JP2022135780A - 被験物質の検出方法、検出試薬組成物、検出装置、精製水製造設備、注射用水製造設備、精製水製造方法及び注射用水製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】被験物質を高感度に検出可能な検出方法、これを用いた精製水製造方法及び注射用水製造方法、並びに、検出試薬組成物、これを用いた検出装置、精製水製造設備及び注射用水製造設備が提供されること。【解決手段】被験物質及び水を含む検体、応答部位と認識部位とがスペーサを介して連結された構造を有する化合物並びに界面活性剤を添加する工程Ａと、前記認識部位と前記被験物質とが相互作用し前記相互作用によって生じる前記応答部位における応答を検出する工程Ｂとを含む被験物質の検出方法これを用いた精製水製造方法及び注射用水製造方法、並びに、式（１）で表される化合物と界面活性剤とを含む検出試薬組成物、これを用いた検出装置、精製水製造設備及び注射用水製造設備。【選択図】なし

Description

本開示は、被験物質の検出方法、検出試薬組成物、検出装置、精製水製造設備、注射用水製造設備、精製水製造方法及び注射用水製造方法に関する。

食品、水、土壌、血液等に含まれる微量成分を検出する方法は多く知られており、検出対象に適した検出方法が従来から検討されている。
微量成分としては、例えば、発熱性物質（エンドトキシン）等が知られており、注射用水（ＷＦＩ、Ｗａｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）の製造においては、精製水を滅菌した滅菌精製水に対して、所定のエンドトキシン試験が行われている。
なお、精製水とは、常水を蒸留、イオン交換樹脂塔又は電気式脱塩装置（ＥＤＩ）等によるイオン交換、逆浸透若しくは限外ろ過、紫外線照射装置（ＵＶ）又はそれらの組み合わせにより精製したもので、製剤の原料のみでなく、試薬の調製などにも使用されている。
ＷＦＩ製造設備として、例えば、特許文献１には、原水を逆浸透膜処理とイオン交換処理の組み合わせによって処理して得られる処理対象水をろ過する高分子膜ろ過装置と、前記高分子膜ろ過装置の透過水中の微粒子数を測定する微粒子測定装置とを具備することを特徴とする注射用水の製造装置が記載されている。

エンドトキシンとは、グラム陰性菌の細胞壁成分であるリポ多糖であり、生活環境に偏在する代表的な発熱物質である。エンドトキシンが血液中に入ると発熱、敗血症性ショック、多臓器不全、頻脈等などの作用が起こることから、医薬品や医療機器、特に生体内へ直接導入される液体や、製薬用水、注射器、人工臓器、透析膜などの医療機器の製造においては、厳重な管理が必要となる。たとえば、「日本薬局方（ＪＰ１７）品質適合試験」における注射用水の管理基準では、０．２５ＥＵ／ｍＬ未満と定められている。

エンドトキシンの検出方法としては、例えば、特許文献２及び特許文献３に記載の電気化学的な方法によるエンドトキシンの検出が開示されている。

特開２０１９－０２５４５６号公報 特開２０１６－１５１４８２号公報 特開２００７－０９３３７８号公報

検体中の微量成分を検出する方法は多く知られているが、いずれの方法も、多量の試料が必要であったり、妨害物質の存在により測定不能となったりと何らかの問題点を有している場合があり、更なる開発が求められている。

ＷＦＩの製造には、精製水製造設備で製造された精製水から、蒸留器又は高分子膜ろ過装置（好ましくは限外ろ過膜装置）のようなエンドトキシン除去設備によってエンドトキシンを高度に除去することが求められる。
エンドトキシン除去設備において、エンドトキシン除去能力に異常が発生すると、容易にＷＦＩ中のエンドトキシン濃度が増大し、注射液の製造には不適となる。特に近年は、エネルギー消費量の削減のため、このような設備として従来の蒸留器に代えて高分子膜ろ過装置を採用する傾向が強まっている。しかし、高分子膜ろ過装置では高分子膜として樹脂材料が使われているため、たとえば、加熱殺菌を行うたびに樹脂材料が劣化する懸念がある。この懸念が、エンドトキシン除去設備に高分子膜ろ過装置を採用することを妨げる要因となっている。
したがって、安定的に要求水質のＷＦＩを製造するためには、例えば、エンドトキシン除去能力の変化を監視し、エンドトキシン除去設備において異常が発生する前に、高分子膜などの部品を直ちに交換又は修理するなどのメンテナンスを行う必要がある。しかし、エンドトキシン除去能力の変化を迅速に検出できる方法は、まだ実現できていない。

エンドトキシンの検出は、カブトガニの血球成分がエンドトキシンにより凝固することを利用したリムルス試験で行われている。リムルス試験では、カブトガニの血液から抽出されたライセート試薬を用いて行うのが現在では標準であるが、試験結果が出るのに１～２時間を要する。さらに、リムルス試験を用いたオンライン測定装置も考案されているが、実用的な定量下限を得ることが難しく、定量性や再現性が乏しい。たとえば、試薬自体が生物由来であるため、その性能は試薬のロットによっても異なる場合がある。このことから、より迅速に試験結果を得られ、かつオンライン測定を実用的な精度で行うことができる検出方法が望まれていた。
また、ライセート試薬を得るためにはカブトガニという野生生物を捕獲して採血を行う必要があるため、動物愛護の観点からも、カブトガニの血液を使用しない代替手段の開発が望まれていた。
また、電気化学的な方法によるエンドトキシンの検出は、特に実用的な定量下限を得るためには、検出に用いる電極の作製技術若しくは量産性、要求されるメンテナンス頻度、又は測定の精度、定量下限、迅速性などの課題が多く、実用化には至っていない。

本開示の実施形態が解決しようとする課題は、被験物質を高感度に検出可能な被験物質の検出方法及びこれを用いた精製水製造方法及び注射用水製造方法を提供することである。また、本開示の他の実施形態が解決しようとする課題は、被験物質を高感度に検出可能な検出試薬、これを用いた検出装置、精製水製造設備及び注射用水製造設備を提供することである。

上記課題を解決するための手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞ 被験物質及び水を含む検体、応答部位と認識部位とを有する構造を有する化合物並びに界面活性剤を混合する工程Ａと、
前記認識部位と前記被験物質とが相互作用し、前記相互作用によって生じた前記応答部位における応答を検出する工程Ｂと、を含む
被験物質の検出方法。
＜２＞ 前記化合物が、前記応答部位と認識部位とがスペーサを介して連結されている構造を有する、＜１＞記載の被験物質の検出方法。
＜３＞ 前記化合物は、下記式（１）で表される化合物である、＜１＞又は＜２＞に記載の被験物質の検出方法。

式（１）中、Ａは共役多重結合を含む基である応答部位を表し、Ｌは単結合又は鎖長が原子数１～１０のスペーサを表し、Ｙは被験物質と相互作用する基である認識部位を表す。

＜５＞ 前記式（１）におけるＹが、金属配位性基、又は酸基を含む基である、＜３＞又は＜４＞に記載の被験物質の検出方法。
＜６＞ 前記金属配位性基又は酸基を含む基が、下記式（Ｙ１）又は式（Ｙ２）で表される基である、＜５＞に記載の被験物質の検出方法。

前記式（Ｙ１）及び式（Ｙ２）中、波線は前記式（１）中のＬとの連結部位を表し、式（Ｙ２）中、Ｍ^ｎ＋は金属イオンを表し、ｎは自然数を表す。

＜７＞ 前記金属イオンは、銅イオン（Ｃｕ^２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）又はコバルトイオン（Ｃｏ^２＋）である、＜６＞に記載の被験物質の検出方法。
＜８＞ 前記界面活性剤のＨＬＢ値が、６～４０である、＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載の被験物質の検出方法。
＜９＞ 前記界面活性剤が、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤である、＜１＞～＜８＞のいずれか１つに記載の被験物質の検出方法。
＜１０＞ 前記化合物が、前記界面活性剤と分子集合体を形成可能な化合物である、＜１＞～＜９＞のいずれか１つに記載の被験物質の検出方法。
＜１１＞ 前記被験物質が、リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方を含む、＜１＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の被験物質の検出方法。
＜１２＞ 前記被験物質が、エンドトキシンであり、
前記化合物が、下記式（１Ａ）又はＣ４－ＡＰＢで表される化合物である、＜１＞～＜１１＞のいずれか１つに記載の被験物質の検出方法。

前記式（１Ａ）中、ｍは０～６を表し、Ｍ^ｎ＋は金属イオンを表し、ｎは自然数を表す。
＜１３＞ 下記式（１）で表される化合物と、
界面活性剤と、
を含む、検出試薬組成物。

式（１）中、Ａは共役多重結合を含む基である応答部位を表し、Ｌは単結合又は鎖長が原子数１～１０のスペーサを表し、Ｙは有機基である認識部位を表す。

＜１４＞ 前記Ｌは、線状の飽和アルキル鎖である、＜１３＞に記載の検出試薬組成物。
＜１５＞ 前記式（１）におけるＹが、金属配位性基又は酸基を含む基である、＜１３＞又は＜１４＞に記載の検出試薬組成物。
＜１６＞ 前記金属配位性基又は酸基を含む基が、下記式（Ｙ１）又は式（Ｙ２）で表される基である、＜１５＞に記載の検出試薬組成物。

前記式（Ｙ１）及び式（Ｙ２）中、波線は前記式（１）中のＬとの連結部位を表し、式（Ｙ２）中、Ｍ^ｎ＋は金属イオンを表し、ｎは自然数を表す。

＜１７＞ 前記金属イオンは、銅イオン（Ｃｕ^２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）又はコバルトイオン（Ｃｏ^２＋）である、＜１６＞に記載の検出試薬組成物。
＜１８＞ 前記界面活性剤のＨＬＢ値が、６～４０である、＜１３＞～＜１７＞のいずれか１つに記載の検出試薬組成物。
＜１９＞ 前記界面活性剤が、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤である、＜１３＞～＜１８＞のいずれか１つに記載の検出試薬組成物。
＜２０＞ 被験物質及び水を含む検体が導入される試料導入部と、
＜１３＞～＜１９＞のいずれか１つに記載の検出試薬組成物を前記検体に供給する供給部と、
前記検体と前記検出試薬組成物とが反応する反応部と、
前記反応を検出する検出部と、
を備える、検出装置。
＜２１＞ 原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、
前記精製水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、
＜２０＞に記載の検出装置と、
を備える精製水製造設備。
＜２２＞ 原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、
前記精製水をろ過する高分子膜ろ過装置又は前記精製水を蒸留する蒸留器により前記精製水から注射用水を得る注射用水製造部と、
前記注射用水を加熱した状態で維持して貯留する注射用水タンクと、
前記注射用水タンクに備えられている前記注射用水を所定の使用場所へ送出する送出ラインと、
前記注射用水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、
＜２０＞に記載の検出装置と、
を備える注射用水製造設備。
＜２３＞ 前記試料採取部は、前記注射用水製造部より下流側でかつ前記注射用水タンクより上流側において、前記注射用水タンクから直接、又は、前記送出ラインから、前記試料を採取する、＜２２＞に記載の注射用水製造設備。
＜２４＞ 原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得る工程と、
＜１＞～＜１２＞のいずれか１つに記載の検出方法を用いて、前記精製水から採取された被験対象の試料を測定する測定工程と、
を含む、精製水製造方法。
＜２５＞ 前記測定工程は、＜２０＞に記載の検出装置を用いて、前記精製水から採取された被験対象の試料を測定する測定工程を含む、＜２４＞に記載の精製水製造方法。
＜２６＞ 原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得る工程と、
前記精製水の高分子膜ろ過によるろ過により、又は、前記精製水の蒸留により、前記精製水から注射用水を得る工程と、
＜１＞～＜１２＞のいずれか１つに記載の検出方法を用いて、前記注射用水から採取された前記被験対象の試料を測定する測定工程と、
を含む、注射用水製造方法。
＜２７＞ 前記測定工程は、＜２０＞に記載の検出装置を用いて、前記精製水から採取された被験対象の試料を測定する測定工程を含む、＜２５＞に記載の注射用水製造方法。

本開示に係る一実施形態によれば、被験物質を高感度に検出可能な被験物質の検出方法及びこれを用いた精製水製造方法及び注射用水製造方法が提供される。また、本開示に係る他の実施形態によれば、被験物質を高感度に検出可能な検出試薬、これを用いた検出装置、精製水製造設備及び注射用水製造設備が提供される。

図１は本開示に係る被験物質の検出方法に用いる化合物の一例の模式図である。 図２は本開示に係る検出装置の一例の構成を表す模式図である。 図３は本開示に係る精製水製造設備及び注射用水製造設備の一例の概略構成を模式図で示す。 図４はＣｕ^２＋－ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙ/ＤＤＡＢにエンドトキシンを添加したときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。 図５はエンドトキシン濃度に対する波長３７７ｎｍにおける蛍光強度の検量線のグラフである。 図６はＣｕ^２＋－ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙとエンドトキシンを含むサンプルに各濃度の界面活性剤：ＤＤＡＢを添加したときの蛍光強度の変化を示すグラフである。 図７はＺｎ^２＋－ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙ/ＤＤＡＢにエンドトキシンを添加したときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。 図８はＣｕ^２＋－ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙ/ＣＴＡＢにエンドトキシンを添加したときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。 図９はエンドトキシン濃度に対する波長３７７ｎｍにおける蛍光強度の検量線のグラフである。 図１０はＣｕ^２＋－ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙとエンドトキシンを含むサンプルに各濃度の界面活性剤：ＣＴＡＢを添加したときの蛍光強度の変化を示すグラフである。

