JP2561928B2 - 発色性化合物およびそれらの製造法 - Google Patents

発色性化合物およびそれらの製造法

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JP2561928B2 JP62211504A JP21150487A JP2561928B2 JP 2561928 B2 JP2561928 B2 JP 2561928B2 JP 62211504 A JP62211504 A JP 62211504A JP 21150487 A JP21150487 A JP 21150487A JP 2561928 B2 JP2561928 B2 JP 2561928B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な発色性化合物に関するものである。そ
れら化合物は蛋白分解酵素を検出するための診断用の酵
素基質として適当である。本発明による新規な化合物は
特にエンドプロテアーゼ特にアミノ酸たとえばアルビニ
ン、リジンまたは芳香族の側鎖を有するアミノ酸の後ろ
でペプチドおよび蛋白質を解裂するエンドプロテアーゼ
を定量するために使用される。従つてこれらの発色性化
合物は上記の酵素を産生するか、消費するか、または阻
害する反応を定量するために使用することができる。
本発明の属する技術水準によればアミド結合を介して
ペプチドまたはペプチド誘導体に結合していて、蛋白質
分解酵素により解裂することができる発色団はこの目的
で使用されるものである。特にその酵素が測光的にかま
たは螢光分析的に定量しうる基を解裂することができる
ようなペプチド基質はこれまでに知られている（ヨーロ
ツパ特許出願第0,046,742号およびドイツ特許第3,244,0
30A1号各明細書参照）酵素を測光的に測定するために
は、現在までp-ニトロアニリンの好ましいペプチド誘導
体が使用されてきた。酵素的に解裂されたp-ニトロアニ
リンは波長405nmで測定される。発色性基質に重要な必
要条件は試験バツチにおいて溶解度が高く、測定する際
に特異性および感度が高く、そして取り扱いおよび検出
が容易であることである。これらの必要条件は現在まで
使用されてきた基質においては満足できる程度に満たさ
れてはいないので、改良が求められている。
p-ニトロアニリンまたはその誘導体の測光的評価は、
405nmにおける測定は血漿成分または他の体液により妨
害されるかまたは測定不能になるから特に不利である。
580nmより上で測光的に定量するためには、基質を解裂
したのちに化学反応により色素を生成するような物質が
すでに記載されている。しかしながらこれらの反応は終
点測定を可能にするだけである。なぜならば有機または
無機の化合物質を加えることにより酵素反応の速度論的
追跡がしばしば妨害されるか、または少なくとも極端に
不便になるからである〔ヨーロツパ特許出願第0,076,04
2号明細書、エイチシークワーン氏ら著「トロンブレ
ス」（H.C.Kwaan氏ら著「Thromb.Res.」）第13巻第５〜
13頁（1978年）を参照〕。
本発明は有利な溶解度および特異性を有し、そして血
液、血漿成分または他の体液の存在下で蛋白質分解酵素
の定性的および定量的測定を可能にするような発色性化
合物を提供するという目的を有する。
従つて本発明は （ただし式中、Ｘは水素原子、末端アミノ基を非可逆的
にマスクする基、またはペプチド化学において通常使用
される保護基たとえばBoc-、Z-またはFmoc-を表わし、 ＡおよびＢは同一または異なり、２〜15個の炭素原
