WO1998028625A1 - Verfahren zur diagnose und therapie von hodgkin-lymphomen - Google Patents

Verfahren zur diagnose und therapie von hodgkin-lymphomen Download PDF

Info

Publication number
WO1998028625A1
WO1998028625A1 PCT/EP1997/007081 EP9707081W WO9828625A1 WO 1998028625 A1 WO1998028625 A1 WO 1998028625A1 EP 9707081 W EP9707081 W EP 9707081W WO 9828625 A1 WO9828625 A1 WO 9828625A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
antibody molecule
vlo
exon
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/EP1997/007081
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Karl-Heinz Heider
Kurt Zatloukal
Christine Beham-Schmid
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh
Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh, Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh
Priority to US09/331,254 priority Critical patent/US6372441B1/en
Priority to CA002272855A priority patent/CA2272855A1/en
Priority to EP97954412A priority patent/EP0946880A1/de
Priority to JP52834198A priority patent/JP2001508052A/ja
Publication of WO1998028625A1 publication Critical patent/WO1998028625A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2884—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD44
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis

Definitions

  • the present invention relates to methods for diagnosing and treating Hodgkin's lymphomas (Ly phogranulomatosis) which are based on the expression of the variant exon vlO of the CD44 gene as a molecular target, agents for these methods and the use of these agents
  • the highly glycosylated cell surface protein CD44 is involved in the interaction between cells and the extracellular matrix such as migration and activation of leukocytes in inflammation and immune monitoring, precursors of leukocytic and myeloid cells in the bone marrow as well as the development of lymphoid organs and the interaction of cells with the extracellular Matrix involved (Lesley et al, 1993, Gunthert 1993, Pals et al, 1993, Mackay et al, 1994)
  • the human CD44 gene is composed of at least 19 exons, of which at least 12 that code for the extracellular region are alternatively spliced (Screaton et al, 1992)
  • the CD44 gene is transcribed in a number of normal tissues and carcinomas (Fox et al, 19 4), while the standard CD44 molecule (CD44s) is found ubiquitously expressed in epithelial and mesenchymal tissues different isoforms, which are generated by alternative RNA splicing, in a very restricted
  • the object of the present invention was to develop new methods for the diagnosis and therapy of Hodgkin lymphomas (lymphogranulomatosis) and to provide means for such methods
  • Hodgkin lymphomas lymphogranulomatosis
  • Antibody molecules with a corresponding specificity are particularly suitable as Vehicle to selectively target Hodgkin's lymphomas in vivo
  • the invention further relates to the use of an antibody molecule which is specific for an epitope within the amino acid sequence which is encoded by the variable exon vlO of the CD44 gene, for producing a pharmaceutical composition for the diagnosis and / or therapy of tumor diseases the tumor disease around Hodgkin's lymphoma (lymphogranulomatosis)
  • the invention further relates to an antibody molecule which is specific for an epitope within the amino acid sequence which is encoded by the variable exon vlO of the CD44 gene, for pharmaceutical use.
  • an antibody molecule is preferably characterized in that it binds to SEQ ID NO 2 In particular, act specifically as a monoclonal antibody, a Fab or F (ab ') 2 fragment of an immunoglobulin, a recombinantly produced antibody, a recombinantly produced chimeric or humanized antibody or single-chain antibody (scFv).
  • Such an antibody molecule is preferred linked to a radioactive isotope, radioactive compound, enzyme, toxin, cytostatic, prodrug, cytokine or other immunomodulatory polypeptide
  • nucleotide and amino acid sequence of the variant exon vlO of the CD44 gene is known (Screaton et al, 1992, Tolg et al, 1993). These sequences can be found in the sequence listing (SEQ ID NO 1 and 2). The existence of degenerate or allelic variants is for the implementation of the invention is not important, such variants are therefore expressly included
  • the invention can be carried out with polyclonal or monoclonal antibodies which are specific for an epitope which is encoded by the exon vlO.
  • the production of antibodies against known amino acid sequences can be carried out according to methods known per se (Catty, 1989).
  • a peptide of this sequence can be synthesized and used as an antigen in an immunization protocol.
  • Another way is to produce a fusion protein which contains the desired amino acid sequence by using a nucleic acid (which can be prepared synthetically or, for example, by polymerase chain reaction (PCR) from a suitable sample). , which codes for this sequence, is integrated into an expression vector and the fusion protein is expressed in a host organism.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the optionally purified fusion protein can then be used as antigen in an immunization protocol and insert-specific antibodies or, in the case of monoclonal antibodies, hybridomas, which express insert-specific antibodies can be selected using suitable methods.
  • Such methods are state of the art Heider et al. (1993, 1996) and Koopman et al. (1993) describe the production of antibodies against variant epitopes of CD44
  • antibody molecules derived from poly- or monoclonal antibodies can also be used for the method according to the invention, for example Fab or F (ab ') 2 fragments of immunoglobulins, recombinantly produced single-chain antibodies (scFv), chimeric or humanized antibodies as well as other molecules that bind specifically to epitopes that are encoded by exon vlO.
  • Fab or F (ab ') 2 fragments or other fragments can be generated from a complete immunoglobulin (Kreitman et al, 1993) furthermore able to produce recombinant VlO-specific antibody molecules. Corresponding methods are state of the art.
  • Such recombinant antibody molecules can eg be humanized antibodies (Shin et al, 1989, Gussow et Seemann, 1991), bispecific antibodies (Weiner et al, 1993, Goodwin, 1989), single-chain antibodies (scFv, Johnson et Bird, 1991), complete or fragmentary immunoglobulins (Coloma et al, 1992, Nesbit et al, 1992, Barbas et al, 1992), or antibodies generated by chain shuffling (Winter et al, 1994).
  • Humanized antibodies can be produced, for example, by CDR grafting (EP 0239400).
  • Framework regions can also be produced Modifications (EP 0519596) Methods such as PCR (see B EP 0368684, EP 0438310, WO 9207075) or computer modeling (see B WO 9222653) can be used for the humanization of antibodies. Fusion proteins, for example swg / ec / z ⁇ zn, can also be used Antibody / toxin fusion proteins (Chaudhary et al, 1990, Friedman et al, 1993) are produced and used.
  • the generic terms "antibodies” and “antibody molecules” are intended to include all polyclonal and monoclonal antibodies in this section Compounds fall, as well as other compounds that can be structurally derived from immunoglobulins and can be prepared by methods known per se
  • antibody molecules can be used, for example, with radioactive isotopes such as 1 1 I, ⁇ In, 9 9 ⁇ v ⁇ / c o c j er radioactive compounds (Larson et al, 1991, Thomas et al, 1989, Srivastava, 1988), enzymes such as peroxidase or alkaline Phosphatase (Catty et Raykundalia, 1989), linked with fluorescent dyes (Johnson, 1989) or biotin molecules (Guesdon et al, 1979)
  • IO-specific antibody molecules with radioisotopes such as 90 Y, ⁇ In, I31 I or 186 can be used Re (Quadri et al, 1993, Lenhard et al, 1985, Vriesendorp et al, 1991, Wilbur et al, 1989), toxins (Vitetta et al, 1991, Vitetta et Thorpe, 1991, Kreitman et al, 1993, Theuer
  • the diagnostic method according to the invention can advantageously be used to examine samples from patients, for example from * biopsies, in whom Hodgkin's lymphoma (lymphogranulomatosis) is suspected or the diagnosis already exists but the tumor is to be characterized more precisely.
  • Detection of variant CD44 -Molecules which contain an amino acid sequence which is encoded by the variable exon vlO can be carried out at the protein level by means of antibodies or at the nucleic acid level by means of specific nucleic acid probes or primers for the polymerase chain reaction (PCR).
  • the invention accordingly also relates to antibody molecules and nucleic acids which are suitable as probes or primers for such methods, and the use of such antibodies and nucleic acids for the diagnosis and analysis of Hodgkin's lymphomas, for example Tissue sections can be examined immunohistochemically with antibodies using methods known per se. Extracts or body fluids obtained from tissue samples can also be examined using other immunological methods using antibodies, for example in Western blots, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA, Catty et Raykundalia, 1989), Radioimmunoassays (RIA, Catty et Murphy, 1989) or related immunoassays The tests can be qualitative, semi-quantitative or quantitative.
  • the expression of the CD44 splice variant vlO in Hodgkin's disease is associated with aggressive behavior of the tumor and high risk of recurrence. It correlates with advanced stage and poor prognosis of NSHD (nodular sclerosis Hodgkin's disease)
  • antibody molecules with specificity according to the invention are also suitable for the diagnosis of Hodgkin's lymphomas.
  • the label can be detected for diagnostic purposes, for example visualization of the tumor in vivo (imaging, or, for example, for radio-assisted surgery (radwguided surgety), for the use of antibodies conjugated with radioactive isotopes for immunoscintigraphy (imagingJ, for example, there are a number of protocols on the basis of which the person skilled in the art can carry out the invention ( Siccardi et al, 1989, Keenan et al, 1987, Perkins et Pimm, 1992, Colcher et al, 1987, Thompson et al, 1984)
  • Data obtained by detecting and / or quantifying the expression of the variant CD44 epitope vlO can thus be incorporated into the diagnosis and prognosis.
  • the combination with other prognostic parameters, for example with the degree of tumor, can be advantageous
  • Antibody molecules with the specificity according to the invention and possibly linked to a cytotoxic agent can advantageously be used for the therapy of Hodgkin lymphomas (lymphogranulomatosis).