以下において、本開示に係る内容について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、本開示に係る代表的な実施態様に基づいてなされることがあるが、本開示はそのような実施態様に限定されるものではない。
本開示において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。本開示に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において、２以上の好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。

本開示において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合は、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本開示において、全固形分とは、組成物の全組成から溶剤を除いた成分の総質量をいう。本開示における固形分は、２５℃における固形分である。
本開示において、「工程」との用語には、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。

（被験物質の検出方法）
本開示に係る被験物質の検出方法（以下、単に「本開示に係る検出方法」ともいう場合がある。）は、被験物質及び水を含む検体、応答部位と認識部位とを有する構造を有する化合物並びに界面活性剤を混合する工程Ａと、前記認識部位と前記被験物質とが相互作用し、前記相互作用によって生じる前記応答部位における応答を検出する工程Ｂと、を含む。
本開示者らが鋭意検討したところ、本開示に係る検出方法は上記構成を有することで、高感度に被験物質を検出可能であることを見出した。上記効果が得られる詳細なメカニズムは不明であるが、以下のように推測される。
被験物質及び水を含む検体に応答部位と認識部位とを有する構造を有する化合物（以下、「特定化合物」ともいう場合がある。）及び界面活性剤を添加することで、界面活性剤と特定化合物とが水を含む検体中で分子集合体（例えば、ミセル、ベシクル等）を形成し、分子集合体に被験物質及び特定化合物が取り込まれる、具体的には、例えば、球形や円筒形の分子集合体の表面を形成する界面活性剤の分子層内に特定化合物が取り込まれる、もしくは、分子集合体の内部に内包されることによって、被験物質が高感度に検出されると推定している。分子集合体に被験物質及び特定化合物が取り込まれるため被験物質が濃縮され、更に、上記分子集合体において、特定化合物の認識部位が被験物質と安定に相互作用しやすい位置関係となり得るので、高感度に被験物質を検出することが可能である。
また、本開示に係る検出方法は、上記工程を含むことで、迅速かつ簡易に被験物質を検出することができる。

被験物質と界面活性剤との分子集合体を選択的に形成させることにより、被験物質と被験物質以外の物質との混合状態の検体（試料）から、選択的に被験物質を検出できるので高感度に被験物質を検出することが可能である。本開示に係る検出方法は、被験物質を高感度に検出可能な観点から、水中で分子集合体を形成している被験物質の検出に好適に用いることができる。
以下、本開示に係る検出方法の各工程について説明する。

＜工程Ａ＞
本開示に係る検出方法が含む工程Ａは、被験物質及び水を含む検体、応答部位と認識部位とを有する構造を有する化合物並びに界面活性剤を混合する工程である。

＜＜特定化合物＞＞
工程Ａに用いられる特定化合物は、応答部位と認識部位とを有する構造を有する。
認識部位は、被験物質と相互作用を生じる構造を有していれば特に制限はないが、被験物質を高感度に検出する観点からは、被験物質の所定の部位又は官能基と物理的又は化学的に相互作用する構造を有する部位であることが好ましい。
応答部位は、認識部位と被験物質との相互作用に応答する構造を有していればよく、例えば、認識部位と被験物質との相互作用に応答して発光又は発色する構造が挙げられ、被験物質をより高感度に検出可能な観点から、発光構造を有していることが好ましい。
ここで、「発光」とは、蛍光又は燐光が発生することをいう。なお、大きい光量を得ることで被験物質（好ましくはエンドトキシン）の検出感度をよくする観点からは、蛍光の発生がより好ましい。応答部位は発光構造を有する構造を含むことが好ましく、発光構造としては、共役多重結合を有する構造が好ましく、共役多重結合を有する構造の一部は環状であることが好ましい。なお、共役多重結合の部位には炭素原子以外の原子（複素原子）が含まれる複素化合物でもよい。
応答部位と認識部位とは、直接結合していてもよいし、後述するスペーサを介して結合してもよいが、より高感度に被験物質を検出可能な点から、特定化合物は、応答部位と認識部位とがスペーサを介して連結されている構造を有することが好ましい。

被験物質を高感度に検出可能な観点から、特定化合物としては、下記式（１）で表される化合物であることが好ましい。

式（１）中、Ａは共役多重結合を含む基である応答部位を表し、Ｌは単結合又は鎖長が原子数１～１０のスペーサを表し、Ｙは被験物質と相互作用する基である認識部位を表す。

〔認識部位：Ｙ〕
Ｙは被験物質と相互作用する基である認識部位を表す。
認識部位は、被験物質の所定の部位又は官能基と物理的又は化学的に相互作用する基であることが好ましく、被験物質の特定の部位と特異的に相互作用する基であり、かつ、被験物質を認識部位が認識した場合にその情報（以下、「認識情報」とする。）を応答部位に伝達することができる構造を有する基であることがより好ましい。
ここでいう認識情報とは、たとえば、認識部位の化学構造内部における電子の配位状態の変化を示す。
認識部位は、被験物質の特定部位を認識すると、化学構造内で電子の配位状態が変化する。この電子の配位状態の変化は、認識情報として後述する応答部位に伝達される。認識情報が伝達された応答部位では電子の配位状態が変化することで、応答部位の発光強度又は発色強度を変化（増大又は減衰）させ、これにより認識部位が被験物質（好ましくは被験物質の特定部位）を認識していることが可視化される。
本開示において、認識部位と被験物質とが相互作用した場合、認識部位が被験物質を認識したと推定することができる。
認識部位と被験物質との相互作用の態様としては、例えば、静電力、分子間力、共有結合、水素結合等が挙げられる。

Ｙとしては、金属配位性基、酸基又は塩基基を含む基であることが好ましく、金属配位性基又は酸基であることがより好ましい。

金属配位性基は、少なくとも１種の金属に直接配位する基、又は、金属への配位を促進する基であればよい。上記金属としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属などの金属イオン（カチオン）（Ｌｉ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^２＋、Ａｇ^＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｏ^２＋又は、Ｚｎ^２＋等）が挙げられ、これらの中でも、被験物質を高感度に検出可能な観点から、遷移金属が好ましく、２価の遷移金属がより好ましく、銅イオン（Ｃｕ^２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）又はコバルトイオン（Ｃｏ^２＋）が更に好ましく、Ｃｕ^２＋が特に好ましい。
また、上記金属配位性基としては、窒素原子、硫黄原子、及び酸素原子よりなる群から選ばれる少なくとも１つの原子を含む芳香族複素環基、水酸基、カルボキシ基、クラウンエーテル基等を含む基が挙げられる。

芳香族複素環基としては、窒素原子、硫黄原子、及び酸素原子よりなる群から選ばれる少なくとも１つの原子を含む複素環基が挙げられる。高感度に検出可能な観点から、これらの中でも芳香族複素環基としては、窒素原子及び酸素原子よりなるから選ばれる少なくとも１種の原子を含む複素環基であることが好ましく、窒素原子を含む複素環基であることがより好ましく、環員数５又は６の窒素原子を含む複素環であることが更に好ましく、環員数が５の窒素原子を含む複素環であることが特に好ましい。
窒素原子を含む複素環としては、例えば、ピロール環、ピリジン環、ピラジン環、ピリミジン環等が挙げられる。
また、上記複素環は無置換であってもよいし、置換基を有していてもよいが、被験物質を高感度に検出可能な観点から、置換基を有する複素環であることが好ましい。
置換基としては、アルキル基、アリール基等が挙げられるが、これらの中でも、アルキル基が好ましく、炭素数１～４のアルキル基がより好ましい。

被験物質を高感度に検出可能な観点から、置換基を有する複素環の中でも、アルキル基を有する窒素原子を含む複素環であることが好ましく、炭素数１～４のアルキル基を有し、かつ、環員数５又は６の窒素原子を含む複素環であることがより好ましく、炭素数１～４のアルキル基を有し、かつ、環員数５の窒素原子を含む複素環であることが更に好ましく、炭素数１～４のアルキル基を有するピリジル基であることが特に好ましい。

金属配位性基が芳香族複素環を含む場合、被験物質を高感度に検出可能な観点から、芳香族複素環を含む基としては、複素環基で置換された置換アミノ基であることが好ましく、炭素数１～４のアルキル基を含む複素環（好ましくは、炭素数１～４のアルキル基を有し、かつ、環員数５又は６の窒素原子を含む複素環であり、より好ましくは、炭素数１～４のアルキル基を有し、かつ、環員数５の窒素原子を含む複素環であり、更に好ましくは、炭素数１～４のアルキル基を有するピリジル基である）で置換された置換アミノ基であることがより好ましく、炭素数１～４のアルキル基を含む複素環（好ましくは、炭素数１～４のアルキル基を有し、かつ、環員数５又は６の窒素原子を含む複素環であり、より好ましくは、炭素数１～４のアルキル基を有し、かつ、環員数５の窒素原子を含む複素環であり、更に好ましくは、炭素数１～４のアルキル基を有するピリジル基である）で置換された二置換アミノ基であることが更に好ましい。

また、認識部位（好ましくはＹ）における金属配位性基が芳香族複素環基である場合、認識部位を構成する官能基と、被験物質（好ましくはエンドトキシン）の所定の部位又は官能基と物理的又は化学的に相互作用する錯体を形成し得る金属イオンを添加することが好ましい。後述する応答部位が蛍光を発光しうる構造を含む場合、例えば、応答部位の発光及び消光の機構が光誘起電子移動（Ｐｈｏｔｏ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＰＥＴ）に依存する場合、この金属イオンとしてｄ軌道が閉殻でない遷移金属イオン(たとえば、銅イオン（Ｃｕ^２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）又はコバルトイオン（Ｃｏ^２＋））を認識部位に配位させることが好ましい。特定の金属イオンを配位させることで、被験物質（好ましくはエンドトキシン）が存在しない場合に応答部位の蛍光が消光するため、Ｓ／Ｎ比とともに検出感度を高めることができる。
また、金属イオンに配位すると蛍光の発光量が著しく増加するので、発光量の減少として被験物質（好ましくはエンドトキシン）を検出可能な場合もある。このような金属イオンとしては、上述の金属配位性基における金属イオンが挙げられ、例えば、亜鉛イオン（Ｚｎ^２＋）、カドミウムイオン（Ｃｄ^２＋）が挙げられる。

酸基としては、例えば、スルホ基、カルボキシ基、リン酸基、ボロン酸基、フェノール基これらの塩又はこれらの脱塩構造から選ばれる基が挙げられ、これらの中でも、カルボキシ基、ボロン酸、これらの塩又はこれらの脱塩構造から選ばれる基が好ましい。
上記酸基を含む基としては、上記酸基を含むアルキル基、上記酸基を含むアリール基、又は上記酸基を含むアミノ基等が挙げられる。これらの中でも、上記酸基を含むアリール基、又は、上記酸基を含むアミノ基が好ましい。
上記酸基以外の置換基としては、アルキル基、アリール基等が挙げられるが、これらの中でも、アルキル基が好ましく、炭素数１～４のアルキル基がより好ましい。

被験物質を高感度に検出可能な観点から、酸基を含む基としては、酸基を含むフェニル基又は酸基を含むアミノ基であることが好ましく、酸基を含むフェニル基又は酸基を含む炭素数１～４のアルキル基で置換されたアミノ基であることが好ましく、ボロン酸を含むフェニル基又はカルボキシ基を含む炭素数１～４のアルキル基で置換されたアミノ基であることがより好ましく、ボロン酸を含むフェニル基又はカルボキシ基を含む炭素数１～４のアルキル基で置換された二置換のアミノ基であることが更に好ましく、ボロン酸を含むフェニル基又はカルボキシ基を含む炭素数１又は２のアルキル基で置換された二置換のアミノ基であることが特に好ましい。
カルボキシ基を含む炭素数１又は２のアルキル基で置換された二置換のアミノ基としては、例えば、イミノ二酢酸から水素原子を除いた１価の基等が挙げられる。

塩基基としては、例えば、アミノ基、窒素原子を含む芳香環等が挙げられる。被験物質を高感度に検出可能な観点から、塩基基としては、アミノ基又はグアニジノ基であることが好ましい。

金属配位性基又は酸基を含む基としては、下記式（Ｙ１）又は式（Ｙ２）で表される基であることが好ましい。

前記式（Ｙ１）及び式（Ｙ２）中、それぞれ独立に、波線は前記式（１）中のＬとの連結部位を表し、Ｍ^ｎ＋は金属イオンを表し、ｎは自然数を表す。ｎとしては１～３の整数であることが好ましい。
金属イオンとしては、上述の金属配位性基における金属イオンと同義であり、好ましい態様も同様である。

