DE2827657C2 - Amino- oder Guanidino-phenylpropionsäureesterderivate, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

-NH₂ oder —

NH

NH,

COOH

NOj

OD

60

worin R¹ die vorstehend genannten Bedeutungen besitzt, mit einem Phenolderivat oder einem Naphtholderivat der allgemeinen Formel III:

R^J-OH

65 worin R² die vorgenannten Bedeutungen besitzt, verestert, wobei man ein Nitroziratsäureesterderivat der allgemeinen Formel IV erhält:

COOR^J

R¹

OV)

NO,

10

15

worin R¹ und R² die vorstehenden Bedeutungen besitzen, und

anschließend das Produkt der allgemeinen Formel IV in Gegenwart eines Reduktionskatalysators reduziert, wobei man ein Aminophenyl-' propionesterderivat der allgemeinen Formel V erhält:

steht, R¹ Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, R² eine unsubstituierte Phenylgruppe ode eine durch eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine Carboxyalkylgruppe, deren Alkylgruppe 1 bis 4 C-Atome aufweist, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine Alkoxycarbonylgruppe, deren Alkoxygruppe 1 bis 4 C-Atome aufweist oder eine durch Halogen substituierte Phcnylgruppe oder eine unsubstituierte oder durch Halogen substituierte Naphthylgruppe bedeutet, sowie deren pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze.

2. p-Methylphenyl-yHp-aminophenyl)-propionat, sowie dessen Hydrochlorid.

3. p-Chlorphenyl-e-methyl-j8-(m-aminophenyl)-propionat, sowie dessen Hydrochlorid.

4. Phenyl-./Hp-aminophenyl)-propionat, sowie dessen Hydrochlorid.

5. Naphthyl-a-äthyl-j3-(m-aminophenyl)-propionat, sowie dessen Hydrochlorid.

6. Phenyl-fl-äthyl:/Hp-guanidinophenyI)-propionat, sowie dessen Carbonat, Methansulfonat oder Tosylat

7. p-Äthoxycarbonylphenyl-a-äthyl-yHp-guanidinophenyO-propionat, sowie dessen Hydrochlorid.

8. l-Naphthyl-fl-methyl-jff<p-guanidinophenyl)-propionat, sowie dessen Carbonat

9. p-Äthoxycarbonylphenyl-./Hp-guanidinophenyl)-propionat, sowie dessen Hydrochlorid.

10. Phenyl-a-propyl-./Hm-guanidinophenyl)-propionat, sowie dessen Carbonat.

11. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

a) ein Nitrozimtsäurederivat der allgemeinen Formel U COOR²

NHj

R¹

(V)

worin R¹ und R² die vorstehenden Bedeutungen besitzen, und, gewünschtenfalls, die Verbindung der allgemeincn'Formel V zur Herstellung eines Guanidinophenylpropionsäureesterderivats mit Cyanamid umsetzt und gewünschtenfalls die Reaktionsprodukte in ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz überführt.

12. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem üblichen Träger enthält

(HI)

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen näher bezeichneten neuen Amino- oder Guanidino-phenylpropionsäureesterderivate, ein Verfahren zu deren Herstellung und ein Arzneimittel, das diese Verbindungen enthält

Bekannt ist, daß Guanidino-capronsäurederivate, beispielsweise das Älhyl-p-(6-guanidinohexanoyloxy)-benzoat-Methansulfonat (Naohiro Kayama & Hiroko Yoshimura, Gendai Iryo, 6, 1010-1016 [1974]), sowie Benzamidinderivate, beispielsweise die 4-Amidinophenylbrenztraubensäure (P. Walsmann, ?. Markwardt, P. Richter, J. Stürzebecher, G. Wagner & H. Landmanr, Pharmazie 29, H. 5, 333-336 [1974]), und dergleichen, eine inhibitorische Wirkung auf proteolytische Enzyme besitzen. Jedoch ist die Enzym-inhibitorische Aktivität dieser Verbindungen nicht spezifisch, sondern unspezifisch insofern, als sie auf mehr als ein proteolytisches Enzym einwirken. Diese Verbindungen sind daher mit dem Nachteil behaftet, daß sie bei der Inhibierung eines eine Erkrankung verursachenden, speziellen Enzyms auch zur Inhibierung anderer Enzyme fuhren, die jedoch für eine normale Funktion des Organismus von Bedeutung sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Amino- oder Guanidino-phenylpropionsäureesterderivate bereit zu stellen, die auf ein spezifisches proteolytisches Enzym eine Enzym-inhibierende Wirkung aufweisen. Erfindungsgemäß soll auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen sowie ein Arzneimit-

te), das diese Verbindungen enthält, geschaffen werden.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die Schaffung der

neuen Amino- oder Guanidino-pbsnylpropionsäureesterderivate der nachstehenden allgemeinen Formel I;

COOR²

R
worin R für

R¹

(D

NH

-NH₂ oder —NH-/

NO₂

OD

R¹

R²-0H

(III)

R¹

(IV)

worin R¹ und R² die vorstehenden Bedeutungen besitzen, und

anschließend das Produkt der allgemeinen Formel IV in Gegenwart eines Reduktionskatalysators reduziert, wobei man ein Aminophenylpropipnesterderivat der allgemeinen Formel V erhält:

10

NH₂ ^IJ

steht, R¹ Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, R² eine unsubstituierte Phenylgruppe oder eine durch eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine Carboxyalkylgruppe, deren Alkylgruppe 1 bis 4 C-Atome »ufweist, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine Alkoxycarbonylgruppe, deren Alkoxygruppe 1 bis 4 C-Atome aufweist oder eine durch Halogen substituierte Phenylgruppe oder eine unsubstituierte oder eine durch Halogen substituierte Naphthylgruppe bedeutet, sowie deren pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze.

Die durch die Formel I dargestellten Amino- oder Guanidino-phenylpropionsäureesterderivate oder deren pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze werden erfindungsgemäß dadurch hergestellt, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

a) ein Nitrozimtsäurederivat der allgemeinen Formel II:

COOH

worin R¹ die vorstehend genannten Bedeutungen besitzt, mit einem Phenolderivat oder einem Napbtholderivat der allgemeinen Formel III:

worin R² die vorgenannten Bedeutungen besitzt, verestert, wobei man ein Nitrozimtsäureesterderivat der allgemeinen Formel IV erhält:

COOR²

55

COOR²

NHj

(V)

60

65 worin R¹ und R² die vorstehenden Bedeutungen besitzen, und, gewünschtenfalls, die Verbindung der allgemeinen Formel V zur Herstellung eines Guanidinophenylpropionsäureesterderivats mit Cyanamit umsetzt und gewünschtenfalls die Reaktionsprodukte in ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz überführt Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I besitzen gegenüber proteolytischen Enzymen, wie Trypsin, Thrombin, Cl-Esterase und dergleichen, eine spezifische, Enzym-inhibitorische Wirkung. Sie sind daher brauchbar zur Behandlung der durch Aktivierung eines bestimmten Enzyms hervorgerufenen Erkrankungen.

In der allgemeinen Formel I steht R¹ für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Zu Beispielen für die Alkylgruppe gehören Methyl, Äthyl, n-Propyl und η-Butyl, wobei Methyl, Äthyl und Propyl am bevorzugtesten sind.

In der Formel I steht R² fur eine unsubstituierte Phenylgruppe oder eine durch Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Carböxyalkyl, deren Alkylgnippe 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl, deren Alkoxygruppe 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist, oder Halogen substituierte Phenylgruppe oder eine unsubstituierte oder durch Halogen substituierte Naphthylgruppe. Zu Beispielen für die Alkylgruppe gehören Methyl, Äthyl, n-Propyl, η-Butyl, wobei Methyl und Äthyl besonders bevorzugt sind. Zu Beispielen für die Carboxyalkylgruppe gehören Carboxymethyl, Carboxyäthyl, Carboxypropyl und Carboxybutyl, wobei Carboxymethyl und Carboxyäthyl besonders bevorzugt sind. Zu Beispielen für die Alkoxygruppe gehören Methoxy, Äthoxy, n-Propoxy und n-Butoxy, wobei Methoxy und Äthoxy besonders bevorzugt sind. Zu Beispielen fur die AIkoxycarbonylgruppe gehören Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, n-Propoxycarbonyl und n-Butoxycarbonyl, wobei Methoxycarbonyl und Äthoxycarbonyl besonders bevorzugt sind. Zu Beispielen für das an die Phenyl- und Naphthylgruppen als Substituent gebundene Halogen gehören Chlor, Brom, Fluor und Jod, wobei Chlor am bevorzugtesten ist.

