JP2014199180A

JP2014199180A - 術野洗浄液中の菌の検出方法

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Publication number: JP2014199180A
Application number: JP2011176336A
Authority: JP
Inventors: 恭大木村; Kyota Kimura; 美雪小山; Miyuki Koyama
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 2011-08-11
Filing date: 2011-08-11
Publication date: 2014-10-23
Also published as: WO2013021894A1

Abstract

【課題】生体試料を含む術野洗浄液中の菌の存在を簡便に検出できる方法を提供する。
【解決手段】（ｉ）術野洗浄液を血小板活性化物質と混合・接触させ；（ｉｉ）前記血小板活性化物質を前記術野洗浄液から除去して、被測定試料を得；（ｉｉｉ）前記被測定試料を、前記被測定試料中のエンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子含有試薬および発光合成基質と反応させて、前記発光合成基質から前記発光基質を遊離させ；（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で遊離した発光基質に発光酵素を作用させて、発光量を測定し；さらに（ｖ）前記工程（ｉｖ）で得られた発光量を、基準値と比較することを有する術野洗浄液中の菌の検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、術野洗浄液中の菌の検出方法に関する。生体試料が混入した術野洗浄液中の菌の存在を簡易に検出する方法に関する。

股関節置換術、膝関節置換術、心臓手術、血管手術、結腸直腸手術等の外科手術時には、微生物に対してバリアとして機能している皮膚が切開され、本来無菌である内部組織が開放されるため、手術を行った部位に発生する手術部位感染（surgical site infection：ＳＳＩ）が問題となっている。ＳＳＩの原因と推定される細菌としては、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、肺炎球菌、グラム陰性菌などが挙げられる。また、ＳＳＩの発生率は手術の種類や手術を行う部位によって異なり、ＪＡＮＩＳ（厚生労働省院内感染対策サーベイランス事業）２００７年季報（１月〜６月）のデータによると、例えば、胃の手術では４．０％、直腸の手術では１７．１％となっており、入院患者の院内感染の中で、ＳＳＩが占める割合は１４〜１６％を占め、尿路感染や肺炎に次いで２番目の多さである。さらに、ＳＳＩが起こると、治癒が遅くなることで、入院日数や医療コストが増え、患者への負担がかなり大きくなってしまう。このため、ＳＳＩを最小限にする取り組みが急務である。

一般的にＳＳＩ対策としては、手術前・中・後で異なる。このうち、手術中のＳＳＩ対策としては、絹糸ではなく合成吸収糸を縫合糸として使用する、創縁ドレープを用いる、など様々な対策があるが、上記対策に加えて、疾患部を縫合する前に、術野を生理食塩水などで洗浄し、感染の原因となる菌を可能な限り除去する対策がとられている。また、術野での菌数がある程度以下であれば自助回復力によってその菌を死滅させることが期待できる。しかしながら、従来の方法では、検出時間に少なくとも数時間を要し、術後にしか細菌の検出結果を得られないため、細菌数の確認が行われないまま縫合されていた。このため、短時間で（術中に）細菌の存在を検出できる方法が求められている。

一方、細菌の検出方法としては、グラム陰性菌の外膜を構成する成分の一つである「エンドトキシン(endotoxin)」の濃度を測定する方法がある（例えば、特許文献１）。特許文献１の方法は、試料と、エンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子を含有する試薬と、ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質とを反応させ、発光合成基質から発光基質を遊離させる発光基質遊離工程と、発光基質遊離工程により遊離した発光基質に発光酵素を作用させ、発光量を測定する発光量測定工程と、発光量測定工程により得られた測定値に基づいて試料中のエンドトキシン濃度を定量する濃度定量工程とを包含することを特徴としている。当該方法によると、試料中のエンドトキシンを、簡便かつ高感度に測定できる。

国際公開第２００９／０６３８４０号パンフレット

しかしながら、特許文献１に記載の方法は、血液等の生体試料を含む場合には、エンドトキシンが存在しない試料でも発光してしまい、少量のエンドトキシン（細菌）が存在する試料の場合には、当該試料とエンドトキシン（細菌）が存在しない試料とを識別することができないという問題がある。

したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、生体試料を含む術野洗浄液中の菌の存在を簡便に検出できる方法を提供することを目的とする。

また、本発明の他の目的は、生体試料を含む術野洗浄液中の菌の存在を短時間で検出できる方法を提供することである。

本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、生体試料を含む術野洗浄液中のエンドトキシン濃度を測定する前に、術野洗浄液を血小板活性化物質で予め処理することによって、偽陽性の問題を解消し、上記目的が達成できることを知得した。当該知見に基づいて、本発明を完成した。

すなわち、上記諸目的は、（ｉ）術野洗浄液を血小板活性化物質と混合・接触させ［工程（ｉ）］；（ｉｉ）前記血小板活性化物質を前記術野洗浄液から除去して、被測定試料を得［工程（ｉｉ）］；（ｉｉｉ）前記被測定試料を、前記被測定試料中のエンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子含有試薬および発光合成基質と反応させて、前記発光合成基質から前記発光基質を遊離させ［工程（ｉｉｉ）］；（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で遊離した発光基質に発光酵素を作用させて、発光量を測定し［工程（ｉｖ）］；さらに（ｖ）前記工程（ｉｖ）で得られた発光量を、基準値と比較する［工程（ｖ）］、ことを有する術野洗浄液中の菌の検出方法によって達成できる。

本発明の方法によれば、生体試料を含む術野洗浄液であっても、術野洗浄液中の細菌を容易にかつ短時間で検出できる。

本発明の方法の第一の実施形態を示すフローチャートである。本発明の方法の第二の実施形態を示すフローチャートである。本発明の方法の第三の実施形態を示すフローチャートである。本発明の方法に好適に使用できるデバイスの一実施形態を示す図である。参考例１において、菌数と発光量との関係を示す図である。実施例１において、血小板活性化物質との混合・接触時間と発光量との関係を示す図である。

本発明は、（ｉ）術野洗浄液を血小板活性化物質と混合・接触させ［工程（ｉ）］；（ｉｉ）前記血小板活性化物質を前記術野洗浄液から除去して、被測定試料を得［工程（ｉｉ）］；（ｉｉｉ）前記被測定試料を、前記被測定試料中のエンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子含有試薬および発光合成基質と反応させて、前記発光合成基質から前記発光基質を遊離させ［工程（ｉｉｉ）］；（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で遊離した発光基質に発光酵素を作用させて、発光量を測定し［工程（ｉｖ）］；さらに（ｖ）前記工程（ｉｖ）で得られた発光量を、基準値と比較する［工程（ｖ）］、ことを有する術野洗浄液中の菌の検出方法に関する。本発明の方法は、生体試料を含む術野洗浄液中のエンドトキシン濃度を測定する前に、術野洗浄液を血小板活性化物質で予め処理することを特徴とする。本発明者らは、生体試料中の血小板凝固因子が存在すると、エンドトキシン（細菌）が存在しない試料であっても発光してしまうことを発見した。さらに、術野洗浄液中の血小板凝固因子を血小板活性化物質で処理することによって、上記したような偽陽性結果の原因物質を除去できる。このため、当該処理後の術野洗浄液中のエンドトキシン濃度を測定すると、エンドトキシン（細菌）が存在しない試料の発光量を有意に抑制でき、エンドトキシン（細菌）の存在を正確に検出することができる。また、２０ＣＦＵ／ｍＬ以下という少数の細菌をも検出することができる。上記利点に加えて、本発明の方法によると、２０分以下という短時間での検出が可能である。このため、患者への負担を軽減でき、また、表皮を縫合する前に細菌が検出できるため、ＳＳＩを有効に予防することができる。

