WO2010064443A1 - 活性窒素測定用試薬 - Google Patents

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nitric oxide
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長野哲雄
浦野泰照
和泉沙希
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国立大学法人 東京大学
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    • Y10T436/179228—Both nitrogen oxide and dioxide

Definitions

  • the present invention relates to a compound capable of measuring active nitrogen species such as nitric oxide and peroxynitrite existing in cells with high sensitivity over a long period of time, and a measurement reagent containing the compound.
  • Nitric oxide is a short-lived unstable radical species and has been shown to have an important function as a biologically active substance in vivo (Special Issue of the Hyundai Chemistry, April 1994).
  • Method for measuring nitric oxide, NO 2 is oxidative degradation product of nitric oxide - or NO 3 - and indirect method of measuring, it is roughly classified into methods of measuring the nitrogen monoxide directly.
  • direct methods are attracting attention from the viewpoint of detecting and quantifying nitric oxide under physiological conditions, at present, no specific and highly sensitive detection method applicable to in vitro systems has been developed.
  • chemiluminescence using luminescence generated when ozone oxidation of NO radicals (Palmer, RM, et al., Nature, 327, pp.524-526, 1987), oxyhemoglobin (O 2 Hb) is oxidized
  • the absorption spectrum of metHb produced (Kelm, M., et al., Circ. Res. 66, pp.1561-1575, 1990), the current flowing when the electrode is inserted into the tissue and oxidized Methods for quantification (Shibuki, K., Neurosci. Res. 9, pp. 69-76, 1990; Malinski, T., Nature, 356, pp.
  • This method of measuring nitric oxide using 2,3-diaminonaphthalene has a detection limit of about several tens of nM and is characterized by 50 to 100 times higher sensitivity than the grease reaction method (Misko, TP , Anal. Biochem. 214, pp. 11-16, 1993). In addition, this method is very excellent in that it does not require any special equipment or technology and can be easily carried out (for the above, as a review, DOJIN News, No. 74, Information . NO measuring reagents: 2, 3-Diaminonaphthalene, published by Dojin Chemical Laboratory, 1995).
  • the present inventor conducted research to provide a means for directly and highly sensitively measuring nitric oxide under physiological conditions, and as a result, dissolved oxygen and oxide compounds (for example, PTIO and its derivative carboxy PTIO). It was found that nitric oxide efficiently reacts with 2,3-diaminonaphthalene or a derivative thereof under neutral conditions in the presence of an oxygen source to give a fluorescent naphthalenetriazole or a derivative thereof. Further, the present inventors have found that a measurement method of nitric oxide using this reaction is extremely excellent in detection sensitivity, and a trace amount of nitric oxide can be accurately quantified (see Japanese Patent Application No. 7-189978).
  • 2,3-diaminonaphthalene itself has a simple chemical structure.
  • it is not suitable as a basic skeleton to which various chemical modifications are made so that the reagent is localized inside the cell. there were.
  • the present inventor has proposed a method using a diaminofluorescein derivative as a method for quantifying nitric oxide which has solved these problems (US Pat. No. 5,874,590).
  • a diaminofluorescein derivative as a method for quantifying nitric oxide which has solved these problems (US Pat. No. 5,874,590).
  • this derivative it is possible to measure nitric oxide with long-wavelength excitation light that does not damage living tissue or cells, and the nitric oxide present inside the cells is measured for each individual cell. It can be measured accurately.
  • this diaminofluorescein derivative is not always satisfactory from the viewpoint of intracellular retention, and leakage from the cell is quick, making it difficult to measure nitric oxide over a long period of time.
  • An object of the present invention is to provide a reagent for measuring active nitrogen species such as nitric oxide and peroxynitrite existing in cells with high sensitivity over a long period of time.
  • R 1 and R 2 each represent an amino group substituted at an adjacent position on the benzene ring, wherein either one represents a mono C 1-6 alkyl-substituted amino group or an unsubstituted amino group, and the other represents R 3 and R 4 each independently represent a halogen atom;
  • R 5 and R 6 each independently represent a hydrogen atom, an acyl group, or an acyloxy C 1-6 alkyl group;
  • R 7 and R 8 is independently-(CH 2 ) p -N (R 9 ) (R 10 ) (wherein p represents an integer of 1 to 4, R 9 and R 10 are each independently-(CH 2 ) (wherein, n 1 to 4 show an integer of) n -COOH compound represented by indicating represented showing a group) in]
  • a salt thereof or an ester.
  • R 1 and R 2 are each an unsubstituted amino group substituted at an adjacent position on the benzene ring
  • R 3 and R 4 are chlorine atoms
  • R 5 and R 6 are Provided is the above compound, a salt thereof, or an ester thereof, each independently a hydrogen atom or an acetoxymethyl group, wherein R 7 and R 8 are groups represented by —CH 2 —N (CH 2 —COOH) 2.
  • the present invention provides a reagent for measuring active nitrogen species, preferably nitric oxide, containing the compound represented by the above general formula (I), a salt thereof, or an ester thereof.
  • R 17 and R 18 are each independently - (CH 2) s -N ( R 19) (R 20) ( wherein, s is an integer of 1 to 4, R 19 and R 20 are each independently -(CH 2 ) t -COOH (wherein t represents an integer of 1 to 4)), a salt thereof, or an ester thereof.
  • a method for measuring active nitrogen species preferably nitric oxide, (1) reacting the compound represented by the above general formula (I), a salt thereof, or an ester thereof with an active nitrogen species, preferably nitric oxide; (2) Provided is a method comprising a step of detecting the compound represented by the above general formula (II), a salt thereof, or an ester thereof produced in the step (1).
  • FIG. 6 is a graph showing the change in the average value of the fluorescence intensity from 0 to 2000 sec (before adding NOC7) in FIG. 5 as a ratio.
  • R 1 and R 2 each represent an amino group substituted at an adjacent position on the benzene ring, and either one represents a mono C 1-6 alkyl-substituted amino group or an unsubstituted amino group. The other represents an unsubstituted amino group.
  • C 1-6 alkyl group constituting the mono C 1-6 alkyl-substituted amino group may be linear or branched, specifically, for example, a methyl group, an ethyl group, n- propyl group, an isopropyl group N-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group and the like can be used.
  • both R 1 and R 2 are unsubstituted amino groups.
  • R 3 and R 4 each independently represent a halogen atom.
  • a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom can be used, and a fluorine atom or a chlorine atom is preferable. It is particularly preferred that R 3 and R 4 are both chlorine atoms.
  • R 5 and R 6 each independently represent a hydrogen atom, an acyl group, or an acyloxy C 1-6 alkyl group.
  • the acyl group include arylcarbonyl groups such as benzoyl group, paramethoxybenzoyl group, parachlorobenzoyl group, or naphthylcarbonyl group; or C 1-6 alkylcarbonyl groups such as acetyl group, propionyl group, and butanoyl group. Can be used.
  • the acyl moiety of the acyloxy C 1-6 alkyl group the above acyl groups can be used.
