JP2005530485A - 生物発光プロテアーゼ分析方法 - Google Patents

Abstract

カスパーゼ、トリプシンおよびトリプターゼを包含するプロテアーゼを検出するための敏感な生物ルミネセンス分析法が提供される。

Description

（発明の背景）
プロテアーセは種々の生理学的プロセス、例えば血液凝固、炎症、生殖、繊維素溶解、および免疫応答に含まれる広大で、重要な酵素群を構成する。多数の病気状態が、特定のプロテアーゼおよびそれらのインヒビターの活性における変化によって発症し、またこの変化を特徴とすることができる。研究または臨床におけるこれらのプロテアーゼの測定能力は、病気状態の検討、処置および管理にとって重要である。一例として、カスパーゼ（caspases）３および７はシステインアスパルチル−特異性プロテアーゼ（これはアスパルテート特異性システインプロテアーゼ、「ＡＳＣＰ」としても知られている）一族の一員であり、哺乳動物細胞における細胞自滅（apoptosis）で鍵となるエフェクターとしての役割を演じる（Ｔｈｏｍｂｅｒｒｙ等、１９９２；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ等、１９９５；Ｔｅｗａｒｉ等、１９９５；およびＦｅｒｍａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ等、１９９６）。

しかしながら、プロテアーゼは、それらの天然産生基質を用いる分析が容易ではない。さらにまた、現時点で入手できるかなりの合成基質は高価であり、無感受性であり、また非選択性である。さらにまた、この分析には、天然産生基質または合成基質とともに、標的プロテアーゼを高濃度で使用する必要があることがあり、これは当該プロテアーゼの自己分解をもたらすことがある。

プロテアーゼの測定には、多数の色素原性基質および蛍光原性基質が使用されており（Ｍｏｎｓｅｅｓ等、１９９４；Ｍｏｎｓｅｅｓ等、１９９５）、また修飾ルシフェリンが蛍光指示体の代用物として提供されている（米国特許第５，０３５，９９９号および同第５，０９８，８２８号）。前基質（pro-substrate）として、加水分解酵素用の認識部位を備えた修飾ルシフェリンを用いる方法は、ＭｉｓｋａおよびＧｅｉｇｅｒ（１９８９）により最初に開示された。これらの不均質分析法は、修飾ルシフェリンを加水分解酵素とともに、特定の期間にわたりインキュベートし、次いで一定量の混合物をルシフェラーゼ含有溶液中に移すことによって行われた。Ｍａｓｕｄａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等（２０００）は、ガラクトシダーゼ基質−修飾ルシフェリンを使用する単管（均質）分析法の使用を報告した。非不均質プロテアーゼ発光分析法は、いまだに開示されていない。

発光分析法は、それらの感度について一般的に知られているが、蛍光分析法に対するそれらの性能は、分析形式が基本的に相違していることから、予測が困難である。詳細にいえば、酵素結合したルミネセンス分析は、即時的速度の触媒作用と結び付いた光を生じる。これに対し、酵素結合した蛍光分析法は、経過時間にわたって測定される蓄積触媒作用活性に基づき光が生じる（この方法はまた、発蛍光団の蓄積に基づく「最終点」（endpoint）分析法と称される）。数時間から数日にわたる経過時間にわたる触媒作用活性を評価することによって、蛍光分析法からの光信号は、大きく増大させることができる。このような長期間にわたる類似の集積は、発光分析法では実用的ではない。
従って、迅速で、単管による、均質で高感度を有する分析法であるプロテアーゼ活性の監視方法が求められている。

本発明は、プロテアーゼ、例えばカスパーゼ、トリプシンまたはトリプターゼを検出するための高感度を有する発光方法を提供する。一例として、本発明は、１種または２種以上のカスパーゼを検出するための発光分析法を提供する。この方法は、１種または２種以上のカスパーゼを含有するものと予測される試料を、甲虫ルシフェラーゼ（beetle luciferase）およびアミノ−修飾甲虫アミノルシフェリンまたはそのカルボキシ−末端保護誘導体を含有する混合物と接触させることを包含し、ここでアミノルシフェリンまたはその誘導体のアミノ基は、アミノルシフェリンまたはその誘導体のアミノ基がペプチド結合を経てカスパーゼ用基質に共有結合するように修飾されている。試料が当該基質における認識部位を有するカスパーゼを含有する場合、この基質は、この基質をアミノルシフェリンに結合しているペプチド結合の部位で分解され、混合物中にルシフェラーゼ用基質であるアミノルシフェリンが生成される。ルミネセンスを次いで、検出する。

この方法は、プロテアーゼ濃度または活性とルミネセンスとを相関させることをさらに包含する。すなわち、増加したルミネセンスはプロテアーゼの濃度または活性の増加と相関関係を有する。好ましくは、この発光分析法は、発蛍光団が少なくとも１個の基質分子またはその官能性均等物にアミド結合を経て共有結合した共役結合体を用いる対応する分析法に比較し、高い感度を有する。すなわち、発蛍光団を含有する共役結合体は、基質の１個または２個以上の分子に共有結合することができる。本発明の一態様において、当該発光分析法は、発蛍光団ローダミン（rhodamine）−１１０を用いる対応する分析法に比較し、高感度を有する。この場合、ローダミン−１１０はアミド結合を経て修飾し、発蛍光団に２種のプロテアーゼ基質を結合させることができる。

対象基質の「官能性均等物」（functional equivalent）は、対象基質の配列に対し１個または２個以上のアミノ酸置換基を有する基質であり、この官能性均等基質は対象基質として認識され、また対象基質と実質的に類似する効力の観点で、対象基質と同一のプロテアーゼによって分解されるものである。図１３は、種々のカスパーゼに対する代表的官能性均等基質を示している。

本発明の発光基質を用いる方法による増大した分析感度は、少なくとも１種の基質分子またはその官能性均等物に共有結合した発蛍光団を含有する共役結合体を用いる分析法の感度に比較し、少なくとも２倍、さらに好ましくは３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きく、もしくはそれ以上大きく、例えば少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、５００、または１０００倍大きい。従って、本発明の方法は試料中の５μＵまたはそれ以下よりも少ない量、例えば１μＵ、０．５μＵまたは０．２μＵよりも少ない量のカスパーゼを検出することができる。本明細書で使用するものとして、検出限界は、背景ノイズ以上３標準偏差を意味する（「ノイズ」（noise）は、背景の１標準偏差であり、背景はカスパーゼを含有していない対照である）。

以下で説明するように、アミノルシフェリンまたはローダミン−１１０のどちらかに結合したカスパーゼ３および７用の基質を使用する場合、アミノルシフェリンを基材とする基質にかかわる検出限界は、精製カスパーゼ０．２μＵ〜０．５μＵであるのに対し、ローダミン−１１０を基材とする基質の場合、１０μＵであることが見出された。本明細書に記載されているものとして、アミノルシフェリンを基材とする基質によるカスパーゼ発現細胞の検出限界は、１時間の時点で１５細胞であるのに対し、ローダミン−１１０を基材とする基質の場合、１時間の時点で１５０細胞であることが見出された。従って、本発明の方法は、精製された、または部分的に精製された酵素調製物を含有する試料、ならびに細胞ライゼートまたは完全細胞を含有する試料とともに使用することができる。さらにまた、本発明の検出法の増大した感度に基づき、例えば誘導物質または毒素の不存在下における細胞のような休止細胞における活性の蓄積背景レベルを容易に、また正確に確立することができる。

本発明はまた、アスパルテート含有基質を特異的に分解するプロテアーゼを検出するための発光分析法を提供する。この方法は、１種または２種以上のアスパルテート特異性プロテアーゼを含有するものと予測される試料を、ルシフェラーゼおよびアミノ修飾アミノルシフェリンまたはそのカルボキシ末端保護誘導体を含有する混合物と接触させることを包含し、ここでアミノルシフェリンまたはその誘導体のアミノ基は、基質がペプチド結合を経てアミノルシフェリンまたはそのカルボキシ末端保護誘導体に共有結合されるように修飾されている。試料が認識部位としてアスパルテートを含有するプロテアーゼを含有する場合、この基質はアスパルテート含有基質をアミノルシフェリンに結合させるペプチド結合の部位で分解され、混合物中のルシフェラーゼ用基質であるアミノルシフェリンが生成される。次いで、試料中のルミネセンスを検出する。

好ましくは、この発光分析法は、発蛍光団が少なくとも１個の基質分子またはその官能性均等物にアミド結合を経て共有結合する対応する分析法に比較し、高い感度を有する。アスパルテート含有基質を特異的に分解する好適プロテアーゼは、カスパーゼ、例えばカスパーゼ１〜１４のいずれか１種を包含するが、こられに制限されるものではない。好適基質は、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｄを含有し、ここでＸ_１は、Ｙ、Ｄ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｗ、またはＰであり；Ｘ_２は、ＶまたはＥであり；およびＸ_３は、いずれかのアミノ酸であり、例えば基質はＤＥＶＤ、ＷＥＨＤ、ＶＤＶＡＤ、ＬＥＨＤ、ＶＥＩＤ、ＶＥＶＤ、ＶＥＨＤ、ＩＥＴＤ、ＡＥＶＤ、ＬＥＸＤ、ＶＥＸＤ、ＩＥＨＤまたはＰＥＨＤを含有する。

