JP2003344419A - コレステロール検出試薬 - Google Patents
コレステロール検出試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 コレステロールと特異的に結合することによ
りコレステロールを検出することができる物質を含む新
規なコレステロール検出試薬およびそれを用いたコレス
テロールの検出方法を提供すること。 【解決手段】 標識されていてもよいポリエチレングリ
コールコレステリルエーテルを含む、コレステロール検
出試薬。
りコレステロールを検出することができる物質を含む新
規なコレステロール検出試薬およびそれを用いたコレス
テロールの検出方法を提供すること。 【解決手段】 標識されていてもよいポリエチレングリ
コールコレステリルエーテルを含む、コレステロール検
出試薬。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、コレステロール検
出試薬、及びそれを用いたコレステロールの検出方法に
関する。より詳細には、本発明は、ポリエチレングリコ
ールコレステリルエーテルを含むコレステロール検出試
薬、及びそれを用いたコレステロールの検出方法に関す
る。
出試薬、及びそれを用いたコレステロールの検出方法に
関する。より詳細には、本発明は、ポリエチレングリコ
ールコレステリルエーテルを含むコレステロール検出試
薬、及びそれを用いたコレステロールの検出方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】細胞内コレステロールの含量および分布
は厳密に調節されている。細胞内において、コレステロ
ールはゴルジ後膜に蓄積する(M.S.Bretscher,他、Scien
ce 261,1280-1.(1993))。原形質膜上で、コレステロー
ルはスフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質と一緒
になってミクロドメインを形成する(A.Rietveld,他、Bi
ochim Biophys Acta 1376,467-79.(1998)；及び、R.E.B
rown,J Cell Sci 111,1-9.(1998)）。カベオリン、及び
グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合糖タ
ンパク質および二重にアシル化された非受容体型チロシ
ンキナーゼ等の他のクラスのタンパク質がこのドメイン
に存在する（T.V.Kurzchalia,他、Curr Opin Cell Biol
11,424-31.(1999)；及びE.Ikonen,他、Traffic 1,212-
7.(2000)）。このドメインは脂質ラフトとして知られて
いる。脂質ラフトは、シグナリング、接着、運動および
膜通過などの細胞機能において重要な役割を果たす（D.
A.Brown,他、Annu Rev Cell Dev Biol 14,111-36(199
8)；及び、K.Simons,他、Nat Rev Mol Cell Biol 1,31-
9.(2000)）。メチル-β-シクロデキストリン(MβCD)に
より表面のコレステロールを除去するか、または代謝阻
害剤を用いることにより細胞のコレステロール含量が減
少すると、このドメインの分解が引き起こされる(L.J.P
ike,他、J Biol Chem 273,22298-304.(1998)；A.Prall
e,他、J Cell Biol148,997-1008.(2000)；及び、K.Rope
r,他、Nat Cell Biol 2,582-92.(2000)）。
は厳密に調節されている。細胞内において、コレステロ
ールはゴルジ後膜に蓄積する(M.S.Bretscher,他、Scien
ce 261,1280-1.(1993))。原形質膜上で、コレステロー
ルはスフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質と一緒
になってミクロドメインを形成する(A.Rietveld,他、Bi
ochim Biophys Acta 1376,467-79.(1998)；及び、R.E.B
rown,J Cell Sci 111,1-9.(1998)）。カベオリン、及び
グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合糖タ
ンパク質および二重にアシル化された非受容体型チロシ
ンキナーゼ等の他のクラスのタンパク質がこのドメイン
に存在する（T.V.Kurzchalia,他、Curr Opin Cell Biol
11,424-31.(1999)；及びE.Ikonen,他、Traffic 1,212-
7.(2000)）。このドメインは脂質ラフトとして知られて
いる。脂質ラフトは、シグナリング、接着、運動および
膜通過などの細胞機能において重要な役割を果たす（D.
A.Brown,他、Annu Rev Cell Dev Biol 14,111-36(199
8)；及び、K.Simons,他、Nat Rev Mol Cell Biol 1,31-
9.(2000)）。メチル-β-シクロデキストリン(MβCD)に
より表面のコレステロールを除去するか、または代謝阻
害剤を用いることにより細胞のコレステロール含量が減
少すると、このドメインの分解が引き起こされる(L.J.P
ike,他、J Biol Chem 273,22298-304.(1998)；A.Prall
e,他、J Cell Biol148,997-1008.(2000)；及び、K.Rope
r,他、Nat Cell Biol 2,582-92.(2000)）。
【０００３】細胞のコレステロール含量は、de novo合
成と、リポタンパク質のエンドサイトーシスにより外部
から得られるコレステロールとの均衡を通して調節され
る（M.S.Brown,他、Proc Natl Acad Sci USA 96,11041-
8.(1999)；K.Simons,他、Science 290,1721-6.(2000)；
及び、Y.A.Ioannou,Nat Rev Mol Cell Biol 2,657-68.
(2001)）。この調節が破綻すると、動脈硬化またはニー
マン−ピック病C型(NPC)のような病態が引き起こされる
(P.G.Pentchev 他、Biochim Biophys Acta 1225,235-4
3.(1994)；及び、L.Liscum,Traffic 1,218-25.(200
0)）。後期エンドソームのリゾビスホスファチジン酸リ
ッチな内膜ドメインは収集および分配装置として作用す
ることにより、コレステロール輸送の調節に関与する
(T.Kobayashi 他、Nat Cell Biol 1,113-8.(1999))。し
かし、コレステロールおよび／またはコレステロールリ
ッチな膜ドメインの細胞内輸送については、ほとんど知
られていない。
成と、リポタンパク質のエンドサイトーシスにより外部
から得られるコレステロールとの均衡を通して調節され
る（M.S.Brown,他、Proc Natl Acad Sci USA 96,11041-
8.(1999)；K.Simons,他、Science 290,1721-6.(2000)；
及び、Y.A.Ioannou,Nat Rev Mol Cell Biol 2,657-68.
(2001)）。この調節が破綻すると、動脈硬化またはニー
マン−ピック病C型(NPC)のような病態が引き起こされる
(P.G.Pentchev 他、Biochim Biophys Acta 1225,235-4
3.(1994)；及び、L.Liscum,Traffic 1,218-25.(200
0)）。後期エンドソームのリゾビスホスファチジン酸リ
ッチな内膜ドメインは収集および分配装置として作用す
ることにより、コレステロール輸送の調節に関与する
(T.Kobayashi 他、Nat Cell Biol 1,113-8.(1999))。し
かし、コレステロールおよび／またはコレステロールリ
ッチな膜ドメインの細胞内輸送については、ほとんど知
られていない。
【０００４】ポリエチレングリコールコレステリルエー
テル(PEG-Chols)は、疎水性のコレステリル部分および
親水性のポリエチレングリコール部分からなる非イオン
性かつ両親媒性の一群の分子である(図１Ａ)（H.Ishiwa
ta,他、Biochim Biophys Acta 1359,123-35(1997)）。P
EG(50)-Chol（分子量は2587、括弧内の数字である50は
エチレングリコールの反復数を示す）は、培地中の生細
胞に添加すると、クラスリンを介したトランスフェリン
のインターナリゼーションに影響を与えない条件下にお
いて、クラスリンとは無関係であるカベオラ様エンドサ
イトーシスを阻害することが知られている(T.Baba 他、
Traffic 2,501-12.(2001))。しかしながら、PEG-Cholが
細胞の如何なる成分と相互作用するのかは不明であっ
た。
テル(PEG-Chols)は、疎水性のコレステリル部分および
親水性のポリエチレングリコール部分からなる非イオン
性かつ両親媒性の一群の分子である(図１Ａ)（H.Ishiwa
ta,他、Biochim Biophys Acta 1359,123-35(1997)）。P
EG(50)-Chol（分子量は2587、括弧内の数字である50は
エチレングリコールの反復数を示す）は、培地中の生細
胞に添加すると、クラスリンを介したトランスフェリン
のインターナリゼーションに影響を与えない条件下にお
いて、クラスリンとは無関係であるカベオラ様エンドサ
イトーシスを阻害することが知られている(T.Baba 他、
Traffic 2,501-12.(2001))。しかしながら、PEG-Cholが
細胞の如何なる成分と相互作用するのかは不明であっ
た。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ポリエチレ
ングリコールコレステリルエーテルが細胞内で特異的に
結合することができる分子を同定することを解決すべき
課題とした。さらに、本発明は、コレステロールと特異
的に結合することによりコレステロールを検出すること
ができる物質を含む新規なコレステロール検出試薬およ
びそれを用いたコレステロールの検出方法を提供するこ
とを解決すべき課題とした。
ングリコールコレステリルエーテルが細胞内で特異的に
結合することができる分子を同定することを解決すべき
課題とした。さらに、本発明は、コレステロールと特異
的に結合することによりコレステロールを検出すること
ができる物質を含む新規なコレステロール検出試薬およ
びそれを用いたコレステロールの検出方法を提供するこ
とを解決すべき課題とした。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討し、PEG(50)-Cholによりクラス
リンとは無関係のエンドサイトーシスが特異的に阻害さ
れるという以前の知見を考慮して、PEG-Cholが一以上の
脂質ラフト成分と特異的に相互作用している可能性があ
るものと推測し、オーバーレイ・アッセイを使用して、
PEG-Cholが様々な脂質とin vitroで結合することを確認
した。さらに細胞内でPEG-Cholが相互作用する物質を検
討した結果、PEG-Cholがコレステロールに特異的に結合
することができることを見出した。本発明はこれらの知
見に基づいて完成したものである。
解決するために鋭意検討し、PEG(50)-Cholによりクラス
