KR102646848B1 - 세포막에서 칼슘을 표지할 수 있는 이광자 청색 표지자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포내 소기관 특이적 이광자 형광 프로브에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포 내 소기관 중에서도 세포막(원형질막)을 타겟하여 형광신호를 통해 칼슘 이온(Ca2+)을 선택적으로 검출할 수 있는 청색 발광 이광자 프로브, 이의 제조방법과 상기 이광자 프로브를 이용하여 세포막에 위치한 칼슘 이온을 이미징하는 방법 및 칼슘 이온의 분포 또는 농도의 변화를 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 세포내 특정 소기관(organelles)을 타겟하여 검출 대상 이온을 표지할 수 있는 이광자 형광 프로브(표지자)에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 세포막(plasma membrane, 원형질막)을 타겟하는 칼슘 이온 검출용 청색 발광 이광자 프로브, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 세포막에 위치한 칼슘 이온을 이미징하는 방법에 관한 것이다.
Ca2+은 생체내에서 신호 전달, 세포외유출, 세포자멸사, 전사, 근육 수축 및 뼈 형성 등 여러 중요한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. Ca2+ 신호 전달의 결함은 신경변성, 근육 결함, 심장병 및 피부 질환과 같은 질병을 유발할 수 있다. 칼슘(Ca) 이온은 세포외 공간이나 소포체 및 미토콘드리아와 같은 내부 Ca2+ 저장소에서 세포질로 들어간다. 유리(free) Ca2+의 농도는 세포외 공간에서 ~1mM인 반면, 세포질, 소포체 및 미토콘드리아에서는 각각 0.1-1μM, 0.1-1mM 및 0.1-20μM이다. 신호는 Ca2+가 세포 내 저장소에서 방출되거나 이온 채널을 통해 세포로 들어갈 때 촉발된다.
Fluo-4, Fura-2, Rhod-2 또는 Calcium Green-1과 같은 형광 프로브를 사용한 형광 이미징(fluorescence imaging)은 세포에서 Ca2+ 생물학을 연구하는 가장 일반적인 방법이다. 그러나 이러한 프로브는 상대적으로 짧은 여기 파장(350-500nm)을 필요로 하므로 제한된 침투 깊이(<80μm) 및 자가형광으로 인해 조직 이미징에 적합하지 않다. 이광자(two-photon; TP) 현미경(two-photon microscopy; TPM)은 500 μm 이상의 깊이에서 살아있는 조직의 장기 이미징을 가능하게 하기 때문에 이러한 단점을 극복할 수 있다.
이광자 현미경은 현재 널리 사용되고 있는 단일광자 현미경(one-photon microscopy)에 비하여 공간 분해능이 높고, 광표백 현상이 적으며, 광독성이 적은 장점이 있다. 이러한 이점들은 이광자 흡수율 (two-photon absorption)이 크고, 양자 효율(quantum yield)이 높은 이광자 표지자 (two-photon fluorescent probe)를 함께 사용할 때 더욱 두드러지며, 살아있는 세포 및 조직 안에서 일어나는 생명현상에 대한 3차원 실시간 영상을 얻는데 유리하다. 그러나 현재까지 개발된 이광자 표지자의 수가 적어서 이광자 현미경을 이용하여 다양한 생명현상을 관찰할 수 없었다.
특히, 살아있는 조직에서 한 세포 소기관에서 다른 세포 소기관으로의 Ca2+ 전달을 모니터링하기 위한 다색 이미징에 적합한 세포 소기관 특이적 Ca2+ TP 프로브의 개발이 시급히 필요한 실정으로, 기존에 Ca2+에 대한 몇 가지 TP 프로브가 개발되었지만 상기와 같은 목적을 실현하기 위한 다색 이미징에 적합한 Ca2+ TP 프로브를 개발하려는 시도는 진행된 바 없었다. 또한 Ca2+에 대한 청색 방출 TP 프로브는 거의 없다.
이에, 본 발명자들은 생체 내 Ca2+를 검출할 수 있는 청색광 이광자 프로브를 개발하기 위하여 연구한 결과, 벤즈옥사졸 유도체 및 칼슘 농도 변화를 측정하기에 적합한 칼슘 이온 수용체를 결합하여 Ca2+ 이광자 프로브를 합성하였으며, 상기 청색 발광 이광자 형광 프로브가 세포내 특정 소기관 내 칼슘 이온과 결합함에 따라서 이광자 여기 형광이 증가됨으로써, 세포 내 소기관 특이적으로 칼슘 이온 변화를 실시간으로 측정할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 세포내 특정 소기관을 타겟하여 형광신호를 통해 칼슘을 검출할 수 있는 청색 발광 이광자 프로브 화합물, 이의 제조방법, 상기 화합물을 포함하는 생체 세포 또는 조직의 칼슘 이온 검출용 이광자 형광 프로브 조성물 및 상기 화합물을 이용하여 생체 세포 또는 조직 내 칼슘 이온을 이미징하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서 Y는 K, CH3 또는 CH2OC(O)CH3 이고, X는 H, OH 또는 O(CH2)5CH3 이다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물을 포함하는 생체 세포 또는 조직의 칼슘 이온 검출용 이광자 형광 프로브 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물을 생체로부터 분리된 세포 또는 조직에 주입하는 단계; 상기 생체로부터 분리된 세포 또는 조직에 여기원(excitation source)을 조사하는 단계; 및 이광자 현미경으로 상기 이광자 형광 프로브 화합물로부터 발생하는 형광을 관측하는 단계;를 포함하는, 칼슘 이온을 이미징하는 방법을 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물의 제조방법을 제공한다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
상기 화학식 1, 2 또는 3에서 각각 Y는 K, CH3 또는 CH2OC(O)CH3 이고, X는 H, OH 또는 O(CH2)5CH3 이고, R1은 CO2C(CH3)3 또는 CO2H 이고, L은 H 또는 NH2 이다.
본 발명의 칼슘 이온 검출용 청색 발광 이광자 프로브는, 세포내 특정 소기관(organelles)을 타겟하여 검출 대상 이온을 선택적으로 이미징할 수 있는 이광자 형광 프로브(표지자)로서, 세포막(원형질막)에 위치한 칼슘 이온에 대한 선택성이 매우 높으며, 낮은 세포독성, 높은 광안정성, 및 pH 독립성을 보유한 이광자 프로브를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포막을 타겟하는 칼슘 이온 검출용 청색 발광 이광자 프로브는 살아있는 세포 및 조직의 세포막 내 칼슘 이온을 실시간으로 이미징이 가능하므로, 생체 내 칼슘 이온 분포 또는 농도 변화를 모니터링하는데 유용할 할 수 있다.
도 1은 질량 분석 및 액체 크로마토그래피에 의해 BCa-2mito의 순도를 분석한 결과를 나타낸 것이다: (a) 총 이온 크로마토그램(TIC, 상단) 및 254 nm에서의 UV 크로마토그램(하단), (b) 상기 (a)의 TIC (상단 패널) 및 UV (하단 패널)의 크로마토그램의 확대 결과, (c) 피크 1, 2 및 3의 ESI 포지티브 모드에서 질량 스펙트럼 및 (d) HPLC 조건 및 UV 피크의 적분 표.
도 2는 수성 완충액(pH 7.4)에서 (a) BCa-1, (b) BCa-2mito, (c) BCa-3°mem 및 (d) FHEt-1 lyso의 흡수 스펙트럼 및 수성 완충액(pH 7.4)에서 (e) 353 nm (BCa-1), (f) 358 nm (BCa-2mito), (g) 350 nm (BCa-3°mem) 또는 (h) 359 nm (FHEt-1 lyso)에서의 프로브 농도 대비 흡광도 플롯을 나타낸 그래프이다.
도 3은 수성 완충액(pH 7.2)에서 (a) BCa-1, (b) BCa-2mito, (c) BCa-3°mem 및 (d) FHEt-1 lyso 의 형광 스펙트럼 및 수성 완충액(pH 7.2)에서 (e) BCa-1, (f) BCa-2mito, (g) BCa-3°mem 또는 (h) FHEt-1 lyso 의 농도 대비 형광 강도를 나타낸 플롯이다.
도 4는 BCa-1-AM, BCa-2 mito-AM, BCa-3mem 및 FHEt-1 lyso로 표지된 Hela 세포에 대하여 여기 파장 750 nm에서의 정규화된 TPEF 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 5는 HeLa 세포(검은색 곡선) 또는 수성 완충액(빨간색 곡선)에서 (a) BCa-1, (b) BCa-2mito, (c) BCa-3mem 및 (d) FHEt-1 lyso에 대한 정규화된 형광 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 6은 CB에서 0-39 μM 유리(free) Ca2+ 존재 하에서 BCa-1의 (a) 형광 스펙트럼 및 (b) Ca 이온과의 착물화에 대한 형광 적정곡선; CB에서 0-2.5 mM 유리 Ca2+ 존재 하에서 BCa-2 mito의 (c) 형광 스펙트럼 및 (d) Ca 이온과의 착물화에 대한 형광 적정곡선; CB에서 0-5 mM 유리 Ca2+ 존재 하에서 BCa-3°mem의 (e) 형광 스펙트럼 및 (f) Ca 이온과의 착물화에 대한 형광 적정곡선; 및 UB 에서 pH 4.3-11의 조건에서 FHEt-1 lyso 의 (g) 형광 스펙트럼 및 (h) pH에 따른 양성자화에 대한 형광 적정 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 7은 CB에서 (a) 0-39 μM 유리(free) Ca2+ 존재 하에서 BCa-1; (b) 0-2.5 mM 유리 Ca2+ 존재 하에서 BCa-2 mito; 및 (c) 0-5 mM 유리 Ca2+ 존재 하에서 BCa-3°mem;의 이광자(TP) 형광 스펙트럼, (d) UB 에서 pH 4.3-11의 조건에서 FHEt-1 lyso의 TP 형광 스펙트럼, (e) CB에서 0-39 μM 유리 Ca2+ 존재 하에서 Ca2+와 BCa-1의 착물화에 대한 TP 형광 적정 곡선 및 (f) UB에서 pH 4.3-11에서 FHEt-1 lyso의 양성자화에 대한 TP 형광 적정 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 8은 MOPS 완충액 (30 mM 3-[N-morpholino]propanesulfonic acid, 100 mM KCl, pH 7.2)에서 2 mM Mg2+ 또는 100 μM Zn2+, Mn2+, Fe2+, Cu2+, 또는 Co2+의 존재 하(검은색 막대) 및 이 후 100 μM Ca2+의 첨가(빨간색 막대)에 따른 (a) BCa-1, (b) BCa-2mito 또는 (c) BCa-3°mem의 상대 형광 강도를 나타낸 그래프이다. 이때, 여기 파장은 각각 (a) 363 nm, (b) 355 nm 및 (c) 350 nm이다.
도 9는 수성 완충액(pH 4-10)에서 CaCl2 (2.5 mM; 빨간색 원) 및 EDTA (2.5 mM; 검은색 사각형)의 존재하에서 (a) BCa-1, (b) BCa-2mito 또는 (c) BCa-3°mem의 단일광자(one-photon) 형광 강도에 대한 pH의 영향을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 이때, 여기 파장은 각각 (a) 363 nm, (b) 355 nm 및 (c) 350 nm이다.
도 10은 수성 완충액에서 과량의 Ca2+의 존재 또는 부존재 하에서의 BCa-1, BCa-2 mito 및 BCa-3°mem 의 이광자 여기 스펙트럼 및 pH 4.3 또는 11에서의 FHEt-1 lyso의 이광자 여기 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 11은 (a) BCa-1-AM, (c) BCa-2mito-AM, (e) BCa-3mem 또는 (g) FHEt-1 lyso. 로 표지된 HeLa 세포의 이광자 현미경(TPM) 이미지(스케일 바: 20μm) 및 (b, d, f, h) 상기 각 이미지의 ROI1-ROI3에 대하여 시간의 함수로서 상대적 TPEF 강도를 나타낸 그래프이다. 이때, 디지털화된 형광 강도는 750 nm에서 여기 시 xyt 모드에서 1시간 동안 2초 간격으로 기록되었다.
도 12는 (a) BCa-1-AM, (b) BCa-2mito-AM, (c) BCa-3mem 또는 (d) FHEt-1 lyso 처리된 HeLa 세포에 대하여, CCK-8 분석을 통해 각 프로브의 처리 농도에 따른 2시간 또는 24시간 배양 후 HeLa 세포의 생존력을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 (a) BCa-2mito-AM 및 MitoTracker Red, (b) BLT-blue 및 FHEt-1 lyso, 또는 (c) BCa-1-AM 및 FHEt-1 lyso로 표지된 Hela 세포에 대하여 여기 파장 750 nm에서의 정규화된 TPEF 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 14는 실온에서 10분 동안 0.5 μM BCa-3mem (상단 패널) 또는 0.5 μM BCa-3°mem (하단 패널)로 표지된 Hela 세포의 TPM 이미지이다(스케일 바: 20 μm). 이미지는 750 nm에서 여기 시 60분 동안 10분 간격으로 캡처되었으며, 하단 이미지의 밝기는 상단 이미지 대비 100% 증가시켰다.
도 15는 BCa-3mem으로 표지된 Hela 세포에 대한 (a) TPM 이미지(스케일 바: 10μm) 및 (b) 상기 이미지의 ROI에 대하여 시간의 함수로서 상대적 TPEF 강도 변화를 나타낸 그래프이다. 이때, TPEF 데이터는 750 nm에서 여기 시 380-660 nm에서 측정되었다.
도 16은 BCa-1-AM으로 표지된 Hela 세포에 대한 (a) TPM 이미지(스케일 바: 20μm) 및 (b) 상기 이미지의 ROI에 대하여 시간의 함수로서 상대적 TPEF 강도 변화를 나타낸 그래프이다. 이때, TPEF 데이터는 750 nm에서 여기 시 380-660 nm에서 측정되었고, 그래프의 x 및 y 축은 형광 강도 변화의 30초 및 10%를 의미한다.
도 17은 (a) BCa-2 mito-AM 및 (b) MitoTracker Red로 공동 표지된 Hela 세포의 TPM 이미지 및 (c) 이들 이미지가 병합된 TPM 이미지;와 BCa-2 mito-AM으로 표지된 HeLa 세포의 (d) 0초 시점 및 (e) 1200초 시점에서의 TPM 이미지; 및 (f) BCa-2 mito-AM으로 표지된 HeLa 세포의 시간에 따른 ROI 1(미토콘드리아, 검은색 곡선) 및 ROI 2(세포질, 빨간색 곡선)의 TPEF 강도 변화를 나타낸 그래프이다. 이때, 상기 각 TPM 이미지는 750 nm에서 여기시 380-540 nm(a, d, e: BCa-2 mito-AM) 및 600-680 nm(b: MitoTracker Red)에서 캡처되었고, 스케일 바는 10 μm (a-c) 및 20 μm (d, e)이다.
