CN102866187A - 一种检测内毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测内毒素的方法,包括:在鲎试剂中加入具有氧化还原活性的物质,再向鲎试剂中加入可能含有内毒素的待测样品,并对鲎试剂施加与所述具有氧化还原活性的物质相应的氧化还原电位,同时实时监测通过鲎试剂的电流大小,进而获知待测样品中内毒素的浓度;其中,加入所述鲎试剂中的内毒素浓度与通过鲎试剂的电流的骤降时间点之间存在对数线性关系。本发明通过电化学过程直接反应出鲎试剂凝固过程中粘度的改变,不受样品颜色的干扰,能快速、精确的实现对内毒素的检测,适于在药品质量控制、医疗器械热原监测等领域广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种内毒素的检测方法,特别涉及一种内毒素的电化学检测方法。
背景技术
所有能引起热原反应的物质称为热原,药品中的热原主要是细菌内毒素。半个多世纪以来,热原检查法对保证注射用药品安全发挥了重要作用。但随着制药工业的发展,该方法已不完全适合许多品种的热原检查。为此,人们研究了一种替代热原检查法的方法,这就是我们今天正在研究和扩大应用的细菌内毒素检查法。细菌内毒素检查是输注药品及器械质量控制中的一项重要指标。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分之一,革兰氏阴性菌破裂后,释放出内毒素,环境中内毒素无处不在,具有广泛的生物活性,以致热居首。防止输注用药及器械的热原污染,是十分重要的。
目前检测内毒素的主要试剂是鲎试剂,基于鲎试剂的检测方法包括:凝胶法、显色法和浊度法。内毒素与鲎试剂接触后,能引发一系列的级联反应,最终激活鲎试剂中的凝固酶原,从而导致鲎试剂的凝固。凝胶法用于定性测试,显色法和浊度法可以用于内毒素的定量测定。显色法和浊度法实验过程中都需要分光光度计,用时1-2小时,检测容易受到样品中显色物质的干扰,而且鲎试剂的凝固过程对光学测量有一定干扰,因此难以实现对内毒素的精确检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测内毒素的新方法,其能实现对内毒素的快速、精确检测,从而克服了现有技术中的不足。
为实现上述发明目的,本发明采用的一种检测内毒素的方法包括:
在鲎试剂中加入具有氧化还原活性的物质,再向鲎试剂中加入可能含有内毒素的待测样品,并对鲎试剂施加与所述具有氧化还原活性的物质相应的氧化还原电位,同时实时监测通过鲎试剂的电流大小,进而获知待测样品中内毒素的浓度;
其中,加入所述鲎试剂中的内毒素浓度与通过鲎试剂的电流的骤降时间点之间存在如下对数线性关系:logT=klogC+h,其中T为电流骤降时间,C为内毒素的浓度,k为直线斜率,h为Y轴截距,更确切的讲,k和h为与鲎试剂种类和浓度相关的常数。
作为较佳的实施方案之一,加入所述鲎试剂中的具有氧化还原活性的物质的浓度为0.1~100 mM,尤其优选为1-50 mM。
作为较佳的实施方案之一,所述氧化还原电位的大小为-1.0V~+1.0V。
作为可实施的方案之一,所述具有氧化还原活性的物质可选自铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌或其配合物(六氨合钌等)、吩恶嗪衍生物(8-二甲基氨-2,3-苯并吩恶嗪、7-二甲基氨-1,2-苯并吩恶嗪等),但不限于此。
作为可实施的方案之一,所述鲎试剂可选自商品化凝胶法、浊度法、显色法鲎试剂,但不限于此。
进一步的,该方法还可包括如下步骤:
在鲎试剂中加入具有氧化还原活性的物质,并将鲎试剂的温度调整至设定值,再向鲎试剂中分别加入一系列具有不同浓度的内毒素标准样品,且保持所述鲎试剂温度不变,并向所述鲎试剂施加与所述具有氧化还原活性的物质相应的氧化还原电位,同时实时监测通过鲎试剂的电流大小,进而绘制内毒素浓度-电流骤降时间点标准曲线,并得出加入所述鲎试剂中的内毒素浓度与通过鲎试剂的电流的骤降时间点之间的对数线性关系。
作为较佳的实施方案之一,该方法是在温度为37.0±1℃的条件下进行的。
与现有技术相比,本发明的优点至少在于:通过电化学过程直接反应出鲎试剂凝固过程中粘度的改变,不受样品颜色的干扰,使用相同的鲎试剂,采用本发明方法完成检测用时比显色法与浊度法减少10-25%,能快速、精确的实现对内毒素的检测,检测灵敏度可达0.01 EU/ml适于在药品质量控制、医疗器械热原监测等领域广泛应用。
