JP2013535991A - 生物医学向けにチューニングされた多機能性磁性ナノ粒子 - Google Patents

Abstract

磁性ナノ粒子並びに関連するデバイス及び方法を記載する。組成物及び方法は、診断及び地様における使用のための狭いサイズ分布を有する磁性ナノ粒子を含み得る。更に別の実施形態において、本発明は、磁性粒子の撮像のために、チューニングされたサイズ分布を備える磁性ナノ粒子の製造方法を提供する。該方法は、磁性粒子の撮像において使用される周波数で、最大信号及び／又は最大空間分解能を生成する磁性ナノ粒子の直径を選択することを含み得る。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年６月２１日に出願された、「生物医学のためにチューニングされた多機能性磁性ナノ粒子」という表題の、米国特許仮出願番号第６１／３５６，８９２号明細書、及び、２０１１年２月１１日に出願された、「サイズを最適化した磁性ナノ粒子」という表題の、米国特許仮出願番号第６１／４４１，９３３号明細書の優先権の利益を主張し、参照によって、それらの全体が、本明細書中に組み込まれる。

連邦政府支援の研究又は開発の元で行われた発明についての権利に関する声明
本発明は、国立科学財団によって授与された助成番号０２０３０６９号及び０５０１４２１号、及び、国立衛生研究所によって授与された助成番号Ｒ２１ＥＢ００８１９２の下で、政府の支援を用いて成された。

発明の背景
本発明は、磁性ナノ粒子及び関連するデバイス並びに方法に関する。より具体的には、本発明は、診断及び治療における使用のための狭いサイズ分布を有する磁性ナノ粒子を作成するための、組成物及び方法に関する。

磁性ナノ粒子（ＭＮＰとも呼ばれる）は、強い固有磁気のため、生物医学について誘引性の剤であり、その強い固有磁気は、磁場との相互作用を介して、生体の奥深くからの、検出又は影響を可能にする。当然のことながら、磁性ナノ粒子は、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）に基づく分子撮像用途における潜在的な造影剤又はナノ粒子材料としてのみならず、磁気的に援助された薬剤の送達及び温熱療法のためのキャリアとしても、広く研究されている。近年、磁気粒子撮像と呼ばれる、新しい画像診断法が、ヒト及び動物における磁性ナノ粒子を可視化するための技法として紹介された。ＭＲＩが行うようなプロトン緩和への間接的な影響というよりもむしろ、ＭＰＩは、大型のナノ粒子のモーメントについて直接的に調べるため、ＭＰＩは、高速、定量的、機密、且つ、機能良好な空間分解能であり、それらは、磁性ナノ粒子のＭＲＩにおいて実現が困難な組み合わせである。注目すべき細菌ンのＭＰＩ研究は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、鼓動するマウスの心臓を通過する磁性ナノ粒子のリアルタイム撮像及び、最初に費用がかかり、且つ、閉所恐怖症を引き起こす磁気装置にそれらを挿入することなく患者を撮像することができる潜在的に小型の、片面スキャナを含む。

ＭＰＩスキャナ設計及び関連する画像処理における多くの刺激的な進歩にも関わらず、比較的少ない努力が、撮像感度を最適化する磁性ナノ粒子の開発に費やされてきた。実際、ＭＰＩが正常に、診療所又は臨床前研究室に、原理証明実験を超えて移動するために、ＭＰＩ用に最適化された磁性ナノ粒子を設計することが重要になるであろう。最近の研究は、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｈａｒｍａ，Ｂｅｒｌｉｎ）及びＦｅｒｉｄｅｘ Ｉ．Ｖ．（登録商標）（ＡＭＡＧ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ；ヨーロッパでの名称；Ｅｎｄｏｒｅｍ（商標））を含む、商業的に利用可能な磁性ナノ粒子を使用しており、これらは、ＭＰＩのために磁気的に最適化された状態とは程遠く、従って、ＭＰＩが空間分解能及び質量感度の両面において、その可能性を最大化することを阻害する。例えば、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（登録商標）において、これは現在までＭＰＩの研究において最も一般的な材料であるが、総試料の質量のわずか３％のみが、ＭＰＩ信号に著しく起用していることが示されている。より効率的なナノ粒子が、最高感度のために、能動的ターゲティングに依存する分子イメージング・アプリケーションに望まれており、ナノ粒子の各ユニットは、最大達成可能なＭＰＩの信号電圧を生成することが望まれている。更に、定量的な撮像、信号強度、及び、従って磁性ナノ粒子の特性のために必要なのは、均一性及び再現性である。

更に、磁性ナノ粒子は、離れた状態で、外部磁場勾配又は他の能動的及び受動的ターゲティング法の適用対象とすることができるため、部位特的ながん治療のための魅力的な選択肢である。一旦局在化されると、磁性ナノ粒子における得られる緩和の損失から熱を放散するために、交流磁場（ＡＭＦ）を利用する治療法である磁性流体温熱療法（ＭＦＨ）は、局部加熱を誘発させるために使用することができる。がん細胞の加熱（典型的には、４２〜４３℃まで）は、より効率的な従来の確立された方法により、術後補助療法を行う細胞の代謝を妨害することが知られている。広範囲の強磁性ナノ粒子は、ＭＦＨのために合成することができる。それらの適度な磁気特性のために、しかしながら、磁性ナノ粒子は、ＭＦＨにおける効果的な適用のために、それらの形態面（サイズ、サイズ分布、形状）、結晶構造（相純度）、及び磁性（緩和）特性において、最適化される必要がある。

残念なことに、磁性ナノ粒子を製造する現在の方法は、磁性ナノ粒子を使用して、既存の診断及び／又は治療の技術を工場させることができる、形態学上（サイズ、サイズ分布、形状）、結晶構造（相純度）、及び磁性（緩和）特性において、十分な制御を提供していない。

発明の概要
本発明は、磁性ナノ粒子、関連するデバイス及び方法に関する。より具体的には、本発明は、診断及び治療における使用のために、狭いサイズ分布を有する磁性ナノ粒子を製造するための組成物及び方法に関する。

一態様において、本発明は、狭いサイズ分布を有する磁性ナノ粒子の個体群を具備する、磁性ナノ粒子の組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、狭いサイズ分布を有する磁性ナノ粒子の個体群を具備する、磁性ナノ粒子の個体群を提供し、該個体群における約７０％以上の磁性ナノ粒子が、中位径から１．５ナノメートル（ｎｍ）未満の直径を有している。

別の態様において、本発明は、狭いサイズ分布を有する磁性ナノ粒子の組成物の製造方法を提供する。該方法は、有機溶媒中で、鉄前駆体及び界面活性剤を組み合わせることを含む。いくつかの実施形態において、鉄前駆体に対する界面活性剤の比率は、１０：１以上である。該方法は、更に、第一の磁性ナノ粒子の個体群を形成するために、有機溶媒中で鉄前駆体及び界面活性剤を加熱すること、及び、第二の磁性ナノ粒子の個体群を形成するために、第一の磁性ナノ粒子の個体群と両親媒性のポリマー又は分子とを組み合わせることを含む。第二の個体群の磁性ナノ粒子は、両親媒性のポリマーを含むことができ、狭いサイズ分布を有し、水溶液中に分散することができる。

更に別の態様において、本発明は、磁性ナノ粒子を撮像する方法を提供する。該方法は、被験者へ磁性ナノ粒子の個体群を投与することを含み、該磁性ナノ粒子の個体群は、狭いサイズ分布を有し、且つ、撮像システムを備える磁性ナノ粒子の個体群において、少なくとも一つの磁性ナノ粒子を刺激する。

更に別の態様において、本発明は、磁気温熱を実施する方法を提供する。該方法は、被験者へ磁性ナノ粒子の個体群を投与することを含み、該磁性ナノ粒子は、狭いサイズ分布を有し、且つ、該磁性ナノ粒子の個体群において、少なくとも一つの磁性ナノ粒子の近傍の細胞を加熱する。

更に別の実施形態において、本発明は、磁性粒子の撮像のために、チューニングされたサイズ分布を備える磁性ナノ粒子の製造方法を提供する。該方法は、磁性粒子の撮像において使用される周波数で、最大信号及び／又は最大空間分解能を生成する磁性ナノ粒子の直径を選択することを含み得る。該方法は、更に、最大信号及び／又は最大空間分解脳を生成する磁性ナノ粒子の、おおよその選択された半径の中位径を有する磁性ナノ粒子の個体群を生成することを含み得、該磁性ナノ粒子の個体群は、狭いサイズ分布を有する。

本発明の性質及び利点の、より完全な理解のために、添付の図面と合わせて、以下の詳細な説明を参照するべきである。図面は、例示によって本発明の実施形態を洗わせている。本発明は、本発明を逸脱することなく、様々な点で変更が可能である。従って、図面／図、及びこれらの実施形態の説明は、本質的に例示であり、限定的ではない。

図１は、本発明の実施形態による、磁性ナノ粒子の製造方法を示す。 図２は、本発明の実施形態による、撮像システムを示す。 図３は、本発明の実施形態による、ＭＰＩ信号試験結果を示す。記号は、ナノ粒子の試料を表す。エラーバーは、試料の直径分布の第一の標準偏差を描く。曲線は、式１１から一定の記載された異方性を有する粒子についての模擬データ及び、標準偏差０．１の対数正規分布である。 図４は、本発明の実施形態による、ＭＰＩ送受信コイルの概略図である。誘導的に送信を解除してから、チャンネルを受信するために、中央の受信コイルは、隣り合う二つのコイルと逆方向に巻かれている。 図５は、本発明の実施形態による、ＭＰＩ信号試験結果を示す。記号は、ＭＮＰ試料を表し、エラーバーは、試料の直径分布の第一の標準偏差を描く。図５Ｂは、参考のための重複測定点（灰色）とともに、各実験試料についてシミュレートされたデータを示す。 図６Ａ〜６Ｃは、本発明の実施形態による、（Ａ）異なる異方性定数Ｋ、（Ｂ）異なる直径の分布幅（σ）、及び（Ｃ）異なるフィールド駆動振幅を示す。 図７Ａ〜７Ｃは、本発明の実施形態による（Ａ）直径〜１６ｎｍのマグネタイトナノ粒子のＴＥＭ画像、（Ｂ）粒径の範囲についての磁化曲線、（Ｃ）１２ｎｍＭＮＰについての相間移動の前後、及び、相間移動後５ヶ月の磁化曲線を示す。 図８Ａ〜８Ｃは、本発明の実施形態による、（Ａ）ＭＮＰ直径の範囲のＳＬＰ、（Ｂ）水及びＤＭＥＭ内で測定する場合の、ＰＭＡＯ−ＰＥＧでコーティングしたＭＮＰの加熱容量、及び、（Ｃ）ＰＭＡＯ−ＰＥＧでコーティングしたＭＮＰのＤＫＳ測定値を示す。 図９は、本発明の実施形態による、マグナタイトナノ粒子の、θ〜２θスキャンの、粉末Ｘ線解析を示す。凡例で示されたサイズは、Ｓｃｈｅｒｒｅｒ’ｓ式により、２θ＝３５．４°におけるピークを使用して決定した。マグネタイト基準（ボトム）は、解析データのための国際センターから入手した（ＰＤＦ＃０１９−０６２９）。 図１０は、本発明の実施形態による、（Ａ）相移動の後に水相が好ましい（右）一方、相移送の前（左）はより密度が高いクロロホルム相中に選択的に分散したＭＮＰ、（Ｂ）ｐＨの関数としても、ＭＮＰ＠ＰＭＡＯ−ＰＥＧのゼータ電位、及び（Ｃ）時間の関数としての、ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ ＦＢＳ細胞培養培地における、ＭＮＰ＠ＰＭＡＯ−ＰＥＧの流体力学的サイズの測定値を示す。 図１１は、ＪｕｒｋａｔｓにおけるＭＮＰ＠ＰＭＡＯ−ＰＥＧのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞毒性を提供する。生存率は、ルシフェラーゼアッセイによって測定し、毒性は、ＬＤＨアッセイによって測定した。ＭＮＰは、本発明の実施形態によって、生理的条件（３７℃及び５％Ｃｏ_２）において２４時間インキュベートした。 図１２は、本発明の実施形態による、ＭＮＰ＠ＰＭＡＯ−ＰＥＧを２４時間インキュベートした後の、Ｊｕｒｋａｔ細胞の明視野画像を示す。 図１３は、本発明の実施形態による、サイズ及びサイズ分布（周波数（ｆ）＝３７３ｋＨｚ及びＨ０＝１４ｋＡ／ｍ）の関数としての特定の損失電力（Ｗ／ｇ Ｆｅ_３Ｏ_４）を示す。 図１４は、本発明の実施形態による、直径が（Ａ）１２ｎｍ、（Ｂ）１３ｎｍ、（Ｃ）１６ｎｍのＭＮＰを使用する（ＡＭＦは１５分間増幅した）、Ｊｕｒｋａｔｓのｉｎ ｖｉｔｒｏ加熱を示す。 図１５は、本発明の実施形態による、ＡＣ ＯＦＦ_ａｖｇ．−ＡＣ ＯＮ_ａｖｇとして計算した対照と比較した細胞生存率を示す。

発明の詳細な説明

本発明は、磁性ナノ粒子、関連デバイス、及び方法に関する。より具体的には、本発明は、診断及び治療に使用するための、狭いサイズ分布を有する磁性ナノ粒子の製造方法に関する。

１．狭いサイズ分布を有する磁性ナノ粒子
本発明は、診断及び／又は診療の目的など、いくつかの異なる用途のために設計することができる、多種多様な磁性ナノ粒子を提供する。例えば、本発明の磁性ナノ粒子は、酸化された形態の鉄などの、磁性材料からなる磁性粒子を含み得る。いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子は、酸化鉄で構成することができる。磁性ナノ粒子は、例えば、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）及び／又はマグヘマイト（Ｆｅ_２Ｏ_３）粒子を含み得る。特定の実施形態において、磁性ナノ粒子は、単一の、無欠陥結晶であるマグネタイトコアを有している。ナノ粒子は、例えば、スピネル相などの様々な相を有し得る。以下に更に記載するように、磁性ナノ粒子は、また、両親媒性分子でコーティングされた、磁気コア（例えば、マグネタイトコア）を有し得る。

