JP2003034700A - ＣＤ４４ｖ６に対する抗体分子 - Google Patents

ＣＤ４４ｖ６に対する抗体分子

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JP2003034700A JP2002178280A JP2002178280A JP2003034700A JP 2003034700 A JP2003034700 A JP 2003034700A JP 2002178280 A JP2002178280 A JP 2002178280A JP 2002178280 A JP2002178280 A JP 2002178280A JP 2003034700 A JP2003034700 A JP 2003034700A
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ギュンター エル アドルフ
Erik Patzelt
エリック パッツェルト
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Abstract

(57)【要約】 【課題】従来のv6特異的抗体に比して明らかに優れた特
性を有する抗体分子を提供すること。 【解決手段】 受託番号DSM ACC2174で同定されるハイ
ブリドーマ細胞が産生するVFF-18と命名された抗体に由
来する組換え抗体分子。また、本発明は上記抗体分子を
含む腫瘍治療用医薬組成物および上記抗体を用いた腫瘍
検出方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、CD44遺伝子の変異
体(variant)エキソンv6によってコードされるエピトー
プに対するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体
から誘導される抗体分子、及び診断及び治療の目的のた
めの抗体又は抗体分子の利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、表面糖蛋白CD44の変異体の発現
が、非転移性ラット繊維肉腫細胞株のみでなく、非転移
性ラット膵臓腺癌細胞株の、いわゆる自発的な転移作用
を引き起こすことに必要且つ十分であることが示された
(Gunthertら,1991)。最も小さいCD44イソ型、標準型CD4
4（すなわちCD44std）は、上皮細胞を含む種々の組織で
遍在的に発現するが、ある種のCD44スプライシング変異
体（CD44ｖ、CD44var）は上皮細胞のサブセット(subse
t)でのみ発現する。CD44変異体は、１０個のエキソン
（v1-v10）の配列がCD44ｓ中で完全に除去されるような
選択的なスプライシングによって生じるが、異なる組み
合わせ中でより大きな変異体に生じることができる(Scr
eatonら,1992; Tolgら,1993; Hofmannら,1991)。変異体
は、タンパク質の細胞外部位の一定の部位に種々のアミ
ノ酸配列が挿入している点で異なっている。そのような
変異体は、ヒトの腫瘍組織及び種々のヒト腫瘍細胞にお
いて検出することができる。そこで、結腸直腸の発癌の
過程におけるCD44の発現が近年研究された(Heiderら,19
93a）。CD44変異体の発現は、正常ヒト結腸上皮細胞で
は見られず、増殖する腺窩細胞では弱い発現のみが検出
される。腫瘍の進行の後期においては、例えば、腺癌、
全ての悪性腫瘍においてCD44の変異体が発現する。高濃
度のCD44変異体の組織発現は、攻撃的なNon-Hodgkinリ
ンパ腫においても見られる(Koopmanら,1993)。
【０００３】エキソンv6は、特に転移が広がる間に、特
別の役割をするらしい(Rudyら，1993)。動物モデルにお
いて、v6特異的エピトープに対する抗体は転移細胞の定
着及び転移の増大を妨げることができる(Seiterら,199
3)。結腸癌においては、v6の発現は腫瘍の増殖と相関関
係がある(Wielengaら,1993)。胃癌においては、v6の発
現は、腸管型腫瘍を拡散型腫瘍と区別するための重要な
診断マーカーである(Heiderら,1993b)。後の２つの刊行
物において、v6の発現はv6特異的エピトープに対する抗
体を用いて検出されている。エキソンv6によってコード
されるエピトープに対するモノクローナル抗体は当業界