  • acyloxy C 1-6 alkyl group for example, an acetoxy C 1-6 alkyl group is preferable, and an acetoxymethyl group is more preferable.
  • R 5 and R 6 are independently a hydrogen atom or an acyloxy C 1-6 alkyl group, or R 5 and R 6 are both hydrogen atom, or together if methoxymethyl group is particularly preferred.
  • R 7 and R 8 may be the same or different and each independently represents — (CH 2 ) p —N (R 9 ) (R 10 ).
  • p represents an integer of 1 to 4
  • R 9 and R 10 each independently represent — (CH 2 ) n —COOH
  • n represents an integer of 1 to 4. If R 7 and R 8 are different, p and / or n may be different integers.
  • R 7 and R 8 are the same, and p is an integer of 1 to 3, more preferably 1 or 2, particularly preferably 1.
  • n is preferably an integer of 1 to 3, more preferably 1 or 2, and particularly preferably 1.
  • the case where R 7 and R 8 are both —CH 2 —N (CH 2 —COOH) 2 is particularly preferred.
  • R 1 and R 2 are each an unsubstituted amino group substituted at an adjacent position on the benzene ring, R 3 and R 4 are chlorine atoms, R 5 And R 6 are each independently a hydrogen atom or an acetoxymethyl group, and compounds in which R 7 and R 8 are groups represented by —CH 2 —N (CH 2 —COOH) 2 are preferred, and R 1 and R 2 Are each an unsubstituted amino group substituted at an adjacent position on the benzene ring, R 3 and R 4 are chlorine atoms, R 5 and R 6 are each independently hydrogen atoms, and R 7 and R 8 are A compound that is a group represented by —CH 2 —N (CH 2 —COOH) 2 is particularly preferred.
  • R 13 and R 14 respectively correspond to R 3 and R 4 in the above general formula (I)
  • R 15 and R 16 are respectively in the above general formula (I). It corresponds to R 5 and R 6
  • R 17 and R 18 correspond to R 7 and R 8 in the above general formula (I), respectively.
  • Specific examples and preferred ranges for each group are the same as those described in the above general formula (I).
  • the compounds represented by the above general formulas (I) and (II) may exist as salts.
  • the salt include base addition salts, acid addition salts, amino acid salts and the like.
  • the base addition salt include metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, ammonium salt, or organic amine salts such as triethylamine salt, piperidine salt, morpholine salt, and acid addition salt.
  • examples thereof include mineral acid salts such as hydrochloride, sulfate, and nitrate, and organic acid salts such as methanesulfonate, paratoluenesulfonate, citrate, and oxalate.
  • amino acid salts include glycine salts.
  • the salt of the compound of the present invention is not limited to these. Among these, physiologically acceptable water-soluble salts can be suitably used for the reagent and measurement method of the present invention.
  • esters of the compounds represented by the general formulas (I) and (II) physiologically acceptable esters are preferable.
  • suitable ester residues include, for example, methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, butyl group, isobutyl group, t-butyl group, benzyl group, acetoxymethyl group, 1- (acetoxy) ethyl group , Propionyloxymethyl group, 1- (propionyloxy) ethyl group, butyryloxymethyl group, 1- (butyryloxy) ethyl group, isobutyryloxymethyl group, 1- (isobutyryloxy) ethyl group, valeryloxy Methyl group, 1- (valeryloxy) ethyl group, isovaleryloxymethyl group, 1- (isovaleryloxy) ethyl group, pivaloyloxymethyl group, 1- (pivaloyloxy) ethyl group,
  • ester it is preferable that four carboxyl groups of R 7 and R 8 form an ester, and these esters are more preferably the same ester.
  • the carboxyl group of the carboxyphenyl group in the fluorescein skeleton may form an ester.
  • the compounds represented by the general formulas (I) and (II) in free form, salts thereof, or esters thereof may exist as hydrates or solvates, and these substances are all of the present invention. Included in the range.
  • solvents such as ethanol, acetone, isopropanol, can be illustrated.
  • the compounds represented by the general formulas (I) and (II) may have one or two or more asymmetric carbons depending on the type of substituent, and may be a stereoisomer such as an optical isomer or a diastereoisomer. Isomers may exist. Pure forms of stereoisomers, any mixture of stereoisomers, racemates, and the like are all within the scope of the present invention. Optically active substances based on lactone formation are also included in the scope of the present invention.
  • a fluorescein derivative also exists as a compound [9- (o-carboxyphenyl) -6-hydroxy-3H-xanthen-3- one] in a form that does not form a lactone ring.
  • the compounds represented by the general formulas (I) and (II) of the present invention can also exist in a form in which the lactone ring is cleaved to form a 2-carboxyphenyl group, and the lactone ring is cleaved.
  • Those skilled in the art will readily understand that is a tautomer of the compounds represented by the above general formulas (I) and (II) having a lactone ring.
  • the compound represented by the above general formula (I) is, for example, a group corresponding to R 7 and R 8 using a fluorescein derivative having an amino group and a nitro group adjacent to each other on a benzene ring as a raw material compound (these are It can be easily produced by introducing a nitro group (which may be protected) and then reducing the nitro group.
  • the above nitro compound can be produced, for example, by the method described in US Pat. No. 5,874,590. Since the production method of a representative compound of the compound represented by the general formula (I) of the present invention is specifically shown in the examples of the present specification, those skilled in the art will be based on the specific description of the examples.
  • the compound of the present invention can be easily produced by appropriately selecting starting materials and reaction reagents, and appropriately changing or modifying the reaction conditions and steps as necessary.
  • the compound represented by the general formula (II) can be easily produced, for example, by reacting the compound represented by the general formula (I) with nitric oxide.
  • the target product can be efficiently produced by carrying out the reaction while protecting specific functional groups as necessary in the reaction process.
  • Synthesis Protective Groups, Organic, Synthesis, TWGreene, John, Wiley, Sons, Inc, 1981, etc., and those skilled in the art can select an appropriate protecting group.
  • isolation and purification of the product in the production method can be performed by appropriately combining methods used in ordinary organic synthesis, for example, filtration, extraction, washing, drying, concentration, crystallization, various chromatography and the like.
  • the production intermediate in the above step can be subjected to the next reaction without particular purification.
  • the salt of the compound of the present invention when the salt of each compound is obtained in the above production method, it may be purified as it is.
  • the free form compound is obtained, the free form compound is obtained. Is dissolved or suspended in a suitable solvent, a base is added to form a salt, and purification may be performed as necessary.
  • the compound represented by the general formula (I) has a property of efficiently reacting with an active nitrogen species (RNS) to produce the compound of the general formula (II) with a high yield.
  • the compound represented by the general formula (I) itself hardly emits fluorescence when irradiated with excitation light of about 500 nm under neutral conditions, but the compound of the above formula (II) is extremely under the same conditions. It has the property of emitting strong fluorescence (emission: 520 nm). Therefore, the compound represented by the general formula (I) is taken into living tissues or cells and reacted with the active nitrogen species to produce a fluorescent compound represented by the general formula (II). By measuring the fluorescence of the active nitrogen species in living tissues or cells can be measured.
