JP2000275247A - Ｄ−システインの測定法 - Google Patents
Ｄ−システインの測定法Info
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】簡便かつ高感度なＤ−システインの測定法およ
びＤ−システインの測定用試薬を提供すること。 【解決手段】（１）Ｄ−システインをＤ−ルシフェリン
前駆体と反応させて、Ｄ−ルシフェリンまたはＤ−ルシ
フェリン誘導体を生成させる第１工程、生成したＤ−ル
シフェリンまたはその誘導体の量を測定することによ
り、Ｄ−システイン量を測定する第２工程、を含むこと
を特徴とする、試料中のＤ−システインの測定法。Ｄ−
ルシフェリン前駆体としては、2-シアノ-6-ヒドロキシ
ベンゾチアゾール、2-シアノ-6-Ｏ-β-Ｄ−ガラクトシ
ルベンゾチアゾール等が使用できる。 （２）Ｄ−ルシフェリン前駆体を含むことを特徴とす
る、Ｄ−システインの測定用試薬。
びＤ−システインの測定用試薬を提供すること。 【解決手段】（１）Ｄ−システインをＤ−ルシフェリン
前駆体と反応させて、Ｄ−ルシフェリンまたはＤ−ルシ
フェリン誘導体を生成させる第１工程、生成したＤ−ル
シフェリンまたはその誘導体の量を測定することによ
り、Ｄ−システイン量を測定する第２工程、を含むこと
を特徴とする、試料中のＤ−システインの測定法。Ｄ−
ルシフェリン前駆体としては、2-シアノ-6-ヒドロキシ
ベンゾチアゾール、2-シアノ-6-Ｏ-β-Ｄ−ガラクトシ
ルベンゾチアゾール等が使用できる。 （２）Ｄ−ルシフェリン前駆体を含むことを特徴とす
る、Ｄ−システインの測定用試薬。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ−システインの
測定法およびＤ−システインの測定用試薬に関する。
測定法およびＤ−システインの測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内に存在するアミノ酸は、そのほと
んどがＬ−アミノ酸であると考えられていたが、近年、
ほ乳類を含めた高等動物に高濃度のＤ−アミノ酸が相次
いで見いだされており、その由来や役割に関心が寄せら
れている。このため、Ｄ−アミノ酸を簡便、短時間かつ
高感度に測定する方法を確立することは、バイオテクノ
ロジー、臨床検査、医学等の分野において非常に重要で
ある。Ｄ−システインは、Ｄ−アミノ酸の一種である。
従来、試料中のＤ−システインの測定法としては、高速
液体クロマトグラフィーを利用する方法などがあった。
んどがＬ−アミノ酸であると考えられていたが、近年、
ほ乳類を含めた高等動物に高濃度のＤ−アミノ酸が相次
いで見いだされており、その由来や役割に関心が寄せら
れている。このため、Ｄ−アミノ酸を簡便、短時間かつ
高感度に測定する方法を確立することは、バイオテクノ
ロジー、臨床検査、医学等の分野において非常に重要で
ある。Ｄ−システインは、Ｄ−アミノ酸の一種である。
従来、試料中のＤ−システインの測定法としては、高速
液体クロマトグラフィーを利用する方法などがあった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便かつ高
感度なＤ−システインの測定法およびＤ−システインの
測定用試薬を提供することを目的とする。
感度なＤ−システインの測定法およびＤ−システインの
測定用試薬を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本願発明者は、Ｄ−シス
テインとＤ−ルシフェリン前駆体との反応により生成し
たＤ−ルシフェリンを、ルシフェラーゼと反応させるこ
とにより、Ｄ−システイン量を測定できることを見出
し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明はＤ−
システインの測定法に関する。また、本発明はＤ−シス
テインの測定用試薬に関する。
テインとＤ−ルシフェリン前駆体との反応により生成し
たＤ−ルシフェリンを、ルシフェラーゼと反応させるこ
