KR20230154033A - 피험물질의 검출 방법, 검출 시약 조성물, 검출 장치, 정제수 제조 설비, 주사용수 제조 설비, 정제수 제조 방법 및 주사용수 제조 방법 - Google Patents

피험물질의 검출 방법, 검출 시약 조성물, 검출 장치, 정제수 제조 설비, 주사용수 제조 설비, 정제수 제조 방법 및 주사용수 제조 방법 Download PDF

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마사미츠 이야마
유 에비사와
타케시 하시모토
타카시 하야시타
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노무라마이크로사이엔스가부시키가이샤
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Abstract

피험물질의 검출방법은 피험물질 및 물을 포함하는 검체, 반응 부위와 인식 부위가 스페이서를 통해 연결된 구조를 갖는 화합물 및 계면활성제를 첨가하는 공정 A와, 상기의 인식 부위와 상기의 피험물질이 상호작용하고 상기의 상호작용에 의해 발생하는 상기의 반응 부위에서의 반응을 검출하는 공정 B를 포함한다. 더욱이, 이것을 이용한 정제수 제조 방법 및 주사용수 제조 방법, 및 식 (1)로 표시되는 화합물과 계면활성제를 포함하는 검출 시약 조성물, 이것을 이용한 검출 장치, 정제수 제조 설비 및 주사용수 제조 설비도 제공된다.

Description

피험물질의 검출 방법, 검출 시약 조성물, 검출 장치, 정제수 제조 설비, 주사용수 제조 설비, 정제수 제조 방법 및 주사용수 제조 방법
본 개시는 피험물질의 검출 방법, 검출 시약 조성물, 검출 장치, 정제수 제조 설비, 주사용수 제조 설비, 정제수 제조 방법 및 주사용수 제조 방법에 관한 것이다.
식품, 물, 토양, 혈액 등에 포함되는 미량 성분을 검출하는 방법은 많이 알려져 있고, 검출 대상에 적합한 검출 방법이 종래부터 검토되고 있다.
미량 성분으로는, 예컨대, 발열성 물질(엔도톡신) 등이 알려졌고, 주사용수(WFI, Water for Injection)의 제조에는, 정제수를 멸균한 멸균 정제수에 대하여 소정의 엔도톡신 시험을 행하고 있다.
또, 정제수란, 상수를 증류, 이온 교환 수지탑 또는 전기식 탈염 장치(EDI) 등에 의한 이온 교환, 역침투 혹은 한외 여과(ultrafiltration), 자외선 조사 장치(UV) 또는 이들의 조합에 의해 정제했으므로, 제제의 원료뿐만 아니라, 시약의 조제 등에도 사용되고 있다.
WFI 제조 설비로서, 예컨대, 일본 특허 공개 제2019-025456호 공보에는, 원수(raw water)를 역삼투막 처리와 이온 교환 처리의 조합에 의해 처리하여 얻어지는 처리 대상수를 여과하는 고분자막 여과 장치와, 고분자막 여과 장치의 투과수 내의 미립자 수를 측정하는 미립자 측정 장치를 구비하는 것을 특징으로 하는 주사용수의 제조 장치가 기재되어 있다.
엔도톡신이란, 그램 음성균(gram-negative bacteria)의 세포벽 성분인 리포 다당이며, 생활환경에 편재하는 대표적인 발열 물질이다. 엔도톡신이 혈액 내로 들어가면, 발열, 패혈증성 쇼크, 다발성 장기부전, 빈맥(tachycardia) 등의 작용이 일어나기 때문에, 의약품이나 의료기기, 특히, 생체 내에 직접 도입되는 액체나 제약용수, 주사기, 인공 장기, 투석막 등의 의료기기의 제조에 있어서는, 엄중한 관리가 필요하다. 예컨대, 「일본 약전(JP17) 품질 적합 시험」의 주사용수의 관리 기준에서는, 0.25 EU/mL 미만으로 규정되어 있다.
엔도톡신의 검출 방법으로는, 예컨대, 일본 특허 공개 제2016-151482호 공보 및 일본 특허 공개 제2007-093378호 공보에 기재된 전기화학적 방법에 의한 엔도톡신의 검출이 개시되어 있다.
검체 내의 미량 성분을 검출하는 방법은 많이 알려졌지만, 어느 방법도 다량의 시료가 필요하거나, 방해 물질의 존재로 인해 측정할 수 없게 되거나 하는 등의 문제점이 있는 경우가 있어, 추가 개발이 요구되고 있다.
WFI의 제조에는, 정제수 제조 설비에서 제조된 정제수로부터, 증류기 또는 고분자막 여과 장치(바람직하게는 한외 여과막 장치)와 같은 엔도톡신 제거 설비에 의해 엔도톡신을 고도로 제거하는 것이 요구된다.
엔도톡신 제거 설비에서, 엔도톡신 제거 능력에 이상이 발생하면, WFI 내의 엔도톡신 농도가 용이하게 증대하여, 주사액의 제조에는 부적합한 것으로 된다. 특히, 최근에는 에너지 소비량을 절감하기 위해, 이와 같은 설비로서 종래의 증류기를 대신하여 고분자막 여과 장치를 채용하는 경향이 강해지고 있다. 그러나, 고분자막 여과 장치에서는 고분자막으로 수지 재료를 사용하고 있기 때문에, 예컨대, 가열 살균을 행할 때마다 수지 재료가 열화할 우려가 있다. 이러한 우려가 엔도톡신 제거 설비에 고분자막 여과 장치를 채용하는 것을 방해하는 요인으로 되었다.
따라서, 안정적으로 요구 수질의 WFI를 제조하기 위해서는, 예컨대, 엔도톡신 제거 능력의 변화를 감시하고, 엔도톡신 제거 설비에서 이상이 발생하기 전에 고분자막 등의 부품을 즉시 교환 또는 수리하는 등의 유지보수를 행할 필요가 있다. 그러나, 엔도톡신 제거 능력의 변화를 신속하게 검출할 수 있는 방법은 아직 실현되지 않았다.
엔도톡신의 검출은 투구게의 혈구 성분이 엔도톡신에 의해 응고되는 것을 이용한 리물루스 시험에서 행해지고 있다. 리물루스 시험에서는, 투구게의 혈액으로부터 추출된 라이세이트 시약을 사용하여 실시하는 것이 현재는 표준이지만, 시험 결과가 나오는데 1 ~ 2시간을 필요로 한다. 더욱이, 리물루스 시험을 이용한 온라인 측정 장치도 고안되어 있지만, 실용적인 정량 하한을 얻는 것이 어려워, 정량성이나 재현성이 부족하다. 예컨대, 시약 자체가 생물 유래이기 때문에, 그 성능은 시약의 로트에 따라서도 달라지는 경우가 있다. 이 때문에, 보다 신속하게 시험 결과를 얻을 수 있고, 또한 온라인 측정을 실용적인 정밀도로 행할 수 있는 검출 방법이 요망되고 있었다.
또한, 라이세이트 시약을 얻기 위해서는 투구게라는 야생 생물을 포획하여 채혈해야 하기 때문에, 동물 애호의 관점에서도, 투구게의 혈액을 사용하지 않는 대체 수단의 개발이 요망되고 있었다.
또한, 전기화학적 방법에 의한 엔도톡신의 검출은, 특히, 실용적인 정량 하한을 얻기 위해서는, 검출에 이용되는 전극의 제작 기술이나 양산성, 요구되는 유지보수 빈도나 측정의 정밀도, 정량 하한, 신속성 등의 과제가 많아 실용화에는 이르지 못하고 있다.
본 개시의 실시형태가 해결하고자 하는 과제는, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 피험물질의 검출방법 및 이를 이용한 정제수 제조방법 및 주사용수 제조방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 개시의 다른 실시형태가 해결하고자 하는 과제는, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 검출 시약, 이것을 이용한 검출 장치, 정제수 제조 설비 및 주사용수 제조 설비를 제공하는 것이다.
위의 과제를 해결하기 위한 수단으로는, 이하의 양태가 포함된다.
<1> 피험물질 및 물을 포함하는 검체, 반응 부위와 인식 부위를 포함하는 구조를 갖는 화합물 및 계면활성제를 혼합하는 공정 A와,
인식 부위와 피험물질이 상호작용하고, 상기의 상호작용에 의해 발생한 상기의 반응 부위에서의 반응을 검출하는 공정 B를 포함하는
피험물질의 검출 방법.
<2> 상기의 화합물은 상기의 반응 부위와 인식 부위가 스페이서를 통해 연결되어 있는 구조를 갖는, <1>에 기재된 피험물질의 검출 방법.
<3> 상기의 화합물은, 하기 식 (1)로 표시되는 화합물인, <1> 또는 <2>에 기재된 피험물질의 검출 방법.
식 (1)
식 (1) 중, A는 공액 다중 결합을 포함하는 기인 반응 부위를 나타내고, L은 단결합 또는 사슬 길이가 원자수 1 ~ 10인 스페이서를 나타내고, Y는 피험물질과 상호작용하는 기인 인식 부위를 나타낸다.
<5> 상기의 식 (1)에서의 Y는 금속 배위성기, 또는 산기를 포함하는 기인, <3> 또는 <4>에 기재된 피험물질의 검출 방법.
<6> 상기의 금속 배위성기 또는 산기를 포함하는 기는 하기 식 (Y1) 또는 식 (Y2)로 표시되는 기인, <5>에 기재된 피험물질의 검출 방법.
상기의 식 (Y1) 및 식 (Y2) 중, 물결선은 식 (1) 내의 L과의 연결 부위를 나타내고, 식 (Y2) 중, Mn+는 금속 이온을 나타내고, n은 자연수를 나타낸다.
<7> 상기의 금속 이온은 구리 이온(Cu2 +), 니켈 이온(Ni2 +) 또는 코발트 이온(Co2+)인, <6>에 기재된 피험물질의 검출 방법.
<8> 상기의 계면활성제의 HLB값은 6 ~ 40인, <1> ~ <7> 중 어느 하나에 기재된 피험물질의 검출 방법.
<9> 상기의 계면활성제는 양이온성 계면활성제, 양성(兩性) 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제인, <1> ~ <8> 중 어느 하나에 기재된 피험물질의 검출 방법.
<10> 상기의 화합물은 계면활성제와 분자 집합체를 형성할 수 있는 화합물인, <1> ~ <9> 중 어느 하나에 기재된 피험물질의 검출 방법.
<11> 상기의 피험물질은 인지질 및 당지질 중 적어도 하나를 포함하는, <1> ~ <10> 중 어느 하나에 기재된 피험물질의 검출 방법.
<12> 상기의 피험물질은 엔도톡신이고,
상기의 화합물은 하기 식 (1A) 또는 C4-APB로 표시되는 화합물인, <1> ~ <11> 중 어느 하나에 기재된 피험물질의 검출 방법.
상기의 식 (1A) 중, m은 0 ~ 6을 나타내고, Mn+는 금속 이온을 나타내고, n은 자연수를 나타낸다.
<13> 하기 식 (1)로 표시되는 화합물과,
계면활성제
를 포함하는, 검출 시약 조성물.
식 (1)
식 (1) 중, A는 공액 다중 결합을 포함하는 기인 반응 부위를 나타내고, L은 단결합 또는 사슬 길이가 원자수 1 ~ 10인 스페이서를 나타내고, Y는 유기기인 인식 부위를 나타낸다.
<14> 상기의 L은 선 형상의 포화 알킬 사슬인, <13>에 기재된 검출 시약 조성물.
<15> 상기의 식 (1)에서의 Y는 금속 배위성기 또는 산기를 포함하는 기인, <13> 또는 <14>에 기재된 검출 시약 조성물.
<16> 상기의 금속 배위성기 또는 산기를 포함하는 기는 하기 식 (Y1) 또는 식 (Y2)로 표시되는 기인, <15>에 기재된 검출 시약 조성물.
상기의 식 (Y1) 및 식 (Y2) 중, 물결선은 식 (1) 내의 L과의 연결 부위를 나타내고, 식 (Y2) 중, Mn+는 금속 이온을 나타내고, n은 자연수를 나타낸다.
<17> 상기의 금속 이온은 구리 이온(Cu2 +), 니켈 이온(Ni2 +) 또는 코발트 이온(Co2+)인, <16>에 기재된 검출 시약 조성물.
<18> 상기의 계면활성제의 HLB 값은 6 ~ 40인, <13> ~ <17> 중 어느 하나에 기재된 검출 시약 조성물.
<19> 상기의 계면활성제는 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제인, <13> ~ <18> 중 어느 하나에 기재된 검출 시약 조성물.
<20> 피험물질 및 물을 포함하는 검체가 도입되는 시료 도입부와,
<13> ~ <19> 중 어느 하나에 기재된 검출 시약 조성물을 상기의 검체에 공급하는 공급부와,
상기의 검체와 상기의 검출 시약 조성물이 반응하는 반응부와,
상기의 반응을 검출하는 검출부
를 구비하는 검출 장치.
<21> 원수를 역침투 여과하는 역침투막 장치 및 원수를 이온 교환하는 이온 교환 장치 중 적어도 한쪽에 의해 상기의 원수로부터 정제수를 얻는 정제수 제조부와,
상기의 정제수로부터 상기의 피험 대상의 시료를 채취하는 시료 채취부와,
<20>에 기재된 검출 장치
를 구비하는 정제수 제조 설비.
<22> 원수를 역침투 여과하는 역침투막 장치 및 원수를 이온 교환하는 이온 교환 장치 중 적어도 한쪽에 의해 상기의 원수로부터 정제수를 얻는 정제수 제조부와,
상기의 정제수를 여과하는 고분자막 여과 장치 또는 상기의 정제수를 증류하는 증류기에 의해 상기의 정제수로부터 주사용수를 얻는 주사용수 제조부와,
상기의 주사용수를 가열한 상태로 유지하여 저류하는 주사용수 탱크와,
상기의 주사용수 탱크에 구비되어 있는 상기의 주사용수를 소정의 사용 장소로 송출하는 송출 라인과,
상기의 주사용수로부터 상기의 피험 대상의 시료를 채취하는 시료 채취부와,
<20>에 기재된 검출 장치
를 구비하는 주사용수 제조 설비.
<23> 상기의 시료 채취부는 상기의 주사용수 제조부보다 하류측에서 그리고 상기의 주사용수 탱크보다 상류측에서, 상기의 주사용수 탱크로부터 직접, 또는 상기의 송출 라인으로부터 상기의 시료를 채취하는, <22>에 기재된 주사용수 제조 설비.
<24> 원수를 역침투 여과 및 이온 교환 중 적어도 한쪽에 의해 처리하여 정제수를 얻는 공정과,
<1> ~ <12> 중 어느 하나에 기재된 검출 방법을 이용하여, 상기의 정제수로부터 채취된 피험 대상의 시료를 측정하는 측정 공정
을 포함하는 정제수 제조 방법.
<25> 상기의 측정 공정은, <20>에 기재된 검출 장치를 이용하여, 상기의 정제수로부터 채취된 피험 대상의 시료를 측정하는 측정 공정을 포함하는, <24>에 기재된 정제수 제조 방법.
<26> 원수를 역침투 여과 및 이온 교환 중 적어도 한쪽에 의해 처리하여 정제수를 얻는 공정과,
상기의 정제수의 고분자막 여과에 의한 여과에 의해, 또는 상기의 정제수의 증류에 의해 상기의 정제수로부터 주사용수를 얻는 공정과,
<1> ~ <12> 중 어느 하나에 기재된 검출 방법을 이용하여, 상기의 주사용수로부터 채취된 상기의 피험 대상의 시료를 측정하는 측정 공정
을 포함하는 주사용수 제조방법.
