JP2022538169A - 光測定アッセイにおける試料マトリックス効果に対処するための方法 - Google Patents

Abstract

光測定アッセイにおける試料マトリックス効果に対処するための方法が提供される。選択した量の発光材料が試料に添加され、試料からの光出力が測定される。既知の発光材料の量と測定された光出力とに基づくアルゴリズムを使用することにより、試料のアッセイのための補正係数が決定される。補正係数を使用して、アッセイを使用して記録された他の試料の後続の光出力測定値を調整することができる。

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１９年６月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／８６８，６６１号に対する優先権を主張し、その教示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

試料中の目的の物質の存在、量、又は独自性を測定するために使用される多くの分析技術について、試料中の背後にある成分、すなわち試料マトリックスの組成が、分析が実施される方法と得られる結果の品質の両方に大きな影響を有し得ることはよく理解されている。例えばイオン強度やｐＨなどの試料マトリックスの特性は、試験対象の化合物のコンフォメーション又はプロトン化状態に影響を与える可能性がある。キレート剤、プロテアーゼ、及び阻害剤は、特定の分析ワークフローに関連する酵素の必要な活性を妨げる可能性がある。試料マトリックス内の他の材料は、分析物と同様の特性を示し、測定を混乱させ、観察の根本的な起源を確認することを困難にする可能性がある。これらの各ケースで、偽陽性又は偽陰性の結果は、アッセイが特定の用途に必要な正確度又は精度を達成することを妨げる可能性がある。

試料から検出器に到達する光の観察及び定量化に依存する分析プロトコールの場合、試料マトリックス効果を考慮することが同様に重要となり得る。場合によっては、試料の濁度が、光が検出器に到達する前に試料を通過する光の透過を低下させる可能性がある。試料マトリックスの１種以上の要素が、観察される波長の光に対して消光効果を有する場合、試料からの光出力も減少する可能性がある。あるいは、一部の試料には、光を増幅するか又は光の向きを変える成分が含まれている場合があり、このため、これらの成分がない場合に得られた読み取り値に比べて、アッセイ結果が誇張される可能性がある。試料マトリックスの組成が変わらない場合でも、試料マトリックスの量の変動は分析結果に追加的に影響を与える可能性がある。

光測定アッセイにおいて試料マトリックス効果に対処するためのほとんどの従来のアプローチは、もっぱら外部光源の使用を伴う。例えば透過照明又は落射照明光源を使用して、未知の又は未決定のマトリックスを有する試料に又は試料を通して光を投射することができ、通過、反射、又は放出された光が測定される。この操作は、既知のマトリックスを有する基準試料に対して繰り返され、試料と基準データが比較される。これらの手法では、試料の外側にありアッセイ装置の一部である光源のみを使用するため、得られる試料補正は個々の機器と密接に関連している。さらに、これらの操作は、目的の分析物に関連する測定された光が試料自体の内部から発生する試料タイプへの適用を、より限定する可能性がある。

従って、分析試料間の試料マトリックスの違いに対処し、これを補償する方法の必要性が存在する。マトリックス組成の違いや変化の補償は、特に時間分解蛍光共鳴エネルギー移送（ＦＲＥＴ）では困難な場合がある。本開示は、これら及び他の必要性を提供する。

（簡単な要約）
１つの実施態様において、本開示は、分析物を含む試験試料中のヘマトクリット（％ＨＣＴ）の未知濃度を決定するための方法を提供し、この方法は以下を含む：
ａ）均一な容量又は濃度の分析物を試料に添加する工程；
ｂ）既知量の発光材料を試料に添加する工程であって、前記発光材料は光出力を生成する工程；
ｃ）試料中の少なくとも２つの既知の異なるヘマトクリット濃度レベルを使用して、試料中の光出力とパーセントヘマトクリットとのアルゴリズム的関係を決定する工程；及び
ｄ）分析物を有する試験試料中の、発光材料からの測定された光出力と工程ｃで決定されたアルゴリズム的関係とを使用して、（％ＨＣＴ）ヘマトクリットの未知濃度を決定する工程。

アルゴリズム的関係は、例えば線形、非線形、対数、指数、又は多項式のカーブフィッティングアルゴリズムであり得る。

特定の態様において、分析物は、抗ＴＮＦα薬、タンパク質、ビタミン、又は炎症性タンパク質である。

別の実施態様において、本開示は、試験試料の全血中の分析物血漿濃度を決定するための方法を提供し、この方法は以下を含む：
ａ）均一な容量又は濃度の分析物を試料に添加する工程；
ｂ）既知量の発光材料を試料に添加する工程であって、前記発光材料は光出力を生成する工程；
ｃ）前記発光材料からの少なくとも２つの別個の光出力を測定する工程であって、第１の光出力は既知量の発光材料と相関し、そして第２の光出力は分析物濃度を決定するために使用される工程；
ｄ）既知量の発光材料の出力と既知の％ヘマトクリット濃度とのアルゴリズム的関係を決定する工程；
ｅ）工程ｄのアルゴリズム的関係を使用して、試験試料のヘマトクリット濃度を決定する工程；
ｆ）ヘマトクリットの較正曲線と分析物のシグナル出力との数学的関係を決定する工程；及び
ｇ）工程ｅ及びｆに従って、試料内のヘマトクリット量を考慮して、較正曲線又は較正曲線からの出力のいずれかを調整して、試験試料中の前記分析物の血漿濃度を決定する工程。

特定の態様において、分析物は、抗ＴＮＦα薬、タンパク質、ビタミン、又は炎症性タンパク質、例えばＣ反応性タンパク質である。

別の実施態様において、本開示は、試験試料に添加された緩衝液の容量を決定するための方法を提供し、この方法は以下を含む：
ａ）均一な容量又は濃度の分析物を試料に添加する工程；
ｂ）既知量の発光材料を試料に添加する工程であって、前記発光材料は光出力を生成する工程；
ｃ）試料中の少なくとも２つの別個の光出力を測定する工程であって、第１の光出力は既知量の発光材料と相関し、そして第２の光出力は分析物濃度を決定するために使用される工程；
ｄ）既知量の発光材料の出力と試料に添加された緩衝液容量とのアルゴリズム的関係を決定する工程；及び
ｅ）前記アルゴリズム的関係を使用して、試験試料に添加された緩衝液容量を決定する工程。

特定の態様において、分析物は糞便カルプロテクチンである。

別の実施態様において、本開示は、試験試料中の未知の緩衝液濃度中のドナー及びアクセプターを有するＦＲＥＴアッセイを使用して分析物濃度を決定するための方法を提供し、この方法は以下を含む：
ａ）均一な容量又は濃度の分析物を試料に添加する工程；
ｂ）既知量の発光材料を試料に添加する工程であって、前記発光材料は光出力を生成する工程；
ｃ）試料中の少なくとも２つの別個の光出力を測定する工程であって、第１の光出力は既知量の発光材料と相関し、そして第２の光出力は分析物濃度を決定するために使用される工程；
ｄ）既知量の発光材料の出力と試料に添加された緩衝液容量とのアルゴリズム的関係を決定する工程；
ｅ）試験試料に添加された緩衝液容量を決定する工程；
ｆ）添加された緩衝液容量と分析物シグナル出力とのアルゴリズム的関係を決定する工程；及び
ｇ）工程ｅ及びｆに従って、試験試料内に添加された緩衝液容量を考慮して、較正曲線又は較正曲線からの出力のいずれかを調整して、分析物の血漿濃度を決定する工程。

さらに別の実施態様において、本開示は、試料のアッセイのための補正係数を決定するための方法を提供する。この方法は、選択された量の発光材料を試料に加えることを含む。この方法は、試料内の発光材料からの観察された光出力の測定値を得ることをさらに含む。この方法はさらに、観察された光出力測定値と試料からの予測される光出力とを関連付けるアルゴリズムを適用して、補正係数を決定することを含む。

いくつかの実施態様において、アルゴリズムの適用は、観察された光出力測定値と選択された量の発光材料又は予測される光出力との関数を使用して、補正係数を計算することを含む。いくつかの実施態様において、アルゴリズムの適用は、探索表から値を検索することを含む。いくつかの実施態様において、アルゴリズムは、アッセイを使用する以前の測定値から導かれる。特定の態様において、以前の測定値は、２つ以上の以前の試料からの観察された光出力のものであり、ここで、２つ以上の以前の試料のうちの少なくとも２つは、互いに異なるマトリックスを有する。特定の態様において、以前の測定値は、２つ以上の以前の試料からの観察された光出力のものであり、ここで、２つ以上の以前の試料のうちの少なくとも２つは、互いに異なる容量を有する。

いくつかの実施態様において、試料は第１の試料であり、この方法はさらに、アッセイを使用して第２の試料からの観察された光出力の第２の測定値を記録し、決定された補正係数を使用して第２の測定値を調整し、こうして補正された測定値を計算することを含む。特定の態様において、第２の試料は第１の試料と同じマトリックスを有する。特定の態様において、第２の試料は第１の試料と同じ容量を有する。

いくつかの実施態様において、光出力は、試料から放出される蛍光を含む。特定の態様において、試料はＦＲＥＴシステムを含む。特定の態様において、発光材料は、ランタニド蛍光発色団を含む。特定の態様において、ランタニド蛍光発色団はクリプテートを含む。いくつかの実施態様において、光出力は試料から放出された化学発光の光を含む。