  • the application can be systemic or topical, for example intravenous (as a bolus or continuous infusion), intraperitoneal, intramuscular Subcutaneous injection or infusion protocols for the administration of conjugated or non-conjugated antibodies (whether as complete immunoglobulins, fragments, recombinant humanized molecules or the like) are state of the art (Mulshine et al, 1991, Larson et al, 1991, Vitetta et Thorpe, 1991 , Vitetta et al, 1991, Breitz et al, 1992, 1995, Press et al, 1989, Weiner et al, 1989, Chatal et al, 1989, Sears et al, 1982)
  • the antibody molecules can be formulated in a manner known per se.
  • the antibody molecules can be present, for example, in an aqueous solution which may be buffered with a physiologically acceptable buffer. Such a solution can be characterized by the addition of suitable stabilizers and auxiliary substances.
  • the antibody molecules can also be in the form of a freeze-dried preparation ( Lyophyllisate) are present, which is reconstituted with a suitable solvent, e.g. water, before use
  • a preferred embodiment of a therapeutic application consists of a humanized vlO-specific immunoglobulin or an F (ab ') 2 fragment thereof with 90 Y (Quadri et al, 1993, Vriesendorp et al, 1995), 131 I (Juweid et al, 1995, Press et al, 1995, Thomas et al, in Catty 1985, p.
  • 186 Re (Breitz et al, 1992, 1995) or another suitable radioisotope and to use them for radioimmunotherapy of Hodgkin's lymphomas
  • an antibody molecule can be linked to 90 Y using a chelating linker such as ITCB-DTPA (isothiocyanatobenzyl-diethylenetriaminepentaacteate), a specific activity of 5-20 mCi / mg, preferably 10 mCi / mg should be achieved -positive tumor in a dosage of 0 1 to 1 mCi / kg body weight, preferably 0 3 to 0 5 mCi / kg body weight, particularly preferably 0 4 mCi / kg, given a total to be administered Protein amount of 2 to 5 mg can be done in the form of a rapid intravenous bolus injection.
  • ITCB-DTPA isothiocyanatobenzyl-diethylenetriaminepentaacteate
  • Fig. 1 A. Single HRS (Hodgkin and Reed-Sternberg) cell of a patient without recurrence, which reacts with mAb VFF16 (CD44vlO) arrowheads point to non-reactive HRS cells B.> 50% of the HRS cells from patients with relapse show reactivity (ABC, x 400)
  • the entire variant region of the HPKII type of CD44v was amplified from human keratinocyte cDNA by polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the two PCR primers 5 '-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3 ' , positions 25-52, and 5 -TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3 ', positions 1013-984 of the LCLC97 variant region as described by Hofmann et al. contained an EcoRI recognition site that was used to clone the PCR product directly into the vector ⁇ GEX-2T (Smith et al, 1988).
  • the resulting construct (pGEX CD44v HPKII, v3-vl0) encoded a fusion protein of ⁇ 70 kD, consisting of glutathione-S-transferase from Schistosoma japonicum and exons v3-vl0 from human CD44 (Heider et al, 1993).
  • the fusion protein was expressed in E. coli and then affinity-purified using glutathione-agarose (Smith et al, 1988)
  • mice Female Balb / c mice were immunized intraperitoneally with the affinity-purified fusion protein according to the following scheme
  • the immunizations were carried out at intervals of 4 weeks. 14 days after the last immunization, the animals were immunized for three consecutive days with 10 ⁇ g of fusion protein in PBS on the following day Polyethylene glycol 4000 fused The hybridoma cells were then selected in microtiter plates in HAT medium (Kohler et Milstein, 1975, Kearney et al, 1979)
  • the determination of the antibody titer in the serum or the screening of the hybridoma supernatants was carried out with the aid of an ELISA.
  • microtiter plates were first coated with fusion protein (GST-CD44v3-10) or only with glutathione-S-transferase, followed by serial dilutions incubated with serum samples or hybridomas and the specific antibodies were detected with peroxidase-conjugated antibodies against mouse immunoglobulin. Hybridomas that only reacted with glutathione-S-transferase were discarded.
  • Antibodies from the supernatants of the hybrid domains VFF-14 and VFF-16 only bind to fusion proteins which contain a domain which is encoded by the exon vlO
  • the lymph node samples were stained with the following mAbs CD44 standard (s) recognized by mAb SFF2, CD44v5 detected by mAb VFF8, CD44v6 detected by mAbs VFF7 and VFF18, CD44vlO detected by mAbs VFF14 and VFF16 MAb SFF2 recognized an epitope that Common to all CD44 isoforms MAbs VFF7 and VFF18 recognize different but overlapping epitopes that are encoded by exon v6 MAb VFF8 is specific to exon v5 MAbs VFF14 and VFF16 react with an epitope that is encoded by exon vlO
  • CD44 expression patterns were analyzed using the Pearson-chi-square calculation and the Mantel-Haenszel test for linear association using the SPSS for Windows program P values that were equal to or less than 0 05 , were considered significant
  • Table 1 shows an overview of the results obtained with antibodies directed against CD44s, CD44v5, v6 and v10 in HRS cells.
  • the majority of the antigenic reactivity of the HRS cells was in all cases on the cell surface giving a variable number of HRS cells cytoplasmic and / or point-like perinuclear reactivity with or without surface staining, which are likely to reflect the reactivity of CD44 molecules in the Golgi apparatus or in the endoplasmic reticulum
  • CD44vlO detected by mAbs VFF14 and VFF16
  • CD44- mAbs can also be applied to paraffin embedded material when microwave treatment is used. This procedure requires constant fixation and microwave treatment to give reproducible results.
  • CD44v6 positive and we could not find any correlation with the prognosis using two different antibodies to CD44v6. Because these two mAbs used against v6 recognize different epitopes of the exon v6-encoded amino acid sequence, this lack of detectable CD44v6 in most cases (see Table 1) cannot be explained by modification or masking of epitopes. In contrast to the frequent expression of CD44v5 in gastric adenocarcinomas (Heider et /., 1993), the data regarding CD44v5 expression were not statistically significant within the three groups of NSHD.
  • Exon vlO is - in addition to exons v3 and v6 - a variant exon that is constitutively expressed in lymphocytes (Stauder et al, 1994). So far, CD44v10 expression in NHLs has not been systematically analyzed, and this exon has rarely been detected in carcinomas (Heider et al, 1996).
  • VFF14 and VFF16 two different antibodies against CD44vlO
  • the present invention demonstrates a statistically significant upregulation of CD44vlO expression in HRS cells from NSHD with poor prognosis (groups 2 and 3). Both exon vlO-specific antibodies showed identical results both on the surface and (and / or) in the cytoplasm of the HRS cells.
  • CD44v10 expression with 2 different mAbs is important because, for example, in breast cancer, divergent data were obtained from different authors using different mAbs with the same exon specificity (Friedrichs et al, 1995, Kaufmann et al, 1995). To further confirm our surprising results, all cases were independently immunostained in a different laboratory (using a different staining method), with identical results.
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • RNA 1 ⁇ g of total RNA was isolated and reverse transcribed, as described in the literature (Gunthert et ⁇ /., 1991) 5 ⁇ l first-strand cDNA was amplified with Taq polymerase (Promega, Madison, USA) in a volume of 50 ⁇ l , using the buffer conditions recommended by the manufacturer. The primer concentration was 0 2 mM.
  • a GAPDH-PCR with oligonucleotides homologous to positions 8-29 and 362 was carried out - 339 of the published GAPDH cDNA sequence (Allen et /., 1987) were carried out.
  • the RT-PCR analysis confirmed the expression of CD44 isoforms containing CD44vlO (since these are only recently obtained samples, the further course of the disease in these patients is not yet known)
  • the amplified fragments correspond to CD44 transcripts which have the constant proportion of CD44 in combination with the variant exon vlO (460 bp band) or variant exon vlO plus further variant exons (660 bp band) (FIG. 3, right half) )
  • cDNAs were amplified in parallel with primers specific for the 5 'and 3' constant region of CD44 (Fig.
  • Quadri SM Quadri SM, Vriesendorp HM, Leichner PK, Williams J R. Evaluation of indium- 1 11 and yttrium-90 labeled linker immunoconjugates in nude mice and dogs. J. Nucl Med. 34: 938-945 (1993). Ristamäki R, Joensuu H, Salmi M, Jalkanen S Serum CD44 in malignant lymphoma an association with treatment response Blood 84 (1): 238-243 (1994)
  • Senter PD Schreiber GJ, Hirschberg DL, Ashe SA, Hellstrom KE, Hellstrom I Enhancement of the in vitro and in vivo antitumor activities of phosphorylated mitomyein C and etoposide derivatives by monoclonal antibody-alkaline phosphatase conjugates. Cancer Res. 49: 5789-5792 (1989).
  • lymphocyte molecule implicated in lymph node homing is a member of the cartilage link protein family. Cell 56 (6): 1057-1062 0 (1989).
  • CD44 variant isoforms are preferentially expressed in basal epithelial of non-malignant human fetal and adult tissues. Histochemistry 101 30 (2): 79-89 (1994).
  • Weiner LM Holmes M, Adams GP, LaCreta F, Watts P, Garcia de Palazzo I. A human tumor xenograft model of therapy with a bispecific monoclonal antibody targeting c-erbB-2 and CD16. Cancer Res. 53 (1): 94-100 (1993). Weiner LM, Holmes M, Richeson A, Godwin A, Adams GP, Hsieh-Ma ST, Ring DB, Alpaugh RK. Binding and cytotoxicity characteristics of the bispecific murine monoclonal antibody 2B1. J. Immunol 151 (5): 2877-2886 (1993).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose und Therapie von Hodgkin-Lymphomen (Lymphogranulomatose), das auf der Expression des varianten Exons v10 des CD44-Gens als molekularem Marker bzw. Target beruht. Es besteht eine signifikante Korrelation zwischen v10-Expression und Stadium sowie Prognose der Erkrankung. In einer bevorzugten Ausführungsform werden v10-spezifische Antikörpermoleküle verwendet, um die Expression des Exons in Proben zu messen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden radiomarkierte v10-spezifische Antikörper zur Therapie von Hodgkin-Lymphomen verwendet.