リンとは無関係のエンドサイトーシスが特異的に阻害さ
れるという以前の知見を考慮して、PEG-Cholが一以上の
脂質ラフト成分と特異的に相互作用している可能性があ
るものと推測し、オーバーレイ・アッセイを使用して、
PEG-Cholが様々な脂質とin vitroで結合することを確認
した。さらに細胞内でPEG-Cholが相互作用する物質を検
討した結果、PEG-Cholがコレステロールに特異的に結合
することができることを見出した。本発明はこれらの知
見に基づいて完成したものである。
【０００７】即ち、本発明によれば、標識されていても
よいポリエチレングリコールコレステリルエーテルを含
む、コレステロール検出試薬が提供される。本発明の別
の側面によれば、標識されていてもよいポリエチレング
リコールコレステリルエーテルを用いることを特徴とす
る、コレステロールの検出方法が提供される。本発明で
は、親和性物質又は蛍光物質で標識されているポリエチ
レングリコールコレステリルエーテルを用いることが好
ましい。
よいポリエチレングリコールコレステリルエーテルを含
む、コレステロール検出試薬が提供される。本発明の別
の側面によれば、標識されていてもよいポリエチレング
リコールコレステリルエーテルを用いることを特徴とす
る、コレステロールの検出方法が提供される。本発明で
は、親和性物質又は蛍光物質で標識されているポリエチ
レングリコールコレステリルエーテルを用いることが好
ましい。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。本発明のコレステロール検出試薬は、標識
されていてもよいポリエチレングリコールコレステリル
エーテルを含むものである。本発明で用いるポリエチレ
ングリコールコレステリルエーテルとは、図１Ａに記載
した構造を有する化合物であり、疎水性のコレステリル
部分および親水性のポリエチレングリコール部分からな
る化合物である（H.Ishiwata,他、Biochim Biophys Act
a 1359,123-35(1997)）。ｎはポリエチレングリコール
部分におけるエチレングリコールの反復数を示す。本発
明で用いるポリエチレングリコールコレステリルエーテ
ルにおけるｎの数は、コレステロールとの結合性に悪影
響を与えない限り特に限定されないが、例えば、１０〜
１０００、好ましくは２０〜２００、より好ましくは２
０〜１００程度である。好ましく使用できる一例として
は、ｎ＝５０のポリエチレングリコール部分を含むポリ
エチレングリコールコレステリルエーテルを挙げること
ができる。
て説明する。本発明のコレステロール検出試薬は、標識
されていてもよいポリエチレングリコールコレステリル
エーテルを含むものである。本発明で用いるポリエチレ
ングリコールコレステリルエーテルとは、図１Ａに記載
した構造を有する化合物であり、疎水性のコレステリル
部分および親水性のポリエチレングリコール部分からな
る化合物である（H.Ishiwata,他、Biochim Biophys Act
a 1359,123-35(1997)）。ｎはポリエチレングリコール
部分におけるエチレングリコールの反復数を示す。本発
明で用いるポリエチレングリコールコレステリルエーテ
ルにおけるｎの数は、コレステロールとの結合性に悪影
響を与えない限り特に限定されないが、例えば、１０〜
１０００、好ましくは２０〜２００、より好ましくは２
０〜１００程度である。好ましく使用できる一例として
は、ｎ＝５０のポリエチレングリコール部分を含むポリ
エチレングリコールコレステリルエーテルを挙げること
ができる。
【０００９】本発明で用いるポリエチレングリコールコ
レステリルエーテルは公知の化合物であり、例えば、上
記の文献（H.Ishiwata,他、Biochim Biophys Acta 135
9,123-35(1997)）に記載されている。本発明で用いるポ
リエチレングリコールコレステリルエーテルは、コレス
テロールを溶媒に溶かしエチレングリコールガスを注入
し反応させることにより製造することができる（Ishiwa
ta他、Chem Pharm Bull 43, 1005-1011(1995)）。この
他、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルは、
コレステロールのトルエンスルホン酸エステルとポリエ
チレングリコールとを反応させる方法により製造するこ
ともできる（Patel他、Biochim BiophysActa 797:20-26
(1984)）。
レステリルエーテルは公知の化合物であり、例えば、上
記の文献（H.Ishiwata,他、Biochim Biophys Acta 135
9,123-35(1997)）に記載されている。本発明で用いるポ
リエチレングリコールコレステリルエーテルは、コレス
テロールを溶媒に溶かしエチレングリコールガスを注入
し反応させることにより製造することができる（Ishiwa
ta他、Chem Pharm Bull 43, 1005-1011(1995)）。この
他、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルは、
コレステロールのトルエンスルホン酸エステルとポリエ
チレングリコールとを反応させる方法により製造するこ
ともできる（Patel他、Biochim BiophysActa 797:20-26
(1984)）。
【００１０】本発明で用いるポリエチレングリコールコ
レステリルエーテルとしては、検出のための標識物質が
結合しているものを使用することが好ましい。このよう
な標識物質の種類は特に限定されないが、例えば、親和
性物質、蛍光物質、放射性物質などが挙げられる。親和
性物質としては、ビオチンまたはジゴキシゲニンなどを
使用することができる。蛍光物質としては、フルオレセ
イン（fluorescein）、ＦＩＴＣ、BODIPY493/503、BODI
PY FL 、ジアルキルアミノクマリン、２’，７’−ジク
ロロフルオレセイン、ヒドロキシクマリン、メトキシク
マリン、ナフトフルオレセイン、Oregon Green 514、テ
トラメチルローダミン（ＴＭＲ）、Ｘ−ローダミン、Ｎ
ＢＤ、ＴＲＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＩＲ
144、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸなどを使用
することができる。放射性物質としては、32Ｐ、
13 1Ｉ、35Ｓ、45Ｃａ、3Ｈ、14Ｃなどを使用することが
できる。この他、酸化ストレス検出剤 (同仁)carboxy-P
TIO、DTCS；ＮＯ発生剤(同仁)BNN5；種々のcagedアミノ
酸；キレート剤（例えば、DTPA、EDTA、NTAなど）、種
々のcarboxy disulfide（（カルボン酸）S-S（カルボン
酸）の構造を有する）等を使用することができる。
レステリルエーテルとしては、検出のための標識物質が
結合しているものを使用することが好ましい。このよう
な標識物質の種類は特に限定されないが、例えば、親和
性物質、蛍光物質、放射性物質などが挙げられる。親和
性物質としては、ビオチンまたはジゴキシゲニンなどを
使用することができる。蛍光物質としては、フルオレセ
イン（fluorescein）、ＦＩＴＣ、BODIPY493/503、BODI
PY FL 、ジアルキルアミノクマリン、２’，７’−ジク
ロロフルオレセイン、ヒドロキシクマリン、メトキシク
マリン、ナフトフルオレセイン、Oregon Green 514、テ
トラメチルローダミン（ＴＭＲ）、Ｘ−ローダミン、Ｎ
ＢＤ、ＴＲＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＩＲ
144、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸなどを使用
することができる。放射性物質としては、32Ｐ、
13 1Ｉ、35Ｓ、45Ｃａ、3Ｈ、14Ｃなどを使用することが
できる。この他、酸化ストレス検出剤 (同仁)carboxy-P
TIO、DTCS；ＮＯ発生剤(同仁)BNN5；種々のcagedアミノ
酸；キレート剤（例えば、DTPA、EDTA、NTAなど）、種
々のcarboxy disulfide（（カルボン酸）S-S（カルボン
酸）の構造を有する）等を使用することができる。
【００１１】本発明のコレステロール検出試薬は、上記
した標識されていてもよいポリエチレングリコールコレ
ステリルエーテルを含む限り、その形態は特に限定され
ず固体でも液体（溶液、懸濁液など）でもよい。液体の
場合には適当な溶媒（好ましくは、該ポリエチレングリ
コールコレステリルエーテルが一定の溶解度を示す有機
溶媒など）に溶解または懸濁することによって試薬を調
製することができる。上記した形態で提供される本発明
の試薬には、ポリエチレングリコールコレステリルエー
テル以外の助剤（例えば、保存剤、安定化剤、ｐＨ緩衝
剤など）を適宜添加することもできる。
した標識されていてもよいポリエチレングリコールコレ
ステリルエーテルを含む限り、その形態は特に限定され
ず固体でも液体（溶液、懸濁液など）でもよい。液体の
場合には適当な溶媒（好ましくは、該ポリエチレングリ
コールコレステリルエーテルが一定の溶解度を示す有機
溶媒など）に溶解または懸濁することによって試薬を調
製することができる。上記した形態で提供される本発明
の試薬には、ポリエチレングリコールコレステリルエー
テル以外の助剤（例えば、保存剤、安定化剤、ｐＨ緩衝
剤など）を適宜添加することもできる。
【００１２】本発明によれば、標識されていてもよいポ
リエチレングリコールコレステリルエーテルを用いてコ
レステロールを検出する方法も提供される。検出はイン
ビトロで行ってもよいし、細胞内で行ってもよいし、あ
るいは生体内で行ってもよい。先ず、検出すべきコレス
テロールを含む試料と、（好ましくは標識されている）
ポリエチレングリコールコレステリルエーテルとを一定
条件下で接触させることにより、両者を結合させる。
リエチレングリコールコレステリルエーテルを用いてコ
レステロールを検出する方法も提供される。検出はイン
ビトロで行ってもよいし、細胞内で行ってもよいし、あ
るいは生体内で行ってもよい。先ず、検出すべきコレス
テロールを含む試料と、（好ましくは標識されている）
ポリエチレングリコールコレステリルエーテルとを一定
条件下で接触させることにより、両者を結合させる。
【００１３】結合後に、コレステロールに結合したポリ
エチレングリコールコレステリルエーテルの検出を行
う。検出は、用いた標識の種類に応じて適宜行うことが
できる。例えば、ビオチンを標識として用いた場合に
は、ビオチンに特異的に結合するアビジンまたはストレ
プトアビジンを用いて検出を行うことができる。例え
ば、コレステロールに結合したビオチン標識ポリエチレ
ングリコールコレステリルエーテルに対して、アビジン
またはストレプトアビジンを反応させ、次いで、ビオチ
ン化したアルカリホスファターゼを結合させると、ビオ
チンを介して酵素が結合する。未結合の酵素を除去した
後、アルカリホスファターゼの基質であるニトロブルー
テトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）と反応させると、ビ
オチン標識ポリエチレングリコールコレステリルエーテ
ルが存在する場合には紫色の発色が見られ、検出するこ
とができる。ジゴキシゲニンを標識として用いた場合に
