JP2015059087A - 変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】従来技術よりも優れた変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤、および前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤を提供すること。【解決手段】Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaからなる群から選択される少なくとも1つのペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤、および前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤。【選択図】なし
Description
本発明は、ペプチド分子等を含有する変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤等に関する。
関節軟骨には血管系が存在しないため、血管が存在する骨組織と比較すると、その修復や再生が困難である。これは、関節(摺動部)軟骨細胞および肋軟骨組織において特に顕著である。関節軟骨の修復や再生が充分でなければ、関節軟骨を支える骨組織が疎となって、関節部の機能に支障をきたす結果、変形性関節炎を発症することになる。また、関節軟骨細胞は増殖しないとされており、存在する関節軟骨細胞がアポトーシスを起こして徐々に減少していくとも言われている。
骨粗鬆症は、骨の絶対量の減少を生じているが骨の質的な変化を伴わない状態をいう。骨は絶えず吸収、形成されており、吸収率と形成率に差を生じ、骨形成が負の平衡となれば骨粗しょうが起こる。骨の吸収は破骨細胞によって行われ、破骨細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨の吸収率は高くなる。一方、骨の形成は骨芽細胞によって行われ、骨芽細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨の形成率は高くなる。
骨粗鬆症は、骨の絶対量の減少を生じているが骨の質的な変化を伴わない状態をいう。骨は絶えず吸収、形成されており、吸収率と形成率に差を生じ、骨形成が負の平衡となれば骨粗しょうが起こる。骨の吸収は破骨細胞によって行われ、破骨細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨の吸収率は高くなる。一方、骨の形成は骨芽細胞によって行われ、骨芽細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨の形成率は高くなる。
従来、変形性関節症の治療および予防のための方法としては、関節局所への高分子ヒアルロン酸の注入が一般的であった。しかし、感染等の問題もあり、最近、様々な改良が提案されている。例えば、特許文献1には、関節炎治療および軟骨や靱帯損傷の予防食品として有用な、コラーゲンペプチドおよびグルコサミン塩を含み、pHが2〜5である関節強化飲料が記載されている。特許文献2には、コラーゲン成分またはゼラチン成分をコラゲナーゼ酵素を用いて分解して得られる、アミノ酸配列がGly−X−Yのトリペプチドを有効成分とする慢性関節リウマチまたは変形性関節症の改善剤、および骨粗鬆症の予防または改善剤等が記載されている。特許文献3には、コラーゲンおよびコラーゲンペプチドから選ばれた少なくとも1種と、アミノ糖と、ムコ多糖類およびウロン酸から選ばれた少なくとも1種を含有することを特徴とする経口関節障害治療剤または機能性食品が記載されている。特許文献4には、Pro−Hypを含有する関節軟骨再生促進剤が記載されている。特許文献5には、Hyp−Glyを含有する骨粗鬆症抑制剤および変形性関節炎抑制剤が記載されている。
本発明が解決しようとする課題は、従来技術よりも優れた変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤、および前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤を提供することにある。
本発明者らは、鋭意検討した結果、Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaならびにこれらの組合せに、関節軟骨の変性マーカーを有意に減少させ、骨分化マーカーを有意に増加させ、前駆軟骨細胞および骨芽細胞を増殖促進させる優れた効果があることを見出して、本発明を完成させるに至った。即ち本発明は、以下の通りである。
[1] Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaからなる群から選択される少なくとも1つのペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤。
[2] Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaからなる群から選択される2つ以上のペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を含有する、[1]に記載の変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤。