<27> 상기의 측정 공정은, <20>에 기재된 검출 장치를 이용하여, 상기의 정제수로부터 채취된 피험 대상의 시료를 측정하는 측정 공정을 포함하는, <25>에 기재된 주사용수 제조 방법.
본 개시에 관한 일 실시형태에 따르면, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 피험물질의 검출 방법, 이를 이용한 정제수 제조 방법 및 주사용수 제조 방법이 제공된다. 또한, 본 개시에 관한 다른 실시형태에 따르면, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 검출 시약, 이것을 이용한 검출 장치, 정제수 제조 설비 및 주사용수 제조 설비가 제공된다.
도 1은 본 개시에 관한 피험물질의 검출 방법에 사용되는 화합물의 일 예의 모식도이다.
도 2는 본 개시에 관한 검출 장치의 일 예의 구성을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 개시에 관한 정제수 제조 설비 및 주사용수 제조 설비의 일 예의 개략 구성을 모식도로 나타낸다.
도 4는 Cu2 +-dpa-C4Py/DDAB에 엔도톡신을 첨가했을 때의 형광 스펙트럼 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 엔도톡신 농도에 대해 파장 377 ㎚에서의 형광 강도의 검량선의 그래프이다.
도 6은 Cu2 +-dpa-C4Py와 엔도톡신을 포함하는 샘플에 각 농도의 계면활성제: DDAB를 첨가했을 때의 형광 강도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 Zn2 +-dpa-C4Py/DDAB에 엔도톡신을 첨가했을 때의 형광 스펙트럼 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 Cu2 +-dpa-C4Py/CTAB에 엔도톡신을 첨가했을 때의 형광 스펙트럼 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 엔도톡신 농도에 대해 파장 377 ㎚에서의 형광 강도의 검량선의 그래프이다.
도 10은 Cu2 +-dpa-C4Py와 엔도톡신을 포함하는 샘플에 각 농도의 계면활성제: CTAB를 첨가했을 때의 형광 강도의 변화를 나타내는 그래프이다.
이하에서, 본 개시에 관한 내용에 대하여 상세하게 설명한다. 이하에 기재하는 구성 요건의 설명은 본 개시에 관한 대표적인 실시형태에 기초하여 이루어질 수 있지만, 본 개시는 이와 같은 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 개시에서, 「 ~ 」를 사용하여 나타낸 수치 범위는, 「 ~ 」의 전후에 기재되는 수치를 각각 최소값 및 최대값으로 포함하는 범위를 의미한다. 본 개시에 단계적으로 기재되어 있는 수치 범위에서, 특정 수치 범위로 기술된 상한값 또는 하한값은 다른 단계적인 기재의 수치 범위의 상한값 또는 하한값으로 치환되어도 좋다. 또한, 본 개시에 기재되어 있는 수치 범위에서, 특정 수치 범위로 기재된 상한값 또는 하한값은 실시예에 나타내고 있는 값으로 치환되어도 좋다.
본 개시에서, 2 이상의 바람직한 양태의 조합은 더욱 바람직한 양태이다.
본 개시에서, 조성물 중의 각 성분의 양은, 조성물 내에 각 성분에 해당하는 물질이 복수 존재하는 경우는, 특별히 언급하지 않는 한, 조성물 내에 존재하는 해당 복수의 물질의 합계량을 의미한다.
본 개시에서, 원수란, 수돗물, 우물물, 하천수, 배수 등이어도 좋고, 또한 정제수 제조 장치 및 주사용수 제조 장치 등의 수처리 장치에 의해 제조된 물이어도 좋고, 이들 수처리 장치에 의해 처리 중인 공정에서의 물이어도 좋다.
본 개시에서, 전체 고형분이란, 조성물의 전체 조성으로부터 용제를 제외한 성분의 총 질량을 말한다. 본 개시에서의 고형분은 25℃의 고형분이다.
본 개시에서, 「공정」이라는 용어에는, 독립적인 공정뿐만 아니라, 다른 공정과 명확하게 구별할 수 없는 경우더라도 공정의 소기의 목적이 달성되면, 본 용어에 포함된다.
(피험물질의 검출 방법)
본 개시에 관한 피험물질의 검출 방법(이하, 단지 「본 개시에 관한 검출 방법」이라고 하는 경우가 있음)은 피험물질 및 물을 포함하는 검체, 상기의 반응 부위와 인식 부위를 포함하는 구조를 갖는 화합물 및 계면활성제를 혼합하는 공정 A와, 상기의 인식 부위와 피험물질이 상호작용하고, 상기의 상호작용에 의해 생성된 상기의 반응 부위에서의 반응을 검출하는 공정 B를 포함한다.
본 개시자들이 예의 검토한 결과, 본 개시에 관한 검출 방법은 상기의 구성을 가지므로, 고감도로 피험물질을 검출할 수 있다는 것을 발견하였다. 상기의 효과가 얻어지는 상세한 메카니즘은 불분명하지만, 이하와 같이 추측된다.
피험물질 및 물을 포함하는 검체에 반응 부위와 인식 부위를 포함하는 구조를 갖는 화합물(이하, 「특정 화합물」이라고도 말하는 경우가 있음) 및 계면활성제를 첨가함으로써, 계면활성제와 특정 화합물이 물을 포함하는 검체 내에서 분자 집합체(예컨대, 미셀(micell), 베시클(vesicle) 등)를 형성하고, 분자 집합체에 피험물질 및 특정 화합물이 취입되거나, 구체적으로는, 예컨대, 구형이나 원통형의 분자 집합체의 표면을 형성하는 계면활성제의 분자층 내에 특정 화합물이 취입되거나, 또는 분자 집합체의 내부에 내포되는 것에 의해 피험물질이 고감도로 검출되는 것으로 추정하고 있다. 분자 집합체에 피험물질 및 특정 화합물이 취입되기 때문에 피험물질이 농축되고, 더욱이 상기의 분자 집합체에서, 특정 화합물의 인식 부위가 피험물질과 안정적으로 상호작용하기 쉬운 위치 관계로 될 수 있으므로, 고감도로 피험물질을 검출하는 것이 가능하다.
또한, 본 개시에 관한 검출 방법은, 상기의 공정을 포함함으로써, 신속하고 용이하게 피험물질을 검출할 수 있다.
피험물질과 계면활성제의 분자 집합체를 선택적으로 형성시킴으로써, 피험물질과 피험물질 이외의 물질의 혼합 상태의 검체(시료)로부터, 선택적으로 피험물질을 검출할 수 있으므로 고감도로 피험물질을 검출하는 것이 가능하다. 본 개시에 관한 검출 방법은, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 물 내에서 분자 집합체를 형성하고 있는 피험물질의 검출에 적합하게 사용할 수 있다.
이하, 본 개시에 관한 검출 방법의 각 공정에 대하여 설명한다.
<공정 A>
본 개시에 관한 검출 방법이 포함하는 공정 A는 피험물질 및 물을 포함하는 검체, 반응 부위와 인식 부위를 포함하는 구조를 갖는 화합물 및 계면활성제를 혼합하는 공정이다.
<<특정 화합물>>
공정 A에 사용되는 특정 화합물은 반응 부위 및 인식 부위를 포함하는 구조를 갖는다.
인식 부위는 피험물질과 상호작용을 일으키는 구조로 되어 있으면, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 피험물질을 고감도로 검출하는 관점에서는, 피험물질의 소정 부위 또는 관능기와 물리적 또는 화학적으로 상호작용하는 구조를 갖는 부위인 것이 바람직하다.
반응 부위는 인식 부위와 피험물질의 상호작용에 반응하는 구조로 되어 있으면 좋고, 예컨대, 인식 부위와 피험물질의 상호작용에 반응하여 발광 또는 발색하는 구조를 들 수 있으며, 피험물질을 보다 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 발광 구조로 되어 있는 것이 바람직하다.
여기서, 「발광」이란, 형광 또는 인광이 발생하는 것을 말한다. 또, 큰 광량을 얻음으로써 피험물질(바람직하게는 엔도톡신)의 검출 감도를 좋게 하는 관점에서는, 형광의 발생이 보다 바람직하다. 반응 부위는 발광 구조를 갖는 구조를 포함하는 것이 바람직하고, 발광 구조로는 공액 다중 결합을 갖는 구조가 바람직하며, 공액 다중 결합을 갖는 구조의 일부는 환상인 것이 바람직하다. 또, 공액 다중 결합의 부위에는 탄소 원자 이외의 원자(복소 원자)가 포함되는 복소 화합물이어도 좋다.
반응 부위와 인식 부위는 직접 결합되어 있어도 좋고, 후술하는 스페이서를 통해 결합되어도 좋지만, 보다 고감도로 피험물질을 검출할 수 있는 점에서, 특정 화합물은 반응 부위와 인식 부위가 스페이서를 통해 연결되어 있는 구조를 갖는 것이 바람직하다.
피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 특정 화합물로는, 하기의 식 (1)로 표시되는 화합물인 것이 바람직하다.
식 (1)
식 (1) 중, A는 공액 다중 결합을 포함하는 기인 반응 부위를 나타내고, L은 단결합 또는 사슬 길이가 원자수 1 ~ 10인 스페이서를 나타내고, Y는 피험물질과 상호작용하는 기인 인식 부위를 나타낸다.
[인식 부위：Y]
Y는 피험물질과 상호작용하는 기인 인식 부위를 나타낸다.
인식 부위는 피험물질의 소정 부위 또는 관능기와 물리적 또는 화학적으로 상호작용하는 기인 것이 바람직하고, 피험물질의 특정 부위와 특이적으로 상호작용하는 기이며, 또한 피험물질을 인식 부위가 인식한 경우에 그 정보(이하, 「인식 정보」라고 함)를 반응 부위로 전달할 수 있는 구조를 갖는 기인 것이 보다 바람직하다.
여기서 말하는 인식 정보란, 예컨대, 인식 부위의 화학 구조 내부에서의 전자의 배위 상태의 변화를 나타낸다.
인식 부위는 피험물질의 특정 부위를 인식하면, 화학 구조 내에서 전자의 배위 상태가 변화한다. 이 전자의 배위 상태의 변화는 인식 정보로서 후술하는 반응 부위에 전달된다. 인식 정보가 전달된 반응 부위에서는 전자의 배위 상태가 변화함으로써, 반응 부위의 발광 강도 또는 발색 강도를 변화(증대 또는 감쇠)시키고, 이것에 의해 인식 부위가 피험물질(바람직하게는 피험물질의 특정 부위)을 인식하고 있는 것이 가시화된다.
본 개시에서, 인식 부위와 피험물질이 상호작용한 경우, 인식 부위가 피험물질을 인식하였다고 추정할 수 있다.
인식 부위와 피험물질의 상호작용의 양태로는, 예컨대, 정전력, 분자간 힘, 공유 결합, 수소 결합 등을 들 수 있다.
Y로는, 금속 배위성기, 산기 또는 염기기를 포함하는 기인 것이 바람직하고, 금속 배위성기 또는 산기인 것이 보다 바람직하다.
금속 배위성기는, 적어도 1종의 금속에 직접 배위하는 기, 또는 금속에의 배위를 촉진하는 기이면 좋다. 상기의 금속으로는, 알칼리 금속, 알칼리토류 금속, 전이 금속 등의 금속 이온(양이온)(Li+, Na+, K+, Mg2 +, Ag+, Ni2 +, Co2 + 또는 Zn2 + 등)을 들 수 있고, 이들 중에서도, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 전이 금속이 바람직하고, 2가의 전이 금속이 보다 바람직하고, 구리 이온(Cu2 +), 니켈 이온(Ni2+) 또는 코발트 이온(Co2 +)이 더욱 바람직하며, Cu2 +가 특히 바람직하다.
또한, 상기의 금속 배위성기로는, 질소 원자, 황 원자 및 산소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 원자를 포함하는 방향족 복소환기, 수산기, 카르복실기, 크라운 에테르기 등을 포함하는 기를 들 수 있다.
방향족 복소환기로는, 질소 원자, 황 원자 및 산소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 원자를 포함하는 복소환기를 들 수 있다. 고감도로 검출할 수 있다는 관점에서, 이들 중에서도 방향족 복소환기로는, 질소 원자 및 산소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 원자를 포함하는 복소환기인 것이 바람직하고, 질소 원자를 포함하는 복소환기인 것이 보다 바람직하고, 환원수 5 또는 6인 질소 원자를 포함하는 복소환인 것이 더욱 바람직하며, 환원수가 5인 질소 원자를 포함하는 복소환인 것이 특히 바람직하다.
질소 원자를 포함하는 복소환으로는, 예컨대, 피롤환, 피리딘환, 피라진환, 피리미딘환 등을 들 수 있다.
또한, 상기의 복소환은 무치환이어도 좋고, 치환기를 갖고 있어도 좋지만, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 치환기를 갖는 복소환인 것이 바람직하다.
치환기로는 알킬기, 아릴기 등을 들 수 있지만, 이들 중에서도 알킬기가 바람직하며, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기가 보다 바람직하다.
피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 치환기를 갖는 복소환 중에서도, 알킬기를 갖는 질소 원자를 포함하는 복소환인 것이 바람직하고, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖고, 또한, 환원수 5 또는 6인 질소 원자를 포함하는 복소환인 것이 보다 바람직하고, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖고, 또한 환원수 5인 질소 원자를 포함하는 복소환인 것이 더욱 바람직하며, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖는 피리딜기인 것이 특히 바람직하다.
금속 배위성기가 방향족 복소환을 포함하는 경우, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 방향족 복소환을 포함하는 기로는, 복소환기로 치환된 치환 아미노기인 것이 바람직하고, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 포함하는 복소환(바람직하게는, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖고, 또한 환원수 5 또는 6인 질소 원자를 포함하는 복소환이며, 보다 바람직하게는, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖고, 또한 환원수 5인 질소 원자를 포함하는 복소환이며, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖는 피리딜기임)으로 치환된 치환 아미노기인 것이 보다 바람직하고, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 포함하는 복소환(바람직하게는 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖고, 또한 환원수 5 또는 6인 질소 원자를 포함하는 복소환이고, 보다 바람직하게는 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖고, 또한 환원수 5인 질소 원자를 포함하는 복소환이며, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖는 피리딜기임)으로 치환된 2치환 아미노기인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 인식 부위(바람직하게는 Y)에서의 금속 배위성기가 방향족 복소환기인 경우, 인식 부위를 구성하는 관능기와, 피험물질(바람직하게는 엔도톡신)의 소정 부위 또는 관능기와 물리적 또는 화학적으로 상호작용하는 복합체를 형성할 수 있는 금속 이온을 첨가하는 것이 바람직하다. 후술하는 반응 부위가 형광을 발광할 수 있는 구조를 포함하는 경우, 예컨대, 반응 부위의 발광 및 소광(消光)의 기구가 광 유기 전자 이동(Photo-induced Electron Transfer, PET)에 의존하는 경우, 이러한 금속 이온으로서 d 궤도가 폐각(closed shell)이 아닌 전이 금속 이온(예컨대, 구리 이온(Cu2 +), 니켈 이온(Ni2 +) 또는 코발트 이온(Co2 +))을 인식 부위에 배위시키는 것이 바람직하다. 특정 금속 이온을 배위시킴으로써, 피험물질(바람직하게는 엔도톡신)이 존재하지 않는 경우에 반응 부위의 형광이 소광되기 때문에, S/N 비와 함께 검출 감도를 높일 수 있다.
또한, 금속 이온에 배위하면 형광의 발광량이 현저하게 증가하므로, 발광량의 감소로서 피험물질(바람직하게는 엔도톡신)을 검출할 수 있는 경우도 있다. 이와 같은 금속 이온으로는, 상술한 금속 배위성기에서의 금속 이온을 들 수 있고, 예컨대, 아연 이온(Zn2 +), 카드뮴 이온(Cd2 +)을 들 수 있다.
