JPS5890535A - 新規な発色性ペプチド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特定酵素活性測定用の発色性基質又は、その
合成中間体として有用な新規ペプチド誘導体であり、さ
らに詳しくは、４−アルギニルアミノ−Ｎ、Ｎ−ジアル
キルアニリンとそめ誘導体〔１〕及び（ＩＩ）並びにそ
れらの酸付加塩に関するものである。

各種酵素の作用や力価を測定するには、その酵素により
特異的な作用を受ける物質にその酵素を作用させ、作用
前後の状態を比較する方法が通常行われる。この際に使
用される酵素に特異的な作用を受ける物質、即ち基質と
して天然に存在する物質や種々の合成ペプチド誘導体が
開発され報告されている。

カブトガニの血球抽出液（アメボサイト・ライセード）
が微量の細菌内毒素と反応してケル化する現象をもとに
した内毒素の微量検出法が開発され実用化されている。

しかし米国薬局方［Ｕ、　Ｓ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅ　ｊａ　ＸＸ　−８８８（１９８
０）　、）に採用されたケ九の固さを肉眼的に判定する
方法をはじめ、濁度測定法、フロント蛋白定量法等があ
るがいずれもゲル化現象に基づくため精度が良くない。

又「新規な色素体酵素基質Ｊ　（特開昭５１−８３５３
５）の発明は、Ｒ＋　　ＡｌＡｔ　　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ
−ＮＨ＝　Ｒｔで示される色素体基質を用い酵素作用を
受けて遊離した発色体を分光光度計で測定する事を特徴
としているが、不法では血液試料中の色素成分による妨
害を受けやすい欠点がある。

本発明者らは、簡便で高感度に、さらに血液試料中の色
素成分による妨害を避けうるための特定酵素（グロテア
ーゼ）の活性を測定できる酵素の基質を得るため鋭意研
究を重ねた結果、特許請求管 ＮＨ ■ Ｃ＝ＮＨ ■ ＮＨ。

で示されるペプチド誘導体を合成することに成功し、さ
らにこの新規ペプチド誘導体が、簡便で高感度にその活
性測定ができる血液凝固酵素例えは、カブトガニ血中の
アメボサイト・ライセードもしくはその中に含まれ、該
ライ−セードから分離された酵素成分（アミダーゼ前駆
物質が、内１素により活性化されてアミダーゼ様物質に
変イヒする）の基質となることを見出し、本発明を完成
するにキクた。但し、式中、Ｒ７はロイシル基、バリル
基、パリルーロイシル基等の疎水性アミノ酸又は、保護
基等の疎水性基であり、Ｒ１はＨ，ＣＨ，、Ｒ１、Ｒ４
は、ＣＨ，、ＣｔＨｓ、Ｃ，Ｈ，ＯＨ％Ｃ，Ｈ，ＮＨＣ
ＯＣＨ，、Ｃ，Ｈ，ＮＨ３ｏｔ　ＣＨｓである。

前記一般式のペプチド誘導体において、Ｎ−末端アミン
基はアセチル、ベンゾイル等アシル基、カルボベンゾキ
シ基、第３アルキルオキシカルボニル基、トシル基、グ
ルタリル基等のペプチドのＮ−末端アミノ基の保護基と
して常用されているもので保護されていてもよい。

また、分子を構成するアルギニンのグアニジノ基は保護
されていてもよく、その保護基としては、ニトロ基、ト
シル基、Ｐ−メトキンペンセンスルホニル基、４−メト
キシ−２，６−シメチルベンゼンスルホニル基等ペプチ
ド合成に慣用されているＮ−グアニジノ保護基、その低
酸付加塩のごとくプロトンを付加したものも採用できる
。

