JP4465452B2 - エンドトキシンの濃度測定方法およびエンドトキシンの濃度測定キット - Google Patents
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Description
エンドトキシンを含む試料に一定量の可逆的酸化還元物質を含む溶液を添加するか、あるいは一定量の可逆的酸化還元物質を含む溶液に当該試料を添加すると、試料中のエンドトキシンの量に応じて、可逆的酸化還元物質が該エンドトキシンと錯体形成を起こす。このエンドトキシンと錯体形成を起こした可逆的酸化還元物質と錯体未形成の可逆的酸化還元物質とは、電気化学的特性が異なり識別可能である。したがって、錯体未形成の可逆的酸化還元物質の量を測定すれば、錯体形成した可逆的酸化還元物質の量に対応する試料中のエンドトキシンの量を知ることが可能となる。
(a) フェロセンボロン酸(還元型)→フェロセンボロン酸(酸化型)+e
また、ここに酵素基質であるβ-ニコチンアミドジヌクレオチド還元型(NADH)を添加すると、以下の酵素反応が生ずる。
(b)フェロセンボロン酸(酸化型)+NADH→
フェロセンボロン酸(還元型)+β-ニコチンアミドジヌクレオチド酸化型(NAD+)
したがって、この酵素反応によりフェロセンボロン酸(還元型)が再生し、さらに電極反応、酵素反応のサイクルを繰り返す。このサイクリックな反応によりNADH添加前に比べて、添加によって10〜1000倍程度の電流の増加が観測される。この反応サイクルにおいて、フェロセンボロン酸は、酸化型と還元型とを繰り返すが、酸化型および還元型の合計量は変わらずフェロセンボロン酸は、メディエータとしても機能する。また、上記反応式中の「e」の量、つまり電極における電流は、添加するNADHの量を過剰にすれば、この反応に関与するフェロセンボロン酸の量に依存する。
ジアフォラーゼ4.0%(w/v)水溶液(pH8.5に調整)5μL、牛血清アルブミン4.0%(w/v)水溶液(pH7に調整)10μL、グルタルアルデヒド1.0%(w/v)水溶液(pH7調整)4.OμLをよく混合し、この混合液を直径1.6mmの金電極上に5μL滴下し、室温で2時間以上放置、乾操させることで、ジアフォラーゼ固定化電極を作製した。
<試験例2> 西洋ワサビペルオキシダーゼ固定化酵素電極によるエンドトキシンの測定
西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horseradish peroxidase; HRP)4.0%(w/v)水溶液(pH7.0に調整)5μL、牛血清アルブミン4.0%(w/v)水溶液(pH7.0に調整)10μL、グルタルアルデヒド1.0%(w/v)水溶液(pH7.0に調整)4.0μLをよく混合し、この混合液を直径1.0mmのグラッシーカーボン電極上に5μL滴下し、室温で2時間以上放置、乾操させることで、酵素電極としてHRP固定化電極を作製した。
<比較例> ジアフォラーゼ固定化酵素電極による単糖類の測定
実際の測定系で単糖類が含まれている血液中や培養液中では、これら単糖においてもフェロセンボロン酸と錯体形成を容易に起こし、エンドトキシン測定の妨害物となることが予想される。
Claims (12)
- 試料中に含まれるエンドトキシンの濃度測定方法であって、エンドトキシンと錯体形成をする反応性官能基を有する可逆的酸化還元物質を試料に添加し、試料中のエンドトキシンと錯体形成させ、作用電極上で錯体未形成の可逆的酸化還元物質の濃度変化を選択的に増幅して、このときの電流変化を電気化学的に測定することを特徴とするエンドトキシンの濃度測定方法。
- 前記作用電極を、電極上に酸化還元酵素を固定化してなる酵素電極とし、この酵素電極において、可逆的酸化還元物質を酸化還元酵素により酸化あるいは還元する反応と、電極反応により可逆的酸化還元物質を還元あるいは酸化して再生する反応とからなる反応サイクルを形成させて錯体形成に伴う電流信号の変化を増幅し、かつ、錯体形成した可逆的酸化還元物質の透過を電極上に設けた酵素膜によって抑制させ、このときの電流変化を電気化学的に測定することを特徴とする請求項1に記載のエンドトキシンの濃度測定方法。
- 可逆的酸化還元物質は、ボロン酸基を有する化合物である請求項1または2に記載のエンドトキシンの濃度測定方法。
- ボロン酸基を有する化合物は、フェロセンボロン酸である請求項3に記載のエンドトキシンの濃度測定方法。
- 前記酸化還元酵素に対する基質をさらに加える請求項2から4いずれかに記載の測定方法。
- 電極に固定化する酸化還元酵素は、ジアフォラーゼ、コリン酸化酵素、乳酸酸化酵素、グルタミン酸酸化酵素および西洋ワサビペルオキシダーゼの少なくともいずれかである請求項2から5いずれかに記載のエンドトキシンの濃度測定方法。
- 基質は、ジアフォラーゼ、コリン酸化酵素、乳酸酸化酵素、グルタミン酸酸化酵素および西洋ワサビペルオキシダーゼの少なくともいずれかの酵素に対するものである請求項6に記載のエンドトキシンの濃度測定方法。
- 測定対象のエンドトキシンは、内毒素、リポ多糖、発熱物質およびパイロジェンの少なくともいずれかである請求項1から7いずれかに記載のエンドトキシンの濃度測定方法。
- 試料中のエンドトキシンの濃度を測定するための測定キットであって、少なくとも酸化還元酵素を固定化した電極を備えている電気化学セルと、エンドトキシンと錯体形成をする反応性官能基を有する可逆的酸化還元物質とを具有することを特徴とするエンドトキシンの濃度測定キット。
- 酸化還元酵素に対する基質をさらに具有する請求項9に記載のエンドトキシンの濃度測定キット。
- 酸化還元酵素は、ジアフォラーゼ、コリン酸化酵素、乳酸酸化酵素、グルタミン酸酸化酵素および西洋ワサビペルオキシダーゼの少なくともいずれかである請求項9または10に記載のエンドトキシンの濃度測定キット。
- 基質は、ジアフォラーゼ、コリン酸化酵素、乳酸酸化酵素、グルタミン酸酸化酵素および西洋ワサビペルオキシダーゼの少なくともいずれかの酵素に対するものである請求項11に記載のエンドトキシンの濃度測定キット。
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