本発明はまた、トリプシンまたはトリプターゼを検出するための発光分析法を提供する。この方法は、トリプシンまたはトリプターゼを含有するものと予測される試料を、ルシフェラーゼおよびアミノ修飾アミノルシフェリンまたはそのカルボキシ末端保護誘導体を含有する混合物と接触させることを包含し、ここでアミノルシフェリンまたはその誘導体のアミノ基は、トリプシンまたはトリプターゼ用基質がペプチド結合を経てアミノルシフェリンまたはそのカルボキシ末端保護誘導体に共有結合されるように修飾されている。次いで、試料中のルミネセンスを検出する。好ましくは、この発光分析法は、少なくとも１個の基質分子またはその官能性均等物に共有結合する発蛍光団を含有する共役結合体による対応する分析法に比較し、高い感度を有する。トリプシンの場合、アルギニンおよびリジンは、トリプシンと同様に、これらの残基の後のペプチド結合を実質的に同様の効力を持って分解するという観点で、官能性均等基質である。

トリプシンまたはトリプターゼに対し本発明の発光基質を使用する方法による増大した分析感度は、少なくとも１種の基質分子またはその官能性均等物に共有結合した発蛍光団を含有する共役結合体を用いる分析法の感受性に比較し、少なくとも２倍大きく、さらに好ましくは３、４、５、６、７、８、９、または１０倍、もしくはそれ以上大きく、例えば少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００倍大きい。トリプシン用基質を使用する場合、リシル−アミノルシフェリン基質にかかわる検出限界は３．０ｐｇであり、他方、アルギニン_２−ローダミン−１１０を基材とする基質の場合、１２〜３０ｐｇであった。すなわち、アミノ修飾アミノルシフェリン基質を使用するトリプシン分析法は、２個の均等トリプシン基質に共有結合したローダミン−１１０を含有する共役結合体による対応する分析法に比較し、少なくとも４倍以上の高感度を有する。

さらに、アルギニンまたはリジンを含有する基質を特異的に分解するプロテアーゼを検出するための発光分析法が提供される。この方法は、アルギニンまたはリジンを含有する基質に対し特異的な１種または２種以上のプロテアーゼを含有するものと予測される試料を、ルシフェラーゼおよびアルギニンまたはリジン含有基質にペプチド結合を経て共有結合したアミノ修飾アミノルシフェラーゼまたはそのカルボキシ末端保護誘導体を含有する混合物と接触させることを包含する。次いで、試料中のルミネセンスを検出する。好ましくは、この分析法は、基質分子またはこの基質の官能性均等物に共有結合した発蛍光団を含有する共役結合体による対応する分析法に比較し、高い感度を有する。トリプターゼがアレルギー反応、例えばアナフィラキシイ反応およびアレルギー性鼻炎を包含する炎症状態を付随して、活性化された肥満細胞から放出され、大便中のトリプシンが嚢胞性繊維症を示唆できる場合、本発明の方法は診断に使用することができ、または治療、例えば抗炎症治療を受けている哺乳動物の監視に使用することができる。

また、プロテアーゼ認識部位、例えばカスパーゼ認識部位、トリプシン認識部位、またはトリプターゼ認識部位にペプチド結合を経て共有結合したアミノルシ
フェリンまたはそのカルボキシ末端保護誘導体を包含する化合物が提供される。
本発明はまた、本発明による化合物の製造に有用な合成方法および本明細書に記載の中間体を提供する。
本発明の方法に有用なキットがまた、包含される。このようなキットは、本発明によるアミノ修飾アミノルシフェリンまたはそのカルボキシ末端保護誘導体、およびそれらの使用指示書を包含し、および任意に、ルシフェラーゼ、例えば耐熱性ルシフェラーゼおよびまた任意に、溶解剤を包含することができる発光反応用緩衝剤を含有する。

（発明の詳細な説明）
タンパク質加水分解活性の迅速で、敏感な分析は、プロテアーゼの一般的特徴確認およびプロテアーゼインヒビターの高生産性のスクリーニングにとって重要である。しかしながら、特に細胞ベースシステムにおける蛍光の固有の背景は、分析感度を制限することができる。さらにまた、最高感度を得るためには、蛍光分析生成物の蓄積に長いインキュベーシヨンがしばしば要求される。発光分析法は、より短い時間でより大きい感度をしばしば提供することができる。

従って、本発明は、原核細胞または真核細胞のどちらかの細胞ライゼートまたは細胞中のプロテアーゼを含有する精製調製物のプロテアーゼ活性を監視するための改良された高感度を有する方法を提供する。好適真核細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト、ネコ、ウシ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、非ヒト霊長類、例えばサル、鳥類、植物または昆虫の細胞を包含する。細胞は組換え技法により遺伝的に変性されていない細胞（非組換え細胞）またはそのゲノムが組換えＤＮＡにより増大されている組換え細胞であることができる。このＤＮＡは本発明の方法によって検出されるプロテアーゼ、細胞中のプロテアーゼのレベルまたは活性を変更する分子および／またはプロテアーゼのレベルまたは活性を変更する分子またはプロテアーゼとは無関係の分子をコードすることができる。

プロテアーゼは、アミノ修飾アミノルシフェリンまたはそのカルボキシ末端保護誘導体を用いて検出する。この修飾はプロテアーゼにかかわる基質を包含する。プロテアーゼ用の認識部位を包含する１種または２種以上のアミノ酸残基を含有する基質を、ペプチド結合を経てアミノルシフェリンまたはカルボキシ末端修飾誘導体のアミノ基に共有結合させる。好ましくは、この基質のＮ−末端を修飾し、アミノペプチダーゼによる分解を防止する、例えばアミノ末端保護基を使用する。

相当する酵素の非存在下において、基質およびルシフェラーゼを含有する混合物は、最低量のアミノルシフェリンが存在すると、最低の光を発生するものと見なされる（この少量の光はペプチド結合の自発的加水分解により発生することができる）。相当する酵素の存在下において、基質とルシフェラーゼとを結合するペプチド結合（この結合はルシフェリン中心分子の６´位置に直接的に隣接している）は、プロテアーゼによって分解され、ルシフェリンの基質であるアミノルシフェリンを生成することができる。従って、ルシフェラーゼ、例えば天然、組換えまたは変異ルシフェラーゼの存在下において、光が発生される。この光はプロテアーゼの量または活性に比例する。いずれかの甲虫ルシフェラーゼ、好ましくは耐熱性ルシフェラーゼを、本発明の方法に使用することができる。

本発明のアミノルシフェリンを基材とする基質は、合成が比較的安価であり、また高度に精製することができる。さらにまた、これらが格別の高感度を有する基質であることから、この分析には非常に少量の生物学的試料（例えば、細胞、生理学的流体、血液、尿など、これらは細胞を含有する）が必要であるのみである。さらにまた、アミノルシフェリンを基材とする基質は、格別の高感度を有することから、僅かに精製されているか、または非精製の生物学的試料が必要である。一例として、このような分析法を使用する場合、カスパーゼ３、カスパーゼ７およびトリプシンの活性は、ローダミン−１１０カスパーゼ基質（ローダミン−１１０はまた、公知の最も敏感な指示体の一つである）を用いる対応する分析法の検出レベルよりも低いことが見出された。特に、カスパーゼにかかわり本明細書に記載されている感度は、Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）（Promega,Madison,WI）よりも優れている。Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）は、蛍光に基づく分析法であり、この方法はカスパーゼ３／７にかかわる２個の認識配列に結合した発蛍光団ローダミン−１１０を使用する方法である。

好ましくは、本発明の方法はプロテアーゼ、例えばカスパーゼ、トリプターゼまたはトリプシン用の均質分析法として用いられる。すなわち、修飾アミノルシフェリン、ルシフェラーゼおよび追加の成分を混合した後、この混合物を試料に添加する。結果は反応剤をさらに移動させることなく読み取ることができる。

本発明による特定の化合物は、式（Ｉ）で表わされる化合物またはその適当な塩である：

式中、Ｒは、カスパーゼ、トリプシンおよびトリプターゼ用の基質であるペプチドであり、このペプチドはその末端Ｃ−末端を経て式（Ｉ）で表わされる化合物の残りの部分に結合し、ペプチド（アミド）結合を形成しており；およびＲ´は、Ｈまたは適当なカルボキシ保護基（例えば、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル、フェニルまたはベンジルエステル）である。

もう一つの本発明による特定の化合物は、式（Ｉ）で表わされる化合物またはその適当な塩である：

式中、Ｒは、ペプチドのＣ−末端でアスパルテート、リジンまたはアルギニン基を経て式（Ｉ）で表わされる化合物の残りの部分に結合し、ペプチド（アミド）結合を形成するペプチドであり；およびＲ´は、Ｈまたは適当なカルボキシ保護基（例えば、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル、フェニルまたはベンジルエステル）である。

アミノ修飾アミノルシフェリン化合物またはそのカルボキシ末端保護誘導体の塩はまた、本明細書に記載の方法に使用することができ、また本発明の一部を形成する。適当な塩の調製方法は、当技術で公知である。
本発明による化合物は、一般に公知である方法を用いて製造することができ、またはこれらの化合物は本明細書に記載の方法を使用して製造することができる。一例として、本発明による化合物は、標準的溶液相化学を用いて製造することができる。従って、ペプチドをアミノ−シアノベンゾチアゾールに結合させ、次いでＤ−システインと反応させることによって、本発明の化合物が得られる。別法として、アミノ−シアノベンゾチアゾールを先ず、Ｄ−システインと反応させ、中間体アミノ化合物を生成し、この中間体を次いで、ペプチドに共役結合させ、本発明の化合物を得ることができる。

