JP2003522324A - 内部標準イムノアッセイおよび試験装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 サンプル中の分析物の存在を検出する方法および装置であって：ａ）サンプルを、分析物に対して結合特異性を有する結合試薬および試験区域内に配置された分析物受容体と接触させて、結合試薬、分析物および分析物受容体を含む第１の複合体を作製し、第１の複合体が試験信号を与えることと；（ｂ）サンプルに標準リガンドを接触させて、標準リガンドに対する特異性をさらに有する結合試薬および標準リガンドを含む第２の複合体を作製し、第２の複合体が標準信号を与えることを含み、ここで標準リガンドが標準区域内にあり；これによって標準信号に対する試験信号の比が、サンプル中の分析物のレベルを定義し、このレベルがサンプルに接触した結合試薬の量とは無関係である方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、特異性結合を含む免疫学的測定法およびそのような検定法を実施す
る試験装置に関する。特に本発明は、内部標準を含む検定法の結果として再現性
の向上をイムノアッセイ（および試験装置）に関する。アッセイのキャリブレー
ションを可能とするこの内部標準によって、アッセイ結合試薬の量におけるバラ
ツキが明らかとなる。

【０００２】 （発明の背景） サンプル中のある分析物の存在を検出する抗体型分子の特異的結合特性を利用
するイムノアッセイが当業界で既知である。本来、そのようなイムノアッセイは
、検定および１以上の抗体型分子より成る複合体が生成するように、サンプルを
各種結合試薬に接触させて、その後ひき続いて、表面上または溶液中の複合体の
有無を検出することによって機能する。

【０００３】 イムノアッセイは、測定するよう設計された分析物の種類および／または使用
される特定の診断設定によって、多数の具体的な形式のいずれを取ってもよい。
たとえばイムノアッセイは本質的には、競合的にも非競合的（すなわち「サンド
イッチ型」）にもなることがあり、どちらも文献でかなり詳細に述べられている
。加えて、イムノアッセイは各種の結合試薬を含み、そのように結合試薬の数と
種類の両方が豊富であることによって、各種分析物に対する検定の選択性および
感度を調節する手段が与えられる。イムノアッセイは、たとえばヒトの肉眼で見
える信号、または複雑な監視機器の補助によってのみ測定可能な信号など、各種
の検定信号を与えるような方法で作製されることもある。

【０００４】 上述のことが示すように、現在、市販で利用されているイムノアッセイは複雑
な診断ツールである。したがって、同一の検定装置を使用する場合でも、同一分
析物の各種試験には多様性が存在する可能性が大きい。大半のアッセイは少なく
とも一部は、温度、展開時間、インキュベーション、サンプルサイズおよび試薬
安定性に対して感受性であり、それぞれが変化した場合、可変性の、それゆえ許
容できない結果が生じることがある。イムノアッセイにおける誤差の考えられる
別の原因は、所与のサンプルが曝露される結合試薬の量が変化することである。
このため、そのような試薬のレベルを内部標準すること、そして連続する検定試
験ではそのレベルの変化を補正することが望ましい。

【０００５】 この点に関して、Ａｔｔｒｉｄｇｅら、ＷＯ ９２／０９８９２、Ｇｕｎａｒ
ｓら、ＡＵ−Ａ−７０４４７／８７およびＬｉｔｍａｎら、ＥＰ−Ａ−００９３
６１３はすべて、試験結果の可変性を補正できる内部標準の形式を含むイムノア
ッセイについて述べている。特にＥＰ−Ａ−００９３６１３は、測定表面および
校正表面を利用するイムノアッセイ（および試験装置）について述べている。測
定表面は、特異性結合対複合体形成による、接合体の表面への結合を含み、この
場合、接合体は２つの異なる成分、すなわち特異性結合対のメンバーに結合した
信号生成系のメンバーを含む。それに対して校正表面は、初期に、または特異性
結合対複合体生成に仲介されて、表面に結合した信号生成メンバーを含み、特異
性結合対は測定表面の結合対とは異なる。

【０００６】 ＥＰ−Ａ−００９３６１３は内部標準を規定しているが、明白な欠点のある方
法で規定している。ＥＰ−Ａ−００９３６１３は競合的または非競合的検定形式
のいずれかで、多数の各種特異性結合対メンバーの作製を必要とし、各メンバー
は、温度または他の試験条件が変化した場合、変性による不活性化を別個に受け
る。そのような不活性化は、試験結果において許容できない可変性につながるた
め、明らかに望ましくない。

【０００７】 ＷＯ ９２／０９８９２およびＡＵ−Ａ−７０４４７／８７で述べられた内部
標準イムノアッセイも同様に、これらと同じ欠陥を示す。

【０００８】 （発明の開示） したがって、上述の欠点を克服できるイムノアッセイを提供し、そのようなイ
ムノアッセイを実施できる分析試験装置を提供することが望ましい。この点で、
本発明はサンプル中の分析物の存在を検出する方法を提供し、該方法は以下の工
程を含む： ａ）サンプルを結合試薬および分析物受容体と接触させて、該結合試薬、分析
物および分析物受容体を含む第１の複合体を作製する工程（第１の複合体は試験
信号を提供し、分析物受容体は試験区域内に配置され、分析物に結合可能であり
、結合試薬が分析物に対して結合特異性を有する）； ｂ）サンプルを標準リガンドに接触させて、該結合試薬および標準リガンドを
含む第２の複合体を作製する工程（標準リガンドは標準区域内に配置され、さら
に結合試薬が標準リガンドに対する結合特異性を有する）；および ｃ）試験および標準区域から試験および標準信号を検出する工程（それにより
標準信号に対する試験信号の比を得ると、サンプル中の分析物のレベルが規定さ
れ、但しそのようなレベルがサンプルに接触した結合試薬のレベルとは無関係で
ある）。

【０００９】 第１の分析物を作製するためにサンプルが曝露される結合試薬、および分析受
容体への分析物の特異性結合によって、液体生体サンプル中の分析物の存在を検
出する分析試験装置も考慮され、ここで結合試薬は抗体または多価抗原結合タン
パク質より選択され、該結合試薬および多価抗原結合タンパク質はそれぞれ、第
１および第２のドメイン結合単位を含む。ここで第１のドメイン結合単位は分析
物に対する結合特異性を与え、第２のドメイン結合ユニットは標準リガンドに対
する結合特異性を提供する；装置は第１および第２の固体支持体を含み、第１の
固体支持体は標準区域を含み、標準区域はその上に標準リガンドを可逆的に固定
し、標準リガンドは結合試薬に結合すると第２の複合体を生成する。第２の複合
体は、サンプルに曝露される結合試薬の量のバラツキを補正する手段である、標
準信号を与える；第２の固体支持体は試験区域を含み、試験区域はその上に分析
物受容体を可逆的に固定し、試験区域は分析物および結合試薬に結合すると、試
験信号を与える第１の複合体を生成する。

【００１０】 本発明のイムノアッセイは、正確で再現性のある試験結果を得られ、臨床また
は家庭検査市場などの営利市場にこの上なく適した、構成すべき検定装置を規定
する。該イムノアッセイは、従来技術固有の問題を避けるよう特別に作製された
結合試薬を使用して内部標準される。結合試薬は１個の分子上に、分析物測定お
よび内部標準に必要な２個のドメイン結合ユニットを有するため、試験条件の変
化によって検定成分が変性する機会が減少するため、試験結果の可変性が最小限
となる。さらに、本発明で利用する結合試薬は２以上の分子の複合体ではなく１
個の分子に過ぎないため、たとえ変性がおこっても、分子全体が変性すると考え
られることから、標準信号に対する試験信号の比は影響を受けない。

