методом, известным специалисту в данной области.
Термин эпитоп относится к той части антигена или другой макромолекулы, которая способна создавать связывающее взаимодействие со связывающим карманом вариабельной области антитела. Такие связывающие взаимодействия могут проявляться в виде межмолекулярного контакта с одним или более аминокислотными остатками одного или более СЭР. В связывание с антигеном могут быть вовлечены, например, СЭКЗ. или пара СЭК3. или в некоторых случаях взаимодействия вплоть до всех шести СОК νΗ- и Уь-цепей. Эпитоп может представлять собой линейную пептидную последовательность (т.е. непрерывную) или может состоять из прерывистых аминокислотных последовательностей (т.е. быть конформационным или дискретным). Антитело может распознавать одну или более аминокислотных последовательностей; поэтому эпитоп может определять более чем одну дискретную аминокислотную последовательность. Эпитопы, распознаваемые антителами, могут быть определены методами пептидного картирования и анализа последовательности, хорошо известными специалисту в данной области. Связывающие взаимодействия проявляются в виде межмолекулярных контактов с одним или более аминокислотными остатками СЭР. ТКС105 представляет собой химерное антитело, которое имеет такую же вариабельную аминокислотную последовательность, что и мышиное антитело, описанное как Υ4-2Ρ1 или §Ν6_) в патентах США с номерами 5928641, 6200566, 6190660 и 7097836. Эпитопы, распознаваемые Υ4-2Ρ1 и §Ν6_) и, следовательно, ТКС105, были идентифицированы ранее.
Термин специфический относится к ситуации, при которой антитело не будет демонстрировать какого-либо значительного связывания с молекулами, отличными от антигена, содержащего эпитоп, распознаваемый антителом. Термин также применим, когда, например, антиген-связывающий домен специфичен к конкретному эпитопу, который имеется у многих антигенов, в этом случае антитело или его антигенсвязывающий фрагмент будут способны связываться с различными антигенами, несущими этот эпитоп. Термины предпочтительно связывается или специфически связывается означают, что антитела или их фрагменты связываются с эпитопом с более высокой аффинностью, чем с неродственными аминокислотными последовательностями, и если обладают перекрестной реактивностью в отношении других полипептидов, содержащих данный эпитоп, то являются нетоксичными в концентрациях, приготовленных для введения людям. В одном из аспектов такая аффинность по меньшей мере в 1 раз выше, по меньшей мере в 2 раза выше, по меньшей мере в 3 раза выше, по меньшей мере в 4 раза выше, по меньшей мере в 5 раз выше, по меньшей мере в 6 раз выше, по меньшей мере в 7 раз выше, по меньшей мере в 8 раз выше, по меньшей мере в 9 раз выше, в 10 раз выше, по меньшей мере в 20 раз выше, по меньшей мере в 30 раз выше, по меньшей мере в 40 раз выше, по меньшей мере в 50 раз выше, по меньшей мере в 60 раз выше, по меньшей мере в 70 раз выше, по меньшей мере в 80 раз выше, по меньшей мере в 90 раз выше, по меньшей мере в 100 раз выше или по меньшей мере в 1000 раз выше, чем аффинность антитела или его фрагмента в отношении неродственных аминокислотных последовательностей. Термины иммунореактивный, связывается, предпочтительно связывается и специфически связывается используются в данной заявке взаимозаменяемо. Термин связывание относится к непосредственной ассоциации двух молекул вследствие, например, ковалентных, электростатических, гидрофобных и ионных взаимодействий и/или взаимодействий на основе водородных связей в физиологических условиях и включает такие взаимодействия, как солевые мостики и водные мостики и любые другие традиционные способы связывания.
Фраза консервативная аминокислотная замена относится к распределению аминокислот по группам на основе определенных общих свойств. Функциональный способ определения общих свойств среди индивидуальных аминокислот заключается в анализе нормированных частот аминокислотных изменений среди соответствующих белков гомологичных организмов (§сйик, С.Е. апб К.Н. §сЫгтег, ΡήηαρΚδ οί Рго1еш §1гис1иге, 8ргтдег-Уег1ад). В соответствии с такими анализами можно определить группы аминокислот, где аминокислоты в пределах группы предпочтительно заменяются друг на друга и поэтому сходны друг с другом по своему влиянию на общую структуру белка (8сйик, С.Е. апб К.Н. §сЫгтег, Ргшс1р1е8 οί Рго1еш §1гис1иге, 8ргшдег-Уег1ад). Примеры групп аминокислот, определенных таким обра- 12 025174 зом, включают:
(1) с заряженной группой, состоящих из С1и и Акр, Ьук, Агд и Ηίκ, (2) с положительно заряженной группой, состоящих из Ьук, Агд и Ηίκ, (3) с отрицательно заряженной группой, состоящих из С1и и Акр, (4) с ароматической группой, состоящих из РЬе, Туг и Тгр, (5) с азотсодержащей кольцевой группой, состоящих из Ηίκ и Тгр, (6) с большой алифатической неполярной группой, состоящих из Уа1, Ьеи и 11е, (7) со слабополярной группой, состоящих из Ме! и Сук, (8) с небольшой группой остатка, состоящих из Зег. ТЬг, Акр, Акп, С1у, А1а, С1и, С1и и Рго, (9) с алифатической группой, состоящих из Уа1, Ьеи, 11е, Ме! и Сук и (10) с небольшой гидроксильной группой, состоящих из Зег и ТЬг.
Помимо групп, представленных выше, каждый аминокислотный остаток может образовывать свою собственную группу, и такая группа, образованная индивидуальной аминокислотой, может быть обозначена просто с помощью одно- и/или трехбуквенного сокращения для такой аминокислоты, обычно используемого в данной области, как описано выше.
Консервативный остаток представляет собой аминокислоту, которая является относительно инвариантной во всем диапазоне сходных белков. Зачастую консервативные остатки будут отличаться только тем, что они будут заменены на сходную аминокислоту, как описано выше для консервативной аминокислотной замены.
Символ х или хаа, который использован в данной заявке в аминокислотных последовательностях, предназначен для указания на то, что в этом положении может быть осуществлена замена на любую из двадцати стандартных аминокислот, если конкретно не указано иное. Для задач конструирования пептидомиметиков, х или хаа в аминокислотной последовательности может быть заменен имитатором аминокислоты, присутствующей в последовательности-мишени, или аминокислота может быть заменена спейсером, по существу, любой формы, которая не оказывает влияния на активность пептидомиметика.
Гомология, или идентичность, или сходство относится к сходству последовательностей двух пептидов или двух молекул нуклеиновой кислоты. И гомология, и идентичность каждая может быть определена путем сравнения положения в каждой последовательности, которое может быть выравнено в целях сравнения. Когда эквивалентное положение в сравниваемых последовательностях занято одним и тем же основанием или одной и той же аминокислотой, тогда эти молекулы являются идентичными по такому положению; когда эквивалентный сайт занят тем же или сходным аминокислотным остатком (например, сходным по стерической и/или электронной природе), тогда эти молекулы могут быть названы гомологичными (сходными) по такому положению. Выражение гомологии/сходства или идентичности в виде процента имеет отношение к функции количества идентичных или сходных аминокислот в положениях, являющихся общими для сравниваемых последовательностей. Последовательность, являющаяся неродственной или негомологичной, имеет менее 40% идентичности, предпочтительно даже менее 25% идентичности с последовательностью по настоящему изобретению. При сравнении двух последовательностей, отсутствие остатков (аминокислот или нуклеиновых кислот) или присутствие дополнительных остатков также снижает идентичность и гомологию/сходство.
Термин гомология описывает математически обоснованное сравнение сходства последовательностей, которое применяют для идентификации генов или белков со сходными функциями или мотивами. Нуклеиновокислотные (нуклеотидные, олигонуклеотидные) и аминокислотные (белковые) последовательности по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве запрашиваемой последовательности для проведения поиска относительно опубликованных баз данных, например, с целью идентификации других представителей семейства, родственных последовательностей или гомологов. Такие поиски могут быть проведены с использованием программ ПВЬАЗТ и ХВЬАЗТ (версия 2.0) из А1!ксЬи1, е! а1. (1990) 1. Мо1. Βίο1. 215: 403-10. ВЬАЗТ-поиски нуклеотидов могут быть выполнены с использованием программы ПВЬАЗТ, (балл = 100, длина слова = 12) для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот по изобретению. ВЬАЗТ-поиски аминокислот могут быть выполнены с использованием программы ХВЬАЗТ (балл = 50, длина слова = 3) для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам по изобретению. Для получения выравниваний с брешами в сравнительных целях можно использовать Саррей ВЬАЗТ, как описано в А1!ксЬи1 е! а1., (1997) Ыис1е1с Ас1Йк Кек. 25(17): 3389-3402. При применении программ ВЬАЗТ и Саррей ВЬАЗТ могут быть использованы параметры по умолчанию для соответствующих программ (например, ХВЬАЗТ и ВЬАЗТ) (см. \у\у\у.псЫ.п1т.шЬ.доу).
Как использовано в данной заявке, идентичность означает процент идентичных нуклеотидных или аминокислотных остатков в соответствующих положениях двух или более последовательностей, когда эти последовательности выравнивают с целью максимизации соответствия последовательностей, т.е. принимая в расчет бреши и вставки. Идентичность можно легко рассчитать известными методами, включая, но не ограничиваясь этим, методы, описанные в Сотри1айоиа1 Мо1еси1аг Вю1оду, Ьекк, А.М., ей., ОхГогй ИшуегкЬу Ргекк, №\у Уогк, 1988; Вюсотрийид: ТиГогтайск апй Сепоте Рго_|ес1к, ЗтЪЬ, Ό.Α.,
- 13 025174 ей., Асайетю Ргезз, №\ν Уогк, 1993; Сотрйег Лпа1у818 о! Бесщепсе Эа1а. Рай I, ОпГйп, А.М., апй ОпГПп. Н.О., ейз., Нитапа Ргезз, №\ν 1ег§еу, 1994; Бесщепсе Апа1у818 ш Мо1еси1аг Вю1о§у, уоп Нет)е, О., Асайет1с Рге88, 1987; и Бесщепсе Апа1у818 Рйтег, ОйЪзкоу, М. апй Иеуегеих, ΐ., ейз., М БЮскЮп Ргезз, №\ν Уогк, 1991; и СагШо, Н., апй Ыртап, И., Б1АМ ΐ. АррПей МаШ., 48: 1073 (1988). Методы определения идентичности разработаны с целью получения максимального соответствия между тестируемыми последовательностями. Кроме того, методы определения идентичности систематизированы в общедоступных компьютерных программах. Методы с использованием компьютерных программ для определения идентичности между двумя последовательностями включают, но не ограничиваются этим, пакет программ ОСО (Иеуегеих, ΐ., е1 а1., Ыискю Ашйз КезеагсП 12(1): 387 (1984)), ВЬАБТР, ВЬАБТЫ и РАБТА (АИзсМ, Б.Р. е1 а1., ΐ. Мо1ес. Вю1. 215: 403-410 (1990) и АНзс1ш1 е1 а1., Ыис. Άοΐάδ Кез., 25: 3389-3402 (1997)). Программа ВЬАБТ X является общедоступной программой от ЫСВ1 и из других источников (ВЬАБТ Мапиа1, АНзсПШ, Б., е1 а1., ЫСВ1 ΝΙΑ1 №Н ВеШезйа, Мй. 20894; А1йсЬи1, Б., е1 а1., ΐ. Мо1. Вю1. 215: 403-410 (1990)). Для определения идентичности также можно использовать хорошо известный алгоритм СмитаУотермана.
Термин выделенный (используемый взаимозаменяемо с термином по существу, чистый) при применении к полипептидам означает полипептид или его участок, который в соответствии с его происхождением или процедурой: (1) присутствует в клетке-хозяине в виде продукта экспрессии участка экспрессирующего вектора; или (2) связан с белком или другой химической группировкой, отличными от тех, с которыми они связаны в природе; или (3) не встречается в природе, например, белок, который подвергается химической обработке путем присоединения или добавления по меньшей мере одной гидрофобной группировки к данному белку, с тем чтобы данный белок находился в форме, не обнаруженной в природе. Под выделенным также подразумевают белок, который: (1) синтезирован химическим путем; или (2) экспрессирован в клетке-хозяине и очищен от сопутствующих и загрязняющих белков. Как правило, этот термин означает полипептид, который отделен от других белков и нуклеиновых кислот, с которыми он существует в природе. Предпочтительно, чтобы полипептид также был отделен от таких веществ, как антитела или гелевые матрицы (полиакриламид), которые используются для его очистки.
Как использовано в данной заявке, термины ингибирующий ангиогенез, ангиогенезингибирующий или антиангиогенный включают ингибирование васкулогенеза (образование и развитие сосудов) и предназначены для обозначения влияния на уменьшение степени, величины или скорости неоваскуляризации. Влияние на уменьшение степени, величины или скорости пролиферации эндотелиальных клеток или миграции в ткани представляет собой конкретный пример ингибирования ангиогенеза.
Термин ангиогенез-ингибирующая композиция относится к композиции, которая ингибирует ангиогенез-опосредованные процессы, такие как миграция, пролиферация эндотелиальных клеток, образование трубочек, и впоследствии приводит к ингибированию образования новых кровеносных сосудов из уже существующих сосудов и, таким образом, влияет на ангиогенез-зависимые состояния.
Как использовано в данной заявке, термин ангиогенез-зависимое состояние предназначен для обозначения состояния, при котором процесс ангиогенеза или васкулогенеза поддерживает или усиливает патологическое состояние или оказывает благоприятное воздействие на нормальные физиологические процессы. Поэтому лечение ангиогенез-зависимого состояния, при котором ангиогенез поддерживает патологическое состояние, могло бы приводить к подавлению заболевания, в то время как лечение ангиогенез-зависимого состояния, при котором ангиогенез оказывает благоприятное воздействие на нормальные физиологические процессы, могло бы приводить, например, к усилению нормального процесса.
Ангиогенез представляет собой образование новых кровеносных сосудов из уже существующих капилляров или посткапиллярных венул. Васкулогенез является результатом образования новых кровеносных сосудов, возникающих из ангиобластов, которые являются предшественниками эндотелиальных клеток. Оба процесса приводят к образованию новых кровеносных сосудов и включены в значение термина ангиогенез-зависимые состояния. Подразумевается, что термин ангиогенез, как использовано в данной заявке, включает в себя образование сосудов йе поуо, например, которые возникают в результате васкулогенеза, а также тех, которые возникают в результате разветвления и прорастания существующих сосудов, капилляров и венул. Ангиогенез также может быть вовлечен в индукцию АЬК1-сигнального пути и фосфорилирования и/или сигнального пути, родственного Бтай 1/5/8. Кроме того, известно, что СЭ105 вовлечен в АЬК1-сигнальный путь и, таким образом, также включен в понятие ангиогенеза.
Индукция иммунного ответа хозяина означает, что пациент испытывает облегчение или ослабление признаков или симптомов болезни и конкретно включает в себя, без ограничения, продление выживаемости. В некоторых предпочтительных воплощениях способов по изобретению СИ8+ ΙΡΝγпродуцирующая Т-клетка активируется для индукции цитотоксического Т-лимфоцитарного (СТЬ) иммунного ответа у пациента, которому вводят антагонист. В некоторых воплощениях способов по изобретению СИ4+ ΙΡΝγ-продуцирующая Т-клетка активируется для индукции хелперного Т-клеточного иммунного ответа у пациента, которому вводят композицию. Эти активированные СИ4+ ΙΡΝγпродуцирующие Т-клетки (т.е. хелперные Т-клетки) обеспечивают необходимую иммунологическую
- 14 025174 помощь (например, путем высвобождения цитокинов) для индукции и поддержания не только СТЬ-, но также гуморального иммунного ответа, опосредованного В-клетками. Таким образом, в некоторых воплощениях способов по изобретению у пациента, которому вводят композицию, активируется гуморальный ответ на антиген. В одном аспекте для усиления иммунного ответа к композиции может быть добавлен адъювант. Адъюванты хорошо известны в данной области.
Активация СЭ8+ и/или СЭ4+ Т-клеток означает стимуляцию Т-клеток, которые обладают способностью продуцировать цитокины (например, ШЫ-у (интерферон-гамма), действительно продуцировать один или более цитокинов или увеличивать продуцирование ими одного или более цитокинов. Индукция СТЬ-ответа означает стимуляцию потенциально цитотоксических Т-лимфоцитов демонстрировать антигенспецифическую цитотоксичность. Антигенспецифическая цитотоксичность означает цитотоксичность против клетки, презентирующей антиген, который ассоциирован с антигеном, ассоциированным с раком, которая оказывается выше, чем для антигена, не ассоциированного с раком. Цитотоксичность относится к способности цитотоксического Т-лимфоцита вызывать гибель клетки-мишени. Такая антиген-специфическая цитотоксичность может быть по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 10 раз выше, по меньшей мере примерно в 100 раз или более выше, чем цитотоксичность против клетки, не презентирующей антиген, не ассоциированный с раком. Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЭСС) также включает активацию природных киллерных клеток (ИК клеток), которые опосредуют клеточный киллинг посредством связывания с антителом. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, могут опосредовать АЭСС через N14 клетки посредством связывания эндоглина.
Как использовано в данной заявке, термины пролиферативное расстройство и пролиферативное состояние означают любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризующееся аберрантной или нежелательной пролиферацией. Термины клеточное пролиферативное расстройство и клеточное пролиферативное состояние означают любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризующееся аберрантной или нежелательной клеточной пролиферацией, а также включающее состояния, характеризующиеся нежелательной или неблагоприятной клеточной пролиферацией или клеточным выживанием (например, вследствие недостаточного апоптоза), состояния, характеризующиеся аберрантным или недостаточным апоптозом, а также состояния, характеризующиеся аберрантным или нежелательным либо неблагоприятным клеточным выживанием. Термин расстройство дифференцировки означает любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризующееся аберрантной или недостаточной дифференцировкой.
Пролиферативные расстройства или расстройства дифференцировки, подлежащие лечению, включают заболевания и непатологические физиологические состояния, доброкачественные и неопластические, характеризующиеся аномальным или нежелательным числом клеток, клеточным ростом или клеточным выживанием. Поэтому такие расстройства или состояния могут представлять собой болезненное состояние и включать все типы раковых опухолей или онкогенных процессов, метастатических тканей или трансформированных в злокачественные клеток, тканей или органов, или могут представлять собой непатологическое, т. е. отклонение от нормального, но которое обычно не ассоциировано с заболеванием. Конкретным примером непатологического состояния, которое может быть подвергнуто лечению согласно изобретению, является возобновление роста ткани после заживления раны, которое приводит к образованию рубца.
Клетки, характеризующие пролиферативное расстройство или расстройство дифференцировки, могут быть агрегированы в клеточную массу или рассеяны. Термин солидная опухоль относится к новообразованиям или метастазам, которые обычно агрегируют вместе и образуют массу. Конкретные примеры включают висцеральные опухоли, такие как рак желудка или толстой кишки, гепатомы, почечные карциномы, опухоли/виды рака легкого и головного мозга. Термин несолидная опухоль относится к новообразованиям гематопоэтической системы, таким как лимфомы, миеломы и лейкозы, или новообразованиям, которые являются диффузными по своей природе, поскольку обычно они не образуют твердой массы. Конкретные примеры лейкозов включают, например, острую и хроническую лимфобластную, миелобластную и множественную миелому.
Такие расстройства включают новообразования или виды рака, которые могут поражать фактически любой тип клеток или тканей, например карциному, саркому, меланому, метастатические расстройства или гематопоэтические неопластические расстройства. Метастатическая опухоль может возникать из множества типов первичных опухолей, включая, но не ограничиваясь этим, опухоль молочной железы, легкого, щитовидной железы, головы и шеи, головного мозга, лимфоидной ткани, желудочнокишечного тракта (ротовой полости, пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстой кишки, прямой кишки), мочеполового пути (матки, яичника, шейки матки, мочевого пузыря, яичка, полового члена, предстательной железы), почки, поджелудочной железы, печени, кости, мышцы, кожи и т.д.
Карциномы относятся к злокачественным новообразованиям эпителиальной или эндокринной ткани и включают карциномы дыхательной системы, карциномы желудочно-кишечной системы, карциномы мочеполовой системы, карциномы яичка, карциномы молочной железы, карциномы предстательной железы, карциномы эндокринной системы и меланомы. Типичные карциномы включают карциномы, про- 15 025174 исходящие из шейки матки, легкого, предстательной железы, молочной железы, головы и шеи, толстой кишки, печени и яичника. Термин также включает в себя карциносаркомы, например, которые включают злокачественные опухоли, состоящие из карциноматозных и саркоматозных тканей. Аденокарцинома включает карциному железистой ткани или в которой опухоль образует железистоподобную структуру.
Глазная ткань, подлежащая лечению, представляет собой, например, ретинальную ткань пациента с диабетической ретинопатией, дегенерацией желтого пятна или неоваскулярной глаукомой, и ангиогенез, подлежащий ингибированию, представляет собой ангиогенез в ретинальной ткани, где происходит неоваскуляризация ретинальной ткани.
Раковая ткань, подлежащая лечению, представляет собой, например, эндотелиальную ткань, экспрессирующую аномальный уровень эндоглина. Как использовано в данной заявке, термин трансформированные клетки относится к клеткам, которые спонтанно превратились в состояние неограниченного роста, т. е. они приобрели способность расти вследствие неопределенного числа делений в культуре. Трансформированные клетки можно охарактеризовать такими терминами, как неопластический, анапластический и/или гиперпластический в отношении утраты ими контроля роста. Для целей данного изобретения подразумевается, что термины трансформированный фенотип злокачественных клеток млекопитающих и трансформированный фенотип охватывают, но не ограничиваются этим, любой из следующих фенотипических признаков, ассоциированных с клеточной трансформацией клеток млекопитающих: иммортализацию, морфологическую трансформацию или трансформацию роста и онкогенность, выявляемые по продолжительному росту в клеточной культуре, росту на полутвердых средах или онкогенному росту в иммунонекомпетентных или сингенных животных.
Термин антиген опухолевых клеток определен в данной заявке как антиген, который присутствует в более высоких количествах на опухолевой клетке или в жидкостях организма, чем на не имеющих к нему отношения опухолевых клетках, нормальных клетках или в нормальной жидкости организма. Присутствие антигена можно определить любым из множества анализов, известных специалистам в данной области, и они включают без ограничения, отрицательную и/или положительную селекцию с помощью антител, например ЕЫБА-анализ, радиоиммуноанализ или вестерн-блоттинг.
Термин апоптоз или программируемая гибель клеток относится к физиологическому процессу, посредством которого нежелательные или непригодные клетки удаляются в процессе развития и других нормальных биологических процессов. Апоптоз представляет собой тип клеточной смерти, который происходит в нормальных физиологических условиях, и клетка является активным участником своей собственной гибели (клеточный суицид). Это очень часто происходит в процессе нормального обновления клеточной популяции и тканевого гомеостаза, эмбриогенеза, индукции и поддержания иммунологической толерантности, развития нервной системы и зависимой от эндокринной системы атрофии ткани. Клетки, подвергающиеся апоптозу, демонстрируют характерные морфологические и биохимические признаки. Эти признаки включают агрегацию хроматина, ядерную и цитоплазматическую конденсацию, разделение цитоплазмы и ядра на ограниченные мембранами везикулы (апоптотические тельца), которые содержат рибосомы, морфологически интактные митохондрии и ядерный материал. Ιη νίνο, эти апоптотические тельца быстро распознаются и фагоцитируются макрофагами, дендритными клетками или прилегающими эпителиальными клетками. Благодаря этому эффективному механизму удаления апоптотических клеток ίη νίνο не индуцируется воспалительный ответ. Ιη νίίτο, апоптотические тельца, а также оставшиеся клеточные фрагменты в конце концов набухают и в итоге лизируются. Эта конечная фаза гибели клеток ίη νίίτο была названа вторичным некрозом. Апоптоз можно определять методами, известными специалистам в данной области, такими как фрагментация ДНК, воздействие аннексина V, активация каспаз, высвобождение цитохрома С и т.д. Клетка, гибель которой была индуцирована, называется в данной заявке апоптотической клеткой.
Апоптоз-индуцирующий агент определяют в данной заявке как индуцирующий апоптоз/программируемую гибель клеток и включающий, например, облучение, химиотерапевтические агенты или рецептор-связывающие агенты, где клетки, например опухолевые клетки, индуцируются к программируемой клеточной смерти. Типичные апоптоз-индуцирующие агенты описаны более подробно ниже.
Апоптоз можно определять, используя стандартный анализ апоптоза с помощью аннексина V: клетки ΝΙΗ (Национальный институт здравоохранения 0ΤυΑ):Θν0ΑΚ-3 (рак яичников; от англ. οναπαη саисег) выращивают в 6-луночных планшетах (ΝυΝΟ) и облучают или обрабатывают антагонистом (или в комбинации с другим противораковым лекарственным средством) в течение 4-48 ч, промывают и окрашивают с помощью аннексин ν-НТС (флуоресцеинизотиоцианат) (ΒΌ-ΡΙιαπηίη^η) в течение 1 ч. Клетки анализируют с помощью проточной цитометрии (Βесίοη-^^ск^η8οη, Се110ие51). подвергают контрастному окрашиванию йодидом пропидия и снова анализируют на проточном цитометре.
В. Способы получения и экспрессии гуманизированных антител против эндоглина.
Было разработано химерное моноклональное антитело, которое связывает эндоглин. Это антитело обозначено ТК105 (также известно как с-8№_|).
В одном аспекте антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, были созданы путем гуманизации последовательностей V и νΗ химерного моноклонального антитела ТКС105
- 16 025174 (§Ε0 ΙΌ N0 1 и 39 соответственно).
Гуманизированные иммуноглобулины, в том числе гуманизированные антитела, были сконструированы посредством генетической инженерии. Большинство гуманизированных иммуноглобулинов, которые были описаны ранее, содержат каркас, идентичный каркасу конкретной человеческой иммуноглобулиновой цепи (т.е. акцепторной или реципиентной) и три СЭК из нечеловеческой (т.е. донорной) иммуноглобулиновой цепи. Как описано в данной заявке, гуманизация также может включать критерии, согласно которым ограниченное число аминокислот в каркасе гуманизированной иммуноглобулиновой цепи идентифицируют и выбирают такими же, как и аминокислоты в этих положениях в доноре, а не в акцепторе, для увеличения и поддержания аффинности антитела, содержащего гуманизированную иммуноглобулиновую цепь.
Настоящее изобретение отчасти основано на модели, что двумя причинами, способствующими потере аффинности в предшествующих способах получения гуманизированных антител (с использованием в качестве примеров мышиных антител в качестве источника СЭК), являются следующие: (1) когда мышиные СЭР объединяют с человеческим каркасом, тогда аминокислоты в каркасах вблизи СЭК становятся человеческими вместо мышиных. Без связи с какой-либо теорией, эти измененные аминокислоты могут несколько деформировать СЭК (например, они могут создавать другие электростатические или гидрофобные силы, нежели в донорном мышином антителе, и такие деформированные СЭК не смогут создавать эффективные контакты с антигеном, как это делали СЭК в донорном антителе); (2) кроме того, аминокислоты в исходном мышином антителе вблизи СЭК, но не являющиеся их частью (т.е. все еще являющиеся частью каркаса), могут создавать контакты с антигеном, которые вносят вклад в аффинность. Эти аминокислоты утрачиваются, когда антитело подвергается гуманизации, поскольку, как правило, все каркасные аминокислоты создаются человеческими. Чтобы обойти эти ограничения и получить гуманизированные антитела, имеющие очень высокую аффинность в отношении желаемого антигена, можно конструировать гуманизированные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, используя один или более из следующих далее принципов.
Один из неограничивающих принципов заключается в том, что, например, в качестве акцептора для гуманизации используют каркас из конкретного человеческого иммуноглобулина, который обычно гомологичен донорному иммуноглобулину, или в качестве акцептора используют консенсусный каркас из многих человеческих антител. Например, сравнение последовательности вариабельной области тяжелой (или легкой) цепи мыши с вариабельными областями тяжелой (или легкой) цепи человека в банке данных (например, в Ресурсе идентификации белков Национального фонда медико-биологических исследований (№цюпа1 Вютейюа1 КекеагсЬ Роипйайоп Рго1еш Иепййсайоп Кекоигке) или базе данных по белковым последовательностям Национального центра биотехнологической информации - NСВI) показывает, что степень гомологии в разных человеческих участках может сильно варьировать, например, от примерно 40 до примерно 60, примерно 70, примерно 80% или более. Благодаря выбору в качестве акцепторного иммуноглобулина одной из вариабельных областей тяжелых цепей человека, которая наиболее гомологична вариабельной области тяжелой цепи донорного иммуноглобулина, будет изменено меньшее количество аминокислот при переходе от донорного иммуноглобулина к гуманизированному иммуноглобулину. Благодаря выбору в качестве акцепторного иммуноглобулина одной из вариабельных областей легких цепей человека, которая наиболее гомологична вариабельной области легкой цепи донорного иммуноглобулина, будет изменено меньшее количество аминокислот при переходе от донорного иммуноглобулина к гуманизированному иммуноглобулину. Как правило, с использованием таких методов уменьшается шанс изменения аминокислоты вблизи одного или более СЭК, которое деформирует их конформацию. Кроме того, точная общая конфигурация гуманизированного антитела, содержащего гуманизированную иммуноглобулиновую цепь, может иметь более близкое сходство с конфигурацией донорного антитела, тем самым также уменьшая шанс деформации СЭК.
Кроме того, в качестве акцепторных последовательностей также можно использовать легкие и тяжелые цепи из одного и того же человеческого антитела для повышения вероятности того, что гуманизированные легкие и тяжелые цепи создадут благоприятные контакты друг с другом. Альтернативно, в качестве акцепторных последовательностей также можно использовать легкие и тяжелые цепи из разных последовательностей зародышевой линии человеческих антител; когда используют такие комбинации, можно легко определить, связывают ли Ун и Уъ интересующий эпитоп, используя традиционные анализы (например, ЕЫ§А). В одном примере будет выбрано человеческое антитело, в котором последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, взятые вместе, в целом наиболее гомологичны последовательностям донорных вариабельных областей легкой и тяжелой цепей. Иногда последовательности тяжелой цепи будут придавать большую массу. Независимо от того, какой акцепторный иммуноглобулин будет выбран, в некоторых случаях можно добиться более высокой аффинности путем выбора небольшого числа аминокислот в каркасе гуманизированной иммуноглобулиновой цепи такими же, как и аминокислоты в этих положениях в доноре, а не в акцепторе. Способы созревания аффинности известны в данной области.
Гуманизированные антитела обычно имеют по меньшей мере три потенциальных преимущества по сравнению с мышиными или химерными антителами для применения в терапии человека. Поскольку
- 17 025174 эффекторная область антитела является человеческой, считают, что она лучше взаимодействует с другими частями иммунной системы человека (например, разрушает клетки-мишени более эффективно посредством комплемент-зависимой цитотоксичности (СЭС) или антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС)). Кроме того, иммунная система человека не должна распознавать каркас или константную область гуманизированного антитела как чужеродную, и поэтому антительный ответ против такого инъецируемого антитела обычно должен быть более слабым, чем против полностью чужеродного мышиного антитела или частично чужеродного химерного антитела. И наконец, известно, что мышиные антитела имеют период полувыведения из кровотока человека намного более короткий, чем период полувыведения человеческих антител. Гуманизированные антитела предположительно могут иметь период полувыведения более приближенный к природным человеческим антителам, что позволяет вводить меньшие дозы и с меньшей частотой.
Гуманизацию антител и их антигенсвязывающих фрагментов можно осуществить различными методами, известными в данной области и описанными в данной заявке. Аналогично, получение гуманизированных антител также можно осуществить методами, известными в данной области и описанными в данной заявке.
Методы модификаций каркасных участков известны в данной области и рассматриваются в данной заявке. Выбор одного или более релевантных аминокислотных положений в каркасе, подлежащих изменению, зависит от множества критериев. Один из критериев выбора релевантных аминокислот в каркасе, подлежащих изменению, может представлять собой относительное различие в аминокислотных остатках каркаса между донорной и акцепторной молекулами. С использованием этого подхода выбор релевантных положений в каркасе, подлежащих изменению, имеет то преимущество, что позволяет избежать любых субъективных ошибок при определении остатков или любых ошибок при определении вклада каждого такого остатка СОК в аффинность связывания.
Другим критерием, который может быть использован для определения релевантных аминокислотных положений, подлежащих изменению, может быть, например, выбор каркасных остатков, которые, как известно, важны или вносят вклад в конформацию СОК. Например, для конформации и/или структуры СОК важными являются канонические каркасные остатки. Ориентация на канонический каркасный остаток в качестве релевантного положения, подлежащего изменению, может быть использована для идентификации более приемлемого аминокислотного остатка в смысле ассоциированной с ним донорной последовательности СОК.
Частота встречаемости аминокислотного остатка в конкретном положении в каркасе представляет собой другой критерий, который может быть использован для выбора релевантных аминокислотных положений в каркасе, подлежащих изменению. Например, сравнивая выбранный каркас с другими каркасными последовательностями в пределах его подсемейства, можно обнаружить остатки, которые присутствуют с минимальной частотой встречаемости в конкретном(ых) положении или положениях. Положения, несущие менее часто встречающиеся остатки, аналогичным образом подходят для выбора в качестве подлежащего изменению положения в акцепторном каркасе вариабельной области.
Релевантные аминокислотные положения, подлежащие изменению, также могут быть выбраны, например, исходя из близости к СОК. В некоторых смыслах, РК остатки могут принимать участие в конформации СОК и/или в связывании с антигеном. Кроме того, этот критерий аналогично можно использовать для ранжирования релевантных положений, выбранных согласно другим критериям, описанным в данной заявке. Поэтому установление различия между остатками, проксимальными и дистальными по отношению к одному или более СОК, представляет собой один из путей уменьшения числа релевантных положений, подлежащих изменению.
Другие критерии для выбора релевантных аминокислотных положений в каркасе, подлежащих изменению, включают, например, остатки, которые, как известно или прогнозируется, расположены в трехмерном пространстве вблизи поверхности раздела антиген-СГОК или как прогнозируется, они модулируют активность СОК. Аналогично, можно выбрать каркасные остатки, которые, как известно или прогнозируется, образуют контакты на поверхности раздела между вариабельными доменами тяжелой (УН) и легкой (Уъ) цепей. Такие положения в каркасе могут влиять на конформацию и/или аффинность СОК путем модулирования СГОК-связывающего кармана, взаимодействия с антигеном (эпитопом) или взаимодействия между УН и Уь. Поэтому выбор этих аминокислотных положений с целью конструирования разнообразной популяции для скрининга связывающей активности можно использовать для идентификации каркасных изменений, в результате которых происходит замена остатков, оказывающих неблагоприятные эффекты на конформацию СОК, или компенсация неблагоприятных эффектов остатков, присутствующих где-либо еще в каркасе.
Другие каркасные остатки, которые могут быть выбраны для изменения, включают аминокислотные положения, являющиеся недоступными для растворителя. Такие остатки обычно погружены в вариабельную область и поэтому способны влиять на конформацию СОК или на взаимодействия между УН И Уъ. Доступность для растворителя можно предсказать, например, на основании относительной гидрофобности окружения, создаваемого аминокислотными боковыми цепями полипептида и/или на основании известных данных по трехмерной структуре.
- 18 025174
После выбора релевантных аминокислотных положений в донорных СОК, а также любых релевантных аминокислотных положений в каркасных участках, в которых желательно выполнить изменения, в нуклеиновые кислоты, кодирующие акцепторный каркас вариабельной области и донорные СОК, могут быть включены изменения, соответствующие аминокислотным изменениям в некоторых или во всех выбранных положениях. Измененные каркасные или СОК-последовательности могут быть получены и протестированы по отдельности или могут быть последовательно или одновременно объединены и протестированы.
Разнообразие в любом или во всех измененных положениях может характеризоваться диапазоном от нескольких до большинства разных аминокислотных остатков, включая все двадцать природных аминокислот или их функциональных эквивалентов и аналогов. В некоторых случаях также могут рассматриваться неприродные аминокислоты, и они известны в данной области.
Выбор числа и расположения аминокислотных положений, подлежащих изменению, является не жестким и может зависеть от предполагаемого применения и желаемой эффективности в отношении идентификации измененной вариабельной области, имеющей желаемую активность, например, по существу, такую же или более высокую аффинность связывания по сравнению с донорной вариабельной областью. В этом смысле, чем больше число изменений, внесенных в популяцию измененных вариабельных областей, тем с более высокой эффективностью можно будет идентифицировать по меньшей мере одну разновидность, которая демонстрирует желаемую активность, например, по существу, такую же или более высокую аффинность связывания, что и у донора. Альтернативно, если у пользователя имеются эмпирические или реальные данные относительно того, что определенные аминокислотные остатки или положения вносят непропорциональный вклад в аффинность связывания, то может быть желательно получить ограниченную популяцию измененных вариабельных областей, которая будет сфокусирована на изменениях в пределах или вокруг этих идентифицированных остатков или положений.
Например, если желательны СОК-привитые вариабельные области, то большая разнообразная популяция измененных вариабельных областей может включать все неидентичные положения в каркасном участке между донорным и акцепторным каркасом и все изменения в одном аминокислотном положении СОК. Альтернативно, популяция, характеризующаяся средним разнообразием, может включать подгруппы, например, только близко расположенных неидентичных положений в каркасе, подлежащих включению, вместе со всеми изменениями в одном аминокислотном положении СОК, например, для увеличения аффинности гуманизированных антител или антигенсвязывающих фрагментов. Разнообразие вышеупомянутых популяций также может быть увеличено, например, путем дополнительного включения всех попарных изменений аминокислотных положений в СОК. В отличие от этого, для скрининга и идентификации измененной вариабельной области антитела аналогичным образом могут быть сконструированы популяции, фокусирующиеся на предварительно установленных остатках или положениях, которые включают вариантные остатки минимум по одному аминокислотному положению в каркасе и/или в СОК. Как и в случае вышеупомянутых популяций, разнообразие таких фокусированных популяций также может быть увеличено путем дополнительного расширения положений, выбранных для изменения с целью включения других релевантных положений в один из двух или в оба каркасных и СОК участка. Имеются другие многочисленные комбинации в диапазоне от нескольких изменений до многочисленных изменений в одном из двух или в обоих каркасных участках и СОК, которые могут быть дополнительно использованы, которые все будут приводить к получению популяции измененных вариабельных областей, которые могут быть подвергнуты скринингу с целью идентификации по меньшей мере одной измененной СОК-привитой вариабельной области, имеющей желаемую активность, например, связывающую активность с эндоглином. Специалисты в данной области будут знать или смогут определить, какие выбранные положения остатков в каркасе или донорных СОК, либо их подгруппах, могут варьироваться с целью получения популяции для скрининга и идентификации измененного антитела по изобретению с учетом разъяснений и инструкций, приведенных в данной заявке. Кодоны, кодирующие аминокислоты, известны в данной области.
Другой способ гуманизации антител включает способ, названный супергуманизацией. Супергуманизация включает стадии получения пептидной последовательности для рассматриваемой вариабельной области, кодируемой геном нечеловеческого зрелого антитела, и идентификации первой группы типов канонической структуры СОК по меньшей мере для двух СОК в прееделах вариабельной области нечеловеческого антитела. Типы канонической структуры СОК представляют собой структурные типы, обозначаемые согласно С1ю11иа (С1ТЕ). ΟΗοίΗίη с соавт. обнаружил, что критические участки СОК из многих антител принимают почти идентичные конформации пептидного остова, несмотря на большое разнообразие на уровне аминокислотной последовательности. Соответственно С1ю11иа определил для каждого СОК в каждой цепи одну или несколько канонических структур. Каждая каноническая структура определяет прежде всего набор торсионных углов пептидного остова для непрерывного сегмента аминокислотных остатков, образующих петлю.
После идентификации типа канонической структуры СОК также получают библиотеку пептидных последовательностей для человеческих антительных вариабельных областей для человеческих антител. Эта библиотека содержит последовательности для вариабельных областей человеческой зародышевой
- 19 025174 линии, которые кодируются сегментами нуклеиновой кислоты зародышевой линии и могут включать последовательности зрелых человеческих антител. В любом случае способ включает идентификацию типов канонической структуры СОК (т.е. вторую группу типов канонической структуры СОК) по меньшей мере для двух СОК для каждой последовательности в библиотеке последовательностей человеческих вариабельных областей. Из этой библиотеки выбирают подгруппу кандидатных последовательностей, сравнивая первую группу типов канонической структуры СОК со второй группой типов канонической структуры СОК (т.е. сравнивая типы канонической структуры мышиных СОК с типами канонической структуры человеческих СОК в соответствующих местах локализации в пределах вариабельной области) и выбирая те человеческие последовательности, где вторая группа типов канонической структуры СОК является такой же, как и первая группа типов канонической структуры СОК для последовательностей СОК в соответствующих местах локализации в пределах нечеловеческих и человеческих вариабельных областей соответственно. В данном способе эти кандидатные последовательности человеческих вариабельных областей используются в качестве основы для конструирования химерной молекулы, которая включает по меньшей мере две СОК последовательности из нечеловеческой вариабельной области (например, из мышиных СОК), объединенные с каркасныим участками из кандидатных последовательностей человеческих вариабельных областей. Результатом конструирования является то, что химерное антитело содержит каждую из нечеловеческих СОК последовательностей, замененную на каждую из человеческих СОК последовательностей в соответствующих местах локализации в вариабельных областях, так что каркасные последовательности в химерном антителе отличаются от кандидатных человеческих каркасных последовательностей.
Сходство рассматриваемых СОК из кандидатных последовательностей человеческих антител оценивают для каждого домена на двух уровнях. В первую очередь отыскивают идентичные трехмерные конформации пептидных остовов СОК. Экспериментально определенные атомные координаты рассматриваемых СОК редко доступны, поэтому пространственное сходство аппроксимируют, определяя для рассматриваемых СОК типы канонической структуры согласно С1ю11иа и исключая из дальнейшего рассмотрения кандидатов с другими каноническими структурами. Во вторую очередь учитывают гомологию остаток-к-остатку между рассматриваемыми СОК и остальными человеческими кандидатными СОК и выбирают кандидата с самой высокой гомологией.
Выбор наиболее высокой гомологии основан на различных критериях, используемых для ранжирования кандидатных человеческих вариабельных областей, имеющих ту же каноническую структуру, что и рассматриваемые нечеловеческие вариабельные области. Критерий ранжирования представителей выбранной группы может быть основан на идентичности аминокислотных последовательностей или аминокислотной гомологии или на них обеих. Аминокислотная идентичность просто представляет собой балл для положения, определяемый числом совпадений положений аминокислотных остатков. Сходство по аминокислотной гомологии представляет собой положение, определяемое сходством положений в структуре или природе остатков. Гомология может быть оценена в баллах, например, согласно таблицам и процедурам, описанным в нсшкоГГ апД неткоГГ, (1992) Ашто асИ киЬкШийои та1псс5 Ггот рго1еш Ь1оск8, Ргос. №11. АсаД. Зск, 89: 10915-10919 или с использованием ВЬ03иМ, описанной неткоГГ и неткоГГ (1996). Эти стадии приведены ниже.
а) Определить пептидные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи рассматриваемого антитела. Их можно определить любым из нескольких методов, таких как ДНК секвенирование соответствующих генов после традиционного клонирования кДНК; ДНК секвенирование клонируемых продуктов, которые были амплифицированы в результате полимеразной цепной реакции из обратных транскриптов или ДНК рассматриваемой гибридомной линии; или пептидное секвенирование очищенного белка антитела.
б) Применить систему нумерации по КаЬа1 (КаЬа1 и др., там же, 1991) к последовательностям тяжелой и легкой цепей рассматриваемого нечеловеческого антитела. Определить типы канонической структуры для каждого из СОК рассматриваемого нечеловеческого антитела. Это определение выполняется на основании изучения пептидной последовательности с учетом рекомендаций, рассмотренных С1ю11иа и Ьекк (1987), С1ю11иа и др. (1992), ТотНикои и др. (1995), Магйи и ТйогпЮп (1996) и АШа/Пкии и др. (1997).
Отличительные признаки определения канонической структуры для каждого из СОК приведены ниже. Для СОК1 тяжелой цепи в настоящее время известны три типа канонической структуры. Распределение новой последовательности является простым, поскольку каждый тип канонической структуры имеет разное количество остатков. Как описано АШа/Пкии и др. (1997), если для данной последовательности задается нумерация по КаЬаГ то нумерация для остатков 31-35 будет такой, как она приведена ниже для соответствующих канонических структур:
каноническая структура 1-го типа: 31, 32, 33, 34, 35. каноническая структура 2-го типа: 31, 32, 33, 34, 35, 35а. каноническая структура 3-го типа: 31, 32, 33, 34, 35, 35а, 35Ь.
Для СОК2 тяжелой цепи в настоящее время известны четыре типа канонической структуры. Некоторые из них имеют уникальные количества остатков, и их легко отличить от их уникальной нумерации
- 20 025174 по КаЬа! для положений 52-56, а именно:
каноническая структура 1-го типа: 52, 53, 54, 55, 56; каноническая структура 4-го типа: 52, 52а, 52Ь, 52с, 53, 54, 55, 56.
Каноническая структура 2-го и 3-го типов для СЭК2 тяжелой цепи имеет равное число остатков, поэтому необходимо различать по признакам в пределах их последовательности, как было рассмотрено Οιοίΐιίη и др. (1992). Нумерация по КаЬа! сегмента, содержащего эти признаки, представляет собой: 52, 52а, 53, 54, 55. Каноническая структура 2-го типа имеет Рго или §ег в положении 52а и О1у или §ег в положении 55, без ограничения по другим положениям. Каноническая структура 3-го типа имеет О1у, 8ег, Аки или Αδρ в положении 54, без ограничения по другим положениям. В большинстве случаев этих критериев достаточно для получения правильного распределения. Кроме того, каркасный остаток 71 обычно представляет собой Α1;·γ Уа1, Ьеи, 11е или ТЬг для канонической структуры 2-го типа и обычно Αγ§ для канонической структуры 3-го типа.
СЭР3 тяжелой цепи характеризуется наибольшим разнообразием из всех СОК. Он образуется с помощью генетических процессов несколько случайного характера, уникального для лимфоцитов. Поэтому трудно предсказать канонические структуры для ί'.ΌΡ3. В любом случае У-генные сегменты человеческой зародышевой линии не кодируют любую часть СОК3, поскольку У-генные сегменты заканчиваются в положении 94 по КаЬа!, в то время как СЭК3 кодируется положениями 95-102. По этим причинам канонические структуры СОК3, как правило, не учитываются при выборе кандидатных человеческих последовательностей.
Что касается ί'.ΌΡ1 легкой цепи, то в настоящее время известны шесть типов канонической структуры для СЭК1 в каппа-цепях. Каждый тип канонической структуры имеет разное количество остатков, поэтому соотнесение типа канонической структуры с новой последовательностью является очевидным из нумерации по КаЬа! для положений остатков 27-31.
Каноническая структура 1-го типа Каноническая структура 2-го типа Каноническая структура 3-го типа Каноническая структура 4-го типа Каноническая структура 5-го типа Каноническая структура 6-го типа
27, 29, 30, 31.
27, 28, 29, 30, 31.
27, 27а, 27Ь, 27с, 27б, 27е, 27Г, 28, 29, 30,31.
27, 27а, 27Ь, 27с, 27б, 27е, 28, 29, 30, 31.
27, 27а, 27Ь, 27с, 27б, 28, 29, 30, 31.
27, 27а, 28, 29, 30, 31.
Что касается ί'.ΌΡ2 легкой цепи, то известен только один тип канонической структуры для СЭК2 в каппа-цепях, поэтому, кроме необычных рассматриваемых последовательностей антител, соотнесение осуществляется автоматически. Что касается ί'.ΌΡ3 легкой цепи, то описано вплоть до шести типов канонической структуры для ί'.ΌΡ3 в каппа-цепях, однако три из них встречаются редко. Три часто встречающиеся последовательности можно различить на основании их длины, как отражено в нумерации по КаЬа! положенияй остатков 91-97:
каноническая структура 1-го типа: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 (также вместе с обязательным Рго в положении 95 и О1п, Αδη или Ηίδ в положении 90);
каноническая структура 3-го типа: 91, 92, 93, 94, 95, 97; каноническая структура 5-го типа: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 96а, 97.
После идентификации типов канонической структуры СОК рассматриваемого нечеловеческого антитела, человеческие гены цепи того же типа (тяжелой или легкой), которые имеют ту же комбинацию типов канонической структуры, что и рассматриваемое антитело, идентифицируют для образования кандидатной группы человеческих последовательностей. Большинство этих генных фрагментов описаны и уже соотнесены с типом канонической структуры (СЬобиа и др., 1992, ТошПпкоп и др., 1995).
Что касается тяжелой цепи, то оценивают соответствие ί'.ΌΚ1 и СЭК2 типам канонической структуры мышиного антитела и исключают несоответствующие гены. Что касается легкой цепи, то сначала оценивают соответствие СЭР 1 и СЭК2 каждой человеческой последовательности типам канонической структуры рассматриваемого антитела. Оценивают способность остатков 89-95 кандидатного гена Ук образовывать СЭК3 того же типа канонической структуры, что и у рассматриваемого антитела, исходя из слияния данного гена с 1-областью и применяя критерии определения типа канонической структуры СОК для СЭК3 в этой слитой последовательности, и несоответствующие последовательности исключают.
Альтернативно, когда вариабельный домен рассматриваемого антитела имеет тип канонической структуры, отсутствующий в человеческом геноме, то для сравнения рассматривают У-гены человеческой зародышевой линии, которые имеют трехмерные сходным, но не идентичные, типы канонической структуры. Такой случай часто имеет место для СЭР 1 каппа-цепи в мышиных антителах, включая два примера, описанных ниже. В мышиных антителах в этом СОК были обнаружены все 6 возможных типов канонической структуры, в то время как геном человека кодирует только канонические типы 2, 3, 4 и 6. В этих случаях для сравнения может быть выбран тип канонической структуры СОК, имеющий длину аминокислотных остатков в пределах двух длин аминокислотных остатков рассматриваемой нечеловеческой последовательности. Например, если в рассматриваемом антителе обнаружена каноническая струк- 21 025174 тура 1-го типа, то для сравнения используют человеческие Ук -последовательности с канонической структурой 2-го типа. Если в мышином антителе обнаружена каноническая структура 5-го типа, то для сравнения используют человеческие Ук -последовательности с канонической структурой либо 3-го, либо 4-го типа.
Для сравнения последовательностей можно рассматривать последовательности зрелых, перегруппированных человеческих антител. Такое рассмотрение может быть оправдано в ряде случаев, включая, но не ограничиваясь этим, примеры, когда зрелая человеческая последовательность (1) очень близка к зародышевой линии; (2) известна как неиммуногенная для людей; или (3) содержит тип канонической структуры, идентичный таковому для рассматриваемого антитела, но не обнаруженный в человеческой зародышевой линии.
Что касается каждого из кандидатных У-генов с соответствующими типами канонической структуры, то идентичность и/или гомологию последовательностей по типу остаток-к-остатку в рассматриваемой последовательности также оценивают с целью ранжирования кандидатных человеческих последовательностей. Например, оцениваемые остатки являются следующими: (1) положения аминокислотных остатков СОК легкой цепи каппа (к) представляют собой СЭК1 (26-32), СЭК2 (50-52), СЭК3 (91-96); и (2) положения аминокислотных остатков СОК тяжелой цепи представляют собой СЭК1 (31-35) и СЭК2 (50-60). Кроме того, также можно рассматривать положения аминокислотных остатков 95-102 в СЭК3 тяжелой цепи.
Сначала оценивают в баллах гомологию остаток-к-остатку по количеству идентичных аминокислотных остатков между рассматриваемой последовательностью и кандидатными человеческими последовательностями. Человеческую последовательность, используемую для последующего конструирования преобразованного антитела, выбирают среди 25% кандидатов с самым высоким баллом. Если это целесообразно, например, когда несколько кандидатных последовательностей имеют аналогичные баллы в отношении идентичности, тогда можно дополнительно рассмотреть, при необходимости, сходство между неидентичными аминокислотными остатками. К указанным баллам добавляют совпадения между рассматриваемыми и целевыми остатками по типу алифатический-с-алифатическим, ароматический-сароматическим или полярный-с-полярным. В другом примере может быть проведена количественная оценка гомологии последовательностей с использованием матриц аминокислотных замен, таких как матрица ВЬО§иМ62 от НешкоГГ и НешкоГГ.
Целевую последовательность для каркасного участка, находящегося на С-конце последовательности СОК3, можно выбрать из набора известных 1-сегментов человеческой зародышевой линии. Iпептидную последовательность выбирают по результатам оценки гомологии остаток-к-остатку для каждого 1-сегмента для положений последовательности, по которым СЭК3 и I перекрываются, используя критерии бальной оценки, установленные для оценки кандидатных У-генов, как упомянуто выше. Пептидную последовательность Ι-генного сегмента, используемую для последующего конструирования преобразованного антитела, выбирают среди 25% кандидатов с самым высоким баллом.
В качестве примера химерная вариабельная цепь содержит по меньшей мере два СОК из рассматриваемой нечеловеческой последовательности и каркасные последовательности из кандидатной человеческой последовательности. В другом примере химерная легкая цепь содержит три СОК из рассматриваемой нечеловеческой последовательности и каркасные последовательности из кандидатной человеческой последовательности. В дополнительных примерах химерная тяжелая цепь содержит по меньшей мере два СОК из рассматриваемой тяжелой цепи и каркасную последовательность из кандидатной человеческой тяжелой цепи, или химерная тяжелая цепь содержит каждый из СОК из рассматриваемой тяжелой цепи и каркасные последовательности из кандидатной человеческой тяжелой цепи. В еще одном другом примере тяжелая цепь химерного антитела содержит СОК 1 и 2 из рассматриваемой нечеловеческой последовательности и остатки 50-60 для ί'.ΌΡ3 и остатки 61-65 для СОК из кандидатной человеческой тяжелой цепи вместе с каркасными последовательностями кандидатной человеческой последовательности. В другом примере последовательность химерной тяжелой цепи содержит каждый СОК из рассматриваемой нечеловеческой последовательности; каркасные последовательности 27-30 из рассматриваемой последовательности и каркасные последовательности из кандидатных последовательностей. Однако во всех случаях молекула химерного антитела содержит не более 10 аминокислотных остатков в каркасной последовательности, которые отличаются от остатков в каркасной последовательности кандидатной человеческой вариабельной области.
Если желательно иметь гуманизированное антитело с повышенной аффинностью, то остатки в пределах СОК пребразованного антитела могут быть дополнительно заменены на другие аминокислоты. Обычно изменяют не более четырех аминокислотных остатков в СОК, и чаще всего будут изменены не более двух остатков в СОК, за исключением СЭК2 тяжелой цепи, где могут быть изменены вплоть до 10 остатков. Изменения аффинности могут быть измерены традиционными способами, такими как способы, описанные в данной заявке (например, В1асоге).
Способы супергуманизации антител описаны более подробно в патенте США № 6881557, который таким образом включен посредством ссылки во всей своей полноте.
- 22 025174
Гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут быть сконструированы и получены с использованием традиционных методов, известных в данной области. Кроме того, полученные рекомбинантным способом антитела часто могут продуцироваться в больших количествах, в частности, при использовании векторов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии.
Антитела могут быть секвенированы с использованием традиционных методов, известных в данной области. В одном аспекте аминокислотные последовательности одного или более СОК встроены в синтетическую последовательность, например, каркаса человеческого антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) с целью создания человеческого антитела, которое могло бы ограничить неблагоприятные побочные реакции лечения пациента-человека нечеловеческим антителом. Аминокислотные последовательности одного или более СОК также могут быть встроены в синтетическую последовательность, например, в связывающий белок, такой как АВИМЕР™, с целью создания конструкции для введения пациенту-человеку. Такие методы можно модифицировать в зависимости от вида животного, подлежащего лечению. Например, что касается применений в ветеринарии, то антитело, антигенсвязывающий фрагмент или связывающий белок могут быть синтезированы для введения субъекту, не являющемуся человеком (например, примату, корове, лошади и т.д.).
В другом аспекте, используя принятые в данной области техники методы, такие как методы, предложенные и включенные в данное описание, можно встраивать нуклеотиды, кодирующие аминокислотные последовательности одного или более СОК, например, с помощью рекомбинантных методов в сайтах рестрикции эндонуклеазами существующего полинуклеотида, который кодирует антитело, антигенсвязывающий фрагмент или связывающий белок.
Что касается экспрессии, то экспрессирующая система представляет собой систему, в которой применяется Οδ-система (Ьопиа), использующая ген глутаминсинтетазы в качестве селектируемого маркера. Кратко, трансфекцию осуществляют в клетках СНО путем электропорации (250 В) с помощью Οδсистемы (Ьопиа), в которой используют ген глутаминсинтетазы в качестве селектируемого маркера. Клетки СНО дикого типа выращивали в ΌΜΕΜ (81дша), содержащей 10% диализованной фетальной телячьей сыворотки (РС8), с 2 мМ глутамином. 6х107 клеток СНО подвергают трансфекции с помощью 300 мкг линеаризованной ДНК путем электропорации. После электропорации клетки ресуспендируют в ΌΜΕΜ с глутамином и высевают в 36х96-луночные планшеты (50 мкл/лунка) и инкубируют при 37°С в 5% СО2. На следующие сутки добавляют по 150 мкл/лунка селективной среды (ΌΜΕΜ без глутамина). Приблизительно через 3 недели колонии подвергают скринингу с помощью ΕΌΙδΑ (см. ниже), используя нерелевантное антитело в качестве отрицательного контроля. Все колонии, продуцирующие более 20 мкг/мл, переносят в 24-луночные планшеты и затем в дублирующие флаконы Т25.
Что касается продукции на высоком уровне, то широко используемая экспрессирующая система млекопитающих представляет собой систему, в которой используют процедуру амплификации генов, обеспечиваемую дефектными по дегидрофолатредуктазе (άΜτ-) клетками яичника китайского хомячка. Эта система хорошо известна специалистам в данной области. Система основана на гене дегидрофолатредуктазы бЫт, который кодирует фермент ΌΗΡΚ. катализирующий превращение дегидрофолата в тетрагидрофолат. Для достижения высокого уровня продукции, йМг- клетки СНО подвергают трансфекции экспрессирующим вектором, содержащим функциональный ген ΌΗΡΚ вместе с геном, который кодирует целевой белок. В этом случае целевой белок представляет собой тяжелую цепь и/или легкую цепь рекомбинантного антитела.
При увеличении количества конкурентного ингибитора ΌΗΡΚ метотрексата (МТХ) рекомбинантные клетки развивают устойчивость посредством амплификации гена йМг. В стандартных случаях размер используемой единицы амплификации гораздо больше размера гена йМг и в результате тяжелая цепь антитела амплифицируется совместно.
При крупномасштабном получении белка, такого как цепь антитела, желательно, чтобы в расчет принимался как уровень экспрессии, так и стабильность используемых клеток. В долгоживущей культуре популяции рекомбинантных клеток СНО утрачивают однородность в отношении продуцирования ими конкретного антитела в процессе амплификации, даже если они происходят из одного родительского клона.
Согласно настоящему изобретению предложены выделенный полинуклеотид (нуклеиновая кислота), кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как описано в данной заявке, векторы, содержащие такие полинуклеотиды, и клетки-хозяева и экспрессирующие системы для транскрипции и трансляции таких полинуклеотидов в полипептиды.
Согласно настоящему изобретению также предложены конструкции в форме плазмид, векторов, транскрипционных или экспрессирующих кассет, которые содержат по меньшей мере один полинуклеотид, упомянутый выше.
Согласно настоящему изобретению также предложена рекомбинантная клетка-хозяин, которая содержит одну или более конструкций, упомянутых выше. Нуклеиновая кислота, кодирующая любое антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, которая предложена как таковая, образует аспект настоящей заявки, согласно которому предложен способ получения антитела или
- 23 025174 его антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, который включает экспрессию посредством этого кодирующей нуклеиновой кислоты. Экспрессия удобно достигается путем культивирования в соответствующих условиях рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих данную нуклеиновую кислоту. После продукции посредством экспрессии антитело или антигенсвязывающий фрагмент можно выделить и/или очистить с помощью любого подходящего метода, затем использовать соответствующим образом.
Конкретные антитела, антигенсвязывающие фрагменты и кодирующие молекулы нуклеиновых кислот и векторы, описанные в данной заявке, могут быть предложены выделенными и/или очищенными, например, из их естественного окружения, по существу, в чистой или гомогенной форме. В данном случае нуклеиновая кислота не содержит или по существу не содержит нуклеиновую кислоту или гены, имеющие происхождение, отличное от последовательности, кодирующей полипептид с необходимой функцией. Нуклеиновая кислота может содержать ДНК или РНК и может быть полностью или частично синтетической. Способы очистки хорошо известны в данной области.
Системы клонирования и экспрессии полипептида во многих различных клетках-хозяевах хорошо известны. Подходящие клетки-хозяева включают клетки бактерий, млекопитающих, дрожжей и бакуловирусные системы. Линии клеток млекопитающих, доступные в данной области для экспрессии гетерологичного полипептида, включают клетки яичника китайского хомячка, клетки НеЬа, клетки почки новорожденного сирийского хомячка, клетки мышиной миеломы Νδ0 и многие другие. Самым распространенным бактериальным хозяином является Е. сой.
Экспрессия антител и фрагментов антител в прокариотических клетках, таких как Е. сой, является общепринятой в данной области. В качестве обзора см., например, Р1иск1йип, А. Вю/Тесйпо1о§у, 9: 545551 (1991). Экспрессия в эукариотических клетках в культуре также доступна специалистам в данной области в качестве варианта получения антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, см. недавние обзоры, например, РаГГ, М.Е. (1993) Сигг. Оршюп Вю!есй., 4: 573-576; ТгШ И е! а1. (1995) Сигг. Ор1пюп Вю!есй., 6: 553-560, каждый из которых включен в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.
Могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие соответствующие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, терминаторные последовательности, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие последовательности, в зависимости от ситуации. Векторы могут быть плазмидами, вирусными, например фагом, или фагмидными, в зависимости от ситуации. Подробнее см., например, Мо1еси1аг С1отпд: а ЬаЪога!огу Мапиа1: 2пй еййюп, §атЪгоок е! а1., 1989, Со1й 8ргшд НагЬог БаЬогаЮгу Рге§8. Многие известные методы и протоколы для работы с нуклеиновой кислотой, например, для получения конструкций нуклеиновых кислот, для мутагенеза, секвенирования, введения ДНК в клетки и генной экспрессии и анализа белков, подробно описаны в §йой РгоЮсой ш Мо1еси1аг Вю1о§у, 8есопй Еййюп, Аи8иЪе1 е! а1. ей8., 1ойп Айеу & 8оп8, 1992. Методы, описанные 8атЪгоок и др. и Аи8иЪе1 и др., включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте и хорошо известны в данной области.
Таким образом, в другом аспекте предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту, которая описана в данной заявке. В еще одном аспекте предложен способ, включающий введение такой нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Для введения можно использовать любой подходящий метод. Что касается эукариотических клеток, то подходящие методы могут включать, например, трансфекцию с использованием фосфата кальция, ОЕАЕ-декстрана, электропорацию, опосредованную липосомами трансфекцию и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса, например вируса осповакцины, или, для клеток насекомых, бакуловируса. Что касается бактериальных клеток, то подходящие методы могут включать, например, трансформацию с использованием хлорида кальция, электропорацию и трансфекцию с использованием бактериофага.
После введения можно инициировать или сделать возможной экспрессию нуклеиновой кислоты, например, путем культивирования клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии данного гена.
В одном из воплощений нуклеиновая кислота интегрирована в геном (например, хромосому) клетки-хозяина. Интеграцию можно стимулировать путем включения последовательностей, которые способствуют рекомбинации с геномом, согласно стандартным способам. Для максимизации экспрессии можно использовать 1§-энхансер, при необходимости.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ, включающий применение конструкции, как указано выше, в экспрессирующей системе для экспрессии антител или их антигенсвязывающих фрагментов, упомянутых выше.
Настоящее изобретение также относится к выделенным нуклеиновым кислотам, таким как рекомбинантные молекулы ДНК или клонированные гены либо их вырожденные варианты, мутанты, аналоги или их фрагменты, которые кодируют антитело или антигенсвязывающую последовательность, описанные в данной заявке, которые связывают эндоглин.
В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данной заявке, которые связывают эндоглин.
- 24 025174
В другом воплощении полная ДНК-последовательность рекомбинантной молекулы ДНК или клонированного гена антитела или антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данной заявке, может быть функционально связана с контролирующей экспрессию последовательностью, которая может быть введена в подходящего хозяина. Данная заявка соответственно распространяется на одноклеточных хозяев, трансформированных клонированным геном или рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую УН и/или Уъ, или их участки, данного антитела.
Другим признаком является экспрессия последовательностей ДНК, описанных в данной заявке. Как хорошо известно в данной области, последовательности ДНК могут экспрессироваться в результате функционального связывания их с контролирующей экспрессию последовательностью в соответствующем экспрессирующем векторе и применения такого экспрессирующего вектора для трансформации соответствующего одноклеточного хозяина.
Такое функциональное связывание последовательности ДНК с контролирующей экспрессию последовательностью несомненно включает, если не часть последовательности ДНК, то обеспечение инициирующего кодона АТС в корректной рамке считывания выше последовательности ДНК.
Полинуклеотиды и векторы могут быть предложены в выделенной и/или очищенной форме (например, не содержащей или по существу не содержащей полинуклеотидов, имеющих происхождение, отличное от полинуклеотида, кодирующего полипептид с необходимой функцией). Как использовано в данной заявке, термин по существу, чистый и по существу, не содержащий относится к раствору или суспензии, содержащему (ей) менее чем, например, примерно 20% или меньше примеси, примерно 10% или меньше примеси, примерно 5% или меньше примеси, примерно 4% или меньше примеси, примерно 3% или меньше примеси, примерно 2% или меньше примеси или примерно 1% или меньше примеси.
Для экспрессии последовательностей ДНК по данному изобретению можно использовать целый ряд комбинаций хозяин/экспрессирующий вектор. Полезные экспрессирующие векторы, например, могут состоять из сегментов хромосомных, нехромосомных и синтетических последовательностей ДНК. Подходящие векторы включают, но не ограничиваются этим, производные §У40 (обезьяний вирус 40) и известные бактериальные плазмиды, например плазмиды Е. сой со1 Е1, Рсг1, РЬг322, РтЬ9 и их производные, плазмиды, такие как КР4; фаговые ДНК, например многочисленные производные фага А, например НМ989. и ДНК другого фага, например М13, и однонитевую ДНК нитчатого фага; дрожжевые плазмиды, такие как плазмида 2и или ее производные; векторы, полезные в эукариотических клетках, такие как векторы, полезные в клетках насекомых или млекопитающих; векторы, происходящие из комбинаций плазмид и фаговых ДНК, такие как плазмиды, которые были модифицированы для использования фаговой ДНК, или другие контролирующие экспрессию последовательности; и тому подобное.
Кроме того, согласно данному изобретению предложена рекомбинантная клетка-хозяин, которая содержит одну или более полинуклеотидных конструкций. Полинуклеотид, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в данной заявке, образуют аспект настоящей заявки, согласно которому предложен способ получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента, который включает экспрессию с полинуклеотида. Экспрессия может достигаться, например, путем культивирования в подходящих условиях рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих данный полинуклеотид. Затем антитело можно выделить и/или очистить с помощью любого подходящего метода и использовать соответствующим образом.
Любая из широкого спектра контролирующих экспрессию последовательностей - последовательностей, которые контролируют экспрессию последовательности ДНК, функционально связанной с ней, может быть использована в этих векторах для экспрессии последовательностей ДНК. Такие полезные, контролирующие экспрессию последовательности включают, например, ранние или поздние промоторы §У40, СМУ (цитомегаловирус), вируса осповакцины, полиомы или аденовируса, 1ас-систему, !грсистему, ТАС-систему, ТКС-систему, ЬТК-систему, главные операторные и промоторные участки фага λ, регуляторные участки белка оболочки фага йй, промотор для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы (например, Рйо5), промоторы факторов спаривания дрожжей и другие последовательности, известные для регуляции экспрессии генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и различные их комбинации.
Системы клонирования и экспрессии полипептида во многих различных клетках-хозяевах хорошо известны. Подходящие клетки-хозяева включают клетки бактерий, млекопитающих, дрожжей и бакуловирусные системы. Линии клеток млекопитающих, доступные в данной области для экспрессии гетерологичного полипептида, включают клетки яичника китайского хомячка, клетки НеЬа, клетки почки новорожденного сирийского хомячка, клетки мышиной миеломы N§0 и многие другие. Самым распространенным бактериальным хозяином является Е. сой.
Экспрессия антител или антигенсвязывающих фрагментов в прокариотических клетках, таких как Е. сой, является общепринятой в данной области. В качестве обзора см., например, Р1иск1йип, А. Вю/Тесйпо1оду, 9: 545-551 (1991). Экспрессия в эукариотических клетках в культуре также доступна специалистам в данной области (Кай-, М.Е. (1993) Сигг. Оршюп Вю1есй., 4: 573-576; ТтШ 1.1. е! а1. (1995) Сигг. Оршюп Вю1есй., 6: 553-560).
Широкий спектр одноклеточных клеток-хозяев также полезен для экспрессии последовательностей
- 25 025174
ДНК. Эти хозяева включают хорошо известных эукариотических и прокариотических хозяев, таких как штаммы Е. сой, Ркеийотопак, ВасШик, 81гер1отусе5, грибы, такие как дрожжи, и клетки животных, такие как клетки СНО, ΥΒ/20, N80, 8Р2/0, К1.1, Β-Ψ и Ь-М, клетки почки африканской зеленой мартышки (например, С08 1, С08 7, В8С1, В8С40 и ВМТ10), клетки насекомых (например, 8£9), человеческие клетки и растительные клетки в тканевой культуре.
Следует понимать, что не все векторы, последовательности, контролирующие экспрессию, и хозяева будут одинаково хорошо функционировать для экспрессии последовательностей ДНК. Также не все хозяева будут одинаково хорошо функционировать с одной и той же экспрессирующей системой. Однако специалист в данной области будет способен выбрать надлежащие векторы, последовательности, контролирующие экспрессию, и хозяев без чрезмерного экспериментирования, чтобы осуществить желаемую экспрессию без отклонения от объема данной заявки. Например, при выборе вектора необходимо учитывать хозяина, поскольку вектор должен в нем функционировать. Также следует принимать во внимание число копий вектора, способность контролировать такое число копий и экспрессию любых других белков, кодируемых данным вектором, таких как маркеры антибиотиков. Средний специалист в данной области может выбрать надлежащие векторы, последовательности, контролирующие экспрессию, и хозяев, чтобы осуществить желаемую экспрессию без отклонения от объема данной заявки. Например, при выборе вектора учитывают хозяина, поскольку вектор в нем функционирует. Также следует принимать во внимание число копий вектора, способность контролировать такое число копий и экспрессию любых других белков, кодируемых данным вектором, таких как маркеры антибиотиков.
Согласно настоящему изобретению также предложены конструкции в форме плазмид, векторов, транскрипционных или экспрессирующих кассет, как описано в другом месте в данной заявке, которые содержат по меньшей мере один полинуклеотид, упомянутый выше. Могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие соответствующие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, терминаторные последовательности, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, селектируемые маркеры и другие последовательности, в зависимости от ситуации. Векторы могут быть плазмидами, вирусными, например фагом, фагмидой, в зависимости от ситуации. Подробнее см., например, Мо1еси1аг С1отпд: а ЬаЬогаФгу Мапиа1: 2ηά еШйоп, 8атЬгоок е1 а1., 1989, СоШ 8рппд НагЬог ЬаЬогаШгу Ргекк. Многие известные методы и протоколы для работы с нуклеиновой кислотой, например, для получения конструкций нуклеиновых кислот, для мутагенеза, секвенирования, введения ДНК в клетки и генной экспрессии и анализа белков, подробно описаны в 81юг1 РгоЮсоЕ ш Мо1еси1аг Вю1о§у, 8есопй ЕШйоп, Аи8иЬе1 е1 а1. ейк., 1оЬп \УПеу & 8опк, 1992. Методы, описанные 8атЬгоок и др. и Аи8иЬе1 и др., включены в данное описание посредством ссылки.
При выборе последовательности, контролирующей экспрессию, обычно учитывают множество факторов. Они включают, например, относительную эффективность системы, ее регулируемость и ее совместимость с конкретной последовательностью ДНК или геном, подлежащими экспрессии, в частности, что касается возможных вторичных структур. Подходящие одноклеточные хозяева будут выбраны с учетом, например, их совместимости с выбранным вектором, особенностей их секреции, их способности к корректному сворачиванию белков и необходимых условий их ферментации, а также токсичности для хозяина продукта, кодируемого последовательностями ДНК, подлежащими экспрессии, и легкости очистки продуктов экспрессии.
В другом аспекте предложена клетка-хозяин, содержащая один или более полинуклеотидов, описанных в данной заявке. В еще одном аспекте предложен способ введения таких одного или более полинуклеотидов в клетку-хозяина любым подходящим методом. Что касается эукариотических клеток, то подходящие методы могут включать, например, трансфекцию с использованием фосфата кальция, ПЕАЕ-декстрана, электропорацию, опосредованную липосомами трансфекцию и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса (например, вируса осповакцины), или, для клеток насекомых, бакуловируса. Что касается бактериальных клеток, то подходящие методы могут включать, например, трансформацию с использованием хлорида кальция, электропорацию и трансфекцию с использованием бактериофагов.
После введения можно инициировать или сделать возможной экспрессию одного или более полинуклеотидов, например, путем культивирования клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии одного или более полипептидов с одного или более полинуклеотидов. Можно использовать индуцибельные системы и индуцировать экспрессию путем добавления активатора.
В одном из воплощений полинуклеотиды могут быть интегрированы в геном (например, хромосому) клетки-хозяина. Интеграцию можно стимулировать путем включения последовательностей, которые стимулируют рекомбинацию с геномом, в соответствии со стандартными способами. В другом воплощении нуклеиновая кислота сохраняется на эписомном векторе в клетке-хозяине.
В данной заявке предложены способы, включающие применение конструкции, которая указана выше, в экспрессирующей системе с целью экспрессии конкретного полипептида.
Учитывая эти и другие факторы, специалист в данной области сможет сконструировать ряд комбинаций вектор/последовательность, контролирующая экспрессию/хозяин, которые будут экспрессировать
- 26 025174 последовательности ДНК при ферментации или крупномасштабном культивировании клеток животных.
Полинуклеотид, кодирующий антитело, антигенсвязывающий фрагмент или связывающий белок, может быть получен рекомбинантным методом/методом синтеза в дополнение к клонированию, или скорее, клонирован. Полинуклеотид может быть сконструирован с использованием подходящих кодонов для антитела, антигенсвязывающего фрагмента или связывающего белка. В общем случае для предполагаемого хозяина будут выбраны предпочтительные кодоны, если данная последовательность будет использована для экспрессии. Полный полинуклеотид можно собрать из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными методами и собранных в полную кодирующую последовательность; см., например, Ейде, Ыа!иге, 292: 756 (1981); ШтЬаи е! а1., Заеисе, 223: 1299 (1984); 1ау е! а1., 1. Вю1. СЬет., 259: 6311 (1984).
Общий метод сайт-специфического включения неприродных аминокислот в белки описан в СЬпк!орЬег ί. Ыогеи, Зреисег ί. Аи1Ьоиу-СаЬй1, М1сЬае1 С. СйГГйЬ, Ре!ег С. Зс1ш11/. Зшеисе, 244: 182-188 (Аргй 1989). Этот метод можно использовать для создания аналогов с неприродными аминокислотами.
Как упомянуто выше, последовательность ДНК, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может быть получена методом синтеза, а не клонирована. Последовательность ДНК может быть сконструирована с использованием подходящих кодонов для аминокислотной последовательности антитела или антигенсвязывающего фрагмента. В общем случае, для предполагаемого хозяина можно будет выбрать предпочтительные кодоны, если данная последовательность будет использоваться для экспрессии. Полную последовательность собирают из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными методами и собранных в полную кодирующую последовательность; см., например, статьи Ейде, Ыа!иге, 292: 756 (1981); ЫатЬай е! а1., Заеисе, 223: 1299 (1984); 1ау е! а1., 1. Вю1. СЬет., 259: 6311 (1984), каждая из которых включена в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.
С. Анализ иммуногенности ш кШсо.
При необходимости, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данной заявке, могут быть оценены в отношении иммуногенности и по мере необходимости могут быть деиммунизированы (т.е. антитело делают менее иммунореактивным путем изменения одного или более Т-клеточных эпитопов). Анализ иммуногенности и Т-клеточных эпитопов, имеющихся в гуманизированных антителах против эндоглина и антигенсвязывающих фрагментах, описанных в данной заявке, может быть осуществлен с использованием программного обеспечения и специальных баз данных. Типичные программное обеспечение и базы данных включают Поре™, разработанную АиШоре (Кембридж, Англия). Поре™ представляет собой технологию ш кШсо для анализа связывания пептидов с человеческими аллелями МНС класса II.
Программное обеспечение Поре™ прогнозирует связывание пептидов с человеческими аллелями МНС класса II и тем самым обеспечивает первоначальный скрининг для локализации таких возможных Т-клеточных эпитопов. Программное обеспечение Поре™ прогнозирует благоприятные взаимодействия между аминокислотными боковыми цепями пептида и специфическими связывающими карманами в пределах связывающих желобков 34 человеческих аллелей МНС класса II. Расположение ключевых связывающих остатков определяют, создавая ш кШсо 9-мерные пептиды, которые перекрываются на одну аминокислоту, охватывая последовательность вариабельной области тестируемого антитела. Каждый 9-мерный пептид может быть протестирован относительно каждого из 34 аллотипов МНС класса II и оценен в баллах на основании их потенциального соответствия и взаимодействий со связывающим желобком молекул МНС класса II. Пептиды, которые дают высокий средний балл за связывание (более 0,55 согласно оценке в Поре™) относительно более 50% аллелей МНС класса II, рассматриваются в качестве потенциальных Т-клеточных эпитопов. В таких участках анализируют коровую 9-аминокислотную последовательность в отношении пептидного связывания в пределах желобка молекул МНС класса II с целью определения остатков кармана (Р1, Р4, Р6, Р7 и Р9) молекул МНС класса II и возможных принимающих участие в контакте остатков (Р-1, Р2, Р3, Р5, Р8) Т-клеточного рецептора (ТСК).
После идентификации всех Т-клеточных эпитопов с целью удаления идентифицированного Т-клеточного эпитопа могут быть произведены изменения, замены, вставки и/или делеции аминокислотных остатков. Такие изменения могут быть сделаны таким образом, чтобы сохранить структуру и функцию антитела, несмотря на удаление идентифицированного эпитопа. Типичные изменения могут включать, но не ограничиваются этим, консервативные аминокислотные замены.
Стали применяться методы, в которых используются растворимые комплексы рекомбинантных молекул МНС в комбинации с синтетическими пептидами. Эти реагенты и процедуры можно использовать для идентификации присутствия Т-клеточных клонов из образцов периферической крови субъектов: людей или экспериментальных животных, которые способны связывать определенные МНС-пептидные комплексы и не подходят для скрининга многочисленных возможных эпитопов в отношении широкого разнообразия аллотипов МНС.
Биологические анализы Т-клеточной активации остаются лучшим практическим средством определения способности тестируемой пептидной/белковой последовательности вызывать иммунный ответ.
- 27 025174
Примеры этого вида подхода включают применение анализов Т-клеточной пролиферации для бактериального белка стафилокиназы с последующим картированием эпитопов с использованием синтетических пептидов для стимуляции Т-клеточных линий. Аналогично, анализы Т-клеточной пролиферации с использованием синтетических пептидов белка столбнячного токсина привели к определению иммунодоминантных эпитопных участков данного токсина. В одном из воплощений Т-клеточные эпитопы в тестируемом белке можно определить, используя выделенные подгруппы человеческих иммунных клеток, стимулируя их дифференцировку ίη νίίτο и культивируя клетки в присутствии представляющих интерес синтетических пептидов и измеряя любую индуцированную пролиферацию в культивируемых Т-клетках. Также можно использовать другие методы. Такой метод включает тщательное применение методов выделения клеток и клеточное культивирование с множественными добавками цитокинов с целью получения желаемых подгрупп иммунных клеток (дендритных клеток, ί'.'Ό4+ и/или СЭ8+ Т-клеток). В другом воплощении присутствие Т-клеточных эпитопов в антителе можно определить путем добавления данного антитела к выделенным подгруппам человеческих иммунных клеток и оценки их дифференцировки ίη νίίτο и измерения индуцированной пролиферации в культивируемых Т-клетках.
Для определения лигандов МНС класса II для многочисленных, представляющих терапевтический интерес белков также можно применять методы ίη δίίκο. Однако по причинам, таким как необходимость протеолитического процессинга и других физиологических стадий, приводящих к презентации иммуногенных пептидов ίη νίνο, подгруппа полного репертуара пептидов, определяемых с использованием компьютеризированных схем, может иметь конечную биологическую значимость. Таким образом, анализы активации Т-клеток человека ех νίνο можно использовать для идентификации участков в белковой последовательности полипептида, которые способны поддерживать активацию Т-клеток и поэтому являются наиболее биологически релевантными в отношении проблемы иммуногенности этого белка. Как использовано в данной заявке, Т-клеточный эпитоп относится к аминокислотной последовательности, которая способна связывать МНС класса ΙΙ, способна стимулировать Т-клетки и/или также связывать (не обязательно с измеримой активацией) Т-клетки в комплекс с МНС класса ΙΙ.
Согласно способу, описанному в данной заявке, синтетические пептиды или целые антитела тестируют в отношении их способности вызывать пролиферативный ответ в человеческих Т-клетках, культивируемых ίη νίίτο. Т-клетки присутствуют в слое мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), легко получаемом хорошо известными методами из образцов цельной крови. Кроме того, препарат РВМС содержит физиологических соотношения Т-клеток и антигенпрезентирующих клеток и поэтому представляет собой хороший источник материалов, с которыми проводят псевдоиммунную (китгода1е иптиие) реакцию ίη νίίτο. При проведении такого анализа индекс стимуляции, приближающийся или превышающий 2,0, является полезным показателем индуцированной пролиферации. Однако индекс стимуляции может отличаться в зависимости от антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и может быть установлен с учетом исходного уровня для каждого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и соответствующей пептидной библиотеки. В одном из примеров такого тестирования индекс стимуляции (δΙ) может быть получен стандартно путем деления показателя пролиферации (например, числа импульсов, соответствующих радиоактивности, в минуту при использовании, например, включения 3Нтимидина), измеренного для тестируемого пептида, на показатель, измеренный в клетках, не контактировавших с тестируемым пептидом. Пептиды, которые не индуцируют никакого ответа, могут давать δΙ = 1,0, хотя также могут встречаться значения δΙ в диапазоне 0,8-1,2. С целью обеспечения надежности регистрируемых количественных показателей при проведении таких анализов может быть использован ряд технических процедур. Обычно все определения выполняют по меньшей мере в трех повторах, и можно вычислить среднее значение показателя. Если вычисленные значения δΙ составляют не менее 2,0, то можно исследовать индивидуальные показатели, взятые в трех повторах, на наличие резко отклоняющихся значений. Тестируемые пептиды приводят в контакт с клетками по меньшей мере в двух разных концентрациях, и эти концентрации обычно охватывают как минимум двухкратное различие в концентрации. Такой диапазон концентраций обеспечивает отклонение для кинетического измерения в данном анализе и может быть полезен в случае проведения определения в одной временной точке, например, в сутки плюс 7. В некоторых анализах могут проводиться многочисленные определения в зависимости от времени, и это также может быть выполнено с использованием пептидного иммуногена, взятого как минимум в двух различных концентрациях. Аналогично, в каждый планшет для анализа могут быть введены контрольные пептиды, на которые, как ожидается, будет отвечать большинство образцов доноров РВМС. Пептид 307-309 гемагглютинина вируса гриппа с последовательностью ΡΚΥνΚΟΝΤΕΚΕΑ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 104) и пептидная последовательность ΚννορΙΚΚΙδΚΡνρΗ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 105) ΗδΡ 60 (белок теплового шока) хламидий являются примерами контрольных пептидов, используемых в таком анализе. Альтернативно или дополнительно, в анализах также может быть использован мощный целый белковый антиген, такой как гемоцианин лимфы улитки, в отношении которого, как можно было бы ожидать, все образцы РВМС будут демонстрировать δΙ значительно выше 2,0. Другие контрольные антигены для такого применения будут хорошо известны в данной области.
Способы, описанные в данной заявке, могут обеспечить эпитопную карту антител или их антигенсвязывающих фрагментов, где карта релевантна в отношении широкого спектра возможных аллотипов
- 28 025174
МНС. Такая карта может быть достаточно репрезентативной для обеспечения конструирования или выбора модифицированного белка, для которого способность белка вызывать запускаемый Т-клетками иммунный ответ может быть устранена или, по меньшей мере, ослаблена у большинства пациентов, которым по всей вероятности будет введен данный белок. Ослабление может относиться к снижению иммунного ответа (т. е. уменьшенной иммуногенности) по сравнению с немодифицированным белком (например, примерно в 1,5 раза, примерно в 2 раза, примерно в 5 раз, примерно в 10 раз, примерно в 20 раз, примерно в 50 раз, примерно в 100 раз, примерно в 200 раз, примерно в 500 раз или более или в любом диапазоне, упомянутом здесь). Альтернативно, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты с уменьшенной иммуногенностью могут ссылаться на процент снижения их способности вызывать иммунный ответ по сравнению с немодифицированным белком (например, примерно на 1, примерно на 2, примерно на 3, примерно на 4, примерно на 5, примерно на 10, примерно на 20, примерно на 50, примерно на 100% и в любом диапазоне, упомянутом здесь). Соответственнно, при практическом применении процесса скрининга, происходящие из РВМС Т-клетки от интактных доноров собирают из пула доноров с достаточным иммунологическим разнообразием для получения образца, содержащего по меньшей мере более 90% репертуара МНС класса II (НЬЛ-ЭК), существующего в настоящее время в человеческой популяции. Если на практике необходимо измерить ответ интактных Т-клеток, то заданный синтетический пептид (или антитело), пептид (или антитело) приводят в контакт с препаратами РВМС, полученными от многочисленных доноров отдельно; количества доноров (или размер пула доноров) для практических целей, по-видимому, не должны быть меньше 20 неродственных индивидуумов, и все образцы в пуле доноров могут быть предварительно выбраны в соответствии с их гаплотипом МНС класса II.
Как использовано в данной заявке, термин интактный донор относится к субъекту, который ранее не подвергался воздействию антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, ни в результате воздействия окружающей среды, ни в результате вакцинации или других способов, таких как, например, переливание крови.
При скрининге Т-клеточных эпитопов могут быть получены Т-клетки из образца периферической крови от большого количества разных здоровых доноров, но тех, кто не получал данный белок терапевтически. При необходимости, образцы крови пациентов могут быть протестированы на присутствие конкретного полипептида с использованием традиционных анализов, таких как ЕЬРЗЛ, в которых используются антитела для идентификации присутствия или отсутствия одного или более полипептидов. Анализ проводят, используя РВМС, культивируемые ίη У11го. с применением традиционных процедур, известных в данной области и включающих приведение РВМС в контакт с разновидностями синтетических пептидов, характерных для интересующего белка (т.е. с библиотекой), или целым белком, таким как антитело, и после подходящего периода инкубации измерение индуцированной Т-клеточной активации, такой как клеточная пролиферация. Измерение может быть выполнено с использованием любых подходящих средств и может быть проведено, например, с использованием включения 3Н-тимидина, где накопление 3Н в клеточном материале легко измеряют с помощью лабораторного оборудования. Степень клеточной пролиферации для каждой комбинации образца РВМС и синтетического пептида или целого белка может быть исследована в сравнении с таковой, наблюдаемой в необработанном образце РВМС. Сравнение также может быть сделано в отношении пролиферативного ответа, наблюдаемого после обработки пептидом или пептидами либо целыми белками, для которых существует ожидаемый пролиферативный эффект. В этом отношении предпочтительно использовать пептид или целый белок с известной широкой рестрикцией по МНС и особенно пептидные эпитопы с рестрикцией по МНС для изотипов ΌΡ или Эр, хотя изобретение не ограничивается применением таких рестриктированных пептидов или белков. Такие пептиды были описаны выше, например, в отношении гемагглютинина вируса гриппа и Н8Р60 хламидий.
В одном неограничивающем примере Т-клеточные эпитопы картируют и затем модифицируют, используя способы, описанные в данной заявке. Для облегчения составления эпитопной карты получают библиотеку синтетических пептидов. Каждый из пептидов имеет длину 15 аминокислотных остатков и каждый перекрывает следующий пептид в этой серии на 12 аминокислотных остатков; т.е. каждый последующий пептид в этой серии шаг за шагом добавлял следующие 3 аминокислоты для анализа. Таким образом, любая заданная смежная пара пептидов картирует 18 аминокислот непрерывной последовательности. Один из способов определения Т-клеточной карты с использованием анализов интактных Тклеток проиллюстрирован ниже в Примерах. Предполагают, что каждый из пептидов, идентифицированных методом с использованием определения Т-клеточной карты, способен связывать МНС класса II и захватывать по меньшей мере один когнатный ТСК с достаточной аффинностью для индукции пролиферативного взрыва, детектируемого в аналитической системе.
В другом неограничивающем примере оценивают способность антитела подвергаться процессингу с получением Т-клеточных эпитопов, которые связывают МНС класса II и захватывают по меньшей мере один родственный ТСК с достаточной аффинностью для индукции пролиферативного взрыва, детектируемого в аналитической системе.
Молекулы, описанные в данной заявке, могут быть получены любым из нескольких путей, включающих использование рекомбинантных методов. Белковые последовательности и информация, предло- 29 025174 женная в данной заявке, могут быть использованы для выведения полинуклеотида (ДНК), кодирующего аминокислотную последовательность. Этого может достичь, например, с использованием компьютерных программных средств, таких как комплект программного обеспечения □ΝΛ5ΐ;·π (ΟΝΆδΙηΓ 1ис, Майкоп ^18., И8А) или аналогичный ему. Любой такой полинуклеотид, кодирующий полипептиды или значимые гомологи, варианты, укороченные варианты, удлинения или дополнительные их модификации включены в данное изобретение.
Согласно данному изобретению предложены способы картирования (идентификации) Т-клеточных эпитопов и модификации эпитопов, так что модифицированная последовательность уменьшает (частично или полностью) индукцию Т-хелперного ответа. Модификация включает аминокислотные замены, делеции или вставки, произведенные в кодонах полинуклеотида, кодирующего модифицированные полипептиды с целью вызвать сходные изменения. Кодоны, кодирующие аминокислотные остатки, хорошо известны в данной области. Для осуществления направленного мутагенеза последовательностеймишеней можно использовать методы рекомбинантной ДНК, и многие такие методы доступны, описаны в данной заявке и известны в данной области, как описано выше. В общем, хорошо известен метод сайтспецифического мутагенеза. Кратко, применяют бактериофаговый вектор, который продуцирует одноцепочечную матрицу для олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием ПЦР. Фаговые векторы (например, М13) имеются в продаже, и их применение обычно хорошо известно в данной области. Аналогично, в сайт-специфическом мутагенезе также рутинно применяются двухцепочечные плазмиды, что позволяет исключить стадию переноса интересующего полинуклеотида из фага в плазмиду. Синтетические олигонуклеотидные праймеры, несущие желаемую мутированную последовательность, могут быть использованы для направления синтеза ш νίίτο модифицированной (желаемой мутантной) ДНК с этой матрицы, и гетеродуплексную ДНК используют для трансформации компетентных клеток Е. сой для роста, селекции и идентификации желаемых клонов. Альтернативно, в ПЦР пару праймеров можно отжигать с двумя отдельными цепями двухцепочечного вектора для одновременного синтеза обеих соответствующих комплементарных цепей с желаемой(ыми) мутацией(ями).
В одном из воплощений может быть применен метод сайт-специфического мутагенеза Цшск СЬаиде с использованием плазмидных ДНК матриц. ПЦР-амплификацию плазмидной матрицы, содержащей интересующий встроенный ген-мишень, проводят с использованием двух синтетических олигонуклеотидных праймеров, содержащих желаемую мутацию. Олигонуклеотидные праймеры, каждый из которых комплементарен противоположным цепям вектора, удлиняют во время проведения температурного цикла с использованием ДНК-полимеразы РГиТигЬо марки для мутагенеза. По мере встраивания олигонуклеотидных праймеров образуется мутированная плазмида со ступенчатыми однонитевыми разрывами. Амплифицированные неметилированные продукты обрабатывают Эри I для переваривания метилированной родительской ДНК матрицы и производят отбор вновь синтезированной ДНК, содержащей мутации. Поскольку ДНК, выделенная из большинства штаммов Е. сой, йат-метилирована, то она чувствительна к перевариванию с помощью Эри I, которая специфична в отношении метилированной и полуметилированной ДНК. Продукты реакции подвергают трансформации в высокоэффективные штаммы Е. сой с целью получения плазмид, содержащих желаемые модификации. Дополнительные методы введения аминокислотных модификаций в полипептид хорошо известны в данной области и также могут быть использованы в данной заявке.
Подходящие модификации белка могут включать аминокислотную замену конкретных остатков или комбинаций остатков. Для элиминации Т-клеточных эпитопов выполняют аминокислотные замены в соответствующих точках или аминокислотных остатках в аминокислотной последовательности, для которых прогнозируется достижение уменьшения или элиминации активности Т-клеточного эпитопа. На практике, соответствующие точка или аминокислотный остаток предпочтительно будут приравниваться аминокислотному остатку, связывающемуся в одном из карманов, имеющихся внутри связывающего желобка МНС класса II. Такие модификации могут изменять связывание в первом кармане щели в так называемом Р1 или Р1 якорном положении пептида. Считается, что качество связывающего взаимодействия между Р1 якорным остатком пептида и первым карманом связывающего желобка МНС класса II является главной детерминантой общей аффинности связывания для целого пептида. Соответствующая замена в этом положении аминокислотной последовательности обычно будет встраивать аминокислотный остаток, менее охотно размещаемый в данном кармане (например, замена на более гидрофильный остаток). Аминокислотные остатки в пептиде в положениях, приравниваемых к связыванию в других участках кармана внутри связывающей щели МНС, также рассматриваются и находятся в пределах объема настоящего изобретения.
Понятно, что единичные аминокислотные модификации в пределах заданного потенциального Тклеточного эпитопа представляют один из путей, посредством которого могут быть устранены один или более Т-клеточных эпитопов. Могут рассматриваться комбинации модификаций в пределах одного эпитопа, и они могут быть уместны, когда индивидуально определенные эпитопы перекрываются друг с другом. Кроме того, могут быть выполнены аминокислотные модификации (либо единичные в пределах заданного эпитопа, либо в комбинации в пределах одного эпитопа) в положениях, не приравниваемых к остатками кармана применительно к связывающему желобку МНС класса II, а в любой точке в преде- 30 025174 лах аминокислотной последовательности. Могут быть выполнены модификации с учетом гомологичной структуры или структурного способа, осуществляемого с использованием методов ίη δ^1^со, известных в данной области и описанных в данной заявке, которые могут быть основаны на известных структурных характеристиках полипептида. Может рассматриваться изменение (модификация), восстанавливающее структуру или биологическую активность вариантной молекулы. Такие компенсаторные изменения и изменения также могут включать делецию из полипептида или вставку (инсерцию) в полипептид конкретных аминокислотных остатков. Кроме того, могут быть выполнены модификации, которые изменяют структуру и/или уменьшают биологическую активность молекулы и также удаляют Т-клеточный эпитоп, снижая таким образом иммуногенность молекулы. Все типы модификаций рассматриваются в данном изобретении.
Дополнительным способом удаления эпитопов из белковых молекул является согласованное применение схемы анализа активации интактных Т-клеток, как изложено в данном описании, совместно со способом ίη δίΠ^, разработанным в соответствии со схемой, описанной в заявке \УО 02/069232, которая также полностью включена в данное описание посредством ссылки. Программное обеспечение моделирует процесс презентации антигена на уровне связывающего взаимодействия полипептид-МНС класса II с получением балла за связывание для любой заданной полипептидной последовательности. Такой балл определяют для многих преобладающих аллотипов МНС класса II, существующих в настоящее время в популяции. Поскольку с помощью этой схемы можно тестировать любую полипептидную последовательность, то можно прогнозировать последствия аминокислотных замен, добавлений или делеций в отношении способности полипептида взаимодействовать со связывающим желобком МНС класса II. Следовательно, можно конструировать новые композиции последовательностей, которые содержат меньшие количества аминокислот, способных взаимодействовать с МНС класса II и таким образом действовать в качестве иммуногенных Т-клеточных эпитопов. Если в биологическом анализе с использованием любого заданного донорного образца можно оценить связывание максимум четырех аллотипов ΌΚ, то способ ίη δίΠ^ позволяет тестировать ту же полипептидную последовательность с использованием более 40 аллотипов одновременно. На практике этот подход способен направлять конструирование новых вариантов последовательности с измененной способностью взаимодействовать с многочисленными аллотипами МНС. Специалисту в данной области будет очевидно, что могут быть получены многочисленные альтернативные группы замен, с помощью которых решается задача удаления нежелательных эпитопов. Однако следует понимать, что полученные последовательности должны быть полностью гомологичны конкретным композициям, описанным в данной заявке, и поэтому будут попадать в пределы объема настоящего изобретения.
Объединенный подход к использованию способа ίη δ^1^со для идентификации лигандов МНС класса II и конструирования аналогов последовательностей, не содержащих лигандов МНС класса II, совместно с эпитопным картированием и повторным тестированием возможно с использованием биологических анализов Т-клеточной активации, представляет собой дополнительные способ и воплощение настоящей заявки. Общий способ в соответствии с этим воплощением включает следующие стадии:
1) использование анализов активации интактных Т-клеток и синтетических пептидов, совместно охватывающих интересующую белковую последовательность, для идентификации эпитопных участков, способных активировать Т-клетки;
2) использование вычислительного алгоритма, моделирующего связывание пептидного лиганда с одним или более аллотипами МНС, для анализа эпитопных участков, идентифицированных на стадии (1), и таки образом идентификации лигандов МНС класса II в пределах данного эпитопного участка;
3) использование вычислительного алгоритма, моделирующего связывание пептидного лиганда с одним или более аллотипами МНС для идентификации аналогов последовательностей лигандов МНС в пределах эпитопного(ых) участка(ов), которые больше не связывают МНС класса II или связывают с пониженной аффинностью с меньшим числом аллотипов МНС, и возможно
4) использование анализов активации интактных Т-клеток и синтетических пептидов, охватывающих полностью или совместно охватывающих эпитопные участки, идентифицированные в интересующем белке, и тестирование аналогов последовательностей в анализе активации интактных Т-клеток параллельно с последовательностями дикого типа (родительскими).
В одном воплощении способ получения модифицированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, демонстрирующих пониженную иммуногенность по сравнению с немодифицированным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, включает идентификацию по меньшей мере одного Т-клеточного эпитопа в аминокислотной последовательности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и модификацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка по меньшей мере в одном идентифицированном Т-клеточном эпитопе.
В другом воплощении модифицированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, демонстрирующие пониженную иммуногенность по сравнению с немодифицированным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, получают в процессе идентификации по меньшей мере одного Тклеточного эпитопа в аминокислотной последовательности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и модификации по меньшей мере одного аминокислотного остатка по меньшей мере в одном
- 31 025174 идентифицированном Т-клеточном эпитопе.
В еще одном другом воплощении способ выбора модифицированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые демонстрируют пониженную иммуногенность по сравнению с немодифицированным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, включает идентификацию по меньшей мере одного Т-клеточного эпитопа в аминокислотной последовательности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, модификацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка по меньшей мере в одном идентифицированном Т-клеточном эпитопе и выбор модифицированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые демонстрируют пониженную иммуногенность по сравнению с немодифицированным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.
Т-клеточные эпитопы, описанные в данной заявке, могут быть дополнительно охарактеризованы участками эпитопа. Такие участки включают эпитопный кор, Ν-конец и С-конец. Как использовано в данной заявке эпитопный кор относится к коровым 9-мерным аминокислотным последовательностям Т-клеточных эпитопов. Эпитопный кор также может включать 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка, прилегающих к коровой 9-мерной аминокислотной последовательности на Ν-конце и/или С-конце. Таким образом, длина такого эпитопного кора в некоторых воплощениях может варьироваться от примерно 9 аминокислот вплоть до примерно 15 аминокислот.
Как использовано в данной заявке, Ν-конец относится к аминокислотам, прилегающим к Ν-концу эпитопного кора, и включает по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 аминокислот, прилегающих к Νконцу и расположенных выше Ν-конца эпитопного кора.
Как использовано в данной заявке, С-конец относится к аминокислотам, прилегающим к С-концу эпитопного кора, и включает по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 аминокислот, прилегающих к Сконцу и расположенных ниже С-конца эпитопного кора.
В одном воплощении модифицированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит одну или более модификаций.
В одном воплощении модифицированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит две модификации.
В одном воплощении модифицированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три модификации.
В одном воплощении модифицированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит четыре модификации.
В одном воплощении модифицированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит пять модификаций.
В одном воплощении модифицированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит шесть модификаций.
В одном воплощении модифицированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит семь модификаций.
В одном воплощении модифицированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит восемь модификаций.
В одном воплощении модифицированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит девять модификаций.
В одном воплощении модифицированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит десять модификаций.
В одном воплощении модифицированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вплоть до двенадцати модификаций.
Согласно данному изобретению предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в §Е0 ΙΌ Ν0: 93 (УК1АА), и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в §Е0 ГО Ν0: 89 (УН1А2).
Согласно данному изобретению предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в виде любой из §Е0 ГО Ν0: 88, 89, 90, 91 и 92.
Согласно данному изобретению предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в виде любой из §ЕО ГО Ν0: 93, 94, 95, 96, 97, 100, 102 и 103.
Согласно данному изобретению предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают эндоглин, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в §ЕО ГО Ν0: 89, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в §ЕО ГО Ν0: 93, где:
(1) вариабельная область тяжелой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены глицина (О) на аланин (А) или серин (§) в положении 49; замены аланина (А) на изолейцин (I) в положении 51; замены лизина (К) на аргинин (К) или аспарагин (О) в положении 52Ъ; замены лейцина (Ь) на валин (У) в положении 78 согласно системе нумерации по КаЬаЕ
- 32 025174 и (2) вариабельная область легкой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены метионина (М) на лейцин (Ь) в положении 4; замены аланина (А) на валин (У) в положении 19; замены треонина (Т) на серин (З) в положении 22; замены аланина (А) на изолейцин (I) в положении 48; и замены треонина (Т) на серин (З) в положении 51 согласно системе нумерации по КаЬа1.
Согласно данному изобретению предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ГО N0: 88, 89, 90, 91 и 92; и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ГО N0: 93, 95, 96, 97, 100, 102 или 103.
В дополнение к вышеупомянутым примерам и воплощениям в данном изобретении рассматриваются модифицированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с одной или более аминокислотными модификациями в одном или более Т-клеточных эпитопах. В одном неограничивающем примере согласно данному изобретению предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, имеющие по меньшей мере одну модификацию по меньшей мере в одном Т-клеточном эпитопе. В другом неограничивающем примере согласно данному изобретению предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, имеющие по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 Т-клеточных эпитопах, как описано в данной заявке. Дополнительные неограничивающие примеры включают антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, имеющие более чем одну аминокислотную модификацию более чем в одном Т-клеточном эпитопе. В данном изобретении рассматривается любая комбинация аминокислотных модификаций в любом количестве антител или их антигенсвязывающих фрагментов, Т-клеточных эпитопов, описанных выше.
Т-клеточные эпитопы и частота встречаемости аллотипов.
Индивидуальные эпитопы, обнаруженные в антигенах, предпочтительно могут быть презентированы конкретными аллотипами МНС класса II, и аналогично другие специфические эпитопы в том же антигене вообще не могут быть презентированы молекулами МНС класса II. Было показано, что такие ассоциации конкретных эпитопов со специфическими молекулами МНС класса II зависят от аллотипа МНС класса II у индивидуума. Ассоциация специфического эпитопа со специфическим аллотипом также может рассматриваться при модификации антител или их антигенсвязывающих фрагментов для удаления Т-клеточных эпитопов. Такие соображения могут предусматривать высокоспецифическую модификацию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для специфических аллотипов (например, для специфических популяций субъектов, имеющих некоторые аллотипы МНС класса II). Аллотип МНС класса II у субъекта или субъектов может быть легко определен методами генотипирования, известными в данной области, и ассоциация Т-клеточных эпитопов с заданным аллотипом, легко идентифицируемая таким образом, для рассмотрения в модификации антител или их антигенсвязывающих фрагментов, адаптирована к этому аллотипу. Идентификация ассоциаций между Т-клеточными эпитопами и аллотипами МНС класса II описана более подробно ниже в Примерах. Данным изобретением предусмотрены модифицированные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые имеют модификации Тклеточных эпитопов, адаптированные (Ειί1οΐΌ6) к ассоциациям МНС класса II, идентифицированным для заданных эпитопов.
Ό. Антитела против эндоглина.
Одновременное встраивание всех РК- и/или СОК-кодирующих нуклеиновых кислот и всех аминокислотных замен по выбранным положениям могут быть осуществлены различными методами, известными специалистам в данной области, включая, например рекомбинантный и химический синтез. Например, одновременное встраивание может быть осуществлено посредством, например, химического синтеза нуклеотидной последовательности для акцепторной вариабельной области, слитой вместе с донорными СОК-кодирующими нуклеиновыми кислотами, и встраивания множества соответствующих аминокислотных кодонов в положения, выбранные для размещения вариабельных аминокислотных остатков.
Согласно данному изобретению предложены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с эндоглином. Также предложены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин и ингибируют (частично или полностью) или контролируют/лечат (частично или полностью) ангиогенез/неоваскуляризацию, дилатацию малых сосудов и/или заболевания, ассоциированные с чрезмерным ангиогенезом. Аналогично, в понятие ингибирования или связывания эндоглина также включено ингибирование функции эндоглина (например, передачи сигнала, связывания, активации и тому подобного). В еще одном другом воплощении антитело или антигенсвязывающий фрагмент ингибирует ангиогенез посредством связывания с эндоглином. Согласно данному изобретению также предложены клеточные линии, которые могут быть использованы для продукции антител, способы получения таких клеточных линий, способы экспресии антител или антигенсвязывающих фрагментов и их очистки.
Очевидно, что антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают эндоглин, полученные с использованием способов, описанных в данной заявке, можно протестировать с использованием анализов, предложенных в данной заявке или известных в данной области, в отношении
- 33 025174 способности связываться с эндоглином, используя традиционные методы, включая, но не ограничиваясь этим, ЕЬ18А. Аффинность антител, описанных в данной заявке, также можно определить, используя традиционные методы, включая, но не ограничиваясь этим, В1асоге или поверхностный плазмонный резонанс.
Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, конструировали путем гуманизации УН- и Уъ-последовательностей антитела ТКС105. Для осуществления такой гуманизации была создана и проанализирована 3-мерная модель УН- и Уь-цепей ТКС105. Эти УН- и Уьпоследовательности затем сравнивали по отдельности с базой данных по человеческим последовательностям зародышевой линии, откуда отбирали человеческие УН- и Уъ-последовательности на основании их гомологии с УН- и Уь-последовательностями ТКС105. Человеческая УЪ-последовательность, выбранная для гуманизации, представляла собой 02/012 (УК1-39) (8ЕЦ ГО N0. 2). 02/012 имеет идентичность последовательности с ТКС105 65%, и данный ген экспрессируется в высокой степени в репертуаре человеческой зародышевой линии. Человеческая УН-последовательность, выбранная для гуманизации, представляла собой УН3-15 (8ЕЦ ГО N0. 40). УН3-15 имеет идентичность последовательности с ТКС105 70% и экспрессируется с надлежащей частотой в репертуаре человеческой зародышевой линии. Аминокислотные положения, которые были разными у ТКС105 и этих человеческих последовательностей, исследовали в 30-модели ТКС105 с целью определения, какие замены следовало бы принимать во внимание для модификации. Критерии выбора аминокислот, основанные на анализе 30-модели, включали, но не ограничивались этим, например, пространственные эффекты, связанные с аминокислотой, относительный заряд аминокислоты и местоположение аминокислоты в вариабельной области тяжелой и/или легкой цепей. Идентифицированные и предполагаемые замены для человеческих каркасных участков встраивают в человеческие каркасные участки 02 и УН3-15, а СОК ТКС105 переносят на соответствующие человеческие каркасные участки 02 и УН3-15, получая в результате большое количество гуманизированных антител или антигенсвязывающих фрагментов. Кроме того, РК-4 легкой цепи происходит из Iпоследовательности человеческой зародышевой линии 1к4. Аналогично, РК-4 тяжелой цепи происходит из 1-последовательности человеческой зародышевой линии Ш4.
В данной заявке описаны гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин. Кроме того, в данной заявке описаны гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин и ингибируют ангиогенез. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, создавали, как описано выше.
Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты могут иметь вариабельную тяжелую (УН) цепь, вариабельную легкую (Уъ) цепь, обе из них или их связывающие участки. В одном воплощении УН-цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в любой из 8ЕЦ ГО N0: 41-43, или ее связывающие участки. Такие УН-цепи могут иметь последовательности каркасных участков, представленные в любой из 8ЕЦ ГО N0:44-62. В другом воплощении Уъ-цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в любой из 8ЕЦ ГО N0: 3-5, или ее связывающий участок. Такие УБ-цепи могут иметь последовательности каркасных участков, представленные в любой из 8ЕЦ ГО N0: 6-38.
Согласно данному изобретению предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 3, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 41.
Согласно данному изобретению предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 3, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 41, где вариабельная область тяжелой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены глицина (С) на аланин (А) в положении 49; замены аспарагина (Ц) на серин (8) в положении 76; замены треонина (Т) на аргинин (К) в положении 77; замены лейцина (Ь) на валин (У) в положении 78; замены аспарагина (Ц) на изолейцин (I) в положении 82а; замены валина (У) на изолейцин (I) или лейцин (Ь) в положении 89; замены треонина (Т) на аргинин (К) или глицин (С) в положении 94; замены лейцина (Ь) на треонин (Т) в положении 108; замены валина (У) на лейцин (Ь) в положении 109; и замены серина (8) на аланин (А) в положении 113 согласно системе нумерации по КаЪар и вариабельная область легкой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены аспарагиновой кислоты (О) на глутамин (О) в положении 1; замены глутамина (О) на валин (У) в положении 3; замены метионина (М) на лейцин (Ь) в положении 4; замены треонина (Т) на серин (8) в положении 5; замены тирозина (Υ) на фенилаланин (Р) в положении 36; замены лейцина (Ь) на пролин (Р) в положении 46; замены лейцина (Ъ) на триптофан (Ψ) в положении 47; замены серина (8) на валин (У) или аланин (А) в положении 60; замены аспарагиновой кислоты (О) на серин (8) в положении 70; замены фенилаланина (Р) на тирозин (Υ) в положении 71; замены глутамина (С) на аланин (А) в положении 100; и замены изолейцина (I) на лейцин (Ь) в положении 106 согласно системе нумерации по КаЪаЕ
Согласно данному изобретению предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают эндоглин, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислот- 34 025174 ную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 41, 42 или 43; и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 3, 4 или 5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 41, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 41, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 41, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 42, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 42, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 42, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 43, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 43, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 43, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 5. Такие антитела могут связываться с эндоглином и ингибировать ангиогенез.
В любом из таких воплощений вариабельная область тяжелой цепи может дополнительно содержать одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из: замены аспарагина (Н) на серин (Б) в положении 76; замены треонина (Т) на аргинин (К) в положении 77; замены аспарагина (№) на изолейцин (I) в положении 82а; замены валина (У) на изолейцин (I) или лейцин (Ь) в положении 89; замены треонина (Т) на глицин (О) в положении 94; замены лейцина (Ь) на треонин (Т) в положении 108; замены валина (У) на лейцин (Ъ) в положении 109; и замены серина (Б) на аланин (А) в положении 113; и вариабельная область легкой цепи может дополнительно содержать одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из: замены аспарагиновой кислоты (Ό) на глутамин (О) в положении 1; замены глутамина (О) на валин (У) в положении 3; замены треонина (Т) на серин (Б) в положении 5; замены тирозина (Υ) на фенилаланин (Р) в положении 36; замены серина (Б) на валин (У) или аланин (А) в положении 60; замены аспарагиновой кислоты (Ό) на серин (Б) в положении 70; замены глицина (О) на аланин (А) в положении 100 и замены изолейцина (I) на лейцин (Ь) в положении 106 согласно системе нумерации по КаЪаЕ
Согласно данному изобретению предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают эндоглин, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит:
(1) СИК1 с БЕЕ) ГО N0: 66, СИК2 с БЕЕ) ГО N0: 67 и СИК3 с БЕЕ) ГО N0: 68;
(2) РК1 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность БЕО ГО N0: 44 или аминокислотную последовательность БЕО ГО N0: 44, за исключением одной или более консервативных замен;
(3) РК2 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность БЕО ГО N0: 45 или аминокислотную последовательность БЕО ГО N0: 45, за исключением замены глицина (О) на аланин (А) в положении 49 согласно системе нумерации по КаЪаЕ и (4) РК3 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность БЕО ГО N0: 47 или аминокислотную последовательность БЕО ГО N0: 47, за исключением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из:
(а) замены аспарагина (№) на серин (Б) в положении 76;
(б) замены треонина (Т) на аргинин (К) в положении 77;
(в) замены лейцина (Ь) на валин (У) в положении 78;
(г) замены аспарагина (Ю на изолейцин (I) в положении 82а;
(д) замены валина (У) на изолейцин (I) или лейцин (Ь) в положении 89; и (е) замены треонина (Т) на аргинин (К) или глицин (О) в положении 94 согласно системе нумерации по КаЪаЕ и
- 35 025174 (5) РК4 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 56 или аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 56, за исключением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из:
(а) замены лейцина (Ь) на треонин (Т) в положении 108;
(6) замены валина (У) на лейцин (Ь) в положении 109 и (в) замены серина (§) на аланин (А) в положении 113 согласно системе нумерации по КаЬа!; и указанная вариабельная область легкой цепи содержит:
(1) СГОК1 с §ЕО ГО N0: 63, СГОК2 с §ЕО ГО N0: 64 и СГОК3 с §ЕО ГО N0: 65;
(2) РК1 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 6 или аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 6, за исключением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из:
(а) замены аспарагиновой кислоты (Ό) на глутамин (О) в положении 1;
(б) замены глутамина (О) на валин (У) в положении 3;
(в) замены метионина (М) на лейцин (Ь) в положении 4; и (г) замены треонина (Т) на серин (§) в положении 5 согласно системе нумерации по КаЬа!; и (3) РК2 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 20 или аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 20, за исключением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из:
(a) замены тирозина (Υ) на фенилаланин (Р) в положении 36;
(b) замены лейцина (Ь) на пролин (Р) в положении 46; и (c) замены лейцина (Ь) на триптофан (XV) в положении 47 согласно системе нумерации по КаЬа!; и (4) РК3 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 28 или аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 28, за исключением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из:
(a) замены серина (§) на валин (У) или аланин (А) в положении 60;
(b) замены аспарагиновой кислоты (Ό) на серин (§) в положении 70; и (c) замены фенилаланина (Р) на тирозин (Υ) в положении 71 согласно системе нумерации по КаЬа!; и (5) РК4 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 35 или аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 35, за исключением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из:
(a) замены глицина (С) на аланин (А) в положении 100 и (b) замены изолейцина (Ι) на лейцин (Ъ) в положении 106 согласно системе нумерации по КаЬа!.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в данной заявке, могут содержать
СГОК1 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §Е0 ГО N0: 66, СГОК2 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 67, СГОК3 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 68, СГОК1 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 63, СГОК2 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §Е0 ГО N0: 64, и СГОК3 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 65.
В одном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает эндоглин и содержит РК1 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §Е0 ГО N0: 44; РК2 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 45; РК3 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 47; РК4 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 56.
В другом воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает эндоглин и содержит РК1 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §Е0 ГО N0: 44; РК2 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 46; РК3 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 48; РК4 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 56.
В другом воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит РК1 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 6; РК2 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §Е0 ГО N0: 20; РК3 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 28; и РК4 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 35.
В другом воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает эндоглин и содержит РК1 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, пред- 36 025174 ставленную в 8Е0 ΙΌ N0: 6; РК2 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 21; РК3 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 29; и РК4 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 35.
В другом воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает эндоглин и содержит РК1 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 7; РК2 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 21; РК3 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 29; и РК4 вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 35.
Согласно данному изобретению предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 42, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 4.
Согласно данному изобретению предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают эндоглин, содержащие вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 4, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 42, где указанная вариабельная область тяжелой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены глицина (О) на аланин (А) в положении 49; замены аспарагина (М) на серин (8) в положении 76; замены треонина (Т) на аргинин (К) в положении 77; замены лейцина (Ь) на валин (У) в положении 78; замены аспарагина на изолейцин (I) в положении 82а; замены валина (У) на изолейцин (I) или лейцин (Ь) в положении 89; замены аргинина (К) на треонин (Т) или глицин (О) в положении 94; замены лейцина (Ь) на треонин (Т) в положении 108; замены валина (У) на лейцин (Ь) в положении 109; и замены серина (8) на аланин (А) в положении 113 согласно системе нумерации по КаЬа1; и вариабельная область легкой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены аспарагиновой кислоты (Ό) на глутамин (О) в положении 1; замены глутамина (О) на валин (У) в положении 3; замены метионина (М) на лейцин (Ь) в положении 4; замены треонина (Т) на серин (8) в положении 5; замены тирозина (Υ) на фенилаланин (Р) в положении 36; замены пролина (Р) на лейцин (Ь) в положении 46; замены триптофана (XV) на лейцин (Ъ) в положении 47; замены серина (8) на валин (У) или аланин (А) в положении 60; замены аспарагиновой кислоты (Ό) на серин (8) в положении 70; замены тирозина (Υ) на фенилаланин (Р) в положении 71; замены глутамина (О) на аланин (А) в положении 100; и замены изолейцина (I) на лейцин (Ь) в положении 106 согласно системе нумерации по КаЬаЕ
Согласно данному изобретению предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают эндоглин, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит:
(1) С1Ж1 с 8ЕО ГО N0: 66, С1Ж2 с 8ЕО ГО N0: 67 и СОК3 с 8ЕО ГО N0: 68;
(2) РК1 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 44 или аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 44, за исключением одной или более консервативных замен;
(3) РК2 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 45 или аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 45, за исключением замены глицина (О) на аланин (А) в положении 49 согласно системе нумерации по КаЬа1; и (4) РК3 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 47 или аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 47, за исключением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из:
(а) замены аспарагина (И) на серин (8) в положении 76;
(б) замены треонина (Т) на аргинин (К) в положении 77;
(в) замены лейцина (Ь) на валин (У) в положении 78;
(г) замены аспарагина (Х) на изолейцин (I) в положении 82а;
(д) замены валина (У) на изолейцин (I) или лейцин (Ь) в положении 89; и (е) замены аргинина (К) на треонин (Т) или глицин (О) в положении 94 согласно системе нумерации по КаЬаЕ и (5) РК4 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 56 или аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 56, за исключением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из:
(а) замены лейцина (Ь) на треонин (Т) в положении 108;
(6) замены валина (У) на лейцин (Ь) в положении 109 и (в) замены серина (8) на аланин (А) в положении 113 согласно системе нумерации по КаЬа1; и указанная вариабельная область легкой цепи содержит:
(1) С1Ж1 с 8ЕО ГО N0: 63, С1Ж2 с 8ЕО ГО N0: 64 и СОК3 с 8ЕО ГО N0: 65;
(2) РК1 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 6 или аминокис- 37 025174 лотную последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 6, за исключением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из:
(а) замены аспарагиновой кислоты (Ό) на глутамин (О) в положении 1;
(б) замены глутамина (О) на валин (V) в положении 3;
(в) замены метионина (М) на лейцин (Ь) в положении 4; и (г) замены треонина (Т) на серин (δ) в положении 5 согласно системе нумерации по КаЬаЕ и (3) ΡΚ2 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 21 или аминокислотную последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 20, за исключением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из:
(а) замены тирозина (Υ) на фенилаланин (Ρ) в положении 36;
(б) замены пролина (Р) на лейцин (Ъ) в положении 46; и (в) замены триптофана (XV) на лейцин (Ь) в положении 47 согласно системе нумерации по КаЬаЕ и (4) ΡΚ3 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 29 или аминокислотную последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 28, за исключением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из:
(а) замены серина (δ) на валин (V) или аланин (А) в положении 60;
(б) замены аспарагиновой кислоты (О) на серин (δ) в положении 70; и (в) замены тирозина (Υ) на фенилаланин (Ρ) в положении 71 согласно системе нумерации по КаЬаЕ и (5) ΡΚ4 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность δΕΟ Ш N0: 35 или аминокислотную последовательность δΕΟ Ш N0: 35, за исключением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из:
(а) замены глицина (Ο) на аланин (А) в положении 100 и (6) замены изолейцина (Ι) на лейцин (Ь) в положении 106 согласно системе нумерации по КаЬаЕ
Существенная часть вариабельного домена будет включать три участка ί','ΌΚ вместе с расположенными между ними каркасными участками. Эта часть также может включать по меньшей мере примерно 50% любого из двух или обоих первого и четвертого каркасных участков, при этом 50% представляют собой 50% первого каркасного участка на С-конце и 50% четвертого каркасного участка на Оконце. Дополнительные остатки на N или С-конце этой существенной части вариабельного домена могут представлять собой остатки, в норме не ассоциированные с участками природного вариабельного домена. Например, конструирование гуманизированных антител и антигенсвязывающих фрагментов против эндоглина, описанных в данной заявке, полученных методами рекомбинантной ДНК, может привести к введению N или С-концевых остатков, кодируемых линкерами, введенными для облегчения клонирования или других стадий обработки. Другие стадии обработки включают введение линкеров с целью присоединения вариабельных доменов к другим белковым последовательностям, включающим иммуноглобулиновые тяжелые цепи, другие вариабельные домены (например, при получении диател) или белковые метки, как рассмотрено более подробно ниже.
Гуманизированные СЮК3-участки против эндоглина, имеющие аминокислотные последовательности, по существу, такие, как для СЮК3-участков антител, описанных в данной заявке, будут располагаться в структуре, которая обеспечивает связывание ί'.'ΌΚ3 -участков с эндоглином. Структура, несущая ί'.'ΌΚ3. может происходить из последовательности тяжелой или легкой цепи антитела или ее существенной части, в которой участки ί'.'ΌΚ3 расположены в местах, соответствующих СЮК3-участку природных вариабельных доменов νΗ и V антитела, кодируемых перегруппированными иммуноглобулиновыми генами.