被験物質と相互作用する基：Ｙは、被験物質と相互作用する部位であり、後述する被験物質の種類に応じて適宜設定することができる。

〔Ａ〕
Ａは共役多重結合を含む基である応答部位を表す。共役多重結合を含む基は、直鎖状であってもよいし、環構造を有していてもよい。共役多重結合の部位に、複素原子を含まれていてもよい。
共役多重結合を含む基としては、例えば、メチン基（－Ｃ＝Ｃ－）、芳香族基、アゾ基及びこれらを組み合わせた基等が挙げられる。
また、Ａは、特に限定されず、共役多重結合のみで構成されている基であってもよいが、適宜アルキル基等の共役結合とならない置換基を有していてもよい。置換基として、例えば、アルキル基をＡに導入させると、特定化合物と、ミセル、ベシクル等との相溶性(すなわち、界面活性剤とともに、ミセルやベシクル等の分子集合体の表面層を形成する特性)が向上するため、光学的特性が向上し、より低濃度まで被験物質を測定することが可能となる。
高感度に被験物質を検出可能な観点から、共役多重結合を含む基としては、芳香族基及びアゾ基の少なくとも一方を含む基であることが好ましい。

芳香族基としては、芳香族炭化水素環であってもよいし、芳香族複素環であってもよい。また、上記環構造は、単環又は多環であってもよいし、多環は、縮合環であってもよい。芳香族基は、無置換であってもよいし、置換基を有していてもよいが、被験物質を高感度に検出可能な観点から、無置換であることが好ましい。

芳香族複素環は、単環であってもよいし、２環以上の複素環又は複素環と芳香族環とが縮合した縮合複素環であってもよいが、複素環と芳香族環とが縮合した縮合複素環であることが好ましい。
複素環の環員数は、特に制限はないが、５員環～８員環であることが好ましく、５員環又は６員環であることがより好ましい。
複素環は、窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群より選ばれる少なくとも１種の複素原子を、少なくとも１つ有する複素環が好ましく、窒素原子及び酸素原子からなるより選ばれる少なくとも１種の複素原子を有することがより好ましく、窒素原子又は酸素原子を含むことが更に好ましく、窒素原子を含むことが特に好ましい。
複素環としては、例えば、クマリン環、ピリジン環、ピリミジン環、チオフェン環、フラン環、ピロール環等が挙げられる。
上記複素環は、無置換又は置換基を有していてもよい。置換基としては、特に制限はないが、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アルコキシ基、アリーロキシ基、ハロゲン原子、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、アリール基、アルキルオキシカルボニル基、アルキルカルボニルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アリーロキシカルボニル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ジアルキルアミノ基、アルキルアリールアミノ基、ジアリールアミノ基、及び、これらを２以上組み合わせた基等が挙げられる。これらの中でも、置換基としては、ヒドロキシ基、及び、カルボキシ基よりなる群から選ばれる少なくとも１種の基であることが好ましい。
被験物質を高感度に検出可能な観点から、複素環としては、置換基を有する複素環が好ましく、置換基を有するクマリン環であることがより好ましく、ヒドロキシ基、及び、カルボキシ基よりなる群から選ばれる少なくとも１種の基で置換されたクマリン環であることが更に好ましく、ヒドロキシ基及びカルボキシ基で置換されたクマリン環であることが特に好ましい。

芳香族環は、単環であってもよいし、２環以上の芳香族環が縮合した縮合芳香族環であってもよいが、被験物質を高感度に検出可能な観点から、縮合芳香族環であることが好ましい。縮合芳香族環としては、２環～８環の芳香族環が縮合した縮合芳香族環であることが好ましく、２環～６環の芳香族環が縮合した縮合芳香族環であることがより好ましく、２環～４環の芳香族環が縮合した縮合芳香族環であることが更に好ましい。
縮合芳香族環としては、ナフタレン環、アントラセン環、フェナレン環、フェナントレン環、ピレン環、トリフェニレン環、テトラセン環、キノリン環、クリセン環、ピセン環等が挙げられる。
Ａが芳香族基である場合、被験物質が高感度に検出可能な観点から、複素環又縮合芳香族環が好ましく、クマリン環、ピレン環又はアントラセン環がより好ましく、ピレン環が特に好ましい。

また、芳香族環が単環である場合、芳香環としてはベンゼン環であることが好ましい。
芳香族基を含む基が単環の芳香族環を含む場合、芳香族環を１つ含んでいてもよいし、２つ以上含んでいてもよい。
単環の芳香族環を含む基としては、フェニル基、ビフェニル基、スチルベン基等が挙げられ、被験物質を高感度に検出可能な観点から、ビフェニル基が好ましい。

芳香族基を含む基としては、被験物質を高感度に検出可能な観点から、下記式（Ａ^ａｒｏ）で表される基であることが好ましい。

式Ａ^aro中、Ａは芳香族環を表し、Ｒ^Ｙ１はそれぞれ独立に、１価の置換基を表し、ａは０～５の整数を表し、波線は式（１）中のＬとの結合部位を表す。
芳香族環としては、上記Ａにおける芳香族が挙げられるが、これらの中でも、ベンゼン環、クマリン環、ピレン環又はアントラセン環が好ましい。
Ｒ^Ｙ１は、それぞれ独立に、上記芳香族炭化水素基における置換基が挙げられる。置換基は、アミド結合又はエステル結合を介して環Ａと結合していてもよい。
置換基としては、アルキル基、ヒドロキシ基、又は、カルボキシ基であることが好ましい。アルキル基としては、炭素数１～１５のアルキル基が好ましく、炭素数２～１２のアルキル基がより好ましく、炭素数５～１０のアルキル基が更に好ましい。
式Ａ^aroにおいて、ａが１～５の整数である場合、Ｒ^Ｙ１の少なくとも１つが、アミド結合を介して環Ａと結合していることが好ましく、Ｒ^Ｙ１の少なくとも１つが、アミド結合を介して環Ａと結合した炭素数１～１５のアルキル基（好ましくは炭素数２～１２、より好ましくは炭素数５～１０）であることがより好ましい。
ａは、０～３の整数が好ましく、０～２の整数がより好ましい。

上記環Ａがクマリン環である場合、Ａは、下記式Ａ^ｃｏｕで表されることが好ましい。

式Ａ^ｃｏｕ中、Ｒ^Ｙ１はそれぞれ独立に、１価の置換基を表し、ａは１又は２の整数を表し、波線は式（１）中のＬとの結合部位を表す。
Ｒ^Ｙ１における置換基は、Ａ^aro中の置換基として同義であり、好ましい態様も同様である。

アゾ（－Ｎ＝Ｎ－）構造を含む基（以下、「アゾ基」ともいう場合がある。）は、アゾ構造を１つ含んでいてもよいし、２以上を含んでいてもよいが、被験物質を高感度に検出可能な観点からは、アゾ構造を１つ含む基であることが好ましく、アゾ基と芳香族基とを組み合わせた基であることがより好ましい。アゾ基と芳香族基とを組み合わせた基において、芳香族基としては、芳香族炭化水素環であってもよいし、芳香族複素環であってもよいが発色性に優れる観点から、芳香族炭化水素基であることが好ましい。
芳香族炭化水素基が有する芳香族環は、単環であってもよいし、２環以上の芳香族環が縮合した縮合芳香族環であってもよい。縮合芳香族環としては、ナフタレン環、アントラセン環、ピレン環等が挙げられる。
また、芳香族環が単環である場合、芳香環としてはベンゼン環であることが好ましい。
また、芳香族炭化水素基としては、無置換であってもよいし、置換基を有していてもよい。置換基としては、特に制限はないが、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アルコキシ基、アリーロキシ基、ハロゲン原子、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、アリール基、アルキルオキシカルボニル基、アルキルカルボニルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アリーロキシカルボニル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ジアルキルアミノ基、アルキルアリールアミノ基、ジアリールアミノ基、及び、これらを２以上組み合わせた基等が挙げられる。

アゾ（－Ｎ＝Ｎ－）構造を含む基としては、被験物質を高感度に検出可能な観点から、アゾ構造に芳香族炭化水素基が結合した基であることが好ましく、下記式（Ａ^ａｚｏ）で表される基であることがより好ましい。

式（Ａ^ａｚｏ）中、Ｒ^Ｚ１及びＲ^Ｚ２は、それぞれ独立に、置換基を表し、波線は式（１）中のＬとの結合部位を表す。
置換基としては、上記芳香族炭化水素基における置換基が挙げられる。置換基は、アミド結合又はエステル結合を介してアゾベンゼン構造と結合していてもよい。
置換基としては、アルキル基、ヒドロキシ基、又は、カルボキシ基であることが好ましい。アルキル基としては、炭素数１～１５のアルキル基が好ましく、炭素数２～１２のアルキル基がより好ましく、炭素数５～１０のアルキル基が更に好ましい。
Ｒ^Ｚ１及びＲ^Ｚ２は、同一構造であってもよいし、互いに異なっていてもよいが、ミセル形成の観点から、Ｒ^Ｚ１及びＲ^Ｚ２は、互いに異なっていることが好ましい。
また、Ｒ^Ｚ１及びＲ^Ｚ２はアゾ基に対して、オルト位、メタ位及びパラ位のいずれの位置で結合していてもよい。これらの中でも、Ｒ^Ｚ１及びＲ^Ｚ２における置換基は、アゾ基に対して、パラ位に結合することが好ましい。
Ｌとの結合部位は、アゾ基に対して、オルト位、メタ位及びパラ位のいずれの位置で結合していてもよい。これらの中でも、Ｌとの結合部位は、アゾ基に対して、メタ位に結合することが好ましい。

式（１）におけるＡの具体例としては、下記式（５Ａ）に示すクマリン(以下Ｃと記す)、下記式（６Ａ）に示すビフェニル、下記式（７Ａ）に示すピレン(以下Ｐｒと記す)、下記式（８Ａ）に示すスチルベン及び下記式（９Ａ）に示すアントラセン、下記式（１０Ａ）に示すアゾベンゼン並びにこれらの誘導体、有機エレクトロルミネセンス用色素、並びに蛍光蛋白質が挙げられる。なお、本開示は以下の具体例に限定されることはない。

応答部位として利用可能なクマリン誘導体としては、クマリン１、クマリン６、クマリン７、クマリン３０、７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸及び８－（２，２’－ジピコリルアミノメチル）－７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸等が挙げられるが、７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸が最も好ましい。

応答部位として利用可能なビフェニル誘導体としては、４－ビフェニルカルボン酸、２－（４’－ｔ－ブチルフェニル）－５－（４’－ビフェニル）１，３，４－オキサジアゾール、２，５－ビス－（２－（４－ビフェニル）エテニル）ピラジン及び４，４’－ビス（２，２－ジフェニルビニル）ビフェニル等が挙げられるが、検出感度の面から、４－ビフェニルカルボン酸が最も好ましい。

応答部位として利用可能なピレン誘導体としては、アルキニルピレンが挙げられるが、検出感度の面から、上記式（７Ａ）に示すピレンが最も好ましい。

応答部位として利用可能なスチルベン誘導体としては、１，１，４，４－テトラフェニル－１，３－ブタジエン、４，４’－ビス（２，２－ジフェニルビニル）ビフェニル及びシアノスチルベン等が挙げられるが、検出感度の面から、上記式（８Ａ）に示すスチルベンが最も好ましい。

応答部位として利用可能なアントラセン誘導体としては、１０－［２－（９アントラセニル）エチル］フェノキサジン、１０－［２－（９－アントラセニル）エチル］フェノチアジン及び２－（９－アントラセニル）エチルジフェニルアミン等が挙げられるが、検出感度の面から、上記式（９Ａ）に示すアントラセンが最も好ましい。

応答部位として利用可能なアゾベンゼン誘導体としては、上記式（Ａ^ａｚｏ）で表される基を有する誘導体が挙げられ、好ましい態様も同様である。

応答部位として利用可能な蛍光蛋白質としては、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ（Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＹＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＰＡ－ＧＦＰ（Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）等が挙げられるが、ＧＦＰが最も好ましい。

応答部位が蛍光を発光する構造を含む場合、蛍光を発光する構造は疎水性を示す場合が多く、認識部位は親水性を示す場合が多い。したがって、たとえば、スペーサの種類を適切なものにして、後述する蛍光物質に十分な親水性を持たせることにより蛍光物質が水溶性を持つこととなり、たとえば有機溶媒等に溶かして使用する等の必要がなく、検出精度を高くすることが可能である。
また、スペーサの種類を適切なものにする方法としては、たとえば後述のスペーサ：Ｌの鎖長の炭素数を調整したり、親水性基を側鎖に導入したり、窒素等の原子を鎖中に導入する方法が考えられる。なお、同様の調整を、応答部位や認識部位に対して行うことも可能である。

応答部位が蛍光を発光する構造を含む場合、特定化合物は、図１の模式図に示すような概略構成を有する。例えば、被験物質（好ましくは、エンドトキシン）５０と相互作用する認識部位４０と、発光する蛍光部位２０とがスペーサ３０で連結されている。認識部位４０には化学構造に応じて金属イオンが配位される場合もある。