一態様において、本発明は、他のこれまでに報告された磁性粒子よりも驚く程狭いサイズ分布を有する磁性ナノ粒子の個体群の製造に少なくとも部分的に基づく。狭いサイズ分布を有する磁性ナノ粒子の個体群は、既存の磁性粒子以上に幅広い利点を提供する。例えば、非常に小さいサイズのばらつきは、所望の磁気特性を指数関数的に改善するか、又は、低下させる可能性がある。狭いサイズ分布を備える磁性ナノ粒子の生成は、撮像を改善するために、最大信号及び／又は最大解像度を生成するサイズの選択及び製造によって、磁気撮像様式（ＭＰＩ又はＭＲＩなど）に影響を与えることができる。あるいは、局所的な組織の加熱は、例えばがん細胞などの近くに配置された狭いサイズの磁性ナノ粒子を励起させることによって最適化することが可能であり、それによって、磁気低体温症の適用における選択肢を改善する。これれは、磁性ナノ粒子の狭いサイズ分布によって提供される、改良された機能のほんの一部である。当業者は、本開示に照らして、追加の利点を理解するであろう。

従って、一実施形態において、本発明は、狭いサイズ分布を有する磁性ナノ粒子の個体群を提供する。本明細書に記載するように、「狭いサイズ分布」は、磁性ナノ粒子の個体群の中位径から特定の指定された範囲内であるサイズ（例えば、直径）を有する、磁性ナノ粒子の分布を意味することを意図する。磁性ナノ粒子のサイズ分布は、様々な方法によって決定することができ、分布の特性は、磁性ナノ粒子のサイズを決定するために使用される方法に依存し得る。磁性ナノ粒子のサイズ（例えば、直径）を分析する方法は、磁気測定技術、光学技術（例えば、光子相関分光法又は動的光分散）および撮像技術（例えば、透過型電子顕微鏡）などを含むが、それらに限定されない。

磁性ナノ粒子の個体群のサイズ分布は、様々な形態で表すことができる。例えば、サイズ分布は、対数正規分布、正規分布、二峰性分布などに従うことができる。様々な高知の技術は、磁性ナノ粒子の個体群のサイズ分布に適合するために使用することができる。更に、適合の質は、例えば、カイ二乗検定、又は、コルモゴルフ−スミルノフ検定などの、適合試験の標準的な良さによって決定され得る。

いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子の個体群のサイズ（例えば、直径）は、対数正規分布によって特徴付けられ得る。特定の実施形態において、磁性ナノ粒子の直径分布ｇ（ｄ）は、以下の式（１）に示すように、対数正規分布で近似することができ、
式中、ｅｘｐ（σ）は、分布の幾何標準偏差であり、ｄ_０は、中位径である。対数正規分布では、標準偏差は加法ではなく、乗法的である。シグマ（σ）は、ｌｏｇ（ｄ）の標準偏差として説明することができ、式中、ｄは直径であり、ｌｏｇ（ｄ）は、正規分布（すなわち、ガウス分布によって定義される）。磁性ナノ粒子の個体群について直径の範囲を決定するために、分布についての標準偏差を考慮することができる。例えば、シグマが０．３である場合、ｅｘｐ（σ）は１．３５（単位なし）であり、ここで、分布にける６８．３％の直径が、ｄ_０＊ｅｘｐ（σ）およびｄ_０／ｅｘｐ（σ）（単位なし）の間に存在すると解釈することができる。いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子の個体群は、体積加重（例えば、正規対数）分布関数（例えば、磁気測定技術または動的光散乱法によって測定される）に従う、サイズ（例えば、直径）分布を有するであろう。特定の実施形態において、磁性ナノ粒子の個体群は、個数加重（例えば、正規対数）分布関数（例えば、透過型電子顕微鏡によって測定される）に従う、サイズ（例えば、直径）分布を有するであろう。対数正規分布の適合の質は、例えば、カイ二乗検定などの、標準的な適合の良さによって識別することができる。

特定の実施形態において、対数正規分布によって説明される磁性ナノ粒子の個体群は、中位径及び標準偏差（σ）又は、代替的に、ｅｘｐ（σ）を有するとして説明することができ、これは、分布（又は、乗法標準偏差）の幾何標準偏差である。中位径及び直径分布は、例えば、Ｒ．Ｃｈａｎｔｒｅｌｌらによる、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｍｇｎｍ Ｍｇ，１４：９７５−９７７（１９７８）に記載の、Ｃｈａｎｔｒｅｌｌ法を使用して、決定することができる。本発明の磁性ナノ粒子の個体群の中位径は、例えば、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約２５ｎｍ、約１０ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１５ｎｍ〜約２５ｎｍ、及び、約１５ｎｍ〜約２０ｎｍなどの、範囲であり得る。本発明の磁性ナノ粒子の個体群についての乗法標準偏差（即ち、ｅｘｐ（σ））は、それぞれ、例えば、約０．３未満、約０．２未満、又は、約０．１未満などであり得る。特定の実施形態において、標準偏差（例えば、シグマ）は、磁性ナノ粒子の中位径が小さくなるに連れて減少するであろう。

磁性ナノ粒子の個体群のサイズ分布は、また、個体群の中位径からの距離値によって表すことができる。例えば、磁性ナノ粒子のパーセンテージは、母集団の中位径から、ナノメートルの距離内に特徴付けることができる。例えば、磁性ナノ粒子の狭い分布は、個体群における約７０％以上の磁性ナノ粒子が、中位径から１０．５ｎｍ未満の直径を有する（例えば、体積加重対数正規分布関数によって測定した）分布を含み得る。いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子の狭い分布は、個体群における約７０％以上の磁性ナノ粒子が、体積加重対数正規分布関数によって測定したものとして、中位径から８．８ｎｍ未満の直径を有する分布を含み得る。いくつかの実施形態において、個体群中の、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約９９％以上の磁性ナノ粒子は、例えば、体積加重（例えば、対数正規）分布関数によって測定したものとして、中位径から約９ｎｍ、約８ｎｍ、約７ｎｍ、約６ｎｍ、約５ｎｍ、約４ｎｍ、約３ｎｍ、約２ｎｍ又は約１ｎｍ未満の直径を有し得る。いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子の狭いサイズ分布は、個体群中の約７０％以上の磁性ナノ粒子が、個数加重（例えば、対数正規）分布関数によって測定したものとして、中位径から３ｎｍ未満の直径を有する分布を含み得る。いくつかの実施形態において、個体群における、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約９９％の磁性ナノ粒子が、個数加重対数正規分布関数で測定したものとして、中位径から、約５ｎｍ、約４ｎｍ、約３ｎｍ、２．５ｎｍ、約２ｎｍ、約１．５ｎｍ、約１ｎｍ、約０．５ｎｍ未満の直径を有し得る。

上述のナノ粒子コアサイズの特徴付けに加えて、磁性ナノ粒子の個体群はまた、流体力学的特性によっても特徴付けることができる。例えば、磁性ナノ粒子の個体群は、平均の流体力学的直径を含み得、例えば、それは、溶液条件、及び／又は、磁性ナノ粒子の表面上の、両親媒性分子のコーティングに依存し得る。特定の実施形態において、本発明の、一群の磁性ナノ粒子は、水溶液中で、約２０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約８０ｎｍ、又は、約６０ｎｍ〜約７０ｎｍの範囲の平均の流体力学的直径を含み得る。

ＩＩ 磁性ナノ粒子の生成方法
本発明は、本明細書中に記載した磁性ナノ粒子の生成方法を含む。様々な技法が、例えば、所望の磁性ナノ粒子のサイズ及び／又は特性に依存して使用することができる。例えば、磁性ナノ粒子の生成方法は、特定の診断及び／治療への適用に最適なサイズ及び磁気特性を有する磁性ナノ粒子を生成するように調整することができる。

図１は、本発明の実施形態による、方法１００を示す。磁性ナノ粒子の生成方法は、鉄前駆体及び界面活性剤を有機溶媒中で組み合わせること（ステップ１０２）、鉄前駆体及び界面活性剤を、第一の磁性ナノ粒子個体群を形成するために加熱すること（ステップ１０４）、及び、第一の磁性ナノ粒子個体群と追加の両親媒性小分子とポリマーとを、第二の磁性ナノ粒子の個体群を形成するために組み合わせること（ステップ１０６）とを含み得る。

一例の実施形態において、本発明の方法は、鉄前駆体及び界面活性剤を、鉄前駆体溶液を形成するために、有機溶媒中で組み合わせることを含む、磁性ナノ粒子の個体群の生成方法を含む。鉄前駆体に対する界面活性剤の比は、例えば、１０：１以上であり得る。該方法は、鉄前駆体溶液を、第一の磁性ナノ粒子の個体群を形成するために加熱することと、第一の磁性ナノ粒子の個体群を、両親媒性ポリマーを含む第二の磁性ナノ粒子の個体群を形成するために、両親媒性ポリマーと組み合わせることとを、更に含む。第二の磁性ナノ粒子の個体群は、狭いサイズ分布（例えば、乗法標準偏差が、約１．３５未満）を有し得、水溶液中で分散性であり得る。

本明細書中に提供されるように、本発明の鉄前駆体溶液は、鉄前駆体を含み得る。様々な鉄前駆体材料が、磁性ナノ粒子を生成するために選択され得る。鉄前駆体は、還元又は酸化された（例えば、第一鉄又は第二鉄）の状態の鉄を含み得る。いくつかの実施形態において、鉄前駆体は、少なくとも一つの他の分子と複合体化した鉄イオン（例えば、Ｆｅ^３＋）を含む。例えば、鉄前駆体は、式：Ｆｅ^３＋（Ｒ^１）_３を有し得、式中、Ｒ^１は、磁性ナノ粒子の生成を促進する第二鉄イオンと錯体を形成し得る任意の化合物を含み得る。一実施形態において、鉄前駆体は、式：Ｆｅ^３＋（Ｒ^１）_３を有し、式中、Ｒ^１は置換若しくは非置換飽和Ｃ_１〜Ｃ_２４カルボン酸、又は、置換若しくは非置換不飽和Ｃ_１〜Ｃ_２４カルボン酸である。いくつかの実施形態において、鉄前駆体は、Ｆｅ^３＋オレイン酸塩又は、Ｆｅ^３＋ステアリン酸塩を含む。

磁性ナノ粒子の生成に使用される鉄前駆体溶液は、更に、界面活性剤を含み得る。界面活性剤は、例えば、安定化のために、鉄前駆体と組み合わせることができる。広い範囲の界面活性剤を使用することができる。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、置換若しくは非置換のＣ_１〜Ｃ_２４アルカン又は、置換若しくは非置換のＣ_１〜Ｃ_２４アルケンを含み得る。例えば、界面活性剤は、オレイルアミンを含み得る。特定の実施形態において、界面活性剤は、カルボン酸であり得る。カルボン酸は、置換若しくは非置換飽和Ｃ_１〜Ｃ_２４カルボン酸又は、置換若しくは非置換不飽和Ｃ_１〜Ｃ_２４カルボン酸であり得る。例えば、カルボン酸はオレイン酸であり得る。他の型の界面活性剤、例えば、アルキルホスフィンを使用することができる。アルキルホスフィン界面活性剤は、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）を含み得るがそれに限定されない。特定の実施形態において、鉄前駆体は、本明細書中に記載した界面活性剤の任意の組み合わせと組み合わせられ得る。

本明細書中に記載される置換された化合物の置換基（例えば、置換Ｃ_１〜Ｃ_２４アルカン又は置換Ｃ_１〜Ｃ_２４アルケン）は、０〜（２ｍ’＋１）の範囲の数で、−ＯＲ’，＝Ｏ，＝ＮＲ’，＝Ｎ−ＯＲ’，−ＮＲ’Ｒ”，−ＳＲ’，−ハロゲン，−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’，ＯＣ（Ｏ）Ｒ’，Ｃ（Ｏ）Ｒ’，−ＣＯ_２Ｒ’，−ＣＯＮＲ’Ｒ”，−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”，−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’，ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’，−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’，ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””，ＮＲＣ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’，−Ｓ（Ｏ）Ｒ’，−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’，−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ”，ＮＲＳＯ_２Ｒ’，ＣＮ及び−ＮＯ_２から選択された一つ以上の様々な群であり得るがそれらに限定されず、式中、ｍ’は、そのようなラジカル中の全炭素数である。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’はそれぞれ、好ましくは、独立的に、水素、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール（例えば、１〜３の水素で置換されたアリール）、置換若しくは非置換アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を示す。本明細書中に開示した化合物が一つ以上のＲ基を含む場合、これらの基のうちの一つ以上が存在しているとき、例えば、各Ｒ基は、それぞれＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基から独立的に選択される。Ｒ’及びＲ”が同じ窒素原子に結合している場合、それらは、４−、５−、６−又は７−員環を形成するために、窒素原子と結合し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むがそれらに限定されないことを意味する。上述の置換基の議論から、当業者は、用語「アルキル」が、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ_３及び−ＣＨ_２ＣＦ_３）及びアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＯＣＨ_３など）の、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むことを理解するであろう。

本明細書中に提供するように、本発明は、例えば、磁化特性及びそれらの使用などを促進し得る、狭いサイズ分布を備える磁性ナノ粒子を生成する際に、鉄前駆体に対する界面活性剤の比率は、驚く程の役割を果たし得るという発見に、部分的に基づく。例えば、界面活性剤：鉄前駆体の比が１：１〜４：１の低いモル比は、磁性ナノ粒子を生成するために使用されてきた。しかしながら、鉄前駆体に対して、大過剰料の界面活性剤が、磁性ナノ粒子を生成するために使用できることを発見した。特に、高い比率は、核生成と粒子成長を阻害することが予想されていた。驚くべきことに、鉄前駆体に対する界面活性剤の高いモル比は、以前には実現されていない狭いサイズ分布を有する磁性ナノ粒子の個体群を作るために使用することができる。鉄前駆体に対する界面活性剤のモル比は、例えば、５：１より大きい、１０：１より大きい、１５：１より大きい、２０：１より大きい、及び、２５：１より大きいなどの範囲になり得る。いくつかの実施形態において、鉄前駆体に対する界面活性剤のモル比は、約５：１〜約４０：１、約１０：１〜約４０：１、約１０：１〜約３０：１、及び、約１０：１〜約２０：１の範囲になり得る。特定の実施形態において、鉄前駆体に対する界面活性剤のモル比は、約５：１、約１０：１、約１５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１又は約４０：１である。