いくつかの実施態様において、試料は赤血球を含む。いくつかの実施態様において、濃縮係数は、試料中のヘマトクリットレベルを標準化するために使用される。

これら及び他の実施態様、態様、及び目的は、以下の詳細な説明を及び図とともに読むと、より明らかになるであろう。

１つの実施態様によるプロセスのフローチャートである。

様々な試料におけるＦＲＥＴドナー蛍光シグナル対ヘマトクリットレベルのグラフである。

様々な試料における蛍光対マトリックス容量のグラフである。

蛍光対％ＨＣＴのグラフである。

蛍光対１／容量のグラフである。

％誤差対緩衝液容量のグラフである。

（詳細な説明）
本開示は一般に、光出力についてアッセイされる試料におけるマトリックス効果に対処するための方法に関する。これらの技術は、試料からの測定された光出力の特性が、目的の１種以上の分析物が存在する試料環境によって影響を受ける程度を決定することを可能にする有利な特性を提供する。例えば試料中の分析物の量や濃度の変化ではなく１種以上の他の試料成分の量によって引き起こされる、ある試料から別の試料への読み取り値のオフセットを、アッセイの技師が確認して修正することは有益である可能性がある。またアッセイの技師が、分析される異なる試料間の試料容量の変化を補償できることも有益である可能性がある。

本発明者らは、試料の内部環境に外因性光源を導入することにより、試料マトリックス効果の決定及び補正が可能になり得ることを発見した。特に、既知量の光生成材料を、分析物を測定するために使用される試料、例えば均一な混合物に加えることができることが見出された。次に、光生成材料から検出された光が測定され、予測される既知シグナルを試料からの実際の測定シグナルと比較することにより、試料マトリックスの容量変化と試料マトリックス組成変化の一方又は両方に対処するように、アッセイ出力を数学的に調整することができる。本明細書で提供される方法は、光を測定するすべてのアッセイ、例えば発光アッセイ、化学発光アッセイ、蛍光アッセイ、及び吸光度アッセイに使用することができる。有利なことに、開示された方法は、より強固なアッセイを可能にし、アッセイ操作の違いに対してより高い耐性を可能にする。提供される方法はまた、予測された光出力測定値と観察された光出力測定値との比較により、試料の特性、例えば試料容量又は試料マトリックス組成を識別又は推定することを可能にするという追加の利点を提供する。

図１は、試料のアッセイのための補正係数を決定するための実施態様による方法（１００）のフローチャートを提示する。操作１０１において、特定の濃度などの選択された量の発光材料が試料に加えられる。操作１０２において、試料からの観察された光出力の測定値が、アッセイを使用して得られる。操作１０３において、補正係数を決定するためにアルゴリズムが適用され、ここでアルゴリズムは、観察された光出力測定値と発光材料の量から予測される光出力とを関連付けて、試料のアッセイのための補正係数を決定する。アルゴリズムは、線形、非線形、対数、指数、又は多項式のカーブフィッティングアルゴリズムでもよく、アルゴリズムの適用は、較正曲線を調整して出力濃度を調整することができる。特定の例において、標準曲線はすでに既知量の分析物を使用して作成されているため、予測される光出力は過去の測定値からわかっている。

提供される方法のアッセイは、一般に、試料からの光出力の測定を含む任意のアッセイであり得る。アッセイは、例えば蛍光光度法、分光光度法、比色法、及び分光法のうちの１種以上を含むことができる。アッセイは、一般に、発光、光透過、光吸収、及び光反射の１種以上を測定するために使用することができる。

様々なアッセイ機器及び装置が、本明細書に開示される方法での使用に適している。例えば分光光度計を使用して蛍光発光を測定することができる。蛍光は、ある波長での光エネルギーの分子吸収と、別のより長い波長でのそのほぼ瞬時の再放出である。自然に蛍光を発する分子もあれば、蛍光を発するように修飾する必要のある分子もある。マトリックス組成の違いや変化の補償は、特に時間分解蛍光共鳴エネルギー移送（ＦＲＥＴ）が使用されている場合は困難な場合がある。本明細書の方法は、時間分解蛍光共鳴エネルギー移送（ＦＲＥＴ）に特に適している。

蛍光分光光度計又は蛍光計、蛍光分光計（fluorospectrometer）、又は蛍光分光計（fluorescence spectrometer）は、キセノンフラッシュランプなどの光源で照射した後、試料から異なる波長で放出される蛍光を測定する。蛍光計は、緑と青、又は紫外線と青のチャネルなど、さまざまな色の蛍光シグナル（波長が異なる）を測定するためのさまざまなチャネルを有することができる。１つの態様において、適切なアッセイ装置は、時間分解蛍光共鳴エネルギー移送（ＦＲＥＴ）実験を実施する能力を含む。

１つの実施態様において、本開示は、分析物を含む試験試料中のヘマトクリット（％ＨＣＴ）の未知濃度を決定するための方法を提供し、この方法は以下を含む：
ａ）均一な容量又は濃度の分析物を試料に添加する工程；
ｂ）既知量の発光材料を試料に添加する工程であって、前記発光材料は光出力を生成する工程；
ｃ）試料中の少なくとも２つの既知の異なるヘマトクリット濃度レベルを使用して、試料中の光出力とパーセントヘマトクリットとのアルゴリズム的関係を決定する工程；及び
ｄ）分析物を有する試験試料中の、発光材料からの測定された光出力と工程ｃで決定されたアルゴリズム的関係とを使用して、（％ＨＣＴ）ヘマトクリットの未知濃度を決定する工程。

別の実施態様において、本開示は、試験試料の全血中の分析物血漿濃度を決定するための方法を提供し、この方法は以下を含む：
ａ）均一な容量又は濃度の分析物を試料に添加する工程；
ｂ）既知量の発光材料を試料に添加する工程であって、前記発光材料は光出力を生成する工程；
ｃ）前記発光材料からの少なくとも２つの別個の光出力を測定する工程であって、第１の光出力は既知量の発光材料と相関し、そして第２の光出力は分析物濃度を決定するために使用される工程；
ｄ）既知量の発光材料の出力と既知の％ヘマトクリット濃度とのアルゴリズム的関係を決定する工程；
ｅ）工程ｄのアルゴリズム的関係を使用して、試験試料のヘマトクリット濃度を決定する工程；
ｆ）ヘマトクリットの較正曲線と分析物のシグナル出力との数学的関係を決定する工程；及び
ｇ）工程ｅ及びｆに従って、試料内のヘマトクリット量を考慮して、較正曲線又は較正曲線からの出力のいずれかを調整して、試験試料中の分析物の血漿濃度を決定する工程。

さらに別の実施態様において、本開示は、試験試料に添加された緩衝液の容量を決定するための方法を提供し、この方法は以下を含む：
ａ）均一な容量又は濃度の分析物を試料に添加する工程；
ｂ）既知量の発光材料を試料に添加する工程であって、前記発光材料は光出力を生成する工程；
ｃ）試料中の少なくとも２つの別個の光出力を測定する工程であって、第１の光出力は既知量の発光材料と相関し、そして第２の光出力は分析物濃度を決定するために使用される工程；
ｄ）既知量の発光材料の出力と試料に添加された緩衝液容量とのアルゴリズム的関係を決定する工程；及び
ｅ）前記アルゴリズム的関係を使用して、試験試料に添加された緩衝液容量を決定する工程。

さらに別の実施態様において、本開示は、試験試料中の未知の緩衝液濃度中のドナー及びアクセプターを有するＦＲＥＴアッセイを使用して分析物濃度を決定するための方法を提供し、この方法は以下を含む：
ａ）均一な容量又は濃度の分析物を試料に添加する工程；
ｂ）既知量の発光材料を試料に添加する工程であって、前記発光材料は光出力を生成する工程；
ｃ）試料中の少なくとも２つの別個の光出力を測定する工程であって、第１の光出力は既知量の発光材料と相関し、そして第２の光出力は分析物濃度を決定するために使用される工程；
ｄ）既知量の発光材料の出力と試料に添加された緩衝液容量とのアルゴリズム的関係を決定する工程；
ｅ）試験試料に添加された緩衝液容量を決定する工程；
ｆ）添加された緩衝液容量と分析物シグナル出力とのアルゴリズム的関係を決定する工程；及び
ｇ）工程ｅ及びｆに従って、試験試料内に添加された緩衝液容量を考慮して、較正曲線又は較正曲線からの出力のいずれかを調整して、分析物の血漿濃度を決定する工程。

特定の態様において、アルゴリズム的関係及び／又は数学的関係は、それぞれ独立して、線形、非線形、対数、指数、又は多項式のカーブフィッティングアルゴリズムの群から選択されるメンバーである。アルゴリズム的関係又は数学的関係は、ｙ＝ｍｘ＋ｂに対応する直線を生成することができる線形回帰でもよい。

特定の態様において、分析物は、被験体の血液中に見られる内因性成分又は外因性成分である。被験体は、ヒトなどの哺乳動物であり得る。１つの態様において、分析物は、抗ＴＮＦα薬、タンパク質、ビタミン、又は炎症性タンパク質である。