  • the active nitrogen species include nitric oxide and peroxynitrite, and nitric oxide is a preferable measurement target.
  • the term “measurement” should be interpreted in the broadest sense including measurement for various purposes such as detection, quantification, and qualitative.
  • the above reaction can be preferably carried out under neutral conditions, for example, in the range of pH 6.0 to 8.0, preferably in the range of pH 6.5 to 7.8 ⁇ , more preferably in the range of pH 6.8 to 7.6.
  • the measurement of nitric oxide using the compound of the present invention is not limited to the neutral region or the weakly acidic region.
  • the compounds represented by the general formulas (I) and (II) of the present invention are easily taken up into cells and can stay in the cells for a long time without leaking from the cells. Has an excellent property that can be detected over a long period of time.
  • the compound represented by the general formula (II) of the present invention has a property of emitting very strong fluorescence, and is extremely excellent in intracellular retention, so that it exists in cells for a long time. There is a feature that a trace amount of active nitrogen species can be measured with high sensitivity.
  • the ester of the compound represented by the general formula (I) is highly lipophilic, has a property of being easily incorporated into cells by easily adding a fat-soluble cell membrane, and is hydrolyzed in cells after incorporation. It can be decomposed to produce the corresponding carboxyl group compound.
  • the compound represented by the above formula (I) or a salt thereof may be used as it is, but if necessary, an additive usually used for the preparation of the reagent is blended. It may be used as a composition.
  • additives such as solubilizers, pH adjusters, buffers, and isotonic agents can be used as additives for using the reagent in a physiological environment, and the amount of these additives is appropriately selected by those skilled in the art. Is possible.
  • These compositions are provided as a composition in an appropriate form such as a mixture in a powder form, a lyophilized product, a granule, a tablet, or a liquid.
  • Example 1 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, the scope of the present invention is not limited to the following Example.
  • Example 1 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, the scope of the present invention is not limited to the following Example.
  • Example 1 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, the scope of the present invention is not limited to the following Example.
  • Compound 5 (51.2 mg) was dissolved in acetonitrile, diisopropylethylamine (DIEA, 352.5 mg) and bromomethyl acetate (421.2 mg) were added, and the mixture was stirred under an argon atmosphere for 48 hours. After neutralizing with acetic acid, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by HPCL to obtain Compound 6 (15.4 mg) as a pale yellow powder.
  • Compound 6 (15 mg) was dissolved in 3 ml of a mixed solvent of dichloromethane: methanol (1: 1), 220 mg of 10% Pd-C was added, and catalytic reduction was performed in a hydrogen atmosphere.
  • Example 3 The reactivity of DCl-DA Cal with reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) was examined.
  • the fluorescence spectrum after adding reactive oxygen species and reactive nitrogen species to DCl-DA Cal is shown in FIG.
  • DCl-DA Cal increased the fluorescence in a concentration-dependent manner when active nitrogen species such as peroxynitrite and nitric oxide were added ((a) and (b) in the figure). There was no significant increase in fluorescence when the seed was added. From this result, it was shown that DCl-DA Cal is a fluorescent probe capable of specifically detecting active nitrogen species.
  • Example 4 Nitric oxide was added from outside the cell using HeLa cells, and intracellular nitric oxide was measured.
  • DCI-DA Cal-AM having excellent cell membrane permeability was used as the compound of the present invention. After this compound is taken up into cells, the ester is hydrolyzed to give DCl-DA Cal, and this DCl-DA Cal reacts with nitric oxide to give the above triazole compound.
  • DAF2-DA Korean Organic Chemical Vapentasulfate
  • HeLa cells were loaded with DAF2-DA or DCl-DA-Cal-AM (10 ⁇ M; 0.1% DMSO as a co-solvent) for 30 minutes.
  • the medium containing the compound was removed, and fresh medium (DMEM) was added to the dish and set under a microscope.
  • NOC-13 was added to a final concentration of 100 ⁇ M and photographed every 5 minutes. The result is shown in figure 2.
  • DAF2-DA was used, background fluorescence increased due to leakage of compounds from the cell, but when DCl-DA Cal-AM was added, background fluorescence did not increase. .
  • HeLa cells were loaded with DAF2-DA or DCl-DA-Cal-AM (10 ⁇ M; 0.1% DMSO as co-solvent) for 30 minutes.
  • the medium containing the compound was removed, and NOC 13 (final concentration: 100 ⁇ M) was added and allowed to stand for 20 minutes.
  • the medium containing NOC ⁇ ⁇ ⁇ 13 was removed, and the change in fluorescence intensity was measured by FACS.
  • the results are shown in FIG. From these results, it was shown that the above-mentioned triazole compound produced in the cells by adding DCl-DA Cal-AM has a high intracellular retention.
  • Example 5 We tried to visualize the minute amount of NO actually produced by cells.
  • Bovine aortic endothelial cells (BAEC) cells are known to produce NO upon stimulation with bradykinin. Using these cells, nitric oxide was imaged with DCl-DA Cal-AM and a conventional fluorescent probe, DAF2-DA.
  • BAEC cells were loaded with DAF2-DA or DCl-DA-Cal-AM (10 ⁇ M; 0.1% DMSO as a co-solvent) for 60 minutes. The medium containing the compound was removed and post-incubation was performed for 30 minutes. The observation was started under a microscope by replacing with fresh medium (HBSS) (0 sec). At 200 ⁇ sec, bradykinin (final concentration 0.1 ⁇ M) was added and the fluorescence change was observed (200 to 2000 ⁇ sec). In order to confirm the presence of deesterified compounds in the cells, NOC was added at 2000 sec (final concentration 100 ⁇ M), and nitric oxide was artificially generated to observe changes in fluorescence (2000-2300). sec).
  • DCl-DA Cal-AM and DAF2-DA are sufficiently taken up into cells, and nitric oxide is generated in very small amounts in living cells such as BAEC cells.
  • DCl-DA Cal-AM and DAF2-DA which are only a part of the incorporated DCl-DA and DAF2-DA, indicate that they are involved in the detection reaction and can be imaged without leaking out of the cell for a long time.
  • -DA -Cal-AM and its deesterified form are very useful for long-term measurement of intracellular nitric oxide.
  • FIG. 6 is a graph showing the change in the average value of the fluorescence intensity as a ratio from 0 to 2000 ⁇ sec (before adding NOC7).
  • DCl-DAlCal-AM it was confirmed that the fluorescence intensity continued to increase with time, whereas in DAF2-DA, the fluorescence intensity decreased after about 600 ⁇ ⁇ sec.
  • the compound of the present invention is useful as a reagent for measuring active nitrogen species such as nitric oxide and peroxynitrite existing in cells with high sensitivity over a long period of time.