なお、本発明の方法により検出される菌としては、特に制限されず、一般的に手術部位感染（ＳＳＩ）の原因と推定される細菌でありうる。具体的には、Budvicia属、Buttauxella属、Cedecea属、Citrobacter属、Enterobacter属、Escherichia属、Edwardsiella属、Erwinia属、Ewingella属、Hafnia属、Klebsiella属、Kluyvera属、Leclercia属、Leminorella属、Morganella属、Obesumbacterium属、Pragia属、Proteus属、Providencia属、Rahnella属、Salmonella属、Serratia属、Shigella属、Tatumella属、Trabulsiella属、Xenorhabdus属、Yersinia属、Yokenella属、Acinetobacter属、Actinobacillus属、Aeromonas属、Agrobacterium属、Alcaligenes属、Arcobacter属、Bordetella属、Brucella属、Branhamella属、Burkholderia属、Calymmatobacterium属、Campylobacter属、Capnocytophage属、Cardiobacterium属、Chromobacterium属、Chryseomonas属、Comamonas属、Eikenella属、Flavimonas属、Flavobacterium属、Flexispira属、Francisella属、Haemophilus属、Helicobacter属、Kingella属、Legionella属、Methylobacterium属、Moraxella属、Neisseria属、Ochrobactrum属、Oligella属、Pasteurella属、Pectobacterium属、Plesiomonas属、Pseudomonas属、Shewanella属、Sphingobacterium属、Sphingomonas属、Stenotrophomonas属、Streptobacillus属、Viblio属、Weeksalla属、Xanthomonas属、Acidaminococcus属、Anaerobiospirillum属、Anaerorhabdus属、Bacteroides属、Biophila属、Centipeda属、Desulfomonas属、Desulfovibrio属、Dichelobacter属、Fusobacterium属、Leptotrichia属、Megasphaera属、Mitsuokella属、Mobiluncus属、Porphyromonas属、Prevotella属、Selenomonas属、Tissierella属、Veillonella属、及びWolinella属等に属するグラム陰性菌などが挙げられる。これらのうち、手術部位感染の主要原因となるEnterobacter属、Escherichia属、Pseudomonas属、Bacteroides属に適応するのが望ましい。なお、手術部位感染の原因としてはグラム陰性菌だけではなく、グラム陽性菌も含まれるが、洗浄の度合いを確認するためにはグラム陰性菌のみの検出で十分である。

以下、本発明の実施の形態を図１〜３を参照しながら説明する。なお、各図中では、液の量、反応条件などが記載されているが、これらは好ましい一実施形態を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。

１．工程（ｉ）
本工程では、術野洗浄液を血小板活性化物質と混合・接触させる。

ここで、術野洗浄液とは、股関節置換術、膝関節置換術、心臓手術、血管手術、結腸直腸手術等の外科手術で患部の縫合前に、術野を洗浄液で洗浄するが、その際の洗浄液をいう。このため、本発明の方法が適用される術野洗浄液は、通常、血液成分等の生体由来の成分を含む。洗浄後は、術野洗浄液を吸引・廃液し、この洗浄および吸引・廃液操作を、適当回数、例えば、合計２〜２５回（好ましくは４〜２０回）程度、繰り返す。各洗浄工程で得られる術野洗浄液のいずれを本工程で使用してもよいが、一般的には、最終洗浄工程で得られた術野洗浄液が使用される。なお、術野の洗浄回数は術式、病気の重篤度、患者の体重などによって異なり、最終的には術者の判断にゆだねられる。また、術野洗浄液は、特に制限されず、通常、外科手術で洗浄に使用されるものが同様にして使用できる。具体的には、生理食塩水、滅菌水、リンガー溶液、４．５％のブドウ糖等の糖やグリセリン等の細胞に無害な浸透圧保持剤を加えて生体組織細胞と実質的に同じ浸透圧に等張した溶液、脳脊髄手術用洗浄灌流液などが挙げられる。また、１回あたりに使用される術野洗浄液の量は、特に制限されず、通常外科手術における使用量と同様でありうる。具体的には、１回あたりに使用される術野洗浄液の量は、１００〜１，０００ｍＬが好ましく、総量としては、１００〜１０，０００ｍＬがより好ましい。また、上記術野洗浄液は、そのまま使用されてもよいが、患者への負担をかんがみると、体温とほぼ同等の温度（例えば、３５〜４０℃、好ましくは３７℃前後）に加温されることが好ましい。