[3] Glu−Hyp−GlyおよびGlu−Hypの2つのペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を必須成分として含有する、[2]に記載の変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤。
[4] Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaからなる群から選択される少なくとも1つのペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、前駆細胞または骨芽細胞の増殖促進剤。
[5] Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaからなる群から選択される2つ以上のペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を含有する、[3]に記載の前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤。
[6] Glu−Hyp−GlyおよびGlu−Hypの2つのペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を必須成分として含有する、[5]に記載の前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤。
[1] Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaからなる群から選択される少なくとも1つのペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤。
[2] Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaからなる群から選択される2つ以上のペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を含有する、[1]に記載の変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤。
[3] Glu−Hyp−GlyおよびGlu−Hypの2つのペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を必須成分として含有する、[2]に記載の変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤。
[4] Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaからなる群から選択される少なくとも1つのペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、前駆細胞または骨芽細胞の増殖促進剤。
[5] Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaからなる群から選択される2つ以上のペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を含有する、[3]に記載の前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤。
[6] Glu−Hyp−GlyおよびGlu−Hypの2つのペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を必須成分として含有する、[5]に記載の前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤。
Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaは、下記の評価試験1〜5に記載の通り、前駆軟骨細胞のアルカリフォスファターゼ(ALP)活性を抑制し、前駆軟骨細胞の増殖を促進し、骨芽細胞の石灰化を促進し、骨芽細胞の細胞増殖を促進する。従って、本発明によって、本ペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤、および前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤を提供することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
1.ペプチド
Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Ala(以下、本ペプチドと言うことがある)は、薬学上許容される塩とすることができる。本ペプチドは、2つ以上を組合せて用いこともできる。
「薬学上許容される塩」としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩等の有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が挙げられる。
1.ペプチド
Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Ala(以下、本ペプチドと言うことがある)は、薬学上許容される塩とすることができる。本ペプチドは、2つ以上を組合せて用いこともできる。