Description

Verfahren zur Diagnose und Therapie von Hodgkin-Lymphomen
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose und Therapie von Hodgkin-Lymphomen (Ly phogranulomatose), die auf der Expression des Varianten Exons vlO des Gens CD44 als molekularem Target beruhen, Mittel für diese Verfahren sowie die Verwendung dieser Mittel
Das hochglykosylierte Zelloberflachenprotein CD44 ist an der Wechselwirkung -zwischen Zellen und der extrazellularen Matrix wie Migration und Aktivierung von Leukozyten bei Entzündung und Immunuberwachung, Vorlauferbildung von leukozytischen und mye- loiden Zellen im Knochenmark als auch der Entwicklung lymphoider Organe und der Wechselwirkung von Zellen mit der extrazellularen Matrix beteiligt (Lesley et al, 1993, Gunthert 1993, Pals et al, 1993, Mackay et al, 1994) Das menschliche CD44-Gen ist aus wenigstens 19 Exons zusammengesetzt, wovon wenigstens 12, die für die extrazellulare Region kodieren, alternativ gespleißt werden (Screaton et al, 1992) Das CD44-Gen wird in einer Reihe von Normalgeweben und Karzinomen transkribiert (Fox et al, 19 4) Wahrend das Standard-CD44-Molekul (CD44s) ubiquitar exprimiert in epithelialen und mesenchymalen Geweben gefunden wird, werden die verschiedenen Isoformen, die durch alternatives RNA- Spleißen erzeugt werden, in einer sehr beschrankten Verteilung gefunden (Heider et al, 1993) Einige der Varianten Isoformen sind an der Aktivierung von LymphoTzyten beteiligt und treten in Assoziation mit Metastasenbildung auf (Mackay et al, 1994, Gunthert et /., 1991, Rudy et al, \993, Koopman et al, \993) Obwohl eine direkte biologische Rolle der Expression von variantem CD44 bei der Metastasenbildung im Pankreaskarzinom der Ratte gezeigt wurde (Gunthert et al, 1991, Seiter et al, 1993), ist seine Rolle in menschlichen Tumoren noch unbekannt
Es_wurden verschiedene Berichte publiziert, in denen gezeigt wurde, daß bestimmte alternativ gespleißte Formen von CD44 in menschlichen metastatischen Tumoren exprimiert wurden (Heider et al, 1993 und 1996, Fox et al, 1994, Friedrichs et al, 1995, Kaufmann et al, 1995, Salles et al, 1993, Stauder et al, 1995, Koopman et al , 1993, Tanabe et al , 1993) Studien der Expression von CD44 in Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) konzentrierten sich auf die Analyse des sogenannten Lymphozyten-homing Rezeptors CD44H oder CD44s (Horst et al, 1990a, Horst et al, 1990b, Jalkanen et al, 1991, Moller et α/ , 1992) Wahrend einige Autoren (Horst et al, 1990a, Jalkanen et al, 1991, Picker et al, 1988, Pals et α/., 1989, Fujiwara et al, 1993) eine Korrelation zwischen erhöhter CD44s-Expression und ungunstiger Prognose fanden, konnten andere (Terpe et al , 1994) diese Befunde nicht bestätigen Kurzlich wurde eine Hochregulation von CD44v3 und CD44v6-Isoformen in NHL mit ungunstigem pathologischen Status gefunden (Koopman et al, \993, Terpe et al, 1994, Salles et al, 1993, Stauder et al, \995), wobei varianten-spezifische CD44-mAbs benutzt wurden (Mackay et al, 1994, Koopman et al, 1993, Fox et al, 1993)
Es sind verschiedene Ansätze bekannt geworden, die differentielle Expression varianter Exons des CD44-Gens in Tumoren und Normalgeweben für diagnostische und therapeutische Verfahren nutzbar zu machen (WO 94/02633, WO 94/12631, WO 95/00658, WO 95/00851, EP 0531300)
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung von neuen Verfahren zur Diagnose und Therapie von Hodgkin-Lymphomen (Lymphogranulomatose) sowie die Bereitstellung von Mitteln für solche Verfahren
Diese Aufgabe konnte mit der vorliegenden Erfindung gelost werden Sie betrifft Verfahren zur Diagnose und Therapie von Hodgkin-Lymphomen (Lymphogranulomatose), die auf der Expression des Varianten Exons vlO des CD44-Gens als molekularem Marker bzw Target beruhen Antikorpermolekule mit entsprechender Spezifitat eignen sich insbesondere als Vehikel, um Hodgkin-Lymphome in vivo selektiv zu erreichen
Bevorzugt sind dabei Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß dabei ein Anti- korpermolekul verwendet wird, das spezifisch an die Aminosauresequenz SEQ ID NO 2 (siehe Sequenzprotokoll) bindet
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind die Verwendung solcher Antikorpermolekule bei den erfindungsgemaßen Verfahren sowie Mittel, um diese Verfahren auszufuhren
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Antikorpermolekuls, das für ein Epitop innerhalb der Aminosauresequenz spezifisch ist, die durch das variable Exon vlO des CD44-Gens kodiert wird, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Diagnose und/oder Therapie von Tumorerkrankungen Bevorzugt handelt es sich bei der Tumorerkrankung um ein Hodgkin-Lymphom (Lymphogranulomatose)
Die Erfindung betrifft ferner ein Antikorpermolekul, das für ein Epitop innerhalb der Aminosauresequenz spezifisch ist, die durch das variable Exon vlO des CD44-Gens kodiert wird, zur pharmazeutischen Verwendung Bevorzugt ist ein solches Antikorpermolekul dadurch gekennzeichnet, daß es an die SEQ ID NO 2 bindet Es kann sich dabei insbe- sondere um einen monoklonalen Antikörper, ein Fab- oder F(ab')2-Fragment eines Immun- globulins, einen rekombinant hergestellten Antikörper, einen rekombinant hergestellten chimaren bzw humanisierten Antikörper oder single-chain-Antikorper (scFv) handeln Bevorzugt ist ein solches Antikorpermolekul mit einem radioaktiven Isotop, einer radioaktiven Verbindung, einem Enzym, einem Toxin, einem Zytostatikum, einem Prodrug, einem Zytokin oder einem anderen immunmodulatorischen Polypeptid verknüpft
Die Nuklein- und Aminosauresequenz des Varianten Exons vlO des CD44-Gens ist bekannt (Screaton et al, 1992, Tolg et al, 1993) Diese Sequenzen finden sich im Sequenzprotokoll (SEQ ID NO 1 und 2) Die Existenz degenerierter oder alleler Varianten ist für die Ausfuhrung der Erfindung nicht von Bedeutung, solche Varianten sind daher ausdrucklich mit eingeschlossen
Die Erfindung kann mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern ausgeführt werden, die für ein Epitop spezifisch sind, das vom Exon vlO kodiert wird Die Herstellung von Antikörpern gegen bekannte Aminosauresequenzen kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen (Catty, 1989) Beispielsweise kann ein Peptid dieser Sequenz synthetisch hergestellt und als Antigen in einem Immunisierungsprotokoll eingesetzt werden Ein anderer Weg ist die Herstellung eines Fusionsproteins, das die gewünschte Aminosauresequenz enthalt, indem eine Nukleinsaure (die synthetisch oder z B durch Polymerase-Kettenreak- tion (PCR) aus einer geeigneten Probe hergestellt werden kann), die für diese Sequenz kodiert, in einen Expressionsvektor integriert und das Fusionsprotein in einem Wirtsorganismus exprimiert wird Das gegebenenfalls gereinigte Fusionsprotein kann dann als Antigen in einem Immunisierungsprotokoll eingesetzt und Insert-spezifische Antikörper oder, im Falle monoklonaler Antikörper, Hybridome, die insertspezifische Antikörper exprimieren, mit geeigneten Verfahren selektiert werden Solche Verfahren sind Stand der Technik Heider et al. (1993, 1996) und Koopman et al. (1993) beschreiben die Herstellung von Antikörpern gegen Variante Epitope von CD44
Für das erfindungsgemaße Verfahren können jedoch auch Antikorpermolekule verwendet werden, die von poly- oder monoklonalen Antikörpern abgeleitet sind, z B Faboder F(ab')2-Fragmente von Immunglobulinen, rekombinant hergestellte single-chain-Antikorper (scFv), chimare bzw humanisierte Antikörper sowie andere Moleküle, die spezifisch an Epitope binden, die durch Exon vlO kodiert werden Aus einem kompletten Im- munglobuhn können beispielsweise Fab- oder F(ab')2-Fragmente oder andere Fragmente erzeugt werden (Kreitman et al, 1993) Der Fachmann ist ferner in der Lage, rekombinante vlO-spezifische Antikorpermolekule herzustellen Entsprechende Verfahren sind Stand der Technik Solche rekombinanten Antikorpermolekule können z B humanisierte Antikörper (Shin et al, 1989, Gussow et Seemann, 1991), bispezifische Antikörper (Weiner et al, 1993, Goodwin, 1989), single-chain- Antikörper (scFv, Johnson et Bird, 1991), komplette oder fragmentarische Immunglobuline (Coloma et al, 1992, Nesbit et al, 1992, Barbas et al, 1992), oder durch chain shuffling erzeugte Antikörper (Winter et al, 1994) sein Humanisierte Antikörper können beispielsweise durch CDR-grafting (EP 0239400) hergestellt werden Auch Framework-Regionen können modifiziert werden (EP 0519596) Zur Humanisierung von Antikörpern können heute Methoden wie PCR (s z B EP 0368684, EP 0438310, WO 9207075) oder Computer-modelling (s z B WO 9222653) angewendet werden Es können auch Fusionsproteine, beispielsweise swg/e-c/zαzn-Antikorper/Toxin- Fusionsproteine (Chaudhary et al, 1990, Friedman et al, 1993) hergestellt und verwendet werden Unter die Oberbegriffe "Antikörper" und "Antikorpermolekule" sollen außer polyklonalen und monoklonalen Antikörpern alle in diesem Abschnitt diskutierten Verbindungen fallen, sowie weitere Verbindungen, die sich strukturell von Immunglobulinen ableiten lassen und mit an sich bekannten Methoden herstellbar sind
Für diagnostische Verfahren können Antikorpermolekule beispielsweise mit radioaktiven Isotopen wie 1 1I, ^In, 99πvτ/c ocjer radioaktiven Verbindungen (Larson et al , 1991, Thomas et al, 1989, Srivastava, 1988), Enzymen wie Peroxidase oder alkalischer Phos- phatase (Catty et Raykundalia, 1989), mit Fluoreszenzfarbstoffen (Johnson, 1989) oder Biotinmolekulen (Guesdon et al, 1979) verknüpft werden Für therapeutische Anwendungen können vlO-spezifische Antikorpermolekule mit Radioisotopen wie 90Y, ^In, I31I oder 186Re (Quadri et al, 1993, Lenhard et al, 1985, Vriesendorp et al, 1991, Wilbur et al, 1989), Toxinen (Vitetta et al, 1991, Vitetta et Thorpe, 1991, Kreitman et al , 1993, Theuer et al, 1993), Zytostatika (Schrappe et al, 1992), Prodrugs (Wang et al, 1992, Senter et al, 1989) oder radioaktiven Verbindungen verknüpft werden Der Antikörper kann ferner mit einem Zytokin oder einem anderen immunmodulatorischen Polypeptid verknüpft sein, z B mit Tumornekrosefaktor oder Interleukin-2