とにより、Ｄ−システイン量を測定できることを見出
し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明はＤ−
システインの測定法に関する。また、本発明はＤ−シス
テインの測定用試薬に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】１．試料中のＤ−システインの測
定法について 本発明における試料中のＤ−システインの測定法は、以
下の２工程を含むことを特徴とする。
定法について 本発明における試料中のＤ−システインの測定法は、以
下の２工程を含むことを特徴とする。
【０００６】（１）第１工程 第１工程では、Ｄ−システインをＤ−ルシフェリン前駆
体と反応させて、Ｄ−ルシフェリンまたはＤ−ルシフェ
リン誘導体を生成させる。「Ｄ−ルシフェリン前駆体」
とは、Ｄ−システインと反応することによりＤ−ルシフ
ェリンまたはＤ−ルシフェリン誘導体を生成させること
ができる化合物を意味する。Ｄ−ルシフェリン前駆体と
しては、例えば2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾー
ルが使用できる。Ｄ−システインと2-シアノ-6-ヒドロ
キシベンゾチアゾールの反応は以下の通り。
体と反応させて、Ｄ−ルシフェリンまたはＤ−ルシフェ
リン誘導体を生成させる。「Ｄ−ルシフェリン前駆体」
とは、Ｄ−システインと反応することによりＤ−ルシフ
ェリンまたはＤ−ルシフェリン誘導体を生成させること
ができる化合物を意味する。Ｄ−ルシフェリン前駆体と
しては、例えば2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾー
ルが使用できる。Ｄ−システインと2-シアノ-6-ヒドロ
キシベンゾチアゾールの反応は以下の通り。
【０００７】
【化１】
【０００８】本発明でいう「Ｄ−ルシフェリン誘導体」
とは、Ｄ−ルシフェリンの本質的な構造を有する化合物
であり、例えば、Ｄ−ルシフェリンの塩、エステルある
いは配糖体等が挙げられる。配糖体としては、例えば、
ルシフェリン−β−Ｄ−ガラクトシド、ルシフェリン−
β−Ｄ−グルコシド等が挙げられる。ルシフェリン−β
−Ｄ−ガラクトシドは、糖加水分解酵素、例えばβ−ガ
ラクトシダーゼを作用させることにより、Ｄ−ルシフェ
リンを生成する。Ｄ−ルシフェリン誘導体がルシフェリ
ン−β−Ｄ−ガラクトシドである場合、本発明のＤ−ル
シフェリン前駆体としては、２−シアノ−６−Ｏ−β−
Ｄ−ガラクトシルベンゾチアゾールが使用できる。
とは、Ｄ−ルシフェリンの本質的な構造を有する化合物
であり、例えば、Ｄ−ルシフェリンの塩、エステルある
いは配糖体等が挙げられる。配糖体としては、例えば、
ルシフェリン−β−Ｄ−ガラクトシド、ルシフェリン−
β−Ｄ−グルコシド等が挙げられる。ルシフェリン−β
−Ｄ−ガラクトシドは、糖加水分解酵素、例えばβ−ガ
ラクトシダーゼを作用させることにより、Ｄ−ルシフェ
リンを生成する。Ｄ−ルシフェリン誘導体がルシフェリ
ン−β−Ｄ−ガラクトシドである場合、本発明のＤ−ル
シフェリン前駆体としては、２−シアノ−６−Ｏ−β−
Ｄ−ガラクトシルベンゾチアゾールが使用できる。
【０００９】試料としては、特に限定されず、Ｄ−シス
テインを含むと思われるもの、例えば、飲食物、医薬、
化粧品、海水、河川水、工業用水、下水、土壌、生物学
的材料（尿、糞便、血液、喀痰、膿汁、皮膚・臓器・毛
髪等の生体組織、生体からの各種抽出物）、微生物の培
養物等が挙げられる。また、上記の試料を適当な溶媒
（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、トリ
ス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）に懸濁した溶液を
試料としてもよい。試料が固形分を含む場合には、該検
体液を適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等等）に懸濁す