산기로는, 예컨대, 설포기, 카르복시기, 인산기, 보론산기, 페놀기, 이들의 염 또는 이들의 탈염 구조로부터 선택되는 기를 들 수 있고, 이들 중에서도, 카르복시기, 보론산, 이들의 염 또는 이들의 탈염 구조로부터 선택되는 기가 바람직하다.
상기의 산기를 포함하는 기로는, 상기의 산기를 포함하는 알킬기, 상기의 산기를 포함하는 아릴기, 또는 상기의 산기를 포함하는 아미노기 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 상기의 산기를 포함하는 아릴기, 또는 상기의 산기를 포함하는 아미노기가 바람직하다.
상기의 산기 이외의 치환기로는 알킬기, 아릴기 등을 들 수 있지만, 이들 중에서도 알킬기가 바람직하고, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기가 보다 바람직하다.
피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 산기를 포함하는 기로는 산기를 포함하는 페닐기 또는 산기를 포함하는 아미노기인 것이 바람직하고, 산기를 포함하는 페닐기 또는 산기를 포함하는 탄소수 1 ~ 4인 알킬기로 치환된 아미노기인 것이 바람직하고, 보론산을 포함하는 페닐기 또는 카르복시기를 포함하는 탄소수 1 ~ 4인 알킬기로 치환된 아미노기인 것이 보다 바람직하고, 보론산을 포함하는 페닐기 또는 카르복시기를 포함하는 탄소수 1 ~ 4인 알킬기로 치환된 2치환의 아미노기인 것이 더욱 바람직하며, 보론산을 포함하는 페닐기 또는 카르복시기를 포함하는 탄소수 1 또는 2의 알킬기로 치환된 2치환의 아미노기인 것이 특히 바람직하다.
카르복시기를 포함하는 탄소수 1 또는 2의 알킬기로 치환된 2치환의 아미노기로는, 예컨대, 이미노디아세트산으로부터 수소 원자를 제외한 1가의 기 등을 들 수 있다.
염기기로는, 예컨대, 아미노기, 질소 원자를 포함하는 방향족환 등을 들 수 있다. 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 염기기로는 아미노기 또는 구아니디노기(guanidino group)인 것이 바람직하다.
금속 배위성기 또는 산기를 포함하는 기로는, 하기 식 (Y1) 또는 식 (Y2)로 표시되는 기인 것이 바람직하다.
상기의 식 (Y1) 및 식 (Y2) 중, 각각 독립적으로, 물결선은 상기의 식 (1) 내의 L과의 연결 부위를 나타내고, Mn+는 금속 이온을 나타내며, n은 자연수를 나타낸다. n으로는 1 ~ 3의 정수인 것이 바람직하다.
금속 이온으로는, 상술한 금속 배위성기에서의 금속 이온과 마찬가지이며, 바람직한 양태도 마찬가지이다.
피험물질과 상호작용하는 기: Y는 피험물질과 상호작용하는 부위이며, 후술하는 피험물질의 종류에 따라 적절하게 설정할 수 있다.
[A]
A는 공액 다중 결합을 포함하는 기인 반응 부위를 나타낸다. 공액 다중 결합을 포함하는 기는 직쇄 형상이어도 좋고, 환 구조를 가지고 있어도 좋다. 공액 다중 결합 부위에, 복소 원자가 포함되어 있어도 좋다.
공액 다중 결합을 포함하는 기로는, 예컨대, 메틴기(-C=C-), 방향족기, 아조기 및 이들을 조합한 기 등을 들 수 있다.
또한, A는 특별히 한정되지 않고, 공액 다중 결합만으로 구성되는 기이더라도 좋지만, 적절히 알킬기 등의 공액 결합이 되지 않는 치환기를 갖고 있어도 좋다. 치환기로서, 예컨대, 알킬기를 A에 도입시키면, 특정 화합물과, 미셀, 베시클 등과의 상용성(즉, 계면활성제와 함께, 미셀이나 베시클 등의 분자 집합체의 표면층을 형성하는 특성)이 향상되기 때문에, 광학적 특성이 향상되고, 보다 저농도까지 피험물질을 측정하는 것이 가능해진다.
고감도로 피험물질을 검출할 수 있는 관점에서, 공액 다중 결합을 포함하는 기로는, 방향족기 및 아조기 중 적어도 하나를 포함하는 기인 것이 바람직하다.
방향족기로는, 방향족 탄화수소환이어도 좋고, 방향족 복소환이어도 좋다. 또한, 상기의 환 구조는 단환 또는 다환이어도 좋고, 다환은 축합 환이어도 좋다. 방향족기는 무치환이어도 좋고, 치환기를 갖고 있어도 좋지만, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 무치환인 것이 바람직하다.
방향족 복소환은 단환이어도 좋고, 2환 이상의 복소환 또는 복소환과 방향족환이 축합된 축합 복소환이어도 좋지만, 복소환과 방향족환이 축합된 축합 복소환인 것이 바람직하다.
복소환의 환원수는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 5원환 ~ 8원환인 것이 바람직하고, 5원환 또는 6원환인 것이 보다 바람직하다.
복소환은, 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 복소 원자를, 적어도 하나 갖는 복소환이 바람직하고, 질소 원자 및 산소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 복소 원자를 갖는 것이 보다 바람직하고, 질소 원자 또는 산소 원자를 포함하는 것이 더욱 바람직하며, 질소 원자를 포함하는 것이 특히 바람직하다.
복소환으로는, 예컨대, 쿠마린환, 피리딘환, 피리미딘환, 티오펜환, 푸란환, 피롤환 등을 들 수 있다.
상기의 복소환은, 무치환 또는 치환기를 갖고 있어도 좋다. 치환기로는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 하이드록시기, 카르복시기, 알콕시기, 아릴록시기, 할로겐 원자, 알킬기, 할로겐화알킬기, 아릴기, 알킬옥시카르보닐기, 알킬카르보닐옥시기, 알콕시카르보닐기, 아릴록시카르보닐기, 알킬티오기, 아릴티오기, 디알킬아미노기, 알킬아릴아미노기, 디아릴아미노기 및 이들을 2 이상 조합한 기 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 치환기로는 하이드록시기 및 카르복시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 기인 것이 바람직하다.
피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 복소환으로는 치환기를 갖는 복소환이 바람직하고, 치환기를 갖는 쿠마린환인 것이 보다 바람직하고, 하이드록시기 및 카르복시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 기로 치환된 쿠마린환인 것이 더욱 바람직하고, 하이드록시기 및 카르복시기로 치환된 쿠마린환인 것이 특히 바람직하다.
방향족환은, 단환이어도 좋고, 2환 이상의 방향족환이 축합된 축합 방향족환이어도 좋지만, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 축합 방향족환인 것이 바람직하다. 축합 방향족환으로는, 2환 ~ 8환인 방향족환이 축합한 축합 방향족환인 것이 바람직하고, 2환 ~ 6환인 방향족환이 축합한 축합 방향족환인 것이 보다 바람직하며, 2환 ~ 4환인 방향족환이 축합한 축합 방향족환인 것이 더욱 바람직하다.
축합 방향족환으로는 나프탈렌환, 안트라센환, 페날렌환, 페난트렌환, 피렌환, 트리페닐렌환, 테트라센환, 퀴놀린환, 크리센환, 피센환 등을 들 수 있다.
A가 방향족기인 경우, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 복소환 또는 축합 방향족환이 바람직하고, 쿠마린환, 피렌환 또는 안트라센환이 보다 바람직하며, 피렌환이 특히 바람직하다.
또한, 방향족환이 단환인 경우, 방향족환으로는 벤젠환인 것이 바람직하다.
방향족기를 포함하는 기가 단환의 방향족환을 포함하는 경우, 방향족환을 1개 포함하여도 좋고, 2개 이상 포함하고 있어도 좋다.
단환의 방향족환을 포함하는 기로는, 페닐기, 비페닐기, 스틸벤기 등을 들 수 있고, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서 비페닐기가 바람직하다.
방향족기를 포함하는 기로는, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 하기 식 (Aaro)로 표시되는 기인 것이 바람직하다.
식 (Aaro) 중, A는 방향족환를 나타내고, RY1은 각각 독립적으로 1가의 치환기를 나타내고, a는 0 ~ 5인 정수를 나타내며, 물결선은 식 (1) 내의 L과의 결합 부위를 나타낸다.
방향족환으로는, 상기의 A에서의 방향족을 들 수 있지만, 이들 중에서도, 벤젠환, 쿠마린환, 피렌환 또는 안트라센환이 바람직하다.
RY1은, 각각 독립적으로, 상기의 방향족 탄화수소기에서의 치환기를 들 수 있다. 치환기는 아미드 결합 또는 에스테르 결합을 통해 환 A와 결합하고 있어도 좋다.
치환기로는 알킬기, 하이드록시기 또는 카르복시기인 것이 바람직하다. 알킬기로는, 탄소수 1 ~ 15인 알킬기가 바람직하고, 탄소수 2 ~ 12인 알킬기가 보다 바람직하며, 탄소수 5 ~ 10인 알킬기가 더욱 바람직하다.
식 (Aaro)에서, a가 1 ~ 5의 정수인 경우, RY1 중 적어도 하나가 아미드 결합을 통해 환 A와 결합하고 있는 것이 바람직하고, RY1 중 적어도 하나가, 아미드 결합을 통해 환 A와 결합한 탄소수 1 ~ 15인 알킬기(바람직하게는 탄소수 2 ~ 12, 보다 바람직하게는 탄소수 5 ~ 10)인 것이 보다 바람직하다.
a는 0 ~ 3인 정수가 바람직하고, 0 ~ 2인 정수가 보다 바람직하다.
상기의 환 A가 쿠마린환인 경우, A는 하기 식 (Acou)로 표시되는 것이 바람직하다.
식 (Acou) 중, RY1은 각각 독립적으로 1가의 치환기를 나타내고, a는 1 또는 2의 정수를 나타내고, 물결선은 식 (1) 내의 L과의 결합 부위를 나타낸다.
RY1에서의 치환기는 Aaro 내의 치환기와 마찬가지이며, 바람직한 양태도 마찬가지이다.
아조(-N=N-) 구조를 포함하는 기(이하, 「아조기」라고도 말하는 경우가 있음)는, 아조 구조 하나를 포함하고 있어도 좋고, 2 이상을 포함하고 있어도 좋지만, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서는, 아조 구조 하나를 포함하는 기인 것이 바람직하고, 아조기와 방향족기를 조합한 기인 것이 보다 바람직하다. 아조기와 방향족기를 조합한 기에서, 방향족기로는, 방향족 탄화수소환이어도 좋고, 방향족 복소환이어도 좋지만, 발색성이 우수한 관점에서, 방향족 탄화수소기인 것이 바람직하다.
방향족 탄화수소기가 갖는 방향족환은, 단환이어도 좋고, 2환 이상의 방향족환이 축합된 축합 방향족환이어도 좋다. 축합 방향족환으로는 나프탈렌환, 안트라센환, 피렌환 등을 들 수 있다.
또한, 방향족환이 단환인 경우, 방향족환으로는 벤젠환인 것이 바람직하다.
또한, 방향족 탄화수소기로는, 무치환이어도 좋고, 치환기를 갖고 있어도 좋다. 치환기로는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 하이드록시기, 카르복시기, 알콕시기, 아릴록시기, 할로겐 원자, 알킬기, 할로겐화알킬기, 아릴기, 알킬옥시카르보닐기, 알킬카르보닐옥시기, 알콕시카르보닐기, 아릴록시카르보닐기, 알킬티오기, 아릴티오기, 디알킬아미노기, 알킬아릴아미노기, 디아릴아미노기 및 이들을 2 이상 조합한 기 등을 들 수 있다.
아조(-N=N-) 구조를 포함하는 기로는, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 아조 구조에 방향족 탄화수소기가 결합한 기인 것이 바람직하고, 하기 식 (Aazo)로 표시되는 기인 것이 보다 바람직하다.
식 (Aazo) 중, RZ1 및 RZ2는 각각 독립적으로 치환기를 나타내고, 물결선은 식 (1) 내의 L과의 결합 부위를 나타낸다.
치환기로는, 상기의 방향족 탄화수소기에서의 치환기를 들 수 있다. 치환기는 아미드 결합 또는 에스테르 결합을 통해 아조벤젠 구조와 결합하고 있어도 좋다.
치환기로는 알킬기, 하이드록시기 또는 카르복시기인 것이 바람직하다. 알킬기로는, 탄소수 1 ~ 15인 알킬기가 바람직하고, 탄소수 2 ~ 12인 알킬기가 보다 바람직하며, 탄소수 5 ~ 10인 알킬기가 더욱 바람직하다.
RZ1 및 RZ2는, 동일한 구조이더라도 좋고, 서로 상이하여도 좋지만, 미셀 형성의 관점에서, RZ1 및 RZ2는 서로 상이한 것이 바람직하다.
또한, RZ1 및 RZ2는 아조기에 대하여, 오르토 위치, 메타 위치 및 파라 위치 중 어느 하나의 위치에 결합하고 있어도 좋다. 이들 중에서도, RZ1 및 RZ2에서의 치환기는 아조기에 대하여 파라 위치에 결합하는 것이 바람직하다.
L과의 결합 부위는 아조기에 대하여, 오르토 위치, 메타 위치 및 파라 위치 중 어느 하나의 위치에 결합하고 있어도 좋다. 이들 중에서도, L과의 결합 부위는 아조기에 대하여 메타 위치에 결합하는 것이 바람직하다.
식 (1)에서의 A의 구체예로는, 하기 식 (5A)에 나타내는 쿠마린(이하, C로 기재함), 하기 식 (6A)에 나타내는 비페닐, 하기 식 (7A)에 나타내는 피렌(이하, Pr로 기재함), 하기 식 (8A)에 나타내는 스틸벤 및 하기 식 (9A)에 나타내는 안트라센, 하기 식 (10A)에 나타내는 아조벤젠 및 이들의 유도체, 유기 일렉트로루미네센스용 색소 및 형광 단백질을 들 수 있다. 또, 본 개시는 이하의 구체예로 한정되는 것은 아니다.
반응 부위로 이용할 수 있는 쿠마린 유도체로는 쿠마린 1, 쿠마린 6, 쿠마린 7, 쿠마린 30, 7-하이드록시쿠마린-3-카르복실산 및 8-(2,2'-디피코릴아미노메틸)-7-하이드록시쿠마린-3-카르복실산 등을 들 수 있지만, 7-하이드록시쿠마린-3-카르복실산이 가장 바람직하다.
반응 부위로 이용할 수 있는 비페닐 유도체로는 4-비페닐카르복실산, 2-(4'-t-부틸페닐)-5-(4'-비페닐)1,3,4-옥사디아졸, 2,5-비스-(2-(4-비페닐)에테닐)피라진 및 4,4'-비스(2,2-디페닐비닐)비페닐 등을 들 수 있지만, 검출 감도의 면에서, 4-비페닐카르복실산이 가장 바람직하다.
반응 부위로 이용할 수 있는 피렌 유도체로는, 알키닐피렌을 들 수 있지만, 검출 감도의 면에서, 상기 식 (7A)에 나타내는 피렌이 가장 바람직하다.
반응 부위로 이용할 수 있는 스틸벤 유도체로는, 1,1,4,4-테트라페닐-1,3-부타디엔, 4,4'-비스(2,2-디페닐비닐)비페닐 및 시아노스틸벤 등을 들 수 있지만, 검출 감도의 관점에서, 상기의 식 (8A)로 표시되는 스틸 벤이 가장 바람직하다.
