CN101553889A - 磁性颗粒及其制备方法和使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供颗粒、制备颗粒的方法、使用颗粒的方法以及含有颗粒的试剂盒。所述颗粒可以包括具有保护层的磁性颗粒和具有亲水部和疏水部的包覆层。

Description

磁性颗粒及其制备方法和使用方法
相关申请的交叉参考
本申请要求于2006年9月5日提交的美国临时申请60/824,493的优先权和任何其它权益，该临时申请的全部内容引入本文作为参考。
背景技术
在三种常见的铁氧化物Fe3O4、Fe2O3和FeO中；也被称为磁铁矿的Fe3O4具有最广泛的商业应用，包括生物医学诊断和治疗。磁铁矿的“铁磁流体”是铁氧化物颗粒沿磁场线自我排列的稳定悬浮液，它们可以在电子、航空电子、机器人、机械加工和汽车工业中具有商业价值(K.Raj，R.Moskowitz，J.Magn.Mag.Mater.85，233(1990))。磁铁矿分散液也已经被用于印刷应用(调色剂和油墨)(Suryanarayanan的美国专利4,991,191和Okana等人的美国专利5,648,170)，以及液晶装置的制造中，例如彩色显示器、单色光开关和可调谐滤波器(Rosenweig等人的美国专利3,648,269；Romankiv等人的美国专利3,972,595；Hong等人的美国专利5,948,321和6,086,780)。磁铁矿颗粒的生物医学应用包括临床诊断和治疗、药物传送和磁共振成像(MRI)(Gunther等人的美国专利6,123,920；Esenaliev的美国专利6,165,440；Gray等人的美国专利6,167,313；和D.K.Kim等人，J.Magn.Mag.Mater.225，256(2001))。在生物医学临床和研究领域中，磁性颗粒的最广泛应用是用于生物医学分离。
通过几种方法来制备商用纳米颗粒，例如Fe+2和Fe+3盐的碱共沉淀、直接化学还原、球磨、化学气相沉积和等离子体气相沉积(D.Huber，Small1，482(2005)；R.Kalyanaraman等人，Nanostructured Materials 10，1379(1998))。一些所述方法能够连续生产具有高度均匀性的干燥粉末形式的颗粒。这对于制造和商业化目的是非常理想的。然而，在溶剂中分散干燥粉末而同时保持它们的单分散性是非常具有挑战性的。这经常导致大量的材料损失以及样品的不均匀性。通常不选择炉子干燥的材料作为生物医学磁性产品的原料。
大多数通过化学方法制备的具有生物医学价值的商用磁性颗粒由包裹聚苯乙烯、多糖或二氧化硅的铁磁性磁赤铁矿(γ-Fe2O3)和磁铁矿的芯核混合物构成。在铁芯合成过程中或之后进行包覆，然后，将抗体、抗生蛋白链菌素或生物素连接到它们的表面上(G.H.Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press(1996))。
可以使用葡聚糖包覆铁颗粒，因为它赋予胶体稳定性并且作为不同蛋白质偶合作用的优异平台。Molday的美国专利4,452,773公开了包覆有水溶性多糖或具有支链官能团的衍生物的稳定的非团聚磁铁颗粒的生产。在Skold的美国专利申请2002/0000398中，通过使用被认为与铁芯共价连接的羧基葡聚糖、醛基葡聚糖和氨基葡聚糖衍生物，发展成为更稳定的连接。在Skold专利申请中所讨论的包覆层的具体类型是要求在葡聚糖衍生物和铁表面之间发生直接键合的包覆层。
用血清包覆颗粒的类似包覆层同样已经被描述过(Liberti等人的美国专利5,512,332和5,597,531)，尽管Whitehead等人的美国专利4,554,088声称被吸附的蛋白质的量低，并且在高于50℃时在1M的氯化钠中可去除。在大多数生物医学应用中，这种环境并不是典型的，但是在Liberi等人的美国专利6,120,856中，添加加热步骤将蛋白质不可逆地键合到颗粒上。
在Khalafalla等人的美国专利3,764,540、Kelley的4,019,994、Wyman的4,855,079和Hong等人的6,086,780中，公开了用于生产具有稳定包覆层的磁性材料的另一种方法，其中，通过将覆盖有脂肪酸单层的共沉淀的磁铁矿转移到非极性溶剂中来获得稳定的磁铁矿流体分散液(铁磁流体)。这种方法不需要长的制备时间，并且适于磁性流体的规模化生产。脂肪酸选择也是很重要的，Wyman的美国专利4,855,079教导将不同脂肪酸例如油酸和肉豆蔻酸组合可以生产不同直径的颗粒。
通过阻止邻近的磁性颗粒之间的紧密相互作用，油酸及其它脂肪酸起到有效的分散剂的作用。它们被认为化学吸附在铁表面上，使得疏水性侧链从该表面上延伸出来。在一些情况下，脂肪酸链也可以在颗粒表面周围折叠。无论如何，表面上存在表面活性剂在空间上阻止邻近颗粒之间的紧密相互作用。从而通过阻止颗粒随时间的团聚作用来赋予胶体稳定性，这是颗粒生长的主要机制。封端作用是所述包覆层的间接结果，但是用来显著限制颗粒的尺寸。
表面活性剂(脂肪酸)包覆的另一间接结果是提供防止铁氧化的随后保护。当铁表面暴露于空气中时发生铁颗粒的氧化，由于在颗粒表面上形成磁性失效层，铁颗粒的氧化引起其磁性的损失。在Wakayama等人的美国专利4,608,186、4,624,797和4,626,370中，描述了解决这种问题即防止磁性颗粒氧化的尝试。在Khalafalla等人的美国专利3764540中已经描述了脂肪酸包覆层的具体应用，其中发现脂肪酸包覆层完全满足防止方铁矿自燃氧化。一般认为脂肪酸是有取向性的，使得羧基与颗粒表面相互作用，并且疏水性脂肪链从所述表面指向溶剂。
对于生物医学应用，使用油酸覆盖磁性颗粒的缺点之一是赋予颗粒显著的疏水性以及缺少将蛋白质和配体化学连接到颗粒表面上的的官能团。非极性的长烷基链赋予了这两种特性。磁性颗粒的许多生物学应用和生物医学应用是在含水溶剂中进行的，这将导致疏水性颗粒的大量团聚。
磁性颗粒的磁芯的性质在选择用于特殊应用的颗粒中是重要的。最常见地，选择铁氧化物例如磁铁矿和磁赤铁矿作为磁芯，因为它们在生物缓冲液和培养基中是稳定的。然而，它们的磁化率不如未被氧化的金属铁的磁化率大(R.S.Tebble和D.J.Craik，Magnetic Materials，New York，Wiley-Interscience，(1969))。铁纳米晶可以在比其氧化物的可能尺寸更大的尺寸下保持它们的超顺磁性，并且因此具有较高的磁矩。然而，由于Fe0在空气和水中快速氧化成非磁性的氧氢化物，抵销了较高的磁矩。通常，保持铁在零价状态下使得其应用限制在基本上排除水和氧的条件下。
近来，已经引入碳包覆层作为防止金属铁颗粒氧化和降解的方法。在惰性气氛中进行的电弧放电技术可以在铁芯的周围获得20-30nm石墨包覆层壳。在颗粒表面发生显著氧化之前，碳包覆层可以将Fe0的磁化率保持至少3个月。