応答部位が蛍光を発光する構造を含む場合、具体的な特定化合物（蛍光物質）の例としては、前記式（Ｙ２）に示す、金属イオンが配位されたジピコリルアミノ基と、前記式（５Ａ）に示すクマリンの誘導体である７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸とが、鎖長の炭素数１のスペーサを介して結合された、前記式（１）で表されるｄｐａ－ＨＣＣが挙げられる。

アルキル鎖等を導入させたＡの具体例としては、次のものが例示される。

Ｒ－ＨＣＣ(ヒドロキシクマリンカルボン酸アルキルアミド)はクマリンにアミド結合を介してアルキル鎖を導入したものである。同様に、Ｒ―ａｚｏ（ヒドロキシアゾベンゼンカルボン酸アルキルアミド）は、４－ヒドロキシアゾベンゼンにアミド結合を介してアルキル鎖を導入したものである。
なお、上記Ｒ－ＨＣＣ、及び、Ｒ―ａｚｏ中のＲは、アルキル基（好ましくは炭素数１～１５のアルキル基、より好ましくは炭素数２～１２のアルキル基、更に好ましくは炭素数５～１０のアルキル基である）を表す。

具体的な特定化合物（蛍光物質）の別の例としては、前記式（Ｙ１）に示すフェニルボロン酸（以下ＰＢと示す場合がある。）と、前記式（７Ａ）に示すピレン環とが、スペーサ３０としてのアミド結合（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－）で連結された、Ｃ４－ＡＰＢが挙げられる

〔Ｌ〕
Ｌは単結合又は鎖長が原子数１～１０のスペーサを表す。Ｌが単結合である場合、Ｌは連結基であるので、式（１）においてＡとＹとが直接結合していることを表している。
スペーサは、応答部位と認識部位との結合を仲介する。認識部位から応答部位への認識情報の受け渡しが効率的に行われる観点から、鎖長が原子数１～１０のスペーサであることが好ましい。
本明細書において、鎖長とは、応答部位からスペーサを経て認識部位までの間の原子数を、最小となるように数えた値であり、応答部位及び認識部位に含まれる原子の数は鎖長の長さに含まれない。

例えば、下記の化合物ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙにおける鎖長は４である。また、下記の化合物Ｃ４－ＡＰＢにおける鎖長は６である。

上記の鎖長を構成する鎖としては、炭素原子、酸素原子、窒素原子、硫黄原子からなる群から選択される少なくとも１種の原子を含む鎖であることが好ましく、炭素原子、酸素原子及び硫黄原子からなる群より選択される少なくとも１種の原子を含む鎖であることがより好ましく、アルキル鎖、エーテル結合（－Ｏ－）、アミド結合（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－）、及びエステル結合（－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－）よりなる群より選択される少なくとも１種を含む鎖であること更に好ましく、アルキル鎖、及び、アミド結合からなる群より選択される少なくとも１種を含む鎖であることが特に好ましい。
Ｌは、線状（直鎖）又は分岐状（分岐鎖）のいずれであってもよいが、被験物質を高感度に検出可能な観点から、線状の飽和アルキル鎖であることが好ましい。
また、特定化合物において複数の認識部位を有するために、Ｌを分岐鎖として認識部位と結合させてもよい。また、Ｌを分岐鎖にして、親水性基を側鎖に導入してもよい。
親水性基としては、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基等が挙げられる。

被験物質を高感度に検出可能な観点から、Ｌとしては、鎖長が原子数１～１０であり、かつ、アルキル鎖、及び、アミド結合からなる群より選択される少なくとも１種を含む鎖であることが好ましく、鎖長が原子数１～８であるアルキル鎖であることがより好ましく、鎖長が原子数１～８である線状のアルキル鎖であることが更に好ましく、鎖長が原子数１～６である線状のアルキル鎖であることが特に好ましい。

特定化合物（好ましくは式（１）で表される化合物）の具体例としては、下記例示化合物が挙げられる。なお、本開示は以下の具体例に限定されることはない。以下、下記例示化合物はカッコ内の記号で表す場合もある。例示化合物中、Ｍ^ｎ＋は、金属イオンを表し、上述のＭ^ｎ＋と同義である。

なお、上記例示化合物において、ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙは、Ｎ,Ｎ’-（ジピコリル）-4-(1-ピレニル)ブチルアミンであり、Ｃ４－ＡＰＢは、フェニルボロン酸-4-（1-ピレニル）ブチルアミドであり、ｄｐａ―ＨＣＣは、ジピコリルアミン－ヒドロキシクマリンカルボン酸であり、ｄｐａ－ａｚｏは、ジピコリルアミン－ヒドロキシアゾベンゼンであり、ｄｐａ－Ｃ６Ｐｙは、Ｎ,Ｎ’-（ジピコリル）-4-(1-ピレニル)ヘキシルアミンである。

ｄｐａ－Ｒ－ＨＣＣは、ジピコリルアミン－ヒドロキシクマリンカルボン酸アルキルアミド、ｄｐａ－Ｒ－ａｚｏは、ジピコリルアミン－ヒドロキシアゾベンゼンカルボン酸アルキルアミドである。なお、上記ｄｐａ－Ｒ－ＨＣＣ、及び、ｄｐａ－Ｒ－ａｚｏ中のＲは、アルキル基（好ましくは炭素数１～１５のアルキル基、より好ましくは炭素数２～１２のアルキル基、更に好ましくは炭素数５～１０のアルキル基である）を表す。

被験物質を高感度に検出する観点から、特定化合物は、水溶液中で後述の界面活性剤と分子集合体を形成可能な化合物であることが好ましく、水溶液中で後述の界面活性剤とミセル又はベシクルを形成可能な化合物であることがより好ましい。

特定化合物は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
なお、本開示に係る検出方法では、被験物質の異なる特定部位を認識する認識部位を有する複数の蛍光物質を用いてもよい。これにより、被験物質（例えば、エンドトキシン）の多点認識が可能となり、より特異性及び検出感度が増す。たとえば、ｄｐａ－ＨＣＣとＣ４－ＡＰＢとを混合したものを蛍光試薬として試料に添加し、蛍光強度を２波長で検出することができる。さらに、複数の認識部位を持つ特定化合物、又は、複数の応答部位を持つ特定化合物を用いても、同様の効果が得られる。この場合、スペーサとして、側鎖を持ったものを用いるか、又は、スペーサを複数使用すればよい。

＜界面活性剤＞
本開示に係る検出方法において、界面活性剤の種類は制限されない。本開示における界面活性剤は、公知の界面活性剤を包含する。
界面活性剤としては、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤が挙げられる。
被験物質を高感度に検出可能な観点から、界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤であることが好ましく、カチオン性界面活性剤であることがより好ましい。

カチオン性界面活性剤としては、例えば、窒素原子を有する界面活性剤が挙げられ、具体的には、アルキルトリメチルアンモニウム塩（例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、及び塩化ラウリルトリメチルアンモニウム）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩（例えば、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム）、アルキルピリジニウム塩（例えば、塩化ポリ（Ｎ、Ｎジメチル－３、５－メチレンピペリジニウム）、及び塩化セチルピリジニウム）、アルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルイソキノリニウム塩、ジアルキルモリホニウム塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、及び塩化ベンゼトニウムが挙げられる。

これらの中でもカチオン性界面活性剤としては、被験物質を高感度に検出可能な観点から、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ，ＨＬＢ：１０）、ジドデシルジメチルアンモニウムプロミド（ＤＤＡＢ）又はドデシルトリメチルアンモニウム塩化物（ＤＴＡＣ）であることが好ましく、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ，ＨＬＢ：１０）、又は、ジドデシルジメチルアンモニウムプロミド（ＤＤＡＢ）であることがより好ましい。
カチオン性界面活性剤は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。

アニオン性界面活性剤としては、例えば、高級脂肪酸塩（例えば、コール酸ナトリウム、ステアリン酸カリウム、及びベヘニン酸カリウム）、アルキルエーテルカルボン酸塩（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテルカルボン酸ナトリウム）、Ｎ－アシル－Ｌ－グルタミン酸塩（例えば、Ｎ－ステアロイル－Ｌ－グルタミン酸モノナトリウム塩）、高級アルキル硫酸エステル塩（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、及びラウリル硫酸カリウム）、ポリオキシエチレンラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルエーテル硫酸エステル塩（例えば、ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム）、Ｎ－アシルサルコシン酸塩（例えば、ラウロイルサルコシンナトリウム）、アルキルリン酸塩（例えば、ステアリルリン酸ナトリウム）、アルキルエーテルリン酸塩（例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテルリン酸ナトリウム、及びポリオキシエチレンステアリルエーテルリン酸ナトリウム）、高級脂肪酸エステル硫酸エステル塩（例えば、硬化ヤシ油脂肪酸グリセリン硫酸ナトリウム）、及び、ホスファチジルグリセロール（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）等）が挙げられる。

これらの中でもアニオン性界面活性剤としては、被験物質を高感度に検出可能な観点から、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ，ＨＬＢ：４０）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、又は、コール酸ナトリウムであることが好ましい。
アニオン性界面活性剤は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。

非イオン性界面活性剤としては、例えば、モノ脂肪酸ソルビタン（例えば、ポリソルベイト２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、ポリソルベイト８０（オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン））、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、及びポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等が挙げられる。

これらの中でも非イオン性界面活性剤としては、被験物質を高感度に検出可能な観点から、ポリソルベイト（ＰＳ）、オクトキシノール、（ポリオキシエチレン）ｎエチルエーテル（ｎ＝１０（ＨＬＢ：１６））、（ポリオキシエチレン）ｎ－ｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル（ｎ＝９～１０（ＨＬＢ：１４））又は（ポリオキシエチレン）ｎモノステアリン酸ソルビタン（ｎ＝２０（ＨＬＢ：１５））であることが好ましく、（ポリオキシエチレン）ｎエチルエーテル（ｎ＝１０（ＨＬＢ：１６））、（ポリオキシエチレン）ｎ－ｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル（ｎ＝９～１０（ＨＬＢ：１４））又は（ポリオキシエチレン）ｎモノステアリン酸ソルビタン（ｎ＝２０（ＨＬＢ：１５））であることがより好ましい。
非イオン性界面活性剤は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。

両性界面活性剤としては、例えば、カルボキシベタイン、アミノカルボン酸、スルホベタイン、アミノ硫酸エステル、イミタゾリン、リン脂質（レシチン）等が挙げられる。
リン脂質としては、ジフタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）、１，２―ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２―ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、１，２―ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２―ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２―ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等のリン脂質が挙げられる。

これらの中でも両性界面活性剤としては、被験物質を高感度に検出可能な観点から、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）又はドデシル－Ｎ－ベタインであることが好ましく、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）であることがより好ましい。
両性界面活性剤は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。

界面活性剤の分子量は制限されない。分子集合体の形成の観点から、界面活性剤の分子量は１０００以下であってもよく、１５０以上１０００以下であってもよく、２００以上５００以下であってもよい。
本開示において、分子量分布を有する界面活性剤の分子量は、重量平均分子量によって表すものとする。本開示において、重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定される。

被験物質を高感度に検出可能な観点から、界面活性剤のＨＬＢ値としては、６～４０であることが好ましく、７～３０であることがより好ましく、７～２０であることが更に好ましい。
親水性－親油性バランスの値（以下、「ＨＬＢ値」ともいう。）ＨＬＢは、通常、界面活性剤の分野で使用される親水性－疎水性のバランスを意味する。親水性－親油性バランスの値（以下、「ＨＬＢ値」ともいう。）は、以下に示す川上式を用いて計算する。なお、グリセリン脂肪酸エステルとして、市販品を使用する場合には、市販のカタログデータを優先して採用する。

ＨＬＢ＝７＋１１．７ｌｏｇ（Ｍｗ／Ｍｏ）
ここで、Ｍｗは親水基の分子量、Ｍｏは疎水基の分子量を示す。

工程Ａにおいて、界面活性剤の濃度が、臨界ミセル濃度以下であっても、部分的にミセルないしミセルに近い形態のものが形成されると推測されるが、より高感度に被験物質を検出可能な点から、被験物質及び水を含む検体、特定化合物及び界面活性剤の混合液に対する、室温（２５℃）における、界面活性剤の濃度としては、臨界ミセル濃度以上であることがより好ましい。また、界面活性剤の濃度は、検出結果を参照しながら適宜設定することもできる。
例えば、標準物質を用いて測定を行い、界面活性剤の濃度を設定してもよい。
臨界ミセル濃度は色素可溶化法により測定することができ、臨界ミセル濃度とは、気液界面への吸着が飽和し、溶液内部でミセルの形成が始まる濃度を意味する。本開示における界面活性剤の含有量としては、臨界ミセル濃度の０．５倍～１００倍が好ましい。より好ましくは、１倍～５０倍である。