도 18은 (a) BLT-blue 및 (b) FHEt-1 lyso로 표지된 Hela 세포의 TPM 이미지 및 (c) 이들 이미지가 병합된 TPM 이미지이다. 이때, 상기 각 TPM 이미지는 750 nm에서 여기시 380-480 nm (a: BLT-blue) 및 550-660 nm (b: FHEt-1 lyso)에서 캡처되었고, A 는 Pearson's colocalization coefficient이며, 스케일 바는 20 μm이다.
도 19는 BCa-1 및 FHEt-1 lyso으로 공동표지된 HeLa 세포의 (a, b) 0초 시점 및 (c, d) 700초 시점에서의 TPM 이미지; (e) 상기 (a) 및 (b)의 이미지가 병합된 TPM 이미지; 및 (f, g) 상기 (e)의 이미지의 ROI에 대하여 시간의 함수로서 TPEF 강도 변화를 나타낸 그래프이다. 이때, 100초에 모넨신(monensin)을 세포에 첨가하였으며, TPEF는 750 nm에서 여기 시 380-480 nm(a, c: BCa-1) 및 550-660 nm(b, d: FHEt-1 lyso)에서 측정되었고, 스케일 바는 10 μm이다.
도 20은 BCa-1-AM and FHEt-1 lyso로 공동 표지된 쥐 해마 슬라이스의 (a) 90-140 μm 깊이(10× 배율)에서의 이중색상 단면 TPM 이미지; (b) 상기 (a) 패널의 100 μm 깊이에서의 이중색상 단면 TPM 이미지; 상기 (b) 패널의 흰색 직사각형 영역을 확대한 (c) 380-480 nm(세포질) 및 (d) 550-660 nm(리소좀)에서 촬영한 이미지; (e) 상기 (c)및 (d)의 이미지를 병합한 이미지; BCa-2 mito-AM으로 표지된 쥐 해마 슬라이스에 대하여 100 μm 깊이에서 (f) 100× 배율 또는 (g) 100× 배율을 4×줌으로 캡쳐한 TPM 이미지; BCa-3mem으로 표지된 쥐 해마 슬라이스에 대하여 100 μm 깊이에서 (h) 100× 배율 또는 (i) 100× 배율을 4×줌으로 캡쳐한 TPM 이미지;이다. 이때, 각 이미지는 750 nm에서 여기시 촬영하였으며, 스케일 바는 (b) 100 μm, (c-e, g, i) 5 μm 및 (f, h) 20 μm이다.
도 21은 (a) BCa-2mito-AM 또는 (b) BCa-3mem로 표지된 쥐 해마 슬라이스의 90-140 μm 깊이(10× 배율)에서의 단면 TPM 이미지이다. 이때, 상기 이미지는 750 nm에서 여기 시 380-660 nm에서 방출을 측정하여 나타내었다.
도 22는 BCa-3mem의 1H NMR 스펙트럼(500 MHz, DMSO-d 6 /CD3CN at 9:1) 및 13C NMR 스펙트럼(75 MHz, DMSO-d 6 ) 이다.
도 23은 BCa-3°mem의 1H NMR 스펙트럼(500 MHz, DMSO-d 6 ) 및 13C NMR 스펙트럼(151 MHz, DMSO-d 6 ) 이다.
도 2는 수성 완충액(pH 7.4)에서 (a) BCa-1, (b) BCa-2mito, (c) BCa-3°mem 및 (d) FHEt-1 lyso의 흡수 스펙트럼 및 수성 완충액(pH 7.4)에서 (e) 353 nm (BCa-1), (f) 358 nm (BCa-2mito), (g) 350 nm (BCa-3°mem) 또는 (h) 359 nm (FHEt-1 lyso)에서의 프로브 농도 대비 흡광도 플롯을 나타낸 그래프이다.
도 3은 수성 완충액(pH 7.2)에서 (a) BCa-1, (b) BCa-2mito, (c) BCa-3°mem 및 (d) FHEt-1 lyso 의 형광 스펙트럼 및 수성 완충액(pH 7.2)에서 (e) BCa-1, (f) BCa-2mito, (g) BCa-3°mem 또는 (h) FHEt-1 lyso 의 농도 대비 형광 강도를 나타낸 플롯이다.
도 4는 BCa-1-AM, BCa-2 mito-AM, BCa-3mem 및 FHEt-1 lyso로 표지된 Hela 세포에 대하여 여기 파장 750 nm에서의 정규화된 TPEF 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 5는 HeLa 세포(검은색 곡선) 또는 수성 완충액(빨간색 곡선)에서 (a) BCa-1, (b) BCa-2mito, (c) BCa-3mem 및 (d) FHEt-1 lyso에 대한 정규화된 형광 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 6은 CB에서 0-39 μM 유리(free) Ca2+ 존재 하에서 BCa-1의 (a) 형광 스펙트럼 및 (b) Ca 이온과의 착물화에 대한 형광 적정곡선; CB에서 0-2.5 mM 유리 Ca2+ 존재 하에서 BCa-2 mito의 (c) 형광 스펙트럼 및 (d) Ca 이온과의 착물화에 대한 형광 적정곡선; CB에서 0-5 mM 유리 Ca2+ 존재 하에서 BCa-3°mem의 (e) 형광 스펙트럼 및 (f) Ca 이온과의 착물화에 대한 형광 적정곡선; 및 UB 에서 pH 4.3-11의 조건에서 FHEt-1 lyso 의 (g) 형광 스펙트럼 및 (h) pH에 따른 양성자화에 대한 형광 적정 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 7은 CB에서 (a) 0-39 μM 유리(free) Ca2+ 존재 하에서 BCa-1; (b) 0-2.5 mM 유리 Ca2+ 존재 하에서 BCa-2 mito; 및 (c) 0-5 mM 유리 Ca2+ 존재 하에서 BCa-3°mem;의 이광자(TP) 형광 스펙트럼, (d) UB 에서 pH 4.3-11의 조건에서 FHEt-1 lyso의 TP 형광 스펙트럼, (e) CB에서 0-39 μM 유리 Ca2+ 존재 하에서 Ca2+와 BCa-1의 착물화에 대한 TP 형광 적정 곡선 및 (f) UB에서 pH 4.3-11에서 FHEt-1 lyso의 양성자화에 대한 TP 형광 적정 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 8은 MOPS 완충액 (30 mM 3-[N-morpholino]propanesulfonic acid, 100 mM KCl, pH 7.2)에서 2 mM Mg2+ 또는 100 μM Zn2+, Mn2+, Fe2+, Cu2+, 또는 Co2+의 존재 하(검은색 막대) 및 이 후 100 μM Ca2+의 첨가(빨간색 막대)에 따른 (a) BCa-1, (b) BCa-2mito 또는 (c) BCa-3°mem의 상대 형광 강도를 나타낸 그래프이다. 이때, 여기 파장은 각각 (a) 363 nm, (b) 355 nm 및 (c) 350 nm이다.
도 9는 수성 완충액(pH 4-10)에서 CaCl2 (2.5 mM; 빨간색 원) 및 EDTA (2.5 mM; 검은색 사각형)의 존재하에서 (a) BCa-1, (b) BCa-2mito 또는 (c) BCa-3°mem의 단일광자(one-photon) 형광 강도에 대한 pH의 영향을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 이때, 여기 파장은 각각 (a) 363 nm, (b) 355 nm 및 (c) 350 nm이다.
도 10은 수성 완충액에서 과량의 Ca2+의 존재 또는 부존재 하에서의 BCa-1, BCa-2 mito 및 BCa-3°mem 의 이광자 여기 스펙트럼 및 pH 4.3 또는 11에서의 FHEt-1 lyso의 이광자 여기 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 11은 (a) BCa-1-AM, (c) BCa-2mito-AM, (e) BCa-3mem 또는 (g) FHEt-1 lyso. 로 표지된 HeLa 세포의 이광자 현미경(TPM) 이미지(스케일 바: 20μm) 및 (b, d, f, h) 상기 각 이미지의 ROI1-ROI3에 대하여 시간의 함수로서 상대적 TPEF 강도를 나타낸 그래프이다. 이때, 디지털화된 형광 강도는 750 nm에서 여기 시 xyt 모드에서 1시간 동안 2초 간격으로 기록되었다.
도 12는 (a) BCa-1-AM, (b) BCa-2mito-AM, (c) BCa-3mem 또는 (d) FHEt-1 lyso 처리된 HeLa 세포에 대하여, CCK-8 분석을 통해 각 프로브의 처리 농도에 따른 2시간 또는 24시간 배양 후 HeLa 세포의 생존력을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 (a) BCa-2mito-AM 및 MitoTracker Red, (b) BLT-blue 및 FHEt-1 lyso, 또는 (c) BCa-1-AM 및 FHEt-1 lyso로 표지된 Hela 세포에 대하여 여기 파장 750 nm에서의 정규화된 TPEF 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 14는 실온에서 10분 동안 0.5 μM BCa-3mem (상단 패널) 또는 0.5 μM BCa-3°mem (하단 패널)로 표지된 Hela 세포의 TPM 이미지이다(스케일 바: 20 μm). 이미지는 750 nm에서 여기 시 60분 동안 10분 간격으로 캡처되었으며, 하단 이미지의 밝기는 상단 이미지 대비 100% 증가시켰다.
도 15는 BCa-3mem으로 표지된 Hela 세포에 대한 (a) TPM 이미지(스케일 바: 10μm) 및 (b) 상기 이미지의 ROI에 대하여 시간의 함수로서 상대적 TPEF 강도 변화를 나타낸 그래프이다. 이때, TPEF 데이터는 750 nm에서 여기 시 380-660 nm에서 측정되었다.
도 16은 BCa-1-AM으로 표지된 Hela 세포에 대한 (a) TPM 이미지(스케일 바: 20μm) 및 (b) 상기 이미지의 ROI에 대하여 시간의 함수로서 상대적 TPEF 강도 변화를 나타낸 그래프이다. 이때, TPEF 데이터는 750 nm에서 여기 시 380-660 nm에서 측정되었고, 그래프의 x 및 y 축은 형광 강도 변화의 30초 및 10%를 의미한다.
도 17은 (a) BCa-2 mito-AM 및 (b) MitoTracker Red로 공동 표지된 Hela 세포의 TPM 이미지 및 (c) 이들 이미지가 병합된 TPM 이미지;와 BCa-2 mito-AM으로 표지된 HeLa 세포의 (d) 0초 시점 및 (e) 1200초 시점에서의 TPM 이미지; 및 (f) BCa-2 mito-AM으로 표지된 HeLa 세포의 시간에 따른 ROI 1(미토콘드리아, 검은색 곡선) 및 ROI 2(세포질, 빨간색 곡선)의 TPEF 강도 변화를 나타낸 그래프이다. 이때, 상기 각 TPM 이미지는 750 nm에서 여기시 380-540 nm(a, d, e: BCa-2 mito-AM) 및 600-680 nm(b: MitoTracker Red)에서 캡처되었고, 스케일 바는 10 μm (a-c) 및 20 μm (d, e)이다.
도 18은 (a) BLT-blue 및 (b) FHEt-1 lyso로 표지된 Hela 세포의 TPM 이미지 및 (c) 이들 이미지가 병합된 TPM 이미지이다. 이때, 상기 각 TPM 이미지는 750 nm에서 여기시 380-480 nm (a: BLT-blue) 및 550-660 nm (b: FHEt-1 lyso)에서 캡처되었고, A 는 Pearson's colocalization coefficient이며, 스케일 바는 20 μm이다.
도 19는 BCa-1 및 FHEt-1 lyso으로 공동표지된 HeLa 세포의 (a, b) 0초 시점 및 (c, d) 700초 시점에서의 TPM 이미지; (e) 상기 (a) 및 (b)의 이미지가 병합된 TPM 이미지; 및 (f, g) 상기 (e)의 이미지의 ROI에 대하여 시간의 함수로서 TPEF 강도 변화를 나타낸 그래프이다. 이때, 100초에 모넨신(monensin)을 세포에 첨가하였으며, TPEF는 750 nm에서 여기 시 380-480 nm(a, c: BCa-1) 및 550-660 nm(b, d: FHEt-1 lyso)에서 측정되었고, 스케일 바는 10 μm이다.
도 20은 BCa-1-AM and FHEt-1 lyso로 공동 표지된 쥐 해마 슬라이스의 (a) 90-140 μm 깊이(10× 배율)에서의 이중색상 단면 TPM 이미지; (b) 상기 (a) 패널의 100 μm 깊이에서의 이중색상 단면 TPM 이미지; 상기 (b) 패널의 흰색 직사각형 영역을 확대한 (c) 380-480 nm(세포질) 및 (d) 550-660 nm(리소좀)에서 촬영한 이미지; (e) 상기 (c)및 (d)의 이미지를 병합한 이미지; BCa-2 mito-AM으로 표지된 쥐 해마 슬라이스에 대하여 100 μm 깊이에서 (f) 100× 배율 또는 (g) 100× 배율을 4×줌으로 캡쳐한 TPM 이미지; BCa-3mem으로 표지된 쥐 해마 슬라이스에 대하여 100 μm 깊이에서 (h) 100× 배율 또는 (i) 100× 배율을 4×줌으로 캡쳐한 TPM 이미지;이다. 이때, 각 이미지는 750 nm에서 여기시 촬영하였으며, 스케일 바는 (b) 100 μm, (c-e, g, i) 5 μm 및 (f, h) 20 μm이다.
도 21은 (a) BCa-2mito-AM 또는 (b) BCa-3mem로 표지된 쥐 해마 슬라이스의 90-140 μm 깊이(10× 배율)에서의 단면 TPM 이미지이다. 이때, 상기 이미지는 750 nm에서 여기 시 380-660 nm에서 방출을 측정하여 나타내었다.
도 22는 BCa-3mem의 1H NMR 스펙트럼(500 MHz, DMSO-d 6 /CD3CN at 9:1) 및 13C NMR 스펙트럼(75 MHz, DMSO-d 6 ) 이다.