るか、ミキサ−などでホモジナイズすれば溶液状のもの
と同様に扱うことができる。
テインを含むと思われるもの、例えば、飲食物、医薬、
化粧品、海水、河川水、工業用水、下水、土壌、生物学
的材料（尿、糞便、血液、喀痰、膿汁、皮膚・臓器・毛
髪等の生体組織、生体からの各種抽出物）、微生物の培
養物等が挙げられる。また、上記の試料を適当な溶媒
（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、トリ
ス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）に懸濁した溶液を
試料としてもよい。試料が固形分を含む場合には、該検
体液を適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等等）に懸濁す
るか、ミキサ−などでホモジナイズすれば溶液状のもの
と同様に扱うことができる。
【００１０】第1工程を実施する場合、任意の方法が採
用し得るが、試料とＤ−ルシフェリン前駆体を含む溶液
とを接触させる方法が簡便である。Ｄ−ルシフェリン前
駆体を含む溶液は、Ｄ−ルシフェリンの他に、反応促進
や試薬の保存性向上のために通常使用される成分、例え
ば、緩衝剤、キレート剤、塩類、界面活性剤等を含んで
いてもよい。該溶液としては、後述するＤ−システイン
の測定用試薬が使用できる。試料と、Ｄ−ルシフェリン
前駆体を含む溶液との接触条件（混合比、接触温度、接
触時間、ｐＨ条件等）は、試料またはＤ−ルシフェリン
前駆体の種類、試料の形態等に応じて適宜設定すればよ
い。
用し得るが、試料とＤ−ルシフェリン前駆体を含む溶液
とを接触させる方法が簡便である。Ｄ−ルシフェリン前
駆体を含む溶液は、Ｄ−ルシフェリンの他に、反応促進
や試薬の保存性向上のために通常使用される成分、例え
ば、緩衝剤、キレート剤、塩類、界面活性剤等を含んで
いてもよい。該溶液としては、後述するＤ−システイン
の測定用試薬が使用できる。試料と、Ｄ−ルシフェリン
前駆体を含む溶液との接触条件（混合比、接触温度、接
触時間、ｐＨ条件等）は、試料またはＤ−ルシフェリン
前駆体の種類、試料の形態等に応じて適宜設定すればよ
い。
【００１１】（２）第２工程 第２工程では、生成したＤ−ルシフェリンまたはその誘
導体の量を測定することにより、Ｄ−システイン量を測
定する。Ｄ−ルシフェリン量を測定する方法としては、
例えば、Ｄ−ルシフェリンと生物発光試薬を反応させて
生じた発光量を測定する方法が挙げられる。生物発光と
は、発光基質であるルシフェリンと、酵素であるルシフ
ェラーゼとが関与する発光反応である。昆虫（ゲンジボ
タル、ヘイケボタル、ヒカリコメツキムシ等）の系で
は、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンの存在下、Ｄ−ル
シフェリンと、昆虫ルシフェラーゼとの反応により光が
生じる。昆虫の系を用いる場合、第2工程では、昆虫ル
シフェラーゼ、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンを含む
生物発光試薬と、第１工程で生成したＤ−ルシフェリン
またはＤ−ルシフェリン誘導体を溶液状態で接触させれ
ばよい。この時に生じる発光量を測定することにより、
Ｄ−ルシフェリン量を求めることができる。発光量は、
ルミノメーター、例えばルミテスター Ｃ−１００、Ｋ
−１００、Ｋ−２００、Ｋ−２１０（いずれもキッコー
マン社製）、ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１
（アロカ社製）、Lumat LB9501（ベルトールド社製）
により測定することができる。発光量から、Ｄ−システ
イン量を算出するには、予め検量線を作成しておくこと
が望ましい。検量線は、市販のＤ−システインを定量
し、水もしくは緩衝液に溶解後適宜希釈したＤ−システ
イン溶液に、Ｄ−ルシフェリン前駆体、例えば2-シアノ
-6-ヒドロキシベンゾチアゾールを加え、生成したＤ−
ルシフェリンを生物発光試薬と反応させ、その発光量を