Zu spezifischen Beispielen der erfindungsgemäßen Vebindungen der allgemeinen Formel I gehören die folgenden Vertreter:

p-Methylphenyl-./K-aminopheny!)-propionat, p-Chlorphenyl-a-methyl-./Mp-aminophenyl)-propionat,

Phenyl-y?-(p-aminophenyl)-propionat, p-Methoxyphenyl-a-äthyl-^S-(m-aminophenyl)-

propionat,
p-Chlorphenyl-o-me!hyl-j3-(m-aminophenyl)-

propionat,
p-Chlorphenyl-a-methyl-./Hm-aminophenyl)-

propionat,
p-Chlorphenyl-a-äthylvS-(m-aminophenyl)-propionat,

l-Naphthyl-a-äthyl-./Hm-aminophenyI)-propionat, 4-ChlQr-l-naphthyl-a-methyl-^-(m-aminophenyl)-propionat,

o,o'-Dimethylphenyl-jiKp-aminophenyl)-propionat, p-Chlorphenyl-./?-(p-aminophenyl)-propionat, l-Naphthyl-./Mp-aminophenyl)-propionat, 2-Naphthyl-^-(p-aminophenyl)-propionat, p-Methylphenyl-a-methyl-./Kp-aminophenyl)-propionat,

l-Naphthyl-fl-roethyl-^-ip-aminophenyD-propionat, p-CWorphenyl-e-äthyl-^Kp-amJnopbenyl^propionat, l-Napbthyl-e-äthyl-j3-(p-aminopbenyl)-propionat, p-Carboxymethylpbenyl-fl-äthyl-j8-(p-amino-

phenyD-propionat, p-Carboxyäthylphenyl-a-äthyl-./Kp-aminophenyl)-propionat, l-Naphthyl-a-methyl-j?-{m-aminophenyl)-propionat, p-Methylphenyl-e-metbyl-j8-(m-aminophenyl)-

propioiüt, p-Methylphenyl-a-ätbyl-j3-(p-aminophenyl)-

propionat, p-sek.-Butylphenyl-fl-äthyl-j8-(p-aminophenyl)-

propionat, o-Methylphenyl-a-äthyl-j5-(p-aminophenyl)-propionat, o-Bromphenyl-a-äthyl^{p-aminophenyl)-propionat, Phenyl-j3-{ni-aniinophenyi)-propionat, p-Äthoxycarbonylphenyl-^S-(m-aniinophenyl)-prcpionat, Phenyl-a-methyl-^3-(m-aminophenyl)-propionat, Phenyi-fl-älhyi-jö-(m-aminophenyl)-propiönai, p-Äthoxycarbonylphenyl-a-äthyl-jHm-aminophenyl)-propionat, Phenyl-a-n-propyl-jS-(tn-aminophenyl)-propionat, p-Äthoxycarbonylphenyl-./Hp-aminophenynpropionat, p-Methoxyphenyl-./Kp-aminophenyl)-propionat, p-n-Butoxyphenyl-Xp-aminophenyl)-propionat, Phenyl-aTmethyl-j8-(p-aminophenyl)-propionat, Phenyl-a-äthyl-jS-(p-aminophenyl)-propionat, p-Äthoxycarbonylphenyl-e-äthyl-^S-(p-amino-

phenyl)-propiona^ p-Äthoxycarbonylphenyl-a-methyl-^-Cp-amino-

phenyl)-propionat, p-Methoxyphenyl-a-methyl-jß-(p-aminophenyl)-

propi<?nat, p-Methoxycarbonylphenyl->S-(p-aniinophenyl)-

propionat, p-n-Butoxycarbonylphenyl-a-äthyl-./Kp-amino-

phenyO-propionat, m-Methoxycarbonylphenyl-a-äthyl-jff-ip-ainino-

phenyl)-propionat, m-MethoxyphenyI-e-äthyl-j5-(p-aminophenyl)-

propionat, p-Methoxyphenyl-ii-äthyl-y?-(p-aminophenyl)-

propionat, p-Chlorphenyl-a-methyl-^-(m-guanidinophenyl)-

propionat, p-Methylphenyl-a-methyl-./?-(p-guanidinophenyl)-propional, Phenyl-a-methyl-y?-(ni-guani(linophenyl)-propionat, p-Äthoxycarbonylphenyl-^?-(p-guanidinophenyl)-propionat, p-Methylphenyl-y?-(m-guanidinophenyl)-propionat, p-Chlorphenyl-a-äthyl-^-(m-guanidinophenyl)-

propionat, l-Naphthyl-a-methyl-^-(m-guanidinophenyl)-

propionat, 4-Chlor-l-naphthyl-a-methyI-jS-(m-guanidino-

phenyl)-propionat, p-Chlorphenyl-a-methyl->?-(p-guanidinophenyl)-

propionat, p-Chlorphenyl-e-äthyl-yHp-guanidinophenyl)-

propionat, l-Naphthyl-e-nethyl-jS-(p-guanidinophenyl)-

propionat, 1-Naphthyl-a-äthyl-^p-guanidinophenyl)-

propionat,
p-Methylpbsnyl-a-ätbyl-Xp-guanidiTiophenyl)-

propionat,
p-CaiboxymethylpbenyJ-e-ätbyl-Xp-guanidino-

phenylj-propionat,
p-Carboxyäthylphenyl-a-äthyl-jS-ip-guanidino-

phenyl)-propionat,
l-Naphthyl-fl-äthyl-jS-(ni-guanidinophenyl)-

propionat,
p-sek.-Butylphenyl-a-äthyl-jS-(p-guanidinophenyl)-

propionat,
o-Methylphenyl-a-äthyI-j3-(p-guanidinophenyl)-

propionat,
o-Bromphenyl-a-äthyl-je-(p-guanidinophenyl)-propionat,

Phenyl-^8-(in-guanidinophenyl)-propionat, p-Äthoxycarbonylphenyl-^S-(in-guanidinophenyl)-propionat,

Phenyl-a-äthyl-j8-(ni-guanidinophenyl)-propionat, p-Äthoxycarbonylphenyl-a-äthyl-jS-ini-guanidino-

phenyl)-propionat,
p-MethoxypheRy!-a-äthyi-jS-(m-jruanidinophenyl)-

propionat,
Phenyl-a-n-propyl-Xm-guanidinophenyl)-propionat,

Ph?nyl-j8-(p-guanidinophenyl)-propionat, p-Methoxyphenyl-Xp-guanidinophenyl)-propionat, p-n-Butoxyphenyl-^p-guanidinophenyl)-propionat, Phenyl-a-methyl-j8-(p-guanidinophenyl)-propionai, Phenyl-o-äthyl-Xp-guanidinophenyl)-propionat, p-Äthoxycarbonylphenyl-a-äthyl-^-{p-guanidino-

phenyl)-propionat,
p-Äthoxycarbonylphenyl-a-methyl-^-(p-guanidino-

phenyl)-propionat,
p-Methoxyphenyl-a-methyl-^-(p-guanidinophenyl)-

propionat,
p-n-Butoxycarbonylphenyl-e-äthyl-^-(p-guanidino-

phenyl)-propionat,
m-Methoxycarbonylphenyl-a-äthyl-./Kp-guaiiidino-

phenyl)-propionat,
m-Methoxyphenyl-e-äthyl-^-(P-Buanidinophenyl)-

propionat und
p-Methoxyphenyl-a-äthyl-^-(p-guanidinophenyl)-propionat sowie die

Hydrochloride, Carbonate, Methansuliate und Tosylate dieser Ester.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren dadurch hergestellt werden, daß man ein Nitrozimtsäurederivat der allgemeinen Formel II und ein Phenolderivat oder ein Naphtholderivat der allgemeinen Formel III auf übliche Weise verestert, um ein Nitrozimtsäureesterderivat der allgemeinen Formel IV zu erhalten, anschließend das Esterderivat reduziert und gewünschtenfalls das Pro-' dukt mit Cyanamtf umsetzt, um ein Guanidino-phenylpropionsäureesterderivat zu erhalten. Die Veresterung kann durch eine übliche, bekannte Arbeitsweise durchgeführt werden, beispielsweise durch die DCC(Dicy clohexylcarbodii;iiid)-Methode, die DPPA(DiphenylphQsphory!azid)-Methode, die Methode mit einem gemischten Anhydrid oder die Methode mit einem Säurechlorid.
Unter diesen Arbeitsweisen ist die Säurechloridmethod? im Hinblick auf die Einfachheit der Arbeitsweise, die Wirtschafdichkeit und die Reinheit des Produkts am bevorzugtesten. Man kann die Säurechloridmethode vorteilhaft in Gegenwart eines Dehydrohalo-

genierungsmittels durchführen, beispielsweise in Gegenwart einer organischen Base. Hier kann man beispielsweise nennen Triethylamin, Tributylamin, Pyrydin oder dergleichen, oder eine anorganische Base, beispielsweise Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat oder dergleichen, da bei der Säurechloridmethode ein Halogenwasserstoff als Nebenprodukt gebildet wird. Diese Reaktion fuhrt man in einem Lösungsmittel durch. Zu bevorzugten Lösungsmitteln gehören Benzol, Äthylacetat, Diäthyläther, Tetrahydrofuran, Pyridin oder dergleichen, wobei im Hinblick auf die Reinheit des Produkts Äthylacelat am bevorzugtesten ist. Die Veresterung erfolgt relativ leicht über einen großen Temperaturbereich. Im allgemeinen ist die Reaktion innerhalb eines Zeitraums von 30 Minuten bis 1 Stunde bei einer Temperatur von 0 bis 30⁰C abgeschlossen.

Das erfindungsgemäß eingesetzte Nitrozimtsäurederivat der Formel II kann hergestellt werden, indem man Nitrobenzaldehyd mit einem Anhydrid oder die dem gewünschten Salz entspricht, zur erhaltenen Lösung zu, wodurch das Derivat bei Raumtemperatur in ein Säureadditionssalz überführt wird.

Wenn es gewünscht ist, ein Guanidinophenylpropionsäureesterderivat aus dem Aminophenylpropionsäure- esterderivat herzustellen, löst man das isolierte Aminophenylpropionsäureesterderivat in einem organischen Lösungsmittel auf oder suspendiert es darin und setzt dann mit Cyanamid um. Alternativ kann das isolierte

ίο Aminophenylpropionsäureesterderivat direkt mit Cyanamid umgesetzt werden. Alternativ kann man aber auch das Aminophenylpropionsäureesterderivat ohne Isolierung aus der Reaklionsmischung mit Cyanamid umsetzen, wodurch das gewünschte Guanidinophenylpro- pionsäureesterderivat der allgemeinen Formel I, worin R für

NH

StUI CIIlCI IHL·UI

1 VlUaUI Ir₁

drid, Propionsäureanhydrid, Milchsäureanhydrid, Methylacetat oder dergleichen, unter Bedingungen umsetzt, die bei der bekannten Perkin-Reaktion oder Claisen-Kondensation gewählt werden.