【００１１】 （図の簡単な説明） 図１は、配列番号１のアミノ酸配列である、２個の結合部位、１個はヒト絨毛
性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）用、１個は反応性レッド６染料用を含む、ラマバイ
ヘッドグリーン蛍光タンパク質結合試薬を示す。

【００１２】 図２は、配列番号２のアミノ酸配列である、２個の結合部位、すなわち１個は
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）用、１個はグルコースオキシダーゼ（ＧＯ
ｘ）用を含む、ダブルヘッド抗体結合試薬を示す。

【００１３】 （発明の詳細な説明） 本発明のイムノアッセイは、任意の数の既知の分析物の存在を判定するのに用
いられる。代表的な分析物としては薬剤、代謝分析物（たとえば酵素）、タンパ
ク質、核酸または炭水化物が挙げられる。あるいは分析物は、アレルゲン（たと
えばホコリダニの糞）、細菌（たとえばクラミジアまたはサルモネラ）あるいは
ウィルス粒子またはその成分などの巨大分子または粒子体であるか、あるいは菌
または細菌胞子などの他の微生物である。とりわけ興味深いのは、ホルモン分析
物、特にエストロン−３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）、プレグナンジオール−３−
グルクロニド（Ｐ３Ｇ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、黄体形成ホル
モン（ＬＨ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）などの性および／または生殖ホ
ルモンおよびその類似体である。

【００１４】 尿、血清、涙、唾液、頚部液、涙液または尿道液などに由来する液体生体サン
プルおよび大便サンプルが最も一般的に使用されるが、イムノアッセイは、実質
的にどの種類の生体または非生体サンプルにも適用できる。本発明の検定に適し
た他のサンプルとしては、液体または固体食品サンプルおよび工業環境によるサ
ンプルが挙げられる。サンプルは精製または希釈してから検定する。

【００１５】 細菌またはウィルス分析物を含むサンプルを使用する場合、最初に細菌またウ
ィルスから興味のある分析物を抽出できる抽出緩衝液にサンプルを接触させる必
要がある。抽出は、両性イオン洗浄剤または非イオン性洗浄剤を用いるなど、既
知のどの手段で行ってもよい。

【００１６】 いったん適切なサンプルが確認されたら、本発明のイムノアッセイを用いて、
サンプル中の特定の分析物の有無を確認することができる。これは以下によって
行う： ａ）サンプルを結合試薬および分析物受容体と接触させて、該結合試薬、分析
物および分析物受容体を含む第１の複合体を作製する工程（第１の複合体は試験
信号を提供し、分析物受容体は試験区域内に配置され、分析物に結合可能であり
、結合試薬が分析物に対して結合特異性を有する）； ｂ）サンプルを標準リガンドに接触させて、該結合試薬および標準リガンドを
含む第２の複合体を作製工程（標準リガンドは標準区域内に配置され、さらに結
合試薬が標準リガンドに対する結合特異性を有する）；および ｃ）試験および標準区域から試験および標準信号を検出する工程（それにより
標準信号に対する試験信号の比を得ると、サンプル中の分析物のレベルが規定さ
れ、但しそのようなレベルがサンプルに接触した結合試薬のレベルとは無関係で
ある）。

【００１７】 本検定の結合試薬は、２つの別個の結合特異性、すなわち１つは興味のある分
析物に対する結合特異性、もうひとつは標準リガンドに対する結合特異性を有す
るどの化合物でもよい。結合特異性とは、結合試薬が、大量の興味のない他の物
質の存在下で選択的な方法で、有用な検定となるために十分緊密に（十分に高い
親和性によって）興味のあるエピトープに結合可能なことを意味する。特異性結
合を示す標準試薬の例としては、ある種の細菌のみに結合し、他の種の細菌には
結合しない抗体が挙げられる。「別個の」とは、結合試薬が、生じた２つの結合
事象の間の立体または他の干渉がわずかであり、結合試薬が両方の分子または部
位に同時に結合する能力に大きな影響を与えないように、２個の異なる分子、ま
たは同一分子上の２個の異なる部位に対して、２つの異なる結合特異性を示すこ
とを意味する。

【００１８】 本発明の好ましい実施形態において、結合試薬は抗体または多価抗原結合タン
パク質より選択され、該抗体および多価抗原結合タンパク質はそれぞれ、第１お
よび第２のドメイン結合単位を含み、ここで第１のドメイン結合単位は分析物に
対する結合特異性を与え、第２のドメイン結合ユニットは標準リガンドに対する
結合特異性を提供する。本明細書で使用されるように、ドメイン結合ユニットは
、本来、完全な抗原結合部位を形成する免疫グロブリン可変性ドメインを意味す
る。

【００１９】 Ｆｖ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖなどの抗体型分子および作製物など、抗体の各種形式
が考えられる。本発明に適した抗体の具体例は、文献で述べられ、１以上のポリ
ペプチド鎖を含む多価および／または多特異性構造を含むか−−たとえば、特許
出願 Ｈａｒｒｉｓら、ＷＯ ９４／０９１３１およびＤａｖｉｓら、ＷＯ ９
７／１４７１９−−あるいは、たとえばＷｈｉｔｌｏｗら、ＷＯ ９３／１１１
６１およびＭｅｚｅｓら、ＷＯ ９４／１３８０６で述べられているように、２
個以上の１価ＳｃＦｖ分子がともに結合している場合に多価が生じ、４以上の可
変ドメインを含む単鎖分子が与えられる、’ダブルＳｃＦｖ’アプローチに基づ
いている。これらの場合すべてで、ドメイン結合単位は軽および重鎖可変ドメイ
ンの会合によって形成される。他の適した結合試薬は、ヒンジジスルフィドによ
って結合された独立ＶＨドメインまたはＶＨダイマーに該当する断片を含め、軽
鎖を含まない重鎖免疫グロブリンの断片を開示している、Ｃａｓｔｅｒｍａｎら
、ＥＰ−Ａ−０５８４４２１で述べられたような抗体に由来する。

【００２０】 本発明の結合試薬は多価抗原結合タンパク質であることが好ましく、さらに好
ましくは、連続に結合されている第１および第２のドメイン結合ユニットを有す
る単一ポリペプチド鎖を含む多価抗原結合タンパク質であることがさらに好まし
い。結合試薬が２価抗原結合タンパク質を含むことが最適である。

【００２１】 多価抗原結合タンパク質を含むドメイン結合単位は、抗原結合部位が重鎖可変
ドメインに排他的に配置されるように、本来、軽鎖を含まない任意の免疫グロブ
リンに由来する重鎖可変ドメインであることが好ましい。好ましくは、重鎖可変
ドメインは、Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、ＥＰ−Ａ−０５８４４２１で述べられてい
るＣａｍｅｌｉｄ（ラクダ科の動物）から得られるような、本来、軽鎖を含まな
い免疫グロブリンに由来する。

【００２２】 限定された抗原特異性を有する軽鎖を本来含まない免疫グロブリンに由来する
重鎖可変ドメインは、たとえばＣａｓｔｅｒｍａｎら、ＥＰ−Ａ−０５８４４２
１およびＦｒｅｎｋｅｎら、ＷＯ ９９／２３２２１で述べられているような従
来の技法を用いて、ｃａｍｅｌｉｄ免疫グロブリンをコード化する遺伝子のクロ
ーン化断片の発現ライブラリをスクリーニングすることによって都合よく得られ
る。

