CN115572755A - 内毒素测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能够消除各试剂盒不同的背景发光的影响而再现性良好地测定内毒素浓度的内毒素测定方法。该内毒素测定方法中，将试样液、由内毒素激活的试剂、通过激活了的试剂使发光基质游离的发光合成基质、使游离出的发光基质发光的发光酶混合而制备测定液，对在制备了所述测定液后经过了第1时间T1时的第1发光量L1和经过了第2时间T2时的第2发光量L2进行测定，根据所述第1发光量L1和所述第2发光量L2，求得基于内毒素的净发光量LX，根据求得的净发光量LX，求得试样液中的内毒素浓度。

Description

内毒素测定方法

技术领域

本发明涉及一种内毒素测定方法。更详细而言，涉及一种能够消除试剂造成的背景发光的影响而高精度地求得内毒素浓度的内毒素测定方法。

背景技术

“内毒素(endotoxin)”是构成革兰氏阴性菌的外膜的成分之一，其活性的主体是LPS(lipopolysaccharide：脂多糖)。生物体内的内毒素作为外膜的一部分存在于革兰氏阴性菌的表层。此外，一般情况下在革兰氏阴性菌死亡后会作为游离的内毒素游离存在于血液中。

血液中存在一定量或更多的内毒素时，由于该内毒素的刺激，会在单核细胞、粒细胞等中产生过多的炎性细胞因子。其结果是，会诱发发热、败血症、败血性休克或多器官衰竭等称作内毒素血症的症状。因此，对注射药物等中的内毒素的检测极为重要。

此外，在临床诊断中，准确测定血液中的内毒素被认为是尽早诊断和确定疗效的关键。

作为高灵敏度地检测内毒素的方法，已知有通过由内毒素激活的试剂使发光基质从发光合成基质游离并使游离的发光基质发光的生物发光法(专利文献1)。

基于生物发光法的发光分析中使用的试剂多采用来源于生物的试剂，每一批次的灵敏度往往各不相同。因此，会针对每一批次的试剂求得示出待测成分和发光量之间的关系的校准曲线。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2009/063840号

发明内容

发明所要解决的问题

但是，即使针对每一批次的试剂制作了校准曲线，也难以再现性良好地求得内毒素浓度。

本发明人等究其原因发现，之所以会如此，是因为即使是同一批次的试剂盒，各个试剂盒的试剂量也略有不同，相应地，导致背景发光的物质的量也不同。

本发明鉴于上述情况，目的在于提供一种能够消除各试剂盒不同的背景发光的影响而再现性良好地测定内毒素浓度的内毒素测定方法。

解决问题的技术方案

为了达成上述目的，本发明采用了以下构成。

本发明的第1方案为，一种内毒素测定方法，其中，制备包含试样液、由内毒素激活的试剂、通过激活了的试剂使发光基质游离的发光合成基质、以及使游离出的发光基质发光的发光酶的测定液；对在制备了所述测定液后经过了第1时间T1时的第1发光量L1和经过了第2时间T2时的第2发光量L2进行测定；根据所述第1发光量L1和所述第2发光量L2，求得基于内毒素的净发光量LX，根据求得的净发光量LX，求得试样液中的内毒素浓度。

其中，所述第1时间T1是取代试样液而测定不含内毒素的空白溶液时的发光量达到最大值或近乎最大值且在测定包含内毒素的试样液时的发光量与测定所述空白溶液时的发光量之间没有显著差异的时间，所述第2时间T2是在测定包含内毒素的试样液时的发光量与测定所述空白溶液时的发光量之间有显著差异的时间。

本发明的第2方案为，根据第1方案所述的内毒素测定方法，其中，将从所述第2发光量L2中减去所述第1发光量L1后的发光量作为所述净发光量LX。

本发明的第3方案为，根据第1方案或第2方案所述的内毒素测定方法，其中，通过在容纳有由所述内毒素激活的试剂、所述发光合成基质以及所述发光酶的测定容器中注入所述试样液，来制备所述测定液。