Zu Beispielen für Nitrozimtsäurederivate der allgemeinen Formel II gehören die p- und m-Nitrozimtsäuren, p- und m-Nitra-a-methylzimtsäuren, p- und m-Nitro-a-äthylzimtsäuren, p- und m-Nitro-ö-n-propylzimtsäuren und p- und m-Nitrol-o-n-butylzimtsäuren.

Zu Beispielen für die Phenolderivate und Naphtholderivate der allgemeinen Formel III gehören Phenol, p-Methylphenol, p-Äf.hylphenol, p-n-Propylphenol, p-Chlorphenoi, p-Bromphenol, o,o'-Dimethylphenol, p-Methoxyphenol, p-Athoxyphenol, p-n-Butoxyphenol, p-Methoxycarbonylphenol, p-Äthoxycarbonylphenol, p-n-Butoxycarbonylphenol, p-Carboxymethylphenol, p-Carboxyäthylphcnol, Naphthoi und Monochlornaphthol.

Die Reduktion des Nitrozimtsäureesterderivats der allgemeinen Formel IV kann mit einem Katalysator durchgeführt werden, der für übliche katalytische Reduktionen eingesetzt wird, beispielsweise Palladium-Aktivkohle, Raney-Nickel. Platinoxid und dergleichen. Dies bedeutet, daß man ein Nitrozimtsäureesterderivat der allgemeinen Formel IV in einem organischen Lösungsmittel auflöst oder suspendiert und in Gegenwart der zuvor erwähnten Katalysatoren gasförmigen Wasserstoff einfuhrt, wodurch ein Aminophenylpropionsäurederivat der allgemeinen Formel I, worin R für -NH₂ steht, leicht hergestellt werden kann. Zu bevorzugten Lösungsmitteln für diese Reaktion gehören Methanoi, Äthanci, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Diäthyläther und dergleichen, wobei Methanol und Äthanol besonders bevorzugt sind. Die Reduktion erfolgt leicht über einen weiten Temperaturbereich. Im allgemeinen ist die Reduktion innerhalb eines Zeitraums von 1 bis 2 Stunden bei einer Temperatur von 20 bis 40°C beendet

Das Aminophenylpropionsäureesterderivat der Formel I, worin R für -NH₂ steht, kann auf übliche Weise aus der Reaktionsmischung isoliert werden. Dies bedeutet, daß man es durch Entfernen des Katalysators au? der Reaktionsmischung durch Filtrieren und anschließendes Konzentrieren des Filtrats unter vermindertem Druck isolieren kann.

Wenn man ein Säureadditionssalz des Aminophenylpropionsäureesterderivats erhalten will, löst man das isolierte Derivat in Diäthyläther auf und gibt eine Säure, NH₂

steht, erhältlich ist. Zu den bei der obigen Reaktion vorzugsweise brauchbaren Lösungsmitteln gehören Me- thanol, Äthanol, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran und Diäthyläther, wobei Methanol und Äthanol besonders bevorzugt sind. Die Reaktion erfolgt glatt bei einer Temperatur im Bereich von Raumtemperatur bis zum Sii,'-2punkt des eingesetzten Lösungsmitteis. Das gewünschte Guanidinophenylpropionsäureesterderivat kann auf übliche Weise aus der Reaktionsmischung isoliert werden. Dies bedeutet, daß man es durch Konzentrieren der Reaktionsmischung unter vermindertem Druck und Umkristallisieren des Rückstands aus einem geeigneten Lösungsmittel leicht isolieren kann.

Wenn ein Carbonat des Guanidinophenylpropionsäureesterderivats gewünscht ist, gibt man das isolierte Derivat zu gesättigter wässeriger Natriumbicarbonatlösung. Wenn man andere Salze erhalten möchte, sus-

pendiert man das Carbonat in Äthylalkohol und gibt eine dem gewünschten Salz entsprechende Säure zur erhaltenen Suspension, wodurch das gewünschte Salz erhalten wird.

Zu den Säureadditionssalzen der Verbindung der all-

gemeinen Formel I gehören das Carbonal, Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Nitrat, Acetat, Lactat, Oxalat, Maleat, Fumarat, Tartrat, Citrat, Ascorbat, Benzolsulfonat, Toluolsulfonat und Methansulfonat. Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen der all gemeinen Formel I handelt es sich um Inhibitoren neuer Art für Trypsin, C 1-Esterase oder Thrombin, die eine sehr hohe Spezifität besitzen. Die erfindungsgc-mäßen Verbindungen weisen darüber hinaus eine starke Hemmwirkung auf die Blutplätlchenaggregation auf.

Bei den bislang bekannten synthetischen Inhibitoren

dieser Enzyme handelt es sich um Guanidinocapron-

' säurederivate, wie beispielsweise das FOY, nämlich das

Äthyl-p-(6-guanidinohexanoyloxy)benzoat-Methansul-

fonat (Naohiro Kayama und Hiroko Yoshimura, Gendai Iryo, 6,1010-1016 [1974]) und um Benzamidinderivate, wie die 4-Arnidinophenylbrenztraubensäure (P. Walsmann, F. Markwardt, P. Richter, J. Stürzebecher, G. Wagner und H. Landmann, Pharmazie 29, H. 5, 333-336 [1974]). Jedoch sind diese Verbindungen von nurgerin ger Spezifität und besitzen im allgemeinen ein breites Inhibitionswirkungsspektrum. Als blutplättchenaggregationsinhibierende Mittel sind nicht-steroidale, entzündungshemmende Pharmazeutika, wie Aspirin, be-

kannt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind jedoch diesen Pharmazeutika hinsichtlich ihrer Inhibierungswirkung wesentlich überlegen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen mit Antithrombin-Wirksamkeit oder mit blutplättchenaggregationshemmcnder Wirk- s samkeit sind brauchbar zur Behandlung von Thrombosen. Erfindungsgemäße Verbindungen mit einer Cl-Esterase-Hemmwirkung sind brauchbar zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Antigen-Antikörper-Reaktion bewirkt sind, beispielsweise die Autoimmunkrankheiten. Eine Erfindung mit Anti-Trypsin-Wirksamkcit ist brauchbar zur Behandlung akuter Pankreatitis.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich in den Beispielen Prozentangaben auf Gewichtsprozent.

Beispiel 1

(p-Methylphenyl-^-ip-aminophenylJ-propionat-Hydrochlorid (Verbindung Nr. 1)

Man gibt 22 g Phosphorpentachlorid zu 19,3 g p-Nitrozimtsäure, die in 300 ml Äthylacetat suspendiert ist, und rührt die erhaltene Suspension 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion entfernt man das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck. Der erhaltene Niederschlag aus p-Nitrozimtsäurechlorid wird in 300 ml Äthylacetat gelöst. Zur erhaltenen Lösung gibt man 10,8 g p-Methylphenol und anschließend langsam bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren 12 g Triethylamin. Nachdem man die Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur hat reagieren lassen, wäscht man die Reaktionsmischung mit 10%iger HCl, 10%iger NaOH und Wasser in dieser Reihenfolge und trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat. Dann entfernt man das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck, wodurch man das p-Methylphenyl-p-nitrocinnamat erhält. Die Ausbeute beträgt 26,8 g (95%), Schmelzpunkt 168 bis 170°C. IR fern"¹): 1720, 1510, 1345.

Man suspendiert 26,8 g des so erhaltenen p-Methylphenyl-p-nitrocinnamats und 2,0 g 10%iges Palladiumauf-Aktivkohle in 200 ml Äthanol und leitet unter Ruhren gasförmigen Wasserstoff ein. Auf diese Weise werden im Verlauf von 2 Stunden ungefähr 8,5 Liter Wasserstoff absorbiert. Nach beendeter Reaktion entfernt man den Palladium-Katalysator durch Filtrieren und entfernt das Lösungsmittel durch Destillieren unter vermiindertem Druck. Man löst den Rückstand in 200 ml Diäthyläther und leitet in die erhaltene Lösung gasförmiges Chlorwasserstoff ein, worauf das p-Methyl- phenyl-p-atninophenylpropionat-Hydrochlorid in Form farbloser Kristalle ausfällt Die Ausbeute beträgt 24,2 g (87,7%), Schmelzpunkt 203 bis 205⁰C (Zersetzung). IR (cm"¹): 3250-2500, 1745, 1506. MS: M⁺ = m/e 255 (M.G.-HC1).

Analyse für C₁₆H₁₈NO₂Cl = 291,77

60

Berechnet: !gefunden:

C 65,86
C 65,96

H 6,22
H 6,33

N 4,80% N 4,76%

Diese Verbindung führt zur Inhibierung der Tosylargininmethylester-Hydrolysewirkung des Thrombins in vitro. Die Konzentration, bei der die Verbindung die Hydrolyse zu 50% inhibiert (ID₅₀) beträgt 8,8 x 10"⁴ M.