Abstract

　細胞内に存在する一酸化窒素やパーオキシナイトライトのような活性窒素種を長時間にわたり高感度に測定するために有用な一般式(I)で表される化合物〔R1及びR2はベンゼン環上の隣接した位置に置換するアミノ基；R3及びR4はハロゲン原子；R5及びR6は水素原子、アシル基、又はアシルオキシC1-6アルキル基；R7及びR8は-(CH2)p-N(R9)(R10)(pは1～4、R9及びR10は-(CH2)n-COOH（nは1～4）で表される基）〕。

Description

活性窒素測定用試薬
　本発明は細胞内に存在する一酸化窒素やパーオキシナイトライトのような活性窒素種を長時間にわたり高感度に測定することができる化合物及び該化合物を含む測定用試薬に関する。
　一酸化窒素(NO)は短寿命の不安定ラジカル種であり、生体内生理活性物質として重要な機能を有していることが明らかにされてきた（現代化学, 1994年 4月号特集）。一酸化窒素の測定方法は、一酸化窒素の酸化分解物であるNO2 -やNO3 -を測定する間接的な方法と、一酸化窒素を直接測定する方法に大別される。一酸化窒素を生理的条件下で検出・定量するという観点からは直接法が注目されているものの、現時点ではイン・ビトロ系に適用できる特異的かつ高感度な検出方法は開発されていない。
　例えば、NO ラジカルをオゾン酸化したときに発生する発光を利用する化学発光法(Palmer, R.M., et al., Nature, 327, pp.524-526, 1987) 、オキシヘモグロビン(O2Hb)が酸化されて生じるmetHb の吸収スペクトルを測定する方法 (Kelm, M., et al., Circ. Res. 66, pp.1561-1575, 1990)、電極を組織に差し込んで酸化されるときに流れる電流で定量する方法(Shibuki, K., Neurosci. Res. 9, pp.69-76, 1990; Malinski, T., Nature, 356, pp.676-678, 1992)、及びグリース反応法(Green, L.C., et al., Anal. Biochem., 126, pp.131-138, 1992)などが代表的な方法として知られている（総説として、戸田 昇編集「最新医学からのアプローチ12, ＮＯ」，pp.42-52, 3.NOの測定法, 長野哲雄著, メジカルビュー社発行；Archer, S., FASEB J., 7, pp.349-360, 1993）。
　グリース反応法は、一酸化窒素ラジカルが酸化されて生じるNO2 -によるジアゾニウム塩化合物とナフチルエチレンジアミンのアゾカップリングを利用して検出する方法である。この方法は、一酸化窒素ラジカルを直接測定するものではないが、特別な装置や技術を必要としないという利点を有している。またカドミウム(Stainton, M.P., Anal. Chem., 46, p.1616, 1974; Green, L.C., et al., Anal. Biochem., 126, pp.131-138, 1982) やヒドラジン(Sawicki, C.R. and Scaringelli, F.P., Microchem. J., 16, pp.657-672, 1971)でNO3 -をNO2 -に還元して測定できることから、一酸化窒素関連代謝物を定量できるという特徴もある。
　グリース反応法と同様にNO2 -を検出することにより一酸化窒素を測定するための試薬として2,3-ジアミノナフタレン(2,3-diaminonaphthalene)が知られている。この試薬は、酸性条件下で NO2 - と反応して蛍光性付加体であるナフタレントリアゾール（化学名: 1-[H]-naphtho[2,3-d]triazole) を形成する(Wiersma, J.H., Anal. Lett., 3, pp.123-132, 1970) 。2,3-ジアミノナフタレンと NO2 - の反応条件については詳細に検討されており、反応は pH=2 以下で最も速く進行し、室温下では約５分程度で完了する(Wiersma, J.H., Anal. Lett., 3, pp.123-132, 1970; Sawicki, C.R., Anal. Lett., 4, pp.761-775, 1971)。また、生成した付加体は pH=10以上で最も効率よく蛍光を発する(Damiani, P. and Burini,G., Talanta, 8, pp.649-652, 1986)。
　この2,3-ジアミノナフタレンを用いる一酸化窒素の測定方法は、検出限界が数十nM程度であり、グリース反応法に比べて50～100 倍も高感度であるという特徴がある(Misko, T.P., Anal. Biochem. 214, pp.11-16, 1993) 。また、この方法は特別な装置や技術を必要とせず、簡便に行えるという点でも非常に優れた方法である（以上について、総説として DOJIN News, No. 74, Information .NOの測定試薬：2,3-Diaminonaphthalene, 株式会社同仁化学研究所発行、1995) 。しかしながら、一酸化窒素自体ではなくその酸化物である NO2 - を反応種としていることから、一酸化窒素を直接測定する方法に比べて間接的な方法であり、また、2,3-ジアミノナフタレンと NO2 - の反応を強酸性下(pH=2 以下）で行うために、一酸化窒素を生理的条件下で検出・定量する方法としては採用できないという問題があった。
　本発明者は、生理的条件下で一酸化窒素を直接的かつ高感度に測定する手段を提供すべく研究を進めた結果、溶存酸素やオキシド化合物（例えばPTIOやその誘導体であるカルボキシPTIOなど）の酸素源の存在下では、2,3-ジアミノナフタレン又はその誘導体に対して中性条件下においても一酸化窒素が効率よく反応し、蛍光性のナフタレントリアゾール又はその誘導体を与えることを見出した。また、この反応を応用した一酸化窒素の測定方法が極めて検出感度に優れており、微量の一酸化窒素を正確に定量できることを見出した（特願平7-189978号明細書参照）。
　しかしながら、2,3-ジアミノナフタレンを用いる上記の方法では、蛍光の検出において 370～390 nm程度の低波長の励起光を照射する必要があり、測定系内の細胞や組織がダメージを受ける可能性があった。また、細胞自身の強い自家蛍光が測定に影響を与えることがあり、通常の蛍光顕微鏡に備えられている蛍光フィルターでは蛍光測定時に励起光を十分にカットできないという問題もあった。さらに、2,3-ジアミノナフタレンから生成する蛍光性のトリアゾール化合物は蛍光強度が必ずしも十分ではないことから、汎用の蛍光顕微鏡では個々の細胞内の蛍光を正確に測定することが困難であった。一方、2,3-ジアミノナフタレン自体は単純な化学構造を有しており、例えば、試薬が細胞内部に局在化するように種々の化学的修飾を加える基本骨格としては好適ではないという問題もあった。
　本発明者は、これらの問題を解決した一酸化窒素の定量方法として、ジアミノフルオレセイン誘導体を用いる方法を提案した（米国特許第5,874,590号）。この誘導体を用いると、生体組織や細胞に対してダメージを与えないような長波長の励起光により一酸化窒素を測定することができ、細胞の内部に存在する一酸化窒素を個々の細胞ごとに正確に測定することができる。もっとも、このジアミノフルオレセイン誘導体は細胞内滞留性の観点からは必ずしも満足すべきものではなく、細胞内からの漏出が早く、長時間にわたって一酸化窒素を測定することが困難であった。
米国特許第5,874,590号明細書