１つの態様において、抗ＴＮＦα薬は、REMICADE（商標）（インフリキシマブ）、INFLECTRA（インフリキシマブ－ｄｙｙｂ）、RENFLEXIS（インフリキシマブ－ａｂｄａ）、FLIXABI（インフリキシマブバイオシミラー）、REMSIMA（インフリキシマブバイオシミラー）、ENBREL（商標）（エタネルセプト）、HUMIRA（商標）（アダリムマブ）、AMJEVITA（アダリムマブ－ａｔｔｏ）、IMRALDI（アダリムマブバイオシミラー）、CYLTEZO（アダリムマブバイオシミラー）、HYRIMOZ（アダリムマブバイオシミラー）、HULIO（アダリムマブバイオシミラー）、CIMZIA（商標）（セルトリズマブペゴール）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーである。

特定の態様において、抗ＴＮＦα薬はREMICADE（商標）（インフリキシマブ）である。

特定の態様において、分析物はＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）である。

特定の態様において、「試料」は、既知の濃度又は容量の、例えば分析物又は緩衝液容量を有する既知の試料である。「試験試料」は、未知量の、例えば分析物又は緩衝液容量を有する未知の試料である。

特定の態様において、試料に添加されるか又は試料中の抗ＴＮＦα薬などの分析物の量は、０μｇ～１０００μｇである。例えばこの量は、約０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ、１２５μｇ、１５０μｇ、１７５μｇ、２００μｇ、２２５μｇ、２５０μｇ、２７５μｇ、３００μｇ、３２５μｇ、３５０μｇ、３７５μｇ、４００μｇ、４２５μｇ、４５０μｇ、４７５μｇ、５００μｇ、５２５μｇ、５５０μｇ、５７５μｇ、６００μｇ、６２５μｇ、６５０μｇ、６７５μｇ、７００μｇ、７２５μｇ、７５０μｇ、７７５μｇ、８００μｇ、８２５μｇ、８５０μｇ、８７５μｇ、９００μｇ、９２５μｇ、９５０μｇ、９７５μｇ、及び／又は１０００μｇであり得る。特定の態様において、試料中の分析物の量は、約０μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、１６μｇ、１７μｇ、１８μｇ、１９μｇ、２０μｇ、２１μｇ、２２μｇ、２３μｇ、２４μｇ、２５μｇ、２６μｇ、２７μｇ、２８μｇ、２９μｇ、３０μｇ、３１μｇ、３２μｇ、３３μｇ、３４μｇ、３５μｇ、３６μｇ、３７μｇ、３８μｇ、３９μｇ、４０μｇ、４１μｇ、４２μｇ、４３μｇ、４４μｇ、４５μｇ、４６μｇ、４７μｇ、４８μｇ、４９μｇ、及び／又は５０μｇである。

特定の態様において、分析物は、（ｉ）１～１５％及び（ｉｉ）１６～７５％から選択される少なくとも２つの既知の異なるヘマトクリット濃度レベルである。他の態様において、少なくとも２つの異なる濃度は、以下のパーセントから選択される任意の２つの値である：１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、及び／又は７５％。２つの値は、前述のパーセントの端数である可能性がある。

特定の態様において、試料中の発光材料の濃度は、例えば１ｆＭ～１ｍＭ、例えば１ｆＭ～１６ｎＭ、１６ｆＭ～２５０ｎＭ、２５０ｆＭ～４μＭ、４ｐＭ～６３μＭ、又は６３ｐＭ～１ｍＭの範囲であり得る。上限に関して、発光材料濃度は、１ｍＭ未満、例えば６３μＭ未満、４μＭ未満、２５０ｎＭ未満、１６ｎＭ未満、１ｎＭ未満、６３ｐＭ未満、４ｐＭ未満、２５０ｆＭ未満、又は１６ｆＭ未満であり得る。下限に関して、発光材料濃度は、１ｆＭ超、例えば１６ｆＭ超、２５０ｆＭ超、４ｐＭ超、６３ｐＭ超、１ｎＭ超、１６ｎＭ超、２５０ｎＭ超、４μＭ超、又は６３μＭ超であり得る。より高い濃度、例えば１ｍＭを超える濃度、及びより低い濃度、例えば１ｆＭ未満もまた企図される。

いくつかの態様において、血中のＣ反応性タンパク質の正常濃度は３ｍｇ／Ｌ未満である。いくつかの実施態様において、血中のＣ反応性タンパク質の高濃度は、少なくとも１５ｍｇ／Ｌである。特定の実施態様において、血中のＣ反応性タンパク質の高濃度は、少なくとも３０ｍｇ／Ｌである。試料に添加されるＣ反応性タンパク質などの分析物の量は、０μｇ～１００μｇの間であり、例えば約０μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、１６μｇ、１７μｇ、１８μｇ、１９μｇ、２０μｇ、２１μｇ、２２μｇ、２３μｇ、２４μｇ、２５μｇ、２６μｇ、２７μｇ、２８μｇ、２９μｇ、３０μｇ、３１μｇ、３２μｇ、３３μｇ、３４μｇ、３５μｇ、３６μｇ、３７μｇ、３８μｇ、３９μｇ、４０μｇ、４１μｇ、４２μｇ、４３μｇ、４４μｇ、４５μｇ、４６μｇ、４７μｇ、４８μｇ、４９μｇ、５０μｇ、５１μｇ、５２μｇ、５３μｇ、５４μｇ、５５μｇ、５６μｇ、５７μｇ、５８μｇ、５９μｇ、６０μｇ、６１μｇ、６２μｇ、６３μｇ、６４μｇ、６５μｇ、６６μｇ、６７μｇ、６８μｇ、６９μｇ、７０μｇ、７１μｇ、７２μｇ、７３μｇ、７４μｇ、７５μｇ、７６μｇ、７７μｇ、７８μｇ、７９μｇ、８０μｇ、８１μｇ、８２μｇ、８３μｇ、８４μｇ、８５μｇ、８６μｇ、８７μｇ、８８μｇ、８９μｇ、９０μｇ、９１μｇ、９２μｇ、９３μｇ、９４μｇ、９５μｇ、９６μｇ、９７μｇ、９８μｇ、９９μｇ、及び／又は１００μｇである。

いくつかの実施態様において、分析物はビタミンＤである。血液中のビタミンＤの正常濃度は、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬである（例えば約２０ｎｇ／ｍＬ、２３ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ、／ｍＬ、２７ｎｇ／ｍＬ、２９ｎｇ／ｍＬ、３１ｎｇ／ｍＬ、３３ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、３７ｎｇ／ｍＬ、３９ｎｇ／ｍＬ、４１ｎｇ／ｍＬ、４３ｎｇ／ｍＬ、４５ｎｇ／ｍＬ、４７ｎｇ／ｍＬ、４９ｎｇ／ｍＬ、又は５０ｎｇ／ｍＬ）。これらの量は、標準曲線を作成するために使用することができる。

いくつかの実施態様において、血中のビタミンＤの高濃度は、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬである（例えば６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ、２７０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、２９０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３１０ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ、３３０ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ、３７０ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ、３９０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４１０ｎｇ／ｍＬ、４２０ｎｇ／ｍＬ、４３０ｎｇ／ｍＬ、４４０ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、４６０ｎｇ／ｍＬ、４７０ｎｇ／ｍＬ、４８０ｎｇ／ｍＬ、４９０ｎｇ／ｍＬ、又は５００ｎｇ／ｍＬ）。これらの量は、標準曲線を作成するために使用することができる。

いくつかの実施態様において、血中のビタミンＤの高濃度は、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬである（例えば少なくとも１１０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ、２７０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、２９０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３１０ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ、３３０ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ、３７０ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ、３９０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４１０ｎｇ／ｍＬ、４２０ｎｇ／ｍＬ、４３０ｎｇ／ｍＬ、４４０ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、４６０ｎｇ／ｍＬ、４７０ｎｇ／ｍＬ、４８０ｎｇ／ｍＬ、４９０ｎｇ／ｍＬ、又は５００ｎｇ／ｍＬ）。これらの量は、標準曲線を作成するために使用することができる。

糞便カルプロテクチンは、ＩＢＤ（炎症性腸疾患）とＩＢＳ（過敏性腸症候群）とを鑑別するのに有用である。通常、ＩＢＤ（例えばクローン病（ＣＤ）又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ））には炎症が伴うが、ＩＢＳには炎症がない。カルプロテクチンのレベルが通常よりも高い場合は炎症を示しているため、ＩＢＤとＩＢＳを鑑別するために使用することができる。

特定の態様において、カルプロテクチンの濃度量は、約１０μｇ／ｇ～約８００μｇ／ｇ（糞便１グラムあたりのμｇ）の範囲にある。特定の態様において、範囲は約１０μｇ／ｇ～約６０μｇ／ｇであり、例えば約０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、及び／又は６０μｇである。特定の態様において、約１０μｇ／ｇ～約６０μｇ／ｇの範囲は正常又は健康と見なされる。これらの量は、標準曲線を作成するために使用することができる。

他の例では、カルプロテクチンの濃度量は、約１０μｇ／ｇ～約１００μｇ／ｇの範囲であり、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、及び／又は１００μｇ／ｇであり、これは正常又は健康と見なされる。これらの量は、標準曲線を作成するために使用することができる。

特定の例において、約６０μｇ／ｇ又は約１００μｇ／ｇの数は、上昇しており異常であると見なされる（糞便１グラムあたりのμｇ）。約１００μｇ／ｇ～約８００μｇ／ｇの範囲のカルプロテクチンの濃度、例えば１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、及び／又は８００μｇ／ｇは異常と見なされる。これらの量は、標準曲線を作成するために使用することができる。