Vorteilhaft können mit dem erfindungsgemaßen diagnostischen Verfahren Proben von Patienten, beispielsweise aus* Biopsien, untersucht werden, bei denen der Verdacht auf Ho- dgkin-Lymphom (Lymphogranulomatose) besteht oder die Diagnose bereits vorliegt, der Tumor aber genauer charakterisiert werden soll Der Nachweis vaπanter CD44-Molekule, die eine Aminosauresequenz enthalten, die vom variablen Exon vlO kodiert wird, kann auf Proteinebene mittels Antikörpern oder auf Nukleinsaureebene mittels spezifischer Nuklein- sauresonden oder Primern für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgen Die Erfindung betrifft demzufolge auch Antikorpermolekule und Nukleinsäuren, die als Sonden bzw Primer für solche Verfahren geeignet sind, und die Verwendung solcher Antikörper und Nukleinsäuren zur Diagnose und Analyse von Hodgkin-Lymphomen Beispielsweise können Gewebsschnitte immunhistochemisch mit Antikörpern mit an sich bekannten Methoden untersucht werden Aus Gewebeproben gewonnene Extrakte oder Korperflussigkeiten können ferner mit anderen immunologischen Methoden unter Verwendung von Antikörpern untersucht werden, beispielsweise in Western Blots, Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA, Catty et Raykundalia, 1989), Radioimmunoassays (RIA, Catty et Murphy, 1989) oder verwandten Immunoassays Die Untersuchungen können qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ erfolgen Die Expression der CD44-Spleißvariante vlO bei der Hodgkin'schen Erkrankung ist assoziiert mit aggressivem Verhalten des Tumors und hohem Rezidivrisiko Sie korreliert mit fortgeschrittenem Stadium und schlechter Prognose von NSHD (nodular sclerosis Hodgkin's disease)
Neben der zn-v/tro-Diagnostik eignen sich Antikorpermolekule mit erfindungsgema- ßer Spezifitat auch zur /«-v/vo-Diagnostik von Hodgkin-Lymphomen Tragt das Antikorpermolekul ein detektierbares Label, kann eine Detektion des Labels zu diagnostischen Zwecken, z B Visualisierung des Tumors in vivo (Imagingj, oder beispielsweise zur radio- unterstutTzten Chirurgie (radwguided surgety) erfolgen Für die Verwendung von mit radioaktiven Isotopen konjugierten Antikörpern zur Immunszintigraphie (ImagingJ beispielsweise gibt es eine Reihe von Protokollen, auf deren Grundlage der Fachmann die Erfindung ausfuhren kann (Siccardi et al, 1989, Keenan et al, 1987, Perkins et Pimm, 1992, Colcher et al, 1987, Thompson et al, 1984)
Durch Nachweis und/oder Quantifizierung der Expression des Varianten CD44-Epi- tops vlO erhobene Daten können so in die Diagnose und Prognose einfließen Vorteilhaft kann dabei die Kombination mit anderen prognostischen Parametern sein, etwa mit dem Tumorgrad
Antikorpermolekule mit der erfindungsgemaßen Spezifitat und ggf verknüpft mit einem zytotoxischen Agens können vorteilhaft zur Therapie von Hodgkin-Lymphomen (Lymphogranulomatose) verwendet werden Dabei kann die Applikation systemisch oder topisch erfolgen, beispielsweise durch intravenöse (als Bolus oder Dauerinfusion), intrape- ritoneale, intramuskuläre, subkutane o a Injektion/Infusion Protokolle für die Verabreichung von konjugierten oder nichtkonjugerten Antikörpern (sei es als komplette Immunglobuline, Fragmente, rekombinante humanisierte Moleküle o a ) sind Stand der Technik (Mulshine et al, 1991, Larson et al, 1991, Vitetta et Thorpe , 1991, Vitetta et al , 1991, Breitz et al, 1992, 1995, Press et al, 1989, Weiner et al, 1989, Chatal et al, 1989, Sears et al, 1982) Die Antikorpermolekule können in an sich bekannter Weise formuliert sein Sie können beispielsweise in wäßriger Losung vorliegen, die gegebenenfalls mit einem physiologisch vertraglichen Puffer gepuffert ist Eine solche Losung kann durch Zusatz geeigneter Stabilisatoren und Hilfstoffe gekennzeichnet sein Die Antikorpermolekule können aber auch in Form einer gefriergetrockneten Zubereitung (Lyophyllisat) vorliegen, die vor Verwendung mit einem geeigneten Losungsmittel, z B Wasser rekonstituiert wird
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform einer therapeutischen Anwendung besteht darin, ein humanisiertes vlO-spezifisches Immunglobulin oder ein F(ab')2-Fragment davon mit 90Y (Quadri et al, 1993, Vriesendorp et al, 1995), 131I (Juweid et al, 1995, Press et al, 1995, Thomas et al, in Catty 1985, S 230-239) 186Re (Breitz et al, 1992, 1995) oder einem anderen geeigneten Radioisotop zu verknüpfen und zur Radioimmunotherapie von Hodgkin-Lymphomen einzusetzen Beispielsweise kann ein solches Antikorpermolekul mit 90Y unter Verwendung eines chelatbildenden Linkers wie ITCB-DTPA (Isothiocyanatobenzyl- Diethylentriaminpentaacteat) verknüpft werden, wobei eine spezifische Aktivität von 5-20 mCi/mg, vorzugsweise 10 mCi/mg erreicht werden sollte Dieses Agens kann dann einem Patienten mit antigen-positivem Tumor in einer Dosierung von 0 1 bis 1 mCi/kg Korpergewicht, vorzugsweise 0 3 bis 0 5 mCi/kg Korpergewicht, besonders bevorzugt 0 4 mCi/kg, verabreicht werden Bei einer zu verabreichenden Gesamtproteinmenge von 2 bis 5 mg kann dies in Form einer schnellen intravenösen Bolusinjektion geschehen Bei monoklonalen Antikörpern kann es notwendig sein, das Agens vor der Verabreichung mit einem Überschuß (z B dem zehnfachen molaren Überschuß) des nichtradioaktiven Antikörpers zu vermischen, in diesem Fall erfolgt die Verabreichung besser in Form einer intravenösen Infusion z B über 15 Minuten Die Anwendung kann wiederholt werden Die Therapie kann durch Knochenmarkstransplantation unterstutzt werden
Abbildungen
Fig. 1: A. Einzelne HRS(Hodgkin und Reed-Sternberg)-Zelle eines Patienten ohne Rezidiv, die mit mAb VFF16 (CD44vlO) reagiert Pfeilspitzen zeigen auf nicht-reaktive HRS-Zellen B. >50% der HRS-Zellen von Patienten mit Rezidiv zeigen Reaktivität (ABC, x 400)
Fig. 2: CD44vlO-Expression in HRS-Zellen in verschiedenen Patientengruppen Es ist zu beachten, daß Patienten mit schlechtem klinischen Verlauf, d h Rezidiv oder Knochenmarksbeteiligung ausschließlich mehr als 10% positive HRS-Zellen zeigen, wahrend Patien- ten ohne Rezidiv weniger als 10%. positive HRS-Zellen haben Der Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen ist statistisch hochsignifikant
Fig. 3: RT-PCR- Analyse unter Verwendung von CD44vl0-spezifischen Primern (rechte Hälfte) Das Haupttranskript von etwa 470 bp in allen Proben und ein schwächeres Transkript von 660 bp in den Proben 2, 3 und 4 belegen CD44vlO-enthaltende Isoformen in allen 5 Fallen Eine dominierende Bande von 440 bp bei Verwendung von Primern, die für die 5'- und 3 '-konstante Region spezifisch sind, zeigt die Standardform von CD44 an (linke Hälfte)
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung vlO-spezifischer Antikörper
Die gesamte Variante Region des HPKII-Typs von CD44v (Hofmann et al, 1991) wurde aus menschlicher Keratinozyten-cDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert Die beiden PCR-Primer 5 '-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3 ', Positionen 25-52, und 5 -TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3 ', Positionen 1013-984 der LCLC97-varianten Region, wie von Hofmann et al. beschrieben, enthielten eine EcoRI-Erkennungsstelle, die benutzt wurde, um das PCR-Produkt direkt in den Vektor ρGEX-2T (Smith et al, 1988) zu Monieren Das resultierende Konstrukt (pGEX CD44v HPKII, v3-vl0) kodiert für ein Fusionsprotein von ~70 kD, bestehend aus Glutathion-S- transferase von Schistosoma japonicum und den Exons v3-vl0 von humanem CD44 (Heider et al, 1993) Das Fusionsprotein wurde in E. coli exprimiert und anschließend über Glutathion-Agarose affinitatsgereinigt (Smith et al, 1988)
Weibliche Balb/c Mause wurden intraperitoneal mit dem affinitatsgereinigten Fusionsprotein nach folgendem Schema immunisiert
1 Immunisierung 90 μg Fusionsprotein in komplettem Freund'schen Adjuvans
2. und 3 Immunisierung 50 μg Fusionsprotein in inkomplettem Freund'schen Adjuvans
Die Immunisierungen erfolgten im Abstand von jeweils 4 Wochen 14 Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere noch an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit jeweils 10 μg Fusionsprotein in PBS immunisiert Am darauffolgenden Tag wurden Milzzellen eines Tieres mit hohem Antikorpertiter mit P3 X63-Ag8 653-Mausmyelomzellen mit Hilfe von Polyethylenglykol 4000 fusioniert Die Hybridomzellen wurden dann in Mikroti- terplatten in HAT-Medium selektioniert (Kohler et Milstein, 1975, Kearney et al, 1979)
Die Bestimmung des Antikorpertiters im Serum bzw das Screening der Hybridom- uberstande wurde mit Hilfe eines ELISAs durchgeführt Bei diesem Test wurden zunächst Mikrotiterplatten mit Fusionsprotein (GST-CD44v3-10) oder nur mit Glutathion-S-Transfe- rase beschichtet Anschließend wurde mit seriellen Verdünnungen von Serumproben bzw Hybridomuberstanden inkubiert und die spezifischen Antikörper mit Peroxidase-konjugier- ten Antikörpern gegen Maus-Immunglobulin nachgewiesen Hybridome, die nur mit Glutathion-S-transferase reagierten, wurden verworfen Die verbleibenden Antikörper wurden zunächst in einem ELISA mit domanenspezifischen Fusionsproteinen (Exon v3, Exon v5 + v6, Exon v6 + v7, Exon v8 - vlO, Exon vlO) charakterisiert (Koopman et al, 1993) Ihre immunhistochemische Reaktivität wurde an menschlichen Hautschnitten getestet
Antikörper aus der Überstanden der Hybπdomaklone VFF-14 und VFF-16 binden nur an Fusionsproteine, die eine Domäne enthalten die durch das Exon vlO kodiert wird
Beispiel 2: Immunhistochemische Untersuchung von Gewebeproben
Gewebe und Patienten
37 Paraffin-eingebettete Lymphknotenproben von 29 Patienten mit NSHD (nodular sclero- sis Hodgkin's disease, gemäß Rye-Klassifizierung) wurden aus der Sammlung der Abteilung für Pathologie, Universitatsschule für Medizin, Graz, Osterreich, erhalten und in drei Gruppen eingeteilt, Gruppe 1 11 Patienten mit vorbehandelter NSHD vor Behandlung (5 Patienten im Stadium I, 6 im Stadium II), die für mehr als 6 Jahre Rezidiv-frei waren, Gruppe 2 9 Patienten mit vorbehandelter NSHD vor Behandlung (4 im Stadium I, 5 im Stadium II) zeigten einen Ruckfall der "Krankheit in einem bis drei Jahren Von 7 dieser 9 Patienten wurden zwei bis drei follow-up Lymphknotenschnitte von NSHD-Rezidiven ebenfalls in diese Studie eingeschlossen, Gruppe 3 9 Patienten mit Knochenmarksbeteiligung zum Zeitpunkt der ursprunglichen Diagnose (Stadium IV) Immunhistochemie
Die Lymphknotenproben wurden mit den folgenden mAbs gefärbt CD44 Standard (s) erkannt durch den mAb SFF2, CD44v5 detektiert durch den mAb VFF8, CD44v6 detektiert durch die mAbs VFF7 und VFF18, CD44vlO detektiert durch die mAbs VFF14 und VFF16 MAb SFF2 erkennt ein Epitop, das allen CD44-Isoformen gemein ist MAbs VFF7 und VFF18 erkennen verschiedene, aber überlappende Epitope, die durch das Exon v6 kodiert werden MAb VFF8 ist spezifisch für Exon v5 MAbs VFF14 und VFF16 reagieren mit einem Epitop, das durch Exon vlO kodiert wird
Die Immunhistochemie wurde an mit Mikrowellen behandelten Schnitten ausgeführt (Gerdes et al, 1992), wobei die Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Peroxidase-Methode verwendet wurde (Guesdon et al, 1979) Paraffin-Schnitte wurden in Xylol entwachst, rehydriert, und die endogene Peroxidase mit L£)2 in Methanol blockiert Die Objektträger wurden in einem Glasstander plaziert und in 500 ml 0 01 M Citratpuffer (2 1 g Zitronensaure in 1 1 deionisiertem Wasser, pH mit 2 N NaOH auf 6 0 eingestellt) benetzt Die Mikrowellenbehandlung erfolgte für 35 Minuten bei maximaler Leistung (600 W) in einem Mikrowellenofen (BioRad) Nach 9 Minuten Mikrowellenbehandlung wurde der verdampfte Puffer mit deionisiertem Wasser aufgefüllt Nach der Mikrowellenbestrahlung wurde die Losung für 20 Minuten gekühlt Danach wurden die Objektträger in Phosphat-gepufferter Salzlosung (PBS) gespult und durch Diaminobenzidin (DAB)-Entwicklung immungefarbt