本发明的第4方案为，根据第1方案或第2方案所述的内毒素测定方法，其中，通过在以冻干状态容纳有由所述内毒素激活的试剂、所述发光合成基质以及所述发光酶的测定容器中注入所述试样液，来制备所述测定液。

本发明的第5方案为，根据第1方案至第4方案中的任一方案所述的内毒素测定方法，其中，由所述内毒素激活的试剂是裂解试剂，所述发光合成基质由发光基质与肽结合而成，且为通过活性C因子、活性B因子以及凝固酶中的至少任一种的作用而导致所述肽与所述发光基质的结合被切断的结构。

本发明的第6方案为，根据第1方案至第5方案中的任一方案所述的内毒素测定方法，其中，所述发光基质为氨基荧光素，所述发光酶为荧光素酶。

发明效果

根据本发明的内毒素测定方法，能够消除各试剂盒不同的背景发光的影响而再现性良好地测定内毒素浓度。

附图说明

图1是示出本发明的一个实施方式的内毒素测定方法的步骤的图。

图2是示出测定液中的反应的一个例子的图。

图3是示出与反应时间相应的发光量的变化的图表。

图4是示出实施本发明的测定方法的测定装置的一个例子的结构示意图。

具体实施方式

参照图1，对本发明的一个实施方式的内毒素测定方法的步骤进行说明。

如图1的(a)所示，首先，从测定容器1的容器主体2取下盖3。容器主体2由玻璃等至少可透过基于内毒素的发光的材料构成。

在测定容器1的容器主体2中提前容纳有试剂盒6(构成测定液的试样液以外的成分)。优选试剂盒6在冻干状态下容纳于容器主体2中。此外，优选试剂盒6附着于容器主体2的底部。

优选地，容纳有试剂盒6的测定容器1截至使用时刻之前被以冷藏状态保存。

试剂盒6中包含由内毒素激活的试剂、通过激活了的试剂使发光基质游离的发光合成基质、使游离出的发光基质发光的发光酶、以及其它发光反应所需的其它化合物。

作为由内毒素激活的试剂，优选为包含通过与内毒素结合而激活的C因子的试剂，更优选为除了C因子外还含有由活性C因子激活的B因子以及由活性B因子激活并生成凝固酶的前凝固酶的试剂。作为含有C因子、B因子以及前凝固酶的试剂，可以优选使用裂解试剂(鲎血细胞提取成分)。

作为发光合成基质，可以使用发光基质与肽结合而成的发光合成基质。作为发光合成基质，可以使用具有以下结构的物质，即：通过活性C因子、活性B因子以及凝固酶中的至少任一种的作用(蛋白酶活性)而导致发光基质与肽的结合被切断的结构。

作为发光基质，可以优选使用氨基荧光素。作为与发光基质结合的肽，只要是由以下氨基酸序列构成者即可，即：通过活性C因子、活性B因子以及凝固酶中的至少任1种的蛋白酶活性而导致与该肽的C末端的氨基荧光素的酰胺结合被切断的氨基酸序列。

作为肽的具体的氨基酸序列，可以是专利文献1所述的序列。

发光酶是对从发光合成基质游离的发光基质的生物发光发挥催化剂的作用而产生光的酶。发光基质为氨基荧光素时的发光酶是荧光素酶，发光反应所需的其它化合物是ATP以及二价金属离子。作为二价金属离子，可以是镁离子、钙离子等。

需要说明的是，试样液包含盐分时，为了消除起因于盐分浓度的误差，试剂盒6也可以进一步包含NaCl。

接着如图1的(b)所示，使用微量移液器5向容器主体2中注入试样液。对注入的试样液的量没有特别限定，从易于利用测定装置100测定发光且减少试样液和试剂盒6的量的角度出发，优选为50μL-500μL，更优选为100μL-300μL，例如可以是200μL。

如图1的(c)所示，当注入试样液时，试样液会加入到试剂盒6中，从而制备成测定液4。对容纳有该测定液4的容器主体2关闭盖3，并如图1的(d)所示进行搅拌混合。需要说明的是，虽然图1的(d)中示出了用手振荡混合的方式，但对搅拌混合的方法没有限定，例如也可以使用振动混合器等。