測定することにより作成することが出来る。
導体の量を測定することにより、Ｄ−システイン量を測
定する。Ｄ−ルシフェリン量を測定する方法としては、
例えば、Ｄ−ルシフェリンと生物発光試薬を反応させて
生じた発光量を測定する方法が挙げられる。生物発光と
は、発光基質であるルシフェリンと、酵素であるルシフ
ェラーゼとが関与する発光反応である。昆虫（ゲンジボ
タル、ヘイケボタル、ヒカリコメツキムシ等）の系で
は、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンの存在下、Ｄ−ル
シフェリンと、昆虫ルシフェラーゼとの反応により光が
生じる。昆虫の系を用いる場合、第2工程では、昆虫ル
シフェラーゼ、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンを含む
生物発光試薬と、第１工程で生成したＤ−ルシフェリン
またはＤ−ルシフェリン誘導体を溶液状態で接触させれ
ばよい。この時に生じる発光量を測定することにより、
Ｄ−ルシフェリン量を求めることができる。発光量は、
ルミノメーター、例えばルミテスター Ｃ−１００、Ｋ
−１００、Ｋ−２００、Ｋ−２１０（いずれもキッコー
マン社製）、ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１
（アロカ社製）、Lumat LB9501（ベルトールド社製）
により測定することができる。発光量から、Ｄ−システ
イン量を算出するには、予め検量線を作成しておくこと
が望ましい。検量線は、市販のＤ−システインを定量
し、水もしくは緩衝液に溶解後適宜希釈したＤ−システ
イン溶液に、Ｄ−ルシフェリン前駆体、例えば2-シアノ
-6-ヒドロキシベンゾチアゾールを加え、生成したＤ−
ルシフェリンを生物発光試薬と反応させ、その発光量を
測定することにより作成することが出来る。
【００１２】以上により、試料中のＤ−システイン量の
測定が可能となる。なお、本発明の方法は、遊離の形で
存在するＤ−システインの測定法のみならず、Ｄ−シス
テイン誘導体の測定法としても有用である。ここでいう
「Ｄ−システイン誘導体」とは、Ｄ−ルシフェリン前駆
体と反応することによりＤ−ルシフェリンまたはＤ−ル
シフェリン誘導体を生成させることができる化合物を意
味する。本発明でいう「Ｄ−システイン」の概念には、
Ｄ−システイン誘導体も含まれる。
測定が可能となる。なお、本発明の方法は、遊離の形で
存在するＤ−システインの測定法のみならず、Ｄ−シス
テイン誘導体の測定法としても有用である。ここでいう
「Ｄ−システイン誘導体」とは、Ｄ−ルシフェリン前駆
体と反応することによりＤ−ルシフェリンまたはＤ−ル
シフェリン誘導体を生成させることができる化合物を意
味する。本発明でいう「Ｄ−システイン」の概念には、
Ｄ−システイン誘導体も含まれる。
【００１３】例えば、Ｄ−ルシフェリン前駆体が2-シア
ノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾールである場合、Ｄ−シ
ステインのカルボキシル基は、第2工程が実施可能であ
ればどのように修飾されていてもよい。この場合、Ｄ−
システイン誘導体とは、例えば、Ｎ末端にＤ−システイ
ン残基を有するポリペプチド鎖である。そのようなポリ
ペプチド鎖は、2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾー
ルと反応することにより、Ｄ−ルシフェリン誘導体（Ｄ
−ルシフェリンのカルボキシル基の部分が、ペプチド結
合を介してポリペプチド鎖と結合している化合物）を生
成することができる。該Ｄ−ルシフェリン誘導体を測定
するときは、プロテアーゼ等で処理してＤ−ルシフェリ
ンを遊離させ、これを測定すればよい。Ｄ−システイン
誘導体の測定も可能であることから、本発明は、生体を
構成する高分子（例えばタンパク質）中のＤ-システイ
ン量、生体組織（例えば、臓器、皮膚、毛髪）中のＤ-
システイン量の測定法として、特に有用である。
ノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾールである場合、Ｄ−シ
ステインのカルボキシル基は、第2工程が実施可能であ
ればどのように修飾されていてもよい。この場合、Ｄ−
システイン誘導体とは、例えば、Ｎ末端にＤ−システイ
ン残基を有するポリペプチド鎖である。そのようなポリ
ペプチド鎖は、2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾー
ルと反応することにより、Ｄ−ルシフェリン誘導体（Ｄ
−ルシフェリンのカルボキシル基の部分が、ペプチド結
合を介してポリペプチド鎖と結合している化合物）を生
成することができる。該Ｄ−ルシフェリン誘導体を測定
するときは、プロテアーゼ等で処理してＤ−ルシフェリ
ンを遊離させ、これを測定すればよい。Ｄ−システイン
誘導体の測定も可能であることから、本発明は、生体を
構成する高分子（例えばタンパク質）中のＤ-システイ
ン量、生体組織（例えば、臓器、皮膚、毛髪）中のＤ-
システイン量の測定法として、特に有用である。
【００１４】３．Ｄ−システインの測定用試薬について 本発明のＤ−システインの測定用試薬は、Ｄ−ルシフェ
リン前駆体を含むことを特徴とする。Ｄ−ルシフェリン
前駆体としては、2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾ
ール、２−シアノ−６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシルベン
ゾチアゾールなどが挙げられる。該測定用試薬は、Ｄ−
ルシフェリン前駆体の他に、反応促進や試薬の保存性向
上のために通常使用される成分、例えば、緩衝剤、キレ
ート剤、塩類、界面活性剤等を含んでいてもよい。試薬
の形態は溶液状態、凍結状態、乾燥状態のいずれであっ
てもよいが、溶液状態でＤ−システインと反応可能な形
態であることが好ましい。
リン前駆体を含むことを特徴とする。Ｄ−ルシフェリン
前駆体としては、2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾ
ール、２−シアノ−６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシルベン
ゾチアゾールなどが挙げられる。該測定用試薬は、Ｄ−
ルシフェリン前駆体の他に、反応促進や試薬の保存性向
上のために通常使用される成分、例えば、緩衝剤、キレ
ート剤、塩類、界面活性剤等を含んでいてもよい。試薬
の形態は溶液状態、凍結状態、乾燥状態のいずれであっ
てもよいが、溶液状態でＤ−システインと反応可能な形
態であることが好ましい。
【００１５】また、本発明の測定用試薬は、Ｄ−ルシフ
ェリン前駆体および生物発光試薬からなるものであって
もよい。この場合、Ｄ−ルシフェリン前駆体および生物
発光試薬とは、分けて保存されていてもよく、また混合
状態であってもよい。本発明の測定用試薬を用いること
により、上記したＤ−システインの測定法を好適に実施
することができる。Ｄ−システインの測定用試薬が2-シ
アノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾール溶液であり、かつ
生成したＤ−ルシフェリンを測定する方法が、ホタルル
シフェラーゼ、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンを含む
生物発光試薬を用いる方法である場合、本発明の測定法
は、以下のように実施することができる。まず、第1工
程として、Ｄ−システインを含むと思われる試料に、Ｄ
−システインの測定用試薬を添加する。Ｄ−システイン
と2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾールと反応し、
Ｄ−ルシフェリンが生成する。次いで、第2工程とし
て、試料に生物発光試薬を添加し、生じた発光量をルミ
ノメーターにより測定する。予め作成した検量線によ
り、発光量から試料中のＤ−システイン量を算出する。