在生物医学领域，其中被包覆的颗粒用于细胞、蛋白质和核酸的磁性分离，通常的误解是商用磁性颗粒可以在间歇式磁系统或者在连续流过式磁系统中互换使用。Comelia(K.Comelia等人，Cytometry 45(4)，285(2001))和Melnik(K.Melnik等人，Biotechnol.Prog.17(5)，907(2001))的研究显示出较高磁矩的颗粒在连续流过式磁系统中运作，但是这些相同的颗粒则导致使用高梯度磁分离柱的商用间歇式磁系统聚集和堵塞。
尽管尚不清楚所有生物医学应用都需要高磁矩的磁性颗粒，但是清晰易辨的物理性能有助于获得可重现和可预测的临床应用结果，特别是癌细胞的临床富集。目前安装在磁能梯度内的间歇式分离柱受到堵塞，从而损害了最终产物的完整性。因为间歇式系统的内部几何形状，高磁性的细胞易于在分离柱中聚集。在间歇式分离柱的钢球之间的磁梯度是最高的，细胞趋向于团聚和粘结。因此，由于分离柱中的不可逆捕获，可能损失了重要的细胞，即使当分离柱不受磁影响时。相反，在流过式磁性细胞分选器中，弱磁性细胞趋向于不能迁移到顺流中，从而被损失掉。在连续流过式系统中，降低初始进料流速来提供足够的时间使较弱磁性细胞迁移通过内部分离柱。连续系统中的较低流速具有较大的缺点。较低的流速使处理时间减少并最终减少样品体积，此外，来自未被标记的细胞的污染增加。因此，在低流速模式下，回收率增加，但是牺牲了高纯的样品。
因此，对于间歇式系统和流过式系统，具有适用于每种系统并且随后可以优化它们性能(回收率、纯度、处理速率)的磁性颗粒是有利的。因此，所需要的是，可溶于水溶液的高质量磁性颗粒；以及制备和使用这种颗粒的方法。
发明内容
根据本发明的实施方式，提供颗粒。所述颗粒包括至少一个具有疏水性保护层的磁芯颗粒和包覆层。所述包覆层包括至少一个疏水部和至少一个亲水部，选择所述疏水部以与所述疏水性保护层的至少一部分自缔合，选择所述亲水部以促进所述颗粒在含水体系中的分散。
根据其它实施方式，提供颗粒。所述颗粒包括至少一个具有碳保护层的磁芯颗粒和包覆层。所述包覆层包括至少一个胺部和至少一个亲水部，选择所述胺部以与所述碳保护层的至少一部分自缔合，选择所述亲水部以促进所述颗粒在含水体系中的分散。
根据另外的实施方式，提供制备颗粒的方法。该方法包括：在第一溶剂中悬浮至少一个具有疏水性保护层的磁芯颗粒；在第二有机溶剂中溶解包括疏水部和亲水部的包覆层前体；以及将第一溶剂中的所述至少一个具有疏水性保护层的磁芯颗粒添加到第二溶剂中的所述包覆层前体中，使得形成至少一个具有疏水性保护层和包覆层的颗粒。所述包覆层前体的疏水部与所述疏水性保护层自缔合。
根据另外实施方式，提供制备颗粒的方法。该方法包括：在有机溶剂中溶解包括胺部和亲水部的包覆层前体；以及将至少一个具有碳保护层的磁芯颗粒添加到所述溶剂中的所述包覆层前体中，使得形成至少一个具有碳保护层和包覆层的颗粒。所述包覆层前体的胺部与所述碳保护层自缔合。
附图说明
当结合下面附图阅读时，可以很好理解如下的本发明实施方式的详细描述，其中相同附图标记表示相同结构：
图1是根据本发明实施方式的颗粒的示意图；
图2显示用根据发明实施方式颗粒标记的CD45+单核细胞(MNC)和用美天旎MACS珠(Miltenyi MACS beads)标记的CD45+MNC的磁泳迁移率；
图3显示根据本发明实施方式的颗粒的TEM图像；和
图4说明在丙烯葡聚糖凝胶S-300(柱尺寸45×2.5cm)上色层分离的自缔合磁性颗粒的代表性分离柱分布结果。
具体实施方式
现在通过不时参考本发明的具体实施方式来描述本发明。然而，本发明可以不同形式具体实施，不应认为限制于在此描述的实施方式。而是，提供这些实施方式使得公开内容更为彻底和完整，并且对于本领域技术人员而言完全在本发明的范围内。
除非其它限定，在此使用的所有技术术语和科学术语具有与通常由本发明所属技术领域中的普通技术人员所理解的相同含义。在本发明说明书中使用的术语仅用于描述特殊实施方式，并不打算限制本发明。正如本发明说明书和附加的权利要求书中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”也包括复数形式，除非上下文中另外清楚地说明。所有在此提及的出版物、专利申请、专利及其它参考都整体引入作为参考。
“可选择的”或“可选择地”意指随后描述的情况或情形可能发生或可能不发生，说明书包括事件发生的情形和事件不发生的情形。在整个本发明申请中，使用各种术语例如“主要”、“其次”、“第一”、“第二”等，这些术语是区别不同单元的常用措词，这种术语并不限制不同单元如何使用。正如在此所使用的，术语“癌症”是指任何类型癌症，包括但不限于卵巢癌、白血病、肺癌、结肠癌、CNS癌、黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳癌等。
根据本发明的实施方式，提供颗粒。所述颗粒包括至少一个具有疏水性保护层的磁芯颗粒和包覆层。所述包覆层包括至少一个疏水部和至少一个亲水部，选择所述疏水部以与所述疏水性保护层的至少一部分自缔合，选择所述亲水部以促进所述颗粒在含水体系中的分散。
可以使用任何适合的磁芯颗粒。为了定义和描述本发明，术语“磁芯颗粒”应当理解为表示具有磁性、能磁化或具有顺磁性的并且适于进行磁性分离的任何材料。所述磁芯颗粒可以具有任何适合的尺寸。例如，所述磁芯颗粒可以为约5nm-约2μm。在另一实施例中，所述磁芯颗粒可以为约20nm-约300nm。所述磁芯颗粒可以由任何适合的磁性材料构成。例如，所述磁芯颗粒可以选自：铁氧体，例如磁铁矿、锌铁氧体或锰铁氧体；金属，例如铁、镍、铝、钡、铋、铈、铬或钴；金属合金；铁氧化物和二氧化铬。在一些实施例中，所述磁芯颗粒由磁铁矿(Fe3O4)构成或由金属铁(Fe0)构成。在其它实施例中，所述磁芯颗粒可以为其它的氧化铁基颗粒材料，包括具有通常结构MFe2O4的复合材料，其中M可以为Co、Ni、Cu、Zn、Mn、Cr、Ti、Ba、Mg或Pt。应当理解的是，对于具体的应用可以选择具体的磁芯颗粒。
所述疏水性保护层可以包括任何适合的疏水性单元。在一些实施例中，选择疏水性保护层以防止所述至少一个磁芯颗粒氧化。正如在此进一步讨论的，所述疏水性保护层参与至少部分所述包覆层的自缔合。为了定义和描述本发明，术语“自缔合”应当被理解为表示在一个或多个分子或部分分子之间的领域或者区域的自发但可预知的排列。一般认为自缔合主要由热动力学力驱动。自缔合的实例包括但不局限于将磷脂添加到水中之后自发形成双分子层。磷脂是两亲分子，由连接极性含氮碱基、甘油部分或肌醇基团的非极性脂肪酸链构成。双分子层由两层排列的脂类构成，使得它们的长链疏水性尾端相互面对面以通过各向异性的分子间力结合在一起形成油质芯核，而它们的亲水性首基面向薄膜任何一侧的水溶液，并且参与氢键键合。这种特殊的自缔合反应主要由熵力驱动，使脂肪酸链与水隔离。