반응 부위로 이용할 수 있는 안트라센 유도체로는, 10-[2-(9-안트라세닐)에틸]페녹사진, 10-[2-(9-안트라세닐)에틸]페노티아진 및 2-(9-안트라세닐)에틸디페닐아민 등을 들 수 있지만, 검출 감도의 면에서, 상기의 식 (9A)에 나타내는 안트라센이 가장 바람직하다.
반응 부위로 이용할 수 있는 아조벤젠 유도체로는, 상기의 식 (Aazo)로 표시되는 기를 갖는 유도체를 들 수 있고, 바람직한 양태도 마찬가지이다.
반응 부위로 이용할 수 있는 형광 단백질로는, GFP(Green Fluorescent Protein), BFP(Blue Fluorescent Protein), CFP(Cyan Fluorescent Protein), EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), EYFP(Enhanced Yellow Fluorescent Protein) 및 PA-GFP(Photoactivatable Green Fluorescent Protein) 등을 들 수 있지만, GFP가 가장 바람직하다.
반응 부위가 형광을 발광하는 구조를 포함하는 경우, 형광을 발광하는 구조는 소수성을 나타내는 경우가 많고, 인식 부위는 친수성을 나타내는 경우가 많다. 따라서, 예컨대, 스페이서의 종류를 적절한 것으로 하여, 후술하는 형광 물질에 충분한 친수성을 갖게 함으로써 형광 물질이 수용성을 가지게 되고, 예컨대, 유기 용매 등에 녹여 사용하는 등의 필요가 없어 검출 정밀도를 높일 수 있다.
또한, 스페이서의 종류를 적절한 것으로 하는 방법으로는, 예컨대, 후술하는 스페이서: L의 사슬 길이의 탄소수를 조정하거나, 친수성기를 측쇄에 도입하거나, 질소 등의 원자를 사슬 내에 도입하는 방법을 생각할 수 있다. 또, 반응 부위 및 인식 부위에 대하여 마찬가지의 조정을 행할 수도 있다.
반응 부위가 형광을 방출하는 구조를 포함하는 경우, 특정 화합물은 도 1의 개략도에 나타내는 바와 같은 개략 구성을 갖는다. 예컨대, 피험물질(바람직하게는 엔도톡신)(50)과 상호작용하는 인식 부위(40)와 발광하는 형광 부위(20)가 스페이서(30)에서 연결되어 있다. 인식 부위(40)에는 화학 구조에 따라 금속 이온이 배위되는 경우도 있다.
반응 부위가 형광을 발광하는 구조를 포함하는 경우, 구체적인 특정 화합물(형광 물질)의 예로는, 상기의 식 (Y2)로 나타내는 금속 이온이 배위된 디피코릴아미노기와, 상기의 식 (5A)에 나타내는 쿠마린의 유도체인 7-하이드록시쿠마린-3-카르복실산이 사슬 길이의 탄소수 1인 스페이서를 개재하여 결합된, 상기의 식 (1)로 표시되는 dpa-HCC를 들 수 있다.
알킬 사슬 등을 도입시킨 A의 구체예로는, 다음과 같은 것이 예시된다.
R-HCC(하이드록시쿠마린카르복실산알킬아미드)는 쿠마린에 아미드 결합을 통해 알킬 사슬을 도입한 것이다. 마찬가지로, R-azo(하이드록시아조벤젠카르복실산 알킬아미드)는 4-하이드록시아조벤젠에 아미드 결합을 통해 알킬 사슬을 도입한 것이다.
또, 상기의 R-HCC 및 R-azo 내의 R은 알킬기(바람직하게는 탄소수 1 ~ 15인 알킬기, 보다 바람직하게는 탄소수 2 ~ 12인 알킬기, 더욱 바람직하게는 탄소수 5 ~ 10인 알킬기임)를 나타낸다.
구체적인 특정 화합물(형광 물질)의 다른 예로는, 상기의 식 (Y1)에 나타내는 페닐보론산(이하, PB로 나타내는 경우가 있음)과, 상기의 식 (7A)에 나타내는 피렌환이 스페이서(30)로서의 아미드 결합 (-C(=O)NH-)로 연결된 C4-APB를 들 수 있다.
[L]
L은 단결합 또는 사슬 길이가 원자수 1 ~ 10인 스페이서를 나타낸다. L이 단결합인 경우, L은 연결기이므로, 식 (1)에서 A와 Y가 직접 결합하고 있는 것을 나타내고 있다.
스페이서는 반응 부위와 인식 부위의 결합을 중재한다. 인식 부위로부터 반응 부위로의 인식 정보의 전달이 효율적으로 행해지는 관점에서, 사슬 길이가 원자수 1 ~ 10인 스페이서인 것이 바람직하다.
본 명세서에서, 사슬 길이란, 반응 부위로부터 스페이서를 거쳐 인식 부위까지 사이의 원자수를 최소가 되도록 카운트한 값이며, 반응 부위 및 인식 부위에 포함되는 원자의 수는 사슬 길이에 포함되지 않는다.
예를 들어, 하기의 화합물 dpa-C4Py의 사슬 길이는 4이다. 또한, 하기 화합물 C4-APB의 사슬 길이는 6이다.
상기의 사슬 길이를 구성하는 사슬로는, 탄소 원자, 산소 원자, 질소 원자, 황 원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 원자를 포함하는 사슬인 것이 바람직하고, 탄소 원자, 산소 원자 및 황 원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 원자를 포함하는 사슬인 것이 보다 바람직하고, 알킬 사슬, 에테르 결합(-O-), 아미드 결합(-C(=O)NH-) 및 에스테르 결합(-C(=O)O-)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 사슬인 것이 더욱 바람직하며, 알킬 사슬 및 아미드 결합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 사슬인 것이 특히 바람직하다.
L은, 선형(직쇄) 또는 분기형(분기쇄) 중 어느 하나라도 좋지만, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 선형의 포화 알킬 사슬인 것이 바람직하다.
또한, 특정 화합물에서 복수의 인식 부위를 갖기 위해, L을 분기쇄로서 인식 부위와 결합시켜도 좋다. 또한, L을 분기쇄로 하여, 친수성기를 측쇄에 도입하여도 좋다.
친수성기로는, 예컨대, 하이드록시기, 카르복시기, 아미노기 등을 들 수 있다.
피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, L로는, 사슬 길이가 원자수 1 ~ 10이고, 또한, 알킬 사슬 및 아미드 결합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 사슬인 것이 바람직하고, 사슬 길이가 원자 수 1 ~ 8인 알킬 사슬인 것이 보다 바람직하고, 사슬 길이가 원자 수 1 ~ 8인 선형 알킬 사슬인 것이 더욱 바람직하며, 사슬 길이가 원자 수 1 ~ 6인 선형 알킬 사슬인 것이 특히 바람직하다.
특정 화합물(바람직하게는 식 (1)로 표시되는 화합물)의 구체예로는, 하기 예시 화합물을 들 수 있다. 또, 본 개시는 이하의 구체예로 한정되는 것은 아니다. 이하, 하기 예시 화합물은 괄호 내의 기호로 나타내는 경우도 있다. 예시 화합물 중, Mn+는 금속 이온을 나타내며, 상술한 Mn+와 마찬가지이다.
또, 상기의 예시 화합물에서, dpa-C4Py는 N,N'-(디피코릴)-4-(1-피레닐)부틸아민이고, C4-APB는 페닐보론산-4-(1-피레닐)부틸아미드이고, dpa-HCC는 디피코릴아민-하이드록시쿠마린 카르복실산이고, dpa-azo는 디피코릴아민-하이드록시아조벤젠이며, dpa-C6Py는 N,N'-(디피코릴)-4-(1-피레닐)헥실아민이다.
dpa-R-HCC는 디피코릴아민-하이드록시쿠마린카르복실산알킬아미드, dpa-R-azo는 디피코릴아민-하이드록시아조벤젠카르복실산알킬아미드이다. 또, 상기의 dpa-R-HCC 및 dpa-R-azo 내의 R은 알킬기(바람직하게는 탄소수 1 ~ 15인 알킬기, 보다 바람직하게는 탄소수 2 ~ 12인 알킬기, 더욱 바람직하게는 탄소수 5 ~ 10인 알킬기임)를 나타낸다.
피험물질을 고감도로 검출하는 관점에서, 특정 화합물은 수용액 중에서 후술하는 계면활성제와 분자 집합체를 형성할 수 있는 화합물인 것이 바람직하고, 수용액 내에서 후술하는 계면활성제와 미셀 또는 베시클을 형성할 수 있는 화합물인 것이 보다 바람직하다.
특정 화합물은 1종 단독으로 사용하여도 좋고, 2종 이상을 병용하여도 좋다.
또, 본 개시에 관한 검출 방법에서는, 피험물질의 상이한 특정 부위를 인식하는 인식 부위를 갖는 복수의 형광 물질을 사용하여도 좋다. 이것에 의해, 피험물질(예컨대, 엔도톡신)의 다점 인식을 가능하게 하고, 특이성 및 검출 감도를 더욱 증가시킨다. 예컨대, dpa-HCC와 C4-APB를 혼합한 것을 형광 시약으로서 시료에 첨가하고, 형광 강도를 2파장으로 검출할 수 있다. 더욱이, 복수의 인식 부위를 갖는 특정 화합물 또는 복수의 반응 부위를 갖는 특정 화합물을 사용하여도 마찬가지의 효과가 얻어진다. 이 경우, 스페이서로서 측쇄를 갖는 것을 사용하든지 또는 복수의 스페이서를 사용하면 좋다.
<계면활성제>
본 개시에 관한 검출 방법에서, 계면활성제의 종류는 한정되지 않는다. 본 개시의 계면활성제는 공지된 계면활성제를 포함한다.
계면활성제로는, 예컨대, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제를 들 수 있다.
피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 계면활성제로는, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제인 것이 바람직하고, 양이온성 계면활성제인 것이 보다 바람직하다.
양이온성 계면활성제로는, 예컨대, 질소 원자를 갖는 계면활성제를 들 수 있고, 구체적으로는, 알킬트리메틸암모늄염(예컨대, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 및 염화라우릴트리메틸암모늄), 디알킬디메틸암모늄염(예컨대, 염화디스테아릴디메틸암모늄), 알킬피리듐염(예컨대, 염화폴리(N,N디메틸-3,5-메틸렌피페리듐) 및 염화세틸피리듐), 알킬 4급 암모늄염, 알킬디메틸벤질암모늄염, 알킬이소퀴놀리늄염, 디알킬몰리포늄염, 폴리옥시에틸렌알킬아민, 알킬아민염, 폴리아민 지방산 유도체, 아밀알콜 지방산 유도체, 염화벤잘코늄 및 염화벤제토늄을 들 수 있다.
이들 중에서도 양이온성 계면활성제로는, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 브롬화세틸트리메틸암모늄(CTAB, HLB:10), 디도데실디메틸암모늄프로마이드(DDAB) 또는 도데실트리메틸암모늄염화물(DTAC)인 것이 바람직하고, 브롬화세틸트리메틸 암모늄(CTAB, HLB:10), 또는 디도데실디메틸암모늄프로마이드(DDAB)인 것이 보다 바람직하다.
양이온성 계면활성제는 1종 단독으로 사용하여도 좋고, 2종 이상을 병용하여도 좋다.
음이온성 계면활성제로는, 예컨대, 고급 지방산염(예컨대, 콜산나트륨, 스테아린산칼륨 및 베헤닌산칼륨), 알킬에테르카르복실산염(예컨대, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르카르복실산나트륨), N-아실-L-글루탐산염(예컨대, N-스테아로일-L-글루탐산 모노나트륨염), 고급 알킬 황산 에스테르염(예컨대, 도데실 황산나트륨(SDS), 라우릴 황산나트륨 및 라우릴 황산칼륨), 폴리옥시에틸렌 라우릴 황산트리에탄올아민, 알킬에테르황산에스테르염(예컨대, 폴리옥시에틸렌 라우릴황산나트륨), N-아실살코신산염(예컨대, 라우로일살코신나트륨), 알킬인산염(예컨대, 스테아릴인산나트륨), 알킬에테르 인산염(예컨대, 폴리옥시에틸렌올레일에테르인산나트륨 및 폴리옥시에틸렌스테아릴에테르인산나트륨), 고급 지방산 에스테르 황산 에스테르 염(예컨대, 경화 야자유 지방산 글리세린 황산나트륨) 및 포스파티딜글리세롤(디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG) 등)을 들 수 있다.
이들 중에서도 음이온성 계면활성제로는, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 도데실황산나트륨(SDS, HLB: 40), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 또는 콜산나트륨인 것이 바람직하다.
음이온성 계면활성제는 1종 단독으로 사용하여도 좋고, 2종 이상을 병용하여도 좋다.
비이온성 계면활성제로는, 예컨대, 모노지방산 솔비탄(예컨대, 폴리솔베이트 20(모노라우인산 폴리옥시에틸렌 솔비탄), 폴리솔베이트 80(올레인산 폴리옥시에틸렌 솔비탄)), 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 등을 들 수 있다.
이들 중에서도 비이온성 계면활성제로서는, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 폴리솔베이트(PS), 옥톡시놀, (폴리옥시에틸렌)n에틸에테르(n=10(HLB: 16)), (폴리옥시에틸렌)n-p-t-옥틸페닐에테르(n=9 ~ 10(HLB: 14)) 또는 (폴리옥시에틸렌)n모노스테아린산솔비탄(n=20(HLB: 15))인 것이 바람직하고, (폴리옥시에틸렌)n에틸에테르(n=10(HLB: 16)), (폴리옥시에틸렌)n-p-t-옥틸페닐에테르(n=9 ~ 10(HLB: 14)) 또는 (폴리옥시에틸렌)n모노스테아린산솔비탄(n=20(HLB: 15))인 것이 보다 바람직하다.
비이온성 계면활성제는 1종 단독으로 사용하여도 좋고, 2종 이상을 병용하여도 좋다.
양성 계면활성제로는, 예컨대, 카르복시베타인, 아미노카르복실산, 설포베타인, 아미노황산에스테르, 이미타졸린, 인지질(레시틴) 등을 들 수 있다.
인지질로는, 디프타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPhPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 디피타노일포스파티딜에탄올아민(DPhPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 등의 인지질을 들 수 있다.
이들 중에서도 양성 계면활성제로는, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 또는 도데실-N-베타인인 것이 바람직하며, 1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)인 것이 보다 바람직하다.
양성 계면활성제는 1종 단독으로 사용하여도 좋고, 2종 이상을 병용하여도 좋다.
계면활성제의 분자량은 한정되지 않는다. 분자 집합체의 형성의 관점에서, 계면활성제의 분자량은 1,000 이하이더라도 좋고, 150 이상 1,000 이하이더라도 좋으며, 200 이상 500 이하이더라도 좋다.
본 개시에서, 분자량 분포를 갖는 계면활성제의 분자량은 중량 평균 분자량으로 나타내는 것으로 한다. 본 개시에서, 중량 평균 분자량은 겔 침투 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정된다.
피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 계면활성제의 HLB값으로는, 6 ~ 40인 것이 바람직하고, 7 ~ 30인 것이 보다 바람직하며, 7 ~ 20인 것이 더욱 바람직하다.
친수성-친유성의 균형값(이하, 「HLB 값」이라고도 함) HLB는 통상 계면활성제의 분야에서 사용되는 친수성-소수성 균형을 의미한다. 친수성-친유성의 균형값(이하, 「HLB 값」이라고도 함)은 이하에 나타내는 가와카미식을 이용하여 계산한다. 또, 글리세린 지방산 에스테르로서, 시판품을 사용하는 경우에는, 시판의 카탈로그 데이터를 우선적으로 채용한다.
