JPH0641453B2 - 酵素活性測定用の化合物、酵素の検出法及び検出用試薬 - Google Patents

酵素活性測定用の化合物、酵素の検出法及び検出用試薬

Info

Publication number
JPH0641453B2
JPH0641453B2 JP1152038A JP15203889A JPH0641453B2 JP H0641453 B2 JPH0641453 B2 JP H0641453B2 JP 1152038 A JP1152038 A JP 1152038A JP 15203889 A JP15203889 A JP 15203889A JP H0641453 B2 JPH0641453 B2 JP H0641453B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino
dye intermediate
enzyme
dye
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP1152038A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0242063A (ja
Inventor
デイ アーチス ジヨセフ
エム ベンシー ジム
ザツク ベニー
エス ラーデン ダニエル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UEEN STATE UNIV
UEEN SUTEETO UNIV
Original Assignee
UEEN STATE UNIV
UEEN SUTEETO UNIV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by UEEN STATE UNIV, UEEN SUTEETO UNIV filed Critical UEEN STATE UNIV
Publication of JPH0242063A publication Critical patent/JPH0242063A/ja
Publication of JPH0641453B2 publication Critical patent/JPH0641453B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/14—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D231/18—One oxygen or sulfur atom
    • C07D231/20—One oxygen atom attached in position 3 or 5
    • C07D231/22—One oxygen atom attached in position 3 or 5 with aryl radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/14—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D231/44—Oxygen and nitrogen or sulfur and nitrogen atoms
    • C07D231/46—Oxygen atom in position 3 or 5 and nitrogen atom in position 4
    • C07D231/50—Acylated on said nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、アミノ酸で置換された４−アミノピリン
（「４−アミノフエナゾン」とも称しうる。）であつて
酵素活性を測定するための基質として利用される新規な
アミドに関するものである。特にこの発明はアミノ酸で
置換された４−アミノピリン、特にＬ−ガンマ−グルタ
ミル−４−アミノピリン及びアラニル−４−アミノピリ
ン、であつて、置換体アミノ酸がアミノ酸を認識する酵
素により開裂されて４−アミノピリンが生成され、その
４−アミノピリンをアミノ色素中間体として酸化剤の存
在下で第２の色素中間体と反応させてクロモゲンを生成
させるように用いられるところの、アミノ酸で置換され
た４−アミノピリンに係る。
〔従来の技術〕
全ゆる肝臓病で血清ガンマグルタミルトランスフエラー
ゼ（ＧＧＴ）が高められる(Moss,D.W.,et al.Enzymes.I
n：Teitz,N.W.,ed.Textbook of Clinical Chemistry.Ph
iladelphia：W.B.Saunders,５：721-722(1986))。閉塞
性黄疸、胆管炎及び胆のう炎を検知するためにＧＧＴは
アルカリンホスフアターゼ、５′−ヌクレオシダーゼ、
ロイシンアミノペプチダーゼ、及びトランスアミナーゼ
類よりも感受性が大である(Moss,D.W.,et al.Enzymes.I
n：Teitz,N.W.,ed.Textbook of Clinical Chemistry.Ph
iladelphia：W.B.Saunders,５：721-722(1986))。ＧＧ
Ｔの上昇は上述の他の酵素よりも早期に生じ、より長く
持続する。血清ＧＧＴの活性測定はアルコールに原因す
る肝臓病を検知するのに極めて有用である。アルコール
肝硬変症の患者の血清中のみならず大多数の大酒飲みの
血清中にも、ＧＧＴ濃度の上昇が認められる(Moss,D.