前記ペプチド誘導体は、酢酸、塩酸等の酸性カロ塩や水
和物の形であってもよい。

本発明の４−（Ｎ、Ｎ−ジアルキル 導体は、例えば、下記のようにして製造することができ
る。

アミノ基及びグアニジノ基が保護されたアルギニンある
いはグアニジノ基が保護されていないアルギニンと４−
アミノ−Ｎ．Ｎ　−　シアルキルアニ１ノン誘導体をジ
シクロヘキシルカルボジイミドＣＣＤ）等ペプチド合成
に慣用される縮合剤の存在下で反応させた後、ペプチド
合成に慣用されている方法に従って本発明のペプチド誘
導体を製造することができる。

上記のごとくして得た４−（Ｎψ−保護アルキ！−ルア
ミノ）−Ｎ、Ｎ−ジアルキルアニリンを出発原料として
、さらにペプチド合成に慣用されている方法に従って本
発明の発色性ペプチド誘導体を製造することができる。

例えば、アミン基が保護されたグリシンおよび、ロイシ
ル−グリシン、バリル−グリシン、バリルーロイシルー
グリシント上記Ｎａ−無保護の４−（！−保護アルギニ
ルアミノ）−Ｎ、Ｎ−ジアルキルアニリン誘導体と前記
縮合剤の存在下で反応させるか、あるいは前記グリシン
およヒ、ロイシル−グリシン、バリル−グリシン、バリ
ル−ロイシル−グリシンの活性エステルと上記４−（Ｎ
”−保護アルギニルアミノ）　−Ｎ、Ｎ−ジアルキルア
ニリン誘導体と反応させた後、同様に保護基を脱離させ
ると、４−１Ｎ”−保護グリンルーアルギニル）−アミ
ノ）−Ｎ、Ｎ−ジアルキルアニリン誘導体が得られるし
、同様に４−（（Ｎ“−保護ロイシル−グリシル−アル
ギニル）−アミノ）−Ｎ、Ｎ−ジアルキルアニリン誘導
体、４−〔（Ｎａ−保１１ハＩＪルークリシル−アルギ
ニル）アミン）−Ｎ、Ｎ−ジアルキルアニリン誘導体４
体、４−４（Ｎ”−保護ハＩＪルーロインルークｌ）ン
ルーアルギニル）−アミノ）−Ｎ、Ｎ−ジアルキルアニ
リン誘導体をそれぞれ得ることが出来、これらはいずれ
も新規化合物である。

本発明のペプチド誘導体を製造する時の縮合反応はいず
れも適当な溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラハイ
ドロフラン（ＴＨＦ）　、水あるいはこれらの混合物の
中で行うのがよい。アミノ基成分と反応させるカルボキ
シル基成分は、活性エステルの形で用いるのが有利であ
るが、この活性エステルとしては１．Ｎ−ヒドロキンス
クンンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキ／−５−ノルボル
ネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル（ＨＯＮＢ
）　、１−ヒドロキシ−ベンツトリアゾールエステル、
Ｐ−ニトロフェニルエステルナトが、好適である。この
活性エステルを用いた反応は室温でも充分に進行するが
、所望に応じ加熱して反応を促進させることもできる。

反応終了後、反応混合物を濃縮乾固し、残留物をカラム
クロマトグラフィーにより精製し、次いで凍結乾燥する
。

これらの化合物の中で、アミン基又はカルボキシル基に
保護基を有するものは、例えばカルボベンゾキシ基やベ
ンジルニステルハ、アルコールのような溶液中で水素添
加することにより、第３級ブチルオキシカルボニル基は
酢酸等の溶媒中トルエンスルホン酸と９０分程度反応さ
せることにより除去しうる。

本発明のペプチド誘導体において、所望に応じ遊離形の
ものは酸付加塩に、又、酸付加塩のものは遊離形のもの
にそれぞれ変換することができる。

この付加塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リ
ン酸塩などの無機塩、酢酸塩、シーウ酸塩、酒石酸塩、
コ・・り酸、クエン酸、トルエンスル酸塩などの有機酸
塩がある。