测定液4中，从制备时起就在进行内毒素与由内毒素激活的试剂的反应。图2示出了试剂盒6包含裂解试剂、由氨基荧光素与肽结合而成的发光合成基质以及荧光素酶情况下的反应过程。

裂解试剂(鲎血细胞提取成分)中存在与内毒素发生特异性反应的C因子通路。

“C因子通路”中，如图2所示，首先，内毒素与C因子(Factor C)紧密结合并激活C因子。然后，通过与内毒素的结合被激活的C因子(活性C因子)激活B因子(Factor B)。接着，通过被激活的B因子(活性B因子)进一步激活前凝固酶(proclotting enzyme)，从而生成凝固酶(clotting enzyme)。

该凝固酶切断由氨基荧光素与肽结合而成的发光合成基质的肽与氨基荧光素的结合。其结果是，作为发光基质的氨基荧光素游离。通过使荧光素酶(发光酶)作用于该氨基荧光素，从而产生光。

需要说明的是，利用荧光素酶使游离出的氨基荧光素发光的反应中，有ATP以及二价金属离子(图2中以镁离子为例)参与。

如图1的(e)所示，利用测定装置100测定该产生的光。具体而言，将容纳有经过搅拌混合的测定液4的测定容器1存放于测定装置100的测定室10中，并关闭测定室10的门12。

当将容纳有测定液4的测定容器1存放于测定装置100的测定室10中并关闭测定室10的门12时，测定装置100开始测定，求得内毒素浓度。

需要说明的是，从向容器主体2注入试样液后直至将测定容器1存放于测定室10中并关闭门12为止的时间(以下称为“准备时间”)优选尽可能为固定的时间。

准备时间可以为例如1秒-60秒的范围，优选为5秒-10秒的范围。准备时间的波动优选在30秒以内，更优选在5秒以内。

测定装置100对在制备了测定液4后经过了第1时间T1时的第1发光量L1和经过了第2时间T2时的第2发光量L2进行测定，根据第1发光量L1和所述第2发光量L2，求得基于内毒素的净发光量LX。然后，通过将求得的净发光量LX与提前存储的校准曲线进行对照，求得试样液中的内毒素浓度。

以下参照图3对利用测定装置100求得内毒素浓度的方法进行详细说明。图3示出了与反应时间相应的发光量的变化的一个例子。

具体而言，示出了试剂盒6包含裂解试剂、由氨基荧光素与肽结合而成的发光合成基质以及荧光素酶情况下的、内毒素浓度为“0EU/mL”的空白溶液的数据(2个)以及内毒素浓度为“0.005EU/mL”的试样液的数据的例子。

图3中，横轴的“反应时间”的数值是将容纳有测定液4的测定容器1存放于测定装置100的测定室10中并关闭门12后的时间，略微小于测定液4制备后的经过时间(以下称为“全反应时间”)。由于取得本数据时的准备时间约为5秒，因此反应时间为200秒时的全反应时间约为205秒。

图3的纵轴为发光量。

第1时间T1是取代试样液而测定不含内毒素的空白溶液时的发光量为最大值或近乎最大值且在测定包含内毒素的试样液时的发光量与测定所述空白溶液时的发光量之间没有显著差异的时间。

第2时间T2是在测定包含内毒素的试样液时的发光量与测定所述空白溶液时的发光量之间有显著差异的时间。

测定空白溶液时的发光，是不基于内毒素而基于试剂盒自身的背景发光。试剂盒自身的背景发光是通过例如发光合成基质中包含的游离的发光基质由于发光酶而发光所产生的。

本发明人等确认后发现，背景发光存在以较短的反应时间开始并急速上升、达到最大值后缓慢下降的趋势。

另一方面，测定包含内毒素的试样液时的发光量存在以下趋势，即截至测定空白溶液时的发光量达到最大值的时间前后，会与测定空白溶液时的发光量大致同等地上升，然后会变得大于测定空白溶液时的发光量，其差异会随着时间的经过而变大。

