JPH02236453A

JPH02236453A - 免疫測定装置の発光光量検出方法

Info

Publication number: JPH02236453A
Application number: JP5843989A
Authority: JP
Inventors: Susumu Saito; 進斉藤; Minoru Ineji; 稲次　稔; Yoichi Inaba; 洋一稲葉
Original assignee: Jeol Ltd
Current assignee: Jeol Ltd
Priority date: 1989-03-10
Filing date: 1989-03-10
Publication date: 1990-09-19
Anticipated expiration: 2011-07-24
Also published as: JP2517102B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は免疫反応により生ずる化学発光を検出する免疫
測定装置の発光光量検出方法に関するものである。

〔従来の技術〕

一般に、免疫測定として酵素免疫測定法が使用されてい
る。この酵素免疫測定法は、酵素活性をマーカーとして
抗原抗体反応の程度を知り、これから抗原または抗体の
量を定量する方法であって、酵素標識抗原（または抗体
）と非標識抗原（または抗体）とが抗体（または抗原）
に対して競合しないサンドイッチ法や、酵素標識抗原（
または抗体）と非標識抗原（または抗体）とを競合させ
ることによってその非標識抗原量を求める競合反応法、
その他種々の方法がある。

第４図はサンドイッチ法による測定原理を説明するため
の図、第５図は競合法による測定原理を説明するための
図であり、６１は固相担体、６２は抗体、６３は被測定
抗原、６ｌ１は標識物質、６５は標識抗体、６６は基質
、θ７は生成物を示す。

サンドイッチ法は、第４図に示すように、■　まず、固
相担体６１の表面に物理的な吸着や化学反応を利用した
結合により抗体６２を固相状態にしておき、これに被測
定抗原６３を含むサンブルを加える。

■　その結果、サンプル中にはいろいろな爽雑成分があ
るものの、抗体６２と抗原６３とか特異的に反応し（第
１反応）、被測定抗原６３が固相化抗体６２に結合する
ので、その後、洗浄を行うことによりサンプル中の爽雑
成分を廃棄する。

■　次に、酵素を標ｒａ６４として結合させた酵素標識
抗体６５を添加する。

■　その結果、抗原抗体反応（第２反応）が起こり、固
相化抗体６２に結合している抗原６３の上に酵素標識抗
体６５が結合する。この場合、酵素標識抗体６５は、過
剰に添加されるので、抗原６３と抗体６５が結合して生
じた結合型の部分（ｂｏｕｎｄ　，　　以下Ｂと記す）
と結合していない遊離型の部分（ｆｒｅｅ，　　以下Ｆ
と記す）ができる。

■　そこで、洗浄を行うことによって遊κ型の部分Ｆの
過剰酵素標識抗体を廃棄する。つまり、Ｂ／Ｆ分離を行
う。

■　次に酵素反応を行う。このときの酵素活性は、結合
型の部分の酵素標識抗体の量によって決まるので、その
酵素標識抗体量は固相化抗体に結合した抗厚量、すなわ
ち被測定抗原量を表すことになる。

競合反応法は、第５図に示すように、 ■　抗体を固相化しておき、被測定抗原及び被測定抗原
と同じ抗原に標識を結合させた標識抗原を添加する。

■　その結果、抗原抗体反応が起こり、被測定抗原及び
標識抗原がそれぞれの量の割合に応じて固相化抗体に結
合する。

■、■　次に、サンドイッチ法と同様にＢ／Ｆ分離を行
い、酵素反応を行う。このときの酵素活性は、結合型の
郎分の酵素標識抗体の量によって決まるので、添加した
標識抗原量から検量線を使って被測定抗原量を求めるこ
とができる。

上記の方法は、いずれも所謂分離法であり、これに対し
てＢ／Ｆ分離を行わない非分離法もある。

非分離法は測定時間が早く操作が簡単であるが、測定感
度が低い等の欠点がある。それに比べて分離法は、測定
感度は高いが操作が非常に複雑且つ面倒であり、自動化
が難しく従来はほとんどの場合手作業で行われていた。

上記の免疫測定を自動化する場合は、ポリスチレンボー
ルまたはガラスビーズ等の固相に抗体または抗原を固定
して固相化したものが固相試薬として用いられている。

この固相試薬は、不安定であるため、通常は保存液を満
たした容器の中に入れておき、酵素免疫測定を行うとき
に容器の中から固相試薬を１つずつ反応検出容器に移し
、サンプルの分注、標識試薬の分注、Ｂ／Ｆ分離、洗浄
を行って、しかる後、結合型の部分を検出器へ移すよう
にしている。