В одном неограничивающем примере согласно данному изобретению предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие вариабельную тяжелую цепь, имеющую СОК3, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ Ш N0: 68, и/или вариабельную легкую цепь, имеющую СОК3, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 65. В одном воплощении вариабельная тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ Ш N0: 40, за исключением замены 0ΌΚ3 на 0ΌΚ3 с аминокислотной последовательностью, представленной в δΕΟ Ш N0: 68. В другом воплощении вариабельная легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ Ш N0: 2, за исключением замены 0ΌΚ3 на ί'.'ΌΚ3 с аминокислотной последовательностью, представленной в δΕΟ Ш N0: 65. В дополнение к этому, такие ί'.'ΌΚ3-содержащие вариабельные области/цепи могут содержать один или более ΡΚ с приведенными аминокислотными последовательностями, например, описанными выше (или такие ΡΚ, содержащие одну или более дополнительных модификаций), где антитела или антигенсвязывающие фрагменты имеют 3 СОК и 4 ΡΚ в каждой из νΗ- и ^-областей, обладают специфической связывающей активностью в отношении эндоглина и способны ингибировать ангиогенез. Помимо этого, в пределах этих вариабельных областей также могут быть сделаны замены в различных 1-сегментах антител для дальнейшего изменения вариабельных областей цепей.
- 38 025174
В одном аспекте вариабельные тяжелые и легкие цепи, описанные в данной заявке, также могут быть созданы посредством замены последовательностей РК4. В одном воплощении последовательности
дующего:
их антигенсвязывающими фрагментами. Такие супергуманизированные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕР ГО N0: 71 или 72, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕР ГО N0: 75.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложено гуманизированное антитело, способное конкурировать с гуманизированным антителом или антигенсвязывающим фрагментом против эндоглина, описанными в данной заявке, в условиях, при которых по меньшей мере 5% антитела, имеющего УН- и Уъ-последовательности данного антитела, блокировано от связывания с эндоглином вследствие конкуренции с таким антителом в ЕЫ§А-анализе.
Согласно данному изобретению предложены нейтрализующие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с эндоглином и модулируют активность эндоглина. Нейтрализующее антитело, например, может ингибировать ангиогенез посредством связывания с эндоглином.
Процент (%) ингибирования ангиогенеза гуманизированным антителом против эндоглина или его антигенсвязывающим фрагментом, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз или более раз превышающий величину для отрицательных контролей, является показателем того, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует ангиогенез. Процент (%) ингибирования ангиогенеза гуманизированным антителом против эндоглина или его антигенсвязывающим фрагментом, менее чем в 2 раза превышающий величину для отрицательных контролей, является показателем того, что антитело не ингибирует ангиогенез.
Связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с эндоглином может частично (например, на 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99% или на любое число в данной заявке) или полностью ингибировать ангиогенез. Нейтрализующая или ингибирующая активность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может быть определена с использованием анализа ίη ν 11го и/или ίη νί\Ό с использованием принятых в данной области техники анализов, такие как анализы, описанные в данной заявке или иным образом известные в данной области.
В одном аспекте антигенсвязывающий фрагмент любого из гуманизированных антител, описанных выше, представляет собой РаЬ, РаЬ', Ρά, Р(аЬ')2, Ρν, 8сРу, одноцепочечный связывающий полипептид (например, 8сРу вместе с Рс-областью) или любой другой их функциональный фрагмент, как описано в данной заявке.
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, полезны для применений в детекции или диагностике, как более подробно описано ниже. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, полезны для связывания с эндоглином, что, в свою очередь, может ингибировать ангиогенез, как описано в данной заявке.
При необходимости, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке,
- 39 025174 также могут быть модифицированы с целью изменения специфических свойств антитела при сохранении желаемой функциональности. Например, в одном воплощении соединение может быть модифицировано с целью изменения фармакокинетического свойства соединения, такого как стабильность, растворимость, биодоступность или период полувыведения ίη νίνο. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, могут дополнительно содержать терапевтическую группировку, детектируемую группировку или и ту и другую для использования в диагностических и/или терапевтических применениях.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в виде иммуноконъюгатов. Как использовано в данной заявке, для целей описания и формулы изобретения, иммуноконъюгаты относятся к конъюгатам, состоящим из гуманизированных антител против эндоглина или их фрагментов по настоящему изобретению и по меньшей мере одной терапевтической метки. Терапевтические метки включают противоопухолевые агенты и ингибиторы ангиогенеза. Такие противоопухолевые агенты известны в данной области и включают, но не ограничиваются этим, токсины, лекарственные средства, ферменты, цитокины, радионуклиды, фотодинамические агенты и ингибиторы ангиогенеза. Токсины включают, но не ограничиваются этим, цепь А рицина, мутантные экзотоксины Ρ8еиάοтοηа8, дифтерийный анатоксин, стрептонигрин, боамицин, сапорин, гелонин и антивирусный белок лаконоса. Лекарственные средства включают даунорубицин, метотрексат и калихеамицины. Радионуклиды включают радиоактивные металлы. Цитокины включают, но не ограничиваются этим, трансформирующий фактор роста (ΤΟΡ)-β, интерлейкины, интерфероны и факторы некроза опухолей. Фотодинамические агенты включают, но не ограничиваются этим, порфирины и их производные. Дополнительные терапевтические метки будут известны в данной области и также рассматриваются в данной заявке. Способы образования комплексов тАЬ против эндоглина или его фрагмента по меньшей мере с одним противоопухолевым агентом хорошо известны специалистам в данной области (т.е. обзор конъюгатов антител приведен в СЬеЬе е1 а1., 1994, Ρ1ι;·ιηη;κο1. ТЬет., 63: 209-34). В таких способах можно применять один из нескольких доступных гетеробифункциональных реагентов, используемых для сочетания или связывания молекул. Дополнительные радионуклиды такжеописаны в данной заявке вместе с дополнительными способами связывания молекул, таких как терапевтические и диагностические метки.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть модифицированы с использованием методов, известных в данной области для различных целей, например, посредством добавления полиэтиленгликоля (ПЭГ). Модификация посредством ПЭГ (ПЭГилирование) может приводить к одному или более чем одному из следующего: улучшенному времени циркуляции, улучшенной растворимости, повышенной устойчивости к протеолизу, пониженной антигенности и иммуногенности, улучшенной биодоступности, пониженной токсичности, улучшенной стабильности и упрощению технологии изготовления лекарственного средства (см. обзор в Ртаис18 е1 а1., ΙηΦΓη;·ιΙίοη;·ι1 ίοιίΓηαΙ ο£ ^ιηηΐοίοβ.ν 68: 1-18, 1998).
В случае антигенсвязывающего фрагмента, который не содержит Рс-области, Рс-область к данному фрагменту можно добавить (например, рекомбинантным методом), например, с целью увеличения периода полувыведения антигенсвязывающего фрагмента из кровотока после введения пациенту. Выбор соответствующей Рс-области и способы встраивания таких фрагментов известны в данной области. Встраивание Рс-области Ι§0 в интересующий полипептид для увеличения периода его полувыведения из кровотока, а не для утраты его биологической активности, можно осуществить, используя традиционные методы, известные в данной области, такие как, например, описанные в патенте США № 6096871, который таким образом включен посредством ссылки во всей своей полноте. Рс-области антител также могут быть модифицированы с целью увеличения периода полувыведения антигенсвязывающего фрагмента из кровотока после введения пациенту. Модификации могут быть определены с использованием традиционных в данной области способов, таких как, например, описанные в патенте США № 7217798, который таким образом включен посредством ссылки во всей своей полноте.
Также известны другие способы увеличения периода полувыведения слитых белков на основе антител из кровотока, такие как, например, описанные в патентах США №№ 7091321 и 6737056, каждый из которых таким образом включен посредством ссылки. Кроме того, могут быть получены или экспрессированы такие антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые не содержат фукозу на своих комплексных Ν-гликозид-связанных сахарных цепях. Известно, что удаление фукозы из комплексных Νгликозид-связанных сахарных цепей увеличивает эффекторные функции антител и антигенсвязывающих фрагментов, включая, но не ограничиваясь этим, антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЭСС) и комплемент-зависимую цитотоксичность (СЭС). Аналогично, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые могут связывать эндоглин, могут быть присоединены по их Сконцу ко всей или к части тяжелой цепи иммуноглобулина, происходящей из любого изотипа антител, например ЦС, Ι§Α, Ι§Ε, Ι§Ό и Ι§Μ, и любого из подклассов изотипов, в частности Ι§01, Ι§02^ Ι8Ο23, ΙβΟ3 и Ι§04.
Помимо этого, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, также могут быть модифицированы с тем, чтобы они могли проходить через гематоэнцефалический барьер. Такая модификация антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, делает возможным лечение заболеваний головного мозга, таких как мультиформная глиобластома (0ΒΜ). Ти- 40 025174 пичные модификации, позволяющие белкам, таким как антитела или антигенсвязывающие фрагменты, проходить через гематоэнцефалический барьер, описаны в патентной публикации США 20070082380, которая таким образом включена посредством ссылки во всей своей полноте.
Было показано, что гликозилирование иммуноглобулинов оказывает значительное влияние на их эффекторные функции, структурную стабильность и скорость секреции из антитело-продуцирующих клеток (ЬеаНегЬагготе е! а1., Мо1. Iттииο1. 22: 407 (1985)). Углеводные группы, отвечающие за эти свойства, обычно присоединены к константным (С) областям антител. Например, гликозилирование !дС по аспарагину 297 в домене СН2 требуется для полной способности !дС активировать классический путь комплемент-зависимого цитолиза (Тао аий Моткои, I. Iттииο1. 143: 2595 (1989)). Гликозилирование IдМ по аспарагину 402 в домене СН3 необходимо для достижения правильной сборки и цитолитической активности антитела (Мигаока аий 3Ьи1таи, I. Iттииο1. 142: 695 (1989)). Удаление сайтов гликозилирования в положениях 162 и 419 в доменах СН1 и СН3 !дА антитела приводит к внутриклеточной деградации и по меньшей мере к 90%-ному ингибированию секреции (Тау1ог аий Аа11, Мо1. Се11. Вю1. 8: 4197 (1988)). Кроме того, могут быть получены или экспрессированы такие антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые не содержат фукозу на своих комплексных Ν-гликозид-связанных сахарных цепях. Известно, что удаление фукозы из комплексных Ν-гликозид-связанных сахарных цепей увеличивает эффекторные функции антител и антигенсвязывающих фрагментов, включая, но не ограничиваясь этим, антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЭСС) и комплемент-зависимую цитотоксичность (СЭС). Эти дефукозилированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с помощью различных систем, в которых используются методы молекулярного клонирования, известные в данной области, включая, но не ограничиваясь этим, трансгенных животных, трансгенные растения или клеточные линии, которые были созданы с помощью генной инженерии, так что они больше не содержат ферменты и биохимические пути, необходимые для включения фукозы в комплексные Ν-гликозид-связанные сахарные цепи (также известные как фукозилтрансфераза-нокаутные животные, растения или клетки). Неограничивающие примеры клеток, которые могут быть модифицированы с тем, чтобы получить фукозилтрансфераза-нокаутные клетки, включают клетки СНО, клетки 3Р2/0, клетки N30 и клетки УВ2/0.
Также было рассмотрено гликозилирование иммуноглобулинов в вариабельной (V) области. 3ох и Ноой сообщили, что примерно 20% человеческих антител гликозилированы в ν-области (Ргос. Иа!1. Асай. 3с1. иЗА, 66: 975 (1970)). Предполагают, что гликозилирование ν-домена происходит в результате случайной встречаемости Ν-связанного сигнала гликозилирования Аки-Хаа-Зег/ТЬг в последовательности ν-области и, как считается в данной области, не играет существенной роли в функционировании иммуноглобулинов.
Гликозилирование по каркасному остатку в вариабельном домене может изменять связывающее взаимодействие антитела с антигеном. Настоящее изобретение включает критерии, согласно которым выбирают ограниченное количество аминокислот в каркасном участке или СЭР гуманизированной иммуноглобулиновой цепи, которые подлежат мутации (например, путем замены, делеции или добавления остатков) с целью увеличения аффинности антитела.
Аффинность связывания с предварительно определенным полипептидным антигеном обычно можно модулировать путем введения одной или более мутаций в каркас ν-области, обычно в участки, прилегающие к одному или более СЭР, и/или в один или более каркасных участков. Обычно такие мутации подразумевают введение консервативных аминокислотных замен, которые либо разрушают, либо создают последовательности сайтов гликозилирования, но, по существу, не влияют на гидропатические структурные свойства данного полипептида. Обычно избегают мутаций, которые вводят остаток пролина. Гликозилирование антител и их антигенсвязывающих фрагментов также описано в патенте США № 6350861, который включен в данное описание посредством ссылки в отношении гликозилирования.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть приготовлены для кратковременной доставки или пролонгированной (долговременной) доставки.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с эндоглином, также могут быть использованы для очистки эндоглина и/или для определения уровней эндоглина в образце или у пациента, чтобы определить или диагностировать заболевание или расстройство, ассоциированное с эндоглином, как описано более подробно ниже.
Гуманизированные антитела, антигенсвязывающие фрагменты и связывающие белки, которые связывают эндоглин, полученные с использованием таких способов, можно протестировать в отношении одного или более чем одного из следующего: аффинности связывания, авидности и нейтрализующих свойств. Полезные гуманизированные антитела, антигенсвязывающие фрагменты и связывающие белки могут быть использованы для введения указанному пациенту с целью предупреждения, ингибирования, регуляции или лечения состояния, заболевания или расстройства, ассоциированного с ангиогенезом.
Согласно данному изобретению предложены способы идентификации гуманизированных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с эндоглином. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут быть оценены в отношении одного или более чем одного из следующего: аффинности связывания, скоростей ассоциации, скоростей диссоциации и авидности. В одном из аспектов
- 41 025174 антитела могут быть оценены в отношении их способности нейтрализовать активность эндоглина или полипептида, в котором присутствует эндоглин-связывающая последовательность. Измерение аффинности связывания, скоростей ассоциации, скоростей диссоциации и авидности может быть осуществлено с использованием принятых в данной области техники анализов, включающих, но не ограничивающихся этим, иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЫ8А), анализ Скэтчарда, В1АС0КЕ-анализ (поверхностный плазмонный резонанс) и т.д., а также другие анализы, обычно используемые и известные среднему специалисту в данной области.
Измерение связывания антител с эндоглином и/или способности антител и их антигенсвязывающих фрагментов, например, ингибировать ангиогенез, можно осуществить, используя, например, иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЫ8А), анализ конкурентного связывания, ЕЫ8Р0Т-анализ (иммуноферментный спот-анализ) или любой другой полезный анализ, известный в данной области. Эти анализы являются обычно используемыми анализами и хорошо известны среднему специалисту в данной области.
В одном неограничивающем воплощении ЕЫ8А-анализ может быть использован для измерения связывающей способности специфических антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с эндоглином.
Анализы, такие как ЕЫ8А, также могут быть использованы для идентификации антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые демонстрируют повышенную специфичность к эндоглину в сравнении с другими антителами или их антигенсвязывающими фрагментами. Анализы, такие как ЕЫ8А, также могут быть использованы для идентификации антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с эпитопами на одном или более полипептидах и на одном или более видах эндоглина. Анализ специфичности можно выполнить, осуществляя параллельные ЕЫ8А-анализы, в которых в отдельных камерах для анализа одновременно проводят скрининг тестируемых антител в отношении способности связываться с одним или более эпитопами на различных вариантах полипептида, содержащего эпитопы эндоглина, для идентификации антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с эндоглином. Другим методом измерения кажущейся аффинности связывания, известным специалистам в данной области, является метод поверхностного плазмонного резонанса (анализ осуществляют на системе В1АС0КЕ 2000) (Ы1)еЬ1аф е1 а1., С1усо. ί., 2000, 17: 323-329). Стандартные измерения и традиционные анализы связывания описаны в Нее1еу, К.Р., Епйосг. Кек., 2002, 28: 217-229.
Гуманизированные антитела к эндоглину также могут быть проанализированы в отношении их способности лечить различные заболевания и состояния, ассоциированные с ангиогенезом, например различные формы глазных заболеваний, характеризующихся ангиогенезом/неоваскуляризацией (например, дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию), диабетическую нефропатию, хронические воспалительные заболевания (например, 1ВО), ревматоидный артрит, остеоартрит и различные формы рака (первичные опухоли и метастазы). Для мониторинга таких эффектов можно использовать любой подходящий анализ, известный специалисту в данной области. Некоторые такие методы описаны в данной заявке. В одном из примеров антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, анализируют в отношении их способности связывать эндоглин. В другом примере константы аффинности для антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, определяют методом поверхностного плазмонного резонанса (8РК). В еще одном другом примере антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, анализируют в отношении их эффекта на ингибирование ангиогенеза.
II. Композиции.
Каждое из соединений, описанных в данной заявке, может быть использовано в виде композиции при объединении с приемлемым носителем или эксципиентом. Такие композиции полезны для анализа ш νΐΐΐΌ или ш νί\Ό либо для введения субъекту ш νί\Ό или ех νί\Ό для лечения субъекта описанными соединениями.
Такие фармацевтические композиции могут включать, в дополнение к активному ингредиенту, фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, буфер, стабилизатор или другие вещества, хорошо известные специалистам в данной области. Такие вещества должны быть нетоксичными и не должны влиять на эффективность активного ингредиента. Точная природа носителя или другого вещества будет зависеть от пути введения.
Фармацевтические препараты, содержащие интересующий белок, например антитело или антигенсвязывающий фрагмент, идентифицированные способами, описанными в данной заявке, могут быть приготовлены для хранения путем смешивания белка, имеющего желательную степень очистки, с возможными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (КеттдЮп'к Рйагтасейса1 8с1епсек, 1611 еФйоп, 0ко1, А. Ей. (1980)) в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами являются такие, которые не токсичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях, и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид, бензэтония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпара- 42 025174 бены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЕЭТА (этилендиаминтетрауксусная кислота); сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; металлокомплексы (например, Ζπ-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как ΤΑΞΗΝ®, РЬИРОМСЗ® или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Приемлемые носители являются физиологически приемлемыми для введения пациенту и сохраняют терапевтические свойства соединений, с которыми/в которых их вводят. Приемлемые носители и их препараты в целом описаны, например, в РепипДопХ Рйагтасейса1 8аепсе8 (18!й Еййюп, ей. А. Оеппаго, Маск РиЫййтд Со., Район РА 1990). Одним из типичных носителей является физиологический раствор. Фраза фармацевтически приемлемый носитель, которая использована в данной заявке, означает фармацевтически приемлемое вещество, композицию или разбавитель, такие как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал, вовлекаемые в перенос или транспортировку соединений по настоящему изобретению из места введения, расположенного в одном органе или участке тела, в другой орган или участок тела или в систему для анализа ш \йго. Каждый носитель является приемлемым в смысле его совместимости с другими ингредиентами препарата и не наносит вреда субъекту, которому его вводят. Никакой приемлемый носитель не должен изменять специфической активности соединений по настоящему изобретению.
В одном из аспектов согласно данному изобретению предложены фармацевтически приемлемые или физиологически приемлемые композиции, включающие растворители (водные или неводные), растворы, эмульсии, дисперсионные среды, покрытия, изотонические и стимулирующие или замедляющие всасывание агенты, совместимые с фармацевтическим введением. Таким образом, фармацевтические композиции или фармацевтические препараты относятся к композиции, подходящей для фармацевтического применения у субъекта. Фармацевтические композиции и препараты включают количество соединения, описанного в данной заявке, и фармацевтически или физиологически приемлемый носитель.
Композиции могут быть приготовлены совместимыми с конкретным путем введения (т.е. системным или локальным). Таким образом, композиции включают носители, разбавители или эксципиенты, подходящие для введения различными путями.
В другом воплощении композиции могут дополнительно содержать, при необходимости, приемлемое вспомогательное вещество с целью улучшения стабильности соединений в композиции и/или для контроля скорости высвобождения композиции. Приемлемые вспомогательные вещества не изменяют специфической активности соединений по настоящему изобретению. Типичные приемлемые вспомогательные вещества включают, но не ограничиваются этим, сахар, такой как маннит, сорбит, глюкоза, ксилит, трегалоза, сорбоза, сахароза, галактоза, декстран, декстроза, фруктоза, лактоза, и их смеси. Приемлемые вспомогательные вещества могут быть объединены с приемлемыми носителями и/или эксципиентами, такими как декстроза. Альтернативно, типичные приемлемые вспомогательные вещества включают, но не ограничиваются этим, поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 20 или полисорбат 80, для увеличения стабильности пептида и уменьшения желирования раствора. Поверхностноактивное вещество можно добавлять к композиции в количестве от 0,01 до 5% раствора. Добавление таких приемлемых вспомогательных веществ увеличивает стабильность и период полуразложения композиции при хранении.
Фармацевтическую композицию можно вводить, например, посредством инъекции, включая, но не ограничиваясь этим, подкожную, интравитреальную, интрадермальную, внутривенную, внутриартериальную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию. В данной заявке рассматриваются эксципиенты и носители для применения в изготовлении композиций для каждого типа инъекции. Следующие далее описания приведены только в качестве примера и не предполагают ограничения объема композиций. Композиции для инъекций включают водные растворы (когда вещества растворимы в воде) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Носители, подходящие для внутривенного введения, включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Сгеторйог ЕЬ™ (ВА8Р, Рагаррапу, ΝΤ.) или забуференный фосфатами физиологический раствор (РВ§). Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. Текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем сохранения необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Антибактериальные и противогрибковые агенты включают, например, парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновую кислоту и тимеросал. В композиции могут быть включены изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит и хлорид натрия. Полученные растворы могут быть упакованы для применения
- 43 025174 в том виде, как они есть, или могут быть лиофилизированы; лиофилизированный препарат позже можно объединить со стерильным раствором перед введением. В случае внутривенной инъекции или инъекции в место поражения активный ингредиент будет находиться в форме приемлемого для парентерального введения водного раствора, который является апирогенным и имеет подходящие рН, изотоничность и стабильность. Специалисты в данной области способны правильно приготовить подходящие растворы, используя, например, изотонические разбавители, такие как раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор Рингера с лактатом для инъекций. При необходимости, могут быть включены консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие вспомогательные вещества. Стерильные инъекционные растворы можно приготовить путем включения активного ингредиента в необходимом количестве в соответствующий растворитель вместе с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии готовят путем включения активного ингредиента в стерильный разбавитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов, предпочтительные способы приготовления представляют собой вакуумную сушку и сублимационную сушку, посредством которых получают порошок активного ингредиента вместе с любым дополнительным желательным ингредиентом из его раствора, предварительно простерилизованного фильтрацией.
Традиционно композиции можно вводить интравитреально, подкожно или посредством интравитреального имплантата.
Традиционно композиции можно вводить внутривенно, например, посредством инъекции однократной дозы. В случае инъекции активный ингредиент может находиться в форме приемлемого для парентерального введения водного раствора, который является, по существу, апирогенным и имеет подходящие рН, изотоничность и стабильность. Подходящие растворы можно приготовить, используя, например, изотонические разбавители, такие как раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор Рингера с лактатом для инъекций. При необходимости, могут быть включены консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие вспомогательные вещества. Кроме того, композиции можно вводить посредством распыления в виде аэрозоля. (Ьа1т е! а1., Αе^оδо1^ζеб АпЦ-Т-сс11Кесер!ог Αηι^Ьоб^еδ Аге ЕГГссЬус адате! Атену Ш^атта!^ анб нурен-еас^Иу, к!. АгсЬ. АПедегу Тштгте, 134: 49-55 (2004)).
В одном из воплощений композиция лиофилизирована, например, для увеличения срока годности при хранении. Если композиции рассматриваются для применения в лекарственных средствах или в любом из способов, предложенных в данной заявке, предполагается, что данная композиция может быть, по существу, свободна от пирогенов, таким образом, композиция не будет вызывать воспалительную реакцию или опасную аллергическую реакцию при введении пациенту-человеку. Тестирование композиций на пирогены и приготовление композиций, по существу, свободных от пирогенов, хорошо известно среднему специалисту в данной области и может быть выполнено с использованием имеющихся в продаже наборов.
Приемлемые носители могут содержать соединение, которое стабилизирует, увеличивает или замедляет всасывание или клиренс. Такие соединения включают, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстраны; низкомолекулярные белки; композиции, которые уменьшают клиренс или гидролиз пептидов; или эксципиенты или другие стабилизаторы и/или буферы. Агенты, которые замедляют всасывание, включают, например, моностеарат алюминия и желатин. Для стабилизации или для увеличения или уменьшения всасывания фармацевтической композиции также можно использовать детергенты, включая липосомные носители. Для защиты от переваривания, соединение можно подвергнуть образованию комплекса с композицией для придания ему устойчивости к кислотному и ферментативному гидролизу, или соединение можно подвергнуть образованию комплекса в соответственно устойчивом носителе, таком как липосома. Способы защиты соединений от переваривания известны в данной области (см., например, Ρίχ (1996) РЬагт. Κεδ. 13: 1760-1764; δатаηеη (1996) I. РЬагт. РЬагтасоЕ, 48: 119-135; и патент США № 5391377, описывающие липидные композиции для пероральной доставки терапевтических агентов).
Фраза фармацевтически приемлемый относится к молекулярным субстанциям и композициям, которые являются физиологически переносимыми и обычно не дают аллергической или подобной неблагоприятной реакции, такой как растройство желудка, головокружение и тому подобное, при введении человеку.
Термин однократная доза, когда он используется со ссылкой на терапевтическую композицию, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве унитарной дозировки для людей, где каждая единица содержит заданное количество активного вещества, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, вместе с необходимым разбавителем; т.е. носителем или наполнителем.
Композиции можно вводить способом, совместимым с дозированной лекарственной формой и в терапевтически эффективном количестве. Количество, подлежащее введению, зависит от субъекта, которо- 44 025174 го лечат, способности иммунной системы субъекта утилизировать активный ингредиент и степени желаемой связывающей способности. Точные количества активного ингредиента, необходимые для введения, зависят от заключения практикующего врача, и являются индивидуальными для каждого индивидуума. Подходящие режимы для первоначального введения и бустер-инъекций также меняются, но являются типичными для первоначального введения с последующими повторными дозами с интервалами в один или более часов с последующей инъекцией или другим введением. Альтернативно, рассматриваются непрерывные внутривенные инфузии, достаточные для поддержания концентраций в крови.
Одно из воплощений охватывает применение композиций, описанных в данной заявке, для изготовления лекарственного средства для лечения состояния, заболевания или расстройства, описанного в данной заявке. Лекарственные средства могут быть приготовлены на основании физических характеристик пациента/субъекта, нуждающегося в таком лечении, и могут быть приготовлены в виде однократных или многократных препаратов с учетом стадии состояния, заболевания или расстройства. Лекарственные средства могут быть упакованы в подходящую упаковку с соответствующими этикетками для распределения по больницам и клиникам, где этикетка предназначена для указания лечения субъекта, имеющего заболевание, описанное в данной заявке. Лекарственные средства могут быть упакованы в виде одной или множества единиц. Инструкции относительно дозировки и введения композиций могут быть включены в упаковки, как описано ниже. Данное изобретение также направлено на лекарственные средства из гуманизированного антитела против эндоглина или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данной заявке выше, и фармацевтически приемлемого носителя.
Согласно данному изобретению предложены композиции гуманизированных антител и их антигенсвязывающих фрагментов, которые связывают эндоглин и включают таковые, которые описаны в другом месте в данной заявке. Гуманизированные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин, описанные в данной заявке, могут быть использованы для лечения различных форм глазных заболеваний, характеризующихся ангиогенезом/неоваскуляризацией (например, дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии), диабетической нефропатии, хронических воспалительных заболеваний (например, ΙΒΌ), ревматоидного артрита, остеоартрита и различных форм рака (первичных опухолей и метастазов).
Композицию (антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данной заявке) можно вводить отдельно или в комбинации со второй композицией либо одновременно, либо последовательно в зависимости от состояния, подлежащего лечению. В одном воплощении второе терапевтическое лечение представляет собой ингибитор ангиогенеза (как описано в данной заявке). В том случае, когда применяются две или более композиций, эти композиции можно вводить в комбинации (либо последовательно, либо одновременно). Композицию можно вводить в однократной дозе или многократных дозах.
В одном из воплощений настоящего изобретения приготовлены композиции, свободные от пирогенов, так что они являются приемлемыми для введения пациентам-людям. Тестирование композиций на пирогены и получение фармацевтических композиций, свободных от пирогенов, хорошо известно среднему специалисту в данной области.
В одном из воплощений настоящего изобретения рассматривается применение любой из композиций по настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения расстройства по настоящему изобретению. Лекарственные средства могут быть приготовлены на основании физических характеристик пациента/субъекта, нуждающегося в таком лечении, и могут быть приготовлены в виде однократных или многократных композиций с учетом расстройства. Лекарственные средства могут быть упакованы в подходящую фармацевтическую упаковку с соответствующими этикетками для распределения по больницам и клиникам, где этикетка предназначена для указания лечения расстройства, как описано в данной заявке, у субъекта. Лекарственные средства могут быть упакованы в виде одной или множества единиц. В упаковки могут быть включены инструкции относительно дозировки и введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению.
ΙΙΙ. Способы применения.
Согласно данному изобретению предложен способ индукции ответа у пациента (человека или субъекта, не являющегося человеком) путем введения указанному пациенту композиции антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое(ый) предпочтительно связывается с эндоглином. Сайт связывания, посредством которого связывается антитело, может представлять собой непрерывный или конформационный/дискретный эпитоп.
Эффективный ответ по настоящему изобретению достигается, если пациент испытывает частичное или полное облегчение или ослабление признаков или симптомов болезни, и конкретно включает, без ограничения, продление выживаемости и/или повышение остроты зрения. Ожидаемые периоды времени выживания без развития заболевания могут составлять от нескольких месяцев до нескольких лет, в зависимости от прогностических факторов, включающих число рецидивов, стадию заболевания и другие факторы. Увеличение выживаемости включает, без ограничения, периоды времени, составляющие по меньшей мере 1, примерно по меньшей мере 2, примерно по меньшей мере 3, примерно по меньшей мере 4, примерно по меньшей мере 6 мес, примерно по меньшей мере 1, примерно по меньшей мере 2, примерно по меньшей мере 3 года и т.д. Общая выживаемость также может составлять от нескольких меся- 45 025174 цев до нескольких лет. Альтернативно, эффективный ответ может состоять в том, что симптомы у пациента остаются неизменными. Следующие указания к лечению показаний описаны более подробно ниже.
Композиции антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, могут быть использованы в качестве нетерапевтических агентов (например, в качестве агентов для аффинной очистки). Обычно в одном из таких воплощений интересующий белок иммобилизован на твердой фазе, такой как смола §ерЬайех или фильтровальная бумага, с использованием традиционных методов, известных в данной области. Иммобилизованный белок приводят в контакт с образцом, содержащим интересующую мишень (или ее фрагмент), подлежащую очистке, и после этого носитель промывают подходящим растворителем, который будет удалять, по существу, весь материал в образце, за исключением белкамишени, который связан с иммобилизованным антителом. В конце носитель промывают другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер, рН 5,0, который будет высвобождать целевой белок. Помимо очистки, композиции могут быть использованы для детекции, диагностики и терапии заболеваний и расстройств, ассоциированных с эндоглином и ангиогенезом.
Термин приведение в контакт, как использовано в данной заявке, относится к добавлению раствора или композиции соединения вместе с жидкой средой, омывающей полипептиды, клетки, ткань или орган из организма. Альтернативно, приведение в контакт относится к смешиванию раствора или композиции соединения вместе с жидкостью, такой как кровь, сыворотка или плазма крови, происходящей из организма. В случае применений ш ν 11го, композиция также может содержать другой компонент, такой как диметилсульфоксид (ЭМ§0). ЭМ§0 облегчает поглощение соединений или растворимость соединений. Раствор, содержащий тестируемое соединение, можно добавить в среду, омывающую клетки, ткани или органы, или смешать с другой жидкостью, такой как кровь, используя аппарат для доставки, такой как устройство на основе пипетки или устройство на основе шприца. Для применений ш νί\Ό приведение в контакт может быть осуществлено, например, посредством введения композиции пациенту любым подходящим способом; композиции вместе с фармацевтически приемлемыми эксципиентами и носителями описаны более подробно выше.
Пациент (например, млекопитающее, такое как человек или животное, не являющееся человеком, такое как примат, грызун, корова, лошадь, свинья, овца и т. д.) в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения представляет собой млекопитающее, которое демонстрирует одно или более клинических признаков и/или симптомов заболевания или расстройства, описанного в данной заявке. В некоторых ситуациях пациент может не обнаруживать симптомы и все же иметь клинические проявления заболевания или расстройства. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть конъюгированы с терапевтической группировкой или представлять собой слитый белок, содержащий терапевтическую группировку. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть конъюгированы с детектируемой группировкой или представлять собой слитый белок, содержащий детектируемую группировку. В одном из воплощений антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть конъюгированы как с терапевтической группировкой, так и с детектируемой группировкой. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть конъюгированы или рекомбинантно сконструированы с аффинной меткой (например, меткой для очистки). Аффинные метки, такие как, например, Н1к6-метки (§ЕО ΙΌ Ν0: 85), традиционно используются в данной области.
В данном изобретении предложены такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые могут быть конъюгированы или связаны с терапевтической группировкой, и/или визуализирующей или детектируемой группировкой, и/или аффинной меткой. Способы конъюгирования или связывания полипептидов хорошо известны в данной области. Ассоциации (связывание) между соединениями и метками включают любые способы, известные в данной области, включающие, но не ограничивающиеся этим, ковалентные и нековалентные взаимодействия, химическое конъюгирование, а также рекомбинантные методы.
А. Связывание эндоглина и ангиогенез.
Эндоглин (СЭ105) экспрессируется на клеточной поверхности в виде гомодимерного трансмембранного белка с массой 180 кДа. Наружный домен связывается с изоформами ΤΟΡ-β1 и -3 с высокой аффинностью (50 нМ), и трансмембранный и внутриклеточный домены СГО105 имеют 71%-ное сходство последовательности с бетагликаном. Ген СГО105 человека расположен на хромосоме 9д34, как идентифицировано с использованием флуоресцентной гибридизации ш кйи, и кодирующая область содержит 14 экзонов, и были охарактеризованы две разные изоформы (Ь и §) СГО105 со способностью связывать ΤΟΡβ. Ь-СЭ105 состоит из 633 аминокислотных остатков с 47 аминокислотными остатками в цитоплазматическом хвосте, в противоположность 8-СЭ105, который состоит из 600 аминокислотных остатков и с цитоплазматическим хвостом длиной 14 аминокислот. Однако преобладающей формой является ЬСЭ105. СГО105 конститутивно фосфорилируется в эндотелиальных клетках, главным образом по остаткам серина и треонина, и это фосфорилирование обусловлено конститутивно активным ΤΟΡ-β К11 в клетке. Связывание ΤΟΡ-β с СГО105 приводит к подавлению фосфорилирования, аналогичному эффектам, наблюдаемым для ингибиторов протеинкиназы С. Аминокислотная последовательность человеческого СГО105 содержит трипептид аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (РСЭ), локализованный в экс- 46 025174 понированном участке внеклеточного домена. Пептид КСЭ представляет собой ключевую распознаваемую структуру, обнаруженную на белках ЕСМ (внеклеточный матрикс), таких как фибронектин, витронектин, фактор фон Виллебрандта (ν^Τ), коллаген I типа и фибриноген, и распознается интегринами клеточной поверхности. Адгезия с участием интегринов вовлечена в гемостаз, тромбоз, ангиогенез и воспаление, процессы, в которых эндотелий играет решающую роль. (ОиГГ е1 а1., РА8ЕВ 1., 17: 984-992 (2003)).
СО105 является членом семейства рецепторов ТОР-β, который экспрессируется пролиферирующими эндотелиальными клетками. Для пролиферации эндотелиальных клеток необходимы нормальные уровни СП 105. Экспрессия СО 105 увеличивается в результате клеточной гипоксии благодаря продуцированию гипоксия-индуцибельного фактора-1-α (ШР-1-α) и защищает гипоксические клетки от апоптоза. Некоторые функции СО105 ассоциированы с ТОР^-сигнальным путем. ТОР-β передает сигнал через гетеродимерные рецепторы, состоящие из серинкиназ, рецептора I (К!) и рецептора II (КП). Связывание ТОР-β с наружными доменами рецептора демаскирует активность цитоплазматической киназы КП, фосфорилирущей ТОР-β ПЕ который затем может взаимодействовать с нижележащими сигнальными молекулами, такими как белки §тай. СО105 образует часть ТОЕ-(1-рецепторного комплекса, но может существовать независимо на клеточной поверхности. Во многих клетках ш νίίτο СО 105 подавляет ТОР-βсигнальный путь.
СО105 также связывает другие ростовые факторы, такие как активин А и костные морфогенетические белки (ВМР) -10, -9, -7 и -2. Связывание ТОР-β или других лигандов ростовых факторов с СО105 требует присутствия, по меньшей мере, рецептора КП, а сам он не может связывать лиганды. Ассоциация СО105 с рецепторами не изменяет их аффинности к самому лиганду. После ассоциации цитоплазматический домен СО105 фосфорилируется под действием ТОР-β Ы и ТОР-β КП; затем киназа ТОР-β Ы, но не ТОР-β КП, диссоциирует из рецепторного комплекса.
Экспрессия СО105 ингибирует уровни фосфорилирования ТОР-β КП, но увеличивает уровни фосфорилирования ТОР-β К! что приводит к повышенному фосфорилированию 8тай 2, но не 8тай 3. Поскольку §тай 2 может взаимодействовать с рядом транскрипционных факторов, коактиваторов и супрессоров, фосфорилированный §тай 2 может действовать в качестве интегратора многочисленных сигналов для модулирования транскрипции генов. Таким образом, СО105 модулирует функции ТОР-β путем взаимодействия с ТОР-β К[ и ТОР-β КП и модифицирует фосфорилирование нижележащих §тай-белков.
Действие СО105 заключается в модулировании передачи сигнала в многокомпонентных киназных рецепторных комплексах суперсемейства ТОР-β, включающего рецепторы ТОР-β (ТОР^К), активинрецептор-подобные киназы (АПК) и активиновые рецепторы. В отсутствие СО105 активация рецепторов ТОР-β приводит к фосфорилированию белков §МАО (8МАО 2 и 3), которые ингибируют рост эндотелиальных клеток. Однако активация СО 105 под действием ТОР-β модулирует фосфорилирование белков 8МАО (включая фосфорилирование 8МАО 1, 5 и 8). Конечным результатом является высвобождение ингибирующих рост эффектов активации рецептора ТОР-β на эндотелиальных клетках (см. фиг. 3). Неудивительно, что предупреждение активации СО 105 с помощью антитела против СО 105 или антисмыслового олигонуклеотида действует синергически с ТОР-β в отношении подавления роста эндотелиалыных клеток.
Промотор СО 105 имеет длину 2,6 т.п.н., но не содержит ТАТА- или СААТ-боксы для инициации транскрипции. Однако он имеет две ОС-богатые области, консенсусные мотивы для §р1, е18, ОАТА, АР2, ЫОР-β и Май, а также ТОР^-отвечающие элементы. Тем не менее, СО105 имеет относительно ограниченное клеточное распределение. По-видимому, для достижения базального уровня транскрипции необходим е!з-сайт в положении -68 и §р1-сайты, однако в относительное ограничение экспрессии, например, в эндотелиальных клетках, по-видимому, вовлечены многочисленные регуляторные участки, в частности один в положении от -1294 до -932, а другой очень близко к сайту инициации транскрипции. СО105 активируется под действием ТОР-β, и это, как показано, требует §р1-сайта в положении от -37 до -29, также вовлекая один или более смежных вышележащих §ВЕ (§тай-связывающих элементов) сайтов, связывающих §тай 3 и/или 4 (которые активируются ТОР-β-сигнальным путем). Гипоксия является общим признаком ишемических тканей и опухолей и является мощным стимулятором экспрессии гена СО105 в эндотелиальных клетках (ЕС) сосудов. Такой эффект потенцируется в комбинации с ТОР-β 1. Активированный СО105 может влиять на функцию самозащиты в ЕС в условиях гипоксического стресса.
ЕС сосудов являются главным источником СО105. Клетки других типов, включая гладкомышечные клетки сосудов, фибробласты, макрофаги, лейкозные клетки пре-В- и миеломоноцитарного происхождения и эритроидные предшественники, экспрессируют СО105 в меньшей степени.
СО105 вовлечен в ангиогенез. Эксперименты с использованием антисмысловых последовательностей продемонстрировали, что подавление экспрессии СО105 в НИУЕС приводило к заметному ингибированию ангиогенеза ш νίίτο в комбинации с ТОР-β 1, что указывает на то, что СО105 является проангиогенным компонентом в эндотелиальных клетках. Дополнительным доказательством важной роли СО105 в ангиогенезе является использование 00105-нокаутных мышей. СО105-нулевые мыши демонстриру- 47 025174 ют многочисленные сердечно-сосудистые дефекты, приводящие к смерти на ранней стадии эмбрионального развития. Тяжелые сосудистые поражения, обнаруженные у СО105-нулевых мышей, указывают на то, что СЭ105 необходим для образования зрелых кровеносных сосудов во внеэмбриональной сосудистой сети, что также подтверждает непосредственную роль эндоглина в ангиогенезе.
Эндоглин, среди прочего также известный как СЭ105 или ебд-1, представляет собой гомодимерный мембранный гликопротеин I типа, который экспрессируется на высоких уровнях в пролиферирующих эндотелиальных клетках сосудов. Таким образом, эндоглин главным образом представляет собой ассоциированный с пролиферацией маркер эндотелиальных клеток, подвергающихся активному ангиогенезу. Однако экспрессия эндоглина может быть ограничена сосудистым эндотелием нормальных тканей. Известно, что человеческий эндоглин специфически связывается с трансформирующим фактором роста-β (ТОР-β), и выведенная аминокислотная последовательность эндоглина имеет строгую гомологию с β-гликаном, типом рецептора ТОР-β.
Эндоглин (ΕΌΟ) был мишенью в основанных на антителах способах сокращения сосудистой сети опухоли, поскольку ΕΌΟ представляет собой ассоциированный с пролиферацией антиген на эндотелиальных и лейкозных клетках. Его экспрессия активируется в опухолеассоциированном сосудистом эндотелии, и ΕΌΟ является существенным фактором ангиогенеза. Ангиогенез включает образование новых капиллярных кровеносных сосудов, приводящее к неоваскуляризации, а также поддержанию существующей сосудистой сети. Он представляет собой сложный процесс, который включает серию последовательных стадий, в том числе опосредованную эндотелиальными клетками деградацию базальной мембраны сосудов и интерстициальных матриксов, миграцию эндотелиальных клеток, пролиферацию эндотелиальных клеток и образование капиллярных петель эндотелиальными клетками.
Согласно данному изобретению предложены гуманизированные антитела, которые связывают эндоглин. Эндоглин можно обнаружить на клетках, которые содержат и поддерживают существующую сосудистую сеть, а также в клетках, которые стимулируют рост новой сосудистой сети и становятся ее частью. Эти антитела могут связывать эндоглин и тем самым ингибировать ангиогенез, ингибировать существующую сосудистую сеть или поддержание существующей сосудистой сети и/или ингибировать дилатацию малых сосудов. В дополнение к их применению для очистки эндоглина, эти антитела полезны для очистки, детекции и диагностических целей, а также терапевтических целей. Антитела, предложенные в данной заявке, могут быть использованы для изготовления лекарственных средств для лечения ряда состояний и заболеваний, в способах лечения указанных состояний и заболеваний и способах детекции или диагностики.
Были получены мышиные моноклональные антитела (тЛЬ) против эндоглина, которые модулируют активность эндоглина и посредством этого ингибируют ангиогенез и/или ингибируют вазодилатацию малых кровеносных сосудов. Эти мышиные антитела описаны в патентах США 5928641, 6200566, 6190660 и 7097836, каждый из которых таким образом включен во всей своей полноте. Кроме того, была продемонстрирована эффективность ех νίνο и ίη νίνο ряда таких антител; моноклональные антитела, которые связывают эндоглин, представляют интерес в качестве эндоглин-модулирующих соединений. Однако терапевтическое применение мышиных антител является недопустимым, поскольку введение мышиных антител имеет ряд ограничений, включая иммуногенность, например, в форме человеческих антимышиных антител (НАМА).
Ангиогенез, используемый в данной заявке, включает все аспекты поддержания и развития кровеносных сосудов. Таким образом, ангиогенез включает образование новых капиллярных кровеносных сосудов, приводящее к неоваскуляризации, а также поддержание и контроль существующей сосудистой сети и малых кровеносных сосудов. Ангиогенез представляет собой сложный процесс, который включает серию последовательных стадий, включающих опосредованную эндотелиальными клетками деградацию сосудистой базальной мембраны и интерстициальных матриксов, миграцию эндотелиальных клеток, пролиферацию эндотелиальных клеток и образование капиллярных петель эндотелиальными клетками. Ангиогенез вовлечен в рост и/или развитие новых кровеносных сосудов (что также обозначается как неоваскуляризация), дилатацию малых сосудов, чрезмерный или пролонгированный рост сосудов и поддержание существующей сосудистой сети. Известно, что эндоглин вовлечен в регуляцию ангиогенеза, и полагают, что он вовлечен в многочисленные биохимические пути, связанные с индукцией ангиогенеза. (ΜΓ е1 а1., РАЗЕВ I., 17: 984-992 (2003); ВегиаЬеи е1 а1., I. Се11. ВюсНет., 102(6): 1375-1388 (2007)).
Как использовано в данной заявке, термины ингибирующий ангиогенез, ангиогенезингибирующий или антиангиогенный включают ингибирование васкулогенеза (образование и развитие сосудов) и предназначены для обозначения влияния на уменьшение степени, величины или скорости неоваскуляризации. Влияние на уменьшение степени, величины или скорости пролиферации эндотелиальных клеток или миграции в ткани представляет собой конкретный пример ингибирования ангиогенеза.
Термин ангиогенез-ингибирующая композиция относится к композиции, которая ингибирует ангиогенез-опосредованные процессы, такие как миграция эндотелиальных клеток, пролиферация, образование трубочек, и впоследствии приводит к ингибированию образования новых кровеносных сосудов из
- 48 025174 уже существующих сосудов и, таким образом, влияет на ангиогенез-зависимые состояния.
Термин ангиогенез-ассоциированное заболевание используется в данной заявке для целей описания и формулы изобретения для обозначения некоторых патологических процессов у людей, при которых ангиогенез является аномально продолжительным. Он также включает ангиогенные состояния и заболевания, такие как заболевания и состояния, которые связаны с ангиогенезом, вызваны или ассоциированы с ангиогенезом. Неограничивающие примеры таких заболеваний включают различные формы глазных заболеваний, характеризующихся ангиогенезом/неоваскуляризацией (например, дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию), диабетическую нефропатию, хронические воспалительные заболевания (например, !ВО), ревматоидный артрит, остеоартрит и различные формы рака и метастазы. Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, могут быть использованы для лечения ангиогенез-ассоциированного заболевания посредством связывания эндоглина и ингибирования ангиогенеза.
Термин антиангиогенная терапия используется в данной заявке для целей описания и формулы изобретения для обозначения терапии, направленной на клетки и/или сосудистую сеть, экспрессирующие эндоглин (экспрессируемый на более высоких уровнях в пролиферирующей сосудистой сети по сравнению с сосудистой сетью, находящейся в состоянии покоя); он также включает в себя терапию, направленную против ангиогенеза (т.е. образования новых капиллярных кровеносных сосудов, приводящего к неоваскуляризации); терапию, направленную против ангиогенеза существующей сосудистой сети и/или чрезмерной васкуляризации или роста кровеносных сосудов; терапию, направленную против дилатации малых сосудов; и терапию, направленную на заболевание или состояние (например, сосудистую направленную терапию). Типичные заболевания или состояния, рассматриваемые в данном изобретении, включают, но не ограничиваются этим, различные формы глазных заболеваний, характеризующихся ангиогенезом/неоваскуляризацией (например, дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию), диабетическую нефропатию, хронические воспалительные заболевания (например, ΣΒΌ), ревматоидный артрит, остеоартрит и различные формы рака, солидные опухоли и метастазы.
Термин глазное заболевание, характеризующееся неоваскуляризацией используется в данной заявке для целей описания и формулы изобретения для обозначения любого глазного заболевания, вызываемого усилением ангиогенеза или приводящего к усилению ангиогенеза в любом участке глаза, включая сетчатку, роговицу, зрачок, радужную оболочку, стекловидное тело или внутриглазную жидкость. Такие заболевания включают, например, возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию, недиабетическую ретинопатию, хориоидальную неоваскуляризацию (С№У) и субретинальную неоваскуляризацию (δКN или §КNУ) и неоплазмы глаза.
В. Диагностические применения.
Гуманизированные антитела против эндоглина и их фрагменты могут быть использованы для целей детекции, диагностики и/или мониторинга ίη угуо и ίη νίΐΐΌ. Полагают, что эндоглин вовлечен в многочисленные заболевания и расстройства, как описано дополнительно ниже. Лечение связанных с эндоглином заболеваний и состояний частично зависит от их диагностики, и антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, полезны для диагностики избытка эндоглина или для диагностики заболеваний и состояний, ассоциированных с активностью эндоглина.
Согласно данному изобретению предложен способ детекции уровней эндоглина в образце или у субъекта, включающий: (1) приведение в контакт антитела или антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данной заявке, с образцом или субъектом и (2) детекцию комплекса антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и эндоглина.
Согласно данному изобретению предложен способ визуализации или диагностики ангиогенеза или ангиогенез-зависимого заболевания или расстройства, включающий приведение в контакт композиции антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данной заявке, с образцом. Образцом может быть, например, кровь, сыворотка, плазма, тромбоциты, биопсийная жидкость, спиномозговая пункция, оболочки головного мозга и моча. Способ визуализации или диагностики может осуществляться в анализе ίη νίΙΐΌ. Альтернативно, в случае приведения в контакт путем введения композиции пациенту, визуализацию или диагностику ангиогенеза или ангиогенез-зависимого заболевания или расстройства осуществляют ίη νί\Ό.
В одном воплощении антитело или антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит детектируемую группировку. Детекция может осуществляться ίη νίύΌ, ίη νί\Ό или ех угуо. Анализы ίη νίίΐΌ для детекции и/или определения (количественного, качественного определения и т.д.) эндоглина антителами или их антигенсвязывающими фрагментами включают, но не ограничиваются этим, например, ЕЫ8А, ЫА и вестерн-блоттинг. Детекция, диагностика или мониторинг эндоглина ίη У11го может осуществляться путем получения образца (например, образца крови) от пациента и тестирования данного образца, например, в стандартном ЕЫ§А-анализе. Например, 96-луночный титрационный микропланшет можно покрыть антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, описанным в данной заявке, промыть и покрыть смесью ΡΒδ-Тетееи/БСА (бычий сывороточный альбумин) для ингибирования неспецифического связывания. Можно выполнить серийные разведения образца крови и поместить в дублированные лунки для сравнения с серийно разведенной стандартной кривой эндоглина. После инкубации и промыв- 49 025174 ки лунок можно добавить антитело против эндоглина, меченое биотином, с последующим добавлением стрептавидин-щелочной фосфатазы. Лунки можно промыть и добавить субстрат (пероксидаза хрена) для проявления планшета. Планшет можно считывать с использованием стандартного планшет-ридера и программного обеспечения.
Если детекцию осуществляют ш У1уо, то приведение в контакт выполняется посредством введения антитела или антигенсвязывающего фрагмента с использованием любых традиционных средств, таких как средства, описанные в другом месте в данной заявке. В таких способах детекция эндоглина в образце или у субъекта может быть использована для диагностики заболевания или расстройства, ассоциированного или коррелирующего с активностью эндоглина, такого как заболевания и расстройства, описанные в данной заявке.
При детекции, диагностике или мониторинге эндоглина ш У1уо пациенту вводят антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с эндоглином, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связаны с детектируемой группировкой. Детектируемую группировку можно визуализировать с использованием принятых в данной области техники методов, таких как, но не ограничивающихся этим, магнитно-резонансная визуализация (МЫ), флуоресценция, визуализация с примененим радиоактивных изотопов, источники излучения, оснащенные эндоскопами, лапароскопами или внутрисосудистым катетером (т.е. посредством детекции фотоактивных агентов), фотосканирование, сканирование с применением позитронно-эмиссионной томографии (РЕТ), ядерный магнитный резонанс (NМК) всего тела, радиосцинтиграфия, однофотонная эмиссионная компьютерная томография (БРЕСТ), сканирование в ближней инфракрасной области спектра (№К), рентгеновский анализ, ультразвуковое обследование и т.д., которые описаны, например, в патенте США № 6096289, патенте США № 7115716, патенте США № 7112412, заявке на патент США № 20030003048 и заявке на патент США № 20060147379, каждый из которых включен в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. Метки для детекции соединений с использованием таких методов также известны в данной области и описаны в таких патентах и заявках, и включены в данное описание посредством ссылки. Визуализация детектируемой группировки может предусматривать детекцию, диагностику и/или мониторинг состояния или заболевания, ассоциированного с эндоглином и/или ангиогенезом.
Дополнительные диагностические анализы, в которых используются антитела, специфичные к желаемому целевому белку, т.е. эндоглину, известны в данной области и также рассматриваются в данной заявке.
Неограничивающие состояния, заболевания и расстройства, которые следует рассматривать в связи с этими способами, включают, но не ограничиваются этим, состояния, заболевания и расстройства, ассоциированные с ангиогенезом, такие как, например, различные формы глазных заболеваний, характеризующихся ангиогенезом/неоваскуляризацией (например, дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию), диабетическую нефропатию, хронические воспалительные заболевания (например, ГВО), ревматоидный артрит, остеоартрит и различные формы рака (первичные опухоли и метастазы). При детекции, диагностики или мониторинге таких заболеваний рассматриваемому пациенту вводят композицию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данной заявке, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы с детектируемой группировкой. Группировка может быть визуализирована с использованием принятых в данной области техники методов, таких как методы, описанные выше. Визуализация детектируемой группировки может обеспечивать детекцию, диагностику и/или мониторинг таких состояний или заболеваний.
Для методов детекции ш νίΙΐΌ образцы, которые должны быть получены от пациента, включают, но не ограничиваются этим, кровь, образцы тканевой биопсии и жидкость из них.
Таким образом, согласно настоящему изобретению предложены гуманизированные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты против эндоглина, которые полезны для детекции или диагностики уровней эндоглина, ассоциированных с заболеванием или расстройством, потенциально указывающих на необходимость терапевтического лечения. В некоторых воплощениях антитела содержат гуманизированное антитело против эндоглина, описанное в данной заявке. В других воплощениях антитело дополнительно содержит второй агент. Такой агент может представлять собой молекулу или группировку, такую как, например, репортерная молекула или детектируемая метка. Детектируемые метки/группировки для таких методов детекции известны в данной области и описаны более подробно ниже. Репортерные молекулы представляют собой любую группировку, которую можно определить с использованием анализа. Неограничивающие примеры репортерных молекул, которые были конъюгированы с полипептидами, включают ферменты, радиоактивные метки, гаптены, флуоресцентные метки, фосфоресцентные молекулы, хемилюминесцентные молекулы, хромофоры, люминесцентные молекулы, фотоаффинные молекулы, окрашенные частицы или лиганды, такие как биотин. Детектируемые метки включают соединения и/или элементы, которые можно определить благодаря их специфическим функциональным свойствам и/или химическим характеристикам, использование которых делает возможной детекцию и/или при желании дальнейшее количественное определение полипептида, к которому они присоединены. В данной области известны многочисленные соответствующие детектируемые (визуализирующие) агенты, а также способы их присоединения к полипептидам (см., например, патенты США №№ 5021236, 4938948
- 50 025174 и 4472509, каждый из которых таким образом включен посредством ссылки).
Методы связывания полипептидов, таких как антитела, с детектируемыми группировками известны в данной области и включают, например, технологию рекомбинантных ДНК с образованием слитых белков и конъюгирование (например, химическое конъюгирование). Методы получения слитых белков посредством химического конъюгирования или конструирования рекомбинантов хорошо известны в данной области. Методы ковалентного и нековалентного присоединения компонентов также известны в данной области; см., например, \νί11ί;πηδ (1995) ВюсЬет1кЬу, 34: 1787-1797; ОоЬеЬ (1998) Рго!еш Ехрг. РипТ. 12: 404-414 и Кго11 (1993) ΌΝΑ Се11. Вю1. 12: 441-453.
В некоторых случаях может быть необходимо введение участка неструктурированного полипептидного линкерного участка между меткой или группировкой и одним или более чем одним участком антител, антигенсвязывающих фрагментов или связывающих белков, описанных в данной заявке. Линкер может облегчать повышенную гибкость и/или уменьшать пространственное затруднение между любыми двумя фрагментами. Линкер также может облегчать надлежащий фолдинг каждого фрагмента. Линкер может иметь природное происхождение, например последовательность, которая определена как существующая в случайной спирали между двумя доменами белка. Одна линкерная последовательность представляет собой линкер, обнаруженный между С-концевыми и Ν-концевыми доменами асубъединицы РНК-полимеразы. Другие примеры природных линкеров включают линкеры, обнаруженные в белках 1С1 и ΕόχΑ.
В самом линкере аминокислотная последовательность может варьироваться в зависимости от характеристик линкера, которые определяют эмпирически или выявляют посредством моделирования. Соображения при выборе линкера включают гибкость линкера, заряд линкера и присутствие некоторых аминокислот линкера в природных субъединицах. Кроме того, линкер может быть сконструирован таким образом, чтобы остатки в линкере контактировали с дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК), таким образом влияя на аффинность или специфичность связывания, или для взаимодействия с другими белками. В некоторых случаях, например, когда необходимо соединить более длинное расстояние между субъединицами или когда домены должны удерживаться в конкретной конфигурации, линкер возможно может содержать дополнительный свернутый домен. В некоторых воплощениях конструкция линкера может вовлекать пространственную конфигурацию доменов, которая необходима для того, чтобы линкер соединил относительно короткое расстояние, например менее чем примерно 10 А. Однако в некоторых воплощениях линкеры соединяют расстояние вплоть до примерно 50 А.
В самом линкере аминокислотная последовательность может варьироваться, в зависимости от характеристик линкера, которые определяют эмпирически или выявляют посредством моделирования. Соображения при выборе линкера включают гибкость линкера, заряд линкера и присутствие некоторых аминокислот линкера в природных субъединицах. Кроме того, линкер может быть сконструирован таким образом, чтобы остатки в линкере контактировали с ДНК, посредством чего влияя на аффинность связывания или специфичность, или чтобы взаимодействовать с другими белками. В некоторых случаях, когда необходимо соединить более длинное расстояние между субъединицами или когда домены должны удерживаться в конкретной конфигурации, линкер возможно может содержать дополнительный свернутый домен.
Способы связывания полипептидов (в свободном или в связанном с клетками состоянии) с гранулами известны в данной области. Способы селекции связанных полипептидов или клеток, экспонирующих полипептид, также известны в данной области. Кратко, в продаже имеются парамагнитные полистирольные микрочастицы (§рЬего!есЬ, 1пс., ЫЬебууШе, 1Ь; 1пуЬгодеп, Саг1кЬаб, СΑ), которые связывают пептиды с поверхностями микрочастиц, которые были модифицированы функциональными группами или покрыты различными антителами или лигандами, такими как, например, авидин, стрептавидин или биотин.
Парамагнитное свойство микрочастиц обеспечивает их выделение из раствора с использованием магнита. После удаления магнита микрочастицы могут быть легко ресуспендированы. Полипептиды могут быть связаны с парамагнитными полистирольными микрочастицами, покрытыми слоем полиуретана в пробирке. Группы гидрокси на поверхности микрочастиц активируются в результате взаимодействия с п-толуолсульфонилхлоридом (№1ккоп К. апб МокЬасЬ К. р-То1иепеки1Топу1 сЫопбе ак ап асйуабпд адеп! оГ адагоке Тог !Ье ргерагабоп оТ иптоЫП/еб аГПпИу Ьдапбк апб рго!ешк. Еиг. I ВюсЬет. 1980, 112: 397402). Альтернативно, парамагнитные полистирольные микрочастицы, содержащие карбоновую кислоту на поверхности, можно активировать карбодиимидом с последующим связыванием с полипептидом, получая в результате стабильную амидную связь между первичной аминогруппой полипептида и группами карбоновой кислоты на поверхности микрочастиц ^акаДта Ν. апб 1кабе Υ., МесЬаткт оГ ат1бе Гогта!юп Ьу сагЬобипибе Гог Ьюсоищдабоп ш ациеоик теб1а, Вюсоп)ида!е СЬет. 1995, 6(1): 123-130; ОШек МА., Нибкоп Α.ρ. апб Вогбегк С.Ь. 1г., 8!аЫ1йу оГ \уа1ег-ко1иЫе сагЬобиппбек т асщеоик ко1ибоп, Αηа1. ВюсЬет., 1990 РеЬ 1, 184(2): 244-248; 8еЬда1 Ό. апб Ууау 1.К., Α те!Ьоб Гог !Ье ЫдЬ еГйаепсу оГ \уа1егкоЫЫе сагЬобит1бе-теб1а!еб ат1бабоп, Α^Τ ВюсЬет., 1994 Αρ^, 218(1): 87-91; 5>/а]аЫ В. е! а1., ЕГГес!к оГ сагЬобит1бе кЬисЫге оп !Ье иптоЫЬ/айоп оГ еп/утек, Αρρ1. ВюсЬет. Вю!есЬпо1. 1991 Α^, 30(2): 225231). Другая возможность заключается в сочетании биотинилированных полипептидов с парамагнитны- 51 025174 169Еи, 177Ьц, 186Ке ми полистирольными микрочастицами, поверхности которых была ковалентно связана с монослоем стрептавидина. (Агдагаиа С.Е., Кии!/ ΓΌ., Вйкеи 3., Ахе1 К., Саи!ог С.К. Мо1еси1аг с1отид аий иискоййе кециеисе оГ Не к!гер!ау1йш деие. ШсШс Аайк Кек. 1986, 14(4): 1871-82; РаЬ1ег А., Неийпсккои А.А., Са\\то\ую/ Ко1кк М.А., Агадаиа С.Е., Саи!ог С.К. СЬагас!ег1/аЬои аий сгуккШ/айои оГ соге к!гер!ау1йш. I. Вю1. СЬет., 1987, 262(29): 13933-13937).