适合的疏水性保护层的实例包括但不局限于饱和或不饱和的、共轭或非共轭的、取代或未被取代的有机酸或者具有约10-约22个碳原子的一元羧酸。在一些实施例中，所述疏水性保护层为至少一种脂肪酸。脂肪酸具有长的烃链，末端具有羧基，并且脂肪酸可以为饱和或不饱和的，具有顺式或反式构型的双键。适合的脂肪酸的实例包括但不局限于己酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十四酸、亚麻酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、异硬脂酸、花生酸、二十二烷酸、油酸和亚油酸。在其它实施例中，也可以使用分子间能够交联的改性脂肪酸衍生物。这种的实例包括化学反应活性衍生物、光活性衍生物以及能够通过自氧化交联的衍生物。化学反应活性物质包括磺基-N-琥珀酰亚胺基衍生物、光活性衍生物例如含有活性叠氮基、二苯甲酮或双吖丙啶基团的脂肪酸。能够自氧化的衍生物包括天然和合成的聚不饱和脂肪酸，其链长大于8个碳原子且具有2个以上的顺式双键，这些双键最常见通过单亚甲基相互分开。也可以添加活性小分子以使不饱和双键进行化学交联
Wyman的美国专利4,855,079教导当尾端部分的长度(ζ)与磁性颗粒直径(D)的比例小于约0.2时所述颗粒会团聚。因此，一般认为可以选择特定的疏水性保护层以有助于形成适合尺寸的颗粒。例如，具有18个碳且长度为2.35nm的油酸将形成不超过约12.5nm的铁颗粒芯核。预测具有14个碳且长度为1.83nm的肉豆蔻酸形成不超过约9.2nm的芯核直径。
有几种方式可以使疏水性保护层与磁芯颗粒表面进行键合。应理解的是，所述键合取决于具体的金属芯核颗粒和所选择的疏水性保护层。例如，油酸和脂肪酸可以键合到铁颗粒的表面。基于具有油酸包覆层的FePt颗粒的FTIR结果(N.Shukla等人，J.Magn.Mag.Mater.266,178-184(2003))，铁和脂肪酸之间的表面键合包括单齿和双齿羧酸盐键合。因此，脂肪酸的羧基与铁表面紧接，烃链从颗粒表面指向外。疏水性保护层可以充当有效的阻挡层，以防止磁芯颗粒氧化，并且可以帮助颗粒保持分散状态。然而，这种颗粒仅在有机溶剂中分散，在含水缓冲液中形成明显的团聚。因此，使用包覆层以提供更适合的颗粒。
在一些实施例中，单个具有疏水性保护层的磁芯颗粒与包覆层紧接。因此，所述颗粒包括单个具有疏水性保护层的磁芯颗粒和包覆层的亲水部分，所述疏水性保护层与所述包覆层的疏水部自缔合。在其它实施例中，所述颗粒包括多个磁芯颗粒，所述多个磁芯颗粒中的每个磁芯颗粒具有疏水性保护层，包覆层与具有疏水性保护层的所述多个磁芯颗粒中的一个以上的磁芯颗粒紧接。因此，在该实施例中，具有疏水性保护层的磁芯颗粒的集合体被包覆层包裹。
选择包覆层的疏水部以使其与所述疏水性保护层自缔合，可以使用任何适合的疏水部。例如，所述疏水部可以为疏水性单元，包括但不局限于饱和或不饱和的、共轭或非共轭的、被取代或未被取代的有机酸或者具有约10-约22个碳原子的一元羧酸。例如，可以使用多糖包括脂肪酸；可生物降解的聚合物例如但不局限于聚乳酸(PLA)、聚己酸内酯(PCL)和聚羟基丁酸戊酯(PHBV)；可生物降解的聚合物复合材料和聚烯烃，包括但不局限于聚乙烯及其变体。适合的多糖的实例包括但不局限于葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖、出芽短梗霉聚糖、纤维素、纤维二糖、菊粉、脱乙酰壳多糖、藻酸盐和透明质酸。在一些实施例中，糖类单元通过选自缩醛、半缩醛、缩酮、原酸酯、酰胺、酯、碳酸和氨基甲酸酯的键进行连接。在其它实施例中，多糖可以具有2-2000个糖单元。在其它实施例中，也可使用分子间能够交联的改性脂肪酸衍生物。这些实施例包括化学反应活性衍生物、光活性衍生物以及通过自氧化交联的衍生物。化学反应活性物质包括磺基-N-琥珀酰亚胺衍生物；光活性衍生物例如含有活性叠氮基、二苯甲酮或双吖丙啶基的脂肪酸。能够自氧化的衍生物包括天然和合成的聚不饱和脂肪酸，其链长大于8个碳且具有2个以上的顺式双键，这些双键最常见通过单个亚甲基相互分开。也可以添加活性小分子以使不饱和双键进行化学交联。对于本领域技术人员显而易见的是，可以应用光活性和化学活性的方法以在脂肪链之间产生直接共价键，从而在颗粒周围形成持久的不能移动的包覆层。
包覆层的疏水部和所述疏水性保护层自缔合以在磁芯颗粒周围形成疏水性区域。例如，包覆层的疏水部和所述疏水性保护层可以通过互相交错来自缔合，并且可以通过交错的烃链之间的疏水性相互作用使疏水区域稳定。在一些实施例中，当发生自缔合时，所述疏水性保护层的分子和/或链的尾端部分与疏水性包覆层部分相互缔合，并且朝颗粒表面折叠，从而减少颗粒之间的距离。
所述包覆层还具有被选择用来促进所述颗粒在含水体系中分散的亲水部。所述包覆层的亲水部和疏水部可以以任何其它适合的方式进行共价键连或缔合。可以设置亲水部，使得由亲水区域包裹疏水区域。例如，不束缚于理论，与亲水部连接的疏水部可以通过与所述疏水性保护层相互交错进行自缔合，使得产生将金属芯核颗粒与所述亲水部分隔的疏水层。因此，亲水部成为包裹疏水区域和金属芯核颗粒的最外层。图1示意性说明具有油酸疏水性保护层的具体铁颗粒和具有油酸疏水部和葡聚糖亲水部的包覆层。葡聚糖亲水部在疏水区域周围形成层。
也可以选择亲水部以作为配体或对重要的受体具有亲合力的其它单元的连接位置。在其它实施例中，重要的受体可以与亲水部连接。例如，可以选择亲水部以作为以下配体或对重要的受体具有亲合力的其它单元的连接位置，所述配体或对重要的受体具有亲合力的其他单元包括但不限于蛋白质、缩氨酸、多肽、核苷酸、多核苷酸、短链和长链有机分子以及被选择对特定的受体具有亲合力的无机分子。本领域技术人员将能够根据使用所述颗粒的特定体系选择特定的配体和/或对重要的受体具有亲合力的其它单元。
在一些实施例中，可使用烷基硅烷作为包覆层。选择烷基硅烷使得它们具有至少一个饱和或不饱和的、被取代或未被取代的、共轭或未共轭的脂肪基团，其包括具有充分疏水性和三维结构的疏水部，使得允许它们与疏水性保护层自缔合。烷基硅烷的硅部不与磁芯颗粒连接，烷氧基可以用来与相邻基团反应。烷氧基包括亲水部，通过碱性或酸性条件使烷氧基脱水可以使各个硅烷交联以生成稳定的包覆层。
在一些实施例中，烷基硅烷可以具有链长为8-20个碳的脂肪基团，并且链中不具有双键、具有一个双键或者多个双键。适合的烷基硅烷的实例包括但不局限于正辛基三乙氧基硅烷、十四烷基三甲氧基硅烷、十六烷基三乙氧基硅烷、十六烷基三甲氧基硅烷、十六烷基三乙酰氧基硅烷、甲基十六烷基二乙酰氧基硅烷、甲基十六烷基二甲氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、十八烷基三氯硅烷、十八烷基三乙氧基硅烷和1，12-双(三甲氧基甲硅烷基)十二烷。