ところで、酵素反応を利用して測定する場合には、例え
ば色素液を形成し、比色計により色の濃さを測定して反
応を検出するものがあるが、検出感度が低いため、免役
反応に伴う化学発光を検出することが行われている。

化学発光の検出には、連続的に反応生成物を流して計測
する７ローセルタイプと試験管等を利用して試験管単位
で８１１１定するバッチ式測定タイプのものがあるが、
化学発光における光量が微弱であるため、いずれのタイ
プのものでも発光反応液の部位にフォトマルチブライヤ
等の検出素子を近接設置することにより発光検出を行っ
ていた。

〔発明が解決すべき課題〕

しかしながら、例えば、バッチ式測定タイプの場合ｂこ
、Ｂ／Ｆ分離自洗浄を行った後反応管を発光検出器に挿
入すると、発光試薬を注入する前にもある程度の発光が
検出される。この発光は、発光試薬の注入とは関係なく
発生するものであるから、目的とする発光種からの発光
ではなく、別の種々の化学的要因によって発生するもの
である。

このようなバックグランド発光は、反応管に発光試薬を
注入して免疫反応に伴う化学発光の検出を行っている間
にも発生しているものであるが、当然のことながら所望
の発光検出に対してはノイズとなるものであり、とりわ
け、免疫反応に伴う化学発光が前述したように極めて微
弱であるため、微量のノイズでも検出精度に重大な影響
を及ぼすものである。ところが、このようなバックグラ
ンド発光に対しては従来全く配慮がなされておらず、精
度の高い発光検出が行えないという問題があった。

本発明は上記の課題を解決するものであって、検出した
発光光量からバックグランド発光による発光光量の影響
を除去して、精度の高い発光光量検出が可能な免疫測定
装置の発光光量検出方法を提供することを目的とするも
のである。

〔課題を解決するための手段〕

そのために本発明は、反応管内の免疫反応により生ずる
化学発光を検出する免疫測定装置の発光光量検出方法に
おいて、バックグランド発光の発光光量を検出し、当該
発光光量を全体の発光光量から減算することにより所定
の発光皿の発光光量を演算により求めること、さらには
、バックグランド発光の検出を、反応管を発光検出器に
挿入した後、当該反応管に発光試薬を注入する直前に行
うことを特徴とする。

〔作用〕

本発明は、バックグランド発光の原因の如何にかかわら
ず発光検出の前後ではバノクグランド発光の発光光量は
略同一あるいは略一定の微小な減衰率で減衰するもので
あることに着目し、バックグランド発光の発光光量を発
光検出の前後で各反応管ごとに実測し、この実測値を免
疫反応に伴う発光検出を行った際の全体の発光光量から
減算するようにしたので、いかなる場合にもバックグラ
ンド発光の影響のない高精度の検出を行うことが可能で
ある。

〔実施例〕

以下、実施例を図面を参照して説明する。

第１図は本発明の発光光量検出方法を適用して好適な発
光検出器の一構成例を示す図で、図中、１００は容器、
１０１は積分球、１０３は遮光板、１０５は反応管、１
０７は発光反応物、１０９は蓋、１１１は支持部材、１
１３は分注ピペット、１１５は送液ボンプ、１１７は発
光試薬、１１９はフォトマルチプライヤである。

図において、容器１００内には積分球１０１が配置され
、その中に支持部材１１１により反応管１０５が支持さ
れており、容器上部は蓋１０９により密閉し、容器を暗
箱にするようにしている。

反応管１０５内には分注ピペット１１３が連通し、送液
ボンプ１１５により発光試薬１１７が注入できるように
なっており、発光試薬を反応管１０５内に注入すること
により試料と混合させて発光反応物１０７が生成される
。また、作業性を向上させるために蓋１０９と分注ピペ
ット１１３とは一体にしてワッタッチ動作で蓋と分注ピ
ペットをセットしたり、取り外したりすることができる
ようにしている。

積分球１０１の内面はアクリル系の樹脂、酸化マグネン
アの粉末等の反射材が塗布され、ほぼ１００％の反射率
になるように形成され、積分球１０１からの光はフォト
マルチプライヤ１１９で検出される。また、積分球１０
１内には遮光板１０３が配置されて発光反応物１０７か
らの直接光がフォトマルチプライヤ１１９に入射しない
ように構成されている。もちろん遮光板１０３も反射率
がほぼ１００％になるように表面に反射材が塗布されて
いる。