附图说明
图1是本发明内毒素检测方法的工作原理示意图,其中,内毒素引发鲎试剂的级联反应,导致鲎试剂聚集形成凝胶,且聚集过程中导致稳态电流急剧降低。
图2a和图2b分别是本发明一典型实施例中的时间-电流曲线图和对应的标准曲线图,在图2a中,从右到左所示曲线分别对应浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 Eu mL-1的内毒素,标准曲线如图2b所示,其中实验中实际测得的时间电流曲线100秒时的电流在图2a中被定义为1。
图3a是以传统浊度法所获时间-吸光度曲线图,图3b所示系以传统浊度法和本发明一典型实施例中内毒素检测方法所获标准曲线对照图,在图3a中从右到左所示曲线分别对应浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 Eu mL-1的内毒素,在图3b中上下两条标准曲线分别对应传统浊度法和本发明的结果。
具体实施方式
如前所述,有鉴于现有技术中的诸多不足,本发明旨在提供一种新型的基于电化学的检测鲎试剂凝固过程的方法用于内毒素的测定。
概括的讲,本发明是通过电化学过程直接反应出鲎试剂凝固过程中粘度的改变,进而实现对样品中所含内毒素的检测,且检测结果不会受到样品颜色的干扰,检测精确度好、时间短。
更为具体的讲,参阅图1,本发明通过在鲎试剂中加入具有氧化还原活性的物质(如铁氰化钾、钌等),对鲎试剂施加氧化还原电位,即可利用电化学工作站或者其他检测设备,检测到电流信号随时间的改变,该电流在不加入内毒素时是一个稳态电流(图1下端左侧曲线所示)。而当内毒素加入后,会引发鲎试剂的凝固反应,使体系的粘度增加,并阻碍氧化还原物质与电极之间的电子传递,这一过程打破了电流的稳态,电流会出现一个急剧的减小过程(图1下端右侧曲线所示)。不同浓度的内毒素加入体系后,引发鲎试剂凝固的快慢是不一样的,对应不同的电流急剧减小时刻,并且,本案发明人还发现,内毒素的浓度与内毒素引起的电流骤降时间点之间存在对数线性关系,因此利用本发明方法可以实现内毒素的快速精确检测。
作为本发明的一个较优实施方案,其所涉及的内毒素的检测方法可以包括如下步骤:
(1)选取市售的任一种商品化凝胶法、浊度法或显色法鲎试剂备用;
(2)选取本领域习用的铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌或其配合物(六氨合钌等)、吩恶嗪衍生物(8-二甲基氨-2,3-苯并吩恶嗪、7-二甲基氨-1,2-苯并吩恶嗪等)中的任意一种作为具有氧化还原活性的物质备用;
(3)将所述具有氧化还原活性的物质加入前述鲎试剂中,优选使得其中具有氧化还原活性的物质的浓度达到0.1-100mM,并且,进一步优选的,还可将形成的混合物预热至设定温度37.0±1℃;
(4)再向前述鲎试剂中加入内毒素标准品或者待测样品,并插入电极,向鲎试剂施加与前述具有氧化还原活性的物质对应的氧化还原电位(一般为-1.0V~+1.0V),并实时监测通过该混合体系的电流,电流将在一定时间后(大约30s)进入稳态,即以较稳定的速度缓慢下降,当鲎试剂在内毒素引发下而发生凝固时,稳态打破,电流急剧减小。
为确切探知加入鲎试剂中的内毒素浓度与通过鲎试剂的电流的骤降时间点之间的关系,以下仅结合一典型实施例及相应附图作更为详细的说明:
本实施例中内毒素的检测方法包括:
取30μL 50 mM Fe(CN)6 3-、150μL LAL试剂、120μL含有不同浓度内毒素的样品均匀混合,并将形成的混合体系的温度调整至37.0±1℃,再以碳电极作为工作电极、Ag/AgCl电极作为参比电极、铂电极作为对电极插入该混合体系中,构建三电极电化学体系,其后,以CHI 660D电化学工作站(产自CH设备公司,中国上海)配合前述电化学体系进行试验,其中,测试电压恒定为-0.3V。
前述样品可采用浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 Eu mL-1的一系列内毒素标准样品。藉由这些标准样品,可以获得如图2a所示时间-电流曲线图谱,而根据该图谱,还绘制了如图2b所示标准曲线。参照该图2b,显然可以看到,加入所述鲎试剂中的内毒素浓度与通过鲎试剂的电流的骤降时间点之间存在对数线性关系,线性回归方程为:y=2.935-0.3600x,R2=0.9942,其中y是凝固开始时间的对数值,x是内毒素浓度的对数值。