本发明的包覆层可以具有任何适合的厚度。例如，所述包覆层可以具有选择的厚度，使得整个颗粒具有约20nm-约4.5μm尺寸。在其它实施例中，所述颗粒可以具有约200nm-约400nm的尺寸。应理解的是，所述包覆层可以包括单层或多层。
在本发明的其它实施方式中，提供包括至少一个具有碳保护层的磁芯颗粒和包覆层的颗粒。所述包覆层包括至少一个胺部和至少一个亲水部，选择所述胺部以与所述碳保护层的至少一部分自缔合，选择所述亲水部以促进所述颗粒在含水体系中的分散。可以使用任何适合的胺部。适合的胺包括那些在生理条件下是阳离子性的，或者能够与碳包覆层形成静电复合物的胺。这种胺包括但不局限于含有伯胺、仲胺、叔胺或者甚至季铵的支链多胺和直链多胺。应理解的是，适合的胺可以是高度取代的胺，包括叔胺和季铵。适合的胺部的实施例包括但不局限于聚乙烯亚胺(PEI)、精胺(4胺)和亚精胺(3胺)。在一些实施例中，在亲水部被氧化之后所述胺可以通过胺键或亚胺键连接。例如亲水多糖可以被氧化成聚醛(席夫碱)。应理解的是，所述包覆层的亲水部可以如上述讨论的，磁芯颗粒和整个颗粒的尺寸也可以如上述讨论的。
根据本发明的实施方式，可以通过任何适合的方法制得颗粒。在一些实施方式中，通过如下步骤来制得颗粒：在第一溶剂中悬浮至少一个具有疏水性保护层的磁芯颗粒；将包括疏水部和亲水部的包覆层前体溶解在第二有机溶剂中；以及将第一溶剂中的所述至少一个具有疏水性保护层的磁芯颗粒添加到第二溶剂中的包覆层前体中，使得形成至少一个具有疏水性保护层和包覆层的颗粒，其中所述包覆层前体的疏水部与所述疏水性保护层自缔合。
在一些实施例中，该方法可以进一步包括在添加所述至少一个磁芯颗粒步骤之后去除第一溶剂和第二溶剂的步骤。例如，去除第一溶剂和第二溶剂的步骤可以包括将溶液加热到足够温度以去除第一溶剂和第二溶剂中的至少一种溶剂的至少一部分。在一些实施例中，通过加热仅可以去除第一溶剂或第二溶剂。在其它实施例中，该方法可以进一步包括通过渗析、柱色谱法、渗滤和搅拌单元装置中的压滤或它们的组合中的至少一种来去除第一溶剂和第二溶剂的高沸点残余物的步骤。
可以使用任何适合的第一溶剂和第二溶剂。例如，第一溶剂可以选自氯仿、甲醇、己烷以及它们的组合。在其它实施例中，第二溶剂可以选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺(DMSO)、甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮的混合物、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、丙二醇、乙腈、油酸乙酯以及它们的组合。应理解的是，第一溶剂和第二溶剂可以为任何适合的溶剂，根据具有疏水性保护层的具体磁芯颗粒和具体的包覆层前体进行选择。在一些实施例中，第一溶剂或第二溶剂可以为DMSO。DMSO用于自缔合反应，因为其与非极性化合物和极性化合物的混溶性可以允许其使包覆层前体的疏水部和包覆层前体的亲水部成为溶剂化物。可以使用基于薄膜的切向流动过滤(TFF)单元通过渗滤来去除DMSO。为了使DMSO对膜滤器潜在破坏最小化，在TFF之前可以使该反应液在0.5M的NaCl中稀释10倍。在用0.5M的NaCl对DMSO进行10倍体积交换(去除99.9％的DMSO)之后，可以进行第二次渗滤以用50HEPES pH值为7.4、0.15M的NaCl对这种溶液进行交换。此时颗粒是胶态状，并且能够在适合的温度下储存。
还应理解的是，可以使用任何适合的反应条件和附加步骤。例如，在混合之后，包覆层前体溶液和磁芯颗粒可以进行超声处理。
金属芯颗粒可以以任何适合的方式制得，并且可以具有以任何适合方式提供的疏水性保护层。例如，通过改性的铁盐共沉淀法，可以经济地实现数克规模的铁颗粒的生产，所述共沉淀法包括以摩尔比2∶1混合六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)和四水合氯化亚铁(FeCl2·4H2O)，然后添加氢氧化铵(NH4OH)以快速沉淀胶体铁颗粒。所获得的颗粒随后包裹在有机材料中，该有机材料阻止氧化、团聚，并且作为包覆层自缔合的基础。Reimers等人的美国专利3,843,540教导在胶体铁颗粒已经形成之后添加脂肪酸以避免干扰沉淀反应。这种添加应尽快以阻止颗粒通过团聚进一步长大。脂肪酸的量并不重要，只要足以包覆铁以防止团聚。例如，在该实施例中，油酸的量可以为Fe3O4理论产率的30％-75％。
包覆层前体可以以任何适合的方式制得。例如，可以使用任何适合的方法将适合的疏水部连接到适合的亲水部。在一些实施例中，可以生成用脂肪酸链取代的疏水性葡聚糖，从而能够与疏水性保护层自缔合。例如，如Domb的美国专利7,001,891所描述的，油胺可以与葡聚糖共轭。葡聚糖聚合物上脂肪链取代的程度可以为约2-约20％。疏水性残基一般通过酯、酰胺、亚胺、胺、尿烷或碳酸酯键与葡聚糖主链共轭，这取决于共轭组分上的可获得的官能团。可以在G.H.Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，(1996)中获得用于这些偶合的方法。
在一些实施例中，可以由脂肪酸例如己酸制备包覆层前体，或者使用活性酸例如酸酐或酰基氯衍生物或更适于含水介质的活化剂例如二环己基碳化二亚胺(DCC)及其衍生物，油酸可以与亲水部上的羟基或胺基键合。或者，使用碳酰氯衍生物通过碳酸酯或尿烷键，可以共轭己基或油烯基醇或胺。在亲水溶液中进行反应，其中亲水部溶解在或者至少分散在具有大表面积的细颗粒中。用于这些制备的适合溶剂的实例包括但不局限于二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮、二甲亚砜(DMSO)以及它们与水的混合物。在它们偶合之后，可以对包覆层前体进行清洗，去除未反应的试剂，并且在真空中干燥。
制备具体金属颗粒的一个实施例是用疏水性葡聚糖包覆具有油酸疏水性保护层的铁颗粒。可以在水浴超声波仪中进行用疏水性葡聚糖包覆铁-油酸酯。在一个实施例中，油胺残基取代度为约6％的疏水性葡聚糖溶解在二甲亚砜中，并且在80℃下保温30分钟。通过离心分离去除未溶解的材料，然后过滤淡黄色液体，且返回到水浴中。将氯仿中的包覆油酸的铁颗粒逐滴添加到以100W功率超声处理的疏水性葡聚糖中。葡聚糖与铁的比例为至少10∶1(w/w)。之后在60℃下保温至少30分钟。