ェリン前駆体および生物発光試薬からなるものであって
もよい。この場合、Ｄ−ルシフェリン前駆体および生物
発光試薬とは、分けて保存されていてもよく、また混合
状態であってもよい。本発明の測定用試薬を用いること
により、上記したＤ−システインの測定法を好適に実施
することができる。Ｄ−システインの測定用試薬が2-シ
アノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾール溶液であり、かつ
生成したＤ−ルシフェリンを測定する方法が、ホタルル
シフェラーゼ、ＡＴＰおよびマグネシウムイオンを含む
生物発光試薬を用いる方法である場合、本発明の測定法
は、以下のように実施することができる。まず、第1工
程として、Ｄ−システインを含むと思われる試料に、Ｄ
−システインの測定用試薬を添加する。Ｄ−システイン
と2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾールと反応し、
Ｄ−ルシフェリンが生成する。次いで、第2工程とし
て、試料に生物発光試薬を添加し、生じた発光量をルミ
ノメーターにより測定する。予め作成した検量線によ
り、発光量から試料中のＤ−システイン量を算出する。
【００１６】
【実施例】以下実施例によりさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。実施例で
は、試料として濃度既知のＤ−システイン溶液、Ｄ−シ
ステイン量の測定用試薬として2-シアノ-6-ヒドロキシ
ベンゾチアゾール溶液を使用した。また、生成したＤ−
ルシフェリンの測定法として、ホタルルシフェラーゼ、
ＡＴＰおよびマグネシウムイオンを含む生物発光試薬を
用いる方法を採用した。
本発明はこれらに限定されるものではない。実施例で
は、試料として濃度既知のＤ−システイン溶液、Ｄ−シ
ステイン量の測定用試薬として2-シアノ-6-ヒドロキシ
ベンゾチアゾール溶液を使用した。また、生成したＤ−
ルシフェリンの測定法として、ホタルルシフェラーゼ、
ＡＴＰおよびマグネシウムイオンを含む生物発光試薬を
用いる方法を採用した。
【００１７】[2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾール
の合成]2-シアノ-6-メトキシベンゾチアゾール（シグマ
社製）0.48 gと塩化ピリジニウム（和光純薬工業社製）
1.0 gを混合したものを、窒素ガスを封入した金属製チ
ューブ内に入れ、密閉した。このチューブを200 ℃で45
分間加熱した。その後、炭酸水素ナトリウム（和光純薬
工業社製）の飽和水溶液を加え、ＰＨを７に合わせ、析
出した沈澱を濾紙で分離した。得られた沈澱は水で洗っ
た後、減圧乾固させた。このようにして得られた粉末
を、1 mlのジクロロメタンに溶解後、シリカゲルカラム
に添加し、ジクロロメタンでクロマトを行った。2-シア
ノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾールの画分は分取した
後、エバポレータで濃縮乾固させた。これにより、約0.
4gの2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾールを取得し
た。
の合成]2-シアノ-6-メトキシベンゾチアゾール（シグマ
社製）0.48 gと塩化ピリジニウム（和光純薬工業社製）
1.0 gを混合したものを、窒素ガスを封入した金属製チ
ューブ内に入れ、密閉した。このチューブを200 ℃で45
分間加熱した。その後、炭酸水素ナトリウム（和光純薬
工業社製）の飽和水溶液を加え、ＰＨを７に合わせ、析
出した沈澱を濾紙で分離した。得られた沈澱は水で洗っ
た後、減圧乾固させた。このようにして得られた粉末
を、1 mlのジクロロメタンに溶解後、シリカゲルカラム
に添加し、ジクロロメタンでクロマトを行った。2-シア
ノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾールの画分は分取した
後、エバポレータで濃縮乾固させた。これにより、約0.