HLB = 7+11.7 log(Mw/Mo)
여기서, Mw는 친수기의 분자량, Mo는 소수기의 분자량을 나타낸다.
공정 A에서, 계면활성제의 농도가, 임계 미셀 농도 이하이더라도, 부분적으로 미셀 내지 미셀에 가까운 형태의 것이 형성된다고 추측되지만, 보다 고감도로 피험물질을 검출 가능한 점에서, 피험물질 및 물을 포함하는 검체, 특정 화합물 및 계면활성제의 혼합액에 대한, 실온(25℃)에서의, 계면활성제의 농도로는, 임계 미셀 농도 이상인 것이 보다 바람직하다. 또한, 계면활성제의 농도는 검출 결과를 참조하면서 적절히 설정할 수 있다.
예컨대, 표준 물질을 사용하여 측정을 행하여, 계면활성제의 농도를 설정하여도 좋다.
임계 미셀 농도는 색소 가용화법에 의해 측정할 수 있고, 임계 미셀 농도란, 기액 계면에의 흡착이 포화되고, 용액 내부에서 미셀의 형성이 시작되는 농도를 의미한다. 본 개시의 계면활성제의 함유량으로는, 임계 미셀 농도의 0.1배 ~ 100배가 바람직하고, 0.5배 ~ 100배가 보다 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1배 ~ 50배이다.
구체적인 계면활성제의 함유량으로는, 피험물질, 특정 화합물 및 계면활성제를 포함하는 용액의 총질량에 대하여, 1×10-6 질량% ~ 1 질량%인 것이 바람직하고, 1×10-5 질량% ~ 0.1 질량%인 것이 보다 바람직하다.
특정 화합물과 계면활성제의 함유량비는 질량 기준이고, 1:1 ~ 1:400인 것이 바람직하고, 1:10 ~ 1:200인 것이 보다 바람직하다.
[피험물질]
피험물질로는, 수용액 내에서 분자 집합체를 형성할 수 있는 화합물이 바람직하게 예시된다. 수용액 내에서 분자 집합체를 형성할 수 있는 화합물로는, 예컨대, 인지질, 당지질, 지방산, 후술하는 본 개시에 관한 검출 방법에 사용되는 계면활성제 이외의 계면활성제(이하, 「그 외의 계면 활성제」라고도 함), 세균 등을 들 수 있다.
상기의 다른 계면활성제로는, 예컨대, PFOS(퍼플루오로옥탄술폰산) 및 PFOA(퍼플루오로옥탄산)를 들 수 있다.
또한, 수용액 내에서 분자 집합체를 형성할 수 있는 화합물이 알칼리 금속, 전이 금속(Na, K, Mg, Ag, Ni, Co 또는, Zn 등) 등을 포함하는 경우, 본 개시에 관한 검출 방법은, 이들의 금속을 검출하는 것도 가능하다.
또한, 피험물질이 세균(바람직하게는, 그램 음성균)인 경우에는, 계면활성제에 의해 세균의 세포벽을 파괴하고, 세포벽에 포함되는 인지질, 당지질, 엔도톡신 등을 분자 집합체에 취입하는 것에 의해 검출할 수 있게 된다.
이들 중에서도, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 피험물질로는, 인지질, 당지질, 또는 인산을 포함하는 그 외의 계면활성제를 포함하는 것이 바람직하고, 인지질 및 당지질 중 적어도 하나를 포함하는 것이 보다 바람직하며, 엔도톡신을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
엔도톡신은 친수성 부위인 당쇄(糖鎖)와 소수성 부위인 아실산이 2분자의 글루코사민을 통해 결합한 구조를 갖는다. 엔도톡신에서 글루코사민에는 각각 인산이 결합되어 있다(다카모토 켄이치 「엔도톡신과 의약품의 품질 관리」Bull. Natl. Inst. HealthSci., 126, 19-33(2008)). 엔도톡신 중 아실산이 결합된 글루코사민이 2개 결합한 부분은 리피드 A라 칭하며, 엔도톡신의 생물활성의 대부분은 이 부분에서 유래한다.
인지질로는, 예컨대, 포스파티딜콜린 등을 들 수 있다.
당지질로는, 예컨대, 갈락토 지질을 들 수 있다.
인산을 포함하는 계면활성제로는, 라우릴인산염 등의 알킬인산염 및 폴리옥시알킬렌알킬에테르인산염 등을 들 수 있다.
― 피험물질이 당지질을 포함하는 경우 ―
피험물질이, 예컨대, 당지질(바람직하게는 엔도톡신, 보다 바람직하게는 엔도톡신의 당 부분)인 경우, Y로는 산기를 포함하는 기인 것이 바람직하고, 산기를 포함하는 페닐기인 것이 보다 바람직하며, 보론산을 포함하는 페닐기인 것이 더욱 바람직하다.
또한, A로는, 2환 ~ 4환의 방향족환이 축합한 축합 방향족환이 바람직하고, 3환 또는 4환의 방향족환이 축합한 축합 방향족환이 보다 바람직하고, 피렌환 또는 쿠마린환인 것이 더욱 바람직하며, 피렌환인 것이 특히 바람직하다.
L로는, 상술한 L과 마찬가지이며, 바람직한 양태도 마찬가지이다.
상기의 피험물질이 엔도톡신인(바람직하게는 엔도톡신의 당 부분을 인식하는) 경우, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 특정 화합물이 하기 화학식 1A, C4-APB, dpa-R-HCC 또는 dpa-R-azo로 표시되는 화합물인 것이 바람직하다.
상기의 식 (1A) 중, m은 0 ~ 6을 나타내고, Mn+는 금속 이온을 나타내고, n은 자연수를 나타낸다. n으로는 1 ~ 3의 정수인 것이 바람직하다.
금속 이온으로는, 상술한 금속 배위성기에서의 금속 이온과 마찬가지이며, 바람직한 양태도 마찬가지이다. 또, 상기의 dpa-R-HCC 및 dpa-R-azo 내의 R은 알킬기(바람직하게는 탄소수 1 ~ 15인 알킬기, 보다 바람직하게는 탄소수 2 ~ 12인 알킬기, 더욱 바람직하게는 탄소수 5 ~ 10인 알킬기임)를 나타낸다.
― 피험물질이 인산 또는 인지질을 포함하는 경우 ―
또한, 피험물질이, 예컨대, 인산 또는 인지질을 포함하는 경우, Y로는, 금속 배위성기인 것이 바람직하고, 복소환기로 치환된 치환 아미노기인 것이 바람직하고, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 포함하는 복소환(바람직하게는, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖고, 또한 환원수 5 또는 6인 질소 원자를 포함하는 복소환이고, 보다 바람직하게는, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖고, 또한 환원수 5인 질소 원자를 포함하는 복소환이며, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖는 피리딜기임)으로 치환된 치환 아미노기인 것이 바람직하며, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 포함하는 복소환(바람직하게는, 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖고, 또한 환원수 5 또는 6인 질소 원자를 포함하는 복소환이고, 보다 바람직하게는 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖고, 또한 환원수 5인 질소 원자를 포함하는 복소환이며, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 ~ 4인 알킬기를 갖는 피리딜기임)으로 치환된 2치환 아미노기인 것이 더욱 바람직하다.
또한, A로는 아조 구조에 방향족 탄화수소기가 결합된 기, 복소환 또는 축합 방향족환이 바람직하고, 아조 구조에 페닐기가 결합된 기, 쿠마린환, 피렌환 또는 안트라센환이 바람직하다.
L로는, 사슬 길이가 원자수 1 ~ 10이고, 또한 알킬 사슬 및 아미드 결합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 사슬인 것이 보다 바람직하고, 사슬 길이가 원자수 1 ~ 8인 알킬 사슬 또는 사슬 길이가 원자수 1 ~ 8인 아미드 결합을 포함하는 쇄인 것이 보다 바람직하고, 사슬 길이가 원자수 1 ~ 8인 선형의 알킬 사슬 또는 사슬 길이가 원자수 1 ~ 6인 아미드 결합을 포함하는 사슬인 것이 더욱 바람직하며, 사슬 길이가 원자수 1 ~ 6인 선형의 알킬 사슬 또는 사슬 길이가 원자수 1 ~ 4인 아미드 결합을 포함하는 사슬인 것이 특히 바람직하다.
― 피험물질이 알칼리 금속을 포함하는 경우 ―
피험물질이, 예컨대, 알칼리 금속을 포함하는 경우, Y로는 금속 배위성기인 것이 바람직하고, 크라운 에테르기 등을 포함하는 기가 보다 바람직하다.
L 및 A는 상술한 식 (1) 내의 L 및 A와 마찬가지이며, 바람직한 양태도 마찬가지이다.
― 피험물질이 전이 금속을 포함하는 경우 ―
피험물질이, 예컨대, 전이 금속을 포함하는 경우, Y로는 산기를 포함하는 기인 것이 바람직하고, 산기를 포함하는 페닐기 또는 산기를 포함하는 아미노기인 것이 바람직하고, 산기를 포함하는 탄소수 1 ~ 4인 알킬기로 치환된 아미노기인 것이 바람직하고, 카르복시기를 포함하는 탄소수 1 ~ 4인 알킬기로 치환된 아미노기인 것이 보다 바람직하고, 카르복시기를 포함하는 탄소수 1 ~ 4인 알킬기로 치환된 2치환의 아미노기인 것이 더욱 바람직하며, 카르복시기를 포함하는 탄소수 1 또는 2의 알킬기로 치환된 2치환의 아미노기인 것이 특히 바람직하다.
L 및 A는 상술한 식 (1) 내의 L 및 A와 마찬가지이며, 바람직한 양태도 마찬가지이다.
<검체>
공정 A에 사용되는 검체는 상기의 피험물질 및 물을 포함한다.
검체로는, 예컨대, 식품(신선식품, 가공식품 등), 물(음료수, 지하수, 하천수, 해수, 생활 배수, 산업 배수 등), 토양 등의 환경 유래의 검체, 인간 또는 인간 이외의 동물로부터 채취한 혈액, 소변, 타액, 즙 등의 체액, 조직액 등을 들 수 있다.
검체에 포함되는 물은, 검체로부터 유래하는 물이어도 좋고, 별도 첨가한 것이어도 좋다. 별도로 첨가하는 물로는 특별히 한정되는 것은 아니고, 증류수, 이온 교환수, 탈이온수, 한외 여과수, 순수 등이어도 좋다.
공정 A는 상기의 검체, 특정 화합물 및 계면활성제 이외의 성분(기타 성분)을 첨가하여도 좋다. 기타 성분으로는, 완충액, 염 용액 등을 들 수 있다.
공정 A에서, 상기의 검체, 특정 화합물 및 계면활성제를 혼합하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 공지의 혼합 방법을 사용할 수 있다.
검체에 특정 화합물과 계면활성제를 첨가하는 순서는, 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 검체에 계면활성제를 첨가한 후에, 특정 화합물을 첨가하여도 좋고, 계면활성제와 특정 화합물을 혼합한 후, 혼합물을 검체에 첨가하여도 좋다.
― 온도 ―
공정 A에서, 검체에 특정 화합물과 계면활성제를 첨가할 때의 온도로는, 15 ~ 35℃인 것이 바람직하다.
― pH ―
공정 A에서, 검체, 특정 화합물 및 계면활성제의 혼합액의 pH는, 25℃에서, pH 5.0 ~ 9.0인 것이 바람직하고, pH 7.0 ~ pH 8.0인 것이 보다 바람직하다.
<공정 B>
본 개시에 관한 검출 방법은 인식 부위와 상기의 피험물질이 상호작용하고, 상기의 반응 부위에서의 반응을 검출하는 공정 B를 포함한다.
본 명세서에서, 반응 부위에서의 반응이란, 피험물질과 인식 부위가 상호작용하고, 상호작용에 의해 발생하는 반응 부위에서의 특성 변화(예컨대, 형광, 흡광, 전기화학법, 제타 전위, 광 산란, 육안 등의 변화를 들 수 있고, 바람직하게는 광학 특성의 변화임)를 의미한다. 광학 특성의 변화로는, 예컨대, 흡광 파장, 발광(형광) 파장 또는 발광(형광) 강도, 여기 광의 파장 변화 등의 변화를 들 수 있다.
또한, 광학 특성의 변화는, 특정 화합물과 피험물질의 복합체가 회합체에 포함됨으로써, 복합체의 구조가 변화하고, 관찰되는 발광(형광) 파장 또는 강도의 변화가 일어나는 것이어도 좋다.
상호작용에 의해 생성된 반응 부위에서의 광학 특성의 변화예로는, 특정 화합물인 dpa-HCC를 들어 이하에 설명한다.
dpa-HCC의 반응 부위(형광 부위)인 7-하이드록시쿠마린-3-카르복실산은 단독으로는, 예컨대, 396 ㎚의 여기 파장에 대하여 448 ㎚에 형광 강도의 피크를 나타낸다. 이 7-하이드록시쿠마린-3-카르복실산에 스페이서(-CH2-)를 통해 디피코릴아미노기가 결합된 dpa-HCC에서는, 디피코릴아미노기의 분기 질소 원자의 비공유 전자쌍이 전자 공여부로서 반응 부위(형광 부위)에 PET(광 유도 전자 이동(Photo-induced Electron Transfer))에 의해 이동하고 형광이 일부 억제되어 있다. 더욱이 이러한 dpa-HCC에, 상기의 식 (Y2)에 나타내는 금속 이온으로서 구리 이온, 니켈 이온 또는 코발트 이온(이하, 「구리 이온 등」이라고 함)이 배위되면, 반응 부위(형광 부위)인 7-하이드록시쿠마린-3-카르복실산으로부터, 구리 이온 등의 비어있는 d 궤도로 전자가 유입되는 LMCT(Ligand to Metal Charge Transfer)에 의해 형광이 감쇠된 상태로 된다.
그렇지만, 피험물질이 엔도톡신인 경우에, dpa-HCC는 감쇠되어 있던 형광이 부활한다. 즉, 디피코릴아미노기에 배위하고 있는 구리 이온 등에 엔도톡신의 인산기가 배위하면, 구리 이온 등과 dpa-HCC의 화학 결합이 약해짐으로써, 감쇠되어 있던 7-하이드록시쿠마린-3-카르복실산의 형광이 부활하는 것으로 생각된다.
즉, 특정 화합물(형광 물질)로서의 dpa-HCC의 인식 부위가 인식하는 특정 부위는 엔도톡신의 인산기이다.
광학 특성의 변화의 다른 예로는, 특정 화합물인 C4-APB를 들 수 있다. 이 C4-APB는, 엔도톡신이 없는 상태에서는, 반응 부위인 피렌환으로부터 페닐보론산으로 전자가 유입되는 PET에 의해 형광이 감쇠한 상태로 된다. 한편, 엔도톡신이 있는 상태에서 C4-APB는 형광을 발한다.
즉, 페닐보론산과 엔도톡신의 당쇄 부분에 존재하는 하이드록실기의 상호작용에 의해, 페닐보론산의 전자 수용성이 감소하고, 감쇠되어 있던 피렌의 형광이 부활하는 것으로 생각될 수 있다.
즉, 특정 화합물(형광 물질)로서의 C4-APB의 인식 부위가 인식하는 특정 부위는 엔도톡신의 당쇄 부분이다.
반응 부위에서의 반응의 검출 방법으로는, 상술한 반응 부위의 구조 및 검출하는 광학 특성에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 검출 장치는, 예컨대, 공지의 흡광도계, 발광 검출기, 형광 검출기 등을 사용할 수 있다. 의뢰 정보의 상세에 대해서는 후술한다.