有機溶媒もまた、鉄前駆体溶液中及び本明細書に記載した方法の他のステップ中に含まれ得る。有機溶媒は、例えば、鉄前駆体に対する界面活性剤のモル比の調整を容易にする量で使用することができる。有機溶媒は、非極性溶媒を含む。有機溶媒の選択は、特定の条件下で、使用される界面活性剤及び／又は鉄前駆体に依存する。いくつかの実施形態において、有機溶媒は、置換若しくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_２４アルカン又は置換若しくは非置換Ｃ１〜Ｃ２４アルケンを含む。特定の実施形態において、有機溶媒は、オクタデセンを含む。いくつかの実施形態において、有機溶媒は、オレイルアミンを含み得る。

鉄前駆体に対する界面活性剤の高い比率で、核生成及び粒子成長を可能にするために、特定のステップが、磁性ナノ粒子を生成する方法の間に取られ得る。例えば、鉄前駆体及び界面活性剤を含む溶液は、例えば、約２４時間以上の長時間、所定の温度及び／又は圧力下で加熱され得る。特定の実施形態において、鉄前駆体に対する界面活性剤のモル比によって、磁性ナノ粒子の核生成を、鉄前駆体溶液が１〜４時間の間、還流される（例えば、加熱される）まで、遅延させることができる。特定の実施形態において、比率が高いほど、核生成が開始されるまでの時間がより長くなる。更に、核生成後の磁性ナノ粒子の成長は、鉄前駆体に対する界面活性剤の低いモル比（例えば、１：１）を含むプロセスよりも、長くすることができる。使用される、鉄前駆体に対する界面活性剤の高い比率によって、本明細書中に記載される磁性ナノ粒子の生成方法は、約２０時間よりも長い、約２２時間よりも長い、約２４時間よりも長い、及び／又は約２６時間よりも長い加熱プロセスを含み得る。

いかなる特定の理論にも拘束されず、より長い加熱期間中、界面活性剤の分解によって、本発明の鉄前駆体濃度と一致して徐々に超飽和状態に達すると考えられている。例えば、鉄前駆体としてＦｅ^３＋オレイン酸塩を含む方法について、界面活性剤オレイン酸は、２５０℃以上の温度で、鉄原子から解離し始めることができる。例えば、３２０℃の温度での加熱は、オレイン酸が徐々に分解を引き起こす可能性があり、それによって、核生成したあとに、成長を引き起こすことを可能にする。例えば、２４時間よりも長いなどの、長い成長期間は、酸性の界面活性剤（例えば、オレイン酸）が部分的に成長過程で表面の粒子を溶解するメカニズムが原因である可能性があり、従って、継続的な成長と競合して、成長時間を延長する。

特定の実施形態において、本明細書中に記載の鉄前駆体溶液の加熱は、様々な異なる加熱段階を含み得る。いくつかの実施形態において、鉄前駆体溶液の加熱は、傾斜温度加熱段階及び安定温度加熱段階を含み得る。これらの段階の順序と期間は、使用される特定の鉄前駆体、界面活性剤及び／又は有機溶媒に依存し得る。例えば、鉄前駆体溶液の加熱は、傾斜温度加熱段階のあとに、安定温度段階を含み得、逆もまた同様である。傾斜加熱段階の間の温度上昇率は、約１℃／分、約２℃／分、約３℃／分、約５℃／分、約１０℃／分、約２０℃／分、約３０℃／分、又は約４０℃／分であり得る。オレイン酸を使用する一例の実施形態において、加熱は、鉄前駆体溶液を、約３０℃／分の率で３２０℃まで加熱する、傾斜加熱段階を含み得る。３２０℃に到達すると、溶液は、次に、約２４時間又は、磁性ナノ粒子の生成を可能にする任意の他の指定時間（例えば、２０時間よりも長い）よりも長い安定加熱段階の間、安定温度で維持され得る。特定の実施形態において、前駆体溶液の加熱は、更に、例えば、アルゴン及び／又は窒素雰囲気下で、溶液をパージすることを含み得る。

本明細書中に提供された磁性ナノ粒子の表面特定は、また、非極性及び／又は極性溶媒中の溶解性に影響を与えるように変更され得る。特定の実施形態において、磁性ナノ粒子は、磁性ナノ粒子の表面が、非極性有機溶媒中で可溶である表面から、例えば水溶液などの極性溶媒中で可溶な表面へ変換される、相間移動を受けることができる。例えば、磁性ナノ粒子の生成方法は、水溶液中で可溶ではない（例えば、難溶性）磁性ナノ粒子の個体群の形成を含み得る。磁性ナノ粒子の第一の個体群は、例えば、磁性ナノ粒子の表面を変更させる両親媒性ポリマーなどの、両親媒性分子と組み合わせることができ、それによって、それらを水溶液中で分散性にすることができる。両親媒性分子又はポリマーは、例えば、磁性ナノ粒子の表面と共有結合及び／又は非共有結合性相互作用によって、磁性ナノ粒子と結合することができる。更に、驚くべきことに、相移動プロセスは、実際に磁性ナノ粒子の集団のサイズ分布の更なる絞込みを引き起こし得る。例えば、鉄前駆体溶液中で生成された磁性ナノ粒子の第一の個体群は、例えば、磁性ナノ粒子を両親媒性ポリマーでコーティングすることによる、相移動プロセスから生成された磁性ナノ粒子の第二の個体群よりも、広いサイズ分布を有し得る。

様々な両親媒性分子（例えば、ポリマー）が、本発明において使用され得る。適切な両親媒性ポリマーは、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイドブロックコポリマー、ポリエチレンオキシドポリマー、ポリエチレングリコールポリマー、ポリ（無水マレイン酸ａｌｔ−１−オクタデセン）ポリマー及び／又はポリ（無水マレイン酸ａｌｔ−１−オクタデセン）−ポリエチレングリコールポリマー（ＰＭＡＯ−ＰＥＧ）を含むがそれらに限定されない。両親媒性ポリマーは、広い範囲の分子量を有し得、直鎖又は分枝鎖であり得る。特定の実施形態において、両親媒性のポリマーは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ１２７を含み得る。いくつかの実施形態において、両親媒性のポリマーは、ＰＭＡＯ−ＰＥＧを含み得る。一実施形態において、ＰＭＡＯ−ＰＥＧポリマーは、Ｍｎ約３０，０００〜５０，０００のＰＭＡＯ部分及び、Ｍｎ約５０００のＰＥＧ部分を有し得る。いくつかの実施形態において、ＰＭＡＯ部分は、約１，０００〜約５０，０００、約５，０００〜約４０，０００、約１０，０００〜約３０，０００、又は約２０，０００〜約５０，０００までの範囲であり得る。より高い分子量もまた、使用され得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧ５００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ１００００及びそれ以上を含み得るが、それらに限定されない。

ＩＩＩ 磁性ナノ粒子を使用するシステム及び方法
本発明の磁性ナノ粒子は、幅広い様々な用途においての使用が見つけられ得る。例えば、本発明は、本明細書中に記載の磁性ナノ粒子を使用する、診断及び／又は治療方法を提供する。いくつかの実施形態において、例えば、本発明は、本明細書中に記載の磁性ナノ粒子の個体群を被験者に投与することと、撮像システムの磁性ナノ粒子の個体群における、少なくとも一つの磁性ナノ粒子を励起することとを含む、磁性ナノ粒子の撮像方法を提供する。方法は、更に、磁性ナノ粒子の個体群中の、少なくとも一つの励起された磁性ナノ粒子から信号を検出することを含み得る。

図２は、本発明の様々な態様を示す。例えば、図２は、撮像の前に患者又は被験者に送達され得る、磁性ナノ粒子２０２の組成物を示す。図２はまた、撮像システム２００の基本構造を示す。システム２００は、例えば、公知の撮像システムに一般的に用いられている、構成／構成要素を含み得る。示されているように、撮像システム２００は、患者又は被験者エリア２０４（位置する被験者は、例示のために示した）、検出器アセンブリ２０６及びコンピュータ制御ユニット２０８を含む。コンピュータ制御ユニットは、データ取得、画像再構成及び処理、データ格納及び取得、並びに、システムの様々な構成要素／態様の制御のための回路及びソフトウェアを含み得る。特定の用途について、検出器アセンブリ及び被験者エリアは、お互いに移動可能であり得、被験者エリアについて検出器アセンブリを移動させること、及び／又は、検出器アセンブリについて被験者エリアを移動させることを含み得る。図２に示される構成要素は、一般的な例示の目的のために提供する。当業者は、異なる導電診断（例えば、ＭＰＩ及び／又はＭＲＩ）及び／又は治療（例えばＭＦＨ）技法に関連し得る変更を理解するであろう。例えば、ＭＲＩ用途について、検出器アセンブリ２０６は、被験者を収納する従来のＭＲＩスキャナ形態であり得る。同様に、ＭＰＩの使用について従来的に知られているアセンブリは、検出器アセンブリ２０６の代わりに、被験者の周りに配置することができる。

様々な撮像システムは、被験者、植物、動物、哺乳類、又はヒトを含むがそれらに限定されない、被験者中の磁性ナノ粒子を検出するために使用することができる。特定の実施形態において、撮像システムは、磁性粒子撮像（ＭＰＩ）及び／又は磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）を実施するように構成することができる。市販及び／又は特注のＭＰＩ及び／又はＭＲＩシステムを使用することができる。ＭＰＩ撮像は、周波数及び振幅の範囲の下で実施することができる。特定の実施形態において、ＭＰＩ撮像システムは、約１ｋＨｚ〜約２５０ｋＨｚの間、約１ｋＨｚ〜約１００ｋＨｚの間、及び、約１ｋＨｚ〜約２５ｋＨｚの間の周波数範囲を用いることができる。より高い又はより低い周波数もまた使用することができる。

本発明は、また、本明細書中に記載の磁性ナノ粒子を用いる治療方法を提供する。一例の実施形態において、本発明は、磁気温熱療法を実施する方法を提供する。該方法は、本明細書中に記載の磁性ナノ粒子の個体群を被験者に投与することと、磁性ナノ粒子の個体群中の少なくとも一つの磁性ナノ粒子の近傍の細胞を加熱することとを含む。磁性ナノ粒子の加熱は、例えば、指定された周波数及び振幅での交流磁界を備える磁性ナノ粒子を放射することができる、市販又は特注の温熱療法システムを使用して行うことができる。

本発明は、更に、本明細書に記載の診断及び／又は治療のために最適化された特定の磁性ナノ粒子のサイズを選択することを含み得る。例えば、本発明は、磁性粒子撮像のためにチューニングされたサイズを備える磁性ナノ粒子を生成する方法を提供する。該方法は、磁性粒子撮像において使用される周波数で最大信号を生成する磁性ナノ粒子の直径を選択することと、最大信号そ生成する磁性ナノ粒子の選択された直径とおおよそ等しい中位径を有する磁性ナノ粒子の個体群を生成することを含み得る。磁性ナノ粒子の個体群は、更に、上述のように、狭いサイズ分布を有し得る。いくつかの実施形態において、本発明は、磁性粒子撮像において使用される周波数で最大の空間解像度を生成する磁性ナノ粒子の直径を選択することと、最も狭い空間解像度を生成する磁性ナノ粒子の選択された直径にほとんど等しい中位径を有する磁性ナノ粒子の個体群を生成することを含み得る、磁性ナノ粒子撮像のためのチューニングされたサイズ分布を備える磁性ナノ粒子を生成する方法を提供する。磁性ナノ粒子の個体群は、更に、上述のように、狭いサイズ分布を有し得る。

最大信号及び／又は最大空間解像度を生成する磁性ナノ粒子の直径の選択は、様々な方法によって実施することができる。例えば、選択された直径を備える磁性ナノ粒子のシステムが、どのように、高調波を生成する交流磁場に応答するのか、従って、どのように、例えば磁性粒子撮像システムなどによって信号が認識されるのかをシミュレートするために使用され得る。一実施形態において、以下のモデルが使用され得る：磁性ナノ粒子感受性χは、デバイによって溶液中の極性誘電体の誘電率を記述するために最初に開発され、複雑な規則を使用してモデル化されており、
式中、ωは、適用した磁場の角周波数τは、磁性ナノ粒子の磁気モーメントが方向を反転させるための時間であり、χ_０は、平衡感受性である。この近似が厳密に有効であるために、緩和は回転されドメインプロセスは除外されるべきであり、全ての粒子は、同じ大きさと形状を有するべきである。

従って、形態の駆動磁場は、
であり、磁性ナノ粒子の磁化は、
であり、Ｍ（ｔ）は、式（２）の複雑な形態のために、同位相と逆位相の条件の両方を含む。超常磁性ナノ粒子の非線形平衡感受性χ_０は、ランジュバン関数Ｌによって記述することができ、
式中、
であり、μｏは４×１０−７（ヘンリーｍ^−１）であり、Ｈｏは、Ｔμｏ^−１の強度の平衡磁場であり、ｋ_ｂはボルツマン定数１．３８×１０^−２３（ＪＫ^−１）であり、Ｔはケルビン温度であり、各粒子の磁気モーメントは、その磁気体積の直径ｄ及び、ｋＡｍ^−１における体積飽和磁化Ｍｓ（バルクのマグネタイトについては４４６）によって表される。

磁性ナノ粒子感受性は、交流磁場で反転する磁性ナノ粒子のモーメントのために効果的な緩和時間ｔに依存し、
これは、二つの別個の緩和プロセスを含み、それぞれは、特性時間を備える。小さな振幅の適用磁場について、ニール緩和時間ｔ_Ｎは、「ブロックされていない」体積の磁化反転を説明し、
式中、Ｋ（Ｊｍ^−３）は、結晶磁気異方性定数であり、材料特性
及び試行時間ｔ_０は、約１０^−１０秒である。ブラウン緩和時間ｔ_Ｂは、「ブロックされた」磁気ボリュームの物理的な回転を説明し、
式中、ｄ_Ｈは、磁性ナノ粒子流体力学的直径であり、η（Ｐａ秒）は、懸濁流体の粘度である（水について、０．８９）。式（４）は、式３で与えられる形態の交流磁場における直径ｇ（ｄ）の分散を有する磁性ナノ粒子の磁化Ｍ（ｔ）を説明するように変更することができ、
直径分散ｇ（ｄ）は、式（１）において、上述した。

本発明は、また、本明細書中に記載の磁性ナノ粒子を、診断及び／又は治療用途を促進するために、被験者へ投与するための方法及び組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物は、磁性ナノ粒子の個体群及び薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。本発明において有用な医薬品賦形剤は、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、甘味料、風味料及び着色料を含むが、それらに限定されない。当業者は、他の医薬品賦形剤が本発明において有用であることを理解するであろう。