Полипептиды могут быть конъюгированы с широким спектром флуоресцентных красителей, гасителей и гаптенов, таких как флуоресцеин, К-фикоэритрин и биотин. Конъюгирование может осуществляться либо в процессе полипептидного синтеза, либо после завершения синтеза и очистки полипептида. Биотин представляет собой небольшой (244 кДа) витамин, который связывается с высокой аффинностью с авидиновым и стрептавидиновым белками и может быть конъюгирован с большинством пептидов без изменения их биологических активностей. Меченые биотином полипептиды легко очистить от немеченых полипептидов, используя аффинные гели с иммобилизованными стрептавидином и авидином, а стрептавидин- или авидин-конъюгированные зонды можно использовать для детекции биотинилированных полипептидов, например, в применениях с использованием ЕЫЗА, дот-блоттинга или вестернблоттинга. Ν-гидроксисукцинимидные сложные эфиры биотина представляют собой наиболее часто используемый тип биотинилирующего агента. Ν-гидроксисукцинимид-активированные биотины эффективно взаимодействуют с первичной аминогруппой в физиологических буферах с образованием стабильных амидных связей. Полипептиды имеют первичные амины на Ν-конце и также могут иметь несколько первичных аминов в боковой цепи остатков лизина, которые доступны в качестве мишеней для мечения Ν-гидроксисукцинимид-активированными биотиновыми реагентами. Доступны несколько разных Νгидроксисукцинимидных сложных эфиров биотина с различными свойствами и длиной спейсерной ножки (Р1егсе, КоскГогй, ГЬ). Реагенты на основе сульфо-N-гидроксисукцинимидных сложных эфиров являются водорастворимыми, позволяющими осуществлять реакции в отсутствие органических растворителей.
Мольное отношение биотина к полипептиду можно оценить в анализе с применением 2-(4'гидроксиазобензол-2-карбоновой кислоты), используя принятые в данной области техники методы (Сгееи, Ν4 (1975) АуПш. Ш Айуаисек ш Рго!еш СЬет1к!гу. Асайетк Ргекк, №\у Уогк. 29, 85-133; Сгееи, Ν4 (1971) ТЬе ике оГ Ы£иисЬоиа1 ЬюЬиу1 сотроиийк !о йе!егтте !Ье аггаидетеи! оГ киЬииЪк т ау1йш. ВюсЬет I. 125, 781-791; Сгееи, ΝΜ, (1965) А крес!горЬо!отеЬк аккау Гог ау1йш аий Ью!т Ьакей ои Ьтйшд оГ йуек Ьу ауМш. ВюсЬет. I. 94: 23с-24с). С полипептидом могут быть конъюгированы несколько молекул биотина, и каждая молекула биотина может связывать одну молекулу авидина. Образование биотин-авидиновой связи происходит очень быстро, и она стабильна в органических растворителях, при крайних значениях рН и в денатурирующих реагентах. Для количественного определения биотинилирования добавляют раствор, содержащий биотинилированный полипептид, к смеси 2-(4'гидроксиазобензол-2-карбоновой кислоты) и авидина. Поскольку биотин имеет более высокую аффинность в отношении авидина, он заменяет 2-(4'-гидроксиазобензол-2-карбоновую кислоту), и поглощение при 500 нм пропорционально уменьшается. Количество биотина в растворе можно определить количественно в одной кювете, измеряя поглощение раствора 2-(4'-гидроксиазобензол-2-карбоновая кислота)авидина до и после добавления биотин-содержащего пептида. Изменение в поглощении относится к количеству биотина в данном образце согласно коэффициенту экстинкции комплекса 2-(4'гидроксиазобензол-2-карбоновая кислота)авидин.
Альтернативно, антитело, антигенсвязывающий фрагмент или связывающий белок могут быть конъюгированы с флуоресцентной группировкой. Конъюгирование полипептидов с флуоресцентными группировками (например, К-фикоэритрином, флуоресцеин-изоцианатом (НТС) и т.д.) может быть осуществлено с использованием принятых в данной области техники методов, описанных, например, в С1а/ег, Ά.Ν. аий 3!гуег Ь. (1984). Тгеийк ВюсЬет. 3сг, 9: 423-7; Кготск, М.К аий Сгокктаи, Р.И. (1983) СЬи. СЬет., 29: 1582-6; Ьатег, Ь.Ь. аий Ьокеи, М.К. (1984) I. Iттииο1., 132:151-156; Рагкк, И.К. е! а1. (1984) Су!оте!гу, 5: 159-68; Нагйу, К.К. е! а1. (1983) №1ше, 306: 270-2; Нагйу К.К. е! а1. (1984) I. Ехр. Мей., 159: 1169-88; Кготск, М.П (1986) I. Iттииο. Ме!Ь., 92: 1-13; Иег-ВаНаи С., Катейа, Ν. аий Коу1еу, С. (1988) Аиа1. ВюсЬет., 173: 59-63.
В одном неограничивающем воплощении антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут быть ассоциированы (конъюгированы с) детектируемой меткой, такой как радионуклид, железо-связанное соединение, краситель, визуализирующий агент или флуоресцентный агент, для иммунодетекции эндоглина, которая может быть использована для визуализации связывания антител с эндоглином ш уЬго и/или ш У1Уо.
Неограничивающие примеры радиоактивных меток включают, например, 32Р, 33Р, 64Си, 67Са, 67Си, 68Са, 71Се, 75Вг, 76Вг, 77Вг, 77Ак, 77Вг, 81КЬ/81МКг, 87М3г, 90Υ, 97Ки, 99Тс,
Ди, 'Ди, 1193Ь, 1213и, 'Д, 'Д, 127Ск, 128Ва, 129Ск, 131Σ, 131Ск, 143Рг, 1533т,
Ке, 189Ке, 191Ок, 193Р!, Ч 197Нд, 199Аи, 203РЬ, 211А!, 212РЬ, 212В1 и 213Вг Радиоактивные метки могут быть присоединены к соединениям с использованием традиционной химии, известной в области визуализации антител. Меченые радиоактивной меткой соединения полезны в методах диагностики ш уЬго и в методах визуализации ш У1уо с примененим радиоактивных изотопов, и в радиоимму43К, 52Ре, 57Со, 100Рй, 101КЬ, 103РЬ, 161ТЬ, 166Но, 1Ад,
- 52 025174 нотерапии. Например, в случае визуализации ίη У1уо антитела и их антигенсвязывающие фрагменты могут быть конъюгированы скорее с визуализирующим агентом, чем с радиоактивным изотоп(ами), включая, но не ограничиваясь этим, агент, усиливающий магнитно-резонансную визуализацию, где, например, молекулу антитела нагружают большим числом парамагнитных ионов посредством хелатирующих групп. Примеры хелатирующих групп включают ЕЭТА, порфирины, полиамины, краун-эфиры и полиоксимы. Примеры парамагнитных ионов включают ионы гадолиния, железа, марганца, рения, европия, лантана, гольмия и эрбия. Кроме того, такие детектируемые группировки включают: металлы; хелаторы металлов; лантаниды; хелаторы лантанидов; радиоактивные металлы; хелаторы радиоактивных металлов; позитронно-активные ядра; микропузырьки (для ультразвукового исследования); липосомы; молекулы, микроинкапсулированные в липосомы или наносферы; монокристаллические наносоединения оксида железа; контрастные вещества для магнитно-резонансной визуализации; поглощающие, отражающие и/или рассеивающие свет агенты; коллоидные частицы; флуорофоры, такие как флуорофоры ближней инфракрасной области. Во многих воплощениях такая вторичная функциональная группа/группировка будет относительно большой по размеру, например по меньшей мере 25 а.е.м. (атомных единиц массы) и во многих случаях может иметь размер по меньшей мере 50, 100 или 250 а.е.м. В некоторых воплощениях вторичная функциональная группа представляет собой хелатную группировку для хелатирования металла, например хелатор для радиоактивного металла или парамагнитного иона. В воплощениях имеется хелатор для радионуклида, полезного для процедур лучевой терапии или визуализации.
Антагонисты по изобретению также могут быть проанализированы в отношении их способности модулировать ангиогенез в ткани. Для мониторинга таких эффектов можно использовать любой подходящий анализ, известный специалисту в данной области. Некоторые такие методы описаны в данной заявке.
Одним из способов оценки ангиогенеза является модель глаза кролика ίη У1уо, и его обозначают как анализ с использованием глаза кролика. Анализ с использованием глаза кролика описан подробно другими авторами и был использован для оценки как ангиогенеза, так и неоваскуляризации в присутствии ингибиторов ангиогенеза, таких как талидомид; см. Э'АтаЮ е1 а1. (1994) Ргос. №·ιΗ. Асаб. 8сЕ И8А, 91: 4082-4085.
Анализ с использованием глаза кролика является признанной моделью анализа ангиогенеза ίη У1уо, поскольку за процессом неоваскуляризации, проиллюстрированным прорастанием кровеносных сосудов кролика от края роговицы внутрь роговицы, легко наблюдать через прозрачную по своей природе роговицу глаза. Кроме того, и степень и уровень стимуляции или ингибирования неоваскуляризации или регрессии неоваскуляризации можно легко регистрировать во времени.
И наконец, кролика подвергают воздействию какого-либо тестируемого реагента, и, следовательно, состояние здоровья кролика является показателем токсичности тестируемого реагента.
В другом анализе измеряют ангиогенез с использованием мышиной модели химерная мышь: человек, и его обозначают как анализ с использованием химерных мышей. Данный анализ описан подробно другими авторами и дополнительно был описан в данной заявке для оценки ангиогенеза, неоваскуляризации и регрессии опухолевых тканей; см. Υаη, е1 а1. (1993) ί. Οίη. ЩуекЕ, 91: 986-996.
Анализ с использованием химерных мышей является полезной моделью для анализа ангиогенеза ίη У1уо, поскольку трансплантируемые кожные лоскуты гистологически очень напоминают нормальную человеческую кожу, и неоваскуляризация целой ткани происходит, когда настоящие человеческие кровеносные сосуды прорастают из пересаженной человеческой кожи в человеческую опухолевую ткань, расположенную на поверхности пересаженной человеческой кожи. Начало неоваскуляризации в человеческом трансплантате может быть продемонстрировано с использованием иммуногистохимического окрашивания новообразованной сосудистой сети на специфические маркеры эндотелиальных клеток человека.
Анализ с использованием химерных мышей демонстрирует регрессию неоваскуляризации на основе как количества новых сосудов, так и степени регрессии роста новых сосудов. Кроме того, он прост для мониторинга влияния на рост любой ткани, трансплантированной на пересаженную кожу, такой как опухолевая ткань. И наконец, данный анализ является полезным, поскольку существует внутренний контроль токсичности в данной аналитической системе. Химерную мышь подвергают воздействию какоголибо тестируемого реагента, и, следовательно, состояние здоровья мыши является показателем токсичности. Другие животные модели, описанные в данной заявке и известные в данной области, также могут быть использованы в способах, описанных в данной заявке.
С. Лечение с помощью гуманизированных антител против эндоглина.
Согласно данному изобретению предложены способы предупреждения или лечения одного или более заболеваний или расстройств, ассоциированных с ангиогенезом/неоваскуляризацией, чрезмерной васкуляризацией, опухолевым ростом, пролиферацией опухолевых клеток или дилатацией малых сосудов, включающие введение композиции, содержащей гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данной заявке, которые связываются с эндоглином, ассоциированным с данным заболеванием или расстройством, и предотвращают ангиогенез, посредством этого предупреж- 53 025174 дая, подвергая лечению, облегчению или ослаблению заболевание или его тяжесть.
Согласно данному изобретению предложены способы предупреждения или лечения одного или более заболеваний или расстройств, ассоциированных с ангиогенезом/неоваскуляризацией, включающие введение композиции, содержащей гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данной заявке, которые связываются с эндоглином, ассоциированным с данным заболеванием или расстройством, ослабляют ангиогенез или предотвращает чрезмерный ангиогенез.
Как использовано в данной заявке, предупреждение относится к профилактике, предупреждению начала возникновения симптомов, предупреждению развития заболевания или расстройства, ассоциированного с ангиогенезом или коррелирующего с активностью эндоглина. Как использовано в данной заявке, термины ингибирование, лечение и осуществление лечения используются взаимозаменяемо и относятся, например, к остановке развития симптомов, продлению выживаемости, частичному или полному облегчению симптомов и частичной или полной ликвидации состояния, заболевания или расстройства, ассоциированного с ангиогенезом или коррелирующего с активностью эндоглина.
Композиции можно вводить пациенту в терапевтически эффективном количестве, которое эффективно для получения некоторого желаемого терапевтического эффекта путем ингибирования заболевания или расстройства, такого как описанное в данной заявке, которое может быть ассоциировано с эндоглином, при целесообразном соотношении польза/риск, подходящем для любого терапевтического лечения. Для введения композиций по настоящему изобретению пациентам-людям эти композиции могут быть приготовлены согласно методологии, известной среднему специалисту в данной области. Терапевтически эффективное количество представляет собой количество, с помощью которого достигается, по меньшей мере частично, желаемый терапевтический или профилактический эффект в органе или ткани. Количество гуманизированного антитела против эндоглина или его антигенсвязывающего фрагмента, необходимое для обеспечения предупреждения и/или терапевтического лечения заболевания или расстройства, не является фиксированным рег бс. Количество вводимого гуманизированного антитела против эндоглина или его антигенсвязывающего фрагмента может варьироваться, в зависимости от типа заболевания, распространения заболевания и размера млекопитающего, страдающего от данного заболевания или расстройства. В одном из воплощений два гуманизированных антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, вводят пациенту в комбинации. Комбинация включает одновременное или последовательное введение антител.
Введение определяется в данной заявке как метод предоставления композиции пациенту способом, который приводит к поступлению композиции внутрь организма пациента. Такое введение может быть осуществлено любым путем, включающим, без ограничения, локальный, местный или системный посредством подкожного, интравитреального, интрадермального, внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного или внутримышечного введения (например, посредством инъекции). Совместное введение означает введение в пределах относительно короткого периода времени относительно друг друга; такой период времени может составлять менее 2 недель, менее 7 суток, менее 1 суток, и возможно даже одновременное введение.
Действительные уровни дозировок активных ингредиентов в композициях можно варьировать для того, чтобы получить то количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения желаемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, без токсичности для пациента. Выбранный уровень дозировок будет зависеть от множества факторов, включающих активность конкретного используемого соединения, путь введения, время введения, скорость экскреции конкретного используемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, используемые в комбинации с конкретной используемой композицией, возраст, пол, массу, состояние, общее состояние здоровья и предшествующую историю болезни пациента, которого лечат, и тому подобные факторы, хорошо известные в области медицины. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, можно вводить субъекту в различных дозовых количествах и в течение различных временных интервалов. Неограничивающие дозы включают примерно 0,01, примерно 0,05, примерно 0,1, примерно 0,5, примерно 1, примерно 5, примерно 10, примерно 20, примерно 30, примерно 40, примерно 50, примерно 60, примерно 70, примерно 80, примерно 90, примерно 100, примерно 125, примерно 150, примерно 175, примерно 200 мг/кг или любое целое число между ними. Кроме того, дозу(ы) антитела или антигенсвязывающего фрагмента можно вводить два раза в неделю, один раз в неделю, каждые две недели, каждые три недели, каждые 4 недели, каждые 6 недель, каждые 8 недель, каждые 12 недель или любую комбинацию недель среди них. Также рассматриваются такие циклы ведения доз, как, например, введение антител или их антигенсвязывающих фрагментов один или два раза в неделю в течение 4 недель, с последующими двумя неделями без терапии. Дополнительные циклы введения доз, включающие, например, различные комбинации доз и еженедельных циклов, описанных в данной заявке, также рассматриваются в пределах данного изобретения.
Приведение в контакт определяют в данной заявке как способ приведения композиции, предложенной в данной заявке, в состояние физической близости с клеткой, органом, тканью или жидкостью, как описано в данной заявке. Приведение в контакт охватывает системное или локальное введение любой из композиций, предложенных в данной заявке, и включает, без ограничения, процедуры и способы
- 54 025174 ш У11го, ш νί\Ό и/или ех νί\Ό. Термины объединение и приведение в контакт используются в данной заявке взаимозаменяемо и подразумевают их определение аналогичным образом.
Ответ достигается, если пациент испытывает частичное или полное облегчение или ослабление признаков или симптомов болезни, и конкретно включает, без ограничения, продление выживаемости. Ожидаемые периоды времени выживания без развития заболевания могут составлять от нескольких месяцев до нескольких лет, в зависимости от прогностических факторов, включающих число рецидивов, стадию заболевания и другие факторы. Увеличение выживаемости включает, без ограничения, периоды времени, составляющие по меньшей мере 1, примерно по меньшей мере 2, примерно по меньшей мере 3, примерно по меньшей мере 4, примерно по меньшей мере 6 мес, примерно по меньшей мере 1, примерно по меньшей мере 2, примерно по меньшей мере 3 года или более. Общая выживаемость также может составлять от нескольких месяцев до нескольких лет. Симптомы у пациента могут оставаться неизменными или могут ослабляться.
Врач или ветеринар, имеющий среднюю квалификацию в данной области, может легко определить и назначить эффективное количество (ЕЭ50) необходимой композиции. Например, врач или ветеринар мог бы начать с доз соединений, используемых в композиции, на более низких уровнях, чем те, которые требуются для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозировку до тех пор, пока не будет достигнут желаемый эффект. Альтернативно, дозу можно оставить постоянной.
Композиции можно вводить пациенту любым удобным путем, как описано выше. Независимо от выбранного пути введения, соединения по настоящему изобретению, которые могут быть использованы в подходящей гидратированной форме, и/или композиции готовят в приемлемых лекарственных формах, таких как описано ниже, или другими традиционными способами, известными специалистам в данной области.
Антитела могут быть объединены с терапевтической группировкой или с детектируемой (визуализирующей) группировкой с использованием методов, известных в данной области, таких как, например, химическое конъюгирование, ковалентные или нековалентные связи, или рекомбинантные методы, для создания конъюгатов или слитых белков, описанных более подробно ниже. Альтернативно, антитела и/или другие агенты могут быть объединены в раздельных композициях для одновременного или последовательного введения.
Токсичность и терапевтическая эффективность такого ингредиента могут быть определены стандартными фармацевтическими процедурами в клеточных культурах или на экспериментальных животных, например, для определения ЬП50 (доза, летальная для 50% популяции) и ЕО50 (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектами называется терапевтическим индексом, и его можно выразить в виде соотношения НО50/ЕО50. Поскольку могут быть использованы соединения, которые демонстрируют токсичные побочные эффекты, при конструировании системы доставки, которая нацеливает такие соединения на участок пораженной ткани, следует позаботиться о том, чтобы минимизировать возможное повреждение здоровых клеток и, таким образом, уменьшить побочные эффекты.
Данные, полученные из анализов клеточных культур и исследований на животных, могут быть использованы в определении диапазона дозировки для применения у людей. Дозировка таких соединений предпочтительно находится в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают ЕО50 с незначительной токсичностью или с отсутствием токсичности. Дозировка может варьироваться в пределах этого диапазона, в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для любого соединения, используемого в способе по изобретению, терапевтически эффективную дозу можно определить первоначально на основании анализов клеточных культур. В животных моделях может быть определена доза для достижения диапазона концентраций, циркулирующих в плазме крови, который включает 1С50 (т.е. концентрацию тестируемого соединения, которая вызывает полумаксимальное ингибирование), как определено в клеточной культуре. Уровни в плазме крови могут быть измерены, например, посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии. Такая информация может быть использована для более точного определения доз, полезных для людей.
Проангиогенная роль эндоглина была установлена на многих моделях, включая модели культивируемых эндотелиальных клеток и нокаутных мышей. Хорошо известно, что эндотелиальные и ассоциированные клетки экспрессируют эндоглин (СО 105), и в целом роль эндоглина в ангиогенезе, а также в развитии сердца также была подтверждена в многочисленных исследованиях, моделях культивирования и животных моделях (ΌιιΙΤ е! а1., РА8ЕВ 1., 17: 984-992 (2003); ВегпаЪеи е! а1., 1. Се11. Вюсйет., 102(6): 1375-1388 (2007); патент США № 7097836).
Таким образом, способы, которые ингибируют ангиогенез в пораженной болезнью ткани, ослабляют симптомы заболевания и, в зависимости от заболевания, могут вносить вклад в излечение данного заболевания. В одном из воплощений изобретение охватывает ингибирование ангиогенеза в ткани. Степень ангиогенеза в ткани и, следовательно, степень ингибирования, достигаемого способами по настоящему изобретению, можно оценить различными способами, такими как способы, описанные в данной заявке.
Уникальная специфичность антител, которые распознают (например, связывают) эпитоп на эндог- 55 025174 лине и ингибируют ангиогенез, обеспечивает диагностические и терапевтические применения в отношении заболеваний, характеризующихся ангиогенезом (неоваскуляризацией), дилатацией малых сосудов и/или чрезмерной васкуляризацией, таких, которые описаны в данной заявке. Гуманизированные антитела против эндоглина и их фрагменты можно вводить субъекту, такому как млекопитающее (например, человек), страдающему от медицинского расстройства, например различных форм глазных заболеваний, характеризующихся ангиогенезом/неоваскуляризацией (например, дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии), диабетической нефропатии, хронических воспалительных заболеваний (например, ШО), ревматоидного артрита, остеоартрита и различных форм рака (первичных опухолей и метастазов). Согласно данному изобретению предложен способ лечения субъекта, имеющего глазное заболевание, характеризующееся ангиогенезом, путем введения гуманизированного антитела или его фрагмента, описанных в данной заявке, которые связывают эндоглин и ингибируют ангиогенез. Кроме того, согласно данному изобретению предложен способ лечения субъекта, имеющего хроническое воспалительное заболевание, путем введения гуманизированного антитела или его фрагмента, описанных в данной заявке, которые связывают эндоглин и ингибируют ангиогенез. Примеры таких хронических воспалительных заболеваний включают, но не ограничиваются этим, болезнь Крона и язвенный колит. Кроме того, согласно данному изобретению предложен способ лечения субъекта, имеющего диабетическую нефропатию, путем введения гуманизированного антитела или его фрагмента, описанных в данной заявке. Согласно данному изобретению предложен способ лечения субъекта, имеющего ревматоидный артрит или остеоартрит, путем введения гуманизированного антитела или его фрагмента, описанных в данной заявке.
Понимая, что антитела против эндоглина могут быть эффективны для лечения ангиогенеза, в данной заявке предполагается, что субъекта также можно лечить одним или более чем одним дополнительным ингибитором ангиогенеза.
Термин ингибитор ангиогенеза используют в данной заявке для целей описания и формулы изобретения, для обозначения соединения или молекулы, включающих, но не ограничивающихся этим, пептиды, белки, ферменты, полисахариды, олигонуклеотиды, ДНК, РНК, рекомбинантные векторы и лекарственные средства, функция которых заключается в ингибировании ангиогенеза. Ингибиторы ангиогенеза известны в данной области, и все типы рассматриваются в данной заявке. Неограничивающие примеры соединений и молекул включают природные и синтетические биомолекулы, такие как паклитаксел, 0-(хлорацетил-карбамоил)-фумагиллол (ТНР-470 или АСМ 1470), тромбоспондин-1, тромбоспондин-2, ангиостатин, ингибитор ангиогенеза из хондроцитов человека (ЬСШАМР), ангиогенный ингибитор из хряща, фактор-4 тромбоцитов, дго-бета, интерферон-индуцибельный белок 10 (ГРЮ) человека, интерлейкин-12, Ко 318220, трициклодекан-9-ил-ксантат (Ό609), ирсогладин, 8,9-дигидрокси-7-метилбензо[Ь]-хинолизиния бромид (СРА 1734), медроксипрогестерон, комбинацию гепарина и кортизона, ингибиторы глюкозидазы, генистеин, талидомид, диамино-антрахинон, гербимицин, урсоловую кислоту и олеанолевую кислоту. Неограничивающие примеры антител включают антитела, направленные против таких молекул, как νΈΌΡ, рецептор УТСР или различные эпитопы эндоглина. Кроме того, известны и рассматриваются в данной заявке низкомолекулярные ингибиторы рецептора νΡ^Ρ. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора VΡСΡ включают бевацизумаб (АVА8ТIN®), ранибизумаб (ЬисепИк), афлиберцепт (VΡСΡ-Т^аρ), сунитиниб (8и1еп1), сорафениб (№хауаг), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб.
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, можно вводить в комбинации с ингибиторами рецепторов VΡСΡ для комбинированной терапии любого из связанных с ангиогенезом состояний или заболеваний, описанных в данной заявке. В одном неограничивающем воплощении ингибитором рецептора VΡСΡ является бевацизумаб. Типичные дозировки для бевацизумаба составляют примерно 7,5, примерно 10 или примерно 15 мг/кг, вводимые каждые 2 или 3 недели.
В одном неограничивающем воплощении ингибитором рецептора VΡСΡ является ранибизумаб. Типичные дозировки для глаз для ранибизумаба включают примерно 0,5 мг, вводимых интравитреально ежемесячно. В одном неограничивающем воплощении ингибитором рецептора VΡСΡ является афлиберцепт (VΡСΡ-Т^аρ). Типичные дозировки для VΡСΡ-Т^аρ включают от примерно 0,5 до примерно 10 мг/кг, вводимых каждые 2 или 3 недели. Типичные дозировки для глаз для VΡСΡ-Т^аρ включают от примерно 0,5 до примерно 2,0 мг, вводимых интравитреально ежемесячно или ежеквартально.
В другом неограничивающем воплощении ингибитором рецептора VΡСΡ является сунитиниб. Типичные режимы для сунитиниба включают примерно 50 мг, вводимых в течение 4 недель, затем в течение 2 недель без лекарственного средства. Схемы лечения можно повторять, основываясь на циклической или ациклической схеме.
В другом неограничивающем воплощении ингибитором рецептора VΡСΡ является сорафениб. Типичные дозировки для сорафениба включают примерно 400 мг, вводимых один раз в сутки.
В другом неограничивающем воплощении ингибитором рецептора VΡСΡ является акситиниб. Типичные дозировки для акситиниба включают примерно 3, примерно 5 или примерно 10 мг, вводимых два раза в сутки.
В другом неограничивающем воплощении ингибитором рецептора VΡСΡ является пегаптаниб. Типичные дозировки для пегаптаниба включают от примерно 0,3 до примерно 3 мг, вводимых интравитре- 56 025174 ально каждые 6 недель.
В еще одном другом неограничивающем воплощении ингибитором рецептора УЕОР является пазопаниб. Типичные дозировки для пазопаниба включают от примерно 200 до примерно 1000 мг, вводимых один раз в сутки.
Многочисленные комбинации этих ингибиторов рецептора УЕОР можно вводить вместе с антителами и антигенсвязывающими фрагментами, описанными в данной заявке. В одном из воплощений комбинации могут приводить к применению более низких доз для антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, ингибиторов рецептора УЕОР или их обоих. Такие изменения в дозировке могут быть результатом синергических эффектов комбинаций антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, с ингибиторами рецептора УЕОР.
Глазные состояния, вовлекающие ангиогенез.
Состояния дегенерации желтого пятна и диабетическая ретинопатия.
В одном из аспектов согласно настоящему изобретению предложен способ лечения диабетической ретинопатии, дегенерации желтого пятна, хориоидальной неоваскуляризации или неоваскулярной глаукомы у пациента путем введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества одной или более композиций, предложенных в данной заявке.
Эндоглин представляет собой рецептор, ассоциированный с ангиогенезом и внеклеточным матриксом. Дегенерация желтого пятна (АМЭ) представляет собой утрату фоторецепторов в центральной области сетчатки, называемой макулой, которые отвечают за высокую остроту зрения. Дегенерация макулы ассоциирована с аномальным отложением компонентов внеклеточного матрикса и другого дебриса в мембране между ретинальным пигментным эпителием и сосудистой оболочкой глаза. Такой дебрисоподобный материал называется друзами. Друзы наблюдаются при офтальмоскопическом исследовании глаза. Нормальные глаза могут не иметь друз, однако на периферии сетчатки друзы могут присутствовать в изобилии. Присутствие мягких друз в макуле, при отсутствии утраты макулярного зрения, считается ранней стадией АМЭ. Дегенерация желтого пятна характеризуется хориоидальной неоваскуляризацией развитием аномальных кровеносных сосудов под слоем ретинального пигментного эпителия (КРЕ) сетчатки. Эти сосуды прорываются через мембрану Бруха, нарушая ретинальный пигментный эпителий, кровоточат и в конечном итоге вызывают рубцевание макулярной зоны, что приводит к полной потере центрального зрения (образованию дисковидного рубца).
Хориоидальная неоваскуляризация (СNV) обычно наблюдается при дегенерации желтого пятна, в дополнение к другим глазным расстройствам, и ассоциирована с пролиферацией хориоидальных эндотелиальных клеток, сверхпродуцированием внеклеточного матрикса и образованием сосудистоволокнистой субретинальной мембраны. Пролиферация клеток ретинального пигментного эпителия и продуцирование ангиогенных факторов, по-видимому, оказывают эффект на хориоидальную неоваскуляризацию.
Диабетическая ретинопатия (ЭК) представляет собой глазное расстройство, характеризующееся чрезмерным ангиогенезом, который развивается при диабете вследствие утолщения капиллярных базальных мембран и отсутствия контакта между перицитами и эндотелиальными клетками капилляров. Утрата перицитов усиливает пропотевание капилляров и приводит к нарушению гематоретинального барьера. Диабетическая ретинопатия является результатом микрососудистых изменений сетчатки. Индуцированная гипергликемией гибель перицитов и утолщение базальной мембраны приводят к функциональной недостаточности стенок сосудов. Эти нарушения вызывают изменения в образовании гематоретинального барьера и также делают кровеносные сосуды сетчатки более проницаемыми. Малые кровеносные сосуды, такие как сосуды в глазу, особенно чувствительны к недостаточной регуляции содержания сахара в крови (содержания глюкозы в крови). Избыточное накопление глюкозы и/или фруктозы повреждает очень мелкие кровеносные сосуды в сетчатке. Макулярный отек также может развиться, когда жидкость и липиды вытекают из кровеносных сосудов на макулу. Под воздействием этих жидкостей макула набухает, в результате чего теряется четкость зрения. Это повреждение также приводит к недостатку кислорода в сетчатке.
По мере развития заболевания недостаток кислорода в сетчатке стимулирует ангиогенез во всей сетчатке и в прозрачном гелеобразном стекловидном теле глаза, которым заполнена внутренняя часть глаза. Без своевременного лечения эти новые кровеносные сосуды могут кровоточить, затуманивать зрение и разрушать сетчатку. Сосудисто-волокнистая пролиферация также может вызывать тракционную отслойку сетчатки. Новые кровеносные сосуды также могут прорастать в угол передней камеры глаза и вызывать неоваскулярную глаукому.
Пролиферативная витреоретинопатия ассоциирована с клеточной пролиферацией клеточных и фиброзных оболочек внутри стекловидных мембран и на поверхностях сетчатки. При этом глазном расстройстве часто встречается пролиферация и миграция клеток ретинального пигментного эпителия. Мембраны, ассоциированные с пролиферативной витреоретинопатией, содержат такие компоненты внеклеточного матрикса, как коллаген I, II и ГУ типов и фибронектин, и постепенно становятся фиброзными.
Возрастная дегенерация желтого пятна (АМЭ) и диабетическая ретинопатия представляют собой две основные причины слепоты в развитом мире. Недавнее разрешение на применение макромолекул
- 57 025174
Β^Ε^Ιδ®, ΑνΑδΊΓΗ® и ΜΑСυΟΕN® улучшило возможности лечения для пациентов с ΑΜΌ. ЬИСБЭТК® представляет собой РаЬ, а ΑνΑδΊΓΜ® представляет собой моноклональное антитело. Оба они связывают фактор роста сосудистого эндотелия (νΕΟΡ) и продемонстрировали наиболее впечатляющие на сегодняшний день результаты в отношении лечения ΑΜΌ; тем не менее, только меньшая часть подвергнутых лечению пациентов испытывает значительное улучшение остроты зрения. Антиангиогенная терапия, сфокусированная на мишени, отличной от νΕΟΡ, может преодолеть некоторые из ограничений, ассоциированных с агентами, которые направленно действуют на νΕΟΡ-путь.
Гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин и описаны в данной заявке, могут быть использованы для лечения или предупреждения дегенерации желтого пятна, СNV, диабетической ретинопатии или пролиферативной витреоретинопатии. В данной заявке описаны способы лечения или предупреждения дегенерации желтого пятна, СNV, диабетической ретинопатии или пролиферативной витреоретинопатии посредством введения антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке. Гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин и описаны в данной заявке, также могут вызывать сокращение объема кровеносных сосудов, ингибировать пролиферацию эндотелиальных клеток, ассоциированную с глазным заболеванием, устранять симптомы кровотечения, лечить замутненное (ранее: затуманенное) зрение, останавливать процесс потери зрения и/или предупреждать пропотевание кровеносных сосудов. Гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в лекарственных средствах для лечения дегенерации желтого пятна, СNV, диабетической ретинопатии или пролиферативной витреоретинопатии.
Кроме того, гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в комбинации с известными терапиями и/или соединениями для лечения дегенерации желтого пятна, СNV, диабетической ретинопатии или пролиферативной витреоретинопатии. Примеры таких соединений включают, но не ограничиваются этим, бевацизумаб (ΑνΑδТГЫ®), ранибизумаб (ЬиСВетК®), афлиберцепт (νΕΟΡ-Тгар), сунитиниб (δυΤΕNΤ®), сорафениб ^ΕΧΑνΑ®!-), акситиниб, пегаптаниб, пазопаниб или ΜΑСυΟВN®. Помимо способов введения, описанных в данной заявке, гуманизированные антитела против эндоглина и антигенсвязывающие фрагменты можно вводить через интравитреальные пути (в стекловидное тело). Неограничивающие примеры интравитреальных способов введения включают интравитреальную инъекцию и применение интравитреальных имплантатов.
Пациентов можно оценивать в отношении улучшения и восприимчивости к лечению. Лечение включает, но не ограничивается этим, уменьшение макулярного отека, уменьшение областей СNV и увеличение остроты зрения. Показатели симптомов известны в данной области и дополнительно описаны ниже в примерах.
Хронические воспалительные заболевания.
Любые из множества тканей или органов, состоящих из организованных тканей, могут поддерживать ангиогенез при болезненных состояниях, включая кожу, мышцу, кишечник, соединительную ткань, суставы, кости и тому подобную ткань, в которой кровеносные сосуды могут распространяться при ангиогенных стимулах. Так, в одном из воплощений ткань, подлежащая лечению, представляет собой воспаленную ткань, а ангиогенез, подлежащий ингибированию, представляет собой ангиогенез в воспаленной ткани, при этом в воспаленной ткани происходит неоваскуляризация.
Воспалительные заболевания кишечника.
Ангиогенез играет важную роль в воспалительном заболевании кишечника (ΙΒΌ). ΙΒΌ представляет собой обобщающий термин для ряда кишечных и интестинальных заболеваний или состояний, включающих болезнь Крона и язвенный колит. Болезнь Крона обычно характеризуется воспалением тонкого и толстого кишечника, в то время как язвенный колит обычно локализуется в толстой кишке. Аномальный или патологический ангиогенез играет центральную роль как при болезни Крона, так и при язвенном колите. Оба заболевания вызывают увеличение плотности капилляров и дисфункцию мелких сосудов, и такой ангиогенез связан во времени с тканевой патологией и воспалительными циклами, обнаруженными при обоих заболеваниях. Известно, что эндоглин экспрессируется в этих тканях и играет роль в разрегуляции ангиогенеза при ΙΒΌ (СЫб1о№ с1 а1., Αт. I. Ρΐινδίοΐ. ОаЧгоиНсЧ. Ыусг РЬу8ю1., 293:5-18 (2007)).
Гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин и описаны в данной заявке, могут быть использованы для лечения ΙΒΌ. Кроме того, гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин, могут быть использованы для лечения болезни Крона или язвенного колита. Гуманизированные антитела против эндоглина и антигенсвязывающие фрагменты также могут быть использованы в комбинации с хирургической операцией и/или терапиями, известными для ΙΒΌ, болезни Крона или язвенного колита. Примеры таких известных терапий включают, но не ограничиваются этим, аминосалицилаты (например, месаламин), кортикостероиды (например, будесонид, преднизон и т.д.), антибиотики (например, метронидазол и т.д.), иммуносупрессивные лекарственные средства (например, азатиоприн, 6-меркаптопурин, метотрексат, такроли- 58 025174 мус и циклоспорин и т.д.) и биологические лекарственные средства, такие как белки и антитела (например, инфликсимаб и т.д.).
Лечение ΙΒΌ можно оценить по уменьшению васкуляризации воспалительной ткани. Лечение также можно оценить по остановке развития, прекращению воспалительного процесса и/или заживлению язвенных поражений, которые характеризуют ΙΒΌ.
Диабетическая нефропатия и ишемия после трансплантаци почки.
Диабетическая нефропатия представляет собой главную причину осложнений и смертности при диабете как 1 типа, так и 2 типа. Она является основной причиной терминальной стадии почечной недостаточности во всем мире. Диабетическая нефропатия характеризуется повреждением гломерулярных капилляров вследствие повышенного синтеза проангиогенных факторов. Эти проангиогенные факторы вызывают повышенную пролиферацию эндотелиальных клеток и последующий ангиогенез, и эндоглин, как известно, активируется при хроническом почечном заболевании. Этот ангиогенез приводит к разрушению клубочков и в конечном счете к почечной недостаточности. (Ζеηΐ е1 а1., δет^ηа^8 ίη №ρΗτο1ο^, 27(2): 161-171 (2007); Ксу-СЪаидЬшу е1 а1., Ехр. ΝαρΒιοΙ., 5: 55-60 (1997)).
Аналогичные эффекты наблюдаются при трансплантаци почки, что приводит к ишемии и нарушению работы трансплантированного органа. Активация эндоглина приводит к активации ангиогенеза и воспалению в почке. И наоборот, исследования с использованием эндоглин-нулевых мышей демонстрируют значительное уменьшение почечного повреждения после трансплантации/ишемии и повышенную выживаемость органа. (ΌοΟκΠν е1 а1., №р1ю1. Όί;·ι1. Тгаи8р1ай., 21: 2106-2119 (2006)).
Гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин и описаны в данной заявке, могут быть использованы для лечения или предупреждения диабетической нефропатии, почечной недостаточности после трансплантации и/или ишемического повреждения почек после трансплантации.
В данной заявке описаны способы лечения или предупреждения диабетической нефропатии, почечной недостаточности после трансплантации и/или ишемического повреждения почек после трансплантации посредством введения антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке. Гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в лекарственных средствах для лечения диабетической нефропатии, почечной недостаточности после трансплантации и/или ишемического повреждения почек после трансплантации. Кроме того, гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в комбинации с известные терапиями и/или соединениями для лечения диабетической нефропатии, почечной недостаточности после трансплантации и/или ишемического повреждения почек после трансплантации.
Пациентов можно оценивать в отношении эффективности лечения, например, по улучшению функционирования почек.
Ревматоидный артрит и остеоартрит.
Ревматоидный артрит характеризуется чрезмерным ангиогенезом и в этом смысле хорошо понятен. Воспаление и разрушение, обнаруживаемые в синовиальных жидкостях, относятся непосредственно к повышенному ангиогенезу, обнаруживаемому в его окружении и в синовиальных тканях. В пораженных тканях пациентов с ревматоидным артритом присутствуют многочисленные проангиогенные факторы. (ΚοΟι ;·ιηύ ΌίκίΦΓ, Αιΐΐηίΐκ Ке8. & ТЬег., 9(δυρρ1. 2): δ3, 1-9 (2007).
Остеоартрит относится к группе хронических инвалидизирующих состояний, которые поражают синовиальные суставы. Ангиогенез и воспаление представляют собой важные процессы в патофизиологии данного заболевания, и они вносят вклад в поражение суставов с помощью различных механизмов, включая, но не ограничиваясь этим, стимуляцию продукции ММР (матриксные металлопротеазы) и эндохондральное окостенение. Кроме того, ангиогенез при остеоартрите индуцирует последующую иннервацию, в результате чего развивается петля обратной связи, где одно из них продолжает стимулировать другое. (ΒοηικΙ & \Уа18к КЬеитаФФду, 44: 7-16 (2005)).
Гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин и описаны в данной заявке, могут быть использованы для лечения или предупреждения ревматоидного артрита и остеоартрита. В данной заявке описаны способы лечения или предупреждения ревматоидного артрита и остеоартрита посредством введения антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке. Гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в лекарственных средствах для лечения ревматоидного артрита и остеоартрита.
Двумя общепринятыми суммарными показателями улучшения ΚΑ в испытаниях являются критерии Паулюса Ща^ик) и критерии Американской коллегии ревматологии (ЛСВ). Критерии Паулюса определяются как улучшение по 4-м из следующих показателей: число болезненных и припухших суставов, утренняя скованность, оценка пациентом активности заболевания, оценка врачом активности заболевания и показатель скорости оседания эритроцитов (ΕδΚ). Уровень улучшения выражают в виде процентного улучшения каждой из этих переменных, т.е. классификация по Паулюсу 20 указывает на пациента, отвечающего на лечение, который показал 20%-ное улучшение по 4 из 6 параметров.
- 59 025174
Ревматоидный артрит также можно оценить, используя оценку по шкале Американской коллегии ревматологии (АСК). Кратко, критерии классификации согласно АСК для определения клинической ремиссии при ревматоидном артрите оценивают по наличию 5 или более из следующих факторов, присутствующих по меньшей мере в течение двух месяцев подряд:
а) утренняя скованность менее 15 мин;
б) отсутствие усталости;
в) отсутствие боли в суставах;
г) отсутствие болезненности суставов или боли при движении;
д) отсутствие припухлости мягких тканей в суставах или влагалищах сухожилий и
е) Е§К (метод Вестергрена (№ек!ег§геп)) менее 30 мм/ч для женщин или 20 мм/ч для мужчин.
Могут быть исключения, и они включают клинические проявления активного васкулита, перикардита, плеврита или миозита и необъяснимое недавнее уменьшение массы или лихорадку, обусловленную ревматоидным артритом, что будет препятствовать установлению полной клинической ремиссии (Рша1к К§, е1. а1., ΛηΗΓίΙίκ КЬеит. 24: 1308, 1981). Кроме того, критерии классификации согласно АСК функционального статуса при ревматоидном артрите включают классификацию, основанную на следующих способностях пациента:
класс Ι: способен полностью осуществлять привычную деятельность в повседневной жизни (уход за собой, профессиональную и относящуюся к хобби);
класс ΙΙ: способен осуществлять обычный уход за собой и профессиональную деятельность, но ограничен в деятельности, относящейся к хобби;
класс ΙΙΙ: способен осуществлять обычный уход за собой, но ограничен в профессиональной и относящейся к хобби деятельности; и класс ГУ: ограниченная способность осуществлять обычный уход за собой, профессиональную и относящуюся к хобби деятельность.
Остеоартрит также можно оценить, используя количественную оценку по шкале АСК. Клинические критерии согласно классификации АСК для остеоартрита тазобедренного сустава оценивают, используя историю болезни, данные медицинского осмотра и лабораторных исследований: проводят оценку состояния пациента в отношении боли в тазобедренном суставе и одного из следующего:
(1) внутренняя ротация в тазобедренном суставе составляет менее 15°, а Е§К не более 45 мм/ч, или сгибание тазобедренного сустава не более 115°, если данных Е§К нет в наличии; или (2) внутренняя ротация в тазобедренном суставе составляет менее 15°, боль ассоциирована с внутренним тазобедренным суставом, утренняя скованность тазобедренного сустава в течение не более 60 мин и возраст пациента более 50 лет.
Используя историю болезни, данные медицинского осмотра, лабораторных и рентгенографических исследований, традиционным форматом считают боль в тазобедренном суставе и два из следующих показаний: Е§К менее 20 мм/ч, рентгенографически выявляемые остеофиты бедренной кости и/или вертлужной впадины либо рентгенографически выявляемое сужение суставной щели (в верхнем, аксиальном и/или медиальном отделе). Дерево классификации приведено ниже: боль в тазобедренном суставе в сочетании с (1) рентгенографически выявляемыми остеофитами бедренной кости и/или вертлужной впадины, или (2) Е§К не более 20 мм/ч и рентгенографически выявляемое сужение суставной щели в аксиальном отделе (АИтап, К., е1 а1., АгШгШк КЬеит., 34: 505, 1991).
Клинические критерии согласно классификации АСК для остеоартрита колена.
Клинические критерии согласно классификации АСК для остеоартрита колена оценивают с использованием истории болезни и данных медицинского осмотра, применяя следующие критерии: боль в колене в сочетании с тремя (3) из следующих признаков:
(1) возраст пациента составляет более 50 лет;
(2) длительность утренней скованности менее 30 мин;
(3) крепитация при активном движении;
(4) болезненность костей;
(5) костное разрастание и (6) непальпируемое тепло от синовиальной оболочки.
Используя историю болезни, данные медицинского осмотра, лабораторных и рентгенографических исследований, можно оценить боль в колене в сочетании с одной из следующих характеристик пациента:
(1) возраст пациента составляет больше 50 лет; (2) длительность утренней скованности менее 30 мин; и (3) крепитация при активном движении и остеофиты. Используя историю болезни, данные медицинского осмотра и лабораторных исследований: боль в колене можно оценить в сочетании с пятью (5) из следующих признаков:
(1) возраст пациента составляет больше 50 лет;
(2) длительность утренней скованности менее 30 мин;
(3) крепитация при активном движении;
(4) болезненность костей;
- 60 025174 (5) костное разрастание;
(6) непальпируемое тепло от синовиальной оболочки;
(7) Е§Р составляет менее 40 мм/ч;
(8) ревматоидный фактор (КР) менее 1:40 и (9) признаки остеоартрита в синовиальной жидкости (§Р); см., например, АИтап, К., е! а1., АййгШк Кйеит., 29: 1039, 1986.
Клинические критерии согласно классификации АСК для остеоартрита кисти рук можно оценить, как приведено ниже: боль, тупая боль или тугоподвижность в кисти в сочетании с тремя (3) из следующих признаков: (1) разрастание твердых тканей двух или более из следующих суставов (вторых и третьих дистальных межфаланговых, вторых и третьих проксимальных межфаланговых и первых пястнозапястных суставов обеих кистей); (2) разрастание твердых тканей двух или более дистальных межфаланговых суставов; (3) наличие меньше трех припухших МСР (пястно-фаланговых) суставов и (4) деформация по меньшей мере одного из суставов, перечисленных выше в (1).
Рак.
СО105 ассоциирован с опухолевым ангиогенезом и сильно активируется в эндотелии различных опухолевых тканей по сравнению с эндотелием в нормальных тканях. СО 105 активируется в широком диапазоне эндотелия опухолей, в том числе, например, при раке толстой кишки, молочной железы, головного мозга, легкого, предстательной железы, эндометрия, почки, печени, желудка, головы и шеи и шейки матки. Кроме того, известно, что наблюдается более сильная экспрессия СО105 в эндотелии опухоли, чем соответствующих нормальных тканях. (ΌιιΓΓ е! а1., РА§ЕВ 1., 17: 984-992 (2003); ВегпаЬеи е! а1., 1. Се11. Вюсйет., 102(6): 1375-1388 (2007); патент США № 7097836). Таким образом, ингибирование ангиогенеза гуманизированными антителами против эндоглина представляет собой способ лечения раковых опухолей. Гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают эндоглин и описаны в данной заявке, могут быть использованы для лечения раковых опухолей. Гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в изготовлении лекарственных средств для лечения раковых опухолей.
Термин опухоль используется в данной заявке для обозначения раковой ткани, экспрессирующей эндоглин (по сравнению с экспрессией нормальной тканью того же типа). Опухоли могут включать солидные опухоли и полусолидные опухоли. Неограничивающие примеры опухолей включают лейкозы человека, в том числе не-Т-клеточный (не-Т) острый лимфобластный лейкоз (АЬЬ), миеломоноцитарный лейкоз; и солидные и полусолидные опухоли человека, вместе с окружающей их сосудистой сетью, экспрессирующей эндоглин на уровнях от средних до высоких (по сравнению с экспрессией нормальной тканью того же типа), включая ангиосаркому, рак молочной железы, рак желудка, рак толстой кишки, лимфому Ходжкина, лимфому, мультиформную глиобластому (СВМ), рак легких, меланому, миелому, лимфому, остеосаркому, рак яичников, опухоль околоушной железы, фарингеальную карциному, рак предстательной железы, гепатоцеллюлярную карциному, карциному почки и карциному ректосигмоидного отдела.
Раковая ткань, подлежащая лечению, представляет собой, например, эндотелиальную ткань, экспрессирующую аномальный уровень эндоглина.
В отсутствие неоваскуляризации опухолевой ткани, эта опухолевая ткань не получает необходимых питательных веществ, рост ее замедляется, прекращается дополнительный рост, происходит регрессия, и она в конце становится некротической, что приводит к уничножению опухоли. Согласно данному изобретению предложены способы ингибирования неоваскуляризации опухоли путем ингибирования опухолевого ангиогенеза в соответствии со способами по настоящему изобретению. Аналогично, согласно данному изобретению предложены способы ингибирования опухолевого роста путем практического применения ингибирующих ангиогенез способов.
Данные способы также особенно эффективны против образования метастазов, поскольку их образование требует васкуляризации первичной опухоли, чтобы метастазирующие раковые клетки могли покинуть первичную опухоль, и их закрепление во вторичном месте требует васкуляризации для поддержания роста метастазов.
Следует понимать, что субъект, страдающий от рака/метастаза по изобретению может экспрессировать мутантный белок (опухолеассоциированный антиген) или мутантный ген и все еще не демонстрировать симптомы данного заболевания. В одном неограничивающем примере, где раком является рак толстой кишки (который ассоциируется с мутантным белком К-гак), пациент с мутантным белком К-гак в некоторых клетках толстой кишки представляет собой пациента, соответствующего данному изобретению, даже если этот пациент может все еще не иметь симптомов рака толстой кишки. Признаки или симптомы болезни представляют собой клинически идентифицированные проявления или признаки заболевания.
Под лечением пациента, страдающего от рака, подразумевают, что симптомы у пациента частично или полностью снимаются или остаются неизменными после лечения по изобретению. Пациент, который был подвергнут лечению, может демонстрировать частичное или полное облегчение симптомов и/или уменьшение опухолевой нагрузки. Подразумевают, что это охватывает профилактику, лечение и
- 61 025174 излечение. В одном неограничивающем примере лечат пациента, страдающего от высокометастатического рака (например, рака молочной железы), при этом дополнительные метастазы либо не возникают, либо количество их уменьшено по сравнению с пациентом, который не получает лечения. В другом неограничивающем примере лечат пациента, у которого солидная раковая опухоль либо уменьшается в размере, либо не увеличивается в размере по сравнению с пациентом, который не получает лечения. В еще одном другом неограничивающем примере количество раковых клеток у пациента, которого лечат, либо не увеличивается, либо уменьшается по сравнению с количеством раковых клеток у пациента, который не получает лечения. Улучшение также может быть определено, например, как пониженная клеточная пролиферация, сниженные количества клеток, повышенный апоптоз и/или увеличенная выживаемость пациента, которого лечат.
Кроме того, как использовано в данной заявке, лечение рака включает остановку развития, частичную или полную элиминацию злокачественного роста или опухоли. Лечение или частичная элиминация включает, например, кратное уменьшение роста или размера и/или объема опухоли, например, примерно в 2 раза, примерно в 3 раза, примерно в 4 раза, примерно в 5 раз, примерно в 10 раз, примерно в 20 раз, примерно в 50 раз или любое промежуточное кратное уменьшение. Аналогично, лечение или частичная элиминация может включать процентное уменьшение роста или размера и/или объема опухоли, составляющее примерно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или любое промежуточное процентное уменьшение.
Опухоль или рак, которые лечат в способах, описанных в данной заявке, включают, но не ограничиваются этим, рак легкого, гинекологические злокачественные опухоли, меланому, рак молочной железы, рак головного мозга (например, мультиформную глиобластому, ОВМ), рак поджелудочной железы, рак яичников, рак матки, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак почки, рак головы, рак печени (гепатоцеллюлярный рак), рак матки, рак шеи, рак почки (почечноклеточный рак), саркому, миелому и лимфому. В одном из воплощений опухоль, подлежащая лечению, представляет собой солидную или полусолидную опухоль. В другом воплощении опухоль, подлежащая лечению, представляет собой первичную опухоль. В другом воплощении опухоль, подлежащая лечению, представляет собой метастатическую опухоль. В одном из воплощений опухоль или рак, которые лечат, имеют эпителиальное происхождение. В другом воплощении рак, подлежащий лечению, представляет собой миелому. В другом воплощении рак, подлежащий лечению, представляет собой рак яичников. В другом воплощении рак, подлежащий лечению, представляет собой рак почки/почечноклеточный рак. В еще одном другом воплощении рак, подлежащий лечению, представляет собой гепатоцеллюлярный рак/рак печени.
Рак легкого.
В одном из аспектов согласно данному изобретению предложен способ лечения рака легкого. Наиболее распространенным типом рака легкого является немелкоклеточный рак легкого (№СЬС), который составляет приблизительно 80-85% случаев рака легкого и подразделяется на плоскоклеточные карциномы, аденокарциномы и крупноклеточные недифференцированные карциномы. Мелкоклеточный рак легкого составляет 15-20% случаев рака легкого.
Стадирование рака легкого представляет собой оценку степени распространения рака из его первоначального источника. Это является важным фактором, влияющим на прогноз и возможное лечение рака легкого. Немелкоклеточную карциному легкого классифицируют на стадии от (первая А; наиболее благоприятный прогноз) до IV (четвертая; наиболее неблагоприятный прогноз). Мелкоклеточную карциному легкого классифицируют как локализованную стадию, если она ограничивается одной половиной грудной клетки и находится в области одного радиотерапевтического поля; в противном случае, ее относят к распространенной стадии.
Стадии немелкоклеточного рака легкого можно определить, используя ЕИЗ (эндоскопическое ультразвуковое исследование) или сканирование посредством СТ (компьютерная томография) либо МК1 (магнитно-резонансная визуализация), или при хирургической операции для классификации степени заболевания согласно системе ΤΝΜ. Эти субъекты подвергаются процедуре стадирования, являющейся частью процесса анализа прогноза и лечения. А1СС (Американский объединенный комитет по изучению рака) рекомендует ΤΝΜ-стадирование с последующей классификацией по группам.
Первичная опухоль (Т): ТХ: первичную опухоль невозможно определить, или имеются злокачественные клетки в мокроте или бронхоальвеолярном лаваже, но это не видно при визуализации или бронхоскопии; Τίκ: карцинома ίη κίΐιι. Т0: нет признаков первичной опухоли. Т1: опухоль имеет размер менее 3 см в наибольшем измерении, окружена легким или висцеральной плеврой и без бронхоскопической инвазии в главный бронх. Т2: опухоль характеризуется любым из следующего: размер более 3 см в наибольшем измерении; распространение в главный бронх (но не ближе 2 см от киля (трахеи)) и обструктивный пневмонит (но не затрагивающий все легкое). Т3: опухоль характеризуется любым из следующего: инвазия на грудную стенку, диафрагму, средостенную плевру или париетальный перикард; распространение в главный бронх не доходя 2 см до киля, но не затрагивая киль; и обструктивный пневмонит всего легкого. Т4: опухоль характеризуется любым из следующего: инвазия в средостение, сердце, крупные сосуды, трахею, пищевод, позвоночник или киль; отдельные опухолевые узлы в той же доле; и злокачественный плевральный выпот. Лимфоузлы (Ν): ΝΧ: лимфоузлы определить невозможно; N0: лим- 62 025174 фоузлы не задеты; N1: метастаз в ипсилатеральные перибронхиальные или ипсилатеральные лимфоузлы корня (легкого); N2: метастаз в ипсилатеральные средостенные или трахеобронхиальные лимфоузлы; и N3: метастаз в любые из: ипсилатеральные надключичные лимфоузлы; ипсилатеральные лестничные лимфоузлы; и контралатеральные лимфоузлы. Отдаленный метастаз (М): М^: отдаленный метастаз определить невозможно; М0: отдаленного метастаза не выявлено и М1: отдаленный метастаз присутствует.
Рак матки/гинекологические злокачественные опухоли.
Рак матки может относиться к любому из нескольких различных типов рака, которые встречаются в матке, а именно саркомы матки (например, саркомы миометрия или мышечной оболочки матки представляют собой наиболее распространенные лейомиосаркомы), эндометриальный рак и рак шейки матки.
В другом аспекте согласно данному изобретению предложен способ лечения рака эндометрия. Эндометриальный рак представляет собой рак, который начинается в эндометрии, внутренней выстилке матки. Некоторые из примеров рака матки и эндометрия включают, но не ограничиваются этим, аденокарциномы, аденоакантомы, плоскоклеточные аденокарциномы, папиллярные серозные аденокарциномы, светлоклеточные аденокарциномы, саркомы матки, стромальные саркомы, злокачественные смешанные мезодермальные опухоли и лейомиосаркомы.
В другом аспекте, используя данный способ, лечат рак шейки матки, предпочтительно аденокарциному эпителия шейки матки. Существуют два основных типа этого рака: плоскоклеточная карцинома и аденокарциномы. Первая составляет примерно 80-90% всех случаев рака шейки матки и развивается там, где соединяются есЮсеглзх (область, примыкающая к влагалищу) и егЛосеглтх (слизистая оболочка канала шейки матки) (область, примыкающая к матке). Последние развиваются в продуцирующих слизь железистых клетках егЛосеглтх. Некоторые случаи рака шейки матки имеют характеристики обоих из них и называются плоскоклеточными аденокарциномами или смешанными карциномами.
Рак яичников.
В другом аспекте согласно данному изобретению предложен способ лечения рака яичников, включая эпителиальные опухоли яичников.
Рак яичников классифицируют в соответствии с гистологией опухоли, полученной в отчете о результатах гистологического исследования. Поверхностная эпителиально-стромальная опухоль, также известная как эпителиальная карцинома яичников, представляет собой наиболее типичный вид рака яичников. Она включает серозную опухоль, эндометриоидную опухоль и муцинозную цистаденокарциному. Опухоль стромы полового тяжа, включая эстроген-продуцирующую зернистоклеточную опухоль и вирилизирующую опухоль из клеток Сертоли-Лейдига или арренобластому, составляет 8% случаев рака яичников. Опухоль из зародышевых клеток составляет приблизительно 30% случаев опухолей яичников, но только 5% случаев рака яичников, поскольку большинство опухолей из зародышевых клеток представляют собой тератомы, а большинство тератом являются доброкачественными. Склонность к возникновению опухоли из зародышевых клеток наблюдается у молодых женщин и девочек. Прогноз зависит от конкретных результатов гистологии опухоли из зародышевых клеток, но в общем является благоприятным. Смешанные опухоли содержат элементы более чем одного из приведенных выше классов гистологии опухолей.
Рак яичников также может представлять собой вторичный рак, результат метастаза из первичного рака, находящегося в другом месте в организме. Распространенными видами первичного рака являются рак молочной железы и рак желудочно-кишечного тракта (в этом случае рак яичников представляет собой рак Крукенберга). Поверхностная эпителиально-стромальная опухоль может возникать в брюшине (выстилке брюшной полости), в этом случае рак яичников является вторичным по отношению к первичному перитонеальному раку, но лечение в основном является таким же, как и для первичной поверхностной эпителиально-стромальной опухоли, вовлекающей брюшину.
Стадирование рака яичников осуществляют с использованием системы классификации стадий заболевания РЮ0 (Международная федерация акушеров и гинекологов) и используют информацию, полученную после хирургической операции, которая может включать полную абдоминальную гистерэктомию, удаление обоих яичников и обеих маточных труб, промывания сальника и таза (брюшины) для цитологического исследования. Стадия согласно А1СС представляет собой ту же стадию, что и стадия согласно РЮ0.
Стадия I относится к раку яичников, ограниченному одним или двумя яичниками: ТА - поражен один яичник; капсула интактна; опухоли на поверхности яичника нет; злокачественных клеток в асцитах или водах после промывания брюшины нет; ΣΒ - поражены оба яичника; капсула интактна; опухоли на поверхности яичников нет; отрицательный ответ в промывных водах; и Ю - опухоль ограничена яичниками, плюс любое из следующего: капсула перфорирована, опухоль на поверхности яичников, положительный ответ в промывных водах.
Стадия II относится к распространению или внедрению в область таза: ПА - распространение или внедрение в матку или маточную трубу; отрицательный ответ в промывных водах; ПВ - распространение или внедрение в другие структуры таза; отрицательный ответ в промывных водах; и ПС распространение или внедрение в отделы таза с положительным ответом в водах после промывания брюшины.
- 63 025174
Стадия III относится к микроскопическим внедрениям в брюшину за пределами таза; или ограничивается тазом с распространением в тонкий кишечник или сальник: ША - микроскопические перитонеальные метастазы за пределами таза; ШВ - макроскопические перитонеальные метастазы за пределами таза размером менее 2 см; и ШС - перитонеальные метастазы за пределами таза размером более 2 см или метастазы в лимфоузлы.
Стадия ГУ относится к отдаленным метастазам в печень или за пределами брюшной полости.
Метастазы парааортального лимфоузла считаются регионарными лимфоузлами (стадия ШС).
В некоторых воплощениях способами, описанными в данной заявке, лечат рак яичников, выбранный из следующего: аденокарцинома яичника и аденокарцинома, которая мигрировала из яичника в брюшную полость.
Меланома.
Меланома представляет собой злокачественную опухоль меланоцитов, которая преимущественно обнаруживается в коже, а также в кишечнике и в глазу (увеальная меланома). Это один из редко встречающихся типов рака кожи, однако вызывает большинство смертей, связанных с раком кожи. Злокачественная меланома является тяжелой формой рака кожи, вызываемой неконтролируемым ростом пигментных клеток, называемых меланоцитами. Меланомы также включают, но не ограничиваются этим, хориоидальную меланому, злокачественные меланомы, меланомы кожи и внутриглазные меланомы.