W.,et al.Enzymes.In：Teitz,N.W.,ed.Textbook of Cli
nical Chemistry.Philadelphia：W.B.Saunders,５：721
-722(1986))。
ＧＧＴを測定するための当初の方法には生理的な基質グ
ルタチオンを利用する方法(Hanes,C.S.,et al.：Bioche
m.J.51,25-35(1952))が含まれていたが、これは厄介で
あるため早期に合成基質を利用する方法にとつて替られ
た。Ｎ−（ＤＬ−ガンマ−グルタミル）アニリン(Goldb
erg,J.,et al.：Arch.Biochem.Biophys.91,61-70(196
0))、Ｌ−ガンマ−グルタミル−ナフチルアミド(Orlows
ki,M.,et al.：Clin.Chem.Acta.7,755-760(1962))、及
びＬ−ガンマ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド(Szas
z,G.,Clin.Chem.15,124-136(1969))のような合成基質の
利用法は全て開裂生成物からの色素の生成を伴なうが、
日常的に利用するのには一定の限界がある。ビーテイ(B
eaty)等に附与された米国特許NO.4,511,651及びベツク
(Beck)等に附与された米国特許NO.4,567,138も、参照さ
れたい。
現在ＧＧＴ活性の測定のために選択されている基質はＬ
−ガンマ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロア
ニリド(gluCANA)である(IFCC Methods for the Measure
ment of Catalytic Concentration of Enzymes,Part 4,
IFCC Method for gamma-Gultamyltransferase,〔(gamma
-Glutamyl)-Peptide：Amino Acid gamma-Gultamyltrans
ferase,EC 2.3.2.2〕，1983)。本基質の高い転換率と溶
解度は、それ以前に利用されていた低溶解度の基質Ｌ−
ガンマ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド(gluPA)と対
比して一定の長所を附与する。しかしこれらの両基質と
もモル吸光係数が小さく、また基質と生成物とが重複す
るスペクトルを呈し、色素の吸光ピークにおいてよりむ
しろスペクトルの肩の部分で測定を行なわねばならない
(Fossati,P.,et al.：Clin.Chem.32,1581-1584(198
6))。
同様の問題は酵素のアラニンアミノペプチダーゼ及びア
リールアミダーゼに関しても認められる。すなわちこれ
らの酵素は尿中から検出され、その活性の増大は腎臓障
害（例えば薬剤の腎細胞毒性による。）を示すことにな
るが、これらの酵素も従来はグルタミルトランスフェラ
ーゼの場合に類似してＬ−アラニル−β−ナフチルアミ
ド(Biochemistry,Vol.13,No.16,p.p.3221-3225(1974)及
びEur.j.Biochem.,Vol.104,155-165(1980))とかアラニ
ン−４−ニトロアニリド(Clinical Biochemistry,Vol.2
1,No.1,p.p.53-57(1988))といった酵素基質を利用して
検出されて来ている。したがってグルタミルトランスフ
ェラーゼの検出に関して前述したのと同様の限界がある
と認められるのである。
〔発明課題〕
したがつてこの発明の目的とするところはグルタミルト
ランスフェラーゼ用或いはアラニンアミノペプチダーゼ
及びアリールアミダーゼ用の基質として、色素中間体で
ある４−アミノピリンを生成するのに有用であるところ
のアミノ酸で置換された４−アミノピリンである新規な
アミドを、提供するにある。またこの発明は新規なアミ
ノ酸置換−４−アミノピリンを利用した酵素検出法と酵
素検出試薬を提供することも、目的とする。さらにこの
発明は比較的安価で信頼性が高い酵素の検出法と検出用
試薬を提供することも、目的とするものである。
〔一般的な説明〕
この発明は式 ［式中、 はＬ−ガンマ−グルタミル基又はアラニル基である。］
で表される化合物に係る。
またこの発明はアミノ酸を結合したアミノ色素中間体を
用いる酵素検出法であって、アミノ酸を酵素により上記
アミノ色素中間体を形成するように除去し、次に該アミ
ノ色素中間体を第２の色素中間体と結合させてクロモゲ
ンを形成する酵素検出法において、 （ａ）．式 ［式中、 はＬ−ガンマ−グルタミル基又はアラニル基である。］
で表される化合物を、酵素との反応により生成されるア
ミノ酸カルボニル基用の受容体と共に水溶液の形で設
け、 （ｂ）．上記化合物を酵素と反応させて、式 で表される４−アミノ色素中間体、及びアミノ酸カルボ
ニル基と上記受容体との反応生成物を形成し、 （ｃ）．上記した４−アミノ色素中間体を酸化剤の存在
下で第２の色素中間体と反応させて、４−アミノ色素中
間体の４−アミノ基と第２の色素中間体との反応生成物
であるクロモゲン色素複合体を形成する、 ことを特徴とする酵素検出法に係る。
さらにこの発明はグルタミルトランスフェラーゼの検出
法であって、 （ａ）．１−フェニル−２−メチル−３−メチル−４−
（Ｌ−ガンマ−グルタミルアミノ）−３−ピラゾリン−
５−オンを、グルタミルトランスフェラーゼとＬ−ガン
マ−グルタミル基との反応により生成されるグルタミル
カルボキシ基用の受容体と共に水溶液の形で設け、 （ｂ）．この水溶液中にグルタミルトランスフェラーゼ
を導入して、アミノ色素中間体としての１−フェニル−
２−Ｎ−メチル−３−メチル−４−アミノ−３−ピラゾ
リン−５−オン、及びグルタミルカルボキシ基と上記受
容体との反応生成物を形成し、 （ｃ）．１−フェニル−２−Ｎ−メチル−３−メチル−