本発明の磁性ナノ粒子は、毎時間、毎日、毎週又は毎月を含め、必要に応じて頻繁に投与することができる。本発明の方法で利用される化合物は、例えば、約１ｍｇ〜約５１０ｍｇ、又は、約０．０１２５ｍｇ／ｋｇ体重〜約６．３７５ｍｇ／ｋｇ体重（成人の平均体重を８０ｋｇとする）の範囲で投与され得る。投与量は、しかしながら、患者の要件、治療される及び／又は撮像される症状の重篤度、及び／又は用いられる磁気ナノ粒子によって、変化し得る。例えば、投与量は、投与量は経験的に、特定の患者および／または磁性ナノ粒子と一緒に使われている撮像様式のタイプに診断された疾患の種類や病期を考慮して決定することができる。本発明の文脈において、患者に投与される用量は、患者に有益な診断又は治療反応をもたらすのに、十分であるべきである。投与のサイズはまた、特定の患者における、特定の磁性ナノ粒子の投与に伴う、任意の有害な副作用の存在、性質及び程度によって決定されるであろう。特定の状況に対する適切な投与量の決定は、医師の技量の範囲内である。

本明細書に記載の組成物を、非経口、静脈内、皮内、筋肉内、結腸、直腸又は腹腔内を含む、様々な方法で患者へ投与可能である。好ましくは、医薬組成物は、非経口、静脈内、筋肉内又は経口で投与される。本発明の磁性ナノ粒子の個体群を含む経口剤は、液体、錠剤、カプセルなどの任意の適切な形態であり得る。経口製剤は、胃内での溶解を防止又は軽減するために、コーティング又は処理することができる。

本発明の磁性ナノ粒子組成物は、当業者に公知である任意の適切な方法を使用して被験者へ投与することができる。本発明における使用のために適切な製剤及び送達方法は、一般的に、当業者に公知である。例えば、本明細書中に記載された磁性ナノ粒子の個体群は、薬学的に許容可能な、希釈剤、担体又は賦形剤を含む医薬組成物として製剤化することができる。本発明の磁性ナノ粒子の個体群は、任意の薬学的に許容可能な組成物で投与することができる。薬学的に許容される無毒組成は通常用いられる賦形剤のいずれか、及び１０〜９５％の活性成分又は２５〜７５％の濃度で活性成分を組み込むことによって形成される。更に、いくつかの実施形態において、ナノ粒子、微粒子、又はリポソームなどの様々な担体系を使用することができる。例えば、磁性ナノ粒子は、例えば、リポソームに封入することができる。このアプローチは、例えば、エリア内の磁性ナノ粒子の高密度化を可能にすることができ、それによって、診断及び／又は治療の適用に影響を与える。更に、磁性ナノ粒子は、例えば、患者にターゲットを絞った薬物送達のためのナノ粒子の採用などの、当業者に一般的に公知な薬物送達の方法論と更に組み合わせることができる。

更に、磁性ナノ粒子の個体群は、非経口、局所、鼻、舌下、強制経口投与、又は局所投与のために処方することができる。例えば、医薬組成物は、非経口で、例えば、微腔内、静脈内、皮下、皮内、又は筋肉内などに投与する。従って、本発明は、本発明に記載した磁性ナノ粒子の個体群を単一で又は混合物で、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解されるか又は懸濁した状態で非経口で投与するための組成物を提供する。様々な水性担体がしようされ得る。これらの組成物は、従来の公知な滅菌手法又は、滅菌ろ過を使用して滅菌され得る。得られた水溶液は、凍結乾燥のためにパックされ、凍結乾燥された調製品は、投与の前に滅菌溶液と組み合わされる。組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレイン酸塩などの、ｐＨ調製及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤などの薬学的に許容可能な補助物質を含み得る。

本発明は、また、疾患の状態を治療及び／又は診断するために、患者に磁性ナノ粒子を投与するためのキットを提供する。そのようなキットは、典型的に、投与のために有用である二つ以上の構成要素を含む。構成要素は、本発明の磁性ナノ粒子、試薬、容器、及び／又は機器を含み得る。いくつかの実施形態において、キット内の容器は、使用前に放射性標識されている放射性医薬品を含む磁気ナノ粒子組成物を含み得る。キットは、更に、任意の反応成分又は磁性ナノ粒子組成物の投与のために必要な緩衝液を含む。更に、磁性ナノ粒子組成物は、凍結乾燥された形態であり、投与前に再構成することが可能である。

特定の実施形態において、本発明のキットは、一つ以上の構成要素を含み得る、包装アセンブリを含み得る。例えば、包装アセンブリは、本明細書に記載の少なくとも一つの磁性ナノ粒子組成物を収容する容器を含み得る。別の容器には、患者への投与前に磁性ナノ粒子組成物と混合することができる他の賦形剤又は薬剤を含み得る。いくつかの実施形態において、特定の診断及び／又は治療の用途によって、医師は、特定の構成要素及び／又は包装アセンブリを選択及び合わせ得る。

本発明のこれらの装置、デバイス、システム、及びコンポーネントのいずれかの特定の寸法は、意図する用途によって容易に変更可能であり、本明細書の開示の観点から当業者には明らかであろう。更に、本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示の目的のみであり、それらに照らして様々な修正又は変更が、当業者に、本出願及び添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれることを示唆している。本明細書に記載の実施形態の多数の異なる組み合わせが可能であり、そのような組み合わせは、本発明の一部であると考える。更に、本明細書中の任意の一つの実施形態に関連して説明したすべての特徴は、容易に本明細書中の他の実施形態での使用に適合させることができる。異なる実施形態における、同様の特徴についての、異なる用語又は参照番号の使用は、必ずしも明示的に規定された以外の違いを意味するものではない。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲を参照することによってのみ、説明されることを意図しており、本明細書に開示される好ましい実施形態に限定されることを意図するものではない。

実施例１
本実施例は、ＭＰＩ信号を発生するために使用される磁性ナノ粒子の最適なサイズを特定する方法を実証し、該信号は、任意の運転磁界周波数ｖについての磁性ナノ粒子の三次高調波（Ｍ）として検出される。任意に選ばれたｖ＝２５０ｋＨｚについての実験結果は、超常磁性のランジュバン理論に基づくナノ粒子の磁化モデルの予測と一致していた。注意深くサイズを管理することによって、ＭＰＩの質量感度を最大にする最適な物理的な寸法を有する生体適合性マグネタイトナノ粒子を設計することが可能である。この結果は、ランジュバン理論を使用して説明され、実験的に実証され、商業的オプションの相対パフォーマンスの向上と最適な材料を合成するための基礎を提供する。

マグネタイトナノ粒子合成。マグネタイトナノ粒子は、１−オクタデセン（工業銘柄、９０％、アルドリッチ）中の、鉄（ＩＩＩ）オレイン酸塩の熱分解によって合成した。１５ｎｍの磁性ナノ粒子を生成するための典型的な反応において、１２ｎｍｏｌのオレイン酸（工業銘柄、９０％、アルドリッチ）を、２．５ｇの１−オクタデセン中に溶解した、０．５ｍｍｏｌの鉄（ＩＩＩ）オレイン酸塩複合体中へ加えた。３０分間アルゴン下でパージした後、混合物をまた、アルゴン雰囲気下で加熱し、２４時間還流する。最終的に、反応物を室温まで冷却し、ナノ粒子を収集し、クロロホルム及びメタノールの１：１の混合物中で洗浄する。

ＭＰＩ信号試験用に調製するために、各試料は、生体適合性のために、有機層から水層へ、両親媒性ポリマーである、ポリ（無水マレイン酸ａｌｔ−Ｉ−オクタデセン）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＭＡＯ−ＰＥＧ）を使用して移送し、１Ｘのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に溶解した。層移送の後、鉄濃度を、誘導結合プラズマ原子発光分光分析装置（Ｊａｒｒｅｌ Ａｓｈ９５５）を使用して測定した。合成した試料中の鉄濃度は、一般的に、０．５〜３．６ｍｇＦｅ／ｍＬである。それぞれの中位径及びサイズ分布は、Ｃｈａｎｔｒｅｌｌ法（Ｃｈａｎｔｒｅｌｌら、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ １９７８；Ｍａｇ−１４（５）：９７５）に従って、磁化対磁場データを当てはめることによって測定した。

ＭＰＩ信号試験。ＭＰＩ信号性能は、特別にナノ粒子の磁化の第三の調波を検出するために設計された特注のトランシーバを使用して測定した。操作の間、試料調波は、市販の無線周波数（ＲＦ）アンプ（Ｈｏｔｅｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｍｏｄｅｌ ＡＧＩＯＩＯＩ７Ｌ）を使用して、２５０ｌＨｚで駆動させた空冷ソレノイドを使用して励起させる。高調波を次に、両方とも同軸内側に存在する、比較的小さな受信コイル及び反巻線を使用して検出する。受信帯域幅を狭くし、調波検出のための最適な動力伝達を提供するために、受信コイルはチューニングされ、７５０ｋＨｚで５０Ωに調整する。誘導された調波は、また、〜２４ｋｄＢのゲインを使用して、市販のスペクトルアナライザ（Ｒｏｃｈｅ＆Ｓｃｈｗａｒｚ、Ｍｏｄｅｌ ＦＳＬ３０３）で検出する前に増幅する。

試験の間、トランシーバの送信コイルは、１０ｍＴμ_０ ^−１の励起磁場を生成するためのＲＦ電力１０ワットで駆動した。測定のばらつきを評価するために、ＭＰＩ信号試験をトリプリケートで行った。各トリプリケートについて、３つの小さなキュベットを、表１に示した測定濃度で、１００μＬの試料で満たした。試料キュベットを、次に、トランシーバコイル内に挿入した。

ナノ粒子磁化のランジュバンモデル。ナノ粒子の試料について、時間依存磁化Ｍを、中央値ナノ粒子直径ｄｏ及び標準偏差σの関数としてモデル化した：
式中、Ｈ（ω，ｔ）は、ＲＦ駆動磁場であり、これは振幅Ｈ及び角周波数ωについて正弦波的に変化し、
であり、式中、Ｍ_ｓは、ナノ粒子の飽和磁化（マグネタイトについては、４４６ｋＡ／ｍ）であり、μｏは、４π×１０^−７Ｈｍ^−１であり、ｋ_ｂは、ボルツマン定数、１．３８×１０^−２３ＪＫ^−１であり、Ｔは、ケルビン温度であり、ｔは、粒子が交流磁界で反転するための効果的な緩和時間であり、
式中、ｔ_Ｎは、ニール緩和であり；
_{式中、Ｋは結晶磁気異方性定数であり、}
及びｔ_０
は、１０^−１０秒とみなされ、
ｔ_Ｂは、ブラウン緩和であり、
の式中、Ｖは粒子の流体力学的体積であり、ηは、懸濁流体の粘度である。最終的に、ｇ（ｄ_０，ω，ｄ）は、試料中の直径の分布を表し、対数正規分布関数を用いて十分に近似可能であり；
式中、σは、分布の標準偏差であり、ｄ_０は中位径である。

注意深く磁性ナノ粒子のサイズを管理することによって、ＭＰＩ信号が動的にナノ粒子の直径ｄによって変化し得る。これは、図３に示されており、測定された鉄のｍｇごとの信号は、ほぼ三桁にわたって変化することが分かり、いくつかの粒子は、同等の鉄濃度について市販の対応物よりも、３０倍の感度増加を示している。調波信号対直径で観測されたピークがあり、２５０ｋＨｚでのＭＰＩの最適なナノ粒子サイズがあることを示している。この最適なサイズは、駆動周波数及び異方性定数Ｋ（式１１）に依存し得、前述したランジュバンモデルを使用して他の周波数に対して予測することができる。２５０ｋＨｚのＭＰＩについて、最適な直径は、約１５ｎｍである。図３に示したナノ粒子試料についての詳細な情報を、表１に示す。また、直径が増加するに連れたマグネタイト試料についての３つのシミュレートされた曲線は図３に含まれ、それぞれ、１５、２０及び２５ｋＪ／ｍ^３の異方性定数を有し、それぞれについての対数正規サイズ分布の標準偏差は、σ＝０．１である。

最大信号は、表１中の試料ｍｆ０９０９１９ｐによって生成された。試料ｍｆ０９１００１ｐのサイズは、室温でオープンルーフの条件で、ＴＥＭ（ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｆ２０）による測定及び、他の試料に対する前駆体の比によって決定した。直径に対する測定された信号におけるピークの高さ及び位置は（図３）、約２０ｋＪ／ｍ^３の異方性定数Ｋを備えるマグネタイトなの粒子の予測された値と、定量的に一致する。マグネタイトについてのＫの測定値は、理論的には、１１ｋＪ／ｍ^３を予測しているが、典型的には、２３〜４１ｋＪ／ｍ^３の範囲となる。大きな粒子についてのＭＰＩ信号における減少は、１０ｍＴμｏ^−１励起磁場は調波を生成するのに十分な大きさであるが、効果的な緩和時間ｔを短縮するのに十分な長さではなく、上述のように、代わりに、緩和は粒子サイズによって決定される。実際に、短縮は、高い適用磁場のみにおいて生じる必要があり、Ｈａは、例えば、Ｈａ＞＞Ｈｋであり、式中、Ｈｋ＝２Ｋ／Ｍｓ異方性磁界。ｍｇ鉄当たりの信号電圧曲線は、鉄濃度及びＭＰＩ信号電圧測定値の誤差のため、９％の不確実性を有する。

実施例２
本実施例において、上述の式１〜９において本明細書中に記載されたモデルを、シミュレーションに使用した。マグネタイト磁性ナノ粒子は、１−オクタデセン（工業銘柄、９０％、アルドリッチ）中で、鉄（ＩＩＩ）オレイン酸塩を熱分解することによって合成した。鉄（ＩＩＩ）オレイン酸塩を、ナノ粒子を形成する前に、１０ｍｍｏｌの塩化鉄（ＩＩＩ）（無水物、アルドリッチ）を、３０ｍｍｏｌのオレイン酸（工業銘柄、９０％、アルドリッチ）と共に、５０ｍｌのメタノール中で溶解することによって、別の反応で形成した。この混合物へ、１００ｍｌのメタノール中に溶解した水酸化ナトリウムを、３０ｍｍｏｌ滴下した。得られた蝋状の沈殿物を、メタノールで５回洗浄し、乾燥させ、ヘキサン中に分散させ、分液ロート内で水で５回洗浄した。最終的に、貯蔵及び後の使用のために、生成物を再び乾燥させた。典型的な反応において、１５ｎｍのマグネタイトなの粒子を生成するために、１２ｍｍｏｌのオレイン酸（工業銘柄、９０％、アルドリッチ、セントルイス、ＭＯ）を、２．５ｇの１−オクタデセン中に溶解させた鉄（ＩＩＩ）オレイン酸塩複合物０．５ｍｍｏｌへ加えた。３０分間アルゴン下でパージした後、同様にアルゴン雰囲気下で混合物を過熱し、２４時間還流した。最終的に、反応混合物を室温まで冷却し、ナノ粒子を収集し、クロロホルム及びメタノールの１：１混合物内で徹底的に洗浄した。