Zum Vergleich wurden 10 gefrorene Lymphknotenproben (3 von Patienten der Gruppe 1, 2 von Gruppe 2 und 5 erst kurzlich gesammelte Falle) ebenfalls mit den mAbs VFF14 (vlO) und VFF16 (vlO) inkubiert, wobei die alkalische Phosphatase-anti-alka sche-Phos- phatase (APAAP)-Methode verwendet wurde (Cordeil et al, 1984)
Zu Kontrollzwecken wurden Schnitte von normaler humaner Epidermis, die dafür bekannt ist^die jeweiligen Antigene zu enthalten, getestet (positiv-Kontrollen) Ersatz des Primarantikorpers durch Nofmalserum ergab immer negative Ergebnisse (negativ-Kontrol- len)
Für weitere Kontrollzwecke wurden immunhistochemische Färbungen für CD44vlO und CD44v6-Expression jeweils zweimal wiederholt Um die Befunde zu bestätigen, wurden die Falle zusatzlich in einem anderen Laboratorium inkubiert, wobei die AP AAP -Methode verwendet wurde (Cordeil et al, 1984) Der Prozentsatz von HRS-(Hodgkin- und Reed-Sternberg-)-Zellen, der mit den Anti- korpern gefärbt wurde, wurde als 0%, weniger als 10%, 10-50%, und über 50% klassifiziert Es wurde darauf geachtet, daß die immunreaktiven HRS-Zellen eindeutig Tumorzellen waren (z B anhand der Anwesenheit charakteristischer Kerndetails), besonders in den Fallen, wo weniger als 10% der HRS-Zellen die jeweiligen Antigene exprimierten Alle Falle wurden getrennt von 2 der Erfinder begutachtet Die Verteilung der Färbung, z B an der Membran, im Zytoplasma oder beides, wurde ebenso aufgezeichnet wie die Immunre- aktivitat in Zellen, die keine HRS-Zellen waren
Statistische Analyse
CD44-Expressionsmuster wurden analysiert, indem die Pearson-chi-square-Kalkula- tion und der Mantel-Haenszel-Test für lineare Assoziation verwendet wurde, wobei das Programm SPSS for Windows verwendet wurde P-Werte, die gleich oder geringer waren als 0 05, wurden als signifikant betrachtet
Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen
Tabelle 1 zeigt eine Übersicht der Ergebnisse, die mit gegen CD44s, CD44v5, v6 und vlO gerichteten Antikörpern in HRS-Zellen erhalten wurden Der Hauptteil der antigenen Reaktivität der HRS-Zellen war in allen Fallen auf der Zelloberflache Eine variable Anzahl von HRS-Zellen ergab zytoplasmatische und/oder punktahnliche perinukleare Reaktivität mit oder ohne Oberfiachenfarbung, die wahrscheinlich die Reaktivität von CD44-Molekulen im Golgiapparat oder im endoplasmatischen Retikulum wiedergeben
CD44vl 0-Expressιon korreliert m t fortgeschrittenem Stadium und schlechter Prognose von NSHD CD44s-, CD44v5- (detektiert durch mAb VFF8) und CD44v6-Expression (detektiert durch mAb VFF 8) in HRS-Zellen wurde in der Mehrzahl der Falle gefunden, wobei allerdings eine große Variabilität in der Zahl der gefärbten Zellen beobachtet wurde (Tabelle 1) CD44v6-Expression (detektiert durch mAb VFF7) wurde nur in wenigen Fallen gefunden, und wenn vorhanden, dann war sie auf eine Minderheit von HRS-Zellen beschrankt (Tabelle 1) In Patienten ohne Rezidiv wurde CD44vlO-Expression (detektiert durch die mAbs VFF14 und VFF16) nur in sehr wenigen Fallen gefunden, und der Anteil reaktiver HRS-Zellen war <10% (Fig 1A und 2) Im Gegensatz dazu wurde in allen Fallen von Patienten mit Rezidiv oder anfanglicher Knochenmarksbeteiligung CD44vlO-Expres- sion gesehen In den meisten dieser Falle bestand eine deutliche Uberexpression von CD44vlO mit >50% reaktiven HRS-Zellen (Fig. IB und 2). Diese Überexpression von CD44vlO wurde auch in den untersuchten Lymphknotenschnitten von Rezidiven gef nden (Tabelle 2).
Gefrorene Lymphknotenschnitte von 3 Patienten ohne Rezidiv und von 2 Patienten mit Rezidiv ergaben identische Ergebnisse wie Paraffinschnitte. Beide für Exon vlO spezifische Antikörper (VFF14 und VFF16) zeigten identische Resultate in der Reaktion entweder auf der Oberfläche und/oder im Zytoplasma der HRS-Zellen.
Unter Verwendung von Fishers exaktem Test ergaben die Unterschiede der CD44- Isoform-Expression zwischen Patientengruppen mit nicht-aggressiver und aggressiver NSHD die folgenden p-Werte: CD44s (p=0.3625), CD44v5 (p=0.2415), CD44v6 (nachgewiesen mit mAb VFF7) (p=0.2903), CD44v6 (nachgewiesen durch mAb VFF18) (p=0.1836), CD44vlO (nachgewiesen durch mAbs VFF14 und VFF16) (p=0.001). Dies zeigt, daß die unterschiedlichen Expressionsmuster von CD44vlO (nachgewiesen durch mAbs VFF14 und VFF16) innerhalb dieser NSHD-Gruppen statistisch hochsignifikant waren. Die Expression der CD44-Spleißvariante vlO bei der Hodgkin'schen Erkrankung ist assoziiert mit aggressivem Verhalten des Tumors und hohem Rezidivrisiko. Sie korreliert mit fortgeschrittenem Stadium und schlechter Prognose von NSHD.
Im Gegensatz zu früheren immunhistochemischen Studien der CD44-Expression im Zusammenhang mit prognostischer Relevanz in Neoplasien verschiedenen histogeneti sehen Ursprungs, die ausschließlich an Gefrierschnitten ausgeführt wurden (Koopman et al, 1993, Terpe et al, 1994, Ristamäki et al, 1994, 1995, Stauder et al, 1994, Heider et al, \993, Horst et al, 1990a,b, Heider et al, 1996, Kaufmann et al, 1995, Mulder et al. 1994), konnte mit der vorliegenden Erfindung demonstriert werden, daß CD44-mAbs auch an Paraffineingebettetem Material angewendet werden können, wenn Mikrowellenbehandlung benutzt wird. Dieses Verfahren erfordert konstante Fixierung und Mikrowellenbehandlung, um reproduzierbare Ergebnisse zu ergeben. Für die Validierung der Immunreaktivität, die mit Paraffin-eingebettetem Material erhalten wurde, wurde die immunhistochemische Analyse parallel an gefrorenen Proben durchgeführt, und es wurden identische Ergebnisse erhalten. Zusätzlich wurden die Ergebnisse der CD44vl0-Expression durch RT-PCR bestätigt. Für die CD44v6-Expression konnte eine Korrelation mit schlechter Prognose in NHL (Koopman et al, 1993, Salles et al, 1993, Terpe et al, 1994, Ristamäki et al, 1994, Stauder et al, 1994), Brustkrebs (Kaufmann et al, 1995) und Kolonkarzinomen (Heider et al, 1993) gezeigt werden. In den von uns untersuchten Fällen von NSHD jedoch waren nur einige wenige Fälle CD44v6-positiv, und wir konnten keine Korrelation mit der Prognose feststellen, wobei wir zwei verschiedene Antikörper gegen CD44v6 benutzten. Weil diese beiden verwendeten mAbs gegen v6 verschiedene Epitope der Exon v6-kodierten Aminosauresequenz erkennen, kann dieser Mangel an detektierbarem CD44v6 in den meisten Fällen (siehe Tabelle 1) nicht durch Modifikation oder Maskierung von Epitopen erklärt werden. Im Gegensatz zur häufigen Expression von CD44v5 in gastrischen Adenokarzinomen (Heider et /., 1993) waren die Daten betreffend CD44v5 -Expression innerhalb der drei Gruppen von NSHD nicht statistisch signifikant.
Exon vlO ist - zusätzlich zu den Exons v3 und v6 - ein variantes Exon, das in Lym- phozyten konstitutiv exprimiert wird (Stauder et al, 1994). Bis jetzt wurde CD44vlO-Ex- pression in NHLs noch nicht systematisch analysiert, und dieses Exon wurde nur selten in Karzinomen detektiert (Heider et al, 1996). Die vorliegende Erfindung demonstriert am Beispiel zweier verschiedener Antikörper gegen CD44vlO (VFF14 und VFF16) eine statistisch signifikante Hochregulierung der CD44vlO-Expression in HRS-Zellen von NSHD mit schlechter Prognose (Gruppen 2 und 3). Dabei zeigten beide Exon vlO-spezifische Antikörper identische Ergebnisse sowohl auf der Oberfläche als auch (und/oder) im Zytoplasma der HRS-Zellen. Der Nachweis der CD44vlO-Expression mit 2 verschiedenen mAbs ist wichtig, da beispielweise bei Mammakarzinom divergierende Daten von verschiedenen Autoren erhalten wurden, die verschiedene mAbs der gleichen Exon-Spezifität verwendeten (Friedrichs et al, 1995, Kaufmann et al, 1995). Zur weiteren Bestätigung unserer überraschenden Ergebnisse wurden alle Fälle in einem anderen Laboratorium unabhängig immunogefärbt (wobei eine andere Färbungsmethode verwendet wurde), mit identischen Ergebnissen.
Die Ergebnisse für die CD44vlO-Expression in HRS-Zellen von NSHD sind die ersten Daten, die eine Korrelation der CD44vlO-Expression mit Stadium und Prognose der Krankheit zeigen. Die erfindungsgemäßen Verfahren geben dem Arzt somit wertvolle diagnostische und prognostische Informationen zur Erkrankung am Hodgkin-Lymphom. Darüber hinaus ist CD44vlO ein geeignetes molekulares Target für therapeutische Interventionen bei. dieser Erkrankung. Tabelle 1 : Reaktivität von HRS-Zellen
Patienten % CD44s v5 v6 v6 vlO vlO SFF2 VFF8 VFF7 VFF18 VFF1 VFF16
Gruppe 1 n = l l n % n % n % n % n % n %
>50 3 27.3 0 0 0 0 1 9.1 0 0 0 0
10-50 3 27.3 1 9.0 0 0 0 0 0 0 0 0
<10 3 27.3 6 54.5 2 18.2 8 72.7 4 36.4 4 36.4
0 2 18.1 4 36.5 9 81.8 2 18.2 7 63.6 7 63.6
Gruppe 2 n = 9 n % n % n % n % n % n %
>50 2 22.2 1 11.1 0 0 1 11.0 4 44.4 4 44.4
10-50 5 55.6 1 1 1.1 1 11.1 4 44.5 5 55.6 5 55.6
<10 2 22.2 7 77.8 3 33.3 4 44.5 0 0 0 0
0 0 0 0 0 5 55.6 0 0 0 0 0 0
Gruppe 3 n = 9 n % n % n % n % n % n %
>50 0 0 0 0 0 0 0 0 5 55.6 5 55.6
10-50 6 66.7 1 11.1 1 11.1 2 22.2 4 44.4 4 44.4
<10 3 33.3 8 88.9 0 0 7 77.8 0 0 0 0
0 0 0 0 0 8 88.9 0 0 0 0 0 0
Tabelle 2: Reaktivität (%) von CD44vlO (VFF14 und VFF16) und CD44v6 (VFF18) in HRS-Zellen von Patienten der Gruppe 2 (Rezidiv)
Figure imgf000016_0001
Beispiel 3: Anwendung von vlO-spezißscher RT-PCR zu diagnostischen Zwecken
Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Fünf Falle erlaubten die Isolierung von mRNA und wurden zusatzlich durch reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) analysiert
Es wurde 1 μg Gesamt-RNA isoliert und revers transkribiert, wie in der Literatur beschrieben (Gunthert et α/., 1991) 5 μl Erststrang-cDNA wurde mit Taq-Polymerase (Promega, Madison, USA) in einem Volumen von 50 μl amplifiziert, wobei die Pufferbedingungen verwendet wurden, die vom Hersteller empfohlen wurden Die Primer-Konzentration betrug 0 2 mM Um die Qualität und Häufigkeit der cDNA-Synthese zu testen, wurde eine GAPDH-PCR mit Oligonukleotiden, die homolog zu den Positionen 8 - 29 und 362 - 339 der publizierten GAPDH-cDNA- Sequenz (Allen et /., 1987) waren, durchgeführt Einer Vorinkubation für 5 min bei 95°C folgten 25 Amplifikationsrunden (30 sec bei 95°C, 1 5 min bei 62°C) und ein Extensionszyklus von 7 min bei 72°C Danach wurden 10 μl der Reaktion auf einem 2%igen Agarosegel analysiert und das Amplifikationsprodukt unter UY-Licht visualisiert, nachdem das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt worden war Für die Amplifizierung von CD44vlO-enthaltenden cDNAs wurden Primer verwendet, die homolog zum 3'-Ende des Exons vlO (Positionen 986-1013, Hofmann et al, 1991) und zur 5'- konstanten Region von CD44 (Positionen 513-540, Stamenkovic et α/., 1989) waren Zur Amplifikation CD44-Standard-enthaltender Isoformen wurde statt des CD44vlO-spezifι- schen Primers ein 3'-konstanter-CD44-Primer (Positionen 934-958, Stamenkovic et /., 1989) verwendet Nach 40 Amplifikationszyklen (94°C für 30 sec, 62°C für 1 5 min) wurden 10 μl des Reaktionsgemisches wie oben analysiert Zu Kontrollzwecken wurde statt RNA entweder destilliertes Wasser (Negativkontrolle) oder ein CD44v3-vlO enthaltendes Plasmid (Positivkontrolle, Heider et al, 1996) benutzt