4gの2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾールを取得し
た。
【００１８】[試薬の調製]Ｄ−システイン量を測定する
ため、以下の試薬を調製した。 （１）Ｄ−システイン量の測定用試薬（2-シアノ-6-ヒ
ドロキシベンゾチアゾール溶液） 2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾール1 mgを1 mlの
エタノールに溶解させた。 （２）0.2 M炭酸カリウム溶液 （３）活性測定用緩衝液 50 mM HEPES 緩衝液（pH 7.8） 0.3 M MgSO4 （４）ルシフェラーゼ、ATP溶液 50 mM HEPES 緩衝液（pH 7.8） 40 mM ATP 10 mg/ml ゲンジボタルルシフェラーゼ （５）試料（Ｄ−システイン溶液） Ｄ−システイン（和光純薬社製）を純水に溶解させ、各
種濃度（５０μＭ、１００μＭ、1ｍＭ、１０ｍＭ）の
Ｄ−システイン溶液を調製した。
ため、以下の試薬を調製した。 （１）Ｄ−システイン量の測定用試薬（2-シアノ-6-ヒ
ドロキシベンゾチアゾール溶液） 2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾール1 mgを1 mlの
エタノールに溶解させた。 （２）0.2 M炭酸カリウム溶液 （３）活性測定用緩衝液 50 mM HEPES 緩衝液（pH 7.8） 0.3 M MgSO4 （４）ルシフェラーゼ、ATP溶液 50 mM HEPES 緩衝液（pH 7.8） 40 mM ATP 10 mg/ml ゲンジボタルルシフェラーゼ （５）試料（Ｄ−システイン溶液） Ｄ−システイン（和光純薬社製）を純水に溶解させ、各
種濃度（５０μＭ、１００μＭ、1ｍＭ、１０ｍＭ）の
Ｄ−システイン溶液を調製した。
【００１９】[Ｄ−システイン量の測定]１０マイクロリ
ットルの2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾール溶液
に、８０μｌの0.2 M炭酸カリウム溶液と１０μｌのＤ
−システイン溶液を加え、３０℃で１０分間反応させ
た。本反応液１０μｌに活性測定用緩衝液９０μｌを加
え、さらにルシフェラーゼ、ATP緩衝液１００μｌを添
加し、ルミネッセンスリーダー（アロカ社製）で発光量
を２０秒間測定した。なお、反応液は必要に応じ活性測
定用緩衝液で希釈したうえで、同様の測定を行った。結
果を図１に示した。図１の横軸は試料中のＤ−システイ
ン濃度を、縦軸はルミネッセンスリーダーで測定された
発光量を示す。図１より、Ｄ−システイン濃度と発光量
とは直線性を有することが明らかである。本発明の測定
法および測定用試薬により、精度良くＤ−システイン量
を求めることができることが確認された。
ットルの2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾール溶液
に、８０μｌの0.2 M炭酸カリウム溶液と１０μｌのＤ
−システイン溶液を加え、３０℃で１０分間反応させ
た。本反応液１０μｌに活性測定用緩衝液９０μｌを加
え、さらにルシフェラーゼ、ATP緩衝液１００μｌを添
加し、ルミネッセンスリーダー（アロカ社製）で発光量
を２０秒間測定した。なお、反応液は必要に応じ活性測
定用緩衝液で希釈したうえで、同様の測定を行った。結
果を図１に示した。図１の横軸は試料中のＤ−システイ
ン濃度を、縦軸はルミネッセンスリーダーで測定された
発光量を示す。図１より、Ｄ−システイン濃度と発光量
とは直線性を有することが明らかである。本発明の測定
法および測定用試薬により、精度良くＤ−システイン量
を求めることができることが確認された。
【００２０】
【発明の効果】本発明により、簡便かつ高感度なＤ−シ
ステインの測定法およびＤ−システインの測定用試薬が
提供された。本発明は、試料中に遊離の形で存在するＤ
−システインのみならず、Ｄ−システイン誘導体の測定
法、例えば生体由来のタンパク質中のＤ−システイン残
基の測定法として利用可能である。
ステインの測定法およびＤ−システインの測定用試薬が
提供された。本発明は、試料中に遊離の形で存在するＤ
−システインのみならず、Ｄ−システイン誘導体の測定
法、例えば生体由来のタンパク質中のＤ−システイン残
基の測定法として利用可能である。
【００２１】本発明はバイオテクノロジー、臨床検査、
医学等の分野において非常に有用である。
医学等の分野において非常に有用である。
【図１】実施例における、試料中のＤ−システイン濃度
と発光量との関係を示す図
と発光量との関係を示す図
Claims (6)
- 【請求項１】以下の工程を含むことを特徴とする、試料
中のＤ−システインの測定法。 （１）Ｄ−システインをＤ−ルシフェリン前駆体と反応
させて、Ｄ−ルシフェリンまたはＤ−ルシフェリン誘導
体を生成させる第１工程。 （２）生成したＤ−ルシフェリンまたはその誘導体の量
を測定することにより、Ｄ−システイン量を測定する第
２工程。 - 【請求項２】Ｄ−ルシフェリン前駆体が、2-シアノ-6-
ヒドロキシベンゾチアゾールまたは2-シアノ-6-Ｏ-β-
Ｄ−ガラクトシルベンゾチアゾールである、請求項１記
載のＤ−システインの測定法。 - 【請求項３】生成したＤ−ルシフェリンまたはその誘導
体の量を測定する方法が、Ｄ−ルシフェリンまたはその
誘導体と、生物発光試薬とを反応させて生じた発光量を
測定する方法である、請求項１または２記載のＤ−シス
テインの測定法。 - 【請求項４】以下の工程を含むことを特徴とするＤ−シ
ステインの測定法。 （１）Ｄ−システインを2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾ
チアゾールと反応させて、Ｄ−ルシフェリンを生成させ