又及,本案发明人还采用与本实施例相同的鲎试剂,利用传统浊度法对浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 Eu mL-1的一系列内毒素标准样品进行了检测,并获得如图3a所示时间-吸光度曲线图谱,并藉由该时间-吸光度曲线图谱绘制了相应的标准曲线(参阅图3b中所示位于上方的曲线),并将之与本实施例所获的前述标准曲线(参阅图3b中所示位于下方的曲线)进行了对比,显然,可以看到,藉由本实施例的内毒素检测方法,可以更为精确快捷的实现对内毒素的检测,且完成同样灵敏度的内毒素测试,本发明方法耗时较之传统方法减少10-25%。
进一步,显然,若要对待测样品中的内毒素浓度进行检测,则只需按照本实施例所示的方法进行操作,并根据最终所获通过鲎试剂的电流的骤降时间点等数据及前述图2b所示标准曲线,即可获知待测样品中的内毒素浓度。
例如,本案发明人曾以含有10%牛血清蛋白的细胞培养介质进行了试验,在应用所述细胞培养介质培养细胞2天之后,向该细胞培养介质中分别加入不同数量的内毒素,并分别以本发明前述实施例的方法(以下简称“本发明方法”)及传统浊度法进行了测试,其结果参见下表1:
表1 以本发明方法和传统浊度法对细胞培养介质中的内毒素进行的测试结果
样品 | 内毒素浓度(Eu mL-1) | 传统浊度法(Eu mL-1) | 本发明方法(Eu mL-1) | 相对误差(%) |
1 | 0 | 0.3516 | 0.3624 | 3.07 |
2 | 0.5 | 0.8972 | 0.8831 | 1.57 |
3 | 1.0 | 1.3594 | 1.3431 | 1.20 |
4 | 5.0 | 5.2951 | 5.3516 | 1.07 |
需要指出的是,以上所揭示的仅为本发明较佳实施例的一种,凡是局部的变更或修饰而源于本发明的技术思想而为熟习该项技术的人所易于推知的,俱不脱离本发明的专利权范围。
Claims (9)
1.一种检测内毒素的方法,其特征在于,它包括:
在鲎试剂中加入具有氧化还原活性的物质,再向鲎试剂中加入可能含有内毒素的待测样品,并对鲎试剂施加与所述具有氧化还原活性的物质相应的氧化还原电位,同时实时监测通过鲎试剂的电流大小,进而获知待测样品中内毒素的浓度;
其中,加入所述鲎试剂中的内毒素浓度与通过鲎试剂的电流的骤降时间点之间存在如下对数线性关系:logT=klogC+h,其中T为电流骤降时间,C为内毒素的浓度,k和h为与鲎试剂种类和浓度相关的常数。
2.根据权利要求1所述的检测内毒素的方法,其特征在于,加入所述鲎试剂中的具有氧化还原活性的物质的浓度为0.1~100 mM。
3.根据权利要求1或2所述的检测内毒素的方法,其特征在于,加入所述鲎试剂中的具有氧化还原活性的物质的浓度为1-50 mM。
4.根据权利要求1所述的检测内毒素的方法,其特征在于,所述氧化还原电位的大小为-1.0V~+1.0V。
5.根据权利要求1中任一项所述的检测内毒素的方法,其特征在于,所述具有氧化还原活性的物质至少选自铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌或其配合物和吩恶嗪衍生物中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的检测内毒素的方法,其特征在于,所述钌的配合物包括六氨合钌,所述吩恶嗪衍生物包括8-二甲基氨-2,3-苯并吩恶嗪和/或7-二甲基氨-1,2-苯并吩恶嗪。
7.根据权利要求1所述的检测内毒素的方法,其特征在于,所述鲎试剂至少选自商品化凝胶法、浊度法、显色法鲎试剂中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的检测内毒素的方法,其特征在于,该方法还包括如下步骤:
在鲎试剂中加入具有氧化还原活性的物质,并将鲎试剂的温度调整至设定值,再向鲎试剂中分别加入一系列具有不同浓度的内毒素标准样品,且保持所述鲎试剂温度不变,并向所述鲎试剂施加与所述具有氧化还原活性的物质相应的氧化还原电位,同时实时监测通过鲎试剂的电流大小,进而绘制内毒素浓度-电流骤降时间点标准曲线,并得出加入所述鲎试剂中的内毒素浓度与通过鲎试剂的电流的骤降时间点之间的对数线性关系。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的检测内毒素的方法,其特征在于,该方法是在温度为37.0±1℃的条件下进行的。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103675051A (zh) * | 2013-12-20 | 2014-03-26 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种检测液体中内毒素含量的方法 |
CN103901083A (zh) * | 2014-01-10 | 2014-07-02 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种电化学法检测内毒素的微流控芯片 |
CN109557085A (zh) * | 2017-09-26 | 2019-04-02 | 江西省药品检验检测研究院 | 一次性使用输注器类的生物安全性评价方法研究 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN2238437Y (zh) * | 1995-07-19 | 1996-10-23 | 中国科学院半导体研究所 | 一种细菌内毒素测定仪 |
US20050079566A1 (en) * | 2003-09-10 | 2005-04-14 | Caterer Nigel Robert | Analytical methods for determination of proteolytic cleavage at specific sites |
JP4465452B2 (ja) * | 2005-09-28 | 2010-05-19 | 独立行政法人科学技術振興機構 | エンドトキシンの濃度測定方法およびエンドトキシンの濃度測定キット |
-
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN2238437Y (zh) * | 1995-07-19 | 1996-10-23 | 中国科学院半导体研究所 | 一种细菌内毒素测定仪 |
US20050079566A1 (en) * | 2003-09-10 | 2005-04-14 | Caterer Nigel Robert | Analytical methods for determination of proteolytic cleavage at specific sites |
JP4465452B2 (ja) * | 2005-09-28 | 2010-05-19 | 独立行政法人科学技術振興機構 | エンドトキシンの濃度測定方法およびエンドトキシンの濃度測定キット |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103675051A (zh) * | 2013-12-20 | 2014-03-26 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种检测液体中内毒素含量的方法 |
CN103675051B (zh) * | 2013-12-20 | 2015-12-30 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种检测液体中内毒素含量的方法 |
CN103901083A (zh) * | 2014-01-10 | 2014-07-02 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种电化学法检测内毒素的微流控芯片 |
CN103901083B (zh) * | 2014-01-10 | 2016-04-20 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种电化学法检测内毒素的微流控芯片 |
CN109557085A (zh) * | 2017-09-26 | 2019-04-02 | 江西省药品检验检测研究院 | 一次性使用输注器类的生物安全性评价方法研究 |
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