４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オンを酸化剤及び第
２の色素中間体と反応させて、アミノ色素中間体の４−
アミノ基と第２の色素中間体との反応生成物である色素
複合体を形成する、検出法に係る。
またこの発明は、アミノ酸を除去してアミノ色素中間体
を形成する酵素を、上記アミノ色素中間体を酸化剤の存
在下で第２の色素中間体と反応させてクロモゲンを形成
することにより検出する酵素検出用試薬であって、 （ａ）．式 ［式中、 はＬ−ガンマ−グルタミル基又はアラニル基である。］
で表され、上記酵素と反応して式 で表される４−アミノ色素中間体を形成する化合物、 （ｂ）．上記した４−アミノ色素中間体と反応してクロ
モゲン色素複合体を形成する第２の色素中間体、 （ｃ）．上記した４−アミノ色素中間体の４−アミノ基
と第２の色素中間体との間の反応を生じさせて上記クロ
モゲン色素複合体を生成させる酸化剤、及び （ｄ）．上記した化合物が酵素と反応することにより遊
離されるアミノ酸カルボニル基のための受容体、 の組合せからなる酵素検出用試薬に係る。
本発明化合物は酵素と反応して４−アミノピリンを生成
し、４−アミノピリンは酸化剤の存在下で第２の色素中
間体と反応してクロモゲン色素複合体を形成する。この
クロモゲン色素複合体は、フエノールとの反応により生
成されるところの４−アミノピリンの４−モノイミノ誘
導体であるのが望ましい。クロモゲン色素複合体はま
た、アミノ基を含む第２の色素中間体との反応によつて
生成されるアゾ誘導体であつてもよい。４−アミノピリ
ンは溶液中で本質的に無色であり、したがつて色の全て
がクロモゲン色素複合体によつて発現されることからし
て該複合体の測定に対し干渉しない。
Ｌ−ガンマ−グルタミル−４−アミノピリンはガンマ−
グルタミルトランスフエラーゼ（ＧＧＴ）と反応して色
素中間体としての４−アミノピリンを生成し、この４−
アミノピリンはビリルビンオキシダーゼ(BOX)のような
酸化剤の存在下で２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロベ
ンゼンスルホン酸（ＨＤＣＢＳ）のような第２の色素形
成中間体と反応してクロモゲン色素複合体、特に特定試
薬で赤色を呈する複合体を、形成する。フエリシアン化
カリウムのような何れの強力な酸化剤も、クロモゲン色
素複合体の形成反応を促進するために使用することがで
きる。
第２の色素形成中間体としてはフエノール化合物が適当
しており、その例としては２−ヒドロキシ−３，５−ジ
クロロベンゼンスルホン酸、２，５−ジメチルフエノー
ル、及び一般にフエノール類、ナフトール類とそれらの
誘導体がある。酸化剤としてのオキシダーゼには例えば
ビリルビンオキシダーゼ、アスコルバートオキシダー
ゼ、ラツカーゼ、及び過酸化水素または有機過酸化物と
共に用いるペルオキシダーゼ或はマイクロペルオキシダ
ーゼ（チトクロムＣ分子のヘム部分）がある。化学的な
酸化剤としては例えばフエリシアン化カリウムがある。
アゾ色素複合体を形成するための中間体としては例えば
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロオキシ−３−スルホノピ
リル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピルアニリン、或はＮ−スルホプロピルアニリンがあ
る。複素環式アミノ化合物を用いて種々のクロモゲン色
素複合体を形成する方法は周知であり、アーチス(Artis
s)等によりMicrochemical Journal 26,487-505(1981)に
記載されている。K.Tamaoku,et al：Anal.Chem.Acta 13
6,121(1982)及びChem.Pharm.Bull.30,2492（１９８２）
に記載されているようなトリンダー試薬(Trinder′s Re
agents)を、用いることができる。
受容体としては例えば、本発明化合物のアミド基から開
裂されるカルボニル基と反応するグリシルグリシン(gl
y)を用いることができる。他の受容体としては例えば、
グリシルグリシルグリシン或は水がある。
検出可能な酵素にはＬ−ガンマ−グルタミルトランスフ
エラーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、及びアリール
アミダーゼがある。アミノ酸は酵素に対応させて選択さ
れる。
この発明に係る化合物は構造式 で表され、式中φはフエニル、 はアミノ酸基である。
好ましい はＬ−ガンマ−グルタミル基であり、この基をもつ化合
物は通称でＬ−ガンマ−グルタミル−４−アミノピリン
と称し得、正確には１−フェニル−２−メチル−３−メ
チル−４−（Ｌ−ガンマ−グルタミルアミノ）−３−ピ
ラゾリン−５−オンである。他の 基はアラニル基（ で言えばアラニニル基 ）である。この基をもつ化合物は１−フェニル−２−メ
チル−３−メチル−４−アラニルアミノ−３−ピラゾリ
ン−５−オンである。
アミノ酸−４−アミノピリンを調製するためには両アル
フア官能基をマスキングしたグルタミン酸（或は−ＮＨ
２マスクのアラニン）、例えばＮ−ｔ−BOC−Ｌ−グル
タミン酸−アルフア−ベンジルエステル（ここにｔ−BO
Cはｔ−ブチルオキシカルボニル）を、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）及び溶剤（例えばジオキサ
ン或はテトラヒドロフラン）の存在下で４−アミノピリ
ンと先ず０℃で、次に常温で反応させることができる。
αマスクの生成物を反応混合物から分離精製し、次に塩
化メチレン中でトリフルオル酢酸によりBOC基を除去
し、水素添加分解によりアルフア−ベンジル基を除去し
て、グルタミル−４−アミノピリンを遊離させうる。反
応式は次のようである。
他の可能な合成法はMeth.Enzymol 19,789-797(1970)、J.