도 23은 BCa-3°mem의 1H NMR 스펙트럼(500 MHz, DMSO-d 6 ) 및 13C NMR 스펙트럼(151 MHz, DMSO-d 6 ) 이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 다색 이미징(imaging, 영상화)을 위한 Ca2+ 검출용 이광자(TP) 프로브(probe, 표지자)를 설계하기 위하여, 6-(benzo[d]oxazol-2-yl)-2-naphthalylamine (화합물 B)을 형광단(fluorophore)으로 사용 및 O,O′-bis(2-aminophenyl)ethyleneglycol-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (BAPTA) 및 2-(2′-morpholino-2′-oxoethoxy)-N,N-bis(hydroxycarbonylmethyl)aniline (MOBHA) 유도체를 Ca2+ 수용체로 사용하여 Ca2+에 대한 소기관 특이적 청색 방출 TP 프로브(BCa-1-AM, BCa-2 mito-AM 및 BCa-3mem)를 개발하였으며, 제조된 상기 Ca2+ 검출용 TP 프로브들에 대하여 특정 소기관(각각 세포질, 미토콘드리아, 세포막) 및 칼슘 이온에 대한 높은 선택성을 가짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한편, BCa-3mem은 수용해도가 너무 낮아 수성 완충액에서 광물리학적 특성을 정확하게 측정할 수 없으므로, BCa-3mem을 모방하도록 BCa-3°mem을 추가로 설계하였다. 또한, 본 발명자들은 2-아세틸-7-아미노플루오렌(2-acetyl-7-aminofluorene; 화합물 F)을 녹색 방출 TP 형광단으로 사용하고 4-디에틸아미노페닐기(4-diethylaminophenyl group)를 H+ 수용체로 사용하여 리소좀 H+ 검출용 TP 프로브인 FHEt-1 lyso를 개발하였다.
이때, 상기 화합물 B 및 화합물 F는 각각 리소좀을 타겟하는 BLT-blue 및 미토콘드리아를 타겟하는 FMT-green으로부터 파생시켜 제조하였다. 상기 BLT-blue 및 FMT-green 트랙커(tracker)들은 각각 451 및 523 nm에서 최대 TP 여기 형광(TP excited fluorescence; TPEF)을 가지며, 2120× 및 1480×10-50 cm4s/photon (GM)의 높은 TP 작용 단면적 값(TP action cross-section values, Φδeff)을 갖는다. 이들 트랙커는 탐침으로 표지된 세포에 있는 두 소기관(organelles)의 이중 색상 이미징이 가능하다는 것을 기존 연구에서 확인한 바 있다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서 Y는 K, CH3 또는 CH2OC(O)CH3 이고, X는 H, OH 또는 O(CH2)5CH3 이다.
바람직하게는, 상기 Y는 K 또는 CH3 일 수 있고, K인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 [BCa-3mem] 또는 [BCa-3°mem]으로 표시되는 화합물일 수 있다:
[BCa-3mem]
[BCa-3°mem]
.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물은 칼슘 이온(Ca2+)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있고, 칼슘 이온과 반응하여 착물을 형성하는 것일 수 있으며, 칼슘 이온에 대한 형광 반응으로 청색 형광을 방출하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물은 세포막(plasma membrane, 원형질막) 내 칼슘 이온을 선택적으로 이미징하기 위한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물을 포함하는 생체 세포 또는 조직의 칼슘 이온 검출용 이광자 형광 프로브 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 칼슘 이온 검출용 이광자 형광 프로브 조성물은 세포막 내 칼슘 이온을 선택적으로 이미징하는 것일 수 있다. 상기 이미징의 깊이는 90 ~ 140㎛일 수 있다.
본 발명에 따른 칼슘 이온 검출용 이광자 형광 프로브 조성물은 하기 화학식 4, 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 화합물, MitoTracker Red, BLT-blue 및 FMT-green 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 형광 프로브 화합물을 추가로 더 포함하는 것일 수 있다:
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
상기 화학식 4 및 화학식 5에서 각각 Y는 K, CH3 또는 CH2OC(O)CH3 이고, 화학식 6에서 W는 NH(CH2)2N(CH3)2 또는 OCH3 이다. 바람직하게는, 상기 화학식 4 및 화학식 5에서 각각 Y는 K 또는 CH2OC(O)CH3 이고, 화학식 6에서 W는 NH(CH2)2N(CH3)2 일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 화학식 4로 표시되는 화합물은 하기 [BCa-1] 또는 [BCa-1-AM]으로 표시되는 화합물인 것일 수 있고, 상기 화학식 5로 표시되는 화합물은 하기 [BCa-2 mito] 또는 [BCa-2 mito-AM]으로 표시되는 화합물인 것일 수 있고, 상기 화학식 6으로 표시되는 화합물은 하기 [FHEt-1 lyso]로 표시되는 화합물인 것일 수 있다:
[BCa-1]
[BCa-1-AM]
[BCa-2 mito]
[BCa-2 mito-AM]
[FHEt-1 lyso]
.
상기 화학식 4로 표시되는 화합물(바람직하게는 [BCa-1] 및 [BCa-1-AM])은 세포질을 타겟하는 칼슘 이온 선택적 검출을 위한 청색 발광 이광자 프로브 화합물일 수 있고, 상기 화학식 5로 표시되는 화합물(바람직하게는 [BCa-2 mito] 또는 [BCa-2 mito-AM])은 미토콘드리아를 타겟하는 칼슘 이온 선택적 검출을 위한 청색 발광 이광자 프로브 화합물일 수 있고, 상기 화학식 6으로 표시되는 화합물(바람직하게는 [FHEt-1 lyso])은 리소좀을 타겟하는 수소 이온 선택적 검출을 위한 녹색 발광 이광자 프로브 화합물로서, 리소좀 내 pH 변화를 이미징하기 위한 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 추가로 화학식 4 내지 6으로 표시되는 화합물 중 1종 이상의 화합물을 포함하는 조성물일 수 있으며, 세포내 특정 소기관에 위치한 칼슘 이온(또는 칼슘 이온 및 수소 이온)을 동시에 이미징하기 위한 조성물로서, 예컨대, 세포막에 위치한 칼슘 이온과 함께 세포질 내 칼슘 이온, 미토콘드리아 내 칼슘 이온 및 리소좀에 위치한 수소 이온 중 1종 이상을 동시에 이미징하기 위한 것일 수 있고, 상기 각 세포 소기관 내 칼슘 이온 및/또는 수소 이온의 분포 또는 농도의 변화를 동시에 모니터링 하기 위한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물을 생체로부터 분리된 세포 또는 조직에 주입하는 단계; 상기 생체로부터 분리된 세포 또는 조직에 여기원(excitation source)을 조사하는 단계; 및 이광자 현미경으로 상기 이광자 형광 프로브 화합물로부터 발생하는 형광을 관측하는 단계;를 포함하는, 칼슘 이온을 이미징하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 칼슘 이온을 이미징하는 방법은 세포막을 타겟하여 세포막 내 칼슘 이온을 선택적으로 이미징하는 것일 수 있다. 상기 이미징의 깊이는 90 ~ 140㎛일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 칼슘 이온을 이미징하는 방법에 있어서, 상기 주입하는 단계는 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물 자체를 주입하는 것일 수 있고, 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물을 포함하는 조성물, 예컨데, 상기 칼슘 이온 검출용 이광자 형광 프로브 조성물을 주입하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 칼슘 이온을 이미징하는 방법을 이용하여 살아있는 세포 또는 조직내 칼슘 분포 또는 농도의 변화를 모니터링하는 것이 가능하며, 정성적 분석뿐만 아니라, 이를 정량적으로 측정하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물의 제조방법을 제공한다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
상기 화학식 1, 2 또는 3에서 각각 Y는 K, CH3 또는 CH2OC(O)CH3 이고, X는 H, OH 또는 O(CH2)5CH3 이고, R1은 CO2C(CH3)3 또는 CO2H 이고, L은 H 또는 NH2 이다.
바람직하게는, 상기 화학식 1에서 Y는 K 또는 CH3 이고, X는 O(CH2)5CH3 또는 H 이고, 화학식 2에서 X는 H 또는 OH 이고, R1은 CO2H 이고, 화학식 3에서 Y는 CH3 이고, L은 NH2 일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물의 제조방법에 있어서, 상기 화학식 2에서 X가 OH 인 경우, 상기 OH 를 O(CH2)5CH3 로 치환하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 화학식 3에서 Y가 CH3 인 경우, 상기 CH3 를 K 또는 CH2OC(O)CH3 으로 치환하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물은 하기 반응식 1을 포함하는 방법으로 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
[반응식 1]
상기 반응식 1에서, (a)는 화합물 2, Pd(OAc)2, CuI, Cs2CO3, Xphos, dimethylformamide (DMF), 120℃; (b)는 (i) trifluoroacetic acid, CH2Cl2, RT; (ii) HATU, (i-Pr)2NEt, H2N-MOBHA-Me, DMF, RT; (c)는 (i) Me(OCH2CH2)2OTs, K2CO3, DMF, 120℃; (ii) KOH, EtOH/dioxane, 0℃; (d)는 BrCH2OC(O)Me, (i-Pr)2NEt, MeCN/DMF, RT; (e)는 (i) BrCH2CH2CH2Br, K2CO3, DMF, 75℃; (ii) PPh3, MeCN, 90℃; (iii) KOH, EtOH/dioxane, RT; (f)는 n-C6H13Br, K2CO3, DMF, 80℃; (ii) KOH, EtOH/dioxane, 0℃; 및 (g)는 KOH, EtOH/dioxane, 0℃의 반응조건일 수 있고, 상기 반응식 1을 포함하는 방법으로 제조되는 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물은 상기 BCa-3mem 또는 BCa-3°mem일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 방법으로 제조된 Ca2+에 대한 소기관 특이적 청색 방출 TP 프로브(BCa-1-AM, BCa-2 mito-AM 및 BCa-3mem)들이 과량의 Ca2+의 존재 하에서 750 nm에서 350-358 nm의 최대 흡수(λmax), 464-466 nm의 최대 방출(λfl), 55-70×10-50 cm4s/photon의 TP 작용 단면적(Φδmax) 값을 나타냄을 확인하였고, 각각 세포질, 미토콘드리아 및 세포막(원형질막)에서 Ca2+를 검출하는 데 적절한 값인 0.18, 2.7 및 100μM의 해리 상수를 가지고 있음을 확인하였으며, 특히, BCa-3mem를 사용하여 살아있는 세포와 조직의 세포막에 위치한 Ca2+의 실시간 검출을 용이하게 할 수 있음을 TP 현미경 분석을 통해 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
준비예 1. 기구 및 재료
1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼은 Varian 300(1H NMR의 경우 300MHz 및 13C NMR의 경우 75MHz) 및 Bruker Avance III 500 및 600(1H NMR의 경우 500 및 600MHz 및 13C NMR의 경우 151 MHz) 분광계에서 CDCl3, (CD3)2SO, CD3OD, 또는 CD3CN 을 용매 및 내부참조[CDCl3: δ H 7.26, δ C 77.0; (CD3)2SO: δ H 2.50, δ C 39.51; CD3CN: δ H 1.94, δ C 1.39]로 사용하여 측정하였다.
고분해능 질량 스펙트럼(HRMS)은 AB SCIEX Triple TOF® 5600 plus (BCa-1, BCa-2 mito-AM, BCa-3mem, BCa-3°mem 및 FHEt-1 lyso 용) 및 Thermo Scientific Q Exactive (BCa-1-AM and BCa-2 mito 용) 질량 분석기를 통해 분석하였다.
모든 화학 시약은 상업적 공급업체에서 구입했으며 달리 명시되지 않는 한 추가 정제 없이 사용하였다.
실시예 1. 이광자 프로브의 제조
화합물 3°, 화합물 C2, BAPTA-Me, BAPTA-F-Me 및 MOBHA-Me는 종래기술에 따라 합성하였다[Analytical Chemistry (2012) 84:8110-8113, Angewandte Chemie International Edition (2013) 52:3874-3877, Nature Chemical Biology (2007) 3:423-431]. 다른 화합물의 합성은 하기 반응식 1-1 및 반응식 1-2에 나타내었다.
먼저, BCa-1, BCa-1-AM, BCa-2 mito, BCa-2 mito-AM, BCa-3mem 및 BCa-3mem는 하기 반응식 1-1의 방법으로 합성하였다.
[반응식 1-1]
간략하게, 화합물 3은 화합물 1 및 화합물 2를 결합하여 70% 수율로 제조되었다. 화합물 3을 가수분해한 후 수용체 부분(BAPTA-Me, BAPTA-F-Me 또는 MOBHA-Me)과 결합하여 화합물 4 내지 화합물 7을 65%-89%의 수율로 합성하였다. 화합물 4 내지 화합물 7은 소기관 표적 부분(moiety) 중 하나의 도입 및 에스테르 그룹의 가수분해를 통해 47%-72% 수율로 BCa-1, BCa-3mem, BCa-3°mem 및 BCa-2 mito를 제조하였다. BCa-1 및 BCa-2 mito는 각각 BrCH2OC(O)Me와 반응시켜 28% 및 29% 수율로 BCa-1-AM 및 BCa-2 mito-AM을 제조하였다. 워크업 동안 생성물이 천천히 분해되기 때문에 미정제 생성물(고성능 액체 크로마토그래피에 따른 순도 97%)을 추가 실험에 사용했다(도 1).
한편, FHEt-1 lyso는 9-메틸플루오렌(9-methylfluorene)으로부터 하기 반응식 2-1의 방법으로 제조하였다.
[반응식 2-1]
간략하게, 9-메틸플루오렌과 BuLi을 반응시킨 후 이어서 메틸 브로모아세테이트(methyl bromoacetate), 니트로화(nitration) 및 아실화(acylation)를 사용한 알킬화(alkylation) 과정을 통해 화합물 8을 전체의 41% 수율로 얻었다. 니트로기(nitro group)의 환원 반응 및 아미노기(amino group)와 화합물 A의 반응을 통해 화합물 9를 46% 수율로 얻었다. 에스테르기(ester group) 가수분해 후 4-디에틸아미노아닐린(4-diethylaminoaniline)과의 결합을 통해 40% 수율로 FHEt-1 lyso를 제조하였다.
상기 반응식 1-1 및 1-2의 각 화합물의 구조 및 구체적인 합성 과정은 하기에 나타내었다.
1-1. 화합물 1(Compound 1)의 제조
MeCN (60 mL) 중의 6-브로모-2-아미노나프탈렌(6-bromo-2-aminonaphthalene; 6.7 g, 30 mmol), K2CO3 (12.4 g, 90 mmol) 및 BrCH2CO2Bu-t (8.8 g, 45 mmol)의 용액을 12시간 동안 환류시켰다. 혼합물을 실온(room temperature, RT)으로 냉각시키고, 증류수로 희석한 다음 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 추출하였다. 유기층(organic layer)을 염수(brine)로 세척하고, 무수(anhydrous) Na2SO4로 건조시킨 다음, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이동상(mobile phase)으로 헥산/에틸아세테이트(hexane/EtOAc; 3:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 통해 정제하여 백색 고체 상태의 화합물 1(수율 7.8 g, 78%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.82 (1 H, d, J = 2.0 Hz), 7.54 (1 H, d, J = 8.8 Hz), 7.47 (1 H, d, J = 8.7 Hz), 7.42 (1 H, dd, J = 8.7, 2.0 Hz), 6.94 (1 H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz), 6.67 (1 H, d, J = 2.4 Hz), 4.56 (1 H, br s), 3.89 (2 H, s), 1.51 (9 H, s) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 169.9, 145.0, 133.5, 129.6, 129.5, 128.7, 128.1, 127.6, 118.8, 115.3, 104.4, 82.2, 46.3, 28.0(3) ppm.
