JP6017194B2 - 骨、軟骨または皮膚に関連する疾患の治療もしくは予防剤 - Google Patents

Description

本発明は、天然コラーゲン由来のペプチド等を含有する骨、軟骨または皮膚に関連する疾患の治療もしくは予防剤に関する。

コラーゲン由来のペプチド分子に関しては、様々な薬理作用を有することが知られいる。例えば、特許文献１には、Ｈｙｐ−Ｐｒｏ等のジペプチドが破骨細胞分化抑制作用、アルカリフォスファターゼ抑制作用等を有することが記載されている。また、非特許文献１には、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ等のペプチドが抗酸化作用を有することが記載されている。

ＷＯ２０１０／０３８３２３

日本アミノ酸学会第５回学術大会（JSAAS2011）要旨集,p74

本発明が解決しようとする課題は、天然コラーゲン由来のペプチドを含有する、従来技術よりも優れた骨、軟骨または皮膚に関連する疾病の治療もしくは予防剤を提供することにある。

本発明者らは、鋭意検討した結果、天然コラーゲン由来のペプチドであるＨｙｐ−Ｇｌｙ−ＰｒｏおよびＨｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐが優れたヒアルロン酸産生促進作用、色素沈着抑制作用、アルカリフォスファターゼ抑制作用および破骨細胞分化抑制作用を有することを見出して、本発明を完成させるに至った。即ち本発明は、以下の通りである。

［１］ Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐまたはこれらの薬学上許容される塩を含有する、骨、軟骨または皮膚に関連する疾患の治療もしくは予防剤。
［２］ ヒアルロン酸産生促進剤、色素沈着抑制剤、アルカリフォスファターゼ活性抑制剤または前駆破骨細胞分化抑制剤である、［１］記載の治療もしくは予防剤。
［３］ 骨粗しょう症、変形性関節炎または光老化の治療もしくは予防剤である、［１］記載の治療もしくは予防剤。
［４］ Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐまたはこれらの薬学上許容される塩を含有する、飲食品、化粧品または飼料。

本発明によって、天然コラーゲン由来のペプチドを含有する、従来技術よりも優れた骨、軟骨または皮膚に関連する疾病の治療もしくは予防剤を提供することができる。
また、本発明の治療もしくは予防剤は、天然コラーゲンに由来するペプチドであるＨｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐを含有するため、日常的に摂取または塗布しても極めて安全である。そこで、本ペプチド等のかかる効果を利用して、本ペプチド等を含有する飲食品、化粧品または飼料としても有用である。

以下、本発明を詳細に説明する。
１．Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐまたはこれらの薬学上許容される塩
本発明に用いられるペプチドは、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−ＰｒｏおよびＨｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐであり、本ペプチドは薬学上許容される塩とすることができる。好ましいペプチドとして、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏが挙げられる。
「薬学上許容される塩」としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩等の有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が挙げられる。

本ペプチドは、例えば「固相合成法」および「液相合成法」（例えば、特開２００３−１８３２９８）等で合成することができる。なお、固相合成法の場合はさらにＦｍｏｃ法とＢｏｃ法の方法が知られており、本ペプチドはいずれの方法で合成してもよい。固相合成法の例を、以下に具体的に説明する。表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として用い、縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミドを用いる。まず、Ｃ末のアミノ酸のアミノ基をＦｍｏｃ基またはＢｏｃ基で保護して、上記ポリスチレン高分子ゲルのアミノ基とペプチド結合を形成させる。固相を溶媒でよく洗い、残存する試薬、アミノ酸を洗浄・除去し、その後、固相に結合しているアミノ酸のアミノ基の保護基を除去する。続いて、アミノ基を保護したアミノ酸を用いて、順次、同様の反応を繰り返すことで、固相上でペプチドを合成する。最後に、固相をトリフルオロ酢酸で温浸させることで、ペプチドを固相から切り離すことで、ペプチドを合成することができる。
本ペプチドは、ゼラチンにエンド型プロテアーゼおよびエキソ型プロテアーゼの２種以上を組み合わせて加水分解することによっても製造することができる。