において知られている(Hofmannら,1991; Wielengaら,19
93)。そのような抗体には、診断及び治療において高い
潜在的な有用性があるので、改良された特性を有する抗
体が必要とされる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来のv6特
異的抗体に比して明らかに優れた特性を有する抗体分子
を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、DSM-Deutsche
Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen Gmb
H，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germa
nyにおいて、番号DSMACC2174で寄託されたハイブリドー
マ細胞が産生するVFF-18と命名された抗体に由来する組
換え抗体分子に関する。また、本発明は上記抗体分子を
含む腫瘍治療用医薬組成物および上記抗体を用いた腫瘍
検出方法に関する。「抗体」又は「抗体分子」という用
語は、以後、完全な免疫グロブリンだけでなく、結合特
異性及び親和性に関して同等の物質及び記載の抗体誘導
体及び組み換え抗体分子をいう。
【０００６】
【発明の実施の形態】抗体VFF-18は、実施例１の方法で
調製されている。この抗体は、寄託されたハイブリドー
マ細胞株からも得ることができる。本発明の抗体誘導体
を調製すること、又は抗体の配列分析から始め、及び／
又はこの抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を用いる
ことにより同じイディオタイプの組み換え抗体分子、即
ち、抗原結合部位（相補的決定部位、CDR）に抗体VFF-1
8と同じアミノ酸配列を有する抗体分子を調製すること
は、当業者の技術の範囲である。従って、組み換え抗体
分子だけでなくそのような誘導体は、明らかに本発明に
含まれる。例えば、Fab又はF(ab')2フラグメント又はそ
の他のフラグメントはVFF-18抗体の完全な免疫グロブリ
ンから生成することができる(Kreitmanら,1993)。診断
の手順のために、例えば、VFF-18抗体分子、それのフラ
グメント又は同じイディオタイプの組み換え抗体分子
を、131I,111In,99mTc等の放射活性アイソトープ又は放
射活性化合物(Larsonら,1991; Thomasら,1989; Srivast
ava，1988)、パーオキシダーゼ又はアルカリホスファタ
ーゼ等の酵素(Catty及びRaykundalia,1989)、蛍光色素
(Johnson,1989)又はビオチン分子(Guesdonら,1979)と結
合させることができる。治療に適用するためには、VFF-
18又はVFF-18から誘導される抗体分子を、毒素(vitetta
ら,1991; Vitetta及びThorpe，1991; Kreitmanら,1993;
Theuerら,1993)、細胞成長抑止剤(Schrappeら，199
2)、プロドラッグ(Wangら,1992; Senterら,1989)又は放
射活性物質と結合させることができる。更に、抗体をサ
イトカイン又は免疫調節ポリペプチド、例えば腫瘍壊死
因子又はインターロイキン−２と結合させることができ
る。
【０００７】更に、抗体VFF-18のアミノ酸配列の分析
後、及び／又はこの抗体を生産するハイブリドーマ細胞
株の使用により、特にこの細胞内に含有される遺伝情報
の解析により、当業者はVFF-18と同じイディオタイプの
組み換え抗体分子を生産することができる。これを達成
する方法は技術水準の一部を形成する。例えば、このよ
うな組み換え抗体は、抗体(Shinら,1989; Gussow及びSe
emann,1991)、二価特異的抗体(bispecific antibodies)
(Weinerら,1993; Goodwin,1989)、一本鎖抗体(scFV，Jo
hnson及びBird，1991)、完全な又は断片的な免疫グロブ
リン(Colomaら,1992; Nesbitら,1994，Barbasら,199
2)、又は鎖をシャッフルすることによって生成した抗体
(Winterら,1994)を人体に適応させることができる。人
間に適応させる抗体は、例えば、CDRグラフティング(CD
R grafting)によって生成することができる(EP 023940