「薬学上許容される塩」としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩等の有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が挙げられる。
本ペプチドは、例えば「固相合成法」および「液相合成法」(例えば、特開2003−183298)等で合成することができる。なお、固相合成法の場合はさらにFmoc法とBoc法の方法が知られており、本ペプチドはいずれの方法で合成してもよい。固相合成法の例を、以下に具体的に説明する。表面をアミノ基で修飾した直径0.1mm程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として用い、縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミドを用いる。まず、C末のアミノ酸のアミノ基をFmoc基またはBoc基で保護して、上記ポリスチレン高分子ゲルのアミノ基とペプチド結合を形成させる。固相を溶媒でよく洗い、残存する試薬、アミノ酸を洗浄除去し、その後、固相に結合しているアミノ酸のアミノ基の保護基を除去する。続いて、アミノ基を保護したアミノ酸を用いて、順次、同様の反応を繰り返すことで、固相上でペプチドを合成する。最後に、固相をトリフルオロ酢酸で温浸させることで、ペプチドを固相から切り離すことで、ペプチドを合成することができる。
本ペプチドは、ゼラチンにエンド型プロテアーゼおよびエキソ型プロテアーゼの2種以上を組み合わせて加水分解することによっても製造することができる。また、上記加水分解をしたペプチド混合物自体またはこれを部分精製した混合物を、本発明に用いることもできる。
本ペプチドは、ゼラチンにエンド型プロテアーゼおよびエキソ型プロテアーゼの2種以上を組み合わせて加水分解することによっても製造することができる。また、上記加水分解をしたペプチド混合物自体またはこれを部分精製した混合物を、本発明に用いることもできる。
本発明において、本ペプチドは化学修飾されていても良い。化学修飾はアミノ酸単位で行われうるが、例えば、ヒドロキシプロリンの水酸基、N末アミノ酸のアミノ基およびC末アミノ酸のカルボキシル基が挙げられる。このような化学修飾によって、弱酸性から中性で溶解可能にでき、後述する他の有効成分との相溶性向上なども可能となる。
具体的には、ヒドロキシプロリンの水酸基の化学修飾としては、例えばO−アセチル化等が挙げられる。N末アミノ酸のアミノ基の化学修飾としては、例えばポリペプチジル化、スクシニル化、マレイル化、アセチル化、脱アミノ化、ベンゾイル化、アルキルスルホニル化、アリルスルホニル化、ジニトロフェニル化、トリニトロフェニル化、カルバミル化、フェニルカルバミル化、チオール化等が挙げられる。C末アミノ酸のカルボキシル基の化学修飾としては、例えばエステル化、アミド化等が挙げられる。さらに、本ペプチドをカチオン化する場合は、エチレンジアミン化、スペルミン化などを行うことができる。
具体的には、ヒドロキシプロリンの水酸基の化学修飾としては、例えばO−アセチル化等が挙げられる。N末アミノ酸のアミノ基の化学修飾としては、例えばポリペプチジル化、スクシニル化、マレイル化、アセチル化、脱アミノ化、ベンゾイル化、アルキルスルホニル化、アリルスルホニル化、ジニトロフェニル化、トリニトロフェニル化、カルバミル化、フェニルカルバミル化、チオール化等が挙げられる。C末アミノ酸のカルボキシル基の化学修飾としては、例えばエステル化、アミド化等が挙げられる。さらに、本ペプチドをカチオン化する場合は、エチレンジアミン化、スペルミン化などを行うことができる。
化学修飾の具体的手段や処理条件は、通常のペプチドの化学修飾技術が適用される。例えば、ヒドロキシプロリンの水酸基のO−アセチル化は水溶媒中または非水溶媒中で無水酢酸を作用させることなどによって行うことができる。例えば、C末アミノ酸のカルボキシル基のエステル化はメタノールへの懸濁後に乾燥塩化水素ガスを通気することなどによって行うことができ、そのアミド化はカルボジイミドなどを作用させることによって行うことができる。さらに、化学修飾のその他の具体例として、特公昭62−44522号公報や特公平5−79046号公報等に記載の化学修飾技術が適用できる。
2.変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤、および前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤
本ペプチドは、下記の評価試験1〜5に記載の通り、前駆軟骨細胞のアルカリフォスファターゼ(ALP)活性を抑制し、前駆軟骨細胞の増殖を促進し、骨芽細胞の石灰化を促進し、骨芽細胞の細胞増殖を促進する。従って、本ペプチドは、変形性関節症および骨粗鬆症を治療または予防することができ、また前駆軟骨細胞および骨芽細胞の増殖を促進することができる。
本発明の変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤、および前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤は、経口的に又は非経口的に種々の形態で投与することができる。その形態としては、経口的に投与する場合は、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉剤、液剤、懸濁製剤、乳化製剤等が挙げられ、または飲食品に混合することもできる。非経口的に投与する場合は、例えば、関節への注入、皮膚への塗布、注射剤、経皮剤、坐剤、点鼻剤及び吸入剤等が挙げられる。好ましくは、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、関節へ直接注入するための液剤、皮膚へ直接塗布するための液剤、軟膏、クリーム剤、パップ剤等が挙げられる。なお、本ペプチドは、消化管でアミノ酸への分解もほとんど起こらず、腸管で迅速に吸収されるため、経口投与による摂取が好適である。本ペプチドは食事または飲料に混ぜて摂取させることも好ましい。また、本ペプチドは健康食品とすることもできる。