Beispiel 2

p-Chlorphenyl-a-methyl-Xp^aminophenyl)-propionat-Hydrochlorid (Verbindung Nr. 2)

Man gibt 22 g Phosphorpeniachlorid zu 20,7 g p-Nitro-o-methylzimtsäure, die in 300 ml Äthylacetat suspendiert ist und rührt die erhaltene Mischung; 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach beendeter Reaktion entfernt man das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck. Der erhaltene Niederschlag von p-Nitro-e-methylzimtsäurechlorid wird in 300 ml Äthylacetat gelöst, und zur erhaltenen Lösung werden 12,5 g p-Chlorphenol zugesetzt. Man läßt die erhaltene Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren. Dann wäscht man die Reaktionsmischung mit 10%igcr HCI, 10%iger NaOH und Wasser in dieser Reihenfolge und trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat. Dann destilliert man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab, wobei man das p-Chlorphenyl-p-nitro-o- meihylcinnair.at erhält. Ausbeute: 29,8 g (93,9%). Schmelzpunkt 111 bis 112°C. IR (cm"¹): 1721, 1512, 1342.

Man suspendiert 29,8 g des so erhaltenen p-Chlorphenyl-p-nitro-a-methylcinnamats und 3,0 g 10%iges Palladium-auf-Aktivkohle in 250 ml Äthanol und leitet in die erhaltene Suspension unter Rühren gasförmigen Wasserstoff ein. Auf diese Weise werden im Verlauf von 2 Stunden ungefähr 8,5 Liter Wasserstoff absorbiert. Nach beendeter Reaktion entfernt man den Palladium-Katalysator durch Filtrieren und destilliert dann das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab. Der Rückstand wird in 200 ml Diäthyläther gelöst und man leitet in die erhaltene Lösung gasförmigen Chlorwasserstoff ein, worauf das p-Chlorphenyl-o-methyl-^-(p-aminophenyl)-propionat-Hydrochlorid in Form farbloser Kristalle ausfällt. Die Ausbeute beträgt 24,8 g (81,0%). Schmelzpunkt 216 bis 218⁰C. IR (cm"¹): 3250-2500, 1741,1510,1198. MS: M⁺ = /n/e289, 291 (M.G. -HCl).

Analyse für C₆H₁₇NO₂Cl₂ = 326,23

Berechnet:	C	58,90	H	5,25	N	4,29%
gefunden:	C	58,62	H	5,10	N	4,21%

Diese Verbindung inhibiert die Tosylargininmethylester-Hydrolysewirkung des Trypsins in vitro. Die ID₅₀ dieser Verbindung beträgt 3,3 x 10"* M.

Beispiel 3

Phenyl-^-(p-aminophenyl)-propionat-Hydrochlorid
(Verbindung Nr. 3)

Man gibt 22 g Phosphorpentachlorid zu 19,3 g p-Ni- trozimtsäure, die in 300 ml Äthylacetat suspendiert ist und rührt die erhaltene Mischung I Stunde bei Raumtemperatur. Nach beendeter Reaktion destilliert man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab, wor auf das p-Nitrozimtsäurechlorid ausfällt. Der so erhal tene Niederschlag wird in 300 ml Allylacetat gelöst, und zur erhaltenen Lösung werden 9,4 g Phenol zugegeben. Danach gibt man !angssm bei Raumtemperatur unter Rühren 12 g Triethylamin zu. Nach lstündiger Reaktion bei Raumtemperatur wäscht man die Reaktionsmischung mit 10%iger HCl, 10%iger NaOH und Wasser in dieser Reihenfolge und trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat Dann destillier; man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab, um das Phenyl-p-nitrocinnamat zu erhalten. Die Ausbeute be-

trägt 22,5 g (95%). Schmelzpunkt 151 bis 152°C. IR (cm"¹): 1720, 1529, 1345.

Man suspendiert 25,5 g des so erhaltenen Phenyl-pnitrocinnamats und 2,0 g 10%iges Palladium-auf-Aktivkohle in 200 ml Äthanol und leitet unter Rühren gasförmigen Wasserstoff in die Suspension. Im Verlauf von 2 Stunden werden ungefähr 8,5 Liter Wasserstoff absorbiert. Nach beendeter Reaktion filtriert man den Palladium-Katalysator ab und destilliert das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab. Man löst den Rückstand in 200 ml Diethylether und leitet in die erhaltene Lösung gasförmigen Chlorwasserstoff ein, worauf das Phenyl-p-aminophenylpropionat-Hydrochlorid in Form farbloser Kristalle ausfallt. Die Ausbeute beträgt 23,7 g (89,9%). Schmelzpunkt 240°C (Zersetzung). IR (cm"¹): 3250-2500, 1742,1511. MS: M⁺ = w/<?241 (M.G.-HCI).

Analyse für C₁₅H₁₆NO₂Cl = 277,75 Berechnet: C 64,86 H 5,81 N 5,04%

π j,oy

J₁U170

Diese Verbindung inhibiert die Tosylargininmethylester-Hydrolysewirkung des Thrombins in vitro. Die ID₅₀ dieser Verbindung beträgt 2,9 X 10"⁴ M. Sie besitzt jedoch keine Hemmwirkung gegenüber Trypsin, Plasmin, Cl-Esterase und Kallikrein.

Beispiel 4

p-Methoxyphenyl-a-äthyl-Xm-aminophenyl)-propionat-Hydrochlorid (Verbindung Nr. 4)

Man gibt 22 g Phosphorpentachlorid zu 22,1 g m-Nitro-fl-äthylzimtsäure, die in 300 ml Äthylacetat suspendiert ist und rührt die Mischung 1 Stunde oei Raumtemperatur. Nach beendeter Reaktion destilliert man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab, worauf das m-Nitro-a-äthylzimtsäurechlorid ausfällt.

Diese Verbindung löst man in 300 ml Äthylacetat und gibt hierzu 12,4 g p-Methoxyphenol. Nach lstündiger Reaktion bei Raumtemperatur wäscht man die Reaktionsmischung mit 10%iger HCl, 10%iger NaOH und Wasser in dieser Reihenfolge und trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat. Dann destilliert man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab, wobei man das p-Methoxyphenyl-m-nitro-a-äthylcinnamat erhält Die Ausbeute beträgt 30,7 g (93,9%). Schmelzpunkt 65 bis 66°C. IR (cm"'): 1710, 1503, 1351.

Man suspendiert 30,7 g des so erhaltenen p-Methoxyphenyl-m-nitro-fl-äthylcinnamats und 3,0 g 10%iges PaI-ladium-auf-Aktivkohle in 250 ml Äthanol und leitet unter Rühren gasförmigen Wasserstoff in die erhaltene Suspension ein. Im Verlauf von 2 Stunden sind ungefähr 8,5 Liter Wasserstoff absorbiert. Nach beendeter Reaktion filtriert man den Palladium-Katalysator ab und destilliert das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab. Man löst den Rückstand in 200 ml Diäthyläther und leitet in die erhaltene Lösung gasförmigen Chlorwasserstoff, worauf das p-Methoxyphenyl-aäthyI-j8-(m-aminophenyl)-propionat-Hydrochlorid in Form farbloser Kristalle ausfällt. Die Ausbeute beträgt 29,0 g (86,4%). Schmelzpunkt 110 bis 111°C. IR (cm"'):

3250-2500,1738,1503.MS:M* = m/e319(M.G.-HCI).

Diese Verbindung inhibiert die Tosylargininmethyl-

ester-Hydrolysewirkung des Trypsins in vitro. Die ID₅₀

dieser Verbindung beträgt 4,Ox 10"⁴ M. Jedoch besitzt sie keine Hemmwirkung gegenüber Plasmin, Cl-Ester ase, Kallikrein und Thrombin.

Beispiel 5

Unter Befolgung der zuvor genannten Arbeitsweisen mit der Ausnahme, daß die Ausgangsmaterialien hinsichtlich der Substituentenbedeutungen R¹ und R² jeweils verschieden sind, werden die Verbindungen der nachstehenden Tabelle 1 synthetisiert.

iaoeiie ι

COO-R²

R¹

Ver- Stellung R¹

bindung der Nr. NH₂-

Oruppe

Schmelzpunkt

(⁰C)

Bruttoformel

Elementaranalyse berechnet (%)

CHN

gefunden (%) CHN

m CH₃

6 m CH2CH3

7 m CH₂CH₃

HCl 85-90 C₁₆H₁₇NO₂Cl₂ 58,90 5,25 4,29 58,27 5,33 4,35

HCl 147-148 C₁₇H₁₉NO₂Cl₂ 60,01 5,63 4,12 60,31 5,48 4,27

HCl 122-124 C₂₁H₂₂NO₂Cl 70,87 6,23 3,94 70,99 6,15 3,98

8 m CH₃

9 ρ

ioToj

Cl

CH₃

CH₃

HCl 115-117 C₂₀H₁₉NO₂Cl₂ 63,84 5,09 3,72 63,71 5,27 3,71

HCl 148-149 C₂₇H₂₀NO₂Cl 66,77 6,59 4,58 67.02 6,44 4,46

10 ρ

HCl .00 C₁₅H₁₅NO₂Cl₂ 57,70 4,84 4,49 57,99 4,69 4,31

Tabelle 1 (Fortsetzung) Ver- Stellung R¹

bindung der Nr. NH_r

Gruppe

Salz Schmelzpunkt

Bruttoformel

Elementaranalyse berechnet (%)

CHN

gefunden (%) C H

CH₃

CH₃

CH₂CH₃

CH₂CH₃

CH₂CH₃

CH₂CH₃

CH₃

fold)