子、４個までの窒素原子、２個までの硫黄原子、および
６個までの酸素原子を含有し、そしてその側鎖が置換さ
れうるものであるα−，β−またはγ−アミノ酸を表わ
し、そしてＢは場合によつてこれらのアミノ酸から形成
されたジペプチドを表わし、 Ｃはアルギニン、リジン、チロシン、フエニルアラニ
ンまたはトリプトフアンおよびそれらの同族体を表わ
し、 R1およびR2は同一または異なり、水素原子または４個
までの炭素原子を有するアルキル基を表わし、 R3〜R8は同一または異なり、水素、アルキル基、アル
コキシ基またはハロゲン基を表わし、 Ｙは酸素を表わし、そして An-はアニオンたとえばクロリドまたはアセテートを
表わす）の化合物およびそれらの水溶性の塩たとえばフ
マール酸塩、酢酸塩または塩酸塩に関する。
本発明による化合物の本質的特徴は芳香族複素環を有
する発色団である。これにより先行技術と比較して本質
的利点が得られる。驚くべきことには式（II） （ただし式中、R1〜R8およびＹは上記の意味を有する）
の型の発色団にアミノ酸を結合させることにより70nmま
たはそれ以上の浅色シフトを引き起こすことが見い出さ
れた。このことは本質的に青色の染料がペプチド結合の
形態で赤色を有することを意味する。従つて本発明は共
有結合をした形態の式IIによる染料を含有し、そして遊
離色素の吸収極大およびその結合した色素のそれとの差
が70nmまたはそれ以上であり、遊離の発色団の吸収波長
が550nmより大きいという事実を特徴とする式Ｉの物質
に関する。この長波長を吸収することにより特に試験片
の光ダイオードまたは反射分光法（reflecto-metric）
による試験評価が可能になる。この種の評価は短波領域
たとえば405nmにおいては可能ではない。この好ましい
スペクトル上の性質は体液の存在下でたとえば血液中で
の酵素活性の測定を可能にする。なぜならば染料系の吸
収波長はヘモグロビンの吸収波長から充分に離れている
からである。通常の光度計を使用する評価の機会も有利
である。洗料（式II）のモル吸光率はp-ニトロアニリン
の６〜10倍である。
先行技術と比較して記載される利点はさらに本発明に
よる化合物が極めて溶解性に富み、そしてその基質はす
ぐれた特異性を特徴とするという事実により支持され
る。
本発明による化合物は本来ペプチド化学において一般
的に使用される方法により製造される。好ましく使用さ
れるアミノ酸は特に記載しない限りL-形で存在する。ア
ミノ酸という用語は２〜15個の炭素原子を含み、そして
４個までの窒素原子、２個までの硫黄原子および６個ま
での酸素原子を有するα‐，β‐またはγ‐アミノ酸を
表わす。ＡおよびＢに定義されたアミノ酸は天然に存在
するアミノ酸ばかりでなく、たとえばピペコリン酸、ア
ゼチジンカルボン酸またはフエニルグリシンのようなア
ミノ酸であることもできる。
新規な発色性化合物は本発明によりジベンゾ‐1,4-オ
キサジン（フエノキサジン）から誘導される発色性の基
を含む。式IIに示されるようにこれらの染料系には助色
性の基特にジアルキルアミノ基およびジアルキルアミノ
基に対して鏡像の位置に存在するアミノ基がそなえられ
ている。式IIに示される基R3〜R8は同一または異なり、
水素原子、ハロゲン原子、３個までの炭素原子および７
個までの水素原子を有するアルキル基、または３個まで
の炭素原子および７個までの水素原子を有するアルコキ
シ基であつてもよい。芳香族系の第１アミノ基は本発明
によりアミノ酸またはペプチドとアミド結合を形成する