る第１工程。 （２）生成したＤ−ルシフェリンを、ルシフェラーゼ、
ＡＴＰおよびマグネシウムイオンと反応させて生じた発
光量を測定することにより、Ｄ−システイン量を算出す
る第２工程。 - 【請求項５】Ｄ−ルシフェリン前駆体を含むことを特徴
とする、Ｄ−システインの測定用試薬。 - 【請求項６】Ｄ−ルシフェリン前駆体および生物発光試
薬からなるＤ−システインの測定用試薬。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07969199A JP3618572B2 (ja) | 1999-03-24 | 1999-03-24 | Ｄ−システインの測定法 |
| US09/534,283 US6376208B1 (en) | 1999-03-24 | 2000-03-24 | Method and reagent for quantitating D-cysteine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07969199A JP3618572B2 (ja) | 1999-03-24 | 1999-03-24 | Ｄ−システインの測定法 |
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|---|---|
| JP2000275247A true JP2000275247A (ja) | 2000-10-06 |
| JP3618572B2 JP3618572B2 (ja) | 2005-02-09 |
Family
ID=13697238
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07969199A Expired - Fee Related JP3618572B2 (ja) | 1999-03-24 | 1999-03-24 | Ｄ−システインの測定法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
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| JP (1) | JP3618572B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009082095A (ja) * | 2007-10-02 | 2009-04-23 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | ホタルルシフェリンを用いないルシフェラーゼの光活性測定方法 |
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| WO2010030343A1 (en) * | 2008-09-09 | 2010-03-18 | Promega Corporation | Bioluminescent assays using cyanobenzothiazole compounds |
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| US9173966B2 (en) * | 2012-01-17 | 2015-11-03 | The Regents Of The University Of California | Luciferin derivatives from bicyclic reactants and aminothiol derivatives and methods of use thereof |
| CN102633742A (zh) * | 2012-03-22 | 2012-08-15 | 盛世泰科生物医药技术(苏州)有限公司 | 一种2-(6-羟基苯并[d]噻唑-2-基)噻唑-4-羧酸钠的合成方法 |
| JP6703484B2 (ja) | 2014-01-29 | 2020-06-03 | プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 細胞による取り込み測定のための、標識用試薬としての、キノンでマスクされたプローブ |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3700908A1 (de) * | 1987-01-14 | 1988-07-28 | Geiger Reinhard | Aminoluciferine, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung bei der bestimmung von enzymaktivitaeten |
-
1999
- 1999-03-24 JP JP07969199A patent/JP3618572B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-24 US US09/534,283 patent/US6376208B1/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009082095A (ja) * | 2007-10-02 | 2009-04-23 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | ホタルルシフェリンを用いないルシフェラーゼの光活性測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3618572B2 (ja) | 2005-02-09 |
| US6376208B1 (en) | 2002-04-23 |
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