前記のごとくして製造したペプチド誘導体の同定は、薄
層クロマトグラフィー、元素分析、アミノ酸分析により
行った。

本発明のペプチド誘導体は、４−アミノ−Ｎ、Ｎ−ジア
ルキルアニリンが、Ｒ＋　　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ−で小さ
れるペプチド性残基中のＡｒｇのＣ末端と４−位のアミ
ノ基とで酸アミド°結合により連結したものではあるが
、前記アミダーゼ様物質の作用を受けて、この酸アミド
結合が容易に酵素的に加水分解されて４−アミノ−Ｎ、
Ｎ−ジアルキルアニリノを遊離スる。遊離した４−アミ
ノ−Ｎ、Ｎ−ジアルキルアニリンを適当な酸化剤の存在
下、フェノール、ナフトール類等と酸化縮合させ、生成
する青色のインドフェノール型色素の最大吸収波長にお
いて吸光度を測定することによりカスケード的に内毒素
を定量的に検出出来る。

青色色素 本発明ペプチド基質を用いた測定法では、血液試料ｏ共
存物ＩＩ　Ｃ特にヘモグロビン、ビリルビン等）の影響
を受けにくい方法であり、とくに黄桓。

血のような臨床材料では、従来のｐ−ニトロアニリド基
質から生成するｐ−ニトロアニリンの黄色の吸収妨害を
受けるが、本ペプチド基質を用いた場合、測定波長が６
００〜７００　ｎｍであり、全く影響は受けないことな
ど極めて有用なものである。又、本基質は従来のｐ−ニ
トロアニリド基質に比べて、水中、緩衝液中において安
定である。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

参考例１．　　（ａ）カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル
−グリシンエチルエステルの合成 カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシン２６ｇとグリシンエチ
ルエステルｍ２４１４１をＴＨＦ４００ｒｒｔｌに溶解
させた溶液に水浴中、トリエチルアミン１５ｍｌ、　Ｈ
ＯＮＢ　１８．９、ＤＣＣＤ２２．９を加えた。室温に
て２０時間かきまぜた後、生成した沈澱をＦ別除去し、
溶媒を留去した。残留物を酢酸エチル５００　ｍｌにと
かし、飽和重炭酸ソーダ水溶液、ＩＮ−塩酸、水の順で
洗浄した後、有機層を硫酸ソーダで乾燥した。乾燥剤を
沖去した後、有機層を尊王濃縮乾固した。残留物に石油
ベンジンを加え、ゲル状固体を得た。さらに酢酸エチル
、石油ヘンジンより再結晶し、カルボキシ−し−ロイシ
ルグリシンエチルエステルを得だ。

収量　３０．１夕（８３チ） 融点　１１４〜１１５℃ 比旋光度（ａ）ｉ５＝　　２６．１　（Ｃ＝　１．０５
　、　エタ／−ル）元素分析値 Ｃ■Ｈ−ｓ　Ｎｔ　Ｏ−としての計算値Ｃ：６１．７０
チ、Ｈニア、４８チ、Ｎニア、９９チ実測値 Ｃ：６２．０７％、Ｈニア、５０１Ｎニア、９１チ（ｂ
）ｔ−１ｆルオキン力ルボニルーＬ　−ハリルーＬ−ロ
イシルーグリシンの合成 （ａ）　テ得ｆｃカルボベンゾキシ−し一ロイフルーグ
リシンエチルエステル１０．５ｇ、！＝ｐニル−トルエ
ンスルホン、　７　！！ヲエチルアルコール２００　ｍ
ｌに溶かし、５儀パラジウム黒触媒５ｇを加え、水素ガ
スを通じながら室温で３時間かきまぜた。次に反応混合
物を濾過して触媒を除き、ｐ液から溶媒を減圧留去して
油状物を得また。この油状物とｔ−ブチルオキシカルボ
ニル−し−バ’）ｙ６．５ｇ、ＨｏＮ　Ｂ　５．４　、
ＦをＴＨＦ３００ｔｎｌに溶がし、水浴中トリｘｆルア
　ミ７４．２ｍｌトＤＣＣＤ　７．４９　’に加ｔテ。