特定の態様において、本明細書に記載の方法は、ＶＣＡＭ－１を測定及び／又は検出するために使用される。 特定の態様において、ＶＣＡＭ－１の濃度又はレベルが測定される。特定の態様において、ＶＣＡＭ－１が測定される生物学的試料は全血である。

特定の態様において、ＶＣＡＭ－１の通常の対照濃度又は基準値は、約１００～約５００ｎｇ／ｍＬである。特定の態様において、ＶＣＡＭ－１の通常量は、約１００ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ、２７０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、２９０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３１０ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ、３３０ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ、３７０ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ、３９０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４１０ｎｇ／ｍＬ、４２０ｎｇ／ｍＬ、４３０ｎｇ／ｍＬ、４４０ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、４６０ｎｇ／ｍＬ、４７０ｎｇ／ｍＬ、４８０ｎｇ／ｍＬ、４９０ｎｇ／ｍＬ、及び５００ｎｇ／ｍＬである。これらの量は、標準曲線を作成するために使用することができる。

特定の態様において、未知の試験試料中の％ＨＣＴは、試験試料中で１０％～７５％である。

適切な蛍光光度計及び他のアッセイ機器は、キュベット、毛細管、シャーレ、又はマイクロプレートの使用を含む異なる方法で、試料を保持することができる。本明細書に記載の方法は、これらの試料構成のいずれかを使用して実行することができる。特定の態様において、アッセイは、任意選択的なマイクロプレートリーダーを有し、最大３８４ウェルプレートでの蛍光発光スキャンを可能にする。他の適切なアッセイ技術は、表面張力を使用して試料を所定の位置に保持する。

特定の態様において、アッセイは、２０１９年２月１４日に出願され、ＷＯ２０１９１５９１０９として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５１２１３（これは、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示された装置を使用する。そこに開示されている分析器は、例えばポイントオブケア（ＰＯＣ）設定で使用して、ユーザーの取り扱い又は相互作用をほとんど又は全く使用せずに、試料の吸光度及び蛍光を測定することができる。開示された分析器は、これらの２つのアプローチのそれぞれで検出することができる特性を有する試料の、より迅速で信頼性の高い分析の有利な特徴を提供する。例えば診断アッセイにかけられている血液試料の蛍光と吸光度の両方を定量化することは有益である可能性がある。一部の分析ワークフローでは、血液試料のヘマトクリットを吸光度アッセイで定量化できるが、ＦＲＥＴアッセイで測定されたシグナル強度は、血液試料の他の成分に関する情報を提供することができる。

国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５１２１３に開示された装置はまた、提供された方法での使用に適しており、試料からの放出光及び試料による透過光の吸光度の両方を検出するために使用することができる。あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる本出願は、励起波長を有する励起光を放出するように構成された第１の光源を含む装置を記載する。この装置は、試料を透過照明光で透過照明するように構成された第２の光源をさらに備える。この装置は、励起光を検出するように構成された第１の光検出器と、放出光及び透過照明光を検出するように構成された第２の光検出器とをさらに備える。この装置は、（１）励起光の少なくとも一部を反射することによって試料を落射照明し、（２）励起光の少なくとも一部を第１の光検出器に送信し、（３）放出光の少なくとも一部を第２の光検出器に送信し、そして（４）透過照明光の少なくとも一部を第２の光検出器に送信する、ように構成されたダイクロイックミラーをさらに備える。

提供された方法のアッセイで使用するのに適したキュベットは、（ＷＯ２０１９１５９１１１）として公開された、２０１９年２月１４日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５１２１５に開示され、そしてすべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。提供されるキュベットの１つは、開放チャンバー上部を有する内部チャンバーを封入する中空体を含む。キュベットはさらに、内壁、外壁、開いた蓋の上部、及び開いた蓋の底部を有する下部の蓋を含む。下部の蓋の少なくとも一部は、開放チャンバー上部に近接する内部チャンバーの内側に適合するように構成される。下部の蓋は、内壁に接続された１つ以上（例えば２つ以上）の容器を含み、ここで各容器は、開いた容器上部を有する。特定の態様において、下部の蓋は、２つ以上のそのような容器を含む。下部の蓋はさらに、中空体に接続された固定手段を備える。キュベットはさらに上部の蓋を含み、ここで上部の蓋の少なくとも一部は、開いた蓋の上部に近接する下部の蓋の内側に適合するように構成される。

提供される方法の試料は、上記のような光測定アッセイで分析することができる任意の試料であり得る。一般に、試料の少なくとも一部は、発光材料が導入される液体成分、溶液、又は懸濁液を含む。好ましくは、試料は実質的に均一な組成を有する。

いくつかの実施態様において、試料は生物学的試料である。適切な生物学的試料には、特に限定されるものではないが、全血、血漿、血清、血球、細胞試料、尿、脊髄液、汗、涙液、唾液、皮膚、粘膜、及び毛が含まれる。特定の態様において、全血、血漿、血清、血球などが好ましく、全血、血球などが特に好ましい。全血には、血漿と混合された全血由来の血球画分の試料が含まれる。これらの全血試料に関しては、試料は、溶血、分離、希釈、濃縮、精製などの前処理に供することができる。

いくつかの実施態様において、生物学的試料は、全血又は血清試料である。いくつかの実施態様において、試料は赤血球を含む。特定の態様において、赤血球は全血由来である。特定の態様において、赤血球は溶解される。他の態様において、試料は赤血球を含まない。いくつかの実施態様において、血液試料は、赤血球を溶解するたよう処理される。これは、血液試料を脱イオン蒸留水などの溶解剤で、例えば１：１の濃度（つまり、１部の血液と１部の溶解剤又は蒸留脱イオン水）で希釈することによって行うことができる。あるいは、試料を凍結して細胞を溶解することができる。

特定の態様において、血液試料は溶解後に希釈される。血液試料は、１：１０（すなわち、１０部の希釈剤中の１部の試料）、１：５００、１：１０００、１：２００、１：２５００、１：８０００又はそれ以上に希釈することができる。特定の態様において、試料は１：２０００、すなわち、２０００部の希釈剤中の１部の血液試料に希釈される。特定の態様において、希釈剤は、蒸留脱イオン水中の０．１％トリフルオロ酢酸、又は蒸留脱イオン水中であり得る。いくつかの実施態様において、血液試料は、溶解と希釈の間で処理されない。

一般に、試料は、目的の１種以上の分析物を含むことができ、ここで、分析物の少なくとも１つは、方法のアッセイを使用して直接的又は間接的に検出することができる。試料はさらに、目的の分析物以外の試料のすべての成分を含むものとして本明細書で定義される試料マトリックスを含む。いくつかの実施態様において、試料マトリックスは水溶液である。いくつかの実施態様において、試料マトリックスは、１種以上の塩、１種以上の緩衝液、１種以上のアッセイ試薬、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、試料マトリックスは、１種以上の分析物を安定化及び貯蔵するのに適した緩衝水溶液である。例えば液体は、分析物を安定化及び貯蔵するのに適したｐＨ及び／又は浸透圧を有することができる。試料マトリックスは、１種以上の希釈剤を含むことができる。

特定の態様において、本開示は、試験試料に添加された緩衝液の容量を決定するための方法を提供する。特定の態様において、緩衝液は、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、又はクエン酸－リン酸緩衝液からなる群から選択される。

特定の態様において、既知量の発光材料の出力と試料に添加された緩衝液容量との間のアルゴリズム的関係は線形である。特定の態様において、既知量の発光材料の出力は、緩衝液容量に相関する（例えば比例する）か、又は緩衝液容量の関数である。試料の光出力とアルゴリズム的関係を使用して、試験試料に添加された緩衝液の容量を決定することができる。任意選択的に、この方法は、５パラメーターのロジスティック回帰を使用して、パーセント誤差と緩衝液容量の線形回帰を決定することをさらに含む。

試料の容量は、例えば１μＬ～１００ｍＬ、例えば１μＬ～１ｍＬ、３．２μＬ～３．２ｍＬ、１０μＬ～１０ｍＬ、３２μＬ～３２ｍＬ、又は１００μＬ～１００ｍＬの範囲であり得る。上限に関して、試料量は、１００ｍＬ未満、例えば３２ｍＬ未満、１０ｍＬ未満、３．２ｍＬ未満、１ｍＬ未満、３２０μＬ未満、１００μＬ未満、３２μＬ未満、１０μＬ未満、又は３．２μＬ未満であり得る。下限に関しては、試料量は１μＬ超、例えば３．２μＬ超、１０μＬ超、３２μＬ超、１００μＬ超、３２０μＬ超、１ｍＬ超、３．２ｍＬ超、１０ｍＬ超、又は３２ｍＬ超であり得る。より大きな容量、例えば１００ｍＬを超える容量、及びより小さな容量、例えば１μＬ未満もまた企図される。

提供される方法の発光材料は、大きく変動する可能性があるが、一般に、アッセイによる正確な検出に適した波長及び強度を有する光を放出する材料である。好ましくは、発光材料は、発光材料の濃度又は密度が試料内で実質的に均一であるように、試料マトリックスに溶解又は懸濁することができる材料から選択される。