这是由于基于内毒素的发光需要时间，因为它在裂解反应系统被激活之前不会产生。截至测定空白溶液时的发光量达到最大值的时间前后，实质上并未产生基于内毒素的发光，仅能观察到背景发光。

接着，随着裂解反应系统的激活以及之后的反应的进行，当产生基于内毒素的发光时，则能观察到结合了背景发光和基于内毒素的发光的发光。

需要说明的是，与测定空白溶液时的发光量间的差异之所以会随着时间的经过而变大，是因为由于裂解反应系统的基于内毒素的激活不断进行，只要存在足够量的可使发光基质游离的发光合成基质，游离的荧光素就会随着裂解反应系统激活的进行而不断增加。

由上可知，能够根据测定试样液时的第1时间T1的第1发光量L1估算测定该试样液时的第2时间T2的第2发光量L2中包含的背景发光的发光量。

即，能够根据第1发光量L1和第2发光量L2，求得基于内毒素的净发光量LX。

可通过下式(1)简易地求得净发光量LX。

LX＝L2－L1……(1)

此外，考虑到测定空白溶液时的发光量会在从第1时间T1起到第2时间T2的期间有些变化，例如若通过下式(2)求取，则能够更高精度地求得净发光量LX。

LX＝L2－L1×k……(2)

其中，k是常数，可通过将第2时间T2的空白溶液的发光量除以第1时间T1的空白溶液的发光量求得。

确定第1时间T1时，如图3所示，尽管测定空白溶液时的发光量达到最大值的时间会在反复测定中有些波动，但如图3的例子所示，大约为200秒左右。

只要是测定空白溶液时的发光量达到近乎最大值的时间，第1时间T1也可以相对于达到最大值的时间偏离。

此处，作为近乎最大值的发光量所允许的发光量可根据所需的测定精度等适当设定，但优选为最大值的50％以上的发光量，更优选为最大值的75％以上的发光量，尤其优选为最大值的90％以上的发光量。

图3的例子中，如果反应时间在100秒-300秒之间，则大致为最大值的95％以上的发光量。

此外，第1时间T1应是在测定包含内毒素的试样液时的发光量与测定所述空白溶液时的发光量之间没有显著差异的时间。即，第1时间T1应是测定试样液时实质上不产生基于内毒素的发光或产生的基于内毒素的发光可以忽略不计的时间。

图3的例子中，在对内毒素浓度为“0EU/mL”的空白溶液的数据(2个)与内毒素浓度为“0.005EU/mL”的试样液的数据进行比较时，从反应时间为300秒左右开始产生发光量的差异。即，从反应时间为300秒左右开始，在空白溶液的发光量与包含内毒素的试样液的数据之间有显著差异，可以说实质上开始产生基于内毒素的发光。

决定空白溶液的发光量与包含内毒素的试样液的数据之间的差异要多小才能说是没有显著差异的阈值，可以根据所需的测定精度等适当设定。

对包含与测定装置100的满量程相当的内毒素的试样液和空白溶液的数据进行对比时，上述阈值优选为测定空白溶液时的最大值的0％-50％，更优选为最大值的0％-30％的量，尤其优选为最大值的0％-10％。

确定第1时间T1时，若上述阈值为优选范围的下限值以上，则第1时间T1的选择自由度较高，若上述阈值为优选范围的上限值以下，则测定试样液时的背景发光量的估算精度较高。

第2时间T2应是在测定包含内毒素的试样液时的发光量与测定所述空白溶液时的发光量之间有显著差异的时间。即，第2时间T2应是测定试样液时能够确认基于内毒素的发光的时间。第2时间T2优选为在测定包含内毒素的试样液时的发光量与测定所述空白溶液时的发光量之间有足够差异的时间。

决定空白溶液的发光量与包含内毒素的试样液的数据的差异要达到何种程度才能称为具有显著差异、优选具有足够差异的阈值，可以根据所需的测定精度和测定效率等适当设定。

对包含与测定装置100的满量程相当的内毒素的试样液与空白溶液的数据进行对比时，上述阈值优选为测定空白溶液时的最大值的5％-100％，更优选为最大值的10％-100％的量，尤其优选为最大值的20％-100％。