室温、２０時間かきまぜた。生成したジシクロヘキシル
尿素をｐ別し、ｐ液を減圧濃縮した。その残留物を酢酸
エチル５ｏｏ１ｎｌにとがし、飽和１ソウ、１０チクエ
ン酸、ＨｖＯＱ順で洗浄した後、有機層をボウ硝で乾燥
し＆、乾燥剤を除去した後、溶媒を減圧濃縮した。残留
物に石油エーテルを加え、固化させた後、酢酸、石油エ
ーテルより再結晶シてｔ　−ブチルオキシカルボニル−
し−バリル−Ｌ−ロイシルグリシンエチルエステルヲ得
り。

収量　１ＯＮ（８３チ） 融点　１１３〜１１４℃ 比旋ｊｔ度（ａ）ｉ５＝　　５６．３　（Ｃ＝０．９５
．　ｘｌ／　−ル）元素分析値 Ｃ１゜Ｈｓｖ　Ｎｓ　Ｏ＊　　としての計算値Ｃ：５７
．８１％、Ｈ：８．９８％、Ｎ：１０．１１チ実測値 Ｃニー５７．９７チ、Ｈ：８．９１％、Ｎ：９．９２％
前記のようにして得たｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ
−バＩＪルーＬ−ロイシルークリシンエチルエステ化４
．１Ｆ／をメチルアルコール３０ｍ１に溶かし、水浴中
、ＩＮ−水酸化ナトリウム水溶液２００ゴを加え、２時
間かきまぜた。次に、ＩＮ＝塩酸１８Ｗｔｌを加え中和
し、減圧濃縮してさらに１１Ｎ−塩酸２ｒｒＬｌを追加
し酢酸エチｋ　３００　ＷＬｔで抽出し、抽出液をボウ
硝で乾燥した。乾燥剤を除去した後、減圧濃縮乾固し残
留物を石油エーテルで固化させた後、酢酸エチル石油エ
ーテルで再結晶してｔ−ブチルオキシカルボニル−し−
バリル−ＩＬ−ロイシルーグリシンヲ得り。

収量　３．６ｇ（９３％） 融点　１０４〜１０８℃ 比旋光度〔α）　ｉ５＝　　５４．６　（Ｃ＝０．９９
．エタノール）（ｅ）４−（ｔ−ブチルオキシカルボニ
ル−し−）；リルーＬ−ロイシルーグリシル−Ｌ−フル
ギニル）アミノ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリンの合成Ｎ（
Ｚ−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニン１．０＃とＤＣ
ＣＤｌ、６Ｎを窒素気流下、水浴中に加えて室温で２６
時間かきまぜた。生成したジシクロヘキシル尿素をｐ別
し、ＦＱを濃縮乾固した後残留物をシリカゲルクロマト
グラフィー−（カラムの大きさ５×１５備、溶媒系＝酢
酸エチル：ピリジン：水：酢酸−６０：２０：１０：５
）にて精製した。主溶出分を濃縮乾固した後、水５０ｍ
１にとかし凍結乾燥した。さらに凍結乾燥物をゲルクロ
マトグラフィー（カラムの大きさ１５０Ｘ３ｃｍ、充て
ん剤：　５ｈｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ２０、溶媒：メタノ
ール）にて精製し、主溶出分を濃縮乾固した抜水にとか
し凍結乾燥し、４−（（Ｎ”−カルボベンゾキシ−し−
アルギニル）アミン）−Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリンを得
た。

収量　０．７ｇ（３２チ） （ｂ）で得たｔ−ブチルオキシカルボニル−し−バリル
−Ｌ−ロイシル−グリシン１．５ｇをＴＨＦ５Ｑａ／に
溶かし、水浴中ＨＯＮＢ０．８４１　ＤＣＣＤｌ、０ｇ
を加え、室温にて２０時間がき１ぜた。