【００２３】 多価抗原結合タンパク質は、それぞれ１個のドメイン結合単位が１以上の他の
可変ドメインに結合されるように、ドメイン結合単位をともに直列に結合するこ
とによって生成される。個々のドメイン結合単位はペプチドリンカーによって順
に結合され、屈曲性のペプチドリンカーによって、ドメインは、複数の抗原決定
基に同時に結合されるように相互に、都合よく屈曲することができる。リンカー
の個々のドメイン結合単位への結合は、ドメイン抗原結合部位の結合能力に影響
を与えない結合であることは認識されるであろう。可変ドメインそれぞれが由来
する免疫グロブリン全体の結合特異性を保持するように、ドメイン結合単位成分
を結合させる、どのペプチドリンカーでも適切に使用される。そのようなリンカ
ーはたとえば、グルコアミラーゼ、セロビオヒドロラーゼなどの既知のタンパク
質に由来するペプチド、または細胞壁タンパク質（ＣＷＰ）、または合成ペプチ
ドが含まれる。リンカーは適切には１〜４００以上のアミノ酸残基を含む；さら
に好ましくは、ペプチドリンカーは５〜２０のアミノ酸残基を含む。

【００２４】 本発明の別の好ましい実施形態において、個々のドメイン結合単位は、仲介リ
ンカーなしで直接直列に結合される。このようにして、本発明で利用される多価
結合タンパク質の結合部位は、免疫グロブリン断片が由来する免疫グロブリン全
体の場合よりも、はるかに近い位置で相互に保持される。

【００２５】 本発明で利用される結合試薬は、標識結合部位であることが好ましい。あるい
は、標識は分析物受容体または標準リガンド上に存在する場合がある。標識によ
って、第１の複合体（すなわち結合された結合試薬、分析物および分析物受容体
）は、サンプル中の分析物の量に直接関連する試験信号を与えることができる。
標識によってさらに、第２の複合体（すなわち結合試薬および標準リガンド）は
、分析物に結合するためにアッセイで利用可能な結合試薬の量に直接関連し、サ
ンプル中の分析物の量とは実質的に無関係である標準信号を与えることができる
。標準信号に対する試験信号の比を取ると、サンプル中の分析物のレベルはただ
ちに決定され、そのようなレベルはサンプルと接触する結合試薬のレベルとは無
関係である。それゆえ、温度、サンプル粘度、サンプルのイオン強度などの環境
および非特異性因子のアッセイ結果に対する影響を緩和することができる。

【００２６】 試験信号および標準信号は、試験および標準表面から任意の既知の従来手段に
よって検出できる。これには、裸眼による評価や、さらに精密な測定が望ましい
場合には適切な計測による評価が含まれる。標準または試験信号が標準または試
験表面での複合体の塊の量によって測定される場合、計測が特に適切である。

【００２７】 本発明の好ましい実施形態において、結合試薬に結合される標識は、存在がた
だちに検出できるどんな実体でもよい。標識は、Ｍａｙら、米国特許第５，６５
６，５０３号で詳細に述べられている標識のように、直接標識であることが好ま
しい。直接標識は、自然の状態で裸眼または光学フィルタおよび／または、蛍光
を促進するためのＵＶ光などの、加えられた刺激などの助けによってただちに見
えるものである。例としては、放射性、化学発光、電気性（酸化還元標識など）
、および蛍光化合物が挙げられる。染料ゾル、金属ゾル（たとえば金）および着
色ラテックス粒子などの直接粒子標識も非常に適切であり、蛍光化合物とともに
好ましい。これらの選択肢のうち、着色ラテックス粒子および蛍光化合物が最も
好ましい。小規模な区域または体積に標識が濃縮されると、ただちに検出可能な
信号、すなわち強く発色した領域が生じることになる。

【００２８】 アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵
素などの間接標識も使用できるが、これらは通常、可視信号が検出される前に、
基質などの１以上の展開試薬を添加する必要がある。それゆえ、これらはあまり
好ましくない。そのような添加試薬は、液体サンプルを加えた場合に溶解または
分散されるように、検査装置の固体支持体に含めることができる。あるいは、サ
ンプルを固体支持体に加える前に、サンプルに展開試薬を加えることもできる。

【００２９】 標識の結合試薬への接合は、共有または非共有（疎水性を含む）結合のどちら
かか、望ましい場合には吸着によっても可能である。そのような接合の技法は当
業界では一般的であり、本発明で使用される特定の結合試薬および標識に即座に
採用される。標識が着色ラテックス粒子である好ましい実施形態において、標識
は吸着によって結合試薬に接合されることが好ましい。標識が蛍光化合物である
場合は、標識が結合試薬に接合するか、結合試薬の一部として作製されることが
好ましい。

【００３０】 本発明の検定で利用される分析物受容体は、興味のある分析物に結合可能など
の化合物でもよく、興味のある分析物に対する結合特異性を示す化合物がさらに
好ましい。分析物受容体は、結合試薬によって結合されるエピトープではなく、
分析物上の異なるエピトープに結合する必要があり、２つの結合事象間の立体お
よび他の干渉結果が最小限となる必要がある。

【００３１】 好ましい実施形態において、分析物受容体は抗体であり、ポリクローナル抗体
も使用されることが特に考えられるが、好ましくはモノクローナル抗体である。
抗体はさらに、Ｆａｂ、Ｆｖなどの機能性抗体と、（またＨＣＶおよびＶＨＨ断
片として当業界で既知である）重鎖可変断片などのさらに小規模なユニットを含
むことがある。これらは、既知の抗体全体から、あるいは抗体または抗体状分子
のライブラリから間接的に、生化学または抗体工学方法によって調製される（た
とえばＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ａｎｄ Ｗｉｎｄｕｓｔ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉ
ｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ： Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ， 第２版、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ刊
、ｐｐ．２８３−３２５（Ｏｘｆｏｒｄ， １９９５）を参照）。

【００３２】 ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、Ｐｒｉｃｅら、Ｐｒｉｎｃ
ｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，
第２版、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ刊（Ｌｏｎｄｏｎ
， １９９７）に述べられている手順を含め、任意の適切な既知の手順で調製さ
れる。

【００３３】 分析物受容体として作用できる他のものとしては、分析物に結合可能な単鎖ま
たは多鎖ポリペプチドが挙げられる。これらは当業界で既知の従来の方法によっ
て調製できる。

【００３４】 本発明のアッセイで利用される標準リガンドは、結合試薬によって結合される
ことのできるどの化合物でもよい。これは、結合試薬が結合特異性を有するすべ
ての抗原化合物（アッセイが計画される特定の分析物を含む）はもちろんのこと
、結合試薬に対する結合特異性を有する任意の抗体またはその機能性断片も含む
。標準リガンドは、分析物または結合試薬に特異性結合親和性を持たないことが
望ましい。それゆえ、結合試薬が結合できる特定のエピトープを含む抗原化合物
または抗体（またはその断片）が含まれる。標準リガンドは、興味のある分析物
とは異なる非抗体抗原であることが最適である。

【００３５】 第１および第２の複合体を作製するために、結合試薬および分析物受容体、標
準リガンドとサンプルの接触は、従来方法で行ってもよい。典型的な方法は、従
来のストリップ含有試験装置で生じる毛管作用から、ある種のＥＬＩＳＡ型イム
ノアッセイおよびエネルギー伝達イムノアッセイ（「ＥＴＩ」）で生じる、溶液
中の１以上の成分の、他の成分の位置への単純な拡散にまで及ぶ。このような後
者の形式のイムノアッセイ（すなわちＥＴＩ）では、試験および標準区域は、ど
の形式の支持体とも結合しないようにすることができる。しかし、さらに典型的
には、（本発明のすべての実施形態について）試験区域および標準区域は実質的
に、試験区域は、結合試薬に非可逆的に固定される試験表面であり、標準区域は
、標準リガンドが非可逆的に固定される標準表面であるように１以上の支持体上
に位置している。