<기타 공정>
본 개시에 관한 검출 방법은, 공정 A 및 공정 B 이외의 공정(기타 공정)을 더 포함하고 있어도 좋다.
기타 공정으로는, 예컨대, 검체의 전처리 공정(예컨대, 이온 교환 등의 피험물질 이외의 물질과의 분리 공정), 검체의 농축 공정(예컨대, 역삼투 처리), 베시클 형성 공정(예컨대, 초음파 처리, 쉐이킹 처리) 등을 들 수 있다.
(검출 장치)
고감도로 피험물질을 검출할 수 있는 관점에서, 본 개시에 관한 검출기로는, 피험물질 및 물을 포함하는 검체가 도입되는 시료 도입부와, 후술하는 검출 시약 조성물을 상기한 검체에 공급하는 공급부와, 상기한 검체와 상기한 검출 시약 조성물이 반응하는 반응부와, 상기한 반응을 검출하는 검출부를 구비하는 것이 바람직하고, 온라인으로 사용할 수 있는 검출 장치(온라인 측정기)인 것이 보다 바람직하다. 검출 장치에 사용되는 검출 시약 조성물의 상세는 후술한다.
예컨대, 피험물질이 엔도톡신이고, 반응 부위가 형광을 발광하는 구조를 갖는 경우, 검출 장치로는, 예컨대, 도 2에 나타내는 검출 장치(100)를 적합하게 사용할 수 있다.
또, 시료 도입부에 도입되는 피험물질 및 물을 포함하는 검체는 피험 대상의 시료로 대체할 수 있다.
도 2는 본 개시의 엔도톡신 검출 장치(100)의 일 예를 모식도로 나타내는 것이다. 본 개시의 엔도톡신 검출 장치(100)는, 피험 대상의 시료(960)가 도입되는 시료 도입부(200)와, 상술한 형광 물질(10)을 상기의 시료에 공급하는 공급부(300)와, 상기의 시료(960)와 상기의 형광 물질(10)이 반응하는 반응부(400)와, 상기의 반응을 겪은 상기의 형광 물질(10)의 형광을 검출하는 검출부(500)를 구비한다. 본 예의 엔도톡신 검출 장치(100)는 플로우 인젝션 분석법(FIA, Flow Injection Analysis)을 이용하여 구성되어 있다.
시료 도입부(200)는 시료(960)를 반송하는 액체로서의 캐리어를 저류하는 캐리어 저류조(210)와, 캐리어를 보내는 캐리어 송액 펌프(220)와, 캐리어가 유동하는 캐리어 송액로(230)와, 캐리어 송액로(230)에 시료(960)가 도입되는 시료 도입부(240)가 구비되어 있다. 캐리어는, 시료(960)를 반송할 수 있는 액체이면, 특별히 한정하는 것은 아니고, 시료(960) 및 형광 물질(10)의 성상에 따라, 예컨대, 순수 또는 각종 완충액을 적절히 사용할 수 있다. 시료(960)는, 엔도톡신(50)의 함유 여부가 검증되는 피험 대상의 액체이며, 예컨대, 주사제, 수액, 투석액 등의 용매로 되는 정제수 또는 주사용수 등의 액체 제품이나, 혈액, 침, 소변 등의 생체액 또는 그 희석액 등이 시료(960)로 될 수 있다. 시료 도입부(240)에는, 상기한 액체 제품의 제조 라인(특히, 정제수 제조 설비나 주사용수 제조 설비)에 설치된 시료 채취부(700)로부터 채취된 시료(960)가 직접, 연속적으로 도입되는 것이 바람직하지만, 측정될 때마다 채취된 시료(960)가 시료 도입부(240)로부터 도입되는 것으로 하여도 좋다.
후술하는 정제수 제조 설비 또는 주사용수 제조 설비에, 도 2에 나타내는 엔도톡신 검출 장치를 직접 접속하여 연속적으로 엔도톡신(50)을 검출하는 경우, 본 개시에 관한 검출 방법을 사용하면, 보다 저농도의 엔도톡신을 단시간에 측정할 수 있으므로, 후술하는 제조 방법에 의해 제조한 정제수 또는 주사용수의 엔도톡신 농도가 규정값 미만인 것을 보증할 수 있다. 도 3에 본 개시에서의 정제수 제조 설비 및 주사용수 제조 설비를 예시한다.
공급부(300)는 형광 물질(10)을 함유하는 시약 용액을 저류하는 시약 저류조(310)와, 시약을 보내는 시약 송액 펌프(320)와, 시약이 유동하는 시약 송액로(330) 및 캐리어 송액로(230)에 합류하는 혼합부(340)를 구비하고 있다. 혼합부(340)에서는, 형광 물질(10)이 시약 용액으로서 시료(960)에 엔도톡신(50)이 공급되어 혼합된다. 형광 물질(10)은, 상술한 바와 같이, 형광 부위(20)와 분자 구조의 특정 부위(51)를 인식하는 인식 부위(40)가 스페이서(30)에서 연결된 구조를 갖고 있다. 형광 부위(20), 인식 부위(40) 및 스페이서(30)의 의미에 대해서는 상술한 바와 같다.
반응부(400)에서는 시료(960)에 엔도톡신(50)이 함유되어 있는 경우, 시약 내의 형광 물질(10)과 엔도톡신(50)의 반응이 발생하고, 형광 물질(10)로부터 발광이 발생한다. 반응부(400)로는, 일반적인 검출 시스템에 채용되는 반응 코일이 사용되지만, 단순한 모세관을 반응부(400)로 하여도 좋다.
검출부(500)에서는, 상술한 반응을 겪은 형광 물질(10)의 발광이 광학적으로 검출된다. 검출부(500)로는, 일반적인 발광 검출기를 사용할 수 있다.
또, 본 개시의 엔도톡신 검출 장치(100)는, 상술한 FIA를 이용한 구성으로 한정되지 않고, 예컨대, CFA(연속 흐름 분석법), SIA(순차 주입 분석법), r-FIA(리버스 플로우 인젝션 분석법)를 포함한 FCA(액체 흐름 분석법)를 이용한 구성에서도 실현할 수 있다.
그리고, 본 개시의 엔도톡신 검출 장치(100)에서는, 형광 물질(10)로서, 특정 부위(51)로서의 인산기와 반응하는 dpa-HCC, 또는 특정 부위(51)로서의 당쇄 부분과 반응하는 C4-APB를 사용하는 것이 바람직하다.
(정제수 제조 설비)
본 개시에 관한 정제수 제조 설비는, 원수를 역침투 여과하는 역침투막 장치, 및 원수를 이온 교환하는 이온 교환 장치 중 적어도 하나에 의해 상기의 원수로부터 정제수를 얻는 정제수 제조부와, 상기의 정제수로부터 상기의 피험 대상의 시료를 채취하는 시료 채취부와, 상기의 검출 장치를 구비하는 것이 바람직하다.
도 3은 본 개시에 관한 정제수 제조 설비(600)의 일 예의 개략 구성을 모식도로 나타내는 것이다. 본 개시의 정제수 제조 설비(600)는 원수(900)로부터 정제수(920)를 얻는 정제수 제조부(610)와, 정제수(920)로부터 피험 대상의 시료(960)를 채취하는 시료 채취부(700) 및 상기의 엔도톡신 검출 장치(100)를 구비한다.
정제수 제조부(610)는, 예컨대, 원수(900)를 역침투 여과하는 역침투막 장치(610) 및 원수를 이온 교환하는 이온 교환 장치(620) 중 적어도 하나에 의해 원수(900)로부터 불순물을 제거하여, 정제수(920)를 제조하는 설비이다. 이온 교환 장치에는, 예컨대, 전기식 탈염 장치나, 혼상식 이온 교환 수지 장치를 사용할 수 있다. 정제수 제조부(610)는 한외 여과막 장치(630)나 자외선 조사 장치를 더 구비하여도 좋다. 제조된 정제수(920)는 주사용수 제조 설비(800)에 공급하여도 좋고, 사용 장소(도시하지 않음)에 공급하여도 좋다.
시료 채취부(700)는, 정제수 제조부(610)의 하류측에서 정제수(920)의 반송 라인의 도중에 설치된다. 시료 채취부(700)에 의해 채취된 정제수(920)는, 피험 대상의 시료(960)로서, 상기한 시료 도입부(240)(도 2 참조)로부터 엔도톡신 검출 장치(100)에 도입된다. 엔도톡신 검출 장치(100)의 상세는 상술한 바와 같다. 이것에 의해, 정제수(920)로부터 채취된 피험 대상의 시료(960)가 상술한 엔도톡신 검출 방법에 제공되는 것으로 된다.
본 개시의 정제수 제조 설비(600)에서는, 상기의 구성에 의해 제조된 정제수(920)로부터 수시로 시료(960)를 채취하여, 엔도톡신 검출 장치(100)에 의해 실시간으로 엔도톡신(50)을 검출하는 것이 가능해진다. 그리고, 엔도톡신(50)의 농도가 소정의 기준치를 초과한 경우에는, 예컨대, 즉시 정제수 제조 설비(600)를 정지하여, 부품 교환 또는 수리 등의 적절한 처치를 강구할 수 있다.
(주사용수 제조 설비)
본 개시에 관한 주사용수 제조 설비는, 원수를 역침투 여과하는 역침투막 장치, 및 원수를 이온 교환하는 이온 교환 장치 중 적어도 하나에 의해 상기의 원수로부터 정제수를 얻는 정제수 제조부와, 상기의 정제수를 여과하는 고분자막 여과 장치 또는 상기의 정제수를 증류하는 증류기에 의해 상기의 정제수로부터 주사용수를 얻는 주사용수 제조부와, 상기의 주사용수를 가열한 상태로 유지하여 저류하는 주사용수 탱크와, 상기의 주사용수 탱크에 구비되어 있는 상기의 주사용수를 소정의 사용 장소로 송출하는 송출 라인과, 상기의 주사용수로부터 상기의 피험 대상의 시료를 채취하는 시료 채취부와, 상기의 검출 장치를 구비하는 것이 바람직하다.
도 3은 본 개시에 관한 주사용수 제조 설비(800)의 일 예의 개략 구성을 모식도로 나타내는 것이다. 본 개시에 관한 주사용수 제조설비(800)는, 원수(900)로부터 정제수(920)를 얻는 정제수 제조부(610)와, 정제수(920)로부터 주사용수(940)를 얻는 주사용수 제조부(810)와, 주사용수(940)를 가열한 상태로 유지하여 저류하는 주사용수 탱크(820)와, 주사용수 탱크(820)에 구비되어 있는 주사용수(940)를 소정의 사용 장소(850)로 송출하는 송출 라인(830)과, 주사용수(940)로부터 피험 대상의 시료(960)를 채취하는 시료 채취부(700)와, 상기의 엔도톡신 검출 장치(100)를 구비한다.
주사용수 제조부(810)에서는, 고분자막 여과 장치(바람직하게는 한외 여과막 장치)(870)에 의해 정제수(920)를 여과함으로써 엔도톡신(50) 등의 불순물을 고도로 제거하여, 주사용수(940)가 제조된다. 또, 고분자막 여과 장치를 대신하여 증류기를 사용하여도 좋다.
또, 이 정제수 제조부(600)에 엔도톡신 검출 장치(100)가 설치되어 있고 정제수(920)의 엔도톡신 농도를 알고 있는 경우, 그에 맞추어 주사용수 제조부(810)의 운전 조건을 조정하여도 좋다. 예컨대, 정제수(920)의 엔도톡신 농도가 충분히 낮다고 알고 있는 경우에는, 그만큼 엔도톡신 제거 능력을 낮추어 고분자막 여과 장치의 투과수량을 증가시켜 주사용수(940)의 생산량을 증가시켜도 좋다.
주사용수 탱크(820)에는, 제조된 주사용수는 열교환기(880)에서 가열하여, 주사용수(940) 내의 세균 등의 증식을 방지하고, 청결한 상태를 유지하기 위해, 예컨대, 60℃ 이상, 바람직하게는 70℃ 이상의 온도 상태가 유지된다. 또, 이러한 온도 상태를 유지하면서, 주사용수(940)의 체류를 방지하기 위해, 순환 배관을 이용하여 이러한 주사용수 탱크(820)를 구성하는 것이 바람직하다. 순환 배관에는 열교환기(890)가 구비되어 있어도 좋다. 또한, 주사용수 탱크(820)에는, 예컨대, 히터 등의 가열 장치를 설치하여도 좋다.
송출 라인(830)은 수시로 또는 필요에 따라 주사용수 탱크(820)에 저류되어 있는 주사용수(940)를 소정의 사용 장소(850)로 송출한다. 여기서 말하는 소정의 사용 장소(850)란, 예컨대, 주사용수(940)의 포장 설비, 또는 주사액의 제조 설비 등, 주사용수(940)의 용도에 따른 다양한 설비가 상정된다.
시료 채취부(701)는, 주사용수 제조 설비(800)에서, 주사용수 제조부(810)의 하류측의 소정 위치에 설치된다. 시료 채취부(701)에 의해 채취된 주사용수(920)는, 피험 대상의 시료(960)로서, 상기한 시료 도입부(240)(도 2 참조)로부터 엔도톡신 검출 장치(100)에 도입된다. 엔도톡신 검출 장치(100)의 상세는 상술한 바와 같다. 시료 채취부(701)가 설치되는 위치로는, 주사용수 제조부(810)보다 하류측에, 그리고 주사용수 탱크(820)보다 상류측에, 주사용수 탱크(820)에 직접(예컨대, 순환 배관의 도중), 또는 송출 라인(830) 도중 중 어느 하나에 설치하여도 좋다. 어느 경우에도, 주사용수(940)로부터 채취된 피험 대상의 시료(960)가 상술한 엔도톡신 검출 방법에 제공되는 것으로 된다.
시료 채취부(701)를 주사용수 제조부(810)보다 하류측에, 그리고 주사용수 탱크(820)보다 상류측에 설치하는 경우, 주사용수 제조부(810)에서 제조된 직후의 주사용수(940)의 엔도톡신 농도가, 예컨대, 일본 약전에 기재된 기준(0.25 EU/mL)를 충족시키는지 여부를 실질적으로 항상 확인할 수 있다. 그리고, 만일 이 기준을 만족하지 않는 경우는, 곧바로 하류에의 주사용수(940)의 공급을 정지함으로써, 그 시점에서 하류의 주사용수 탱크(820)에 저류되어 있는 기준을 만족한 상태의 주사용수(940)에의 오염을 방지할 수 있다. 또, 실질적으로 항상이란, 예컨대, 반복 측정 시간을 30분 이내, 바람직하게는 10분 이내로 하는 측정을 말한다. 하류 측의 장치의 보유수량 및 장치의 조수량을 고려하면, 이들 빈도로 측정을 반복함으로써, 트러블에 의한 수질 악화에 의한 오염에 의해, 주사용수의 제조를 멈추지 않고 운전시킬 수 있다.
시료 채취부(701)를 주사용수 탱크(820)에 직접 설치하는 경우, 순환 저류되고 있는 주사용수(940)가 상기의 기준을 만족하고 있는지 여부를 실질적으로 항상 모니터링할 수 있다. 그리고, 예컨대, 상기의 기준을 만족하고 있는 것이 확인되고 있을 때만 주사용수(940)를 송출 라인(830)에 공급하고, 만일 상기의 기준을 만족하지 않을 때는 도시하지 않은 반송 라인을 이용하여 주사용수(940)를 주사용수 제조부(810)의 상류측으로 복귀시키고, 주사용수 제조부(810)에서 재처리하도록 하여도 좋다.