在一个实施例中，十八烷基三乙氧基硅烷(Gelest Inc.，Morrisville，PA)与铁-油酸酯组合，并且该混合物在70℃水浴超声波仪中进行超声处理。加热去除氯仿(沸点62℃)，这使铁-油酸酯分布到十八烷基三乙氧基硅烷相中。与硅原子连接的18碳脂肪链与包覆铁表面的疏水性油烯基链相互交错。随后添加溶胶-凝胶组分；氢氧化铵、甲醇和表面活性剂，并且在60℃下反应20分钟。在磁性表架上收集该材料，在甲醇中清洗，如果有必要，使用丙烯葡聚糖凝胶S-300(Sephacryl S-300)作为基质通过尺寸排阻色谱法可以纯化所述颗粒。
在一些实施方式中，可以制备至少一个具有碳保护层和包覆层的磁芯颗粒。可以如上述讨论的获得适合的磁芯颗粒。这些颗粒可以具有以任何适合方式提供的碳保护层。例如，磁芯颗粒可以通过任何适合的方法来包覆碳保护层，包括但不限于球磨、激光烧蚀、化学气相淀积和微波等离子体处理。碳保护层可以包括单层或多层碳。在一些实施例中，包覆碳的颗粒可以市场上购买获得。例如，包覆碳的Fe0颗粒可以由商业来源获得。一般认为包覆碳的磁芯颗粒可以防止水解和氧化。
可以以任何适合的方式形成包括至少一个胺部和至少一个亲水部的包覆层，选择所述胺部以与所述碳保护层的至少一部分自缔合，选择所述亲水部以促使所述颗粒在含水体系中的分散。例如，可以在溶剂中提供包覆层前体，可以将具有碳保护层的磁性颗粒添加到溶液中以形成颗粒。在一些实施例中，该方法进一步包括：在添加所述至少一个磁芯颗粒的步骤之后去除溶剂的步骤。例如，去除溶剂的步骤可以包括将溶液加热至足够的温度以去除至少部分溶剂。在其它实施例中，该方法可以进一步包括通过渗析、柱色谱法、渗滤和搅拌单元装置中的压滤中的至少一种或它们的组合来去除溶剂的步骤。
可以以任何适合的方式制得包覆层前体。例如，胺可以在亲水部氧化之后通过胺键或亚胺键进行连接。例如，亲水性多糖可以被氧化成聚醛(席夫碱)。此外，所述包覆层前体可以如上述讨论的方式来制得。
不希望被束缚，需要注意的是，碱性氮原子对碳纳米管具有强的亲合力(参见(1)Liu，J.；Casavant，M.J.；Cox，M.；Walters，D.A.；Boul，P.；Lu，W.；Rimberg，A.J.；Smith，K.A.；Colbert，D.T.；Smalley，R.E.Chem.Phys.Lett.1999，303，125-129、(2)Choi，K.H.；Bourgoin，J.P.；Auvray，S.；Esteve，D.；Duesberg，G.S.；Roth，S.；Burghard，M.Surf.Sci.2000，462，195-202、(3)Lewenstein，J.C；Burgin，T.P.；Ribayrol，A.；Nagahara，L.A.；Tsui，R.K.；Nano Lett.2002，2，443-446、(4)Sano，M.；Kamino，A.；Okamura，J.；Shinkai，S.，Nano Lett.2002，2，531-533)。这涉及在供电子的胺基与碳纳米管表面之间的供体-受体相互作用。在高度取代的具有适合亲水部的胺与具有碳保护层的磁性颗粒之间也可以获得相似的关系。例如，包覆碳的Fe0颗粒可以包覆有包括聚乙烯亚胺部分和葡聚糖部分的包覆层前体。在这种情况下，带正电荷的聚乙烯亚胺部分向包覆碳的Fe0颗粒的表面方向进行取向，而极性葡聚糖部分在外部区域与溶剂分子相互作用。
所述颗粒可以具有任何适合的配体或与所需连接的受体具有亲合力的其它单元，并且本领域技术人员将会理解到，可以使用各种体系来连接各种配体或与所希望的受体具有亲合力的其它单元。适合的配体或与所希望的受体具有亲合力的其它单元的实例包括但不局限于蛋白质、缩氨酸、多肽、核苷酸、多核苷酸、短链和长链有机分子、以及选择用于对特殊受体具有亲合力的无机分子。
例如，通过形成不稳定的亚胺(席夫碱)，之后还原胺化成稳定的仲胺键，蛋白质的胺和氨基改性的核酸的胺可以与被氧化的葡聚糖偶合。对葡聚糖进行适度的高碘酸钠处理，通过对邻近的羟基或二醇进行氧化而产生活性醛。在温和条件下当pH值为7-10时与蛋白质之间形成亚胺键，然后通过用硼氢化钠或氰基硼氢化钠处理还原成稳定的仲胺键，同时将任何未反应的醛基还原成乙醇。
将蛋白质与颗粒偶合的另一方法是产生稳定的腙键。首先将蛋白质改性为含有酰肼化合物，然后与氧化的葡聚糖反应。酰肼与醛明确地反应形成腙键，然后该腙键可以与氰基硼氢化物反应以还原双键。例如，使用己二酸二酰肼(Aldrich)或琥珀酰亚胺4-肼基烟酸酯丙酮腙(succinimidyl4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone)(SANH；Solulink Inc)，可以将抗生蛋白链菌素与葡聚糖偶合。该反应使用少于5倍的抗生蛋白链菌素，所获得的蛋白质密度与通过其它方法获得的密度刚好同样高。
可以使用(3-氨基丙基)三乙氧基甲硅烷(APTS)来完成包覆二氧化硅的颗粒上的配体连接，以在颗粒表面上引入胺，而(3-巯基丙基)三乙氧基甲硅烷(MPTMS)将会引入SH基。然后，可以使用异基双功能偶合剂(琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)将硫醇与胺连接。例如，颗粒表面上的胺已经与抗生蛋白链菌素分子上的硫醇连接，并且颗粒表面上的硫醇与抗生蛋白链菌素的胺连接。
由所述颗粒提供的高磁矩是分析和制备以及诊断、预测和治疗技术所需要的，特别是需要高通量或快速诊断特征的那些技术。所述颗粒可以用于分离或富集无机分子和有机分子、病毒、细胞器官和细胞。
在一些实施方式中，提供用于临床或研究环境的组装试剂盒。试剂盒可以用于生物或分子应用。试剂盒可以包括裂解缓冲液(在需要从样品制备中去除红血球时)、标记表面部分的第一抗体/第一靶、与识别第一抗体/第一靶的第二抗体/第二靶共轭结合的颗粒、和/或直接与所述磁性颗粒共轭结合的第一抗体/第一靶。此外，在所述试剂盒中可以包括生理缓冲液(其可以用于样品清洗和再悬浮)以及各种磁性细胞分离系统中的鞘载流体。缓冲液可以包括但不局限于添加的表面活性剂、抗絮凝剂、稳定剂以及铁磁流体。
应理解的是，所述颗粒可以用于各种应用。所述颗粒可以用于生物医学、生物工艺学、制药学和化学工业，并且可以用于提纯，包括但不限于细胞富集和选择、核酸提纯和亲合分离。当所述颗粒用于临床设置时，可以用于诊断试验例如癌症筛选、癌症监控、作为治疗技术例如移植、糖尿病和干细胞治疗的制备工具。本申请公开的实施方式还提供可以用于富集生物材料和有机或无机材料的方案和方法，这些生物材料和有机或无机材料可能以低水平或极低水平存在于复合物中。
所述的颗粒和方法可以克服与先前研制的磁性颗粒的尺寸、单分散性、表面积和磁特性相关的问题。这些颗粒可以在含水溶液中稀释而没有出现显著的材料沉淀，并且可以与标准化学偶合反应物反应以连接适合的配体和/或受体。因此，它们可以提供磁性富集来自血液、病毒、细胞器官中的稀有细胞的改进方法，以及进一步分离或富集无机分子和有机分子例如蛋白质和核酸的改进方法。它们也可以用于各种其它的应用。所述颗粒可以用于被设计应用于高通量磁性分离方案的步骤中，并且可以使磁性标记的细胞的回收率最大化。