1-2. 화합물 2(Compound 2)의 제조
CH2Cl-2 (200 mL) 중의 5-히드록시벤족사졸(5-hydroxybenzoxazole; 9.0 g, 67 mmol), t-부틸디메틸실리클로라이드(t-butyldimethylsily chloride, TBDMS-Cl; 12.1 g, 80 mmol), 이미다졸(imidazole; 0.45 g, 6.7 mmol), 및 Et3N (8.1 g, 80 mmol)을 포함하는 용액을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 혼합물에 증류수를 첨가하고, 생성물을 CH2Cl-2로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고 무수 MgSO4로 건조시킨 다음 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이동상(mobile phase)으로 헥산/EtOAc (3:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 통해 정제하여 담황색 오일 상태의 화합물 2(수율 15.7 g, 94%)를 수득하였다..
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.03 (1 H, s), 7.39 (1 H, d, J = 8.8 Hz), 7.22 (1 H, d, J = 2.4 Hz), 6.89 (1 H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz), 0.99 (9 H, s), 0.20 (6 H, s) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 153.2, 152.9, 145.0, 140.8, 118.7, 110.7, 110.7, 25.6(3), 18.2, -4.6(2) ppm.
1-3. 화합물 3(Compound 3)의 제조
화합물 1 (1.1 g, 3.3 mmol), 화합물 2 (1.3 g, 5.0 mmol), Cs2CO3 (1.3 g, 5.0 mmol), CuI (0.13 g, 0.67 mmol), Xphos (0.16 mg, 0.33 mmol) 및 Pd(OAc)2 (0.036 g, 0.16 mmol)를 아르곤(Ar) 분위기에서 DMF (10 mL)에 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 120℃에서 3시간동안 교반하고, 실온으로 냉각시킨 후, CH2Cl-2로 희석하고, 10분 동안 교반하였다. 그 다음 셀라이트 패드(Celite pad)를 통해 여과하고 CH2Cl-2로 세척했습니다. 여액(filtrate)을 증발시키고, 잔류물을 이동상으로 헥산/EtOAc(1:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 담황색 고체 상태의 화합물 3(수율 0.90 g, 70%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CD3OD/CDCl3 at 1:4): δ 8.48 (1 H, d, J = 1.7 Hz), 8.04 (1 H, dd, J = 8.8, 1.7 Hz), 7.73 (1 H, d, J = 8.8 Hz), 7.66 (1 H, d, J = 8.8 Hz), 7.37 (1 H, dd, J = 8.8 Hz), 7.09 (1 H, d, J = 2.4 Hz), 6.99 (1 H, dt, J = 8.8, 2.4 Hz), 6.83 (1 H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz), 6.69 (1 H, d, J = 2.4 Hz), 3.91 (2 H, s), 1.47 (9 H, s) ppm; 13C NMR (75 MHz, CD3OD/CDCl3 at 1/4): δ 170.1, 164.4, 154.3, 146.5, 144.4, 142.1, 136.6, 130.0, 127.8, 126.6, 126.4, 123.9, 119.7, 118.6, 113.2, 110.3, 104.0, 103.8, 82.3, 45.8, 27.7(3) ppm.
1-4. 화합물 C1(Compound C1)의 제조
TFA 및 CH2Cl-2 (1:1, 20 mL)의 혼합물을 0℃에서 CH2Cl-2 (10 mL) 중의 화합물 3(3.0 g, 7.7 mmol)의 용액에 적가한 다음, 실온에서 밤새 교반하고, 디에틸 에테르(diethyl ether; 30 mL)를 첨가한 후 용매를 증발시켰다. 형성된 침전물을 디에틸 에테르에 재현탁시키고, 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하였다. 생성물(화합물 C1)은 암황색 고체 형태로 수득되었다(수율 2.3g, 89%).
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6): δ 9.51 (1 H, br s), 8.50 (1 H, d, J = 1.7 Hz), 8.01 (1 H, dd, J = 8.7, 1.7 Hz), 7.85 (1 H, d, J = 8.8 Hz), 7.71 (1 H, d, J = 8.7 Hz), 7.55 (1 H, d, J = 8.8 Hz), 7.15 (1 H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz), 7.07 (1 H, d, J = 2.4 Hz), 6.81 (1 H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz), 6.74 (1 H, d, J = 2.4 Hz), 3.97 (2 H, s) ppm; 13C NMR (75 MHz, DMSO-d 6): δ 172.3, 163.7, 155.0, 148.2, 144.0, 142.9, 136.7, 129.9, 127.5, 126.4, 125.9, 123.9, 119.2, 119.1, 113.2, 110.6, 104.6, 102.6, 44.5 ppm.
1-5. 화합물 4(Compound 4)의 제조
DMF (3.8 mL) 중의 화합물 C1 (0.42 g, 1.3 mmol), BAPTA-Me (0.65 g, 1.2 mmol) 및 (i-Pr)2NH (0.43 mL, 2.5 mmol)을 포함하는 용액에 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 (1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphate, HATU; 0.57 g, 1.5 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 증류수를 첨가하고 CH2Cl2로 생성물을 추출하였다. 유기층을 염수로 세척 하고 무수 Na2SO4로 건조시킨 다음 용매를 증발시켰다. 잔류물을 CH2Cl2/EtOAc (1:2)을 이동상으로 사용한 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여, 담황색 고체 상태의 화합물 C4(수율 1.0 g, 89%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CD3CN): δ 8.60 (1 H, br s), 8.55 (1 H, s), 8.09 (1 H, dd, J = 8.8, 1.8 Hz), 7.87 (1 H, d, J = 8.9 Hz), 7.75 (1 H, d, J = 8.8 Hz), 7.46 (1 H, d, J = 8.8 Hz), 7.26 (1 H, d, J = 2.3 Hz), 7.15 (1 H, dd, J = 8.9, 2.4 Hz), 7.12 (1 H, d, J = 2.4 Hz), 7.05 (1 H, dd, J = 8.7, 2.3 Hz), 7.03 (1 H, s), 6.82-6.92 (5 H, m), 6.74-6.79 (2 H, m), 5.52 (1 H, t, J = 5.9 Hz), 4.16-4.21 (4 H, m), 4.05 (4 H, s), 4.04 (4 H, s), 4.00 (2 H, d, J = 5.6 Hz), 3.50 (6 H, s), 3.48 (6 H, s) ppm; 13C NMR (75 MHz, CD3CN): δ 172.7(2), 172.6(2), 169.4, 165.2, 155.3, 151.0, 150.8, 148.6, 145.9, 144.2, 139.9, 137.8, 136.2, 133.9, 130.9, 128.4, 127.8, 127.6, 125.2, 122.6, 122.0, 121.5, 120.2, 119.6, 119.2, 113.9, 113.8, 113.1, 111.4, 106.4, 105.7, 104.8, 68.0, 67.8, 54.0(4), 52.1(4), 48.7 ppm.
1-6. 화합물 C3(Compound C3)의 제조
DMF (2.2 mL) 중의 화합물 4(0.57 g, 0.66 mmol), 2-(2-메톡시에톡시)에틸 4-메틸 벤젠설포네이트 (2-(2-methoxyethoxy)ethyl 4-methyl benzenesulfonate; 0.24 g, 0.86 mmol) 및 K2CO3 (0.14 g, 0.99 mmol)의 용액을 90℃에서 10시간동안 교반한 다음, 혼합물을 증류수로 희석하고 CH2Cl-2로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고 무수 MgSO4로 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이동상으로 EtOAc를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 황색 고체 상태의 화합물 C3(수율 0.56 g, 84%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.60 (1 H, s), 8.35 (1 H, s), 8.18 (1 H, dd, J = 8.7, 1.8 Hz), 7.83 (1 H, d, J = 8.9 Hz), 7.73 (1 H, d, J = 8.7 Hz), 7.45 (1 H, d, J = 8.8 Hz), 7.29 (1 H, d, J = 2.0 Hz), 7.25 (1 H, d, J = 1.8 Hz), 7.05 (1 H, dd, J = 8.9, 1.8 Hz), 6.96 (2 H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz), 6.81-6.92 (6 H, m), 6.77 (1 H, d, J = 8.7 Hz), 4.24-4.29 (4 H, m), 4.20--4.22 (2 H, m), 4.14 (4 H, s), 4.10 (4 H, s), 4.05 (2 H, s), 3.90-3.93 (2 H, m), 3.74-3.77 (2 H, m), 3.60-3.62 (2 H, m), 3.57 (6 H, s), 3.54 (6 H, s), 3.41 (3 H, s) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 171.9(2), 171.8(2), 168.2, 164.2, 156.1, 150.3, 150.1, 146.3, 145.2, 142.7, 139.0, 136.3, 135.6, 132.4, 130.2, 127.6, 127.1, 126.7, 124.4, 122.2, 121.3, 120.8, 118.9, 118.8, 118.4, 113.6, 112.7, 112.4, 110.3, 105.5, 105.0, 103.1, 71.8, 70.6, 69.7, 67.9, 67.0, 66.7, 59.0, 53.2(4), 51.6(4), 48.8 ppm.
1-7. BCa-1의 제조
디옥산(dioxane; 0.20 mL) 및 EtOH (0.30 mL) 중의 화합물 C3 (0.024 g, 0.025 mmol)의 용액에 0℃에서 교반하면서 KOH(aq) (1 N, 0.20 mL, 0.20 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반한 다음, HCl(aq) (1 N, 0.10 mL, 0.10 mmol)을 적가하였다. 10분 후, 혼합물을 MeCN (2 mL)을 함유하는 바이알(vial)에 적가하면서 교반하였다. 형성된 침전물을 여과하여 수득하고 디에틸 에테르로 세척하여, 황색 고체상태의 BCa-1(수율 0.018 g, 67%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6): δ 8.46 (1 H, s), 7.96 (1 H, d, J = 8.7 Hz), 7.82 (1 H, d, J = 8.9 Hz), 7.72 (1 H, d, J = 8.7 Hz), 7.55 (1 H, d, J = 8.7 Hz), 7.20 (1 H, d, J = 2.3 Hz), 7.09 (1 H, d, J = 8.9 Hz), 6.99 (1 H, br s), 6.95 (2 H, dd, J = 9.0, 2.3 Hz), 6.76-6.87 (7 H, m), 4.15-4.23 (4 H, m), 4.08-4.12 (2 H, m), 3.99 (2 H, s), 3.72-3.75 (2 H, m), 3.56-3.59 (2 H, m), 3.44-3.47 (2 H, m), 3.42 (4 H, s), 3.39 (4 H, s), 3.21 (3 H, s) ppm; 13C NMR (151 MHz, DMSO-d 6): δ 178.0(2), 177.9(2), 171.7, 165.6, 157.4, 151.3, 151.3, 149.1, 146.1, 143.0, 141.5, 138.6, 138.0, 133.7, 131.6, 129.1, 128.1, 127.6, 125.2, 123.9, 122.4, 120.5, 120.1, 119.6(2), 115.3, 114.7, 113.2, 112.6, 106.8, 104.7, 104.3, 72.3, 70.8, 70.2, 69.2, 67.4, 67.1, 59.4(4), 58.8(2) ppm. HRMS (electrospray ionization; ESI) m/z [M+K]+ calculated for C46H47KN5O15: 948.2701, found: 948.2706.
1-8. BCa-1-AM의 제조
MeCN (0.99 mL) 중의 BCa-1 (0.045 g, 0.049 mmol), 브로모메틸 아세테이트(bromomethyl acetate; 0.075 g, 0.49 mmol), 및 DIPEA (0.050 g, 0.39 mmol)의 용액을 실온에서 Ar 분위기하에 40시간 동안 교반하였다. 그 다음, 생성물을 CH2Cl-2로 추출하고 염수로 세척한 후, 무수 Na2SO4로 건조시키고 용매를 증발시켰다. 잔류물을 반분취 역상 고성능 액체 크로마토그래피(semi-preparative reverse-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC; YMC-PACK ODS-A, 5μm, 250× 20mm)를 통해 정제하였다. 이때, RP-HPLC는 20분 동안 10mL/min의 유속으로 0.1% 포름산을 포함하는 MeCN/H2O(1:1)를 사용하여 YMC HPLC 시스템(YMC LC-Forte/R 100)에서 수행하였다. 얻어진 생성물, BCa-1-AM은 황색 고체로, 수율은 0.016 g(28%)이었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.59 (1 H, s), 8.39 (1 H, s), 8.17 (1 H, d, J = 9.0 Hz), 7.82 (1 H, d, J = 9.0 Hz), 7.73 (1 H, d, J = 9.0 Hz), 7.44 (1 H, d, J = 9.0 Hz), 7.31 (1 H, d, J = 2.0 Hz), 7.25 (1 H, d, J = 2.1 Hz), 7.04 (1 H, dd, J = 9.0, 2.1 Hz), 7.00 (1 H, d, J = 8.5 Hz), 6.96 (1 H, d, J = 8.7 Hz), 6.93 (1 H, d, J = 8.5 Hz), 6.84-6.90 (4 H, m), 6.82 (1 H, d, J = 8.7 Hz), 5.64 (4 H, s), 5.60 (4 H, s), 4.82 (1 H, t, J = 5.4 Hz), 4.25-4.32 (4 H, m), 4.19-4.22 (2 H, m), 4.18 (4 H, s), 4.15 (4 H, s), 4.05 (2 H, d, J = 5.2 Hz), 3.89-3.91 (2 H, m), 3.74-3.77 (2 H, m), 3.59-3.62 (2 H, m), 3.41 (3 H, s), 2.05 (12 H, s) ppm; 13C NMR (151 MHz, CDCl3): δ 170.2(2), 170.0(2), 169.6(2), 169.5(2), 168.0, 164.3, 156.4, 150.8, 150.5, 146.2, 145.5, 143.0, 138.6, 136.4, 135.4, 132.9, 130.5, 127.8, 127.6, 126.9, 124.8, 123.0, 121.7, 121.5, 120.3, 119.8, 118.4, 113.9, 113.6, 112.9, 110.5, 106.4, 105.6, 103.7, 79.3(2), 79.2(2), 71.9, 70.8, 69.8, 68.2, 67.4, 67.0, 59.1, 53.4(2), 53.4, 53.3, 49.2, 20.7(2), 20.7(2) ppm. HRMS (ESI) m/z [M+Na]+ calcd for C58H63N5NaO23: 1220.3806, found: 1220.3807.