このような構成において、所定の免役反応を行って得ら
れた試料を入れた試験管を積分球１０１内に設置し、分
注ピペット１１３を通して発光試薬１１７を注入すると
発光反応物１０７が生成されて化学発光が生ずる。この
化学発光は四方八方に放射される。積分球の内面は反射
材が塗布してあるため、全ての化学発光はここで反射さ
れ、理想的には無限回の反射を繰り返し、完全に方向性
が無くなった形でフォトマルチブライヤ１１９で検出さ
れる。したがって、反応管の中での発光位置あるいは反
応管自身の位置、反応管の管壁等に多少の傷がある等に
より反応管からの光の出射の形態が多少変化しても、積
分球により完全に平滑化され、その影響を受けずに検出
することができる。

このように、積分球は光を無限回反射して無方向性にす
る作用をし、その結果直接光を検出するのに比べ感度は
落ちるものの発光位置のずれ等の影響を完全に無くすこ
とが可能であり、安定したデータの収集を行うことを可
能となる。

次に、このようなバッチ式の発光検出器における本発明
の発光光量検出方法を、第２図に基づいて説明する。

第２図に示す曲線Ｄ　（ｔ）はフォトマルチブライヤ１
１９からの検出信号を模式的に表したものである。すな
わち、反応管１０５を積分球１０１内に挿入した時点か
らある発光検出値が現れ、略一定値を保つか、あるいは
時間の経過とともに略一定の微小な減衰率で減少してい
く。そして発光試薬を注入するとその時点から免疫反応
に伴う化学発光がはじまり、発光検出値も増加する。こ
の化学発光はあるピーク値を過ぎて減少し、再びバック
グランドの発光光量にまで低下する。

ここで図中の時点Ｓ．から発光検出を開始し、時点Ｓ．
で終了したとすると、前述したように、その検出光量の
中には発光試薬の注入とは無関係に生じているバックグ
ランド発光の光量までもが含まれてしまう。そこで本発
明では、この免疫反応に伴う発光検出を行っている期間
（すなわち時点Ｓ，から時点Ｓ．までの間）のパックグ
ランド光量を、当該発光検出の前後のバックグランド光
量の実測値に基づいて演出し、この演算値を前記期間の
発光光量検出値から減算するようにしている。

バックグランド発光の光量は、例えば、反応管を積分球
に挿入してから発光試薬を注入するまでの間（検出開始
時点Ｓ，が発光試薬注入時点より先行する場合には当該
時点Ｓ，までの間）に測定すればよいが、バックグラン
ド光量が多少なりとも減衰傾向を示す場合には、なるべ
く発光試薬注入時点、または検出開始時点Ｓ．に近い方
がよい。

いま、第２図の時点Ｎ．から時点Ｎ．までの期間でバッ
クグランド発光光量を検出した場合について、所望の発
光種のみによる発光光量Ｒの求め方を以下に説明する。

まず、期間中Ｎ．〜Ｎ．における発光光量Ｂは、従って
、単位時間当りのバックグランド発光光量ΔＢは、 ΔＢ＝Ｂ／ΔＴイＲ＝Ｓ−Ｎ・Ｓｅただし、ΔＴｎ　＝Ｎｅ−Ｎｓ一方、発光検出期間Ｓ，〜Ｓ．における全体の発光光量
Ｓは、ｒ　Ｓｅまた、同期間Ｓ．−Ｓ．におけるバックグランド発光光
量Ｎは、上記（２）式より、Ｎ＝ΔＢ×ΔＴ，ただし、ΔＴ．＝Ｓ．−Ｓ．従って、求める発光光惜、即ち目的とする発光種からの
発光光ｆｆｌＲは、によって求めることができる。

ここで、上記ΔＴ．やΔＴ．の時間幅は適当に選定する
ことができるが、ΔＴ３は９　ｓａｃ以内、また△Ｔ６
は５　ｓｅａ以内に設定するとよい。

なお、以上の説明ではバックグランド発光光量の検出期
間Ｎ．〜Ｎ．を反応管挿入から発光検出開始時点Ｓ．ま
での間に設けた場合について説明し“Ｃきたが、当該期
間Ｎ．〜Ｎ．は発光検出終了時点Ｓ．から反応管取り出
しまでの間に設けてもよい。

また、バックグランド発光光量の検出期間Ｎ３〜Ｎ０を
発光検出期間Ｓ．〜Ｓ．の前後にそれぞれ設け、両方の
検出値の平均をとって発光検出期間Ｓ．〜Ｓ，のバック
グランド発光光量を求めるようにすれば、バックグラン
ド発光光量が時間とともに減衰するような場合でもより
一層高精度に発光光ｆｆｉＲを求めることができる。