本ペプチドは、下記の評価試験1〜5に記載の通り、前駆軟骨細胞のアルカリフォスファターゼ(ALP)活性を抑制し、前駆軟骨細胞の増殖を促進し、骨芽細胞の石灰化を促進し、骨芽細胞の細胞増殖を促進する。従って、本ペプチドは、変形性関節症および骨粗鬆症を治療または予防することができ、また前駆軟骨細胞および骨芽細胞の増殖を促進することができる。
本発明の変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤、および前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤は、経口的に又は非経口的に種々の形態で投与することができる。その形態としては、経口的に投与する場合は、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉剤、液剤、懸濁製剤、乳化製剤等が挙げられ、または飲食品に混合することもできる。非経口的に投与する場合は、例えば、関節への注入、皮膚への塗布、注射剤、経皮剤、坐剤、点鼻剤及び吸入剤等が挙げられる。好ましくは、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、関節へ直接注入するための液剤、皮膚へ直接塗布するための液剤、軟膏、クリーム剤、パップ剤等が挙げられる。なお、本ペプチドは、消化管でアミノ酸への分解もほとんど起こらず、腸管で迅速に吸収されるため、経口投与による摂取が好適である。本ペプチドは食事または飲料に混ぜて摂取させることも好ましい。また、本ペプチドは健康食品とすることもできる。
本ペプチドの投与量は、対象の状態や体重、化合物の種類、投与経路等によって異なるが、成人1日当たり、経口投与の場合は、例えば、約0.1〜1000mg、好ましくは約1〜500mg、より好ましくは約10〜200mgが挙げられ、患部に直接投与する場合は、例えば、約0.0001〜90重量%、好ましくは約0.001〜50重量%、より好ましくは約0.01〜10重量%が挙げられる。その他の形態の製剤は、これらの投与量を参考にして適宜決めることができる。これら製剤は、1日1〜数回に分けて投与するか、または1〜数日に1回投与することができる。
本発明の変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤、および前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤は、本発明の効果を害しない範囲で、適宜他の有効成分や製剤用の成分を含有させても良い。他の有効成分として、例えばヒアルロン酸等が挙げられる。他の有効成分の配合量としては、各々の作用に応じて適宜、変更することができる。
本発明の変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤、および前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤は、本発明の効果を害しない範囲で、適宜他の有効成分や製剤用の成分を含有させても良い。他の有効成分として、例えばヒアルロン酸等が挙げられる。他の有効成分の配合量としては、各々の作用に応じて適宜、変更することができる。
医薬製剤に製剤化する際に用いる薬学上許容される担体としては、希釈剤、結合剤(シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポリビニルピロリドン)、賦形剤(乳糖、ショ糖、コーンスターチ、リン酸カリウム、ソルビット、グリシン)、滑沢剤(ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ)、崩壊剤(バレイショデンプン)および湿潤剤(ラウリル硫酸ナトリウム)等を挙げることができる。本医薬製剤は、従来公知の方法に従って、本ペプチド、他の有効成分、薬学上許容される担体等を混合して製造することができる。
以下、本発明を実施例、比較例、評価試験によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例1〜4および比較例1〜2
前記のペプチド固相合成法を用いて、以下のペプチドを合成した。
(実施例1)Glu−Hyp−Gly(EOG)
(実施例2)Glu−Hyp(EO)
(実施例3)Pro−Ala−Gly(PAG)
(実施例4)Pro−Ala(PA)
(比較例1)Pro−Hyp(PO)
(比較例2)Hyp−Gly(OG)
実施例1〜4および比較例1〜2
前記のペプチド固相合成法を用いて、以下のペプチドを合成した。
(実施例1)Glu−Hyp−Gly(EOG)
(実施例2)Glu−Hyp(EO)
(実施例3)Pro−Ala−Gly(PAG)
(実施例4)Pro−Ala(PA)
(比較例1)Pro−Hyp(PO)
(比較例2)Hyp−Gly(OG)
評価試験1
前駆軟骨細胞によるALP抑制試験