沈澱物をＰ側抜、溶媒濃縮乾固してｔ−ブチルオキシカ
化ボニル−し−バリル−Ｌ−ロインルーグリシン−Ｎ−
ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシ
イミドエステルを得た。

収量　１．９ｇ（９０チ） 上記のようにして得た４−（（Ｎ“−カルボベンゾキシ
−Ｌ−アルギニル）アミノ）−Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリ
ンをＤＭＦ１０ｍ／にとがした溶液にｔ−ブチルオキシ
カルボニルーし一パリルーＬ−ロイシルーグリシン−Ｎ
−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルポギ
シイミドエステルｏ、９５ｙをＴ　ＨＦ　２０　ｍｌに
とかした溶液を加え、室温、２０時間かきまぜた。その
溶液を濃縮乾固した後、残留物をゲルクロマトグラフィ
ー（１５０Ｘ３ｃＲ。

メタノール）にて精製し、主溶出分を濃縮乾固した。そ
の残留物を水にとかし、アンバーライトＩＲＡ４１０（
酢酸型）を通し酢酸塩とした後、イオン交換クロマトグ
ラフィー（ＣＭ−セルロース。

０．２Ｍ−酢酸アンモニウム）にて精製し、主溶出分を
水にとかして凍結乾燥して、４−（ｔ−ブチルオキシカ
ルボニル−Ｌ　−ｉＺ　ＩＪルーＬ−ロイシル−グリシ
ル−Ｌ−アルギニル）アミノ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリ
ンを得た。

収量　２４０啼（２４チ） 融点　１２９〜１３７℃ 比旋光度〔α）　ｂ＝　　３６．０　（Ｃ＝０．６６．
メタノール）元素分析値 Ｃ３４Ｈ−＊　Ｎｏ　Ｏ−・Ｃ，Ｈ，Ｏ，としての計算
値Ｃ：５６．３５チ、Ｈ：８．３４チ、Ｎ：１５．５６
チ実測値 Ｃ：５６．２０チ、Ｈ：８．２８チ、Ｎ：１６．０１チ
参考例２．　４−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−
バリル−Ｌ−ロイシル−グリシル−Ｌ−アルギニル）ア
ミノ−３−メチル−Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリンの合成 Ｎ（１−カルボベンゾキシ−しニアルギニン５．ＯＦを
ＤＭＦ　１０　Ｑｍに熱時溶解し４−アミノ−３−メチ
ル−Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン３，５ＩとＤＣＣＤ　７
．５　ｇを窒素気流下、水浴中に加えて室温で４８時間
かき−まぜた。生成したジシクロヘキシル尿素をＥ別し
、濃縮乾固した残留物をシリカゲルクロマドグオフイー
（カラムの大きさ：４０Ｘ２ｃｙ。

酢酸エチル：ピリジン：水：酢酸−１２０：２０：１０
：５）４Ｃて精製し、その主溶出分を凍結乾燥し、４−
（（Ｎ”−カルポベンゾキ／−Ｌ−アルギニル）アミノ
コ−３−メチルーＮ、Ｎ−ジエチルアニリンを得た。

収量　３．７ｇ（４９チ） 上記のようにして得た４−１Ｎ”−カルボベンゾキシ−
し−アルギニル）アミノコ−３−メチル−Ｎ、Ｎ−ジエ
チルアニリンの還元生成物４−（Ｌ−アルギニルアミノ
−３−メチル−Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリンのＴＨＦ溶液
５ｏＩｎｌに実施例１　（ｃ）で得りｔ−１−ｙ−ルオ
キシ力ルポニルーＬ−バＩＪ　／ｌ／　−Ｌ−ロイシル
−グリシン−Ｎ−ヒドロキン−５−ノルボルネン−２，
３−ジカルボキ／イミドエステル１．０５ｇ（７）ＴＨ
Ｆ溶液２０ｍ１を加え、室？ｍＴ６０時間かきまぜた。