　本発明の課題は、細胞内に存在する一酸化窒素やパーオキシナイトライトのような活性窒素種を長時間にわたり高感度に測定するための試薬を提供することにある。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ジアミノフルオレセイン誘導体のキサンテン骨格に2個のカルボキシアルキル基で置換されたアミノを有するアルキル基を2個導入した化合物が極めて優れた細胞内滞留性を有しており、かつ活性窒素種に対して高い反応性を保持していることを見出した。また、この化合物を一酸化窒素測定用試薬として用いることにより、個々の細胞内に存在する活性窒素種を長時間にわたり正確かつ簡便に測定できることを見いだした。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
　すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 〔式中、R1及びR2はそれぞれベンゼン環上の隣接した位置に置換するアミノ基を示し、ただしいずれか一方はモノC1-6アルキル置換アミノ基又は無置換アミノ基を示し、他方は無置換アミノ基を示し；R3及びR4はそれぞれ独立にハロゲン原子を示し；R5及びR6はそれぞれ独立に水素原子、アシル基、又はアシルオキシC1-6アルキル基を示し；R7及びR8はそれぞれ独立に-(CH2)p-N(R9)(R10)(式中、pは1ないし4の整数を示し、R9及びR10はそれぞれ独立に-(CH2)n-COOH（式中、nは1ないし4の整数を示す）で表される基を示す）を示す〕で表される化合物、その塩、又はそのエステルを提供するものである。
　上記発明の好ましい態様によれば、R1及びR2がそれぞれベンゼン環上の隣接した位置に置換する無置換アミノ基であり、R3及びR4が塩素原子であり、R5及びR6がそれぞれ独立に水素原子又はアセトキシメチル基であり、R7及びR8が-CH2-N(CH2-COOH)2で表される基である上記の化合物、その塩、又はそのエステルが提供される。
　別の観点からは、上記の一般式(I)で表される化合物、その塩、又はそのエステルを含む活性窒素種、好ましくは一酸化窒素の測定用試薬が本発明により提供される。
　さらに別の観点からは、下記の一般式(II)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 〔式中、R11 及びR12 は互いに結合してベンゼン環上の隣接した位置に環を形成する-N=N-N(R19)- (式中、R19 は水素原子又はC1-6アルキル基を示す)で表される基を示し；R13及びR14はそれぞれ独立にハロゲン原子を示し；R15及びR16はそれぞれ独立に水素原子、アシル基、又はアシルオキシC1-6アルキル基を示し；R17及びR18はそれぞれ独立に-(CH2)s-N(R19)(R20)(式中、sは1ないし4の整数を示し、R19及びR20はそれぞれ独立に-(CH2)t-COOH（式中、tは1ないし4の整数を示す）で表される基を示す）を示す〕で表される化合物、その塩、又はそのエステルが提供される。
　また、本発明により、活性窒素種、好ましくは一酸化窒素の測定方法であって、
(1) 上記一般式(I)で表される化合物、その塩、又はそのエステルを活性窒素種、好ましくは一酸化窒素と反応させる工程；及び
(2) 上記工程(1) において生成する上記一般式(II)で表される化合物、その塩、又はそのエステルを検出する工程
を含む方法が提供される。
DAl-DA Calと活性酸素種又は活性窒素種との反応を示した図である。(a)一酸化窒素；(b)パーオキシナイトライト；(c)ヒドロキシラジカル；(d)次亜塩素酸；(e)スーパーオキサイド；(f)一重項酸素；(g)過酸化水素の結果を示す。 一酸化窒素添加後のDAF2-DA又はDCl-DA Cal-AMによるイメージングの結果を示した図である。 一酸化窒素添加後のDAF2-DA又はDCl-DA Cal-AMの細胞内からの漏出の様子を示した図である。 一酸化窒素添加後のDAF2-DA又はDCl-DA Cal-AMの細胞内からの漏出の様子をFACSにより測定した結果を示した図である。 BAEC細胞にDAF2-DA又はDCl-DA Cal-AMを添加して一酸化窒素のイメージングを行った結果を示した図である。 図5における0～2000 sec (NOC7を加える前まで)における蛍光強度の平均値の変化を比率で示した図である。
　上記一般式(I) において、R1及びR2はそれぞれベンゼン環上の隣接した位置に置換するアミノ基を示すが、いずれか一方はモノC1-6アルキル置換アミノ基又は無置換アミノ基を示し、他方は無置換アミノ基を示す。モノC1-6アルキル置換アミノ基を構成するC1-6アルキル基は直鎖又は分枝鎖のいずれでもよく、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、tert- ブチル基などを用いることができる。本明細書において言及する他のC1-6アルキル基又はC1-6アルキル部分を含む置換基のC1-6アルキル部分についても同様である。R1及びR2の両者が無置換アミノ基であることが好ましい。R1及びR2の置換位置としては、ラクトン環を構成するカルボニル基のオルト位及びメタ位が好ましい。
　R3及びR4はそれぞれ独立にハロゲン原子を示す。ハロゲン原子としてはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を用いることができるが、フッ素原子又は塩素原子が好ましい。R3及びR4が共に塩素原子であることが特に好ましい。
　R5及びR6はそれぞれ独立に水素原子、アシル基、又はアシルオキシC1-6アルキル基を示す。アシル基としては、例えば、ベンゾイル基、パラメトキシベンゾイル基、パラクロロベンゾイル基、若しくはナフチルカルボニル基などのアリールカルボニル基；又はアセチル基、プロピオニル基、ブタノイル基などのC1-6アルキルカルボニル基などを用いることができる。アシルオキシC1-6アルキル基のアシル部分としては上記のアシル基を用いることができる。アシルオキシC1-6アルキル基としては、例えば、アセトキシC1-6アルキル基などが好ましく、より好ましくはアセトキシメチル基などを用いることができる。R5及びR6が独立に水素原子又はアシルオキシC1-6アルキル基であることが好ましく、R5及びR6が共に水素原子であるか、又は共にメトキシメチル基である場合が特に好ましい。
　R7及びR8は同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立に-(CH2)p-N(R9)(R10)を示す。pは1ないし4の整数を示し、R9及びR10はそれぞれ独立に-(CH2)n-COOHを示し、nは1ないし4の整数を示す。R7及びR8が異なる場合には、p及び／又はnは異なる整数の場合がある。好ましくはR7及びR8は同一であり、pは1ないし3の整数、より好ましくは1又は2、特に好ましくは1である。R9及びR10において、好ましくはnは1ないし3の整数、より好ましくは1又は2、特に好ましくは1である。R7及びR8が共に-CH2-N(CH2-COOH)2である場合が特に好ましい。
　上記一般式(I)で表される化合物において、R1及びR2がそれぞれベンゼン環上の隣接した位置に置換する無置換アミノ基であり、R3及びR4が塩素原子であり、R5及びR6がそれぞれ独立に水素原子又はアセトキシメチル基であり、R7及びR8が-CH2-N(CH2-COOH)2で表される基である化合物が好ましく、R1及びR2がそれぞれベンゼン環上の隣接した位置に置換する無置換アミノ基であり、R3及びR4が塩素原子であり、R5及びR6がそれぞれ独立に水素原子であり、R7及びR8が-CH2-N(CH2-COOH)2で表される基である化合物が特に好ましい。