0)。枠組み部分も修飾してもよい(EP 0519596)。最近で
は、抗体を人間に適応させるために、PCR（例えば、EP
0368684; EP 0438310; WO 9207075を参照されたい）等
の方法又はコンピューターモデリング（例えば、WO 922
2653を参照されたい）が用いられる。融合タンパク質、
例えば、一本鎖抗体／毒素融合タンパク質も生産される
(Chaudharyら,1990; Friedmanら,1993)。従って、この
種の抗体分子は、本発明に含まれる。更に、VFF-18の正
確なエピトープを同定すること、及びこの知識をもって
同じ結合特異性を有する等価の抗体を生産することは当
業者の技術範囲である。正確なエピトープは、実施例２
に示すペプチド結合研究、例えば、ペプチドHu1の配列
を変えることにより同定される。従って、このような抗
体も本発明の範囲内である。
【０００８】本発明の更なる側面は、診断及び治療のた
めの、VFF-18、VFF-18の誘導体又はそれらと等価の抗体
分子の利用である。診断方法は、本発明の抗体分子を用
いる公知の方法、例えば、酵素−結合免疫アッセイ(ELI
SA，Catty及びRaykundalia，1989)、ラジオイムノアッ
セイ(Catty及びMurphy，1989)、免疫組織化学的方法(He
iderら,1993b)又はウエスタンブロット等に基づいて行
うことができる。このような方法は、適切には、例え
ば、生検として体から得られる組織試料又は液体で行わ
れる。このような分析は、定性的、半定量的又は定量的
に行われる。抗体又は抗体分子は、他のv6特異的抗体に
ついて先行技術において記載されているように用いら
れ、本発明による抗体又は抗体分子の有益な特性は、そ
のような工程に重要な改良を構成する。
【０００９】in vitroの診断（検出）に加え、本発明の
抗体分子はin vivoの診断（検出）、特に腫瘍の診断
（腫瘍の検出）に適している。抗体分子が検出できるラ
ベルを有していれば、ラベルは診断の目的のために、例
えば、in vivoで腫瘍の像を描くため、又は放射線誘導
手術(radioguided surgery)のために検出できる。免疫
シンチグラフィー（画像）のための放射活性アイソトー
プと結合した抗体の利用としては、例えば、本発明を実
施することができる多くの方法がある(Siccardiら,198
9; Keenanら,1987; Perkins及びPimm,1992; Colcherら,
1987; Thompsonら,1984)。
【００１０】治療への適用は、例えば、抗体ＡＳＭＬ1.
1の利用に類似して行うことができる(Seiterら,1993)。
抗体分子は、例えば、静脈（丸薬又はパーマントインフ
ュージョン）、腹膜内、筋肉内又は皮下注射又は点滴で
全身又は局所に投与される。また、単一の組織、又は手
足が灌流される。結合した、又は非結合抗体の投与のた
めの計画案が論文に見出される(Mulshineら,1991; Lars
onら,1991; Vitetta及びThorpe，1991; Vitettaら,199
1; Breitzら,1992; Pressら,1989; Weinerら,1989; Cha
talら,1989; Searsら,1982)。VFF-18の、他の抗CD44v6
抗体に比して優れた特性は、実施例２〜４に示されてい
る。
【００１１】
【実施例】実施例１：モノクローナル抗体VFF-18の製造 pGEX融合タンパク質のクローニン グ CD44ｖのHPKIIタイプの完全な変異部位をヒトケラチノ
サイトcDNA由来のポリメラーゼチェーンリアクション
（PCR）で増幅した(Hofmannら，1991)。用いられた２種
のPCRプライマー（Hofmannらによって記載されたLCLC97
変異部位の２５〜５２位の5'-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAA
AATG-3'（配列番号１）、１０１３〜９８４位の5'-TGAT
AAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3'（配列番号２））は、
ベクターpGEX-2Tに直接PCR生成物をクローンするために
用いられるEcoRI認識部位を含有する(Smithら,1988)。
得られた構築物（pGEX CD44v HPKII、v3-v10）は、日本