は、アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体
を用いて上記の方法と同様に検出を行うことができる。
なお、発色用の酵素としては、アルカリホスファターゼ
以外にも西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる系も知ら
れている。
エチレングリコールコレステリルエーテルの検出を行
う。検出は、用いた標識の種類に応じて適宜行うことが
できる。例えば、ビオチンを標識として用いた場合に
は、ビオチンに特異的に結合するアビジンまたはストレ
プトアビジンを用いて検出を行うことができる。例え
ば、コレステロールに結合したビオチン標識ポリエチレ
ングリコールコレステリルエーテルに対して、アビジン
またはストレプトアビジンを反応させ、次いで、ビオチ
ン化したアルカリホスファターゼを結合させると、ビオ
チンを介して酵素が結合する。未結合の酵素を除去した
後、アルカリホスファターゼの基質であるニトロブルー
テトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）と反応させると、ビ
オチン標識ポリエチレングリコールコレステリルエーテ
ルが存在する場合には紫色の発色が見られ、検出するこ
とができる。ジゴキシゲニンを標識として用いた場合に
は、アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体
を用いて上記の方法と同様に検出を行うことができる。
なお、発色用の酵素としては、アルカリホスファターゼ
以外にも西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる系も知ら
れている。
【００１４】フルオレセインなどの蛍光物質を使用した
場合には、コレステロールとの反応後に蛍光を測定する
ことによりコレステロールと結合したポリエチレングリ
コールコレステリルエーテルを検出することができる。
蛍光は一定の励起光を照射して発生する蛍光エネルギー
を測定することにより、蛍光の定性的または定量的な検
出を行うことができる。定量に際しては、蛍光エネルギ
ーの強度をコレステロールの存在量の指標として評価す
ることもできる。蛍光エネルギーまたは蛍光は、市販の
適当な検出器や蛍光蛍光顕微鏡などを用いて測定するこ
とができる。
場合には、コレステロールとの反応後に蛍光を測定する
ことによりコレステロールと結合したポリエチレングリ
コールコレステリルエーテルを検出することができる。
蛍光は一定の励起光を照射して発生する蛍光エネルギー
を測定することにより、蛍光の定性的または定量的な検
出を行うことができる。定量に際しては、蛍光エネルギ
ーの強度をコレステロールの存在量の指標として評価す
ることもできる。蛍光エネルギーまたは蛍光は、市販の
適当な検出器や蛍光蛍光顕微鏡などを用いて測定するこ
とができる。
【００１５】放射性物質を使用した場合には、コレステ
ロールとの反応後にコレステロールに結合した放射活性
を当業者に公知の方法により測定することにより、コレ
ステロールの検出を行うことができる。以下の実施例に
より本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施
例によって限定されるものではない。
ロールとの反応後にコレステロールに結合した放射活性
を当業者に公知の方法により測定することにより、コレ
ステロールの検出を行うことができる。以下の実施例に
より本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施
例によって限定されるものではない。
【００１６】
【実施例】実施例１：PEG-Cholを用いたin vitroでの結
合実験 （方法） （１） 様々な量の各種脂質に対するビオチニル化PEG-
Chol（bPEG-Chol:ビオチン1分子がPEG(50)-Cholの末端
エチレングリコール部分と結合している）（10μM）の
結合能を、既報の通り(K.Igarashi 他、J Biol Chem 27
0,29075-8.(1995))、TLCプレート上でのオーバーレイ・
アッセイにより分析した。結果を図１Ｂに示す。 （２） 各種のリン脂質、糖脂質およびオレイン酸コレ
ステロール（10nmol）に対するbPEG-Chol（10μM）の結
合を上記（１）と同様に調べた。結果を図１Ｃに示す。 （３） グルコシルセラミド(GlcCer)とスフィンゴミエ
リン(SM)、またはグルコシルセラミドとジオレオイルホ
スファチジルコリン(DOPC)との混合物（図１Ｄに示した
比率で合計30nmol）に対するbPEG-Cholの結合を分析し
た。結果を図１Ｄに示す。
合実験 （方法） （１） 様々な量の各種脂質に対するビオチニル化PEG-
Chol（bPEG-Chol:ビオチン1分子がPEG(50)-Cholの末端
エチレングリコール部分と結合している）（10μM）の
結合能を、既報の通り(K.Igarashi 他、J Biol Chem 27
0,29075-8.(1995))、TLCプレート上でのオーバーレイ・
アッセイにより分析した。結果を図１Ｂに示す。 （２） 各種のリン脂質、糖脂質およびオレイン酸コレ
ステロール（10nmol）に対するbPEG-Chol（10μM）の結
合を上記（１）と同様に調べた。結果を図１Ｃに示す。 （３） グルコシルセラミド(GlcCer)とスフィンゴミエ
リン(SM)、またはグルコシルセラミドとジオレオイルホ
スファチジルコリン(DOPC)との混合物（図１Ｄに示した
比率で合計30nmol）に対するbPEG-Cholの結合を分析し
た。結果を図１Ｄに示す。
【００１７】（４） GlcCer、SM、GlcCer+SM(1:1)およ
びGlcCer+DOPC(1:1)の差動走査熱量測定のサーモグラム
のトレースを測定した。MicroCal VP-DSCを使用して、1
mMリポソーム(GlcCer、SM、DOPC)または2mMリポソーム
(GlcCer+SM、GlcCer+DOPC)懸濁液500μlを計測した。結
果を図１Ｅに示す。 （５） GlcCerとDOPCとの1:1混合物を含む単分子層の
蛍光画像を取得した。脂質単分子層は、0.5％ C12-BODI
PY-PC（分子プローブ）を含有する1mMのGlcCer+DOPCの
クロロホルム溶液20μlをUSIシステム（Fukuoka, Jpa
n）FSD-500 Langmuir-Blodgettのトラフに注入すること
により作製した。C12-BODIPY-PCは、優先的にDOPC層に
分配された。表面圧力は10mN/mに調整した。LM Plan FI
50x対物レンズおよび東芝3CCDカメラを備えたOlympus
Power BX蛍光顕微鏡を使用して蛍光画像を記録した。結
果を図１Ｆに示す。バーは50μmを示す。
びGlcCer+DOPC(1:1)の差動走査熱量測定のサーモグラム
のトレースを測定した。MicroCal VP-DSCを使用して、1
mMリポソーム(GlcCer、SM、DOPC)または2mMリポソーム
(GlcCer+SM、GlcCer+DOPC)懸濁液500μlを計測した。結
果を図１Ｅに示す。 （５） GlcCerとDOPCとの1:1混合物を含む単分子層の
蛍光画像を取得した。脂質単分子層は、0.5％ C12-BODI
PY-PC（分子プローブ）を含有する1mMのGlcCer+DOPCの
クロロホルム溶液20μlをUSIシステム（Fukuoka, Jpa
n）FSD-500 Langmuir-Blodgettのトラフに注入すること
により作製した。C12-BODIPY-PCは、優先的にDOPC層に
分配された。表面圧力は10mN/mに調整した。LM Plan FI
50x対物レンズおよび東芝3CCDカメラを備えたOlympus
Power BX蛍光顕微鏡を使用して蛍光画像を記録した。結
果を図１Ｆに示す。バーは50μmを示す。
【００１８】（６） 様々な量のコレステロールを含む
1mMのスフィンゴミエリン小胞を用いて、PEG鎖の遠位末
端にフルオレセインを含むフルオレセインPEG-Chol(fPE
G-Chol)(H.Ishiwata,他、Biochim Biophys Acta 1359,1
23-35(1997))の結合について分析した。小胞は、既報の
通り(A.Miyazawa 他、Mol Immunol 25,1025-31.(198
8)）作製した。小胞をfPEG-Cholと一緒に室温で30分間
インキュベートした。未結合のfPEG-Cholを、15K×gで1
5分間遠心分離して洗い流した。ペレットの蛍光を計測
し、スフィンゴミエリンのリンによって標準化した。結
果を図１Ｇに示す。
1mMのスフィンゴミエリン小胞を用いて、PEG鎖の遠位末
端にフルオレセインを含むフルオレセインPEG-Chol(fPE
G-Chol)(H.Ishiwata,他、Biochim Biophys Acta 1359,1
23-35(1997))の結合について分析した。小胞は、既報の
通り(A.Miyazawa 他、Mol Immunol 25,1025-31.(198
8)）作製した。小胞をfPEG-Cholと一緒に室温で30分間
インキュベートした。未結合のfPEG-Cholを、15K×gで1
5分間遠心分離して洗い流した。ペレットの蛍光を計測
し、スフィンゴミエリンのリンによって標準化した。結
果を図１Ｇに示す。
【００１９】（７） 膜間のfPEG-Cholの移動を分析し
た。500μM（最終濃度）のSM/Chol(1:1)リポソームを、
0.5μMのfPEG-Cholおよび0.5μMのN-ローダミン--ジパ
ルミトイルホスファチジルエタノールアミンを含有し、
SM単独またはSM/Chol(1:1)から構成されるリポソーム(5
0μM)に添加した。488nmで励起した蛍光の535nmにおけ
る発光スペクトルの時間的経過をモニターすることによ
り、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)の放出を計測した。
結果を図１Ｈに示す。
た。500μM（最終濃度）のSM/Chol(1:1)リポソームを、
0.5μMのfPEG-Cholおよび0.5μMのN-ローダミン--ジパ
ルミトイルホスファチジルエタノールアミンを含有し、
SM単独またはSM/Chol(1:1)から構成されるリポソーム(5
0μM)に添加した。488nmで励起した蛍光の535nmにおけ
る発光スペクトルの時間的経過をモニターすることによ
り、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)の放出を計測した。
結果を図１Ｈに示す。
【００２０】なお、コレステロールおよびオレイン酸コ
レステロールは、Sigma(ミズーリ州セントルイス)から
購入した。ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド
およびラクトシルセラミドはMatreya（ペンシルベニヤ
州ステートカレッジ）から購入した。他の全ての脂質
は、Avanti Polar lipids（アラバマ州アラバスター）
から購入した。
レステロールは、Sigma(ミズーリ州セントルイス)から
購入した。ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド
およびラクトシルセラミドはMatreya（ペンシルベニヤ
州ステートカレッジ）から購入した。他の全ての脂質
は、Avanti Polar lipids（アラバマ州アラバスター）
から購入した。