通过参考用以说明而并非进行限制的如下实施例，将会更好地理解本发明。
实施例
实施例1：合成疏水性葡聚糖
在Domb的美国专利7,001,891中详细描述了疏水性葡聚糖的合成。该专利教导通过包括酯键、亚胺键、胺键或碳酸酯键的反应将疏水链共轭结合(“枝接”)到葡聚糖及其它多糖的方法。当合成疏水性葡聚糖时，溶剂选择是重要的，因为溶剂必须分散原料和最终产物以及能够使全部偶合反应得以发生。也必须选择取代度，取代度通常是葡聚糖的分子量和脂肪酸的链长的函数。通常，高分子量烷基链以低取代度进行偶合以保持水溶性。低分子量链允许较高的取代度。根据本发明的葡聚糖脂肪族羧酸酯的取代度为0.05％-20％。正如与分子量有关的上述具体说明，取代度也是统计数值。
实施例2：合成磁性铁颗粒
在一个实施方式中，通过混合二价铁(Fe+2)溶液与三价铁(Fe+3)的溶液，并向该溶液中添加氢氧化铵溶液来合成磁性(Fe3O4)。将约1.51g的FeCl3·6H2O和0.64g的FeCl2·4H2O溶解于40ml的N2净化的水中。将约0.1克的油酸或其它脂肪酸添加到在丙酮中，并且在65℃下并在N2保护下进行反应。在剧烈搅拌时，通过添加20ml的28％(v/v)NH4OH，将该混合物滴定至pH值为9-10。将该反应在pH值高于9.5下保持60分钟，然后加热到90℃保持1小时。将该反应冷却到室温，然后用乙酸进行酸化。然后添加约3体积的甲醇，并且将磁性材料捕集在磁棒上。用50∶50的丙酮∶甲醇混合物彻底清洗该材料，并且收集在磁棒上。然后在水中清洗该材料几次，以去除三价铁的氢氧化物(FeOOH)，然后通过3次离心分离除去大的团聚物(以600×g低速临床离心机，5分钟)。干燥该材料，在25mL的氯仿中再悬浮，并且以4,500×g离心分离30分钟。在这些条件下极少材料进行沉淀，但是通常在管底部观测到极细的颗粒。磁性颗粒不容易通过磁性捕获从氯仿中进行回收，然而如果保留在磁性表架中，磁性颗粒可以在12-16小时后回收。通过干重分析来测定，在过程结束时收集的纯化磁性颗粒的量为500-750mg。
实施例3：用疏水性葡聚糖包覆铁-油酸颗粒
将实施例2中制备的铁-油酸颗粒分散在己烷和氯仿中，而不是分散在含水缓冲液中。为了将这些颗粒转移到含水相中，通过油酸酯-葡聚糖进行自缔合，从Fe的油酸酯侧链和从葡聚糖的油脂酸侧链进行交错使得形成脂肪酸层，该脂肪酸层将亲水性葡聚糖层与Fe0铁芯核隔离。包覆材料具有高磁性、可水分散的，并且易于进行常规偶合作用以进行配体连接。
可以使用具有不同取代度(油酸酯单元/糖类单元)的油酸酯-葡聚糖共轭结合物。也可以由不同的葡聚糖分子量、不同的多糖和不同的脂肪族分子来制备脂类多糖共轭结合物以满足具体的需要。可以在可溶解Fe0的氯仿-甲醇(v/v比2∶1)中进行自缔合反应。也可在其它的溶剂例如乙酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃聚乙二醇醚、丙二醇、乙腈或油酸乙酯中进行自缔合。许多这些试剂被FDA(FDA and CDER，Guidence for Industry：QC3Tables and List(2003)，参见http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm)认定是2类(限制使用)或3类(低毒)溶剂。
向5mL的二甲亚砜(DMSO)中添加约150mg的疏水性葡聚糖，将该混合物在65℃下保温20分钟。然后以4500rpm的速率离心分离20分钟，随后过滤透明上层清液。然后将过滤后的葡聚糖放置于在50℃下以100W操作的水浴超声波仪中。通常在体积不超过0.5mL的氯仿中添加约15mg的铁-油酸。将该混合物在50℃下保温并伴随超声处理30分钟。在此期间，升高的温度使氯仿挥发，这促进了铁-油酸酯转移到二甲亚砜中。当保温结束时，通过真空除去残留的氯仿蒸气。向该反应中添加约5体积的0.5M的NaCl，使用密理博培肯XL型(Millipore Pellicon XL)盒式切向流动过滤装置将该混合物渗滤整夜。然后将滤液以4500rpm的速率离心分离20分钟，随后使用装配有500kDa MW的截止聚醚砜过滤器的搅拌单元压滤(N2)透明上层清液。所获得的材料保持悬浮状态几个星期，并且直径为200-250nm。
以至少75％的初始铁颗粒分布到含水相中来判断成功的自缔合。该材料是单分散性的，且保持至少80％的其原始磁特性。通过原子吸附和感应偶合等离子体-光学电子光谱法进行铁定量分析，同时通过细胞跟踪测速仪和磁场场流分离来测定磁特性。
通过透射电镜(TEM)对包覆的铁颗粒进行物理分析，其结果表明铁(Fe3O4)芯核具有20-70nm的晶粒尺寸。动力学光散射(DLS)表明未进行超声处理的包覆葡聚糖的颗粒的平均流体动力学半径是约为200-300nm直径的团聚体(参见图3)。剧烈的探针超声处理并不能减少所述的平均团聚尺寸。通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)证实了在铁颗粒表面上存在油酸包覆层，该傅里叶变换红外光谱在2800-3000cm-1区域显示出油烯基的特有的对称和不对称CH2伸缩方式(Shukla等人，Supra)。在未包覆的颗粒上并不存在这些峰。
在疏水性葡聚糖和疏水性铁芯核之间的自缔合反应的证据包括在常规尺寸筛分分离柱上常见出现与峰值铁含量反应的峰值葡聚糖。图4显示了在丙烯葡聚糖凝胶S-300(分离柱尺寸45×2.5cm)上进行色谱分析的自缔合磁性颗粒的典型分离柱分布图。在这些研究中，通过如Ludwig和GoldbergJ.Dent.Res.35(1)：90.(1956)描述的蒽酮活性过程测量葡聚糖。通过感应偶合等离子体光电谱进行铁含量分析。洗提在孔隙体积中的颗粒，所述颗粒具有220-280nm的粒度分布。如果使用常规的葡聚糖(例如Dextran 70,000)代替所述疏水性葡聚糖，则不会发生自缔合，并且观察到非常不均匀的团聚体，其最小尺寸为2-4微米。此外，磁性收集并且彻底清洗的颗粒显示出强的蒽酮活性。
实施例4：用疏水性硅烷包覆铁-油酸颗粒
约1mL的包覆脂肪酸的铁颗粒与1mL的辛基癸基三乙氧基硅烷或辛基癸基三甲氧基硅烷(GelestInc.，Morrisville，PA)在50mL的菲肯试管(Falcon tube)中混合，然后置于65℃水浴中。将该试管超声处理约30分钟，通过真空吸气定期去除氯仿蒸气。