本発明による化合物はまた、慣用の固体相ペプチド合成技法を用いて製造することもできる。一例として、カルボン酸官能性基を経てペプチド合成樹脂に結合されているＮ−保護アミノ酸の形態のアミノルシフェリン標識反応剤を、標準的カップリング用反応剤（例えば、ＥＤＡＣ、ＤＣＣまたはＨＯＢｔ）を使用して製造することができる。Ｎ−保護基は好ましくは、Ｆｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃであるが、樹脂に標識を結合する化学結合に対し有害に作用することなく、分離することができるいずれかの基であることができる。樹脂に一旦、結合したならば、Ｎ−保護基を分離し、次いで標準的ペプチド合成法を用いて、ペプチドを樹脂結合した標識のＮ−末端に積み上げる。このペプチド合成の終了時点で、標識付けされたペプチドを、標準的分離剤を用いて樹脂から分離し、カルボン酸を得る。

従って、本発明は、ペプチド合成の目的で、固体支持体に遊離カルボキシル基を経てカップリングしたアミノルシフェリンを提供する。このようなカルボキシ末端保護アミノルシフェリンは、アミノルシフェリンのアミノ基に共有結合されている対象のペプチドを含有する共役結合体の合成に好適である。好ましくは、このアミノ基はＦｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ基により保護する。

本発明はまた、固体支持体に結合したアミノルシフェリンのアミノ基と第一アミノ酸または第一ペプチドとの間のアミド結合の形成；および任意に、ペプチド結合を経る１種または２種以上の追加のアミノ酸またはペプチドの付加による当該化合物の生成を包含する本発明の化合物の製造方法を提供する。この固体支持体結合したアミノルシフェリンは、場合により、Ｎ−保護アミノルシフェリンをカルボキシル基を経て固体支持体に結合し、次いでアミノルシフェリンを脱保護化することによって製造することもできる。この固体支持体結合化合物を次いで、分離し、対応する遊離カルボン酸を生成することができ、このカルボン酸を、所望により、保護し、カルボキシ末端保護誘導体を得ることができる。

本発明のカルボキシ保護誘導体は、標準的技法を使用して、対応するカルボン酸から製造することができる。従って、本発明は、アミノルシフェリンのカルボキシ末端保護誘導体の製造方法を提供し、この方法は対応する酸を適当なカルボキシ保護基で保護することを包含する。
本発明の化合物に挿入することができる適当なアミノ保護基（Ｆｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ）、ならびに適当なカルボキシ保護基（例えば、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル、フェニルまたはベンジルエステル）は、当業者にとって周知である（例えば、T.W.Greene、Protecting Groups In Organic Synthesis;Wiley:New York,1981、およびここに引用されている刊行物参照）。
本発明を、下記の非制限的例によってさらに説明する。

例１
発光に基づく分析法および蛍光に基づく分析法によるトリプシンの検出限界を比較するために、２種の基質、Ｌｙｓ−アミノルシフェリン（Ｃｂｚ−修飾リジニル−アミノルシフェリン）およびＡｒｇ−Ｒｈｏ−１１０（Molecular Probes,Catalog no.R6501）を使用した。基質を１０ｍＭ濃度で１００ｍＭヘペス（Hepes）（ｐＨ７．９）に再懸濁し、−２０℃で保存した。解凍したＬｙｓ−アミノルシフェリン基質、耐熱性ルシフェラーゼ（５．２ｍｇ／ｍｌ原溶液）およびＡＴＰ（０．１Ｍ原溶液）を、緩衝液（５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２および０．１％プリオネックス（prionex））中で稀釈し、１０ｘ最終濃度の原溶液を製造した。この１０ｘ原溶液は、２００μＭ Ｌｙｓ−アミノルシフェリン、２００μｇ／ｍｌルシフェラーゼおよび２．０ｍＭ ＡＴＰであった。この１０ｘ原溶液を少なくとも９０分間にわたりインキュベートし、全ての遊離アミノルシフェリンを除去した。

トリプシンは、滴定（titration）用に下記のとおりに調製した：１μｇ／μｌ原溶液を上記と同一の緩衝液（５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２および０．１％プリオネックス）中で１０ｎｇ／５０μｌに稀釈した。この１０ｎｇ／μｌトリプシン溶液を、２ｎｇ、０．４ｎｇ、０．０８ｎｇ、０．０１６ｎｇ、３．２ｐｇ、０．６４ｐｇ、０．１２８ｐｇ、０．０２５６ｐｇおよび０．００５ｐｇに、連続的に５倍稀釈した。このトリプシン稀釈液を、８反復様相で２枚の９６−ウエルプレートに５０μｌ／ウエルの量で添加した。ピペット先端は各列毎に変え、酵素の持込を回避した。２本のコラム（１６ウエル）は、トリプシンを含有していない緩衝液のみを含有していた。

トリプシン稀釈液の２枚のプレートの一方を次いで使用し、Ｌｙｓ−アミノルシフェリン基質を試験した（図３）。試料は、４反復方式で試験した。１０ｘ基質／ルシフェラーゼ／ＡＴＰミックスを、上記緩衝液中でさらに５倍稀釈し、２ｘ原溶液を生成した。この２ｘ原溶液５０μｌを、トリプシン滴定液５０μｌを含有する各ウエルに添加し、最終１００μｌが２０μＭ Ｌｙｓ−アミノルシフェリン、２００μＭ ＡＴＰおよび２０μｇ／ｍｌ耐熱性ルシフェラーゼを緩衝液（５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２および０．１％プリオネックス）中に含有しているようにした。この基質ミックスをまた、トリプシンを含有しておらず、緩衝液のみを含有する１６ウエルのうちの１２ウエルに添加した。残りの４個のウエルは、緩衝液のみのまま放置した（基質ミックス不存在）。このプレートを室温でインキュベートし、次いで基質ミックスにトリプシンを添加して４５分後および３時間後に光測定器により読み取った。

トリプシン稀釈液の２枚目のプレートを使用し、Ａｒｇ−Ｒｈｏ−１１０基質を試験した（図４）。Ａｒｇ−Ｒｈｏ−１１０基質を、１０μＭおよび２．５μＭの最終濃度で試験した。２ｘ原溶液２０μＭおよび５μＭを、５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２および０．１％プリオネック中に基質を稀釈することによって調製した。トリプシン滴定液５０μｌを含有するプレートの各ウエルに、Ａｒｇ−Ｒｐｈ−１１０基質の２ｘ原溶液２０μＭまたは５μＭのどちらかを添加した。最初の４列に、原溶液２０μＭを添加し（列Ａ−Ｄにおいて、最終濃度１０μＭ）、また二番目の４列に、原溶液５μＭ（列Ｅ−Ｈにおいて、最終濃度２．５μＭ）を添加した。基質ミックスをまた、トリプシンを含有しておらず、緩衝液のみを含有する（基質を含有していない）１６ウエル中の１２個のウエルに添加した。このＡｒｇ−Ｒｈｏ−１１０プレートを、暗所で室温において４．５時間かけてインキュベートし、次いで蛍光測定器により読み取った。

信号対ノイズを、信号−背景（トリプシン不存在）／背景のＳ．Ｄ．として計算した。検出限界は、背景ノイズ以上３Ｓ．Ｄ．として測定された。

結果
トリプシン分析に、均質形式（homogeneous format）を使用した。これらの結果は、トリプシンに対しＬｙｓ−アミノルシフェリン基質を使用した場合の検出限界が、Ａｒｇ−Ｒｐｈｏ−１１０基質の場合よりも低いことを示している。特に、これらの結果は、Ｌｙｓ−アミノルシフェリン基質が、Ａｒｇ−Ｒｈｏ−１１０基質に比較し、読取時間に応じて３〜１０倍大きい感度を有することを示している（図９）。さらにまた、この発光分析法は、３０分またはそれ以下で最大感度に達し、また延長された期間にわたり非常に安定であった。

例２
トリプシン添加前、基質をルシフェラーゼ、ＡＴＰおよび緩衝液とともに一夜にわたり予備インキュベートする効果を測定するために、基質／ルシフェラーゼ／ＡＴＰミックスを、暗所において室温でインキュベートした。Ｌｙｓ−アミノルシフェリン基質の場合、解凍したＬｙｓ−アミノルシフェリン基質（１０ｍＭ原溶液）、耐熱性ルシフェラーゼ（５．２ｍｇ／ｍｌ原溶液）およびＡＴＰ（０．１Ｍ原溶液）を、緩衝液（５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２および０．１％プリオネック）中で稀釈し、最終濃度が１０ｘである原溶液を調製した。この１０ｘ原溶液は、２００μＭ Ｌｙｓ−アミノルシフェリン、２００μｇ／ｍｌルシフェラーゼおよび２．０ｍＭ ＡＴＰであった。一夜にわたるインキュベーション後、この１０ｘ原溶液を緩衝液中で稀釈し、２ｘ原溶液（基質４０μＭ、ＡＴＰ ４００μＭおよびルシフェラーゼ４０μｇ／ｍｌ）を調製した。Ａｒｇ−Ｒｈｏ−１１０基質をまた、５ｍＭ原溶液から４０μＭの２ｘ操作原溶液濃度に調製した。

トリプシン稀釈液は、１μｇ／μｌ原溶液から調製し、例１と同一濃度にまで稀釈し、２個の相違するプレートの４個のウエルに、５０μｌ／ウエルの各トリプシン濃度を確立した。２カラムは、対照として、トリプシンを含有しておらず、緩衝液のみを含有していた。次いで、２ｘ Ｌｙｓ−アミノルシフェリン基質ミックス５０μｌを、一方のプレートの各ウエルに添加し、その結果を光測定器において数時間の時点で読み取った。例１と同様に、第二のプレートに、２ｘ Ａｒｇ−Ｒｈｏ−１１０原溶液５０μｌをウエル毎に２０μＭの最終濃度で添加した。
発光に基づく分析法は、３．０ｐｇほどの僅かなトリプシンを検出することができたのに対し、蛍光に基づく分析法は、約１２〜３０ｐｇの検出限界を有していた（４〜１０倍少ない酵素）。