　上記の一般式(II)において、R11 及びR12 は互いに結合してベンゼン環上の隣接した位置に環を形成する-N=N-N(R19)-基を示し、R19 は水素原子又はC1-6アルキル基を示す。
　上記の一般式(II)において、R13及びR14はそれぞれ上記の一般式(I)におけるR3及びR4に対応しており、R15及びR16はそれぞれ上記の一般式(I)におけるR5及びR6に対応しており、R17及びR18はそれぞれ上記の一般式(I)におけるR7及びR8に対応している。それぞれの基についての具体例及び好ましい範囲は上記の一般式(I)において説明されているものと同様である。
　上記一般式(I)及び(II)で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。これらのうち、生理学的に許容される水溶性の塩は、本発明の試薬及び測定方法に好適に使用できる。
　上記一般式(I)及び(II)で表される化合物のエステルとしては生理学的に許容されるエステルが好ましい。好適なエステル残基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、t-ブチル基、ベンジル基、アセトキシメチル基、1-(アセトキシ)エチル基、プロピオニルオキシメチル基、1-(プロピオニルオキシ)エチル基、ブチリルオキシメチル基、1-(ブチリルオキシ)エチル基、イソブチリルオキシメチル基、1-(イソブチリルオキシ)エチル基、バレリルオキシメチル基、1-(バレリルオキシ)エチル基、イソバレリルオキシメチル基、1-(イソバレリルオキシ)エチル基、ピバロイルオキシメチル基、1-(ピバロイルオキシ)エチル基、メトキシカルボニルオキシメチル基、1-(メトキシカルボニルオキシ)エチル基、エトキシカルボニルオキシメチル基、1-(エトキシカルボニルオキシ)エチル基、プロポキシカルボニルオキシメチル基、1-(プロポキシカルボニルオキシ)エチル基、イソプロポキシカルボニルオキシメチル基、1-(イソプロポキシカルボニルオキシ)エチル基、ブトキシカルボニルオキシメチル基、1-(ブトキシカルボニルオキシ)エチル基、イソブトキシカルボニルオキシメチル基、1-(イソブトキシカルボニルオキシ)エチル基、t-ブトキシカルボニルオキシメチル基、1-(t-ブトキシカルボニルオキシ)エチル基、シクロペンタンカルボニルオキシメチル基、1-(シクロペンタンカルボニルオキシ)エチル基、シクロヘキサンカルボニルオキシメチル基、1-(シクロヘキサンカルボニルオキシ)エチル基、シクロペンチルオキシカルボニルオキシメチル基、1-(シクロペンチルオキシカルボニルオキシ)エチル基、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシメチル基、1-(シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ)エチル基、ベンゾイルオキシメチル基、1-(ベンゾイルオキシ)エチル基、フェノキシカルボニルオキシメチル基、1-(フェノキシカルボニルオキシ)エチル基、(5-メチル-2-オキソ-1，3-ジオキソレン-4-イル)メチル基、又は2-トリメチルシリルエチル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。エステルとしては、R7及びR8の4個のカルボキシル基がエステルを形成することが好ましく、これらのエステルは同一のエステルであることがさらに好ましい。場合によりフルオレセイン骨格におけるカルボキシフェニル基のカルボキシル基がエステルを形成していてもよい。
　遊離形態の一般式(I)及び(II)で表される化合物、その塩、又はそのエステルは、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
　一般式(I)及び(II)で表される化合物は、置換基の種類に応じて1個または2個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。ラクトン形成に基づく光学活性体も本発明の範囲に包含される。
　フルオレセイン誘導体は、ラクトン環を形成していない形態の化合物[9-(o-カルボキシフェニル)-6-ヒドロキシ-3H-キサンテン-3- オン] としても存在することが知られている。本発明の一般式(I)及び(II)で表される化合物についても、ラクトン環が開裂して2-カルボキシフェニル基を形成した形態で存在することが可能であり、ラクトン環が開裂した化合物がラクトン環を有する上記一般式(I)及び(II)で表される化合物の互変異性体であることは当業者に容易に理解されることである。従って、ラクトン環が開裂した化合物も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。なお、上記一般式(I)及び一般式(II)においては、便宜上、ラクトン環を形成した化合物のみが記載されており、本明細書に記載された合成スキームにおいては、便宜上、いずれか一方の互変異性体のみが記載されている場合がある。
　上記の一般式(I)で表される化合物は、例えば、ベンゼン環上に隣接するアミノ基及びニトロ基を有するフルオレセイン誘導体を原料化合物として用いて、R7及びR8に相当する基（これらは保護されていてもよい）を導入した後、ニトロ基を還元することにより容易に製造することができる。上記のニトロ化合物は、例えば、米国特許第5,874,590号明細書に記載された方法により製造可能である。本発明の一般式(I)で表される化合物の代表的化合物の製造方法が本明細書の実施例に具体的に示されているので、当業者は実施例の具体的説明を基にして、出発原料及び反応試薬を適宜選択し、必要に応じて反応条件や工程を適宜変更ないし修飾することにより、本発明の化合物を容易に製造することが可能である。一般式(II)で表される化合物は、例えば、一般式(I)で表される化合物に一酸化窒素を反応させることにより容易に製造することができる。
　反応工程において特定の官能基を必要に応じて保護して反応を行うことにより、目的物を効率的に製造することができる場合があるが、保護基については、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス (Protective Groups in Organic Synthesis, T.W.Greene, John Wiley & Sons, Inc., 1981)などに詳しく説明されており、当業者は適宜の保護基を選択することが可能である。
　また、製造法における生成物の単離、精製は通常の有機合成で用いられる方法、例えば濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ行うことができる。また、上記工程における製造中間体は、特に精製することなく次の反応に供することも可能である。本発明の化合物の塩を製造する場合には、上記製造法においてそれぞれの化合物の塩が得られる場合はそのまま精製すればよればよく、遊離形態の化合物が得られる場合には、遊離形態の化合物を適当な溶媒に溶解又は懸濁した後、塩基を加えて塩を形成させ、必要に応じて精製を行えばよい。
　上記一般式(I)で表される化合物は、活性窒素種(RNS)と効率的に反応して収率よく一般式(II)の化合物を生成する性質を有している。一般式(I)で表される化合物自体は、中性条件下において500 nm程度の励起光を照射した場合にはほとんど蛍光を発しないが、上記式(II)の化合物は同じ条件下において極めて強い蛍光 (emission: 520 nm) を発する性質を有している。従って、一般式(I)で表される化合物を生体組織中や細胞内に取り込ませて活性窒素種と反応させ、蛍光性の上記一般式(II)で表される化合物を生成させてこの化合物の蛍光を測定することにより、生体組織中や細胞内の活性窒素種を測定することができる。