1-9. 화합물 5(Compound 5)의 제조
DMF (4 mL) 중의 화합물 C1 (0.40 g, 1.2 mmol), BAPTA-F-Me (0.68 g, 1.2 mmol) 및 (i-Pr)2NH (0.41 mL, 2.4 mmol)의 용액에 HATU (0.55 g, 1.4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 이어서 증류수를 첨가하고 CH2Cl2를 이용하여 생성물을 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이동상으로 CH2Cl2/EtOAc (1:2)을 사용하여 실라카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 담황색 고체 상태의 화합물 5(0.68 g, 65%)를 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.60 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.18 (dd, J = 8.8, 1.8 Hz, 1H), 8.18 (br s, 1H), 7.81 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.26 (br s, 1H), 7.20 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.05-6.97 (m, 2H), 6.92-6.83 (m, 4H), 6.72-6.65 (m, 2H), 4.39-4.35 (m, 2H), 4.30-4.26 (m, 2H), 4.17 (s, 4H), 4.14 (s, 4H), 4.03 (s, 2H), 3.66 (s, 6H), 3.63 (s, 6H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CD3OD/CDCl3 at 1/9): δ 171.9(2), 171.5(2), 168.4, 164.2, 156.4 (d, J = 245.1 Hz), 154.4, 150.6, 146.6, 144.6, 143.7 (d, J = 3.8 Hz), 142.3, 138.3 (d, J = 12.8 Hz), 136.5, 135.6, 132.3, 130.3, 127.8, 127.2, 126.8, 124.2, 123.6 (d, J = 9.7 Hz), 120.6, 119.8, 118.5, 114.7, 113.4, 112.5, 110.4, 109.9 (J = 19.8 Hz), 106.1, 104.9, 104.3, 71.3, 67.6, 53.4(4), 51.7(2), 51.6(2), 48.4 ppm.
1-10. 화합물 C4(Compound C4)의 제조
DMF (2.5 mL) 중의 화합물 5 (0.55 g, 0.62 mmol),1,3-디브로모프로판(1,3-dibromopropane; 0.31 mL, 3.1 mmol) 및 K2CO3 (0.34 g, 2.5 mmol)의 용액을 72℃에서 6시간 동안 교반하였다. 이어서 증류수를 첨가하고 CH2Cl2를 이용하여 생성물을 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이동상으로 EtOAc를 사용하여 실라카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 담황색 고체 상태의 화합물 C4(0.37 g, 60%)를 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.58 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.17 (dd, J = 8.8, 1.8 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.26 (br s, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.02 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 7.00-6.81 (m, 5H), 6.71-6.62 (m, 2H), 4.38-4.34 (m, 2H), 4.25-4.21 (m, 2H), 4.18-4.14 (m, 2H), 4.17 (s, 4H), 4.16 (s, 4H), 4.02 (s, 2H), 3.65 (s, 6H), 3.64 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.61 (s, 6H), 2.36 (p, J = 6.1 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 171.7(2), 171.3(2), 167.9, 164.4, 156.5 (d, J = 245.4 Hz), 156.3, 150.7, 146.4, 145.5, 143.8 (d, J = 3.7 Hz), 143.0, 138.4 (d, J = 12.6 Hz), 136.4, 135.6, 132.5, 130.4, 127.8, 127.4, 126.9, 124.6, 123.7 (d, J = 9.4 Hz), 121.2, 119.8, 118.4, 114.8, 113.6, 112.5, 110.5, 110.0 (d, J = 19.8 Hz), 106.2, 105.4, 103.6, 71.3, 67.7, 66.1, 53.4(4), 51.7(2), 51.6(2), 49.0, 32.3, 30.0 ppm.
1-11. 화합물 C5(Compound C5)의 제조
MeCN (2 mL) 중의 화합물 C4 (0.21 g, 0.21 mmol) 및 Ph3P (0.55 g, 2.1 mmol)의 용액을 90℃에서 12시간동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 이동상으로 CH2Cl2/MeOH (10:1)를 사용하여 실라카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 황색 고체 상태의 화합물 C5(0.11 g, 40%)를 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 9.46 (br s, 1H), 8.16 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.80 (dd, J = 8.9, 1.7 Hz, 1H), 7.77-7.66 (m, 9H), 7.67-7.58 (m, 6H), 7.47 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.08 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.91-6.81 (m, 2H), 6.72 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.69 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.66-6.60 (m, 3H), 6.23 (s, 1H), 4.34-4.29 (m, 2H), 4.21-4.11 (m, 8H), 4.11 (s, 4H), 4.01 (s, 2H), 3.86-3.76 (m, 2H), 3.60 (s, 6H), 3.59 (s, 6H), 2.08-2.02 (m, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 171.8(2), 171.3(2), 169.0, 164.2, 156.5 (d, J = 245.5 Hz), 155.3, 150.5, 147.1, 145.2, 143.8 (d, J = 3.9 Hz), 142.7, 138.4 (d, J = 12.9 Hz), 136.4, 135.2(3) (d, J = 3.0 Hz), 134.9, 133.6, 133.4(6) (d, J = 10.0 Hz), 130.5 (6) (d, J = 12.6 Hz), 129.7, 127.5, 126.6, 126.4, 123.9, 123.6 (d, J = 9.3 Hz), 119.8, 119.7, 119.0, 117.7 (3) (d, J = 86.4 Hz), 114.9, 112.4, 112.2, 110.2, 109.9 (d, J = 19.4 Hz), 105.8, 104.3, 103.6, 71.4, 67.5, 66.9 (d, J = 16.1 Hz), 53.4(4), 51.7(2), 51.5(2), 48.6, 22.8, 19.6 (d, J = 53.4 Hz) ppm.
1-12. BCa-2
mito
의 제조
dioxane (0.070 mL) 및 MeOH (0.21 mL) 중의 화합물 C5(0.022g, 0.017mmol)의 용액을 0℃에서 교반하면서 KOH(aq)(1N, 0.14mL, 0.14mmol)를 적가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하고, HCl(aq)(1 N, 0.070 mL, 0.070 mmol)을 적가하였다. 조 생성물(crude product; HPLC에 따른 순도 97%)을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
HRMS (ESI) m/z [M]+ calcd for C62H56FN5O13P+: 1128.3591, found: 1128.3587.
1-13. BCa-2
mito
-AM의 제조
MeCN (1.4 mL) 및 DMF (0.90 mL)중의 BCa-2 mito (0.089 g, 0.074 mmol), 브로모메틸 아세테이트(bromomethyl acetate; 0.28 g, 1.9 mmol) 및 DIPEA (0.19 g, 1.5 mmol)의 용액을 실온에서 Ar분위기 하에 72시간 동안 교반하였다. 생성물을 CH2Cl-2로 추출하고 염수로 세척한 후, 무수 Na2SO4로 건조시키고 용매를 증발시켰다. 잔류물을 20분 동안 10mL/min의 유속으로 0.1% 포름산을 포함하는 MeCN/H2O(1:1)를 이동상으로 사용하는 Yamazen MPLC system (Yamazen W-Prep 2XY)에서 중압 액체 크로마토그래피(medium-pressure liquid chromatography;Yamazen ODS-SM, 50 μm, 2.3 × 12.3 cm)를 수행하여 정제하였다. 얻어진 생성물, BCa-2mito-AM은 담황색 고체로, 수율은 0.032 g(29%)이었다.
1H NMR (500 MHz, CD3CN): δ9.15 (br s, 1H), 8.50 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 7.88-7.81 (m, 4H), 7.77-7.67 (m, 13H), 7.51 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.17 (dd, J = 8.9, 2.2 Hz, 1H), 7.12 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 1H), 6.97-6.91 (m, 2H), 6.86 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.77-6.70 (m, 2H), 5.89 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.62 (s, 4H), 5.60 (s, 4H), 4.33-4.29 (m, 2H), 4.22-4.11 (m, 12H), 4.02 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.49-3.42 (m, 2H), 2.13-2.06 (m, 2H), 1.97 (s, 6H), 1.96 (s, 6H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ170.0(2), 169.5(2), 169.4(2), 169.0(2), 166.9, 164.4, 156.6 (d, J = 245.3 Hz), 155.2, 150.8, 147.2, 145.3, 143.3 (d, J = 3.3 Hz), 142.9, 138.7 (d, J = 12.7 Hz), 136.6, 135.3(3) (d, J = 2.8 Hz), 134.3, 134.2, 133.2(6) (d, J = 9.9 Hz), 130.5(6) (d, J = 12.5 Hz), 129.8, 127.6, 126.5, 126.4, 124.0, 123.7 (d, J = 9.4 Hz), 120.4, 119.8, 118.9, 117.5(3) (d, J = 86.5 Hz), 115.3, 115.3, 112.4, 110.4 (d, J = 19.3 Hz), 110.3, 106.0, 104.1, 103.6, 79.0(4), 71.4, 67.6, 66.7 (d, J = 16.3 Hz), 53.3(4), 48.4, 22.6, 20.6(4), 19.3 (d, J = 53.8 Hz) ppm. HRMS (ESI) m/z [M]+ calcd for C74H72FN5O21P+: 1416.4436, found: 1416.4442.
1-14. 화합물 6(Compound 6)의 제조
DMF (6 mL)중의 화합물 C1 (0.68 g, 2.0 mmol), MOBHA-Me (0.76 g, 1.9 mmol), 및 (i-Pr)2NH (0.69 mL, 2.0 mmol)의 용액에 HATU (0.89 g, 2.3 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분동안 교반하였다. 혼합물에 증류수를 첨가하고 EtOAc로 추출한 다음, 유기층을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 생성물을 이동상으로 EtOAc/i-PrOH(98:2)를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여, 담황색 고체 상태의 화합물 6(수율 1.09 g, 78%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 /CD3CN at 1:5): δ 9.36 (s, 1H), 9.08 (s, 1H), 8.56 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.10 (dd, J = 8.8, 1.7 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.09 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 6.88 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.08 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 4.77 (s, 2H), 4.15 (s, 4H), 4.03 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 3.66-3.58 (m, 4H), 3.65 (s, 6H), 3.52-3.44 (m, 4H) ppm; 13C NMR (75 MHz, DMSO-d 6 /CD3CN at 1:5): δ 171.5(2), 168.5, 166.0, 164.0, 155.2, 149.6, 148.2, 144.4, 143.2, 136.9, 134.8, 133.6, 130.0, 127.5, 126.5, 126.5, 124.2, 120.0(2), 119.4, 113.2, 112.6, 110.4, 105.9, 104.7, 103.3, 66.3, 66.2, 66.0, 53.1(2), 51.3(2), 47.3, 45.0, 41.8 ppm.
1-15. 화합물 C6(Compound C6)의 제조
DMF (0.7 mL)에 용해된 화합물 6 (0.15 g, 0.21 mmol), 1,3-디브로모프로판(1,3-dibromopropane; 31 μL, 0.23 mmol) 및 K2CO3 (37 mg, 0.27 mmol)의 용액을 80℃에서 16시간동안 교반하였다. 이어서, 증류수를 첨가하고, EtOAc로 생성물을 추출한 다음, 유기층을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이동상으로 CH2Cl2/EtOAc (1:10)를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여, 백색 고체 상태의 화합물 C6(수율 0.14 g, 85%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.61 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.35 (br s, 1H), 8.19 (dd, J = 8.7, 1.7 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.25 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.05 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.94 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.74 (s, 2H), 4.12 (s, 4H), 4.05-3.99 (m, 4H), 3.67-3.64 (m, 4H), 3.66 (s, 6H), 3.62-3.58 (m, 2H), 3.53-3.49 (m, 2H), 1.82 (m, 2H), 1.49 (m, 2H), 1.36 (m, 4H), 0.95-0.87 (m, 3H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 171.5(2), 168.1, 166.2, 164.2, 156.8, 150.0, 146.3, 145.2, 143.0, 136.4, 135.7, 132.8, 130.4, 127.7, 127.4, 126.8, 124.6, 121.3, 120.3, 118.4, 113.8, 113.6, 110.4, 107.2, 105.4, 103.4, 68.8, 67.3, 66.7, 66.6, 53.5(2), 51.7(2), 49.0, 45.4, 42.2, 31.6, 29.2, 25.7, 22.6, 14.0 ppm.
1-16. BCa-3
mem
의 제조
KOH(aq) (1 N, 0.087 mL, 0.087 mmol)를 0℃에서 교반하면서 dioxane (0.20 mL) 및 EtOH (0.52 mL) 중의 화합물 C6 (0.034 g, 0.043 mmol)의 용액에 적가하였다. 실온에서 48시간동안 교반한 후, 혼합물을 MeCN (2.5 mL)을 포함하는 바이알에 적가하였다. 형성된 침전물을 여과에 의해 수집하고 디에틸 에테르로 세척하였다. 얻어진 생성물, BCa-3mem은 황색 고체였으며, 수율은 0.024 g(72%) 였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 /CD3CN at 9:1): δ 10.51 (s, 1H), 8.50 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.01 (dd, J = 8.8, 1.8 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.30 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 8.8, 2.3 Hz, 1H), 7.09 (br s, 1H), 6.95 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H), 4.79 (s, 2H), 4.05-3.98 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 2H), 3.57-3.53 (m, 2H), 3.48-3.42 (m, 4H), 3.21 (br s, 4H), 1.78-1.71 (m, 2H), 1.49-1.42 (m, 2H), 1.36-1.30 (m, 4H), 0.92-0.87 (m, 3H) ppm; 13C NMR (75 MHz, DMSO-d 6 ): δ 174.2(2), 168.7, 166.9, 164.2, 156.8, 150.0, 148.6, 145.0, 143.0, 137.3, 137.1, 133.5, 130.3, 127.9, 126.9, 126.3, 124.3, 119.6, 119.2, 119.0, 113.8, 112.2, 111.3, 104.6, 103.6, 103.1, 68.6, 66.3, 66.2, 64.9, 59.1(2), 47.0, 44.8, 42.0, 31.4, 29.0, 25.6, 22.5, 14.4 ppm. HRMS (ESI) m/z [M+K]+ calcd for C41H45KN5O10: 806.2798, found: 806.2800.
1-17. 화합물 7(Compound 7)의 제조
HATU (0.99 g, 2.6 mmol)를 DMF (7.5 mL) 중의 화합물 C2 (0.76 g, 2.4 mmol), MOBHA-Me (0.89 g, 2.3 mmol), 및 (i-Pr)2NH (0.81 mL, 4.7 mmol)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분동안 교반하였다. 이어서, 증류수를 첨가하고, 생성물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이동상으로 CH2Cl2/EtOAc (1:3)를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여, 담황색 고체 상태의 화합물 7(수율 1.17g, 70%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.59 (s, 1H), 8.50 (br s, 1H), 8.17 (d, J = 8.7, 1H), 7.81-7.73 (m, 2H), 7.70 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.61-7.54 (m, 1H), 7.38-7.31 (m, 3H), 7.03 (br d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.98 (br d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.88-6.81 (m, 2H), 4.71 (s, 2H), 4.11 (s, 4H), 4.00 (s, 2H), 3.66 (s, 6H), 3.66-3.62 (m, 4H), 3.60-3.55 (m, 2H), 3.50-3.45 (m, 2H) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 171.5(2), 168.2, 166.3, 163.5, 150.7, 150.0, 146.4, 142.2, 136.5, 135.7, 132.9, 130.4, 127.9, 127.4, 126.9, 124.8, 124.7, 124.4 121.1, 120.4, 119.6, 118.5, 113.6, 110.4, 107.2, 105.3, 67.3, 66.6, 66.5, 53.5(2), 51.7(2), 48.9, 45.4, 42.2 ppm.