相間移動について、狭いサイズ分布（典型的には、σが０．１、±〜２ｎｍの信頼区間に相当する）及び制御可能なサイズを備える高結晶性磁性ナノ粒子をもたらすため、合成経路は、有機溶媒及び界面活性剤に基づいて選択した。しかしながら、有機溶媒は、生物学的撮像における使用に適していないため、合成したままの磁性ナノ粒子は、水相に移動させた。生体適合性を確保するために、有機残渣を除去し、最終的な磁性ナノ粒子は、安定的であり、且つ、細胞毒性ではない。両親媒性ポリマーである、ポリ（無水マレイン酸−ａｌｔ−１−オクタデセン）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＭＡＯ−ＰＥＧ）を、相間移動に影響を与え、最終的な磁性ナノ粒子を、試験のために１ｘリン酸緩衝生理食塩水中に溶解する。

特性評価について、合成したままの試料を、溶媒を蒸発させることにより制御されたカーボンＴＥＭグリッド上に分散させた。明視野画像を、次に、ＧａｔａｎＣＣＤカメラ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を備えたＦＥＩ ＴｅｃｎａｉＴＥＭ（Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）を使用して、２００ｋＶで操作することによって得た。水溶液への相間移動に続いて、鉄濃度を、誘導結合プラズマ発光分光光度計（Ｊａｒｒｅｌ Ａｓｈ ９５５）を用いて測定した。合成した試料中の鉄濃度は、０．５〜３．６ｍｇＦｅｍｌ^−１の範囲であった。磁化対磁場データであるＭ（Ｈ）は、室温で、ＬａｋｅＳｈｐｒｅ（Ｗｅｔｅｒｖｉｌｌｅ，ＯＨ）振動試料磁力計を用いて取得した。試料ＵＷ１７０＿１６は、室温で僅かに開いたループを示し、この試料について、Ｍ（Ｈ）データは、量子デザイン（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ＰＰＭＳ ＶＳＭオーブンを用いて、５７５Ｋでブロック温度以上で取得した。飽和磁化Ｍｓ（ｋＡｍ−１）は、Ｍ（Ｈ）データ及び化学量論的な磁鉄鉱に等しい密度を仮定することによって測定された試料濃度から決定した。中位径及び各試料の直径分散は、Ｃｈａｎｔｒｅｌｌ法によってＭ（Ｈ）から決定した。

ＭＰＩ信号は、磁性ナノ粒子の磁化の３次高調波を検出するために設計された特注の狭帯域トランシーバを使用して測定した。図４は、ＭＰＩトランシーバ内の送信及び受信コイルの配置の模式図を示す。トランシーバの操作の間、空冷式、巻線、ソレノイド送信コイルは、次に受信コイルで検出された試料の高調波を励起する。送信コイルは、５５０μｍ直径の銅線の９４巻きから構成され、２．７１及び５．２ｃｍの直径及び長さを有する。受信コイルは送信コイルの内側に配置され、１１４μｍ直径の銅線の全部で１４０巻きから構成されている。受信コイルは、誘導的に受信を分離し、チャンネルを送信するように設計されている。これは、直列に接続された３つの同軸ソレノイドを備えている。それぞれ逆方向巻かれた３５巻数の二つの外側コイルは、７０巻数の中央ソレノイドの両側に配置されている。全体の受信コイルは、中央と外側の巻線間の３ミリメートル間隔で、１ｃｍの直径及び２ｃｍの全長を有する。操作の間、外側の巻線は、誘導的に、検出された高調波のノイズレベルを低減するために、送信機から受信機を切り離す。無線周波数（ＲＦ）トラップ及び容量性デカップリングの追加の使用が、送信機と受信機との間の電気的絶縁を１２０ｄＢを超過するまで増加させる。送信コイルは、市販のＲＦアンプ（Ｈｏｔｅｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔａｃｏｍａ，Ｗａ，Ｍｏｄｅｌ ＡＧ １０１７Ｌ）によって、２５０ｋＨｚで駆動した。受信帯域幅を狭くし、高調波検出のための最適なパワー伝達を提供するために、受信コイルはチューニングし、７５０ｋＨｚで５０に合わせた。誘発される高調波を、市販のスペクトルアナライザ（Ｒｏｈｄｅ＆Ｓｃｈｗａｒｚ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍｏｄｅｌ ＦＳＬ３０３）で検出する前に、約２４ｄＢの振幅比を使用して増幅させた。

試験の間、送信コイルを振幅Ｈｏ〜６ｍＴμ０−１の正弦波励起磁場を生成するために、１０ＷのＲＦ電力で駆動した。測定のばらつきを評価するために、ＭＰＩ信号試験を、トリプリケートで行った。各試料について、三つのキュベットを、表２に示した測定濃度で、１００μＬの試料で満たした。試料キュベットを次に、トランシーバコイルへ挿入し、信号を記録した。表２に示された正規化された信号は、三つの試験した試料の平均である。

数値シミュレーション。ＭＰＩ信号は、ＭＡＴＨＲＭＡＴＩＣＡソフトウェアを使用して、本明細書に記載したモデルに従ってシミュレートした。Ｍ（ｔ）データは、４ＭＨｚのサンプリングレートで生成され、式（２）の数値統合によって７５０ｋＨｚにおけるＭＰＩ信号を解決するのに十分であった。統合は、計算時間を削減するために、物理的に関連した直径に制限された。各分散について、統合境界は、境界ｄ値において、ｇ（ｄ）〔式（６）〕＞０．０１となるように選択した。飽和までの全ての磁場Ｈｏについて、この状況は、少なくとも４桁の有効数字で、境界を約０から１０００ｎｍに設定すると、Ｍ（ｔ）におけるのと同じ精度が得られた。ステップサイズは飽和までの磁場の範囲で、Ｍ（ｔ）におけるのと同様の精度を確保するように選ばれた。ＭＰＩ信号は、Ｍ３による受信コイルにおける誘導された超電力となるように画定され、Ｍ（ｔ）の三次高調波は、Ｍ（ｔ）のフーリエ変換によって決定した。相互主義の理論によると、これは受信コイル内のユニット電流によって生成される、軸方向の磁場Ｂ_{ａｘｉａｌ}（ＴＡ−１）に関連し得る：
式中、ｆ０は駆動磁場周波数である。

ＭＰＩ信号は、図５Ａにおいて測定された中位径ｄ０に対してプロットされており、測定されたＭＮＰ試料の特性を表２に提供する。全てのデータは、試料間の比較を可能にする鉄濃度によって正規化されている。ｍｇ鉄当たりの信号電圧は、鉄濃度及びＭＰＩ信号電圧測定値の誤差のために、１２％の平均不確実性を有する。エラーバーは、図５Ａにおける点のサイズよりも小さい。サイズに依存する信号発生は、試料ＵＷ１５０＿２２（中位径が１５ｎｍに等しい）についての最大値を備える、図に見られる。

図５Ｂは、各実験試料についてのシミュレーションしたデータを示す。正規化されたＭＰＩ信号電圧を、密度５１８０ｋｇｍ^−３の化学量論的なマグネタイトを想定して、ｍｇ鉄当たりで計算した。測定値であるｄ_０、σ及びＭｓは、表２に示した値を使用し、Ｋは、バルク値（１１ｋＪｍ^−３）を想定し、ｆ_０は２５０ｋＨｚ、及びＨ_０は６ｍＴμ_０ ^−１を使用して。表２に示したＭｓの値は、主に、Ｎ（Ｈ）を測定するために使用した試料体積における誤差のために、２０％の平均不確実性を有する。流体力学的直径ｄＨ＝ｄ＋２σは、効果的な緩和時間ｔ〔式（６）〕のブラウン構成要素を決定するために使用し、式中、σは、マグネタイトコアを囲むポリマー層の厚さであり、全てのシミュレーションにおいて、σは１０ｎｍであり、ＰＭＡＯ−ＰＥＧ層の長さは、相移動の前及び後に、ＭＮＰの動的光散乱によって測定した。

図６は、異方性定数Ｋ、直径分散の標準偏差σがどのように変化するか、及び、駆動磁場振幅Ｈ０がＭＮＰサイズの関数として信号電圧にどのように影響するかを示すために、マグネタイトＭＮＰについてのシミュレートしたデータを示す。図６Ａにおいて、Ｋ値の範囲は、バルク値１１ｋＪｍ^−３から、以前２０ｎｍ直径よりも小さな粒子について観察した値の範囲の中央値である大きな値２０ｋＪｍ^−３までという、磁性ナノ粒子について予測される範囲である。

密接に離間した直径及び狭い粒径分布を備える、一連の試料を生成するためにＭＮＰの合成を制御することにより、本明細書中に記載したモデルによって予測されるように、ＭＮＰ直径についてＭＰＩ信号は劇的に変化することが実証された。観察された正規化ＭＰＩ信号は、測定された試料において三桁にわたって変化しているようであり、いくつかの粒子は、同程度の鉄濃度を含む市販の対応するものと比較して、３０倍の感度の増加を示している。

我々の実験装置は、小動物に適した、小容量のＭＰＩ撮像のための高調波発生の可能性を試験するために設計された。駆動磁場周波数ｆ_０＝２５０ｋＨｚがこの実験を通して選択された。図６Ｃでシミュレートした磁場が２５０ｋＨｚにおける小動物の撮像に関連するとして選択される一方、実験で使用した磁場強度（６ｍＴμ_０ ^−１）は、コイルの加熱を制限するために選択され、また、１２ｍＴμ_０ ^−１は、磁気シミュレーションの閾値であると推定されている。

図５の特性は、ＭＮＰの関数として観察された高調波信号のピークである。このピークは、２５０ｋＨｚにおけるＭＰＩについての適切なＭＮＰサイズを示す。実験データと図４Ｂのシミュレーションデータを比較すると、ほとんどの試料について２倍以内の定量的な一致が見られる。例外は、二つの最小試料ＵＷ０５６＿４２及びＦｅｒｉｄｅｘＩ．Ｖ（商標）を含み、これは最大のσを特徴とし、試料ＵＷ１４３＿１７は近傍のものに比べて顕著に低い測定値Ｍｓを有し、ＵＷ１７０＿１６は最大の試料である。モデリング試料ＵＷ０５６＿４２及びＦｅｒｉｄｅｚは、小さな中位径及び非常に広分散のため、信頼性が低かった。それらの測定した分散関数ｇ（ｄ）のそれぞれは、１ｎｍと同程度の小ささの直径を含み、これはマグネタイトについての単一ユニットセルの桁である。

図５Ｂのシミュレートされた点において、信号電圧は、実験データに対応して、最大直径１５ｎｍまで増加する。しかしながら、ピーク直径は、はっきりと見えない。実際、Ｋはバルク値（１１ｋＪｍ^−３）と仮定した場合、少なくとも直径が２０ｎｍまでの試料は、明確にピークを解明するために必要であり得る（図５Ａ参照）。１５ｎｍの近くのピークを示した実験データは、そのデータから、ＭＮＰが１１ｋＪｍ^−３よりも大きい異方性を有することを推測することができる。Ｋ＝２０ｋＪｍ^−３について、図６Ａのシミュレートしたデータは、１５ｎｍにおけるピークを示している。これは、その表面における対称性の破れのために、ナノ粒子がバルクよりも大きい効果的な異方性を有するという理論研究と一致している。

増加したＫをもたらす同じ効果が、ＭＮＰサイズが小さくなるに連れて、Ｍｓの減少をもたらした。この傾向は、試料において観察された。平均測定Ｍｓは、ｄ０１０ｎｍの試料についてのマグネタイトのバルク値（４６６）の７０％（３０８ｋＡｍ^−１）であり、ｄ０＜１０ｎｍの試料について４５％（２０１）である。最大濃度３．６５ｍｇＦｅ／ｍｌ（０．０６５ｍｏｌＦｅ／ｌ）は、極めて低く、試料濃度の小さな変動がＭＰＩ信号で観察された差異に寄与していることはほとんど無い。図６Ａ〜Ｃにおいてシミュレートした結果は、ＭＰＩ信号強度が、試料特性及び駆動磁場振幅Ｈ０によってどのように変化するのかについての洞察を提供する。より一般的には、本明細書中で使用したモデル及びシミュレートした結果は、実験で観察されたピークの物理学的な理解を提供する。直径で１５ｎｍよりも大きいＭＮＰについてのＭＰＩ信号における減少は、増加した緩和時間ｔによるものである。直径で約１０ｎｍ未満の小さな粒子において、磁気緩和は、ニールプロセスによって支配され、ここで、モーメントは熱的に活性化され、典型的にはナノ秒で反転している。ブラウン緩和は、直径約２０ｎｍ以上の大きな粒子の主流を占めている。そのような粒子のモーメントは、全体の粒子は、物理的に外部磁場に合わせて回転するように、ブロックされるか、又は、簡単な軸に沿って固定される。ブラウン緩和定数は、流体力学的体積に比例して変化し、ニール緩和よりも大幅に遅くなり、ナノ粒子上に表面コーティング（単数又は複数）で構成される、流体力学的な層の厚さに応じて、その期間はマイクロ秒からミリ秒単位までの範囲となっている。ニール緩和時間ｔＮ〔式（７）〕は、指数関数的に磁気ボリュームに依存しているため、緩和は磁鉄鉱の場合は１０及び２０ｎｍの間の領域における直径の増加とともに遅くなる。効果的な緩和時間ｔが駆動磁場の期間よりも長い場合、駆動磁場に遅れたＭＮＰモーメント、感受性の同相成分の減少、及び、逆移送成分がより顕著になることが期待される。図６Ａ〜Ｃのシミュレーションされたデータについて、この遷移は、直径の増加につれたショルダーに対するＭＰＩ信号におけるピークからの降下に対応している。ピーク高さはＫに連れて変化するが、ショルダーの高さは、緩和がブラウン緩和である場合、そうではないということに注されたい。予期したように、大きなＨｏ磁場は、特にニール緩和が寡占的である中間サイズについて、高調波の振幅を増加させた。ピーク信号は、磁場が増加するに連れて、僅かに小さな直径へシフトしているように見える。