Chem.Soc.3315(1949)、J.Amer.Chem.Soc.72,2469(1950)
から類推して、またJ.Chem.Soc.886(1957)に類似して出
発無水物の合成、ガンマ−アミド結合の形成、及び次い
でのヒドラジン水和物を用いた脱フタロイルといつた、
次の式で表される方法である。
化合物グルタミル−４−アミノピリンはまた、Ｌ−ガン
マ−グルタミン酸メチルエステルを溶剤（クロロホル
ム）中での塩基の存在下で４−アミノピリンと反応させ
ることによつても製造できる。得られた化合物は使用に
供するため、残留アミンを除去するように精製しなけれ
ばならない。
以下にグルタミル−４−アミノピリンを製造するための
好適した方法を記載する。
工程１ａ Ｎ−（ｔ−BOC）−グルタミン酸−α−ベンジルエステ
ル（33.7重量部(pbw-parts by weight)）とトリエチル
アミン(10.1pbw)とをクロロホルムに溶かした溶液を０
℃に冷却して攪拌し、クロルギ酸イソブチル(13.7pbw)
を１滴ずつ加えて行つた。浴を取去り、反応混合物を１
６時間攪拌した。この時点で４−アミノアンチピリン(2
0.3pbw)を少しずつ加え、反応混合物を常温で１晩攪拌
した。その反応混合物を真空中でストリツピング処理し
た。残分を酢酸エチルと共に微細化し、過した。液
を真空中でストリツピング処理し、ガラス状の残分を得
た。ＮＭＲ及びＭＳ分析により予期した通りの構造を確
認した。粗製品の収量は実質的に定量的であつた。
工程１ｂ Ｎ−CBZ−グルタミン酸−α−ベンジルエステル（５０p
bw）とトリエチルアミン（１５pbw）の冷却（０℃）ク
ロロホルム溶液に、クロロギ酸イソブチル(20.3pbw)を
１滴ずつ加えた。反応混合物を常温で１晩、攪拌した。
その反応混合物を真空中でストリツピング処理し、雪泥
状の残分を酢酸エチルと共に攪拌した。この混合物を
過し、過ケークを酢酸エチルで洗滌した。有機物液
を希HCl、水、重炭酸ナトリウムの希水溶液及び水で洗
浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤を
過除去した上で有機物溶液を真空中でストリツピング処
理し、橙赤色の粘性な油を９７％の収率で取得した。薄
層クロマトグラフイー（シリカゲル、酢酸エチル中にエ
タノール２％）による分析でいくつかの僅かな不純物が
存在することが示された。取得物質をシリカゲル上での
フラツシユクロマトグラフイー法（酢酸エチル中にエタ
ノール２％。空気圧で駆動する短カラムクロマトグラフ
イー法−W.Clark Still et al.：J.Organic Chemistry
43,2923(1978)参照）で精製した。製品はレモン様の黄
色の固体として得られた。ＮＭＲ及びＭＳ分析により構
造を確認した。
工程２ａ：脱ベンジル Ｎ−（ｔ−BOC）−４−（γ−グルタミルアミド）−ア
ンチピリン−α−ベンジルエステル(42.2pbw)のジメチ
ルホルムアミド溶液に、ギ酸アンモニウム(30.0pbw)を
加えた。混合物を、炭素(30.0pbw)上の１０％パラジウ
ムを加えながら攪拌した。攪拌は出発物質が薄層クロマ
トグラフイー（シリカゲル、酢酸エチル中にメタノール
３％）上で認められなくなる迄、継続した。これには約
１時間を要した。反応混合物を短長のCelite（登録商
標）層を通して吸引過した。液を高真空中におい
て、ジメチルホルムアミドの大部分を除去した。残分を
酢酸エチル中にとり、飽和食塩水で洗滌し、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥させた。有機物溶液を過し、液を
真空中でストリツピング処理して純白でない粘性の油を
収穫した。粗物質の収率は９８％であつた。ＮＭＲ及び
ＭＳ分析によつて構造を確認した。
工程３ａ：BOC基の除去、所望の４−（γ−グルタミル
アミド）−アンチピリンの調製 窒素雰囲気下で無水のアセトニトリルに溶かしたＮ−
（ｔ−BOC）−４−（γ−グルタミルアミド）−アンチ
ピリン(21.6pbw)の溶液に、ヨウ化ナトリウム(22.5pbw)
を加えた。混合物を、澄んだ溶液が得られるまで常温で
攪拌した。この溶液に塩化トリメチルシリル(10.8pbw)