具体的な界面活性剤の含有量としては、被験物質、特定化合物及び界面活性剤を含む溶液の全質量に対して、１×１０^－６質量％～１質量％であることが好ましく、１×１０^－５質量％～０．１質量％であることがより好ましい。
特定化合物と界面活性剤のとの含有量比は、質量基準で、１：１～１：４００であることが好ましく、１：１０～１：２００であることがより好ましい。

〔被験物質〕
被験物質としては、水溶液中で分子集合体を形成可能な化合物が好適挙げられる。水溶液中で分子集合体を形成可能な化合物としては、例えば、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、後述する本開示に係る検出方法に用いられる界面活性剤以外の界面活性剤（以下、「その他の界面活性剤」ともいう。）、細菌等が挙げられる。
上記その他の界面活性剤としては、例えば、ＰＦＯＳ(ペルフルオロオクタンスルホン酸)、ＰＦＯＡ(ペルフルオロオクタン酸)が挙げられる。
また、水溶液中で分子集合体を形成可能な化合物がアルカリ金属、遷移金属（Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ａｇ、Ｎｉ、Ｃｏ又は、Ｚｎ等）等を含む場合、本開示に係る検出方法は、これらの金属を検出することも可能である。
また、被験物質が、細菌（好ましくは、グラム陰性菌）の場合には、界面活性剤により細菌の細胞壁を破壊し、細胞壁に含まれるリン脂質、糖脂質、エンドトキシン等を分子集合体に取り込むことで、検出が可能となる。

これらの中でも、被験物質を高感度に検出可能な観点から、被験物質としては、リン脂質、糖脂質、又は、リン酸を含むその他の界面活性剤を含むが好ましく、リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方を含むことがより好ましく、エンドトキシンを含むことが更に好ましい。

エンドトキシンは、親水性の部位である糖鎖と、疎水性の部位であるアシル酸とが２分子のグルコサミンを介して結合した構造を有する。エンドトキシンにおいてグルコサミンにはそれぞれリン酸が結合している（棚本憲一「エンドトキシンと医薬品の品質管理」Ｂｕｌｌ．Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉ．，１２６，１９－３３（２００８））。エンドトキシンのうち、アシル酸が結合したグルコサミンが２個結合した部分はリピドＡと称され、エンドトキシンの生物活性の多くはこの部分に由来する。

リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン等が挙げられる。
糖脂質としては、例えば、ガラクト脂質が挙げられる。
リン酸を含む界面活性剤としては、ラウリルリン酸塩等のアルキルリン酸塩、及び、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルリン酸塩等が挙げられる。

－被験物質が糖脂質を含む場合－
被験物質が例えば糖脂質（好ましくはエンドトキシン、より好ましくはエンドトキシンの糖部分）である場合、Ｙとしては、酸基を含む基であることが好ましく、酸基を含むフェニル基であることがより好ましく、ボロン酸を含むフェニル基であることが更に好ましい。
また、Ａとしては、２環～４環の芳香族環が縮合した縮合芳香族環が好ましく、３環又は４環の芳香族環が縮合した縮合芳香族環がより好ましく、ピレン環又はクマリン環であることが更に好ましく、ピレン環であることが特に好ましい。
Ｌとしては、上述のＬと同義であり、好ましい態様も同様である。

前記被験物質がエンドトキシンである（好ましくはエンドトキシンの糖部分を認識する）場合、被験物質を高感度に検出可能な観点から、特定化合物が、下記式１Ａ、Ｃ４－ＡＰＢ、ｄｐａ－Ｒ－ＨＣＣ又はｄｐａ－Ｒ－ａｚｏで表される化合物であることが好ましい。

前記式（１Ａ）中、ｍは０～６を表し、Ｍ^ｎ＋は金属イオンを表し、ｎは自然数を表す。ｎとしては１～３の整数であることが好ましい。
金属イオンとしては、上述の金属配位性基における金属イオンと同義であり、好ましい態様も同様である。なお、上記ｄｐａ－Ｒ－ＨＣＣ、及び、ｄｐａ－Ｒ－ａｚｏ中のＲは、アルキル基（好ましくは炭素数１～１５のアルキル基、より好ましくは炭素数２～１２のアルキル基、更に好ましくは炭素数５～１０のアルキル基である）を表す。

－被験物質がリン酸又はリン脂質を含む場合－
また、被験物質が、例えば、リン酸又はリン脂質を含む場合、Ｙとしては、金属配位性基であることが好ましく、複素環基で置換された置換アミノ基であることが好ましく、炭素数１～４のアルキル基を含む複素環（好ましくは、炭素数１～４のアルキル基を有し、かつ、環員数５又は６の窒素原子を含む複素環であり、より好ましくは、炭素数１～４のアルキル基を有し、かつ、環員数５の窒素原子を含む複素環であり、更に好ましくは、炭素数１～４のアルキル基を有するピリジル基である）で置換された置換アミノ基であることがより好ましく、炭素数１～４のアルキル基を含む複素環（好ましくは、炭素数１～４のアルキル基を有し、かつ、環員数５又は６の窒素原子を含む複素環であり、より好ましくは、炭素数１～４のアルキル基を有し、かつ、環員数５の窒素原子を含む複素環であり、更に好ましくは、炭素数１～４のアルキル基を有するピリジル基である）で置換された二置換アミノ基であることが更に好ましい。
また、Ａとしては、アゾ構造に芳香族炭化水素基が結合した基、複素環又縮合芳香族環が好ましく、アゾ構造にフェニル基が結合した基、クマリン環、ピレン環又はアントラセン環が好ましい。
Ｌとしては、鎖長が原子数１～１０であり、かつ、アルキル鎖、及び、アミド結合からなる群より選択される少なくとも１種を含む鎖であることがより好ましく、鎖長が原子数１～８であるアルキル鎖又は鎖長が原子数１～８であるアミド結合を含む鎖であることがより好ましく、鎖長が原子数１～８である線状のアルキル鎖又は鎖長が原子数１～６であるアミド結合を含む鎖であることが更に好ましく、鎖長が原子数１～６である線状のアルキル鎖又は鎖長が原子数１～４であるアミド結合を含む鎖であることが特に好ましい。

－被験物質がアルカリ金属を含む場合－
被験物質が、例えば、アルカリ金属を含む場合、Ｙとしては金属配位性基であることが好ましく、クラウンエーテル基等を含む基がより好ましい。
Ｌ及びＡは、上述の式（１）中のＬ及びＡと同義であり、好ましい態様も同様である。

－被験物質が遷移金属を含む場合－
被験物質が、例えば、遷移金属を含む場合、Ｙとしては酸基を含む基であることが好ましく、酸基を含むフェニル基又は酸基を含むアミノ基であることが好ましく、酸基を含む炭素数１～４のアルキル基で置換されたアミノ基であることが好ましく、カルボキシ基を含む炭素数１～４のアルキル基で置換されたアミノ基であることがより好ましく、カルボキシ基を含む炭素数１～４のアルキル基で置換された二置換のアミノ基であることが更に好ましく、カルボキシ基を含む炭素数１又は２のアルキル基で置換された二置換のアミノ基であることが特に好ましい。
Ｌ及びＡは、上述の式（１）中のＬ及びＡと同義であり、好ましい態様も同様である。

＜検体＞
工程Ａに用いられる検体は、上記被験物質及び水を含む。
検体としては、例えば、食品（生鮮食品、加工食品等）、水（飲料水、地下水、河川水、海水、生活排水、産業排水等）、土壌等の環境由来の検体、ヒト又はヒト以外の動物より採取した血液、尿、唾液、鼻汁等の体液、組織液などが挙げられる。
検体に含まれる水は、検体に由来する水であってもよいし、別途添加したものであってもよい。別途添加する水としては、特に制限はなく、蒸留水、イオン交換水、脱イオン水、限外ろ過水、純水等であってもよい。

工程Ａは、上記検体、特定化合物及び界面活性剤以外の成分（その他の成分）を添加してもよい。その他の成分としては、緩衝液、塩溶液等が挙げられる。

工程Ａにおいて、上記検体、特定化合物及び界面活性剤を混合する方法は特に限定されず、公知の混合方法を用いることができる。
検体に特定化合物と界面活性剤とを添加する順序は、特に限定されず、例えば、検体に界面活性剤を添加したのちに、特定化合物を添加してもよいし、界面活性剤と特定化合物とを混合したのち、混合液を検体に添加してもよい。

－温度－
工程Ａにおいて、検体に特定化合物と界面活性剤とを添加するときの温度としては、１５～３５℃であることが好ましい。
－ｐＨ－
工程Ａにおいて、検体、特定化合物及び界面活性剤の混合液のｐＨは、２５℃において、ｐＨ５．０～９．０であることが好ましく、ｐＨ７．０～ｐＨ８．０であることがより好ましい。

＜工程Ｂ＞
本開示に係る検出方法は、認識部位と前記被験物質とが相互作用し、前記応答部位おける応答を検出する工程Ｂを含む。
本明細書において、応答部位における応答とは、被験物質と認識部位との相互作用し、相互作用によって生じる応答部位おける特性の変化（例えば、蛍光、吸光、電気化学法、ゼータ電位、光散乱、目視等の変化が挙げられ、好ましくは、光学特性の変化である）を意味する。光学特性の変化としては、例えば、吸光波長、発光（蛍光）波長又は発光（蛍光）強度、励起光の波長の変化等の変化が挙げられる。
また、光学特性の変化は、特定化合物と被験物質との複合体が会合体に含まれることにより、複合体の構造が変化し、観察される発光（蛍光）波長又は強度の変化が引き起こされるものであってもよい。

相互作用によって生じる応答部位における光学特性の変化の例としては、特定化合物であるｄｐａ－ＨＣＣを挙げて以下に説明する。
ｄｐａ－ＨＣＣの応答部位（蛍光部位）である７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸は、単体では、たとえば３９６ｎｍの励起波長に対し、４４８ｎｍに蛍光強度のピークを示す。この７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸にスペーサ（－ＣＨ_２－）を介してジピコリルアミノ基が結合されたｄｐａ－ＨＣＣでは、ジピコリルアミノ基の分岐窒素原子の非共有電子対が電子供与部として応答部位（蛍光部位）へＰＥＴ（（光誘起電子移動（Ｐｈｏｔｏ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）））により移動し、蛍光が一部抑制されている。さらにこのｄｐａ－ＨＣＣに、前記式（Ｙ２）に示す金属イオンとして銅イオン、ニッケルイオン又はコバルトイオン（以下、「銅イオン等」とする。）が配位されると、応答部位（蛍光部位）である７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸から、銅イオン等の空いたｄ軌道へ電子が流れ込むＬＭＣＴ（Ｌｉｇａｎｄ ｔｏ Ｍｅｔａｌ Ｃｈａｒｇｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）によって蛍光が減衰した状態となる。

ところが、被験物質がエンドトキシンである場合において、ｄｐａ－ＨＣＣは、減衰していた蛍光が復活する。つまり、ジピコリルアミノ基に配位している銅イオン等にエンドトキシンのリン酸基が配位すると、銅イオン等とｄｐａ－ＨＣＣとの化学結合が弱められることで、減衰していた７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸の蛍光が復活するものと考えられる。
すなわち、特定化合物（蛍光物質）としてのｄｐａ－ＨＣＣの認識部位が認識する特定部位は、エンドトキシンのリン酸基である。

光学特性の変化の他の例としては、特定化合物であるＣ４－ＡＰＢが挙げられる。このＣ４－ＡＰＢは、エンドトキシンのない状態では、応答部位であるピレン環から、フェニルボロン酸へ電子が流れ込むＰＥＴによって蛍光が減衰した状態となる。一方、エンドトキシンがある状態では、Ｃ４－ＡＰＢは蛍光を発する。
つまり、フェニルボロン酸とエンドトキシンの糖鎖部分に存在するヒドロキシル基との相互作用によって、フェニルボロン酸の電子受容性が減少し、減衰していたピレンの蛍光が復活するものと考えられる。
すなわち、特定化合物（蛍光物質）としてのＣ４－ＡＰＢの認識部位が認識する特定部位は、エンドトキシンの糖鎖部分である。

応答部位における応答の検出方法としては、上述の応答部位の構造及び検出する光学特性に応じて適宜設定することができる。検出装置は、例えば、公知の、吸光度計、発光検出器、蛍光検出器等を用いることができる。検出装置の詳細については後述する。

＜その他の工程＞
本開示に係る検出方法は、工程Ａ及び工程Ｂ以外の工程（その他の工程）を更に含んでいてもよい。
その他の工程としては、例えば、検体の前処理工程(例えば、イオン交換等の被験物質以外の物質との分離工程)、検体の濃縮工程(例えば逆浸透処理)、ベシクル形成工程(例えば、超音波処理、振とう処理)等が挙げられる。

（検出装置）
高感度に被験物質を検出可能な観点から、本開示に係る検出器としては、被験物質及び水を含む検体が導入される試料導入部と、後述の検出試薬組成物を前記検体に供給する供給部と、前記検体と前記検出試薬組成物とが反応する反応部と、前記反応を検出する検出部と、を備えることが好ましく、オンラインで使用可能な検出装置（オンライン測定器）であることがより好ましい。検出装置に用いる検出試薬組成物の詳細は後述する。
例えば、被験物質がエンドトキシンであり、応答部位が蛍光を発光する構造を有する場合、検出装置としては、例えば、図２で示される検出装置１００を好適に用いることができる。
なお、試料導入部に導入される被験物質及び水を含む検体は、被験対象の試料と読み替えることができる。