In den 5 Fallen, in denen eine RNA-Isolierung möglich war, bestätigte die RT-PCR- Analyse die Expression CD44vlO enthaltender CD44-Isoformen (da es sich um erst kurzlich erhaltene Proben handelt, ist der weitere Krankheitsverlauf bei diesen Patienten noch nicht bekannt) Die amplifizierten Fragmente entsprechen CD44-Transkripten, die den konstanten Anteil von CD44 in Kombination mit dem Varianten Exon vlO (460 bp-Bande) bzw varian- tem Exon vlO plus weiteren Varianten Exons (660 bp-Bande) aufweisen (Fig 3, rechte Hälfte) Zu Kontrollzwecken wurden parallel cDNAs mit Primern amplifiziert, die spezifisch für die 5'- und 3'-konstante Region von CD44 waren (Fig 3, linke Hälfte), wobei eine dominierende Bande von 440 bp erhalten wurde, die die Standardform von CD44 anzeigt Die molekulargenetischen Ergebnisse korrelierten mit den immunhistochemischen Befunden, wo in allen 5 Fallen ein hoher Anteil der HRS-Zellen (die weniger als 10 % der Gesamtzellzahl in einer Probe ausmachen) CD44vlO exprimierten und die Mehrheit der Zellen (HRS plus Nicht-Tumorzellen) mit dem antι-CD44s- Antikörper reagierten
Literatur
Allen RW, Trach KA, Hoch JA Identification of the 37-kDa protein displaying a variable interaction with the erythroid cell membrane as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase J. Bwl Chem. 262 (2): 649-653 (1987)
Barbas C F, Bjoriing E, Chiodi F, Dunlop N, Cababa D, Jones T M, Zebedee S L, Persson M A A, Nara P L, Norrby E, Burton D R Recombinant human Fab fragments neutralize human type 1 immunodeficiency virus in vitro Proc. Natl. Acad Sei. U.S.A. 89: 9339-9343 (1992)
Breitz H B, Weiden P L, Vanderheyden J-L, Appelbaum J W, Björn M J, Fer M F, Wolf S B, Ratcliff B A, Seiler C A, Foisie D C, Fisher D R, Schroff R W, Fritzberg A R, Abrams P G Clinical experience with rhenium-186-labeled monoclonal antibodies for radioim- munotherapy results of phase I trials J. Nucl. Med. 33: 1099-1112 (1992)
Breitz H B, Durham J S, Fisher D R, Weiden P L, DeNardo G L, Goodgold H M, Nelp W B Phrmacokinetics and normal organ dosimetry following intrapeπtoneal rhenιum-186- labeled monoclonal antibody J. Nucl. Med 36: 754 (1995)
Catty, D (Hrsg) Antibodies Vols. I und II. IRL Press Oxford (1989)
Catty, D , Raykundalia, C ELISA and related immunoassays In Catty, D (Hrsg) Antibodies Vol. II. LRL Press Oxford (1989), 97-152, s S 105-109
Catty, D , Murphy, G Immunoassays using radiolabels In Catty, D (Hrsg) Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 77-96
Chatal J-F, Saccavini J-C, Gestin J-F, Thedrez P, Curtet C, Kremer M, Guerreau D, Nolibe D, Fumoleau P, Guillard Y Biodistribution of indium-l l l-labeled OC 125 monoclonal an- tibody intraperitoneally injected into patients operated on for ovarian carcinomas. Cancer Res. 49: 3087-3094 (1989).
Chaudhary V K, Batra J K, Galdo M G, Willingham M C, Fitzgerald D J, Pastan I. A rapid method of cloning functional variable-region antibody genes in Escherichia coli as single- chain immunotoxins. Proc. Natl. Acad. Sei. JJ.S.A. 87: 1066 (1990).
Colcher D, Esteban J, Carrasquillo J A, Sugarbaker P, Reynolds J C, Bryant G, Larson S M, Schlom J. Complementation of intraeavitary and intravenous administration of a mono- clonal antibody (B72.3) in patients with carcinoma. Cancer Res. 47: 4218-4224 (1987).
Coloma M J, Hastings A, Wims L A, Morrison S L. Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction. J. Im- munol Methods 152: 89-104 (1992).
Cordell JL, Falini B, Erber WN, Ghosh AK, Abdulaziz Z, MacDonald S, Pulford KA, Stein H, Mason D Y. Immunoenzymatic labeling of monoclonal antibodies using immune comple- xes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP complexes). J. Histochem. Cytochem. 32 (2): 219-229 (1984).
Fox SB, Gatter KC, Jackson DG, Screaton GR, Bell MV, Bell JI, Harris AL, Simmons D, Fawcett J. CD44 and cancer screening. Lancet 342 (8870): 548-549 (1993).
Fox SB, Fawcett J, Jackson DG, Collins I, Gatter KC, Harris AL, Gearing A, Simmons DI. Normal human tissues, in addition to so e tumors, express multiple different CD44 iso- forms. Cancer Res 54: 4539-4546 (1994)
Friedmann P N, Mc Andrew S J, Gawlak S L, Chace D, Trail P A, Brown J P, Siegall C B. BR96 sFy-PE40, a potent single-chain immunotoxin that selectively kills carcinoma cells. Cancer Res. 53: 334-339 (1993).
Friedrichs K, Franke F, Lisboa BW, Kugler G, Gille I, Terpe HJ, Holzel F, Maass H, Gunthert U. CD44 isoforms correlate with cellular differentiation but not with prognosis in human breast cancer. Cancer Res. 55 (22): 5424-5433 (1995).
Fujiwara K, Yoshino T, Miyake K, Ohara N, Akagi T.Expression of a lymphocyte adhesion molecule (CD44) in malignant lymphomas: relevance to primary site, histological subtype and clinical stage. ActaMed. Okayama 47 (3): 215-222 (1993). Gerdes J, Becker MH, Key G, Cattoretti G Immunohistological detection of tumour growth fraction (Ki-67 antigen) in formalin-fixed and routinely processed tissues J. Pathol 168 (1): 85-86 (1992)
Goodwin D A A new appoach to the problem of targeting specific monoclonal antibodies to human tumors using anti-hapten chimeric antibodies J. Nucl. Med. Biol 16: 645 (1989)
Gunthert, U , Hofmann, M , Rudy, W , Reber, S , Zoller, M , Haußmann, I , Matzku, S , Wenzel, A , Ponta, H , and Herrlich, P A new variant of glycoprotein CD44 confers meta- static potential to rat carcinoma cells Cell 65: 13-24 (1991)
Gunthert U CD44 a multitude of isoforms with diverse fünctions Curr. Top. Microbiol Immunol 184: 47-63 (1993)
Guesdon, j I , Ternynck, T , Avrameas, S J. Histochem. Cytochem. 27: 1131 (1979)
Gussow D, Seemann G Humanization of monoclonal antibodies Methods Enzymol 203: 99-121 (1991)
Heider, K -H , Hofmann, M , Horst, E , van den Berg, F , Ponta, H , Herrlich, P , and Pals, S T A human homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polyps J. Cell Biol 120: 227-233 (1993)
Heider, K -H , Mulder, J -W R , Ostermann, E , Susani, S , Patzelt, E , Pals, S T , Adolf, G.R Splice variants of the cells surface glycoprotein CD44 associated with metastatic tu- mor cells are expressed in normal tissues of humans and cynomolgus monkeys Eui J. Cancer 31 A:2385-239\ (1995)
Heider K H, Ratschek M, Zatloukal K, Adolf G R Expression of CD44 isoforms in human renal cell carcinomas Virchows Arch. 428: 267-273 (1996)
Hofmann, M , Rudy, W , Zoller, M , Tolg, C , Ponta, H , Herrlich P , and Gunthert, U CD44 splice variants confer metastatic behavior in rats homologous sequences are expres- sed in human tumor cell lines Cancer Res. 51: 5292-5297 (1991)
Horst E, Meijer CJ, Radaszkiewicz T, Ossekoppele GJ, Van Krieken JH, Pals ST Adhesion molecules in the prognosis of diffuse large-cell lymphoma expression of a lymphocyte hom- ing receptor (CD44), LFA-1 (CDl la/18), and ICAM-1 (CD54). Leukemia 4 (8): 595-599 (1990a).
Horst E, Meijer CJ, Radaskiewicz T, van Dongen JJ, Pieters R, Figdor CG, Hooftman A, Pals ST. Expression of a human homing receptor (CD44) in lymphoid malignancies and re- lated stages of lymphoid development. Leukemia 4 (5): 383-389 (1990b).
Jalkanen S, Joensuu H, Soderstrom KO, Klemi P. Lymphocyte homing and clinical behavior of non-Hodgkin's lymphoma. J. Clin. Invest. 87 (5): 1835-1840 (1991).
Johnson, G. D. Immunofluorescence. In: Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 179-200, s. S. 180-189.
Johnson S, Bird R E. Construction of single-chain derivatives of monoclonal antibodies and their production in Escherichia coli . Methods Enzymol 203: 88-98 (1991).
Juweid M, Sharkey R M, Markowitz A, Behr T, Swayne L C, Dünn R, Hansen H J, Shevitz J, Leung S-O, Rubin A D, Herskovic T, Hanley D, Goldenberg D M. Treatment of Non- Hodgkins's lymphoma with radiolabeled murine, chimeric, or humanized LL2, an anti-CD22 monoclonal antibody. Cancer Res. (Suppl.) 55: 5899s-5907s (1995).
Kaufmann M, Heider KH, Sinn HP, von Minckwitz G, Ponta H, Herrlich P. CD44 variant exon epitopes in primary breast cancer and length of survival. Lancet 345 (8950): 615-619 (1995).
Kearney, J.F., Radbruch A., Liesegang B., Rajewski K. A new mouse myeloma cell line that has lost imunoglobulin expression but permits construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J. Immunol 123: 1548 (1979).
Keenan A M, Weinstein J N, Carrasquillo J A, Bunn P A, Reynolds J C, Foon K A et al Immunolymphoscintigraphy and the dose dependence of n ιIn-labeled T101 monoclonal antibody in patients with cutaneous T-cell lymphoma. Cancer Res. 47: 6093-6099 (1987).
Köhler, G., Milstein, C. Continous culture of füsed cells secreting antibody of predefined specifity. Nature 265: 495 (1975)
Koopman, G., Heider, K.-H., Horts, E., Adolf, G. R., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich, P., Pals, S. T. Activated human lymphocytes and aggressive Non-Hodgkin's lymphomas express a homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44. J. Exp. Med. 177: 897-904 (1993).
Kreitman R J Hansen H J, Jones A L, FitzGerald D J P, Goldenberg D M, Pastan I. Pseu- domonas exotoxin-based immunotoxins containing the antibody LL2 or LL2-Fab' induce regression of subcutaneous human B-cell lymphoma in mice. Cancer Res. 53: 819-825 (1993).
Larson S M, Cheung N-K V, Leibel S A. Radioisotope Conjugates. In: DeVita V T, Hell- man S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biological therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 496-511 (1991).
Lenhard R E, Order S E, Spunberg J J, Asbell S O, Leibel S A. Isotopic immunoglobulin. A new systemic therapy for advanced Hodgkin's Disease. J. Clin. Oncol. 3: 1296-1300 (1985).
Lesley J, Hyman R, Kincade PW. CD44 and its interaction with extracellular matrix. Adv. Immunol 54: 271-335 (1993).
Mackay CR, Terpe HJ, Stauder R, Marston WL, Stark H, Gunthert U. Expression and mo- dulation of CD44 variant isoforms in humans. J. Cell. Biol. 124 (1-2): 71-82 (1994).
Möller P, Eichelmann A, Mechtersheimer G, Koretz K. xpression of beta 1-integrins, H- CAM (CD44) and LECAM-1 in primary gastro-intestinal B-cell lymphomas as compared to the adhesion receptor profile of the gut-associated lymphoid system, tonsil and peripheral lymph node. Int. J. Cancer 49 (6): 846-855 (1991).
Möller P, Eichelmann A, Leithauser F, Mechtersheimer G, Otto HF. Venular endothelium binding molecules CD44 and LECAM-1 in normal and malignant B-cell populations. A comparative study. Virchow Arch. (A) 421 (4): 305-313 (1992).
Mulder JWR, Kruyt PHM, Sewnath M, Oosting J, Seldenrijk CA, Weidema WF, Offerhaus GJ, Pals ST. Expression of exon v6 containing CD44 proteins in human colorectal cancer is associated with unfavorable prognosis in long term follow up. Lancet 344: 1470-1472 (1994). Mulshine J L, Magnani J L, Linnoila R I: Applications of monoclonal antibodies in the treatment of solid tumors. In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biological therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 563-588 (1991).