【００３６】 第１および第２の支持体が標準区域および試験区域にそれぞれ使用される場合
、それらは本来、実質的に同様または同一であるか、異なっていてもよい。試験
区域はその上に分析物受容体が非可逆的に固定されており、標準区域はその上に
標準リガンドが非可逆的に固定されている。「非可逆的に固定された」とは、そ
れまたは（支持体）が湿っている場合に、その移動を防止するように、支持体に
包含または結合されることを意味する。分析物受容体または標準リガンドの非可
逆的固定化は、多くの方法のいずれか１つで実施され、それらは当業者には明白
である。

【００３７】 標準リガンドおよび分析物受容体が支持体に結合される場合、本発明は、当業
界で既知の多くの内部標準検定に比較してより強い標準信号を与えられるという
さらなる利点を有している。この利点は、標準信号を生成するために本発明のア
ッセイが、標準表面に結合された抗体型分子の結合活性よりも、溶液中の結合試
薬の結合活性に依存しているという事実より生じている。それゆえ、支持体にコ
ーティングされた結果として、有効量の標準リガンドが変性する状況では、特に
結合試薬の特異性が、変性によって影響を受けない標準リガンドのエピトープに
対して設計されている場合は、本発明の標準信号は最小限の影響を受ける。これ
に対して既知の内部標準アッセイでは、標準表面上の抗体型分子の変性はすべて
、表面で結合が同時に減少するため、標準信号が低下する。

【００３８】 本発明で使用される固体支持体は既知であり、たとえば、合成プラスチック材
料、マイクロタイターアッセイプレート、ラテックスビード、セルロース（たと
えばニトロセルロース）または合成ポリマー材料を含むフィルタ、ガラスまたは
プラスチックスライド、ディップスティック、毛管充填装置などが挙げられる。

【００３９】 本発明の分析試験装置には、上で例示した第１および第２の支持体を含む。装
置の詳細は、実施する検定の詳細な性質によって異なることがある。たとえば、
ある実施形態において、第１および第２の支持体は物理的に相互に非常に類似し
ている（およそ１ミリメートルほど離れている）。別の実施形態で装置は、適切
に配置された毛管入口に沿って、毛管作用で装置内に液体サンプルを吸引する毛
管充填試験装置を含む。本発明での使用に採用される毛管充填装置はたとえば、
Ｓｈａｎｋｓら、米国特許第５，１４１，８６８号、Ｓｈａｎｋｓら、ＥＰ−Ａ
−０４２２７０８、Ｂｉｒｃｈら、ＥＰ−Ｂ−０２７４２１５に開示されている
。

【００４０】 また別の実施形態では、第１の支持体は、結合試薬または分析物受容体のどち
らかとともにコーティングされ、マイクロタイタープレートのウェル内に嵌め込
むように配置される合成プラスチックペグを含み、ペグとウェル側面の間には、
ごくわずかな間隔しかない。第２の支持体はマイクロタイタープレートによって
形成され、ウェルも結合試薬または分析物受容体のどちらかによってコーティン
グされているが、結合試薬および分析受容体は両方が同じ支持体上にコートされ
ているわけではない。この特定の実施形態では、サンプルと結合試薬の接触は、
サンプルと標準リガンドの接触と実質的に同時に起こり、このことは時間的なア
ッセイのバラツキがおこる可変性を最小限にできるという点で、他の形式の装置
に勝る明確な利点を与えるために好ましい。サンプルは結合試薬および標準リガ
ンドと同時に接触されることが理想的である。

【００４１】 Ｍａｙら、米国特許第５，６２２，８７１号およびＭａｙら、米国特許第５，
６５６，５０３号で述べられているような他の装置も、本発明のイムノアッセイ
を実施するのに適している。使用する場合、これらの装置は、固体支持体を含む
中空延長ケーシングを含むことが好ましく、最も一般的には、乾燥多孔性担体で
ある。固体支持体は、ケーシングから突出した、あるいは突出していない吸水性
液体サンプル受容メンバーを介して、ケーシング外部と間接的に伝達を行い、固
体支持体およびサンプル受容メンバーは、液体サンプルがその２つの毛管作用に
よって移動できるように連結され、固体支持体は結合試薬が可逆的に固定される
区域を有する−−すなわち結合試薬は乾燥固体支持体に固定されるが、支持体が
湿潤状態になると固体支持体の上または内部を自由に移動するようになる。この
ように結合試薬を区域内に可逆的に固定することは、多くの既知の方法のいずれ
か１つによって実施される（たとえば、Ｔａｙｌｏｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｍ
ｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．刊、１９
９１）。特にそのような固定化は、Ｍａｙら、米国特許第５，６２２，８７１号
で述べられているように、支持体への吸着によって行われることが好ましい。

【００４２】 試験および標準区域は、固体支持体に沿ってサンプル受容メンバーから空間的
に隔たっている。以前述べたように、分析物受容体および標準リガンドの固定は
、多数の既知の手段によって行われる。分析物受容体または標準リガンドは、た
とえばＣＮＢｒ、カルボニルジイミダゾールまたは塩化トレシルを用いて、支持
体に化学的に連結される。あるいは、各種の「印刷」技法を用いてもよい。これ
らには、マイクロシリンジによる液体結合試薬の添加、直接印刷、インクジェッ
ト印刷などが含まれる。結合試薬添加前の支持体の化学的または物理的処理も、
特に考慮され、それは固定化を促進する。

【００４３】 そのような装置内のケーシングは通常、１個以上の開口部を含む不透明または
半透明材料で構成され、その開口部を通じて分析結果が確認され、好ましくは裸
眼で目視確認される。

【００４４】 そのような装置は、臨床研究所へ、または家庭での使用に適したキットとして
供給され、そのようなキットはそれぞれ防湿性ラッピングに包まれ、ユーザへの
適切な指示とともに包装された１個以上の装置を含む。

【００４５】 サンプル受容メンバーは、液体を迅速に吸収できる吸水性多孔性または繊維材
料で構成される。材料の多孔性は単一方向性（すなわち、孔または繊維がメンバ
ーの軸に完全にまたは優先的に平衡に走っている）でも、多方向性（メンバーが
アモルファスのスポンジ状構造を持つように、無方向性）でもよい。ポリプロピ
レン、ポリエチレン（好ましくは超高分子量のもの）、フッ化ポリビニリデン、
エチレン酢酸ビニル、アクリロニトリルおよびポリテトラフルオロエチレンなど
の多孔性プラスチック材料が使用できる。製造時にメンバーを表面活性剤で前処
理すると有利である。なぜならこのことによって、メンバー固有の疎水性を低下
させることが可能であるため、含水性サンプルを迅速および効率的に吸収し、輸
送する能力を向上させることができる。多孔性サンプル受容メンバーも、紙や、
ニトロセルロースなどの他のセルロース材料から作製することができる。好まし
くは、サンプル受容メンバーを含む材料は、多孔性メンバーが液体サンプルによ
って数秒間以内に飽和できるように選択する必要がある。液体は多孔性サンプル
受容メンバーから固体支持体に自由に浸透できなければならない。

【００４６】 そのような装置の固体支持体は、乾燥多孔性担体であることが好ましい。それ
は独立したストリップまたはシートから成り、サンプル受容メンバーと同様に、
液体サンプルが長さの一部を通じて、好ましくは毛管作用によって移動可能なす
べての材料から作製できる。支持体は、分析物受容体および標準リガンドの表面
への固定化を可能とし、第１および第２の複合体を生成する結合反応を反応すべ
きではない。

【００４７】 固体支持体は、液体を支持体の長さに上昇させる毛管作用を促進し、過剰なサ
ンプルの添加による試験装置の浸水を防ぐ手段を提供する吸収性「シンク」と結
合することがある。シンク用の特別の材料およびシンクの利用は当業界では従来
のものであり、本発明の装置にも即座に適用される。