1-18. BCa-3°
mem
의 제조
KOH(aq) (1 N, 0.18 mL, 0.18 mmol)를 15℃에서 교반하면서 dioxane (0.50 mL) 및 MeOH (0.50 mL) 중의 화합물 7 (0.050 g, 0.072 mmol)의 용액에 적가한 다음, 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 교반하면서 MeCN(3 mL)을 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 적가하였다. 형성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 디에틸 에테르로 세척하였다. 얻어진 생성물, BCa-3°mem은 황색 고체였으며, 수율은 0.024 g (47%)였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): δ 8.52 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.02 (dd, J = 8.8, 1.7 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.76-7.72 (m, 2H), 7.70 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.40-7.36 (m, 2H), 7.27 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 8.9, 2.2 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 8.7, 2.0 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.78 (br s, 2H), 3.99 (br s, 2H), 3.61-3.55 (m, 2H), 3.53-3.47 (m, 2H), 3.44-3.37 (m, 4H), 3.34-3.26 (m, 4H) ppm; 13C NMR (151 MHz, DMSO-d 6 ): δ 174.3(2), 168.7, 166.9, 163.5, 150.5, 150.1, 148.6, 142.0, 137.2, 137.1, 133.6, 130.2, 128.0, 126.8, 126.2, 125.4, 125.2, 124.3, 119.7, 119.6, 119.1, 119.0, 112.2, 111.0, 104.6, 103.1, 66.2, 66.1, 64.8, 59.2(2), 47.0, 44.7, 42.0 ppm. HRMS (ESI) m/z [M+K]+ calcd for C35H33KN5O9 +: 706.1910, found: 706.1928.
1-19. 화합물 C7(Compound C7)의 제조
t-BuONa (5.3 g, 55 mmol)를 DMSO(100mL) 중의 9-메틸-9H-플루오렌(9-methyl-9H-fluorene; 4.0 g, 22 mmol)의 용액에 10℃에서 교반하면서 첨가하였다. 다음으로, 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 증류수를 첨가하였다. 생성물을 EtOAc로 추출하고, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 증발시켰다. 잔류물을 이동상으로 hexane/EtOAc (5:1)를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여, 백색 고체 상태의 화합물 C7(수율 3.6 g, 65%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.77-7.74 (2H, m), 7.50-7.47 (2H, m), 7.38 (2H, td, J = 7.3, 1.2 Hz), 7.34 (2H, td, J = 7.3, 1.2 Hz), 3.48 (3H, s), 2.88 (2H, s), 1.63 (3H, s) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 171.1, 150.7(2), 139.5(2), 127.4(2), 127.2(2), 122.9(2), 119.9(2), 51.1, 48.3, 43.9, 25.3 ppm.
1-20. 화합물 C8(Compound C8)의 제조
HNO3 (1.4 mL, 33 mmol)를 0℃에서 교반하면서 CH2Cl2 (16 mL) 중의 화합물 C7(2.4 g, 8.1 mmol)의 용액에 적가하였다. 0℃에서 20분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 얼음과 포화 NaHCO3(aq) 용액이 담긴 비커에 부었다. 생성물을 CH2Cl2를 사용하여 추출하고, 염수로 세척하고, 무수 MgSO4로 건조한 다음, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이동상으로 hexane/EtOAc (4:1)를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여, 백색 고체 상태의 화합물 C8(수율 1.8 g, 75%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.35 (1H, d, J = 2.2 Hz), 8.28 (1H, dd, J = 8.3, 2.2 Hz), 7.83 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.82 (1H, dd, 8.3, 0.7 Hz), 7.53-7.50 (1H, m), 7.46-7.41 (2H, m), 3.43 (3H, s), 3.02 (1H, d, J = 15.2 Hz), 2.94 (1H, d, J = 15.2 Hz), 1.62 (3H, s) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 170.3, 152.1, 151.7, 146.9, 146.2, 137.2, 129.4, 128.0, 123.7, 123.1, 121.4, 120.1, 118.6, 51.4, 48.5, 43.2, 25.5 ppm.
1-21. 화합물 8(Compound 8)의 제조
니트로벤젠(nitrobenzene; 15mL) 중의 화합물 C8(3.3 g, 11 mmol) 및 아세틸 클로라이드(acetyl chloride; 3.8 mL, 54 mmol)의 용액을 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. AlCl3 (7.2 g, 54 mmol)를 천천히 첨가하고, 혼합물을 60℃에서 5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 아이스배스(ice bath)에서 냉각시키고, 1N HCl(수성)을 사용하여 반응을 켄칭(quenched)하였다. 생성물을 CH2Cl2로 추출하고, 염수로 세척하고, 무수 MgSO4로 건조시킨 후, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이동상으로 hexane/EtOAc (3:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여, 담황색 고체 상태의 화합물 8(수율 3.2 g, 85%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.35 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.30 (1H, dd, J = 8.4, 2.0 Hz), 8.11 (1H, d, 1.6 Hz), 8.04 (1H, dd, J = 7.9, 1.6 Hz), 7.90 (1H, d, J = 6.6 Hz), 7.89 (1H, d, J = 6.6 Hz), 3.40 (3H, s), 3.09 (1H, d, J = 15.6 Hz), 3.04 (1H, d, J = 15.6 Hz), 2.67 (3H, s), 1.63 (3H, s) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 197.6, 170.0, 153.0, 152.6, 147.9, 144.9, 142.0, 137.6, 128.9, 123.9, 122.7, 121.4, 121.2, 118.7, 51.6, 48.8, 43.0, 26.9, 25.8 ppm.
1-22. 화합물 C9(Compound C9)의 제조
EtOH (10 mL) 및 1,4-디옥산 (10 mL) 중의 화합물 8 (2.2 g, 6.4 mmol), Fe 분말(1.1 g, 19 mmol) 및 NH4Cl (0.69 g, 13 mmol)의 용액을 2시간 동안 환류시켰다. 혼합물을 냉각시키고, Na2CO3 (aq)를 첨가하여 중화시킨 후, 셀라이트(Celite)를 통해 여과하였다. 생성물을 CH2Cl2로 추출하고, 염수로 세척하고, 무수 MgSO4로 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이동상으로 hexane/EtOAc (1:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여, 담황색 고체 상태의 화합물 C9(수율 1.7 g, 80%)를 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.99 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.93 (1H, dd, J = 8.0, 1.5 Hz), 7.61 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.57 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.82 (1H, d, J = 2.1 Hz), 6.72 (1H, dd, J = 8.1, 2.1 Hz), 3.46 (3H, s), 2.89 (1H, d, J = 15.0 Hz), 2.84 (1H, d, J = 15.0 Hz), 2.63 (3H, s), 1.56 (3H, s) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 197.7, 170.8, 154.1, 150.1, 147.6, 145.2, 134.2, 128.9, 128.8, 122.4, 122.0, 118.1, 114.5, 109.4, 51.2, 47.9, 43.6, 26.6, 25.6 ppm.
1-23. 화합물 9(Compound 9)의 제조
DMF (20 mL) 중의 화합물 C9 (3.0 g, 8.8 mmol), 2-브로모-N-(4-(디에틸아미노)페닐)아세트아미드 (2-bromo-N-(4-(diethylamino)phenyl)acetamide; 5.1 g, 18 mmol) 및 (i-Pr)2NH (3.1 mL, 18 mmol)의 용액을 80℃에서 12시간 동안 교반하였다. 혼합물에 증류수를 넣고 EtOAc로 생성물을 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고 무수 무수 MgSO4로 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이동상으로 hexane/EtOAc (1:2)를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여, 담황색 고체 상태의 화합물 9(수율 2.6 g, 58%)를 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.20 (1H, s), 8.00 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.94 (1H, dd, J = 7.8, 1.6 Hz), 7.63 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.62 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.30 (2H, d, J = 9.0 Hz), 6.79 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.70 (1H, dd, J = 8.2, 2.2 Hz), 6.62 (2H, d, J = 9.0 Hz), 4.62 (1H, t, J = 5.2 Hz), 3.97 (2H, d, J = 5.2 Hz), 3.42 (3H, s), 3.31 (4H, q, J = 6.9 Hz), 2.90 (1H, d, J = 15 Hz), 2.87 (1H, d, J = 15 Hz), 2.63 (3H, s), 1.56 (3H, s), 1.12 (6H, t, J = 6.9 Hz) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 197.8, 170.8, 167.9, 154.3, 150.3, 148.1, 145.4, 144.9, 134.7, 130.1, 128.9, 125.6, 122.4, 122.3(3), 118.5, 113.1, 112.1(2), 108.1, 53.4, 51.4, 49.5, 48.2, 44.5, 43.6, 26.7, 25.9, 12.5(2) ppm.
1-24. FHEt-1
lyso
의 제조
KOH(aq) (1 N, 5 mL, 5 mmol)를 실온에서 12시간 동안 교반하면서 EtOH (1 mL) 중의 화합물 9 (0.26 g, 0.5 mmol)의 용액에 적가하였다. 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반한 후, HCl(aq)(1 N, 5 mL, 5 mmol)을 적가하였다. 형성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 증류수로 세척하고, 진공에서 건조시키고, 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. DMF(1mL) 중의 상기 침전물(0.13 g, 0.26 mmol), N,N-디메틸에틸렌디아민 (N,N-dimethylethylenediamine; 0.034 g, 0.39 mmol), 및 (i-Pr)2NH (0.090 mL, 0.52 mmol)의 용액에 HATU (0.13 g, 0.34 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 증류수를 넣고 EtOAc로 생성물을 추출한 다음, 유기층을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이동상으로 CH2Cl2/MeOH (1:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여, 황색 고체 상태의 FHEt-1 lyso(전체 수율 0.11 g, 40%)을 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 8.86 (1H, s), 8.55 (1H, s), 8.03 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.92 (1H, dd, J = 7.9 Hz, 1.6 Hz), 7.90 (1H, br s), 7.59 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.57 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.34 (2H, d, J = 9.1 Hz), 6.84 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.64 (1H, dd, J = 8.3, 2.2 Hz), 6.62 (2H, d, J = 9.1 Hz), 4.02 (1H, d, J = 17 Hz), 3.98 (1H, d, J = 17 Hz), 3.36-3.29 (1H, m), 3.31 (4H, q, J = 7.0 Hz), 3.11-3.04 (1H, m), 2.94 (1H, d, J = 14 Hz), 2.83 (1H, d, J = 14 Hz), 2.68-2.63 (1H, m), 2.63 (3H, s), 2.57-2.52 (1H, m), 2.37 (6H, s), 1.53 (3H, s), 1.12 (6H, t, J = 7.0 Hz) ppm; 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 198.0, 170.3, 168.4, 153.8, 150.5, 148.2, 145.2, 144.9, 134.5, 129.7, 128.6, 126.2, 122.7, 122.4(2), 122.2, 118.3, 112.2(2), 111.9, 108.8, 57.4, 48.9, 48.9, 45.4, 44.5(2), 43.0(2), 34.2, 27.2, 26.8, 12.4(2) ppm. HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calcd for C34H43N5O3 +: 570.3439, found: 570.3445.
실시예 2. 실험방법
2-1. 분광학(Spectroscopy)
이광자 프로브(TP 프로브)의 흡수 및 방출 스펙트럼은 종래 보고된 방법(Chem. Asian J. 2015, 10(10):2240-2249)을 이용하여 Agilent 8453 diode array UV-Vis 분광 광도계 및 Hitachi 형광 분광 광도계 F-7000 시스템을 사용하여 측정하였다. 형광 양자 수율(Φ)은 Coumarin 540A를 사용하여 다른 연구(Anal. Chem. 2011, 83(4):1232-1242)에서 사용된 방법으로 측정하였다. 이광자(TP) 여기(excitation)는 잠금 모드(mode-locked)의 Ti:sapphire laser (Chameleon, 90 MHz, 200 fs; Coherent Inc.)를 사용하여 구현하였다.
2-2. 용해도(Water solubility)
수성 완충액(pH 7.4)에서의 BCa-1, BCa-2 mito, BCa-3°mem 및 FHEt-1 lyso의 수용해도는 종래의 형광 기술을 사용하여 평가되었다(Chem. Asian J. 2015, 10(10):2240-2249).
2-3. TP 작용 단면적(Фδ) 및 유효 TP 작용 단면적(Фδ
eff
) 측정
프로브들에 대한 Фδ 및 Фδeff는 다른 연구에서 보고된 바와 같이 형광법을 사용하여 평가되었다(Chem. Asian J. 2015, 10(10):2240-2249).
2-4. 겉보기 해리 상수(apparent dissociation constants)의 측정
프로브를 Ca2+에 결합하기 위한 해리 상수(Kd)는 종래에 공지된 방법을 사용하여 측정하였다. 0-40μM 농도의 Ca2+를 포함하는 칼슘(calcium) 보정 완충액(calibration buffers, CBs; 10 mM 3-[N-morpholino]propanesulfonic acid [MOPS], 100 mM KCl, pH 7.2)은 칼슘 보정 완충액 키트(calcium calibration buffer kit; Biotium, CA, USA)를 사용하여 준비하였다. 40μM 이상의 Ca2+를 포함하는 완충액은 MOPS 완충액에 적절한 양의 CaCl2를 첨가하여 준비하였다. 프로브(0.3μM 농도의 BCa-3°mem 및 0.1μM 농도의 BCa-1 및 BCa-2 mito)를 칼슘 CB에 첨가하고 형광 강도(fluorescence intensity)를 측정하였다. 각 Kd는 결과 적정 곡선(resultant titration curve) 통해 계산하였다. 또한, FHEt-1 lyso의 형광 적정(fluorescence titration)을 평가하기 위하여, pH 4-11의 범용 완충액(universal buffer, UB; 0.1M 시트르산, 0.1M KH2PO4, 0.1M Na2B4O7, 0.1M 트리스[하이드록시메틸]아미노메탄, 0.1 M KCl)에 0.6 μM농도의 FHEt-1 lyso 프로브를 첨가하고 형광강도를 측정하였다. pK a 값은 적정 곡선을 통해 계산되었다.