본 개시에 관한 검출 장치의 일 예인 엔도톡신 검출 장치(100)는 측정 정밀도가 충분하기 때문에, 실질적으로 항상 모니터링함으로써, 전단의 장치의 결함뿐만 아니라, 결함의 전조도 확인할 수 있다. 예컨대, 제조되는 주사용수(940)의 엔도톡신 측정값이 엔도톡신의 기준치를 만족하지만, 약간의 상승 경향을 나타낸 경우, 이것은 전단의 장치의 성능 악화의 전조인 경우도 많아, 이것을 그대로 방치하면, 제조되는 주사용수(940)가 엔도톡신의 기준치를 만족시키지 않게 되는 경우도 있다. 즉, 주사용수 제조 장치의 결함을 사전에 검출함으로써, 트러블을 회피할 수 있게 된다. 예컨대, 전단의 장치의 운전 조건의 변경, 유지보수 등을 행함으로써 대응할 수 있다.
시료 채취부(701)를 송출 라인(830)에 설치하는 경우, 실제로 사용되는 시점에서의 주사용수(940)의 엔도톡신 농도를 직접 모니터링할 수 있다. 또한, 예컨대, 사용 장소(850)의 직전에 탱크를 설치하고, 탱크 내에 주사용수를 저류하여, 이것을 사용 장소(850)에 공급하고, 탱크가 비워지면 다시 주사용수를 저류한다는 배치식의 사용도 생각할 수 있다. 그리고, 탱크 내의 주사용수의 엔도톡신 농도를 엔도톡신 검출 장치(100)로 배치마다 확인함으로써, 엔도톡신 농도가 관리 기준을 충족하는 주사용수의 사용을 보증할 수 있다.
상술한, 3개소는 모두 시료 채취부(700)를 설치하는 이점이 있어 모두 바람직한 설치 개소이지만, 주사용수(940)의 엔도톡신(50) 오염을 가장 조기에 검출할 수 있다는 점에서, 주사용수 제조부(810)로부터 하류측 및 주사용수 탱크(820)보다 상류측에 설치하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 가능한 경우, 3개소 중 2개소 이상에 시료 채취부(700)를 설치하는 것으로 하여도 좋다.
상기의 구성에 의해, 본 개시의 주사용수 제조 설비(800)에서는, 제조된 주사용수(940)로부터 수시로 시료(960)를 채취하여, 엔도톡신 검출 장치(100)에 의해 실시간으로 엔도톡신(50)을 검출하는 것이 가능해진다. 그리고, 엔도톡신(50)의 농도가 소정의 기준치를 초과한 경우에는, 즉시, 주사용수 제조 설비(800)를 정지하여, 부품 교환 또는 수리 등의 적절한 처치를 강구할 수 있다. 이것에 의해, 요구 수질의 주사용수(940)를 안정적으로 제조할 수 있게 된다.
또한, 본 개시의 주사용수 제조 설비(800)에서는, 시료(960)로 되는 주사용수(940)의 불순물 농도가 충분히 작아지게 되어 있고, 다른 불순물에 의한 영향을 최소한으로 할 수 있기 때문에, 특히, 엔도톡신 농도를 정밀도 좋게 측정할 수 있다. 또한, 시료(960)로 되는 주사용수(940)의 점성은 충분히 낮기 때문에, 특히, 캐리어 용액 등으로 희석할 필요가 없고, 엔도톡신 검출 장치(100)로 직접 송액할 수 있다. 이것에 의해, 캐리어 용액이 불필요해지고, 시료(960)를 불필요하게 캐리어로 희석하는 것을 제거한다는 이점도 있다.
또, 시료 채취부(701)에서 채취되는 시료(960)는 가열된 상태에서 채취되게 된다. 이와 같은 고온의 시료(960)는, 엔도톡신 검출 장치(100)에 공급되기 전에, 열교환기 등에 의해 상온으로 냉각하는 것이 바람직하다.
(정제수 제조 방법)
본 개시에 관한 정제수 제조 방법은, 원수를 역침투 여과 및 이온 교환 중 적어도 한쪽에 의해 처리하여 정제수를 얻는 공정과, 상기의 본 개시에 관한 피험물질의 검출 방법을 이용하여, 상기의 정제수로부터 채취된 피험 대상의 시료를 측정하는 측정 공정을 포함하는 것이 바람직하다.
(주사용수 제조 방법)
원수를 역침투 여과 및 이온 교환 중 적어도 한쪽에 의해 처리하여 정제수를 얻는 공정과, 상기의 정제수의 고분자막 여과에 의한 여과에 의해, 또는 상기의 정제수의 증류에 의해 상기의 정제수로부터 주사용수를 얻는 공정과, 상기의 본 개시에 관한 피험물질의 검출 방법을 이용하여, 상기의 주사용수로부터 채취된 상기의 피험 대상의 시료를 측정하는 측정 공정을 포함하는 것이 바람직하다.
본 개시에 관한 정제수 제조 방법 및 주사수 제조 방법에서, 상기의 측정 공정에 사용하는 검출 방법의 바람직한 양태는 상기의 본 개시에 관한 검출 방법에서의 바람직한 양태와 마찬가지이다.
본 개시에 관한 정제수 제조 방법 및 주사수 제조 방법에서, 고감도로 피험물질을 검출할 수 있는 관점에서, 상기의 측정 공정으로는, 상기의 측정 장치를 이용하여, 상기의 정제수로부터 채취된 피험 대상의 시료를 측정하는 측정 공정을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
(검출 시약 조성물)
본 개시에 관한 검출 시약 조성물은 하기 식 (1)로 표시되는 화합물과 계면활성제를 포함한다.
식 (1)
식 (1) 중, A는 공액 다중 결합을 포함하는 기인 반응 부위를 나타내고, L은 단결합 또는 사슬 길이가 원자수 1 ~ 10인 스페이서를 나타내고, Y는 유기기인 인식 부위를 나타낸다.
본 개시에 관한 검출 시약 조성물에 포함되는 식 (1)로 표시되는 화합물은, 상술한 본 개시에 관한 검출 방법에 사용되는 식 (1)로 표시되는 화합물과 마찬가지이며, 바람직한 양태도 마찬가지이다.
본 개시에 관한 검출 시약 조성물에서, 식 (1)로 표시되는 화합물의 함유량으로는, 조성물의 전체 질량에 대하여, 1×10-5 질량% ~ 1×10-1 질량%인 것이 바람직하고, 1×10-4 질량% ~ 1×10-2 질량%인 것이 보다 바람직하다.
본 개시에 관한 검출 시약 조성물은 식 (1)로 표시되는 화합물을 1종 단독으로 포함하고 있어도 좋고, 2종 이상을 포함하고 있어도 좋다.
본 개시에 관한 검출 시약 조성물에 포함되는 계면활성제는, 상술한 본 개시에 관한 검출 방법에 사용되는 계면활성제와 마찬가지이며, 바람직한 양태도 마찬가지이다.
본 개시에 관한 검출 시약 조성물에서, 계면활성제의 함유량은 임계 미셀 농도의 0.1배 ~ 1,000배인 것이 바람직하고, 0.5배 ~ 1,000배인 것이 보다 바람직하고, 1배 ~ 100배인 것이 더욱 바람직하다. 또는 조성물의 총 질량에 대하여, 1×10-5 질량% ~ 40 질량%인 것이 바람직하고, 1×10-3 질량% ~ 2 질량%인 것이 보다 바람직하다.
본 개시에 관한 검출 시약 조성물은, 상기의 식 (1)로 표시되는 화합물 및 계면활성제 이외의 성분(기타 성분)을 더 포함하고 있어도 좋다.
기타 성분으로는, 안정화제, 완충액제, 이온 강도 조정제 등을 들 수 있다.
또한, 본 개시에 관한 검출 시약 조성물은 상기의 검출 장치에 적합하게 사용할 수 있고, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 정제수 제조 설비 또는 주사수 제조 설비에 사용하는 검출 장치에도 적합하게 사용할 수 있다. 본 개시에 관한 검출 시약 조성물은, 피험물질을 고감도로 검출할 수 있는 관점에서, 알칼리 금속, 전이 금속, 계면활성제, 세균, 인지질 또는 당지질의 검출에 사용하는 것이 바람직하고, 엔도톡신의 검출에 사용하는 것이 보다 바람직하다.
( 실시예 )
이하, 본 개시를 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 또, 본 개시는 이들 실시예로 한정되는 것은 전혀 아니다.
(실시예 1) Cu2 +-dpa-C4Py/DDAB에 의한 엔도톡신의 측정
dpa-HCC를 사용하여 엔도톡신의 측정을 시도하였다. 실험 방법은 이하와 같이 하였다.
측정 샘플로서, 엔도톡신 농도가 0.0 EU/mL ~ 100 EU/mL로 되도록, 하기의 성분을 혼합하여 10 mL 메스플라스크로 조제하여, 측정 샘플을 얻었다.
<측정 샘플의 조성>
· 식 (1)로 표시되는 화합물(특정 화합물)
dpa-C4Py: 0.01 mM(mmol/L, 이하 동일)
· 계면활성제
DDAB: 0.1 mM(도데실디메틸암모늄 브로마이드, 양이온성 계면활성제 HLB: 18.1)(초음파 처리(조건: 주파수 20㎑, 처리 시간: 3분, 장치: 형번 250, BRANSON사제)하여 베시클화한 것.) 또, 측정 샘플을 TEM(배율: 40,000배, 가속 전압: 75.0kV, 장치: 형번 H-7100, 히타치제작소제)으로 관찰한바, 베시클이 형성되어 있는 모습이 확인되었다.
· 금속 화합물(금속 이온)
Cu(NO3)2: 0.01 mM
· HEPES 완충액(pH 7.4): 5.0 mM
· 피험물질
엔도톡신 표준액(형번: 293-16541(E.Coli UKTB주 유래), 후지 필름 와코 쥰야쿠(주)제): 0.0 EU/mL, 10.0 EU/mL, 100.0 EU/mL
상기에서 조제한 엔도톡신 농도를 0 EU/mL, 10 EU/mL 및 100 EU/mL로 변화시킨 각 샘플을 각각, 광로 길이 1㎝의 석영 셀에 취하여, 형광 분광 광도계(형번: F-7000, (주)히타치 하이테크사이언스제)로 형광 스펙트럼을 측정하였다. 측정 조건은 이하와 같이 하였다.
여기 파장: 350 ㎚
개시 파장: 360 ㎚
종료 파장: 640 ㎚
본 측정 조건에 의해, 어느 샘플의 측정도 5분 이내에 종료할 수 있었다.
엔도톡신 농도를 0 EU/mL, 10 EU/mL, 및 100 EU/mL로 변화시킨 각 샘플의 형광 스펙트럼은 도 4에 나타내는 바와 같다. 도 4의 종축은 형광 강도를 나타내고, 횡축은 파장(㎚)을 각각 나타낸다.
엔도톡신 농도를 0 EU/mL ~ 100 EU/mL로 변화시킨 각 샘플은 모두 파장 377 ㎚에서 형광 강도의 피크를 나타냈다. 엔도톡신 농도에 비례하여, 파장 377 ㎚에서 형광 강도의 피크 강도가 높은 것을 알 수 있다.
또한, 각 엔도톡신 농도에 대해 파장 377 ㎚에서의 형광 강도의 검량선을 작성하였다(도 5). 도 5에 나타내는 바와 같이, 파장 377 ㎚에서는 엔도톡신의 농도가 0.1 EU/mL ~ 20 EU/mL인 경우에도 검출 가능하다는 것을 알 수 있다.
<<dpa-C4Py와 DDAB의 농도 관계>>
0 M ~ 10×10-5 M 농도의 계면활성제: DDAB와 dpa-C4Py 및 엔도톡신(100 EU/mL)을 포함하는 샘플을 조제하고, 실온(25℃, 이하 동일)에서의 형광 강도를 측정하였다. 또한, 비교 대조로서, 엔도톡신이 없는 샘플(0 M ~ 10×10-5 M 농도의 계면활성제: DDAB 및 dpa-C4Py를 포함하는 샘플)을 조정하고, 실온에서의 형광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
도 6으로부터, DDAB 농도가 2×10-5 M ~ 4×10-5 M인 경우와 DDAB 농도가 0인 경우를 비교할 경우, 엔도톡신이 존재하면 형광 강도가 3 ~ 35배로 되어 있었다. 또한, DDAB 농도가 4×10-5 M ~ 10×10-5 M인 경우와 DDAB 농도가 0인 경우를 비교할 경우, 엔도톡신이 존재하면 형광 강도가 35배 ~ 90배로 되어 있었다. 또한, DDAB 농도가 10×10-5 M 이상인 경우(10×10-5 M을 초과하는 경우는 도시하지 않음)와 DDAB 농도가 0인 경우를 비교할 경우, 엔도톡신이 존재하면 형광 강도가 90 ~ 300배로 되어 있었다.
DDAB는 임계 미셀 농도(4×10-5 M) 이상에서, 엔도톡신을 포함하는 샘플에서, 현저하게 형광 강도가 증대한다는 것을 알 수 있다.
또, DDAB 농도가 10×10-5 M인 경우와 DDAB 농도가 0인 경우의 형광 강도의 비는 후술하는 표 1에 나타내었다.
(실시예 2) Zn2 +-dpa-C4Py/DDAB에 의한 엔도톡신의 측정
실시예 1에서, Cu(NO3)2를 Zn(NO3)2로 변경하고, 엔도톡신의 농도를 100 EU/mL로 변경한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 측정 샘플을 조제하고, 마찬가지의 측정 조건으로 형광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7의 종축은 형광 강도를, 횡축은 파장(㎚)을 각각 나타낸다. 도 7에서, 엔도톡신을 포함하는 샘플에서는, 파장 377 ㎚에서의 형광 강도가 증가하는 것을 알 수 있다.
(실시예 3) Cu2 +-dpa-C4Py/CTAB에 의한 엔도톡신의 측정
실시예 1에서, 계면활성제를 CTAB(브롬화세틸트리메틸암모늄: HLB10, 양이온성 계면활성제): 2.0×10-2 M로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 하여 엔도톡신 농도를 0 EU/mL ~ 100 EU/mL로 변화시킨 측정 샘플을 조제하였다. 엔도톡신 농도를 0 EU/mL, 10 EU/mL, 및 100 EU/mL로 변화시킨 각 샘플의 형광 스펙트럼은 도 8에 나타내는 바와 같다.
또한, 각 엔도톡신 농도에 대한 파장 377 ㎚에서의 형광 강도의 검량선을 작성하였다(도 9). 도 9에 나타내는 바와 같이, 엔도톡신의 농도가 0.1 EU/mL ~ 20 EU/mL인 경우에도 검출 가능하다는 것을 알 수 있다.
<<dpa-C4Py와 CTAB의 농도 관계>>
또한, 0 mM ~ 2 mM 농도의 계면활성제: CTAB와, dpa-C4Py 및 엔도톡신(100 EU/mL)을 포함하는 샘플을 조제하고, 실온에서의 형광 강도를 측정하였다. 또한, 비교 대조로서, 엔도톡신이 없는 샘플(0 mM ~ 2 mM 농도의 각 계면활성제: CTAB 및 dpa-C4Py를 포함하는 샘플)을 조정하고, 실온에서의 형광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타낸다. 도 10의 종축은 형광 강도를, 횡축은 계면활성제의 농도(mM)를 각각 나타낸다.
CTAB는 임계 미셀 농도(1mM) 이상에서, 엔도톡신을 포함하는 샘플에서, 현저하게 형광 강도가 증대한다는 것을 알 수 있다.
도 10에서, 계면활성제 농도 2.0×10-2 M의 경우의 형광 강도와 0 mM의 경우의 형광 강도를 비교한 결과를 표 1에 나타낸다.