-CH₃

CH₂COOH

HCl 211-213 C₁₉H₁₁NO₂Cl 69,61. 5,54 4,27 69,55 5,29 4,39

HCl 165-167 Ci₉H₁₁NO₂Cl 69,61 5,54 4,27 69,98 5,64 4,77

HCl 194-195 C₁₇H₂₀NO₂Cl 66,77 6,59 4,58 67,03 6,22 4,17

HCl 223-225 C₂₀H₂₀NO₂Cl 70,27 5,90 4,10 69,96 6,32 3,98

HCl 179-181 C₁₇H₁₉NO₂Cl₂ . 60,01 5,63 4,12 60,57 5,49 4,00

HCl 198-200 C₂₁H₂₂NO₂Cl 70,87 6,23 3,94 70,74 6,10 3,77

HCl

-CH₂CH₂COOH HCl öl

HCl öl

C₁₉H₂₂NO₄Cl 62,72 6,10 3,85 61,96 5,89 3,58

C₂₀H₂₄NO₄Cl 63,57 6,40 3,71 63,19 6,71 3,56

C₂₀H₂₀NO₂Cl 70,27 5,90 4,10 70,01 6,41 3,92

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Ver bindung Nr.	Stellung der NH2- Gruppe	R1
20	m	CHj
21	P	CH2CH,
22	P	CH2CH,

R²

Salz Schmelzpunkt

(⁰C)

Bruttoformel

Elementaranalyse berechnet (%)

CHN

gefunden (%) C H

CHjCHj

CHjCHj

25	m	H
26	m	H
27	m	CH,
28	m	CHjCH,
29	m	CH1CH,

CH,

-COOCjHj

HCl öl

CH-CH₂CH, HCl öl

CH,

C₁₇H₂₀NOjCI 66,77 6,59 4,58 66,33 6,87 4,31 _—

HCl 169-170 CHjjNOjCI 67,59 6,93 4,38 67,46 6,85 4,40

Cj₁H₂₁NOjCl 69,69 7,80 3,87 69,14 7,60 3,99

COOCjHj

HCl 188-189 C₁₁H₂₂NO₂Cl 67,59 6,93 4,38 67,21 6,97 4,01

HCl 212-213 C₁₇H₁₉NO₂BrCl 53,07 4,98 3,64 53,02 4,82 3,82

HCl 163-166 C₁₅H₁₆NO₂Cl 64,86 5,81 5,04 64,57 5,98 5,26

HCl 140-142 Ci₁H₂₀NO₄CI 61,80 5,76 4,00 61,38 5,68 4,10 So HCl Öl C₁₄H₁₁NO₂Cl 65,86 6,22 4,80 65,71 6,11 4,92 HCl 83-85 C₁₇Hj₀NOjCl 66.77 6,59 4,58 66,36 6,84 4,77 HCl 130-131 Cj₀H₂₄NO₄Cl 63,57 6,40 3,71 63,36 6,74 3,61

OO IO ^⁴

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Ver	Stellung	R1	R2	Salz	Schmelz	Bruttoformel	Elementaranalyse	gefunden (%)	N
bindung	der				punkt		berechnet (%)
Nr.	NH2-							C H
	G nippe				(0C)		CHN

30 m CH₂CH₂CH₃

31 ρ Η

32 ρ Η

33 ρ H

34 ρ CH₃

35 ρ CH₂CH₃

36 ρ CH₂CHj

37 ρ CH,

38 ρ CHj

39 ρ H

40 ρ CH₂CH₃

COOC₂H₅

OCH₃

0(CH₂)JCH₃

COOC₂H₅

COOCH₃

HCl 72-74 C₁₁H₂₂NO₂Cl 67,59 6,93 4,38 67,58 6,91 4,59

HCl 706-207 C₁₁H₂₀NO₄C! 61,80 5,76 4,00 61,49 5,53 4,24

frei 84-85 C₁₆H₁₇NO₃ 70,83 6,32 5,16 70,61 6,10 5,22

HCl 208-210 C₁₉H₂₄NO₃Cl 65,23 6,91 4,00 65,13 6,77 4,01

HCl 165-170 C₁₆H₁₁NO₂Cl 65,91 6,22 4,80 65,98 6,02 4,76

HCl 190-195 C₁₇H₂₀NO₂Cl 66,77 6,59 4,24 66,15 6,49 4,16

HCl 153-154 C₂₀H₂₄NO₄Cl 63,57 6,40 3,71 63,87 6,93 3,85

HCI 152-156 C₁₉H₂₂NO₄Cl 62,72 6,10 3,85 62,81 6,00 3,96

HCl 149-152 C₁₇H₂₀NO₃Cl 63,45 6,26 4,35 63,73 6,02 4,08

HCI 111-112 C₁₇H₁₁NO₄Cl 60,80 5,40 4,17 60,58 5,33 4,17

COO(CH₂)JCHj HCl 92-93 C₂₂H₂₁NO₄Cl 65,09 6,95 3,45 64,81 6,94 3,35

21

VO

t—

Ov

es

VO

in

OO

4,30	4,03
6,76	6.37
64,45	64,12

JO

tu .

«2

I! 9

.CJ .H ,

ei

VO

00

r—t

00

6,60	6.60
64,37	64.37
Ü C a X	U O X
U	U
r~ VO	00 VO
166-3	167-]
HCl	HCl

X U

υ υ

Beispiel 6

p-CbloiTJhenyl-fl-methyl-jS-irn-guanidinophenyl)-propionat-Carbonat (Verbindung Nr. 44)

Man gibt 22 g Phosphorpentachlorid zu 20,7 g m-Nitro-0-methylzimtsäure, die in 300 ml Äthylacetat suspendiert ist und rührt die erhaltene Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach beendeter Reaktion entfernt man das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck, worauf das m-Nitro-o-methylzimtsäurechlorid ausfällt Die Verbindung wird in 300 ml Äthylacetat aufgelöst und hierzu werden 12,9 g p-Chlorphenol gegeben, worauf die erhaltene Lösung

ι > 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren gelassen wird. Dann wäscht man die Reaktionsmischung mit 10%iger HCI. 10%iger NaOH und Wasser in dieser Reihenfolge und trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat Anschließend destilliert man das Lösungsmittel unter ver-

2" minderten! Druck ab, wobei man das p-Chlorphenyl-mnitro-e-methylcinnamat in kristalliner Form erhält Die Ausbeute beträet 28,5 g (89.9%). Schmelzpunkt 102⁰C.

IR (cm"¹): 1727,1528,1352.

Man suspendiert 28,5 g des so erhaltenen p-Chlor-

2Ί phenyl-m-nitro-a-methylcinnamats und 3,0 g 30%iges Palladium-auf-Aktivkohle in 250 ml Äthanol und leitet in die erhaltene Suspension unter Rühren gasförmigen Wasserstoff ein. Im Verlauf von 2 Stunden werden ungefähr 8,5 Liter Wasserstoff absorbiert Nach beendeii' ter Reaktion filtriert man den Palladium-Katalysator ab und entfernt das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck. Man löst den Rückstand in 200 ml Äthyläther und leitet in die erhaltene Lösung gasförmigen Chlorwasserstoff ein, um das p-Chlor-

i'· phenyl-o-methyl-yJ-(m-aminophenyl)-propionat-Hydrochlorid in Form farbloser Kristalle zu erhalten. Die Ausbeute beträgt 23,0 g (78,5%). Schmelzpunkt 85 bis

95°C. IR(Cm"¹): 3500-2500, 1748, 1492.

Man löst 23,0 g des so erhaltenen p-Chlorphenyl-a-

■»» methyl-jS-im-aminophenyO-propionat-Hydrochiorids und 4,2 g Cyanamid in 200 ml Äthanol und läßt die erhi'tene Lösung 5 Stunden lang bei 70⁰C reagieren. Nach beendeter Reaktion wird das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt wo-

■r. durch man das p-Chlorphenyl-a-methyl-./Km-guanidinophenyl)-propionat-Hydrochlorid in Form einer öligen Substanz erhält. Diese Verbindung wird in 50 ml Äthanol aufgelöst und dann zu einer gesättigten wässerigen NaHCO₃-Lösung zugesetzt worauf farblose Kri-

>" stalle ausfallen. Man sammelt die Kristalle durch Filtrieren, wäscht mit Wasser und Aceton und erhält auf diese Weise das p-Chlorphenyl-fl-methyl-./Hm-guanidinophenyl)-propionat-Carbonat Die Ausbeute beträgt 19,4 g (70%). Schmelzpunkt 87 bis 9O⁰C. IR (cm"¹):

r. 3500-2500, 1748, 1660, 1490. MS: M⁺ = m/e 331 (M-C-H₂CO₃).

Analyse für C₁₈H₂₀N₃O₅Cl = 393,83

Berechnet:
gefunden:

C 54,89
C 54,55

H 5,12
H 5,33

N 10,67%
N 10,54%

Diese Verbindung inhibiert die Acetyltyrosinäthylester-Hydrolysewirkung der Cl-Esterase in vitro. Die IDj₀ dieser Verbindung beträgt 2,5 x 10"⁴ M.

Beispiel 7

p-Methylphenyl-fl-methyl-Xp-guanidinophenyl)-propionat-Hydrochlorid (Verbindung Nr. 45)

Man gibt 22 g Phosphorpentachlorid zu 20,7 g p-Nitro-a-methylzimtsäure, die in 300 ml Äthylacetat suspendiert ist und rührt die erhaltene Mischung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach beendeter Reaktion entfernt man das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck, worauf das p-Nitro-a-methylzimtsäurechlorid ausfällt. Diese Verbindung wird in 300 ml Äthylacetat aufgelöst. Zu dieser Lösung gibt man 10,8 g p-Methylphenol und anschließend unter Rühren bei Raumtemperatur langsam 12 g Triethylamin. Man läßt die erhaltene Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren. Dann gibt man 50 ml 10%iger HCI zu und sammelt das so ausgefällte p-Methylphenyl-p-nitro-47-methylcinnamat durch Filtrieren.