【００２１】Cholはコレステロール、SMはスフィンゴミ
エリン、PCはホスファチジルコリン、PSはホスファチジ
ルセリン、PEはホスファチジルエタノールアミン、PIは
ホスファチジルイノシトール、PAはホスファチジン酸、
GM1はガングリオシドGM1、GM2はガングリオシドGM2、GM
3はガングリオシドGM3、GalCerはガラクトシルセラミ
ド、GlcCerはグルコシルセラミド、LacCerはラクトシル
セラミドである。
エリン、PCはホスファチジルコリン、PSはホスファチジ
ルセリン、PEはホスファチジルエタノールアミン、PIは
ホスファチジルイノシトール、PAはホスファチジン酸、
GM1はガングリオシドGM1、GM2はガングリオシドGM2、GM
3はガングリオシドGM3、GalCerはガラクトシルセラミ
ド、GlcCerはグルコシルセラミド、LacCerはラクトシル
セラミドである。
【００２２】（結果）ビオチニル化PEG-Chol（bPEG-Cho
l:ビオチン1分子がPEG(50)-Cholの末端エチレングリコ
ール部分と結合している）を様々な脂質のスポットに添
加し、それを洗浄した後、基質として4-クロロ-1-ナフ
トールを使用してHRP結合ストレプトアビジンによりそ
の結合を観察した（図１Ｂ及びＣ）(A.Yamaji 他、J Bi
ol Chem273,5300-6.(1998))。bPEG-Cholは、コレステロ
ールおよび中性糖脂質（例えばガラクトシルセラミド、
グルコシルセラミド(GlcCer)およびラクトシルセラミ
ド）に結合した。しかし、bPEG-Cholは、試験したリン
脂質及び酸性糖脂質（ガングリオシド）には結合しなか
った。bPEG-Cholは、コレステリルエステルおよびオレ
イン酸コレステロールにも結合しなかった。また、スフ
ィンゴミエリン(SM)の添加により、bPEG-Cholとグルコ
シルセラミドと結合しなくなったが、ジオレオイルホス
ファチジルコリン(DOPC)にはそのような効果は生じなか
った（図１Ｄ）。
l:ビオチン1分子がPEG(50)-Cholの末端エチレングリコ
ール部分と結合している）を様々な脂質のスポットに添
加し、それを洗浄した後、基質として4-クロロ-1-ナフ
トールを使用してHRP結合ストレプトアビジンによりそ
の結合を観察した（図１Ｂ及びＣ）(A.Yamaji 他、J Bi
ol Chem273,5300-6.(1998))。bPEG-Cholは、コレステロ
ールおよび中性糖脂質（例えばガラクトシルセラミド、
グルコシルセラミド(GlcCer)およびラクトシルセラミ
ド）に結合した。しかし、bPEG-Cholは、試験したリン
脂質及び酸性糖脂質（ガングリオシド）には結合しなか
った。bPEG-Cholは、コレステリルエステルおよびオレ
イン酸コレステロールにも結合しなかった。また、スフ
ィンゴミエリン(SM)の添加により、bPEG-Cholとグルコ
シルセラミドと結合しなくなったが、ジオレオイルホス
ファチジルコリン(DOPC)にはそのような効果は生じなか
った（図１Ｄ）。
【００２３】差動走査熱量測定(DSC)によれば、SMとGlc
Cerとの等モル混合物のゲルから液体への結晶相転移温
度は、SMとGlcCerについての当該温度の中間値であるこ
とが示された（図１Ｅ）。これに対して、DOPCとGlcCer
との等モル混合物の前記相転移温度はGlcCerの相転移温
度に非常に近く、そしてDOPCの相転移温度はSMの該温度
と比べてはるかに低い。これらの結果は、GlcCerはSMと
混和することができるが、この脂質とDOPCとの二成分混
合物は異なるドメインに分離されることを示唆する。
Cerとの等モル混合物のゲルから液体への結晶相転移温
度は、SMとGlcCerについての当該温度の中間値であるこ
とが示された（図１Ｅ）。これに対して、DOPCとGlcCer
との等モル混合物の前記相転移温度はGlcCerの相転移温
度に非常に近く、そしてDOPCの相転移温度はSMの該温度
と比べてはるかに低い。これらの結果は、GlcCerはSMと
混和することができるが、この脂質とDOPCとの二成分混
合物は異なるドメインに分離されることを示唆する。
【００２４】GlcCerがDOPCから分離されることを実証す
るために、単分子層系を利用した（図１Ｆ）。単分子層
の実験により、GlcCer（黒）はDOPC（緑）から分離し
て、空気と水との中間相にてドメインを形成することが
判明した。この結果は、PEG-Cholと中性糖脂質とが互い
に寄り集まっている場合にのみ、PEG-Cholは中性糖脂質
と結合することを示唆する。細胞膜の界面活性剤溶解度
(D.A.Brown,他、Cell 68,533-44.(1992))およびモデル
膜における脂質配分の測定(T.Y.Wang,他、BiophysJ 79,
1478-89.(2000))から、糖脂質が細胞においてスフィン
ゴミエリンリッチな膜に分配されることが示唆される。
生体膜においてスフィンゴミエリンが高濃度であること
を考慮すると、この結果は、細胞ではPEG-Cholは糖脂質
にはほとんど結合していないことを示唆する。糖脂質と
は対照的に、スフィンゴミエリンの添加は、コレステロ
ール含量が10％未満まで減少しない限り、コレステロー
ルに対するbPEG-Cholの結合に影響を及ぼさなかった。
るために、単分子層系を利用した（図１Ｆ）。単分子層
の実験により、GlcCer（黒）はDOPC（緑）から分離し
て、空気と水との中間相にてドメインを形成することが
判明した。この結果は、PEG-Cholと中性糖脂質とが互い
に寄り集まっている場合にのみ、PEG-Cholは中性糖脂質
と結合することを示唆する。細胞膜の界面活性剤溶解度
(D.A.Brown,他、Cell 68,533-44.(1992))およびモデル
膜における脂質配分の測定(T.Y.Wang,他、BiophysJ 79,
1478-89.(2000))から、糖脂質が細胞においてスフィン
ゴミエリンリッチな膜に分配されることが示唆される。
生体膜においてスフィンゴミエリンが高濃度であること
を考慮すると、この結果は、細胞ではPEG-Cholは糖脂質
にはほとんど結合していないことを示唆する。糖脂質と
は対照的に、スフィンゴミエリンの添加は、コレステロ
ール含量が10％未満まで減少しない限り、コレステロー
ルに対するbPEG-Cholの結合に影響を及ぼさなかった。
【００２５】コレステロールに対するPEG-Cholの結合を
調べるために、PEG鎖の遠位末端にフルオレセインを含
むフルオレセインPEG-Chol(fPEG-Chol)を使用して、リ
ポソーム実験をさらに行った。オーバーレイ・アッセイ
と同様に、コレステロールの添加により、スフィンゴミ
エリン・リポソームに対するfPEG-Cholの結合が増加し
た（図１Ｇ）。コレステロール含量が低い（10％）場合
はfPEG-CholがSMリポソームと結合しなかったという事
実は、上記膜において、fPEG-Cholがコレステロールリ
ッチなドメインを認識することを示している。
調べるために、PEG鎖の遠位末端にフルオレセインを含
むフルオレセインPEG-Chol(fPEG-Chol)を使用して、リ
ポソーム実験をさらに行った。オーバーレイ・アッセイ
と同様に、コレステロールの添加により、スフィンゴミ
エリン・リポソームに対するfPEG-Cholの結合が増加し
た（図１Ｇ）。コレステロール含量が低い（10％）場合
はfPEG-CholがSMリポソームと結合しなかったという事
実は、上記膜において、fPEG-Cholがコレステロールリ
ッチなドメインを認識することを示している。
【００２６】PEG-Cholは水溶性であり膜間を移動するこ
とができる。図１Ｈにおいて、膜間のfPEG-Cholの移動
を測定した。fPEG-Cholの輸送を計測するために、fPEG-
Cholと、非置換性マーカーであるローダミン標識したホ
スファチジルエタノールアミン(ローダミン-PE)との間
の蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を測定した(J.W.Nicho
ls,他、Biochemistry 21,1720-6.(1982)）。供与リポソ
ームにおいて、fPEG-Chol蛍光は、FRETにより消光し
た。しかし、一旦、fPEG-Cholが受容リポソームに輸送
されると、蛍光は消光しなくなった。SMリポソームを供
与体として使用し、SM/Chol(1:1)リポソームを受容体と
して使用した場合、fPEG-Cholの効率的な輸送が観察さ
れた。一方、供与体および受容体の両方がSM/Chol(1:1)
である場合、fPEG-Cholはほとんど移動しなかった。こ
れらの結果は、PEG-Cholがコレステロールリッチな膜に
優先的に組み込まれ、はその膜内に閉じ込められること
を示している。
とができる。図１Ｈにおいて、膜間のfPEG-Cholの移動
を測定した。fPEG-Cholの輸送を計測するために、fPEG-
Cholと、非置換性マーカーであるローダミン標識したホ
スファチジルエタノールアミン(ローダミン-PE)との間
の蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を測定した(J.W.Nicho
ls,他、Biochemistry 21,1720-6.(1982)）。供与リポソ
ームにおいて、fPEG-Chol蛍光は、FRETにより消光し
た。しかし、一旦、fPEG-Cholが受容リポソームに輸送
されると、蛍光は消光しなくなった。SMリポソームを供
与体として使用し、SM/Chol(1:1)リポソームを受容体と
して使用した場合、fPEG-Cholの効率的な輸送が観察さ
れた。一方、供与体および受容体の両方がSM/Chol(1:1)
である場合、fPEG-Cholはほとんど移動しなかった。こ
れらの結果は、PEG-Cholがコレステロールリッチな膜に
優先的に組み込まれ、はその膜内に閉じ込められること
を示している。
【００２７】実施例２：細胞を用いたPEG-Cholによる標
識実験 （方法）既報の通り(T.Kobayashi 他、Nat Cell Biol
1,113-8.(1999))、正常(図２Ａ〜Ｄ)およびNPC(図２Ｅ
〜Ｈ)のヒト皮膚繊維芽細胞を固定し、透過化処理し
た。次に、5μMのfPEG-Chol(図２Ａ及びＥ)、50μg/ml
フィリピン(図２Ｂ及びＦ）および抗TGN 46抗体(Serote
c Inc.、イギリス、オックスフォード)(図２Ｃ及びＧ)を
用いて細胞を三重標識した。Zeiss LSM共焦点顕微鏡を
使用して試料を観察した。図２Ｄ及びＨは合成画像を示
す。白色は３種の蛍光団の共局在を示す。fPEG-Cholと
フィリピンとで染色した試料については、蛍光がNPC細
胞において非常に明るいため、正常細胞とNPC細胞に
は、レーザー光線を異なるように照射した。
識実験 （方法）既報の通り(T.Kobayashi 他、Nat Cell Biol
1,113-8.(1999))、正常(図２Ａ〜Ｄ)およびNPC(図２Ｅ
〜Ｈ)のヒト皮膚繊維芽細胞を固定し、透過化処理し
た。次に、5μMのfPEG-Chol(図２Ａ及びＥ)、50μg/ml
フィリピン(図２Ｂ及びＦ）および抗TGN 46抗体(Serote
c Inc.、イギリス、オックスフォード)(図２Ｃ及びＧ)を
用いて細胞を三重標識した。Zeiss LSM共焦点顕微鏡を
使用して試料を観察した。図２Ｄ及びＨは合成画像を示
す。白色は３種の蛍光団の共局在を示す。fPEG-Cholと
フィリピンとで染色した試料については、蛍光がNPC細
胞において非常に明るいため、正常細胞とNPC細胞に