Nesbit M, Fu Z F, McDonald-Smith J, Steplewski Z, Curtis P J. Production of a fünctional monoclonal antibody recognizing human colorectal carcinoma cells from a baculovirus expression System. J. Immunol Methods 151: 201-208 (1992).
Pals ST, Horst E, Ossekoppele GJ, Figdor CG, Scheper RJ, Meijer CJ. Expression of lym- phocyte homing receptor as a mechanism of dissemination in non-Hodgkin's lymphoma. Blood 73 (4): 885-888 (1989).
Pals ST, Koopman G, Griffioen A, et al. A variety of isoforms with fünctions in cell adhesion and tumor metastasis, in Shimiziu (Hrsg.): Lymphocyte adhesion molecules, Austin, Texas, R. G. Landes Co p., 1993, p 135.
Perkins A C, Pimm M V. A role for gamma scintigraphy in cancer immunology and immun- otherapy. Eur. J. Nucl. Med. 19: 1054-1063 (1992).
Picker LJ, Medeiros LJ, Weiss LM, Warnke RA, Butcher EC. Expression of lymphocyte homing receptor antigen in non-Hodgkin's lymphoma. Am. J. Pathol 130 (3): 496-504 (1988).
Press O W, Eary J F, Badger C C, Martin P J, Appelbaum F R, Levy R, Miller R, Brown S, Nelp W B, Krohn K A, Fisher D, DeSantes K, Porter B, Kidd P, Thomas E D, Bernstein I D. Treatment of refractory Non-Hodgkin's lymphoma with radiolabeled MB-1 (anti-CD37) antibody. J. Clin. Oncol. 7: 1027-1038 (1989).
Press O W, Eary J F, Appelbaum F R ,Martin P J, Nelp W B Glenn S, Fisher D J, Porter B, Metthews D C Gooley T, Bernstein I D. Phase II trial of 13 ^-B 1 (anti-CD20) antibody therapy with autologous stem cell transplantation for relapsed B cell lymphomas. Lancet 346: 336-340 (1995).
Quadri S M, Vriesendorp H M, Leichner P K, Williams J R. Evaluation of indium- 1 11 and yttrium-90 labeled linker immunoconjugates in nude mice and dogs. J. Nucl Med. 34: 938- 945 (1993). Ristamäki R, Joensuu H, Salmi M, Jalkanen S Serum CD44 in malignant lymphoma an association with treatment response Blood 84 (1): 238-243 (1994)
Ristamäki R, Joensuu H, Soderstrom KO, Jalkanen S CD44v6 expression in non-Hodgkin's lymphoma an association with low histological grade and poor prognosis J. Pathol. 176 (3): 259-267 (1995)
Rudy W, Hofmann M, Schwartz-Albiez R, Zoller M, Heider KH, Ponta H, Herrlich P The two major CD44 proteins expressed on a metastatic rat tumor cell line are derived from dif- ferent splice variants each one individually suffices to confer metastatic behavior Cancer Res. 53 (6): 1262-1268 (1993)
Salles G, Zain M, Jiang WM, Boussiotis VA, Shipp MA Alternatively spliced CD44 tran- scripts in diffuse large-cell lymphomas characterization and comparison with normal activa- ted B cells and epithelial malignancies Blood 82 (12): 3539-3547 (1993)
Sambrook, J , Fritsch E E , Maniatis I , Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)
Schrappe M, Bumol T F, Apelgren L D, Briggs S L, Koppel G A, Markowitz D D, Mueller B M, Reisfeld R A Long-term growth suppression of human glioma xenografts by chemo- immunoconjugates of 4-desacetylvinblastine-3-carboxyhydrazide and monoclonal antibody 9.2 27 Cancer Res. 52: 3838-3844 (1992)
Screaton, G R , Bell, M V , Jackson, D G , Cornelis, F B , Gerth, U , and Bell, J I Geno- mic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 12160-12164 (1992)
Sears HJ7, Mattis J, Herlyn D, Hayry P, Atkinson B, Ernst C, Steplewski Z, Koprowski H Phase-I clinical trial of monoclonal antibody in treatment of gastrointestinal tumours Lancet 1982 (1): 762-765 (1982)
Seiter, S , Arch, R , Reber, S , Komitowski, D , Hofmann, M , Ponta, H , Herrlich, P , Matzku, S , Zoller, M Prevention of tumor metastasis formation by anti-variant CD44 J. Exp. Med. 177: 443-455 (1993)
Senter P D, Schreiber G J, Hirschberg D L, Ashe S A, Hellstrom K E, Hellstrom I Enhancement of the in vitro and in vivo antitumor activities of phosphorylated mitomyein C and etoposide derivatives by monoclonal antibody-alkaline phosphatase conjugates. Cancer Res. 49: 5789-5792 (1989).
Shin S-U, Morrison S L. Production and properties of chimeric antibody molecules. Me- s thods Enzymol. 178: 459-476 (1989).
Siccardi A G, Buraggi G L, Callegaro L, Colella A C, DeFilippi P G et al. Immunoscinti- graphy of adenocarcinomas by means of radiolabeled F(ab')2 fragments of an anti-carcino- embryonic antigen monoclonal antibody: a multicenter study. Cancer Res. 49: 3095-3103 o (1989).
Smith, D.B., Johnson, K.S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escheri- chia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67: 31 (1988).
s Srivastava S C (Hrsg). Radiolabeled monoclonal antibodies for imaging and therapy. Life Sciences SeriesA 152, Plenum New York (1988).
Stamenkovic I, Amiot M, Pesando JM, Seed B. A lymphocyte molecule implicated in lymph node homing is a member of the cartilage link protein family. Cell 56 (6): 1057-1062 0 (1989).
Stauder R, Eisterer W, Thaler J, Gunthert U. CD44 variant isoforms in non-Hodgkin's lymphoma: a new independent prognostic factor. Blood 85 (10): 2885-2899 (1995).
s Tanabe KK, Ellis LM, Saya H. Expression of CD44R1 adhesion molecule in colon carcinomas and metastases. Lancet 341 (8847): 725-726 (1993).
Terpe HJ, Stark H, Prehm P, Gunthert U. CD44 variant isoforms are preferentially expressed in basal epithelial of non-malignant human fetal and adult tissues. Histochemistry 101 30 (2): 79-89 (1994).
Theuer C P, Kreitman R J, FitzGerald D J, Pastan I. Immunotoxins made with a recombi- nant form oϊ pseudomonas exotoxin A that do not require proteolysis for activity. Cancer Res. 53: 340-347 (1993).
35
Thomas, G D., Dykes, P. W., Bradwell, A. R. Antibodies for tumour immunodetection and methods for antibody radiolab eling. In: Catty, D. (Hrsg.). Antibodies Vol. II IRL Press Oxford , 223-244 (1989). Thompson C H, Stacker S A, Salehi N, Lichtenstein M, Leyden M J, Andrews J T. Immu- noscintigraphy for detection of lymph node metastases from breast cancer. Lancet 1984 (2): 1245-1247 (1984).
Tölg, C, Hofmann, M., Herrlich, P., and Ponta, H. Splicing choice from ten variant exons establishes CD44 variability. Nucleic Acids. Res. 21: 1225-1229 (1993).
Vitetta E S, Thorpe P E. Immunotoxins. In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biological therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 482-495 (1991)
Vitetta E S, Stone M, Amlot P, Fay J, May R, Till M, Newman J, Clark P, Collins R, Cun- ningham D, Ghetie V, Uhr J W, Thorpe P E. Phase I immunotoxin trial in patients with B- cell lymphoma. Cancer Res. 51: 4052-4058 (1991).
Vriesendorp H M, Herbst J M, Germack M A, Klein J L, Leichner P K, Loudenslager D M, Order S E. Phase I-II studies of yttrium-labeled antiferritin treatment for end stage Hodg- kin's diesease, including Radiation Therapy Oncology Group 87-01. J. Clin Oncol. 9: 918- 928 (1991).
Vriesendorp H M, Morton J D, Quadri S M. Review of five consecutive studies of radiolabeled immunoglobulin therapy in Hodgkins's Disease. Cancer Res. (Suppl.) 55: 5888s- 5892s (1995).
Wang S-M, Chern J-W, Yeh M-Y, Ng J C, Tung E, Roffler S R. Specific activation of glucuronide prodrugs by antibody-targeted enzyme conjugates for cancer therapy. Cancer Res. 52: 4484-4491 (1992).
Weiner L M, O'Dwyer j, Kitson J, Comis R L, Frankel A E, Bauer R J, Kopnrad M S, Gro- ves E S. Phase I evaluation of an anti-breast carcinoma monoclonal antibody 260F9-re- combinant ricin A chain immunoconjugate. Cancer Res. 49: 4062-4067 (1989).
Weiner LM, Holmes M, Adams GP, LaCreta F, Watts P, Garcia de Palazzo I. A human tumor xenograft model of therapy with a bispecific monoclonal antibody targeting c-erbB-2 and CD16. Cancer Res. 53 (1): 94-100 (1993). Weiner LM, Holmes M, Richeson A, Godwin A, Adams GP, Hsieh-Ma ST, Ring DB, Al- paugh RK. Binding and cytotoxicity characteristics of the bispecific murine monoclonal antibody 2B1. J. Immunol 151 (5): 2877-2886 (1993).
Wilbur, D. S., Hadley, S. W., Hylarides, M. D., Abrams, P. G., Beaumier, P. A., Morgan, A.C., Reno, J.M., Fritzberg, A.R. Development of a stable radioiodinating agent to label monoclonal antibodies for radiotherapy of cancer. J. Nucl. Med. 30: 216-226 (1989).
Winter, G., Griffith, A. D., Hawkins, R. E., Hoogenboom, H. R. Making antibodies by phage display technology. Ann. Rev. Immunol 12, 433-455 (1994).
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Ingelheim International GmbH
(B) STRASSE: Rheinstrasse
(C) ORT: Ingelheim
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 55216
(G) TELEFON: 06132-77-2770 (H) TELEFAX: 06132-77-4377
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verfahren zur Diagnose und Therapie von Lymphogranulomatose
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
12) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20~4 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
Üx) MERKMAL: (A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE :1..204
(D) SONSTIGE ANGABEN :/product= "Exon vlO of human CD44" /note= "GenBank accession no . L05419" /citation= ([1])
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 3..203
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(A) AUTORS: Screaton, GR
Bell, MV Jackson, DG Cornelis, FB Gerth, U Bell, JI
(B) TITEL: Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons
(C) ZEITSCHRIFT: Proc. Natl . Acad. Sei. U.S.A.
(D) BAND: 89
(F) SEITEN: 12160-12164
(G) DATUM: December-1992
(K) BELANGREICHE RESTE IN SEQ ID NO: 1: VON 1 BIS 204
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
AT AGG AAT GAT GTC ACA~GGT GGA AGA AGA GAC CCA AAT CAT TCT GAA 47 Arg Asn Asp Val Thr Gly Gly Arg Arg Asp Pro Asn His Ser Glu 1 5 10 15
GGC TCA ACT ACT TTA CTG GAA GGT TAT ACC TCT CAT TAC CCA CAC ACG 95 Gly Ser Thr Thr Leu Leu Glu Gly Tyr Thr Ser His Tyr Pro His Thr
20 25 30
AAG GAA AGC AGG ACC TTC ATC CCA GTG ACC TCA GCT AAG ACT GGG TCC 143 Lys Glu Ser Arg Thr Phe Ile Pro Val Thr Ser Ala Lys Thr Gly Ser 35 40 45
TTT GGA GTT ACT GCA GTT ACT GTT GGA GAT TCC AAC TCT AAT GTC AAT 191 Phe Gly Val Thr Ala Val Thr Val Gly Asp Ser Asn Ser Asn Val Asn 50 55 60
CGT TCC TTA TCA G 204
Arg Ser Leu Ser 65
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 67 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Arg Asn Asp Val Thr Gly Gly Arg Arg Asp Pro Asn His Ser Glu Gly 1 5 10 15
Ser Thr Thr Leu Leu Glu Gly Tyr Thr Ser His Tyr Pro His Thr Lys 20 25 30
Glu Ser Arg Thr Phe Ile Pro Val Thr Ser Ala Lys Thr Gly Ser Phe 35 - 40 45
Gly Val Thr Ala Val Thr Val Gly Asp Ser Asn Ser Asn Val Asn Arg 50 55 60
Ser Leu Ser 65 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "PCR Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
CAGGCTGGGA GCCAAATGAA GAAAATG 27
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "PCR primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
TGATAAGGAA CGATTGACAT TAGAGTTGGA 30