さらには、上記発光光量Ｒの値だけを出力させるのでは
なく、全体の発光光量Ｓの値やバックグランド発光光Ａ
Ｎの値も同時に出力するようにすれば、より一層詳細な
データ収集を行うことができる。

また、バックグランド発光光！！１Ｎの値については通
常想定される範囲が存在するので、あらかじめ想定され
る上限●下限値と上記（４）式で求められたＮの値を比
較することにより、検出系の異常を検地することもでき
る。すなわち、発光光量Ｓ’ＰＲの値はサンプルによっ
て種々の値を取りうるため、それらの値が何か特異的な
ものであったとしても、それが真にサンプルの情報によ
るものなのか検出系の異常によるものなのかは一概に判
断することはできない。これに対して、バックグランド
発光光量Ｎの値については、サンプルの種類が同じなら
ばある程度標準的な値の範囲を経験等によって得ること
ができる。したがって、このバックグランド発光光ｆｆ
ｉＮの値を監視パラメータに選定することにより、検出
系の異常を判定することが可能となる。その場合、バッ
クグランド発光光量Ｎの値が異常と判断されたときに警
報を出すようにすれば、より一層正確な測定を効率よく
行うことができる。

なお、第１図の発光検出器の実施例では球形の積分を用
いたものについて示したが、積分球を用いない発光検出
器についても本発明を適用できることは言うまでもない
。また、積分球を用いる場合についても必ずしも球形で
ある必要はなく、箱型、円筒型等他の形状のものでもよ
く、また遮光板を使わな《ても一定程度安定な測定がで
きる。

遮光板を使わない場合には直接光の入射があるため、発
光位置の変化等の影響を受ける反面、測定量が増加し、
Ｓ／Ｎ比を改善するという効果がある。また、本発明の
発光検出は、試験管等を用いたバッチ式に限らず、フロ
ー式タイプのものに適用しても同様の効果が得られるこ
とは言うまでもない。

第３図は本発明を適用して好適な発光検出器の他の実施
例を示す図で、蓋１０９と分注ピペット１１３とを一体
にし、２本のねじ１３１、１３３により容器に取り付け
るようにしたものである。

第１図の実施例においては、蓋１０９を容器上部に載置
するのみであったが、本実施例ではさらに蓋を容器にね
じ止めして反応管を固定し、反応管の位置の変化を防止
することができる［発明の効果コ以上のように本発明によれば、バックグランド発光の発
光光量を発光検出の前後で各反応管ごとに実測し、この
実測値を免疫反応に伴う発光検出を行った際の全体の発
光光量から減算するようにしているので、いかなる場合
にもバックグランド発光の影響のない高精度の検出を行
うことが可能となる。

また、バックグランド発光の発光光量を実測しているた
め、当該発光光量を標準的な値と比較して検出系の異常
等を判定することも可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を適用して好適な発光検出器の一実施例
構成を示す図、第２図は本発明の発光光量検出方法を説
明するための図、第３図は本発明を適用して好適な発光
検出器の他の実施例構成を示す図、第４図はサンドイッ
チ法により測定原理を説明するための図、第５図は競合
法による測定原理を説明するための図である。１００・・・容器、１０１・・・積分球、１０３・・・
遮光板、１０５・・・反応管、１０７・・・発光反応物
、１０θ・・・蓋、１１１・・・支持郎祠、１１３・・
・分注ビベツ｝、１１５・・・送液ボンプ、１ｌ７・・
・発光試薬、　１１９・・・フォトマルチプライヤー出　　願　　人　　日本電子株式会社代理士　弁理士　　菅　井　英　雄（外５名）第図１０３遮Ｌ板第図ＮＳＮｅ５Ｓ ′：）ｅ工

Claims

【特許請求の範囲】

（１）反応管内の免疫反応により生ずる化学発光を検出
する免疫測定装置の発光光量検出方法において、バック
グランド発光の発光光量を検出し、当該発光光量を全体
の発光光量から減算することにより所定の発光種の発光
光量を演算により求めることを特徴とする免疫測定装置
の発光光量検出方法。
（２）反応管を発光検出器に挿入したのち当該反応管に
発光試薬を注入する直前にバックグランド発光を検出す
るようにしたことを特徴とする請求項１記載の免疫測定
装置の発光光量検出方法。