を、いちどに加えた。薄層クロマトグラフイー（シリカ
ゲル、１％の酢酸を含む酢酸エチル中にメタノール１０
％）により出発物質が認められなくなる迄、約２時間攪
拌を続けた。反応混合物にメタノールを加え、１５分間
攪拌した上で冷蔵庫に１晩おいた。反応混合物を真空中
でストリツピング処理し、残分をエーテルと３０％の酢
酸水溶液とに分配させた。水溶液相を、エーテルを加え
て洗浄し、次に数粒の重亜硫酸ナトリウム結晶を加えて
脱色した。溶液をAmberlite（登録商標）ＸＡＤ−２レ
ジン床（Rohm & Haas Co.製）を通過させ、最初蒸留水
で、次に１：１のエタノール：蒸留水で、溶離処理し
た。水・エタノールによる溶出液を真空中でストリツピ
ング処理して、所望の生成物を淡黄色ガラス状の形で得
た。ＮＭＲ及びＭＳ分析により構造を確認した。
工程２ｂ：Ｎ−CBZ−４−（γ−グルタミルアミド）−
アンチピリンのマスク除去 無水エタノールにＮ−CBZ−４−（γ−グルタミルアミ
ド）−α−ベンジルエステルを溶かした溶液を、炭素上
の１０％Pdを触媒として用い３気圧の水素ガスで処理し
た。水素の理論量の消費が認められたときに薄層クロマ
トグラフイー（シリカゲル、酢酸１％を含む酢酸エチル
中にメタノール１０％）は、出発物質の痕跡も示さず工
程３ａで得た物質と同一のRfを有する斑点を示した。反
応混合物を、短長のCelite（登録商標）層を通して吸引
過した。液を真空中でストリツピング処理した。残
分である所望の４−（γ−グルタミルアミド）−アンチ
ピリンを、純白でない固体として取得した。構造はＮＭ
Ｒ及び質量分析により確認した。この物質が工程３ａで
得た物質と同一であることは高性能液体クロマトグラフ
イー（ＨＰＬＣ）により、試料を個別的に共通するカラ
ムに注入して通すことによつて示された。
反応過程を次頁に示す。次頁において「Ｒ」は基C6H5CH
を、また「Prot」はBOCとかCBZといつたマスキングに用
いた基を、それぞれ示している。なおアラニル−４−ア
ミノピリンも−NH2マスクのアラニンを出発化合物とし
て利用して同様に合成できる。
〔明細な説明〕 以下に述べる実施例は、供与体基質を用いてガンマ−グ
ルタミルトランスフエラーゼの活性を測定する例に係
る。なお酵素基質アラニル−４−アミノピリンも類似の
方法でアラニンアミノペプチターゼ及びアリールアミダ
ーゼの活性を測定するために用いることができる。
血清中のガンマ−グルタミルトランスフエラーゼ（ＧＧ
Ｔ）の活性を測定する比色法において供与体基質である
Ｌ−ガンマ−グルタミル−４−アミノピリン(gAAP)を、
開裂されるカルボニル部分のための受容体としてのグリ
シルグリシン(gly)と共に用いる。２−ヒドロキシ−
３，５−ジクロルベンゼンスルホル酸はビリルビンオキ
シダーゼ(BOX)の存在下で、遊離される生成物４−アミ
ノアンチピリン(4AAP)と反応して赤色の色素複合体を生
じさせる。この色素複合体の吸光ピークは５１０nmで現
れる。供与体基質は可視スペクトルの全体にわたつて吸
光性を示さない。反応は全ての試薬を単一の作業溶液に
含ませた単一のキユベツト中でおこる。本方法は自動化
に適している。
本方法は呈色生成物を形成するのに無色の供与体基質を
用いる点で有利である。ＧＧＴは、gAAPからガンマ−グ
ルタミルを奪取して生ぜしめられるカルボニル基をグリ
シルグリシンに引渡す。４−アミノアンチピリンが遊離
されて、BOXの存在下でＨＤＣＢＳ（２−ヒドロキシ−
３，５−ジクロロベンゼンスルホン酸）と結合して赤色
の色素複合体を形成する。試料中に存在するＧＧＴの活
性に比例する１分毎の吸光度の変化から、反応を動的に
鑑視できる。BOXはペルオキシダーゼ類似の活性を示す
ラツカーゼ或はアスコルバートオキシダーゼ等の他の酵
素に置き換え得、また過酸化水素または有機過酸化物の
存在下でペルオキシダーゼ或はマイクロペルオキシダー
ゼ自体に置き換え得る。
材料と方法 装置…温度制御可能なキユベツト保持器を備えたＵＶ−
２６０複光束分光計（日本国京都市のSimadzu製）を使
用した。
材料…BOX（ビリルビンオキシダーゼ）はアメリカ合衆
国、バージニア州、トロイのAmano International Co.