は、レーザー光線を異なるように照射した。
【００２８】図２Ｉ及びＪにおいては、NPC細胞を通常
血清(図２Ｉ)および脱脂血清(図２Ｊ)の存在下で増殖さ
せた。細胞を透過化し、fPEG-Cholで標識した。図２Ｋ
及びＬにおいては、NPC皮膚繊維芽細胞を固定して透過
化した。次いで、1mMスフィンゴミエリン・リポソーム
(図２Ｋ)またはスフィンゴミエリン／コレステロール
(1:1)リポソーム(図２Ｌ)の存在下で、細胞をfPEG-Chol
により標識した。
血清(図２Ｉ)および脱脂血清(図２Ｊ)の存在下で増殖さ
せた。細胞を透過化し、fPEG-Cholで標識した。図２Ｋ
及びＬにおいては、NPC皮膚繊維芽細胞を固定して透過
化した。次いで、1mMスフィンゴミエリン・リポソーム
(図２Ｋ)またはスフィンゴミエリン／コレステロール
(1:1)リポソーム(図２Ｌ)の存在下で、細胞をfPEG-Chol
により標識した。
【００２９】図２Ｍ〜Ｒにおいては、メラノーマ細胞株
MEB4（図２Ｍ〜Ｏ）および糖脂質合成に欠陥のある変異
体GM95（図２Ｐ〜Ｒ）を固定化し透過化した後、fPEG-C
hol（図２Ｍ及びＰ）およびフィリピン（図２Ｎ及び
Ｑ）で二重標識した。MEB4およびGM95における蛍光パタ
ーンの類似性は、fPEG-Cholによる標識が主に糖脂質に
依存するものではないことを示唆する。fPEG-Chol標識
はフィリピン標識と共局在した（図２Ｏ及びＲ）。
MEB4（図２Ｍ〜Ｏ）および糖脂質合成に欠陥のある変異
体GM95（図２Ｐ〜Ｒ）を固定化し透過化した後、fPEG-C
hol（図２Ｍ及びＰ）およびフィリピン（図２Ｎ及び
Ｑ）で二重標識した。MEB4およびGM95における蛍光パタ
ーンの類似性は、fPEG-Cholによる標識が主に糖脂質に
依存するものではないことを示唆する。fPEG-Chol標識
はフィリピン標識と共局在した（図２Ｏ及びＲ）。
【００３０】（結果）in vitroでのPEG-Cholと様々な脂
質との相互作用は、この分子が細胞において特定のコレ
ステロールリッチな膜または膜ドメインに組み込まれる
ことを示唆する。透過化処理したヒト皮膚繊維芽細胞に
fPEG-Cholを添加すると、ゴルジ体が明るい蛍光を発光
した（図２Ａ）。同様の不明瞭な蛍光パターンは、コレ
ステロールと複合体を形成するフィリピンを用いて以前
にも観察されている(J.Sokol他、J Biol Chem 263,3411
-7.(1988)；及び、T.Kobayashi 他、Nat Cell Biol 1,1
13-8.(1999))。fPEG-Chol染色は、トランスゴルジ網マ
ーカーであるTGN46と部分的には共局在していた(A.R.Pr
escott,他、Eur J Cell Biol 72,238-46.(1997))。その
重複が不完全であることは、ゴルジ体においてTGN46と
コレステロールが異なった分布をしていることを示唆す
る。ニーマン−ピック病C型(NPC)は、常染色体劣性の内
臓神経疾患である。NPC症候群の特徴は、非エステル化
コレステロールが細胞内に蓄積することである(P.G.Pen
tchev 他、Biochim Biophys Acta 1225,235-43.(199
4)；L.Liscum,Traffic 1,218-25.(2000)；及び、T.Koba
yashi他、Nat Cell Biol 1,113-8.(1999)）。正常な繊
維芽細胞とは異なり、NPC繊維芽細胞においては、fPEG-
Cholにより核周囲の小胞ならびにゴルジ体が染色される
（図２Ｅ）。この場合も、蛍光はフィリピン蛍光と共局
在していた（図２Ｆ及びＨ）。
質との相互作用は、この分子が細胞において特定のコレ
ステロールリッチな膜または膜ドメインに組み込まれる
ことを示唆する。透過化処理したヒト皮膚繊維芽細胞に
fPEG-Cholを添加すると、ゴルジ体が明るい蛍光を発光
した（図２Ａ）。同様の不明瞭な蛍光パターンは、コレ
ステロールと複合体を形成するフィリピンを用いて以前
にも観察されている(J.Sokol他、J Biol Chem 263,3411
-7.(1988)；及び、T.Kobayashi 他、Nat Cell Biol 1,1
13-8.(1999))。fPEG-Chol染色は、トランスゴルジ網マ
ーカーであるTGN46と部分的には共局在していた(A.R.Pr
escott,他、Eur J Cell Biol 72,238-46.(1997))。その
重複が不完全であることは、ゴルジ体においてTGN46と
コレステロールが異なった分布をしていることを示唆す
る。ニーマン−ピック病C型(NPC)は、常染色体劣性の内
臓神経疾患である。NPC症候群の特徴は、非エステル化
コレステロールが細胞内に蓄積することである(P.G.Pen
tchev 他、Biochim Biophys Acta 1225,235-43.(199
4)；L.Liscum,Traffic 1,218-25.(2000)；及び、T.Koba
yashi他、Nat Cell Biol 1,113-8.(1999)）。正常な繊
維芽細胞とは異なり、NPC繊維芽細胞においては、fPEG-
Cholにより核周囲の小胞ならびにゴルジ体が染色される
（図２Ｅ）。この場合も、蛍光はフィリピン蛍光と共局
在していた（図２Ｆ及びＨ）。
【００３１】リポタンパク質の不在下でNPC細胞を増殖
させると、コレステロールの蓄積が有意に減少した(J.S
okol 他、J Biol Chem 263,3411-7.(1988))。NPC細胞
を、通常血清の代わりに脱脂血清の存在下で増殖させた
場合、fPEG-Cholによる核周囲の標識は著しく減少した
（図２Ｉ及びＪ）。fPEG-CholをSM/Chol(1:1)リポソー
ムと一緒に前培養すると、fPEG-Chol標識は喪失した
（図２Ｌ）。コレステロールを含まないスフィゴミエリ
ンリポソームによる効果は、同条件下において著しく少
ないことが示された（図２Ｋ）。fPEG-Cholは膜ドメイ
ンに組み込まれると、SM/Cholリポソームを用いても除
去されないことから、fPEG-Cholは細胞中のコレステロ
ールリッチな膜ドメインに閉じ込められていることが裏
付けられる。
させると、コレステロールの蓄積が有意に減少した(J.S
okol 他、J Biol Chem 263,3411-7.(1988))。NPC細胞
を、通常血清の代わりに脱脂血清の存在下で増殖させた
場合、fPEG-Cholによる核周囲の標識は著しく減少した
（図２Ｉ及びＪ）。fPEG-CholをSM/Chol(1:1)リポソー
ムと一緒に前培養すると、fPEG-Chol標識は喪失した
（図２Ｌ）。コレステロールを含まないスフィゴミエリ
ンリポソームによる効果は、同条件下において著しく少
ないことが示された（図２Ｋ）。fPEG-Cholは膜ドメイ
ンに組み込まれると、SM/Cholリポソームを用いても除
去されないことから、fPEG-Cholは細胞中のコレステロ
ールリッチな膜ドメインに閉じ込められていることが裏
付けられる。
【００３２】GM95は、糖脂質合成に欠陥のあるメラノー
マ細胞株である(S.Ichikawa,他、Proc Natl Acad Sci U
SA 91,2703-7.(1994))。PEG-Chol染色における糖脂質の
効果を調べるために、GM95とMEB4親細胞とを比較した。
GM95およびMEB4の両細胞ともfPEG-Cholにより同様に標
識された（図２Ｍ及びＰ）。また、その標識はフィリピ
ン標識と共局在していた。これらの結果は、fPEG-Chol
による細胞の標識は主に細胞のコレステロールに依存す
るが、糖脂質には依存しないことを示す。
マ細胞株である(S.Ichikawa,他、Proc Natl Acad Sci U
SA 91,2703-7.(1994))。PEG-Chol染色における糖脂質の
効果を調べるために、GM95とMEB4親細胞とを比較した。
GM95およびMEB4の両細胞ともfPEG-Cholにより同様に標
識された（図２Ｍ及びＰ）。また、その標識はフィリピ
ン標識と共局在していた。これらの結果は、fPEG-Chol
による細胞の標識は主に細胞のコレステロールに依存す
るが、糖脂質には依存しないことを示す。
【００３３】実施例３：fPEG-Cholの細胞表面の分布
（方法）正常なヒトの皮膚繊維芽細胞を、1μMのfPEG-C
holおよび5μM AlexaFluor 594標識したコレラトキシン
とともに室温で90秒間インキュベートし、次いでパラホ
ルムアルデヒドで10分間固定した。図３のＡ及びＣはfP
EG-Chol蛍光、図３のＢ及びＤはAlexaFluor 594蛍光で
ある。小さい矢印は、fPEG-Cholとコレラトキシンで二
重に標識された構造を示す。大きな矢印は、fPEG-Chol
のみで標識された構造を示す。矢じりは、コレラトキシ
ンのみによって陽性を示すスポットを示す。図３のＥ及
びＦにおいては、固定前に、10mMのMβCDによる37℃で3
0分間の処理を細胞に施すか(Ｅ)、または施さなかった
(Ｆ)。次いで、細胞を1μMのfPEG-Cholで標識した。図
３においてバーは4μmを示す。
holおよび5μM AlexaFluor 594標識したコレラトキシン
とともに室温で90秒間インキュベートし、次いでパラホ
ルムアルデヒドで10分間固定した。図３のＡ及びＣはfP
EG-Chol蛍光、図３のＢ及びＤはAlexaFluor 594蛍光で
ある。小さい矢印は、fPEG-Cholとコレラトキシンで二
重に標識された構造を示す。大きな矢印は、fPEG-Chol
のみで標識された構造を示す。矢じりは、コレラトキシ
ンのみによって陽性を示すスポットを示す。図３のＥ及
びＦにおいては、固定前に、10mMのMβCDによる37℃で3
0分間の処理を細胞に施すか(Ｅ)、または施さなかった
(Ｆ)。次いで、細胞を1μMのfPEG-Cholで標識した。図
３においてバーは4μmを示す。
【００３４】図４のＧ〜Ｌにおいては、正常な皮膚繊維
芽細胞を2μMのfPEG-Cholで標識し、さらに5μg/mlビオ
チニル化上皮増殖因子(EGF)とともに4℃で20分間(図４
のＧ及びＨ)、または37℃で2分間（図４のＩ及びＬ）イ
ンキュベートした。次に細胞を3％PFA、8％スクロース
を含むPBSにより固定し、急冷してTRITC標識したストレ
プトアビジンとともに4℃で20分間インキュベートし
た。Hamamatsu C-4742-98冷却CCDカメラを備えたNikon
TE 300顕微鏡で試料を観察した。図４のＧ及びＩはfPEG
-Chol蛍光、図４のＨ及びＪはAlexaFluor 594のEGF蛍光
である。図４のＫおよびＬにおいては、細胞を、1μMの
fPEG-CholおよびAlexaFluor 594標識したコレラトキシ
ンBサブユニットで二重に標識した後、未標識EGFで刺激
した。図４のＫはfPEG-Chol蛍光、図４のＬはコレラト
キシン蛍光である。図４においてバーは4μmを示す。
芽細胞を2μMのfPEG-Cholで標識し、さらに5μg/mlビオ
チニル化上皮増殖因子(EGF)とともに4℃で20分間(図４
のＧ及びＨ)、または37℃で2分間（図４のＩ及びＬ）イ
ンキュベートした。次に細胞を3％PFA、8％スクロース
を含むPBSにより固定し、急冷してTRITC標識したストレ
プトアビジンとともに4℃で20分間インキュベートし
た。Hamamatsu C-4742-98冷却CCDカメラを備えたNikon
TE 300顕微鏡で試料を観察した。図４のＧ及びＩはfPEG
-Chol蛍光、図４のＨ及びＪはAlexaFluor 594のEGF蛍光