マウス正常前駆軟骨細胞ATDC5を用いた。5%FBS含有DMEM/F12で前培養し、0.2×104 cells/wellで2日間培養した。細胞がサブコンフルエントになっていることを確認後、ペプチドサンプルを終濃度2.5mMなるように添加し、5日間培養した。併用実験においては各ペプチドサンプルを等量混合し、終濃度2.5mMで添加した。コントロールには前記培地のみを同量添加した。1日おきに培地交換およびサンプル添加を行った。PBSで洗浄後、抽出液(50mM Tris-HC1, 0.1% TritonX-100(pH 7.5))100μlを添加し、37℃で20分間加温することによって、ALP(アルカリフォスファターゼ)を抽出した。その上清10μlを新しい96wellsプレートに回収し、そこに基質反応液(0.1M 2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール, 2mM MgCl2(pH 10.5))を200μlずつ添加後、37℃で10分間加温した。その後、ただちにプレートリーダーにて405nm波長にて吸光値を測定した。コントロールを100として数値を示す。*、**および***は、paired-t-testにおいて、コントロールに対してそれぞれP<0.05、P<0.01、P<0.001で有意であることを示す。
前駆軟骨細胞によるALP抑制試験
マウス正常前駆軟骨細胞ATDC5を用いた。5%FBS含有DMEM/F12で前培養し、0.2×104 cells/wellで2日間培養した。細胞がサブコンフルエントになっていることを確認後、ペプチドサンプルを終濃度2.5mMなるように添加し、5日間培養した。併用実験においては各ペプチドサンプルを等量混合し、終濃度2.5mMで添加した。コントロールには前記培地のみを同量添加した。1日おきに培地交換およびサンプル添加を行った。PBSで洗浄後、抽出液(50mM Tris-HC1, 0.1% TritonX-100(pH 7.5))100μlを添加し、37℃で20分間加温することによって、ALP(アルカリフォスファターゼ)を抽出した。その上清10μlを新しい96wellsプレートに回収し、そこに基質反応液(0.1M 2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール, 2mM MgCl2(pH 10.5))を200μlずつ添加後、37℃で10分間加温した。その後、ただちにプレートリーダーにて405nm波長にて吸光値を測定した。コントロールを100として数値を示す。*、**および***は、paired-t-testにおいて、コントロールに対してそれぞれP<0.05、P<0.01、P<0.001で有意であることを示す。
評価試験2
前駆軟骨細胞の細胞増殖試験
マウス正常前駆軟骨細胞ATDC5を用いた。5%FBS 含有DMEM/F12で前培養し、0.2×104 cells/wellで2日間培養した。細胞がサブコンフルエントになっていることを確認後、ペプチドサンプルを終濃度2.5mMなるように添加し、5日間培養した。コントロールには前記培地のみを同量添加した。併用実験においては各ペプチドサンプルを等量混合し、終濃度2.5mMで添加した。1日おきに培地交換およびサンプル添加を行った。新しい5%FBS含有DMEM/F12を100μlずつ添加し、さらにWST-1(同仁化学社製)を10μlずつ添加後、37℃で1時間加温した。その後、ただちにプレートリーダーにて450nm波長にて吸光値を測定した。コントロールを100として数値を示す。*、**および***は、paired-t-testにおいて、コントロールに対してそれぞれP<0.05、P<0.01、P<0.001で有意であることを示す。
前駆軟骨細胞の細胞増殖試験
マウス正常前駆軟骨細胞ATDC5を用いた。5%FBS 含有DMEM/F12で前培養し、0.2×104 cells/wellで2日間培養した。細胞がサブコンフルエントになっていることを確認後、ペプチドサンプルを終濃度2.5mMなるように添加し、5日間培養した。コントロールには前記培地のみを同量添加した。併用実験においては各ペプチドサンプルを等量混合し、終濃度2.5mMで添加した。1日おきに培地交換およびサンプル添加を行った。新しい5%FBS含有DMEM/F12を100μlずつ添加し、さらにWST-1(同仁化学社製)を10μlずつ添加後、37℃で1時間加温した。その後、ただちにプレートリーダーにて450nm波長にて吸光値を測定した。コントロールを100として数値を示す。*、**および***は、paired-t-testにおいて、コントロールに対してそれぞれP<0.05、P<0.01、P<0.001で有意であることを示す。
評価試験3
骨芽細胞によるVon Kossa試験
マウス正常骨芽細胞MC3T3-E1を用いた。10%FBS含有α-MEMで前培養し、1.8×105 cells/wellで2日間培養した。細胞がサブコンフルエントになっていることを確認後、培地を分化培地(10%FBS,5mM βグリセロールリン酸,10-10Mデキサメタゾン,100μg/mlアスコルビン酸含有α-MEM)に置換し、ペプチドサンプルを終濃度0.01mMなるように添加し、13日間培養した。コントロールには分化培地のみを同量添加した。併用実験においては各ペプチドサンプルを等量混合し、終濃度0.01mMで添加した。1日おきに培地交換およびサンプル添加を行った。PBSで洗浄し、20%ホルマリンを添加して、20分間静置して固定した。さらにPBSで洗浄後、エタノール/アセトン(1:1)溶媒にて30℃で1分間静置し、透過処理を行った。さらにPBSで洗浄し、ヘマトキシリンを添加し、5分おきに核染色を行った。次いで、5%硝酸銀水溶液を添加後、UV照射にて1晩放置した。PBSで洗浄後、5%チオ硫酸ナトリウム溶液を添加し、反応を停止させた。染色した細胞をimage Jにて数値化した。コントロールを100として数値を示す。*、**および***は、paired-t-testにおいて、コントロールに対してそれぞれP<0.05、P<0.01、P<0.001で有意であることを示す。