図２は、本開示のエンドトキシン検出装置１００の一例を模式図で示すものである。本開示のエンドトキシン検出装置１００は、被験対象の試料９６０が導入される試料導入部２００と、上述の蛍光物質１０を前記試料に供給する供給部３００と、前記試料９６０と前記蛍光物質１０とが反応する反応部４００と、前記反応を被った前記蛍光物質１０の蛍光を検出する検出部５００と、を備える。本例のエンドトキシン検出装置１００はフローインジェクション分析法（ＦＩＡ、Ｆｌｏｗ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を利用して構成されている。

試料導入部２００は、試料９６０を搬送する液体としてのキャリアを貯留するキャリア貯留槽２１０と、キャリアを送液するキャリア送液ポンプ２２０と、キャリアが流動するキャリア送液路２３０と、キャリア送液路２３０に試料９６０が導入される試料導入部２４０とを備えている。キャリアは、試料９６０を搬送することのできる液体であれば特に限定はなく、試料９６０及び蛍光物質１０の性状に応じて、たとえば純水又は各種緩衝液を適宜使用することができる。試料９６０は、エンドトキシン５０を含有しているかどうかが検証される被験対象の液体であり、たとえば、注射剤、輸液、透析液などの溶媒となる精製水又は注射用水等の液体製品や、血液、唾液、尿等の生体液又はその希釈液等が試料９６０となり得る。試料導入部２４０には、上記した液体製品の製造ライン（特に、精製水製造設備や注射用水製造設備）に設けられた試料採取部７００から採取された試料９６０が直接、連続的に導入されることが望ましいが、測定の都度、採取された試料９６０が試料導入部２４０から導入されることとしてもよい。

後述する精製水製造設備又は注射用水製造設備に図２に示すエンドトキシン検出装置を直接接続して、連続してエンドトキシン５０を検出する場合、本開示に係る検出方法を用いると、より低濃度のエンドトキシンを短時間で測定できるので、後述の製造方法により製造した精製水又は注射用水のエンドトキシン濃度が規定値以未満であることを保証することができる。図３に本発明における精製水製造設備及び注射用水製造設備を例示する。

供給部３００は、蛍光物質１０を含有する試薬溶液を貯留する試薬貯留槽３１０と、試薬を送液する試薬送液ポンプ３２０と、試薬が流動する試薬送液路３３０と、キャリア送液路２３０に合流する混合部３４０とを備えている。混合部３４０では、蛍光物質１０が試薬溶液として試料９６０に供給エンドトキシン５０され、そして混合される。蛍光物質１０は、上述のように、蛍光部位２０と、の分子構造の特定部位５１を認識する認識部位４０とがスペーサ３０で連結された構造を有している。蛍光部位２０、認識部位４０及びスペーサ３０の意義については上述したとおりである。

反応部４００では、試料９６０にエンドトキシン５０が含有されている場合、試薬中の蛍光物質１０とエンドトキシン５０との反応が発生し、蛍光物質１０から発光が生ずる。反応部４００としては、一般の検出システムで採用される反応コイルが用いられるが、単純なキャピラリ管を反応部４００としてもよい。

検出部５００では、上述の反応を被った蛍光物質１０の発光が光学的に検出される。検出部５００としては、一般の発光検出器を使用可能である。

なお、本開示のエンドトキシン検出装置１００は、上述のＦＩＡを利用した構成に限定されず、たとえば、ＣＦＡ（連続流れ分析法）、ＳＩＡ（逐次注入分析法）、ｒ－ＦＩＡ（リバースフローインジェクション分析法）を含めたＦＣＡ（液体流れ分析法）を利用した構成でも実現可能である。

本開示のエンドトキシン検出装置１００においては、そして、蛍光物質１０として、特定部位５１としてのリン酸基と反応するｄｐａ－ＨＣＣ、又は、特定部位５１としての糖鎖部分と反応するＣ４－ＡＰＢを用いることが望ましい。

（精製水製造設備）
本開示に係る精製水製造設備は、原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、前記精製水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、上記検出装置と、を備えることが好ましい。
図３は、本開示に係る精製水製造設備６００の一例の概略構成を模式図で示すものである。本開示の精製水製造設備６００は、原水９００から精製水９２０を得る精製水製造部６１０と、精製水９２０から被験対象の試料９６０を採取する試料採取部７００と、前記のエンドトキシン検出装置１００と、を備える。

精製水製造部６１０は、たとえば、原水９００を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置（６１０）、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置（６２０）のうちの少なくとも一方により、原水９００から不純物を除去して、精製水９２０を製造する設備である。イオン交換装置には、たとえば、電気式脱塩装置や、混床式イオン交換樹脂装置を用いることができる。精製水製造部６１０は、さらに限外ろ過膜装置６３０や紫外線照射装置を備えても良い。製造した精製水９２０は注射用水製造設備８００に供給しても良いし、使用場所(図示せず)に供給しても良い。

試料採取部７００は、精製水製造部６１０の下流側で、精製水９２０の搬送ラインの途中に設けられる。試料採取部７００により採取された精製水９２０は、被験対象の試料９６０として、前記した試料導入部２４０（図２参照）からエンドトキシン検出装置１００に導入される。エンドトキシン検出装置１００の詳細は上述のとおりである。これにより、精製水９２０から採取された被験対象の試料９６０が、上述のエンドトキシン検出方法に供されることになる。

上記の構成により、本開示の精製水製造設備６００では、製造された精製水９２０から随時試料９６０を採取して、エンドトキシン検出装置１００によりリアルタイムでエンドトキシン５０を検出することが可能となる。そして、エンドトキシン５０の濃度が所定の基準値を超えた場合には、たとえば即時に精製水製造設備６００を停止して、部品交換又は修理等の適切な処置を講じることができる。

（注射用水製造設備）
本開示に係る注射用水製造設備は、原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、前記精製水をろ過する高分子膜ろ過装置又は前記精製水を蒸留する蒸留器により前記精製水から注射用水を得る注射用水製造部と、前記注射用水を加熱した状態で維持して貯留する注射用水タンクと、前記注射用水タンクに備えられている前記注射用水を所定の使用場所へ送出する送出ラインと、前記注射用水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、上記検出装置と、を備えることが好ましい。
図３は、本開示に係る注射用水製造設備８００の一例の概略構成を模式図で示すものである。本開示に係る注射用水製造設備８００は、原水９００から精製水９２０を得る精製水製造部６１０と、精製水９２０から注射用水９４０を得る注射用水製造部８１０と、注射用水９４０を加熱した状態で維持して貯留する注射用水タンク８２０と、注射用水タンク８２０に備えられている注射用水９４０を所定の使用場所８５０へ送出する送出ライン８３０と、注射用水９４０から被験対象の試料９６０を採取する試料採取部７００と、前記のエンドトキシン検出装置１００と、を備える。

注射用水製造部８１０では、高分子膜ろ過装置（好ましくは限外ろ過膜装置）８７０により、精製水９２０をろ過することでエンドトキシン５０等の不純物を高度に除去して、注射用水９４０が製造される。なお、高分子膜ろ過装置の代わりに、蒸留器を用いてもよい。

なお、この精製水製造部６００にエンドトキシン検出装置１００が設けられており精製水９２０のエンドトキシン濃度が分かっている場合、それに合わせて注射用水製造部８１０の運転条件を調整してもよい。たとえば、精製水９２０のエンドトキシン濃度が十分に低いと分かっている場合は、そのぶんだけエンドトキシン除去能力を下げて高分子膜ろ過装置の透過水量を上げ、注射用水９４０の生産量を増やしてもよい。

注射用水タンク８２０には、製造した注射用水は熱交換器８８０にて加熱して、注射用水９４０中の細菌等の増殖を防ぎ、清潔な状態を保つために、たとえば６０℃以上、望ましくは７０℃以上の温度状態が維持される。なお、この温度状態を維持しつつ、注射用水９４０の滞留を防ぐために、循環配管を用いてこの注射用水タンク８２０を構成することが望ましい。循環配管には、熱交換器８９０が備えられてもよい。また、注射用水タンク８２０に例えばヒーター等の加熱装置を設置してもよい。

送出ライン８３０は、随時、又は必要に応じて、注射用水タンク８２０に貯留されている注射用水９４０を、所定の使用場所８５０へ送出する。ここでいう所定の使用場所８５０とは、たとえば、注射用水９４０の梱包設備、又は、注射液の製造設備等、注射用水９４０の用途に応じた様々な設備が想定される。

試料採取部７０１は、注射用水製造設備８００において、注射用水製造部８１０の下流側の所定の箇所に設けられる。試料採取部７０１により採取された注射用水９２０は、被験対象の試料９６０として、前記した試料導入部２４０（図２参照）からエンドトキシン検出装置１００に導入される。エンドトキシン検出装置１００の詳細は上述のとおりである。試料採取部７０１が設けられる箇所としては、注射用水製造部８１０より下流側でかつ注射用水タンク８２０より上流側か、注射用水タンク８２０に直接（たとえば、循環配管の途中）か、又は送出ライン８３０の途中かの、いずれに設けてもよい。いずれの場合も、注射用水９４０から採取された被験対象の試料９６０が、上述のエンドトキシン検出方法に供されることになる。

試料採取部７０１を注射用水製造部８１０より下流側でかつ注射用水タンク８２０より上流側に設ける場合、注射用水製造部８１０で製造された直後の注射用水９４０のエンドトキシン濃度が、たとえば日本薬局方に記載の基準（０．２５ＥＵ/ｍL）を満たしているかどうかを、実質的に常時確認することができる。そして、万一この基準を満たしていない場合は、すぐに下流への注射用水９４０の供給を止めることで、その時点で下流の注射用水タンク８２０に貯留されている基準を満たした状態の注射用水９４０へのコンタミネーションを防ぐことができる。なお、実質的に常時とは、たとえば、繰り返し測定時間を３０分以内、好ましくは１０分以内とする測定をいう。下流側の装置の保有水量及び装置の造水量を考慮すると、これらの頻度で測定を繰り返すことにより、トラブルによる水質悪化によるコンタミネーションにより、注射用水の製造を止めることなく運転できる。

試料採取部７０１を注射用水タンク８２０に直接設ける場合、循環貯留されている注射用水９４０が上記基準を満たしているかどうかを実質的に常時モニターすることができる。そして、たとえば上記基準を満たしていることが確認されているときのみ注射用水９４０を送出ライン８３０に供給し、万一上記基準を満たしていないときは図示していない返送ラインを用いて注射用水９４０を注射用水製造部８１０の上流側に戻し、注射用水製造部８１０で再処理するようにしてもよい。

本開示に係る検出装置の一例であるエンドトキシン検出装置１００は、十分な測定精度があるため、実質的に常時モニターすることにより、前段の装置の不具合だけでなく、不具合の予兆も確認できる。たとえば、製造される注射用水９４０のエンドトキシン測定値が、エンドトキシンの基準値を満たすものの、わずかな上昇傾向を示した場合、これは前段の装置の性能悪化の予兆であることも多く、これをそのまま放置すると、製造される注射用水９４０がエンドトキシンの基準値を満たさなくなる場合もある。すなわち、注射用水製造装置の不具合を事前に検出する事で、トラブルを回避することが可能である。たとえば、前段の装置の運転条件の変更、メンテナンス等を行うことにより対応可能である。

試料採取部７０１を送出ライン８３０に設ける場合、実際に使用される時点での注射用水９４０のエンドトキシン濃度を直接モニターすることができる。また、たとえば、使用場所８５０の直前にタンクを設置し、タンク内に注射用水を貯留して、これを使用場所８５０に供給し、タンクが空になったら再度注射用水を貯留するというバッチ式の使用も考えられる。そして、タンク内の注射用水のエンドトキシン濃度をエンドトキシン検出装置１００でバッチ毎に確認することで、エンドトキシン濃度が管理基準を満たす注射用水の使用を保証することができる。

以上述べた、３箇所はいずれも試料採取部７００を設置する利点がありいずれも好ましい設置箇所であるが、注射用水９４０のエンドトキシン５０汚染を最も早期に検出できる点で、注射用水製造部８１０より下流側でかつ注射用水タンク８２０より上流側に設けるのが最も好ましい。また、可能であれば３箇所のうち２箇所以上に試料採取部７００を設置することとしてもよい。

上記の構成により、本開示の注射用水製造設備８００では、製造された注射用水９４０から随時試料９６０を採取して、エンドトキシン検出装置１００によりリアルタイムでエンドトキシン５０を検出することが可能となる。そして、エンドトキシン５０の濃度が所定の基準値を超えた場合には、即時に注射用水製造設備８００を停止して、部品交換又は修理等の適切な処置を講じることができる。これにより、要求水質の注射用水９４０を安定的に製造できるようになる。