　活性窒素種としては、例えば、一酸化窒素及びパーオキシナイトライトなどを挙げることができるが、一酸化窒素が好ましい測定対象である。本明細書において「測定」という用語は、検出、定量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈されるべきである。上記反応は好ましくは中性条件下に行うことができ、例えば、pH 6.0～8.0 の範囲、好ましくはpH 6.5～7.8 の範囲、より好ましくはpH 6.8～7.6 の範囲で行うことができる。もっとも、本発明の化合物を用いた一酸化窒素の測定は中性領域ないし弱酸性領域に限定されることはない。
　本発明の一般式(I)及び(II)で表される化合物は、細胞内に容易に取り込まれ、かつ細胞から漏出せずに長時間にわたり細胞内に滞留できることから、細胞内の活性窒素種を長時間にわたり検出することができるという優れた性質を有している。特に、本発明の一般式(II)で表される化合物は非常に強い蛍光を発する性質を有しており、かつ細胞内滞留性が極めて優れていることから、長時間にわたって細胞内に存在する微量の活性窒素種を高感度に測定できるという特徴がある。一般式(I)で表される化合物のエステルは脂溶性が高く、脂溶性の細胞膜を容易に追加して細胞内に効率的に取り込まれる性質を有しており、かつ取り込み後に細胞内で加水分解を受けて対応のカルボキシル基の化合物を生成することができる。
　本発明の活性窒素測定用試薬としては、上記式(I)で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　3-アミノ-4-ニトロフルオレセイン（化合物1、29 mg) とジエチルイミノジアセテート(37 mg)及びパラホルムアルデヒド(40.7 mg)をアセトニトリル(3.5 ml)と水(1.5 ml) の混合溶液に懸濁して24時間加熱還流した。室温まで放冷後に溶媒を減圧留去して化合物2を得た。
　化合物2をジクロルメタン:メタノール(9:1)の混合溶媒10 mlに溶解して10% Pd-Cを36 mg加えて水素雰囲気下で5分間攪拌した。触媒を濾去した後に溶媒を減圧留去して化合物3を得た。
　化合物3を1N 水酸化カリウム/メタノール溶液に溶解して35℃で3時間攪拌した。2N 希塩酸で反応液を中和した後、溶媒を減圧留去し、残渣をHPLCにより精製して黄色粉末状の化合物4（DCl-DA Cal）を得た(22.8 mg、3工程で収率50%）。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ 3.78 (s, 8H), 4.52 (s, 4H), 6.23 (d, 1H, J=7.32), 6.73 (s, 2H), 7.09 (d, 1H, J=8.07)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 42.3, 49.5, 55.3, 83.0, 110.4, 110.5, 112.2, 113.4, 116.2, 118.5, 119.1, 129.9, 150.3, 156.4, 161.8, 162.1, 171.6, 172.3
HRMS (ESI+)  m/z Calcd for [M+H]+ 721.09517, Found, 721.09928 (4.12 mmu)
例２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　化合物1(100 mg)、ジエチルイミノジアセテート(130 mg)、及びパラホルムアルデヒド(56.6 mg)をアセトニトリル(3.5 ml)と水(1.5 ml) の混合溶液に懸濁して24時間加熱還流した。室温まで放冷後に溶媒を減圧留去した。残渣を1N 水酸化カリウム/メタノール溶液に溶解し、35℃で3時間攪拌した。2N 希塩酸で反応液を中和した後に溶媒を減圧留去した。残渣をHPLCにより精製して黄色粉末状の化合物5を得た(131.2 mg、2工程で収率81%）。
　化合物5(51.2 mg)をアセトニトリルに溶解しジイソプロピルエチルアミン(DIEA、352.5 mg)及びブロモメチルアセテート(421.2 mg) を加えてアルゴン雰囲気下で48時間攪拌した。酢酸で中和した後に溶媒を減圧留去し、残渣をHPCLにより精製して淡黄色粉末状の化合物6(15.4 mg)を得た。
　化合物6(15 mg)をジクロルメタン:メタノール(1:1)の混合溶媒3 mlに溶解し10% Pd-Cを220 mg加えて水素雰囲気下で接触還元を行った。反応終了後に触媒を濾去して溶媒を減圧留去した。残渣をHPCLにより精製して淡黄色粉末状の化合物7（DCI-DA Cal-AM、4.9 mg、収率33.4%) を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ　2.08 (s, 12H), 2.17 (s, 6H), 3.75 (s, 8H), 4.34 (m, 4H), 6.70 (s, 8H), 5.78(s, 4H), 6.49 (d, 2H, J=8.07), 6.94 (s,2H) 8.50 (d, 1H, J=8.79)
HRMS (ESI+) m/z Calcd for [M+Na]+ 1205.17807, Found, 1205.17779 (-0.28 mmu)
例３
　DCl-DA Calについて活性酸素種（ROS）及び活性窒素種(RNS)との反応性の検討を行った。DCl-DA Calに活性酸素種及び活性窒素種を添加した後の蛍光スペクトルを図1に示す。DCl-DA Calはパーオキシナイトライト及び一酸化窒素などの活性窒素種を添加した場合には濃度依存的に大きな蛍光上昇を与えたが（図中、(a)及び(b)）、活性酸素種を加えた場合には顕著な蛍光上昇を与えなかった。この結果から、DCl-DA Calは活性窒素種を特異的に検出可能な蛍光プローブであることが示された。
　DCl-DA Calはほぼ無蛍光性（Φf=0.013）の物質であり、活性窒素種と特異的に反応してトリアゾール化合物を与えるが、このトリアゾール化合物は生理的pHにおいて非常に大きな蛍光強度を与え(Φf=0.63)、かつ生理的条件下で安定である。また、このトリアゾール化合物は細胞内滞留性に極めて優れている。従って、DCl-DA Calを用いることにより、従来の活性窒素測定用蛍光プローブでは達成できなかった長時間にわたる細胞内活性窒素種の観察が可能になる。
　活性窒素種を添加した場合に生成する蛍光物質がトリアゾール化合物(DCl-triazole calcein)であることを1H-NMR及びHRMSにより確認した。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD)  δ 3.76 (s, 8H), 4.53 (s, 4H), 6.78 (s, 2H), 7.19 (d, 1H, J=8.79), 8.31 (d, 1H, J=8.79)
HRMS (ESI+) Calcd for [M-H]- 730.05912, Found, 730.05731 (-1.80 mmu)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
例４
　HeLa細胞に用いて細胞外から一酸化窒素を添加し、細胞内の一酸化窒素を測定した。本発明の化合物として細胞膜透過性に優れるDCI-DA Cal-AMを用いた。この化合物は細胞内に取り込まれた後にエステルが加水分解されてDCl-DA Calを与え、このDCl-DA Calが一酸化窒素と反応して上記のトリアゾール化合物を与える。比較化合物として従来の一酸化窒素測定用試薬であるDAF2-DA（Kojima H. et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 3170-3175）を用いた。