住血吸虫（Schistosoma japonicum）のグルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼとヒトCD44のエキソンv3〜v10
を含む、約70kdalの融合タンパク質をコードする（図
１;Heiderら,1993a）。この融合タンパク質は大腸菌中
で発現され、次いでグルタチオンアガロースを用いたア
フィニティークロマトグラフィーにより精製された(Smi
thら,1988)。
【００１２】免疫及びスクリーニング アフィニティー精製した融合タンパク質を用いて、以下
に示す計画によりメスのBalb/cマウスを腹腔注射により
免疫した。 1.免疫：Freundの完全アジュバント中の９０ｇの融合タ
ンパク質 2.及び3.免疫：Freundの不完全アジュバント中の５０ｇ
の融合タンパク質 免疫は、それぞれ４週間隔で行った。最後の免疫の１４
日後に、１０μｇの融合タンパク質を含むリン酸緩衝生
理食塩水（ＰＢＳ）で３日連続して追加免疫した。次の
日、抗体価の高い動物の脾臓細胞を、ポリエチレングリ
コール4000を用いてP3.X63-Ag8.653マウス骨髄腫細胞と
融合した。ハイブリドーマ細胞をHAT培地中のマイクロ
タイタープレート中で選択した(Kohler及びMilstein,19
75; Kearneyら,1979)。
【００１３】血清中の抗体価の決定又はハイブリドーマ
上清のスクリーニングを、それぞれ、ELISAを用いて行
った。この検定において、マイクロタイタープレート
を、先ず、融合タンパク質(GST-CD44v3-10)又はグルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼでコートした。次い
で、ウェルを連続希釈した血清又はハイブリドーマ上清
とインキュベートし、特定の抗体をマウス免疫グロブリ
ンに対するパーオキシダーゼ結合抗体で検出した。グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとのみ反応するハイ
ブリドーマを廃棄した。次いで、残りの抗体を、領域特
異的融合タンパク質（エキソンv3、エキソンv5＋v6、エ
キソンv6＋v7、エキソンv8〜v10）を用いて特徴づけた
(Koopmanら,1993)。その後、ヒト皮膚切片でこれらの抗
体の免疫組織化学的反応試験を行った。次いで、抗体VF
F-18を合成ペプチドHu1(QWFGNRWHEGYRQT(配列番号４))
との結合によって同定した。Hu1の配列はヒトCD44エキソ
ンv6の断片である。
【００１４】＜配列表フリーテキスト＞ 配列番号１および２：PCRプライマー
【００１５】実施例２：CD44v6特異的抗体の合成ペプチ
ドへの結合 CD44v6特異的抗体の合成ペプチドへの結合をELISAによ
り検出した。 溶液： コーティングバッファー： ０.０５Ｍ 炭酸ナトリウム，ｐＨ９.６ 検定バッファー：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水） ０.５％ＢＳＡ（牛血清アルブミン） ０.０５％Tween20 基質溶液： Kierkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg MD，USA; TMBパーオキシダーゼ基質：パーオキシダーゼ溶液Ｂ（H2O2）1:1
【００１６】ペプチド（コーティングバッファー中50μ
g/ml濃度）をNUNC Maxisorp immunoplate(1.1ASML)又は
Bio Products由来のActi Aプレート（VFF 抗体）に４℃
で一晩固定した。Acti Aプレートの場合は、ペプチドは
プレートに共有結合で結合した。次いで、プレートをPB
S/0.05％ Tween20で洗浄し、プレート表面のフリーの吸
着部位を検定バッファーを用いてブロックし（室温で１
時間）、再びPBS/0.05％ Tween20で洗浄した。Acti Aプ
レートを、１０ｍＭ硼化水素ナトリウム加２０ｍＭ炭酸
水素ナトリウム，ｐＨ９.０で希釈し（室温で１時間攪
拌しながら）、次いで３回洗浄した。0.02〜10.0μg/ml
の濃度のハイブリドーマ上清又は抗体溶液を、それぞれ
ウェルに加え、室温で２時間振盪させた。その後、プレ
ートをPBS/0.05％ Tween20で３回洗浄した。次いで、検
定バッファー中に、適当に希釈された西洋ワサビパーオ
キシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体を100μｌ／ウェル
加えた。
【００１７】振盪しながら２時間室温でインキュベート
した後、プレートを３回洗浄し、基質溶液をウェルに加
えた。１０〜１５分後、２Ｍ硫酸で現像を止め、分光光
度計で４５０ｎｍ（対照：６９０ｎｍ）の吸光度を測定
した。最初の実験で、ラットCD44v6特異的抗体1.1ASML
のペプチドＲａ１(KWFEN EWQGK NPPT（配列番号３）)ヘ
の結合が検出された(表１、図３(A))。
【００１８】
【表１】表１．
【００１９】別の実験では、Ra1と相同のヒトCD44v6配
列由来のペプチドが合成された(Hul，QWFGN RWHEG YRQT
(配列番号４)))。種々の抗−ヒトCD44v6抗体がHu1と結
合した。驚くことに、VFF-18は、試験した他の抗体に比
して、このペプチドと高い結合アフィニティーを示した
(表２、図３(B))。
【００２０】
【表２】表２．
【００２１】定量的な評価のために、種々の濃度におけ
る精製抗−ヒトCD44v6抗体をペプチドHu1と結合させ
た。ここでも、他の抗体に比して、VFF-18の実質的に良
い結合アフィニティーが見られた(表３、図３(C))。
【００２２】
【表３】表３．
【００２３】実施例３：放射活性ラベルしたCD44v6特異
的抗体の腫瘍細胞株への結合 抗体の放射活性ラベル 1mCiのN-スクシニミジル−[2,3-3H]−プロピオネート
（[3H]-NSP,Amersham，１mCi/ml）を、０℃で、シリコ
ーンで処理した試料容器中で、水流ポンプ中で、ほとん
ど乾燥するまで蒸発させた。１５μｇの抗体（PBS,pH7.
4中、１mg/ml濃度）を加え、４℃で４８時間インキュベ
ートした。次いで、３０μｌのPBS中の１Ｍグリシンと
室温で２０分間反応させることにより、過剰の[3H]-NSP
を消滅させた。[3H]-グリシンからのラベル化抗体の分
離は、セファデックスG-25-M（カラム容積：１５ｍ
ｌ）、及び溶出バッファーとしてPBS/0.5%BSAを用いて
行った。[ 3H]-ラベル化抗体はボイドボリュームに現れ
た。抗体の量をマウス免疫グロブリン検出用のELISAを
用いて定量し、特異的活性を計算した。
【００２４】放射ラベル化抗体の腫瘍細胞への結合 ３種の抗体、VFF-7（抗−v6）、VFF-8(抗-v5)及びVFF-1
8（抗−v6）をＮ−スクシニミジル−[2,3-3H]−プロピ
オネートで放射ラベルし、種々の腫瘍細胞株で結合検定
に用いた。以下の細胞株を用いた：即ち、CHO-CD44va
r：細胞表面でヒト変異体CD44（エキソンv3-v10）を発
現する組換えハムスター細胞株（チャイニーズハムスタ
ー卵巣）：HCT-116、CX-1、HT-29、CaCo、COLO 205、ヒト結
腸癌細胞株：A431：ヒト扁平上皮細胞癌細胞株を用い
た。細胞を１２ウェルの組織培養プレートに接種し、CO
2インキュベーター中で３７℃で一晩培養し、ＰＢＳで
洗浄しエタノールで固定した（室温で１分）。次いで、
細胞を培養培地（RPMI 1640/10％牛胎児血清）で洗浄
し、放射活性抗体（培養培地に溶解したもの、250000dp
m/ウェル）を加えた。振盪しながら室温で２５時間イン
キュベートした後、プレートをPBS/0.5％BSAで３回洗浄
し、０.１Ｍ水酸化ナトリウム／１％Triton X-100で細
胞を可溶化し放射活性をシンチレーションカウンターで
測定した。１００倍過剰のラベルしていない抗体の存在
下、非特異的結合を検出した。結合は、標準細胞数と相
関関係があった（400000細胞）。抗体の特異的活性を検
出した後、結合抗体の量をfmolで表した。
【００２５】表４及び図４に、抗体の種々の細胞への特
異的結合を示した。v6特異的抗体VFF-7及びVFF-18の組
み換え細胞株CHO-CD44varへの結合はほぼ同じ程度であ
るが、これらの抗体は、腫瘍細胞株に対しては実質的に
異なる結合作用を示す。いくつかのケースにおいては、
VFF-18のみが結合を示し、より小さい範囲でVFF-8の結
合も見られ（HT-29、CaCo、COLO 205）、他のケースではV
FF-18がVFF-7よりも顕著に結合した。
【表４】表４．