Dip Auch,

pendiert ist und rührt die erhaltene Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach beendeter Reaktion entfernt man das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck, worauf das m-Nitro-a-methylzimtsäurechlorid ausfällt. Diese Verbindung löst man in 300 ml Äthylacetat und gibt dann 9,4 g Phenol zur Lösung. Man läßt die Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren. Dann wäscht man die Reaktionsmischung mit lOVoiger HCI, 10%iger NaOH und Wasser

ίο in dieser Reihenfolge und trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei m?.n das Phenylm-nitro-ö-methylcinnamat in Form eines hellgelben öligen Stoffs erhält. Die Ausbeute beträgt 25,5 g (90%).

IR (cm"¹): 1720, 1525, 1352.

Man suspendiert 25,5 g des so erhaltenen Phenyl-mnitro-fl-methylcinnamats und 3.0 g 10%ges Palladiumauf-Aktivkohle in 250 ml Äthanol und leitet unter Rühren gasförmigen Wasserstoff in die erhaltene Suspen-

hpträot 26 4° ($9%^. Schmc!z^n|jnk? 125 20 sion ciri. im Verlsiif vcn 2 Stunde" werden ur!"cf^

bis 126°C. IR (cm"¹): 1710, 1502, 1338.

Man suspendiert 26,4 g des so erhaltenen p-Methylphenyl-p-nitro-a-methylcinnamats und 2,0 g 10% PaIIadium-auf-Aktivkohle in 200 ml Äthanol und leitet unter Rühren gasförmigen Wasserstoff in die Suspension ein. Im Verlauf von 2 Stunden werden ungefähr 8,5 Liter Wasserstoff absorbiert. Nach beendeter Reaktion wird der Palladium-Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Man löst den Rückstand in 200 ml Diäthyläther auf und leitet in die erhaltene Lösung gasförmigen Chlorwasserstoff ein. Hierauf fällt das p-Methylphenyla-methyl-j8-(p-aminophenyl)-propionat-Hydrochlorid in Form farbloser Kristalle aus. Die Aurbeute beträgt 21,8 g (80%). Schmelzpunkt 194 bis 195°C. IR (cm"¹): 3250-2500, 1741, 1200.

Man löst 21,8 g des so erhaltenen p-Methylphenylo-methyl-^-(p-aminophenyl)-propionat-Hydrochlorids und 4,2 g Cyanamid in 200 ml Äthanol und läßt die erhaltene Lösung 5 Stunden bei 70⁰C reagieren. Nach beendeter Reaktion wird das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt, wodurch man ein öliges Produkt erhält. Man gibt dazu eine Mischung aus Äthanol und Diäthyläther und kühlt die Lösung, worauf Kristalle ausfallen. Man sammelt die Kristalle durch Filtrieren und kristallisiert aus einer Mischung von Äthanol und Diäthyläther um, wobei man das p-Mc^|liylphenyl-a-methyl-./Kp-guanidinophenyl)-propionat-Hydrochlorid in Form farbloser Kristalle erhält Die Ausbeute beträgt 17,4 g (70%). Schmelzpunkt 146 bis 148°C. IR (cm"¹): 3500-2550,1748,1653, 1631. MS: M⁺ = ir-'elU (M.G.-HC1).

Analyse für Ci₈H₂₂N₃O₂Cl = 347,84

Berechnet:
gefunden:

C 62,15 H 6,38
C 62,16 H 6,45

N 12,08%
N 12,38%

Diese Verbindung inhibiert die Acetyltyrosinäthylester-Hydrolysewirkung der Cl-Esterase in vitro. Die ID₅₀ dieser Verbindung beträgt 7,8 X10"⁴ M.

Beispiel 8

Phenyl-fl-methyl-Xm-guanidinophenyl)-propionat-Carbonat (Verbindung Nr. 46)

Man gibt 22 g Phosphorpentachlorid zu 20,7 g m-Nitro-a-methylzimtsäure, die in 300 m! Äthylacetat sus-8,5 Liter Wasserstoff absorbiert. Nach beendeter Reaktion filtriert man den Palladium-Katalysator ab und entfernt das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck. Der Rückstand wird in 200 ml Diäthyläther aufgelöst, und gasförmiger Chlorwasserstoff wird in die Lösung eingeleitet, wobei man das Phenyl-omethyI-./Hm-aminophenyl)-propionat-Hydrochlorid in Form eines farblosen, öligen Produkts erhält. Die Ausbeute be( Sgt 24,3 g (93%). IR (cm"): 3500-2500, 1730, 1490.

Man löst 24,3 g des so erhaltenen Phenyl-a-methyl-/?- (m aminophenyl)-propionat-Hydrcchlorids und 4,2 g Cyanamid in 200 ml Äthanol und läßt die Lösung 5 Stunden bei 70⁰C reagieren. Nach beendeter Reaktion wird das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt, wobei man das Phenyl-amethyl-jS-(m-guanidinophenyl)-propionat-Hydrochlorid in Form eines öligen Produkts erhält. Dieses wird in 50 ml Äthanol aufgelöst und dann zu einer gesättigten wässerigen NaHCo₃- Lösung gegeben, worauf farblose Kristalle ausfallen. Die Kristalle werden durch Filtrieren gesammelt und mit Wasser und Aceton gewaschen, wobei man das Phenyl-e-methyl-j3-(m-guanidinophenyl)-propionat-Carbonat erhält. Die Ausbeute beträgt 22,6g (75%). Schmelzpunkt 97 bis 98°C. IR (cm-'): 3500-2500, 1745, 1682, 1625. MS: M⁺ = m/e 297 (M.G. - H₂CO₃).

Analyse für C₁₈H₂₁N₃Oj = 359,37

Berechnet:
gefunden:

C 60,16
C 60,30

H 5,89
H 6,38

N 11,69%
N 11,75%

Diese Verbindung inhibiert die Acetyltyrosinäthyiester-Hydrolysewirkung der Cl-Esterase in vitro. Die ID₅₀ dieser Verbindung beträgt 3,1 x 10"⁴ M. Sie besitzt jedoch keine Hemmwirkung gegenüber Trypsin, Plasmin, Kallikrein und Thrombin.

Beispiel 9

p-ÄthoxycarbonylphenyI-a8-(p-guanidinophenyl)-propionat-Hydrochlorid (Verbindung Nr. 47)

Man gibt 22 g Phosphorpentachlorid zu 19,3 g p-Nitrozimtsäure, die in 300 ml Äthylacetat suspendiert ist, and rührt die Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach beendeter Reaktion entfernt man das Lösungs-

mittel durch Destillation unter vermindertem Druck, woraufdas p-Nitrozimtsäurechlorid ausfällt. Dieses löst man in 300 ml Äthylacetat und gibt 16,6 g p-Äthoxycarbonylphenol zur Lösung, worauf man 12 g Triethylamin bei Raumtemperatur unter Rühren langsam zusetzt. Man läßt die erhaltene Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren. Dann gibt man 50 ml 10%ige HCl zu und sammelt das so ausgefällte p-Äthoxycarbonylphenyl-p-nitrocinnamat durch Filtrieren. Die Ausbeute beträgt 32,3 g (95%). Schmelzpunkt 133 bis 134⁰C. IR (cm"^r): 1731, 1710, 1517, 1351.

Man suspendiert 32,3 g des so erhaltenen p-Äthoxycarbonylphenyl-p-nitrocinnamats und 2,0 g lOVoiges Palladium-auf-Aktivkohle in 200 ml Äthanol und leitet in die erhaltene Suspension unter Rühren gasförmigen Wasserstoff ein. Im Verlauf von 2 Stunden werden ungefähr 8,5 Liter Wasserstoff absorbiert. Nach beendeter Reaktion filtriert man den Palladium-Katalysator ab und entfernt das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck. Der Rückstand wird in 2öÖmi Diäthyläther aufgelöst, und gasförmiger Chlorwasserstoff wird in die Lösung eingeleitet, woraufdas p-Äthoxycarbonylphenyl-j3-(p-aminophenyl)-propionat-Hydrochlorid in Form farbloser Kristalle ausfällt. Die Ausbeute beträgt 28,6 g (87%). Schmelzpunkt 206 bis 207⁰C. IR (cm"¹): 3250-2500, 1750, 1710, 1277.

Man löst 28,6 g des so erhaltenen p-Äthoxycarbonylphenyl-./?-(p-aminophenyl)-propionat-HydrochIorids und 4,2 g Cyanamid in 200 ml Äthanol und läßt die Lösung 5 Stunden lang bei 70⁰C reagieren. Nach beendetf Reaktion wird das Lösungsmittel durch Destilla-

tion unter vermindertem Druck entfernt, wodurch man ein öliges Produkt erhält, zu dem man eine Mischung aus Äthanol und Diäthyläther zusetzt. Dann kühlt man die Lösung, worauf Kristalle ausfallen. Man sammelt die Kristalle durch Filtrieren und kristallisiert aus einer Äthanol-Diäthyläther-Mischung um, wobei man das p-

Athoxycarbonylphenyl-./Kp-guanidinophenylJ-propionat-Hydrochlorid in Form farbloser Kristalle erhält. Die Ausbeute beträgt 25,1 g (78%). Schmelzpunkt 125 bis 127°C. IR (cm¹¹): 3500-2550, 1750, 1708, 1670, 1599. MS: M⁺ = m/e355 (M.G.-HC1).