确定第2时间T2时，若上述阈值是优选范围的下限值以上，则净发光量LX为足够大的值，测定精度较高。若上述阈值是优选范围的上限值以下，则能够缩短求得内毒素浓度所需的时间。

关于校准曲线，取代试样液使用包含已知浓度的内毒素的校准液，在如上所述确定的第1时间T1和第2时间T2测定第1发光量L1和第2发光量L2，通过上述公式(1)、公式(2)等，求得净发光量LX。然后，通过将求得的净发光量LX与该校准液的内毒素浓度相关联，制作成校准曲线。

优选使用内毒素浓度不同的多个校准液来制作校准曲线。也可由厂商等按照每个批次的试剂制作校准曲线并提供给测定人。

测定试样液时，在与制作校准曲线时相同的第1时间T1和第2时间T2测定第1发光量L1和第2发光量L2，通过与制作校准曲线时相同的公式(上式(1)、式(2)等)求得净发光量LX。然后，通过将求得的净发光量LX与提前存储的校准曲线对照，求得试样液中的内毒素浓度。

以往为了消除背景发光的影响，从测定试样液时的发光量中减去了在与试样液相同条件下测定空白溶液时的发光量。

但是，本发明人等发现，若测定空白溶液时的试剂盒6的量不同于测定试样液时的试剂盒6的量，则在与试样液相同条件下测定空白溶液时的发光量会不同于测定试样液时的背景发光量。

即，难以在所有测定容器1中以完全相同的量容纳微量的试剂盒6。例如，本发明人等发现，若测定空白溶液时的试剂盒6的量是测定试样液时的试剂盒6的量的110质量％，则会对背景发光量高估10％左右。

即使测定空白溶液时的试剂盒6的量与测定试样液时的试剂盒6的量之差的绝对值相同，试剂盒6的量越小，则对背景发光量产生的影响越难以忽视。即，本发明人等发现，在减少试剂盒6的量的情况下，按照从测定试样液时的发光量中减去在与试样液相同条件下测定空白溶液时的发光量的现有方法，无法进行准确的测定。

根据本发明，在容纳在测定容器1中的试剂盒6里加入试样液而制备测定液4，首先，在第1时间T1得到用于估算背景发光量的数据，然后，关于相同的测定液4在第2时间T2得到包含背景发光和基于内毒素的发光的发光量的数据。因此，即使容纳在测定容器1中的试剂盒6的量有些变动，也能够避免高估或低估背景发光量。

因此，能够高精度地测定试样液的内毒素浓度。

需要说明的是，上述实施方式中，示出了提前在测定容器1中容纳有试剂盒6的例子，但也可由测定人自身向未容纳试剂盒6的测定容器1中加入各试剂。此时，尽管可能产生因测定人所致的试剂的称量误差等，但根据本发明，即使有些许称量误差，也能准确地消除背景发光的影响。

以下参照图4对实施本发明的测定方法时所使用的测定装置100的一个例子进行说明。

图4的发光分析装置具备：可存放测定容器1的测定室10、对来自容纳在测定室10中的测定容器1内的光进行检测的光检测器20、被输入利用光检测器20检测到的发光量的运算装置30。

测定室10由上端为开口部11a的有底筒状的测定室主体11以及以可开闭的方式覆盖开口部11a的门12构成。

测定室主体11中，除了设置于侧面的透光的检测窗11b的部分以外的其它部分均遮光。而且，门12也遮光。

在门12处于打开状态(图1中用虚线表示的门12的状态)时，可从开口部11a从/向测定室主体11内拿出/放入测定容器1。此外，在门12处于关闭状态(图1中用实线表示的门12的状态)时，测定室10能够遮蔽外部光进入测定室10内部。