例３
カスパーゼ３について、発光基質と蛍光基質との間の直接的比較を行うために、ＤＥＶＤ−Ｒｈｏ−１１０およびＤＥＶＤ−アミノルシフェリンを採用した。ＤＥＶＤ−アミノルシフェリン基質／ルシフェラーゼ／ＡＴＰ混合物を、先ず調製し、次いで遊離アミノルシフェリンを除去するために、酵素分析に先立ち予備インキュベートした。Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）（Promega）１．２５ｍｌに、ＤＥＶＤ−ルシフェリン（１０ｍＭ原溶液）１０μｌ、ＡＴＰ（０．１Ｍ原溶液）１０μｌ、ＭｇＳＯ_４（１Ｍ原溶液）５０μｌ、プリオネックス（１０％原溶液）およびルシフェラーゼ（５．２ｍｇ／ｍｌ原溶液）４８μｌを添加した。この容積を、ナノ純度（nanopure）のオートクレーブ処理した水により２．５ｍｌにし、ＤＥＶＤ−ルシフェリン４０μＭ、ＡＴＰ ４００μＭ、プリオネックス０．２％およびルシフェラーゼ１００μｇ／ｍｌの２ｘ原溶液を調製した。

カスパーゼ（Upstate Biotech,Cat.No.14-264；活性コンフォメーションで＞７５％を有するタンパク質ほぼ１０ｍＵ／ｎｇ）を、Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）緩衝液／ＲＰＭＩ−１６４０培養培地の５０／５０混合物中で、１Ｕ／μｌから１．８ｍＵ／μｌまで、５５０倍稀釈した。２枚の９６−ウエルプレートの各ウエルに、Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）緩衝液／ＲＰＭＩ−１６４０培地５０μｌを添加した。次いで、カスパーゼ原溶液５．５μｌを、Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）緩衝液／ＲＰＭＩ−１６４０培地５０μｌに添加し、約１０ｍＵ／５０μｌの濃度を得た。これらのウエルにおいて、緩衝液／培地ミックス５０μｌにカスパーゼ溶液５．５μｌを連続的に移すことによって、それぞれ１０倍の連続稀釈を行った。最終カスパーゼ濃度は、１０ｍＵ、１ｍＵ、０．１ｍＵ、０．０１ｍＵ、０．００１ｍＵ、０．１μＵ、０．０１μＵ、０．００１μＵ、０．１ｎＵおよび０．０１ｎＵ／ウエルであった。最後の２カラムは、カスパーゼを含有しておらず、緩衝液／培地のみであった。

カスパーゼ稀釈の一枚のプレートにおいて、ＤＥＶＤ−アミノルシフェリン基質混合物５０μｌを各ウエルに添加し、ＤＥＶＤ−ルシフェリン２０μＭ、ＡＴＰ ２００μＭ、ＭｇＳＯ_４ １０ｍＭ、プリオネックス０．１％およびルシフェラーゼ５０μｇ／ｍｌの最終濃度を得た。もう一枚のプレートにおいて、ＤＥＶＤ−Ｒｈｏ−１１０基質５０μｌを、５０μＭの推奨最終濃度で各ウエルに添加した。各プレートについて、１時間、３時間および５時間の時点で、それぞれ光測定器および蛍光測定器による読取を行った。
信号対ノイズは、上記のとおりに計算し、また検出限界は、背景ノイズ以上３Ｓ．Ｄ．として測定された。

トリプシン−基質修飾ルシフェリンの場合と同様に、ＤＥＶＤ−アミノルシフェリンは、ＤＥＶＤ−Ｒｈｏ−１１０に比較し、１０〜１００倍大きい感度を有していた（図１０）。蛍光比分析法は、最高感度の達成に数時間を要し、時間経過に従い常に変化した。さらにまた、蛍光分析法は低カスパーゼ濃度で直線性を失った。
発光分析法は分解した基質の蓄積に依存しない比（ｒａｔｅ）分析法である。従って、一定状態（プロテアーゼ分解対アミノルシフェリンのルシフェラーゼ消費）が迅速に達成され、またこの一定状態は数時間にわたり安定である。さらにまた、この直線状態はまた、数時間にわたり維持される。この発光分析法は３０分またはそれ以下で最高感度に達し、延長された期間にわたり非常に安定であった。この発光分析法は、カスパーゼ濃度において３〜４ｌｏｇにわたり直線状であった（図８）。

例４
ＤＥＶＤ−アミノルシフェリンカスパーゼ基質およびＤＥＤＶ−Ｒｈｏ−１１０カスパーゼ基質を使用し、抗−ＦＡＳ抗体による細胞自滅を受けるように誘発されたジャルカット（Jurkat）細胞におけるカスパーゼ活性を測定した。ＤＥＶＤ−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを調製し、分析に使用する前に予備インキュベートした。基質、ＡＴＰ、ＭｇＳＯ_４、プリオネックスおよびルシフェラーゼを、例３と同一の原溶液から同一の２ｘ濃度に稀釈した。ただしこれらの成分はＡｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）ではなく、オートクレーブ処理した水で稀釈した。この混合物を暗所で一夜にわたりインキュベートした（ホイルで覆う）。

翌日、１０％ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で５ｘ１０５細胞／ｍｌの密度にまで成長させたジャルケット細胞を、抗−ＦＡＳ抗体により処理した。この培地８ｍｌを含有する１本のバイアルに、抗体（１：５０００稀釈）１．６μｌを添加した；第二のバイアルは培地８ｍｌを含有し、抗体は含有していなかった。細胞は、５％ＣＯ_２中で３７℃において４時間かけてインキュベートした。細胞を次いで、遠心処理し、次いで３．２ｘ１０^５細胞／ｍｌの密度にＲＰＭＩ−１６４０ １２．５ｍｌ中で稀釈し、次いでＡｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）緩衝液により１：１稀釈し、１．６ｘ１０^５細胞／ｍｌまたは８，０００／５０μｌにした。

２枚の９６−ウエルプレートを、それぞれの第一カラムが空であるように調製し、残りのウエルにはそれぞれ、ＲＰＭＩ−１６４０：Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）溶液５０μｌを入れた。各プレートの最初の４列に、「誘発」細胞溶液（８，０００細胞）１００μｌを添加し、細胞を次いで、８，０００細胞／ウエルから４，０００細胞／ウエルまで連続的に稀釈し、このようにして７．８細胞／ウエルに低下させた。１２番目のカラムは、細胞を含有しておらず、ＲＰＭＩ−１６４０：Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）溶液のみを含有するようにした。各プレートの次の４列は、「非誘発」細胞溶液１００μｌにより同様に処理し、次いで７．８細胞／ウエルにまで連続的に稀釈した。再度、これら４列の最後のコラムは、培地のみで放置した（無細胞）。

信号対ノイズを計算し（信号−背景（無細胞）／背景のＳ．Ｄ．）／背景のＳ．Ｄ．として計算し、また検出限界は、背景ノイズ以上３Ｓ．Ｄ．として測定された。
２枚のプレートの一方を、ＤＥＶＤ−アミノルシフェリン／ルシフェラーゼミックスまたはＤＥＶＤ−Ｒｈｏ−１１０／Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ７７８ＢおよびＧ７７７Ｂ）のどちらか５０μｌにより処理した。各プレートを３０秒間、プレート振盪器上で混合し、次いで室温でインキュベートし、次いでＤｙｎｅｘ光測定器またはＦｌｕｏｒｏｓｋａｎプレート読取機のどちらかにより、１時間、２時間、４時間および１日後の時点で読み取った。
このアミノルシフェリン基質分析法は、この分析が僅かに１時間ほどで１５細胞を有するウエルでカスパーゼ陽性細胞を検出したこと、およびこの分析が４時間の時点で直線状のままであったことを示した（図１１）。他方、ＤＥＶＤ−Ｒｈｏ−１１０基質分析法は、１時間で１５０細胞／ウエルの、および４時間で約３０細胞の検出限界を有していた。

例５
カスパーゼ−３活性にかかわる相違する分析成分組成を評価するために、およびこれらの組成におけるＤＥＶＤ−アミノルシフェリンの感度をＤＥＶＤ−Ｒｈｏ−１１０の感度と比較するために、２種の原溶液を調製した。上記の通り、ＤＥＶＤ−アミノルシフェリン／ルシフェラーゼ混合物を調製し、一夜にわたりインキュベートした。一方の原溶液には、ＣＨＡＰＳ緩衝液（Sigma,Catalog No.C-5070）の１％溶液を含有させ、また他方の原溶液には、Ｔｈｅｓｉｔ（Pragmatics,Inc.,Catalog No.S-22#9）の１％溶液を含有させた。これらの緩衝液の組成は下記のとおりであった：ＨＥＰＥＳ（１Ｍ原溶液、最終濃度５０ｍＭ）１００μｌ、ＣａＣｌ_２（１Ｍ原溶液、最終濃度５ｍＭ）１０μｌ、ＭｇＳＯ_４（１Ｍ原溶液、最終濃度１５ｍＭ）３０μｌ、ＡＴＰ（０．１Ｍ原溶液、最終濃度４００μＭ）８μｌ、ＤＥＶＤ−アミノルシフェリン（１０ｍＭ原溶液、最終濃度４０μＭ）８μｌ、ルシフェラーゼ（５．２ｍｇ／ｍｌ原溶液、最終濃度１００μｌ／ｍｌ）３８．４μｌおよびプリオネックス（１０％原溶液、最終濃度０．１％）２０μｌを、２本の管のそれぞれで配合した。