【００４８】 本発明は、以下の具体的な実施例を参照することによってさらに理解されるで
あろう。それらは本発明の方法および装置の例示するものであり、網羅している
わけではない。

【００４９】 実施例 これらの実施例は、時間がかかったことにより生じたアッセイのバラツキを補
正するために、２つの異なる結合特異性を有する結合試薬をイムノアッセイで使
用する方法を示す。当業者が、これらのサンプルで利用される結合試薬（および
他の成分）の別の構成経路を設計できることは認識されるであろう。

【００５０】 実施例１ ラマのバイヘッドグリーン蛍光タンパク質結合試薬を用いた検定法
の変化の補正 本例は、２つの結合部位、１つはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、分析物
）用、もう１つは反応性レッド６染料（ＲＲ６、標準リガンド）を含むラマのバ
イヘッドグリーン蛍光タンパク結合試薬が、時間がかかったことにより生じたア
ッセイのバラツキを、生じた検定結合信号の比を取ることによって補正できるこ
とを示している。本例において、結合試薬の結合は、フローサイトメトリーを用
いて、そのグリーン蛍光タンパク質ドメインによって検出される。

【００５１】 １．１ 結合試薬の構成、発現および精製 本例で使用したラマバイヘッドグリーン蛍光タンパク質結合試薬（ＧＦＰ−Ｈ
ＣＶラマバイヘッドグリーン蛍光融合タンパク質）の構成、発現および精製は、
以下の方法で実施した。

【００５２】 １．１．１ 最終のｐＰＩＣ−ＨＩＳ６−ＧＦＰ−ＨＣＶ２１−ｍｙｃ発現ベ
クターの構成は複数のクローニングステップを含み、開始物質として以下のプラ
スミドを含んでいた： ｐＥＧＦＰ−Ｎ２ （ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＵＳ７６０８）ｐＰ
ＩＣ９ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＥＭＢＬ受入：Ｚ４６２３３）ＰＵＣ１９ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， ＧｅｎＢａｎｋ受入： （１９９９年５月１４日発表、Ｘ０２５１４） ｐＰＩＣ．ＨＣＶ２１． （１９９９年５月１４日に発表されたＦｒｅｎｋｅｎら、ＷＯ９９／２
３２２１に詳細に述べられている方法で得られた（ＥＭＢＬ受入ＣＡＡ１５４１
９およびＥＭＢＬ受入ＣＡＡ１５４０９）。 Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中でＨＩＳ
６−ＧＦＰ−ＨＣＶ２１−ｍｙｃ融合作製物を発現および分泌させるために、Ｈ
ＩＳ６−ＧＦＰ−ＨＣＶ２１−ｍｙｃ作製物をコード化する遺伝子を、市販のＰ
．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のアル
ファ交配因子リーダー配列に融合させた。最終発現ベクターの作成は、２個の中
間ベクター、ｐＰＩＣ９−ＨＩＳ６およびｐＰＩＣ−ＨＩＳ６−ＧＦＰを生じる
複数のクローニングステップを含んでいた。ｐＰＩＣ−ＨＩＳ６の場合、ｐＰＩ
Ｃ９のリーダーペプチドのＸｈｏＩ／ＳｎａＢＩ断片が除去され、除去されたリ
ーダー配列断片を置換することに加え、それを６ｘＨＩＳ配列に融合する合成Ｘ
ｈｏＩ／ＳｎａＢＩ断片と置換された。

【００５３】 ｐＰＩＣ９−ＨＩＳ６の合成挿入：

【００５４】

【化１】

【００５５】 合成リンカーは、合成オリゴヌクレオチドＰＣＲ．５２９およびＰＣＲ．５３
０をアニーリングすることによって作製された。

【００５６】

【化２】

【００５７】 発現ベクターｐＰＩＣ９−ＨＩＳ６−ＧＦＰは、ｐＰＩＣ９−ＨＩＳ６ベクタ
ーをＳｎａＢＩ／ＮｏｔＩによって開裂し、したがってベクターからポリリンカ
ー配列を除去し、それをｐＥＧＦＰ−Ｎ２からのＳｍａＩ／ＮｏｔＩ ＧＦＰコ
ード化遺伝子配列と置換することによって作製した。

【００５８】 最終発現ベクターｐＰＩＣ−ＨＩＳ６−ＧＦＰ−ＨＣＶ２１−ｍｙｃは、（Ｐ
ＣＲ．３９３およびＰＣＲ．６８９を用いて）ｐＰＩＣ−ＨＩＳ６−ＧＦＰによ
るＸｈｏＩ／ＸｂａＩ ＨＩＳ６−ＧＦＰ ＰＣＲ断片を、ｐＰＩＣ９−ＨＣＶ
２１−ｍｙｃによるＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ ＨＣＶ２１−ｍｙｃ断片に結合し、そ
れをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで開いたｐＰＩＣ９内へクローニングする３点連結反応
で作製した。

【００５９】

【化３】

【００６０】 １．１．２ 結合試薬の発現および精製 ＢｇｌＩＩで開裂したｐＰＩＣ−ＨＩＳ６−ＧＦＰ−ＨＣＶ２１−ｍｙｃを用
いて、以下に述べるようにＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を形質転換した： Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５細胞は、５００ｍｌのＹＤＰ培地（１％酵
母抽出物、２％ペプトン、１％グルコース）中で３０℃にて一晩、ＯＤ６００＝
１．４まで培養した。細胞を脱水機にかけ、ペレットを滅菌蒸留水で洗浄してか
ら、１００ｍｌのＫＤＴＴ緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム ｐＨ７．５、２５
ｍｌ ＤＴＴ）中で再懸濁させた。３７℃での培養の１５分後、細胞をペレット
化し（３分、３００ｒｐｍ）、１００ｍｌの氷冷ＳＴＭ緩衝液（９２．４ｇのグ
ルコース／ｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸 ｐＨ７．５、１ｍＬｎｏＭｇＣｌ２）
中で再懸濁させた。この緩衝液で５回洗浄した後、細胞ペレットを最終体積０．
５ｍｌのＳＴＭ緩衝液中で再懸濁させた。約２〜５μｌのＨ２Ｏ（ｐＰＩＣ９作
成物で消化：フェノール／クロロホルム抽出物およびＥｔＯＨ沈殿によってＤＮ
Ａを精製）を７０μｌの新しい適格性のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞と（氷上で）
混合した。細胞は、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒにより、１．５ｋＶ
、４００、２５μＦにて、００．２ｃｍキュベット内で電気泳動させた。電気泳
動の直後、１ｍｌのＹＰＤ培地を細胞に加えた。３０℃にて１時間回復させた後
、細胞をペレット化し、２００μｌの１Ｍソルビトール中で再懸濁させ、ＭＤプ
レート（１．３４％ ＹＮＢ、４×１０−５％ビオチン、１％グルコース、０．
１５％寒天）上にプレーティングした。形質転換細胞（Ｈｉｓ＋）によって形成
されたコロニーは、３０℃での培養の４８時間以内に目視された。形質転換Ｐ．
ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞ＧＳ１１５は実質的に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｉｃｈ
ｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ発現マニュアルで推奨されるように選択された：Ｈｉｓ
＋形質転換体を含むプレートを用いて、Ｍｕｔ＋およびＭｕｔｓ表現型のスクリ
ーニングを以下のように実施した：滅菌ヨウジを用いて、コロニーをＭＭプレー
ト（１．３４％ＹＮＢ、４×１０−５％ビオチン、０．５％メタノール、０．１
５％寒天）とＭＤプレートの両方に、最初にＭＭプレートがパッチングされるよ
うに、通常のパターンでパッチングした。各作製物につき、約１００個の形質転
換体を選択した。３０℃にて２〜３日プレートを培養した後、プレートを評価し
た。ＭＤプレートで正常に成長するが、ＭＭプレートではほとんどまたは全く成
長を示さないコロニーは、Ｍｕｔｓクローンとして分類した。