ことができる。
従つてまた本発明は式IIに対応するフエノキサジン誘
導体を保護されたアミノ酸、アミノ酸誘導体またはペプ
チドと反応させることから成る、本発明の発色性基質の
製造法に関する。その反応性の基は炭素末端アミノ酸を
製造する間に色素の第１アミノ基と反応してはいけない
ので、活性に応じてそれらを保護しなければならない。
一時的に使用される保護基は好ましくはウレタン型の保
護基である。これらにはたとえば第３ブトキシカルボニ
ル基、ベンゾキシカルボニル基またはビフエニリルプロ
ポキシカルボニル基が含まれる。連続的ペプチド合成の
観点からアミノ酸またはペプチドの反応性側鎖にも保護
基をそなえることができ、必要な場合には合成が終わる
までそれを除去しないでもよい。従つてたとえばアルビ
ニンのグアニジノ基をニトロ基、トシル基によるかまた
はプロトン化により保護し、アスパラギン酸およびグル
タミン酸のカルボキシル基をエステル化により、オルニ
チンおよびリジンのアミノ基をウレタン型保護基によ
り、そしてチロシンのフエノール性の基をエーテル化に
より保護することができる。保護基組合わせの選択は、
ペプチド化学において通常知られている技術上の条件に
よるので、それらの多様性はかなり大きく、従つて上記
の保護基は単に例としてあげたにすぎない。
アミド結合またはペプチド結合はペプチド化学におけ
る通常の方法により生成される。保護されたアミノ酸ま
たはペプチドのカルボキシル基はこの場合通常活性化さ
れ、そして反応成分のアミノ基と反応せしめられる。カ
ルボキシル基はたとえばカルボジイミド、アジド、酸無
水物、アシルクロリドまたは活性化されたエステル法に
より活性化され、反応成分との結合反応は通常使用され
る溶媒たとえばジメチルホルムアミド、メチレンクロリ
ド、クロロホルム、ピリジン、ジメチルスルホキシドま
たはヘキサメチレンホスホリツクトリアミドまたはその
代替物中で、適当な場合には塩基を添加して行われる。
本発明による方法において出発物質として使用されるフ
エノキサジン誘導体を対応するイソシアネートに変換
し、それをアミノ基が保護されたアミノ酸と反応させる
こともできる。
使用される発色団は好ましくはつぎの構造式を有する
フエノキサジン誘導体である。
これらの深青色発色団は好ましい方法でDCC/HOBt法に
より保護されたアミノ酸と反応せしめられ赤色化合物を
与える。アミノ酸であるアルギニンが使用される場合に
は、Ｎα‐基をBoc、ＺまたはFmoc基で保護し、そしてN
G基をニトロ、ジ‐ＺまたはMtr基で保護する。リジンの
場合には保護基BOc/Zが選ばれる。
両方の発色団すなわちカラーインデツクスベーシツク
ブルー49およびカラーインデツクスベーシツクブルー12
4の場合には、スペクトル上の性質が類似しており、そ
れらの吸収極大の差が5nmよりも小さいような化合物が
得られる。このようにこれらの色素は生理学的緩衝系中
で約625nmに吸収を示すが、これとは対照的にペプチド
が結合した色素は545nmに吸収を示す。
ジ‐、トリ‐またはテトラペプチド基質に組み立てる
のは段階的にすなわち保護され活性化されたアミノ酸を
導入することにより行われるが、別法としては、そして
有利には保護され、活性化されたオリゴペプチドを導入
することにより行われる。N-末端アミノ酸は好ましくは
Ｄ形で存在するか、または保護基またはN-末端を封鎖す
る非可逆的な基たとえばトシル、ベンゾイル、アセチル
またはベンゾイルオキシカルボニルを有する。
必要な場合に解裂されるべき永久保護基は特に合成の