Claims

Patentansprüche
1 Verfahren zur Diagnose oder Therapie von Hodgkin-Lymphomen (Lymphogranulomatose), dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren auf der Expression des variablen Exons vlO des Gens CD44 als molekularem Marker beruht
2 Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es auf der Bindung eines Antikorpermolekuls an ein Epitop, das von dem variablen Exon vlO des Gens CD44 kodiert wird, beruht
3 Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß dabei ein Antikorpermolekul verwendet wird, das die Aminosauresequenz gemäß SEQ ID NO 2 erkennt
4 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikorpermolekul ein monoklonaler Antikörper, ein Fab- oder F(ab')2-Fragment eines
Immunglobulins, ein rekombinant hergestellter Antikörper, ein rekombinant hergestellter chimarer, humanisierter Antikörper oder single-chain- Antikörper (scFv) ist
5 Verwendung eines Antikorpermolekuls, das für ein Epitop spezifisch ist, das von dem Varianten Exon vlO des CD44-Gens kodiert wird, in einem Verfahren gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 4
6 Verwendung eines Antikorpermolekuls, das für ein Epitop innerhalb der Aminosauresequenz spezifisch ist, die durch das variable Exon vlO des CD44-Gens kodiert wird, zur Therapie von Hodgkin-Lymphomen (Lymphogranulomatose)
7 Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikorpermolekul an die Aminosauresequenz gemäß SEQ ID NO 2 bindet
8 Verwendung nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikorpermolekul ein monoklonaler Antikörper, ein Fab- oder F(ab')2-Fragment eines Immunglobulins, ein rekombinant hergestellter Antikörper, ein rekombinant hergestellter chimarer bzw humanisierter Antikörper oder single-chain-Antikorper (scFv) ist
9 Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das
Antikorpermolekul mit einem radioaktiven Isotop, einer radioaktiven Verbindung, einem Enzym, einem Toxin, einem Zytostatikum, einem Prodrug, einem Zytokin oder einem anderen immunmodulatorischen Polypeptid verknüpft ist
10. Verwendung eines Antikörpermoleküls, das für ein Epitop innerhalb der Aminosäuresequenz spezifisch ist, die durch das variable Exon vlO des CD44-Gens kodiert wird, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Diagnose und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Tumorerkrankung um ein Hodgkin-Lymphom (Lymphogranulomatose) handelt.
12. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß daß das Antikörpermolekül an die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 bindet.
13. Antikörpermolekül, das für ein Epitop innerhalb der Aminosäuresequenz spezifisch ist, die durch das variable Exon vlO des CD44-Gens kodiert wird, zur pharmazeutischen Verwendung.
14. Antikörpermolekül nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es an die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 bindet.
15. Antikörpermolekül nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß es ein monoklonaler Antikörper, ein Fab- oder F(ab')2-Fragment eines Immunglobulins, ein rekombinant hergestellter Antikörper, ein rekombinant hergestellter chimärer bzw. humanisierter Antikörper oder single-chain-Antikörper (scFv) ist.
16. Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem radioaktiven Isotop, einer radioaktiven Verbindung, einem Enzym, einem Toxin, einem Zytostatikum, einem Prodrug, einem Zytokin oder einem anderen immunmodulatorischen Polypeptid verknüpft ist.
PCT/EP1997/007081 1996-12-20 1997-12-17 Verfahren zur diagnose und therapie von hodgkin-lymphomen WO1998028625A1 (de)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/331,254 US6372441B1 (en) 1996-12-20 1997-12-17 Method for diagnosis and therapy of Hodgkin's lymphomas
CA002272855A CA2272855A1 (en) 1996-12-20 1997-12-17 Method of diagnosis and therapy of hodgkin's lymphomas
EP97954412A EP0946880A1 (de) 1996-12-20 1997-12-17 Verfahren zur diagnose und therapie von hodgkin-lymphomen
JP52834198A JP2001508052A (ja) 1996-12-20 1997-12-17 ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）の診断および治療方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19653607.3 1996-12-20
DE19653607A DE19653607A1 (de) 1996-12-20 1996-12-20 Verfahren zur Diagnose und Therapie von Hodgkin-Lymphomen

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US09/331,254 A-371-Of-International US6372441B1 (en) 1996-12-20 1997-12-17 Method for diagnosis and therapy of Hodgkin's lymphomas
US10/052,641 Continuation US20030032073A1 (en) 1996-12-20 2002-01-23 Method for diagnosis and therapy of Hodgkin's lymphomas

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998028625A1 true WO1998028625A1 (de) 1998-07-02

Family

ID=7815732

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1997/007081 WO1998028625A1 (de) 1996-12-20 1997-12-17 Verfahren zur diagnose und therapie von hodgkin-lymphomen

Country Status (6)

Country Link
US (2) US6372441B1 (de)
EP (1) EP0946880A1 (de)
JP (1) JP2001508052A (de)
CA (1) CA2272855A1 (de)
DE (1) DE19653607A1 (de)
WO (1) WO1998028625A1 (de)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19911329A1 (de) * 1998-03-27 2000-09-21 Benes Ivan Friedrich Humantherapeutisch anwendbares Radioimmunkonjugat und Verfahren zu seiner Herstellung
US8071072B2 (en) 1999-10-08 2011-12-06 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US20090004103A1 (en) * 1999-10-08 2009-01-01 Young David S F Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US20050100542A1 (en) * 1999-10-08 2005-05-12 Young David S. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US7947496B2 (en) * 1999-10-08 2011-05-24 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US8048416B2 (en) 1999-10-08 2011-11-01 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US20080124327A1 (en) * 1999-10-08 2008-05-29 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US20030077590A1 (en) * 2000-09-22 2003-04-24 Pedersen Finn Skou Methods for diagnosis and treatment of diseases associated with altered expression of neurogranin
US20030044803A1 (en) * 2000-09-22 2003-03-06 Pedersen Finn Skou Methods for diagnosis and treatment of diseases associated with altered expression of JAK1
US20070098728A1 (en) * 2001-09-24 2007-05-03 Pedersen Finn S Novel compositions and methods in cancer
US20040110933A1 (en) * 2002-09-13 2004-06-10 Dyax Corporation CD44-binding ligands
US20050009110A1 (en) * 2003-07-08 2005-01-13 Xiao-Jia Chang Methods of producing antibodies for diagnostics and therapeutics
JP5960793B2 (ja) * 2011-03-24 2016-08-02 ニューリム ファーマシューティカルズ（１９９１）リミテッド 神経保護ペプチド

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0538754A2 (de) * 1991-10-23 1993-04-28 Forschungszentrum Karlsruhe GmbH Verwendung von Antikörper enthaltenden Präparationen zur Immunsuppression
WO1994002633A1 (en) * 1992-07-21 1994-02-03 Isis Innovation Limited Diagnostic method
WO1995000851A1 (de) * 1993-06-22 1995-01-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Verfahren zur diagnose und analyse von tumoren

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4014510A1 (de) 1990-05-07 1991-11-14 Kernforschungsz Karlsruhe Variante cd44-oberflaechenproteine, diese kodierende c-dna-sequenzen, antikoerper gegen diese proteine sowie ihre verwendung in der diagnostik und therapie
WO1994012631A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Isis Innovation Limited Peptide corresponding to cd44 exon 6, antibodies specific for said peptide and use of these antibodies for diagnosis of tumors
WO1995000658A1 (en) 1993-06-18 1995-01-05 Sirpa Jalkanen COMPOSITIONS AND DIAGNOSTIC METHODS USING MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST CD44v6

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0538754A2 (de) * 1991-10-23 1993-04-28 Forschungszentrum Karlsruhe GmbH Verwendung von Antikörper enthaltenden Präparationen zur Immunsuppression
WO1994002633A1 (en) * 1992-07-21 1994-02-03 Isis Innovation Limited Diagnostic method
WO1995000851A1 (de) * 1993-06-22 1995-01-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Verfahren zur diagnose und analyse von tumoren

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ERMAK, G. ET AL.: "Restricted patterns of CD44 variant exon expression in human papillary thyroid carcinoma", CANCER RESEARCH, vol. 56, 1 March 1996 (1996-03-01), pages 1037 - 1042, XP002063388 *
GHAFFARI, S. ET AL.: "Differentation-associated changes in CD44 isoform expression during normal hematopoiesis and their alteration in chroninc meyloid lekemia.", BLOOD, vol. 86, no. 8, 1995, pages 2976 - 2985, XP002063386 *
JACKSON, D. G. ET AL.: "Multiple variants of the human lymphocyte homing receptor CD44 generated by insertions at a single site in the extracellular domain", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 267, no. 7, 1992, pages 4732 - 4739, XP002063387 *
SCREATON G R ET AL: "THE IDENTIFICATION OF A NEW ALTERNATIVE EXON WITH HIGHLY RESTRICTEDTISSUE EXPERESSION IN TRANSCRIPTS ENCODING THE MOUSE PGP -1 (CD44) HOMING RECEPTOR", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 268, no. 17, 15 June 1993 (1993-06-15), pages 12235 - 12238, XP000470181 *
TOLG C ET AL: "SPLICING CHOICE FROM TEN VARIANT EXONS ESTABLISHES CD44 VARIABILITY", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 21, no. 5, 11 March 1993 (1993-03-11), pages 1225 - 1229, XP000508272 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20030032073A1 (en) 2003-02-13
JP2001508052A (ja) 2001-06-19
US6372441B1 (en) 2002-04-16
CA2272855A1 (en) 1998-07-02
EP0946880A1 (de) 1999-10-06
DE19653607A1 (de) 1998-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0765343B1 (de) MONOKLONALER ANTIKÖRPER GEGEN CD44v6
WO1998028625A1 (de) Verfahren zur diagnose und therapie von hodgkin-lymphomen
US8946390B2 (en) Cancer-associated antigen
KR20230035697A (ko) 암 진단에 유용한 클라우딘 18.2에 대한 항체
US6010865A (en) Process for detecting a variant CD44 gene product
EP0865609B1 (de) Verfahren zur diagnose und therapie von plattenepithelkarzinomen
WO1995004547A1 (de) DURCH EXON v5 DES CD44-GENS KODIERTE POLYPEPTIDE ALS TARGETS FÜR IMMUNTHERAPIE UND IMMUNSZINTIGRAPHIE VON TUMOREN
EP0585570B1 (de) Granulozytenbindende Antikörperkonstrukte, ihre Herstellung und Verwendung
MXPA99005544A (es) Molecula de anticuerpo y su empleo para la diagnosis y terapia de linfomas de hodgkin
DE19545472A1 (de) Verfahren zur Diagnose und Therapie von Plattenepithelkarzinomen
DE4431297A1 (de) Monoklonaler Antikörper gegen CD44v6
MXPA96006108A (es) Anticuerpos monoclonales contra cd44v6
DE60223677T2 (de) Bcmp-101, ein mit krebs assoziiertes protein
DE4414787A1 (de) Verfahren zur Diagnose und Analyse von Zervixkarzinomen

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP MX US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1997954412

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2272855

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: PA/a/1999/005544

Country of ref document: MX

ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 1998 528341

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1997954412

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09331254

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1997954412

Country of ref document: EP