【００２６】実施例４：血清中の可溶性CD44v6の検出のためのELISA 溶液： コーティングバッファー： 0.05M炭酸ナトリウム，ｐＨ９.６ 検定バッファー：PBS（リン酸緩衝生理食塩水） 0.5％BSA（牛血清アルブミン） 0.05％Tween 20 試料希釈液 Bender MedSystems，Vienna，Austria 基質溶液： Kierkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg MD，USA; TMBパーオキシダーゼ基質：パーオキシダーゼ溶液Ｂ(H2O2)1:1
【００２７】マイクロタイタープレート(Nunc-Immunopl
ate MaxiSorp F96)を５μg/mlのCD44v6特異的抗体でコ
ートした（４℃で一晩インキュベート）。その後、プレ
ートをPBS/0.05%Tween 20で洗浄し、プレート表面のフ
リーの吸着部位を検定バッファーを用いてブロックし
（室温で１時間）、プレートを再び洗浄した。血清試料
を検定バッファーで予め少なくとも１：５に希釈し、ウ
ェル内で更に連続的に１：２に希釈した。次いで、検定
バッファーで適当に希釈した(1:3000 - 1:10000)西洋ワ
サビパーオキシダーゼ結合抗−CD44std抗体(Clone BU-5
2，The Binding Site，Birmingham)を50μｌ／ウェル加
えた。振盪しながら室温で３時間インキュベートした
後、プレートを３回洗浄し、基質溶液を加えた。１０〜
１５分後、２Ｍ硫酸で発色を止め、分光光度計で450ｎ
ｍ（対照：690ｎｍ）の吸光度を測定した。
【００２８】定量化のために、可溶性CD44標準試料の検
定バッファーによる連続希釈液を血清試料と並行して準
備した。この試料は、可溶性CD44v3-v10を発現する組換
えハムスター細胞（ＣＨＯ）の上清から精製した。CD44
v3-v10は、エキソンv3-v10を含むヒトCD44変異体であ
る。表５及び図５は、正常ヒト血清中にエキソンv6を含
む可溶性CD44変異体が存在することを示す。３種のv6特
異的抗体VFF-4、VFF-7及びVFF-18を、サンドイッチELIS
Aにおけるコーティング抗体として用いた。３種の全て
のケースにおいて、パーオキシダーゼ結合CD44std特異
的抗体(BU-52,std＝標準)を検出抗体として用いた。種
々の希釈において２種の正常ヒト血清のシグナルが見ら
れた((A)及び(B))。両方のケースにおいて、VFF-18で
は、他の抗体に比して実質的に強いシグナルが観察され
た。
【００２９】
【表５】表５A （血清１）
【００３０】
【表６】表５ （血清２）
【００３１】表６及び図６は、CD44変異体を含むv6の血
清中の濃度を示す。６人の健康人ドナーの血清中の可溶
性CD44varの量を２種のELISAで定量した。１つの試験で
はVFF-7を、他の試験ではVFF-18をコーティング抗体と
して用いた。両方のケースにおいて、コントロールとし
てCHO細胞中で生産される組換え可溶性CD44変異体（エ
キソンv3-v10）を用いた。VFF-18 ELISAはVFF-7 ELISA
に比して平均３.５倍高い値を示した。これは、組換え
タンパク質と比較しての値を意味する。血清中に存在す
る可溶性CD44varは、VFF-7よりもVFF-18により良く認識
される。
【００３２】
【表７】表６．
【００３３】参考文献
【００３４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Boehringer Ingelheim International GmbH Forschungszentrum Karlsruhe GmbH <120> Antibody molecules against CD44v6 <130> X1J0882 <140> <141> <150> DE P 44 19 913.9 <151> 1994-06-08 <150> DE P 44 31 297.0 <151> 1994-09-02 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 1 caggctggga gccaaatgaa gaaaatg 27 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 2 tgataaggaa cgattgacat tagagttgga 30 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Rat <400> 3 Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gln Gly Lys Asn Pro Pro Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 42 <212> PRT <213> Rat <400> 5 Trp Ala Asp Pro Asn Ser Thr Thr Glu Glu Ala Ala Thr Gln Lys Glu 1 5 10 15 Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gln Gly Lys Asn Pro Pro Thr Pro Ser 20 25 30 Glu Asp Ser His Val Thr Glu Gly Thr Thr 35 40 <210> 6 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu 1 5 10 15 Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg 20 25 30 Glu Asp Ser Gly Ser Thr Thr Gly Thr Ala Ala 35 40
【図面の簡単な説明】
【図１】 GST-CD44(v3-v10)融合タンパク質の図による
説明。GST＝Schistosomajaponicumのグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ。v3-v10＝ケラチン生成細胞CD44
の変異体挿入物。矢印は、トロンビン切断部位。
【図２】 ヒト（配列番号６）及びラット（配列番号
５）のCD44遺伝子のエキソンv6の配列の比較。抗体1.1A
SML（抗−ラットCD44v6）又はVFF-18（抗−ヒトCD44v
6）によって認識されるペプチドRa1及びHu1の配列を、
それぞれ太字で表した。一致するアミノ酸をアステリス
クで印をつけた。
【図３】 CD44v6特異的抗体の合成ペプチドへの結合。
ペプチドへの抗体の結合は、ペプチドを固定し抗体溶液
とインキュベーションするELISAにより検出した。適当
な洗浄工程の後、結合した抗体をパーオキシダーゼ結合
抗−マウスＩｇＧ抗体で検出した。 (A):最初の実験で、CD44v6ラット特異的抗体1.1ASMLの
ペプチドRa1(KWFEN EWQGK NPPT（配列番号３）)への結
合が証明された。 (B):別の実験で、Ra1に同族であるがヒトCD44v6配列由
来のペプチドが合成された。別の抗−ヒトCD44v6ハイブ
リドーマの上清がHu1(QWFGN RWHEG YRQT（配列番号
４）)と呼ばれるペプチドに結合した。VFF-18が、試験
した他の抗体よりもペプチドに良く結合することが見出
された。 (C):定量的な評価のために、実験を精製された抗体の種
々の濃度で繰り返した。また、この実験で、VFF-18が他
の抗体に比較して高い結合アフィニティーを示すことが
わかった。
【図４】 放射活性抗体の腫瘍細胞への結合。３種類の
抗体、VFF-7（抗−v6）、VFF-8(抗-v5)及びVFF-18（抗
−v6）がN-スクシニミル[2,3-3Ｈ]プロピオネートで放
射活性ラベルされ、種々の腫瘍細胞株で結合検定に用い
られた。以下の細胞株が用いられた：即ち、CHO-CD44va
r：細胞表面でヒト変異体CD44（エキソンv3-v10）を発
現する組み換えハムスター細胞株（チャイニーズハムス
ター卵巣）；HCT-116、CX-1、HT-29、CaCo、COLO 205、ヒト
結腸癌細胞株；A431：ヒト扁平上皮細胞癌細胞株が用い
られた。抗体の種々の細胞株への特異的結合が見られ
た。v6特異的抗体VFF-7及びVFF-18の組み換え細胞株CHO
-CD44varへの結合は同じ程度であるが、抗体は、腫瘍細
胞株に関しては異なる結合の作用を示す。いくつかのケ
ースにおいては、VFF-18と少しの程度のVFF-8の結合の
みが見られ(HT-29、CaCo、COLO 205)、他のケースではVFF
-18はVFF-7よりも非常に良く結合する。
【図５】 ヒト正常血清中のエキソンv6を含む可溶性CD
44変異体の検出。３種類のv6に特異的な抗体、VFF-4、V
FF-7及びVFF-18が、サンドウィッチELISAにおけるコー