また、本開示の注射用水製造設備８００では、試料９６０となる注射用水９４０の不純物濃度は十分に小さくなっており、他の不純物による影響が最小限にすることができるため、特にエンドトキシン濃度を精度よく測定することができる。また、試料９６０となる注射用水９４０の粘性は十分に低いため、特にキャリア溶液等で希釈する必要がなく、エンドトキシン検出装置１００へ直接送液することができる。これにより、キャリア溶液が不要となり、試料９６０を不必要にキャリアで希釈することがなくなるという利点もある。

なお、試料採取部７０１で採取される試料９６０は加熱された状態で採取されることになる。このような高温の試料９６０は、エンドトキシン検出装置１００に供給される前に、熱交換器等で常温に冷却することが好ましい。

（精製水製造方法）
本開示に係る精製水製造方法は、原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得る工程と、上記本開示に係る被験物質の検出方法を用いて、前記精製水から採取された被験対象の試料を測定する測定工程と、を含むことが好ましい。

（注射用水製造方法）
原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得る工程と、前記精製水の高分子膜ろ過によるろ過により、又は、前記精製水の蒸留により、前記精製水から注射用水を得る工程と、上記本開示に係る被験物質の検出方法を用いて、前記注射用水から採取された前記被験対象の試料を測定する測定工程と、
を含むことが好ましい。

本開示に係る製造水製造方法及び注射水製造方法において、上記測定工程に用いる検出方法の好ましい態様は、上記本開示に係る検出方法における好ましい態様と同様である。
本開示に係る製造水製造方法及び注射水製造方法において、高感度に被験物質を検出可能な観点から、前記測定工程としては、上記測定装置を用いて、前記精製水から採取された被験対象の試料を測定する測定工程を含むことが更に好ましい。

（検出試薬組成物）
本開示に係る検出試薬組成物は、下記式（１）で表される化合物と、界面活性剤と、を含む。

式（１）中、Ａは共役多重結合を含む基である応答部位を表し、Ｌは単結合又は鎖長が原子数１～１０のスペーサを表し、Ｙは有機基である認識部位を表す。

本開示に係る検出試薬組成物に含まれる式（１）で表される化合物は、上述の本開示に係る検出方法に用いられる式（１）で表される化合物と同義であり、好ましい態様も同様である。
本開示に係る検出試薬組成物において、式（１）で表される化合物の含有量としては、組成物の全質量に対して、１×１０^－５質量％～１×１０^－１質量％であることが好ましく、１×１０^－４質量％～１×１０^－２質量％であることがより好ましい。
本開示に係る検出試薬組成物は、式（１）で表される化合物を１種単独で含んでいてもよいし、２種以上を含んでいてもよい。

本開示に係る検出試薬組成物に含まれる界面活性剤は、上述の本開示に係る検出方法に用いられる界面活性剤と同義であり、好ましい態様も同様である。
本開示に係る検出試薬組成物において、界面活性剤の含有量としては、臨界ミセル濃度の０．５倍～１，０００倍であることが好ましく、１倍～１００倍であることがより好ましい。もしくは組成物の全質量に対して、１×１０^－５質量％～４０質量％であることが好ましく、１×１０^－３質量％～２質量％であることがより好ましい。

本開示に係る検出試薬組成物は、上記式（１）で表される化合物及び界面活性剤以外の成分（その他の成分）を更に含んでいてもよい。
その他の成分としては、安定化剤、緩衝液剤、イオン強度調整剤等が挙げられる。

また、本開示に係る検出試薬組成物は、上記の検出装置に好適に用いることができ、被験物質を高感度に検出可能な観点から、精製水製造設備又は注射水製造設備に用いる検出装置にも好適に用いることができる。本開示に係る検出試薬組成物は、被験物質を高感度に検出可能な観点から、アルカリ金属、遷移金属、界面活性剤、細菌、リン脂質又は糖脂質の検出に用いることが好ましく、エンドトキシンの検出に用いることがより好ましい。

以下、本開示を実施例により具体的に説明する。なお、本開示は、これらの実施例により何ら限定されるものではない。
（実施例１）Ｃｕ^２＋－ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙ／ＤＤＡＢによるエンドトキシンの測定
ｄｐａ－ＨＣＣを用いてエンドトキシンの測定を試みた。実験方法は以下のとおりとした。

測定サンプルとして、エンドトキシン濃度が０．０ＥＵ／ｍＬ～１００ＥＵ／ｍＬになるように、下記の成分を混合して１０ｍＬメスフラスコで調製し、測定サンプルを得た。
＜測定サンプルの組成＞
・式（１）で表される化合物（特定化合物）
ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙ：０．０１ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ、以下同じ）
・界面活性剤
ＤＤＡＢ：０．１ｍＭ（ドデシルジメチルアンモニウムブロミド、カチオン性界面活性剤 ＨＬＢ：１８．１）（超音波処理(条件：周波数２０ｋＨｚ、処理時間：３分、装置：型番２５０、ＢＲＡＮＳＯＮ社製)してベシクル化したもの。）なお、測定サンプルをＴＥＭ（倍率：４０，０００倍、加速電圧：７５．０ｋＶ、装置：型番Ｈ－７１００、日立製作所製）で観察したところ、ベシクルが形成されている様子が確認された。
・金属化合物（金属イオン）
Ｃｕ（ＮＯ_３）_２：０．０１ｍＭ
・ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）：５．０ｍＭ
・被験物質
エンドトキシン標準液（型番：２９３－１６５４１（Ｅ．Ｃｏｌｉ ＵＫＴＢ株由来）、富士フイルム和光純薬（株）製）：０．０ＥＵ／ｍＬ、１０．０ＥＵ／ｍＬ１００．０ＥＵ／ｍＬ

上記で調製したエンドトキシン濃度を０ＥＵ／ｍＬ、１０ＥＵ／ｍＬ、及び、１００ＥＵ／ｍＬに変化させた各サンプルをそれぞれ、光路長１ｃｍの石英セルに取り、蛍光分光光度計（型番：Ｆ－７０００、（株）日立ハイテクサイエンス製）で蛍光スペクトルを測定した。測定条件は以下のとおりとした。
励起波長：３５０ｎｍ
開始波長：３６０ｎｍ
終了波長：６４０ｎｍ

本測定条件により、いずれのサンプルの測定も５分以内に終えることができた。

エンドトキシン濃度を０ＥＵ／ｍＬ、１０ＥＵ／ｍＬ、及び、１００ＥＵ／ｍＬに変化させた各サンプルの蛍光スペクトルは、図４に示すとおりである。図４の縦軸は蛍光強度を、横軸は波長（ｎｍ）をそれぞれ示す。
エンドトキシン濃度を０ＥＵ／ｍＬ～１００ＥＵ／ｍＬに変化させた各サンプルはいずれも波長３７７ｎｍで蛍光強度のピークを示した。エンドトキシン濃度に比例して、波長３７７ｎｍで蛍光強度のピーク強度が高いことが分かる。

また、各エンドトキシン濃度に対する波長３７７ｎｍにおける蛍光強度の検量線を作成した（図５）。図５に示されるとおり、波長３７７ｎｍでは、エンドトキシンの濃度が０．１ＥＵ／ｍＬ～２０ＥＵ／ｍＬの場合であっても検出可能であることが分かる。

＜＜ｄｐａ－Ｃ４ＰｙとＤＤＡＢの濃度との関係＞＞
０Ｍ～１０×１０^－５Ｍ濃度の界面活性剤：ＤＤＡＢと、ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙと、エンドトキシン（１００ＥＵ／ｍＬ）とを含むサンプルを調製し、室温（２５℃、以下同じ）における蛍光強度を測定した。また、比較対照として、エンドトキシンを含まないサンプル（０Ｍ～１０×１０^－５Ｍ濃度の界面活性剤：ＤＤＡＢ及びｄｐａ－Ｃ４Ｐｙを含むサンプル）を調整し、室温における蛍光強度を測定した。その結果を図６に示す。

図６より、ＤＤＡＢ濃度が２×１０^－５Ｍ～４×１０^－５Ｍの場合とＤＤＡＢ濃度が０の場合を比較すると、エンドトキシンが存在すると蛍光強度が３～３５倍となっていた。また、ＤＤＡＢ濃度が４×１０^－５Ｍ～１０×１０^－５Ｍの場合とＤＤＡＢ濃度が０の場合を比較すると、エンドトキシンが存在すると蛍光強度が３５倍～９０倍となっていた。また、ＤＤＡＢ濃度が１０×１０^－５Ｍ以上の場合(１０×１０^－５Ｍを超える場合は図示はしていない)とＤＤＡＢ濃度が０の場合を比較すると、エンドトキシンが存在すると蛍光強度が９０～３００倍となっていた。
ＤＤＡＢが臨界ミセル濃度（４×１０^－５Ｍ）以上で、エンドトキシンを含むサンプルにおいて、顕著に蛍光強度が増大したことが分かる。
なお、ＤＤＡＢ濃度が１０×１０^－５Ｍの場合と、ＤＤＡＢ濃度０の場合の蛍光強度の比は後述の表１に示した。

（実施例２）Ｚｎ^２＋－ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙ／ＤＤＡＢによるエンドトキシンの測定
実施例１において、Ｃｕ（ＮＯ_３）_２をＺｎ（ＮＯ_３）_２に変更し、エンドトキシンの濃度を１００ＥＵ／ｍＬに変更した以外は実施例１と同様にして測定サンプルを調製し、同様の測定条件で蛍光強度を測定した。その結果を図７に示す。
図７の縦軸は蛍光強度を、横軸は波長（ｎｍ）をそれぞれ示す。図７において、エンドトキシンを含むサンプルでは、波長３７７ｎｍにおける蛍光強度が増大することが分かる。

（実施例３）Ｃｕ^２＋－ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙ／ＣＴＡＢによるエンドトキシンの測定
実施例１において、界面活性剤をＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム：ＨＬＢ１０、カチオン性界面活性剤）：２．０×１０^－２Ｍに変更した以外は、実施例１と同様にしてエンドトキシン濃度を０ＥＵ／ｍＬ～１００ＥＵ／ｍＬに変化させた測定サンプルを調製した。エンドトキシン濃度を０ＥＵ／ｍＬ、１０ＥＵ／ｍＬ、及び、１００ＥＵ／ｍＬに変化させた各サンプルの蛍光スペクトルは、図８に示すとおりである。

また、各エンドトキシン濃度に対する波長３７７ｎｍにおける蛍光強度の検量線を作成した（図９）。図９に示されるとおり、エンドトキシンの濃度が０．１ＥＵ／ｍＬ～２０ＥＵ／ｍＬの場合であっても検出可能であることが分かる。

＜＜ｄｐａ－Ｃ４ＰｙとＣＴＡＢの濃度との関係＞＞
また、０ｍＭ～２ｍＭ濃度の界面活性剤：ＣＴＡＢと、ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙと、エンドトキシン（１００ＥＵ／ｍＬ）と、を含むサンプルを調製し、室温における蛍光強度を測定した。また、比較対照として、エンドトキシンを含まないサンプル（０ｍＭ～２ｍＭ濃度の各界面活性剤：ＣＴＡＢ及びｄｐａ－Ｃ４Ｐｙを含むサンプル）を調整し、室温における蛍光強度を測定した。その結果を図１０に示す。図１０の縦軸は蛍光強度を、横軸は界面活性剤の濃度（ｍＭ）をそれぞれ示す。
ＣＴＡＢが臨界ミセル濃度（１ｍＭ）以上で、エンドトキシンを含むサンプルにおいて、顕著に蛍光強度が増大したことが分かる。
図１０より、界面活性剤濃度２．０×１０^－２Ｍの場合の蛍光強度と０ｍＭの場合の蛍光強度を比較した結果を表１に示す。

（実施例４）Ｚｎ^２＋－ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙ／ＤＯＰＣによるエンドトキシンの測定
実施例１において、Ｃｕ（ＮＯ_３）_２をＺｎ（ＮＯ_３）_２に変更し、界面活性剤の種類をＤＯＰＣ（１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＨＬＢ：７．２、両性界面活性剤）に変更した以外は実施例１と同様にして測定サンプルを調製し、同様の条件で蛍光強度を測定した。
界面活性剤濃度が１０×１０^－５Ｍの場合の蛍光強度と、０ｍＭの場合の蛍光強度を比較した結果を表１に示す。

（実施例５）Ｃｕ^２＋－ｄｐａ－ａｚｏ／ＰＳによるラウリルリン酸の測定
実施例１において、特定化合物をｄｐａ－ａｚｏ、界面活性剤の種類をＰＳ（ポリソルベイト、関東化学（株）製、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンＨＬＢ：１５、非イオン性界面活性剤）に変更し、被験物質をラウリルリン酸（濃度０．０１ｍＭ）に変更した以外は実施例１と同様にして測定サンプルを調製し、同様の条件で蛍光強度を測定した。
界面活性剤濃度が２．０×１０^－２Ｍの場合の蛍光強度と、０ｍＭの場合の蛍光強度を比較した結果を表１に示す。