実験データは、検出可能な三次高調波が、６ｍＴμ_０ ^−１と同程度に小さい磁場によって生成されることができることを示している。更に、比較的大きいサイズのＭＮＰについてのＭＰＩ信号において測定された減少は、これらの実験の間に我々のＭＰＩトランシーバによって生成された６ｍＴμ_０ ^−１の磁場は、効果的な緩和時間ｔを短縮するのに十分大きくないということを暗示している。従って、有限の緩和時間は、式１〜９におけるように考えるべきである。我々は、短縮が発生することが予測される磁場を予測することができ、これは、Ｈａ＞＞Ｈｋの場合であり、Ｈａは適用された磁場であり、且つ、Ｈｋは異方性磁場である。全てのバルクマグネタイトについて、立方対象性を有し、Ｈｋ＝４Ｋ／（３μ_０ Ｍｓ）＝３４ｍＴμ_０ ^−１である。

実験で、それらの適切な磁性粒子について選択されたマグネタイトＭＮＰは、市販の試料よりも正規化されたＭＰＩ信号において３０倍の改善を示していることが示されており、駆動磁場の周波数は２５０ｋＨｚであり、ＭＰＩ信号は、３ｆ_０で測定する。我々はまた、ＭＰＩ信号を、約１５ｎｍの直径を有するＭＮＰサイズの関数として観察した。ランジュバン理論に基づく、ＭＮＰ磁化のモデルは、同様のピークを予測し、根本的な原因のいくつかの物理的理解を与えている。ニール及びブラウン緩和の間の遷移は、ＭＰＩ信号の減少をもたらす。試験下のいくつかの試料の効果的な磁性緩和時間ｔがマグネタイトにおける１／２πｆ_０に近付く場合はいつでも、最適なＭＮＰサイズが存在するはずである。

実施例３
この例において、有機溶媒中で合成され、問題なく水へ移動された単分散ＭＮＰ（Ｆｅ_３Ｏ_４）は、磁場周波数及び振幅の任意の選択した組合せについての、強いサイズ依存加熱のために調整することができる。生物学的関連性を確立するためには、加熱速度はまた、細胞培養培地中で測定し、結果は、粒子の凝集に起因するブラウン緩和の変化の観点から解釈される。

ナノ粒子は、金属脂肪酸塩の熱分解に基づく手順に従って合成し、この場合、Ｆｅ^３＋はオレイン酸塩であった。Ｆｅ^３＋オレイン酸塩は、１−オクタデセン（ＯＤＥ、工業銘柄９０％）中にストックソリューション（濃度 １８重量％）として調製し、保存した。所望のサイズのＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子は、ＯＤＥ内で、所定量のＦｅ^３＋オレイン酸塩及びオレイン酸（工業銘柄 ９０％）を反応させることによって合成した。例えば、１５ｎｍの粒子の合成に、２．５ｇの反応溶媒（ＯＤＥ）中で、０．２ｎｎｏｌ／ｇのＦｅ^３＋オレイン酸及び３ｍｍｏｌ／ｇのオレイン酸を使用した。混合物を、アルゴン下で激しく攪拌しながら、一晩（約２４時間）還流した。最終生成物を収集し、過剰な界面活性剤及び溶媒を除去するために、クロロホルム及びメタノールの１：１（体積／体積）混合物を用いて４回洗浄した。真空下で３０分間乾燥させることによって得たＭＮＰ粉体は、疎水性であり、トルエン又はクロロホルムなどの有機溶媒中に容易に分散した。水相への相移動は、オレイン酸コーティングされたＭＮＰ（ＭＮＰ＠ＯＡ）を、両親媒性ポリマーであるポリ（無水マレイン酸−ａｌｔ−１−オクタデセン）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＭＡＯ−ＰＥＧ）でコーティングすることによって達成した。ＰＭＡＯ−ＰＥＧコーティングされたＭＮＰ（ＭＮＰ＠ＰＭＡＯ−ＰＥＧ）のコロイド安定性は、動的光散乱（ＤＬＳ−Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｏ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して特徴付けた。鉄濃度は、誘導結合プラズマ発光分光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ、Ｊａｒｒｅｌｌ Ａｓｈ９５５）を使用して決定した。室温振動試料磁力計（ＶＳＭ、Ｌａｋｅｓｈｏｒｅ）を、磁化結果を得るために使用した。

水及び組織培養培地（１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地、ＤＭＥＭｐ１０％ＦＢＳ）中のＭＮＰの加熱率を、専用温熱療法システム（ｍａｇｎｅＴｈｅｒｍ、ｎａｎｏＴｈｅｒｉｃｓ、英国）を使用して測定した。交流磁場（ＡＭＦ）周波数及び振幅は、それぞれ、３７６ｋＨｚ及び１３．５ｋＡ／ｍに設定した。光ファイバの熱電対（Ｌｕｘｔｏｎ，Ｌｕｍａｓｅｎｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、温度を調べるために使用した。消費電力又はＳＬｐを以下の式を使用して測定した：
式中、ｃは水の比熱容量（４．１８６Ｊ／ｇ℃）であり、ｍＦｅ_３Ｏ_４及びｍＨ_２Ｏ＋Ｆｅ_３Ｏ_４は、それぞれ、グラムでのＤｅ_３Ｏ_４ＭＮＰの質量及び試料全体の質量であり、ｄＴ／ｄｔは、℃／秒での昇温速度である。

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）撮像（図７Ａ）は、有機経路を介して合成したＭＮＰが、単分散している（１６±１ｎｍの直径が示されている）ことを示している。超常磁性粒子について、サイズ及び対数正規サイズ分布はまた、ラジュバン関数へ磁化曲線を当てはめることによって決定する。サイズの範囲についての、ＤＩ水中のＭＮＰ＠ＰＭＡＯ−ＰＥＧの磁化曲線は、粒子サイズの増加に連れた初期磁化率及び飽和における増加を示す（図７Ｂ）。粒子サイズに依存して、飽和磁化値がマグネタイトのバルクの飽和値の８０％、即ち、９０ｅｍｕ／ｇまで達する。表面での無秩序スピンにより、マグネタイトなの粒子の飽和値は、しばしばバルクよりも小さくなる。（ＭＮＰ＠ＯＡ）の相移動前及び（ＭＮＰ＠ＰＭＡＯＰＥＧ）相移動の後の磁化測定は、磁気特性のごくわずかな変化を示す（図７Ｃ）。歳出的に、磁化特性は、試験期間（５ヶ月）にわたって一貫しており、これは、ＭＮＰ＠ＰＭＡＯ−ＰＥＧの素晴らしい貯蔵寿命を示唆している。

ＭＮＰサイズの関数として測定された過熱率は、σ平均＝０．１７５（図８Ａ）についての直径１６ｎｍでのＳＬＰにおいて、鋭いピークを示す。ＳＬＰ値は、式（１３）を使用して計算した。広い平均サイズ分布（σ平均＝０．２６６）の粒子を使用した場合、ピークＳＬＰ値は、１４４から１００Ｗ／ｇ Ｆｅ_３Ｏ_４まで低下した（３０％低下）。これらの結果は、多分散性のわずかな増加は、負のＭＮＰの加熱容量に影響を与え得ることを確認している。

生物学的に関連のある環境をシミュレートするために、（１０％ＦＢＳ及び１％Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ）中に分散させたＭＮＰの過熱率を測定した。図８Ｂは、サイズ１３及び１４ｎｍのＭＮＰが、ＳＬＰにおける如何なる顕著な変化も示さないが、しかしながら、１６ｎｍのＭＮＰが３０％の減少を示すことを示している。ＤＬＳ測定図８は、ＤＭＥＮ＋１０％ＦＢＳ中に分散させた場合、ＭＮＰ＠ＰＭＡＯ−ＰＥＧの流体力学的サイズが増加することを示している。超常磁性ナノ粒子の磁化緩和理論によれば、ニール機構を介して緩和が影響を受けている一方、流体力学的体積の増加はブラウン緩和を延長する。更に、モデルは、水中で、１６ｎｍのＭＮＰは、ニールからブラウン緩和への移行領域内に存在している。従って、我々の結果に基づいて、我々は、１６ｎｍの試料中の約３０％のＭＮＰは、ブラウン緩和を受けるのに十分に大きく、ＤＭＥＭ中の凝集に起因して、ブラウン緩和がブロックされるか、ＡＭＦによって課された３７６ｋＨｚのタイムウィンドウに比較して非常にゆっくりである。１３及び１４試料は、ＤＭＥＭ中においても凝集しているにもかかわらず（データ示さず）、ＳＬＰにおける如何なる顕著な変化も示さず、これは、主にニール緩和を示唆している。これらの測定値は、温熱療法の生物学的意義重要な洞察を付与している。ＭＮＰが標的部位に十分な濃度で配信されている場合でも、細胞や生体分子への付着は、ｉｎ ｖｉｖｏの状況で不可避であると考慮されるべきである。

実施例４
背景

部位特異的な治療法の考え方は、がんの部位に治療を制限することであり、それによって副作用及び患者の不快感を最小化するので、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）は、それらはリモートで外部磁場勾配や他の能動的及び受動的標的手法の適用対象とすることができるため、魅力的な選択肢である。一度局在化すると、ＭＮＰにおいて生じる緩和損失から熱を解放する交流磁界（ＡＭＦ）を利用する治療方法である、磁性流体温熱療法（ＭＦＨ）は、局部加熱を誘導するために使用することができる。がん細胞の加熱（典型的に、約４２〜４３℃まで）は、従来の確立された方法によってより効果的に術後補助療法を行う細胞代謝を混乱させることが知られている。優れた磁気特性を備える広い範囲の強磁性ナノ粒子は、ＭＦＨのために合成することができる。しかしながら、参加鉄（γ−Ｆｅ_２Ｏ_３又はＦｅ_３Ｏ_４）磁性ナノ粒子は最小の毒性を示し、ＭＲＩ造影剤としてＦＤＡに承認されており、慢性肝臓疾患に罹っている患者の治療について、より新しいものである。更に、強磁性要素と比較した場合のそれらのささやかな磁気特性により、ＭＦＨにおける効果的な適用のための、形態学的（サイズ、サイズ分布、形状）、結晶構造的（相純度）及び磁気（緩和）特性を最適化することが所望されている。

ＭＦＨは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方のプラットホームにおいて研究されてきた。しかしながら、顕著な治療効果を促進するために十分な量のＭＮＰを標的部位に送達する困難性は、ＭＦＨの臨床導入を妨げる大きなハードルの一つである。例えば、１０分の治療時間の消費電力の推定３２ｍＷは、前立腺腫瘍組織の１グラム（ｃｐ約３．８ｋＪｋｇ^−１ｓ^−１）の温度を５℃上昇させるために使用されている。これは過小評価され、血流からの冷却を考慮すると高くなることがある。それでも、この概算に基づいて、腫瘍組織のグラム当たり１００Ｗ／ｇの特定の損失電力（ＳＬＰ）を有する、最小投与量の０．３２ｍｇの磁性ナノ粒子が、局所的に温度を５℃上昇させるために必要とされ得る。

ＳＬＰ出力は、ＭＮＰの効果的な磁化緩和時間が、適用されたＡＭＦ周波数に合う場合、最適化され得る。効果的な緩和時間は、ニール（磁化反転）及びブラウン（粒子回転）時間構成要素に依存する。ブラウン緩和（ｔ_Ｂ）は、流体粘性（η）及び流体力学的粒子体積（ＶＨ）に直線的に依存し、典型的に、ｉｎ ｖｉｖｏ環境における動的な性質のため、管理することが困難である。また、流体力学的体積が大幅に増加することが見出された場合に、ＳＬＰ出力は有害であり得る。一方、ニール緩和時間（ｔＮ）の操作は、磁気異方性定数（Ｋ）の生成物及び磁気コア体積（Ｖｍ）ｔＮ〜ｅｘｐ（ＫＶ）に指数関数的に依存する。この指数関数的な依存性のため、サイズ分布のたとえわずかな増加であっても、効果的な緩和時間に影響を与える。上記の議論から、ニール又はブラウン構成要素のいずれに寡占されていたとしても、効果的な緩和時間は、粒子体積に依存することは明らかである。従って、粒子サイズ、より重要なことには、選択されたＡＭＦ周波数についてのサイズ分布を調整すること、及び、ＭＮＰはＳＬＰの出力を最大にするために、生物学的培地で凝集しないようにすることが所望されている。例えば、ＭＮＰにおける磁化緩和の公知なサイズ依存性に基づくモデルによると、サイズ分布が高度に単分散（σ＝０）から多分散（σ＝０．２５）まで増加する場合、加熱速度は５倍に低下する。この変化は、理想的に単分散MNPを前提として、腫瘍組織や必要以上の５倍のグラムあたりの多分散ＭＮＰ（σ＝０．２５）の１．６ｍｇ以上を推定している。

最適化されたＭＦＨ反応のためにＭＮＰを調整するために、高度に単分散のマグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）ＭＮＰは、有機的な方法を使用して合成され、その後、生体適合性の両親媒性ポリマーを使用して水相に転送されている。有機的な合成経路は、サイズ、サイズ分布、形状及び相純度についての管理を付与し、特に選択されたＡＮＦ周波数について調整されたＭＮＰ合成を可能にしている。得られた出力又はＳＬＰは、最大であり、且つ、特定の周波数について最適化されている。体系的な特性が合成のＭＮＰが最適ＭＦＨのパフォーマンスを得るために必要な特性を有していることを確認するために行われた。専用温熱療法システムはＭＮＰの加熱能力を測定し、我々が選択したＡＭＦの条件（ｆ＝３７３ｋＨｚ、Ｈ０＝１４ｋＡ／ｍ）に最適なサイズを特定するために使用された。最終的に、ｉｎ ｖｉｖｏの治療効果は、濃度およびサイズの関数としての細胞内温熱療法を誘導するために、単分散のＭＮＰについて比較した。