【００６１】 形質転換および選択されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓクローンは、以下に概説する
プロトコルを用いて結合試薬を発現するために導入された： １．ＭＤプレートからのコロニーを１個用いて、５０ｍｌ管に１０ｍｌのＢＭ
ＧＹ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ６．０
、１．３４％ＹＮＢ、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール）を播種する
。

【００６２】 ２．振蕩インキュベータ（２５０ｒｐｍ）で３０℃にて、培養物がＯＤ６００
＝２〜８に達するまで培養する。

【００６３】 ３．培養物を２０００ｇで５分間脱水機にかけ、細胞を２ｍｌのＢＭＭＹ（１
％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ６．０、１．３
４％ＹＮＢ、４×１０−５％ビオチン、０．５％グリセロール）培地に再懸濁さ
せる。

【００６４】 ４．培養物をインキュベータに戻す。

【００６５】 ５．２４時間後に２０μＬのメタノールを培養物に加え、誘発を維持する。４
８時間後、遠心分離によって細胞を除去し、上澄を収集する。

【００６６】 粗上澄は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ（商標）システ
ムを用いた、１２％アクリルアミドゲル上での分析によって、ＨＣＶバイヘッド
断片の存在について試験を行った。

【００６７】 ＥＬＩＳＡによって示されたニ特異性結合活性は以下のとおりである： １．９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＨＣプレート）を、２
００μｌ／ウェルのＰＢＳ中のＢＳＡ−ＲＲ６接合体（実施例１を参照）によっ
て、３７℃にて一晩活性化した。

【００６８】 ２．ＰＢＳＴで１回洗浄した後、ウェルは、ウェル当たり２００μＬの阻害緩
衝液を用いて、３７℃にて１時間培養した。阻害緩衝液：ＰＢＳ−Ｔ中の１％Ｂ
ＳＡ ３．試験サンプル（１００μＬ）の連続希釈物を同量の阻害緩衝液と混合し、
感作させたＥＬＩＳＡウェルに加えた。３７℃にて１〜２時間培養した。

【００６９】 ４．２００μｌの阻害緩衝液中のｈＣＧ−ＡＰ接合体を各ウェルに加えると、
各ウェルではｈＣＧがグルタルアルデヒド結合によって、アルカリホスファター
ゼに結合した。

【００７０】 ５．ＰＢＳＴで１回洗浄した後に、１００μｌ／ウェルのｐＮＰＰ基質（１Ｍ
ジエタノールアミン／１ｍＭ ＭｇＣｌ中の１ｍｇ／ｍＬのｐＮＰＰ）を加える
と、捕捉されたｈＣＧ−ＡＰが検出された。

【００７１】 粗上澄は、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）活性の存在について、上澄（１
０ｍｌ）をＰＢＳＴＡで１００ｍｌに希釈して試験を行った。次にこれらをＰｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒフルオリメータによって４８８ｎｍの励起にて分析し、５
０９ｎｍで発光が検出された。

【００７２】 培養物上澄（２００ｍＬ、ｐＨ６〜８）は、０．４５ｍ低タンパク結合酢酸セ
ルロースフィルタ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｌ．）を用いて清澄にし、Ｎ
ｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（５ｍＬ、Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ， Ｕ
Ｋ）に２ｍＬ／分で加え、２８０ｎｍの吸収が基線に達するまでＰＢＳＡで洗浄
した。５カラム分の体積について０〜５００ｍＭイミダゾールの直線濃度勾配に
よって溶出させた後、ＰＢＳＡによって事前に平衡にしたＧ−２５ Ｓｐｅａｄ
ｅｘ（１５０ｍＬ床体積、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を流下させて、ただちに緩衝液
を交換し、４ｍＬの画分を収集した。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬ
ＩＳＡで検定して、次に合わせて分割量ごとに凍結乾燥させた。

【００７３】 特に、上述のプロセスによって作成された結合試薬は、図１に示すアミノ酸配
列（配列番号１）を含んでいた。

【００７４】 １．２ 標準リガンドの調製 反応性レッド６−ウシ血清アルブミン接合体標準リガンド（ＲＲ６−ＢＳＡ）
は、エンドオーバーエンドミキサー内で、２００μｌの反応性レッド６（１０ｍ
ｇ／ｍＬ）を１ｍｌのウシ血清アルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ）によって室温（２
０℃）にて３時間インキュベートして調製した。この後、２００μｌのエタノー
ルアミン（１Ｍ）を加え、溶液をさらに１５分間インキュベートした。遊離した
未結合反応性レッド６は、０．７５ｍｌの溶液を、０．０１％アジ化ナトリウム
を含むリン酸緩衝食塩水によって事前に平衡にしたＰｈａｒｍａｃｉａ ＰＤ１
０（商標）脱塩カラムを流下させることによって、ウシ血清アルブミン画分から
除去し、平衡緩衝液で溶出させた。本実施例と次の実施例では、画分（１ｍｌ）
を収集して利用した。

【００７５】 １．３ 分析物受容体の調製 ｈＣＧへの結合特異性を有し、分析物受容体に相当するモノクローナル抗体（
ＭＡｂ １１４０）は、当業界で既知の手順に従って調製した。モノクローナル
抗体を生成する代表的な方法は、Ｇａｎｉら、Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １９９４， ｖｏｌ． ４８， ｐｐ． ２７７−２８２で述べられており、この方法はｈＣＧに対する結合特異性を持
つ関連抗体を生成するために使用できる。適切なモノクローナル抗体は、分析物
および分析物類似体に対する相対的な親和性および特異性に基づいて選択できる
。これはたとえば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標） ２０００バイオセンサ（Ｂｉａｃ
ｏｒｅ ＡＢ、スウェーデン）を製造者のプロトコル（アプリケーションズハン
ドブック、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）で述べられているように用い、密接に関連し
た類似体のパネルを使用して、標準動力学測定を実施することによって行うこと
ができる。ＭＡｂも市販品を入手可能であり、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａ
ｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ、ノッティンガム、ＵＫより入手可能である。

【００７６】 １．４ 試験および標準区域の形成 分析物受容体および標準リガンドのラテックス表面への吸着による、試験および
標準区域の形成は以下の方法で行った。ＲＲ６−ＢＳＡによって吸収された３μ
ｍのラテックスは次のように調製した。ラテックス原液（５００μｌの１％固体
）を丸底エッペンドルフにピペットで加え、これに０．０１％メルチオレートを
含む５００μｌの１０ｍＭホウ酸塩緩衝液、ｐＨ８．５を加えた。溶液を混合し
、ベンチトップエッペンドルフ遠心分離機によって室温にて１０分間、遠心分離
した。上澄を除去し、ペレットを短時間ボルテックスした。別のエッペンドルフ
で、９００μｌのホウ酸緩衝液に１００μｌのＲＲ６−ＢＳＡ接合体溶液を加え
、生じた溶液を混合してラテックスペレットに加えた。ラテックス−ＲＲ６−Ｂ
ＳＡ溶液をボルテックスし、ソニックプローブを用いて１０秒間超音波処理し、
室温（２０℃）にてエンドオーバーエンドミキサー上で１時間インキュベートし
た。１時間後、５０μｌの２００ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン溶液を加えて、
ラテックス溶液をさらに３０分インキュベートした。ラテックスビードをエッペ
ンドルフ遠心分離機で室温にて１０分間遠心分離し、ペレットを１ｍｌのホウ酸
緩衝液中で再懸濁した。ＲＲ６−ＢＳＡによって吸収された１０μｌ（固体０．
５％）の量のラテックスビードに相当する標準区域は、この懸濁液から分離し、
必要になるまで４℃で貯蔵した。