作为光检测器20，可以适当使用光电倍增管、光电二极管、光电晶体管、雪崩光电二极管等。

本实施方式中，光检测器20仅在门12处于关闭状态时才检测光。例如，光检测器20是光电倍增管时，仅在门12处于关闭状态时才对光检测器20施加电压。

对于仅在门12处于关闭状态时由光检测器20检测光的方法没有特别限定，例如可以是：以门12自身为开关，通过门12的顶端接触测定室主体11的开口部11a周边而关闭对光检测器20施加电压的电路的方法。此外，也可以使用对门12的顶端接触测定室主体11的开口部11a周边进行感知的接触式传感器等。

优选地，运算装置30判断为测定容器1已存放于测定室10中时，即进行求取上述试样液中的内毒素浓度的作业。

据此，仅需将测定容器1存放于测定室10中，即可自动使运算装置30开始求取试样液中的内毒素浓度的作业。

例如，当门12处于打开状态，然后变为关闭状态时，运算装置30可根据光检测器20能否检测到试剂盒6自身的背景发光，来判断测定容器1是否已存放于测定室10中。

具体而言，是根据由光检测器20检测到的发光量是否为规定的阈值以上，来判断能否检测到该背景发光。

阈值是能够明确判断为产生了试剂盒6自身的背景发光的发光量。

需要说明的是，测定容器1自身也可产生极其微小的自然发光，但不应将此类自然发光的发光量或是与该发光量接近的发光量作为阈值。这是因为，若将从测定容器1自身发出的自然发光这种极其微小的发光量作为阈值，则不得不准备具有极高灵敏度的光检测器20，而且难以高精度地对有无背景发光进行判断。

可通过使用不含待测成分的试样液作为空白溶液，对包含该空白溶液和试剂盒6的测定液4的发光量进行测定，来确认试剂盒6自身的背景发光的发光量。

阈值优选为试剂盒6自身的背景发光的发光量的10％-100％，更优选为30％-70％，例如可以是50％左右。

当确认光检测器20的灵敏度时，使用不含待测成分的空白溶液作为测定液4中的试样液。而且，操作者要将容纳有包含该空白溶液的测定液4的测定容器1存放于测定室10中并实施要求确认灵敏度的输入动作。

于是，运算装置30会将利用光检测器20检测到的发光量与提前存储的校准曲线的待测成分浓度为零时的发光量进行对比，确认光检测器20的灵敏度变化。

此处，提前存储的校准曲线的待测成分浓度为零时的发光量(以下有时称为“零基准发光量”)相当于试剂盒6自身的背景发光。例如通过发光合成基质中包含的游离的发光基质由于发光酶而发光，来产生试剂盒6自身的背景发光。

运算装置30将利用光检测器20检测到的发光量与零基准发光量进行对比。例如，通过求得利用光检测器20检测到的发光量与零基准发光量之比或是求得两者之差来进行对比。

当求取利用光检测器20检测到的发光量与零基准发光量之比时，在所求得的比值小于或超过了预设的规定范围的比值的情况下，运算装置30判断为光检测器20的灵敏度超过了规定的允许范围而发生了变动。

此外，当求取两者之差时，在所求得的差超过了预设的规定范围的差的情况下，运算装置30判断为光检测器20的灵敏度超过了规定的允许范围而发生了变动。

可以根据所需的测定精度等适当设定规定的范围并存储在运算装置30中。

运算装置30确认了光检测器20的灵敏度超过了规定的允许范围而发生了变动时，可通过输出警报等方式使操作者采取调整光检测器20的灵敏度、或是更换光检测器20等措施。

若光检测器20是光电倍增管，则可通过变更对光检测器20施加的电压，来调整光检测器20的灵敏度。

为了由运算装置30判断测定容器1是否已存放于测定室10中，或为了确认光检测器20的灵敏度，优选使试剂盒6事先包含发光物质。

发光物质是在不存在待测成分的情况下由于试剂盒6中包含的发光酶而发光的物质，或是其自身会发光的物质，也可以是由多个试剂构成的试剂组。

发光物质发出的光的波长范围优选为与内毒素作用于试剂盒6中包含的其它成分而发出的光的波长范围相等，更优选为相同。据此，当使用空白溶液作为试样液时，能够增加利用光检测器20检测到的发光量。