終点で好ましく除去される。酸分解により除去すること
ができる保護基は1.2N塩酸／氷酢酸またはトリフルオロ
酢酸を使用して除去される。加水素分解により除去する
ことができる保護基はたとえばパラジウム／活性炭を使
用して水素気流中で解裂され、その際発色団の色の性質
は可逆的に消失する。
NGの保護基の穏和な除去に関しては、穏和な酸性条件
下で除去できる基が特に好ましいことが証明された。特
にNG‐Mtr基はこの場合に有利な挙動を示す。
本発明をさらによく理解せしめるために以下に実施例
をあげて説明する。使用される略語に関しては本明細書
の末尾を参照されたい。
実施例１ 7-（D-フエニルアラニル‐L-プロリル‐L-アルギニルア
ミノ）‐3-ジエチルアミノ‐8-メチルフエノキサゾニウ
ムトリアセテート 段階A:7-（Ｎα‐Boc-NG‐Mtr-L-アルギニルアミノ）‐
3-ジエチルアミノ‐8-メチルフエノキサゾニウムトリア
セテートヘミテトラクロロジンクエート N-Boc-NG‐Mtr-L-アルギニン4.3g、7-アミノ‐3-ジエ
チルアミノ‐8-メチルフエノキサゾニウムヘミテトラク
ロロジンクエート2.54gおよびHOBt1.22gをジメチルホル
ムアミド100mlに溶解し、そしてNMM1.1mlを加える。こ
の反応バツチを氷浴中で冷却し、そしてDCC2.1gを加え
る。２時間後にこの混合物を室温まで昇温せしめ、そし
てカツプリング反応を６時間続行する。沈殿したDCUを
去し、そして溶媒を真空下で蒸発除去する。残留物を
ブタノールに溶解し、水で３回抽出し、そして真空下で
少量になるまで濃縮する。酢酸エチルを使用して生成物
を沈殿させ、結晶を過し、そして高度真空下で乾燥す
る。
収量:4.7g 定性:TLC RF＝0.15 （Ｂ） RF＝0.39 （Ａ） 段階B:7-NG‐Mtr-アルギニルアミノ‐3-ジエチルアミノ
‐8-メチルフエノキサゾニウムジ塩酸塩 段階Ａで得られた生成物1.2gを1.2N塩酸／氷酢酸50ml
で30分間処理する。解裂試薬を真空下で蒸発除去し、そ
してトルエンとともに２回蒸発させる。凍結乾燥したの
ち赤色結晶性粉末950mgが得られる。
純度試験:TLC RF＝0.17 （Ａ） 段階C:7-（Ｎα‐Boc-D-フエニルアラニル‐L-プロリル
‐NG‐Ntr-アルギニルアミノ）‐3-ジエチルアミノ‐8-
メチルフエノキサゾニウム塩酸塩 段階Ｂで製造された生成物720mgをHOBt135mgおよびBo
c-D-Phe-Pro-OH362mgとともにジメチルホルムアミド25m
lに溶解し、そしてその混合物を氷浴中で４℃に冷却す
る。DCC215mgを加え、そしてその混合物を４℃で２時
間、そして室温で12時間攪拌する。沈殿したDCUを去
し、そして溶媒を蒸発除去する。油状残留物をシリカゲ
ルのクロマトグラフィー（KG60 40〜63μm100g、溶媒
Ｄ）に付す。さらに精製するために生成物を(R) セフ
アデツクスLH20のクロマトグラフイー（メタノール）に
付す。
収 量:290mg 純度試験:TLC RF＝0.48 （Ｄ） 段階D:7-（D-フエニルアラニル‐L-プロリル‐L-アルギ
ニルアミノ）‐3-ジエチルアミノ‐8-メチルフエノキサ
ゾニウムトリアセテート 段階Ｃで得られた基質200mgを充分に乾燥したのちト
リフルオロ酢酸4.5mlおよびアニソール0.5mlを用いて40
℃で４時間処理する。酸を真空下で留去し、そして残留
物をCM-セルロースのイオン交換クロマトグラフイー
（ホワツトマンCM32、酢酸アンモニウムグラジエント0.