2-5. 세포 준비
HeLa 세포는 한국 세포주 은행(서울, 한국)에서 구입했다. 세포는 기존 연구에서 설명된 방법으로 배양되었다(Chem. Asian J. 2015, 10(10):2240-2249). 이미징 2일 전에 HeLa 세포(5×104/mL)를 공초점 유리 바닥 접시(#200350, SPL Life Sciences, Gyonggi-do, Korea)에 도말(plated)하였다. 세포는 달리 명시되지 않는 한 수성 완충액(aqueous buffer; pH 7.4), Hank’s balanced salt solution(HBSS; LB003-02, WelGene Inc., 경상북도, 한국) 또는 Ringer’s solution(RB; 124mM NaCl, 26mM NaHCO3, 10 mM d-glucose, 1.3 mM MgSO4, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4)으로 세척하였다. 그 다음, 프로브(0.5-3μM) 및 Pluronic® F-127 (0.03%, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 상기 세가지 수성 완충액(1.0mL) 중 하나의 완충액에 담긴 세포에 첨가하였다. 혼합물을 37℃(BCa-1-AM 및 BCa-2 mito-AM)에서 40분 동안 또는 실온(RT; BCa-3mem)에서 10분 동안 배양(인큐베이션)하였다. 프로브로 표지된 세포는 이미징 전에 각 해당 완충액으로 3회 세척하였다.
2-6. 조직 준비
생체 외(Ex vivo) 뇌 조각은 고려대학교 의학연구심의위원회(IRB)의 승인을 받은 프로토콜에 따라 14일 된 Sprague-Dawley 쥐(Orient Bio Inc., 한국)의 해마에서 얻었다. 신선한 해마 절편(두께: 400μm)은 진동 블레이드 마이크로톰에서 이전에 보고된 기술을 사용하여 준비하였다(Chem. Asian J. 2015, 10(10):2240-2249).
2-7. 이광자 이미징(TP imaging)
TP 현미경(TP microscopy; TPM) 이미지는 스펙트럼 공초점 및 다광자 현미경(Leica TCS SP2; Leica)을 사용하여 얻었다. 프로브 표지된 HeLa 세포의 TPM 이미지는 기존 방법을 이용하여 Leica TCS SP2를 사용하여 얻었다(Chem. Asian J. 2015, 10(10):2240-2249). TPEF 강도의 시간 의존적 변화는 750 nm에서 여기 시 xyt 모드에서 1.6-2.0초 간격으로 모니터링하여 측정하였다. 세포막에서 [Ca2+]의 변화를 모니터링하기 위해 세포를 5, 0.1 및 0 mM의 EGTA를 함유하는 RB로 연속적으로 세척한 다음 BCa-3mem(2 μM)과 함께 배양하였다. TPEF 강도는 CaCl2(2mM)를 증류수에서 RB 및 EGTA(2 mM)에 첨가하기 전과 후에 측정하였다.
HBSS에 히스타민 이염산염(histamine dihydrochloride; 100 μM, Sigma-Aldrich)을 첨가하기 전후에, BCa-1-AM(2 μM)으로 표지된 HeLa 세포에서 TPEF 강도 모니터링을 통해 Ca2+ 진동(oscillation)을 평가하였다.
HBSS에 카르보닐 시안화물 p-트리플루오로메톡시페닐히드라존(carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone, FCCP; 0.5M, cat. # 15218, Cayman, USA)을 첨가하기 전과 후에, BCa-2 mito-AM(2 μM)으로 표지된 HeLa 세포에서 TPEF 강도 모니터링을 통해 미토콘드리아 Ca2+의 변화를 분석하였다.
리소좀 pH와 세포질 [Ca2+]의 변화를 동시에 모니터링하기 위해 HeLa 세포를 BCa-1-AM(3 μM)과 FHEt-1 리소(1 μM)의 혼합물로 공동 표지하였다. 세포를 RB로 2회, 5mM EGTA를 함유하는 RB로 1회 및 0.1mM EGTA를 함유하는 RB로 2회 세척하였다. 세포의 TPEF 강도는 EtOH에 모넨신(monensin; 20 μM, Sigma-Aldrich)을 첨가하기 전과 후에 모두 측정하였다.
조직 이미징을 위해 뇌 조각을 다음 중 하나로 표지하였다: 이중 색상 이미징의 경우 37℃에서 60분 동안 BCa-1-AM (7 mM) 및 FHEt-1 lyso (3 mM), 미토콘드리아 이미징의 경우 37℃에서 60분 동안 BCa-2 mito-AM(7 μM), 또는 세포막(membrane) 이미징의 경우 RT에서 10분 동안 BCa-3mem(2 μM). TPM 이미지는 6개의 단면 이미지가 조직 준비 중 발생하는 표면 손상으로 인한 오류를 최소화하기 위해 z-방향을 따라 조직 표면에서 90-140 μm 깊이에서 10 μm 간격으로 캡처된 것을 제외하고는 상기 설명한 방법을 통해 얻었다.
2-8.세포독성(Cytotoxicity)
BCa-1-AM, BCa-2 mito-AM, BCa-3mem 및 FHEt-1 lyso의 세포 독성은 Cell Counting Kit-8(Dojindo, Japan)을 사용하여 측정하였다.
2-9. 광안정성(Photostability)
광안정성은 BCa-1-AM, BCa-2 mito-AM, BCa-3mem 또는 FHEt-1 lyso로 표지된 HeLa 세포에 대한 이미징 조건에서 TPEF 강도의 시간 의존적 감소를 모니터링하여 측정하였다.
실시예 3. 이광자 프로브의 분광학적 특성 및 형광 적정
본 발명의 상기 실시예에서 제조된 이광자(TP) 프로브 BCa-1-AM, BCa-2 mito-AM, BCa-3mem 및 FHEt-1 lyso에 대하여 물리적 특성을 분석한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| 프로브 (Probe) |
λmax (λfl)b | 10-4εc | Φd,e | 2λmax f |
K
d
g
or
pK a h |
FEFi | Φδmax j | Φδeff k |
| BCa-1 | 353 (466) | 3.00 | 0.063d (0.99) |
470 (461) |
0.18g (nd) |
16 (nd) |
55 | 1400 |
| BCa-2 mito | 358 (464) | 3.05 | 0.049d (0.50) |
470 (462) |
2.7g (nd) |
10 (nd) |
70 | 2000 |
| BCa-3°mem | 350 (464) | 3.10 | 0.027d (0.72) |
470 (427) |
100g (95) |
26 (25) |
60 | 4800 |
| FHEt-1 lyso | 359 (571) | 2.80 | 0.014e (0.33) |
562 (550) |
6.5h (6.6) |
25 (24) |
70 | 21000 |
| a 나노미터 단위의 단일광자 흡수 스펙트럼(one-photon absorption spectra)의 λmax. b 나노미터 단위의 단일광자 형광 스펙트럼(one-photon fluorescence spectra)의 λfl. c 몰 흡광 계수(Molar extinction coefficient). d,e 과량의 Ca2+ 부재 또는 존재(괄호 안)안에서의 형광 양자수율 (d) 및 pH 11 및 pH 4.3(괄호 안)에서의 형광 양자수율 (e). f 수성 완충액 또는 Hela 세포(괄호 안)에서의 나노미터 단위의 TPEF 스펙트럼의 λmax. g,h 마이크로미터 단위의 해리상수(Dissociation constant)(g) 및 산 해리 상수(acid dissociation constant)의 음의 로그(negative log)(h). i 형광 향상 인자(Fluorescence enhancement factor). j 10-50 cm4s/광자(GM)에서 최대 TP 동작 단면(action cross-section), 오차범위: ±15%. k GM에서 효율적인 TP 동작 단면. |
||||||||
3-1. 분광학적 특성
BCa-1, BCa-2 mito 및 BCa-3°mem은 인산염 완충 식염수(pH 7.4; 도 2)에서 수행된 스펙트럼 연구 결과, 몰 흡광 계수(ε)가 30,000-31,000 cm-1M-1로서, 350-358 nm의 최대 흡광도(λmax)를 나타내었다. 상기 이광자 프로브 화합물은 모두 CB(10mM MOPS, 100mM KCl, pH 7.2)에서 464-466 nm의 최대 방출값(λfl) 및 0.027-0.063의 형광 양자 수율(Φ)로 약한 형광을 방출하였다. FHEt-1 lyso는 UB(도 2 and Table 1)에서 몰 흡광 계수(ε)가 28,000 cm-1M-1로서 359 nm에서 최대 흡광도(λmax)를 보였고, 형광 양자 수율(Φ)이 0.014로서 571 nm에서 발광 최대값(λfl)을 나타냈다. 이러한 프로브에서 관찰된 낮은 형광 양자 수율(Φ) 값은 수용체에서 형광단으로의 효율적인 광유도 전자 전달(PeT)에 기여할 수 있다(표 1).
각 프로브 화합물들에 대하여 흡수법으로 측정한 수용해도(Water solubility)는 0.4-2.0μM으로 밝혀졌으며, 이는 세포를 염색(착색)하기에 충분하다(도 3).
BCa-3mem, BCa-1-AM, BCa-2 mito-AM 또는 FHEt-1 lyso로 표지된 HeLa 세포(자궁경부암 세포주)는 스캐닝 람다 모드에서 750 nm에서 여기될 때 각각 427, 461, 462 및 550 nm를 중심으로 넓은 TPEF 스펙트럼을 방출하였다(도 4). BCa-3mem, BCa-1-AM, BCa-2 mito-AM 및 FHEt-1 lyso의 TPEF 최대값은 수성 완충액에서 측정된 λfl로부터 각각 43, 9, 8 및 12 nm만큼 청색 이동되었다. 이러한 결과는 세포 내 미세 환경이 물보다 소수성이며 BCa-3mem 프로브의 미세 환경이 가장 소수성임을 나타낸다(도 5).
3-2. 형광 적정
CB에서 BCa-1, BCa-2 mito 및 BCa-3°mem에 Ca2+를 조금씩 첨가한 결과, 형광 강도가 급격히 증가하였다(도 6 및 S5). 이는 Ca 이온에 결합할 때 수용체에서 형광단으로 PeT가 효율적으로 차단됨으로써 이루어지는 것으로 예상할 수 있다. BCa-1, BCa-2 mito 및 BCa-3°mem에 대해 계산된 형광 향상 인자 [FEF = (F max - F min)/F min]는 10-26 수준이었다(도 6 및 표 1). 적정 곡선은 프로브와 Ca2+ 간의 1:1 착물화를 가정할 때 우수한 상관관계를 보여주었다(도 6).
적정 곡선에서 계산된 BCa-1, BCa-2 mito 및 BCa-3°mem의 해리 상수(dissociation constants, Kd)는 각각 0.18, 2.7 및 100 μM이었다. TP 프로세스에서 BCa-3°mem에 대해 유사한 값(Kd TP = 95 μM)이 결정되었다. BCa-1 및 BCa-2 mito에 대한 Kd TP 값은 TP 프로세스의 Fmin 값이 정확한 측정을 하기에는 너무 낮기 때문에 계산하기 어려웠다(도 7). Kd 값은 해당 세포소기관에서 유리 Ca2+의 세포내 농도 범위 내에 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명의 TP 프로브가 TPM 동안 살아있는 조직에서 세포 소기관에 결합된 Ca 이온을 감지할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 BCa-1, BCa-2 mito 및 BCa-3°mem 프로브는 모두 2mM에서 Mg2+ 및 100 μM에서 Fe2+, Cu2+ 및 Co2+에 약한 반응을 보였고 100 μM에서 Zn2+ 및 Mn2+에 중간 정도의 반응을 보인 반면에, Ca2+에 대해서는 높은 선택성을 보였다(도 8). 일반적으로 세포내에서 Zn2+의 농도는 나노몰 범위에 있고 Mn2+의 농도는 무시할 수 있는 수준이기 때문에, 본 발명의 이광자 형광 프로브는 세포에서 다른 경쟁 금속 이온의 간섭을 거의 받지 않으면서 Ca2+를 선택적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 이광자 형광 프로브는 pH 4-10에서 낮은 pH 민감도를 보였고(도 9), 이에 따라, 생체와 관련된 pH 범위에서 pH-미반응인 특성, 즉, pH 독립성을 가짐을 확인하였다.
한편, FHEt-1 lyso의 형광 적정은 pH 4-11의 UB에서 수행되었다. FHEt-1 lyso의 pKa 값은 6.5였으며, 이는 세포의 pH 범위 내에 있다(도 6 및 표 1). 거의 동일한 값(pKa TP = 6.6)이 TP 프로세스에서 결정되었다(도 7). 따라서 FHEt-1 lyso는 살아있는 세포에서 pH를 검출할 수 있음을 확인하였다.
3-3. 이광자 프로브의 밝기
TPM 이미지의 밝기를 평가하기 위해 종래에 알려진 방법으로 TP 동작 단면적(action cross-section, Φδ)을 측정하였다. 과량의 Ca2+가 존재할 때 BCa-1, BCa-2 mito 및 BCa-3°mem의 Φδ최대값(Φδmax)은 750 nm에서 각각 55, 70 및 60 GM인 것으로 나타난 반면, pH 4.3에서 측정된 FHEt-1 lyso의 Φδ최대값은 750 nm에서 70 GM이었다(도 10). 상기 실시예에서 확인된 효율적인 PeT로 인해 Ca2+의 부존재 조건에서의 BCa-3°mem 및 pH 11에서의 FHEt-1 lyso의 Φδ값은 상당히 낮게 나타났다.
또한 MeOH에서 TPEF 강도를 5.0 μM 로다민 6G의 강도와 비교하여 프로브 표지된 세포에서 프로브의 Φδeff 값을 결정했다. HeLa 세포에서 BCa-1, BCa-2 mito, BCa-3mem 및 FHEt-1 lyso의 Φδeff 값은 750 nm에서 각각 1400, 2000, 4800 및 21000 GM으로 나타났고, 이는 밝은 TPM 이미지를 얻기에 충분한 값임을 확인하였다. c eff = Φδeff/Φδmax 의 계산식을 사용하여 BCa-1, BCa-2 mito, BCa-3mem 및 FHEt-1 lyso의 유효 농도(effective concentrations, ceff)를 측정한 결과, 밝은 점에서 각각 25, 29, 80 및 300μM이었다. 이러한 ceff 값은 염색 배지에서 측정된 프로브 농도, BCa-1의 경우 1.5μM, BCa-2 mito의 경우 1.0μM 및 BCa-3mem 및 FHEt-1 lyso의 경우 0.5μM보다 17-600배 높았다. 이러한 결과는 프로브의 미세 환경이 염색 배지보다 세포에서 더 유리하다는 것을 나타낸다.