から購入した。BOXの１単位を、pH7.0，温度３７℃で１
分間に１μmolのビリルビンを酸化する酵素の量で定義
した。ＨＤＣＢＳ（２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロ
ベンゼンスルホン酸）は、スイス国、チユーリツヒのBi
osynth AGから入手した。ウシＧＧＴ、グリシルグリシ
ン及びTriton X-100はアメリカ合衆国、ミズーリ州、セ
ントルイスのSigma Chemical.Co.から購入し、Tris（ヒ
ドロオキシメチル）アミノメタンはアメリカ合衆国、ニ
ユージヤージー州、フエアローンのFisher Scientific
Co.から購入した。
試薬…単一試薬は１当りBOX 5000単位、gAAP 20.0mmo
l、ＨＤＣＢＳ13.0mmol、グリシルグリシン5.0mmol、５
０mmol／のTris-HCl緩衝液(pH7.9)中でTriton X-100
１５ｇを含む。ＧＧＴの標準品も、Tris-HCl緩衝液（５
０mmol／，pH7.9)で調製した。
手順…１０マイクロリツトルの標準ＧＧＴを、1.0mlの
試薬に加えた。１２０秒間の導入期後に５１０nm，３７
℃での吸光度の変化を１８０秒間、記録した。反応はブ
ランク試薬におけるのと対照的に進行する。
活性度の計算…活性度Ｕ／Ｌ＝（△Ａ／分）×力価。
ここに力価＝（全容量(ml)／試料容量(ml)）×（モル／
マイクロモル）／モル吸光係数＝(1.01/0.01)×(106/2
6,000)＝3385 結果 成分の濃度…反応は、１リツトルの緩衝溶液中にＨＤＣ
ＢＳ13.0mmol、グリシルグリシン5.0mmol、gAAG20.0mmo
l、BOX 500単位が含まれるとき反応混合物中に最大のＧ
ＧＴ活性が生ぜしめられるように、最適となつた。
色素のモル吸光係数…赤色の色素複合体のモル吸光係数
を、gAAPに代えて4AAPの増分を0.100と1.000間の吸光度
値が与えられるよう各種濃度の色素を定量的に生じさせ
るようにして加えることにより、測定した。５１０nmで
の色素のモル吸光係数は26,000Ｌmol-1 cm -1であると算
出された。
ＧＧＴのKm値…ウシの腎臓ＧＧＴのKm値をgAAPについ
て、ラインウイーヴアー・ブルク(Lineweaver-Burk)法
でのプロツトに線形回帰して求めた。本酵素のＮ−（ガ
ンマ−Ｌ−グルタミル）−アルフア−ナフチルアミドを
基質とする画分Ａ及びＢについてのKm値が6.3及び6.8mm
ol／であると報告されている。(Szewezick,A.,et a
l.：Biochemische Zeitschrift338,317-329(1963))のに
対し、ＧＧＴのKm値は約9.9mmol／であると算出され
た。他の文献(Allen,L.M.,et al.：Chem.-Boil.Interac
tions33,361-365(1981))では、ガンマ−グルタミル−ｐ
−ニトロアニリドを基質としてウシの腎臓ＧＧＴのKmと
Vmaxがそれぞれ、0.98mmol／及び１７７マイクロモル
／分／mgであると報告されている。発明者が得たVmaxは
36.8マイクロモル／分／mgであつた。
吸収スペクトル…生成物の最大吸収は５１０nmでみられ
た。供与体基質は可視スペクトルの全体にわたつて吸収
を示さなかつた。
反応経過…３７℃で５１０nmにおけるＧＧＴの反応速度
は約２分後に直線的になつた。
考察 この発明は高モル吸光係数をもつ赤色生成物を形成する
ところの新規な無色の供与体基質gAAPを、利用するもの
である。前述したgluCANA或はgluPAを利用する方法でみ
られていた基質と生成物とのスペクトルの重復は何ら存
在せず、また試料量も１０分の１（１００μから１０
μ）に減少する。
本基質の優れた溶解性、スペクトル特性、高い感受性、
及び自動化に対する適応性からして、本発明は汎用され
ているgluCANA或はgluPAによる方法の好ましい代替法を
提供する。
本方法は血清中のガンマ−グルタミルトランスフエラー
ゼ活性を測定するのに、特に有用である。赤血球を除去
して適当量の血清を、本発明の試薬と接触させればよ
い。赤血球の除去は遠心分離或は過によつて行なわれ
る。
フロントページの続き (72)発明者 ダニエル エス ラーデン アメリカ合衆国、60047 イリノイ州、ホ ーソーン・ウツズ、ジヨン・ドライブ 13 (56)参考文献 特公 昭40−21783（ＪＰ，Ｂ１) Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ 要約番号102：149730ｖ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ 要約番号95：108804ｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ 要約番号88：23359ｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ 要約番号87：15736ｇ

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式 ［式中、 はＬ−ガンマ−グルタミル基又はアラニル基である。］
    で表される化合物。
  2. 【請求項２】アミノ酸を結合したアミノ色素中間体を用
    いる酵素検出法であって、アミノ酸を酵素により上記ア
    ミノ色素中間体を形成するように除去し、次に該アミノ
    色素中間体を第２の色素中間体と結合させてクロモゲン
    を形成する酵素検出法において、 （ａ）．式 ［式中、 はＬ−ガンマ−グルタミル基又はアラニル基である。］
    で表される化合物を、酵素との反応により生成されるア
    ミノ酸カルボニル基用の受容体と共に水溶液の形で設
    け、 （ｂ）．上記化合物を酵素と反応させて、式 で表される４−アミノ色素中間体、及びアミノ酸カルボ
    ニル基と上記受容体との反応生成物を形成し、 （ｃ）．上記した４−アミノ色素中間体を酸化剤の存在
    下で第２の色素中間体と反応させて、４−アミノ色素中
    間体の４−アミノ基と第２の色素中間体との反応生成物
    であるクロモゲン色素複合体を形成する、 ことを特徴とする酵素検出法。
  3. 【請求項３】前記した第２の色素中間体がアニリン、ナ
    フトール又はフェノール化合物であり、前記したクロモ
    ゲン色素複合体が前記化合物の４−モノイミノ誘導体で
    ある請求項２の酵素検出法。
  4. 【請求項４】前記した第２の色素中間体が２−ヒドロキ
    シ−３，５−ジクロロベンゼンスルホン酸である請求項
    ２の酵素検出法。
  5. 【請求項５】グルタミルトランスフェラーゼの検出法で
    あって、 （ａ）．１−フェニル−２−メチル−３−メチル−４−
    （Ｌ−ガンマ−グルタミルアミノ）−３−ピラゾリン−
    ５−オンを、グルタミルトランスフェラーゼとＬ−ガン
    マ−グルタミル基との反応により生成されるグルタミル
    カルボキシ基用の受容体と共に水溶液の形で設け、 （ｂ）．この水溶液中にグルタミルトランスフェラーゼ
    を導入して、アミノ色素中間体としての１−フェニル−