その混合物を濃縮乾固した後、シリカゲルクロマトグラ
フィー（カラムの大きさ＝４０×３ｃＭ１クロロホルム
：メタノール：酢酸−４：１６：１）にて精製し、その
主溶出分を濃縮乾固した後、水にとかし凍結乾燥し、４
−（（ｔ−ブチルオキシカルボニルーＬ−〕（リルーし
一ロイシルーグリシルーＬ−アルギニル）アミンクー３
−メチルーＮ、Ｎ−ジエチルアニリンを得た。

収量　０．９ｇ（６７％） 融点　１７５〜１８０℃ 比旋光度［α］　”５＝　　２４．８　（Ｃ＝０．９１
　、メタノール）元素分析値 Ｃｓｓ　ＬＩＮｌ　Ｏ＠・２ＣＨ，Ｃｏｔ　Ｈとしての
計算値Ｃ：　５６．８５ｑｂ、　Ｈ：　８．４４％、Ｎ
：１５．２９チ実測値 Ｃ：５５．５５％、Ｈ：８．７９％、Ｎ：　１ｓ、ｔｏ
＊実施例　１．４−（（ｔ−ブチルオキシカルボニル−
し−バリル−Ｌ−ロイシル−クリシル＝Ｌ　−アルギニ
ル）アミン）　−Ｎ−エチル−Ｎ　−（β−ヒドロキシ
エチル）アニリンの合成 Ｎ（１−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニン３．Ｏｇを
Ｄ　Ｍ　Ｆ　８０　ｍｌに熱時溶解し、４−アミノ−Ｎ
−エチル−Ｎ　−（β−ヒドロキ／エチル）アニリ７２
．７５ｇとＤＣＣＤ４．０ｇを窒素気流下水浴中加えて
、室温で２０時間かきまぜた。生成したジノクロヘキシ
ル尿素を戸別し、濃縮乾固した残留物をシリカゲルクロ
マトグラフィー（カラムの犬き゛さ：１５Ｘ５ｃＩＬ、
溶媒：酢酸エチル：ピリジン：水：酢酸＝６０：２０：
１０：５）にて精製した。

その主溶出分の濃縮乾固物を水にとかし、凍結乾燥して
４−〔（Ｎ”−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニル）ア
ミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ　−（β−ヒドロキシエチル）
アニリンを得た。

収量　１．４５ｇ（２５チ） 上記のようにして得た４−（（Ｎ”−カルボベンゾキシ
−し−アルギニル）アミノＪ−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−
ヒドロキシエチル）アニリンノ接触還元物４−ＭＬ−ア
ルギニル）アミンゴーＮ−エチル−Ｎ　−（β−ヒドロ
キシエチル）７＝ｌＪンのＴＨＦ溶液３０ｍ１に実施例
１（Ｃ）で得たｔ−ブチルオキシカルボニル−し−バリ
ル−Ｌ−ロイ／ルー　りＩＪシン−Ｎ−ヒドロキ／−５
−ノルボルネ／−２，３−ジカルボキシイミドエステル
０．９５ＦのＤＭＦ溶液３Ｑｍｌを加え室温、７２時間
かきまぜた。その混合溶液を濃縮乾固した後その残留物
を水１２０ｍ／にとかし、アンバーライトＩＲＡ−４１
０（酢酸型）を通して、イオン交換カラムクロマトグラ
フィー（ＣＭ−セルロース、０．２Ｍ酢酸アンモニウム
）にて精製し、その主溶出分を凍結乾燥して４−（（ｔ
−ブチｐオキシカルボニル＝Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル
−クリシル−Ｌ−７ルギニル）アミノ）　−Ｎ−エチル
−Ｎ　−（β−ヒドロキシエチル）アニリンを得た。