（実施例６）Ｃｕ^２＋－ｄｐａ－Ｃ６Ｐｙ／ＤＯＰＣによるホスファチジルコリンの測定
実施例１において、特定化合物をｄｐａ－Ｃ６Ｐｙ、界面活性剤の種類をＤＯＰＣ（１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＨＬＢ：７．２、両性界面活性剤）に変更し、被験物質をホスファチジルコリン（濃度０．０１ｍＭ）に変更した以外は実施例１と同様にして測定サンプルを調製し、同様の条件で蛍光強度を測定した。
界面活性剤濃度が１０×１０^－５Ｍの場合の蛍光強度と、０ｍＭの場合の蛍光強度を比較した結果を表１に示す。

（実施例７）Ｃｕ^２＋－Ｃ４－ＡＰＢ／ＣＴＡＢによるガラクト脂質の測定
実施例１において、特定化合物をｄｐａ－ＡＰＢ、界面活性剤の種類をＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム、ＨＬＢ１０、カチオン性界面活性剤）に変更し、被験物質をガラクト脂質（濃度０．０１ｍＭ）に変更した以外は実施例１と同様にして測定サンプルを調製し、同様の条件で蛍光強度を測定した。
界面活性剤濃度が２．０×１０^－２Ｍの場合の蛍光強度と、０ｍＭの場合の蛍光強度を比較した結果を表１に示す。

（実施例８）Ｃｕ^２＋－ｄｐａ－Ｃ６Ｐｙ／ＣＴＡＢによる大腸菌の測定
実施例１において、特定化合物をｄｐａ－Ｃ６Ｐｙ、界面活性剤の種類をＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム、ＨＬＢ１０、カチオン性界面活性剤）に変更し、被験物質を大腸菌（菌株名：Ｋ１２Ｗ３１１０、濃度：１００ＣＦＵ／ｍＬ）に変更した以外は実施例１と同様にして測定サンプルを調製し、同様の条件で蛍光強度を測定した。
界面活性剤濃度が２．０×１０^－２Ｍの場合の蛍光強度と、０ｍＭの場合の蛍光強度を比較した結果を表１に示す。

（比較例１）Ｃｕ^２＋－ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙによるエンドトキシンの測定
実施例１において、界面活性剤を含まず、エンドトキシンの濃度を１００ＥＵ／ｍＬとした以外は実施例１と同様にして測定サンプルを調製した。比較対照として、上記組成において、エンドトキシンを含まない比較対照サンプル及び上記組成においてエンドトキシンと金属錯体を含まない比較対照サンプルをそれぞれ調製した。
測定サンプル及び比較対照サンプルをそれぞれ、実施例１と同様の方法により蛍光強度をそれぞれ測定した。
界面活性剤を含まない比較例１の測定では、エンドトキシンを含む場合でも蛍光強度の変化がほとんど確認できなかった。

（比較例２）Ｚｎ^２＋－ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙによるエンドトキシンの測定
比較例１において、Ｃｕ（ＮＯ_３）_２をＺｎ（ＮＯ_３）_２に変更した以外は、比較例１と同様に測定サンプル及び比較対照サンプルを調製し、実施例１と同様の方法で蛍光強度をそれぞれ測定した。 界面活性剤を含まない比較例１の測定では、エンドトキシンを含む場合でも蛍光強度の変化が確認できなかった。

＜ＦＩＡによるエンドトキシンの定量性＞
前記図２に示すような、ＦＩＡ（フローインジェクション分析法）を利用したエンドトキシン検出装置によるエンドトキシンの定量性を検証した。具体的な検証方法は以下のとおりである。

キャリアには超純水を使用した。蛍光物質としてはｄｐａ－Ｃ４Ｐｙを使用し、試薬は以下の組成で調製したのち、ｐＨを７．４に調整した。
ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙ：０．０２ｍＭ
ＤＤＡＢ：０．２ｍＭ
ＮａＣｌ：２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ：１０ｍＭ
Ｃｕ（ＮＯ_３）_２：０．０２ｍＭ

被験対象としてのエンドトキシンを含有する試料として、標準エンドトキシンを、０．２ＥＵ／ｍＬ、２ＥＵ／ｍＬ、２０ＥＵ／ｍＬ及び２００ＥＵ／ｍＬに希釈した水溶液を調整した。この試料を、試料導入部よりシリンジでキャリアへ添加した。

測定条件は以下のとおりとした。
キャリア流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
試薬流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
励起波長：３５０ｎｍ
蛍光波長：３７７ｎｍ

いずれのエンドトキシン濃度の試料でも、試料の添加から４０秒で蛍光強度がピークとなった。この結果から、ＦＩＡを利用したエンドトキシン検出装置によって、経時的なエンドトキシン濃度の測定が可能となることが推察された。また、試料サンプルを３分以内と迅速にオンラインで測ることが可能となった。すなわち、本実施例で用いたエンドトキシン濃度０．２ＥＵ／ｍＬ～２００ＥＵ／ｍＬの試料は、本実施例で選択した測定条件によって測定可能であることが確認できた。

また、純水製造設備及び注射水製造設備において上記検出装置を用いたところ、注射用水のエンドトキシンの管理基準である０．２５ＥＵ／ｍＬ未満を予防的に管理するのに十分なエンドトキシン濃度である０．０１ＥＵ／ｍＬ～１０ＥＵ／ｍＬを定量可能であることが確認された。また、本開示に係る精製水製造方法及び注射水製造方法においても、同様に、エンドトキシン濃度０．０１ＥＵ／ｍＬ～１０ＥＵ／ｍＬを定量可能であることが確認された。
以上の結果より、界面活性剤の添加の有無による光学強度の増加倍率をまとめると表１のようになる。光学強度の増加倍率が大きいほど、被験物質を高感度に検出可能であるといえる。

以上の結果から、本開示に係る検出方法及び本開示に係る検出試薬組成物である実施例１～８では、比較例１及び２に比べて、被験物質を概ね１０倍～１７０倍高感度に検出可能であることが分かる。

１０ 蛍光物質 ２０ 蛍光部位 ３０ Ｌ(単結合又はスペーサ)
４０ 認識部位 ５０ エンドトキシン ５１ 特定部位
１００ エンドトキシン検出装置
２００ 試料導入部 ２１０ キャリア貯留槽 ２２０ キャリア送液ポンプ
２３０ キャリア送液路 ２４０ 試料導入部
３００ 供給部 ３１０ 試薬貯留槽 ３２０ 試薬送液ポンプ
３３０ 試薬送液路 ３４０ 混合部
４００ 反応部
５００ 検出部
６００ 精製水製造設備 ６１０逆浸透膜装置（ＲＯ）
６２０ 電気脱塩装置(ＥＤＩ) ６３０ 限外ろ過装置(ＵＦ)
７００ 試料採取部 ７０１試料採取部 ７８０ 使用場所(注射用水)
８００ 注射用水製造設備 ８１０ 注射用水(ＷＦＩ)製造装置
８２０ 注射用水タンク ８３０ 送出ライン ８５０ 使用場所
８６０ タンク
８７０ 限外ろ過装置(ＵＦ)
８８０、８９０ 熱交換器
９００ 原水 ９２０ 精製水 ９４０ 注射用水９６０ 試料

Claims (27)

1. 被験物質及び水を含む検体、応答部位と認識部位とを有する構造を有する化合物並びに界面活性剤を混合する工程Ａと、
   前記認識部位と前記被験物質とが相互作用し、前記相互作用によって生じた前記応答部位における応答を検出する工程Ｂと、を含む
   被験物質の検出方法。
2. 前記化合物が、前記応答部位と認識部位とがスペーサを介して連結されている構造を有する、請求項１記載の被験物質の検出方法。
3. 前記化合物は、下記式（１）で表される化合物である、請求項１又は請求項２に記載の被験物質の検出方法。
   

   

   
   式（１）中、Ａは共役多重結合を含む基である応答部位を表し、Ｌは単結合又は鎖長が原子数１～１０のスペーサを表し、Ｙは被験物質と相互作用する基である認識部位を表す。
4. 前記Ｌは、線状の飽和アルキル鎖である、請求項３に記載の被験物質の検出方法。
5. 前記式（１）におけるＹが、金属配位性基、又は酸基を含む基である、請求項３又は請求項４に記載の被験物質の検出方法。
6. 前記金属配位性基又は酸基を含む基が、下記式（Ｙ１）又は式（Ｙ２）で表される基である、請求項５に記載の被験物質の検出方法。
   

   

   
   前記式（Ｙ１）及び式（Ｙ２）中、波線は前記式（１）中のＬとの連結部位を表し、式（Ｙ２）中、Ｍ^ｎ＋は金属イオンを表し、ｎは自然数を表す。
7. 前記金属イオンは、銅イオン（Ｃｕ^２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）又はコバルトイオン（Ｃｏ^２＋）である、請求項６に記載の被験物質の検出方法。
8. 前記界面活性剤のＨＬＢ値が、６～４０である、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の被験物質の検出方法。
9. 前記界面活性剤が、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤である、請求項１～請求項８のいずれか１項に記載の被験物質の検出方法。
10. 前記化合物が、前記界面活性剤と分子集合体を形成可能な化合物である、請求項１～請求項９のいずれか１項に記載の被験物質の検出方法。
11. 前記被験物質が、リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方を含む、請求項１～請求項１０のいずれか１項に記載の被験物質の検出方法。
12. 前記被験物質が、エンドトキシンであり、
    前記化合物が、下記式（１Ａ）又はＣ４－ＡＰＢで表される化合物である、請求項１～請求項１１のいずれか１項に記載の被験物質の検出方法。
    

    

    
    前記式（１Ａ）中、ｍは０～６を表し、Ｍ^ｎ＋は金属イオンを表し、ｎは自然数を表す。
13. 下記式（１）で表される化合物と、
    界面活性剤と、
    を含む、検出試薬組成物。
    

    

    
    式（１）中、Ａは共役多重結合を含む基である応答部位を表し、Ｌは単結合又は鎖長が原子数１～１０のスペーサを表し、Ｙは有機基である認識部位を表す。
14. 前記Ｌは、線状の飽和アルキル鎖である、請求項１３に記載の検出試薬組成物。
15. 前記式（１）におけるＹが、金属配位性基又は酸基を含む基である、請求項１３又は請求項１４に記載の検出試薬組成物。
16. 前記金属配位性基又は酸基を含む基が、下記式（Ｙ１）又は式（Ｙ２）で表される基である、請求項１５に記載の検出試薬組成物。
    

    

    
    前記式（Ｙ１）及び式（Ｙ２）中、波線は前記式（１）中のＬとの連結部位を表し、式（Ｙ２）中、Ｍ^ｎ＋は金属イオンを表し、ｎは自然数を表す。
17. 前記金属イオンは、銅イオン（Ｃｕ^２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）又はコバルトイオン（Ｃｏ^２＋）である、請求項１６に記載の検出試薬組成物。
18. 前記界面活性剤のＨＬＢ値が、６～４０である、請求項１３～請求項１７のいずれか１項に記載の検出試薬組成物。
19. 前記界面活性剤が、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤である、請求項１３～請求項１８のいずれか１項に記載の検出試薬組成物。
20. 被験物質及び水を含む検体が導入される試料導入部と、
    請求項１３～請求項１９のいずれか１項に記載の検出試薬組成物を前記検体に供給する供給部と、
    前記検体と前記検出試薬組成物とが反応する反応部と、
    前記反応を検出する検出部と、
    を備える、検出装置。
21. 原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、
    前記精製水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、
    請求項２０に記載の検出装置と、
    を備える精製水製造設備。
22. 原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、
    前記精製水をろ過する高分子膜ろ過装置又は前記精製水を蒸留する蒸留器により前記精製水から注射用水を得る注射用水製造部と、
    前記注射用水を加熱した状態で維持して貯留する注射用水タンクと、
    前記注射用水タンクに備えられている前記注射用水を所定の使用場所へ送出する送出ラインと、
    前記注射用水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、
    請求項２０に記載の検出装置と、
    を備える注射用水製造設備。
23. 前記試料採取部は、前記注射用水製造部より下流側でかつ前記注射用水タンクより上流側において、前記注射用水タンクから直接、又は、前記送出ラインから、前記試料を採取する、請求項２２に記載の注射用水製造設備。
24. 原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得る工程と、
    請求項１～請求項１２のいずれか１項に記載の検出方法を用いて、前記精製水から採取された被験対象の試料を測定する測定工程と、
    を含む、精製水製造方法。
25. 前記測定工程は、請求項２０に記載の検出装置を用いて、前記精製水から採取された被験対象の試料を測定する測定工程を含む、請求項２４に記載の精製水製造方法。
26. 原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得る工程と、
    前記精製水の高分子膜ろ過によるろ過により、又は、前記精製水の蒸留により、前記精製水から注射用水を得る工程と、
    請求項１～請求項１２のいずれか１項に記載の検出方法を用いて、前記注射用水から採取された前記被験対象の試料を測定する測定工程と、
    を含む、注射用水製造方法。
27. 前記測定工程は、請求項２０に記載の検出装置を用いて、前記精製水から採取された被験対象の試料を測定する測定工程を含む、請求項２５に記載の注射用水製造方法。

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