    ２−Ｎ−メチル−３−メチル−４−アミノ−３−ピラゾ
    リン−５−オン、及びグルタミルカルボキシ基と上記受
    容体との反応生成物を形成し、 （ｃ）．１−フェニル−２−Ｎ−メチル−３−メチル−
    ４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オンを酸化剤及び第
    ２の色素中間体と反応させて、アミノ色素中間体の４−
    アミノ基と第２の色素中間体との反応生成物である色素
    複合体を形成する、検出法。
  6. 【請求項６】前記した第２の色素中間体が２−ヒドロキ
    シ−３，５−ジクロロベンゼンスルホン酸である請求項
    ５の検出法。
  7. 【請求項７】前記酸化剤がオキシダーゼである請求項６
    の検出法。
  8. 【請求項８】前記オキシダーゼがビリルビンオキシダー
    ゼである請求項７の検出法。
  9. 【請求項９】前記酸化剤がフェリシアン化カリウムであ
    る請求項５の検出法。
  10. 【請求項１０】アミノ酸を除去してアミノ色素中間体を
    形成する酵素を、上記アミノ色素中間体を酸化剤の存在
    下で第２の色素中間体と反応させてクロモゲンを形成す
    ることにより検出する酵素検出用試薬であって、 （ａ）．式 ［式中、 はＬ−ガンマ−グルタミル基又はアラニル基である。］
    で表され、上記酵素と反応して式 で表される４−アミノ色素中間体を形成する化合物、 （ｂ）．上記した４−アミノ色素中間体と反応してクロ
    モゲン色素複合体を形成する第２の色素中間体、 （ｃ）．上記した４−アミノ色素中間体の４−アミノ基
    と第２の色素中間体との間の反応を生じさせて上記クロ
    モゲン色素複合体を生成させる酸化剤、及び （ｄ）．上記した化合物が酵素と反応することにより遊
    離されるアミノ酸カルボニル基のための受容体、 の組合せからなる酵素検出用試薬。
  11. 【請求項１１】前記した第２の色素中間体がフェノール
    化合物であり、前記したクロモゲン色素複合体が４−モ
    ノイミノ化合物である請求項１０の酵素検出用試薬。
  12. 【請求項１２】前記フェノール化合物が２−ヒドロキシ
    −３，５−ジクロロベンゼンスルホン酸である請求項１
    １の酵素検出用試薬。
  13. 【請求項１３】前記酸化剤がオキシダーゼである請求項
    １２の酵素検出用試薬。
  14. 【請求項１４】前記オキシダーゼがビリルビンオキシダ
    ーゼである請求項１３の酵素検出用試薬。
  15. 【請求項１５】前記酸化剤がフェリシアン化カリウムで
    ある請求項１０の酵素検出用試薬。
JP1152038A 1988-06-15 1989-06-14 酵素活性測定用の化合物、酵素の検出法及び検出用試薬 Expired - Lifetime JPH0641453B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US206,835 1988-06-15
US07/206,835 US5116730A (en) 1988-06-15 1988-06-15 Amino acid substituted 4-aminophenazones for measuring enzyme activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0242063A JPH0242063A (ja) 1990-02-13
JPH0641453B2 true JPH0641453B2 (ja) 1994-06-01

Family

ID=22768176

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1152038A Expired - Lifetime JPH0641453B2 (ja) 1988-06-15 1989-06-14 酵素活性測定用の化合物、酵素の検出法及び検出用試薬

Country Status (6)

Country Link
US (1) US5116730A (ja)
EP (1) EP0346870A3 (ja)
JP (1) JPH0641453B2 (ja)
KR (1) KR910004208B1 (ja)
AU (1) AU602295B2 (ja)
CA (1) CA1340131C (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5432274A (en) * 1993-07-28 1995-07-11 National Research Council Of Canada Redox dye and method of preparation thereof using 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin and 1,1'-dimethylferrocene
US6011052A (en) * 1996-04-30 2000-01-04 Warner-Lambert Company Pyrazolone derivatives as MCP-1 antagonists

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5569549A (en) * 1978-11-16 1980-05-26 Nitto Boseki Co Ltd Novel substrate for determination of enzyme activity
JPS58198756A (ja) * 1982-05-14 1983-11-18 Nitto Boseki Co Ltd 新規な５−アミノサリチル酸の定量法
US4511651A (en) * 1982-07-30 1985-04-16 American Monitor Corporation Reagent composition and assay for the determination of γ-glutamyltransferase activity
US4567138A (en) * 1982-08-30 1986-01-28 Beckman Instruments, Inc. Method for determining γ-glutamyltransferase activity and kits containing a novel substrate solution for use therein
US4588836A (en) * 1982-09-01 1986-05-13 Toyo Jozo Kabushiki Kaisha Novel synthetic substrate and assay method using the same
JPS61260900A (ja) * 1985-05-11 1986-11-19 Wako Pure Chem Ind Ltd γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定方法