ティング抗体として用いられた。３種類の全てのケース
において、検出抗体として、パーオキシダーゼ結合CD44
std特異的抗体（BU-52、std＝標準）が用いられた。種
々の希釈における２種類の正常ヒト血清のシグナルがこ
れらの検定((A)及び(B))で示された。両方のケースにお
いて、他の２種類の抗体に比較してVFF-18で、実質的に
強いシグナルが示された。
【図６】 v6を含むCD44変異体の血清中濃度。６人の健
康なドナーの血清中の可溶性CD44ｖａｒの含量が２種の
ELISAによって定量された。１つの試験ではVFF-7が用い
られ、他の試験ではVFF-18がコーティング抗体として用
いられた。両方の抗体はエキソンv6を認識する。両方の
ケースにおいて、CHO細胞中で生産された組み換え可溶
性CD44変異体（エキソンv3-v10）がコントロールとして
供給された。平均で、VFF-18 ELISAは、VFF-7 ELISAに
比して3.5倍高い値を示した。これは、血清中に現れるC
D44varは、VFF-7よりもVFF-18によってより良く認識さ
れることを意味する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 502178791 フォルシュングスツェントルム カルルス ルーエ ゲゼルシャフト ミット ベシュ レンクテル ハフツング ドイツ連邦共和国 デー76133 カルルス ルーエ ポストファッハ 3640 (72)発明者 アドルフ ギュンター エル オーストリア アー1070 ウィーン シュ ティフトガッセ 15−17−10 (72)発明者 パッツェルト エリック オーストリア アー3002 プンケルスドル フ ハンス ブッフミューラー ガッセ ８ Ｆターム(参考） 4C085 AA14 AA16 BB01 BB31 CC02 CC03 CC07 CC29 DD22 DD23 DD33 DD63 EE01 FF20 4H045 AA11 BA16 BA19 BA53 BA71 CA41 DA76 EA51 FA72

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 寄託番号DSM ACC2174のハイブリドーマ
    細胞株によって生産される抗体VFF-18のイディオタイプ
    を有する組換え抗体分子。
  2. 【請求項２】 相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列
    が、寄託番号DSM ACC2174のハイブリドーマ細胞株によ
    って生産される抗体VFF-18のCDRのアミノ酸配列と同一
    である、組換え抗体分子。
  3. 【請求項３】 キメラ分子、ヒト化抗体又は一本鎖抗体
    であるか、又は鎖のシャッフリングによって生成した抗
    体分子であることを特徴とする、請求項１または２に記
    載の組換え抗体分子。
  4. 【請求項４】 他の分子又は放射活性アイソトープに結
    合していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか
    １項に記載の組換え抗体分子。
  5. 【請求項５】 寄託番号DSM ACC2174のハイブリドーマ
    細胞株によって生産される抗体VFF-18と同一のエピトー
    プを認識する抗体分子。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗
    体分子を使用することを特徴とする、ヒト又は動物の腫
    瘍のin vitro検出方法。
  7. 【請求項７】 酵素結合免疫アッセイ又はラジオイムノ
    アッセイであることを特徴とする、請求項６記載の方
    法。
  8. 【請求項８】 免疫組織化学的方法であることを特徴と
    する、請求項６記載の方法。
  9. 【請求項９】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗
    体分子を含む、腫瘍治療用医薬組成物。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    抗体分子を含む、invivo腫瘍診断用医薬組成物。
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