いくつかの実施態様において、発光材料は、１種以上の化学発光材料を含む。いくつかの実施態様において、化学発光材料を試料に添加した結果として、試料は化学発光を含む光出力を放出する。化学発光は、化学反応、例えば発色性物質の化学的変化による材料からの光の放出によって特性決定される。化学発光材料の例には、特に限定されるものではないが、ルシフェラーゼ（例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；例えばＵＳ４７３７４５６に開示され、これはあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸脱水素酵素）、複素環式オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどが含まれる。

例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ検出システムは、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と共に使用することができ、これは、４５０ｎｍの波長で検出可能な過酸化水素の存在下で可溶性生成物を生成する。アルカリホスファターゼ検出システムは、例えば発色基質であるｐ－ニトロフェニルリン酸とともに使用でき、これは４０５ｎｍで容易に検出可能な可溶性生成物を生成する。同様に、β－ガラクトシダーゼ検出システムは、発色基質であるｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）とともに使用でき、これは４１０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を生成する。ウレアーゼ検出システムは、尿素－ブロモクレゾールパープル（Sigma Immunochemicals; St. Louis, MO）などの基質とともに使用することができる。

いくつかの実施態様において、発光材料は１種以上の蛍光材料を含む。いくつかの実施態様において、試料に蛍光発光材料を添加した結果として、試料は、蛍光を含む光出力を放出する。特定の態様において、蛍光は、波長、強度、寿命、偏光、又はこれらの組み合わせによって特性決定することができる。特定の態様において、フラッシュ励起と発光波長での蛍光の測定との間に時間遅延を導入することにより、長寿命の蛍光と短寿命の蛍光を区別し、シグナル対ノイズ比を高めることができる。蛍光物質の例には、特に限定されるものではないが、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ヘキスト３３２５８、Ｒ－フィコシアニン、Ｂ－フィコエリトリン、Ｒ－フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンが含まれる。

いくつかの実施態様において、発光材料は１種以上のＦＲＥＴシステムを含む。ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移送又はフェルスター（Forster）共鳴エネルギー移送）は、ドナーとアクセプターが互いに近接しており、かつこれらがドナー蛍光化合物の励起波長で励起される場合の、クリプテートなどのドナー化合物とAlexa 647などのアクセプター化合物との間のエネルギー移送を説明するメカニズムを指す。ドナー化合物は、最初は電子励起状態にあり、非放射双極子－双極子結合を介してアクセプター蛍光発色団にエネルギーを移送することができる。このエネルギー移送の効率は、ドナーとアクセプターとの距離の６乗に反比例するため、ＦＲＥＴは距離の小さな変化に非常に敏感である。エネルギー移送後、アクセプターは蛍光を発するか又は励起をクエンチする。２つの蛍光化合物がＦＲＥＴパートナーになるためには、ドナー蛍光化合物の発光スペクトルがアクセプター化合物の励起スペクトルと部分的に重なる必要があることが知られている。好ましいＦＲＥＴ－パートナー対は、値Ｒ０（フェルスター距離、すなわちエネルギー移送が５０％効率的である距離）が３０Å以上であるものである。

ＦＲＥＴシステムからの測定された光出力は、ドナー蛍光化合物とアクセプター化合物との間のＦＲＥＴを表す任意の測定可能なシグナルであり得る。従って、ＦＲＥＴシグナルは、アクセプター化合物が蛍光性である場合の、ドナー蛍光化合物の又はアクセプター化合物の発光の強度又は寿命の変動であり得る。ＦＲＥＴシグナルはさまざまな方法で測定することができる。ドナーのみ、アクセプターのみ、又はドナーとアクセプターによって放出される蛍光の測定、又はＦＲＥＴの結果としてアクセプターによって媒体中に放出される光の偏光の変化の測定。ドナーの寿命の変化を観察することによるＦＲＥＴの測定も含めることができ、これは、希土類錯体などの蛍光寿命の長いドナーを使用することで容易になる（特にプレートリーダーなどの単純な機器で）。さらに、ＦＲＥＴシグナルは正確な瞬間又は一定の間隔で測定できるため、経時的な変化を調査し、こうして、調べた生物学的プロセスの動態を調査することができる。

特定の態様において、ＦＲＥＴアッセイは、時間分解されたＦＲＥＴアッセイである。時間分解ＦＲＥＴは、ほとんどの標準的な蛍光色素（例えばフルオレセイン）が励起から数ナノ秒以内に発光する場合、励起後長期間（ミリ秒単位で測定）発光する特性を有する特定の蛍光分子の使用に依存している。その結果、例えばパルス光源（例えばキセノンフラッシュランプ又はパルスレーザー）を使用してクリプテートランタニドを励起し、励起パルスの後に測定することが可能である。

いくつかの実施態様において、提供される方法の発光材料は、１種以上のランタニド蛍光発色団を含む。ランタニド蛍光発色団は、例えばクリプテートであり得る。クリプテートは、テルビウムやユーロピウムなどのランタニドイオンをしっかりと埋め込むかキレート化できる大環状化合物を含む複合体である。このケージのような構造は、照射されたエネルギーを収集し、収集されたエネルギーをランタニドイオンに移送するのに有用である。ランタニドイオンは、特徴的な蛍光でエネルギーを放出することができる。特定の態様において、発光材料は、ランタニドクリプテートなどのクリプテートであるＦＲＥＴエネルギードナー化合物を含む。

特定の態様において、クリプテートは、約３００ｎｍ～約４００ｎｍ、例えば約３２５ｎｍ～約３７５ｎｍの吸収波長を有する。特定の態様において、クリプテート色素は、約４９０ｎｍ、約５４８ｎｍ、約５８７ｎｍ、及び６２１ｎｍに４つの蛍光発光ピークを有する。従って、ドナーとしてクリプテートは、フルオレセイン様（緑色ゾーン）分子、Ｃｙ５、ＤＹ－６４７様（赤色ゾーン）アクセプター、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、又はフィコエリトリン（ＰＥ）と互換性があり、ＴＲ－ＦＲＥＴ実験を実施する。

特定の態様において、Cisbio bioassaysによって販売されているLumiphoreからのテルビウムクリプテート分子「Ｌｕｍｉ４－Ｔｂ」は、クリプテートドナーとして使用される。テルビウムクリプテート「Ｌｕｍｉ４－Ｔｂ」は以下の化学構造を有する：

特定の他の態様において、国際特許出願公開ＷＯ２０１５／１５７０５７（これは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているクリプテートは、本開示での使用に適している。この出願公開は、生体分子の標識に役立つクリプテート分子について説明している。そこに開示されているように、特定のクリプテートは以下のような構造を有する：

特定の他の態様において、本開示において有用なテルビウムクリプテートを以下に示す：

特定の態様において、本発明で有用なクリプテートは、国際特許出願公開ＷＯ２０１８／１３０９８８に開示されており、これは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。そこに開示されるように、以下の化学構造を有する化合物は、本開示におけるＦＲＥＴドナーとして有用である：

ここで、点線が存在する場合、Ｒ及びＲ¹は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、１種以上のハロゲン原子で任意選択的に置換されたアルキル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、又はアルキルカルボニルアルコキシからなる群から独立して選択されるか、あるいは、ＲとＲ¹が結合して、点線の結合が存在しない、任意選択的に置換されたシクロプロピル基を形成する；Ｒ²及びＲ³はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、ＳＯ₃Ｈ、－ＳＯ₂－Ｘからなる基から選択されるメンバーであり、ここでＸはハロゲン、任意選択的に置換されたアルキル、任意選択的に置換されたアリール、任意選択的に置換されたアルケニル、任意選択的に置換されたアルキニル、任意選択置換シクロアルキル、又は生体分子に結合することができる活性化基であって、活性化基は、ハロゲン、活性化エステル、活性化アシル、任意選択的に置換されたアルキルスルホン酸エステル、任意選択的に置換されたアリールスルホン酸エステル、アミノ、ホルミル、グリシジル、ハロ、ハロアセトアミジル、ハロアルキル、ヒドラジニル、イミドエステル、イソシアナト、イソチオシアナト、マレイミジル、メルカプト、アルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、環状無水物、アルコキシアルキル、水溶性基、又はＬである；Ｒ⁴はそれぞれ独立して、水素、Ｃ₁～Ｃ₆アルキルであるか、あるいは、Ｒ⁴基の３つは存在せず、得られた酸化物はランタニドカチオンにキレート化され；及びＱ¹～Ｑ⁴は、それぞれ独立して、炭素又は窒素の群から選択されたメンバーである。

ＦＲＥＴシグナルを検出するために、ＦＲＥＴアクセプターが必要である。ＦＲＥＴアクセプターは、ＦＲＥＴドナーの発光波長と重なる励起波長を有する。使用できるアクセプター分子には、特に限定されるものではないが、フルオレセイン様（緑色ゾーン）アクセプター、Ｃｙ５、ＤＹ－６４７、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコエルイスリン（ＰＥ）、及びAlexa Fluor 647が含まれる。他の受容体には、特に限定されるものではないが、シアニン誘導体、Ｄ２、ＣＹ５、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、カルボピロニン、オキサジンとその類似体、Alexa Fluor蛍光発色団、クリスタルバイオレット、ペリレンビスイミド蛍光発色団、スクアライン蛍光発色団、ホウ素ジピロメテン誘導体、ＮＢＤ（ニトロベンズオキサジアゾール）とその誘導体、及びＤＡＢＣＹＬ（４－（（４－（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸）が含まれる。