US4751178A (en) * 1985-09-26 1988-06-14 Eastman Kodak Company Substrates, compositions, elements and methods for the determination of gamma-glutamyltransferase

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ要約番号１０２：１４９７３０ｖ
ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ要約番号８７：１５７３６ｇ
ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ要約番号８８：２３３５９ｅ
ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ要約番号９５：１０８８０４ｒ

Also Published As

Publication number Publication date
EP0346870A2 (en) 1989-12-20
EP0346870A3 (en) 1991-08-07
US5116730A (en) 1992-05-26
KR910004208B1 (ko) 1991-06-24
CA1340131C (en) 1998-11-17
JPH0242063A (ja) 1990-02-13
AU602295B2 (en) 1990-10-04
AU3606889A (en) 1989-12-21
KR900000342A (ko) 1990-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5035999A (en) Aminoluciferin derivatives, processes for the production thereof and their application in the determination of enzyme activities
Miska et al. Synthesis and characterization of luciferin derivatives for use in bioluminescence enhanced enzyme immunoassays. New ultrasensitive detection systems for enzyme immunoassays, I.
EP0553741B1 (en) Fluorogenic and chromogenic betalactamase substrates
AU674385B2 (en) Method for the colorimetric determination of an analyte with a PQQ-dependent dehydrogenase
Fujiwara et al. New chromogenic and fluorogenic substrates for pyrrolidonyl peptidase
CS245763B2 (en) Agent for demonstration of proteolytical ferments
US4806423A (en) Agents and process for the detection of esterolytic and/or proteolytic enzymes
SU786853A3 (ru) Способ определени активности х-пролилдипептидиламинопептидазы
EP0157327A2 (en) Novel compounds for detecting the presence of hydrolytic analytes in a test sample
US4209459A (en) Novel L-leucyl-4-hydroxyanilide derivatives
Kerr et al. Catalysis by serine proteases and their zymogens. Study of acyl intermediates by circular dichroism
JPH0873422A (ja) 新規アミノ酸エステルおよび白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの検出方法
Kimura et al. New reagents for the introduction of the thiomethyl group at sulfhydryl residues of proteins with concomitant spectrophotometric titration of the sulfhydryls: methyl 3-nitro-2-pyridyl disulfide and methyl 2-pyridyl disulfide
JPH0641453B2 (ja) 酵素活性測定用の化合物、酵素の検出法及び検出用試薬
EP0224254B1 (en) a novel substrate for plasma kallikrein and a method for measuring biological components using the same
US5081259A (en) Novel amino acid substituted 4-aminophenazones for measuring enzyme activity
US4384041A (en) Assay method of enzyme activity
KR890004092B1 (ko) 과산화수소, 과산화염-작용화합물 및 과산화효소의 결정을 위한 방법 및 시약조성물
US6503725B2 (en) Composition and device for detecting leukocytes in urine
FR2509324A1 (fr) Substrat pour doser la a-glutamyl transpeptidase et methode de dosage utilisant ce substrat
Kuromizu et al. New fluorogenic substrate for esterase activity of α-chymotrypsin and related enzymes
US4191809A (en) Method of measuring enzymatic activity using novel peptide derivatives
US4894438A (en) Synthetic peptidic substrate for determination of trypsin and α1
US4260681A (en) Reagent system and method for assaying peptidase enzymes
KOKOTOS et al. Fluorogenic substrates for chymotrypsin with new fluorescent markers