最後に、これらの管の１本に、ＣＨＡＰＳまたはＴｈｅｓｉｔ（１％原溶液、最終濃度０．１％）のどちらかを２００μｌの量で添加した。これを一夜にわたりインキュベートした。翌日、ＤＴＴ（Promega,catalog no.V3151）（１Ｍ原溶液、２０ｍＭ最終濃度）４０μｌを各管（ＣＨＡＰＳおよびＴｈｅｓｉｔ）に添加した。最後に、純粋なオートクレーブ処理した水４０μｌを２ｍｌ／溶液の最終容積まで添加した。

カスパーゼ（Upstate Biotech,Cat.No.14-264）は、１Ｕ／μｌ原溶液から緩衝液（下記）４００μ中の１ｍＵ／５０μｌまたはｌ８ｍＵにまで稀釈した。このカスパーゼ緩衝液は、下記のとおりであった：全部が上記と同一濃度であるＨＥＰＥＳ、ＣＨＡＰＳまたはＴｈｅｓｉｔ、ＣａＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、ＤＤＴおよびプリオネックス。カスパーゼは、１０因子で、１ｍＵから１ｘ１０^−８ｍＵを経て４４０μｌの各稀釈液最終容積まで連続的に稀釈した。これらの稀釈カスパーゼ溶液をそれぞれ５０μｌの量で、２枚の９６−ウエルプレートのそれぞれの３ウエルにそれぞれ添加した。ウエルの３コラムは空白のまま残した。

一方のプレートに、ＤＥＶＤ−アミノルシフェリン／ルシフェラーゼ５０μｌを、それぞれ稀釈液を含有する６個のウエルのそれぞれに添加した（ＣＨＡＰＳおよびＴｈｅｓｉｔ処理の両方）。第二のプレートに、ＤＥＶＤ−Ｒｈｏ−１１０基質５０μｌを、それぞれ稀釈液を含有する６個のウエルのそれぞれに添加した（ＣＨＡＰＳおよびＴｈｅｓｉｔ処理の両方）。これらのプレートを、光測定器（Dynex）または蛍光測定器（Fluoroskan）により種々の時点で読み取った。
アミノルシフェリンの場合の検出限界は、ＣＨＡＰＳまたはＴｈｅｓｉｔのどちらかを含有する緩衝液中のカスパーゼ０．２μＵの範囲であった（図１２）。他方、ローダミンを基材とする基質を用いる検出限界は２〜６μＵであった（１０−３０のファクター）。

例６
本発明による代表的化合物を下記非制限的例に従い製造した。
一般合成法
全部の反応を乾燥窒素気体による正の圧力下に行った。無水状態を必要とする反応は、窒素気体下に、またはデシケーター中で冷却させた、オーブン乾燥ガラス容器で行った。無水溶媒および反応剤溶液はオーブン乾燥シリンジを用いて移した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン、ピリジン、アセトニトリルおよびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、無水溶媒として入手し、さらに精製することなく使用した。クロマトグラフイ用には、反応剤級の溶剤をさらに精製することなく使用した。

ＴＬＣは、０．２ｍｍＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ予備被覆したシリカゲル６０Ｆ_２５４ＴＬＣプレート（５ｘ２０ｃｍアルミニウムシート）で行った。フラッシュクロマトグラフイは、Ｓｅｌｅｃｔｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３２−６３μｍシリカゲル（６０Ｆ_２５４）を用いて行った。
分析級逆相ＨＰＬＣは、Ｍｏｄｅｌ １６８ダイオード−アレイ検出器（diode-array detector）およびＭｏｄｅｌ５０７自動供給機（autosampler）を備えたＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ １２６ポンプ系上のＳｙｎｅｒｇｉ ４μ Ｍａｘ−ＲＰカラム（４．６ｍｍｘ５０ｍｍ）を用いて行った。溶剤は、Ａ−１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）およびＢ−メタノールであった。全部の分析級逆相クロマトグラフイは、２５４ｎｍおよび３１５ｎｍで監視した。

ＥＳＩ質量スペクトルは、ＦＩＳＯＮＳ ＶＧ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで記録した。全部の化合物のＮＭＲスペクトル分析は、それらの各構造に一致した。
Ｎｍｒスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ３００Ｍｈｚ分光光度計で得た。

例７
Ｎ−（Ｚ−ＤＥＶＤ）−アミノルシフェリンの製造
Ｎ−［Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）］−アミノルシフェリン（２０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）を含有する２５ｍｌフラスコに、ジクロロメタン中の２０％トリフルオロ酢酸の溶液２ｍｌを添加した。この反応混合物を、室温で４時間にわたり撹拌した。ＨＰＬＣは、反応がゆっくり進行することを示した。追加のトリフルオロ酢酸を添加し、反応混合物中でトリフルオロ酢酸３０％溶液を生成し、この反応混合物を５℃冷蔵庫内で一夜にわたり放置した。翌日、ＨＰＬＣ分析は、反応が完了したことを示した。この反応混合物を、クリーム状固形残留物に濃縮した。この粗製生成物をＳｙｎｅｒｇｉ ４μ Ｍａｘ−ＲＰ半調製用カラムにおいて２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．５）およびメタノールを用いるＨＰＬＣクロマトグラフイによって精製した。生成物を含有するフラクションを集め、次いで凍結乾燥させ、Ｎ−（Ｚ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ）−アミノルシフェリン１０．３ｍｇ（６２％）をオフホワイト色粉末として得た。

中間体Ｎ−［Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）］−アミノルシフェリンは下記のとおりに製造した。
ａ．Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨの合成。Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（５００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を、２５ｍｌ丸底フラスコ中のジクロロメタン−ピペリジンの９：１混合物（５ｍｌ）に溶解した。この反応混合物を、室温で一夜にわたり撹拌した。翌朝、ＴＬＣは完全Ｆｍｏｃ脱保護を示した。この反応混合物を回転蒸発により濃縮し、トルエンとともに２回、共蒸発させ、次いで減圧で乾燥させ、粗製油状物を得た。この油状物をシリカゲル（５０ｇ）上でジクロロメタン中１０％−５０％メタノールの段階的溶剤勾配を用いるフラッシュクロマトグラフイにより精製し、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ ２５０ｍｇ（１００％）を得た。

ｂ．Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨの合成。Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（２５０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を、磁気撹拌機を備えた１００ｍｌ丸底フラスコ中のジクロロメタンとピリジンとの１：１混合物４０ｍｌに溶解した。この溶液に、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ（６９０ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）を添加し、次いで撹拌を室温において窒素雰囲気下に一夜にわたり継続した。翌朝、この反応混合物を回転蒸発により淡黄色油状物に濃縮し、この油状物をジクロロメタンに溶解し、次いで１０％水性クエン酸溶液により２回、洗浄した。この水性層をジクロロメタンにより再度、抽出し、有機層を集め、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、次いで回転蒸発により濃縮し、粗製白色泡状物８２０ｍｇを得た。この生成物をシリカゲル上でジクロロメタン中３％〜２０％メタノールの段階的溶剤勾配を用いるフラッシュクロマトグラフイにより精製し、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ ２５０ｍｇ（３８％）をオフホワイト色固形物として得た。

ｃ．Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨの合成。Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（２５０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を、５０ｍｌ丸底フラスコ中のピペリジン−ジクロロメタンの９：１混合物１０ｍｌに溶解し、この反応混合物を室温で放置した。１時間後、ＴＬＣ分析は、反応が完了したことを示した。この反応混合物を濃縮し、トルエン２０ｍｌとともに２回、共蒸発させ、次いで減圧下に乾燥させ、粗製白色残留物２５０ｍｇを得た。この残留物をシリカゲル（２５ｇ）上でジクロロメタン中２０〜７５％メタノールの段階的溶剤勾配を用いるフラッシュクロマトグラフイにより精製し、純粋Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ １２０ｍｇ（７６％）を得た。

ｄ．Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨの合成。２５ｍｌ丸底フラスコ内のジクロロメタン（５ｍｌ）およびピリジン（３ｍｌ）中のＧｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨの撹拌懸濁液に、Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｏｓｕ（５３０ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）を添加した。生成する混合物を、室温において２日間にわたり撹拌した。この反応混合物を回転蒸発により濃縮し、残留物を酢酸エチルと１０％水性クエン酸溶液とに分配した。この水性相を酢酸エチルにより３回、抽出した。抽出液を集め、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次いで回転蒸発により濃縮し、粗製油状物を得た。この油状物をシリカゲル（７５ｇ）上でジクロロメタン中２％〜４％メタノールの段階的溶剤勾配を用いるフラッシュクロマトグラフイにより精製した。生成物を含有するフラクションを集め、次いで回転蒸発により精製し、Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ ６３０ｍｇ（９８％）をオフホワイト色固形泡状物として得た。

ｅ．Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨの合成。１００ｍｌ丸底フラスコ内のジクロロメタン（２０ｍｌ）中のＺ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（２４５ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（６０．９ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を、次いでジシクロヘキシルカルボジイミド（１０９．２ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を添加し、生成する混濁した混合物を窒素雰囲気下に室温において１時間にわたり撹拌した。ＴＬＣが反応の完了を示した後、ジシクロヘキシル尿素沈殿を濾過により分離し、この濾液を回転蒸発により約７ｍｌまで濃縮した。この時点で、いくらかの沈殿が生じ始めた。この混合物を、５０ｍｌ丸底フラスコ内のＤＭＦ（２０ｍｌ）中Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−ＯＨ（１２０ｍｇ、０．４３７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。反応を室温で２時間にわたり撹拌した後、ＴＬＣ分析は反応がゆっくりと進行していることを示した。この濁った混合物を次いで、約１５ｍｌに濃縮し、次いで撹拌を一夜にわたり継続した。