Analyse für C₁₉H₂₂N₃O₄Cl = 391,85

Berechnet: C 58,23 H 5,66 N 10,72% gefunden: C 57,86 H 5,52 N 10,49%

Diese Verbindung inhibiert die Tosylargininmethylester-Hydrolysewirkung des Trypsins in vitro. Die ID₅₀ dieser Verbindung beträgi 7,8 X i0" M. Sie ucsitit jedoch gegenüber Plasmin, Kallikrein, Cl-Esterase und Thrombin keine Hemmwirkung.

Beispiel 10

Man synthetisiert die in der Tabelle 2 dargestellten Verbindungen unter Befolgung der zuvor beschriebenen Arbeitsweise mit der Ausnahme, daß man Ausgi.ngsmaterialien einsetzt, in denen R¹ und R² verschie dene Bedeutungen besitzen.

Tabelle

COO — R^a

NH₂

Vor- Stellung der

dun« ^NH

Nr. -ζ

NHj Gruppe

R¹

Salz

Schmelz- Bruttoformel Elementaranalyse

punkt berechnet (%) gefunden (%)

CHNCHN

48 m 49 m

50 m

51 m

52 ρ

53 ρ

H CH₂CH₃

CH₃ CH₃

CHj

CH₂CH₃

HCI H₂CO₃

HCl HCI

OO C₁₇H₂₀N₁O₂CI 61,16 6,04 12.59 61,32 6,34 12,17 K)

95-98 C₁₇H₂₂N₃O₅Cl 55,95 5,44 10,30 55,66 5,64 10,05

C₂₁H₂₂N₃O₂Cl 65,70 5,78 10,95 65,01 5,81 10,42 C₂₁H₂₁N₃O₂Cl 60,29 5,10 10,05 59,88 5,60 10,02

HCl

HCI

148-150 C_nH₁₉N₃O₂CI₂ 55,44 5,20 11,41 55,33 5,00 11,83

C₁₁H₂₁N₃O₂Cl₂ 56,55 5,54 11,00 56,04 5,71 10,66

Fortsetzung

Ver- Stellung der

^bin" NH

dung /^H

Nr. -ΝΗ-ζ -

NH, Gruppe

R¹

Schmelz- Bruttoforniel Elementaranalyse

punkt berechnet (%) gefunden (%)

CHNCHN

CH₃

CH₂CH₃

56	P	CH2CH3
57	P	CH2CH3
58	P	CH2CH3

CH₃

CH₂COOH H₂CO₃

CHjCHjCOOH HjCO₃

116-118 C₂₁Hj₂NrOjCI 65,70 5,78 10,95 65,80 5,62 10,54

143-145 C₂₂H₂₄N₁₁O₂Cl 66,40 6,08 10,56 66,18 6,31 10,89

C₁₉H₂₄NiOjCl 63,18 6,69 11,61 63,01 6,90 11,57

125-127 C₂₁H₂₃N₁O₇ 58,46 5,84 9,74 58,38 5,73 9,44

94-95 C₂₂H₂₇N)O₇ 59,31 6,11 9,43 59,61 6,43 9,59

OO CT)

59	m	CH	CH	(pß)	CH3	HCl	Öl	C22H24N3O2Cl	66,40	6,08	10,56	66,16	6,:;6	10,58	ω	9,10
					-<fe>
60	P	CH	2CH3	—/q\— c η c H2C H3	(H2CO3) CH3SO3H	(107-109) 133-134	C23H33N3O5S	59,59	7,18	9,07	59,49	7,20
				CH3									9,89 ;
				(H2CO3)	(90-92)
61	P	CH	2CH3	CH3SO3H	129-130	C20H27N3O5S	56,99	6,46	9,97	57,00	6,53

Fortsetzung

Ver- Stellung der *"■ NH

NH,

Gruppe

CH₂CH,

OCHj

Salz

	(HjCOj)
	CHjSOjH
	HjCOj
COOCjH3	HjCOj
	HjCOj
COOCjH1	HjCOj
OCH3	HjCOj
	HjCOj
	HCl

HCl

CH₃

0(CHj)₃CH₃ HCl

HjCOj

Schmelz- Bruttoformel Elementaranalyse

punkt berechnet (%) gefunden (%)

H N

H N

(90-91)

82-83 C₁₉H₂₄N₃O₅BrS 46,92 4,97 8,64 46,70 5,00 8,80

115 C₁₇H₁₉N₃O₅ 59,12 5,55 12,17 59,02 5,86 12,27

232-234 Cj₀Hi₃N₃O₇ 57,55 5,55 10,07 57,79 5,55 10,09 107-108 C₁₉H₂₃NjO₅ 61,11 6,21 1L25 60,90 6,46 10,75

65-66 C₂₂Hj₇N₃O₇ 59,31 6,11 9,43 58,95 5,87 9,50

99-100 C₂₀H₂₅N₃O₆ 59,54 6,25 10,42 59,24 5,97 11,08

98-99 C₂₀H₂₅NjO₅ 62,00 6,50 10,85 62,12 6,71 10,99

158 C₁₆H₁₁N₃OjCl 60,09 5,67 13,14 59,95 5,78 13,21

114-115 C₁₇H₂₀N₃OjCl 58,36 5,76 12.01 58,41 5,89 11,83 110-115 C₂₀Hj₆NjOjCI 61,29 6,69 10,72 61,73 6,76 10,85

83-87 C₁₁H₂₁N₃O₅ 60,16 5,89 11,69 60,12 5,94 12,01

Fortsetzung

Ver- Stellung der 5ⁱⁿ" NH

5 dung

NH,

Gruppe

Salz

Schmelz- Bruttofbrmcl Elementaranalyse

punkt berechnet (%) gefunden (%)

CHNCHN

CH₂CHj

CHjCHj

CH₂CH₃

CH₂CH,

CH₁

CH,

CH₂CH₃

CH₂CH₃

CHjCHj

CH₂CH₃

H₂CO₃

COOC₂H₅ H₂CO₃

COOCjH₅

OCH₃

H₂CO₃

HCl

(H₂CO₃) -COO(CH₂)JCHj CH₃SO₃H

COOCH₃

OCH₃

■ά

OCH₃

(H₂CO₃) CH₃SO₃H

(H₂CO₃) CH₃SO₃H

(H₂CO₃) CH₃SO₃H 100-101 C₁₉H₂₃N₃O₅ 61,11 6,21 11,25 60,91 6,31 11,26 _ω

117-119 C₁₉HJjN₃O₅S 56,00 6,18 10,31 55,41 6,19 10,33

SOjH 118-121 C₂₅H_nN₃O₅S 62,09 6,05 8,69 62,13 5,99 8,73 (sintert)

100-102 C₂₂H_nN₃O₇ 59,31 6,11 9,43 59,14 5,89 9,42 Κ>

55-58 Cj₁HjJiN₃O₇ 58,46 5,84 9;74 58,30 5,74 9,80

öl

C₁₁H₀N₃O₃Cl 59,42 6,10 11,55 59,37 6,00 11,85

(101-103)

79-78 C₃₄HmN₃O₇S 56,79 6,55 8,28 56,80 6,71 8,30

(99-100)

113-114 C₁₁H₂₇N₃O₇S 54,18 5,85 9,03 54,30 5,55 8,99

(99-100)

124-125 C₂₀Hj₇N₃OtS 54,90 6,22 9,61 55,01 6,09 9,50 (98-99)

125-126 C₂₀Hj₇O₆N₃S 54,90 6,22 9,61 54,77 6,13 9,57

Anwendungsbeispiel

(A) Bestimmung der Enzym-inbibierepden Wirkung

gung der unter dem obigen Punkt (1) beschriebenen Methode verwendet

Die in vitro enzymhemmenden Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden unter Befolgung der Arbeitsweise gemäß der Methode von M. Muramatsu et al. (M, Muramatsu, T. Onishi, S. Makino, Y. Hayashi und S. Fujii, J. Biochem., 58, 214 [1965]) gemessen.

(1) Inhibiemngswirkung der Ester-hydrolysierendcn Aktivität von Trypsin

Man gibt zu 0,1 ml Trypsin (5 μg/mJ) 0,5 ml 0,1 m is Boratpufferlösung (pH 8,6), die 10 mM CaCl₂ enthält, sowie 0,1 ml einer Inhibitorlösung mit variierender Konzentration, und führt bei 37°C eine 5minütige Vorinkubation durch. Dann gibt man 10 μΜοΙ des Substrats, TAMe (Tosylargininmethylester) zu und iriku- biert 30 Minutea lang bei 37°C.

Nach der Inkubation gibt man 1,5 rn! 2 m alkalisches Hydroxylamin zu und mischt gründlich und läßt 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann gibt man jeweils 1,0 ml 18%ige Trichloressigsäure, 4 η HCl und 10%iges FeCh zu und vermischt gründlich. Erforderlichenfalls wird die Mischung 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert Die Absorption der überstehenden Flüssigkeit wird bei 530 nm gemessen.