本発明において、本ペプチドは化学修飾されていても良い。化学修飾はアミノ酸単位で行われうるが、例えば、ヒドロキシプロリンの水酸基、Ｎ末アミノ酸のアミノ基およびＣ末アミノ酸のカルボキシル基が挙げられる。このような化学修飾によって、弱酸性から中性で溶解可能にでき、後述する他の有効成分との相溶性向上なども可能となる。
具体的には、ヒドロキシプロリンの水酸基の化学修飾としては、例えばＯ−アセチル化等が挙げられる。Ｎ末アミノ酸のアミノ基の化学修飾としては、例えばポリペプチジル化、スクシニル化、マレイル化、アセチル化、脱アミノ化、ベンゾイル化、アルキルスルホニル化、アリルスルホニル化、ジニトロフェニル化、トリニトロフェニル化、カルバミル化、フェニルカルバミル化、チオール化等が挙げられる。Ｃ末アミノ酸のカルボキシル基の化学修飾としては、例えばエステル化、アミド化等が挙げられる。さらに、本ペプチドをカチオン化する場合は、エチレンジアミン化、スペルミン化などを行うことができる。

化学修飾の具体的手段や処理条件は、通常のペプチドの化学修飾技術が適用される。例えば、ヒドロキシプロリンの水酸基のＯ−アセチル化は水溶媒中または非水溶媒中で無水酢酸を作用させることなどによって行うことができる。例えば、Ｃ末アミノ酸のカルボキシル基のエステル化はメタノールへの懸濁後に乾燥塩化水素ガスを通気することなどによって行うことができ、そのアミド化はカルボジイミドなどを作用させることによって行うことができる。さらに、化学修飾のその他の具体例として、特公昭６２−４４５２２号公報や特公平５−７９０４６号公報等に記載の化学修飾技術が適用できる。

２．骨、軟骨または皮膚に関連する疾患の治療もしくは予防剤
本ペプチド等は、後述の評価試験に記載の通り、線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進作用、前駆軟骨細胞のアルカリフォスファターゼ抑制作用、および破骨細胞の分化抑制作用を有する。従って、本ペプチド等は、骨、軟骨または皮膚に関連する疾患を治療もしくは予防することができる。
「骨、軟骨または皮膚に関する疾患」としては、例えば、骨粗しょう症、骨ペイジェット病、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症等の骨カルシウム代謝疾患治療；関節炎、慢性進行性関節炎、変形性関節炎、コラーゲン誘導性関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節炎、リウマチ性関節炎、若年性慢性関節リウマチ及びその他のリウマチ性疾患；光老化、切り傷、刺し傷、術創、褥瘡、やけど（熱、凍結、化学物質、電気及び放射線等による）、皮膚の擦過又は暴行、骨髄炎、整形外科的創傷、肌荒れ等が挙げられる。

本発明の治療もしくは予防剤は、経口的に又は非経口的に種々の形態の医薬製剤で投与することができる。その形態としては、経口的に投与する場合は、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉剤、液剤、懸濁製剤、乳化製剤等が挙げられ、非経口的に投与する場合は、例えば、注射剤、経皮剤、坐剤、点鼻剤及び吸入剤等が挙げられる。好ましくは、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、患部に直接投与する液剤等が挙げられる。なお、本ペプチドは、消化管でアミノ酸への分解もほとんど起こらず、腸管で迅速に吸収されるため、経口投与による摂取が好適である。
本ペプチドの投与量は、患者の状態や体重、化合物の種類、投与経路等によって異なるが、成人１日当たり、経口投与の場合は、例えば、約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１〜５００ｍｇ、より好ましくは約１０〜２００ｍｇが挙げられ、患部に直接投与する場合は、例えば、約０．０１〜２００ｍｇ、好ましくは約０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは約１〜５０ｍｇが挙げられる。その他の形態の製剤は、これらの投与量を参考にして適宜決めることができる。これら製剤は、１日１〜数回に分けて投与するか、または１〜数日に１回投与することができる。

本発明の治療もしくは予防剤は、本発明の効果を害しない範囲で、適宜他の有効成分や製剤用の成分を含有させても良い。
他の有効成分として、例えばグルコサミンまたはその薬学上許容される塩、コンドロイチン硫酸などが挙げられる。特に、グルコサミンまたはその薬学上許容される塩は、本ペプチドによる効果を向上させる働きがあるため好ましい。他の有効成分として、骨塩の沈着促進のために、カルシウム、糖転移ヘスペリジン等を用いることができ、またコラーゲンの合成・沈着促進等のためにビタミンＣ等を用いることもできる。さらに、他の有効成分として、本ペプチド以外のペプチドまたはアミノ酸を含んでいても良い。その場合、コラーゲンまたはゼラチンを加水分解して本ペプチドを含有するコラーゲンペプチドを得て、精製せずにそのまま混合物として使用することもできる。