Меланому можно разделить на следующие типы: злокачественное лентиго, меланома типа злокачественного лентиго, поверхностно распространяющаяся меланома, акральная лентигинозная меланома, меланома слизистых оболочек, узловая меланома, полипоидная меланома, десмопластическая меланома, амеланотическая меланома, меланома мягких тканей и увеальная меланома. Стадии меланомы приведены ниже.
Стадия 0 - меланома ш δίΐιι (уровень по Кларку I).
Стадия ЦП - инвазивная меланома: Т1а: первичная менее 1,00 мм, без изъязвления, уровень по Кларку П-Ш; Т1Ь: первичная менее 1,00 мм, с изъязвлением, или уровень по Кларку РУ-У; и Т2а: первичная 1,00-2,00 мм, без изъязвления.
Стадия II - высокий риск развития меланомы: Т2Ь: первичная 1,00-2,00 мм, с изъязвлением; Т3а: первичная 2,00-4,00 мм, без изъязвления; Т3Ь: первичная 2,00-4,00 мм, с изъязвлением; Т4а: первичная 4,00 мм или более, без изъязвления; и Т4Ь: первичная 4,00 мм или более, с изъязвлением.
Стадия III - регионарный метастаз: N1: один положительный лимфоузел; N2: 2-3 положительных лимфоузла или регионарный метастаз в кожу/транзитный метастаз; и Ν3: 4 положительных лимфоузла или лимфоузел и регионарные метастазы в кожу/транзитные метастазы.
Стадия - отдаленный метастаз: М1а: отдаленный метастаз в кожу, нормальный уровень ЬИН (лактатдегидрогеназа); М1Ь: метастаз в легкие, нормальный уровень ЬИН; и М1с: другой отдаленный метастаз или любой отдаленный метастаз с повышенным уровнем ЬИН.
В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат меланому.
Рак толстой кишки и колоректальный рак.
Колоректальный рак (также называемый раком толстой кишки или раком толстого кишечника) включает раковые опухоли в толстой кишке, прямой кишке (анусе) и аппендиксе. С учетом 655000 случаев смерти во всем мире за год, он является третьей наиболее распространенной формой рака и второй основной причиной смерти, связанной с раком, в западном мире. Полагают, что многие случаи колоректального рака возникают из аденоматозных полипов в толстой кишке. Эти грибоподобные опухоли обычно бывают доброкачественными, но некоторые из них со временем могут развиться в раковые.
В другом воплощении для классификации колоректального рака можно использовать классификацию Дьюкса, основанную на стадиях А-Ό. Стадия А относится к колоректальному раку, который ограничивается слизистой оболочкой (т. е. не проникает через стенку кишечника). Стадия В1 относится к прорастанию в мышечную оболочку, но не к прохождению сквозь нее (т.е. лимфоузлы не поражены); в то время как рак на стадии В2 уже проник через мышечную оболочку, но не прошел сквозь нее (т. е. лимфоузлы не поражены). Стадия С1 относится к раку, который прорастает в мышечную оболочку, но не проходит сквозь нее (т.е. лимфоузлы поражены); в то время как стадия С2 относится к раку, который прорастает в мышечную оболочку и проходит сквозь нее (т.е. лимфоузлы поражены). Стадия Ό относится к отдаленному метастатическому распространению. Кроме того, для стадирования колоректального рака можно использовать систему ТNМ согласно традиционным способам, известным в данной области.
Рак молочной железы.
Существует несколько типов рака молочной железы, которые можно лечить способами, описанными в данной заявке. Дольковая карцинома ш δίΐιι и протоковая карцинома ш δίΐιι представляют собой рак молочной железы, который развивается в дольках и протоках соответственно, но не распространяется в жировую ткань, окружающую молочную железу, или в другие части организма. Инфильтрирующие (или инвазивные) дольковая и протоковая карцинома представляют собой рак, который развивается в дольках и протоках соответственно и распространяется или в жировую ткань молочной железы и/или в другие части организма. В одном из аспектов согласно данному изобретению предложен способ лечения рака молочной железы, такого как протоковая карцинома в ткани протоков молочной железы, рак молочной
- 64 025174 железы, который представляет собой Нег2- и/или ЕК (рецептор эстрогена)-, и/или РК (рецептор прогестерона)-. Другие виды рака молочной железы, для которых лечение с помощью данных способов будет полезным, представляют собой медуллярные карциномы, коллоидные карциномы, тубулярные карциномы и воспалительный рак молочной железы.
В одном из воплощений стадирование рака молочной железы осуществляют согласно системе ΤNМ. Прогноз тесно связан с результатами стадирования, и стадирование также используется для распределения пациентов для лечений как в клинических испытаниях, так и в клинической практике.
Кратко, информация по стадированию приведена ниже. ТХ: первичная опухоль не может быть измерена. ТО: опухоль не определяется. Тй: карцинома ш 8Йи, без инвазии; Т1: опухоль не более 2 см; Т2: опухоль более 2 см, но не более 5 см; Т3: опухоль более 5 см; Т4: опухоль любого размера, прорастающая в грудную стенку или кожу, либо воспалительный рак молочной железы. NX: состояние ближних лимфоузлов невозможно оценить. N0: рак не распространен на регионарные лимфоузлы. N1: рак распространился на 1-3 подмышечных или один внутренний лимфоузел молочной железы. N2: рак распространился на 4-9 подмышечных лимфоузлов или многочисленные внутренние лимфоузлы молочной железы. N3: относится к одному из следующего: рак распространился на 10 или более подмышечных лимфоузлов, или рак распространился на подключичные лимфоузлы (ключица), или рак распространился на надключичные лимфоузлы, или рак вовлекает подмышечные лимфоузлы и распространился на внутренние лимфоузлы молочной железы, или рак вовлекает 4 или более подмышечных лимфоузлов, и обнаруживается маленький метастаз во внутренних лимфоузлах молочной железы по данным биопсии сторожевого лимфоузла. МХ: наличие отдаленного поражения (метастаза) невозможно определить. МО: отдаленное поражение отсутствует. М1: обнаружено поражение в отдаленных органах (не включая надключичного лимфоузла).
Рак поджелудочной железы.
В другом аспекте согласно данному изобретению предложен способ лечения рака поджелудочной железы, выбранного из следующего: эпителиоидной карциномы в ткани протока поджелудочной железы и аденокарциномы в протоке поджелудочной железы. Самым распространенным типом рака поджелудочной железы является аденокарцинома, встречающаяся в выстилке протока поджелудочной железы.
В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак поджелудочной железы.
Рак предстательной железы.
В одном из других аспектов согласно данному изобретению предложен способ лечения рака предстательной железы, выбранного из следующего: аденокарциномы или аденокарциномы, которая мигрировала в кость. Рак предстательной железы развивается в предстательной железе у мужчин, которая окружает первую часть уретры. В предстательной железе имеется несколько типов клеток, однако 99% опухолей составляют аденокарциномы, которые развиваются в железистых клетках, отвечающих за образование семенной жидкости.
Существуют две схемы, обычно используемые для стадирования рака предстательной железы. Самой распространенной является система ТТСМ, с помощью которой оценивают размер опухоли, степень вовлечения лимфоузлов и любой метастаз (отдаленное поражение). Так же, как и многие другие виды рака, их часто классифицируют согласно четырем стадиям (ЫУ). Другой схемой, используемой не так часто, является стадирование по Уитмору-Джуитту (\У1й1тоге-.1е\уеи).
Кратко, стадия I заболевания представляет собой рак, который обнаруживается случайно в небольшом участке образца, когда ткань предстательной железы была удалена по другим причинам, таким как доброкачественная гипертрофия предстательной железы, и клетки очень напоминают нормальные клетки, и железа пальпируется как нормальная при обследовании с помощью пальца руки. На стадии II уже вовлечена более значительная часть предстательной железы, и может пальпироваться уплотнение внутри железы. На стадии III опухоль распространена по всей капсуле предстательной железы, и уплотнение может пальпироваться на поверхности железы. На стадии РУ заболевания опухоль инвазирует ближние структуры или распространяется в лимфоузлы или другие органы. Определение стадии основано на клеточном содержимом и архитектуре ткани после биопсии (Глисон), что обеспечивает оценку деструктивного потенциала и окончательный прогноз заболевания.
В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак предстательной железы.
Рак головы и шеи.
Виды рака головы и шеи (например, рака полости рта, рака гортани, рака носоглотки, рака пищевода и т. д.) относятся к группе биологически сходных видов рака, происходящих из верхних отделов дыхательного и пищеварительного тракта, включая губу, ротовую полость (рот), носовую полость, околоносовые пазухи, глотку и гортань. Большинство видов рака головы и шеи представляют собой плоскоклеточные карциномы, происходящие из слизистой выстилки (эпителия) этих областей тела. Рак головы и шеи часто поражает лимфоузлы шеи, и зачастую это является первым (а иногда единственным) проявлением заболевания в момент диагностики. Рак головы и шеи строго ассоциирован с некоторыми факторами внешней среды и факторами риска, обусловленными образом жизни, включая табакокурение, упот- 65 025174 ребление спиртных напитков и некоторые штаммы передаваемого половым путем папилломавируса человека. Тактика лечения пациентов с диагнозом рака головы и шеи остается задачей высокой сложности. Используя соединения, описанные в данной заявке, можно лечить такие виды рака, как рак гортаноглотки, рак гортани, рак носоглотки, рак ротоглотки.
В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак головы или шеи.
Рак почек.
В другом аспекте согласно данному изобретению предложен способ лечения рака почек. Рак почек (также называемый почечноклеточным раком, почечноклеточной карциномой, почечной аденокарциномой и гипернефромой) представляет собой заболевание, при котором злокачественные клетки обнаруживаются в выстилке канальцев в почке. Почечноклеточная карцинома представляет собой наиболее распространенную форму рака почек, возникающего из проксимального почечного канальца. Она является самым распространенным типом рака почек у взрослых, отвечая приблизительно за 80% случаев.
В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак почек.
Рак печени.
В другом аспекте согласно данному изобретению предложен способ лечения первичного рака печени (рака, который начинается в печени). Первичный рак печени может встречаться как у взрослых, так и у детей. Рак печени характеризуется присутствием злокачественных опухолей печени - опухолей или новообразований на поверхности или внутри печени. Они могут быть обнаружены при медицинской визуализации (даже по другой причине, чем сам рак) или могут присутствовать у пациентов в виде абдоминальной опухоли, абдоминальной боли, желтухи или некоторой другой дисфункции печени. Существует несколько типов рака печени.
Гемангиомы: они представляют собой самый распространенный тип доброкачественной опухоли печени. Они возникают в кровеносных сосудах. Большинство этих опухолей не вызывают симптомов, необходимости в их лечении нет. Некоторые могут кровоточить и нуждаться в удалении, если их состояние характеризуется от умеренного до тяжелого.
Гепатоаденомы: эти доброкачественные эпителиальные опухоли печени развиваются в печени. В большинстве случаев они локализованы в правой доле печени и часто являются одиночными. Размер аденом варьируется в диапазоне от 1 до 30 см. Все симптомы, ассоциированные с гепатоаденомами, связаны с обширными поражениями, которые могут вызывать сильную абдоминальную боль.
Фокальная нодулярная гиперплазия: фокальная нодулярная гиперплазия (РNΗ) представляет собой вторую наиболее распространенную опухоль печени. Эта опухоль является результатом реакции гепатоцитов на артериовенозный врожденный порок. Этот процесс представляет собой процесс, при котором присутствуют все нормальные составные части печени, но конфигурация, в которой они представлены, является аномальной. Даже если эти состояния имеют место, печень все же считается функционирующей в пределах нормы.
Гепатоцеллюлярный рак: гепатоцеллюлярный рак (НСС) представляет собой наиболее распространенный рак печени. Он ассоциирован со злоупотреблением алкоголя и инфекцией гепатита В и особенно преобладает в Азии. Большинство случаев НСС детектируется в тот момент времени, когда лечение путем хирургического удаления является невозможным; системное лечение неоперабельного НСС связано с выживаемостью в течение менее одного года.
В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак печени.
Лимфома.
Лимфома представляет собой тип рака, который возникает в лимфоцитах иммунной системы. Они часто происходят из лимфоузлов, присутствуя в виде разрастания узла (опухоли). Лимфомы находятся в близком родстве с лимфоидными лейкозами, которые также происходят из лимфоцитов, но обычно вовлекают только циркулирующую кровь и костный мозг (где клетки крови образуются в процессе, названном гематопоэзом) и, как правило, не образуют опухоли. Существует много типов лимфом, и, в свою очередь, лимфомы представляют собой часть обширной группы заболеваний, называемых гематологическими новообразованиями. Некоторые формы лимфомы являются безболезненными (например, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома), совместимыми с долгой жизнью даже без лечения, тогда как другие формы являются агрессивными (например, лимфома Беркитта), вызывающими быстрое истощение и смерть.
Классификация ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения), опубликованная в 2001 г. и дополненная в 2008 г. (1Шρ://еη.\γ^к^ρеб^а.ο^8/\γ^к^/^утρ1ю1ηа - с^ΐе_ηοΐе-^8Ъη92-832-2411-6-2#с^ΐе_ηοΐе-^8Ъη92832-2411-6-2) представляет собой самую позднюю классификацию лимфом и основывается на основных положениях, заложенных в Пересмотренной Европейско-Американской классификации лимфом (КЕАЬ). Согласно этой системе лимфомы группируют по клеточному типу (т.е. нормальный клеточный тип, который имеет наибольшее сходство с опухолью) и определенным фенотипическим, молекулярным или цитогенетическим характеристикам. Существуют три большие группы: В-клеточные, Т-клеточные опухоли и опухоли природных клеток-киллеров. Также известны другие менее распространенные группы. Лимфома Ходжкина, хотя и рассматривается отдельно в рамках классификации ВОЗ (и предыдущих классификаций), в настоящее время признана как опухоль, хотя и заметно аномальная, лимфоцитов ли- 66 025174 нии зрелых В-клеток.
В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат лимфому.
Саркома.
Саркома представляет собой рак соединительной ткани (костной, хрящевой, жировой), приводящий к пролиферации мезодермы.
Это отличает ее от карцином, которые имеют эпителиальное происхождение (карциномы молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы и другие). Однако с развитием понимания тканевого происхождения, термин саркома иногда применяется к опухолям, которые, как теперь известно, возникают из эпителиальной ткани. Термин саркома мягких тканей используется для описания опухолей мягкой ткани, которая включает элементы, присутствующие в соединительной ткани, но не происходящие из нее (такие как мышцы и кровеносные сосуды).
Саркомы имеют несколько различных названий на основе типа ткани, из которой они возникают. Например, остеосаркома возникает из кости, хондросаркома возникает из хряща, а лейомиосаркома возникает из гладкой мышцы. Саркомы поражают людей всех возрастных групп, но являются очень редкими, составляя только 1% от всех случаев рака. ОКТ представляет собой наиболее распространенную форму саркомы, составляя приблизительно 3000-3500 случаев в год в Соединенных Штатах Америки. Это можно сравнить с раком молочной железы, число случаев которого в Северной Америке составляет приблизительно 200000 в год.
У людей в возрасте до 35 лет диагностируют приблизительно 50% случаев саркомы костей и 20% случаев саркомы мягких тканей. Некоторые саркомы, такие как лейомиосаркома, хондросаркома и стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта (О^Т), чаще встречаются у взрослых, чем у детей. У детей и молодежи намного чаще встречаются саркомы костей в самой высокой степенью злокачественности, включая саркому Юинга и остеосаркому.
В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат саркому.
Карцинома.
Карцинома представляет собой любой злокачественный рак, который возникает из эпителиальных клеток. Карциномы инвазируют окружающие ткани и органы и могут метастазировать или распространяться в лимфоузлы и другие места.
Карцинома, как и любое новообразование, классифицируется согласно своим гистопатологическим признакам. Аденокарцинома и плоскоклеточная карцинома, два общих описательных термина для опухолей, отражают тот факт, что эти клетки могут иметь признаки железистых или сквамозных клеток соответственно. Строго анапластические опухоли могут быть недифференцированными в той степени, что они не будут иметь различимых гистологических признаков (недифференцированная карцинома).
Иногда опухоль обозначают в соответствии с предполагаемым органом первичной (например, карцинома предстательной железы) или предполагаемой клеткой происхождения (гепатоцеллюлярная карцинома, почечноклеточная карцинома).
Аденокарцинома представляет собой злокачественную опухоль, возникающую из эпителиальных клеток железистой ткани и образующую железистые структуры. Она часто встречается в легком (составляя 30-40% всех случаев рака легких). Она обнаруживается по периферии, возникая из бокаловидных клеток или пневмоцитов II типа.
Плоскоклеточная карцинома возникает из плоскоклеточной метаплазии. На нее приходится 20-30% опухолей легкого, и обычно она происходит из корня легкого.
Мелкоклеточная карцинома почти наверняка является следствием курения. Она метастазирует рано и может секретировать АЭн (алкогольдегидрогеназу) (понижая концентрацию натрия у пациентов).
Крупноклеточные недифференцированные карциномы составляют 10-15% новообразований легкого. Они являются агрессивными и плохо распознаются вследствие недифференцированной природы. Наиболее часто они располагаются в центральной части легкого.
Синоназальная недифференцированная карцинома.
В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат карциному.
Миелома.
Множественная миелома (также известная как ММ, миелома, миелома плазматических клеток или как болезнь Калера (Ойо КаЫег)) представляет собой рак плазматических клеток. Эти иммунные клетки образуются в костном мозге, их много в лимфатической системе, и они продуцируют антитела. Миелома считается неизлечимой, однако используя стероиды, химиотерапию, талидомид и трансплантацию стволовых клеток, можно вызывать ремиссии. Миелома является частью большой группы заболеваний, называемых гематологическими злокачественными новообразованиями.
Множественная миелома развивается в В-лимфоцитах пост-герминального центра. У пациентов с множественной миеломой часто наблюдается хромосомная транслокация между геном тяжелой цепи иммуноглобулина (на четырнадцатой хромосоме, локус 14с|32) и онкогеном (часто 11 η13, 4р16.3, 6р21, 16с|23 и 20η11). Эта мутация приводит к разрегуляции данного онкогена, что, как полагают, является важным инициирующим событием в патогенезе миеломы. Результатом является пролиферация клона плазматических клеток и геномная нестабильность, что приводит к последующим мутациям и трансло- 67 025174 кациям. Нарушение в хромосоме 14 наблюдается примерно в 50% всех случаев миеломы. Делеция (частей) тринадцатой хромосомы также наблюдается примерно в 50% случаев.
Продукция цитокинов (особенно ^-6) плазматическими клетками вызывает значительные их локализованные повреждения, такие как остеопороз, и создает микроокружение, в котором разрастаются злокачественные клетки. Ангиогенез (привлечение новых кровеносных сосудов) увеличивается.
В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат миелому.
Рак желудка.
Рак желудка или желудочный рак может развиваться в любой части желудка и может распространяться по всему желудку и другим органам; в частности, пищеводу, легким и печени. Рак желудка является причиной примерно 800000 случаев смерти во всем мире за год.
Метастазы встречаются у 80-90% индивидуумов с раком желудка, с показателем шестимесячной выживаемости 65% у тех, у кого он диагностирован на ранних стадиях, и менее 15% у тех, у кого он диагностирован на поздних стадиях.
Рак желудка часто является бессимптомным или вызывает лишь неспецифические симптомы на ранних стадиях своего развития. Со временем эти симптомы проявляются, рак обычно метастазирует в другие части организма, и это является одной из главных причин для его неблагоприятного прогноза.
В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак желудка.
Рак щитовидной железы.
Новообразование щитовидной железы или рак щитовидной железы обычно относится к любому из четырех видов злокачественных опухолей щитовидной железы: папиллярному, фолликулярному, медуллярному или анапластическому. Папиллярные и фолликулярные опухоли являются наиболее распространенными. Они растут медленно и могут давать рецидивы, но обычно не являются фатальными для пациентов в возрасте до 45 лет. Медуллярные опухоли имеют хороший прогноз, если они ограничены щитовидной железой, и более неблагоприятный прогноз, если имеет место метастаз. Анапластические опухоли являются быстро растущими и плохо отвечают на терапию.
Рак щитовидной железы обычно обнаруживают у пациента с эутиреозом, а симптомы гипертиреоза или гипотиреоза могут быть ассоциированы с большой или метастатической хорошо дифференцированной опухолью. Особенно это касается узлов, когда они обнаруживаются у пациентов в возрасте до 20 лет. Появление доброкачественных узлов в этом возрасте менее вероятно, а значит потенциал злокачественности намного выше.
Типы рака щитовидной железы можно классифицировать в соответствии с их патологическими характеристиками. Можно выделить следующие варианты (распределение по различным подтипам может демонстрировать регионарную вариацию): папиллярный рак щитовидной железы (до 75% включительно); фолликулярный рак щитовидной железы (до 15% включительно); медуллярный рак щитовидной железы (до 8% включительно); и анапластический рак щитовидной железы (меньше 5%). Фолликулярный и папиллярный типы вместе можно классифицировать как дифференцированный рак щитовидной железы. Эти типы имеют более благоприятный прогноз, чем медуллярные и недифференцированные типы. Аденома щитовидной железы представляет собой доброкачественное новообразование щитовидной железы.
В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак щитовидной железы.
Рак мочевого пузыря.
Рак мочевого пузыря относится к любому из нескольких типов злокачественных опухолей мочевого пузыря. Это заболевание, при котором в мочевом пузыре бесконтрольно размножаются аномальные клетки. Мочевой пузырь представляет собой полый мышечный орган, в котором накапливается моча; он локализован в области малого таза. Самый распространенный тип рака мочевого пузыря начинается в клетках, выстилающих внутреннюю поверхность мочевого пузыря, и называется переходноклеточной карциномой (иногда уротелиальной карциномой).
В 90% случаев рак мочевого пузыря представляет собой переходно-клеточную карциному. Другие 10% относятся к плоскоклеточной карциноме, аденокарциноме, саркоме, мелкоклеточной карциноме и вторичным метастазам из видов рака, находящихся в других местах в организме.
Для классификации локализации, размера и распространенности рака в соответствии с системой стадирования ТИМ (опухоль, лимфоузел и метастаз) используют следующие стадии. Стадия 0: раковые клетки обнаружены только на внутренней выстилке мочевого пузыря. Стадия I: раковые клетки проникли в слой, лежащий за пределами внутренней выстилки мочевого пузыря, но не в мышцы мочевого пузыря. Стадия II: раковые клетки проникли в мышцы стенки мочевого пузыря, но не в жировую ткань, которая окружает мочевой пузырь. Стадия III: раковые клетки проникли в жировую ткань, окружающую мочевой пузырь, и в предстательную железу, влагалище или матку, но не в лимфоузлы или другие органы. Стадия БУ: раковые клетки проникли в лимфоузлы, таз или стенку брюшной полости и/или другие органы. Рецидив: после лечения рак рецидивирует в мочевой пузырь или в другой близлежащий орган.
Стадирование ТСС (переходно-клеточная карцинома) мочевого пузыря осуществляют согласно системе ТЫМ 1997 г.: Та - неинвазивная папиллярная опухоль; Т1 - инвазивная, но не дальше мышечного слоя мочевого пузыря; Т2 -инвазивная в мышечную оболочку; Т3 - инвазивная за пределы мышцы в жи- 68 025174 ровую ткань снаружи от мочевого пузыря и Т4 - инвазивная в окружающие структуры, такие как предстательная железа, матка или стенка малого таза.
В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак мочевого пузыря.
Согласно данному изобретению гуманизированные антитела против эндоглина или их фрагменты можно вводить отдельно или в комбинации с активными или неактивными агентами. В том случае, когда применяются комбинации, изобретение подразумевает одновременное или последовательное введение гуманизированных антител против эндоглина или антигенсвязывающих фрагментов и активных или неактивных агентов.
Соединения по настоящему изобретению можно, при необходимости, вводить в комбинации с одним или более чем одним терапевтическим лечением, включая, но не ограничиваясь этим, адриамицин, циклофосфамид, паклитаксел, пеметрексед, темозоломид, оксалиплатин, бевацизумаб, эрбитукс, вектибикс, сорафениб, сунитиниб, гефитиниб, эрлотиниб, 5-фторурацил (5-Ρϋ) иринотекан, топотекан, лейковорин, УЕТСАПЕ®, леналидомид, талидомид, кселода, таксотер и многие другие традиционные противораковые терапии, описанные в данной заявке. Следует понимать, что перечень схем лечения, приведенных ниже, представляет традиционные терапии, однако настоящее изобретение охватывает и другие известные схемы лечения, которые конкретно не описаны в данной заявке.
Как использовано в данном описании, облучение относится, например, к облучению микроволнами, ультрафиолетовому (УФ), инфракрасному (ИК) или альфа-, бета- или гамма-излучению. Облучение может быть сфокусированным или доставленным локально с использованием традиционных методов для нацеливания облучения на участок с одной или более опухолями без облучения всего организма.
В одном из воплощений рак представляет собой рак яичников, а одно или более чем одно терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, химиотерапию (например, доксорубицин, доксил, гемцитабин, рубитекан и химиотерапевтические средства на основе платины, такие как цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин), мелфалан, паклитаксел, ингибиторы топоизомеразы Ι, такие как топотекан и иринотекан, терапию на основе таксана, гормоны, лучевую терапию, гипотермию всего организма, производные изофлавонов, такие как феноксодиал, цитотоксичные макролиды, такие как эпотилоны, ингибиторы ангиогенеза, такие как бевацизумаб, ингибиторы сигнальной трансдукции, такие как трастузумаб, генную терапию, терапию с использованием КNА^ (РНК-интерференция), иммунотерапию, моноклональные антитела, ингибиторы фосфатидилинозитол-подобной киназы, такие как рапамицин, или любую их комбинацию. В одном воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и доксил. В другом воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и топотекан. В еще одном другом воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и ингибитор рецептора УЕСЕ. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕСЕ включают бевацизумаб (АУАетШ®), ранибизумаб (ЬиСЕЭТ1§®), афлиберцепт (УΕΟΡ-Τ^ар), сунитиниб (δϋΤΈΝΤ®), сорафениб (№/ХАУА®г), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб. Комбинированная терапия антителами и антигенсвязывающими фрагментами, описанными в данной заявке, вместе с терапиями рака яичников также может предусматривать более низкие дозы либо одной из них, либо обеих терапий, благодаря синергическому эффекту от совместного применения этих терапий.
В одном из воплощений рак представляет собой почечный рак/рак почки, а одно или более чем одно терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, химиотерапию, сунитиниб, сорафениб, пазопаниб, АУА§ΤIN®, интерферон-альфа или ГЬ-2. В одном воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и сорафениб. В одном воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и сунитиниб. В одном воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и АУА§ΤIN®. В еще одном другом воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и ингибитор рецептора ΥΈΟΡ. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора ΥΈΟΡ включают бевацизумаб (АУА§ΤIN®), ранибизумаб (ЬиСЕЭТК®), афлиберцепт (УΕΟΡ-Τ^ар), сунитиниб (δϋΤΈΝΤ®), сорафениб (ЖХАУАК®), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб. Комбинированная терапия антителами и антигенсвязывающими фрагментами, описанными в данной заявке, вместе с терапиями рака почек, также может предусматривать более низкие дозы либо одной из них, либо обеих терапий, благодаря синергическому эффекту от совместного применения этих терапий.
В одном из воплощений рак представляет собой миелому, а одно или более чем одно терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, лучевую терапию, УЕТСАПЕ®, леналидомид или талидомид. В одном воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и УЕЬСАЭЕ®. Дозировки для любой из этих терапий известны в данной области и соответственно могут быть адаптированы с учетом комбинированной терапии.
- 69 025174
В одном из воплощений рак представляет собой рак предстательной железы, а одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, лучевую терапию (например, терапию внешним пучком или брахитерапию), антигормональную терапию (подавление андрогенов), ингибиторы белка теплового шока 90 (Н8Р90), химиотерапию (например, доцетаксел, химиотерапию на основе платины, такую как цисплатин, карбоплатин, сатраплатин и оксалиплатин, таксан, эстрамустин), преднизон или преднизолон, понижающие уровень холестерина лекарственные средства, такие как статины, агонисты рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (ЬНРН), терапию с использованием РУАк целые опухолевые клетки, генетически модифицированные с целью секреции гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-С8Р) (также известного как ОУАХ) или любую их комбинацию. В еще одном другом воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и ингибитор рецептора УЕОР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕОР включают бевацизумаб (АУА§ТЮ®), ранибизумаб (ЬиСЕЫТ1§®), афлиберцепт (УЕОР-Тгар), сунитиниб (8иТЕЫТ®), сорафениб (УЕХАУАР®), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб.
В одном из воплощений рак представляет собой рак легкого, а одно или более чем одно терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, лучевую терапию (например, торакальную лучевую терапию, лучевую терапию с использованием заряженных частиц), урацил-тегафур и химиотерапию на основе платины (например, цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин и т. д.) и винорелбин, эрлотиниб (ТАРСЕУА®), гефитиниб (1РЕ§§А®), антитела к рецептору эпидермального фактора роста (например, цетуксимаб), антитела к фактору роста сосудистого эндотелия (например, бевацизумаб), низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ, прямые ингибиторы белков, вовлеченных в пролиферацию клеток рака легкого, ингибиторы Аигога-киназы, лазер-индуцированную термотерапию, терапию с использованием РЫА1, целые опухолевые клетки, генетически модифицированные с целью секреции гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-С8Р) (также известного как ОУАХ) или любую их комбинацию. Дополнительные терапевтические лечения включают таксол или пеметрексед. В одном воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и эрлотиниб. В одном воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и гефитиниб. В одном воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и пеметрексед. В еще одном другом воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и ингибитор рецептора УЕОР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕОР включают бевацизумаб (АУА§Т1Ы®), ранибизумаб (ЕиСЕЫТ1§®), афлиберцепт (УЕОР-Тгар), сунитиниб (ЗиТЕЫТ®), сорафениб (№ХАУА®г), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб. Дозировки для любой из этих терапий известны в данной области и соответственно могут быть адаптированы с учетом комбинированной терапии.
В одном из воплощений рак представляет собой рак молочной железы, а одно или более чем одно терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, моноклональные антитела (например, антитела к Нег-2, герцептин), адъювантную химиотерапию, такую как химиотерапия с использованием одного средства, или комбинированную химиотерапию (например, полихимиотерапии на основе антрациклина и таксана, таксол или мишень-специфичный трастузумаб с эндокринной регуляцией или без нее с применением или без применения РМРТ (радиационная терапия после мастэктомии), винорелбин), адриамицин, циклофосфамид, кселода, таксотер, селективные модуляторы рецепторов эстрогена, такие как тамоксифен и ралоксифен, аллостерические модуляторы рецепторов эстрогена, такие как трилостан, облучение (например, интерстициальную брахитерапию, устройство Маштокйе, 3-мерную конформную наружную лучевую терапию и интраоперационную лучевую терапию), ингибиторы ароматазы, которые подавляют общий синтез в организме (например, анастрозол, экземестан и летрозол), терапию с использованием РЫА1, внутривенные аналоги рапамицина, которые являются иммуносупрессивными и антипролиферативными, такие как темсиролимус (СС1779), или любую их комбинацию. Обзор способов получения трехмерных моделей культивирования ш νί!ΐΌ тканей рака молочной железы описан в Кгт е! а1., Вгеай Сапсег Рекеагсй Тгеактепк, 85(3): 281-91 (2004). Другие модели тестирования рака ш νί\Ό и ш νΐΐΐΌ известны и могут быть использованы для тестирования антител против эндоглина, описанных в данной заявке. В одном воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент, таксол и АУА§Т1Ы®. В одном воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и адриамицин. В одном воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и кселода. В одном воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и таксотер. В еще одном другом воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и ингибитор рецептора УЕОР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕОР включают бевацизумаб (АУА§ТЮ®), рани- 70 025174 бизумаб (ЬиСЕЭТК®), афлиберцепт (УЕСР-Тгар), сунитиниб (§иТЕЭТ®), сорафениб (№ХАУА®г), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб. Дозировки для любой из этих терапий известны в данной области и соответственно могут быть адаптированы с учетом комбинированной терапии.
В одном из воплощений рак представляет собой рак толстой кишки, а одно или более чем одно терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, лучевую терапию и химиотерапию (например, 5-фторурацил (5-РИ), левамизол, лейковорин или семустин (метил-ССНЫ [метил-1-(2хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевина])), N-[2-(диметиламино)этил]акридин-4-карбоксамид и другие родственные карбоксамидные противораковые лекарственные средства; ингибиторы топоизомеразы, не являющиеся ингибиторами топоизомеразы ΙΙ, иринотекан, липосомный топотекан, противораковые средства таксанового класса (например, паклитаксел или доцетаксел), соединение класса ксантенонуксусной кислоты (например, 5,6-диметилксантенон-4-уксусная кислота РМАА), ламинарин, сайтселективные аналоги циклического АМР (аденозинмонофосфат) (например, 8-хлораденозин-3',5'циклический фосфат), пираноиндольные ингибиторы Сох-2 (циклооксигеназа-2), карбазольные ингибиторы Сох-2, тетрагидрокарбазольные ингибиторы Сох-2, инденовые ингибиторы Сох-2, ограниченные ингибиторы К/АЮ (нестероидные противовоспалительные лекарственные средства) (такие как антраниловые кислоты, аспирин (5-ацетилсалициловая кислота), азодизал-натрий, карбогетероциклические кислоты, карпрофен, хлорамбуцил, диклофенак, фенбуфен, фенклофенак, фенопрофен, флуфенамовая кислота, флурбипрофен, флупрофен, фуросемид, ауротиомалат натрия, ибупрофен, индометацин, индопрофен, кетопрофен, лоназолак, локсопрофен, меклофенамовая кислота, мефенамовая кислота, мелфалан, напроксен, пеницилламин, фенилуксусные кислоты, пропионовые кислоты, салициловые кислоты, салазосульфапиридин, сулиндак, толметин, кУАЮ пиразолон бутазон пропазон, мелоксикам, оксикамы, пироксикам, фелден, пироксикам бета-циклодекстран, теноксикам, этодолак и оксапрозин), ингибитор НЕК-2/пеи, терапию с использованием КЛАк СМ-С§Р, моноклональные антитела (например, антитела против Нег-2/пеи, антитела против СЕА (карциноэмбриональный антиген), А33 (НВ 8779), 100-210 (НВ 11764) и 100-310 (НВ 11028)), эрбитукс, вектибикс, гормональную терапию, пиримидинамины, производные камптотецина (например, СРТ-11), фолиновую кислоту (РА), гемцитабин, Ага-С, химиотерапевтические средства на основе платины, такие как цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин, ингибитор сСМРспецифической фосфодиэстеразы или любую их комбинацию. В одном из воплощений комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и комбинацию 5-РИ, лейковорина и оксалиплатина (Р0ЬР0Х). В одном из воплощений комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и комбинацию 5-РИ, иринотекана и лейковорина (ГРЬ). В одном из воплощений комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и эрбитукс. В одном из воплощений комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и вектибикс. В еще одном другом воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и ингибитор рецептора УЕСР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕСР включают бевацизумаб (АУА§ТIN®), ранибизумаб (ЬиСЕЭТК®), афлиберцепт (УЕСР-Тгар), сунитиниб (§ИТЕЭТ®), сорафениб (МЕХАУАК®), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб. Дозировки для любой из этих терапий известны в данной области и соответственно могут быть адаптированы с учетом комбинированной терапии.
В одном из воплощений рак представляет собой рак поджелудочной железы, а одно или более чем одно терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, лучевую терапию (КТ), фторурацил (5-РИ) и КТ, системную терапию, стентирование, гемцитабин (СЕМ2АК®), гемцитабин и КТ, цетуксимаб, эрлотиниб (ТАКСЕУА®), химиолучевую терапию, бевацизумаб (АУА§ТIN®) или любую их комбинацию. В еще одном другом воплощении комбинация представляет собой гуманизированное антитело против эндоглина или его антигенсвязывающий фрагмент и ингибитор рецептора УЕСР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕСР включают бевацизумаб (АУА§ТIN®), ранибизумаб (ЬиСЕЭТК®), афлиберцепт (УЕСР-Тгар), сунитиниб (§иТЕЭТ®), сорафениб (№ХАУАК®), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб.
Пациентов оценивают в отношении симптомов для одной или более многочисленных временных точек, в том числе до, во время и после применения схем лечения. Лечение может приводить к улучшению состояния субъекта и может быть оценено путем определения присутствия одного или более из перечисленных ниже факторов: уменьшение размера опухоли, уменьшение клеточной пролиферации, уменьшение количества клеток, уменьшение неоваскуляризации, увеличение апоптоза или уменьшение выживаемости по меньшей мере части клеток, характеризующихся клеточным пролиферативным расстройством. Одно или более из этих событий в некоторых случаях может приводить к частичной или полной ликвидации рака и продлению выживаемости пациента. Альтернативно, для видов рака в терминальной стадии лечение может приводить к остановке развития заболевания, улучшенному качеству жизни и/или продлению выживаемости.
- 71 025174
IV. Функциональные анализы.
Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты могут быть протестированы в отношении разнообразных функций с использованием различных методов ш νίΙΐΌ и ш уйо, включая, но не ограничиваясь этим, методы, известные в данной области, и методы, описанные в данной заявке.
Методы анализа сигнального пути и функции ί'.Ό105.
СО 105 (эндоглин) является членом семейства рецепторов ТСР-β, который экспрессируется пролиферирующими эндотелиальными клетками, и для пролиферации эндотелиальных клеток необходимы нормальные уровни СЭ105. Экспрессия СЭ105 увеличивается при клеточной гипоксии благодаря продукции индуцируемого гипоксией фактора-1-α (ШР-1-α) и защищает гипоксические клетки от апоптоза. ί'.Ό105 действует на модулирование передачи сигнала в многокомпонентных комплексах рецепторных киназ суперсемейства ТСР-β, включающего рецепторы ТСР-β (ТСР-βΚ), активин-рецептор-подобные киназы (АЬК) и активиновые рецепторы. В отсутствие СЭ105 активация рецепторов ТСР-β приводит к фосфорилированию белков 8МАО, которые ингибируют рост эндотелиальных клеток. Однако активация ί'.Ό105 под действием ТСР-β модулирует фосфорилирование белков 8МАЭ. Конечным результатом является высвобождение ингибирующих рост эффектов активации рецептора ТСР-β на эндотелиальных клетках. Предотвращение активации СО 105 с помощью антитела против СЭ105 осуществляется синергически с ТСР-β для подавления роста эндотелиальных клеток. ТСР-β может стимулировать два различных опосредованных рецептором I типа/8тай сигнальных пути, вызывающих противоположные эффекты в эндотелиальных клетках. ТСР^/АЬК5-сигнальный путь (А) приводит к ингибированию клеточной пролиферации и миграции, тогда как ТСР^/АЬК1-путь (В) индуцирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. СЭ105, вспомогательный рецептор ТСР-β, экспрессируемый в высокой степени в процессе ангиогенеза, является существенным для АЬК1-сигнального пути. В отсутствие СЭ105 ТСР(1/Аи<5-сигнальный путь становится преобладающим и поддерживает эндотелий в состоянии покоя. Высокая экспрессия ί'.Ό105 стимулирует АЬК1-путь и опосредованно ингибирует АЬК5-сигнальный путь, обеспечивая таким образом активированное состояние ангиогенеза.
В одном неограничивающем воплощении антитела и антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в данной заявке, блокируют ангиогенез посредством блокирования ТСР^/АЬК1-сигнального пути. В другом воплощении антитела и антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в данной заявке, блокируют ангиогенез посредством предотвращения фосфорилирования и/или сигнального пути через 8тай1/5/8. СЭ105 участвует в стимуляции ангиогенеза путем передачи сигнала через ТСР^/АЬК1, что в свою очередь включает снижение и/или блокирование фосфорилирования белков 8тай2/3. В еще одном другом воплощении антитела и антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в данной заявке, блокируют ангиогенез посредством усиления фосфорилирования и/или сигнального пути через 8тай2/3. Способы и методы анализа блокирующего или ингибирующего действия антител и антигенсвязывающих фрагментов, предложенных в данном изобретении, на ТСР^/АЬК1-сигнальный путь и/или фосфорилирование 8тай1/5 включают, но не ограничиваются этим, известные молекулярные методы. В качестве примера, для определения ингибирующего и/или стимулирующего эффекта антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, на ТСР-()/Аи<5- или ТСР^/АЬК1-пути можно применять вестерн-блоттинг с использованием антител, специфичных к любому из этих белков в ТСР-()/АЫ<5- или ТСР^/АЬК1-путях. Аналогично, для анализа ингибирующего и/или стимулирующего эффекта антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, можно использовать детекцию мРНК или регуляцию мРНК для белков, вовлеченных в ТСР^/АЬК5- или ТСР^/АЬК1-пути. Дополнительные методы анализа передачи клеткой сигнала по ТСР^/АЬК5- или ТСР^/АЬК1-путям известны в данной области и рассматриваются в данном описании.
В одном неограничивающем воплощении антитела могут быть оценены в отношении ингибирования ангиогенеза и пролиферации эндотелиальных клеток. Связывание антител против эндоглина с НИνΈ£ не предотвращает последующего связывания ТСР-β с ΗυνΈα Таким образом, непосредственное подавление роста эндотелиальных клеток антителами против эндоглина представляет собой один из основополагающих механизмов, с помощью которых антиангиогенные эффекты и эффекты подавления опухолей наблюдаются ш νί\Ό. В другом воплощении антитела могут быть оценены в отношении блокирования ангиогенеза посредством предотвращения фосфорилирования и/или сигнального пути через 8тай1/5/8. СЭ105 участвует в стимуляции ангиогенеза путем передачи сигнала через ТСР^/АЬК1, что, в свою очередь, включает снижение и/или блокирование фосфорилирования белков 8тай2/3. В еще одном другом воплощении антитела могут быть оценены в отношении блокирования ангиогенеза посредством усиления фосфорилирования и/или сигнального пути через 8тай2/3.
Способы и методы анализа блокирующего или ингибирующего действия антител, предложенных в данном изобретении, на ТСР^/АЬК1-сигнальный путь и/или фосфорилирование 8тай1/5 включают, но не ограничиваются этим, известные молекулярные методы. В качестве примера, для определения ингибирующего и/или стимулирующего эффекта антител против эндоглина, описанных в данной заявке, на ТСР^/АЬК5- или ТСР^/АЬК1-пути можно применять вестерн-блоттинг с использованием антител,
- 72 025174 специфичных к любому из этих белков в ΤΟΕ-β/Αυ<5- или ТОР^/АЬК1-путях. Аналогично, для анализа ингибирующего и/или стимулирующего эффекта антител, описанных в данной заявке, можно использовать детекцию мРНК или регуляцию мРНК для белков, вовлеченных в ΤΟΕ-β/Λυ<5- или ΤΟΕ-β/Λυ<1пути. Дополнительные методы анализа передачи клеткой сигнала по ΤΟΕ-β/Λυ<5- или ΤΟΕ-β/Λυ<1путям известны в данной области и рассматриваются в данном описании.
Активность антител против эндоглина, описанных в данной заявке, можно оценить, используя принятые в данной области анализы, например, с использованием анализов связывания, таких как ЕЫЗА, конкурентные ЕЫЗА, поверхностный плазмонный резонанс, и влияния на клетки НИУЕС, как описано более подробно ниже.
Методы анализа клеточной адгезии.
Клеточную адгезию можно измерить методами, известными специалистам в данной области. Анализы были описаны ранее, например, в ЬеЬгш, е! а1., ί. С1ш. Нкек!., 1997, 99: 1390-1398. Кратко, клетки можно оставить прикрепляться к субстрату (т.е. компоненту ЕСМ), нанесенному на лунки. Неприкрепившиеся клетки удаляют промывкой и участки неспецифического связывания блокируют путем инкубации с БСА. Прикрепившиеся клетки окрашивают кристаллическим фиолетовым, и клеточную адгезию определяют количественно, измеряя оптическую плотность элюированного с прикрепившихся клеток кристаллического фиолетового при длине волны 600 нм.
Методы анализа клеточной миграции.
Анализы клеточной миграции были описаны в литературе, например, в ΒγοοΚκ, е! а1., ί. С1ш. Пкек!., 1997, 99: 1390-1398, и методы измерения клеточной миграции известны специалистам в данной области. В одном из методов измерения клеточной миграции, описанных в данной заявке, мембраны из камер Тгапк\уе11 для изучения миграции покрывают субстратом, камеры ТгаиктеП промывают и участки неспецифического связывания блокируют с помощью БСА. Опухолевые клетки из субконфлюэнтных культур собирают, промывают и ресуспендируют в буфере для анализа миграции в присутствии или в отсутствие антител для анализа. После того, как опухолевым клеткам позволяют мигрировать под мембраны Тгаик\уе11 с покрытием, клетки, оставшиеся над мембраной, удаляют, а клетки, которые мигрировали через нее, окрашивают кристаллическим фиолетовым. Затем клеточную миграцию определяют количественно путем прямого подсчета числа клеток в поле микроскопа.
ЗСГО/бестимусные мыши.
В одном из методов анализа опухолевого роста используют ЗСГО-мышей (с тяжелым комбинированным иммунодефицитом, от англ. ксусгс тотЬтеб ^ттииοбеί^с^еису), как приведено ниже: субконфлюэнтные клетки меланомы человека М21 собирают, промывают и ресуспендируют в стерильном РВЗ (20х106 на 1 мл). ЗСГО-мышам инъецируют подкожно по 100 мкл суспензии клеток меланомы человека М21 (2х106). Через трое суток после инъекции опухолевых клеток мышей либо не обрабатывают, либо обрабатывают внутривенно или внутрибрюшинно (например, 100 мкг/мышь) одной или более чем одной контрольной или тестируемой композицией. Мышей обрабатывают один раз в сутки в течение 24 суток. Размер опухоли измеряют циркулем и объем оценивают, используя формулу У = (Ьх^2)/2, где У представляет собой объем, Ь представляет собой длину и представляет собой ширину.
В одном из способов анализа опухолевого роста используют бестимусных мышей, как приведено ниже: опухолевые клетки МОА-МВ-435 (0,4х106 клеток/мышь) в 50 мкл РВЗ ортотопически имплантируют в жировую ткань молочной железы самкам бестимусных мышей (в возрасте пяти-шести недель). Когда опухоли достигают среднего объема приблизительно 50-80 мм3, мышей рандомизируют (по меньшей мере 10/группа) и начинают внутривенную или внутрибрюшинную обработку два раза в неделю, используя одно или более чем одно антитело в количестве 1 мкг (0,05 мг/кг) на одну дозу, 10 мкг (0,5 мг/кг), 100 мкг (5 мг/кг) или 200 мкг (10 мг/кг), либо 100 мкг контрольного антитела в 100 мкл РВЗ, либо 100 мкл разбавителя РВЗ; в некоторых исследованиях также можно оценивать необработанную группу. Размер опухоли измеряют циркулем и объем оценивают, используя формулу У = (Ьх^2)/2, где У представляет собой объем, Ь представляет собой длину и представляет собой ширину.
Модели сингенных мышей ВАЬВ/с.
Альтернативно, для оценки опухолевого роста и его ингибирования антителами, описанными в данной заявке, также могут быть использованы модели сингенных мышей ВАЬВ/с, как проиллюстрировано, например, в Ткице е! а1., Ы! I. Оитокду, 29: 1087-1094 (2006).
Химерные мыши.
В другом анализе измеряют ангиогенез с использованием мышиной модели химерная мышь: человек, и его обозначают как анализ с использованием химерных мышей. Данный анализ описан подробно другими авторами и дополнительно был описан в данной заявке для оценки ангиогенеза, неоваскуляризации и регрессии опухолевых тканей; см. Уаи, е! а1. (1993) ί. С1ш. кгек!., 91: 986-996.
Анализ с использованием химерных мышей является полезной моделью для анализа ангиогенеза ш νίνο, поскольку трансплантируемые кожные лоскуты гистологически очень напоминают нормальную человеческую кожу, и неоваскуляризация целой ткани происходит, когда настоящие человеческие кровеносные сосуды прорастают из пересаженной человеческой кожи в человеческую опухолевую ткань,
- 73 025174 расположенную на поверхности пересаженной человеческой кожи. Начало неоваскуляризации в человеческом трансплантате может быть продемонстрировано с использованием иммуногистохимического окрашивания новообразованной сосудистой сети на специфические маркеры эндотелиальных клеток человека.
Анализ с использованием химерных мышей демонстрирует регрессию неоваскуляризации на основе как количества, так и степени регрессии роста новых сосудов. Кроме того, он прост для мониторинга влияния на рост любой ткани, трансплантированной на пересаженную кожу, такой как опухолевая ткань. И наконец, данный анализ является полезным, поскольку существует внутренний контроль токсичности в данной аналитической системе. Химерную мышь подвергают воздействию какого-либо тестируемого реагента, и, следовательно, состояние здоровья мыши является показателем токсичности. Другие животные модели, описанные в данной заявке и известные в данной области, также могут быть использованы в способах, описанных в данной заявке.
Анализ с использованием глаза кролика.
Другим способом оценки ангиогенеза является модель глаза кролика ίη νίνο, и его обозначают как анализ с использованием глаза кролика. Анализ с использованием глаза кролика описан подробно другими авторами и был использован для оценки как ангиогенеза, так и неоваскуляризации в присутствии ингибиторов ангиогенеза, как проиллюстрировано в О'ЛтаЮ с1 а1. (1994) Ргос. №И. Αсаб. δοί. υδΑ, 91(9): 4082-4085.
Анализ с использованием глаза кролика является признанной моделью анализа ангиогенеза ίη νίνΌ, поскольку за процессом неоваскуляризации, проиллюстрированным прорастанием кровеносных сосудов кролика от края роговицы внутрь роговицы, легко наблюдать через прозрачную по своей природе роговицу глаза. Кроме того, и степень и уровень стимуляции или ингибирования неоваскуляризации или регрессии неоваскуляризации можно легко регистрировать во времени.
И наконец, кролика подвергают воздействию какого-либо тестируемого реагента, и, следовательно, состояние здоровья кролика является показателем токсичности тестируемого реагента.
Кратко, проводят анализы с использованием хорионаллантоисной мембраны (САМ) цыпленка и влияние на развитие сосудистой сети регистрируют через 48 ч после имплантации гранулы из 0,5%-ной карбоксиметилцеллюлозы, содержащей одно или более чем одно контрольное или тестируемое соединение. Неоваскуляризацию роговицы индуцируют имплантацией гранулы из поли(гидроксиэтилметакрилата) (гидрон; ПЦегГегоп δαοικοδ, №ν Βιυηδνκ^ N1), содержащей 650 нг сильнодействующего ангиогенного белка основного фактора роста фибробластов (ЬРОР), связанного с сукральфатом (сахароза, алюминий, сульфат; ΒιιΚΙι Μβάίΐβ^ СорепЬадеп). Добавление сукральфата к грануле защищает ЬРОР от деградации и обеспечивает его медленное высвобождение, вызывая таким образом устойчивый агрессивный ангиогенез, который более выражен, чем индуцированный только ЬРОР/гидроном. Высвобождение ЬРОР из гранул, содержащих сукральфат/гидрон, можно определять ίη νίΐΐΌ в течение до 4 суток включительно после образования таких гранул, по сравнению только с 1 сутками для гранул, содержащих лишь гидрон. Гранулы делают путем смешивания 110 мкл физиологического раствора, содержащего 12 мкг рекомбинантного ЬРОР (Такеба, 0§ака), с 40 мг сукральфата; эту суспензию добавляют к 80 мкл 12%-ного (мас./об.) гидрона в этаноле. Затем, используя пипетку, аликвоты (10 мкл) этой смеси наносят на тефлоновые штифты и оставляют высыхать, получая приблизительно 17 гранул.
Гранулу имплантируют в роговичные карманы каждого глаза подвергнутой анестезии самки новозеландского белого кролика в 2 мм от края с последующим однократным местным нанесением на поверхность роговицы эритромициновой мази. Гистологическое исследование в последующие дни демонстрирует прогрессирующее прорастание кровеносных сосудов в роговицу в направлении гранулы с наблюдаемыми очень редкими воспалительными клетками. Этот ангиогенный ответ не изменяется в результате серьезного подавления иммунитета при облучении всего организма, и гранулы с одним только сукральфатом не индуцируют ангиогенез. Новые сосуды главным образом индуцируются ЬРОР, а не воспалением. Животным один раз в сутки, начиная с 2-х суток после имплантации, вводят посредством желудочного зонда одно или более соединений, суспендированных в 0,5%-ной карбоксиметилцеллюлозе, или только разбавитель. Подвергаемые иммуносупрессивной терапии животные получают облучение всего организма (6 Гр) в течение 6 мин непосредственно перед имплантацией гранул. Эта доза облучения приводит к развитию заметной лейкоцитопении с более чем 80%-ным уменьшением числа лейкоцитов на 2-е сутки и более чем 90%-ным уменьшением на 3-й сутки, результаты, которые согласуются с предварительными сообщениями.
Животных обследуют один раз в двое суток, используя щелевую лампу с экраном, один и тот же специалист по роговице (Μ.δ.Κ). Зону неоваскуляризации роговицы определяют путем измерения с использованием окулярной сетки длины сосудов (Ь) от края и количества сегментов циферблата (С) от края. Для определения площади сегмента круговой зоны используют формулу: С/12х3,1416 [г2 - (г - Ь)2], где г=6 мм, измеренный радиус роговицы глаза кролика. Измеряют равномерно распределенную сплошную зону неоваскуляризации, прилегающую к грануле, таким образом можно оценить общее ингибирование неоваскуляризации.
- 74 025174
Анализы ангиогенеза на мышах с использованием вставки из матригеля.
Для подтверждения эффектов композиции на ангиогенез может быть применен анализ ангиогенеза на мышах с использованием вставки из матригеля. Различные ростовые факторы (например, Ι0Ρ-1 (инсулиноподобный ростовой фактор 1 типа), ЬРСР или νΕΟΡ) (250 нг) и гепарин (0,0025 единиц на 1 мл) смешивают с матригелем, характеризующимся пониженным содержанием ростовых факторов, как описывалось ранее (Μοηΐе8аηο, е1 а1., ί. Се11 Βίο1., 1983, 97: 1648-1652; δΐеίаи88οи, е1 а1., ί. Βίο1. СЬет., 2000, 276: 8135-8141). Композиции, описанные в данной заявке, или контрольные антитела могут быть включены в препараты матригеля для применения в одной или более группах дозировок у животных. В контрольных экспериментах матригель готовят в отсутствие ростовых факторов. Мышам подкожно инъецируют 0,5 мл препарата матригеля и оставляют инкубироваться в течение одной недели. После периода инкубации мышей умерщвляют и полимеризованные вставки из матригеля извлекают хирургическим путем. Ангиогенез внутри вставок из матригеля количественно определяют, используя два общепризнанных метода, включая иммуногистохимический анализ и определение содержания гемоглобина (Риг81еиЬегдег, е1 а1., Ьаисе1, 2002, 3: 298-302; νο^τί, е1 а1., Саисег Се11, 2002, 2(6): 473-83 и δυ, е1 а1., Саисет Ке8., 2003, 63: 3585-3592). Для иммуногистохимического анализа вставки из матригеля погружают в ОСТ, быстро замораживают и готовят срезы толщиной 4 мкм. Замороженные срезы фиксируют в смеси метанол/ацетон (1:1). Замороженные срезы окрашивают поликлональным антителом против СЭ31. Ангиогенез количественно определяют по плотности капилляров, подсчитанной в 20 полях высокомощного (200х) микроскопа.
Содержание гемоглобина можно определить количественно, как описано ранее (δсЬиаρе^, е1 а1., ί. Се11 ΡЬу8^ο1., 1993, 256: 235-246; Μοиίе8аиο, е1 а1., ί. Се11 Βίο1., 1983, 97: 1648-1652; δίβίίΐηδίϊοη, е1 а1., ί. Βίο1. СЬет., 2000, 276: 8135-8141 и 0ΐ§1ΐ, е1 а1., ί. ^тимЕ 1986, 100: 1154-1164). Имплантаты матригеля быстро замораживают на сухом льду и лиофилизируют в течение ночи. Высушенные имплантаты ресуспендируют в 0,4 мл 1,0%-ного сапонина (Са1ЬюсЬет) в течение 1 ч и разрушают энергичным пипетированием. Препараты центрифугируют при 14000хд в течение 15 мин для удаления всех твердых частиц. Концентрацию гемоглобина в супернатанте затем определяют непосредственно путем измерения поглощения при 405 нм и сравнивают со стандартной концентрацией очищенного гемоглобина.
Методы анализа опухолевого роста.
Опухолевый рост можно проанализировать методами, известными специалистам в данной области, например, используя модель δСI^-мышей, модель бестимусных мышей и мышей ΒΑΕΒ/с с сингенными опухолями. Модели δСI^-мышей для анализа опухолевого роста осуществляют, как приведено ниже: субконфлюэнтные клетки меланомы человека М21 (или любой желаемый тип опухолевых клеток) собирают, промывают и ресуспендируют в стерильном ΡΒδ (20х106 на 1 мл). δΟΌ-λίΕ^ηι инъецируют подкожно по 100 мкл суспензии клеток меланомы человека М21 (2х106). Через трое суток после инъекции опухолевых клеток мышей либо не обрабатывают, либо обрабатывают внутривенно или внутрибрюшинно антагонистом в желаемых диапазонах доз. Мышей обрабатывают один раз в сутки в течение 24 суток. Размер опухоли измеряют циркулем, и объем оценивают, используя формулу ν = (Ьх^2)/2, где ν представляет собой объем, Ь представляет собой длину и представляет собой ширину.
Альтернативно, для оценки опухолевого роста и его ингибирования гуманизированными антителами или антигенсвязывающими фрагментами, описанными в данной заявке, также могут быть использованы модели бестимусных мышей, модели δСI^-мышей и/или модели сингенных мышей ΒΑΣΒ/с (Т8ице е1 а1., Ιηί. ί. Ο^οΦ^, 29: 1087-1094 (2006).
Методы анализа клеточной пролиферации.
Клеточную пролиферацию можно анализировать методами, известными специалистам в данной области. Как описано в данной заявке, субконфлюэнтные эндотелиальные клетки человека (ΗυνΈΟ) могут быть ресуспендированы в буфере для пролиферации, содержащем низкое количество (5,0%) сыворотки в присутствии или в отсутствие СМ (25 мкл) из клеток ΕСV или ΕΟνΣ, и эндотелиальные клетки оставляют пролиферировать в течение 24 ч. Пролиферацию можно определить количественно путем измерения активности митохондриальной дегидрогеназы с использованием имеющегося в продаже набора для анализа ^8Т-1 (Οκιηχοη). Кроме того, как описано в данной заявке, пролиферацию можно определить количественно путем измерения включения 3Н с использованием стандартных методов ^Ье е1 а1., Ιηί ί. Сагоет, 108: 251-257 (2004)).
Другие способы оценки клеточной пролиферации известны в данной области и рассматриваются в данном описании. Другие неограничивающие примеры более подробно описаны в Примерах.
Способы индукции СЭС, ΑΌΕΕ и опсонизации.
На усиление природного иммунного ответа организма на трансформированные клетки были направлены различные терапии. Традиционные эффекторные способы включают комплемент-зависимый цитолизис (СОС), антителозависимую клеточную цитотоксичность (ΑΌΕΕ) и фагоцитоз (клиренс посредством ретикулоэндотелиальной системы после того, как клетка-мишень покрывается иммуноглобулином). Известно, что в присутствии антител некоторые эффекторные клетки, такие как лимфоидные клетки, имеющие связанные с поверхностью рецепторы для Рс-областей антител, опосредуют реакцию
- 75 025174 антителозависимой клеточной цитотоксичности (АОСС) против клеток-мишеней. Посредством ЛЭСС эти эффекторные клетки демонстрируют цитолитическую активность против таких клеток-мишеней.
Были продемонстрированы два типа реакций АОСС ίη νίΙΐΌ. В классических реакциях АОСС эффекторные клетки прикрепляются к покрытым антителами клеткам-мишеням и после этого вызывают цитолизис клеток-мишеней (А.Н. Огеейегд е1 а1., СИагасТепкТюк 0Г ТИе ЕГГесТог Се11к МейаТшд Су1о1ох1с11у Адатк! АйЬойу-СоаТей Тагде! Се11к, Iттиηо1оду, 21, р. 719 (1975)). Такое прикрепление эффекторной клетки к клетке-мишени является результатом взаимодействия Рс-области антитела, покрывающего клетку-мишень, и Рс-рецептора эффекторной клетки. Одним из недостатков этого типа реакции АЭСС является то, что ее протекание может быть затруднено циркулирующими в крови комплексами антиген-антитело, часто ассоциированными с различными заболеваниями, которые конкурируют со связанным с клеткой-мишенью антителом за Рс-рецепторы на эффекторных клетках (1С.М. Мас^еииаη, Сотреι^ι^ои Рог КесерТогк Рог ^ти^д^Ый 0η СуТоТохю ЬутрИосуТек, С1ш. Ехр. ^тимЕ, 10, р. 275 (1972)). В связи с таким недостатком классической АЭСС был предложен второй тип реакции АЭСС антитело-направленная АЭСС. При антитело-направленной АОСС специфичное к мишени антитело первоначально прикрепляется к эффекторной клетке, и полученный комплекс затем направляется, при посредничестве антитела, к его специфичному антигену на поверхности клетки-мишени. Предпочтительно, когда на антитело-направленную АЭСС может не влиять присутствие комплексов антигенантитело, циркулирующих в системе хозяина. Взаимодействие между антителами и эффекторными клетками путем присоединения Рс-области к Рс-рецептору в норме является слабым. И в некоторых случаях антитела не остаются ассоциированными с эффекторными клетками в течение периода времени, достаточного для того, чтобы обеспечить лизис клеток-мишеней. В свете этой возможной проблемы, антитела были присоединены к эффекторным клеткам с использованием предварительной обработки полиэтиленгликолем и смесью фталатных масел (!Р. йиек ай Э.М. 8еда1, АηТ^Ьоάу-^ереηάеηТ Се11 Мейа1ей СуТо1у818 (АОСС) \УЙ1 АйЬойу-СоаТей ЕГГесТогк: №ν Мейойк Рог Еий-шсйд АйЬойу Виййд Апй СуТо1ук1к, I Iттиηо1., 125, р. 926-33 (1980)). Однако применимость этого способа для обработок ίη угуо может быть снижена из-за токсичных эффектов, которые могут оказывать на организм любые остатки полиэтиленгликоля и фталатного масла на комплексе антитело-эффекторная клетка.