(실시예 4) Zn2 +-dpa-C4Py/DOPC에 의한 엔도톡신의 측정
실시예 1에서, Cu(NO3)2를 Zn(NO3)2로 변경하고, 계면활성제의 종류를 DOPC(1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, HLB: 7.2, 양성 계면활성제)로 변경한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 측정 샘플을 조제하고, 마찬가지의 조건으로 형광 강도를 측정하였다.
계면활성제 농도가 10×10-5 M의 경우의 형광 강도와, 0 mM의 경우의 형광 강도를 비교한 결과를 표 1에 나타낸다.
(실시예 5) Cu2 +-dpa-azo/PS에 의한 라우릴인산의 측정
실시예 1에서, 특정 화합물을 dpa-azo, 계면활성제의 종류를 PS(폴리솔베이트, 간토화학(주)제, 모노올레산 폴리옥시에틸렌솔비탄 HLB: 15, 비이온성 계면활성제)로 변경하고, 피험물질을 라우릴 인산(농도 0.01 mM)으로 변경한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 측정 샘플을 조제하고, 마찬가지의 조건으로 형광 강도를 측정하였다.
계면활성제 농도가 2.0×10-2 M의 경우의 형광 강도와, 0 mM의 경우의 형광 강도를 비교한 결과를 표 1에 나타낸다.
(실시예 6) Cu2 +-dpa-C6Py/DOPC에 의한 포스파티딜 콜린의 측정
실시예 1에서, 특정 화합물을 dpa-C6Py, 계면활성제의 종류를 DOPC(1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, HLB: 7.2, 양성 계면활성제)로 변경하고, 피험물질을 포스파티딜콜린(농도 0.01 mM)으로 변경한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 측정 샘플을 조제하고, 마찬가지의 조건으로 형광 강도를 측정하였다.
계면활성제 농도가 10×10-5 M의 경우의 형광 강도와, 0 mM의 경우의 형광 강도를 비교한 결과를 표 1에 나타낸다.
(실시예 7) Cu2 +-C4-APB/CTAB에 의한 갈락토 지질의 측정
실시예 1에서, 특정 화합물을 dpa-APB, 계면활성제의 종류를 CTAB(브롬화세틸트리메틸암모늄, HLB10, 양이온성 계면활성제)로 변경하고, 피험물질을 갈락토 지질(농도 0.01 mM)로 변경한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 측정 샘플을 조제하고, 마찬가지의 조건으로 형광 강도를 측정하였다.
계면활성제 농도가 2.0×10-2 M인 경우의 형광 강도와 0 mM인 경우의 형광 강도를 비교한 결과를 표 1에 나타낸다.
(실시예 8) Cu2 +-dpa-C6Py/CTAB에 의한 대장균의 측정
실시예 1에서, 특정 화합물을 dpa-C6Py, 계면활성제의 종류를 CTAB(브롬화세틸트리메틸암모늄, HLB10, 양이온성 계면활성제)로 변경하고, 피험물질을 대장균(균주명: K12W3110, 농도: 100 CFU/mL)으로 변경한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 측정 샘플을 조제하고, 마찬가지의 조건으로 형광 강도를 측정하였다.
계면활성제 농도가 2.0×10-2 M인 경우의 형광 강도와 0 mM인 경우의 형광 강도를 비교한 결과를 표 1에 나타낸다.
(비교예 1) Cu2 +-dpa-C4Py에 의한 엔도톡신의 측정
실시예 1에서, 계면활성제를 포함하지 않고, 엔도톡신의 농도를 100 EU/mL로 한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 측정 샘플을 조제하였다. 비교 대조로서, 상기의 조성에서, 엔도톡신이 없는 비교 대조 샘플 및 상기의 조성에서 엔도톡신과 금속 착체를 포함하지 않는 비교 대조 샘플을 각각 제조하였다.
측정 샘플 및 비교 대조 샘플을 각각 실시예 1과 마찬가지의 방법에 의해 형광 강도를 각각 측정하였다.
계면활성제를 포함하지 않는 비교예 1의 측정에서는, 엔도톡신을 포함하는 경우에도 형광 강도의 변화를 거의 확인할 수 없었다.
(비교예 2) Zn2 +-dpa-C4Py에 의한 엔도톡신의 측정
비교예 1에서, Cu(NO3)2를 Zn(NO3)2로 변경한 것 이외에는, 비교예 1과 마찬가지로 측정 샘플 및 비교 대조 샘플을 조제하고, 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 형광 강도를 각각 측정하였다. 계면활성제를 포함하지 않는 비교예 1의 측정에서는, 엔도톡신을 포함하는 경우에도 형광 강도의 변화를 확인할 수 없었다.
<FIA에 의한 엔도톡신의 정량성>
상기의 도 2에 나타내는 바와 같은 FIA(플로우 인젝션 분석법)를 이용한 엔도톡신 검출 장치에 의한 엔도톡신의 정량성을 검증하였다. 구체적인 검증 방법은 다음과 같다.
캐리어에는 초순수를 사용하였다. 형광 물질로는 dpa-C4Py를 사용하고, 시약은 이하의 조성으로 조제한 후, pH를 7.4로 조정하였다.
dpa-C4Py: 0.02 mM
DDAB: 0.2 mM
NaCl: 20 mM
HEPES: 10mM
Cu(NO3)2: 0.02 mM
시험 대상으로서의 엔도톡신을 함유하는 시료로서, 표준 엔도톡신을 0.2 EU/mL, 2 EU/mL, 20 EU/mL 및 200 EU/mL로 희석한 수용액을 조정하였다. 이 시료를 시료 도입부로부터 주사기로 캐리어에 첨가하였다.
측정 조건은 이하와 같이 하였다.
캐리어 유속: 0.5 mL/min
시약 유속: 0.5 mL/min
여기 파장: 350 ㎚
형광 파장: 377 ㎚
어느 엔도톡신 농도의 시료라도, 시료의 첨가로부터 40초에 형광 강도가 피크로 되었다. 이 결과로부터, FIA를 이용한 엔도톡신 검출 장치에 의해, 경시적인 엔도톡신 농도의 측정이 가능해지는 것이 추찰되었다. 또한, 시료 샘플을 3분 이내로 신속하게 온라인으로 측정하는 것이 가능해졌다. 즉, 본 실시예에서 사용한 엔도톡신 농도 0.2 EU/mL ~ 200 EU/mL의 시료는, 본 실시예에서 선택한 측정 조건에 의해 측정 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 순수 제조 설비 및 주사수 제조 설비에서 상기의 검출 장치를 사용한 결과, 주사용수의 엔도톡신의 관리 기준인 0.25 EU/mL 미만을 예방적으로 관리하기에 충분한 엔도톡신 농도인 0.01 EU/mL ~ 10 EU/mL를 정량 가능한 것으로 확인되었다. 또한, 본 개시에 관한 정제수 제조 방법 및 주사수 제조 방법에서도, 마찬가지로, 엔도톡신 농도 0.01 EU/mL ~ 10 EU/mL를 정량 가능한 것으로 확인되었다.
이상의 결과로부터, 계면활성제의 첨가 유무에 의한 광학 강도의 증가 배율을 정리하면 표 1과 같이 된다. 광학 강도의 증가 배율이 클수록, 피험물질을 고감도로 검출 가능하다고 할 수 있다.
이상의 결과로부터, 본 개시에 관한 검출 방법 및 본 개시에 관한 검출 시약 조성물인 실시예 1 ~ 8에서는, 비교예 1 및 2에 비해, 피험물질을 대체로 10배 ~ 170배 고감도로 검출 가능하다는 것을 알 수 있다.
10 형광 물질 20 형광 부위
30L (단결합 또는 스페이서) 40 인식 부위
50 엔도톡신 51 특정 부위
100 엔도톡신 검출 장치 200 시료 도입부
210 캐리어 저류조 220 캐리어 송액 펌프
230 캐리어 송액로 240 시료 도입부
300 공급부 310 시약 저류조
320 시약 송액 펌프 330 시약 송액로
340 혼합부 400 반응부
500 검출부 600 정제수 제조 설비
610 역침투막 장치(RO) 620 전기 탈염 장치(EDI)
630 한외 여과 장치(UF) 700 시료 채취부
701 시료 채취부 780 사용 장소(주사용수)
800 주사용수 제조 설비 810 주사용수(WFI) 제조 장치
820 주사용 물탱크 830 송출 라인
850 사용 장소 860 탱크
870 한외 여과 장치(UF) 880, 890 열교환기
900 원수 920 정제수
940 주사용수 960 시료

Claims (27)

  1. 피험물질 및 물을 포함하는 검체, 반응 부위와 인식 부위를 포함하는 구조를 갖는 화합물 및 계면활성제를 혼합하는 공정 A와,
    상기 인식 부위와 상기 피험물질이 상호작용하고, 상기 상호작용에 의해 발생한 상기 반응 부위에서의 반응을 검출하는 공정 B
    를 포함하는 피험물질의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은, 상기 반응 부위와 인식 부위가 스페이서를 통해 연결되어 있는 구조를 갖는, 피험물질의 검출 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 화합물은, 하기 식 (1)로 표시되는 화합물인, 피험물질의 검출 방법.
    [화학식 1]

    식 (1)
    식 (1) 중, A는, 공액 다중 결합을 포함하는 기인 반응 부위를 나타내고, L은, 단결합 또는 사슬 길이가 원자수 1 ~ 10인 스페이서를 나타내며, Y는, 피험물질과 상호작용하는 기인 인식 부위를 나타낸다.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 L은, 선 형상의 포화 알킬 사슬인, 피험물질의 검출 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 식 (1)의 Y는, 금속 배위성기 또는 산기를 포함하는 기인, 피험물질의 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 금속 배위성기 또는 산기를 포함하는 기는, 하기 식 (Y1) 또는 식 (Y2)로 표시되는 기인, 피험물질의 검출 방법.
    [화학식 2]

    식(Y1) 식(Y2)
    식 (Y1) 및 식 (Y2) 중, 물결선은, 상기 식 (1) 내의 L과의 연결 부위를 나타내고, 식 (Y2) 중, Mn+는, 금속 이온을 나타내며, n은, 자연수를 나타낸다.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 금속 이온은, 구리 이온(Cu2 +), 니켈 이온(Ni2 +) 또는 코발트 이온(Co2 +)인, 피험물질의 검출 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 계면활성제의 HLB 값은, 6 ~ 40인, 피험물질의 검출 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 계면활성제는, 양이온성 계면활성제, 양성(兩性) 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제인, 피험물질의 검출 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물은, 상기 계면활성제와 분자 집합체를 형성할 수 있는 화합물인, 피험물질의 검출 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험물질은, 인지질 및 당지질 중 적어도 하나를 포함하는, 피험물질의 검출 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험물질은, 엔도톡신이고,
    상기 화합물은, 하기 식 (1A) 또는 C4-APB로 표시되는 화합물인,
    피험물질의 검출 방법.
    [화학식 3]

    식 (1A) ( C4- APB )
    상기 식 (1A) 중, m은, 0 ~ 6을 나타내고, Mn+는, 금속 이온을 나타내며, n은, 자연수를 나타낸다.
  13. 하기 식 (1)로 표시되는 화합물, 및
    계면활성제
    를 포함하는 검출 시약 조성물.
    [화학식 4]

    식 (1)
    식 (1) 중, A는, 공액 다중 결합을 포함하는 기인 반응 부위를 나타내고, L은, 단결합 또는 사슬 길이가 원자수 1 ~ 10인 스페이서를 나타내고, Y는, 유기기인 인식 부위를 나타낸다.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 L은, 선 형상의 포화 알킬 사슬인, 검출 시약 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 식 (1)에서의 Y는, 금속 배위성기 또는 산기를 포함하는 기인, 검출 시약 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 금속 배위성기 또는 산기를 포함하는 기는, 하기 식 (Y1) 또는 식 (Y2)로 표시되는 기인, 검출 시약 조성물.
    [화학식 5]

    식(Y1) 식(Y2)
    상기 식 (Y1) 및 식 (Y2) 중, 물결선은, 상기 식 (1) 내의 L과의 연결 부위를 나타내고, 식 (Y2) 중, Mn+는, 금속 이온을 나타내며, n은, 자연수를 나타낸다.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 금속 이온은, 구리 이온(Cu2 +), 니켈 이온(Ni2 +) 또는 코발트 이온(Co2 +)인, 검출 시약 조성물.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 계면활성제의 HLB 값은, 6 ~ 40인, 검출 시약 조성물.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 계면활성제는, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제인, 검출 시약 조성물.
  20. 피험물질 및 물을 포함하는 검체가 도입되는 시료 도입부와,
    제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 검출 시약 조성물을 상기 검체에 공급하는 공급부와,
    상기 검체와 상기 검출 시약 조성물이 반응하는 반응부, 및
    상기 반응을 검출하는 검출부
    를 구비하는 검출 장치.
  21. 원수를 역침투 여과하는 역침투막 장치 및 원수를 이온 교환하는 이온 교환 장치 중 적어도 하나에 의해 상기 원수로부터 정제수를 얻는 정제수 제조부와,
    상기 정제수로부터 상기 피험 대상의 시료를 채취하는 시료 채취부, 및
    청구항 20에 기재된 검출 장치
    를 구비하는 정제수 제조 설비.
  22. 원수를 역침투 여과하는 역삼투막 장치 및 원수를 이온 교환하는 이온 교환 장치 중 적어도 하나에 의해 상기 원수로부터 정제수를 얻는 정제수 제조부와,
    상기 정제수를 여과하는 고분자막 여과 장치 또는 상기 정제수를 증류하는 증류기에 의해 상기 정제수로부터 주사용수를 얻는 주사용수 제조부와,
    상기 주사용수를 가열한 상태로 유지하여 저류하는 주사용수 탱크와,
    상기 주사용수 탱크에 구비되어 있는 상기 주사용수를 소정의 사용 장소로 송출하는 송출 라인과,
    상기 주사용수로부터 상기 피험 대상의 시료를 채취하는 시료 채취부, 및
    청구항 20에 기재된 검출 장치
    를 구비하는 주사용수 제조 설비.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 시료 채취부는, 상기 주사용수 제조부보다 하류측에서 그리고 상기 주사용수 탱크보다 상류측에서, 상기 주사용수 탱크로부터 직접, 또는 상기 송출 라인으로부터 상기 시료를 채취하는, 주사용수 제조 설비.
  24. 원수를 역침투 여과 및 이온 교환 중 적어도 하나에 의해 처리하여 정제수를 얻는 공정, 및
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법을 이용하여, 상기 정제수로부터 채취된 피험 대상의 시료를 측정하는 측정 공정
    을 포함하는 정제수 제조 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 측정 공정은, 제20항에 기재된 검출 장치를 이용하여, 상기 정제수로부터 채취된 피험 대상의 시료를 측정하는 측정 공정을 포함하는, 정제수 제조 방법.
  26. 원수를 역침투 여과 및 이온 교환 중 적어도 하나에 의해 처리하여 정제수를 얻는 공정과,
    상기 정제수의 고분자막 여과에 의한 여과에 의해, 또는 상기 정제수의 증류에 의해 상기 정제수로부터 주사용수를 얻는 공정, 및
    제1항 ~ 제12항 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법을 이용하여, 상기 주사용수로부터 채취된 상기 피험 대상의 시료를 측정하는 측정 공정
    을 포함하는 주사용수 제조방법.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 측정 공정은, 제20항에 기재된 검출 장치를 이용하여, 상기 정제수로부터 채취한 피험 대상의 시료를 측정하는 측정 공정을 포함하는, 주사용수 제조 방법.
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