である。図４のＫおよびＬにおいては、細胞を、1μMの
fPEG-CholおよびAlexaFluor 594標識したコレラトキシ
ンBサブユニットで二重に標識した後、未標識EGFで刺激
した。図４のＫはfPEG-Chol蛍光、図４のＬはコレラト
キシン蛍光である。図４においてバーは4μmを示す。
【００３５】図５のＭ〜Ｐにおいては、Ｂ細胞株A20.2J
を抗体なしで37℃で1分間インキュベートした。次に細
胞を洗浄し、1％PFAで30分間固定し、さらに氷上におい
て45分間、0.7μMのfPEG-Cholおよび10μg/mlのAlexa 5
46結合コレラトキシンBサブユニットを含有する0.1％BS
Aを用いて標識した。洗浄後、Zeiss LSM 510共焦点顕微
鏡の下で、染色された細胞を観察した。図５のＭはfPEG
-Chol標識、図５のＮはコレラトキシン標識、図５のＯ
は合成画像、図５のＰは位相差画像である。これらの条
件下において、fPEG-Cholは固定した細胞に浸透するこ
とが可能となり、細胞内膜ならびに原形質膜を染色す
る。対照的に、コレラトキシンは細胞内に入らず、細胞
表面のみを染色した。
を抗体なしで37℃で1分間インキュベートした。次に細
胞を洗浄し、1％PFAで30分間固定し、さらに氷上におい
て45分間、0.7μMのfPEG-Cholおよび10μg/mlのAlexa 5
46結合コレラトキシンBサブユニットを含有する0.1％BS
Aを用いて標識した。洗浄後、Zeiss LSM 510共焦点顕微
鏡の下で、染色された細胞を観察した。図５のＭはfPEG
-Chol標識、図５のＮはコレラトキシン標識、図５のＯ
は合成画像、図５のＰは位相差画像である。これらの条
件下において、fPEG-Cholは固定した細胞に浸透するこ
とが可能となり、細胞内膜ならびに原形質膜を染色す
る。対照的に、コレラトキシンは細胞内に入らず、細胞
表面のみを染色した。
【００３６】図５のＱ〜Ｔでは、A20.2J細胞をマウスIg
G+IgMに特異的なF(ab')2ヤギ抗体（F(ab')2抗Ig）15μg
/mlを用いて37℃で１分間刺激した。次いで上記と同様
に細胞を固定し、染色した。図５のＱはfPEG-Chol標
識、図５のＲはコレラトキシン標識、図５のＳは合成画
像、図５のＴは位相差画像である。
G+IgMに特異的なF(ab')2ヤギ抗体（F(ab')2抗Ig）15μg
/mlを用いて37℃で１分間刺激した。次いで上記と同様
に細胞を固定し、染色した。図５のＱはfPEG-Chol標
識、図５のＲはコレラトキシン標識、図５のＳは合成画
像、図５のＴは位相差画像である。
【００３７】（結果）実施例３では、fPEG-Cholの細胞
表面の分布を調べた（図３〜図５）。正常なヒトの皮膚
繊維芽細胞をfPEG-Cholで処理し、洗浄及び固定した。
小さいドメイン（直径200〜500nm）において、より強い
蛍光で標識されている不均一な表面が認められた（図３
Ａ及びＣ）。これらのドメインの一部は、Alexa Fluor
594標識したコレラトキシンB鎖と共局在していた（図３
Ｂ及びＤ）。コレラトキシンは、原形質膜に非ランダム
に分布しカベオラに蓄積するGM1と結合する(R.G.Parto
n, J Histochem Cytochem 42,155-66.(1994))。細胞
を、コレステロールを細胞から特異的に除去するメチル
-β-シクロデキストリン(MβCD)で前処理すると、fPEG-
Chol染色が失われた（図３Ｅ及びＦ）(G.H.Rothblat
他、J Lipid Res 40,781-96.(1999))。
表面の分布を調べた（図３〜図５）。正常なヒトの皮膚
繊維芽細胞をfPEG-Cholで処理し、洗浄及び固定した。
小さいドメイン（直径200〜500nm）において、より強い
蛍光で標識されている不均一な表面が認められた（図３
Ａ及びＣ）。これらのドメインの一部は、Alexa Fluor
594標識したコレラトキシンB鎖と共局在していた（図３
Ｂ及びＤ）。コレラトキシンは、原形質膜に非ランダム
に分布しカベオラに蓄積するGM1と結合する(R.G.Parto
n, J Histochem Cytochem 42,155-66.(1994))。細胞
を、コレステロールを細胞から特異的に除去するメチル
-β-シクロデキストリン(MβCD)で前処理すると、fPEG-
Chol染色が失われた（図３Ｅ及びＦ）(G.H.Rothblat
他、J Lipid Res 40,781-96.(1999))。
【００３８】次に、細胞を上皮増殖因子(EGF)で刺激し
なかった場合のfPEG-Cholの分布を測定した。EGF受容体
はコレステロールリッチな原形質膜ドメインを特定して
おり、EGF受容体へのEGFの結合は細胞表面のコレステロ
ールに依存することが示唆された(M.G.Waugh,他、Bioch
em Soc Trans 29,509-11.(2001)； K.Roepstorff,他、J
Biol Chem 8,8(2002)；及び、T.Ringerike,他、J Cell
Sci 115,1331-40.(2002)）。fPEG-Chol蛍光は、EGFを4
℃で添加した場合のビオチン標識EGFの分布と共局在し
ていた（図４Ｇ及びＨ）。EGFを37℃で添加すると、EGF
受容体のクラスター化が観察された（図４Ｊ）。これら
のクラスターはfPEG-Cholで標識された（図４Ｉ）。GM1
の細胞表面の分布もこの条件下で調べた。GM1もこれら
のクラスターにおいて富化されており、さらにfPEG-Cho
lと共局在していた（図４Ｋ及びＬ）。これらの結果
は、EGFが、コレステロールおよびGM1の両方についてEG
F受容体が富化されている前記クラスターへの分配を誘
導することを示す。
なかった場合のfPEG-Cholの分布を測定した。EGF受容体
はコレステロールリッチな原形質膜ドメインを特定して
おり、EGF受容体へのEGFの結合は細胞表面のコレステロ
ールに依存することが示唆された(M.G.Waugh,他、Bioch
em Soc Trans 29,509-11.(2001)； K.Roepstorff,他、J
Biol Chem 8,8(2002)；及び、T.Ringerike,他、J Cell
Sci 115,1331-40.(2002)）。fPEG-Chol蛍光は、EGFを4
℃で添加した場合のビオチン標識EGFの分布と共局在し
ていた（図４Ｇ及びＨ）。EGFを37℃で添加すると、EGF
受容体のクラスター化が観察された（図４Ｊ）。これら
のクラスターはfPEG-Cholで標識された（図４Ｉ）。GM1
の細胞表面の分布もこの条件下で調べた。GM1もこれら
のクラスターにおいて富化されており、さらにfPEG-Cho
lと共局在していた（図４Ｋ及びＬ）。これらの結果
は、EGFが、コレステロールおよびGM1の両方についてEG
F受容体が富化されている前記クラスターへの分配を誘
導することを示す。
【００３９】原形質膜ガングリオシドは、Ｂ細胞株A20.
2Jの原形質膜上のＢ細胞抗原受容体が架橋される際に再
分配される(M.J.Aman,他、J Biol Chem 276,46371-8.(2
001))。F(ab')2抗Igでの処理によりfPEG-Cholが再分配
されるかどうかを調べた。処理前では、Alexa Fluor 59
4標識したコレラトキシンおよびfPEG-Cholにより表面全
体の輪郭が浮かび上がった（図５のＭ〜Ｐ）。しかし、
F(ab')2断片で１分間刺激した後には、コレラトキシン
は凝集構造となって原形質膜に蓄積した（図５のＲ）。
fPEG-Cholもこの構造に局在した（図５のＱ及びＳ）。
この結果は、Ｂ細胞株の刺激の際にコレステロールがGM
1と一緒に再分配されることを示す。
2Jの原形質膜上のＢ細胞抗原受容体が架橋される際に再
分配される(M.J.Aman,他、J Biol Chem 276,46371-8.(2
001))。F(ab')2抗Igでの処理によりfPEG-Cholが再分配
されるかどうかを調べた。処理前では、Alexa Fluor 59
4標識したコレラトキシンおよびfPEG-Cholにより表面全
体の輪郭が浮かび上がった（図５のＭ〜Ｐ）。しかし、
F(ab')2断片で１分間刺激した後には、コレラトキシン
は凝集構造となって原形質膜に蓄積した（図５のＲ）。
fPEG-Cholもこの構造に局在した（図５のＱ及びＳ）。
この結果は、Ｂ細胞株の刺激の際にコレステロールがGM
1と一緒に再分配されることを示す。
【００４０】実施例４：コレステロールの膜内分布及び
細胞表面での挙動の分析 （方法） （１） 上記の通り、ストレプトリジンOを使用して正
常(図６のＡ)およびNPC(図６のＢ)繊維芽細胞の原形質
膜を透過化した。細胞を、fPEG-Cholとともに室温で30
分間インキュベートした後に洗浄し、Zeiss LSM 510共
焦点顕微鏡の下で蛍光画像を撮影した。結果を図６に示
す。 （２） 正常繊維芽細胞(図７のＣ〜Ｈ)およびNPC繊維
芽細胞(図７のＩ〜Ｎ)を、1μMのfPEG-Cholとともに室
温で5分間インキュベートした。細胞を洗浄し、1mg/ml
ローダミン・デキストランの存在下において、37℃で10
分間(図７のＦ、Ｉ、Ｌ)、60分間(図７のＤ、Ｇ、Ｊ、
Ｍ)および180分間(図７のＥ、Ｈ、Ｋ、Ｎ)インキュベー
トした。結果を図７に示す。
細胞表面での挙動の分析 （方法） （１） 上記の通り、ストレプトリジンOを使用して正
常(図６のＡ)およびNPC(図６のＢ)繊維芽細胞の原形質
膜を透過化した。細胞を、fPEG-Cholとともに室温で30
分間インキュベートした後に洗浄し、Zeiss LSM 510共
焦点顕微鏡の下で蛍光画像を撮影した。結果を図６に示
す。 （２） 正常繊維芽細胞(図７のＣ〜Ｈ)およびNPC繊維
芽細胞(図７のＩ〜Ｎ)を、1μMのfPEG-Cholとともに室
温で5分間インキュベートした。細胞を洗浄し、1mg/ml
ローダミン・デキストランの存在下において、37℃で10
分間(図７のＦ、Ｉ、Ｌ)、60分間(図７のＤ、Ｇ、Ｊ、
Ｍ)および180分間(図７のＥ、Ｈ、Ｋ、Ｎ)インキュベー
トした。結果を図７に示す。
【００４１】（３） NPC繊維芽細胞を、1μMのfPEG-Ch
olとともに室温で5分間インキュベートした。次に細胞
を洗浄し、37℃で30分間インキュベートした（図８
Ｏ）。NPC繊維芽細胞を、1μMのfPEG-Cholとともに4℃
で30分間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、撮影
した。次に細胞を洗浄し、37℃で30分間インキュベート
した（図８Ｐ）。NPC繊維芽細胞を、5μg/mlのブレフェ
ルジンAで30分間(図８Ｑ)、5μg/mlのノコダゾールで90
分間(図８Ｒ)、または5μg/mlのサイトカラシンBで30分
間(図８Ｓ)処理した後、1μMのfPEG-Cholおよび1mg/ml
のローダミン・デキストランとともに30分間インキュベ
ートした。図８Ｔにおいては、NPC繊維芽細胞を1μMのf
PEG-Cholとともに30分間インキュベートした後、5μg/m
lのサイトカラシンBで30分間処理した。図６〜８におい
て、バーは20μmを示す。
olとともに室温で5分間インキュベートした。次に細胞
を洗浄し、37℃で30分間インキュベートした（図８
Ｏ）。NPC繊維芽細胞を、1μMのfPEG-Cholとともに4℃
で30分間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、撮影
した。次に細胞を洗浄し、37℃で30分間インキュベート