他の有効成分の配合量としては、各々の作用に応じて適宜、変更することができるが、例えば、本発明の治療もしくは予防剤に対して０．００１〜２０重量部で用いることができ、好ましくは０．０１〜２０重量部の割合が挙げられる。特に、グルコサミンまたはその薬学上許容される塩の場合は、５〜１５重量部の割合とすることが好ましい。５重量部未満では特定構造のペプチド分子の効果を向上させる効果が充分に発揮されないおそれがあり、１５重量部を超えると尿や糞中に排出され、過剰摂取となるおそれがある。

医薬製剤に製剤化する際に用いる薬学上許容される担体としては、希釈剤、結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポリビニルピロリドン）、賦形剤（乳糖、ショ糖、コーンスターチ、リン酸カリウム、ソルビット、グリシン）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ）、崩壊剤（バレイショデンプン）および湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム）等を挙げることができる。本医薬製剤は、従来公知の方法に従って、本ペプチド、他の有効成分、薬学上許容される担体等を混合して製造することができる。

３．飲食品、化粧品または飼料
本ペプチド等は、天然コラーゲンに由来するペプチドであるため、日常的に摂取または塗布しても極めて安全である。そこで、本ペプチド等の優れたヒアルロン酸産生促進作用、アルカリフォスファターゼ抑制作用および破骨細胞分化抑制作用等の効果を利用した、本ペプチド等を含有する飲食品、化粧品または飼料としても有用である。本発明の飲食品、化粧品または飼料における本ペプチド等は、利用する効果に応じて適宜、含有量を変更して用いることができる。

以下、本発明を実施例、比較例、評価試験によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

実施例１、２および比較例１、２
前記のペプチド固相合成法を用いて、以下のペプチドを合成した。
（実施例１）Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
（実施例２）Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ
（比較例１）Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ
（比較例２）Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ
これらのペプチドはいずれも公知のペプチドである。

評価試験１
［ヒアルロン酸産生促進作用］
J. R. Martinsらのヒアルロン酸測定法（Anal Biochem., 319(1): 65-72 (2003)）に準じて評価した。
ヒアルロン酸は、分子量1000〜5000ｋDaの陰イオン性多糖でグルクロン酸−アセチルグルコサミンのニ糖の繰り返しで構成されている。正常ヒト皮膚線維芽細胞ＮＨＤＦ（クラボウ社製）における細胞当たりのヒアルロン酸産生量を測定して、コントロールに対するヒアルロン酸産生促進作用を評価した。
本試験において、測定キットはR&D社製DuoSet（製品コードDY3614）を使用した。ＮＨＤＦ細胞を８×１０^３cells/wellになるように９６ウェルプレートに播種し、接着安定後、サンプルを添加した。添加後２４時間の培地上清を試験試料とした。試料中のヒアルロン酸量をアグリカンとヒアルロン酸が会合体を形成する性質を利用し、サンドイッチ法を用いてヒアルロン酸のみを特異的に検出・定量した。以下にその試験結果を記す。

評価試験２
［色素沈着抑制作用］
近年、チロシナーゼに関連するタンパクであるTRP-1とTRP-2が黒色のユーメラニン生成に関与することが、遺伝子レベルおよびタンパクレベルで明らかにされた。特に、TRP-1はbrown遺伝子座の産物であり、５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸（DHICA）酸化活性を有すること、TRP-2はslaty遺伝子座の産物であり、ドーパクロームからDHICAへの異性化を触媒する酵素と同一であることが示された。これら３種の酵素の協調的な発現により黒色のメラニンが生成する。本試験ではマウスＢ１６メラノーマ細胞を用いて、上記酵素TRP-1、TRP-2の発現抑制効果を確認した。
メラノーマ細胞を２×１０^４cells/ml×１０mlの濃度で１００mmシャーレに播種し、２日間、前培養を行った後、培地を試験用無血清DMEM/F12(1:1)培地に変え、試料を添加し、３日間培養した。培養後、回収した細胞にTrizol溶液を1ml加え、プロトコールに従ってtotal RNAを調整した。そして、逆転写酵素にて逆転写し、リアルタイムPCRにて各遺伝子発現量を測定した。GAPDHにて各値を補正し、controlを1.0とし、各遺伝子発現量を計算した。