翌朝、ＴＬＣ分析は反応がまだ完了していないことを示した。この反応フラスコに凝縮器を付け、この混合物を次いで、水浴を用い１．５時間にわたり３５〜３８℃で加熱した。この期間中、混合物は幾分、清明化した。この反応混合物を冷却させ、次いで回転蒸発により濃縮し、この残留物を酢酸エチル（５０ｍｌ）中に懸濁し、次いで１０％水性クエン酸溶液１０ｍｌにより２回、洗浄した。この有機層を次いで、水１０ｍｌにより２回、洗浄し、次いでこの水性層を酢酸エチルにより逆抽出した。これらの有機層を集め、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次いで回転蒸発により濃縮し、次いでジクロロメタンとともに２回、共蒸発させ、粗製オフホワイト色泡状物５００ｍｇを得た。この粗製生成物をシリカゲル（２５ｇ）上でジクロロメタン中５％〜２０％メタノールの段階的溶剤勾配を用いるフラッシュクロマトグラフイにより精製し、Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ １９０ｍｇ（５６％）をオフホワイト色泡状物として得た。

ｆ．６−（Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−アミノ−２−シアノベンゾチアゾールの合成。−１０℃浴（塩化ナトリウム浴）で冷却させたＴＨＦ（５ｍｌ）中のＺ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（９５ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、シリンジを経てＮ−メチルモルホリン（１３．４μｌ、０．１２２ｍｍｏｌ）を添加し、次いでイソブチルクロロホーメート（１．６μｌ、０．１２２ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を−１０℃で１時間にわたり撹拌し、次いでＴＨＦ（２ｍｌ）中の６−アミノ−２−シアノベンゾチアゾール（２７．９ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ）をピペットを経て添加した。冷却浴を取り除き、反応混合物を室温まで温まるままにし、２日間にわたり撹拌した。ＴＬＣ分析は、新しい生成物が生成したことを示した。この反応混合物を回転蒸発により濃縮し、得られた粗製残留物を次いで、酢酸エチルに溶解し、次いで水により２回、洗浄した。この水性相は酢酸エチルにより再度、抽出した。抽出液を集め、乾燥させ、次いで濃縮し、粗製黄色残留物１０４ｍｇを得た。この残留物をシリカゲル（１０ｇ）上でジクロロメタン中４％〜７％アセトンの段階的溶剤勾配を用いるフラッシュクロマトグラフイにより精製し、６−（Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−アミノ−２−シアノベンゾチアゾール４４ｍｇ（４２％）を黄色固形物として得た。

ｇ．Ｎ−［Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）］−アミノルシフェリンの合成。５０ｍｌ丸底フラスコに、Ｄ−システイン塩酸塩（９９７ｍｇ、５．８６ｍｍｏｌ）および脱イオン水（１４ｍｌ、１５分間にわたり窒素を泡立てて通すことによって脱気）を添加した。生成する混合物を溶解が達成されるまで、窒素雰囲気下に磁気撹拌した。別の２５ｍｌエルメンマイヤー（erlenmyer）フラスコに、無水炭酸カリウム（７８５ｍｇ、５．６８ｍｍｏｌ）および脱気した脱イオン水（１４ｍｌ）を添加した。生成する溶液を、ｐＨを７．０以下に維持するのに要する６Ｎ塩酸の定期的添加を伴い、Ｄ−システイン溶液含有フラスコにパスツールピペットを経て添加した。反応フラスコに炭酸カリウム溶液を添加した後、反応混合物の一部（０．２４ｍｌ、約０．０４７ｍｍｏｌのＤ−システイン含有）を計量し（ピペットによる）、別の５ｍｌ反応バイアルに移した。

この５ｍｌ反応バイアルに、メタノール（１ｍｌ）中の６−（Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−アミノ−２−シアノベンゾチアゾール（４４ｍｇ、０．０４７）を添加し、次いでｐＨを７．０以下に維持するのに要する０．１Ｍ塩酸溶液を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。ＨＰＬＣおよびＴＬＣ分析は、出発材料の消費を示した。この反応混合物を回転蒸発により濃縮し、次いでアセトニトリルと共蒸発させ、固形残留物を得た。この粗製生成物をシリカゲル（１０ｇ）上でジクロロメタン中１０％〜１２％メタノールの段階的溶剤勾配を用いるクロマトグラフイに付し、Ｎ−［Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）］−アミノルシフェリン２０ｍｇ（４１％）をオフホワイト色固形物として得た。

例８
ラセミ体状Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノルシフェリンの製造
２−［６´−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ−２´−ベンゾチアゾリル］−△^２−チアゾリン−４−カルボン酸（Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノルシフェリン）。１００ｍｌ丸底フラスコに、Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノルシフェリン（６６０ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）およびメタノール性アンモニアの溶液（７Ｍ溶液の３０ｍｌ、２１０ｍｍｏｌ）を添加した。生成する混合物を室温で４日間、放置した。この反応混合物を回転蒸発により濃縮し、次いでジクロロメタンとともに共蒸発させ、得られた粗製褐色固形物６２６ｍｇを、精製することなく引続く工程に使用した。この粗製褐色生成物の一部（３９１ｍｇ）を１００ｍｌ丸底フラスコ内のメタノール（４０ｍｌ）および水（２ｍｌ）に溶解した。この溶液に、Ｆｍｏｃ−Ｃｌ（４３５ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を室温で２時間にわたり撹拌した。この反応混合物を回転蒸発により濃縮し、次いでアセトニトリルとともに、次いでジクロロメタンとともに共蒸発させ、減圧乾燥後、褐色泡状物を得た。

この生成物を最初の２本のカラムに１００ｇおよび三番目のカラムに１５０ｇを用いる３本連続シリカゲルカラムにおけるフラッシュクロマトグラフイにより精製した。第一カラム用の溶出溶剤は９８：２ジクロロメタン−メタノールであった。第二カラム用の溶出溶剤は９３：７ジクロロメタン−メタノールであった。第三カラム用の溶出溶剤は９７：３ジクロロメタン−メタノールであった。生成物を含有するフラクションを集め、次いで濃縮し、得られたワックス状生成物２８０ｍｇは９５％純粋であり、また生成物３２０ｍｇは８９％純粋であった。このワックス状生成物２８０ｍｇをシリカゲル２５ｇ上で４：１ジクロロメタン−メタノールを用いて再精製し、乾燥した淡黄色固形物１０８ｍｇを得た。生成物の一部である３２０ｍｇを上記３本のカラムから集められた不純なフラクションから回収された生成物２３０ｍｇと一緒に合わせた。この集められた生成物（５５０ｍｇ）をシリカゲル（５０ｇ）上で７８：２２ジクロロメタン−メタノールを用いるフラッシュクロマトグラフイにより再精製し、生成物２２３ｇを得た。このようにして得られた総合生成物はコハク色固形物３８０ｍｇであり、ＨＰＬＣ分析により９５％純度を有していた。ＭＳ（ＥＳＴ）ｍ／ｚ５００（Ｍ−Ｈ）⁻：４５６（Ｍ−Ｈ−ＣＯ_２）⁻。

中間体化合物Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノルシフェリンは下記のとおりにして製造した。
ａ．２−（６´−トリフルオロアセチルアミノ−２´−ベンゾチアゾリル）−△^２−チアゾリン−４−カルボン酸（Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノルシフェリン）。５０ｍｌ丸底フラスコに、Ｄ，Ｌ−システイン（６８８ｍｇ、５．６８ｍｍｏｌ）および脱イオン水（１４ｍｌ、１５分間にわたり窒素を泡立てて通すことによって脱気）を添加した。生成する混合物を溶解が達成されるまで、窒素雰囲気下に磁気撹拌した。別の２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコに、無水炭酸カリウム（７８５ｍｇ、５．６８ｍｍｏｌ）および脱気した脱イオン水（１４ｍｌ）を添加した。生成する溶液を、ｐＨを７．５以下に維持するのに要する６Ｎ塩酸の定期的添加を伴い、Ｄ，Ｌ−システイン溶液含有フラスコにパスツールピペットを経て添加した。

反応フラスコへの炭酸カリウム溶液の添加が完了した後、反応混合物の一部（１０．１ｍｌ、約２．０４ｍｍｏｌのＤ，Ｌ−システイン含有）を計量し（目盛り付シリンダーによる）、別の５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに移した。この混合物を脱気したメタノール１５ｍｌにより稀釈し、生成する溶液を脱気したメタノール（１７ｍｌ）中の２−シアノ−６−トリフルオロアセチルアミノベンゾチアゾール（５５２ｍｇ、２．０４ｍｍｏｌ）含有１００ｍｌ丸底フラスコに移した（Ｗｈｉｔｅ等、１９６６）。この反応混合物を室温で磁気撹拌し、次いでこの反応フラスコをアルミニウムホイルにより覆った。１時間の撹拌後、ＴＣＬおよびＨＰＬＣ分析は、痕跡量のみの出発材料の残留を示した。この反応混合物を水（７９ｍｌ）で稀釈し、そのｐＨは〜８．０であることが見出された。この反応混合物を別のロート（２５０ｍｌ）に移し、次いで酢酸エチル（７９ｍｌ）により抽出し、中性有機化合物を分離した。

この水性相を６Ｎ塩酸の添加によりｐＨ２に酸性化し、生成する粘着性オフホワイト色沈殿を５℃において一夜にわたり保存した。この懸濁液を５０ｍｌ遠心管に移し、次いで約３分間かけて遠心処理した。この懸濁液をデカンテーション処理し、このペレット状生成物を冷水で洗浄し、次いで３回、遠心処理した。このペレット状物をメタノール中に懸濁し、次いで２５０ｍｌ丸底フラスコに移した。この懸濁液を回転蒸発により濃縮し、次いでジクロロメタンとともに共蒸発させ、粗製淡黄色固形物を得た。この粗製生成物をシリカゲル２４ｇ上で溶出溶液として９：１ジクロロメタン−メタノールを用いるフラッシュクロマトグラフイによって精製した。２本目のクロマトグラフイカラムが必要であり、シリカゲル１００ｇおよび溶出溶剤として９：１ジクロロメタン−メタノールを使用し、淡黄色固形物６６０ｍｇ（８６％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３７５（Ｍ−Ｈ）⁻。