実施態様の特定の態様において、アッセイは、クリプテート内に結合したテルビウムからなるドナー蛍光発色団を使用する。テルビウムクリプテートは、３６５ｎｍ ＵＶ ＬＥＤで励起され得る。テルビウムクリプテートは、可視領域内で４つの波長で発光する。１つの態様において、アッセイは、アッセイ内のドナーシグナルとして、６２０ｎｍの最低ドナー発光エネルギーピークを使用する。特定の態様において、アクセプター蛍光発色団は、非常に近接している場合、４９０ｎｍの最高エネルギーのクリプテート発光ピークによって励起され、５２０ｎｍで発光を引き起こす。６２０ｎｍと５２０ｎｍの両方の発光波長は、装置又は機器で個別に測定され、結果はＲＦＵ比６２０／５２０として報告することができる。あるいは、ドナー発光又はアクセプター発光を使用することができる。

試料に添加される発光材料の量は一般に知られており、その量は、補正係数を決定するために使用される方法のアルゴリズムにおいて定義された量であり得る。その量は、例えば、試料の予測される遮光特性、及び／又はアッセイの光感度及び／又は検出限界特性を含むことができる要因に少なくとも部分的に基づいて選択することができる。試料中の発光材料の濃度は、例えば１ｆＭ～１ｍＭの範囲、例えば１ｆＭ～１６ｎＭ、１６ｆＭ～２５０ｎＭ、２５０ｆＭ～４μＭ、４ｐＭ～６３μＭ、又は６３ｐＭ～１ｍＭの範囲であり得る。上限に関して、発光材料濃度は、１ｍＭ未満、例えば６３μＭ未満、４μＭ未満、２５０ｎＭ未満、１６ｎＭ未満、１ｎＭ未満、６３ｐＭ未満、４ｐＭ未満、２５０ｆＭ未満、又は１６ｆＭ未満であり得る。下限に関して、発光材料濃度は、１ｆＭ超、例えば１６ｆＭ超、２５０ｆＭ超、４ｐＭ超、６３ｐＭ超、１ｎＭ超、１６ｎＭ超、２５０ｎＭ超、４μＭ超、又は６３μＭ超であり得る。より高い濃度、例えば１ｍＭを超える濃度、及びより低い濃度、例えば１ｆＭ未満もまた企図される。

試料による光出力の測定は、試料からのすべての光出力の測定、又は１つ以上の選択された波長範囲内の光の測定を含むことができる。測定される光は、１５μｍ～１０００μｍ、例えば１５μｍ～９３０μｍ、３６０μｍ～９６０μｍ、５８０μｍ～９８０μｍ、７３０μｍ～９９０μｍ、又は８３０μｍ～１０００μｍの波長を有する遠赤外線を含み得る。測定される光は、８μｍ～１５μｍ、例えば８μｍ～１２．２μｍ、８．７μｍ～１２．９μｍ、９．４μｍ～１３．６μｍ、１０．１μｍ～１４．３μｍ、又は１０．８μｍ～１５μｍの波長を有する長波長赤外線を含み得る。測定される光は、３μｍ～８μｍ、例えば３μｍ～６μｍ、３．５μｍ～６．５μｍ、４μｍ～７μｍ、４．５μｍ～７．５μｍ、又は５μｍ～８μｍの波長を有する中波長赤外線を含むことができる。測定される光は、１４００ｎｍ～３０００ｎｍ、例えば１４００ｎｍ～２４００ｎｍ、１６００ｎｍ～２５００ｎｍ、１７００ｎｍ～２７００ｎｍ、１９００ｎｍ～２８００ｎｍ、又は２０００ｎｍ～３０００ｎｍの波長を有する短波長赤外線を含むことができる。測定される光は、７５０ｎｍ～１４００ｎｍ、例えば７５０ｎｍ～１１００ｎｍ、８２０ｎｍ～１２００ｎｍ、８８０ｎｍ～１３００ｎｍ、９５０ｎｍ～１３００ｎｍ、又は１０００ｎｍ～１４００ｎｍの波長を有する近赤外線を含み得る。測定される光は、３８０ｎｍ～７５０ｎｍ、例えば３８０ｎｍ～６００ｎｍ、４２０ｎｍ～６４０ｎｍ、４５０ｎｍ～６８０ｎｍ、４９０ｎｍ～７１０ｎｍ、又は５３０ｎｍ～７５０ｎｍの波長を有する可視光を含むことができる。測定される光は、１０ｎｍ～４００ｎｍ、例えば１０ｎｍ～３６６ｎｍ、１３３ｎｍ～３８０ｎｍ、２１８ｎｍ～３８９ｎｍ、２７８ｎｍ～３９６ｎｍ、又は３１９ｎｍ～４００ｎｍの波長を有する紫外線を含むことができる。測定される光は、赤外線と可視光を含み得る。測定される光は、可視光と紫外線を含み得る。測定される光は、赤外線、可視光、及び紫外線を含み得る。

この方法のアルゴリズムは大きく変化し得るが、好ましくは、試料からの観察された光出力測定値、試料に添加された発光材料の選択された量、及び試料のアッセイのための補正係数との関係を含む。このようにして、アルゴリズムは、観察された光の測定値と既知の発光材料の量をアルゴリズムへの入力として受け入れ、補正係数をアルゴリズムの出力として提供することができる。予測される光出力量は、標準曲線を使用した以前の測定値でもよい。特定の態様において、アルゴリズムは、光の既知の特性、試料の成分、及びアッセイ機器の既知の特性に基づいて、部分的又は完全に理論的に導かれる。特定の態様において、アルゴリズムは、他の試料、例えば発光材料を含む基準試料からの以前の光出力測定値に基づいて、部分的又は完全に経験的に導かれる。

いくつかの実施態様において、アルゴリズムは、観察された光出力測定値、選択された発光材料の量、及び補正係数を関連付ける１つ又は一連の数学的関数を使用して、補正係数を計算することを含む。１つ以上の関数は、測定された光出力と発光材料の既知量に関して補正係数を表すことができる。１つ以上の関数は、経験的及び／又は理論的に導き出すことができる。

特定の態様において、アルゴリズムの関数は、以前の測定値に基づいてプロットされたデータポイントに曲線又は直線を当てはめることによって導かれる。非限定的な例として、異なる既知量の発光材料を、発光材料による光出力を妨害しないことが知られているマトリックスを有する２つ以上の試料のそれぞれに加えることができる。これらの試料からの光出力を測定することができ、２つ以上の試料について発光材料濃度と光出力測定値を表す点のプロットを構築することができる。次に、線又は曲線、すなわち標準曲線は、当技術分野で一般に知られている任意のカーブフィッティング技術を使用して、これらのデータ点に当てはめることができる。次に、直線又は曲線の方程式を使用して、未知の試料マトリックスを有する将来の試料に添加される既知の量の発光材料の予測される光出力を計算することができる。この未知の試料の予測される光出力と測定された光出力を比較することにより、補正係数を決定することができる。特定の態様において、補正係数は、予測される光出力と測定された光出力との計算された差を含む。特定の態様において、補正係数は、予測される光出力と測定された光出力の比、又はその逆を含む。

いくつかの実施態様において、アルゴリズムは、観察された光出力測定値、選択された発光材料の量、及び補正係数を関連付ける探索表から値を検索することを含む。探索表には、経験的に導かれた値を含めることができる。いくつかの実施態様において、アルゴリズムは、探索表から検索された２つ以上の値の間で補間することによって計算された値を導くことを含む。補間は、当技術分野で一般的に知られている任意の技術を含むことができる。

本開示は、以下の非限定的な例からよりよく理解されるであろう。

実施例１

いくつかの実施態様において、提供された方法のアッセイを使用して試料中のヘマトクリットレベルが測定され、補正係数を使用して試料中のヘマトクリットレベルが標準化される。ヘマトクリットは、充填赤血球の容量と総血液量の比率である。これは、充填赤血球容量又はＰＣＶとしても知られている。一部の条件下では、ヘマトクリットとヘモグロビン濃度（ｃｔＨｂ）の間には線形関係がある。この関係は次のように表すことができる：
Ｈｃｔ（％）＝（０．０４８５×ｃｔＨｂ（ｍｍｏｌ／Ｌ）＋０．００８３）×１００
（Kokholm G. Simultaneous measurements of blood pH, pCO2, pO2 and concentrations of hemoglobin and its derivatives - a multicenter study. Radiometer publication AS107. Copenhagen: Radiometer Medical A/S, 1991）。試料中の赤血球の量が異なると、光の消光も異なることも知られている。

図２は、同一の既知量の発光材料を使用して、異なる量のヘマトクリットが蛍光シグナルに及ぼす影響を示すＨｃｔ（％）試料の標準曲線を示す。当てはめられた標準曲線の式と、ヘマトクリットとヘモグロビン濃度を関係付ける上記式を使用して、光出力測定値に基づいてＨｂの総量（ｃｔＨｂ）を計算することができる。補正係数を導き出し、観察された光出力測定値を調整するために提供された方法を使用することにより、そのようなヘモグロビン濃度決定の正確度を改善することができる。