評価試験３
［アルカリフォスファターゼ抑制作用］
Y. Nakamuraらの軟骨細胞分化培養法（J Pharmacol Sci 109, 413-423 (2009)）に準じて評価した。
前軟骨細胞ＡＴＤＣ５は、数日間（約５〜７日間）培養することで石灰化を起こし、さらに培養することで肥大化、石灰化、最後はアポトーシスへと分化していく性質を持った細胞である。この前軟骨細胞の石灰化を抑制することは、関節軟骨を想定した場合に変形性関節症などの関節炎によって起こる痛みの原因（石灰化）を緩和、若しくは遅延できると想定しており、軟骨の再生をin virtoで評価できる系として汎用されている。ＡＴＤＣ５が石灰化を起こす前兆としてアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ：リン酸モノエステル加水分解酵素）を細胞膜上に排出させることが知られている。このＡＬＰの基質となるナフトール又はその誘導体のリン酸エステルがＡＬＰに分解されて生じるナフトール又は誘導体がジアゾカップリング反応を起こして、不溶性のアゾ色素を生じる。これらの反応を利用して、ＡＴＤＣ５が石灰化するステップに移る前過程を抑制可能かどうか検証するスクリーニング系である。ＡＴＤＣ５細胞を１×１０^４個/wellになるように播種し、７日間培養した。
試験時には培地を捨て、まずＰＢＳで２回洗浄、0.1% TritonX-100を含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH 7.5) 100μl/wellを加えて、細胞けん濁液Ａを作製した。次に、0.05M ２−アミノ−２−メチルプロパノール、2mM ＭｇＣｌ_２および10mM ｐ−ニトロフェニルホスホン酸の染色液Ｂを作製した。この染色液Ｂ 200μlに細胞けん濁液Ａを10μl添加した。37℃で30分間、反応させ、反応後速やかに、405nmのｐ−ニトロフェノールの吸光度を測定した。コントロールのＡＬＰ活性を１００％とした各ペプチドのＡＬＰ活性の値を、以下に記す。

評価試験４
［破骨細胞分化抑制作用］
Y. Kobayashiらの破骨細胞分化培養法（J. Bone Miner. Metab., 22: 318-328 (2004)）に準じて評価した。
造血細胞を用いた破骨細胞形成系で実験を行なった。８週齢の雄性ddyマウス(東京実験動物)から大腿骨、脛骨を摘出し、筋肉、軟骨などをきれいに取り除いた。骨髄細胞は骨髄空から採取し、シャーレ上で10%FBS(GIBCO)、ロイコプロール(協和発酵)2 uint/ml、ペニシリンGカリウム(明治製菓) 100 units/mlを添加したα-ＭＥＭ（Minimum Essential Medium Alpha Medium培地：GIBCO)を用い、37℃、5%ＣＯ_２の条件下で培養した。３日後、T-EDTA(SIGMA)によりマクロファージ様造血細胞を採取した。洗浄後1400Gで４分間遠心し、実験に用いる培地へ交換を行い、培養を開始した。培地交換は２日後に行った。
分離したマクロファージ様造血細胞を１×１０^４/100μL/wellづつ96well細胞培養プレートに播種した。コントロールとして20 ng/mLのＭ−ＣＳＦ（R&D）および10 ng/mLのRANKL（WAKO）を添加し、さらにペプチドを各々(total)1mM添加した。96well細胞培養プレート上に播種したものは、培養約64時間後に100%メタノール(WAKO)で固定した。３又は４回水洗後、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（TRAP）染色試液SIGMA-ALDRICH 387A-IKT（SIGMA）と37℃で5分間反応させ、光学顕微鏡下で観察した。TRAP陽性多核細胞形成および数を測定した後、顕微鏡デジタルカメラシステムPenguin 600CL（ピクセラコーポレーション）を用いて、細胞画像を取り込み、上記システム専用ソフトウェアであるIn Studio（ピクセラコーポレーション）を用いて画像解析を行った。

本発明によって、従来技術よりも優れた骨、軟骨または皮膚に関連する疾病の治療もしくは予防剤を提供することができ、またその効果を利用した飲食品、化粧品または飼料を提供することができる。

Claims (4)

1. Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐまたはこれらの薬学上許容される塩を含有する、骨、軟骨または皮膚に関連する疾患の治療もしくは予防剤。
2. ヒアルロン酸産生促進剤、色素沈着抑制剤、アルカリフォスファターゼ活性抑制剤または前駆破骨細胞分化抑制剤である、請求項１記載の治療もしくは予防剤。
3. 骨粗しょう症、変形性関節炎または光老化の治療もしくは予防剤である、請求項１記載の治療もしくは予防剤。
4. Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐまたはこれらの薬学上許容される塩を含有する、骨、軟骨または皮膚に関連する疾患の治療もしくは予防のための飲食品、化粧品または飼料。