01M pH4.5から0.3M pH6.8まで）により精製する。凍結
乾燥をくり返すことにより溶出緩衝液を除去する。
収 量:135mg赤色粉末 純度試験:TLC RF＝0.27（20/10/2/1） アミノ酸分析:Phe＝0.98 Pro＝1.04 Arg＝1.00 ペプチド含量＝ 96％ 実施例２ 7-（L-アラニル‐L-アラニル‐L-フエニルアラニル）‐
2-ジエチルアミノ‐8-メチル‐フエノキサゾニウムジア
セテート 段階１ 7-（Boc-L-フエニルアラニル）‐3-ジエチルア
ミノ‐8-メチルフエノキサゾニウムヘミテトラクロロジ
ンクエート Boc-L-Phe1.33g、7-アミノ‐3-ジエチルアミノ‐8-メ
チルフエノキサゾニウムヘミテトラクロロジンクエート
1.41gおよびHOBt0.76gをDMF50mlに溶解し、そしてその
混合物を０℃に冷却する。NMM0.55mlおよびDCC1.05gを
加える。この反応混合物を氷浴中で２時間そして室温で
３時間攪拌する。沈殿したDCUを別し、そして残留物
をメタノールに溶解する。エーテルを加えることにより
生成物を沈殿させる。結晶を吸引過し、そして高度真
空下で乾燥する。
収量:1.95g 純度試験:TLC RF＝0.77 （Ｃ） 段階２ 7-L-フエニルアラニル‐3-ジエチルアミノ‐8-
メチルフエノキサゾニウムジ塩酸塩 段階１で製造した生成物1.8gを1.2N塩酸／氷酢酸50ml
とともに25分間攪拌してBoc基を除去する。解裂試薬を
真空下で留去し、そして油状生成物をトルエンとともに
２回蒸発除去する。残留物を水に溶解し、そしてブタノ
ール／酢酸エチル混合物（1:2容量部）で２回抽出す
る。水相を凍結乾燥する。
収量:1.65g 純度試験:TLC RF＝0.26 （Ｄ） 段階３ 7-Boc-L-アラニル‐L-アラニル‐L-フエニルア
ラニル‐3-ジエチルアミノ‐8-メチルフエノキサゾニウ
ム塩酸塩 Boc-Ala-Ala-OH1g、HOBt0.58gおよび段階２で製造し
た生成物1.6gをDMF50mlに溶解し、そしてその混合物を
氷浴中で冷却する。DCC 0.8gおよびNMM420μｌを加え、
その混合物を氷浴中で１時間、そして室温で４時間攪拌
する。不溶性物質を去し、そして溶媒を真空下で蒸発
除去する。油状残留物をシリカゲルのクロマトグラフィ
ー（シリカゲル100g、40〜63μｍ、溶出剤Ｄ）に付す。
さらに精製するためには生成物を(R)セフアデツクスLH2
0のクロマトグラフイー（メタノール）に付す。
収量:820mg 純度試験:TLC RF＝0.45 （Ｄ） 段階４ 7-L-アラニル‐L-アラニル‐L-フエニルアラニ
ル‐3-ジエチルアミノ‐8-メチルフエノキサゾニウムジ
アセテート 段階３で得られた生成物300mgを1.2N塩酸／氷酢酸20m
l中で25分間攪拌する。その酸を真空下で留去し、そし
てトルエンとともに（２回）蒸留することにより付着し
ている痕跡の酸を除去する。残留物をイオン交換クロマ
トグラフィー（ホワツトマンCM32、酢酸アンモニウムグ
ラジエント0.01M、pH4.2から0.3M、pH6.8まで）により
精製する。純粋な生成物は凍結乾燥により結晶の形態で
得られる。
収量:160mg 純度試験:TLC RF＝0.53（20/10/2/1） アミノ酸分析:Ala 2.06 Phe 1.00 ペプチド含量:0.89％ 表１に列挙された化合物／基質は同様の方法で製造さ
れる。
基質試験 酵素溶液100μｌを緩衝液（トリスヒドロキシアミノ
メタン、50mmol/l）800μｌ（pH8.0）に37℃で加え、そ
して2mmol/lの基質溶液100μｌを加える。解裂したpNA
を405nmで測定し青色49または青色124を623nmで測定す
る。１分間あたりの工学濃度として解裂速度を測定す
る。
相対的解裂速度、すなわち基質および酵素の特異性は
表IIからわかる。
略 語 pNA p-ニトロアニリン 青色49 7-アミノ‐3-ジエチルアミノ‐8-メチルフエノ
キサゾニウムヘミテトラクロロジンケート（またはアセ