した（図８Ｐ）。NPC繊維芽細胞を、5μg/mlのブレフェ
ルジンAで30分間(図８Ｑ)、5μg/mlのノコダゾールで90
分間(図８Ｒ)、または5μg/mlのサイトカラシンBで30分
間(図８Ｓ)処理した後、1μMのfPEG-Cholおよび1mg/ml
のローダミン・デキストランとともに30分間インキュベ
ートした。図８Ｔにおいては、NPC繊維芽細胞を1μMのf
PEG-Cholとともに30分間インキュベートした後、5μg/m
lのサイトカラシンBで30分間処理した。図６〜８におい
て、バーは20μmを示す。
【００４２】（結果）コレステロールの膜内分布につい
ては従来ほとんど報告がない。本実施例では半透過性細
胞を使用して、コレステロールが細胞内膜の細胞原形質
側に局在するのか内腔側に局在するのかを調べた。正常
およびNPC皮膚繊維芽細胞の原形質膜を細菌毒素ストレ
プトリジンOにより、選択的に透過化した。次に細胞をf
PEG-Cholとともにインキュベートした（図６Ａ及び
Ｂ）。fPEG-Chol染色は、固定し透過化した細胞で得ら
れた染色とは著しく異なっていた（図２Ａ及びＥ）。さ
らに、正常細胞とNPC細胞には大きな違いがあった。正
常な皮膚繊維芽細胞では、周辺部の小胞様構造が強く染
色されたが、NPC細胞では、網状様の構造が可視化され
た。この構造は、細胞を固定して透過化した後では見ら
れなかったことから、この区画は壊れやすいか、あるい
は界面活性剤により傷害を受けやすいことが示唆され
る。ゴルジ体および後期エンドソーム／リソソームは、
これらの条件下では、ほとんど標識されなかった。これ
らの結果から、コレステロールがこれらのオルガネラの
内腔にのみ存在することが示唆される。一方、正常な繊
維芽細胞の周辺部の小胞およびNPC細胞の網状構造は、
細胞質膜にコレステロールを含む。
ては従来ほとんど報告がない。本実施例では半透過性細
胞を使用して、コレステロールが細胞内膜の細胞原形質
側に局在するのか内腔側に局在するのかを調べた。正常
およびNPC皮膚繊維芽細胞の原形質膜を細菌毒素ストレ
プトリジンOにより、選択的に透過化した。次に細胞をf
PEG-Cholとともにインキュベートした（図６Ａ及び
Ｂ）。fPEG-Chol染色は、固定し透過化した細胞で得ら
れた染色とは著しく異なっていた（図２Ａ及びＥ）。さ
らに、正常細胞とNPC細胞には大きな違いがあった。正
常な皮膚繊維芽細胞では、周辺部の小胞様構造が強く染
色されたが、NPC細胞では、網状様の構造が可視化され
た。この構造は、細胞を固定して透過化した後では見ら
れなかったことから、この区画は壊れやすいか、あるい
は界面活性剤により傷害を受けやすいことが示唆され
る。ゴルジ体および後期エンドソーム／リソソームは、
これらの条件下では、ほとんど標識されなかった。これ
らの結果から、コレステロールがこれらのオルガネラの
内腔にのみ存在することが示唆される。一方、正常な繊
維芽細胞の周辺部の小胞およびNPC細胞の網状構造は、
細胞質膜にコレステロールを含む。
【００４３】NPC細胞における遊離コレステロールの細
胞内蓄積の詳細なメカニズムは未解明である。最近の研
究によれば、膜区画間のコレステロールの活発な流れの
アンバランスが蓄積を引き起こすことを示している(Y.L
ange,他、J Biol Chem 275,17468-75.(2000))。生体内
で合成されたコレステロールおよびLDLを介して得られ
るコレステロールはともに原形質膜に到達後、続いて細
胞内取り込まれる。Cruzら(J.C.Cruz,他、J Biol Chem
275,4013-21.(2000))は、NPC1（即ち、それに突然変異
が生じることにより前記疾患の原因となる遺伝子により
コードされるタンパク質）が、原形質膜以後のコレステ
ロール転送経路に関与することを示唆した。フィリピン
は毒性があるため、細胞表面のコレステロールの挙動の
追跡のためには適当でない。蛍光コレステロール類似体
であるデヒドロエルゴステロールは、CHO細胞株におい
て、エンドサイトーシスを受けて再生区画に蓄積される
ことが示された(S.Mukherjee,他、Biophys J 75,1915-2
5.(1998)；及び、M.Hao 他、J Biol Chem 277,609-17.
(2002))。DHEは、３つ多い二重結合と追加のメチル基を
もつ点で、コレステロールとは異なる。近年、ペルフリ
ンゴリシンOがコレステロールリッチな膜ドメインに選
択的に結合することが判明した(A.A.Waheed 他、Proc N
atl Acad Sci USA 98,4926-31.(2001)；及び、W.Mobius
他、J Histochem Cytochem 50,43-55.(2002))。fPEG-C
holの利点としては、蛍光団の安定性および量子効率が
高いこと、バックグラウンド染色が低いこと、細胞毒性
が低いこと、並びにサイズが比較的小さいために実施濃
度での構造摂動が少ないことなどが挙げられる。
胞内蓄積の詳細なメカニズムは未解明である。最近の研
究によれば、膜区画間のコレステロールの活発な流れの
アンバランスが蓄積を引き起こすことを示している(Y.L
ange,他、J Biol Chem 275,17468-75.(2000))。生体内
で合成されたコレステロールおよびLDLを介して得られ
るコレステロールはともに原形質膜に到達後、続いて細
胞内取り込まれる。Cruzら(J.C.Cruz,他、J Biol Chem
275,4013-21.(2000))は、NPC1（即ち、それに突然変異
が生じることにより前記疾患の原因となる遺伝子により
コードされるタンパク質）が、原形質膜以後のコレステ
ロール転送経路に関与することを示唆した。フィリピン
は毒性があるため、細胞表面のコレステロールの挙動の
追跡のためには適当でない。蛍光コレステロール類似体
であるデヒドロエルゴステロールは、CHO細胞株におい
て、エンドサイトーシスを受けて再生区画に蓄積される
ことが示された(S.Mukherjee,他、Biophys J 75,1915-2
5.(1998)；及び、M.Hao 他、J Biol Chem 277,609-17.
(2002))。DHEは、３つ多い二重結合と追加のメチル基を
もつ点で、コレステロールとは異なる。近年、ペルフリ
ンゴリシンOがコレステロールリッチな膜ドメインに選
択的に結合することが判明した(A.A.Waheed 他、Proc N
atl Acad Sci USA 98,4926-31.(2001)；及び、W.Mobius
他、J Histochem Cytochem 50,43-55.(2002))。fPEG-C
holの利点としては、蛍光団の安定性および量子効率が
高いこと、バックグラウンド染色が低いこと、細胞毒性
が低いこと、並びにサイズが比較的小さいために実施濃
度での構造摂動が少ないことなどが挙げられる。
【００４４】正常な繊維芽細胞とNPC繊維芽細胞とを用
いて、細胞表面のfPEG-Cholの挙動を比較した（図７の
Ｃ〜Ｎ）。本実験では1μMのfPEG-Cholを使用した。こ
の濃度のfPEG-Cholは、この系においてはデキストラン
およびコレラトキシンのエンドサイトーシスに影響を及
ぼさない。細胞をfPEG-Cholとともに室温で5分間インキ
ュベートし、洗浄し、さらに1mg/mlローダミン・デキス
トランの存在下、37℃でインキュベートした。正常な繊
維芽細胞では、fPEG-Cholで5分間標識した後、細胞表面
が強く標識された。10分間の追跡後、蛍光の大部分は原
形質膜上に残っていた（図７のＣ及びＦ）。60分間の追
跡後、核は細胞質の蛍光発光した区画に囲まれた非標識
オルガネラとして認識された（図７のＤ）。これらの区
画の全体パターンは、CHO細胞においてDHE-MβCDにより
検出したものと同様であった(M.Hao他、J Biol Chem 27
7,609-17.(2002))。しかし、fPEG-Cholは細胞内の小胞
も染色した。これらの小胞の大部分は、細胞内に取り込
みされたローダミン・デキストランとは共局在しなかっ
た（図７のＧ）。これらの小胞は、図６Ａでの観察と同
様に、細胞の周辺部で観察される場合が多い。180分
後、ゴルジ体はfPEG-Cholで顕著に標識され、ローダミ
ン蛍光発光はエンドソーム／リソソーム中に分布してい
た（図７のＥ及びＨ）。NPC繊維芽細胞におけるfPEG-Ch
olの挙動は著しく異なっていた。10分の追跡後、fPEG-C
holは特徴的な網状構造を染色したが（図７のＩ及び
Ｌ）、これは正常細胞では全く観察されなかった。180
分の追跡後でも、大部分のfPEG-Cholはこの構造中に残
存し、ゴルジ蛍光発光はほとんど見られなかった（図７
のＪ及びＭ）。細胞内に取り込みされたローダミン・デ
キストランが網状構造に囲まれる場合もり（図７Ｍ、矢
印）、これらの構造がエンドサイトーシス性区画の特徴
をもつことが示唆される。これらの構造は、図６Ｂにお
いて観察されるものと非常に類似している。
いて、細胞表面のfPEG-Cholの挙動を比較した（図７の
Ｃ〜Ｎ）。本実験では1μMのfPEG-Cholを使用した。こ
の濃度のfPEG-Cholは、この系においてはデキストラン
およびコレラトキシンのエンドサイトーシスに影響を及
ぼさない。細胞をfPEG-Cholとともに室温で5分間インキ
ュベートし、洗浄し、さらに1mg/mlローダミン・デキス
トランの存在下、37℃でインキュベートした。正常な繊
維芽細胞では、fPEG-Cholで5分間標識した後、細胞表面
が強く標識された。10分間の追跡後、蛍光の大部分は原
形質膜上に残っていた（図７のＣ及びＦ）。60分間の追
跡後、核は細胞質の蛍光発光した区画に囲まれた非標識
オルガネラとして認識された（図７のＤ）。これらの区
画の全体パターンは、CHO細胞においてDHE-MβCDにより
検出したものと同様であった(M.Hao他、J Biol Chem 27
7,609-17.(2002))。しかし、fPEG-Cholは細胞内の小胞
も染色した。これらの小胞の大部分は、細胞内に取り込
みされたローダミン・デキストランとは共局在しなかっ
た（図７のＧ）。これらの小胞は、図６Ａでの観察と同
様に、細胞の周辺部で観察される場合が多い。180分
後、ゴルジ体はfPEG-Cholで顕著に標識され、ローダミ
ン蛍光発光はエンドソーム／リソソーム中に分布してい
た（図７のＥ及びＨ）。NPC繊維芽細胞におけるfPEG-Ch
olの挙動は著しく異なっていた。10分の追跡後、fPEG-C
holは特徴的な網状構造を染色したが（図７のＩ及び
Ｌ）、これは正常細胞では全く観察されなかった。180
分の追跡後でも、大部分のfPEG-Cholはこの構造中に残
存し、ゴルジ蛍光発光はほとんど見られなかった（図７
のＪ及びＭ）。細胞内に取り込みされたローダミン・デ
キストランが網状構造に囲まれる場合もり（図７Ｍ、矢
印）、これらの構造がエンドサイトーシス性区画の特徴
をもつことが示唆される。これらの構造は、図６Ｂにお
いて観察されるものと非常に類似している。
【００４５】網状構造へのfPEG-Cholの組み込みは、温
度に依存する。4℃では、fPEG-Cholは原形質膜上にとど
まり、網状体に組み込まれなかった（図８Ｐ）。図８Ｐ
はまた、fPEG-Cholが自然発生的には二分子層横断移動
を起こさないことを示す。自然発生的にフリップフロッ
プを起こす蛍光団は、これらの条件下において細胞内膜
を染色する(R.E.Pagano,他、J Cell Biol 91,872-7.(19
81)；及び、R.E.Pagano,他、J Biol Chem 260,1909-16.