図３は、同一の既知量の発光材料が添加された４つの試料からの蛍光出力シグナルのプロットを示す。さまざまな量の緩衝液が試料に添加され、発光材料がさまざまな濃度レベルに希釈されたため、試料の容量は互いに異なる。グラフに示されている結果は、種々の試料マトリックス容量が、試料内の発光材料からの測定された光出力に与える影響を示す。

実施例２

この実施例は、０～１．５６μｇ／ｍＬのインフリキシマブ（ＩＦＸ）と％ヘマトクリット（ＨＣＴ）の間の既知量のドナーＲＦＵを使用して、未知の％ＨＣＴ試料内の未知のＩＦＸ濃度を決定するための方法を示す。

以下の３つの表は、アッセイの線形範囲にまたがる一連のＩＦＸレベルを測定することからのＲＦＵ要約データを示す。試験された各濃度でのドナーＲＦＵ、アクセプターＲＦＵ、及びアクセプター対ドナー比について、三重測定の平均が、２５％、４０％、及び５３％ＨＣＴを表す３つの表にまとめられている。

平均ドナーＲＦＵを要約する表１。

平均ドナーＲＦＵを要約する表２。

対応する各ＩＦＸ濃度についての平均ドナーＲＦＵを要約する表３。

３つの％ＨＣＴ値のそれぞれにおける０～１．５６μｇ／ｍＬまでのＩＦＸ濃度についての平均ドナーＲＦＵの要約は、以下の表４に要約される。

表４に見られる値のグラフは図４に示される。

図４から、試験されたドナーＲＦＵと％ＨＣＴの間に線形関係が存在することがわかる。この関係を使用して、各試料の測定されたドナーＲＦＵと図４に示す線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｂ）を使用して、試験された各試料の％ＨＣＴを概算することができる（ｙ＝－１５７１．５１ｘ＋１３８，３１１．２６）。ＨＣＴレベルの量を決定するために新しい標準曲線を作成する必要はない。

この方法を使用して得られた逆算された％ＨＣＴ値の要約は、以下の表５に見出すことができる。

この実施例は、ヘマトクリット量が、各試料のドナーＲＦＵと、図４に示すｙ＝ｍｘ＋ｂ方程式のアルゴリズムから決定できることを示す。インフリキシマブレベルの標準曲線を使用して、％ＨＣＴの量を決定することができる。

実施例３
この実施例は、全血中のインフリキシマブ（ＩＦＸ）血漿濃度を決定するための方法を示す。

所定の％ＨＣＴ内で、インフリキシマブ濃度に対してプロットされた出力シグナルが用量応答をもたらすことが発見された。

単一のドナーＲＦＵを使用して、試料の％ＨＣＴを概算し、それを使用して、ＩＦＸ結果出力を調整することができる。

ドナーＲＦＵ ％ＨＣＴ決定法をＩＦＸ濃度決定法と組み合わせることにより、定量的ＩＦＸ値を計算することができる。試験された２５、４０、及び５３％ＨＣＴレベルの定量的な要約結果は、以下の表６に示される。

既知の値２５％ＨＣＴ ４０％ＨＣＴ ５３％ＨＣＴ
［ＩＦＸ］（μｇ／ｍＬ）平均計算値［ＩＦＸ］（μｇ／ｍＬ）％ＣＶ％エラー平均計算値［ＩＦＸ］（μｇ／ｍＬ）％ＣＶ％エラー平均計算値［ＩＦＸ］（μｇ／ｍＬ）％ ＣＶ％エラー

これは、各試料ドナーＲＦＵを使用して％ＨＣＴを概算し、次にこれを使用して個々の試料結果を計算することにより計算された、各％ＨＣＴで得られた定量的ＩＦＸ結果の要約である。

未知の％ＨＣＴ試料内のＩＦＸ濃度を決定するための上記方法は、２５～５３％ＨＣＴにまたがる全血のレベルで試験する場合、許容できる正確度と精度を示す。

実施例４
この実施例は、未知の緩衝液内の糞便カルプロテクチン（ＦＣＰ）濃度を決定するための方法を示す。

以下の表７の材料：

アッセイの線形範囲にまたがる一連のＦＣＰレベルを測定することからのＲＦＵ要約データ。各濃度は、０．７５、０．８７５、１．０、１．２５、及び１．５ｍＬで一回測定で測定された。試験した各容量と濃度について、結果を以下の表８に要約する。

表８は、５分で試験された各緩衝液容量について各対応するＦＣＰ濃度についてのドナーＲＦＵ、アクセプターＲＦＵ、及びアクセプター対ドナー比を要約している。

ＦＣＰ決定

ドナーＲＦＵ緩衝液容量決定法

観察されたドナーＲＦＵに対して１／容量（ｍＬ）をプロットすると、強い相関が得られることが見出された。５分で試験されたさまざまな緩衝液容量濃度での平均ドナーＲＦＵ値をまとめた表は、以下の表９に見られる。ドナーＲＦＵ値は、ＦＣＰの濃度０、３５、及び４３３μｇ／ｇで観察された平均ドナーＲＦＵから取得される。

表９中の値のグラフは図５で見られ、この図は、０～６．２５μｇ／ｍＬ ＦＣＰの平均ドナーＲＦＵ対１／容量を示す。

図５から、試験された容量において、ドナーＲＦＵと１／容量との間に線形関係が存在することが分かる。この関係を使用して、各試料の測定されたドナーＲＦＵと図５に示すｙ＝ｍｘ＋ｂ式を使用して、試験された各試料について添加された緩衝液の容量を概算することができる。

図５に見出される式を使用してドナーＲＦＵから決定された計算された容量を使用して、単一の５－ＰＬ較正曲線を使用することからの定量値におけるパーセントオフセットを決定することが可能である。次に、このパーセント誤差オフセットを使用して、５－ＰＬ較正曲線から取得した元の濃度からの出力を調整することができる。図６は、単一の５－ＰＬ較正曲線を使用した場合の、較正範囲全体にわたる平均パーセント誤差を緩衝液容量に対してプロットした線形回帰プロットを示す。

１．０ｍＬの緩衝液容量の標準曲線を使用して、５－ＰＬフィッティングを使用して較正曲線が作成される。

１．０ｍＬの緩衝液を使用してＦＣＰ較正曲線を作成することから得られた５－ＰＬパラメーターが示される：

次に、試験中に使用されるすべての緩衝液容量について５－ＰＬフィッティングを使用して、各レベルと対応する添加された緩衝液容量とについて濃度が計算される。添加された各緩衝液容量について、平均パーセント誤差が計算される。添加された各緩衝液容量の平均パーセント誤差を要約した表は、以下の表である。

記載されたドナーＲＦＵ対１／容量（ｍＬ）緩衝液容量近似法を単一の５－ＰＬ較正曲線からのＦＣＰ濃度オフセット決定法と組み合わせることにより、定量的ＦＣＰ値を計算することができる。

緩衝液容量０．７５、０．８７５、１．０、１．２５、及び１．５ｍＬで試験された既知濃度のＦＣＰの定量的要約結果を以下の表に示す。

各試料ドナーＲＦＵを使用して容量を概算し、次にこれを使用して、単一の５－ＰＬ較正曲線出力から定量的出力を調整して結果が得ることにより、結果が計算される。

添加された未知の緩衝液容量内のＦＣＰ濃度を決定するためのこの報告書に記載の方法は、０．７５～１．５ｍＬの緩衝液添加量にまたがる異なる濃度のＦＣＰで試験する場合の正確度と精度を示す。

前述の開示は、理解を明確にする目的で例示及び例として、ある程度詳細に説明されているが、当業者は、特定の変更及び修正が添付の特許請求の範囲内で実施され得ることを理解するであろう。さらに、本明細書で提供される各参考文献は、各参考文献が参照によって個別に組み込まれた場合と同じ程度に、その全体が参照によって組み込まれる。本出願と本明細書で提供される参考文献との間に矛盾が存在する場合、本出願が優先するものとする。

Claims (43)