テート） 青色124 7-アミノ‐3-ジエチルアミノ‐8-メトキシフ
エノキサゾニウムヘミテトラクロロジンクエート（また
はアセテート） NG アルギニングアニジノ官能基の窒素基 Mtr 4-メトキシ‐2,3,6-トリメチルフエニルスルホ
ニル Boc 第３ブトキシカルボニル HOBt ヒドロキシベンゾトリアゾール DMF ジメチルホルムアミド NMM N-メチルモルホリン DCC ジシクロヘキシルカルボジイミド DCU ジシクロヘキシル尿素 TLC 薄層クロマトグラフイー RF 保持因子 AcOH 氷酢酸 MeOH メタノール OD 光学濃度 Ｚ カルボベンゾキシ Fmoc 9-フルオレニルオキシカルボニル 薄層クロマトグラフイーのための溶出剤 Ａ ブタノール／氷酢酸／水 3:1:1（容量部） Ｂ クロロホルム／メタノール／氷酢酸 50:10:5（容量
部） Ｃ クロロホルム／メタノール／氷酢酸 50:10:2.5（容
量部） Ｄ クロロホルム／メタノール／氷酢酸 50:15:3（容量
部） アミノ酸に対する略語はIUPACIUB規則〔「バイオケム
ジエイ」（Biochem.J.）第219巻第345〜373頁 1984
年〕と同一である。

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式（Ｉ） （ただし式中、Ｘは水素原子、末端アミノ基を非可逆的
    にマスクする基、またはペプチド化学において通常使用
    される保護基を表し、 ＡおよびＢは同一または異なり、２〜15個の炭素原子、
    ４個までの窒素原子、２個までの硫黄原子、および６個
    までの酸素原子を含有し、そしてその側鎖が置換されう
    るものであるα−、β−またはγ−アミノ酸を表し、そ
    してＢは場合によってこれらのアミノ酸から形成された
    ジペプチドを表し、 Ｃはアルギニン、リジン、チロシン、フェニルアラニン
    またはトリプトファンを表し、 R1およびR2は同一または異なり、水素原子または４個ま
    での炭素原子を有するアルキル基を表し、 R3〜R8は同一または異なり、水素、アルキル基、アルコ
    キシ基またはハロゲン基を表し、 Ｙは酸素を表し、そして An-はアニオンを表す）の化合物およびそれらの水溶性
    の塩。
  2. 【請求項２】Ｘが水素原子であり、そしてアミノ酸であ
    るＡがキラルアミノ酸であるならばＡはＤ−形で存在す
    る、特許請求の範囲第１項記載の化合物。
  3. 【請求項３】式（Ｖ） （ただし式中、Ｘ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＹは特許請求の範
    囲第１項記載の意味を有し、 R1およびR2は同一または異なり、メチル、エチルまたは
    プロピル基または水素原子であり、そして R7は水素原子またはメチル、エチル、プロピル、メトキ
    シまたはエトキシ基である）の化合物。
  4. 【請求項４】式（II） （ただし式中、R1およびR8、An-、ＹおよびＣは式
    （Ｉ）と同様の意味を有するが、アミノ酸の他の反応性
    の基は保護基で保護されていてもよい）のアミノ酸誘導
    体を式（III） Ｘ−Ａ−Ｂ−OH （III） （ただし式中、Ｘ、ＡおよびＢは上記の意味を有する
    が、ただしＸは水素ではなくて保護基またはＮ−末端を
    非可逆的に封鎖する基である）のオリゴペプチドと縮合
    させるか、または式（IV） Ｘ−Ａ−OH Ｘ−Ｂ−OH （IV） （ただし式中、Ｘ、ＡおよびＢは上記の意味を有する）
    を有する保護されたアミノ酸と縮合させることからな
    る、特許請求の範囲第１項記載の式（Ｉ）の化合物の製
    造法。
  5. 【請求項５】特許請求の範囲第１、２または３項記載の
    化合物からなるエンドプロテアーゼの定性的または定量
    的測定試薬。
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