【００７７】 上述のように得られた、ＭＡｂ１１４０に吸収された３μｍのラテックスは、
以下のように調製した。ラテックス原液（５００μｌの１％固体）を丸底エッペ
ンドルフにピペットで加え、ベンチトップエッペンドルフ遠心分離機で遠心分離
した。上澄を除去し、これに０．０１％メルチオレートを含む５００μｌの１０
ｍＭホウ酸塩緩衝液、ｐＨ８．５を加えた。溶液を混合し、上で述べたように遠
心分離した。上澄を除去し、ペレットを短時間ボルテックスした。別のエッペン
ドルフで、ホウ酸緩衝液で作製した１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ ＭＡｂ １１４０溶
液を調製し、生じた溶液を混合してラテックスペレットに加えた。ラテックス−
ＭＡｂ １１４０溶液をボルテックスし、ソニックプローブを用いて１０秒間超
音波処理した。この溶液に、２００μｌの９５％（ｖ／ｖ）エタノール ０．５
％（ｗ／ｖ）酢酸ナトリウムを加え、生じた溶液をボルテックスした。エンドオ
ーバーエンド回転ミキサーで３７℃にて２時間混合した後、５０μｌの２００ｍ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液を加え、ラテックス溶液をさらに３０分間インキュベート
した。ラテックスビードをエッペンドルフ遠心分離機で室温にて１０分間遠心分
離し、ペレットを１ｍｌのホウ酸緩衝液中で再懸濁した。ＭＡｂ １１４０によ
って吸収された１０μｌ（固体０．５％）の量のラテックスビードに相当する試
験区域は、この懸濁液から分離し、必要になるまで４℃で貯蔵した。

【００７８】 １．５ ｈＣＧ検出のための内部標準検定法 上で調製および説明した試験区域を、表１に示す濃度で、リン酸緩衝食塩水に
よって５０μｌとした、分析物であるｈＣＧ（１０μｌの２０ＩＵ／ｍｌ）を含
む溶液と、結合試薬（すなわち、上で調製および説明したラマバイヘッドグリー
ン蛍光タンパク質）に曝露した。試験区域は溶液中で室温（２０℃）にて１時間
培養した。

【００７９】 上で調製および説明した標準区域に、試験区域と同じ条件を与えた。１時間の
培養時間の後、試験区域と標準区域の両方で、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｉｔｅ（商
標） フローサイトメータを用いてアルゴンレーザーによって蛍光を定量した（
平均蛍光単位は、ラテックスビード数に対して測定した。

【００８０】 結果は表１に示す。全く明らかであるが、実施した各試験において、変化係数
によって測定された検定の変動は、内部標準を利用すると減少した；そして、標
準表面および分析物と標準リガンドの両者に対して結合特異性を有する結合試薬
を使用する内部標準を利用すると、特に減少した。

【００８１】

【表１】

【００８２】 実施例２ ダブルヘッド抗体結合試薬を用いた検定法の変化の補正 本例は、２つの結合部位、１つはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、分析物
）用、もう１つはグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ、標準リガンド）を含むダブ
ルヘッド抗体結合試薬が、慎重に導入された検定法の変化を、生じた検定結合信
号の比を取ることによって補正できることを示している。本例において、結合試
薬の結合は、表面プラズマ共鳴バイオセンサを用いて、その固有の質量によって
検出される。

【００８３】 ２．１ 結合試薬の構成、発現および精製 本例で利用するダブルヘッド結合試薬の構成、発現および精製は、特にＧＯＳ
Ａ．Ｔ作製物の構成に関して、従来手段（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ）に例示されているように）によって、抗Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ特異性
ＶＨ４７１５およびＶＬ４７１５ドメインが抗ｈＣＧ特異性ＶＨ３２９９および
ＶＬ３２９９ドメイン（ＷＯ９６／２７６１２では、ＢｓｔＥ１１−Ｓａｃ１リ
ンカー断片によって結合されたＦｖＫＣ−ＩＩとして述べられている）と置換さ
れることを除いて、Ｄａｖｉｓら、ＷＯ ９７／１４７１９で述べられている方
法で行い、図２に示すアミノ酸配列（配列番号２）を含む抗ｈＣＧ／抗ＧＯｘダ
ブルヘッド結合試薬が生じた。

【００８４】 ２．２ バイオチップ上への試験および標準区域の調製 以下の方法でＣＭ５バイオセンサチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を、標準リガ
ンドＧＯｘと分析物受容体ＭＡｂ １１４０（実施例１．３で調製）に結合した
。チップをＢｉａｃｏｒｅ（商標） ２０００バイオセンサ（Ｂｉａｃｏｒｅ
ＡＢ）に配置し、センサグラムを以下のように実施した。フローパスはフローセ
ル１、２、３、４に渡って流れるように設定し、ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水（ＨＢＳ
、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）のフロー速度は１０μｌ／分に設定した。次にセンサ
チップ表面を、製造者（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）が説明するように作製した６０
μｌの１， エチル−３−［ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ
）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化溶液を２回連続で噴射するこ
とによって活性化した。フローパスは次に、フローセル２を渡って流れるように
変更し、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ４によって１００μｇ／ｍｌ
まで希釈したＧＯｘ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、デンマーク、コペ
ンハーゲンのＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋより入手）を２回連続噴射した。フロー
パスを次にフローセル３を渡って流れるよう変更し、ＭＡｂ １１４０を噴射し
た（３×２０μｌおよび１×４０μｌ）。フローパスを再度フローセル１、２、
３、４に渡って流れるように変更し、過剰な活性化結合部位は、１Ｍエタノール
アミンを６０μｌずつ２回噴射して阻害した。

【００８５】 バイオセンサチップのフローセル２に結合したＧＯｘの量は、２７７０反応単
位（「ＲＵ」、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標） ２０００バイオセンサで測定した）。
バイオセンサチップのフローセル３に結合したＭＡｂ １１４０の量は２５７０
ＲＵであった。他のフローセルには、ＧＯｘもＭＡｂ １１４０も結合しなかっ
た。フローセル１および４は対照表面に相当した。フローセル２は標準区域に相
当したが、フローセル３は試験区域に相当した。

【００８６】 ２．３ ｈＣＧ検出のための内部標準検定法 ２．１節で調製したダブルヘッド抗体結合試薬は、ＨＢＳを用いて以下の比で
希釈した（１９：１、１８：２、１７：３、バイヘッド：ＨＢＳ）。したがって
、これらの溶液は、希釈していない溶液およびそれぞれから、含有する結合試薬
の量がわずかに変化した。

【００８７】 Ｂｉａｃｏｒｅの方法を用いて、以下を実施した。ＨＢＳのフロー速度は１０
μｌ／分に設定し、フローパスはフローセル１、２、３、４に渡るように設定し
た。２０マイクロリットルのｈＣＧ（ＨＢＳ中の１０ ＩＵ／ｍｌ）をセンサ表
面に渡って噴射した。フローセル３の表面のみがすべてのｈＣＧを捕捉した（こ
れは分析物受容体ＭＡｂ１１４０が結合した表面であった）。次に２０マイクロ
リットルの結合試薬（希釈していない溶液）をセンサチップのフローセルすべて
に噴射した。フローセル２の表面と、（ここでは捕捉された分析物ｈＣＧを含む
）フローセル３の表面でも結合試薬が捕捉された（標準リガンド、ＧＯｘと結合
）。結合試薬の量はＲＵで決定された。さらに表面は５μｌの１０ｍＭ ＨＣｌ
を噴射して再生した。ｈＣＧ（１０ＩＵ／ｍｌ）およびダブルヘッド結合試薬の
噴射を３回繰り返したが、今回は１９：１、１８：２、１７：３の比の結合試薬
を使用した。これによって結合試薬の捕捉で４つの値が得られた。フローセル１
および４は捕捉を示さなかった。フローセル２および３は結合試薬の捕捉を示し
た。試験２を行うために、５ＩＵ／ｍｌ ｈＣＧを用いて上述の試験（試験１）
を繰り返した。

【００８８】 結果は、変化係数について表２に示す。実施例１と同様に、実施した各試験に
おいて、変化係数によって測定された検定法の変化は、内部標準を使用すると減
少した；そして、標準表面および分析物と標準リガンドの両方に対する結合特異
性を有する結合試薬によって行った内部標準を使用すると特に、減少した。

【００８９】

【表２】

【００９０】 本発明を詳細に具体的なその実施例について述べたが、当業者には、その精神
と範囲を逸脱せずにそこで多様な変更および改良を行えることは明らかとなるで
あろう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 配列番号１のアミノ酸配列である、２個の結合部位、すなわち１個はヒト絨毛
性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）用、１個は反応性レッド６染料用を含む、ラマバイ
ヘッドグリーン蛍光タンパク質結合試薬を示す。

【図２】 配列番号２のアミノ酸配列である、２個の結合部位、すなわち１個はヒト絨毛
性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）用、１個はグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）用を
含む、ダブルヘッド抗体結合試薬を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１０月３０日（２００１．１０．３０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ハウエル，スチーブン イギリス国、ベツドフオードシヤー・エ ム・ケー・44・１・エル・キユー、ベツド フオード、シヤーンブルツク、コルワー ス・ハウス、ユニリーバー・リサーチ・コ ルワース (72)発明者 フアン・デル・ロフト，コルネリス・パウ ル・エリク オランダ国、エヌ・エル−3133・アー・テ ー・フラールデインゲン、オリビア・フア ン・ノールトラーン・120、ユニリーバ ー・リサーチ・フラールデインゲン

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サンプル中の分析物の存在を検出する方法であって： ａ）サンプルを結合試薬および分析物受容体と接触させて、該結合試薬、分析
   物および分析物受容体を含む第１の複合体を作成することであって、第１の複合
   体は試験信号を提供し、分析物受容体は試験区域内に配置され、分析物に結合可
   能であり、結合試薬が分析物に対して結合特異性を有することと； ｂ）サンプルを標準リガンドに接触させて、該結合試薬および標準リガンドを
   含む第２の複合体を作成することであって、標準リガンドは標準区域内に配置さ
   れ、さらに結合試薬が標準リガンドに対する結合特異性を有すること；および ｃ）試験および標準区域から試験および標準信号を検出することであって、そ
   れにより標準信号に対する試験信号の比を得ると、サンプル中の分析物のレベル
   が規定され、そのようなレベルがサンプルに接触した結合試薬のレベルとは無関
   係であること； を含む方法。
2. 【請求項２】 結合試薬が非可逆的に固定される試験表面が試験区域であり
   、標準リガンドが非可逆的に固定される標準表面が標準区域である、請求項１に
   記載の方法。
3. 【請求項３】 結合試薬が抗体または多価抗原結合タンパク質から選択され
   、該結合試薬および多価抗原結合タンパク質はそれぞれ第１および第２のドメイ
   ン結合単位を含み、ここで第１のドメイン結合単位は分析物に対する結合特異性
   を与え、第２のドメイン結合ユニットは標準リガンドに対する結合特異性を与え
   る、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 結合試薬が多価抗原結合タンパク質である、請求項１〜３の
   いずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 結合試薬が、第１および第２のドメイン結合ユニットが連続
   に結合されている単一ポリペプチド鎖を含む多価抗原結合タンパク質である、請
   求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 【請求項６】 結合試薬が２価抗原結合タンパク質を含む、請求項１〜５の
   いずれか１項に記載の方法。
7. 【請求項７】 単一ドメイン結合単位が本来、軽鎖を含まない免疫グロブリ
   ンに由来する重鎖可変ドメインである、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方
   法。
8. 【請求項８】 単一ドメイン結合単位がＣａｍｅｌｉｄ（ラクダ科の動物）
   免疫グロブリンに由来する重鎖可変ドメインである、請求項２〜７のいずれか１
   項に記載の方法。
9. 【請求項９】 結合試薬が標識化結合試薬である、請求項１〜８のいずれか
   １項に記載の方法。
10. 【請求項１０】 標識が着色ラテックス粒子または蛍光化合物である、請求
    項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 サンプルが尿、血清、唾液、頸部液または尿道液より成る
    群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 【請求項１２】 サンプルと結合試薬の接触が、サンプルと標準リガンドの
    接触と実質的に同時に起こる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 【請求項１３】 分析物受容体が分析物に対する結合特異性を有する、請求
    項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 【請求項１４】 結合試薬が結合特異性を示す標準リガンドが抗原である、
    請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 【請求項１５】 第１の分析物を作成するためにサンプルが曝露される結合
    試薬、および分析受容体への分析物の特異性結合によって、液体生体サンプル中
    の分析物の存在を検出する分析試験装置であって、結合試薬は抗体または多価抗
    原結合タンパク質より選択され、 該結合試薬および多価抗原結合タンパク質はそれぞれ、第１および第２のドメ
    イン結合単位を含み、ここで第１のドメイン結合単位は分析物に対する結合特異
    性を与え、第２のドメイン結合ユニットは標準リガンドに対する結合特異性を提
    供し；該装置は第１および第２の固体支持体を含み、第１の固体支持体は標準区
    域を含み、標準区域はその上に標準リガンドを可逆的に固定し、標準リガンドは
    結合試薬に結合すると第２の複合体を生成し、第２の複合体は、サンプルに曝露
    される結合試薬の量の変化を補正する手段である、標準信号を与え；第２の固体
    支持体は試験区域を含み、試験区域はその上に分析物受容体を可逆的に固定し、
    試験区域は分析物および結合試薬に結合すると、試験信号を与える第１の複合体
    を生成する、分析試験装置。
16. 【請求項１６】 結合試薬が多価抗原結合タンパク質である、請求項１５に
    記載の分析試験装置。
17. 【請求項１７】 多価抗原結合タンパク質が第１および第２のドメイン結合
    ユニットが連続に結合されている単一ポリペプチド鎖を含む、請求項１５または
    請求項１６に記載の分析試験装置。
18. 【請求項１８】 結合試薬が２価抗原結合タンパク質を含み、分析物受容体
    が分析物に対する結合特異性を有する、請求項１５または請求項１７に記載の分
    析試験装置。
19. 【請求項１９】 単一ドメイン結合単位が本来、軽鎖を含まない免疫グロブ
    リンに由来する重鎖可変ドメインである、請求項１５から１８のいずれか１項に
    記載の分析試験装置。
20. 【請求項２０】 単一ドメイン結合単位がＣａｍｅｌｉｄ（ラクダ科の動物
    ）免疫グロブリンに由来する重鎖可変ドメインである、請求項１５から１９のい
    ずれか１項に記載の分析試験装置。
21. 【請求項２１】 結合試薬が標識化結合試薬である、請求項１５から２０の
    いずれか１項に記載の分析試験装置。
22. 【請求項２２】 標識が着色ラテックス粒子または蛍光化合物である、請求
    項２１に記載の分析試験装置。