실시예 4. 이광자 프로브의 광안정성 및 세포독성 분석
프로브의 광안정성을 평가하기 위해 프로브 레이블이 지정된 세포의 TPM 이미지에서 관심 영역(regions of interest, ROIs)의 TPEF 강도를 모니터링하면서 프로브에 펨토초 펄스(femtosecond pulses)를 지속적으로 조사하였다(도 11). TPEF 강도 값은 1시간 동안 거의 동일하게 유지되어 높은 광안정성을 나타냈다. Cell Counting Kit-8로 측정한 결과, 모든 프로브는 세포 독성이 낮았다(도 12). 이러한 결과로부터, 프로브가 TPM과 관련하여 높은 광안정성을 가지며 세포독성 문제 없이 세포 소기관에서 Ca2+ 및 H+를 감지할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 이광자 프로브의 검출 윈도우 분석
BCa-3mem으로 표지된 HeLa 세포의 TPEF는 380-660 nm의 파장에서 측정되었다. BCa-2 mito-AM/MitoTracker RedTM (cat. # M22425, Invitrogen, Waltham, MA, USA), BLT-blue/FHEt-1 lyso-, 및 BCa-1-AM/FHEt-1 lyso으로 각각 공동 표지된 HeLa 세포에 대한 colocalization 실험을 위해, 비교 대상이 되는 두 프로브의 TPEF 스펙트럼을 사용하여 검출 윈도우를 측정하였고, 프로브들의 검출 윈도우는 발광 밴드가 잘 분리되고 비교 대상이 되는 두 프로브들로부터의 방출(발광) 강도 수준이 비슷하게 나타나도록 확인되었다.
BCa-2 mito-AM, MitoTracker Red, BLT-blue, FHEt-1 lyso 및 BCa-1-AM에 대한 검출 윈도우는 각각 380-540, 600-680, 380-480, 550-660, 및 380-480 nm로 확인되었다(도 13). 상기 조건에서 BCa-2 mito-AM과 MitoTracker Red의 TPEF 범위는 겹치지 않았다. 또한, FHEt-1 lyso 형광은 BLT-blue 형광의 33%를 담당하였고, BLT-blue 형광은 FHEt-1 lyso 형광의 3%를 기여하며, FHEt-1 lyso 형광이 BCa-1-AM 형광의 33%를 기여하는 반면, BCa-1-AM 형광은 FHEt-1 리소 형광의 3%를 기여하였다. 따라서 colocalization 실험에 사용된 BCa-2 mito-AM/MitoTracker RedTM (cat. # M22425, Invitrogen, Waltham, MA, USA), BLT-blue/FHEt-1 lyso-, 및 BCa-1-AM/FHEt-1 lyso 프로브 쌍들의 TPEF 값은 서로 최소한의 간섭으로 정량화할 수 있다(도 13).
실시예 6. 이광자 프로브의 소기관 특이적 검출능 평가
6-1. 세포막에서 Ca
2+
의 검출
먼저, BCa-3mem이 세포막(plasma membrane)에서 Ca2+를 검출할 수 있는지 여부를 평가하였다. BCa-3mem으로 표지된 HeLa 세포의 TPM 이미지는 세포막에 밝은 반점을 포함했으며 이러한 신호는 최소 1시간 동안 지속되었다(도 14). TPEF 강도는 Ca2+(2mM) 첨가 시 증가하였고 Ca2+에 대한 킬레이트제인 EGTA(2mM)로 처리하는 동안 감소했다(도 15). 따라서, BCa-3mem이 세포막을 타겟하여 세포막내 Ca2+를 검출할 수 있음을 확인하였다.
한편, BCa-3mem의 결과와는 대조적으로, 세포가 BCa-3°mem으로 표지되었을 때 이미지는 훨씬 더 어둡고 흐릿했다(도 14). 이러한 결과를 통해 막 결합 표적에 대한 TP 프로브를 설계하기 위하여 최적 길이의 탄화수소 꼬리를 도입하는 것이 중요함을 확인하였다.
6-2. 세포질에서 Ca
2+
의 검출
BCa-1이 세포질(cytoplasm)에서 Ca2+를 검출할 수 있는지 여부를 평가하였다. BCa-1-AM으로 표지된 HeLa 세포의 TPM 이미지는 세포질에 밝은 반점을 보여주었다. Ca 진동(oscillation)을 유도하는 시약인 히스타민(histamine)을 첨가하면 TPEF 강도가 증가했다가 감소했다. TPEF 강도의 증가 및 감소는 800초 동안 반복되었으며, 이는 기존 히스타민 유도 Ca 진동 연구의 결과와 일치하였다. 따라서, BCa-1이 세포질을 타겟하여 세포질내 Ca2+를 검출할 수 있음을 확인하였다(도 16).
6-3. 미토콘드리아에서 Ca
2+
검출
BCa-2 mito-AM이 미토콘드리아(mitochondria)에서 Ca2+를 검출할 수 있는지 여부를 평가하였다. BCa-2 mito-AM으로 표지된 HeLa 세포의 TPM 이미지에는 Pearson의 공동 국소화 계수(Pearson's colocalization coefficient, A)가 0.84(도 17a-c)인 MitoTracker Red와 함께 잘 공동 국소화된 밝은 반점이 나타났다.
세포에 미토콘드리아 막을 탈분극시키는 시약인 FCCP을 처리하였을 때, TPEF 강도는 미토콘드리아에서 급격히 감소했으며(도 17f, 검은색 곡선), 세포질에서 TPEF 강도가 일시적으로 급증하였다가 기준선으로 점진적으로 감소했다(도 17f, 빨간색 곡선). 이러한 결과는 FCCP에 의해 Ca2+가 미토콘드리아에서 먼저 세포질로, 다음으로 세포외 공간으로 방출이 유도되는 것과 일치하였다(도 17d-f). 따라서, BCa-2 mito가 미토콘드리아를 타겟하여 미토콘드리아내 Ca2+를 검출하는 능력이 있음을 확인하였다.
6-4. 리소좀에서 H
+
검출
FHEt-1 lyso가 리소좀(lysosomes)에서 H+를 검출할 수 있는지 여부를 평가하였다. FHEt-1 lyso로 표지된 HeLa 세포의 TPM 이미지에는 리소좀에 대한 TP 프로브로서 Pearson 공동 국소화 계수(Pearson's colocalization coefficient, A)가 0.86인 BLT-blue와 함께 잘 공동 국소화된 밝은 반점이 나타났다(도 18). 따라서, FHEt-1 lyso가 리소좀을 타겟하여 리소좀내 H+를 검출하는 능력이 있음을 확인하였다.
6-5. 이중 색상 이미징
BCa-1 및 FHEt-1 lyso가 이중 색상(dual-color) TPM 동안 세포질의 [Ca2+] 및 리소좀 pH의 변화를 동시에 모니터링하는데 사용할 수 있는지 여부를 평가하였다. BCa-1-AM 및 FHEt-1 lyso로 공동 표지된 HeLa 세포의 TPM 이미지는 세포질에서 Ca2+(녹색 픽셀) 및 리소좀에서 H+(빨간색 픽셀, 도 19a-d)를 나타내었다. 모넨신이 세포에 추가되었을 때 세포질의 Ca 농도와 리소좀의 pH가 증가함에 따라, TPEF 강도는 리소좀(빨간색 곡선)에서 급격히 감소했으며 세포질(검은색 곡선)에서는 동시에 증가하였다(도 19f, g). 이러한 결과는 모넨신에 의해 유도된 세포질의 Ca2+ 농도 및 리소좀의 pH의 증가와 일치하였다. 따라서, BCa-1 및 FHEt-1 lyso가 이중 색상 TPM 동안 살아있는 세포에서 세포질의 [Ca2+] 및 리소좀의 pH의 변화를 동시에 모니터링하는 데 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. 살아있는 조직에서 TP 프로브로서의 유용성 평가
본 발명의 BCa-1-AM 및 FHEt-1lyso 프로브에 대하여 조직 이미징을 위한 TP 프로브로서의 유용성을 평가하였다. 14일 된 Sprague-Dawley 쥐의 해마 조직 조각을 37℃에서 60분 동안 7M BCa-1-AM 및 3M FHEt-1 lyso와 함께 배양했다. CA1 및 치상회 영역의 피라미드 뉴런 층에 대하여 서로 다른 깊이에서 세포질 Ca2+ 및 리소좀 H+ 이온의 분포를 시각화하기 위해 90-140 μm 깊이에서 6개의 TPM 이미지를 얻었다(도 20a 및 b). 단면 이미지는 유사하여 서로 다른 깊이에서 세포질 Ca2+ 및 리소좀 H+의 유사한 분포를 나타냈다. 또한 고배율에서 380-480nm(BCa-1-AM) 및 550-660nm(FHEt-1 lyso)에서 얻은 이미지는 100μm 깊이에서 두 이온의 분포를 명확하게 보여주었다(도 20c-e). 서로 다른 세포 소기관에 위치하는 것으로부터 예상한 대로, 신호는 두 이미지 간에 겹치지 않았다(도 20e). 따라서, BCa-1-AM 및 FHEt-1lyso가 이중 색상 TPM의 맥락에서 살아있는 조직에서 세포질 Ca2+ 및 리소좀 H+를 동시에 검출할 수 있음을 확인하였다.
또한, BCa-2 mito-AM 및 BCa-3mem으로 표시된 해마 조각의 단면 TPM 이미지(90-140μm 깊이)를 얻었다(도 21). 이들 프로브 역시 상기 결과와 유사하게 전체 분석 깊이에 걸쳐 xy 평면 내에서 미토콘드리아 및 세포막 Ca 이온의 유사한 분포를 나타냈다. 특히, 고배율에서 얻은 이미지는 100 μm 깊이에서 미토콘드리아와 세포막 Ca 이온의 분포를 명확화하였다(도 20f-i). 따라서, BCa-2 mito-AM과 BCa-3mem이 TPM 동안 살아있는 조직에서 미토콘드리아와 세포막 각각의 Ca 이온을 검출할 수 있음을 확인하였다.
결론
본 발명자들은 세포질, 미토콘드리아, 원형질막, 리소좀 각각의 세포 소기관 특이적 검출이 가능한 Ca2+에 대한 청색 방출 TP 프로브(BCa-1-AM, BCa-2 mito-AM, BCa-3mem)와 H+에 대한 녹색 방출 TP 프로브(FHEt-1 lyso)를 제작하였다. 이들 프로브는 상당한 TP 단면, 검출 대상인 Ca2+에 대한 높은 선택성 및 민감도, 높은 광안정성, 낮은 pH 의존성 및 무시할 수 있는 세포 독성을 보여주었다. BCa-1-AM, BCa-2 mito-AM, BCa-3mem은 각각 살아있는 세포와 조직의 세포질, 미토콘드리아, 세포막에서 선택적으로 Ca2+를 실시간으로 검출할 수 있고, FHEt-1 lyso는 살아있는 세포와 조직의 리소좀에서 H+를 검출할 수 있다. 또한, BCa-1-AM 및 FHEt-1 lyso는 이중 색상 TPM 영상을 통해 살아있는 세포 및 조직에서 세포질 Ca2+ 및 리소좀 H+를 동시에 검출할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 6-(benzoxazol-2-yl)-2-naphthalylamine에서 파생된 소기관 특이적 청색 방출 TP 프로브가 살아있는 세포 및 조직의 세포질, 미토콘드리아 및 세포막에서 Ca 이온을 검출할 수 있는 TP Ca2+ 프로브로서 유용함을 확인하였다. 또한 본 발명의 프로브는 다색 TPM 이미징을 통해 금속 이온 간의 crosstalk 조사에 사용 가능하다. 따라서, 본 발명의 프로브는 살아있는 생물학적 조직에 대한 생리학적 연구를 포함하는 생물의학 연구에 유용할 수 있다.
Claims (13)
- 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서 Y는 K, CH3 또는 CH2OC(O)CH3 이고,
X는 H, OH 또는 O(CH2)5CH3 이다. - 제1항에 있어서, 상기 이광자 형광 프로브 화합물은 칼슘 이온(Ca2+)에 특이적으로 결합하는 것인, 이광자 형광 프로브 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 이광자 형광 프로브 화합물은 세포막(plasma membrane) 내 칼슘 이온을 선택적으로 이미징하기 위한 것인, 이광자 형광 프로브 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 이광자 형광 프로브 화합물은 칼슘 이온에 대한 형광 반응으로 청색 형광을 방출하는 것인, 이광자 형광 프로브 화합물.
- 제1항에 따른 이광자 형광 프로브 화합물을 포함하는 생체 세포 또는 조직의 칼슘 이온 검출용 이광자 형광 프로브 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 조성물은 세포막 내 칼슘 이온을 선택적으로 이미징하는 것인, 칼슘 이온 검출용 이광자 형광 프로브 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 이미징의 깊이는 90-140㎛인 것인, 칼슘 이온 검출용 이광자 형광 프로브 조성물. - 제1항에 따른 이광자 형광 프로브 화합물을 생체로부터 분리된 세포 또는 조직에 주입하는 단계;
상기 생체로부터 분리된 세포 또는 조직에 여기원(excitation source)을 조사하는 단계; 및
이광자 현미경으로 상기 이광자 형광 프로브 화합물로부터 발생하는 형광을 관측하는 단계;를 포함하는, 칼슘 이온을 이미징하는 방법. - 제8항에 있어서,
세포막을 타겟하여 세포막 내 칼슘 이온을 선택적으로 이미징하는 것인, 칼슘 이온을 이미징하는 방법. - 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물의 제조방법:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
상기 화학식 1, 2 또는 3에서 각각 Y는 K, CH3 또는 CH2OC(O)CH3 이고,
X는 H, OH 또는 O(CH2)5CH3 이고,
R1은 CO2C(CH3)3 또는 CO2H 이고,
L은 H 또는 NH2 이다. - 제10항에 있어서, 상기 화학식 1에서 Y는 K 또는 CH3 이고, X는 O(CH2)5CH3 또는 H 이고, 화학식 2에서 X는 H 또는 OH 이고, R1은 CO2H 이고, 화학식 3에서 Y는 CH3 이고, L은 NH2 인 것인, 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물의 제조방법.
- 제10항에 있어서, 상기 화학식 2에서 X가 OH인 경우, 상기 OH를 O(CH2)5CH3 로 치환하는 단계를 더 포함하는 것인, 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물의 제조방법.
- 제10항에 있어서, 상기 화학식 3에서 Y가 CH3 인 경우, 상기 CH3 를 K 또는 CH2OC(O)CH3 로 치환하는 단계를 더 포함하는 것인, 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브 화합물의 제조방법.
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| KR1020220025904A KR102646848B1 (ko) | 2022-02-28 | 2022-02-28 | 세포막에서 칼슘을 표지할 수 있는 이광자 청색 표지자 |
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-
2022
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Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (3)
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|---|
| Dr.Roopa et al., Chem. Asian J., 2019, 14, pp 4493-4505. |
| 노원영, 국내석사학위논문, 고려대학교, 2010.02, pp.1-40. |
| 홍승택, 학위논문(박사)- 고려대학교 KU-KIST융합대학원, 2020.02, pp.1-164. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| KR20230128705A (ko) | 2023-09-05 |
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