参考文献

全部の刊行物、特許および特許出願書を引用して本明細書に組入れる。前記明細書の記載において、本発明はその或る種の好適態様に関連して説明されており、またかなりの詳細な記載は例示の目的で記載されているが、本発明が追加の態様を受容するものであり、また本明細書の或る詳細な説明を本発明の基本的原則から逸脱することなく格別に変更することができることは当業者にとって明白であると見なされる。

図１は、発光反応における耐熱性ホタルルシフェラーゼ用基質としてのルシフェリンまたはアミノルシフェリンにかかわる相対的光単位（ＲＬＵ）を示す。アミノルシフェリンは、飽和条件下にルシフェリンとして約６０％の光産出をもたらす。Ｋｍは、ルシフェリンにかかわる約０．６μＭからアミノルシフェリンにかかわる２μＭまで移動する。 図２は、均質分析形式における遊離アミノルシフェリンからの背景信号の排除を例示する。遊離アミノルシフェリンは、トリプシンの不存在下においてさえも、高い背景信号を生成することができる。この背景信号は、遊離アミノルシフェリンがルシフェラーゼによって消費されるに従い減少する。この基質をプロテアーゼに曝される前に、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、およびＭｇ^＋と組み合わせることによって、信号対ノイズ比は劇的に増加される。さらにまた、このプロテアーゼの存在はルシフェラーゼ反応を緩衝しなかった。 図３のＡは、経過時間に対するＮ−Ｌｙｓ−アミノルシフェリンによるトリプシン滴定からのＲＬＵを示す。基質を、緩衝液中でルシフェラーゼ、ＡＴＰ、およびＭｇ^＋と組み合わせ、次いで一夜にわたりインキュベートし、遊離アミノルシフェリンを除去した。この基質混合物を次いで、トリプシン滴定に添加した。（実施例１）図３のＢは、延長された期間にわたるＮ−Ｌｙｓ−アミノルシフェリンによるトリプシン滴定からのＲＬＵ（ｌｏｇ）を示す。（実施例１） 図４は、Ｚ−Ａｒｇ−Ｒｈｏ１１０によるトリプシン滴定からの相対的蛍光単位（ＲＦＵ）を示す。（実施例１） 図５は、経過時間にわたるＺ−ＤＥＶＤ−アミノルシフェリンによるカスパーゼ滴定からのＲＬＵを示す。緩衝液中のルシフェラーゼ、ＡＴＰ、およびＭｇ^＋を基質に添加した。 図６は、Ｚ−ＤＥＶＤ−Ｒｈｏ１１０によるカスパーゼ滴定からのＲＦＵを示す。発蛍光Ｚ−ＤＥＶＤ−Ｒｈｏ１１０基質は、Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｃａｓｐａｓｅ３／７分析キット（Promega）として提供された。ＤＥＶＤ−アミノルシフェリン基質の場合と同一の緩衝液を、ＤＥＶＤ−Ｒｈｏ１１０基質の場合に使用した（図５参照）。 カスパーゼおよびＺ−ＤＥＶＤ−Ｒｈｏ１１０にかかわるＲＦＵ（背景控除）またはＲＦＵ（ｌｏｇ）を示す。 カスパーゼおよびＺ−ＤＥＶＤ−アミノルシフェリンにかかわるＲＬＵ（背景控除）またはＲＦＵ（ｌｏｇ）を示す。（実施例３） 図９は、基質としてＮ−Ｌｙｓ−アミノルシフェリンまたはＺ−Ａｒｇ−Ｒｈｏ１１０を用いるトリプシンにかかわるＲＬＵおよびＲＦＵの比較である。トリプシン滴定は、上記のとおりに設定した。この発光分析は、匹敵する蛍光分析よりも大きい感度を有し、例えばＬｙｓ−アミノルシフェリン基質は、読取時間に応じてＡｒｇ−Ｒｈｏ１１０よりも３〜１０倍の感度を有する。（実施例１） 図１０は、カスパーゼおよび基質としてのＺ−ＤＥＶＤ−アミノルシフェリン、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣまたはＺ−ＤＥＶＤ−Ｒｈｏ１１０にかかわるＲＬＵおよびＲＦＵの比較である。使用されたＺ−ＤＥＶＤ−Ｒｈｏ１１０基質および緩衝液は、Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）（Ｐｒｏｍｅｇａ）基質および緩衝液であった。ＤＥＶＤ−ＡＭＣ基質の場合、同一緩衝液を使用した。ＤＥＶＤ−アミノルシフェリン基質は、読取時間に応じてＡｒｇ−Ｒｈｏ１１０基質よりも５０〜３００倍大きい感度を有していた。（実施例３） ジャルカット（Jurkat）細胞（誘発または未誘発）およびカスパーゼ基質Ｚ−ＤＥＶＤ−アミノルシフェリンまたはＺ−ＤＥＶＤ−Ｒｈｏ１１０を用いて得られたＲＬＵおよびＲＦＵを示す。この蛍光カスパーゼ分析には、Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）緩衝液およびＺ−ＤＥＶＤ−Ｒｈｏ１１０基質を使用した。ルシフェラーゼ、ＡＴＰおよびＭｇＳＯ_４の添加とともに、ＤＥＶＤ−アミノルシフェリンの場合と同一の緩衝液を使用した。ＤＥＶＤ−アミノルシフェリン基質は、１時間経過時点で、Ａｒｇ−Ｒｈｏ１１０よりも１０倍大きい感度を有していた。４時間の時点で、これは約２倍に減少した。（実施例４） 図１２Ａは、ＣＨＡＰＳまたはＡｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）緩衝液を用いて得られた相対的ＲＬＵまたはＲＦＵの結果を示す。（実施例５） 図１２Ｂは、ＣＨＡＰＳまたはＡｐｏ−ＯＮＥ（登録商品名）緩衝液を用いて得られた相対的ＲＬＵまたはＲＦＵの結果を示す。（実施例５） 図１３は、種々のカスパーゼにかかわる認識部位を例示する（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ等、１９９７；Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｌｖｏ等、１９９９）。

Claims (76)