収量　１１０ダ（１１チ） 融点　１１５〜１２２℃ 比旋光度〔α）ｉ５−３７．１　　（Ｃ＝０．４２．メ
タノール）元素分析値 Ｃ，Ｈ，Ｎ、　Ｏ，−２ＣＨ，Ｃｏ、　Ｈ−ＴＨ，Ｏと
しての計算値Ｃ：５４．６６％、Ｈ：８．２１％、Ｎ：
１５．０９−実測値 Ｃ：５４．５１Ｇ、）（：８．０２−、Ｎ：　１５．５
４チ参考例　３ 本発明発色性ペプチド基質を用いて、エンドトキシンの
測定を以下の如く、試薬、試液を調製して行った。

（１）　　ＩＪムルス・アメホサイト・ライセー）−（
ＬＡＬ）（凍結乾燥品、５　ａｔ用） （２）標準エンドトキシン（凍結乾燥品、０．５μｙ／
ｖｉａｌ） （３）１−ナフトール−２−スルホン酸カリウム（０，
２ｍＭ）、及びペプチド基質（０，２ｍＭ）を含む０．
１Ｍ−トリス−ＨＣｌ緩衝液、（ｐＨ８，２６，０、０
３Ｍ　−Ｍｇｃｌｚ）　　（オートクレーブ中で滅菌済
み）（４）過ヨウ素酸（０，２チ）、ホウ酸（０，３Ｍ
）を含む発色液 測定操作は先ず所定濃度のレファレンス巴ンドトキシ７
０．０５１１ＩＡ！とＬ　Ａ　Ｌ　０．１　ｍｌとを混
合して３７℃、１０分インキ−ベイトし、さらに基質緩
衝液２．０　ａｔを加え、３７℃、１５分インキュベイ
トした。次に発色液１．　□　ｍｌを加え、本溶液１．
　Ｑ　ｍｌを加え、本溶液の吸光度を各々の基質につい
てその最大吸収波長で測定した。

結果を表１に示す。

表　　　１ 手続補正書 昭和５７年７１月２０日 特許庁長官　殿 ｌ　事件の表示。

新規な発色性ベグチド誘導体 １　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許線（東京）　置　０３−２７０−１１５７
１自　　　発 ５、補正の対象 明細書。

６　補正の内容 明細書の浄書（内容に変更なし。）。

別紙の通り。

以上 ｌ　−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、一般式 で示されるペプチド誘導体。ただし、式中のＲ１はロイ
   ンル基、バリル基、バリル−ｐイシル基であり、Ｒ３は
   Ｈ，ＣＨ，で、Ｒ１、Ｒ１は、Ｒ１がＣ，Ｈ，であシ且
   つＲ４がＣｔＨ４０Ｈである。 ２、酸付加塩の状態にある特許請求の範囲第１項に記載
   のペプチド誘導体。 ３、　　Ｎ−末端アミン基が保護されている状態にある
   特許請求の範囲第１項に記載のペプチド誘導体で、Ｎ−
   末端アミノ基の保護基が１、アシル基、カルボベンゾキ
   ７基、第３アルキルオキシカルボニル基、トシル基又は
   グルタリル基である特許請求の範囲第１項に記載のペプ
   チド誘導体。 ４、分子を構成するアルギニンのグアニジノ基がニドｄ
   基、トシル基、Ｐ−メトキンベンゼンスルホニル＆、４
   −）トキシー２．６−シ）ｆｉレベンゼンスルホニル基
   等で保護されている特許請求の範囲第１項に起部のペプ
   チド誘導体。 ５、　特許請求の範囲第１項に記載のペプチド誘導体製
   造過程の合成中間体である一般式で示される４−アルギ
   ニルアミノ−Ｎ、Ｎ−一ンアルキルアニリン誘導体。た
   だし、Ｒ１は特許請求の範囲第３項に記載のＮ−末端保
   護基であり、Ｒ３は特許請求の範囲第１項に記載の４−
   アミノ−Ｎ、Ｉｌ−ジアルキルアニリン誘導体であり、
   アルギニ／ヒつグアニジノ基が保護されているペプチド
   誘導体も含む。