在单独的烧杯中，通过将1.8g的十六烷基三甲基溴化铵、35.2g的环己烷、3.5mL的丁醇和0.88mL的33％氢氧化铵混合来生成稳定的微乳液。将该混合物剧烈搅拌直到反应液透明。然后将硅烷/铁混合物逐滴添加到该微乳液中，同时快速搅拌反应液。在20分钟后，将该混合物倒入菲肯试管中，然后轻微摇动整夜。第二天，将该磁性材料进行磁性收集，在100％乙醇中清洗几次。用100mM的Tris、150mM的NaCl和0.05％的Tween-20(pH值为8.2)清洗该材料，并且在少量体积的相同缓冲液中再悬浮该材料，在Sephacryl-100上通过凝胶过滤色谱进行尺寸分离。在2.5×33cm的分离柱上应用5mL的反应混合物，用100mM的Tris、150mM的NaCl和0.05％的Tween-20(pH值为8.2)进行洗提。在空隙体积部分中出现纯化的磁性颗粒，并且通过干重分析测定，该磁性颗粒具有约10mg/mL的浓度。
实施例5：配体连接
氢封端的表面与烷氧基硅烷和氯硅烷进行硅烷化是用于二氧化硅表面衍生的最为普通的方法。该反应被认为包括Si-H表面的化学氧化以形成Si-OH中间体。该硅烷化反应被认为通过硅-氢基团的催化水解进行，接着用烷基硅烷提取表面-OH。用于将官能团引入到颗粒表面上以与抗体、小分子、生长因子、镧系元素和量子点进行共价连接的硅烷化试剂包括DETA(三甲氧基甲硅烷基丙基二亚乙基三胺)、MPTMS(巯基丙基三甲氧基硅烷)和APTES(氨基丙基三乙氧基硅烷)。对于包覆葡聚糖的材料不要求这种处理。
对于通过施托贝合成方法(
Figure A20078003717100231
systhetic process)所制得的材料(W.Stober等人，J.Colloid Interf.Sci.26，62(1968))，如果刚完成所述合成，则可以不需要对二氧化硅表面进行氧化预处理。对于多孔的二氧化硅，在氧化预处理过程中，较弱的硅-硅键也是活性的，这导致在表面上形成过氧化层。解决这种问题的最简单方法是使所述表面直接硅烷化，而不需要用氧化剂进行预处理。尽管如此，多孔材料中的Si-Si键仍然易于氧化断裂。
除硅烷化试剂之外，也需要一些同基双功能交联剂或异基双功能交联剂以连接配体和所述颗粒。用于这种的异基双功能试剂包括SMCC(琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)、SAED(硫代琥珀酰亚胺2-[7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺基]乙基-1，3′二硫代丙酸酯)和SATA(N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯)。此外，可以使用各种聚乙二醇衍生物，包括PEG-顺丁烯二酰亚胺、PEG-NHS、PEG-二甲基丙烯酸酯、异基双功能PEG和不连续的PEG(含有2、4或6个PEG单元)。
对于包覆葡聚糖的材料，可以使用肼/羰基反应，这生成稳定的腙键。在过去，利用腙键的偶合剂已经难以使用，并且不易简单合成。近来，化学试剂琥珀酰亚胺4-肼基烟酸酯丙酮腙(SANH)已经可以从苏罗林科有限公司(Solulink Inc，SanDiego，CA)市售获得，它可以提供连接配体的简单方式。在肼之后的化学过程是基于2-肼基吡啶基部分与苯甲醛的反应以生产稳定的双芳香腙。
在这个过程中，用SANH改性抗生蛋白链菌素或IgG，并且将抗生蛋白链菌素或IgG与醛改性的颗粒混合以生成介于腙中间的共轭结合物。在反应中剩余部分是水，不需要还原剂来稳定腙。对该反应进行酸催化，然而直至pH值最高达到8.0才发生反应。在与SANH反应之后，抗体或抗生蛋白链菌素仍然保持它们主要的连接活性。
表格1概括了与抗生蛋白链菌素偶合的磁性颗粒的蛋白质分析。通常，每mL颗粒(约1-5％固体物)偶合2-5μg的抗生蛋白链菌素，总的偶合率为40-60％。由在溶胶-凝胶合成过程中直接添加抗生蛋白链菌素(5mg)获得最高的抗生蛋白链菌素偶合率。在合成过程中添加PEG-600(2％v/v)以稳定蛋白质活性。
表1.用抗生蛋白链菌素偶合的磁性颗粒的功能测试
包壳 改性剂 偶合剂   抗生蛋白链菌素   FITC-生物素(荧光键合/mL)   HABA连接(皮摩尔/mg的Fe/mL)
  葡聚糖   无   无   ＜0.01μg/mL   0   0.10
  偏高碘酸钠偏高碘酸钠   NaBH4 *SANH1   5.5μg/mL1.8μg/mL   10×10521×105   100120
二氧化硅   无APTS2MPTMS3   无SMCCSMCC   ＜0.1μg/mL3.0μg/mL5.0μg/mL   010×10535×105   0.995140
1琥珀酰亚胺6-肼基烟碱丙酮腙
2(3-氨基丙基)三乙氧基甲硅烷；
3(3-巯基丙基)-三乙氧基甲硅烷
*使用0.5mg/mL抗生蛋白链菌素的一个实验。
实施例6：生物分离应用。
在通过四极磁性分选(QMS)从粗短刺状血沉棕黄层分离出癌细胞之前，通过细胞跟踪测速仪(CTV)方法分析被标记细胞的迁移率测量，以确定QMS系统的操作参数。血沉棕黄层从俄亥俄州哥伦布美国红十字会分社购得。通过密度梯度离心分离获得单核细胞(MNC)，并且快速用标记的缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，0.05％人血清白蛋白，2mM的EDTA)清洗。通过胰蛋白酶消化；来去除附着的卵巢癌细胞(四癌PA-1)，并且用含血清的标记缓冲液进行清洗以使胰蛋白酶失活。进行细胞计数，并且以1个肿瘤细胞/107个总MNC细胞的浓度将肿瘤细胞掺入到MNC中。在完成掺入之后，开始标记过程。每5×107个细胞再悬浮在200μL的体积中，并且向再悬浮的细胞中添加100μL的抗-CD45生物素化的抗体。使用抗-CD45抗体标记所有的MNC以从细胞悬浮液中去除它们，留有未标记的肿瘤细胞，因此肿瘤细胞是没有损失的。细胞悬浮液与第一抗-CD45抗体在4℃下保温15分钟，一旦保温时间结束，添加2×染色体积的标记缓冲液。以1500rpms离心分离6分钟，并且以200μL/5×107个细胞的浓度再悬浮细胞颗粒。向再悬浮的颗粒中添加200μL的与三组分颗粒连接的抗生蛋白链菌素。细胞和颗粒在4℃下保温15分钟。在保温时间结束后，通过添加2×染色体积标记缓冲液进行清洗步骤，并且以1500rpm的速率离心分离6分钟，来去除细胞和过量的颗粒。然后细胞颗粒在4mL的体积中被再悬浮，取出500μL等份以分析标记的细胞，获得平均的磁泳迁移率，这控制QMS分离可以进行的快或慢。图2显示出用CNW颗粒标记的CD45+MNC和用美天旎MACS珠(Miltenyi MACS bead)标记的CD45+MNC的磁泳迁移率。与用美天旎MACS珠颗粒标记的相反，当用在此制得的颗粒标记时细胞移动更快。