Альтернативно, был предложен способ усиления антитело-направленной АЭСС посредством адъювантной химиотерапии цитотоксичными лекарственными средствами (ГК. Маскау еТ а1., ЕГГесТ 0η №1ига1 КШег Ай АηТ^Ьоάу-^ерейеηТ Се11и1аг СуТоТохйТу 0Г Ай^уай СуТоТохю СИетоТИегару йсИйтд Ме1рИакт й ВгеакТ Саисе^, Саг1сег Iттиηо1. IттиηоТЬе^., 16, р. 98-100 (1983)). Анализы тестирования АЭСС хорошо известны в данной области, такие как, например, описанные в патенте США № 5756097.
Соответственно согласно настоящему изобретению предложены антитела (например, гуманизированные антитела против эндоглина), которые могут связываться с клетками, играющими роль в неоваскуляризации или ангиогенезе, или которые могут усиливать фагоцитоз и киллинг клеток и поэтому улучшать защиту ίη νί\Ό. Также предложены другие антитела и их функциональные фрагменты, которые являются иммунореактивными, специфически связываются или предпочтительно связываются с сайтом связывания или эпитопом, с которым такие антитела могут связываться, и которые оказывают такой же эффект.
Антитела также могут быть опсоническими или демонстрировать опсоническую активность в отношении клеток, играющих роль в неоваскуляризации или ангиогенезе (например, эндотелиальных клеток). Как понятно специалистам в данной области, опсоническая активность относится к способности опсонина (обычно либо антитела, либо сывороточного фактора С3Ь) связываться с антигеном или клеточным рецептором для стимуляции прикрепления антигена или клеточного рецептора к фагоциту и посредством этого усиления фагоцитоза. Некоторые клетки становятся чрезвычайно привлекательными для фагоцитов, таких как нейтрофилы и макрофаги, когда они покрыты опсоническим антителом, и скорость их клиренса из кровотока поразительным образом увеличивается. Опсоническую активность можно измерить любым традиционным методом, описанным, например, в патенте США № 6610293.
В другом неограничивающем воплощении пациент, имеющий неоваскулярное расстройство или ангиогенез-зависимое расстройство, выделяет (кИейк) антигены/пептиды (например, эндоглин), имеющие отношение к ангиогенезу. Эти антигены/пептиды могут представлять собой опухолеассоциированные антигены. Таким пациентам можно системно вводить антитело к антигену/пептиду (например, эндоглину) и инициировать у них любой из путей, описанных в данной заявке, чтобы индуцировать СЭС, АЭСС, опсонизацию или любую другую форму клеточно-опосредованного киллинга.
Примеры
Данное изобретение может быть лучше понято со ссылкой на следующие далее неограничивающие примеры, которые приведены в качестве типичных воплощений применения. Следующие далее примеры представлены для того, чтобы более полно проиллюстрировать воплощения изобретения и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие широкий объем данной заявки. Хотя некоторые воплощения настоящего изобретения показаны и описаны в данном описании, очевидно, что такие воплощения приведены только в качестве примера. Специалистами в данной области могут быть сделаны многочисленные вариации, изменения и замены без отклонения от изобретения; следует понимать, что
- 76 025174 при практическом воплощении способов, описанных в данной заявке, можно использовать различные альтернативы воплощений, изложенных в данном описании изобретения.
Пример 1. Создание и связывание гуманизированных и гуманизированных/деиммунизированных антител против ί'.Ό105.
Конструирование, экспрессия и очистка антител.
Все гены гуманизированных и гуманизированных/деиммунизированных УН- и УК-областей синтезировали, используя серию перекрывающихся олигонуклеотидов, которые отжигали, лигировали и амплифицировали с применением ПЦР, получая полноразмерные синтетические У-области. Собранные варианты затем клонировали непосредственно в экспрессирующую векторную систему рАКГ от АпШоре Ый. для тяжелых цепей и легких каппа-цепей ЦСЕ
Всеми комбинациями гуманизированных тяжелых и легких цепей (т.е. в общей сложности для образования 4 пар) и комбинациями гуманизированных/деиммунизированных тяжелых и легких цепей (т.е. в общей сложности для образования 24 пар) стабильно трансфицировали клетки №0 посредством электропорации и проводили отбор, используя 200 нМ метотрексат (№ по каталогу Б1дта М8407). Устойчивые к метотрексату колонии для каждой конструкции тестировали в отношении уровней экспрессии ЦС, используя ^О1 -ЕЫБА. Отбирали наилучшие экспрессирующие линии и замораживали в жидком азоте. Для всех вариантов была достигнута успешная трансфекция и селекция клонов, и уровни экспрессии гуманизированных и гуманизированных/деиммунизированных вариантов антител в статических культурах в состоянии насыщения показаны в табл. 1.
Таким образом были очищены двадцать четыре варианта ^О1 из супернатантов культуры клеток N80 на колонке с Рго1еш А сефарозой (№ по каталогу ОЕ Неаййсаге 110034-93) и проведено количественное определение по 0Ό 280 нм с использованием коэффициента экстинции ЕС(0>1%) = 1,62, рассчитанного на основании предсказанной аминокислотной последовательности. Приблизительно 500 мкг каждого варианта антитела очищали, и основные варианты анализировали с использованием ПААГ-ДСН (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) в восстанавливающих условиях. Кратко, окрашенный Кумасси голубым ПААГ-ДСН гель в востанавливающих условиях для основных вариантов антител. 1 мкг каждого образца наносили на 4-12%-ный бис-трис-гель NиРаде (№ по каталогу Ыуйгодеп №0322В0Х) и анализировали при 200 В в течение 30 мин. В качестве маркера использовали Вю-Кай Ргешзюп Р1из (№ по каталогу 161-073). Наблюдали полосы, соответствующие предсказанным размерам тяжелой и легкой цепей, без выраженных примесей на любой дорожке (данные не показаны).
Методология ЕЫБА.
Для анализа связывания гуманизированных и гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина с эндоглином использовали ЕЫБА. Кратко, ЕЫБА проводили согласно приведенным ниже стадиям.
1. Планшет №тс Мах18огр покрывают МАВ9811-01 (поликлональное антитело против эндоглина) в концентрации 1500 нг/мл в РВБ, 100 мкл/лунка. Планшет герметично закрывают и инкубируют в течение ночи (16-24 ч) при 4°С.
2. Промывают планшет 2Х 200 мкл РВБ (без Ыееп).
3. Добавляют 200 мкл/лунка блокирующего раствора с БСА (1% БСА) и инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре.
4. Промывают планшет 3Х РВБ, содержащим Тетееп (РВБ-Т), используя устройство для промывания планшетов ВюТек.
5. Добавляют 100 мкл/лунка СЭ105 (№ по каталогу Р&Э Буйепъ 1097-ЕЦ) в концентрации 100 нг/мл в РВБ-Т с 0,1% БСА и инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре.
6. Промывают планшет 3Х РВБ-Т, используя устройство для промывания планшетов ВюТек.
7. В тестируемые лунки добавляют 100 мкл/лунка антител против эндоглина в концентрации 20, 10, 4, 2, 1, 0,5 и 0,2 нг/мл (разбавленные в РВБ-Т с 0,1% БСА) и инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре. В лунки с отрицательными контролями добавляют 100 мкл/лунка подходящего по изотипу контрольного антитела.
8. Промывают планшет 3Х РВБ-Т, используя устройство для промывания планшетов ВюТек.
9. Во все лунки добавляют 100 мкл/лунка антитела козы против ЦО человека, конъюгированного с НКР (пероксидаза хрена) Цаскзоп [ттипогезеагсН), разбавленного 1:10000 в РВБ-Т с 0,1% БСА; инкубируют в течение 30-60 мин при комнатной температуре.
10. Промывают планшет 5 раз РВБ-Т, используя устройство для промывания планшетов ВюТек.
11. Добавляют 100 мкл/лунка раствора субстрата ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) и инкубируют незакрытым в темноте в течение 15 мин.
12. Останавливают реакцию добавлением стоп-раствора ТМВ в количестве 100 мкл/лунка.
Образцы анализируют в трех повторах, и для построения стандартной кривой и определения константы связывания считывают оптическую плотность. Проводят статистический анализ, используя критерий Стьюдента или другой стандартный критерий.
- 77 025174
Конкурентный ЕЫ8А-анализ.
Антитела в конкурентном ЕЫ8А-анализе тестировали в отношении связывания с СЭ105 по сравнению с биотинилированным химерным антителом против С.О105. Кратко, химерное антитело против СО105 биотинилировали с использованием набора для микробиотинилирования (№» по каталогу 81дта ВТАС-1КТ), следуя инструкциям производителя. 96-луночные микротитрационные планшеты с плоским дном (№тс Iттиηο Мах18огр) покрывали мышиным антителом против СЭ105 человека (Ν° по каталогу 8ои1Нет Вю1ес1то1о81е5 9811-01) в концентрации 1,5 мкг/мл в забуференном фосфатами физиологическом растворе (РВ8) в течение ночи при 4°С. На следующий день в предварительно покрытый планшет добавляли СО 105 человека в концентрации 100 нг/мл (№° по каталогу К&О 8у81ет§ 1097-ЕЦ) в смеси РВ8/2% БСА и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Либо химерные, либо гуманизированные, либо гуманизированные/деиммунизированные антитела против СО 105 в различных концентрациях (от 4 до 0,0018 мкг/мл в трехкратных разведениях) смешивали с биотинилированным химерным антителом против СО105 в фиксированной концентрации (6,25 нг/мл) и добавляли в планшет. Связывание биотинилированного химерного антитела определяли с помощью стрептавидин-НКР (№ по каталогу 81дта 85512) и субстрата ТМВ (№ по каталогу 81дта Т0440). Значения 0О450НМ измеряли на планшетридере Оуиех МКХ ТС11. Результаты конкурентного анализа проиллюстрированы на фиг. 7 и 8. Кривые аппроксимировали при помощи прямолинейного участка для каждого из графиков зависимости поглощения от логарифма концентрации образца и уравнения этих линий использовали для расчета концентраций гуманизированного или гуманизированного/деиммунизированного антитела, необходимых для ингибирования связывания биотинилированного химерного антитела с СО105 на 50% (1С50). Для обеспечения сравнений в пределах экспериментов и между экспериментами, значения 1С50 для гуманизированных или гуманизированных/деиммунизированных вариантов нормировали относительно эталонного антитела, которое содержалось на каждом планшете, с получением значения для кратного различия. Значения 1С50 относятся к химерному антителу против СО105 и являются типичными для трех экспериментов. Обобщенные данные ЕЫ8А представлены в табл. 1 и включают уровни экспрессии антител (мкг/мл), как проанализировано в насыщенных статических культурах.
Таблица 1
Характеристики гуманизированных и гуманизированных/деиммунизированных вариантов антител
Конструкция Относительная 1Си Уровни экспрессии (мкг/мл) Уровень деиммунизации
νκινΗΐ 1,51 10,2 н/а
νΚΐνΗ2 1,15 12,9 н/а
νΚ2νΗ1 0,93 11,1 н/а
УК2\/Н2 1,19 15,8 н/а
\/К2ААУН1А 0,79 10,8 ++++
νΚ2ΑΑνΗ1Α2 0,99 6,6 ++++++
νΚ2ΑΑνΗ1Ο 0,76 7,5 +++++
νΚ2ΑΑνΗ1Β 0,61 10,0 +++++
- 78 025174
νΚ2ΑΑνΗ15 1,27 9,7 ++++
УК2АЗ\/Н1А 1,41 6,6 +++
УК2АЗ\/Н1А2 0,85 5,9 +++++
νΚ2Α5\/Η1Ο 1,04 8,7 ++++
νΚ2Α3νΗ1В 1,02 7,9 ++++
νΚ2Α3νΗ18 1,31 8,8 +++
\/К23АУН1А 0,49 7,5 +++
νΚ23ΑνΗ1Α2 0,84 10,3 +++++
УК25А\/Н1О 0,87 11,5 ++++
\/К23А\/Н1 В 0,77 8,8 ++++
νΚ25ΑνΗ15 0,96 34,6 +++
νΚ233νΗ1Α 1,06 9,7 ++
νΚ233νΗ1Α2 1,03 17,4 ++++
νΚ233νΗ1Θ 1,21 14,7 +++
νΚ23βνΗ1В 0,62 13,7 +++
νΚ233νΗ13 1,21 16,2 +++
νΚ1ΑΑνΗ1Α 2,52 6,9 ++++
νΚ1ΑΑνΗ1Α2 1,12 13,5 ++++++
νΚ1ΑΑνΗ1Ο 1,30 7,6 +++++
νΚ1ΑΑνΗ1Β 1,05 11,5 +++++
н/а - не анализировали.
Значения Κ'.'50 относятся к химерному антителу против эндоглина и являются типичными для трех экспериментов. Уровни экспрессии антител (мкг/мл) анализировали в насыщенных статических культурах. Уровень деиммунизации представлен условной шкалой с учетом положения в подвергнутых мутациям эпитопах.
Пример 2. ВМсоге-анализ (поверхностный плазмонный резонанс: 8РК) связывания гуманизированных и гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина.
Аффинность антител можно оценить, используя, например, ВМсоге-анализ с использованием стандартных протоколов. Кратко, белок А химически связывают с чипом В^сою СМ5, где количество иммобилизованного белка А соответствует примерно 2000 КИ (резонансные единицы). Последующие стадии проводят в рабочем буфере следующего состава: 10 мМ НЕРЕ8 (П-2-гидроксиэтилпиперазин^-2этансульфоновая кислота), 150 мМ №С1, 3 мМ ЕОТА, 0,05% ТХУЕЕК рН 7,4, при 25°С, используя скорость сбора данных 10 Гц. Антитело против эндоглина (10 нМ) захватывают иммобилизованным белком А на чипе В^сою при скорости потока 10 мкл/мин: обычно времена захвата 20, 40 и 80 с обеспечивают захват антител, характеризующихся плотностями 130 КИ, 330 КИ и 570 КИ соответственно. Запуск циклов проводят, используя рабочий буфер при скорости потока 40 мкл/мин, время контакта 90 с и время диссоциации 90 с. Циклы для образцов выполняют, используя рекомбинантный эндоглин в концентрациях, варьирующихся от 0 до 40 нМ. Эндоглин пропускают над поверхностью чипа В^сою, содержащего захваченное антитело, при скорости потока 40 мкл/мин, со временем контакта 525 с и временем диссоциации 2500 с. Обычно для образцов выполняют восемь циклов для каждой плотности захваченного антитела. Регенерацию чипа осуществляют, используя 10 мМ глицин, рН 1,7. Анализ данных проводят, используя программное обеспечение для оценки данных В^соге Т100, версию 1.1. Сравнивают сигналы, генерированные с использованием чипов В^сою, с различными плотностями захваченного антитела, и данные, полученные в отсутствие рекомбинантного эндоглина, используют для корректировки фонового сигнала в этом анализе. Для аппроксимации данных, Ктах позволяют плавать для учета варьирования уровней захвата каждого антитела в каждом цикле. Данные для каждой плотности захвата аппроксимируют одновременно во время анализа каждого антитела. В табл. 2 представлены В^соге-данные для химерных, гуманизированных и гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина, включая ка (1/Мс), кй (1/с), Кс (М) и СЫ2 (хи-квадрат) (КИ2).
- 79 025174
Таблица 2
В^соге-данные связывания химерного антитела против эндоглина, гуманизированного антитела против эндоглина УК1Ун1 и гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина УК1ААУИ1К, УК1ААУ1 ПО и УК1ААУКУИ1А2
Пример 3. Авидность антител и количество доступных эпитопов на эндоглин-экспрессирующих клетках.
Авидность антител и количество доступных эпитопов на эндоглин-экспрессирующих клетках можно оценить, применяя анализы графика Скэтчарда с помощью стандартных протоколов.
Кратко, проводят анализы графика Скэтчарда для прямого связывания меченных радиоактивной меткой гуманизированных антител против эндоглина с эндоглин-экспрессирующими лейкозными клетками КМ-3 и субконфлюентными пролиферирующими ниУЕС. Очищенные антитела против эндоглина индивидуально метят радиоактивным 125Σ, используя 1о6о-Осп и в соответствии со стандартными методами, известными специалистам в данной области. Меченные радиоактивной меткой гуманизированные антитела против эндоглина анализируют в отношении среднего содержания атомов йода на молекулу ЦО. Для определения антиген-связывающей активности проводят эксперименты по титрованию, используя фиксированное количество (0,1 мкг) каждого 125Кмеченного тАЬ и эндоглин-экспрессирующие клетки ниУЕС в серийных 2-кратно возрастающих концентрациях. Анализ данных по связыванию с использованием графика Скэтчарда осуществляют известными методами. В результате проведения этого анализа определяют константу равновесия и среднее максимальное количество связавшегося тАЬ на клетку.
Пример 4. Анализ активности антител против эндоглина с использованием вестерн-блоттинга.
Способность гуманизированных антител против эндоглина модифицировать внутриклеточную передачу сигнала в пролиферирующих эндотелиальных клетках, экспрессирующих СБ105, можно проанализировать с использованием вестерн-блоттинга с детекцией фосфорилирования белков, вовлеченных в сигнальный путь с участием СБ105.
Вестерн-блот-анализы проводят для идентификации фосфорилированных δтаб1/5/8 или δтаб2/3 в соответствии с известными методами вестерн-блоттинга для нетрансфицированных эндотелиальных клеток. Для детекции молекул в образцах используют первичные антитела против фосфорилированных δтаб1, δтаб2, δтаб5, М1 (δ;·ιηΙ;·ι Сги/) и эндоглина. Детекцию осуществляют с использованием усиленной хемолюминесценции (ЕСЬ).
Пример 5. Ингибирование роста ниУЕС и анализ включения 3Н-тимидина.
Для оценки ингибирования клеточного роста пригоден ряд анализов.
В одном из примеров клетки ниУЕС линии Е6/Е7 Р3-17 культивировали в среде ЕВМ2 с добавками (^оηζа-С1оηе!^сδ), содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки. Клетки культивировали во флаконах 75 см2 ^Коп, Вес!оη-^^ск^ηδоη, ΡκιηΙΠίη ЬакеБ, ΝΣ) в СО2-инкубаторе при 37°С в субконфлюентных условиях. Клетки открепляют посредством инкубации со сбалансированным солевым раствором Хенкса вместе с 15 мМ ЕБТА в 25 мМ буфере ΗЕРЕδ, рН 7,3, при 37°С в течение 15 мин. После двухкратной промывки охлажденным во льду РВδ клетки ресуспендируют в среде для роста эндотелиальных клеток в концентрации 25000 клеток/мл. В дополнительных экспериментах эндотелиальные клетки пупочной вены человека (ниУЕС) суспендируют и культивируют в среде для роста эндотелиальных клеток, не содержащей ΡВδ и экстрактов головного мозга быка. 200 мкл аликвоту клеточной суспензии, содержащую 2500 клеток, вносят в каждую лунку 96-луночных культуральных планшетов. Клетки культивируют при 37°С в СО2 инкубаторе в течение ночи, затем добавляют в трех повторах 100 мкг/мл гуманизированного антитела против эндоглина УК1ААУИ1А2 или контрольного ЦО, либо РВδ. Культуральные планшеты выдерживают в инкубаторе в течение 72 ч, осуществляя замену в течение этого периода времени на свежие среды и гуманизированное антитело против эндоглина, контрольный ЦО или РВδ каждые 24 ч. В каждую лунку добавляют 3Н-тимидин (1 мкКи) и планшеты инкубируют в течение 20 ч. Клетки промывают РВδ, затем обрабатывают смесью трипсин-ЕБТА (0,05% трипсина; 0,53 мМ ЕБТА) в количестве 100 мкл/лунка при 37°С в течение 15 мин. Клетки собирают на стекловолокнистых фильтрах (^УаНас Ргш!еб Ρ^1!е^та!Α), используя наг\'еБ1ег 96 (ТОМТЕС, натбещ СТ), и определяют 3Н-радиоактивность в жидкостном сцинтилляционном и люминесцентном счетчике ТгЛих 1540 МкгоВе!а (^Уа11ас, Тигки, Ρίη1;шб). Во втором примере использовали первичную культуру клеток ниУЕС, ниУЕС 2517С. Гуманизи- 80 025174 рованное антитело ТКС105 ингибировало рост клеток ниУЕС линии Е6/Е7 и первичной культуры клеток ниУЕС, ниУЕС 2517С, происходящей от одного донора, в сравнении с контрольным антителом и РВ8 (табл. 3).
Клетки Е6/Е7.
Таблица 3
Ингибирование роста эндотелиальных клеток человека под действием гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина УК1ААУША2
Пример 6. Анализ ингибирования миграции клеток под действием антител против эндоглина.
Миграцию (хемокинез) как меру клеточной пролиферации и активации измеряют, используя камеру Бойдена.
Кратко, миграцию клеток оценивают следующим образом: нуклеопоровый фильтр Со§1аг (поры 8 мм) покрывают фибронектином в течение ночи при 4°С. Камеру промывают забуференным фосфатами физиологическим раствором (РВ8) и нижнюю камеру заполняют ЭМЕМ (среда Игла, модифицированная Дульбекко), содержащей или не содержащей сыворотку, и содержащей или не содержащей ТОР-33. Клетки трипсинизируют и суспендируют в конечной концентрации 50000 клеток/мл в ЭМЕМ в присутствии антитела против эндоглина. В верхнюю камеру добавляют 150 мкл аликвоту клеточной суспензии и инкубируют при 37°С. Через 16 ч клетки промывают и верхнюю поверхность вытирают для удаления немигрировавших клеток. Мембраны фиксируют в метаноле, промывают водой, окрашивают и подсчитывают количество клеток, находящихся на нижней поверхности.
Пример 7. Анализ АОСС гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина.
Антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, можно оценить по их способности связываться с ЕЕ^-активированными природными киллерными (ХК) клетками и индуцировать антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АОСС), используя, например, следующие протоколы.
Выделение ХК и генерация I^-2-активированных ХК-клеток.
РВМС выделяют и оставляют на 24 ч при 4°С в КРМI с 10% РВ8. РВМС затем помещают в КРМI с 2% РВ8 (общий объем = 50 мл) и 10 мл клеточной суспензии помещают на чашку Петри. РВМС инкубируют в течение 2 ч при 37°С и неприкрепившиеся клетки собирают. ИК-клетки культивируют в количестве 8х106/мл вместе с 1000 ед./мл ΣΕ-2 в течение 48 ч, затем в условиях обычного культивирования в течение 5-8 суток, после чего используют в анализе АОСС.
Анализы цитотоксичности и АОСС.
ХК-клетки соскабливают из культуры и собирают в коническую пробирку на 50 мл. Клетки промывают один раз полной средой КРМ1 и центрифугируют при 1200 об/мин в течение 10 мин. Затем ХКклетки ресуспендируют в 5 мл полной среды ИРМ! и подсчитывают их количество. Перед проведением анализа число ХК клеток нормируют к соотношению эффектор :мишень 10:1. Нормированные ХК клетки высевают и в предназначенные для этого лунки добавляют 10 мкл антитела против эндоглина и инкубируют в течение 30 мин при 37°С. Контрольные образцы включают необработанные или обработанные контрольным антителом клеточные популяции. Все образцы и контроли тестируют в пяти повторах.
Интересующие клетки-мишени собирают (клетки ниУЕС), промывают, центрифугируют при 1200 об/мин в течение 10 мин и ресуспендируют в 5 мл полной среды КРМЕ Клетки-мишени еще раз промывают и ресуспендируют в бессывороточной КРМ1 до конечной концентрации 1х106 клеток/мл. Клеткимишени затем метят, используя кальцеин АМ в конечной концентрации 5 мкг/мл, в течение 1 ч при 37°С, затем дважды промывают полной средой КРМЕ Клетки-мишени затем ресуспендируют и добавляют в лунки с ХК-клетками. Комбинацию клетки-мишени/ХК-клетки инкубируют при 37°С в течение 4 ч. После инкубации планшеты центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин, клетки промывают и ресуспендируют в ЭРВ8 (фосфатно-солевой буфер Дульбекко). Флуоресценцию считывают, используя возбуждение/эмиссию 450/530 нм, и эмиссия является количественным показателем киллинга клеток, опосредованного антителами. Подсчитывают среднюю интенсивность флуоресценции и стандартное отклоне- 81 025174 ние и используют для расчета % АОСС в соответствии со следующей формулой:
% АОСС = 100% * [(^образец! среда}-(^подходящий по изотипу контроль1тритон)], где Образец = средняя флуоресценция в лунках, содержащих антитело против эндоглина;
Ореда = средняя флуоресценция в лунках, содержащих среду без антитела;
Оодходящий по изотипу контроль = средняя флуоресценция в лунках, содержащих подходящий по изотипу контрольный 1§С;
Оритон = средняя флуоресценция в лунках, содержащих детергент тритон (для лизиса клеткокмишеней).
Гуманизированное/деиммунизированное антитело УК1ААУН1А2 демонстрировало дозозависимую АОСС для НИУЕС, которая была значительно больше, чем для подходящего по изотипу контрольного антитела (табл. 4А и 4В). Отметим, что эксперименты, суммированные в табл. 4А и 4В, проводили с ΝΚклетками от разных доноров.
Таблица 4А
АОСС гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина УК1ААУН1А2 в сравнении с подходящим по изотипу контрольным 1§С на клетках НЦУЕС
Условие тестирования АОСС для НиУЕС(%) Стандартное отклонение
Подходящий по изотипу контроль (2 мкг/мл) 3,4 4,7
νΚ1ΑΑνΗ1Α2 (0,4 мкг/мл) 14,6 2,1
УК1ААУН1А2 (0,08 мкг/мл) 14,6 2,1
УК1ААУН1А2 (0,016 мкг/мл) 12,6 4,1
УК1ААУН1А2 (0,0032 мкг/мл) 8,4 4,1
УК1ААУН1А2 (0,00064 мкг/мл) 7,6 2,0
Таблица 4В
АОСС гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина УК1ААУН1А2 в сравнении с подходящим по изотипу контрольным 1цО на клетках НЦУЕС
Условие тестирования АОСС для НиУЕСв{%) Стандартное отклонение
Подходящий по изотипу контроль (2 мкг/мл) 21,4 2,5
УК1ААУН1А2 (2,0 мкг/мл) 44,8 4,2
УК1ААУН1А2 (0,4 мкг/мл) 38,5 7,7
УК1ААУН1А2 (0,08 мкг/мл) 31,5 3,2
УК1ААУН1А2 (0,016 мкг/мл) 23,3 8,0
УК1ААУН1А2 (0,0032 мкг/мл) 21,2 5,8
Пример 8. Эффект гуманизированных/деимму визированных антител против эндо глина в мышиной модели хориоидальной неоваскуляризации.
Эффект гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина может быть оценен в мышиной модели хориоидальной неоваскуляризации.
Кратко, мышей С57ВЬ/6 в возрасте 4-5 недель подвергают анестезии гидрохлоридом кетамина (100 мг/кг) и зрачки расширяют, используя 1%-ный тропикамид (А1сои БаЬогаЮпсх. 1ис Рой АоПй. ТХ). На каждую сетчатку наносят три ожога (фотокоагуляция 532 нм диодным лазером; размер пятна 75 им; продолжительность 0,1 с; 120 мВ), используя систему доставки щелевой лампы фотокоагулятора (ОсиЫдй!; 1пс1с.\. Мошйаш νίε\ν, СА) и портативное покровное стекло в качестве контактной линзы. Ожоги выполняют в положениях 9, 12 и 3 ч заднего полюса сетчатки. Образование пузырька во время облучения лазером, которое указывает на нарушение мембраны Бруха, является важным фактором получения хориоидальной неоваскуляризации (С14У); таким образом, в данное исследование включаются только те ожоги, при нанесении которых образуется пузырек.
Для исследования эффекта внутриглазных инъекций проводят четыре независимых эксперимента в 0-е сутки после нарушения мембраны Бруха. Мышам в группе 1 делают внутриглазную инъекцию от примерно 0,5 до примерно 5 мкг антитела против эндоглина или антигенсвязывающего фрагмента в 1 мкл РВ§ в один глаз и 1 мкл РВ§ в другой глаз. Мышам группы 2 делают внутриглазную инъекцию от примерно 1,5 до примерно 10 мкг антитела против эндоглина или антигенсвязывающего фрагмента в 1 мкл РВ§ в один глаз и 1 мкл РВ§ в другой глаз. Мышам группы 3 делают внутриглазную инъекцию от примерно 5 до примерно 25 мкг антитела против эндоглина или антигенсвязывающего фрагмента в 1 мкл
-82025174
РВ§ в один глаз и 1 мкл РВ§ в другой глаз. Группе 4 вводят РВ§ в оба глаза.
Через 14 суток мышей подвергают анестезии, осуществляют перфузию флуоресцеин-меченым декстраном (средняя молекулярная масса 2х106, §^дта-Α1б^^сЬ) и готовят хориоидальные плоские гистологические срезы. Кратко, глаза извлекают, фиксируют в течение 1 ч в 10%-ном забуференном фосфатом формалине и извлекают роговицу и хрусталик. Сетчатку целиком аккуратно иссекают из глазного бокала, делают радиальные разрезы от границы глазного бокала до экватора во всех четырех квадрантах, и сетчатку заключают в плоские гистологические срезы в водной среде для получения гистологических срезов (Αίμη·!·^.!!·!!; ВОН, Роо1е, ИК). Плоские гистологические срезы изучают с использованием флуоресцентной микроскопии ^хюккор; Саг1 2е1кк Меб1!ес,ТЬоги№ооб, ΝΥ) и изображения преобразуют в цифровую форму, используя три прибора с цифровой зарядовой связью (ССЭ) цветной видеокамеры (1К-Тυ40Α, ТокЫЬа, Токуо, 1арап). При анализе изображений для измерения площади каждого СNУповреждения используют программное обеспечение для устройства захвата изображений. Статистические сравнения выполняют, используя ΑΝΟνΑ (дисперсионный анализ) и коррекцию с применением критерия Даннета для множественных сравнений.
Пример 9. Антиангиогенная терапия ранее сформировавшихся раковых опухолей молочной железы человека в коже человека, пересаженной §СГО-мышам.
Эффект гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина, описанных в данной заявке, можно оценить по их антиангиогенному эффекту на ранее сформировавшиеся раковые опухоли молочной железы человека в коже человека, пересаженной §СГО-мышам.
Кратко, клетки МСР-7 (8х106 клеток в 0,1 мл РВ§) трансплантируют интрадермально в полнослойную кожу человека, пересаженную §СГО-мышам, когда эти трансплантаты демонстрировали отсутствие признаков воспаления, сокращения или отторжения. Мышей не обрабатывают до появления отчетливых пальпируемых опухолей (в большинстве случаев 3-6 мм в диаметре). Для терапевтических исследований мышей с отчетливыми опухолями делят на группы. Гуманизированное/деиммунизированное моноклональное антитело (тΑЬ) против эндоглина и подходящий по изотипу контрольный 1дО разбавляют стерильным РВ§, содержащим сывороточный альбумин мыши (конечная концентрация 0,05%). Для терапии антителами внутривенно (в/в) через хвостовую вену мышей вводят антитело против эндоглина или контрольный 1дО в количестве 1-20 мг/кг. Введение осуществляют каждые двое-трое суток.
Во время обработки ежедневно проводят мониторинг размера опухоли и заболеваемости мышей. Мышей взвешивают два раза в неделю, используя электронные весы (ΟΗΑυδ™ модель ОТ210). Размер опухоли измеряют три раза в неделю, используя электронный кронциркуль (6-дюймовый кронциркуль РКΟ-МΑX; Ро\\'1ег Со., №Моп, Макк.), подключенный к компьютеру, с использованием программного обеспечения ОрЮЭето™ (Ро\\'1ег Со.). Измеренные диаметры опухолей переводят в объемы опухолей, используя следующую формулу: У=длинахширинахвысотахд/6. Статистический анализ данных для сравнения разных групп мышей проводят, используя критерий Стьюдента.
Пример 10. Мышиная модель рака яичников.
Для определения способности гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина или их антигенсвязывающих фрагментов лечить рак яичников можно использовать клеточную линию рака яичников в §СГО- или бестимусных мышах.
Кратко, клетки рака яичников имплантируют §СГО- или бестимусным мышам для образования опухолей яичников. Группы мышей, несущих развившиеся опухоли, обрабатывают путем в/в введения возрастающих доз (начиная с 1,8 мг/кг массы тела) гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина или контрольного 1дО. Обработку проводят 2 или 3 раза в неделю. В некоторых или во всех группах может быть использован ингибитор УЕОР и/или другой противораковый агент. Мышей подвергают мониторингу и рост опухоли измеряют 2 или 3 раза в неделю.
Пример 11. Мышиная модель колоректального рака.
Для определения способности гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина или их антигенсвязывающих фрагментов лечить колоректальный рак можно использовать клеточную линию колоректального рака в §СШ- или бестимусных мышах.
Кратко, клетки колоректального рака имплантируют §СГО- или бестимусным мышам для образования опухолей прямой кишки. Группы мышей, несущих развившиеся опухоли, обрабатывают путем в/в введения возрастающих доз (начиная с 1,8 мг/кг массы тела) гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина или контрольного 1дО. Обработку проводят 2-3 раза в неделю. В некоторых или во всех группах может быть использован ингибитор УЕОР и/или другой противораковый агент. Мышей подвергают мониторингу и рост опухоли измеряют 2-3 раза в неделю. Изображения опухолей могут быть получены с использованием стандартной процедуры визуализации, включая РЕТ и ультразвук. Обработанные опухоли могут быть эксплантированы для оценки внутриклеточных сигнальных путей или васкуляризации с использованием иммуногистохимического исследования.
Пример 12. Мышиная модель рака почки.
Для определения способности гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина или их антигенсвязывающих фрагментов лечить рак почки используют клеточную линию рака почки в
- 83 025174 §СГО- или бестимусных мышах.
Кратко, клетки рака почки имплантируют §СГО- или бестимусным мышам для образования опухолей почки. Группы мышей, несущих развившиеся опухоли, обрабатывают путем в/в введения возрастающих доз (начиная с 1,8 мг/кг массы тела) гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина или контрольного ΙβΟ. Обработку проводят с 3-дневными интервалами для первых трех инъекций и с 7-дневным интервалом для четвертой инъекции. В некоторых или во всех группах может быть использован ингибитор ΥΞΟΡ и/или другой противораковый агент. Мышей подвергают мониторингу и рост опухоли измеряют еженедельно после умерщвления животных.
Пример 13. Мышиная модель миеломы.
Для определения способности гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина или их антигенсвязывающих фрагментов лечить миелому используют клеточную линию миеломы в §СГО- или бестимусных мышах.
Кратко, раковые клетки миеломы имплантируют §СГО- или бестимусным мышам для образования миеломных опухолей. Группы мышей, несущих развившиеся опухоли, обрабатывают путем в/в введения возрастающих доз (начиная с 1,8 мг/кг массы тела) гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина или контрольного ΙβΟ. Обработку проводят 2-3 раза в неделю. В некоторых или во всех группах может быть использован ингибитор ΥΞΟΡ и/или другой противораковый агент. Мышей подвергают мониторингу и рост опухоли измеряют 2-3 раза в неделю.
Пример 14. Мышиная модель саркомы.
Для определения способности гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина или их антигенсвязывающих фрагментов лечить саркому используют клеточную линию саркомы в §СГОили бестимусных мышах.
Кратко, раковые клетки саркомы имплантируют §СГО- или бестимусным мышам для образования саркомных опухолей. Группы мышей, несущих развившиеся опухоли, обрабатывают путем в/в введения возрастающих доз (начиная с 1,8 мг/кг массы тела) гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина или контрольного ΙβΟ. Обработку проводят 2-3 раза в неделю. В некоторых или во всех группах может быть использован ингибитор ΥΞΟΡ и/или другой противораковый агент. Мышей подвергают мониторингу и рост опухоли измеряют 2-3 раза в неделю.
Пример 15. Мышиная модель рака молочной железы.
Для определения способности гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина или их антигенсвязывающих фрагментов лечить рак молочной железы используют клеточную линию рака молочной железы в §СГО-или бестимусных мышах.
Кратко, клетки рака молочной железы имплантируют §СГО- или бестимусным мышам для образования опухолей молочной железы. Группы мышей, несущих развившиеся опухоли, обрабатывают путем в/в введения возрастающих доз (начиная с 1,8 мг/кг массы тела) гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина. Контрольным животным вводят контрольный Ι§Ο. Обработку проводят 2-3 раза в неделю. В некоторых или во всех группах может быть использован ингибитор ΥΞΟΡ и/или другой противораковый агент. Мышей подвергают мониторингу и рост опухоли измеряют 2-3 раза в неделю.
Пример 16. Клиническое испытание комбинированной терапии колоректального рака.
В данном примере описано рандомизированное, слепое, плацебо-контролируемое, многоцентровое исследование, фаза 2, предназначенное для получения предварительной оценки безопасности и эффективности гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина у пациентов с колоректальным раком. Включены от примерно 100 до примерно 800 пациентов, при этом от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе лечения и от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе плацебо. Данное испытание будет состоять из введения внутривенных повторяющихся доз гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина в количестве от примерно 0,1 до примерно 20 мг/кг или плацебо каждые одну, две или три недели в течение 6-10 циклов. Во всех группах может быть использован ингибитор ΥΞΟΡ и/или другой противораковый агент. Интервал времени для данного исследования оценивают от примерно 6 месяцев до примерно 5 лет с продолжением терапии для пациентов, отвечающих на лечение, как показано в конце первоначального исследования. Дополнительными критериями эффективности являются следующие.
Основной критерий эффективности: суммарная эффективность ответа. Одна из задач данного исследования заключается в том, чтобы продемонстрировать увеличение выживаемости без развития заболевания на 35% при применении гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина.
Дополнительные критерии эффективности, которые можно оценить, включают суммарную эффективность ответа, продолжительность ответа, общую выживаемость, тяжелые или нетяжелые побочные явления. Например, лечение может предотвращать развитие данного заболевания (т.е. останавливать развитие) или может приводить к улучшению. Альтернативно или в дополнение к этому можно измерить другие показатели, относящиеся к одному или более чем одному из следующих: уменьшение опухолевой массы, уменьшение васкуляризации, уменьшение побочных эффектов, уменьшение неблагоприятных реакций и/или улучшение соблюдения больным режима и схемы лечения.
- 84 025174
Пример 17. Клиническое испытание комбинированной терапии миеломы.
В данном примере описано рандомизированное, слепое, плацебо-контролируемое, многоцентровое исследование, фаза 2, предназначенное для получения предварительной оценки безопасности и эффективности комбинирования гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина с бортезомидом у пациентов с миеломой. Включены от примерно 100 до примерно 800 пациентов, при этом от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе лечения и от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе плацебо. Данное испытание будет состоять из введения внутривенных повторяющихся доз гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина в количестве от примерно 0,1 до примерно 20 мг/кг или плацебо каждые одну, две или три недели в комбинации с бортезомидом в дозе примерно 1,3 мг/кг, вводимой еженедельно. Интервал времени для данного исследования оценивают от примерно 6 месяцев до примерно 5 лет с продолжением терапии для пациентов, отвечающих на лечение, как показано в конце первоначального исследования. Дополнительными критериями эффективности являются следующие.
Основной критерий эффективности: суммарная эффективность ответа. Одна из задач данного исследования заключается в том, чтобы продемонстрировать увеличение суммарной эффективности ответа на величину от примерно 40% при применении бортезомида плюс плацебо до примерно 60% (или более) при применении бортезомида плюс гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина.
Дополнительные критерии эффективности, которые можно оценить, включают продолжительность ответа, выживаемость без развития заболевания, общую выживаемость, тяжелые или нетяжелые побочные явления. Например, лечение может предотвращать развитие данного заболевания (т.е. останавливать развитие) или может приводить к улучшению. Альтернативно или в дополнение к этому можно измерить другие показатели, относящиеся к одному или более чем одному из следующих: уменьшение опухолевой массы, уменьшение васкуляризации, уменьшение побочных эффектов, уменьшение неблагоприятных реакций и/или улучшение соблюдения больным режима и схемы лечения.
Пример 18. Клиническое испытание комбинированной терапии рака почек.
В данном примере описано рандомизированное, слепое, плацебо-контролируемое, многоцентровое исследование, фаза 2, предназначенное для получения предварительной оценки безопасности и эффективности комбинирования гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина с сунитинибом (§и!еп!®) у пациентов с почечноклеточным раком (раком почек). Включены от примерно 100 до примерно 800 пациентов, при этом от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе лечения и от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе плацебо. Данное испытание будет заключаться во введении внутривенных повторяющихся доз гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина в количестве от примерно 0,1 до примерно 20 мг/кг или плацебо каждые одну, две или три недели, в комбинации с сунитинибом в дозе от примерно 5 до примерно 50 мг, вводимой ежедневно в течение 4 недель с перерывом в 2 недели, после чего 4-х недельный цикл введения повторяют. Интервал времени для данного исследования оценивают от примерно 6 месяцев до примерно 5 лет с продолжением терапии для пациентов, отвечающих на лечение, как будет показано в конце первоначального исследования. Дополнительными критериями эффективности являются следующие.
Основной критерий эффективности: выживаемость без развития заболевания. Одна из задач данного исследования заключается в том, чтобы продемонстрировать увеличение продолжительности выживаемости без развития заболевания от примерно 9-13 месяцев в группе, принимающей сунитиниб плюс плацебо, до примерно 14-18 месяцев (или более) в группе, принимающей сунитиниб плюс гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина.
Дополнительные критерии эффективности, которые можно оценивать, включают эффективность ответа, продолжительность ответа, время до начала развития опухоли, общую выживаемость, тяжелые или нетяжелые побочные явления. Например, лечение может предотвращать развитие данного заболевания (т.е. останавливать развитие) или может приводить к улучшению. Альтернативно или в дополнение к этому можно измерить другие показатели, относящиеся к одному или более чем одному из следующего: уменьшение опухолевой массы, уменьшение васкуляризации, уменьшение побочных эффектов, уменьшение неблагоприятных реакций и/или улучшение соблюдения больным режима и схемы лечения.
Пример 19. Клиническое испытание комбинированной терапии гепатоцеллюлярного рака.
В этом примере описано рандомизированное, слепое, плацебо-контролируемое, многоцентровое исследование, фаза 2, предназначенное для получения предварительной оценки безопасности и эффективности комбинирования гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина с сорафенибом (ЫЕХАУА®г) у пациентов с гепатоцеллюлярным раком (раком печени). Включено от примерно 100 до примерно 800 пациентов, при этом от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе лечения и от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе плацебо. Данное испытание будет состоять из введения внутривенных повторяющихся доз гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина в количестве от примерно 0,1 до примерно 20 мг/кг или плацебо каждые одну, две или три недели в комбинации с сорафенибом в количестве примерно 400 мг ежедневно в течение 3-6 циклов или пока продолжается развитие. Интервал времени для данного исследования оценивают от
- 85 025174 примерно 6 месяцев до примерно 5 лет с продолжением терапии для пациентов, отвечающих на лечение, как будет показано в конце первоначального исследования. Дополнительными критериями эффективности являются следующие.
Основные показатели результата: выживаемость без развития заболевания. Одна из задач данного исследования заключается в том, чтобы продемонстрировать увеличение продолжительности выживаемости без развития заболевания от примерно 3-9 месяцев в группе, принимающей сорафениб плюс плацебо, до примерно 6-12 месяцев (или более) в группе, принимающей сорафениб плюс гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина.
Дополнительные критерии эффективности, которые могут быть оценены, включают продолжительность ответа, время до начала развития опухоли, общую выживаемость, тяжелые или нетяжелые побочные явления. Например, лечение может предотвращать развитие данного заболевания (т.е. останавливать развитие) или может приводить к улучшению. Альтернативно или в дополнение к этому можно измерить другие показатели, относящиеся к одному или более чем одному из следующего: уменьшение опухолевой массы, уменьшение васкуляризации, уменьшение побочных эффектов, уменьшение неблагоприятных реакций и/или улучшение соблюдения больным режима и схемы лечения.
Пример 20. Клиническое испытание комбинированной терапии рака почек.
В данном примере описано рандомизированное, слепое, плацебо-контролируемое, многоцентровое исследование, фаза 2, предназначенное для получения предварительной оценки безопасности и эффективности комбинирования гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина с бевацизумабом (АУА§Т1Ы®) у пациентов с почечноклеточным раком (раком почек). Включены от примерно 100 до примерно 800 пациентов, при этом от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе лечения и от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе плацебо. Данное испытание будет состоять из введения внутривенных повторяющихся доз гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина в количестве от примерно 0,1 до примерно 20 мг/кг или плацебо каждые одну, две или три недели, в комбинации с бевацизумабом в дозе примерно 7,5, примерно 10 или примерно 15 мг/кг, вводимой ежедневно каждые две недели. Интервал времени для данного исследования оценивают от примерно 6 месяцев до примерно 5 лет с продолжением терапии для пациентов, отвечающих на лечение, как будет показано в конце первоначального исследования. Дополнительными критериями эффективности являются следующие.
Основной критерий эффективности: выживаемость без развития заболевания. Одна из задач данного исследования заключается в том, чтобы продемонстрировать увеличение продолжительности выживаемости без развития заболевания от примерно 8-12 месяцев в группе, принимающей бевацизумаб плюс плацебо, до примерно 13-18 месяцев (или более) в группе, принимающей бевацизумаб плюс гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина.
Дополнительные критерии эффективности, которые можно оценивать, включают суммарную эффективность ответа, продолжительность ответа, время до начала развития опухоли, общую выживаемость, тяжелые или нетяжелые побочные явления. Например, лечение может предотвращать развитие данного заболевания (т.е. останавливать развитие) или может приводить к улучшению. Альтернативно или в дополнение к этому можно измерить другие показатели, относящиеся к одному или более чем одному из следующего: уменьшение опухолевой массы, уменьшение васкуляризации, уменьшение побочных эффектов, уменьшение неблагоприятных реакций и/или улучшение соблюдения больным режима и схемы лечения.
Пример 21. Клиническое испытание комбинированной терапии рака яичников.
В этом примере описано рандомизированное, слепое, плацебо-контролируемое, многоцентровое исследование, фаза 2, предназначенное для получения предварительной оценки безопасности и эффективности комбинирования гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина с Эохй® у пациентов с раком яичников. Включено от примерно 100 до примерно 800 пациентов, при этом от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе лечения и от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе плацебо. Данное испытание будет состоять из введения внутривенных повторяющихся доз гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина в количестве от примерно 0,1 до примерно 20 мг/кг или плацебо каждые одну, две или четыре недели в комбинации с доксилом в дозе от примерно 5 до примерно 50 мг/м2, вводимой один раз в 4 недели. Интервал времени для данного исследования оценивают от примерно 6 месяцев до примерно 5 лет с продолжением терапии для пациентов, отвечающих на лечение, как будет показано в конце первоначального исследования. Дополнительными критериями эффективности являются следующие.
Основной критерий эффективности: выживаемость без развития заболевания. Одна из задач данного исследования заключается в том, чтобы продемонстрировать увеличение продолжительности выживаемости без развития заболевания от примерно 3-6 месяцев в группе, принимающей Оо.хП® плюс плацебо, до примерно 4-12 месяцев (или более) в группе, принимающей Оо.хП® плюс гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина.
Дополнительные критерии эффективности, которые могут быть оценены, включают продолжитель- 86 025174 ность ответа, время до начала развития опухоли, общую выживаемость, тяжелые или нетяжелые побочные явления. Например, лечение может предотвращать развитие данного заболевания (т.е. останавливать развитие) или может приводить к улучшению. Альтернативно или в дополнение к этому можно измерить другие показатели, относящиеся к одному или более чем одному из следующих: уменьшение опухолевой массы, уменьшение васкуляризации, уменьшение побочных эффектов, уменьшение неблагоприятных реакций и/или улучшение соблюдения больным режима и схемы лечения.
Пример 22. Клиническое испытание основанной на платине комбинированной терапии рака яичников.
В этом примере описано рандомизированное, слепое, плацебо-контролируемое, многоцентровое исследование, фаза 2, предназначенное для получения предварительной оценки безопасности и эффективности комбинирования гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина с химиотерапией на основе платины у пациентов с раком яичников. Включено от примерно 100 до примерно 800 пациентов, при этом от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе лечения и от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе плацебо. Данное испытание будет состоять из введения внутривенных повторяющихся доз гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина в количестве от примерно 0,1 до примерно 20 мг/кг или плацебо каждые одну, две или три недели в комбинации со схемой лечения с применением химиотерапии на основе платины (например, карбоплатина и паклитаксела), состоящей в курсах внутривенной инфузии, повторяющихся на протяжении данного исследования. Интервал времени для данного исследования оценивают от примерно 6 месяцев до примерно 5 лет с продолжением терапии для пациентов, отвечающих на лечение, как будет показано в конце первоначального исследования. Дополнительными критериями эффективности являются следующие.
Основной критерий эффективности: выживаемость без развития заболевания. Одна из задач данного исследования заключается в том, чтобы продемонстрировать увеличение продолжительности выживаемости без развития заболевания от примерно 12-18 месяцев в группе, принимающей топотекан плюс плацебо, до примерно 12-24 месяцев (или более) в группе, получающей химиотерапию на основе платины плюс гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина.
Дополнительные критерии эффективности, которые могут быть оценены, включают продолжительность ответа, время до начала развития опухоли, общую выживаемость, тяжелые или нетяжелые побочные явления. Например, лечение может предотвращать развитие данного заболевания (т.е. останавливать развитие) или может приводить к улучшению. Альтернативно или в дополнение к этому можно измерить другие показатели, относящиеся к одному или более чем одному из следующих: уменьшение опухолевой массы, уменьшение васкуляризации, уменьшение побочных эффектов, уменьшение неблагоприятных реакций и/или улучшение соблюдения больным режима и схемы лечения.
Пример 23. Применение антител против эндоглина для лечения диабетической ретинопатии.
План исследования.
Для оценки биологической активности множественных интравитреальных инъекций гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина у пациентов с клинически значимым диабетическим отеком, затрагивающим центр желтого пятна (ΏΜΕ), и для регистрации любых ассоциированных неблагоприятных событий инициируют одноцентровое открытое пилотное исследование с возрастанием дозы. В список включают пациентов с ΌΜΕ, затрагивающим центр желтого пятна, и остротой зрения с наилучшей коррекцией (ΒСVΑ), составляющей от 20/40 до 20/400, в исследуемом глазу.
Лечение в программе исследования.
Подходящих пациентов произвольным образом разделяют в соготношении 1:1 для получения трех интравитреальных инъекций гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина (примерно от 0,25 до 2,5 мг на каждую инъекцию), вводимых один раз в месяц, и наблюдения продолжают до 24-ого месяца. Первичными конечными точками являются частота встречаемости и тяжесть глазных и системных неблагоприятных событий. Вторичными конечными точками являются 1) оценка зрения с наилучшей коррекцией, которая проводится путем использования таблицы (для определения остроты зрения) в рамках изучения раннего лечения диабетической ретинопатии (ΕΤΌΚδ) с применением стандартизированного протокола по рефракции и тестированию (зрения) при начальном расстоянии при тестировании, равном 2 м, и 2) измерение толщины сетчатки с использованием оптической когерентной томографии. Врач, проводящий количественное сравнение, не осведомлен о распределении пациента в группу лечения; врач, который вводит инъекцию, осведомлен о распределении пациента в группу лечения гуманизированным/деиммунизированным антителом против эндоглина или группу лечения плацебо, но не осведомлен о дозе гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина. Другие работники каждого исследовательского центра (за исключением тех, которые принимают участие в инъекциях), пациенты и персонал главного центра регистрации данных не осведомлены о распределении пациента в группу лечения.
Анализы эффективности и безопасности.
Анализы эффективности проводят с учетом всех пациентов, начавших проходить лечение с использованием метода переноса данных последнего наблюдения для недостающих данных. Для всех пар- 87 025174 ных сравнений выполняют корректировку статистической модели к базовой оценке остроты зрения (< 55 букв против > 55 букв). Сравнения между группами для дихотомических конечных точек выполняют с использованием критерия хи-квадрата Кокрена. Отклонение от базовой остроты зрения анализируют, используя модели дисперсионного анализа. Для оценки признаков поражения в конечных точках используют модели дисперсионного анализа, скорректированные к базовой величине. Для корректировки двух парных сравнений лечений в первичной конечной точке используют метод множественного сравнения Хохберга-Бонферрони (ΗοсЬЪе^§-Вοη£е^^οη^). В анализы безопасности включают всех подвергаемых лечению пациентов.
Заключение.
Гуманизированные антитела против эндоглина будут представлять собой хорошо переносимую терапию для пациентов с ОМЕ. Это пилотное исследование демонстрирует, что терапия гуманизированными/деиммунизированными антителами против эндоглина имеет потенциал для поддержания или улучшения остроты зрения с наилучшей коррекцией и уменьшения толщины сетчатки у пациентов с клинически значимым ОМЕ, затрагивающим центр желтого пятна.
Пример 24. Клиническое исследование антител против эндоглина и возрастной дегенерации желтого пятна.
План исследования.
В 2-годичное проспективное рандомизированное, двойное слепое плацебо-контролируемое исследование безопасности и эффективности повторных интравитреальных инъекций гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина среди пациентов с хориоидальной неоваскуляризацией, ассоциированной с возрастной дегенерацией желтого пятна, включают пациентов из многих центров в Соединенных Штатах Америки. Анализ первичной эффективности осуществляют через 12 месяцев. Конечной точкой первичной эффективности является доля пациентов, которые утратили менее 15 букв (приблизительно 3 линии) от базовой остроты зрения, что оценивается путем использования таблицы (для определения остроты зрения) в рамках изучения раннего лечения диабетической ретинопатии (ЕТОК8) с применением стандартизированного протокола по рефракции и тестированию (зрения) при начальном расстоянии при тестировании, равной 2 м. Приемлемость поражений подтверждается главным независимым центром регистрации данных путем использования стандартизированных критериев и квалифицированных оценивающих специалистов, которые не осведомлены о распределениях пациента в группу лечения. Пациенты дают письменное информированное согласие перед определением их полного соответствия критериям отбора. Скрининг может длиться до 28 дней.
Для включения в данное исследование возраст пациентов должен составлять по меньшей мере 50 лет; острота зрения с наилучшей коррекцией - от 20/40 до 20/320 (эквивалент таблицы Снеллена (δηοΠοη), определено с использованием ЕТОК8-таблицы); пациенты должны иметь первичную или рецидивидующую хориоидальную неоваскуляризацию, ассоциированную с возрастной дегенерацией желтого пятна, охватывающую центр ямки (сетчатки); иметь тип поражения, который с использованием ангиографии с применением флуоресцеина и фотографирования глазного дна был оценен как минимальная классическая или неклассическая хориоидальная неоваскуляризация неизвестного происхождения; иметь максимальный размер поражения на площади 12 дисков оптического нерва (площадь 1 диска оптического нерва эквивалента 2,54 мм2 из расчета диаметра 1 диска оптического нерва 1,8 мм) с неоваскуляризацией, составляющей 50% поражения в целом или более; и иметь предполагаемое недавнее прогрессирование заболевания, что подтверждено наблюдаемой кровью, недавней потерей зрения или недавним увеличением самого большого линейного диаметра поражения на 10% или более. Нет никаких критериев невключения в отношении предсуществующих сердечно-сосудистых, цереброваскулярных состояний или состояний периферических сосудов.
Первое исследование.
От пятидесяти до 500 пациентов (50-500 глаз) с АМО принимают участие в данном исследовании во многих центрах. Подходящих пациентов произвольным образом разделяют в соотношении 1:1:1 для получения гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина в дозе от примерно 0,25 мг до 2,5 мг или инъекции плацебо ежемесячно (в интервале от 23 до 37 дней) в течение 2 лет (24 инъекции) в один глаз. Врач, проводящий количественное сравнение, не осведомлен о распределении пациента в группу лечения; врач, который вводит инъекцию, осведомлен о распределении пациента в группу лечения гуманизированным/деиммунизированным антителом против эндоглина или группу лечения плацебо, но не осведомлен о дозе гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина. Другие работники каждого исследовательского центра (за исключением тех, которые принимают участие в инъекциях), пациенты и персонал главного центра регистрации данных не осведомлены о распределении пациента в группу лечения. Предусматривается терапевтическое вмешательство (например, фотодинамическая терапия с применением вертепорфина), если хориоидальная неоваскуляризация в исследуемом глазу становится преимущественно классического типа.
В качестве первого этапа лечения пациентам следует пройти полное обследование глаз для установления исходного уровня здоровья глаз. Обследование глаз включает обратную офтальмоскопию, биомикроскопию глаза при помощи щелевой лампы, периферическое обследование сетчатки, измерения
- 88 025174 внутриглазного давления, симптоматику остроты зрения (без коррекции и с наилучшей коррекцией), фотографирование глазного дна, ангиографию с использованием флуоресцеина, оптическую когерентную томографию, электроретинографию и измерения в А-режиме.
После проведения предварительного обследования осуществляют описанную выше инъекцию в стекловидное тело в поврежденный глаз пациента с проявлением АМЭ. Если повреждены оба глаза, их можно лечить по отдельности. В глаз, подлежащий лечению, инъецируют глазной раствор.
После лечения необходимо провести обследование глаз пациентов в первые (1), вторые (2), седьмые (7), пятнадцатые (15), тридцатые (30) и шестидесятые (60) сутки и затем ежемесячно в течение 2 лет. В связи с возможностью рецидива в дальнейшем пациенты должны проходить ежемесячные периодические обследования. В каждый день обследования у пациента проводят мониторинг разжижения стекловидного тела. Кроме того у пациентов проводят мониторинг задних отслоений стекловидного тела, используя обратную офтальмоскопию с придавливанием склеры. Наконец, проводят непрерывный мониторинг степени АМО у пациентов путем периодических обследований сетчатки, оптической когерентной томографии и получения ангиограмм с использованием флуоресцеина для мониторинга присутствия субретинальной жидкости, крови, экссудатов, отслоения КРЕ, кистозных изменений сетчатки или наличия серовато-зеленой субретинальной неоваскулярной мембраны. Может потребоваться дополнительное лечение, если наблюдаются признаки повторной неоваскуляризации. Дополнительные виды лечения можно осуществлять еженедельно или ежемесячно. В предпочтительном воплощении последующие виды лечения выполняют после начального лечения через 1-6 месяцев.
Анализы эффективности проводят с учетом всех пациентов, начавших проходить лечение с использованием метода переноса данных последнего наблюдения для недостающих данных. Для всех парных сравнений выполняют корректировку статистической модели к базовой оценке остроты зрения (< 55 букв против > 55 букв) и подтипу хориоидальной неоваскуляризации (минимальное класическое заболевание против неклассического заболевания неизвестного происхождения). Сравнения между группами для дихотомических конечных точек выполняют с использованием критерия хи-квадрата Кокрена. Отклонение от базовой остроты зрения анализируют, используя модели дисперсионного анализа. Для оценки признаков поражения в конечных точках используют модели дисперсионного анализа, скорректированные к базовой величине. Для корректировки двух парных сравнений лечений в первичной конечной точке используют метод множественного сравнения Хохберга-Бонферрони. В анализы безопасности включают всех подвергаемых лечению пациентов.
Второе исследование.
Пациентов с проявлениями возрастной дегенерации желтого пятна лечат согласно первому исследованию (см. выше) инъекцией в стекловидное тело (1) только гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина, (2) только ранибизумаба, (3) гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина в комбинации с ранибизумабом в составе одной и той же композиции или разных композиций, либо (4) контрольного антитела для уменьшения или предупреждения развития неоваскуляризации, макулярного заболевания и повреждения сетчатки.
Заключение.
Гуманизированные/деиммунизированные антитела против эндоглина будут представлять собой хорошо переносимую терапию для пациентов с АМО. Это клиническое исследование демонстрирует, что терапия гуманизированными/деиммунизированными антителами против эндоглина имеет потенциал для поддержания или улучшения остроты зрения с наилучшей коррекцией и уменьшения хориоидальной неоваскуляризации у пациентов с АМЭ. Кроме того, гуманизированные/деиммунизированные антитела против эндоглина будут демонстрировать превосходную активность по сравнению с ранибизумабом и комбинацией гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина и терапии ранибизумабом и будут демонстрировать повышенную активность по сравнению только с одним из двух антител.
Пример 25. Системное токсикологическое исследование на яванских макаках.
В системном токсикологическом исследовании гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина используют яванских макак.
Кратко, макакам один раз в неделю в течение трех недель вводят гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина в количестве 10,0, 30,0 или 100,0 мг/кг. Животным, получающим плацебо, в том же режиме вводят соответствующий раствор, не содержащий антитела. Дозы вводят в виде внутривенного болюса в течение 30-60 мин и для каждого уровня доз используют по меньшей мере шесть животных. Токсикологическое действие оценивают по одному или более чем одному из следующих показателей: измерения массы тела, измерения основных физиологических и клинических показателей, периодический биохимический анализ сыворотки, гематологические оценки и гистопатологические оценки.
Пример 26. Системное токсикологическое исследование в комбинации с бевацизумабом на яванских макаках.
В системном токсикологическом исследовании гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина в комбинации с ранибизумабом (ЬИСЕкПЗ®) используют яванских макак.