材料及び方法

化学物質塩化鉄（ＩＩＩ）無水物（９８％）を、Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒから購入した。オレイン酸（工業銘柄、９０％）、１−オクタデセン（工業銘柄、９０％）、ポリ（無水マレイン酸−ａｌｔ−１−オクタデセン）（Ｍｎ＝３０，０００〜５０，０００）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）−Ｆ１２７（Ｍｎ＝１２，６００）、メトキシポリ（エチレングリコール）（Ｍｎ＝５，０００）及びエチレンジアミンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。Ｎ−スクインイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（９９＋％）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。

Ｆｅ_３Ｏ_４磁化ナノ粒子（ＭＮＰ）の合成。磁化ＭＮＰは、金属脂肪酸塩、特に、Ｆｅ^３＋オレイン酸塩に基づく手順によって、合成した。Ｆｅ^３＋オレイン酸塩は、従来の方法で調製し、１−オクタデセン（ＯＤＥ、工業銘柄９０％）内に、ストックソリューション（濃度、１８重量％）で保存した。方法は、直径の範囲が１０〜２５ｎｍである高度に単分散なＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子の再現性のある合成を、事前に画定した量のＦｅ^３＋オレイン酸塩及びオレイン酸（工業銘柄９０％）をＯＤＥ内で反応させることによって、開発した。例えば、１５ｎｍ粒子の合成は、２．５ｇの反応溶媒（ＯＤＥ）中で、０．２ｍｍｏｌ／ｇのＦｅ^３＋オレイン酸塩及び３ｍｍｏｌのオレイン酸を使用した。混合物は、ブランケット下で激しく攪拌しながら、３２０℃で一晩（≧２４時間）還流した。ナノ粒子の核形成が透明から黒への色の急激な変化として観察された。最終生成物を収集し、過剰量の界面活性剤及び溶媒を除去するために洗浄した。ＭＮＰは、過剰量のクロロホルム及びメタノールの１：１（体積／体積）の混合物を使用して沈殿させ、次に、磁石を使用して分離し、洗浄工程は、少なくとも４回繰り返した。３０分間真空中で乾燥させることにより得たＭＮＰ粉体は、オレイン酸でコーティングし、トルエン又はクロロホルムなどの有機溶媒中で容易に分散できるようになった。Ｘ線回折（ＸＲＤ−Ｒｉｇａｋｕ）は、Ｆｅ_３Ｏ_４の結晶相を確認し、単結晶のサイズを決定するために使用された。振動試料磁力計（ＶＳＭ Ｌａｋｅｓｈｏｒｅ）は、試料の磁気特性を測定するために使用した。

ＰＭＡＯ−ＰＥＧの合成。メトキシ−ポリ（エチレングリコール）（ｍ−ＰＥＧ、Ｍｎ＝５，０００）を、ＰＭＡＯ（Ｍｎ〜３０，０００〜５０，０００）のＰＥＧ化において使用した。ＰＥＧは、非特定のタンパク質吸着を拒否するとして、高度、生体適合性と考えられ、非免疫原性および非毒性である。酸触媒下で、Ｍ−ＰＥＧの水酸基はＰＭＡＯに無水環とエステル結合を形成する。典型的な反応において、２ｇのＰＭＡＯ（〜５０μｍｏｌ）は、２０ｍｌのアセトン中で３．７５ｇのｍ−ＰＥＧ（〜７５０μｍｏｌ）と反応させた。数滴の濃硫酸を、反応を触媒するために加えた。混合物をアルゴン雰囲気中で、５８℃で還流した。２４時間後、混合物を室温まで冷却し、ポリマーを過剰量のＤＩ水中に沈殿させることにより得た。更に、超音波処理及び遠心分離により、数回以上ＤＩ水で洗浄した後、白色のポリマーケーキを２４時間凍結乾燥させた。最終生成物を、白色粉体として得て、室温で保管した。ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を、ＰＥＧ化後の分子量の増加を確認するために使用した。

ＰＭＡＯ−ＰＥＧを使用した疎水性ＭＮＰの相移動。典型的な相移動工程において、約１０ｍｇのオレイン酸コーティングされたＭＮＰ（ＭＮＰ＠ＯＡ）及び、１０ｍｇのＯＭＡＯ−ＰＥＧを、１〜２ｍｌのクロロホルム中に溶解させた。混合物を、約１５分間、超音波浴中で超音波処理し、アルゴン流下で乾燥させた。乾燥させたナノ粒子−ポリマー複合体を、３０分間の超音波処理工程によって、１ｍｌの１ｘトリス−アセテート−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液中に分散させた。ＭＮＰコーティングしたＰＭＡＯ−ＰＥＧ（ＭＮＰ＠ＰＭＡＯ−ＰＥＧ）を、０．４５μｍナイロンシリンジフィルターを使用してろ過した。過剰量の未結合ポリマーを除去するために、ＭＮＰ＠ＰＭＡＯ−ＰＥＧを、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＴＭ Ｓ−２００ＨＲゲルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｄｅｓ）に通過させた。脱イオン（ＤＩ）水又は、１ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、溶離液として使用した。ナノ粒子を、更に使用するまで、４℃で保存した。鉄濃度は、誘導カップルプラズマ原子発光分光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ、Ｊａｒｒｅｌｌ Ａｓｈ ９５５）を使用して、測定した。

コロイド安定性測定。ＭＮＰ＠ＰＭＡＯ−ＰＥＧのコロイド特性を理解するために、ゼータ電位及び流体力学的サイズの測定を、動的光散乱（ＤＬＳ）法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｏ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して行った。生物学的関連性については、流体力学的サイズの測定は、細胞培養培地中で行われた。

細胞毒性研究。Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ−細胞白血病細胞株）を、生理的条件（３７℃及び５％ＣＯ_２）で、ＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ウシ胎仔血清中で育てた。補完的なアッセイは、細胞の生存率と誘導される毒性の間に合理的な相関関係がある確認するために実施された。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイ（Ｃｙｔｏｔｏｘ−ＯＮＥ(R)、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、膜の崩壊による媒体中のＬＤＨ放出を測定することにより細胞にＭＮＰの毒性を決定するために使用した。細胞生存率を、ルシフェラーゼアッセイ（Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−ＧＬＯ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定し、ＡＴＰレベルを測定する。細胞は、９６ウェルプレート中に、２，０００細胞／ウェルで播種した。１５０μｇＦｅ／ｍｌのＭＮＰ濃度、３００μｇＦｅ／ｍｌ及び４５０μｇＦｅ／ｍｌを、生理学的条件中で、２４時間試験した。適切な対照を、アッセイの妥当性及び、アッセイに用いられたＭＮＰ又は培地の任意の干渉を評価するために含めた。マイクロプレートリーダーを、λｅｘ＝５６０ｎｍ及びλｅｘ＝５９０ｎｍでのＬＤＨアッセイについて、蛍光度を測定するために使用し、ルミノメーター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）は、ルシフェラーゼアッセイにおける発光を測定するために使用した。

ｉｎ ｖｉｖｏでの温熱療法。周波数ｆ＝３７３ｋＨｚ及び振幅Ｈｏ＝１４ｋＡ／ｍの交流磁場（ＡＭＦ）を、専用の市販の温熱療法システム（ｍａｇｎｅＴｈｅｒｍ（商標）、ＮａｎｏＴｈｅｒｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＫ）を使用して生成した。Ｊｕｒｋｅｔ細胞は、１０，０００細胞／ウェルの密度で、トリプリケートで培養した。様々な濃度の三つのサイズ（１２，１３及び１６ｎｍ）のＭＮＰを、培養した細胞に加えた。ＡＭＦ加熱の前に、試料及び対照を、温度を安定化させるために１５分間、３７℃でインキュベートした。試料は、測定器のコイルアセンブリに挿入する前に、断熱Ｓｔｙｒｏｆｏａｍ（商標）ジャケットで囲んだ。ＡＭＰ増幅の１５分間後、試料を、３７℃のインキュベータに戻した。Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼアッセイを使用して、細胞生存率を比較した。

結果

Ｆｅ_３Ｏ_４ＭＮＰの特性。合成したＭＮＰを、ＴＥＭ撮像による特徴付けとして高度に単分散した。ＰＭＡＯ−ＰＥＧでのコーティング前後のＭＮＰの流体力学的サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して測定した。ＶＳＭ測定値からの磁化曲線Ｍ（Ｈ）は、Ｃｈａｎｔｒｅｌｌ法を使用して、中央値磁気コアサイズ及び体積加重サイズ分布を得るために、ラジュバン関数に適合させた。対数正規分布を仮定して、平均直径及び対応する標準偏差を、表３に示す。磁性特性は、有機から水相へ移転した後、１２ｎｍの試料の例について、コーティングの前、後、及び５ヶ月後に再確認した。

合成されたままのＭＮＰの粉末Ｘ線回折θ〜２θスキャンを図９に示す。スキャンは、マグネタイトについての粉末回折ファイル（ＰＤＦ）（＃０１９〜０６２９、回折データに関する国際センター）と、良好な一致を示す。図中に示されるように、二つのサイズのＭＮＰについてのスキャンはが含まれている（上部及び中間部）。比較的小さな粒子（＜１５ｎｍ）が、形状がほぼ球体（ＴＥＭデータ示さず）であるため、球体幾何学について計算するＳｃｈｅｒｒｅｒ式の修正版を、比較的小さな粒子（上部スペクトル）の結晶サイズを決定するために使用した。一般化された形態が、ファセットによって特徴付けられる、それらの顕著な非球面幾何学のために、比較的大きなＭＮＰ（中間部スキャン）のために使用された。３５．４２°（θ＝１７．７１°）におけるピークが、全ての結晶子サイズの計算のために選択された。計算した結晶サイズは、上部及び中間部スキャンについて、それぞれ、１３．７ｎｍ及び１６．９ｎｍである。これらは、Ｃｈａｎｔｒｅｌｌ適合法によって決定した対応する磁気直径、それぞれ、１２．９ｎｍ及び１５．９ｎｍと、良く一致している。

コロイド安定性。ＭＮＰは、ＰＭＡＯ−ＰＥＧ（図１０（Ａ））でコーティングした後に、優先的に水相に分散させ、数ヶ月間、物理的な凝集又は凝集体の兆候を示さなかった。長期間の水中のＭＮＰのコロイド安定性は、ｐＨの関数としてのゼータ電位（図１０（Ｂ））の測定によって決定した。ＭＮＰは、ｐＨ値（２〜１２）の広い範囲にわたって、中性表面電荷を表示する。更に、生物学的関連性について、流体力学的サイズの測定は、ｉｎ ｖｉｖｏ実験中のＭＮＰの安定性を確保するために、細胞培養培地中で行われた（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ ＦＢＳ）（図１０（Ｃ））。ＭＮＰは、ＲＰＭＩ １６４０培地中でのインキュベーションの９６時間の間に、流体力学的サイズに有意な変化を示さない。

細胞毒性。図１１は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＭＮＰ＠ＰＭＡＯ−ＰＥＧ細胞毒性の結果を示す。補完的な生存率（ルシフェラーゼアッセイ）及び毒性（ＬＤＨ放出アッセイ）の研究が、実施されたアッセイの妥当性を確認するために行われた。計算の誤差以内の同様のレベルが、高い濃度（３００及び４５０μｇＦｅ／ｍｌ）を維持している一方、細胞生存率は、試験した最低濃度（１５０μｇＦｅ／ｍｌ）について、約７５％低下する。毒性測定において観測された傾向は、生存率の測定において観察されるものと合理的によく一致している。更に、ＭＮＰと共にインキュベートした細胞の明視野画像は後続の形態学的変化を調べるためにキャプチャされた（図１２Ａ〜Ｈ）。Ｊｕｒｋｅｔ細胞は浮遊細胞であり、球体形状によって示されるように、培養プレートに付着していない（図１２（Ａ＆Ｅ））。細胞構造及び形状は、全ての濃度のＭＮＰについての対照（ＭＮＰを含まない）と、一致している（図１２（Ｂ〜Ｄ）＆（Ｆ〜Ｈ））。

磁性流体温熱療法。様々なサイズのＭＮＰ（表３）を、専用温熱療法システム内の特定の損失電力（ＳＬＰ、ワット／ｇ）について試験した。ＡＭＦの周波数及び振幅を、それぞれ、３７３ｋＨｚ及び１４ｋＡ／ｍに設定した。光ファイバは熱電対（Ｌｕｘｔｒｏｎ、ＬｕｍａｓｅｎｓｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、試料中の温度上昇速度（ｄＴ／ｄｔ）を測定するために用いた。ＳＬＰは、以下の式を使用して測定した：
式中、ｃは水の比熱容量（４．１８７Ｌ ｇ^−１℃^−１）である。０．１７５及び０．２６６という平均の標準偏差を備える二組の試料を、特に出力のサイズとサイズ分布の両方の影響を特徴づけるために測定した。このような特徴は、特定の周波数に対して適合かしたサイズの信号を強調することを意図し、したがって、本質的に材料の観点からＭＦＨを最適化するのではなく、濃度や電界振幅などの外的因子を増強する。図１３は、狭い平均サイズ分布を備えるＭＮＰについての１６ｎｍでのＳＬＰにおける明瞭なピークを示す。ＳＬＰ値は、広い平均サイズ分布を備える試料について、約３０％低下する。低下は、１６ｎｍ粒子、３７３ｋＨｚ磁場についてのピーク直径について特に大きい。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ温熱療法。磁性流体温熱療法のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果について研究するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞内のＡＴＰレベルを、代謝活性や細胞の生存率の指標として比較した。一般的に、ＭＦＨを経験する細胞は、対照（ＭＦＨ無し）と比較して、生存率の減少を示した。この傾向は、増加するＭＮＰ濃度と一致していた（図１４）。三つの異なる直径の単分散ＭＮＰを比較した。１６ｎｍのＭＮＰ、ＳＬＰデータに従って、我々が選択した最適なＡＭＦ（図１３）を、１２及び１３ｎｍのＭＮＰと比較した。生存率の減少は、１２及び１３ｎｍのＭＮＰと比較して、１６ｎｍのＭＮＰについて顕著に大きい（図１５）。また、ＭＮＰ濃度は、１２及び１３ｎｍ試料と比較して、１６ｎｍ試料について僅かに低い。