30

(2) Hemmwir Vung auf die Ester-hydrolysierende . Aktivität von humanem Plasmin

Dieser Effekt wird gemessen, indem man 0,1 ml Piasmin (durch Aktivierung von Plasm.nogen mit Streptokinase herstellt) und TAMe als Substrat unter Befol-

(3) Hemmwirkung auf die Ester-hydrolysierende Aktivität von humanem Plasma-Kallikrein

Diese Wirkung wird gemessen, inde.·. man 0,5 ml Kallikrein (durch Aktivierung von KalHkreinogen mit Ace'on hergestellt) und TAMe als Substrat verwendet, wobei man die unter dem obigen Punkt (1) beschriebene Methode befolgt

(4) Inhibierender Effekt auf die Esterhydrolyseaktivität von Rinderthrombin

Dieser Effekt wird gemessen, indem man 0,4 ml Rinderthrombin (1 μ/ml), 0,02 m Natriumphosphatpufferlösung (pH 7,4) und TAMe als Substrat verwendet, wobei man die unter dem obigen Punkt (1) beschriebene Methode befolgt

(5) Inhibitionswirkung auf die Esteihydroiyseaktivität

von menschlicher Cl-Esterase

(K. Okamura, M. Muramatsu und s. Fujii,

Biochem. Biophyi. Acta, 295, 252 bis 257 [1973])

Dieser Effekt wird gemessen, indem man 0,1 ml Cl-Esterase, 0,1 ml 0.02 m Natriumphosphatpufferlösung (pH 7,4) und 10 μΜοΙ ATEe (Acetyltyrosinäthylester) als Substrat verwendet, wobei man die unter dem obigen Punkt (1) beschriebene Methode befolgt

Die enzymhemmenden Wirkungen (prozentuale Inhibierung bei 10"³ M oder IDj₀) der Verbindungen sind in der Tabelle 3 dargestellt

Tabelle 3

COOR²

R¹

Ver	R	R1	R2	Trypsin	Plas	Esterase	KaIIi-	Thrombin
bin					min	Cl	krein
dung
Nr.

NE NE

NE NE

OMe [4,OxIO-¹] NE 14,8

Cl

[1,Ox ΙΟ-⁵] NE NE

NE	(8,8 χ	ΙΟ"'
NE	[2,9 χ	ΙΟ-4
NE	NE
NE	NE

37

Fortsetzung

Ver- R bindung Nr,

R' R²

Trypsin Pias- Esterase

min Cl

Kalli- Thrombin krein

7 m-NH₂ Et

32	P-NH2	H
33	P-NH2	H
36	P-NH2	Et
45	p-G	Me
46	m-G	Me
47	p-G	H
50	m-G	Me

p-G m-G m-G

Me

Et^

Pr

-Cl [1,0 xlO"⁵] NE 11,7

-OMe 38,8

NE NE

[8,9 x HT⁴] NE NE

[1,7 χ 1(T⁴] NE NE

— NE

NE [1,7 x ΙΟ"⁴]

NE 19,9

15,9 25,3

21,4 NE [7,8XlO-⁴] NE NE

12,2 NE [3,1 x 10~⁴] 12,9 NE

-COuEt [7,8 xlO~⁵] NE NE

36,0 12,3

[5,7 x 10~⁵] 42,0 [1,4 x 10~⁴] — NE

[4,9 x ΙΟ"⁴] 18,8 [5,6 x 10"⁵] 38,4 NE

35,0 NE [7,0 χ ΙΟ"⁵] 15,6 16,8

NE 22,0 [4,3 x 10~⁴] 17,6 NE

71 p-G H

-OBu [6,6 x 1(T⁴] 20,0 NE

1,5 NE

73 p-G Et 43,9

NE [3,1 xlO"⁴] 31,5 NE

51 m-G CH₃

30,0

28,0 45,1

1,0 NE xlO

54 p-G CH₃

38,0

NE 8,0 xlO"⁵ 31,7 NE

Fortsetzung

Verbindung

R¹

Trypsin

Phismin

Cl

KaIIi- Thrombin krem

57 p-G C₂H₅

p-G C₂H₅

CH₂COOH NE NE 4,OxIO-⁴ 35,0 25,0

COOC₂Hs 8,0 χ 10~⁵ 45,0 3,OxIO"⁴ 9,0 , 30,0

xlO

_4

NH Anmerkung: G = — NH —/

NH, Bu = -CH₁CHjCHjCH,

Pr _ CH;CH;CH;

Et CH₁CH,

Me = -CH,

NE = nicht wirksam

[ ] = ID₅₀(M)

(B) Bestimmung der Hemmwirkung auf durch Collagen induzierte BlutpläUchenaggregation

Nach der Methode von Born et al. (Born, G.V. R., J. Physiol. 168, 178 [1963]) wurde die Blutplättchenaggregationsinhibierung (%) bei verschiedenen Konzentrationen der erfindungsgemäßen Verbindungen nach der folgenden Arbeitsweise bestimmt:

Man gibt 0,9 ml Kaninchen-PRP (blutplättchenreiches Plasma), das aus Blut, welches mit Natriumeitrat versehen wurde, erhalten wurde, in ein Polyäthylenröhrchep und inkubiert 1 Minute uei 37°C. Dann gibt man 10 μΐ einer Lösung der Verbindung oder einer physiologischen Kochsalzlösung als Kontrolle zu.

Anschließend gibt man 0,1 ml Collagenlösung zu und

bestimmt die Änderung der Absorption des PRP, die

vom Fortschreiten der Blutplättchenaggregation her-

rührt, mit Hilfe eines Blutplättchenaggregationsmeß-

geräts und zeichnet die Ergebnisse auf.

Die prozentuale Inhibierung wird nach der folgenden Gleichung berechnet:

Prozentuale Inhibierung =

maximale Absorptionsänderung (PRP + Induktionsmittel) [maximale Absorptionsänderung"]
(PRP + Verbindung
+ Induktionsmittel)

maximale Absorptionsänderung (PRP + Induktionsmittel)

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4

Inhibierung der durch Collagen induzierten Blutplättchenaggregation von Kaninchen-PRP

(C) Bestimmung der antihämolytischen Aktivität

Verbin- Konzentration an Verbindung

dung Nr. _{05 10 25 50 100}

46%

Aspirin -

4% 100% 100% 100%

37% 84% 100%

41% 100% 100%

100% 100% 100% 100%

78% 100%

50 Die Verhinderung der Komplement-abhängigen Hämolyse durch die erfindungsgemäßen Verbindu: jen wurde nach der Methode von B. R. Baker et al. (J. Med. Chem., 12,408-414 [1969]) nach der folgenden Arbeits-

weise bestimmt:

Man gibt in ein Teströhrchen 0,5 ml sensitivierte Erythrozyten (5 x 10* Zellen/ml), 0.1 ml eine Probelösung (endgültige Konzentration 10~³ oder 10"⁴M) und 0,4 ml Komplement (1:140) in dieser Reihenfolge. Man

inkubiert die Mischung 10 Minuten bei 37°C. Die Reaktion wird abgebrochen, indem man 2,7 ml einer eiskalten Citrat-Kochsalzlösung zusetzt Die erhaltene Mischung wird 3 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert Die Absorption der überstehenden Flüssigkeit wird bei

541 nm gemessen. Als Standard nimmt man anstelle der Probelösung GVB²⁺ (Gelatine-Veronalpuffer), und als Kontrolle nimmt man austeile des Komplements GVB²⁺.

Die antihämolytische Aktivität jeder Verbindung wird berechnet, wobei man die Absorption des Standards als 100*/· ansetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt

Tabelle 5

Verbi^iung	Inhibierung (%)	10"4 M.
Nr.	ICT3 M.	30,0
73	69,1	33,0
76		49,3
54		30,0
68

(D) Wirkung auf Masugi Nephritis

Der Einfluß der Verbindung Nr. 73 auf Masugi Nephritis wurde nach der Methode von Shibata et al. (S. Shibata: Men-ekigaku, Arerugi-gaku Jikkenho (Immunology, Experimental Methods in Allergology), Seite 664, [1971], Bunkodo, Tokio) untersucht

Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von ungefähr 200 g werden in eine Normalgruppe, eine erkrankte Gruppe und eine behandelte Gruppe zu jeweils 7 Ratten eingeteilt. Zur Induzierung von Nephritis verabreicht man intravenös 0,5 ml eines Anti-»Rattennephritis«-Kaninchenserums, das nach der Methode von Shibata et al. hergestellt wurde, an Ratten der erkrankten und der behandelten Gruppe. Der normalen

Gruppe verabreicht man intravenös dieselbe Menge an physiologischer Kochsalzlösung.

Man verabreicht dreimal die untersuchte Verbindung intraperitoneal an die Ratten der behandelten Gruppe, und zwar 2 Tage vor, einen Tag vor und am Tag der Verabreichung des Antiserums. Von den Ratten einer jeden Gruppe werden 24stündige Urinproben am Tag vor der Verabreichung des Antiserums und am ersten, zweiten, fünften, achten und dreizehnten Tag nach der Verabreichung des Antiserums gesammelt. Der Proteingehalt der Urinproben wird durch die Sulfosalicylsäuremethode bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.

Die akute Toxizität der Verbindung Nr. 73 bei intraperitonealer Verabreichung an Mäuse wird zu LD₅₀ = 129 mg/kg bestimmt.

Tabelle 6

Wirkung von Verbindung Nr. 73 auf Masugi Nephritis bei Ratten

Dosis mg/kg	Tage nach Verabreichung des (Protein mg/Tag)	1	8,3	2	S	Antiserums i.v.	14,9	13
	Tag -1	67,9	14,4	12,7	g	126,3	11,9
Normal	5,7	34,0	66,5	78,2	76,3	127,5
t	8,2	41,1	42,5	45,6	63,3	115,5
12,5	6,0	33,9	39,4	71,5
25,0	4,2

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   1, Amino- oder Guanidino-phenylpropionsäureesterdenvate der allgemeinen Formel I:

   COO-R¹

   worin R für

   R¹

   O)