- 89 025174
Кратко, макакам один раз в неделю в течение трех недель вводят гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина в количестве 10,0, 30,0 или 100,0 мг/кг в комбинации с бевацизумабом в количестве примерно от 10 до 100 мг/кг. Другие животные получают либо только гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина, либо бевацизумаб. Животным, получающим плацебо, в том же режиме вводят соответствующий раствор, не содержащий антитела. Дозы вводят в виде внутривенного болюса в течение 30-60 мин и для каждого уровня доз используют по меньшей мере шесть животных. Токсикологическое действие оценивают по одному или более чем одному из следующих показателей: измерения массы тела, измерения основных физиологических и клинических показателей, периодический биохимический анализ сыворотки, гематологические оценки и гистопатологические оценки.
Пример 27. Регионарное токсикологическое исследование на яванских макаках.
В регионарном токсикологическом исследовании гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина используют яванских макак.
Кратко, макакам один раз в неделю в течение шести недель посредством инъекции в стекловидное тело вводят 0,25; 1,25 и 2,5 мг гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина. Животным, получающим плацебо, вводят в том же режиме соответствующий раствор, не содержащий антитела. Дозы вводят в виде инъекций в стекловидное тело и для каждого уровня доз используют по меньшей мере шесть животных. Токсикологическое действие оценивают по одному или более чем одному из следующих показателей: измерения массы тела, измерения основных физиологических и клинических показателей, периодический биохимический анализ сыворотки, гематологические оценки и гистопатологические оценки.
Комбинированное регионарное токсикологическое исследование.
В токсикологическом исследовании гуманизированных/деиммунизированных антител против эндоглина в комбинации с ранибизумабом (^υСЕNΤIБ®), вводимых посредством инъекции в стекловидное тело, используют яванских макак.
Кратко, макакам один раз в неделю в течение шести недель посредством инъекции в стекловидное тело вводят 0,25; 1,25 и 2,5 мг гуманизированного/деиммунизированного антитела против эндоглина и 0,5 мг ранибизумаба (ЬИСЕКПБ®). Другие животные получают только любое из антител в той же дозе и том же режиме. Животным, получающим плацебо, вводят в том же режиме соответствующий раствор, не содержащий антитела. Дозы вводят в виде инъекций в стекловидное тело и для каждого уровня доз используют по меньшей мере шесть животных. Токсикологическое действие оценивают по одному или более чем одному из следующих показателей: измерения массы тела, измерения основных физиологических клинических показателей, периодический биохимический анализ сыворотки, гематологические оценки и гистопатологические оценки.
Пример 28. Анализы прорастания.
Ангиогенез можно тестировать ш νίΙΐΌ в трехмерной модели прорастания. НИУЕС выделяют из пуповин и выращивают в М199 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (РВБ) (ОШС0, СагкЪай, С-А) и ростовой добавкой для эндотелиальных клеток (ЕСОБ) (ВО Вюзшепсез, ВейГогй, МА), при 3°С и 5% С02. Во всех экспериментах используют 2-4-й пассажи НИУЕС (пассаж 0 (Р0) является первичной культурой). Легочные фибробласты (ЬР) выращивают традиционным способом в ОМЕМ (ОШС0, Саг1зЪай, СА) с добавлением 10% РВБ при 37°С и 5% СО2, и используют пассажи между Р10 и Р15. Также можно использовать другие линии фибробластов, которые можно получить из АТСС (Американская коллекция типовых культур).
Получение клеток.
НИУЕС и фибробласты выращивают в М199/10% РВБ/Реп-Бйер (пенициллин + стрептомицин) (1:100) в течение 1-2 суток, затем гранулируют. В случае НИУЕС среду заменяют на ЕОМ-2 (среда-2 для выращивания эндотелиальных клеток) (С1опейс8, ^а1кег8уШе, МО) за сутки до гранулирования. В случае фибробластов среду заменяют на ЕОМ-2 за сутки до включения. Для гранулирования требуется приблизительно 400 НИУЕС на гранулу. Фибробласты используют в количестве 20000 клеток на лунку для 24-луночного планшета. Также можно использовать девяносто шестилуночные планшеты с соответственно пересчитанными количествами.
Подготовка гранул цитодекса 3.
В данном анализе можно использовать, например, гранулы микроносителя цитодекса 3 (Атегзкагп Ркагташа Вю1еск РксаИтау, N1).
Сухие гранулы (0,5 г) гидратируют и оставляют набухать в 50 мл РВБ (рН 7,4) в течение по меньшей мере 3 ч при комнатной температуре (КТ) в 50-мл пробирке, помещая ее на шейкер.
Гранулам дают возможность осесть (примерно 15 мин). Супернатант отбрасывают и гранулы промывают в течение нескольких минут в свежем РВБ (50 мл).
Промывки РВБ отбрасывают и заменяют свежим РВБ.
Суспензию гранул помещают в силиконизированную стеклянную бутылку (например, от \Утй8Ые1й \У1рег или Б|дгпасо1е). Гранулы стерилизуют автоклавированием в течение 15 мин при 115°С и за- 90 025174 тем хранят при 4°С.
Реагенты.
Раствор фибриногена.
Раствор фибриногена готовят путем растворения 2 мг/мл фибриногена в ИРВ§ в водяной бане при 37°С. Затем раствор перемешивают путем переворачивания пробирки, а не встряхивания. Процентное содержание коагулируемого белка может быть определено и соответственно скорректировано. Затем раствор пропускают через 0,22 мкм фильтр для стерилизации.
Апротинин.
Лиофилизированный апротинин можно восстановить в ΌΙ (деионизованной) воде в концентрации 4 ед./мл и подвергнуть стерилизующей фильтрации. Отбирают аликвоты объемом 1 мл каждая и хранят их при -20°С.
Тромбин.
Тромбин восстанавливают в стерильной воде в концентрации 50 ед./мл. Отбирают аликвоты по 0,5 мл и хранят их при -20°С.
Нанесение НИУЕС на гранулы (сутки 1).
Клетки НИУЕС трипсинизируют. Гранулам дают отстояться (не центрифугируют), супернатант удаляют посредством аспирации и гранулы быстро промывают 1 мл теплой среды ЕСМ-2. Гранулы (2500) смешивают с 1 х 106 НИУЕС в 1,5 мл теплой среды ЕСМ-2 в пробирке для РАС§ (активированная флуоресценцией сортировка клеток) и вертикально размещают в инкубаторе. (Этого количества будет достаточно для приблизительно 10 лунок; при необходимости можно провести масштабирование).
Смесь инкубируют в течение 4 ч при 37°С, переворачивая пробирку и перемешивая ее содержимое каждые 20 мин (гранулы после нанесения на них покрытия должны выглядеть как мини-мячи для гольфа, что указывает на образование покрытия, достаточного для прорастания).
Через 4 ч гранулы с нанесенным покрытием переносят во флакон для культивирования тканей Т25 (Ра1соп, ВейГогй, МА) и инкубируют в течение ночи в 5 мл среды ЕСМ-2 при 37°С и 5% С02.
Погружение гранул с нанесенным покрытием в фибриновый гель (сутки 0).
Готовят раствор фибриногена (2,0 мг/мл), как описано выше, и к раствору фибриногена добавляют 0,15 единиц/мл апротинина.
Гранулы с нанесенным покрытием переносят в 15 мл коническую пробирку и гранулам дают отстояться.
Гранулы ресуспендируют в 1 мл среды ЕСМ-2 и переносят в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Гранулы три раза промывают 1 мл среды ЕСМ-2, перемешивают посредством медленного пипетирования вверх/вниз с помощью пипетки Р1000. Гранулы подсчитывают на покровном стекле и ресуспендируют в растворе фибриногена в концентрации 500 гранул/мл.
В каждую лунку 24-луночного планшета добавляют тромбин (0,625 единиц/мл). В каждую лунку добавляют суспензию фибриногена/гранул (0,5 мл), меняя наконечник пипетки для каждой лунки.
Тромбин и фибриноген/гранулы перемешивают посредством аккуратного пипетирования вверх/вниз примерно четыре-пять раз; следует избегать образования пузырьков в фибриновом геле. Контрольные образцы либо обрабатывают в отсутствие антител, либо одним или более контрольными антителами. Тестируемые образцы обрабатывают только антителами против эндоглина, только антителами против УЕСР или их комбинацией. Могут быть протестированы многочисленные концентрации агентов. Раствор фибриногена/гранул оставляют для образования сгустка на 5 мин при комнатной температуре и затем на 15 мин при 37°С/5% С02. Важно не двигать планшет в течение первых 5 мин образования сгустка, чтобы свести к минимуму деформацию фибрина, в результате которой может ухудшиться прорастание.
В каждую лунку по каплям добавляют ЕСМ-2 (1 мл). Легочные фибробласты высевают поверх сгустка в концентрации 20000 клеток/лунка. Следует заменять культуральную среду на свежую среду ЕСМ2 один раз в двое суток до тех пор, пока не будет достигнут желаемый рост.
Когда фибриновый гель сформируется, в геле могут присутствовать крошечные пузырьки; они исчезнут в течение 3-4 суток. Прорастание должно быть заметно между 2-ми и 4-ми сутками. Образование просвета начинается примерно на 4-5-е сутки, и отростки продолжают удлиняться. Вновь образованные трубочки начинают разветвляться примерно на 4-6-е сутки. На 6-7-е сутки эти подобные микрососудам структуры начинают соединяться (анастомоз) с прилегающими трубочками; увеличение числа гранул на одну лунку будет приводить к более раннему началу анастомоза. Глубину прорастания измеряют стандартными методами.
Пример 29. Иммуноцитохимический анализ ангиогенных отростков ш уПго.
Для окрашивания ядер эндотелиальных клеток (ЕС) фибриновые гели дважды промывают 1х РВ§ и затем фиксируют в течение ночи в 2%-ном параформальдегиде. После двух дополнительных промывок с использованием 1хРВ§ гели далее окрашивают 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (ИАИ) (§1§та, §!. Ьошк, МО).
Для иммуноокрашивания сначала удаляют легочные фибробласты (ЬР) посредством непродолжи- 91 025174 тельной обработки гелей 10Х трипсином. Переваривание останавливают сывороткой, как только все фибробласты удалены. Затем гели энергично промывают НВ 88 (сбалансированный солевой раствор Хенкса) 1Х (СеИдго, Негпйоп, νΆ). Затем культуры фиксируют в течение 10 мин в 10%-ном формалине и пермеабилизируют 0,5%-ным тритоном Х-100 в течение 5 мин. Неспецифическое связывание блокируют раствором 5%-ного БСА в РВ8 в течение 2 ч.
Первичные антитела используют в разведении 1/100 в блокирующем буфере и инкубируют в течение ночи при 4°С. После энергичной промывки связавшееся антитело детектируют, используя видоспецифичные конъюгированные с А1еха Р1иог 488 или А1еха Р1иог 568 вторичные антитела в разведении 1/1000 (Мо1еси1аг РгоЬек, Саг1кЬай, СА). В качестве контроля используют изотип-специфичные несвязывающие антитела. Если имеется сильный фоновый сигнал, концентрацию первичного и вторичного антитела можно уменьшить и, если необходимо, можно увеличить продолжительность инкубации и/или промывки. Р-актин окрашивают с помощью ТЫТС (тетраметилродамин-изотиоцианат)-фаллоидина (81дша, 8ΐ. Ьошк, МО) в концентрации 0,2 мкМ.
Фазово-контрастные и флуоресцентные изображения получают на микроскопе Κ70 01утрик, соединенном с цифровой камерой. Набор Ζ-серин флуоресцентных изображений получают на двухфотонном микроскопе Саг1 Ζе^кк Мкгошадшд Ь8М 510 Ме1а и компилируют в трехмерные изображения с использованием программного обеспечения Ме1атогрй Шшусгкй Бпадтд Согрогайоп, ОотетпдЮ^п РА). Таким образом, можно легко обнаружить экспрессию различных маркеров.
Для создания 30-изображений сосудов могут быть получены наборы флуоресцентных оптических изображений вдоль ζ-оси в культурах. Ядра окрашивают ЭАР! (зеленый), а стенки сосудов окрашивают на виментин (оранжевый). Ясно видны широкие полые просветы, окруженные одним слоем эндотелиальных клеток. Эти изображения подтверждают, что просветы, присутствующие в анализе ш уйго, являются межклеточными, а не внутриклеточными щелями, как это часто наблюдается в анализах с использованием матригеля. Кроме того, можно подтвердить, что Ни'УЬС являются поляризованными, так как они содержат апикальную мембрану, обращенную в сторону просвета, и базальную мембрану, смыкающуюся с богатой коллагеном IV основной мембраной и фибриновым гелем.
Пример 30. Подавление хориоидальной неоваскуляризации у яванских макак.
Влияние композиций, описанных в данной заявке, на индуцированную лазером хориоидальную неоваскуляризацию также оценивают на взрослых яванских макаках.
В данном эксперименте посредством внутривенной инъекции или инъекции в стекловидное тело вводят (1) только гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина, (2) только антитело против VΡСΡ, (3) гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина в комбинации с антителом против VΡСΡ в составе одной и той же композиции или разных композиций, либо (4) контрольное антитело. Каждое животное получает девять или десять лазерных ожогов в сетчатке каждого глаза, и развитие активных повреждений, связанных с хориоидальной неоваскуляризацией, оценивают посредством флуоресцентной ангиографии один раз перед началом обработки и через 15, 20 и 29 суток после обработки лазером. Композиции вводят внутривенно один раз в неделю, начиная за одну неделю до повреждения лазером. Инъекции в стекловидное тело выполняют один раз каждые две недели, начиная за одну неделю до обработки лазером, или один раз через две недели после обработки лазером, когда активные СNV-повреждения уже сформированы. Контрольным животным делают один раз в неделю внутривенные инъекции или один раз в две недели инъекции в стекловидное тело плацебо, начиная за одну неделю до обработки лазером.
СNV-повреждения визуализируют с использованием флуоресцентной ангиографии и классифицируют согласно стандартным процедурам.
Пример 31. Ингибирование индуцированной повреждением роговичной неоваскуляризации.
Роговичную неоваскуляризацию индуцируют у самцов мышей С57ВБ/6 посредством интрастромального наложения 3 швов из нейлоновых нитей или посредством химического повреждения (№ЮН) и механической обработки эпителия роговицы. Проводят многочисленные эксперименты, в которых вводят внутрибрюшинно один раз или в различные моменты времени непосредственно до или после повреждения (1) только гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина, (2) только антитело против VΡСΡ, (3) гуманизированное/деиммунизированное антитело против эндоглина в комбинации только с антителом против VΡСΡ в составе одной и той же композиции или разных композиций, либо (4) контрольное антитело.
Рост новых сосудов в роговице оценивают с использованием микроскопии при помощи щелевой лампы и гистологического анализа. Сосудистую сеть метят специфичным к эндотелиальным клеткам лектином, конъюгированным с флуоресцеином, и неоваскуляризацию оценивают по плоским гистологическим срезам, а также по поперечным срезам роговицы, используя иммуногистохимический анализ с использованием РЕСАМ (молекулы адгезии эндотелиальных клеток и тромбоцитов). Наличие отека роговицы оценивают, используя микроскопию при помощи щелевой лампы, а толщину роговицы измеряют на поперечных срезах; увеличение толщины роговицы является отражением величины отека. Количество полиморфноядерных лейкоцитов (РМК) и макрофагов определяют путем окрашивания поперечных срезов при помощи НЕМА-3 или моноклонального антитела крысы против Р4/80 мыши соответственно.
- 92 025174
Пример 32. Идентификация Т-клеточных эпитопов в гуманизированных антителах против эндоглина.
Последовательности гуманизированных вариабельных областей тестировали в Поре'™-анализе. Последовательности гуманизированных вариабельных областей разделяли на перекрывающиеся 9-15мерные пептиды. Эти последовательности вариабельных областей анализировали в отношении промискуитентного высокоаффинного связывания с МНС класса ΙΙ человека (потенциальные Т-клеточные эпитопы), используя Поре™, аналитический метод ίη кШсо, посредством которого определяют аффинность пептидов к МНС класса ΙΙ с применением компьютерного анализа. Последовательности с наименьшей частотой встречаемости потенциальных Т-клеточных эпитопов по результатам ^Τоре™-анализа идентифицируют в качестве главных для создания гуманизированного антитела. Отобранные последовательности гуманизированных вариабельных областей можно реконструировать посредством введения мутаций для удаления потенциальных Т-клеточных эпитопов. С использованием Поре™ планируют мутации для уменьшения или устранения связывания с МНС класса ΙΙ. Альтернативно, в последовательностях зародышевой линии человека можно выполнить замены в сайтах потенциальных Т-клеточных эпитопов или замены можно выполнить в альтернативных последовательностях.
На фиг. 19-23 представлено прогнозируемое связывание 9-мерных пептидов гуманизированного антитела против эндоглина, содержащего НиУК_\'0 легкой цепи и НиУН_\'0 тяжелой цепи, указанные на фиг. 4.
Пример 33. Конструирование гуманизированных/деиммунизированных антител против СЭ105.
В этом примере описывается конструирование терапевтических моноклональных гуманизированных-деиммунизированных антител, направленных на СЭ105 человека, которые демонстрируют сниженную иммуногенность.
Промискуитентные последовательности, связывающиеся с высокой аффинностью с МНС класса ΙΙ, идентифицированные с использованием Поре™ (см. пример 31), далее анализировали посредством Поре™ для идентификации аминокислотных замен в ключевых положениях кармана в МНС класса ΙΙ, которые приводили бы к уменьшению или устранению связывания пептидов с МНС класса ΙΙ. Поскольку все эти последовательности перекрывали СЭК, внимание было также уделено расположению данных изменений в СЭК (потенциальных антиген-контактирующих остатков) и физико-химическим характеристикам исходных и заменяющих аминокислот. Контактирующие с ТСК остатки и остатки за пределами основного связывающего желобка, вовлеченные в стабилизацию взаимодействий пептид/МНС класса ΙΙТСК, также рассматривались в отношении замены.
9-мерный пептид в УНУ1, целиком лежащий в пределах СЭК2 и начинающийся с остатка 51, был идентифицирован в качестве промискуитентного, связывающегося с высокой аффинностью с МНС класса ΙΙ. Наиболее успешным способом устранения связывания с МНС класса ΙΙ является выбор в качестве мишени первой аминокислоты этого 9-мера (положение 1 кармана или р1), где удаление гидрофобной боковой цепи или замена на гидрофильную боковую цепь устраняет связывание с МНС класса ΙΙ. Однако этот тип замены аминокислотного радикала не всегда может быть успешным в плане сохранения аффинности антитела, поэтому также оцениваются вторичные положения в кармане (р4, р6, р7 или р9), по отдельности или в комбинации. Поре™-анализ показал, что направленное воздействие на положение р4 в этом пептиде путем замены К52Ъ на О или К прогнозируемо будет значительно уменьшать связывание с МНС класса ΙΙ, в то время как замена 151 в р1 на А прогнозируемо будет полностью устранять связывание (табл. 5).
Таблица 5
Анализ с использованием Поре™ влияния замен на иммуногенный участок УНУ1
Последовательность ыуевтвекАзннАТ
ИУеБТВВОАЗНКАТ
ИУОЕТВаНАЗННАТ
ЫУСЕАКаКАаЫЕАТ
δ □ Ес а □ Её δ Её а Её о □ Её а □ Её а □ Её а □ Её о 3 Её ΙΛ э Ш э ш ΙΛ э ш ос ш 3 Её см 3 Её о ЕЕ а δ 3 δ о δ δ о См δ СЧ 5 δ δ 3 δ о δ СЧ δ δ □ δ δ □ δ о □ δ I δ ο □ δ со □ο δ ο 8
X X X 0 X X X X X X X X X X X О X X О X X X О О X X X X X X
I ΙΝΙ II II II II II ΙΝΙ ΙΗΝΙ ΙΠΙΜΙ II II II II II II II 11*11 ||°||°|| || || ||°|| ||°|| |
I II II II II II II II 11*11 II 1141 114141 II II II II II II II II II Н°Н II II II Н°Н II II I
I II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II I
£
Ой
2В в
А о
Коровый 9-мерный пептид подчеркнут в колонке последовательность, а замены выделены жирным шрифтом. Фланкирующие остатки не подчеркнуты. Прогнозируемое связывание каждого корового 9-мерного пептида с каждым из аллелей МНС класса ΙΙ отмечено как О, если балл за связывание составлял 0,55-0,6, и X, если балл за связывание составлял более 0,6. Число аллелей МНС класса ΙΙ, для которых предсказано связывание, показано в колонках общее и высокая аффинность. В табл. 5 описаны §ЕО ГО Ν0 106-109 соответственно в порядке появления.
Кристаллические структуры комплексов антитело/антиген позволяют предположить, что Ι51 в редких случаях может контактировать с антигеном; однако замена радикала Ι на А (замена, разрушающая
- 93 025174 якорное положение р1) в этом положении может влиять на общую конформацию СЭР. Поэтому также учитывали относительно консервативные замены в К52Ь (якорном положении р4), поскольку этот остаток доступен растворителю, но может не контактировать с антигеном. И наконец, также конструировали дополнительные мутации, лежащие вне СЭР (О49 на А или δ), для оценки дестабилизирующего влияния на взаимодействия пептид/МНС класса П/ТСР. В табл. 6 перечислены сконструированные гуманизированные и гуманизированные/деиммунизированные варианты Ун-областей; δΞΟ ГО ΝΌ для соответствующих нуклеотидных и аминокислотных последовательностей указаны рядом с этими конструкциями.
Таблица 6
Название конструкции Исходная последовательность Аминокислотные замены ЗЕО Ю ΝΟ
УН1 νΗνί н/а 42
УН2 УНУ2 н/а 43
νκι νκνι н/а 4
УК2 νκν2 н/а 5
УН1А2 νΗνί 151А 89
УН1С! νΗνί К52ЬО 90
УН1Р1 νΗνί К52ЬП 91
νΗ18 νΗνί 0498 92
νΗ1Α νΗνί Θ49Α 88
νΚ2ΑΑ νκν2 У19А+ Ι43Α 94
νΚ2Α3 νκν2 νΐ9Α + Τ513 95
νΚ28Α νκν2 Т223 + Ι48Α 96
νΚ233 νκν2 Т223 + Т513 97
νΚ1ΑΑ νκνι \/19А+ Ι48Α 93
УК1А5 νκνι νΐ9Α + Τ513 102
УК13А νκνι Τ223 + Ι48Α 103
УК135 νκνι Τ223 + Τ518 100
В УКУ2 и УКУ1 были идентифицированы два промискуитентных пептида, связывающихся с высокой аффинностью с МНС класса II. Первый, с р1 якорем в У19, частично перекрывает СЭРЕ а второй, с р1 якорем в М8, перекрывает СГОР2. Оба р1 якоря лежат вне СЭР, и на них направленно воздействовали посредством мутации на А, что может полностью устранить связывание с МНС класса II (табл. 7). Однако оба этих остатка могут быть вовлечены в поддержание конформаций СГОР1 и 2; поэтому были сконструированы дополнительные мутации, которые значительно снижали связывание с МНС класса II (табл. 7). В обоих случаях на р4 остатки направленно воздействовали посредством мутации Т на δ. Т22δ также лежит вне СЭР и с меньшей вероятностью влияет на конформацию СЭР, чем У19А. Т51 лежит вне СГОР2; однако данные кристаллических структур антител в комплексе с антигеном позволяют предположить, что этот остаток редко контактирует с антигеном. В табл. 6 перечислены гуманизированные и гуманизированные/деиммунизированные УК-области, которые были сконструированы.
Таблица 7
Анализ влияния замен в иммуногенных участках УКУ2 или УКУ1 с использованием Поре™
Последовательность
РНУГТСВД353У
РВУТ15СРА555У
РВДТТСВД335У
РИШАТАМ! ААРУ
РУУПАЗБМЬАЗСУ
ΡηΑΓΑ/ΑΤ3ΝίΑ30ν
Коровый 9-мерный пептид подчеркнут в колонке последовательность, а замены выделены жирным шрифтом. Фланкирующие остатки не подчеркнуты. Прогнозируемое связывание каждого корового 9-мерного пептида с каждым из аллелей МНС класса II отмечено как О, если балл за связывание составлял 0,55-0,6, и X, если балл за связывание составлял более 0,6. Число аллелей МНС класса II, для которых предсказано связывание, показано в колонках общее и высокая аффинность. В табл. 7 опи- 94 025174 саны δΕΟ ΙΌ ΝΟ 110-115 соответственно в порядке появления.
Пример 34.
В этом примере описывается метод скрининга антител против эндоглина в отношении Т-клеточных эпитопов. Взаимодействие между МНС, полипептидом и Т-клеточным рецептором (ТСК) обеспечивает структурную основу антигенной специфичности Т-клеточного распознавания. В анализах Т-клеточной пролиферации тестируют связывание полипептидов, полученных из антител, с МНС и распознавание комплексов МНС/полипептид с помощью ТСК. Анализы ίη νίίτο Т-клеточной пролиферации в настоящем примере включают стимуляцию мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), содержащих антигенпредставляющие клетки (АРС) и Т-клетки. Стимуляцию проводят ίη νίίτο, используя интактные антитела против эндоглина. Стимулированную Т-клеточную пролиферацию измеряют, используя 3Нтимидин /ШТ^), и присутствие включенного з^ТЬу оценивают путем подсчета импульсов на сцинтилляционном счетчике на отмытых фиксированных клетках.
Все гены гуманизированных и гуманизированных/деиммунизированных νΗ- и νΚ-областей синтезировали, используя серию перекрывающихся олигонуклеотидов, которые отжигали, лигировали и амплифицировали с применением ПЦР, получая полноразмерные синтетические ν-области. Собранные варианты затем клонировали непосредственно в экспрессирующую векторную систему ρΑNΤ от Αиί^ίορе Όίά. для тяжелых цепей и легких каппа-цепей Ιβ01.
Очистка антител.
Антитела против эндоглина очищали из супернатантов культур млекопитающих посредством хроматографии с белком А. Замену буфера и концентрирование белка выполняли, используя ΡΒδ рН 7,4. Антитело против эндоглина далее очищали эксклюзионной хроматографией, используя колонку с сефакрилом δ200 (0Ε ^аЛЬсаю, Αте^8Ьат, υΚ). Собирают основной пик, подвергают стерилизующей фильтрации и демонстрируют присутствие уровня эндотоксинов менее 5 Ευ (эндотоксиновых единиц)/мг, используя Εиάο8аίе-ΡΤδ (СЬаг1е8 ККет, Мат§а1е, υΚ). Очищенные антитела хранят при 4°С. Конечные концентрации определяли по УФ-поглощению, используя рассчитанные коэффициенты молярной экстинкции, где Α280 1,0 соответствует 1,62 мг/мл. Каждое антитело затем разбавляли до 100 мкг/мл в культуральной среде ΑΙΜ ν.
Получение и селекция донорных РВМС.
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяют из лейкоцитарных пленок группы здоровых доноров (из крови, забранной не позднее 24 ч), которую получают из Национальной службы переливания крови Великобритании (υΚ ΝΑηίΐ1 Β1οοά Τ^аи8ίи8^οи δе^ν^се) (больница Альденбрук, Кэмбридж, Великобритания) в соответствии с санкцией, предоставленной местным комитетом по этике исследований в больнице Альденбрук (ΑάάеиЬ^οοке'8 Ηο8ρίΙ;·ι1 Бюс^И Ке8еагсЬ ΕίЬ^с8 Сотп-иНее). ΡΒΜС выделяют из лейкоцитарных пленок центрифугированием в градиенте плотности ΕγιηρΗορίΌρ (Αχΐ88ЫеФ, Оиабее, Шотландия) и СО8+ Т-клетки подвергают истощению, используя СО8+ Кο88еίίеδеρ™ (Ъ1етСе11 ΤесЬиο1ο8^е8, Фс.). Доноров характеризуют путем идентификации гаплотипов ΗΌΑ-ΌΚ, используя набор для типирования тканей на основе ΗΌΑ δδΡ-ΡΟΚ (ПЦР с последовательностьспецифическими праймерами (от англ. 8ециеасе 81оес1Пс ]оптег ΡΟΚ) для ΗΌΑ-типирования) от Β^οίе8ί (Βίο^Ε ^аиά8ίе^ие^8ί^аβе, Дания). Для положительного контроля определяют Т-клеточные ответы на контрольный антиген - гемоцианин лимфы улитки (ΚΌΗ) (Легсе, Κοскίο^ά, ΙΌ, США). Далее РВМС замораживали и хранили в жидком азоте до необходимого момента. При необходимости использования клетки быстро размораживают в водяной бане при 37°С, после чего переносят в 10 мл предварительно нагретой среды ΑΙΜ ν.
Отбирают когорту из 20 доноров для наилучшего представления числа и частоты встречаемости аллотипов ΗΕΑ-ΌΚ, экспрессируемых в мировой популяции. Анализ экспрессируемых в данной когорте аллотипов в сравнении с экспрессируемыми в мировой популяции показал, что охватывается более 80%, и что все главные аллели ΗΕΑ-ΌΚ (индивидуальные аллотипы, экспрессируемые в мировой популяции с частотой более 5%) хорошо представлены. Сводная информация относительно гаплотипов доноров представлена на фиг. 23, и проведено сравнение частоты встречаемости аллотипов доноров, использованных в данном исследовании, с частотой, представленной в мировой популяции.
РВМС от каждого донора оттаивают, подсчитывают и оценивают жизнеспособность. Клетки оживляли и ресуспендировали в культуральной среде ΑΙΜ ν до 4-6х 106 РВМС/мл. Для каждого донора готовили объемные культуры, в которые в 24-луночном планшете добавляли в общей сложности по 1 мл концентрата пролиферирующих клеток. В общей сложности к РВМС добавляли по 1 мл каждого разбавленного тестируемого образца, получая конечную концентрацию 50 мкг/мл для образца антитела. Кроме того, для каждого донора включали положительный контроль (клетки, инкубируемые с ΚΌΗ (100 мкг/мл)) и отрицательный контроль (клетки, инкубируемые только с культуральной средой). Для первых 4 доноров включали дополнительный контроль для тестирования модуляции Т-клеточных ответов под действием тестируемых образцов, где к РВМС добавляли тестируемый образец и ΚΌΗ. Сравнение этих образцов только с ΚΌΗ может быть использовано для оценки влияния тестируемых образцов на пролиферацию. Культуры инкубировали в общей сложности в течение 8 суток при 37°С с 5%-ным углекислым
- 95 025174 газом. На 5-е, 6-е, 7-е и 8-е сутки клетки в каждой лунке осторожно ресуспендировали и в индивидуальные лунки с круглым дном 96-луночного планшета переносили три аликвоты по 100 мкл. Культуры импульсно обрабатывали 1 мкКи 3[н]-Т1у (Регкш Е1тег, Vа1ΐЬат, МА) в 100 мкл культуральной среды
У и инкубировали в течение следующих 18 ч, после чего собирали на фильтровальных подложках, используя клеточный харвестер Мас1 III от ТотТес. Число импульсов в минуту (имп/мин) для каждой лунки определяли методом сцинтилляционных измерений с применением Ме1й1ех™ (Регкш Е1те®г, Vа1ΐйат, Маккасйикейк, И8А) на сцинтилляционном бета-счетчике для микропланшетов (М1сгор1а1е Ве1а СоиШег) (Регкш Е1те®г, Vа1ΐЬат, Маккасйикейк, И8А) в режиме счета РагаЬих с низким фоном.
Результаты выражают в индексах стимуляции, где индекс стимуляции (8^ получают путем деления показателя пролиферации (например, числа импульсов, соответствующих радиоактивности, в минуту), измеренного для тестируемого антитела против эндоглина, на показатель, измеренный в клетках, не контактировавших с тестируемым антителом против эндоглина. Все базовые имп/мин для контрольных лунок превышают минимальный порог для анализа, составляющий 150 имп/мин.
Для анализов пролиферации предварительно устанавливали эмпирический порог индекса стимуляции (8^, равный или превышающий 2 > 2), таким образом образцы, индуцирующие пролиферативные ответы, превышающие этот порог, считаются положительными (если включены, граничные 8I > 1,90 выделены). Проведение расширенных анализов и предварительные исследования показали, что это есть минимальный порог отношения сигнала к шуму, позволяющий получать максимальную чувствительность без детекции большого числа ложноположительных ответов. Положительные ответы определяют, исходя из следующих далее статистических и эмпирических порогов.
1. Статистическая значимость (р<0,05) ответа, полученного путем сравнения имп/мин в тестируемых лунках с контрольными лунками, содержащими среду, рассчитанная для двух образцов с использованием непарного ΐ-критерия Стьюдента.
2. Индекс стимуляции, превышающий 2 > 2), где 8I = среднее значение для тестируемых лунок (имп/мин)/среднее значение для контрольных лунок, содержащих среду (имп/мин).
Помимо этого оценивают вариацию в этом анализе, подсчитывая коэффициент вариации и стандартное отклонение (8Ό) для исходных данных, полученных для дублированных культур.
Результаты анализа пролиферации в зависимости от времени Ер18сгееп с антителами против эндоглина показаны на фиг. 24 и суммированы в табличном виде (табл. 8). Химерное антитело стимулировало ответы у 4 из 20 доноров (20% от исследуемой когорты), и хотя ответы от двух доноров были граничными (1,92 и 1,95 для доноров 11 и 17 соответственно), они значительно отличались от фона (р<0,05). Гуманизированное антитело УК1Ун1 стимулировало ответы у 2 из 20 доноров (10% от исследуемой когорты), включая один граничный ответ (1,91 для донора 20), что значительно отличалось от фона (р<0,05). Стоит отметить, что доноры 11 и 20 отвечали на оба эти антитела, что наводит на мысль о существовании общего Т-клеточного эпитопа. В противоположность этому, ни один из доноров в исследуемой когорте не давал положительного ответа на деиммунизированное антитело против эндоглина УК1ААУн1А2. Результаты с контрольным антигеном КЬн показывают, что наблюдалась хорошая корреляция между положительными и отрицательными результатами, указывающая на высокий уровень воспроизводимости в анализе.
- 96 025174
Таблица 8. Стимуляция Т-клеток как мера иммуногенности, индуцированная культура с антителами против эндоглина и КЬН, где Р* указывает на граничную стимуляцию выше базовой линии и Р указывает на индекс стимуляции, превышающий 2.
Пример 35. Картирование Т-клеточных эпитопов с использованием Ер1§сгееп™.
Ер1§сгееп™ представляет собой технологию ех νί\Ό для измерения Т-клеточных эпитопов в целых антителах или для картирования расположения последовательностей таких Т-клеточных эпитопов, как описано более подробно ниже.
Селекция доноров с использованием Ер1§сгееп.
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяют из лейкоцитарных пленок группы здоровых доноров (из крови, забранной не позднее 24 ч), которую получают из Национальной службы переливания крови Великобритании (больница Альденбрук, Кэмбридж, Великобритания) в соответствии с санкцией, предоставленной местным комитетом по этике исследований в больнице Альденбрук. РВМС выделяют из лейкоцитарных пленок центрифугированием в градиенте плотности Ьутрйоргер (Ах1к-кЫе1й, Оипйее, Шотландия) и СЭ8+ Т-клетки подвергают истощению, используя СЭ8+ Роккейе8ер™ (81етСе11 Тесйпо1од1ек, 1пс.). Доноров характеризуют путем идентификации гаплотипов НЬА-ОР, используя набор для типирования тканей на основе НЬА 88Р-РСР от Вю!ек! (Вю!екГ ЬапййешегкйаЗе, Дания). Кроме того, для положительного контроля определяют Т-клеточные ответы на контрольный антиген - гемоцианин лимфы улитки (КЬН) (Р1егсе, РоскГогй, 1Ь, США). Отбирают когорту из 54 доноров для наилучшего представления числа и частоты встречаемости аллотипов НЬА-ЭР, экспрессируемых в мировой популяции. Анализ экспрессируемых в данной когорте аллотипов в сравнении с экспрессируемыми в мировой популяции показал, что охватывается более 80%, и что все главные аллели НЬА-ЭР (индивидуальные аллотипы, экспрессируемые в мировой популяции с частотой более 5%) хорошо представлены. Представлена сводная информация относительно гаплотипов доноров и проведено сравнение частоты встречаемости аллотипов доноров, использованных в данном исследовании, с частотой, представленной в мировой популяции.
Особенности доноров и гаплотипы.
Ответы доноров (δΙ) на КЬН тестируют в двух независимых экспериментах. Тест 1 проводят на свежевыделенных РВМС, и антитело повторно тестируют в текущем исследовании. Ответы, не давшие в обоих тестах одинакового результата (т.е. положительного или отрицательного), выделены. Доноры с очень низкой базовой величиной имп/мин (менее 150 имп/мин) исключаются из анализа.
Ер1§сгееп-анализ: анализы пролиферации.
Ер1§сгееп™ используют для тестирования перекрывающихся пептидов, происходящих из последовательности химерных, гуманизированных и гуманизированных/деиммунизированных антител. Конструируют перекрывающиеся пептиды. Синтезируют серию из 128х 15-мерных пептидов, перекрывающихся по 12 аминокислотам, вместе с 1х 14-мерным и 1x11 мерным пептидами и используют для стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), происходящих из когорты от 51 здорового донора, применяя картирование Т-клеточных эпитопов с использованием Ер1§сгееп™. Индивидуальные пептиды тестируют в дублированных культурах и для идентификации точного расположения эпитопов оценивают ответы, используя анализы Т-клеточной пролиферации. РВМС от каждого донора оттаивают, подсчитывают и оценивают жизнеспособность. Клетки оживляют в культуральной среде А1М У (Ιιινί!годеп, Саг1кЪай, СаПГопиа) при комнатной температуре, после чего плотность клеток подводят до 2,5х106 РВМС/мл (концентрат пролиферирующих клеток). Пептиды растворяют в ЭМ5О (§1§та-А1йг1сй, δΐ. Ьошк, МО, И8А) в конечной концентрации 10 мМ. Далее готовят концентраты пептидов в культуре посредством разбавления в культуральной среде А1М У до конечной концентрации 5 мкМ. Для каждого пептида и каждого донора готовят шесть копий культур, добавляя по 100 мкл концентратов пептидов к 100 мкл концентрата пролиферирующих клеток в 96-луночном планшете с плоским дном. Также в виде шести копий готовят культуры и для положительного, и для отрицательного контроля. В общей сложности используют 9х96-луночных планшетов для каждого донора, и каждый планшет годится для тестирования 15 пептидов с одним отрицательным контролем (только носитель) в виде шести копий. В конечный планшет добавляют положительный контроль.
Культуры инкубируют в общей сложности 6 суток, затем в каждую лунку добавляют 3[Н]-тимидин (Регкш Е1тег®, Ааййат, Маккасйикейк, И8А) по 0,5 мкКи. Культуры инкубируют в течение следующих 18 ч, после чего собирают на фильтровальных подложках, используя клеточный харвестер Масй III от ТотТес. Число импульсов в 1 мин (имп/мин) для каждой лунки определяют методом сцинтилляционных измерений с применением Меййех™ (Регкш Е1тег®, Ааййат, Маккасйикейк, И8А) на сцинтилляционном бета-счетчике для микропланшет (Регкш Е1тег®, Ааййат, Маккасйикейк, И8А) в режиме счета РагаЬих с низким фоном.
Для анализов пролиферации предварительно устанавливали эмпирический порог индекса стимуляции (δΙ), равный или превышающий 2 (δΙ > 2), таким образом образцы, индуцирующие пролиферативные ответы, превышающие этот порог, считаются положительными (если включены, граничные δΙ > 1,90 выделены). Проведение расширенных анализов и предварительные исследования показали, что это есть
- 97 025174 минимальный порог отношения сигнала к шуму, позволяющий получать максимальную чувствительность без детекции большого числа ложноположительных ответов. Положительные ответы определяют, исходя из следующих далее статистических и эмпирических порогов.
1. Статистическая значимость (р<0,05) ответа, полученного путем сравнения имп/мин в тестируемых лунках с контрольными лунками, содержащими среду, рассчитанная для двух образцов с использованием непарного !-критерия Стьюдента.
2. Индекс стимуляции, превышающий 2 (δΙ>2), где δΙ = среднее значение в тестируемых лунках (имп/мин)/среднее значение в контрольных лунках, содержащих среду (имп/мин).
Помимо этого оценивают вариацию в этом анализе, подсчитывая коэффициент вариации и стандартное отклонение (δΌ) для исходных данных, полученных для дублированных культур.
Анализы пролиферации проводятся для шести копий культур (нескорректированные данные). Кроме того, для обеспечения низкой вариабельности в анализе данные обрабатывают после исключения максимальных и минимальных значений имп/мин (скорректированные данные) и δΙ ответов доноров сравнивают, используя оба набора данных. С учетом как скорректированного, так и нескорректированного наборов данных получают подробную информацию относительно δΙ доноров. Т-клеточные эпитопы идентифицируют, рассчитывая среднюю частоту встречаемости ответов на все исследуемые пептиды + 2χδΌ (фоновая эффективность ответа). Считается, что любой(ые) пептид(ы), который(е) вызывал пролиферацию выше этого порога, содержит(содержат) Т-клеточный эпитоп.
1Торе™-анализ ш кШсо пептидов.
Последовательности пептидов, дающих положительный результат в анализе пролиферации, анализируют, используя предиктивное программное обеспечение ГГоре™ от Αηί^!ορе. С помощью этого программного обеспечения можно предсказывать благоприятные взаимодействия между боковыми цепями аминокислот пептида и специфическими связывающими карманами в связывающем желобке МНС класса ΙΙ. Расположение ключевых для связывания остатков определяют, создавая 10-мерные пептиды, которые перекрываются на одну аминокислоту, охватывая длинную пептидную последовательность. Каждый 10-мер тестируют, используя базу данных от Αη!^!ορе для аллотипов МНС класса ΙΙ, и оценивают в баллах в зависимости от того, насколько он подходит и взаимодействует с молекулами МНС класса ΙΙ. Считается, что пептиды, получившие высокий балл за связывание в отношении большого числа аллелей, содержат коровый 9-мер.
Идентификация Т-клеточных эпитопов.
Все пептиды, идентифицированные с использованием описанного выше Ερ^δс^ееη™-анализа, успешно синтезируют для тестирования на 51 здоровом доноре (изначально отобраны 54 донора; доноры могут быть исключены из анализа вследствие низкой базовой величины имп/мин, т.е. ниже величины отсечения, составляющей 150 имп/мин). Положительные ответы определяют по донорам, дающим значимый (р<0,05) ответ с δΙ > 2 на любой заданный пептид. Также включены граничные ответы (значимый (р<0,05) ответ с δΙ > 1,90). Сравнивают результаты анализов с нескорректированными и скорректированными данными для того, чтобы убедиться в низкой вариабельности в анализе и в том, что положительные ответы в индивидуальных лунках не являются результатом ложной пролиферации. Результаты каждого анализа показали небольшое различие между способами; и поэтому карту Т-клеточных эпитопов составляют, используя анализ скорректированных данных. С учетом анализов как нескорректированных, так и скорректированных данных получают индексы стимуляции для доноров. Т-клеточные эпитопы идентифицируют, рассчитывая среднюю частоту встречаемости ответов на все исследуемые пептиды в исследовании плюс дважды стандартное отклонение (названное фоновой эффективностью ответа). Считается, что пептиды, индуцирующие пролиферативные ответы выше этого порога, содержат Тклеточный эпитоп.
Тестирование иммуногенности главных вариантов с использованием Ερ^δс^ееη™.
Главные варианты очищают и сравнивают с полипептидом дикого типа, используя Т-клеточные анализы динамики с применением Ερ^δс^ееη™. Из библиотеки доноров, как описано выше, выбирают большое число здоровых доноров, представляющих мировую популяцию в соответствии с экспрессией аллотипов ΗΕΑ. Доноров стимулируют каждым из белков в отдельных объемных культурах, содержащих 2-4х106 РВМС, истощенных по СЭ8' Т-клеткам. Параллельные образцы (Т-лимфобластов) извлекают из объемных культур на 5-8-е сутки и проводят оценку пролиферации вместе с секрецией ГЬ-2 (ЕЬКРОТ (иммуноферментный спот-анализ)). Для дальнейшего подтверждения оценки между диким типом и вариантами, исследуемую когорту дополняют дающими ответ донорами, выявленными в исследовании картирования Т-клеточных эпитопов с использованием Ερ^δс^ееη™ (при условии, что остается достаточное количество РВМС, истощенных по СЭ8' Т-клеткам).
С целью подтверждения потери иммуногенности у главных вариантов, анализ Т-клеточной иммуногенности с использованием Т-клеточных анализов динамики с применением Ερ^δс^ееη™ проводят следующим образом:
(1) лейкоцитарные пленки от здоровых доноров (с охватом аллотипов ЭКВ1 более 80% для мировой популяции) используют для выделения РВМС, которые содержат физиологические уровни АРС и
- 98 025174
СЭ4' Т-клеток;
(2) каждого донора тестируют против положительных контрольных антигенов, включая гемоцианин лимфы улитки (сильнодействующий неоантиген);
(3) СЭ8' Т-клетки подвергают истощению для исключения детекции связанных с Т-клетками ответов на МНС класса Ι;
(4) главные варианты и полипептиды дикого типа сравнивают друг с другом для оценки относительной способности активировать Т-клетки СЭ4' Т-клетки;
(5) данные анализируют, используя предварительно подтвержденные параметры анализа с положительными ответами с δΙ > 2, подтвержденными дополнительной информацией, включающей статистический анализ и анализ частоты встречаемости;
(6) данные Т-клеточных анализов динамики с применением Вр^δс^ееη™ дают информацию о величине и кинетике Т-клеточных ответов на индивидуальные молекулы;
(7) все оставшиеся РВМС от доноров, дающих положительные ответы, архивируют, и они будут доступны для применения в повторных тестовых исследованиях; и (8) дается оценка связи между аллотипом доноров и ответами на полипептид дикого типа и любыми ответами на главные варианты.
Аспекты данного изобретения могут быть реализованы в других формах или выполнены иным образом без отклонения от их сущности или существенных признаков. Поэтому настоящее описание следует рассматривать во всех проиллюстрированных и неограничивающих аспектах, и подразумевается, что все изменения, которые подпадают под значение и диапазон эквивалентности, включены в данное описание.
Пример 36. Перекрестная реактивность антител против эндоглина.
Была продемонстрирована перекрестная реактивность антител против эндоглина с эндотелиальными клетками человека и мыши (Μаΐ8иηο и др., 1999). Гуманизированные/деиммунизированные антитела против эндоглина тестируют в отношении их способности связываться с эндотелием человека и мыши, используя радиоиммуноанализ (ΚΙΑ) в соответствии с методом Иаги1а и др., 1986. Кратко, очищенные антитела против эндоглина индивидуально метят радиоактивным 125Ι, используя йбо-Оеп и в соответствии со стандартными методами, известными специалистам в данной области. Меченные радиоактивной меткой гуманизированные/деиммунизированные антитела против эндоглина анализируют в отношении среднего содержания атомов йода на молекулу ^О. Сравнивают число импульсов в минуту, тестируя антитела против эндоглина и подходящий по изотипу контрольный ^О на культурах эндотелиальных клеток человека и мыши. Связывание с субконфлюентными эндотелиальными клетками мыши и человека также можно демонстрировать, используя РИС-меченое антитело против эндоглина, и анализировать с помощью ΡΑСδсаη от Βесΐοη Эюкпъоп для сравнения средней интенсивности флуоресценции в соответствии с методом Μаΐ8иηο и др., 1999. Связывание с эндотелием мыши также может быть продемонстрировано путем получения изображений биораспределения меченного радиоактивной меткой антитела против эндоглина у мышей с сингенными опухолями. Кратко, иммунокомпетентным мышам имплантируют сингенные 4Т1 карциномы молочной железы. Опухолям дают возможность развиться до пальпируемого размера, и животных обрабатывают хелатным комплексом антитела с радиоактивным изотопом, таким как 64Си. Распределение меченого антитела против эндоглина у опухоленесущих мышей ΒΑΕΒ/с согласно авторадиографии или РЕТ-сканированию сравнивают с распределением меченого аналогичным образом контрольного антитела. Поглощение опухолью меченого антитела сравнивают с поглощением в солидных органах и крови.
- 99 025174
Перечень последовательностей <110> ТЕУЭР, ЧАРЛЬЗ <120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЭНДОГЛИНА <130> 35882-706.202 <14 0>
<141>
<150> 12/570918 <151> 2009-09-30 <150> 61/247290 <151> 2009-09-30 <160> 118 <170> РаЬепЫп уегзЬоп 3.5 <210> 1 <211> 106 <212> ПРТ <213> Миз зр.
<400> 1
СЬп 1 Не УаЬ Ьеи Зег 5 СЬп Зег Рго АЬа Ые 10 Ьеи Зег АЬа Зег Рго 15 СЬу
СЬи Ьуз УаЬ ТЬг МеЬ ТЬг Суз Агд АЬа Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг МеЬ
20 25 30
Ηίδ Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Зег Зег Рго Ьуз Рго Тгр Ые Туг
35 40 45
АЬа ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго УаЬ Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
СЬу Зег СЬу ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Ые Зег Агд Уа1 СЬи АЬа СЬи
65 70 75 80
Азр АЬа АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе СЬу АЬа СЬу ТЬг Ьуз Ьеи СЬи Ьеи Ьуз
100 105 <210> 2 <211> 107 <212> ПРТ
<213> Ното <400> 2 заргепз
Азр 1 Ые СЬп МеЬ ТЬг 5 СЬп Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ 15 СЬу
Азр Агд УаЬ ТЬг 20 Ые ТЬг Суз Агд АЬа 25 Зег СЬп Зег Ые Зег 30 Зег Туг
Ьеи Азп Тгр 35 Туг СЬп СЬп Ьуз Рго 40 СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз 45 Ьеи Ьеи Ые
- 100 025174
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Зег Туг Зег ТЬг Рго Ьеи
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 3
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 3
Азр Не С1п МеЕ ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеЬ 20 25 30
Шз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг 35 40 45
А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег 50 55 60
С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и
70 75 80
Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
90 95
РЬе С1у С1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз 100 105 <210> 4 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 4
Азр 1 11е С1п МеЬ ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 С1у
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеЬ
20 25 30
Шз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр 11е Туг
40 45
- 101 025174
АЬа ТЬг 50 Зег Азп Ьеи АЬа Зег 55 СЬу УаЬ Рго Зег Агд 60 РЬе Зег СЬу Зег
СЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Ые Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи
65 70 75 80
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Ые Ьуз
100 105 <210> 5 <2Ы> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 5
Азр 11е С1п Ьеи ТЬг С1п Зег Рго 1 5
Азр Агд Уа1 ТЬг Ые ТЬг Суз Агд 20
Шз Тгр Туг СЬп С1п Ьуз Рго СЬу 35 40
А1а ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу 50 55
СЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи 65 70
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп 85
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи 100
Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу 10 15
АЬа Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг МеЬ 25 30
Ьуз АЬа Рго Ьуз Рго Тгр Ые Туг 45
УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег 60
ТЬг Ые Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи 75 80
СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг 90 95
Ые Ьуз
105 <210> 6 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 6
Азр Ые СЬп МеЬ ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу 15 10 15
Азр Агд УаЬ ТЬг Ые ТЬг Суз 20 <210> 7 <211> 23
- 102 025174 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 7 Азр 11е 1 С1п Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а 10 Зег Уа1 С1у 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 11е ТЬг Суз
<210> 8 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 8
С1п Не С1п Мей ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз 20 <210> 9 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 9 Азр 11е 1 Уа1 МеЬ ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а 10 Зег Уа1 С1у 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 11е ТЬг Суз
<210> 10 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 10
Азр 11е С1п МеЬ Зег С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз 20
- 103 025174 <210> 11 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 11
Азр Не Уа1 Мер Зег С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз 20 <210> 12 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 12
Азр 11е Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег Уа1 С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз 20 <210> 13 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 13
Азр 11е Уа1 Ьеи Зег С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег Уа1 СЬу 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз 20 <210> 14 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 14
Азр 11е С1п Ьеи Зег С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег Уа1 СЬу 15 10 15
- 104 025174
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз 20 <210> 15 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 15
С1п 11е Уа1 Мей ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз 20 <210> 16 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 16
61п 11е С1п Ьеи ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 СЬу 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз 20 <210> 17 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 17
С1п 11е С1п МеЬ Зег С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег Уа1 С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз 20 <210> 18 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
- 105 025174 <400> 18
С1п Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег Уа1 СЬу 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз 20 <210> 19 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 19
61п 11е С1п Ьеи Зег С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 СЬу 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз 20 <210> 20 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 20
Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго СЬу Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг 15 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 21
Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Рго Тгр Не Туг 15 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 22
- 106 025174
Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Рго Ьеи ЬЬе Туг Ь 5 ЬО 15 <2Ь0> 23 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 23
Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Тгр Не Туг 15 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 24
Тгр РЬе СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Ые Туг 15 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 25
Тгр РЬе СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Рго Ьеи Ые Туг 15 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 26
Тгр РЬе СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Тгр Ые Туг 15 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 107 025174 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 27
Тгр РЬе С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр Не Туг 15 10 15 <210> 28 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 28
С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг 15 10 15
Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 20 25 30 <210> 29 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 29
С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр Туг ТЬг 15 10 15
Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи Θΐη Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 20 25 30 <210> 30 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 30
С1у Уа1 Рго Уа1 Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг 15 10 15
Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 20 25 30 <210> 31 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 108 025174 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: полипептид <400> 31
С1у Уа1 Рго АЬа Агд РЬе Зег СЬу Зег С1у Зег С1у 15 10 синтетический
Ьеи ТЬг Не
Зег Зег 20
Ьеи С1п Рго СЬи Азр РЬе АЬа 25
ТЬг Азр РЬе ТЬг 15
ТЬг Туг Туг Суз 30 <210> 32 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 32
СЬу УаЬ Рго УаЬ Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг 15 10 15
Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз 20 25 30 <210> 33 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 33
СЬу УаЬ Рго АЬа Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг 15 10 15
Ьеи ТЬг ЬЬе Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз 20 25 30 <210> 34 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 34
СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Зег РЬе ТЬг 15 10 15
Ьеи ТЬг ЬЬе Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз 20 25 30
- 109 025174 <210> 35 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 35
РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
10 <210> 36 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 36
РЬе СЬу А1а СЬу ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
10 <210> 37 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 37
РЬе С1у СЬу СЬу ТЬг Ьуз Уа1 С1и Ьеи Ьуз
10 <210> 38 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
РЬе С1у АЬа СЬу ТЬг Ьуз Уа1 С1и Ьеи Ьуз 15 10 <210> 39 <211> 118 <212> ПРТ <213> Миз зр.
<400> 39
С1и Уа1 Ьуз Ьеи СЬи СЬи Зег СЬу С1у СЬу Ьеи Уа1 С1п Рго СЬу СЬу 15 10 15
- 110 025174
Зег МеЬ Ьуз Ьей 20 Зег Суз А1а А1а Зег 25 С1у РЬе ТЬг РЬе Зег 30 Азр А1а
Тгр МеЬ Азр Тгр Уа1 Агд С1п Зег Рго С1и Ьуз С1у Ьей С1и Тгр Уа1
35 40 45
А1а С1и Не Агд Зег Ьуз А1а Зег Азп ΗΪ3 А1а ТЬг Туг Туг А1а С1и
50 55 60
Зег Уа1 Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Зег Зег
65 70 75 80
Уа1 Туг Ьей С1п МеЬ Азп Зег Ьей Агд А1а С1и Азр ТЬг С1у Не Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр С1у С1п С1у ТЬг
100 105 но
ТЬг Ьей ТЬг Уа1 Зег Зег
115 <210> 40 <211> 115 <212> ПРТ
<213> Ното : заргепз
<400> 40
С1и Уа1 С1п Ьей Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьей Уа1 Ьуз Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьей Агд Ьей Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Азп А1а
20 25 30
Тгр МеЬ Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьей С1и Тгр Уа1
35 40 45
ОТ ,7 '-'-Т- 7 Δ 7-7-, X XX- Не Ьуз Зег Т X 70 ти г ΖΧ о гч * СТ ,7 — --7 Οί у ТИ тг ТЬг й О ГТ Т,77д- -и А.1з А1а
50 55 60
Рго Уа1 Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
Ьей Туг Ьей С1п МеЬ Азп Зег Ьей Ьуз ТЬг С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг ТЬг Туг РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьей Уа1 ТЬг
100 105 НО
Уа1 Зег Зег 115 <210> 41 <211> 118 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 41
- 111 025174
С1и УаЬ 1 СЬп Ьеи УаЬ 5 СЬи Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи 10 УаЬ Ьуз Рго СЬу 15 СЬу
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр АЬа
20 25 30
Тгр МеР Азр Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ
35 40 45
СЬу СЬи Ые Агд Зег Ьуз АЬа Зег Азп НЬз АЬа ТЬг Туг Туг АЬа СЬи
50 55 60
Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Ые Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
Ьеи Туг Ьеи СЬп МеР Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг ТЬг Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг
100 105 110
Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
115
<210> 42
<211> 118
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 42 СЬу СЬу СЬу 10 Ьеи УаЬ Ьуз Рго СЬу 15 СЬу
СЬи 1 УаЬ СЬп Ьеи УаЬ 5 СЬи Зег
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр АЬа
20 25 30
Тгр МеР Азр Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ
35 40 45
СЬу СЬи Ые Агд Зег Ьуз АЬа Зег Азп НЬз АЬа ТЬг Туг Туг АЬа СЬи
50 55 60
Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Ые Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
Ьеи Туг Ьеи СЬп МеР Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг
100 105 ыо
Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
115
<210> 43 <211> 118 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
- 112 025174 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 43 УаЬ 5 СЬи Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи УаЬ 10 Ьуз Рго СЬу 15 СЬу
СЬи 1 УаЬ СЬп Ьеи
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр АЬа
20 25 30
Тгр Мер Азр Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ
35 40 45
АЬа СЬи Ые Агд Зег Ьуз АЬа Зег Азп НЬз АЬа ТЬг Туг Туг АЬа СЬи
50 55 60
Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
УаЬ Туг Ьеи СЬп Мер Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг
100 105 110
Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
115
<210> 44
<211> 30
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 44
СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬи Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи УаЬ Ьуз Рго СЬу СЬу 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег 20 25 30 <210> 45 <211> 14 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 45
Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ СЬу 15 10 <210> 46 <211> 14
- 113 025174 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 46
Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго 61у Ьуз С1у Ьеи СЬи Тгр УаЬ АЬа 15 10 <210> 47 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 47
Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи С1п 15 10 15
МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг С1и Азр ТЬг АЬа Уа1 Туг Туг Суз ТЬг ТЬг 20 25 30 <210> 48 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 48
Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг Уа1 Туг Ьеи С1п 15 10 15
МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг Туг Суз ТЬг Агд 20 25 30 <210> 49 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 49
Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг Уа1 Туг Ьеи СЬп 15 10 15
МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг С1и Азр ТЬг АЬа Уа1 Туг Туг Суз ТЬг ТЬг 20 25 30
- 114 025174 <210> 50 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 50
Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Зег ТЬг Ьеи Туг Ьеи СЬп 15 10 15
Мер Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз ТЬг ТЬг 20 25 30 <210> 51 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 51
Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп Агд Ьеи Туг Ьеи СЬп 15 10 15
Мер Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз ТЬг ТЬг 20 25 30 <210> 52 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная послеповательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 52
Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи С1п 15 10 15
МеЬ 11е Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг А1а УаЬ Туг Туг Суз ТЬг ТЬг 20 25 30 <210> 53 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 53
Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи СЬп 15 10 15
- 115 025174
МеЬ Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ые Туг Туг Суз ТЬг ТЬг 20 25 30 <210> 54 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 54
Агд РЬе ТЬг Ые Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи СЬп 15 10 15
МеЬ Агд РЬе ТЬг Ые Зег Агд Азр Азр Зег Ьеи Туг Туг Суз ТЬг ТЬг 20 25 30 <210> 55 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 55
Агд РЬе ТЬг Ые Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи СЬп 15 10 15
МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг Туг Суз ТЬг СЬу 20 25 30 <210> 56 <211> Ы <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 56
Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
10 <210> 57 <211> Ы <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 57
Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг ТЬг УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
10
- 116 025174 <210> 58 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 58
Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег
10 <210> 59 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 59
Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а
10 <210> 60 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 60
Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а
10 <210> 61 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 61
Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Ьеи ТЬг Уа1 Зег А1а
10 <210> 62 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
- 117 025174 <400> 62
Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег 15 10 <210> 63 <211> 10 <212> ПРТ <213> Миз зр.
<400> 63
Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеЪ Шз <210> 64 <211> 7 <212> ПРТ <213> Миз зр.
<400> 64
А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> ПРТ <213> Миз зр.
<400> 65
С1п С1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг 1 5 <210> 66 <211> 5 <212> ПРТ <213> Миз зр.
<400> 66
Азр А1а Тгр МеЪ Азр 1 5 <210> 67 <211> 19 <212> ПРТ <213> Миз зр.