本工程において、術野洗浄液は、全量を血小板活性化物質と混合・接触させる必要はなく、通常、その一部が使用される。

本工程で使用できる血小板活性化物質は、血小板の凝集を誘導できる物質であれば特に制限されない。具体的には、陽イオンがＣａ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｎａ^＋、またはＨ^＋である陽イオン交換樹脂；陰イオンがＳＯ_４ ^２−、Ｉ⁻、ＮＯ_３ ⁻、ＣｒＯ_４ ^２−、Ｂｒ⁻、Ｃｌ⁻、ＯＨ⁻、またはＦ⁻である陰イオン交換樹脂；コラーゲン、フィブリン、ＡＤＰ、アラキドン酸、トロンビン、セロトニン、プロタミン、カルシウム塩、ＲＧＤペプチド、若しくは凝固因子（例えば、フィブリノゲン、トロンビン、プロトロンビン、フォンビルブランドファクター、トロンボキサン、トロンボプラスチン、第五因子、第七因子、第八因子、第九因子、第十因子、第十一因子、第十二因子、プレカリクレイン、高分子キニノゲン等）などの血小板を活性化して血栓を生じやすくする物質から構成されるまたは前記少なくとも一の物質で被覆されるビーズ；珪砂、例えば、大きさが０．４〜２０μｍの珪砂、結晶シリカ、例えば、大きさが５μｍ以下で平均粒径が１．１μｍの結晶シリカ（例えば、ペンシルバニア・グラスサンド社製、商品名：Ｍｉｎ−ＵＳｉｌ）、珪藻土、ガラス微粉末、カオリン、ベントナイト；ならびにポリスチレン、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリアリレート、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、およびポリアクリル酸等のアンモニウム塩、カルボン酸またはスルホン酸を含む樹脂などが挙げられる。陽／陰イオン交換樹脂は、市販品を使用してもよい。具体的には、陽イオン交換樹脂（弱酸性陽イオン交換樹脂、強酸性陽イオン交換樹脂）としては、アンバーライト（商標）ＣＧ−４０００、ＣＧ−５０００、ＣＧ−６０００、ＣＧ−８０００、ＩＲ−１１６、ＩＲ−１１８、ＩＲ−１１８Ｈ、ＩＲ−１２０、ＩＲ−１２０Ｂ、ＩＲ−１２２、ＩＲ−１２４、２５２、２００ＣＴ、２０１ＣＴ、２００Ｃ、ＩＲＣ−５０、ＩＲＣ−８４、ＸＴ−１００７、ＸＴ−１００９、ＸＴ−１００２（以上、いずれも株式会社オルガノ製の商品名）等のアンバーライト（商標）系陽イオン交換樹脂；ダイヤイオン（商標）ＳＫ−１Ａ、ＳＫ−１Ｂ、ＳＫ−１０４、ＳＫ−１１０、ＳＫ−１１２、ＦＭＫ−１０、ＷＫ−１０、ＷＫ−１１、ＷＫ−２０、ＰＡ−４０６、ＰＡ−４０８、ＰＡ−４１２、ＰＡ−４１６、ＰＡ−４１８、ＰＫ−２０８、ＰＫ−２１２、ＰＫ−２１６、ＰＫ−２１８、ＰＫ−２２０、ＰＫ−２２８、ＵＢＫ０８、ＵＢＫ１０、ＵＢＫ１２（以上、いずれも三菱化学株式会社製の商品名）等のダイヤイオン（商標）系陽イオン交換樹脂などが挙げられる。また、陰イオン交換樹脂（弱塩基性陰イオン交換樹脂、中塩基性陰イオン交換樹脂、強塩基性陰イオン交換樹脂）としては、アンバーライト（商標）ＩＲＡ−４００、ＩＲＡ−４００Ｊ、ＩＲＡ−４００Ｔ、ＩＲＡ−４０１、ＩＲＡ−４０２ＢＬ、ＩＲＡ−４０４Ｊ、ＩＲＡ−４３０、ＩＲＡ−４５８、ＩＲＡ−４５８、ＩＲＡ−９００、ＩＲＡ−９００Ｊ、ＩＲＡ−９０４、ＩＲＡ−９１０、ＩＲＡ−９１０ＣＴ、ＩＲＡ−９３８、ＩＲＡ−９５８、ＩＲＡ−９５８ＲＦ、ＩＲＡ−４１０、ＩＲＡ−４１０Ｊ、ＩＲＡ−４１１、ＩＲＡ−９１０、ＩＲＡ−６８、ＩＲＡ−３５、ＩＲＡ−９３等のアンバーライト（商標）系陰イオン交換樹脂；ダイヤイオン（商標）ＷＡ−１０、ＷＡ−１１、ＷＡ−２０、ＷＡ−２１、ＷＡ−３０、ＰＡ−４０６、ＰＡ−４０８、ＰＡ−４１２、ＰＡ−４１６、ＰＡ−４１８、ＰＡ−３０６、ＰＡ−３０６Ｓ、ＰＡ−３０８、ＰＡ−３１２、ＰＡ−３１６、ＰＡ−３１８、ＰＡ−３１８Ｌ、ＰＡ−３１８Ｌ、ＰＡ−４０８、ＰＡ−４１２、ＰＡ−４１８、ＨＰＡ２５、ＳＡ−１０Ａ、ＳＡ−１１Ａ、ＳＡ−１２Ａ、ＳＡ−２０Ａ、ＳＡ−２１Ａ、ＮＳＡ１００、ＵＢＡ１２０（以上、いずれも三菱化学株式会社製の商品名）等のダイヤイオン（商標）系陰イオン交換樹脂；ＯＰＴＩＰＯＲＥ−ＸＵＳ４０２８５．００、ＯＰＴＩＰＯＲＥ−ＸＵＳ４０３９０．００（以上、いずれもダウケミカル株式会社製の商品名）等の弱塩基性陰イオン交換樹脂などが挙げられる。上記陽／陰イオン交換樹脂のうち、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、フェノールホルマリン樹脂などを基体とし、イオン交換基としてスルホン酸基を有するもの等の強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、アンバーライト（商標）ＩＲ−１２０、ＩＲ−１２０Ｂ、ＩＲ−１２４、２５２、２００ＣＴ、；ダイヤイオン（商標）ＳＫ−１Ａ、ＳＫ−１Ｂ、ＳＫ−１０４、ＳＫ−１１０、ＳＫ−１１２、ＵＢＫ０８、ＵＢＫ１０、ＵＢＫ１２、ＦＭＫ−１０、ＰＫ−２０８、ＰＫ−２１２、ＰＫ−２１６、ＰＫ−２１８、ＰＫ−２２０、ＰＫ−２２８）等の、強酸性陽イオン交換樹脂、およびスチレン−ジビニルベンゼン共重合体などを基体とし、イオン交換基としてトリメチルアンモニウム基、β―ヒドロキシエチルジメチルアンモニウム基を有するもの等の強塩基性陰イオン交換樹脂（例えば、アンバーライト（商標）ＩＲＡ−４００、ＩＲＡ−４００Ｊ、ＩＲＡ−４０２ＢＬ、ＩＲＡ−４０４Ｊ、ＩＲＡ−４１０、ＩＲＡ−４１０Ｊ、ＩＲＡ−４１１、ＩＲＡ−９００Ｊ、ＩＲＡ−９０４、ＩＲＡ−９１０ＣＴ、ＩＲＡ−９５８、ＩＲＡ−９５８ＲＦ、；ダイヤイオン（商標）ＳＡ−１０Ａ、ＳＡ−１１Ａ、ＳＡ−１２Ａ、ＳＡ−１０Ｂ、ＦＭＡ−１０、ＮＳＡ１００、ＵＢＡ１２０、ＰＡ−３０６Ｓ、ＰＡ−３０８、ＰＡ−３１２、ＰＡ−３１６、ＰＡ−３１８Ｌ、ＨＰＡ２５、ＳＡ−２０Ａ、ＳＡ−２１Ａ、ＰＡ−４０８、ＰＡ−４１２、ＰＡ−４１８）等の、強塩基性陰イオン交換樹脂が好ましく使用される。また、上記陽／陰イオン交換樹脂以外の血小板活性化物質のうちでは、コラーゲンやポリスチレンビーズが好ましく使用される。なお、上記血小板活性化物質は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。

術野洗浄液と血小板活性化物質との混合比は、血小板活性化物質が、術野洗浄液中のエンドトキシン不存在下で発光の原因となる物質（例えば、血小板凝固因子）を十分除去できる量混合される限り、特に制限されない。具体的には、血小板活性化物質を、術野洗浄液１ｍＬに対して、好ましくは０．０５〜１．０ｇ、より好ましくは０．１〜０．５ｇの量で、混合・接触させることが好ましい。上記量であれば、血小板活性化物質により、術野洗浄液中のエンドトキシン不存在下で発光の原因となる物質を十分除去できる。なお、本明細書において、「エンドトキシン不存在下で発光の原因となる物質を除去する」とは、当該物質の存在による偽陽性を予防・防止することを意味する。このため、「エンドトキシン不存在下で発光の原因となる物質の除去」には、当該物質の物理的な除去に加えて、当該物質の不活性化をも包含する。このため、当該物質の除去後の術野洗浄液は、エンドトキシン不存在下で発光の原因となる物質を実質的に含まない形態、およびエンドトキシン不存在下では発光の原因とならない形態で当該物質を含む形態のいずれの形態をも包含する。

また、術野洗浄液と血小板活性化物質との混合・接触条件もまた、血小板活性化物質が、術野洗浄液中のエンドトキシン不存在下で発光の原因となる物質を十分除去できる条件であれば、特に制限されない。具体的には、血小板活性化物質を、術野洗浄液と、好ましくは１５〜４５℃で、より好ましくは２０〜４０℃で、０．５〜１５分間、より好ましくは３〜１０分間、混合・接触する。この際、術野洗浄液と血小板活性化物質との混合・接触は、攪拌条件下で行ってもまたは静置条件下で行ってもよい。

２．工程（ｉｉ）
本工程は、上記工程（ｉ）で術野洗浄液を血小板活性化物質と混合・接触した後、血小板活性化物質を術野洗浄液から除去して、被測定試料を調製する工程である。

本工程において、血小板活性化物質の除去方法は、特に制限されず、公知の方法が使用される。例えば、上記工程（ｉ）の混合液を所定時間（例えば、３分間以上）静置して血小板活性化物質を沈殿させた後、その上澄み液を得てもよい。または、上記工程（ｉ）の混合液を、遠心分離、濾過、吸引濾過、多孔質膜濾過、不織布濾過等の公知の分離方法を用いて術野洗浄液と血小板活性化物質とを分離して、その上澄み液や濾液を得てもよい。ここで、このようにして得られた上澄み液／濾液をそのまま被測定試料として使用してもよい。また、上記分離方法は、１種を単独で適用してもあるいは２種以上を適宜組み合わせて適用してもいずれでもよく、血小板活性化物質の除去程度によって適宜選択される。

３．工程（ｉｉｉ）
本工程は、上記工程（ｉｉ）で得られた被測定試料を、当該被測定試料中のエンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子含有試薬（以下、単に「Ｃ因子含有試薬」とも称する）および発光合成基質と反応させて、前記発光合成基質から前記発光基質を遊離させる工程である。なお、本工程において、被測定試料は、工程（ｉｉ）で得られた被測定試料全量を使用する必要はなく、通常、その一部が使用され、その量は、工程（ｉｖ）で発光量が測定できる量であればよく、適宜選択できる。

本明細書中、「エンドトキシン(endotoxin)」とは、細菌、特にグラム陰性菌の外膜を構成する成分の１つであり、リポ多糖（ＬＰＳ）がＣ因子の活性化に寄与する。エンドトキシンは、細菌、特にグラム陰性菌の表層に外膜の一部として存在する。また、エンドトキシンは、通常、菌の死後、血流中に遊離して存在している。このため、被測定試料中のエンドトキシン濃度を測定することによって、被測定試料中の菌の存在を検出することが可能である。

本工程では、エンドトキシンを含む被測定試料とＣ因子含有試薬（例えば、カブトガニの血球抽出液）とを混合・接触させると、被測定試料中のエンドトキシンにより反応系（例えば、リムルス反応系）が活性化する。より具体的には、Ｃ因子含有試薬がカブトガニの血球抽出液（ＬＡＬ：Limulus Amebocyte Lysate）である場合の、エンドトキシンによる反応系（リムルス反応系）の活性化メカニズムは下記のとおりである。すなわち、エンドトキシンは、Ｃ因子(Factor C)と結合してＣ因子を活性化し、活性化されたＣ因子（活性型Ｃ因子）はＢ因子(Factor B)をさらに活性化する。続いて、活性化されたＢ因子（活性型Ｂ因子）は前凝固酵素(Preclotting Enzyme)を活性化し、凝固酵素(Clotting Enzyme)が生成する。この凝固酵素はコアギュローゲン(Coagulogen)を基質として部分水解し、凝固タンパク質であるコアギュリン(Coagulin)を生成して、ゲル化する[T. Miyata, M. Hiranaga et al., Amino Acid Sequence of the Coagulogen from Limulus polyphemus Hemocytes, The Journal of Biological Chemistry, 259, 8924-8933 (1984)参照]。次に、当該反応系に発光合成基質が存在すると、発光合成基質のＣ末端のペプチド部分（例えば、Ａｒｇ）と発光基質との結合が切断して、発光合成基質から発光基質が遊離する。

本工程で使用されうるＣ因子含有試薬は、エンドトキシンとの反応により凝固酵素が生成されるものであれば、特に制限されない。例えば、従来リムルステストに使用されているカブトガニ血球抽出液(amebocyte lysate)の成分を好適に用いることができる。また、カブトガニ血球抽出液も特に制限されず、例えば、リムルス(Limulus)属、タキプレウス(Tachypleus)属、およびカルシノスコルピウス(Carcinoscorpius)属に属するカブトガニの血球から得られたものが使用できる。また、Ｃ因子含有試薬は、市販品を使用してもよく、例えば、リムルス試薬（ＬＡＬ(Limulus Amebocyte Lysate)試薬）として市販されているもの、エンドトキシン測定用のキットに付属のリムルス試薬（ＬＡＬ試薬）を用いることができる。エンドトキシン測定用のキットとしては、具体的には、Ｋｉｎｅｔｉｃ−ＱＣＬ、ＱＣＬ−１０００、パイロジェント５０００、パイロジェント０６プラス、パイロジェント０３プラス（いずれも、ロンザジャパン株式会社製の商品名）；リムルスＪテストワコー、リムルスＪシングルテストワコー、リムルスＪシングルテストワコー、リムルスＨＳ−Ｊシングルテストワコー、リムルスＥＳ−Ｊテストワコー、リムルスＦシングルテストワコー、リムルスＨＳ−Ｆテストワコー、リムルスＨＳ−Ｆシングルテストワコー、リムルスＥＳ−ＩＩテストワコー、リムルスＥＳ−ＩＩシングルテストワコー、リムルスＨＳ−Ｔシングルテストワコー、リムルスカラーＫＹテストワコー、リムルスカラーＫＹシングルテストワコー、リムルスＰＳシングルテストワコー（いずれも、和光純薬工業株式会社製の商品名）などが挙げられる。または、カブトガニ血球抽出物Ｊ凍結乾燥品、カブトガニ血球抽出物ＨＳ−Ｊ凍結乾燥品、カブトガニ血球抽出物Ｆ凍結乾燥品、カブトガニ血球抽出物ＨＳ−Ｆ凍結乾燥品、カブトガニ血球抽出物ＥＳ−ＩＩ凍結乾燥品（いずれも、和光純薬工業株式会社製の商品名）などをエンドトキシン測定用専用試薬として使用してもよい。

このように、Ｃ因子含有試薬として、従来、リムルステストに使用されているカブトガニ血球抽出成分（例えば、市販のリムルス試薬）を使用した場合には、上述したように、エンドトキシンを含む試料との反応により、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子および凝固酵素が生成する。これらはいずれもプロテアーゼ活性を有するタンパク質であることが知られている。したがって、発光合成基質としては、活性型Ｃ因子の認識配列を有するもの、活性型Ｂ因子の認識配列を有するもの、および凝固酵素の認識配列を有するものが使用できる。ここで、本発明の方法では、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子および凝固酵素のうちの１種を単独でプロテアーゼ活性を指標としても、または２種以上をプロテアーゼ活性の指標としてもよいが、操作の簡便性などを考慮すると、１種を使用することが好ましい。このため、それぞれの場合に応じて、指標とする酵素に対応する発色合成基質を適宜選択して用いればよい。

または、カブトガニのＣ因子の遺伝子の一部または全部に基づいて合成された組換遺伝子由来のリコンビナントＣ因子を用いることも可能である。このようなリコンビナントＣ因子は、特に制限されず、例えば、市販のパイロジーンｒＦｃ（ロンザジャパン株式会社製の商品名）に付属のリコンビナントＣ因子などを好適に用いることができる。または、リコンビナントＣ因子は、公知の遺伝子操作を用いて、カブトガニＣ因子の遺伝子を発現ベクターに挿入・スクリーニングし、得られた発現ベクターを適当な宿主細胞に形質転換して、当該細胞で組換タンパク質を発現、精製することによって製造してもよい。

このように、Ｃ因子含有試薬としてリコンビナントＣ因子を用いた場合には、当該試薬中にＢ因子および前凝固酵素は存在しないので、エンドトキシンを含む試料との反応により生成されるのは活性型のリコンビナントＣ因子のみである。ゆえに、この場合には、発光合成基質には活性型Ｃ因子の認識配列を有するものを使用すればよい。

Ｃ因子含有試薬の使用量は、被測定試料中のエンドトキシンと十分結合する量であれば特に制限されない。具体的には、Ｃ因子含有試薬の使用量（タンパク質濃度換算）は、被測定試料１ｍＬに対して、好ましくは１．５〜３．５ｍｇ程度、より好ましくは２．０〜３．３ｍｇ程度である。なお、市販品を使用する場合には、通常、製造社の指示に従って、適宜選択できる。

また、本工程で使用されうる発光合成基質は、ペプチドに発光基質が結合してなるものであればよい。本明細書において「発光基質」とは、生物発光で反応の基質となって光を発する物質を意味する。発光基質は、特に制限されず、公知の発光基質が使用できる。例えば、ホタルルシフェリン、下記式で表されるアミノルシフェリン、レニラルシフェリン、ウミホタルルシフェリン、ヴァルグリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、バクテリアルシフェリンなどが挙げられる。これらのうち、アミノルシフェリンを使用する場合には、アミノルシフェリン中のアミノ基が、隣接するアミノ酸のカルボキシル基とアミド結合を形成する。

または、発光基質は市販品を使用してもよい。具体的には、Ｄ−ルシフェリン(D-Luciferin)、Ｄ−ルシフェリンナトリウム(D-Luciferin Sodium Salt)、Ｄ−ルシフェリンナトリウム一水和物(D-Luciferin Sodium Salt Monohydrate)、Ｄ−ルシフェリンカリウム(D-Luciferin Potassium Salt)、Luciferase-Luciferin, Lyophilized、Luciferase, recombinant（いずれも、和光純薬工業株式会社製の商品名）、Ｄ（−）−ルシフェリン（Photinus pyralis ルシフェリン、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）などが挙げられる。

アミノルシフェリンと結合するペプチドは、当該ペプチドのＣ末端におけるアミノルシフェリンとのアミド結合が、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子および凝固酵素のいずれか１種のプロテアーゼ活性により切断されるアミノ酸配列からなるものであればよい。アミノ酸残基数およびアミノ酸配列は、特に限定されない。特異性、合成コスト、取扱い易さ等の観点を考慮すると、アミノ酸残基数は２個〜１０個が好ましい。

具体的には、凝固酵素の認識配列を有するペプチドとしては、以下に制限されないが、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−などが挙げられる。また、活性型Ｃ因子の認識配列を有するペプチドとしては、以下に制限されないが、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−などが挙げられる。活性型Ｂ因子の認識配列を有するペプチドとしては、以下に制限されないが、Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−、Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−などが挙げられる。上記ペプチドは、Ｎ末端が保護基で保護されていてもよい。保護基としては、通常この分野で用いられるものであれば限定されることなく用いることができる。具体的には、例えば、Ｎ−スクシニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゾイル基、ｐ−トルエンスルホニル基などが挙げられる。

または、発光合成基質は、例えば、特表２００５−５３０４８５号公報の実施例６及び実施例７に記載の方法を参照することにより合成することができる。また、Ｐｒｏｍｅｇａ社から市販されている「Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−Ｇｌｏ^ＴＭＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍｓ」に付属の発光合成基質（ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン）を使用することができる。発光合成基質中に遊離のアミノルシフェリンが含まれる場合は、これを予め除去しておくことが好ましい。発光合成基質から遊離のアミノルシフェリンを除去することにより、バックグラウンド発光を抑制することができる。遊離のアミノルシフェリンを除去する方法としては、例えば、２０ｍＭトリシン、８ｍＭＭｇ^２＋、０．１３ｍＭＥＤＴＡの緩衝液（ｐＨ７．８）中、０．８ｍＭ補酵素Ａ、１．５ｍＭＡＴＰ、２５０μｇ／ｍｌホタルルシフェラーゼおよび９０ｍＭＤＴＴを含む溶液と混合し、室温（２５℃）で１時間〜６時間インキュベートする方法が挙げられる。

または、発光合成基質は、市販品を使用してもよい。具体的には、エンドトキシン用ペプチドルシフェリン（株式会社バイオエネックス製）などがある。

発光合成基質の使用量は、十分量の発光基質を遊離できる量であれば特に制限されない。具体的には、発光合成基質の使用量は、好ましくは５０〜１００μＭであり、より好ましくは７０〜８０μＭである。なお、市販品を使用する場合には、通常、製造社の指示に従って、適宜選択できる。

また、本工程において、被測定試料とＣ因子含有試薬と発光合成基質との反応条件は、これらが反応して発光合成基質から発光基質が遊離する条件であれば特に制限されない。具体的には、反応温度は、好ましくは１５〜４５℃であり、より好ましくは２０〜４０℃である。また、反応時間は、好ましくは０．５〜２０分であり、より好ましくは１〜１５分であり、特に好ましくは３〜１０分である。また、被測定試料とＣ因子含有試薬と発光合成基質との反応順序は、上記３成分を同時に反応させても、あるいは、被測定試料とＣ因子含有試薬とを反応させた後、さらに発光合成基質を加えもよいが、後者が好ましい。その際の反応条件もまた、これらが反応して発光合成基質から発光基質が遊離する条件であれば特に制限されない。好ましくは、被測定試料とＣ因子含有試薬とをまず混合して、１５〜４５℃であり、より好ましくは２０〜４０℃で、０．５〜２０分間、より好ましくは１〜１５分間、特に好ましくは３〜１０分間程度反応（インキュベート）した後、発光合成基質を添加・混合して、１５〜４５℃であり、より好ましくは２０〜４０℃で、０．５〜２０分間、より好ましくは１〜１０分間、特に好ましくは３〜７分間程度反応（インキュベート）する。

４．工程（ｉｖ）
本工程は、上記工程（ｉｉｉ）で遊離した発光基質に発光酵素を作用させて、発光量を測定する。本工程では、発光基質（例えば、アミノルシフェリン、ルシフェリン）に発光酵素（例えば、ルシフェラーゼ）を作用させることにより、光が発生し、その発光量を測定する。

本工程で使用できる発光酵素は、特に制限されず、発光合成基質から遊離した発光基質の発光を触媒して、光を発生させるものであればいずれの発光酵素も使用できる。例えば、発光バクテリア(例えば、Vibrio fischeri)、ホタルイカ(Watasenia scintillans)、ウミホタル、昆虫等の生物の発光器官から精製した天然型ルシフェラーゼ、遺伝子工学的手法により調製した組み換え型ルシフェラーゼ、および天然型ルシフェラーゼのアミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸に付加、欠失または置換等の変異を導入した変異型ルシフェラーゼなどを使用することができる。ここで、昆虫由来のルシフェラーゼとしては、北米ホタル(Photinus pyralis；受託番号 M15077)、ゲンジボタル(Luciola cruciata；受託番号 M26194)、ヘイケボタル(Luciola lateralis；受託番号 Z49891, X66919)、ツチボタル(Arachnocampa luminosa)、ヒメボタル(Hotaria parvula；受託番号 L39929)、ヤエヤマヒメボタル(Yaeyama)、マドボタル(Pyrocoelia miyako；受託番号 L39928, Pyrocoelia pygidialis；受託番号 EU826678, Pyrocoelia pectoralis；受託番号 EF155570, Pyrocoelia rufa；受託番号 AY447203)、オバボタル(Lucidina biplagiata)、光コメツキムシ(Pyrearinus termitilluminar；受託番号 AF116843)、鉄道虫(Phrixothrix vivianii；受託番号 AF139644, Phrixothrix hirtus；受託番号 AF139645)、アキマドボタル(Pyrocoelia rufa)、イリオモテボタル(Rhagophthalmus ohbai)などの甲虫由来のルシフェラーゼを好適に用いることができる。これらの甲虫由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は、公知のデータベース（例えば、ＥＭＢＬＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／））に登録されており、一例として上記に受託番号を示す。

また、ルシフェラーゼは、上記したような天然型（野生型）ルシフェラーゼのアミノ酸配列を有するものに限定されず、発光基質の生物発光を触媒する機能を有する限り、これらのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼであってもよい。野生型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列としては、例えば、野生型のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列が挙げられる。ここで、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、挿入、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下（下限は１個））のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されることを意味する。

変異型ルシフェラーゼを使用する場合には、発光強度を増大するように修飾された変異型ルシフェラーゼを用いることが好ましい。このような変異型ルシフェラーゼを用いると、微量のエンドトキシンであっても高感度で測定できる。発光強度を増大するように修飾された変異型ルシフェラーゼは、公知であり、例えば、特開２００９−７７６６０号公報や特開２００７−９７５７７号公報などに記載される。より具体的には、以下の（ア）〜（オ）の変異型ルシフェラーゼが挙げられる。

（ア）野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列(GenBank Accession No. M15077)において、４２３位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）に置換され、４３６位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がグリシン（Ｇｌｙ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ（野生型北米ホタルルシフェラーゼの発光強度と比較して約１８倍）；
（イ）野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）に置換され、５３０位のロイシン（Ｌｅｕ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ（野生型北米ホタルルシフェラーゼの発光強度と比較して約１８倍）；
（ウ）野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４３６位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がグリシン（Ｇｌｙ）に置換され、５３０位のロイシン（Ｌｅｕ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ（野生型北米ホタルルシフェラーゼの発光強度と比較して約８倍）；
（エ）野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）に置換され、４３６位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がグリシン（Ｇｌｙ）に置換され、５３０位のロイシン（Ｌｅｕ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ（野生型北米ホタルルシフェラーゼの発光強度と比較して約２０倍）；および
（オ）野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）に、５３０位のロイシン（Ｌｅｕ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換され、さらに、４７位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がスレオニン（Ｔｈｒ）に、５０位のアスパラギン（Ａｓｎ）がセリン（Ｓｅｒ）に、５９位のメチオニン（Ｍｅｔ）がスレオニン（Ｔｈｒ）に、２５２位のスレオニン（Ｔｈｒ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ（野生型北米ホタルルシフェラーゼの発光強度と比較して約２１倍）。

上記変異型ホタルルシフェラーゼは、野生型ホタルルシフェラーゼの遺伝子を修飾して得られた変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を、公知の方法により発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞に導入して、組換えタンパク質として発現・精製することにより得ることができる。遺伝子の修飾は、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、有機合成等の、当業者に周知の方法により行うことができる。なお、北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列は、Accession No. M15077としてデータベース（例えば、EMBL Nucleotide Sequence Database(http://www.ebi.ac.uk/embl/)）に登録されている。また、上記（ア）〜（オ）に記載の変異型ホタルルシフェラーゼは、特開２００７−９７５７７号公報の実施例を参照することにより作製することができる。

また、ゲンジボタル、ヘイケボタル、ヒメボタル、マドボタル、光コメツキムシおよび鉄道虫のルシフェラーゼについても、上記北米ホタルのルシフェラーゼの場合と同様、公知のデータベースに登録されたルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて、公知の方法により変異型ルシフェラーゼを容易に取得することができる。さらに、上記北米ホタル由来の変異型ホタルルシフェラーゼの置換アミノ酸を参照することによって、他の甲虫由来のルシフェラーゼにおける同等の位置のアミノ酸を置換することにより、当業者は発光強度が増大した変異型ルシフェラーゼを容易に取得することができる。

または、発光酵素は、市販品を使用してもよい。具体的には、エンドトキシン用ペプチドルシフェラーゼ（株式会社バイオエネックス製）、ルシフェラーゼ（北米ホタルルシフェラーゼ、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイキット，高感度（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）などがある。

上記工程（ｉｉｉ）で遊離した発光基質への発光酵素の作用形式は、特に制限されず、公知と同様の方法が使用できる。また、市販品を使用する場合には、製造社の指示に従って反応（作用）および測定を行えばより。通常、上記工程（ｉｉｉ）で得られた術野洗浄液に、発光酵素（ルシフェラーゼ）を添加して、発光基質に発光酵素を作用させるが。この際、ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応には、ＡＴＰおよび２価金属イオンが必要である。このため、例えば、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンを含む緩衝液にルシフェラーゼを溶解し、このルシフェラーゼ溶液を添加することが好ましい。具体的には、例えば、２０〜４０℃、好ましくは約３７℃で反応を行い、ルシフェラーゼ溶液を添加後２秒から１０秒の発光量を計測する方法が挙げられる。ここで、発光量の測定方法は、特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、発光量の測定には、市販のルミノメータ（発光測定装置）、蛍光高度計を用いることができる。メーカーおよび性能については特に限定されないが、相対光量測定値が広範（例えば、０〜１０，０００，０００）に測定できる装置が好ましく使用される。具体的には、キッコーマン社のルミテスターＣ１０００やパーキンエルマー社のＡＲＶＯＬｉｇｈｔ等の仕様が好適である。測定は、使用する装置の説明書に従って行えばよい。

また、本発明では、エンドトキシンの濃度測定用キットを使用してもよい。ここで、エンドトキシンの濃度測定用キットは、Ｃ因子含有試薬、発光合成基質および発光酵素を構成成分として含有し、必要であれば、上記に加えて、必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成としてもよい。キットを使用することにより、エンドトキシンの濃度（発光量）を簡便かつ迅速に測定することができる。具体的には、上記したようなエンドトキシン用ペプチドルシフェリン・ルシフェリン（株式会社バイオエネックス製）、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイキット，高感度（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）など使用できる。

上記工程（ｉ）〜（ｉｖ）は、別々の工程として行っても、または連続して行ってもよい。例えば、図４に示されるデバイスを用いることによって、上記工程（ｉ）〜（ｉｖ）を連続的に行うことができる。以下、当該形態を具体的に説明するが、本発明は下記形態に限定されない。

図４に示されるデバイス１は、上部の中空の管状体２および下部の中空の管状体２’から構成される。このうち、下部の中空の管状体２’の底部には、試料採取部３が配置される。この試料採取部３は、工程（ｉｉｉ）における被測定試料の体積（図１の形態では、５０μＬ）を有する中空の管状構造を有し、上部は開口し、下部はゴムバルブなどで密閉される。また、上部の中空の管状体２の下部には、血小板活性化物質除去部４が設置され、さらにこの血小板活性化物質除去部４の上部に血小板活性化物質載置部５が設置される。ここで、血小板活性化物質除去部４は、工程（ｉｉ）において、術野洗浄液７から血小板活性化物質６を除去するために設置される。このため、血小板活性化物質除去部４は、血小板活性化物質６もしくは採取した術野洗浄液中に含まれる組織片を通過させない程度の網状物でありうる。一方、血小板活性化物質載置部５は、工程（ｉ）で術野洗浄液７と血小板活性化物質６とを混合・接触させるために設置される。このため、血小板活性化物質載置部５は、術野洗浄液７を通過させない程度の膜状物でありうる。また、後述するが、術野洗浄液７と血小板活性化物質６との混合・接触後は、血小板活性化物質載置部５の少なくとも一部に穴を開けることによって、血小板活性化物質６と術野洗浄液７との混合物を血小板活性化物質除去部４に移動させ、血小板活性化物質除去部４により血小板活性化物質６を術野洗浄液７から除去する（工程（ｉｉ））。このため、血小板活性化物質載置部５は、簡単に穴の開く程度の強度を有する膜状物でありうる。この血小板活性化物質載置部５に血小板活性化物質６が配置される。

まず、工程（ｉ）において、所定量の術野洗浄液７を上部の中空の管状体２に添加する（図４Ｂ）。これにより、術野洗浄液７は、血小板活性化物質載置部５上にある血小板活性化物質６と混合・接触する。血小板活性化物質載置部５で術野洗浄液７を血小板活性化物質６と所定時間混合・接触させた後、血小板活性化物質除去用部材８で血小板活性化物質載置部５に穴を開ける（図４Ｃ）。ここで、血小板活性化物質除去用部材８は、血小板活性化物質載置部５の少なくとも一部に穴を開ける構造を有するものであればよく、図４に示されるような棒状（棒状物が複数設置されてもよい）になっているものに限られず、はさみなどで血小板活性化物質載置部５に穴を開けてもよい。これにより、術野洗浄液７は血小板活性化物質除去部４を通過し、下部の中空の管状体２’に貯溜される。一方、血小板活性化物質６は、血小板活性化物質除去部４に保持される。すなわち、術野洗浄液から血小板活性化物質が除去されて、術野洗浄液７’が得られる。次に、上部の中空の管状体２と下部の中空の管状体２’とを分離し（図４Ｄ）、下部の中空の管状体２’の開口部を、密閉部材９で試料採取部３の開口部を密閉し、試料採取部３の下部に設置されたゴムバルブ（図示せず）にシリンジ１０を穿刺して、試料採取部３内部の術野洗浄液７’を採取する（図４Ｅ）。このように採取された試料が工程（ｉｉ）の被測定試料７”となる。さらに、この被測定試料７”を、別の容器１１に入れ（図４Ｆ）、この容器１１に、Ｃ因子含有試薬および発光合成基質（図４Ｇ中では、一括して「１２」で示す）（図４Ｇ）を順次添加して、被測定試料７”をＣ因子含有試薬及び発光合成基質と反応させて、発光合成基質から発光基質を遊離させる（工程（ｉｉｉ））。ここで遊離した発光基質に発光酵素１３を作用させて（図４Ｈ）、発光量を適当な測定装置１４で測定する（図４Ｉ）。

５．工程（ｖ）
本工程では、上記工程（ｉｖ）で得られた発光量を、基準値と比較する。上述したように、術野洗浄液中に特定数以下の菌数が存在していても、自助回復力によってその菌を死滅させることが期待できる。このため、「基準値」は、当該自助回復力によってその菌を死滅させることが期待できる菌数（エンドトキシン濃度）に対応する発光量となりうる。また、自助回復力によってその菌を死滅させることが期待できる菌数は、術式や術式、病気の重篤度、患者の体重などによって異なり、最終的には術者の判断にゆだねられる。通常、自助回復力によってその菌を死滅させることが期待できる菌数は、３０ＣＦＵ／ｍＬ以下（下限＝０ＣＦＵ／ｍＬ）であり、好ましくは２０ＣＦＵ／ｍＬ以下（下限＝０ＣＦＵ／ｍＬ）である。

以下では、自助回復力によってその菌を死滅させることが期待できる菌数が２０ＣＦＵ／ｍＬ以下（下限＝０ＣＦＵ／ｍＬ）である場合の、基準値を設定する方法について具体的に説明するが、本発明は下記方法に限定されるものではない。

５−１．方法（１）
本方法は、菌数が既知な試料を用いる場合の基準値の測定方法を説明する。

すなわち、既知の菌数（本形態の場合には、２０ＣＦＵ／ｍＬ）を含む標準物質を調製し、上記工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）において、被測定試料の代わりに当該物質を使用する以外は、上記工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）と同様の操作を行い、得られた発光量を基準値とする。なお、既知の菌数を含む標準物質は、例えば、Bio Ball（登録商標）シリーズ（シスメックス株式会社製）が使用できる。例えば、Bio Ball（登録商標）SingleShot 30 Escherichia coli NCTC12923（シスメックス株式会社製）は、Escherichia coli NCTC12923を約３０ＣＦＵ／個（２８〜３３ＣＦＵ／個）含むように作製されたボール状の製品（微生物定量試験用標準菌株）である。このため、当該製品を７５μＬの生理食塩水または蒸留水に添加し、均一に混合した混合液を５０μＬ採取することによって、２０ＣＦＵ／ｍＬの菌数を含む標準物質を調製できる。

５−２．方法（２）
本方法は、菌数が不明な試料を用いる場合の基準値の測定方法を説明する。

すなわち、まず、検出すべき菌（手術部位感染（ＳＳＩ）の原因と推定される細菌）を、一般的な培養方法によって、培養する。得られた培養液を遠心分離など公知の方法を用いて、菌体を分離する。この菌体数（菌濃度）が未知の菌試料に、蒸留水１ｍＬを加え、濁度（ＯＤ６００）を測定する。別途、同じ種に属し、菌数が既知の試料（参考試料）を用いて、２０ＣＦＵ／ｍＬ菌液の濁度（ＯＤ６００）を測定する。この結果をもとに、既知の２０ＣＦＵ／ｍＬ菌液の濁度と同じになるように、上記菌試料を蒸留水で希釈する。なお、本方法（２）において参考試料としては、上記方法（１）に記載されるBio Ball（登録商標）シリーズ（シスメックス株式会社製）が同様にして使用できる。このようにして得られた２０ＣＦＵ／ｍＬ菌液を、上記工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）において、被測定試料の代わりに使用して、上記工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）と同様の操作を行うことによって、得られた発光量を基準値とすることができる。

このようにして、上記工程（ｉｖ）で得られた発光量を、上記で得られた基準値と比較し、その結果、上記工程（ｉｖ）で得られた発光量が基準値以下である場合には、工程（ｉ）で採取した術野洗浄液中には自助回復力によってその菌を死滅させることが期待できる程度の菌数しか存在しないこととなる。このため、このような場合には、図２の「Ｙｅｓ」で示されるように、術野洗浄を終了して、術野洗浄液を吸引等によって術野から除去・廃液し、表皮を縫合して、手術を終了する。一方、上記工程（ｉｖ）で得られた発光量が基準値を超える場合には、工程（ｉ）で採取した術野洗浄液中には自助回復力によってはその菌を死滅できないほどの菌が存在している可能性がある。このため、このような場合には、図２の「Ｎｏ」で示されるように、再度術野洗浄を行い、得られた術野洗浄液について、再度工程（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返し、上記工程（ｉｖ）で得られた発光量が基準値以下になるまで、術野洗浄を繰り返す。このような場合であっても、工程（ｉ）〜（ｉｖ）が短時間で行えるため、患者への負担が少なくすむ。また、このような方法を使用することによって、術中にＳＳＩの原因と推定される細菌の存在を確認できるため、手術部位感染症を抑制・防止できる。

または、下記参考例１でも示すが、菌を含まない手術部位感染について工程（ｉ）〜（ｉｖ）を行っても、微量であるが発光量（バックグランドの発光量）を検出することがある。このような場合には、予めバックグランドの発光量を測定しておいて、図３および下記に示されるような計算式で得られた値（計算結果）に応じて、術野洗浄終了の可否を判断してもよい。すなわち、上記工程（ｉｖ）で得られた発光量、上記工程（ｖ）で得られた基準値およびバックグランドの発光量を下記計算式にあてはめて、得られた結果（計算結果）が１以下である場合には、工程（ｉ）で採取した術野洗浄液中には自助回復力によってその菌を死滅させることが期待できる程度の菌数しか存在しないこととなる。このため、このような場合には、図３の「Ｙｅｓ」で示されるように、術野洗浄を終了して、術野洗浄液を吸引等によって術野から除去・廃液し、縫合して、手術を終了する。一方、上記工程（ｉｖ）で得られた発光量、上記工程（ｖ）で得られた基準値およびバックグランドの発光量を下記計算式にあてはめて、得られた結果（計算結果）が１を超える場合には、工程（ｉ）で採取した術野洗浄液中には自助回復力によってはその菌を死滅できないほどの菌が存在している可能性がある。このため、このような場合には、図３の「Ｎｏ」で示されるように、再度術野洗浄を行い、得られた術野洗浄液について、再度工程（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返し、算出される計算結果が１以下になるまで、術野洗浄を繰り返す。このような場合であっても、工程（ｉ）〜（ｉｖ）が短時間で行えるため、患者への負担が少なくすむ。また、このような方法を使用することによって、術中にＳＳＩの原因と推定される細菌の存在を確認できるため、手術部位感染症を抑制・防止できる。

なお、バックグランドの発光量は、例えば、以下のようにして得られる。すなわち、患者の血液を採取して、当該血液を生理食塩水で適当（例えば、１０，０００〜１，０００，０００倍）に希釈したサンプルをバックグランドサンプルとし、当該サンプルについて、上記工程（ｉ）〜（ｉｖ）を行い、得られた発光量を「バックグランドの発光量」とする。

本発明の方法によると、血液成分などの生体試料を含む術野洗浄液であっても、術野洗浄液の菌の存在が自助回復力によって死滅できるか否かを確認することができる。上記利点に加えて、本発明の方法によると、２０分以内、好ましくは１５分以内、より好ましくは１２分以内という短時間での検出が可能である。このため、患者への負担を有意に軽減することができ、また、術中に菌を検出できるため、表皮を縫合する前に細菌が検出でき、ＳＳＩを有効に予防することができる。

本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。

参考例１
ヘパリン処理を施したヒト全血を、生理食塩水で１０，０００倍に希釈し、希釈サンプルを調製した。この希釈サンプルを用いて、全培養した大腸菌(Escherichia coli)菌液を、菌濃度が１３ＣＦＵ／ｍＬ、１３０ＣＦＵ／ｍＬ及び１１７３ＣＦＵ／ｍＬになるように、それぞれ調製した。ここで、各サンプルを、それぞれ、試料Ａ−１３（菌濃度が１３ＣＦＵ／ｍＬ）、試料Ａ−１３０（菌濃度が１３０ＣＦＵ／ｍＬ）、および試料Ａ−１１７３（菌濃度が１１７３ＣＦＵ／ｍＬ）と称する。また、菌を添加しない希釈サンプル自体を、コントロールとして使用し、これを試料Ｃ−１と称する。

また、別途、ヘパリン処理を施したヒト全血に血小板活性化物質としての陽イオン交換樹脂アンバーライトＩＲ−１２０を０．２ｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃の静置条件下で１０分間、混合・接触させた後、上澄み液を回収し、５分以上氷冷した。さらに、氷冷後のヒト全血試料を生理食塩水で１０，０００倍に希釈し、得られた被測定試料をＣ−２と称する。

上記試料Ａ−１３、Ａ−１３０、Ａ−１１７３、Ｃ−１及びＣ−２を、それぞれ、５０μＬずつ採取し、これを、それぞれ、エンドトキシンキット（商品名：エンドトキシン−シングルテストワコー（比濁時間分析法）、和光純薬株式会社製）に添付されるリムルス試薬が５０μＬ入った生物発光測定専用試験管（ルミチューブ、キッコーマン株式会社）に添加し、３７℃、１０分間、インキュベーターで加温した。

その後、１ｍＭＭｇＳＯ_４及び１０％トレハロースを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に溶解した７５μＭエンドトキシン用ペプチドルシフェリン（Ｂｚ−ＬＧＲ−Ｌｕｃ溶液、株式会社バイオエネックス製）（発光合成基質）５０μＬを添加し、３７℃、５分間、インキュベーターで加温した。加温後、反応液に１ｍＭＭｇＳＯ_４及び１０％トレハロースを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）に溶解したエンドトキシン用ルシフェラーゼ（ルシフェラーゼＦＭ、株式会社バイオエネックス製）（発光酵素）５０μＬを添加した後、１ｍＭＭｇＳＯ_４及び１０％トレハロースを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に溶解した１０^−５ＭＡＴＰ溶液５０μＬを添加し、数回チューブをタッピングし攪拌させ、ルミノメーター（商品名：ルミテスターＣ−１１０、キッコーマン食品株式会社製）にて発光量（ＲＬＵ）を測定した。なお、エンドトキシン用ペプチドルシフェリン（Ｂｚ−ＬＧＲ−Ｌｕｃ溶液、株式会社バイオエネックス製）（発光合成基質）、エンドトキシン用ルシフェラーゼ（ルシフェラーゼＦＭ、株式会社バイオエネックス製）（発光酵素）、およびＡＴＰ溶液は、予め、３７℃のインキュベーターで加温した。また、各実験は、Ｎ＝３で行った。

結果を、下記表１および図５に示す。

上記表１および図５から明らかなように、血小板活性化物質で処理しない試料Ｃ−１は、菌濃度が１３ＣＦＵ／ｍＬの試料Ａ−１３とほぼ同等の発光量を示す。これから、生体試料（血液成分）を含む試料は、血小板活性化物質で処理しない場合には、菌（エンドトキシン）が存在しない場合であっても発光してしまうのに対して、血小板活性化物質で処理することによって、菌（エンドトキシン）が存在しない試料Ｃ−２の発光量を有意に低減して、菌濃度が１３ＣＦＵ／ｍＬの試料Ａ−１３の発光量と有意に識別できる。

実施例１
ヘパリン処理を施したヒト全血をヒト全血試料として調製した。

次に、このヒト全血試料に血小板活性化物質としての陽イオン交換樹脂アンバーライトＩＲ−１２０を０．２ｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃の静置条件下で、それぞれ、１、３、５、１０分間、混合・接触させた。所定時間混合・接触させた後、上澄み液を回収し、５分以上氷冷した。さらに、氷冷後のヒト全血試料を生理食塩水で１０，０００倍に希釈することによって、被測定試料Ｂ−１（１分間混合・接触）、Ｂ−３（３分間混合・接触）、Ｂ−５（５分間混合・接触）、Ｂ−１０（１０分間混合・接触）を調製した。また、血小板活性化物質と接触させていない希釈サンプルを、コントロールとして使用し、これを試料Ｃ−３と称する。

上記試料Ｂ−１、Ｂ−３、Ｂ−５、Ｂ−１０及びＣ−３を、それぞれ、５０μＬずつ採取し、これを、それぞれ、エンドトキシンキット（商品名：エンドトキシン−シングルテストワコー（比濁時間分析法）、和光純薬株式会社製）に添付されるリムルス試薬が５０μＬ入った生物発光測定専用試験管（ルミチューブ、キッコーマン株式会社）に添加し、３７℃、１０分間、インキュベーターで加温した。

結果を、下記表２および図６に示す。

上記表２および図６から明らかなように、血小板活性化物質で処理した試料Ｂ−１、Ｂ−３、Ｂ−５、Ｂ−１０は、血小板活性化物質で処理しない試料Ｃ−３の発光量に比して、発光量を低減できる。この結果から、血小板活性化物質で処理しない試料Ｃ−３では、血液中に含まれる成分が試薬と反応して、発光反応が進行してしまうが、血液を血小板活性化物質で処理することによって、この血液中に含まれる成分を減少させ、その結果菌が存在しない際のバックグランドの発光量を減少させることできることが考察される。

また、特に血小板活性化物質との接触・混合時間を３分以上とすることによって、血小板活性化物質で処理しない試料Ｃ−３の発光量と有意に識別できることが分かる。

１…デバイス、
２…上部の中空の管状体、
２’…下部の中空の管状体、
３…試料採取部、
４…血小板活性化物質除去部、
５…血小板活性化物質載置部、
６…血小板活性化物質、
７、７’…術野洗浄液、
７”…被測定試料、
８…血小板活性化物質除去用部材、
９…密閉部材、
１０…シリンジ、
１２…Ｃ因子含有試薬および発光合成基質、
１３…発光酵素、
１４…測定装置。

Claims

（ｉ）術野洗浄液を血小板活性化物質と混合・接触させ；
（ｉｉ）前記血小板活性化物質を前記術野洗浄液から除去して、被測定試料を得；
（ｉｉｉ）前記被測定試料中のエンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子含有試薬および発光合成基質を反応させて、前記発光合成基質から前記発光基質を遊離させ；
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で遊離した発光基質に発光酵素を作用させて、発光量を測定し；さらに
（ｖ）前記工程（ｉｖ）で得られた発光量を、基準値と比較する、
ことを有する術野洗浄液中の菌の検出方法。
前記基準値は、既知の菌数を含む標準物質を前記被測定試料の代わりに用いて前記工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を行うことによって得られる、請求項１に記載の方法。
前記血小板活性化物質は、
陽イオンがＣａ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｎａ^＋、またはＨ^＋である陽イオン交換樹脂；陰イオンがＳＯ_４ ^２−、Ｉ⁻、ＮＯ_３ ⁻、ＣｒＯ_４ ^２−、Ｂｒ⁻、Ｃｌ⁻、ＯＨ⁻、またはＦ⁻である陰イオン交換樹脂；コラーゲン、フィブリン、ＡＤＰ、アラキドン酸、トロンビン、セロトニン、プロタミン、カルシウム塩、ＲＧＤペプチド、若しくは凝固因子から構成されるまたは前記いずれかの物質で被覆されるビーズ；珪砂、結晶シリカ、珪藻土、ガラス微粉末、カオリン、ベントナイト；ならびにポリスチレン、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリアリレート、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、およびポリアクリル酸からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１または２に記載の方法。
前記工程（ｉ）において、術野洗浄液を血小板活性化物質と、３〜１０分間、混合・接触する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。