議論

ＴＥＭ及び分析は、Ｆｅ３Ｏ４ ＭＮＰが、それぞれ、高度に単分散性及び単相であることを示していた。更に、ＭＮＰの磁気特性は優れており、飽和磁化は、１６ｎｍＭＮＰ（即ち、マグネタイト（約９０ｅｍｕ／ｇ）についてのバルクの飽和値の約８３％）についての７５ｅｍｕ／ｇと同じ高さまで達している。試料の総飽和磁化に寄与しないＭＮＰの表面上の無秩序スピンの約０．５ｎｍの層が存在するために、超常磁性粒子は、バルクと比較して、しばしば低い飽和値を有する。また、これは、ＸＲＤスペクトルから決定した結晶直径が、何故、Ｃｈａｎｔｒｅｌｌ法によって決定した磁気コア直径よりも約１ｎｍ大きいのかについて説明している。両親媒性ＰＭＡＯ−ＰＥＧポリマー使用して、有機から水相へ移動した後、ＭＮＰは、水に非常に優れた安定性（例えば、１年まで）を示し、５ヶ月のテスト期間に、その優れた磁気特性を保持する。Ｃｈａｎｔｒｅｌｌ法を使用して決定した磁気コア直径は、ＭＮＰが、相移動した後であってもほぼ単分散のままであることを確認し（表３）、相移動のプロセスの間に凝集は無かった。ｐＨの関数としてのゼータ電位は、ＭＮＰが広いｐＨ範囲（２〜１２）に渡って、中性付近の表面電荷を示すことを示している。これは、ＭＮＰが、主に表面ＰＥＧ層に起因する、立体反発を介して安定化し、少ない吸着形式荷電蛋白質になりやすいまたは、一般的には、非免疫原性であることを示している。細胞培養培地中で実施された流体力学的サイズ測定値（表１０Ｃ）は、生物学的関連性を強調する。培養培地中における粒子の凝集について、緩和のブラウン構成要素は、流体力学的体積に依存しており、ブロックされ得、全体的なＳＬＰ出力を低下させる。ＭＮＰ＠ＰＭＡＯ−ＰＥＧは、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ細胞培養培地において、９６時間までと、比較的安定であり、粒子の凝集によるSLPの出力、その結果として減少が予期されていないことを示唆している。

細胞毒性の結果は、ＭＮＰが、Ｊｕｒｋａｔ細胞内において比較的低い固有毒性を示すことを確認する。典型的に、ヒトの体の中に貯蔵される鉄の総量は、約３５００ｍｇであり、画像診断のために使用される鉄酸化物の総量は、比較的小さい（〜５．６μｇＦｅ／ｍｌ）。我々の細胞毒性実験において使用した最大濃度（最大４５０μｇＦｅ／ｍｌ）は、我々が実際に生体内で使用しているものよりもはるかに大きい。これは、我々が現在臨床的に試みたレベルを超えて細胞傷害性について測定されることを保証している。全体的に、生存率、毒性アッセイの両方が計算された誤差の範囲内で合理的にお互いを補完する。２０Ｘ及び６０Ｘｎｏ倍率における明視野の細胞画像（図１２）は、全体的な細胞形態を様々な濃度ＭＮＰで２４時間インキュベートした後も保持されていることを確認する。

サイズ及びサイズ分布の両方の関数（図１３）としての包括的な実験のＳＬＰデータは、選択されたＡＭＦ条件（３７３ｋＨｚ及び１４ｋＡ／ｍ）について、１６ｎｍの単分散ＭＮＰが、最適なＳＬＰを示すことを示している。さらに重要なのは、ＭＮＰの大きさの関数としての加熱における明確なピークが初めて実証されている。更に、広い平均サイズ分布を備えるＭＮＰは、ＳＬＰ値における全体的な低下を示す。ここに示された実験データは、ＭＦＨの理論モデル、特にサイズ調整された、最大のＳＬＰについての単分散ＭＮＰの必要性に強い正当性を提供している。

細胞死を誘導するＭＦＨのｉｎ ｖｉｖｏの治療効果が、ＭＮＰ濃度及びサイズの両方の関数として、Ｊｕｒｋｅｔ細胞を用いた加熱実験において実証された（図１４及び１５）。予期したとおり、ＭＮＰ濃度の増加は加熱率を増加させ、結果として、生存率％における削減も恒常されている（図１５）。前述したように、外因性パラメータである、ＭＮＰ濃度の増加によるＭＦＨの促進は、ＭＦＨの全体的な治療効力の改善を示すものではない。鍵となる結果は、しかしながら、同じＡＭＦ条件下における、１２ｎｍ及び１３ｎｍのＭＮＰと比較して、最適な１６ｎｍのサイズのＭＮＰによる、生存率％の顕著な減少である。この結果（図１５）は、本質的にＭＦＨの治療効果を改善するために、特定の周波数のためにサイズを調整の中心的な考え方を強調している。

体系的な実験は、最適な磁化特性を備え、具体的な交流磁場の周波数（ｆ＝３７３ｋＨｚ）に合わせられたＭＮＰが、ＭＦＨにおける促進を示し得ることを示している。特に、ＭＮＰサイズの関数としての加熱率又はＳＬＰ中のピークが明確に実証されており、ｉｎ ｖｉｖｏ加熱は、最適化されたＭＮＰ（１６ｎｍ）及び狭いサイズ分布（ＳＬＰにおける３０％の変化は、σ約０．１７５＝σ約０．２６６で観察される）は、減少した細胞生存率において最大の効果を有していることを示し、我々のＳＬＰデータが細胞群へ変換されていることを示唆している。このすべては、有機合成の経路を介して単分散ＭＮＰを合成することによって達成され、首尾よく生体適合性両親媒性ポリマーを使用して水相に移動させることができる。特性化プロトコルは、ＭＮＰが、以下の基準を満たしていることを保証する：（１）均一な形状と単分散、（２）相純度、（３）バルクのそれに近い安定した磁気特性、（４）コロイド安定性、（５）実質的な貯蔵寿命、及び（６）ｉｎ ｖｉｖｏでの有意な毒性を示さない。これは、任意の与えられた周波数におけるＭＦＨについて最適な成体適合性ＭＮＰを、調整／合成するための方法を提示している。

Claims (32)

1. 磁性ナノ粒子の組成物であって、
   狭いサイズ分布を有する磁性ナノ粒子の個体群を含み、
   前記個体群における前記磁性ナノ粒子の約７０％以上が、中位径から１０．５ナノメートル（ｎｍ）未満の直径を有する、磁性ナノ粒子組成物。
2. 前記狭いサイズ分布が、磁気測定または動的光散乱（ＤＬＳ）で測定した、体積加重関数に従う、請求項１に記載の組成物。
3. 前記狭いサイズ分布が、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で測定した、個数加重型関数に従う、請求項１に記載の組成物。
4. 前記狭いサイズ分布が、約１．３５未満の乗法標準偏差を含む対数正規分布に従う、請求項２に記載の組成物。
5. 前記個体群における前記磁性ナノ粒子の約７０％以上が、前記中位径から８．８ｎｍ未満の直径を有する、請求項２に記載の組成物。
6. 前記狭いサイズ分布が、中位径及び約１．２２未満の乗法標準偏差である、対数正規分布に従う、請求項２に記載の組成物。
7. 前記個体群中の前記磁性ナノ粒子の約７０％以上が、前記中央値加重直径を有する、請求項３に記載の組成物。
8. 前記狭いサイズ分布が、中位径及び約１．１１未満の乗法標準偏差を含む、請求項３に記載の組成物。
9. 前記磁性ナノ粒子の個体群が、約１２ｎｍ〜約３０ｎｍの範囲の中位径を含む、請求項１に記載の組成物。
10. 前記磁性ナノ粒子の個体群が、水溶液中で約３０ｎｍ〜約１００ｎｍの流体力学的中位径を含む、請求項１に記載の組成物。
11. 前記磁性ナノ粒子の個体群の少なくとも一つの磁性ナノ粒子が、両親媒性ポリマーで被覆された、マグネタイト（Ｆｅ３４）コアを含む、請求項１に記載の組成物。
12. 前記磁性コアがマグネタイトの単一の、無欠陥結晶である、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記両親媒性ポリマーが、エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロック共重合体、ポリエチレンオキシドポリマー、ポリエチレングリコールポリマー、ポリ（無水マレイン酸ａｌｔ−１−オクタデセン）ポリマー及びポリ（無水マレイン酸ａｌｔ−１−オクタデセン）−ポリエチレングリコールポリマー（ＰＭＡＯ−ＰＥＧ）からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
14. 前記磁性ナノ粒子の個体群が、
    前記鉄の前駆体に対する界面活性剤のモル比が、１０：１よりも大きい鉄の前駆体と有機溶媒中の界面活性剤を組み合わせるステップと、
    磁性ナノ粒子の第一の個体群を形成するために、前記有機溶媒中で前記鉄の前駆体及び前記界面活性剤を過熱するステップと、
    前記第二の個体群の前記磁性ナノ粒子が、前記両親媒性ポリマーを含み、且つ、前記磁性ナノ粒子の第二の個体群が、前記狭いサイズ分布を有し、水溶液中で分散性である、磁性ナノ粒子の第二の個体群を形成するために、前記磁性ナノ粒子の第一の個体群と両親媒性ポリマーを組み合わせるステップ、
    と、を含む方法によって生成される、請求項１に記載の組成物。
15. 磁性ナノ粒子の個体群を製造する方法であって、前記方法が、
    前記鉄の前駆体に対する前記界面活性剤のモル比が１０：１以上である、鉄の前駆体溶液を形成するために、有機溶媒中で鉄の前駆体及び界面活性材を組み合わせることと、
    前記磁性ナノ粒子の第一の個体群を形成するために、前記鉄の前駆体溶液を過熱することと、
    前記磁性ナノ粒子の第二の個体群が前記両親媒性ポリマーを含み、且つ、前記磁性ナノ粒子の第二の個体群が狭いサイズ分布を有し水溶液中で分散性である、前記磁性ナノ粒子の第一の個体群と両親媒性ポリマーを、磁性ナノ粒子の第二の個体群を形成するために組み合わせることと、
    を含む、磁性ナノ粒子の個体群を製造する方法。
16. 前記磁性ナノ粒子の第二の個体群が、前記磁性ナノ粒子の第一の個体群よりも狭いサイズ分布を有する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記鉄の前駆体溶液を、アルゴン又は窒素雰囲気下でパージすることを更に含む、請求項１５に記載の方法。
18. 前記鉄の前駆体溶液を過熱することが、傾斜温度過熱段階及び安定温度過熱段階を含み、前記傾斜温度過熱段階及び安定温度過熱段階の組合せの反応時間が、２０時間以上である、請求項１５に記載の方法。
19. 前記鉄の前駆体が、式：Ｆｗ^３＋（Ｒ^１）_３を有し、前記Ｒ１が置換若しくは非置換の飽和Ｃ１〜Ｃ２４カルボン酸であるか、又は、置換若しくは非置換の不飽和Ｃ_１〜Ｃ_２４カルボン酸である、請求項１５に記載の方法。
20. 前記鉄の前駆体が、Ｆｅ^３＋−オレイン酸塩である、請求項１５に記載の方法。
21. 前記界面活性剤が、カルボン酸、アルキルホスフィン、置換若しくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_２４アルカン、置換若しくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_２４アルケン、又はそれらの任意の組合せである、請求項１５に記載の方法。
22. 前記カルボン酸が、置換若しくは非置換飽和Ｃ_１〜Ｃ_２４カルボン酸、又は、置換若しくは非置換不飽和Ｃ_１〜Ｃ_２４カルボン酸である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記アルキルホスフィドが、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）である、請求項２１に記載の方法。
24. 前記鉄の前駆体に対する界面活性剤のモル比が、１０：１〜３０：１の間である、請求項１５に記載の方法。
25. 前記有機溶媒が、置換若しくは非置換Ｃ１〜Ｃ２４アルカン、又は、置換若しくは非置換Ｃ１〜Ｃ２４アルケンである、請求項１５に記載の方法。
26. 前記有機溶媒が、オクタデセン又はオレイルアミンである、請求項２５に記載の方法。
27. 前記両親媒性ポリマーが、エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマー、ポリエチレンオキシドポリマー、ポリエチレングリコールポリマー、ポリ（無水マレイン酸のａｌｔ−１−オクタデセン）ポリマー及びポリ（無水マレイン酸ａｌｔ−１−オクタデセン）−ポリエチレングリコールポリマー（ＰＭＡＯ−ＰＥＧ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
28. 磁性ナノ粒子を撮像するための方法であって、前記方法が、
    磁性ナノ粒子の個体群を被験者へ投与することであって、前記磁性ナノ粒子が狭いサイズ分布を有することと、
    撮像システムの前記磁性ナノ粒子の個体群における、少なくとも一つの磁性ナノ粒子を励磁すること
    と、を含む、磁性ナノ粒子を撮像するための方法。
29. 前記撮像システムが、磁性粒子撮像（ＭＰＩ）又は磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）を実施するために構成される、請求項２８に記載の方法。
30. 磁気温熱療法を行う方法であって、前記方法は、
    磁性ナノ粒子の個体群を被験者に投与することであって、前記磁性ナノ粒子の個体群は狭いサイズ分布を有していることと、
    前記磁性ナノ粒子の個体群における、前記磁性ナノ粒子の内の少なくとも一つの近くの細胞を加熱すること
    と、を含む、磁気温熱療法を行う方法。
31. 磁性粒子撮像のためにチューニングされたサイズ分布を備える磁性ナノ粒子を製造する方法であって、前記方法は、
    磁性粒子撮像において使用される周波数で最大の信号を生成する磁性ナノ粒子の直径を選択することと、
    およそ、前記最大の信号を生成する前記磁性ナノ粒子の前記選択された直径の中位径を有する、磁性ナノ粒子の個体群を製造することであって、前記磁性ナノ粒子の前記個体群が狭いサイズ分布を有すること
    と、を含む磁性粒子撮像のためにチューニングされたサイズ分布を備える磁性ナノ粒子を製造する方法。
32. 磁性粒子撮像のためにチューニングされたサイズ分布を備える磁性ナノ粒子を製造する方法であって、前記方法は、
    磁性粒子撮像において使用される周波数で最大の空間解像度を生成する磁性ナノ粒子の直径を選択することと、
    およそ、前記最大の空間解像度を生成する前記磁性ナノ粒子の前記選択された直径の中位径を有する磁性ナノ粒子の個体群を製造することであって、前記磁性ナノ粒子の前記個体群が狭いサイズ分布を有すること
    と、を含む磁性粒子撮像のためにチューニングされたサイズ分布を備える磁性ナノ粒子を製造する方法。