1. １種または２種以上のカスパーゼを検出するための発光分析法であって、
   ａ）１種または２種以上のカスパーゼを含有するものと予測される試料を、ルシフェラーゼおよびアミノ−修飾アミノルシフェリンまたはそのカルボキシ末端保護誘導体を含有する混合物と接触させる工程、および
   ｂ）試料中のルミネセンスを検出する工程、
   を包含し、上記修飾はアミノルシフェリンまたはその誘導体のアミノ基に対するカスパーゼ用基質のペプチド結合を経る共有結合であり、またカスパーゼはこのペプチド結合の部位で基質を分解するものであり、および当該発光分析法は基質またはその官能性均等物に共有結合した発蛍光団を含有する共役結合体を用いる対応する分析法よりもさらに高い感度を有する、上記発光分析法。
2. アスパルテート含有基質を特異的に分解するプロテアーゼを検出するための発光分析法であって、
   ａ）１種または２種以上のアスパルテート特異性プロテアーゼを含有するものと予測される試料を、ルフシファーゼおよびアミノ修飾アミノルシフェリンまたはそのカルボキシ末端保護誘導体を含有する混合物と接触させる工程、および
   ｂ）試料中のルミネセンスを検出する工程、
   を包含し、上記修飾はアミノルシフェリンまたはその誘導体のアミノ基に対するアスパルテート含有基質のペプチド結合を経る共有結合であり、またこのプロテアーゼは当該ペプチド結合の部位で基質を分解するものであり、および当該発光分析法は、基質またはその官能性均等物に共有結合した発蛍光団を含有する共役結合体を用いる対応する分析法よりもさらに高い感度を有する、上記発光分析法。
3. プロテアーゼ濃度または活性とルミネセンスとを相関させることをさらに包含する、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
4. カスパーゼ３またはカスパーゼ７以外のカスパーゼを検出する、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
5. カスパーゼ３またはカスパーゼ７を検出する、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
6. 基質がＸ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｄを含有し、ここでＸ_１は、Ｙ、Ｄ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｗ、またはＰであり；Ｘ_２は、ＶまたはＥであり；およびＸ_３は、いずれかのアミノ酸である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
7. Ｘ_３がＡ、Ｖ、Ｈ、ＩまたはＴである、請求項６に記載の方法。
8. 基質がＤＥＶＤ（配列番号：１）を含有する、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
9. 基質がＹＶＡＤ（配列番号：２）を含有する、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
10. 基質がＬＥＨＤ（配列番号：３）を含有する、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
11. 少なくとも０．２マイクロ単位のカスパーゼを検出する、請求項５に記載の方法。
12. 基質に共有結合したローダミン−１１０を含有する共役結合体を用いる対応する分析法に比較し、少なくとも２倍大きい感度を有する、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
13. 試料が細胞ライゼートである、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
14. 細胞を、溶解に先立ち、細胞自滅誘発剤で処理する、請求項１３に記載の方法。
15. 試料が完全細胞を包含する、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
16. 細胞を細胞自滅誘発剤で処理する、請求項１５に記載の方法。
17. カスパーゼ用基質にペプチド結合を経て共有結合したアミノルシフェリンまたはそのカルボキシ末端保護誘導体を包含する化合物。
18. アスパルテート含有基質を特異的に分解する基質にペプチド結合を経て共有結合したアミノルシフェリンまたはそのカルボキシ末端保護誘導体を包含する化合物。
19. 基質がＤＥＶＤ（配列番号：１）を含有する、請求項１７または１８のいずれかに記載の方法。
20. 基質がＹＶＡＤ（配列番号：２）を含有する、請求項１７または１８のいずれかに記載の方法。
21. 基質がＬＥＨＤ（配列番号：３）を含有する、請求項１７または１８のいずれかに記載の方法。
22. 基質がＸ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｄを含有し、ここでＸ_１は、Ｙ、Ｄ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｗ、またはＰであり；Ｘ_２は、ＶまたはＥであり；およびＸ_３は、いずれかのアミノ酸である、請求項１７または１８のいずれかに記載の方法。
23. Ｘ_３がＡ、Ｖ、Ｈ、ＩまたはＴである、請求項２２に記載の方法。
24. アミノルシフェリンのカルボキシ末端保護誘導体である、請求項１７〜２３のいずれかに記載の化合物。
25. カルボキシ末端が、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルエステルとして保護されている、請求項２４に記載の化合物。
26. カルボキシ末端が、メチル、エチル、プロピル、またはｔ−ブチルエステルとして保護されている、請求項２４に記載の化合物。
27. アミノペプチダーゼによる分解を防止するために、基質のＮ−末端が修飾されている、請求項２４に記載の化合物。
28. 基質のＮ−末端が、アミノ保護基により修飾されている、請求項２７に記載の化合物。
29. カルボキシ末端が固体支持体へのカップリングによって保護されている、請求項２４に記載の化合物。
30. アミノルシフェリンのカルボキシ末端保護誘導体の製造方法であって、対応する酸を適当なカルボキシ保護基により保護することを包含する、上記方法。
31. 請求項１７〜２３のいずれかに記載のアミノルシフェリンのカルボキシ末端保護誘導体の製造方法であって、対応する酸を適当なカルボキシ保護基により保護することを包含する、上記方法。
32. 酸をエステルとして保護する、請求項３０または３１に記載の方法。
33. 酸をｔｅｒｔ−ブチルエステルとして保護する、請求項３２に記載の方法。
34. 請求項３０または３１のいずれかに記載の方法によって製造されるカルボキシ末端保護アミノルシフェリン。
35. 酸を、アミノルシフェリンの固体支持体へのカップリングによって保護する、請求項３０または３１のいずれかに記載の方法。
36. 固体支持体がペプチド合成に適する樹脂である、請求項３５に記載の方法。
37. 酸を、エステル結合を経て支持体にカップリングさせる、請求項３５に記載の方法。
38. 請求項１７〜２３のいずれかに記載の化合物の製造方法であって、第一アミノ酸またはペプチドと固体支持体に結合したアミノルシフェリンのアミノ基との間にアミド結合を形成し；次いで場合により、１個または２個以上の追加のアミノ酸またはペプチドをペプチド結合により付加し、当該化合物を生成させる、上記方法。
39. Ｎ−保護したアミノルシフェリンをカルボキシ基を経て固体支持体に結合させ；次いでアミノルシフェリンを脱保護化することによって固体支持体に結合したアミノルシフェリンを製造する、請求項３８に記載の方法。
40. 化合物を固体支持体から分離し、遊離カルボン酸基を有する化合物を得ることをさらに包含する、請求項３８または３９のいずれかに記載の方法。
41. カルボン酸基を適当な保護基により保護することをさらに包含する、請求項３９に記載の方法。
42. ルシフェラーゼが耐熱性ルシフェラーゼである、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
43. 固体支持体にカルボキシル基を経てカップリングされたアミノルシフェリンを包含する化合物。
44. 固体支持体にカルボキシル基を経てカップリングされたＮ−保護アミノルシフェリンを包含する化合物。
45. 固体支持体がペプチド合成に適する樹脂である、請求項４３または４４のいずれかに記載の化合物。
46. アミノ基がＦｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ基により保護されている、請求項４５に記載の化合物。
47. そのカルボキシ末端保護誘導体が、式（Ｉ）：
    

    

    
    （式中、Ｒは、カスパーゼ用基質であるペプチドであり、このペプチドはそのＣ−末端を経て式（Ｉ）で表わされる化合物の残りの部分に結合し、ペプチド（アミド）結合を形成しており；およびＲ´は、Ｈまたは適当なカルボキシ保護基である）
    で表わされる化合物またはその適当な塩である、請求項１に記載の方法。
48. そのカルボキシ末端保護誘導体が、式（Ｉ）：
    

    

    
    （式中、Ｒは、ペプチドのＣ−末端部位でアスパルテート基を経て式（Ｉ）で表わされる化合物の残りの部分に結合し、ペプチド結合を形成するペプチドであり；およびＲ´は、Ｈまたは適当なカルボキシ保護基である）
    で表わされる化合物またはその適当な塩である、請求項２に記載の方法：
49. ＲがＸ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｄを包含し、ここでＸ_１は、Ｙ、Ｄ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｗ、またはＰであり；Ｘ_２は、ＶまたはＥであり；およびＸ_３は、いずれかのアミノ酸である、請求項４７または４８のいずれかに記載の方法。
50. Ｘ_３がＡ、Ｖ、Ｈ、ＩまたはＴである、請求項４９に記載の方法。
51. ＲがＤＥＶＤ（配列番号：１）を包含する、請求項４９に記載の方法。
52. ＲがＹＶＡＤ（配列番号：２）を包含する、請求項４９に記載の方法。
53. ＲがＬＥＨＤ（配列番号：３）を包含する、請求項４９に記載の方法。
54. Ｒ´が（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル、フェニルまたはベンジルである、請求項４７〜５３のいずれかに記載の方法。
55. Ｒ´が（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルである、請求項４７〜５３のいずれかに記載の方法。
56. Ｒ´がメチル、エチル、プロピル、またはｔｅｒｔ−ブチルである、請求項４７〜５３のいずれかに記載の方法。
57. 式（Ｉ）で表わされる化合物またはその適当な塩：
    

    

    
    式中、Ｒは、カスパーゼ用基質であるペプチドであり、このペプチドはその末端Ｃ−末端を経て式（Ｉ）で表わされる化合物の残りの部分に結合し、ペプチド（アミド）結合を形成しており；およびＲ´は、Ｈまたは適当なカルボキシ保護基である。
58. 式（Ｉ）で表わされる化合物またはその適当な塩：
    

    

    
    式中、Ｒは、ペプチドのＣ−末端部位でアスパルテート基を経て式（Ｉ）で表わされる化合物の残りの部分に結合し、ペプチド結合を形成するペプチドであり；およびＲ´は、Ｈまたは適当なカルボキシ保護基である。
59. ＲがＸ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｄを包含し、ここでＸ_１は、Ｙ、Ｄ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｗ、またはＰであり；Ｘ_２は、ＶまたはＥであり；およびＸ_３は、いずれかのアミノ酸である、請求項４７または４８のいずれかに記載の化合物。
60. Ｘ_３がＡ、Ｖ、Ｈ、ＩまたはＴである、請求項５９に記載の化合物。
61. ＲがＤＥＶＤ（配列番号：１）を包含する、請求項５９に記載の化合物。
62. ＲがＹＶＡＤ（配列番号：２）を包含する、請求項５９に記載の化合物。
63. ＲがＬＥＨＤ（配列番号：３）を包含する、請求項５９に記載の化合物。
64. Ｒ´が（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル、フェニルまたはベンジルである、請求項５７〜６３のいずれかに記載の化合物。
65. Ｒ´が（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルである、請求項５７〜６３のいずれかに記載の化合物。
66. Ｒ´がメチル、エチル、プロピル、またはｔｅｒｔ−ブチルである、請求項５７〜６３のいずれかに記載の化合物。
67. 式（Ｉ）：
    

    

    
    （式中、Ｒは、カスパーゼ用基質であるペプチドであり、このペプチドはそのＣ−末端を経て式（Ｉ）で表わされる化合物の残りの部分に結合し、ペプチド（アミド）結合を形成しており；およびＲ´は、適当なカルボキシ保護基である）
    で表わされる化合物の製造方法であって、Ｒ´が水素である対応する酸を適当なカルボキシ保護基により保護することを包含する、上記方法。
68. 式（Ｉ）で表わされる化合物：
    

    

    
    式中、Ｒは、カスパーゼ用基質であるペプチドであり、このペプチドはそのＣ−末端を経て式（Ｉ）で表わされる化合物の残りの部分に結合し、ペプチド（アミド）結合を形成しており；およびＲ´は、固体支持体である。
69. 固体支持体がペプチド合成に適する樹脂である、請求項６８に記載の化合物。
70. 式（Ｉ）で表わされる化合物：
    

    

    
    式中、Ｒは、ペプチドのＣ−末端部位でアスパルテート基を経て式（Ｉ）で表わされる化合物の残りの部分に結合し、ペプチド結合を形成するペプチドであり；およびＲ´は、固体支持体である。
71. 固体支持体がペプチド合成に適する樹脂である、請求項７０に記載の化合物。
72. ＲがＸ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｄを包含し、ここでＸ_１は、Ｙ、Ｄ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｗ、またはＰであり；Ｘ_２は、ＶまたはＥであり；およびＸ_３は、いずれかのアミノ酸である、請求項６８〜７１のいずれかに記載の化合物。
73. Ｘ_３がＡ、Ｖ、Ｈ、ＩまたはＴである、請求項７２に記載の化合物。
74. ＲがＤＥＶＤ（配列番号：１）を包含する、請求項７２に記載の化合物。
75. ＲがＹＶＡＤ（配列番号：２）を包含する、請求項７２に記載の化合物。
76. ＲがＬＥＨＤ（配列番号：３）を包含する、請求項７２に記載の化合物。

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