在不存在待测成分的情况下，作为由于试剂盒6中包含的发光酶而发光的物质，可以是由于试剂盒6中包含的发光酶而发光的发光基质，例如，发光酶是萤火虫荧光素酶时则为荧光素等。

作为其自身会发光的物质，可以是不同于试剂盒6中包含的发光酶的其它发光酶和由于该其它发光酶而发光的发光基质的组合，例如，叩甲虫荧光素酶和荧光素的组合、海肾荧光素酶和腔肠素的组合等。

当发光物质是由于试剂盒6中包含的发光酶而发光的发光基质时，优选为发出波长范围与从试剂盒6中包含的发光合成基质游离的发光基质相等的光的发光基质，特别优选为与从试剂盒6中包含的发光合成基质游离的发光基质相同的发光基质。

例如，作为试剂盒6包含使氨基荧光素游离的发光合成基质且发光酶包含荧光素酶时的发光物质，优选使用氨基荧光素。

当发光物质是不同于试剂盒6中包含的发光酶的其它发光酶和由于该其它发光酶而发光的发光基质的组合时，优选通过该组合发出波长范围与从试剂盒6中包含的发光合成基质游离的发光基质相等的光。

例如，作为试剂盒6包含使氨基荧光素游离的发光合成基质且发光酶使用荧光素酶时的发光物质，优选使用叩甲虫荧光素酶和荧光素的组合。

试剂盒6包含发光物质时的背景发光与不含发光物质时的背景发光比较，发光量较大。因此，能够更容易地判断测定容器1是否已存放于测定室10中和更容易地确认光检测器20的灵敏度。

附图标记说明

1 测定容器

2 容器主体

3 盖

4 测定液

5 微量移液器

6 试剂盒

10 测定室

12 门

100 测定装置

T1 第1时间

T2 第2时间

L1 第1发光量

L2 第2发光量

LX 净发光量。

Claims (6)

1.一种内毒素测定方法，其中，

制备包含试样液、由内毒素激活的试剂、通过激活了的试剂使发光基质游离的发光合成基质、以及使游离出的发光基质发光的发光酶的测定液；

对在制备了所述测定液后经过了第1时间T1时的第1发光量L1和经过了第2时间T2时的第2发光量L2进行测定；

根据所述第1发光量L1和所述第2发光量L2，求得基于内毒素的净发光量LX，根据求得的净发光量LX，求得试样液中的内毒素浓度，

其中，所述第1时间T1是取代试样液而测定不含内毒素的空白溶液时的发光量达到最大值或近乎最大值且在测定包含内毒素的试样液时的发光量与测定所述空白溶液时的发光量之间没有显著差异的时间，所述第2时间T2是在测定包含内毒素的试样液时的发光量与测定所述空白溶液时的发光量之间有显著差异的时间。

2.根据权利要求1所述的内毒素测定方法，其中，

将从所述第2发光量L2中减去所述第1发光量L1后的发光量作为所述净发光量LX。

3.根据权利要求1或2所述的内毒素测定方法，其中，

通过在容纳有由所述内毒素激活的试剂、所述发光合成基质以及所述发光酶的测定容器中注入所述试样液，来制备所述测定液。

4.根据权利要求1或2所述的内毒素测定方法，其中，

通过在以冻干状态容纳有由所述内毒素激活的试剂、所述发光合成基质以及所述发光酶的测定容器中注入所述试样液，来制备所述测定液。

5.根据权利要求1至4中的任一项所述的内毒素测定方法，其中，

由所述内毒素激活的试剂是裂解试剂，所述发光合成基质由发光基质与肽结合而成，且为通过活性C因子、活性B因子以及凝固酶中的至少任一种的作用而导致所述肽与所述发光基质的结合被切断的结构。

6.根据权利要求1至5中的任一项所述的内毒素测定方法，其中，

所述发光基质为氨基荧光素，所述发光酶为荧光素酶。

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