<400> 67
С1и 11е Агд Зег Ьуз А1а Зег Азп Шз А1а ТЬг Туг Туг А1а С1и Зег 15 10 15
Уа1 Ьуз С1у
<210> 68
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Миз зр
<400> 68
- 118 025174
Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег 1 5 <210> 69 <211> 107 <212> ПРТ <213> Ното зартепз
<400> 69
СЬи ЬЬе УаЬ Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго АЬа ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу
1 5 10 15
СЬи Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд АЬа Зег СЬп Зег УаЬ Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп АЬа Рго Агд Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр АЬа Зег Азп Агд АЬа ТЬг СЬу Не Рго АЬа Агд РЬе Зег СЬу
50 55 60
Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи СЬи Рго
65 70 75 80
СЬи Азр РЬе АЬа УаЬ Туг Туг Суз СЬп СЬп Агд Зег Азп Тгр Рго Ьеи
85 90 95
ТЬг РЬе СЬу С1у СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Не Ьуз
100 105
<210> 70
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 70
С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у 15 10 15
СЬи Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Мер 20 25 30
НЬз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго СЬу СЬп АЬа Рго Агд Ьеи Ьеи ЬЬе Туг 35 40 45
АЬа ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу ЬЬе Рго АЬа Агд РЬе Зег С1у Зег 50 55 60
СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи СЬи Рго СЬи
70 75 80
Азр РЬе АЬа УаЬ Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
90 95
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи ЬЬе Ьуз 100 105
- 119 025174 <210> 71 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 71 А1а ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 С1у
С1и 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеЬ
20 25 30
Низ Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Рго Тгр 11е Туг
35 40 45
А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у 11е Рго А1а Агд РЬе Зег С1у Зег
50 55 60
С1у Зег С1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 61и Рго С1и
65 70 75 80
Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 72 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 72
С1и 11е Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у 15 10 15
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеЬ 20 25 30
Ηίδ Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Рго Тгр 11е Туг 35 40 45
А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег С1у Зег 50 55 60
С1у Зег С1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1и Рго С1и
70 75 80
Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
90 95
РЬе С1у С1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз 100 105
- 120 025174 <210> 73 <211> 115 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 73 Ьеи Уа1 5 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи 10 Уа1 С1п Рго С1у С1у 15
С1и 1 Уа1 С1п
Зег Ьеи Ьуз Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а Зег 25 С1у РЬе ТЬг РЬе Зег 30 С1у Зег
А1а Мер Низ 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40 Зег С1у Ьуз С1у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
С1у Агд 50 11е Агд Зег Ьуз А1а 55 Азп Зег Туг А1а ТЬг 60 А1а Туг А1а А1а
Зег 65 Уа1 Ьуз С1у Агд РЬе 70 ТЬг 11е Зег Агд Азр 75 Азр Зег Ьуз Азп ТЬг 80
А1а Туг Ьеи С1п МеЬ 85 Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг 90 С1и Азр ТЬг А1а Уа1 95 Туг
Туг Суз ТЬг Агд 100 Туг РЬе Азр Туг Тгр 105 С1у С1п С1у ТЬг Ьеи 110 Уа1 ТЬг
Уа1 Зег Зег 115
<210> 74 <211> 118 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 74
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у 61у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у 15 10 15
Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Азр А1а 20 25 30
Тгр МеЬ Азр Тгр Уа1 Агд С1п А1а Зег С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр А/а1 35 40 45
С1у С1и Не Агд Зег Ьуз А1а Зег Азп Шз А1а ТЬг Туг Туг А1а С1и 50 55 60
Зег Уа1 Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
70 75 80
А1а Туг Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг
90 95
- 121 025174
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг 100 105 110
Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег 115 <210> 75 <211> 118 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 75 СЬу 10 Ьеи УаЬ СЬп Рго СЬу 15 СЬу
СЬи 1 УаЬ СЬп Ьеи УаЬ 5 СЬи Зег СЬу СЬу
Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр АЬа
20 25 30
Тгр МеЬ Азр Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Зег СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ
35 40 45
АЬа СЬи Ые Агд Зег Ьуз АЬа Зег Азп НЬз АЬа ТЬг Туг Туг АЬа СЬи
50 55 60
Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Ые Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
УаЬ Туг Ьеи СЬп МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг
100 105 110
Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
115
<210> 76
<211> Ы
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 76
Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
10 <210> 77 <211> Ы <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
- 122 025174 <400> 77
Тгр СЬу Агд СЬу ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег Ь 5 ЬО <2Ь0> 78 <211> ЬЬ <2Ь2> ПРТ <2ЬЗ> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 78
Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг МеЬ УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
Ь 5 ЬО <2Ь0> 79 <2ЬЬ> ЬЬ <2Ь2> ПРТ <2ЬЗ> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 79
Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг ТЬг УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
Ь 5 ЬО <2Ь0> 80 <2ЬЬ> ЬО <2Ь2> ПРТ <2ЬЗ> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 80
РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи ЬЬе Ьуз
Ь 5 ЬО <2Ь0> 81 <2ЬЬ> ЬО <2Ь2> ПРТ <2ЬЗ> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 81
РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз Ьеи СЬи ЬЬе Ьуз
Ь 5 10 <210> 82 <211> 10
- 123 025174 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 82
РЬе С1у Рго С1у ТЬг Ьуз УаЬ Азр Не Ьуз
10 <210> 83 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 83
РЬе 61у СЬу СЬу ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
10 <210> 84 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 84
РЬе СЬу С1п СЬу ТЬг Агд Ьеи С1и 11е Ьуз
10 <210> 85 <211> 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая метка бхШз <400> 85
НЬз НЬз НЬз НЬз НЬз НЬз
5 <210> 86 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
- 124 025174
<220>
<221> МОЬ РЕЗ
<222> (1) . '· (1)
<223> Азр или С1п
<220> <221> моь КЕЗ
<222> (3) . (3)
<223> С1п или Уа1
<220> <221> моь КЕЗ
<222> (4) . ’· (4)
<223> МеЬ или Ьеи
<220> <221> МОЬ КЕЗ
<222> (5) . (5)
<223> ТЬг или Зег
<220> <221> МОЬ КЕЗ
<222> (35) ’. . (35)
<223> Туг или РЬе
<220> <221> МОЬ КЕЗ
<222> (45) . · (45)
<223> Рго или Ьеи
<220> <221> моэ КЕЗ
<222> (46) '· · (46)
<223> Тгр или Ьеи
<220> <221> ΜΟΩ КЕЗ
<222> (59) . . (59)
<223> Зег, Уа1 или
<220> <221> МСЮ КЕЗ
<222> (69) . (69)
<223> Азр или Зег
<220> <221> МОЬ КЕЗ
<222> (70) · (70)
<223> Туг или РЬе
<221> МОЬ КЕЗ
<222> (99} . . (99)
<223> СЬу или АЬа
<220> <221> моь КЕЗ
<222> (105)..(105)
<223> 11е или Ьеи
<400> 86
Хаа 11е Хаа Хаа Хаа С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 1 5 10 15
- 125 025174
Азр Агд УаЬ ТЬг 20 Ые ТЬг Суз Агд АЬа 25 Зег Зег Зег УаЬ Зег 30 Туг Мер
НЬз Тгр Хаа 35 СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу 40 Ьуз АЬа Рго Ьуз Хаа 45 Хаа Ые Туг
АЬа ТЬг 50 Зег Азп Ьеи АЬа Зег 55 СЬу УаЬ Рго Хаа Агд 60 РЬе Зег СЬу Зег
СЬу Зег 65 СЬу ТЬг Хаа Хаа 70 ТЬг Ьеи ТЬг Ые Зег 75 Зег Ьеи СЬп Рго СЬи 80
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг 85 Туг Суз СЬп СЬп Тгр 90 Зег Зег Азп Рго Ьеи 95 ТЬг
РЬе СЬу Хаа СЬу ЬОО ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Хаа 105 Ьуз
<2Ь0> 87 <2ЬЬ> 118 <2Ь2> ПРТ <2ЬЗ> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
<221> М00_РЕЗ <222> (49)..(49) <223> СЬу или АЬа <220>
<22Ь> М00_КЕЗ <222> (79)..(79) <223> Азп или Зег <220>
<22Ь> ΜΟϋ_ΚΕ3 <222> (80)..(80) <223> ТЬг или Агд <220>
<22Ь> ΜΟϋ_ΚΕ3 <222> (8Ь)..(8Ь) <223> Ьеи или УаЬ <220>
<221> МОО КЕЗ <222> (86?..(86) <223> Азп или Ые <220>
<22Ь> ΜΟϋ_ΚΕ3 <222> (95)..(95) <223> УаЬ, Ые или Ьеи <220>
<22Ь> МОО_КЕЗ <222> (ЬОО)..(ЬОО) <223> Агд, ТЬг или СЬу
- 126 025174 <220>
<221> ΜΟϋ_ΚΕ3 <222> (113)..(113) <223> Ьеи или ТЬг <220>
<221> М00_КЕ5 <222> (114)..(114) <223> Уа1 или Ьеи <220>
<221> МОЬ_КЕЗ <222> (118)..(118) <223> Зег или А1а
<400> 87 СЬу 10 Ьеи Уа1 Ьуз Рго С1у 15 С1у
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 5 СЬи Зег СЬу С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр А1а
20 25 30
Тгр Мер Азр Тгр Уа1 Агд С1п АЬа Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Хаа С1и 11е Агд Зег Ьуз А1а Зег Азп ΗΪ3 А1а ТЬг Туг Туг АЬа С1и
50 55 60
Зег Уа1 Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Хаа Хаа
65 70 75 80
Хаа Туг Ьеи С1п Мер Хаа Зег Ьеи Ьуз ТЬг С1и Азр ТЬг АЬа Хаа Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг Хаа Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СЬу СЬп С1у ТЬг
100 105 но
Хаа Хаа ТЬг Уа1 Зег Хаа
115
<210> 86
<211> 118
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид νΗ_ν1(А) <400> 88
С1и Уа1 СЬп Ьеи Уа1 С1и Зег СЬу С1у С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго С1у СЬу
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр А1а
20 25 30
Тгр Мер Азр Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
А1а СЬи 11е Агд Зег Ьуз А1а Зег Азп НЬз АЬа ТЬг Туг Туг А1а С1и
55 60
- 127 025174
Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
Ьеи Туг Ьеи СЬп МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг
100 105 но
Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
115
<210> 89
<211> 118
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание ι искусственной последовательности; : синтетический
полипептид УН νί(А2)
<400> 89
СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬи Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи УаЬ Ьуз Рго СЬу СЬу
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр АЬа
20 25 30
Тгр МеЬ Азр Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ
35 40 45
СЬу СЬи АЬа Агд Зег Ьуз АЬа Зег Азп НЬз АЬа ТЬг Туг Туг АЬа СЬи
50 55 60
Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг 1Ье Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
Ьеи Туг Ьеи СЬп МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг
100 105 110
Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
115
<210> 90 <2Ы> 118 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид ΥΗ_ν1(0)
<400> 90
СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬи Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи УаЬ Ьуз Рго СЬу СЬу
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр АЬа
20 25 30
- 128 025174
Тгр МеЪ Азр Тгр УаЬ Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ 35 40 45
СЬу СЬи Ые Агд Зег С1п АЬа Зег Азп НЬз АЬа ТЬг Туг Туг АЬа СЬи 50 55 60
Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Ые Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
70 75 80
Ьеи Туг Ьеи СЬп МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг
90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг 100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210> 91 <211> 118 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид УН_у1(К)
<400> 91 СЬу СЬу 10 Ьеи Уа1 Ьуз Рго СЬу 15 СЬу
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 5 СЬи Зег С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Азр АЬа
20 25 30
Тгр МеР Азр Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр Уа1
35 40 45
С1у СЬи Ые Агд Зег Агд А1а Зег Азп НЬз АЬа ТЬг Туг Туг АЬа С1и
50 55 60
Зег Уа1 Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Ые Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
Ьеи Туг Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг С1и Азр ТЬг АЬа Уа1 Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СЬу СЬп С1у ТЬг
100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг УаЬ Зег Зег
115
<210> 92 <211> 118 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид νΗ_ν1(3)
- 129 025174 <400> 92
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи УаЬ Ьуз Рго СЬу СЬу 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр АЬа 20 25 30
Тгр МеЪ Азр Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ 35 40 45
Зег СЬи 11е Агд Зег Ьуз АЬа Зег Азп НЬз АЬа ТЬг Туг Туг АЬа СЬи 50 55 60
Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
70 75 80
Ьеи Туг Ьеи СЬп МеЪ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг А1а Уа1 Туг
90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг 100 105 110
Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег 115 <210> 93 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид УК νί(АА)
<400> 93
Азр 11е СЬп МеЪ ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег УаЬ СЬу
1 5 10 15
Азр Агд АЬа ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг МеЪ
20 25 30
ΗΪ5 Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Рго Тгр АЬа Туг
35 40 45
АЬа ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
СЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи
65 70 75 80
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи 11е Ьуз
100 105
<210> 94 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 130 025174 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид УК ν2(АА)
<400> 94
Азр 11е СЬп Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу
1 5 10 15
Азр Агд АЬа ТЬг Ые ТЬг Суз Агд АЬа Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг МеЬ
20 25 30
НЬз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Рго Тгр АЬа Туг
35 40 45
АЬа ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
СЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Ые Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи
65 70 75 80
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Ые Ьуз
100 105
<210> 95 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид УК ν2(АА)
<400> 95
Азр Ые СЬп Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу
1 5 10 15
Азр Агд АЬа ТЬг Ые ТЬг Суз Агд АЬа Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг МеЬ
20 25 30
НЬз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Рго Тгр Ые Туг
35 40 45
АЬа Зег Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
СЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Ые Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи
65 70 75 80
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Ые Ьуз
100 105
<210> 96 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 131 025174 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид УК ν2(3Α)
<400> 96
Азр Ые СЬп Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу
1 5 10 15
Азр Агд УаЬ ТЬг Ые Зег Суз Агд АЬа Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг Мер
20 25 30
Н1з Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Рго Тгр АЬа Туг
35 40 45
АЬа ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
СЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Ые Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи
65 70 75 80
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Ые Ьуз
100 105
<210> 97 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид УК_ _ν2 (: 33)
<400> 97
Азр Ые СЬп Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу
1 5 10 15
Азр Агд УаЬ ТЬг Ые Зег Суз Агд АЬа Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг Мер
20 25 30
НЬз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Рго Тгр Ые Туг
35 40 45
АЬа Зег Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
СЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Ые Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи
65 70 75 80
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Ые Ьуз
100 105
<210> 98 <211> 330 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 132 025174 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид 1дС1(шЗ)_сопзЬапЬ_гед1оп <400> 98
АЬа Зег ТЬг Ьуз СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Зег Зег Ьуз 15 10 15
Зег ТЬг Зег СЬу СЬу ТЬг АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг 20 25 30
РЬе Рго СЬи Рго УаЬ ТЬг УаЬ Зег Тгр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТЬг Зег 35 40 45
СЬу УаЬ НЬз ТЬг РЬе Рго АЬа УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег 50 55 60
Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТЬг УаЬ Рго Зег Зег Зег Ьеи СЬу ТЬг СЬп ТЬг
70 75 80
Туг 1Ье Суз Азп УаЬ Азп НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз УаЬ Азр Ьуз
90 95
Агд УаЬ СЬи Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг НЬз ТЬг Суз Рго Рго Суз 100 105 110
Рго АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго 115 120 125
Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз 130 135 140
УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз РЬе Азп Тгр
145 150 155 160
Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи
165 170 175
СЬи СЬп Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи 180 185 190
НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп 195 200 205
Ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго 11е СЬи Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу 210 215 220
СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд СЬи СЬи
225 230 235 240
МеЬ ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг
245 250 255
Рго Зег Азр Ые АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп 260 265 270
Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе 275 280 285
Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп СЬп СЬу Азп 290 295 300
УаЬ РЬе Зег Суз Зег УаЬ МеЬ НЬз СЬи АЬа Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг 305 310 315 320
- 133 025174
СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз 325 330 <210> 99 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид СК сопзРапР гедЬоп
<400> 99
Агд ТНг УаЬ АЬа АЬа Рго Зег УаЬ РНе Не РНе Рго Рго Зег Азр СЬи
1 5 10 15
СЬп Ьеи Ьуз Зег СЬу ТНг АЬа Зег УаЬ УаЬ Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РНе
20 25 30
Туг Рго Агд СЬи АЬа Ьуз УаЬ СЬп Тгр Ьуз УаЬ Азр Азп АЬа Ьеи СЬп
35 40 45
Зег СЬу Азп Зег СЬп СЬи Зег УаЬ ТНг СЬи СЬп Азр Зег Ьуз Азр Зег
50 55 60
ТНг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТНг Ьеи ТНг Ьеи Зег Ьуз АЬа Азр Туг СЬи
65 70 75 80
Ьуз НЬз Ьуз УаЬ Туг АЬа Суз СЬи УаЬ ТНг НЬз СЬп СЬу Ьеи Зег Зег
85 90 95
Рго УаЬ ТНг Ьуз Зег РНе Азп Агд СЬу СЬи Суз
100 105
<210> 100
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид 97 с Ь4М <400> 100
Азр Не СЬп Мер ТНг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу 15 10 15
Азр Агд УаЬ ТНг Не Зег Суз Агд АЬа Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг Мер 20 25 30
НЬз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Рго Тгр Не Туг 35 40 45
АЬа Зег Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РНе Зег СЬу Зег 50 55 60
СЬу Зег СЬу ТНг Азр Туг ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи
70 75 80
Азр РНе АЬа ТНг Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТНг
90 95
- 134 025174
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Ые Ьуз 100 105 <210> 101 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 101
Азр Ые СЬп Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег Рго Тгр Ые Туг 15 10 15
АЬа ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег Туг ТЬг Ьеи ТЬг Ые Зег Зег Ьеи СЬп 20 25 30 <210> 102 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид 95 с Ь4М <400> 102
Азр Ые СЬп МеЬ ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу 15 10 15
Азр Агд АЬа ТЬг Ые ТЬг Суз Агд АЬа Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг МеЬ
НЬз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Рго Тгр Ые Туг
АЬа Зег Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег
СЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Ые Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Ые Ьуз 100 105 <210> 103 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид 96 с Ь4М <400> 103
- 135 025174
Азр 11е СЬп Мер ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу
1 5 10 15
Азр Агд УаЬ ТЬг Ые Зег Суз Агд АЬа Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг МеР
20 25 30
НЬз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Рго Тгр АЬа Туг
35 40 45
АЬа ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
СЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Ые Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи
65 70 75 80
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи 11е Ьуз
100 105
<210> 104 <211> 12 <212> ПРТ
<213> Вирус гриппа А
<400> 104 Рго Ьуз Туг УаЬ Ьуз СЬп Азп ТЬг Ьеи Ьуз Ьеи АЬа
1 5 10
<210> 105 <2Ы> 15 <212> ПРТ <213> Неизвестное <220>
<223> Описание неизвестного: : пептид НЗР 60 из СЫатуйЬа
<400> 105 Ьуз УаЬ УаЬ Азр СЬп Ые Ьуз Ьуз Ые Зег Ьуз Рго УаЬ СЬп НЬз
1 5 10 15
<210> 106 <211> 14 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 106
Тгр УаЬ СЬу СЬи 11е Агд Зег Ьуз АЬа Зег Азп НЬз АЬа ТЬг 15 10 <210> 107 <211> 14 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 136 025174 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 107
Тгр Уа1 С1у С1и 11е Агд Зег Θΐη А1а Зег Азп Шз А1а ТЬг 15 10 <210> 108 <211> 14 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 108
Тгр Уа1 С1у С1и 11е Агд Зег Агд А1а Зег Азп Шз А1а ТЬг 15 10 <210> 109 <211> 14 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 109
Тгр Уа1 С1у О1и А1а Агд Зег Ьуз А1а Зег Азп Шз А1а ТЬг 15 10 <210> 110 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 110
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1
10 <210> 111 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 111
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е Зег Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1
10
- 137 025174 <210> 112 <2Ы> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 112
Азр Агд АЬа ТЬг 11е ТЬг Суз Агд АЬа Зег Зег Зег УаЬ
10 <210> 113 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 113
Рго Тгр ТЬе Туг АЬа ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ <210> 114 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 114
Рго Тгр 11е Туг АЬа Зег Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ
10 <210> 115 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 115
Рго Тгр АЬа Туг АЬа ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ
10 <210> 116 <211> 118 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
- 138 025174 <220>
<221> Μ0ϋ_ΚΕ5 <222> (49)..(49) <223> СЬу, АЬа или Зег <220>
<22Ь> ΜΟϋ_ΚΕ3 <222> (5Ь)..(5Ь) <223> АЬа или Ые <220>
<22Ь> МОО КЕЗ <223> Ьуз, СЬп или Агд <220>
<22Ь> ΜΟϋ_ΚΕ5 <222> (8 Ь) .. (81) <223> Ьеи или УаЬ <400> 116
СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬи 1 5
Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи УаЬ Ьуз 10
Рго СЬу СЬу 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз 20
АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе 25
Зег Азр АЬа 30
Тгр МеЬ Азр Тгр УаЬ Агд 35
Хаа СЬи Хаа Агд Зег Хаа 50
СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ 40 45
АЬа Зег Азп НЬз АЬа ТЬг Туг Туг АЬа СЬи 55 60
Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе 65 70
Хаа Туг Ьеи СЬп МеЬ Азп 85
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд 100
ТЬг Ые Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг 75 80
Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг 90 95
Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг 105 110
Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег 115 <210> 117 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<220> <221> <222> <223> МОО (19) АЬа КЕЗ . · (19)
ИЛИ УаЬ
<220>
<221> МОО КЕЗ
<222> (22) ..(22)
<223> ТЬг ИЛИ Зег
- 139 025174 <220>
<221> Μ0ϋ_ΚΕ3 <222> (47)..(47) <223> А1а или 11е <220>
<221> М00_КЕ8 <222> (50)..(50) <223> ТЬг или Зег <400> 117
Азр 1 11е С1п МеЬ ТЬг 5 СЬп Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ 15 СЬу
Азр Агд Хаа ТЬг Не Хаа Суз Агд АЬа Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг МеЬ
20 25 30
НЬз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Рго Тгр Хаа Туг
35 40 45
А1а Хаа Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
С1у Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи
65 70 75 80
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи 11е Ьуз
100 105 <210> 118 <211> 34 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 118
Тгр 1 УаЬ АЬа СЬи ЬЬе 5 Агд Зег Ьуз АЬа Зег 10 Азп УаЬ Туг Ьеи СЬп 15 МеЬ
Азп Зег Ьеи Ьуз УаЬ Туг Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр
20 25 30
Зег Тгр

Claims (31)

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают эндоглин, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕр ГО N0: 89, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕр ГО N0: 93.
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают эндоглин, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕр ГО N0: 89, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕр ГО N0: 93, где указанная вариабельная область тяжелой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены глицина (О) на аланин (А) или серин (Б) в положении 49; замены аланина (А) на изолейцин (I) в положении 51; замены лизина (К) на аргинин (К) или аспарагин (0) в положении 52Ь; замены лейцина (Ь) на валин (У) в положении 78 согласно системе нумерации по КаЬа1; и вариабельная область легкой цепи дополнительно содержит одну или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из замены метионина (М) на лейцин (Ь) в положении 4; замены аланина (А) на валин (У) в положении 19; замены треонина (Т) на серин (Б) в положении 22; замены аланина (А) на изо- 140 025174 лейцин (I) в положении 48 и замены треонина (Т) на серин (8) в положении 51 согласно системе нумерации по КаЬаЕ
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 88, 89, 90, 91 или 92; и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 93, 94, 95, 96, 97, 100, 102 или 103.
4. Антигенсвязывающий фрагмент по п.1, представляющий собой РаЬ-фрагмент, РаЬ'-фрагмент, Р(аЬ')2-фрагмент, Ру-фрагмент, ксРу-фрагмент, одноцепочечный связывающий полипептид, Рй-фрагмент, вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи или йАЬ-фрагмент.
5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, дополнительно связанные с противоопухолевым агентом или ингибитором ангиогенеза; репортерной молекулой, представляющей собой фермент, радиоактивную метку, гаптен, флуоресцентную метку, фосфоресцентную молекулу, хемилюминесцентную молекулу, хромофор, люминесцентную молекулу, фотоаффинную молекулу, окрашенную частицу или лиганд; или и с тем и с другим.
6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где указанный противоопухолевый агент является токсином, который представляет собой цепь А рицина, мутантный экзотоксин Ркеийотопак, дифтерийный анатоксин, стрептонигрин, боамицин, сапорин, гелонин или антивирусный белок лаконоса.
7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где указанный противоопухолевый агент является лекарственным средством, которое представляет собой даунорубицин, метотрексат или калихеамицин.
8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где указанный противоопухолевый агент является радионуклидом, который представляет собой радиоактивный металл.
9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где указанный противоопухолевый агент является цитокином, который представляет собой трансформирующий фактор роста (ТОР)-(Е интерлейкин, интерферон или фактор некроза опухоли.
10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где указанный противоопухолевый агент является фотодинамическим агентом, который представляет собой порфирин или его производное.
11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где указанный лиганд представляет собой биотин.
12. Композиция для лечения связанного с ангиогенезом заболевания, которая связывает эндоглин, содержащая эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента по п.1 или 2 и приемлемый носитель или эксципиент.
13. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2.
14. Способ лечения связанного с ангиогенезом заболевания у субъекта, включающий введение композиции по п.12.
15. Способ по п.14, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связаны с противоопухолевым агентом или ингибитором ангиогенеза; репортерной молекулой, представляющей собой фермент, радиоактивную метку, гаптен, флуоресцентную метку, фосфоресцентную молекулу, хемилюминесцентную молекулу, хромофор, люминесцентную молекулу, фотоаффинную молекулу, окрашенную частицу или лиганд; или и с тем и с другим.
16. Способ по п.14, где связанное с ангиогенезом заболевание представляет собой глазное заболевание, характеризующееся ангиогенезом/неоваскуляризацией, диабетическую нефропатию, воспалительное заболевание кишечника ПВО), ревматоидный артрит, остеоартрит, рак или метастаз.
17. Способ по п.16, где глазное заболевание представляет собой дегенерацию желтого пятна.
18. Способ по п.16, где глазное заболевание представляет собой диабетическую ретинопатию.
19. Способ по п.16, где рак представляет собой солидную опухоль.
20. Способ по п.16, где рак представляет собой эпителиальную опухоль.
21. Способ по п.16, где рак выбран из рака легкого, гинекологической злокачественной опухоли, меланомы, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака яичника, рака матки, колоректального рака, рака предстательной железы, рака почки, рака головы, рака поджелудочной железы, рака печени, рака шеи, саркомы, миеломы и лимфомы.
22. Способ по п.14, дополнительно включающий введение одного или более ингибиторов ангиогенеза.
23. Способ по п.22, где ингибитор ангиогенеза представляет собой химиотерапевтическое лекарственное средство, ингибитор рецептора УЕОР (фактор роста сосудистого эндотелия), ингибитор УЕОР или их комбинацию.
24. Способ по п.14, где композицию вводят в количестве примерно 0,01, примерно 0,05, примерно 0,1, примерно 0,5, примерно 1, примерно 5, примерно 10, примерно 20, примерно 30, примерно 40, примерно 50, примерно 60, примерно 70, примерно 80, примерно 90, примерно 100, примерно 125, примерно 150, примерно 175 или примерно 200 мг/кг массы тела пациента.
- 141 025174
25. Способ по п.15, где указанный противоопухолевый агент является токсином, который представляет собой цепь А рицина, мутантный экзотоксин Ркеийошопак, дифтерийный анатоксин, стрептонигрин, боамицин, сапорин, гелонин или антивирусный белок лаконоса.
26. Способ по п.15, где указанный противоопухолевый агент является лекарственным средством, которое представляет собой даунорубицин, метотрексат или калихеамицин.
27. Способ по п.15, где указанный противоопухолевый агент является радионуклидом, который представляет собой радиоактивный металл.
28. Способ по п.15, где указанный противоопухолевый агент является цитокином, который представляет собой трансформирующий фактор роста (ТОР)^, интерлейкин, интерферон или фактор некроза опухоли.
29. Способ по п.15, где указанный противоопухолевый агент является фотодинамическим агентом, который представляет собой порфирин или его производное.
30. Способ по п.15, где указанный лиганд представляет собой биотин.
31. Способ по п.23, где ингибитор рецептора VΡОΡ выбран из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба, афлиберцепта, сунитиниба, сорафениба, акситиниба, пегаптаниба и пазопаниба.
Вариабельная область легкой цепи (Уь) 02^к1-39 с привитыми СГОК из V^ ТКС105 (подчеркнуты) [8ЕР ГО N0: 4]
Вариабельная область тяжелой цепи ^Н) VΗ3-15 с привитыми СГОК из VΗ ТКС105 (подчеркнуты) [8ЕР ГО N0: 42] е | ν | о | ь | ν | е | 5 | с | с | с |ь | ν | к | р | с | с | 8 |ь | к |ь | 8 | с | а | а | 5 | с | г |т
49 Г 3 0 А И м 0 и V к Ω А Р с к с ь Е И V С Е I К 3 к А 3 А
76 77 78 N Н А Т Υ Υ А Е 3 V К с к г т I 3 к 0 0 3 к N Т Ь Υ ь 2 5 В. V
82а 89 94 м N 3 ь к т Е Э т А V Υ Υ с т К и к к г г 0 3 и с 2 с т I I т В <3
108 109 113 ь V т V 3 3 т ь А
Фиг. 2
Модель регуляции ангиогенеза посредством СЭ105 (эндоглина)
Фиг. 3
- 142 025174 ог?!?2 ?!™ 889
ΟίνίδΟδΡΑ I ί£Α8Ρ(3ΕΚνΤΜΤ0ΡΑ56δν8- -.....УМНИУ<ЗС|КР(ЗЗЗРКРЩ|
Мышь_\/К
У1-39-О2/О12-кЖ4 ΩΙΩΜΤΩδΡδδΙ-δΑδνΩΟΡνΤίΤΩΡΑδΩδΙδδ-.....ΥΙ_ΝννΥ0αΚΡ0ΚΑΡΚΙ_Ι_Ι
Ηιινκ.νο ΩΙΩΜΤΩδΡ83Ι-3Αδν(3ΩΡνΤΐΤ0ΡΑδδδν3.......ΥΜΗννΥαΩΚΡ(3ΚΑΡΚΙ_Ι_Ι
Ηι_ινκ_ν1 ΟΙΟΜΤΟδΡδδΙ-δΑδνΰΟΡνΤίΤΟΡΑδδδνδ.......ΥΜΗννΥΟΩΚΡΟΚΑΡ КЙ| I
Ηιινκ ν2 Ω I Ο0Τ ΟδΡδδΙ-δΑδνΰΟΡνΤίΤΟΡΑδδδνδ.......ΥΜΗΜΥΟΩΚΡΩΚΑΡ к |ρνν| I
Мышь_УК ΥΑΤ5ΝΙ-Αδ0νΡ\/ΡΡ30δ05(3ΤδΥ£Ι-Τ I 3ΡνΕΑΕΩΑΑΤΥΥΩΩΩνν53ΝΡ|_ΤΡΩΑΘΤ νΐ-39-Ο2/Ο12-κΙΚ4 ΥΑΑδδΙ-ΩδΩνΡδΡΡδΩδΩδΩΤΟΡΤ Ь Τ I 3δΙ_αΡΕΟΡΑΤΥΥθαΩδΥ3ΤΡΙ_ΤΡΟΟ<3Τ
Ηυνκ.νο ΥΑΤ8ΝΙ_Α3ΩνΡ5ΡΡδΩδΟ5ΩΤ Ω_Ρ_Τ ί_ Τ
Ηιινκ_ν1 ΥΑΤ3ΝΙ_Α30νΡ8ΡΡ3<33<33(3Τ
Ηιινκ_ν2 ΥΑΤ3ΝΙ_Α3(3νΡ3ΡΡ3<33<33(3Τ
88 ί_ Ω Ρ Ε Ω ΡΑΤΥΥΟΩΩννδδΝΡίΤΡΰΩΩΤ ь τ ι δδΐ_αΡΕθΡΑΤΥΥοοοννδδΝΡΐ_τΡ3<3θτ Ь Τ I δδΙ_ΩΡΕΩΡΑΤΥΥΩΩ0ννδδΝΡΙ_ΤΡΟΩΩΤ
VI -39-02/012-κΙΚ4 К V Ε I К
ΗιινΚ_νΟ
ΗιΛ/Κ_ν1
ΗιΑ/Κ_ν2
Фиг. 4-1
Мышьз/н ЕУПЕЕгттРссзмпзсААзтт
Х/НЗ-15+бН4 Ε νθ ί V Е $ СбС I V К Ρ ΰ С $ I Ρ ί 5 С А А $ О Ρ Т Р 5 N ΗιινΗ_νΟ Е7<ШЕ5СС61.УКРСб51.Р1.5САА5еРТР50
ΗιΛ/Η_ν1 ΕνθίνΕδ666ΐνΚΡ6651ΡΙδΟΑΑδ6ΡΤΡ80
ΗιινΗ_ν2 Εν<ηνΕδ<366Ι.νΚΡ66δΙ.ΡΙ.δ6ΑΑδ6ΡΤΡδΟ
Мышь_\/н δΚΑδΝΗΑΤΥΥΑΕδνΚΟΡΡΤ УНЗ-15-к1Н4 δΚΤΟδΟΤΤϋΥΑΑΡνΚΟΡΡΤ ΗιΛ/Η_νΟ δ К Α δ Ν Η Α Τ Υ Υ Α Ε δ V К С ρ Ρ τ
Ηυλ/Η_ν1 δ К Α δ Ν Η Α Τ Υ Υ А Ε δ V К С Ρ Ρ Τ
ΗιΛ/Η_ν2 δ К Α δ Ν Η А Τ Υ Υ А Ε δ V К <3 β Ρ Τ
Мышь_УН
УНЗ-15-к1Н4
ΗιινΗ_νΟ
ΗιιΥΗ_ν1
ΗιιΥΗ_ν2 οδΐί/δΰ ст τ ί τ ν δ δ 0Υνν<3Ο<3ΤΙ_ντν§§ ϋδνι/οοοτιντνδδ ϋ3νν000ΤΙ_ντν33 05νν00<3ΤΙ.ντν33
ТРС105Л/К Ω \/3-11-1_6+Д<4 Ε δυρθΐ·νκ_νθ
5ιιρβΓ\/Κ_ν1 $ирег\/К_у2
-ΑννΜΟ\Λ/νΡΟ3ΡΕΚ<3Ι_ΕνννΑΕ
- Α\Λ/Μ3νννΡ0ΑΡ0Κ0Ι_Ενν\/0Ρ
- ΑννΜϋΜνΡΟΑΡΟΚ С |_ Ε N V С Ε
- АЮ ϋ'Λ V Ρ, О А Ρ б К 6 ί ΕΌ Ο Ε
- Α ΑΝ Μ ϋ Μ V Ρ 0 Α Ρ С К <3 |_ Ε Μ/ ν[Α]Ε δ ρϋ Ο δΚ δ δν Υ Ю ΜΝ δ ίΡ ΑΕ 0ТС I ΥΥΟ ΤΡΜΡΡ Ρ ρ δ ΡΟ ϋ δκ Ν Τ ί Υ Ю ΜΝ δ ί К ТЕ ОТА V ΥΥ6 ΤΤ · - · Υ Ρ δΡΟΟδΚΝΤΙΥίΟΜΝδίΚΤΕΟΤΑνΥΥΟΤΤΥνΡΡΡΡ δ Ρ ϋ Ο δ К Ν Τ ί Υ Ю ΜΝ δ ί К ТЕ Ο Τ Α V Υ УС Τίρίνν ΡΡ Ρ Ρ
5 ρϋ Ο δΚ Ν т[у) Υ Ю ΜΝ δ ί К ТЕ ОТА ν Υ Υ6 τ[ρ|νν Ρ Ρ Ρ Ρ
Фиг. 4-2
V ί. $ Ω δ Ρ А I Ι_3Α3ΡΩΕΚνΤΜΤΩΚΑδ$δν3.......ΥΜΗΥνΥΩΩΚΡΟδδΡΚΡννΐ νΐ_ΤΩ3ΡΑΤΙ_3Ι_3Ρ0ΕΡΪΑΤ |_80ΡΑ3Ω3νδ3......ΥίΑννΥΩΩΚΡΩΩΑΡΡΙί. I νΐ_ΤΩ5ΡΑΤΙ_3Ι_3ΡΩΕΡΑΤΙ_30ΡΑ33δν5.......ΥΜΗΜΥΩΩΚΡΩΩΑΡ Ρ ί ί I νΐ_ΤΩ3ΡΑΤΐ.3Ι_3ΡΩΕΒΑΤΙ_3ΩΒΑ33δν3.......ΥΜΗΜΥΩΩΚΡΩΩΑΡ Р|Р\Л/|1 νΐ_ΤΩ3ΡΑΤΙ_3Ι_3Ρ(3ΕΡΑΤΙ_30ΡΑ533ν3.......ΥΜΗ\Λ/ΥΩΩΚΡΩΟΑΡ К Ρ УУ I
ТРС105Л/К ΥΑΤ5ΝΙ-Α8Ω\/Ρ\/ΚΡ5Ω5Ω5ΩΤδΥ3Ι-ΤΙ8ΡνΕΑΕΟΑΑΤΥΥΟΩΩνν88ΝΡΙ_ΤΡΩΑΩ ν3-1116-κΙΚ4 ΥΩ Α8Ν Ρ Α ΤΩ I ΡΑΡΡ3ΩδΩ3ΩΤΩΡΤΙ_Τ I 33Ι.ΕΡΕΩΡΑνΥΥ0ΩΩΡ3ΝννΡΙ_ΤΡ0Ω0 $ирег\/К_\Ю ΥΑΤ$ΝΙΑ30ΐΡΑΒΡ3Ωδ03ΩΤ0ΡΤΙ_ΤΙ33Ι_ΕΡΕ0ΡΑνΥΥ0ΩΩννδ3ΝΡΐ_ΤΡΩΩΩ 3ίΐρβιΛ/Κ_ν1 Υ А Τ 3 Ν ί А 3 О I Ρ А Ρ Ρ 3 0 3 Ω 3 О Τ θίΫ1 Τ I. Τ I 3 3 ί Ε Ρ Ε Ω Ρ А V Υ Υ С Ω Ω № 3 3 Ν Ρ |_ Τ Ρ О С Ο 3ίΐρβιΛ/Κ_ν2 Υ Α Τ3Ν Ι_ А 3Ω0Ρ ΑΡΡ303<330Τθ[γ1τΐ_ΤΙ33Ι_ΕΡΕΟΡΑνΥΥΩΩθνν33ΝΡΙ_ΤΡ<3<3<3
ТРС-105-νΚ Τ К Ι_ Ε Ι_ К ν3-11-Ι_6+ϋΚ4 Τ К νΕ I К Зирег\/К_)/0 Τ К V Ε I К Зирег\/К_у1 Τ К V Ε I К ЗирегУК_у2 Т К V Ε I К
Фиг. 5-1
ТРС105-7Н ΕνΚΙ_ΕΕ3ΩΩΩΙ.νΩΡΩΩ5ΜΚΙ_5ΟΑΑ3ΩΡΤΡ5Ω \/Η3_3-73+ϋΗ4 ΕνΩΙ_νΕ3ΩΩΩΙ-νΩΡΩΩ5Ι-ΚΙ-30ΑΑ5ΩΡΤΡ3Ω ЗирегУН.уО ΕνΩΙ_νΕ5ΩΩΩΙ-νΩΡΩΩ5Ι_ΚΙ_30ΑΑ5ΩΡΤΡ5Ω δυρβιΛ/Η_ν1 ΕνΩΙ_νΕ3ΩΩΩΙ-νΩΡΩΩ5Ι-ΚΙ_50ΑΑ3ΩΡΤΡ3Ω
А ММ Ω № V Ρ Ω 3 Ρ Ε К С Ι_ Ε № V А Ε ΙΡ 5ΑΜΗνννΡΩΑ3(3ΚΟΙ-Εννν(3Ρ ΙΡ Α №Μ Ω № V Ρ Ω Α 5 Ω К Ω Ι_ Ε № V Ω Ε ΙΡ Α ννΜ Ω νν V Ρ Ω Α 3 Ω К Ω Ι_ Ε № Υ[α]Ε I Ρ
ТРС105Л/Н 3ΚΑ3ΝΗΑΤΥΥΑΕ3νΚΩΡΡΤ I 5ΡΩΩ5Κ33νΥΙ_ΩΜΝ5Ι_ΡΑΕΩΤΩ I ΥΥΩΤΡΜΡΡΡΡΩ \/Η3_3-73+ΰΗ43 ΚΑΝ3ΥΑΤΑΥΑΑ3ΥΚΩΡΡΤ Ι3ΡΩΩ5ΚΝΤΑΥΙ_ΩΜΝ5Ι_ΚΤΕΩΤΑνΥΥΩΤΡ - - - ΥΡΩ 3υρβΛ/Η_νΟ 3ΚΑ5ΝΗΑΤΥΥΑΕ5νΚΩΡΡΤΙ5ΡΩΩ5ΚΝΤΑΥΙ-ΩΜΝ5Ι_ΚΤΕΩΤΑνΥΥΩΤΡννΡΡΡΡΩ ЗирегУН_у1 3ΚΑ3ΝΗΑΤΥΥΑΕ5νΚΩΡΡΤ I 3ΡΩΩ3ΚΝ Τ0Υ Ι_ΩΜΝ5Ι_ΚΤΕΩΤΑνΥΥΩΤΡννΡΡΡΡΩ
ТРС105Л/Н 5ΜΩΩΩΤΤΙ_Τν53 νΗ3_3-73+ϋΗ4ΥννΩΩ Ω Τ Ι_ V Τ V 3 5 ЗирегУЮО 5ννΩΩΩτι_ντν55 ЗирегУН_у1 3№ΩΩΩΤΙ_ντν35
Фиг. 5-2
- 143
Мышь_УК Οΐνΐ-505ΡΑ I Ι.5Α5Ρ<3ΕΚνΤΜΤ0ΚΑ55$ν5ΥΜΗνΐ/Υ00ΚΡ055ΡΚΡννΐΥΑΤ5ΝΙ.Α5
ΗιιΥΚ.νΟ ΟΙΟΜΤΟ5Ρ3δ15Αδν6ϋΡνΤΐΤΟΡΑ3δ5ν5ΥΜΗννΥΟ0ΚΡ[3ΚΑΡΚΙ_Ι.ΙΥΑΤ3ΝΙΑ3
ЗирегУК.уО Ε ΐνΐ.ΤΟ3ΡΑΤΙ-3Ι_3ΡΟΕΡΑΤΙ_3ΟΡΑ353ν3ΥΜΗννΥ00ΚΡΟΟΑΡΡΙ.Ι ΙΥΑΤ3ΝΙ.Α3
Мышь_\/К е V Ρ ν К Ρ 8 С 5 С 5 С Τ δ Υ δ I τ I δΚνΕΑΕϋΑΑΤΥΥ00 0ννδδΝΡΙ.ΤΓ6Α6ΤΚ ί Ε ί к
ΗιΛ/Κ_νΟ С V Ρ δ Ρ Ρ 3 С δ С δ 0 Τ 0 Ρ Τ ί Τ I δδΙΟΡΕϋΡΑΤΥΥΟΟΟννδδΝΡίΤΡΟΟΟΤΚνΕ I к
ЗирегУК_\/О С I Ρ А К Ρ 5 С δ С δ С Τ 0 Ρ Τ ί τ I δδΙΕΡΕϋΡΑνΥΥΟΟΟΙΛ/δδΝΡΙΤΡΟΟΟΤΚνΕ I к
Мышь_\/Н
ΗιΛ/Η_νΟ
ЗирегУН_\/О
Е7К1-ЕЕЗС6С1ЛОРС63МК1.3СААЗеРТР50·
Εν0Ι.νΕ306<3ΐνΚΡ063Ι_ΡΙδ0ΑΑ30ΡΤΡ30·
Е7(ШЕ5ССбтРесЗтзСАА56РТРЗО·
ΑΜΜϋΟΡΟδΡΕΚ 0Ι.ΕΌ А Ε I Ρ 3 ΑννΜϋΜνΡΟΑΡΟΚΟΐΕνννΟΕ I Ρ5 ΑννΜΟ\/ννΠΟΑ3<3Κ<3|_Εννν<3Ε I Ρ 3
Мышь_УН К Α δ Ν Η Α Τ Υ Υ А Ε 8 V К С Ρ Ρ Τ I δ Ρ 0 0 δ К 3 δ V Υ I Ο Μ Ν δΙΡΑΕϋΤΘ I Υ Υ С ΤΡ Μ Ρ Ρ Ρ
Ηιι\/Η_νΟ К Α δ Ν Η Α Τ Υ Υ А Ε 8 V К С Ρ Ρ Τ I 5 Ρ 0 0 δ К Ν Τ ί Υ ί Ο Μ Ν 3 ί К Τ Ε ϋ Τ А V Υ Υ С Τ Τ Ш Ρ. Ρ. Ρ
ЗирвгУН_уО К Α δ Ν Η Α Τ Υ Υ А Ε 3 V К С ρ Ρ Τ I 5 Ρ 0 0 δ К Ν Τ Α Υ I. 0 Μ Ν 3Ι-ΚΤΕ0ΤΑνΥΥ0ΤΡννΡΡΡ
Мышь_УН
ΗιιΥΗ.νΟ
3ιιρβΓνΗ_νΟ
8=885886882222
Ρ05«606ΤΤίΤνίϊ Ρ05»(606ΤίνΤΪ85 гозвсоен ντνίδ
Фиг. 6
Фиг. 8-1
144 025174
Фиг. 8-2
Фиг. 8-3
145 025174
Фиг. 10
Фиг. 11
Фиг. 12
- 146 025174
Фиг. 13
Фиг. 14
Фиг. 15
Фиг. 16
- 147 025174
Основной вариант гуманизированного деиммунизированного νΗ1 А2 [5ЕО Ю N0: 89] и его модификации с подчеркнутыми СОК ъ|у|т|у|з|з|
Фиг. 17
Основной вариант гуманизированного деиммунизированного УК1АА [5Е0 Ю N0: 93] и его модификации с подчеркнутыми СОК
Фиг. 18
148 025174
149
150
Фиг. 24
EA201290173A 2009-09-30 2010-09-29 Антитела против эндоглина EA025174B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US24729009P 2009-09-30 2009-09-30
US12/751,907 US8221753B2 (en) 2009-09-30 2010-03-31 Endoglin antibodies
PCT/US2010/050759 WO2011041441A1 (en) 2009-09-30 2010-09-29 Endoglin antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201290173A1 EA201290173A1 (ru) 2012-11-30
EA025174B1 true EA025174B1 (ru) 2016-11-30

Family

ID=43780635

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201290173A EA025174B1 (ru) 2009-09-30 2010-09-29 Антитела против эндоглина

Country Status (12)

Country Link
US (7) US8221753B2 (ru)
EP (1) EP2482848B1 (ru)
JP (2) JP5632002B2 (ru)
KR (1) KR101398707B1 (ru)
CN (2) CN102762227B (ru)
AU (1) AU2010300668B2 (ru)
BR (1) BR112012007318B1 (ru)
CA (1) CA2775810C (ru)
EA (1) EA025174B1 (ru)
ES (1) ES2776977T3 (ru)
IL (1) IL218724A0 (ru)
WO (1) WO2011041441A1 (ru)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100082438A1 (en) * 2008-10-01 2010-04-01 Ronnie Jack Garmon Methods and systems for customer performance scoring
US8221753B2 (en) 2009-09-30 2012-07-17 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Endoglin antibodies
PL2648516T3 (pl) 2010-12-06 2019-04-30 Aclaris Therapeutics Inc Podstawione związki pirydynono-pirydynylowe
JO3283B1 (ar) * 2011-04-26 2018-09-16 Sanofi Sa تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI)
CA3134906A1 (en) 2011-05-18 2012-11-22 Mederis Diabetes, Llc Improved peptide pharmaceuticals for insulin resistance
JP2014524417A (ja) * 2011-08-01 2014-09-22 タフツ メディカル センター インコーポレイテッド 心不全および関連状態の処置
WO2013074840A1 (en) * 2011-11-15 2013-05-23 Allergan, Inc. Treatment of dry age related macular degeneration
UA115789C2 (uk) * 2012-09-05 2017-12-26 Трейкон Фармасутікалз, Інк. Композиція антитіла до cd105 та її застосування
SG11201503637SA (en) * 2012-11-08 2015-06-29 Clearside Biomedical Inc Methods and devices for the treatment of ocular diseases in human subjects
EP3653649A1 (en) 2012-11-20 2020-05-20 Mederis Diabetes, LLC Improved peptide pharmaceuticals for insulin resistance
US9708404B2 (en) 2012-12-21 2017-07-18 Seattle Genetics, Inc. Anti-NTB-A antibodies and related compositions and methods
US10214590B2 (en) 2013-09-20 2019-02-26 Tufts Medical Center, Inc. Inhibitors of endoglin activity for the treatment of fibrosis
GB201402009D0 (en) * 2014-02-06 2014-03-26 Oncomatryx Biopharma S L Antibody-drug conjugates and immunotoxins
CA2944712A1 (en) * 2014-05-01 2015-11-05 Genentech, Inc. Anti-factor d antibody variants and uses thereof
AU2015266854B2 (en) 2014-05-28 2020-03-26 Mederis Diabetes, Llc Improved peptide pharmaceuticals for insulin resistance
LT3170005T (lt) 2014-07-18 2019-07-10 Sanofi Paciento, įtariamo, kad serga vėžiu, gydymo afliberceptu rezultato prognozavimo būdas
US9926375B2 (en) 2014-11-12 2018-03-27 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof
AU2015346444A1 (en) 2014-11-12 2017-05-04 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof
CN105821029A (zh) * 2015-01-04 2016-08-03 彭霞 异源融合基因修饰的癌细胞/树突状细胞融合肿瘤疫苗及其制备方法
EP3370597A4 (en) * 2015-11-03 2019-07-31 The Brigham and Women's Hospital, Inc. IMAGING ENGINE FOR ANGIOGENIC ACTIVITY IN PULMONARY ARTERY HYPERTENSION
CN106928359B (zh) * 2015-12-30 2020-10-13 广西医科大学 一种CD105纳米抗体Nb59
CN106928355B (zh) * 2015-12-30 2020-09-29 广西医科大学 一种CD105纳米抗体Nb184
AU2017286561B2 (en) * 2016-06-14 2024-08-01 Cedars-Sinai Medical Center Sensitization of tumors to therapies through endoglin antagonism
US11136581B2 (en) * 2016-06-24 2021-10-05 University Of South Carolina Inhibin as targetable regulators of angiogenesis
WO2018067819A1 (en) * 2016-10-06 2018-04-12 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of cancers
WO2018187158A1 (en) * 2017-04-07 2018-10-11 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy of cancer with anti-endoglin antibodies and anti-programmed death receptor agents
US20200062839A1 (en) * 2017-05-01 2020-02-27 Del Mar Pharmaceuticals (Bc) Ltd. Use of dianhydrogalactitol or analogs and derivatives in combination with vegf inhibitors to treat cancer
EP3630821A4 (en) * 2017-06-01 2021-03-03 Health Research, Inc. STRONG POTENTIALIZATION OF CANCER IMMUNE CHECKPOINT BLOCKING THERAPY BY COMBINATION WITH ENDOGLINE TARGETING THERAPY
EP3648757A4 (en) * 2017-07-03 2020-11-25 Development Center for Biotechnology ANTI-VEGFR ANTIBODIES AND USES THEREOF
JP2017214419A (ja) * 2017-08-18 2017-12-07 学校法人関西医科大学 白血病改善剤
WO2019126086A1 (en) * 2017-12-19 2019-06-27 Bristol-Myers Squibb Company Cyclohexyl acid isoxazole azines as lpa antagonists
CA3086918A1 (en) 2018-01-03 2019-07-11 Mederis Diabetes, Llc Improved peptide pharmaceuticals for treatment of nash and other disorders
CN108484759A (zh) * 2018-03-01 2018-09-04 东北农业大学 两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
CN108795867A (zh) * 2018-06-05 2018-11-13 华东理工大学 用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法
WO2021118955A1 (en) * 2019-12-13 2021-06-17 Aggamin Llc Methods and systems for treating or preventing pregnancy-related hypertensive disorders
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2024040195A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2024119157A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles with cofusogens and methods of producing and using the same

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020136725A1 (en) * 1996-01-17 2002-09-26 Smithkline Beecham Corporation Antithrombotic agents
US20060223096A1 (en) * 2005-03-25 2006-10-05 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules directed to MCSP and having increased Fc receptor binding affinity and effector function

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US928641A (en) 1908-10-09 1909-07-20 Levi E Edmunds Clasp for pilings.
US4957939A (en) * 1981-07-24 1990-09-18 Schering Aktiengesellschaft Sterile pharmaceutical compositions of gadolinium chelates useful enhancing NMR imaging
US4472509A (en) * 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5308626A (en) 1985-06-28 1994-05-03 Toni N. Mariani Lymphokine activated effector cells for antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) treatment of cancer and other diseases
US4938948A (en) * 1985-10-07 1990-07-03 Cetus Corporation Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4868103A (en) * 1986-02-19 1989-09-19 Enzo Biochem, Inc. Analyte detection by means of energy transfer
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
GB9022788D0 (en) * 1990-10-19 1990-12-05 Cortecs Ltd Pharmaceutical formulations
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
ES2241710T3 (es) 1991-11-25 2005-11-01 Enzon, Inc. Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.
EP0552108B1 (en) * 1992-01-17 1999-11-10 Lakowicz, Joseph R. Energy transfer phase-modulation fluoro-immunoassay
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US6096289A (en) * 1992-05-06 2000-08-01 Immunomedics, Inc. Intraoperative, intravascular, and endoscopic tumor and lesion detection, biopsy and therapy
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US6107090A (en) * 1996-05-06 2000-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains
US6190660B1 (en) * 1996-05-31 2001-02-20 Health Research, Inc. Anti-endoglin monoclonal antibodies and their use in antiangiogenic therapy
EP0938505B1 (en) * 1996-05-31 2002-03-06 Health Research, Inc. Anti-endoglin monoclonal antibodies and their use in anti-angiogenesis therapy
US5796097A (en) * 1997-03-05 1998-08-18 California Lightwave Laboratories, Inc. Chemical sensor and method
ES2190087T3 (es) 1997-06-13 2003-07-16 Genentech Inc Formulacion estabilizada de un anticuerpo.
US6610293B1 (en) * 1997-06-16 2003-08-26 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Opsonic and protective monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of gram positive bacteria
EP1140840B1 (en) 1999-01-13 2006-03-22 Bayer Pharmaceuticals Corp. -g(v)-carboxyaryl substituted diphenyl ureas as raf kinase inhibitors
US6737056B1 (en) * 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6635677B2 (en) 1999-08-13 2003-10-21 Case Western Reserve University Methoxyamine combinations in the treatment of cancer
WO2001058957A2 (en) * 2000-02-11 2001-08-16 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
DE60139944D1 (de) 2000-10-12 2009-10-29 Genentech Inc Niederviskose konzentrierte proteinformulierungen
US20030133939A1 (en) * 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
WO2002069232A2 (en) 2001-02-19 2002-09-06 Merck Patent Gmbh Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity
WO2002072824A2 (en) 2001-02-20 2002-09-19 Bayer Aktiengesellschaft Human transient receptor potential channel protein.
US20040175756A1 (en) * 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050048512A1 (en) * 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050089932A1 (en) * 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050053973A1 (en) * 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
PT1390535E (pt) * 2001-04-26 2010-10-04 Amgen Mountain View Inc Bibliotecas combinatórias de domínios monoméricos
CA2444483A1 (en) * 2001-04-26 2002-11-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Diagnostic imaging compositions, their methods of synthesis and use
CA2491864C (en) 2001-07-12 2012-09-11 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US7371849B2 (en) * 2001-09-13 2008-05-13 Institute For Antibodies Co., Ltd. Methods of constructing camel antibody libraries
US20030211075A1 (en) * 2001-09-27 2003-11-13 Thorpe Philip E. Combined compositions for tumor vasculature coagulation and treatment
US7115716B2 (en) * 2001-11-19 2006-10-03 Eli Lilly And Company Tumor specific monoclonal antibodies
SI1475101T1 (sl) 2002-02-14 2011-03-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Farmacevtski proizvodi iz raztopine, ki vsebuje protitelo
EP1494714A4 (en) * 2002-04-05 2008-03-05 Amgen Inc HUMAN ANTI-OPGL NEUTRALIZING ANTIBODIES AS SELECTIVE OPGL PATH HEMMER
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
US7754884B2 (en) * 2005-01-03 2010-07-13 Vanderbilt University Targeted, NIR imaging agents for therapy efficacy monitoring, deep tissue disease demarcation and deep tissue imaging
US7691374B2 (en) * 2002-10-23 2010-04-06 Health Research, Inc. Method for increasing the efficacy of anti-tumor agents by anti-endoglin antibody
US7097836B1 (en) * 2002-10-23 2006-08-29 Health Research, Inc. Method for increasing the efficacy of anti-tumor agents by anti-endoglin antibody
DE10303664A1 (de) * 2003-01-23 2004-08-12 Nemod Immuntherapie Ag Erkennungsmoleküle zur Behandlung und Detektion von Tumoren
US7120987B2 (en) 2003-08-05 2006-10-17 Avery Dennison Corporation Method of making RFID device
WO2005037867A1 (en) * 2003-10-15 2005-04-28 Pdl Biopharma, Inc. ALTERATION OF Fc-FUSION PROTEIN SERUM HALF-LIVES BY MUTAGENESIS OF POSITIONS 250, 314 AND/OR 428 OF THE HEAVY CHAIN CONSTANT REGION OF IG
AU2004284090A1 (en) * 2003-10-24 2005-05-06 Avidia, Inc. LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
WO2007041643A1 (en) 2005-10-03 2007-04-12 University Of Tennessee Research Foundation Dietary calcium for reducing the production of reactive oxygen species
US8053569B2 (en) 2005-10-07 2011-11-08 Armagen Technologies, Inc. Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins
WO2008038127A2 (en) 2006-09-28 2008-04-03 Merck Serono S.A. Junctional adhesion molecule-c (jam-c) binding compounds and methods of their use
WO2008045373A2 (en) 2006-10-06 2008-04-17 Amgen Inc. Stable antibody formulations
ES2925992T3 (es) 2006-10-20 2022-10-20 Amgen Inc Formulaciones estables de polipéptidos
TW200838875A (en) 2007-02-01 2008-10-01 Genentech Inc Combination therapy with angiogenesis inhibitors
CN101970472B (zh) 2007-06-06 2013-10-30 研究发展基金会 Rtef-1变体及其用于抑制血管发生的用途
CA2696049A1 (en) 2007-08-17 2009-02-26 Amgen Inc. Formulations of antibodies and fc-fusion molecules using polycations
US8524722B2 (en) 2007-09-14 2013-09-03 Bayer Intellectual Property Gmbh Substituted tricyclic compounds and methods of use thereof
AR069501A1 (es) 2007-11-30 2010-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti- vegf (factor de crecimiento endotelial vascular)
BRPI0905660A2 (pt) 2008-01-14 2015-07-07 Genentech Inc "método para reduzir ou inibir a angiogênese"
PE20110677A1 (es) 2008-08-29 2011-09-16 Bayer Ip Gmbh Polimorfo b de la n-(2-aminofenil)-4-[n-(piridin-3-il) metoxicarbonilamino-metil]benzamida (ms-275)
AU2009294414A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Medimmune Llc Antibodies directed to CD105 and uses thereof
US8699361B2 (en) 2008-09-30 2014-04-15 Qualcomm Incorporated Out-of-synchronization handling method and apparatus
US20100082438A1 (en) 2008-10-01 2010-04-01 Ronnie Jack Garmon Methods and systems for customer performance scoring
EP2196476A1 (en) 2008-12-10 2010-06-16 Novartis Ag Antibody formulation
BRPI1006519A2 (pt) 2009-03-06 2016-08-09 Genentech Inc formulação de anticorpos
US8221753B2 (en) 2009-09-30 2012-07-17 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Endoglin antibodies
EP2722055A1 (en) 2009-08-17 2014-04-23 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with antibodies and anti-VEGF agents for the treatment of cancer
CN103108658B (zh) 2010-07-02 2015-08-19 米迪缪尼有限公司 抗体制剂
CN108341863A (zh) 2011-04-20 2018-07-31 阿塞勒隆制药公司 内皮糖蛋白多肽及其用途
JP2014524417A (ja) 2011-08-01 2014-09-22 タフツ メディカル センター インコーポレイテッド 心不全および関連状態の処置
UA115789C2 (uk) 2012-09-05 2017-12-26 Трейкон Фармасутікалз, Інк. Композиція антитіла до cd105 та її застосування
US10214590B2 (en) 2013-09-20 2019-02-26 Tufts Medical Center, Inc. Inhibitors of endoglin activity for the treatment of fibrosis
US9926375B2 (en) 2014-11-12 2018-03-27 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof
AU2015346444A1 (en) 2014-11-12 2017-05-04 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020136725A1 (en) * 1996-01-17 2002-09-26 Smithkline Beecham Corporation Antithrombotic agents
US20060223096A1 (en) * 2005-03-25 2006-10-05 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules directed to MCSP and having increased Fc receptor binding affinity and effector function

Also Published As

Publication number Publication date
US20170044267A1 (en) 2017-02-16
BR112012007318A2 (pt) 2016-11-22
CN102762227A (zh) 2012-10-31
ES2776977T3 (es) 2020-08-03
AU2010300668B2 (en) 2013-01-17
CA2775810C (en) 2018-04-24
JP5960203B2 (ja) 2016-08-02
US20120294864A1 (en) 2012-11-22
US9944714B2 (en) 2018-04-17
US9150652B2 (en) 2015-10-06
WO2011041441A1 (en) 2011-04-07
JP5632002B2 (ja) 2014-11-26
US8221753B2 (en) 2012-07-17
KR101398707B1 (ko) 2014-05-27
IL218724A0 (en) 2012-06-28
AU2010300668A1 (en) 2012-05-17
CN104788562A (zh) 2015-07-22
EA201290173A1 (ru) 2012-11-30
KR20120108973A (ko) 2012-10-05
US20200048360A1 (en) 2020-02-13
US9518122B2 (en) 2016-12-13
EP2482848B1 (en) 2020-01-15
EP2482848A1 (en) 2012-08-08
US20160009811A1 (en) 2016-01-14
CN104788562B (zh) 2019-06-28
CN102762227B (zh) 2015-04-22
JP2013506677A (ja) 2013-02-28
US20140314742A1 (en) 2014-10-23
JP2014209918A (ja) 2014-11-13
US20110076263A1 (en) 2011-03-31
EP2482848A4 (en) 2013-04-17
CA2775810A1 (en) 2011-04-07
BR112012007318B1 (pt) 2020-03-10
US20180194854A1 (en) 2018-07-12
US8609094B2 (en) 2013-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA025174B1 (ru) Антитела против эндоглина
JP6000427B2 (ja) 抗エンドグリン抗体及び抗ｖｅｇｆ剤を用いる癌の併用療法
CN108785669A (zh) 抗体制剂及其用途
US20180057602A1 (en) Combination therapy of cancer with anti-endoglin antibodies and anti-vegf agents

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU