JP7323816B2 - エンドトキシン測定方法 - Google Patents
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Description
また、臨床診断上では、血液中のエンドトキシンを正確に測定することは、早期診断や治療効果の判定に極めて重要であると考えられる。
生物発光法による発光分析に使用する試薬は、生物由来の試薬を使用することも多く、ロット毎に感度が異なる傾向にある。そのため、試薬のロット毎に、測定対象成分と発光量との関係を示す検量線を求めることが行われている。
本発明者らがその原因を検討したところ、同じロットでも試薬キット毎に微妙に試薬量が異なり、それに応じて、バックグラウンド発光の要因となる物質量も異なってしまうためであることが判明した。
本発明は上記事情に鑑みて、試薬キット毎に異なるバックグラウンド発光の影響を排除して、エンドトキシン濃度を再現性良く測定することが可能なエンドトキシン測定方法を提供することを課題とする。
[1]試料液と、エンドトキシンにより活性化する試薬と、活性化した試薬により、発光基質を遊離させる発光合成基質と、遊離した発光基質を発光させる発光酵素とを含む測定液を調製し、
前記測定液の調製後第1の時間T1経過後における第1発光量L1と第2の時間T2経過後における第2発光量L2とを測定し、
前記第1発光量L1と前記第2発光量L2に基づき、エンドトキシンに基づく正味発光量LXを求め、求めた正味発光量LXに基づき、試料液中のエンドトキシン濃度を求めるエンドトキシン測定方法。
ただし、前記第1の時間T1は試料液に代えてエンドトキシンを含まないブランク液を測定したときの発光量が最大値又は最大値近くとなり、かつ、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に有意の差が認められない時間であり、前記第2の時間T2は、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に有意の差が認められる時間である。
[2]前記第2発光量L2から前記第1発光量L1を差し引いた発光量を、前記正味発光量LXとする、[1]に記載のエンドトキシン測定方法。
[3]前記エンドトキシンにより活性化する試薬、前記発光合成基質、及び前記発光酵素が収容された測定容器に、前記試料液を注入することによって、前記測定液を調製する、[1]又は[2]に記載のエンドトキシン測定方法。
[4]前記エンドトキシンにより活性化する試薬、前記発光合成基質、及び前記発光酵素が、凍結乾燥状態で収容された測定容器に、前記試料液を注入することによって、前記測定液を調製する、[1]又は[2]に記載のエンドトキシン測定方法。
[5]前記エンドトキシンにより活性化する試薬がライセート試薬であり、前記発光合成基質がペプチドに発光基質が結合してなり、前記ペプチドと前記発光基質の結合は、活性型C因子、活性型B因子、および凝固酵素の少なくともいずれか1種の作用により切断される構造である、[1]~[4]のいずれか一項に記載のエンドトキシン測定方法。
[6]前記発光基質がアミノルシフェリンであり、前記発光酵素がルシフェラーゼである、[1]~[5]のいずれか一項に記載のエンドトキシン測定方法。
図1(a)に示すように、まず、測定容器1の容器本体2から蓋3を取り外す。容器本体2は、少なくともエンドトキシンに基づく発光を透過可能な素材、例えば、ガラス等で構成されている。
試薬キット6を収容した測定容器1は、使用時まで、冷蔵状態で保管されることが好ましい。
ペプチドの具体的なアミノ酸配列としては、特許文献1に記載の配列が挙げられる。
なお、試料液が塩分を含む場合、試薬キット6は、塩分濃度に起因する誤差を解消するために、さらにNaClを含んでいてもよい。
ライセート試薬(カブトガニ血球抽出成分)中にはエンドトキシンと特異的に反応するC因子経路が存在する。
なお、遊離したアミノルシフェリンをルシフェラーゼで発光させる反応には、ATPおよび2価金属イオン(図2では、マグネシウムイオンを例示)が関与する。
測定装置100は、測定液4を収容した測定容器1が測定装置100の測定室10に格納され、測定室10の扉12が閉められると測定を開始し、エンドトキシン濃度を求める。
準備時間は、例えば1~60秒の範囲、好ましくは5~10秒の範囲とすることができる。準備時間のばらつきは、30秒以内とすることが好ましく、5秒以内とすることがより好ましい。
具体的には、試薬キット6が、ライセート試薬とペプチドにアミノルシフェリンが結合した発光合成基質とルシフェラーゼを含む場合の、エンドトキシン濃度が「0EU/mL」のブランク液のデータ(2つ)と、エンドトキシン濃度が「0.005EU/mL」の試料液のデータの例を示している。
図3の縦軸は発光量である。
第2の時間T2は、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に有意の差が認められる時間である。
本発明者らが確認したところ、バックグラウンド発光は、比較的短い反応時間で開始して急速に立ち上がり、最大値となった後は、緩やかに下降する傾向にあった。
そして、ライセート反応系の活性化とその後の反応が進み、エンドトキシンに基づく発光が生じてくると、バックグラウンド発光とエンドトキシンに基づく発光を合わせた発光が観察されたものと考えられた。
すなわち、第1発光量L1と第2発光量L2に基づき、エンドトキシンに基づく正味発光量LXを求められることがわかった。
LX=L2-L1 ・・・(1)
また、ブランク液を測定したときの発光量が、第1の時間T1から第2の時間T2までの間に多少変化することを考慮すると、例えば、以下の式(2)により求めれば、より高い精度で正味発光量LXを求めることができる。
LX=L2-L1×k ・・・(2)
ここで、kは定数であり、第2の時間T2におけるブランク液の発光量を、第1の時間T1におけるブランク液の発光量で除することにより求められる。
第1の時間T1は、ブランク液を測定したときの発光量が最大値近くとなる時間であれば、最大値となる時間からずれていてもよい。
図3の例では、反応時間100~300秒の間であれば、概ね最大値の95%以上の発光量となっている。
測定装置100のフルスケールに相当するエンドトキシンを含む試料液とブランク液のデータとを対比した際、上記閾値は、ブランク液を測定したときの最大値の0~50%であることが好ましく、最大値の0~30%である量であることがより好ましく、最大値の0~10%であることがさらに好ましい。
第1の時間T1を決めるにあたって、上記閾値が好ましい範囲の下限値以上であれば、第1の時間T1選択の自由度が高まり、好ましい範囲の上限値以下であれば、試料液を測定した際のバックグラウンドの発光量の推定精度が高まる。
測定装置100のフルスケールに相当するエンドトキシンを含む試料液とブランク液のデータとを対比した際、上記閾値は、ブランク液を測定したときの最大値の5~100%であることが好ましく、最大値の10~100%である量であることがより好ましく、最大値の20~100%であることがさらに好ましい。
第2の時間T2を決めるにあたって、上記閾値が好ましい範囲の下限値以上であれば、正味発光量LXが充分に大きい値となり、測定精度が高まる。好ましい範囲の上限値以下であれば、エンドトキシン濃度を求めるまでの時間を短くすることができる。
検量線は、エンドトキシン濃度が異なる複数の校正液を用いて作成することが好ましい。検量線は、試薬のロット毎にメーカー等が作成し、測定者に提供してもよい。
しかし、本発明者らは、ブランク液を測定した際の試薬キット6の量が、試料液を測定した際の試薬キット6の量と異なると、ブランク液を試料液と同じ条件で測定した際の発光量が、試料液を測定した際のバックグラウンドの発光量と異なってしまうことに気がついた。
したがって、精度良く、試料液のエンドトキシン濃度を測定することができる。
図4の発光分析装置は、測定容器1を格納可能な測定室10と測定室10に収容された測定容器1内からの光を検出する光検出器20と光検出器20で検出した発光量が入力される演算装置30とを備えている。
測定室本体11は、側面に設けられた光透過性の検出窓11bの部分以外は遮光性とされている。また扉12も遮光性とされている。
本実施形態では、光検出器20は、扉12が閉状態のときのみ、光を検出するようになっている。例えば光検出器20が光電子増倍管の場合、扉12が閉状態のときのみ光検出器20に電圧がかかるようになっている。
これにより、測定容器1を測定室10に格納するだけで自動的に演算装置30に試料液中のエンドトキシン濃度を求める作業を開始させることができる。
このバックグラウンド発光を検出できたか否かの判断は、具体的には、光検出器20が検出した発光量が、所定のしきい値以上であるか否かにより行う。
しきい値は、試薬キット6自体のバックグラウンド発光が生じていると明確に判断できる発光量とする。
しきい値は、試薬キット6自体のバックグラウンド発光の発光量の10~100%とすることが好ましく、30~70%とすることがより好ましく、例えば50%程度とすることができる。
すると、演算装置30は、光検出器20で検出した発光量を、予め記憶した検量線の測定対象成分濃度ゼロにおける発光量と対比して、光検出器20の感度変化を確認する。
また、両者の差を求める場合は、求めた差が予め定めた所定範囲の差を超えた場合、光検出器20の感度が所定の許容範囲を超えて変動したと判断する。
所定の範囲は求められる測定精度等に応じて適宜設定して演算装置30に記憶させればよい。
光検出器20の感度調整は、光検出器20が光電子増倍管である場合、光検出器20に印加する電圧を変更することにより調整できる。
発光物質は、測定対象成分が存在しない状況下において、試薬キット6に含まれる発光酵素により発光する物質、又はそれ自体が発光する物質であり、複数の試薬で構成された試薬群であってもよい。
それ自体が発光する物質としては、試薬キット6中に含まれる発光酵素とは別の発光酵素とその別の発光酵素により発光する発光基質との組み合わせ、例えば、ヒカリコメツキムシルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせ、ウミシイタケルシフェラーゼとセレンテラジンとの組み合わせ等が挙げられる。
例えば、試薬キット6がアミノルシフェリンを遊離する発光合成基質を含み、発光酵素としてルシフェラーゼを含む場合の発光物質としては、アミノルシフェリンを使用することが好ましい。
例えば、試薬キット6がアミノルシフェリンを遊離する発光合成基質を含み、発光酵素としてルシフェラーゼを使用する場合の発光物質としては、ヒカリコメツキムシルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせとすることが好ましい。
2 容器本体
3 蓋
4 測定液
5 マイクロピペット
6 試薬キット
10 測定室
12 扉
100 測定装置
T1 第1の時間
T2 第2の時間
L1 第1発光量
L2 第2発光量
LX 正味発光量
Claims (6)
- 試料液と、エンドトキシンにより活性化する試薬と、活性化した試薬により、発光基質を遊離させる発光合成基質と、遊離した発光基質を発光させる発光酵素とを含む測定液を調製し、
前記測定液の調製後第1の時間T1経過後における第1発光量L1と第2の時間T2経過後における第2発光量L2とを測定し、
前記第1発光量L1と前記第2発光量L2に基づき、エンドトキシンに基づく正味発光量LXを求め、求めた正味発光量LXに基づき、試料液中のエンドトキシン濃度を求めるエンドトキシン測定方法。
ただし、前記第1の時間T1は試料液に代えてエンドトキシンを含まないブランク液を測定したときの発光量が最大値又は最大値近くとなり、かつ、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に有意の差が認められない時間であり、前記第2の時間T2は、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に有意の差が認められる時間である。 - 前記第2発光量L2から前記第1発光量L1を差し引いた発光量を、前記正味発光量LXとする、請求項1に記載のエンドトキシン測定方法。
- 前記エンドトキシンにより活性化する試薬、前記発光合成基質、及び前記発光酵素が収容された測定容器に、前記試料液を注入することによって、前記測定液を調製する、請求項1又は2に記載のエンドトキシン測定方法。
- 前記エンドトキシンにより活性化する試薬、前記発光合成基質、及び前記発光酵素が、凍結乾燥状態で収容された測定容器に、前記試料液を注入することによって、前記測定液を調製する、請求項1又は2に記載のエンドトキシン測定方法。
- 前記エンドトキシンにより活性化する試薬がライセート試薬であり、前記発光合成基質がペプチドに発光基質が結合してなり、前記ペプチドと前記発光基質の結合は、活性型C因子、活性型B因子、および凝固酵素の少なくともいずれか1種の作用により切断される構造である、請求項1~4のいずれか一項に記載のエンドトキシン測定方法。
- 前記発光基質がアミノルシフェリンであり、前記発光酵素がルシフェラーゼである、請求項1~5のいずれか一項に記載のエンドトキシン測定方法。
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