　HeLa細胞にDAF2-DA又はDCl-DA Cal-AM(10μM; 共溶媒として0.1% DMSO)を30分間ロードした。化合物を含む培地を除き、フレッシュな培地(DMEM)をディッシュに加えて顕微鏡下にセットした。NOC 13を最終濃度100μMになるように添加して5分ごとに撮影した。結果を図2に示す。DAF2-DAを用いた場合には細胞内からの化合物の漏出によるバックグランドの蛍光上昇が認められたが、DCl-DA Cal-AMを添加した場合にはバックグラウンドの蛍光上昇は認められなかった。
　一酸化窒素と反応して細胞内において生成するトリアゾール化合物の細胞外漏出の様子を観察した。漏出が膜損傷によるものではないことを確かめるためにcalcein-AM（1μM; 共溶媒として0.1% DMSO）を用いた。HeLa細胞にDAF2-DA又はDCl-DA Cal-AM(10μM; 共溶媒として0.1% DMSO)を30分間ロードした。化合物を含む培地を除き、NOC 13 (最終濃度：100μM) を加えて10分置いた後に2回洗浄した。60分ごとに撮影して蛍光強度を測定した。結果を図3に示す。DCl-DA Cal-AMを添加した場合にはDAF2-DAを添加した場合に比べて明らかに蛍光性物質の細胞外漏出が少なかった。
　次に、FACSを用いて蛍光体の漏出の比較を行った。HeLa細胞にDAF2-DA又はDCl-DA Cal-AM(10μM; 共溶媒として0.1% DMSO)を30分間ロードした。化合物を含む培地を除き、NOC 13 (最終濃度：100μM) を加えて20分静置した。NOC 13を含む培地を除き、FACSにより蛍光強度の変化を測定した。結果を図4に示す。これらの結果から、DCl-DA Cal-AMの添加により細胞内で生成する上記のトリアゾール化合物が高い細胞内滞留性を有することが示された。
例５
　実際に細胞が産生する微量なNOの可視化を試みた。ウシ大動脈内皮細胞(Bovine aortic endothelial cells: BAEC)細胞はブラジキニン刺激によりNOを産生することが知られている。この細胞を用いてDCl-DA Cal-AM及び従来の蛍光プローブであるDAF2-DAにより一酸化窒素のイメージングを行った。
　BAEC細胞にDAF2-DA又はDCl-DA Cal-AM(10μM; 共溶媒として0.1% DMSO)を60分間ロードした。化合物を含む培地を除き、30分間ポストインキュベートを行った。フレッシュな培地(HBSS)に置き換えて顕微鏡下で観察を開始した(0 sec)。200 secの時点でブラジキニン(最終濃度0.1μM)を加えて蛍光変化を観察した(200～2000 sec)。細胞内に脱エステル化合物が存在していることを確認するため2000 secの時点でNOC 7 (最終濃度100μM)を加え、人工的に一酸化窒素を発生させて蛍光変化を観察した(2000～2300 sec)。
　結果を図5に示す。DCl-DA Cal-AM及びDAF2-DAの両者でBAEC細胞の産生する一酸化窒素を可視化することができたが、DAF2-DAを用いた場合にはかろうじて蛍光の上昇が可視化できている程度であった。一方、DCl-DA Cal-AMを用いた場合には明らかな蛍光強度上昇が認められた(特に2000 secにおける結果を参照）。この結果は、DAF2-DAの脱エステル体から生成するトリアゾール化合物(蛍光性化合物)が細胞内から速やかに漏出していくのに対し、DCl-DA Cal-AMの脱エステル体から生成するトリアゾール化合物(蛍光性化合物)が長期にわたって細胞内に留まることを示している。NOC 7を加えて人工的に一酸化窒素を発生させた場合においてはいずれの場合にも蛍光強度の上昇が観察された（2300 secの結果を参照）。
　この結果は、DCl-DA Cal-AM及びDAF2-DAがいずれも細胞内に十分取り込まれていること、及びBAEC細胞など生細胞においては一酸化窒素が極めて微量ずつ発生しており、細胞内に取り込まれたごく一部のDCl-DA Cal-AM及びDAF2-DAのみが検出反応に関与していることを示すものであり、長時間にわたって細胞外に漏出されずにイメージングを行うことができるDCl-DA Cal-AM及びその脱エステル体が長時間にわたる細胞内一酸化窒素の測定に極めて有用であることを示している。
　図6は0～2000 sec (NOC7を加える前まで)における蛍光強度の平均値の変化を比率で示した図である。DCl-DA Cal-AMでは蛍光強度が時間経過とともに上昇し続けていくのに対して、DAF2-DAでは600 secを過ぎたあたりから蛍光強度が減弱していくことが確認された。
　本発明の化合物は、細胞内に存在する一酸化窒素やパーオキシナイトライトのような活性窒素種を長時間にわたり高感度に測定するための試薬として有用である。

Claims (6)

  1. 下記の一般式(I)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     〔式中、R1及びR2はそれぞれベンゼン環上の隣接した位置に置換するアミノ基を示し、ただしいずれか一方はモノC1-6アルキル置換アミノ基又は無置換アミノ基を示し、他方は無置換アミノ基を示し；R3及びR4はそれぞれ独立にハロゲン原子を示し；R5及びR6はそれぞれ独立に水素原子、アシル基、又はアシルオキシC1-6アルキル基を示し；R7及びR8はそれぞれ独立に-(CH2)p-N(R9)(R10)(式中、pは1ないし4の整数を示し、R9及びR10はそれぞれ独立に-(CH2)n-COOH（式中、nは1ないし4の整数を示す）で表される基を示す）を示す〕で表される化合物、その塩、又はそのエステル。
  2. R1及びR2がそれぞれベンゼン環上の隣接した位置に置換する無置換アミノ基であり、R3及びR4が塩素原子であり、R5及びR6がそれぞれ独立に水素原子又はアセトキシメチル基であり、R7及びR8が-CH2-N(CH2-COOH)2で表される基である請求項１に記載の化合物、その塩、又はそのエステル。
  3. 請求項１又は２に記載の化合物、その塩、又はそのエステルを含む活性窒素種測定用試薬。
  4. 活性窒素種が一酸化窒素である請求項３に記載の試薬。
  5. 下記の一般式(II)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     〔式中、R11 及びR12 は互いに結合してベンゼン環上の隣接した位置に環を形成する-N=N-N(R19)- (式中、R19 は水素原子又はC1-6アルキル基を示す)で表される基を示し；R13及びR14はそれぞれ独立にハロゲン原子を示し；R15及びR16はそれぞれ独立に水素原子、アシル基、又はアシルオキシC1-6アルキル基を示し；R17及びR18はそれぞれ独立に-(CH2)s-N(R19)(R20)(式中、sは1ないし4の整数を示し、R19及びR20はそれぞれ独立に-(CH2)t-COOH（式中、tは1ないし4の整数を示す）で表される基を示す）を示す〕で表される化合物、その塩、又はそのエステル。
  6. 活性窒素種の測定方法であって、
    (1) 請求項１に記載の一般式(I)で表される化合物、その塩、又はそのエステルを活性窒素種と反応させる工程；及び
    (2) 上記工程(1) において生成する請求項５に記載の一般式(II)で表される化合物、その塩、又はそのエステルを検出する工程
    を含む方法。
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