在由CTV分析获得的平均迁移率之后，剩余的细胞在QMS系统中进行分离。细胞被引入到供料注射器中，并且QMS以沉积方式运行，使得在液流中获得无磁性细胞或未标记的细胞，而在QMS系统的沟道壁上收集磁性细胞或被标记的细胞。在分离之后进行细胞计数，并且通过锥虫蓝拒染法测定生命力。当浓度太低以致不能通过流动血细胞计数器进行精确统计分析时，生成细胞尖硬纤维(Cytospins)用于检测和定量分析肿瘤细胞。
平均的回收率非常好。肿瘤细胞掺入的量允许获得1个肿瘤细胞/107全部细胞。被污染细胞的消耗的对数值3.21高于先前已经公开的数值(P.deCremoux等人，Clin Cancer Res 6(8)，3117(2000))，同样地，肿瘤细胞的74％平均回收率远超过使用常规商用试剂QMS富集获得的典型50％平均回收率。
实施例7：用聚乙烯亚胺(PEI)葡聚糖对包覆碳的铁颗粒进行包覆
向5mL的二甲亚砜(DMSO)中添加约150mg的共轭精胺的葡聚糖，将该混合物在65℃下保温20分钟以溶解葡聚糖。然后以4,500rpm的速率离心分离20分钟，随后过滤透明上层清液。然后过滤的葡聚糖放置于65℃下且以100W操作的水浴超声波仪中。添加约150mg的包覆碳的铁(铁芯核尺寸为5-55nm，具有20nm的碳包覆层)，通常通过在葡聚糖溶液的表面上喷洒粉末来添加。允许将该混合物在65℃下保温且同时超声处理18-24小时。向反应中添加约5体积的0.5M的NaCl，并且使用密理博培肯XL型(Millipore Pellicon XL)盒式切向流动过滤装置混合物渗滤整夜。然后滤液以4500rpm离心分离20分钟，随后通过装配有500kDa MW截止聚醚砜过滤器的搅拌单元对透明上层清液进行压滤(N2)。
以这种方式制备的材料在HEPES缓冲盐水以及磷酸盐缓冲盐水中是可分散的。该材料在悬浮液中保持几个星期，并且具有100-1000nm的直径。看来似乎该材料由多个包裹一层或多层PEI-葡聚糖的铁芯核构成。
应理解的是，以上公开的内容及其它特征与功能或其可替换的实施方式中的几种可以组合成许多其它的不同系统或应用。还应理解的是，由本领域技术人员可作出各种目前料想不到或无法预测的替换方式、改变、变化或改进，也包括在如下权利要求的范围内。

Claims (25)

1.一种颗粒，包括：
至少一个具有疏水性保护层的磁芯颗粒；和
包覆层，其中所述包覆层包括至少一个疏水部和至少一个亲水部，选择所述疏水部以与所述疏水性保护层的至少一部分自缔合，选择所述亲水部以促进所述颗粒在含水体系中的分散。
2.如权利要求1所述的颗粒，其中，选择所述疏水性保护层以防止所述至少一个磁芯颗粒氧化。
3.如权利要求1所述的颗粒，包括具有与所述包覆层紧接的疏水性保护层的单个磁芯颗粒。
4.如权利要求1所述的颗粒，其中：
所述颗粒包括多个磁芯颗粒；
所述多个磁芯颗粒中的每个磁芯颗粒具有疏水性保护层；并且
所述包覆层与具有疏水性保护层的所述多个磁芯颗粒中的一个以上颗粒紧接。
5.如权利要求1所述的颗粒，其中，所述至少一个磁芯颗粒具有约5nm-约2μm的尺寸。
6.如权利要求1所述的颗粒，其中，所述至少一个磁芯颗粒具有约20nm-约300nm的尺寸。
7.如权利要求1所述的颗粒，其中，所述颗粒具有约20nm-约4.5μm的尺寸。
8.如权利要求1所述的颗粒，其中，所述颗粒具有约200nm-约400nm的尺寸。
9.如权利要求1所述的颗粒，还包括与所述亲水部连接的配体。
10.如权利要求1所述的颗粒，其中，所述磁芯选自铁氧体、金属、金属合金、铁氧化物、二氧化铬以及它们的组合。
11.如权利要求1所述的颗粒，其中，所述疏水性保护层包括饱和或不饱和的、共轭或非共轭的、被取代或未被取代的有机酸或者具有约10-约22个碳原子的一元羧酸。
12.如权利要求11所述的颗粒，其中，所述疏水性保护层包括至少一种脂肪酸，所述脂肪酸选自由己酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十四烷酸、亚麻酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、异硬脂酸、花生酸、二十二烷酸、油酸、和亚油酸。
13.如权利要求1所述的颗粒，其中，所述至少一个疏水部包括饱和或不饱和的、共轭或非共轭的、被取代或未被取代的有机酸或具有约10-约22个碳原子的一元羧酸。
14.如权利要求1所述的颗粒，其中，所述包覆层的至少一个亲水部选自多糖、可生物降解的聚合物、聚烯烃以及它们的组合。
15.如权利要求14所述的颗粒，其中，所述疏水性保护层包括至少一种脂肪酸，并且所述包覆层的所述疏水部包括至少一种脂肪酸。
16.如权利要求1所述的颗粒，其中，所述包覆层的所述至少一个亲水部包括至少一种葡聚糖。
17.如权利要求1所述的颗粒，其中，所述包覆层包括具有至少一个饱和或不饱和的、被取代或未被取代的、共轭或非共轭的脂肪族基团的烷基硅烷。
18.一种颗粒，包括：
至少一个具有碳保护层的磁芯颗粒；和
包覆层，其中所述包覆层包括至少一个胺部和至少一个亲水部，选择所述胺部以与所述碳保护层的至少一部分自缔合，选择所述亲水部以促进所述颗粒在含水体系中的分散。
19.用于制备颗粒的方法，包括：
在第一溶剂中悬浮至少一个具有疏水性保护层的磁芯颗粒；
在第二有机溶剂中溶解包括疏水部和亲水部的包覆层前体；以及
将第一溶剂中的所述至少一个具有疏水性保护层的磁芯颗粒添加到第二溶剂中的所述包覆层前体中，使得形成至少一个具有疏水性保护层和包覆层的颗粒，其中所述包覆层前体的疏水部与所述疏水性保护层自缔合。
20.如权利要求19所述的方法，还包括在添加所述至少一个磁芯颗粒的步骤之后去除所述第一溶剂和所述第二溶剂的步骤。
21.如权利要求19所述的方法，其中，去除所述第一溶剂和所述第二溶剂的所述步骤包括将溶液加热至足够的温度，以去除所述第一溶剂和所述第二溶剂中的至少一种溶剂的至少一部分。
22.如权利要求19所述的方法，还包括通过渗析、柱色谱法、渗滤以及搅拌单元装置中的压滤中的至少一种或者它们的组合来去除所述第一溶剂和所述第二溶剂中的高沸点残余物的步骤。
23.如权利要求19所述的制备颗粒的方法，其中，所述第一溶剂选自氯仿、甲醇、己烷以及它们的组合。
24.如权利要求19所述的制备颗粒的方法，其中，所述第二溶剂选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮的混合物、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃聚乙二醇醚、丙二醇、乙腈、油酸乙酯以及它们的组合。
25.用于制备颗粒的方法，包括：
在有机溶剂中溶解包括胺部和亲水部的包覆层前体；
将至少一个具有碳保护层的磁芯颗粒添加到所述溶剂中的包覆层前体中，使得形成至少一个具有碳保护层和包覆层的颗粒，其中，所述包覆层前体的胺部与所述碳保护层自缔合。
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