(1985))。次に、阻害剤の存在下におけるfPEG-Cholおよ
びローダミン・デキストランのインターナリゼーション
を計測した。Brefeldin A（ゴルジ後輸送およびノコダ
ゾールの阻害剤。微小管集合を阻害する）は、fPEG-Cho
lの網状体への組み込みにほぼ影響を及ぼさなかった。
対照的に、網状構造はサイトカラシンB（これはアクチ
ン重合を阻害する）により消失した。サイトカラシンB
は、ローダミン・デキストランのインターナリゼーショ
ンに影響を及ぼさなかった。図８Ｔにおいては、サイト
カラシンBによる処理の前に、fPEG-Cholにより細胞を標
識した。この場合もやはり、網状構造は消失し、このこ
とから網状構造がアクチン網に依存することが示唆され
る。
度に依存する。4℃では、fPEG-Cholは原形質膜上にとど
まり、網状体に組み込まれなかった（図８Ｐ）。図８Ｐ
はまた、fPEG-Cholが自然発生的には二分子層横断移動
を起こさないことを示す。自然発生的にフリップフロッ
プを起こす蛍光団は、これらの条件下において細胞内膜
を染色する(R.E.Pagano,他、J Cell Biol 91,872-7.(19
81)；及び、R.E.Pagano,他、J Biol Chem 260,1909-16.
(1985))。次に、阻害剤の存在下におけるfPEG-Cholおよ
びローダミン・デキストランのインターナリゼーション
を計測した。Brefeldin A（ゴルジ後輸送およびノコダ
ゾールの阻害剤。微小管集合を阻害する）は、fPEG-Cho
lの網状体への組み込みにほぼ影響を及ぼさなかった。
対照的に、網状構造はサイトカラシンB（これはアクチ
ン重合を阻害する）により消失した。サイトカラシンB
は、ローダミン・デキストランのインターナリゼーショ
ンに影響を及ぼさなかった。図８Ｔにおいては、サイト
カラシンBによる処理の前に、fPEG-Cholにより細胞を標
識した。この場合もやはり、網状構造は消失し、このこ
とから網状構造がアクチン網に依存することが示唆され
る。
【００４６】
【発明の効果】上記した実施例の結果から、fPEG-Chol
はコレステロールリッチなドメインを可視化するための
有利な手段であることが実証された。即ち、本発明によ
れば、蛍光団の安定性および量子効率が高く、バックグ
ラウンド染色が低く、細胞毒性が低く、さらにサイズが
比較的小さいために実施濃度での構造摂動が少ないとい
った利点を有する新規なコレステロール検出試薬が提供
されることになった。
はコレステロールリッチなドメインを可視化するための
有利な手段であることが実証された。即ち、本発明によ
れば、蛍光団の安定性および量子効率が高く、バックグ
ラウンド染色が低く、細胞毒性が低く、さらにサイズが
比較的小さいために実施濃度での構造摂動が少ないとい
った利点を有する新規なコレステロール検出試薬が提供
されることになった。
【図１】図１は、PEG-Cholを用いたin vitroでの結合実
験の結果を示す。
験の結果を示す。
【図２】図２は、細胞を用いたPEG-Cholによる標識実験
の結果を示す。バーは20μmを示す。
の結果を示す。バーは20μmを示す。
【図３】図３は、fPEG-Cholの細胞表面の分布を調べた
結果を示す。
結果を示す。
【図４】図４は、fPEG-Cholの細胞表面の分布を調べた
結果を示す。
結果を示す。
【図５】図５は、fPEG-Cholの細胞表面の分布を調べた
結果を示す。
結果を示す。
【図６】図６は、コレステロールの膜内分布及び細胞表
面での挙動を分析した結果を示す。
面での挙動を分析した結果を示す。
【図７】図７は、コレステロールの膜内分布及び細胞表
面での挙動を分析した結果を示す。
面での挙動を分析した結果を示す。
【図８】図８は、コレステロールの膜内分布及び細胞表
面での挙動を分析した結果を示す。
面での挙動を分析した結果を示す。
フロントページの続き
(72)発明者 濱島 好男
京都府京都市西京区桂坤町26−20
Ｆターム(参考） 2G045 DA69 FB07 FB12
Claims (4)
- 【請求項１】 標識されていてもよいポリエチレングリ
コールコレステリルエーテルを含む、コレステロール検
出試薬。 - 【請求項２】 ポリエチレングリコールコレステリルエ
ーテルが親和性物質又は蛍光物質で標識されている、請
求項１に記載のコレステロール検出試薬。 - 【請求項３】 標識されていてもよいポリエチレングリ
コールコレステリルエーテルを用いることを特徴とす
る、コレステロールの検出方法。 - 【請求項４】 親和性物質又は蛍光物質で標識されてい
るポリエチレングリコールコレステリルエーテルを用い
る、請求項３に記載のコレステロールの検出方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002160277A JP3838941B2 (ja) | 2002-05-31 | 2002-05-31 | コレステロール検出試薬 |
| US10/516,072 US20060110781A1 (en) | 2002-05-31 | 2003-05-30 | Cholesterol detection reagent |
| PCT/JP2003/006841 WO2003102596A1 (fr) | 2002-05-31 | 2003-05-30 | Reactif de detection de cholesterol |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002160277A JP3838941B2 (ja) | 2002-05-31 | 2002-05-31 | コレステロール検出試薬 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003344419A true JP2003344419A (ja) | 2003-12-03 |
| JP3838941B2 JP3838941B2 (ja) | 2006-10-25 |
Family
ID=29706539
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|---|---|---|---|
| JP2002160277A Expired - Fee Related JP3838941B2 (ja) | 2002-05-31 | 2002-05-31 | コレステロール検出試薬 |
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|---|---|
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| JP (1) | JP3838941B2 (ja) |
| WO (1) | WO2003102596A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2006093252A1 (ja) * | 2005-03-04 | 2006-09-08 | The University Of Tokyo | 膜アンカー型蛍光プローブ |
| JP2008523377A (ja) * | 2004-12-11 | 2008-07-03 | ザ サイエンス アンド テクノロジー ファシリティーズ カウンシル | 蛍光測定を用いて脂質プロファイルを作成するための分析 |
| JP2009047578A (ja) * | 2007-08-21 | 2009-03-05 | Gunma Univ | 抗ｄｎｐ抗体を用いたコレステロール結合剤 |
| WO2016148125A1 (ja) * | 2015-03-16 | 2016-09-22 | 国立大学法人大阪大学 | 新規蛍光標識スフィンゴミエリン及びその利用 |
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|---|---|---|---|---|
| PE20071221A1 (es) | 2006-04-11 | 2007-12-14 | Arena Pharm Inc | Agonistas del receptor gpr119 en metodos para aumentar la masa osea y para tratar la osteoporosis y otras afecciones caracterizadas por masa osea baja, y la terapia combinada relacionada a estos agonistas |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2600065B2 (ja) * | 1994-03-08 | 1997-04-16 | 協和メデックス株式会社 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 |
| US6005113A (en) * | 1996-05-15 | 1999-12-21 | Molecular Probes, Inc. | Long wavelength dyes for infrared tracing |
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2002
- 2002-05-31 JP JP2002160277A patent/JP3838941B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-05-30 US US10/516,072 patent/US20060110781A1/en not_active Abandoned
- 2003-05-30 WO PCT/JP2003/006841 patent/WO2003102596A1/ja active Application Filing
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008523377A (ja) * | 2004-12-11 | 2008-07-03 | ザ サイエンス アンド テクノロジー ファシリティーズ カウンシル | 蛍光測定を用いて脂質プロファイルを作成するための分析 |
| WO2006093252A1 (ja) * | 2005-03-04 | 2006-09-08 | The University Of Tokyo | 膜アンカー型蛍光プローブ |
| JP2009047578A (ja) * | 2007-08-21 | 2009-03-05 | Gunma Univ | 抗ｄｎｐ抗体を用いたコレステロール結合剤 |
| WO2016148125A1 (ja) * | 2015-03-16 | 2016-09-22 | 国立大学法人大阪大学 | 新規蛍光標識スフィンゴミエリン及びその利用 |
| JPWO2016148125A1 (ja) * | 2015-03-16 | 2017-07-13 | 国立大学法人大阪大学 | 新規蛍光標識スフィンゴミエリン及びその利用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2003102596A1 (fr) | 2003-12-11 |
| JP3838941B2 (ja) | 2006-10-25 |
| US20060110781A1 (en) | 2006-05-25 |
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