1. 分析物を含む試験試料中のヘマトクリット（％ＨＣＴ）の未知濃度を決定するための方法であって、以下を含む方法：
   ａ）均一な容量又は濃度の分析物を試料に添加する工程；
   ｂ）既知量の発光材料を試料に添加する工程であって、前記発光材料は光出力を生成する工程；
   ｃ）試料中の少なくとも２つの既知の異なるヘマトクリット濃度レベルを使用して、試料中の光出力とパーセントヘマトクリットとのアルゴリズム的関係を決定する工程；及び
   ｄ）分析物を有する試験試料中の、発光材料からの測定された光出力と工程ｃで決定されたアルゴリズム的関係とを使用して、（％ＨＣＴ）ヘマトクリットの未知濃度を決定する工程。
2. 前記分析物が抗ＴＮＦα薬又は炎症性タンパク質である、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗ＴＮＦα薬が、REMICADE（商標）（インフリキシマブ）、INFLECTRA（インフリキシマブ－ｄｙｙｂ）、RENFLEXIS（インフリキシマブ－ａｂｄａ）、FLIXABI（インフリキシマブバイオシミラー）、REMSIMA（インフリキシマブバイオシミラー）、ENBREL（商標）（エタネルセプト）、HUMIRA（商標）（アダリムマブ）、AMJEVITA（アダリムマブ－ａｔｔｏ）、IMRALDI（アダリムマブバイオシミラー）、CYLTEZO（アダリムマブバイオシミラー）、HYRIMOZ（アダリムマブバイオシミラー）、HULIO（アダリムマブバイオシミラー）、CIMZIA（商標）（セルトリズマブペゴール）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーである、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
4. 前記抗ＴＮＦα薬がREMICADE（商標）（インフリキシマブ）である、請求項３に記載の方法。
5. 前記分析物がＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）である、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記少なくとも２つの既知の異なるヘマトクリット濃度レベルが、（ｉ）１～１５％、及び（ｉｉ）１６～７５％から選択される２つの濃度である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記アルゴリズム的関係が、線形、非線形、対数、指数、又は多項式のカーブフィッティングアルゴリズムからなる群から選択されるメンバーである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記アルゴリズム的関係が線形カーブフィッティングアルゴリズムである、請求項７に記載の方法。
9. 試験試料中の前記％ＨＣＴが試験試料中の１０％～７５％の間である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
10. 試験試料中の全血内の分析物血漿濃度を決定するための方法であって、以下を含む方法：
    ａ）均一な容量又は濃度の分析物を試料に添加する工程；
    ｂ）既知量の発光材料を試料に添加する工程であって、前記発光材料は光出力を生成する工程；
    ｃ）前記発光材料からの少なくとも２つの別個の光出力を測定する工程であって、第１の光出力は既知量の発光材料と相関し、そして第２の光出力は分析物濃度を決定するために使用される工程；
    ｄ）既知量の発光材料の出力と既知の％ヘマトクリット濃度とのアルゴリズム的関係を決定する工程；
    ｅ）工程ｄのアルゴリズム的関係を使用して、試験試料のヘマトクリット濃度を決定する工程；
    ｆ）ヘマトクリットの較正曲線と分析物のシグナル出力との数学的関係を決定する工程；及び
    ｇ）工程ｅ及びｆに従って、試料内のヘマトクリット量を考慮して、較正曲線又は較正曲線からの出力のいずれかを調整して、試験試料中の前記分析物の血漿濃度を決定する工程。
11. 前記分析物が抗ＴＮＦα薬又は炎症性タンパク質である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記抗ＴＮＦα薬が、REMICADE（商標）（インフリキシマブ）、INFLECTRA（インフリキシマブ－ｄｙｙｂ）、RENFLEXIS（インフリキシマブ－ａｂｄａ）、FLIXABI（インフリキシマブバイオシミラー）、REMSIMA（インフリキシマブバイオシミラー）、ENBREL（商標）（エタネルセプト）、HUMIRA（商標）（アダリムマブ）、AMJEVITA（アダリムマブ－ａｔｔｏ）、IMRALDI（アダリムマブバイオシミラー）、CYLTEZO（アダリムマブバイオシミラー）、HYRIMOZ（アダリムマブバイオシミラー）、HULIO（アダリムマブバイオシミラー）、CIMZIA（商標）（セルトリズマブペゴール）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーである、請求項１０～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記抗ＴＮＦα薬がREMICADE（商標）（インフリキシマブ）である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記分析物がＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）である、請求項１０～１１のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記アルゴリズム的関係が、線形、非線形、対数、指数、又は多項式のカーブフィッティングアルゴリズムからなる群から選択されるメンバーである、請求項１０～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 試験試料に添加された緩衝液の容量を決定するための方法であって、以下を含む方法：
    ａ）均一な容量又は濃度の分析物を試料に添加する工程；
    ｂ）既知量の発光材料を試料に添加する工程であって、前記発光材料は光出力を生成する工程；
    ｃ）試料中の少なくとも２つの別個の光出力を測定する工程であって、第１の光出力は既知量の発光材料と相関し、そして第２の光出力は分析物濃度を決定するために使用される工程；
    ｄ）既知量の発光材料の出力と試料に添加された緩衝液容量とのアルゴリズム的関係を決定する工程；及び
    ｅ）前記アルゴリズム的関係を使用して、試験試料に添加された緩衝液容量を決定する工程。
17. 前記分析物が糞便カルプロテクチンである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記アルゴリズム的関係が、線形、非線形、対数、指数、又は多項式のカーブフィッティングアルゴリズムからなる群から選択されるメンバーである、請求項１６～１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 試験試料中の未知の緩衝液濃度中のドナー及びアクセプターを有するＦＲＥＴアッセイを使用して分析物濃度を決定するための方法であって、以下を含む方法：
    ａ）均一な容量又は濃度の分析物を試料に添加する工程；
    ｂ）既知量の発光材料を試料に添加する工程であって、前記発光材料は光出力を生成する工程；
    ｃ）試料中の少なくとも２つの別個の光出力を測定する工程であって、第１の光出力は既知量の発光材料と相関し、そして第２の光出力は分析物濃度を決定するために使用される工程；
    ｄ）既知量の発光材料の出力と試料に添加された緩衝液容量とのアルゴリズム的関係を決定する工程；
    ｅ）試験試料に添加された緩衝液容量を決定する工程；
    ｆ）添加された緩衝液容量と分析物シグナル出力とのアルゴリズム的関係を決定する工程；及び
    ｇ）工程ｅ及びｆに従って、試料内に添加された緩衝液容量を考慮して、較正曲線又は較正曲線からの出力のいずれかを調整して、分析物の血漿濃度を決定する工程。
20. 前記方法が、５パラメーターのロジスティック回帰を使用して、パーセント誤差及び緩衝液容量の線形回帰を決定する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記分析物が抗ＴＮＦα薬又は炎症性タンパク質である、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記抗ＴＮＦα薬が、REMICADE（商標）（インフリキシマブ）、INFLECTRA（インフリキシマブ－ｄｙｙｂ）、RENFLEXIS（インフリキシマブ－ａｂｄａ）、FLIXABI（インフリキシマブバイオシミラー）、REMSIMA（インフリキシマブバイオシミラー）、ENBREL（商標）（エタネルセプト）、HUMIRA（商標）（アダリムマブ）、AMJEVITA（アダリムマブ－ａｔｔｏ）、IMRALDI（アダリムマブバイオシミラー）、CYLTEZO（アダリムマブバイオシミラー）、HYRIMOZ（アダリムマブバイオシミラー）、HULIO（アダリムマブバイオシミラー）、CIMZIA（商標）（セルトリズマブペゴール）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーである、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記抗ＴＮＦα薬がREMICADE（商標）（インフリキシマブ）である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記分析物がＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）である、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記アルゴリズム的関係が、線形、非線形、対数、指数、又は多項式のカーブフィッティングアルゴリズムからなる群から選択されるメンバーである、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 試料のアッセイの補正係数を決定するための方法であって、以下を含む方法：
    選択された量の発光材料を試料に添加する工程；
    試料内の発光材料からの観察された光出力の測定値を得る工程；及び
    観察された光出力測定値と前記試料からの予測される光出力とを関連付けるアルゴリズムを適用して、前記補正係数を決定する工程。
27. 前記アルゴリズムの適用は、前記観察された光出力測定値と発光材料の予測される量との関数を使用して補正係数を計算することを含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記アルゴリズムの適用は、探索表から値を検索することを含む、請求項２６に記載の方法。
29. 前記アルゴリズムの適用は、出力濃度を調整するために較正曲線を調整することを含む、請求項２６に記載の方法。
30. 前記アルゴリズムが、前記アッセイを使用する以前の測定値から導かれる、請求項２６～２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記以前の測定値は、２つ以上の以前の試料からの観察された光出力のものであり、かつ前記２つ以上の以前の試料のうちの少なくとも２つは、互いに異なるマトリックスを有する、請求項３０に記載の方法。
32. 前記以前の測定値は、２つ以上の以前の試料からの観察された光出力のものであり、かつ前記２つ以上の以前の試料のうちの少なくとも２つは、互いに異なる容量を有する、請求項３０又は３１に記載の方法。
33. 前記試料が第１の試料であり、前記方法がさらに以下を含む、請求項２６～３２のいずれか１項に記載の方法：
    前記アッセイを使用して、第２の試料からの観察された光出力の第２の測定値を記録する工程；及び
    前記決定された補正係数を使用して第２の測定値を調整し、こうして補正された測定値を計算する工程。
34. 前記第２の試料は、前記第１の試料と同じマトリックスを有する、請求項３３に記載の方法。
35. 前記第２の試料が前記第１の試料と同じ容量を有する、請求項３３又は３４に記載の方法。
36. 前記光出力が、前記試料から放出された蛍光を含む、請求項２６～３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記試料がＦＲＥＴシステムを含む、請求項３６に記載の方法。
38. 前記発光材料が、ランタニド蛍光発色団を含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
39. 前記ランタニド蛍光発色団がクリプテートを含む、請求項３８に記載の方法。
40. 前記光出力が、試料から放出された化学発光の光を含む、請求項２６～３９のいずれか１項に記載の方法。
41. 前記試料が赤血球を含む、請求項２６～４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記アルゴリズムが、線形、非線形、対数、指数、又は多項式のカーブフィッティングアルゴリズムからなる群から選択されるメンバーである、請求項２６～４１のいずれか１項に記載の方法。
43. 前記補正係数が、前記試料中のヘマトクリットレベルを標準化するために使用される、請求項２６～４１のいずれか１項に記載の方法。

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