骨芽細胞によるVon Kossa試験
マウス正常骨芽細胞MC3T3-E1を用いた。10%FBS含有α-MEMで前培養し、1.8×105 cells/wellで2日間培養した。細胞がサブコンフルエントになっていることを確認後、培地を分化培地(10%FBS,5mM βグリセロールリン酸,10-10Mデキサメタゾン,100μg/mlアスコルビン酸含有α-MEM)に置換し、ペプチドサンプルを終濃度0.01mMなるように添加し、13日間培養した。コントロールには分化培地のみを同量添加した。併用実験においては各ペプチドサンプルを等量混合し、終濃度0.01mMで添加した。1日おきに培地交換およびサンプル添加を行った。PBSで洗浄し、20%ホルマリンを添加して、20分間静置して固定した。さらにPBSで洗浄後、エタノール/アセトン(1:1)溶媒にて30℃で1分間静置し、透過処理を行った。さらにPBSで洗浄し、ヘマトキシリンを添加し、5分おきに核染色を行った。次いで、5%硝酸銀水溶液を添加後、UV照射にて1晩放置した。PBSで洗浄後、5%チオ硫酸ナトリウム溶液を添加し、反応を停止させた。染色した細胞をimage Jにて数値化した。コントロールを100として数値を示す。*、**および***は、paired-t-testにおいて、コントロールに対してそれぞれP<0.05、P<0.01、P<0.001で有意であることを示す。
評価試験4
骨芽細胞によるALP促進試験
マウス正常骨芽細胞MC3T3-E1を用いた。10%FBS 含有α-MEMで前培養し、6×103 cells/wellで2日間培養した。細胞がサブコンフルエントになっていることを確認後、培地を分化培地(10%FBS,5mM βグリセロールリン酸,10-10Mデキサメタゾン,100μg/mlアスコルビン酸含有α-MEM)に置換し、ペプチドサンプルを終濃度0.01および2.5mMになるように添加し、7日間培養した。コントロールには分化培地のみを同量添加した。併用実験においては各サンプルを等量混合し、終濃度0.01mMで添加した。1日おきに分化培地交換およびサンプル添加を行った。PBSで洗浄後、0.0025gのnaphthol AS-BIおよび0.0025gのfast red violet LB saltを0.05M AMP Buffer5mlに溶解し、フィルター濾過後、各wellに200μlずつ添加し、アルカリフォスファターゼ染色した。染色した細胞をimage Jにて数値化した。コントロールを100として数値を示す。*、**および***は、paired-t-testにおいて、コントロールに対してそれぞれP<0.05、P<0.01、P<0.001で有意であることを示す。
骨芽細胞によるALP促進試験
マウス正常骨芽細胞MC3T3-E1を用いた。10%FBS 含有α-MEMで前培養し、6×103 cells/wellで2日間培養した。細胞がサブコンフルエントになっていることを確認後、培地を分化培地(10%FBS,5mM βグリセロールリン酸,10-10Mデキサメタゾン,100μg/mlアスコルビン酸含有α-MEM)に置換し、ペプチドサンプルを終濃度0.01および2.5mMになるように添加し、7日間培養した。コントロールには分化培地のみを同量添加した。併用実験においては各サンプルを等量混合し、終濃度0.01mMで添加した。1日おきに分化培地交換およびサンプル添加を行った。PBSで洗浄後、0.0025gのnaphthol AS-BIおよび0.0025gのfast red violet LB saltを0.05M AMP Buffer5mlに溶解し、フィルター濾過後、各wellに200μlずつ添加し、アルカリフォスファターゼ染色した。染色した細胞をimage Jにて数値化した。コントロールを100として数値を示す。*、**および***は、paired-t-testにおいて、コントロールに対してそれぞれP<0.05、P<0.01、P<0.001で有意であることを示す。
評価試験5
骨芽細胞による細胞増殖試験
マウス正常骨芽細胞MC3T3-E1を用いた。10%FBS含有α-MEMで前培養し、6×103 cells/wellで2日間培養した。細胞がサブコンフルエントになっていることを確認後、培地を分化培地(10%FBS,5mM βグリセロールリン酸,10-10Mデキサメタゾン,100μg/mlアスコルビン酸含有α-MEM)に置換し、ペプチドサンプルを終濃度0.01mMになるように添加し、13日間培養した。コントロールには分化培地のみを同量添加した。1日おきに分化培地交換およびサンプル添加を行った。PBSで洗浄後、新しい分化培地を100μlずつ添加し、さらにWST-1(同仁化学社製)を10μlずつ添加し、37℃で1時間加温した。その後、ただちにプレートリーダーにて450nm波長にて吸光値を測定した。コントロールを100として数値を示す。*、**および***は、paired-t-testにおいて、コントロールに対してそれぞれP<0.05、P<0.01、P<0.001で有意であることを示す。
骨芽細胞による細胞増殖試験
マウス正常骨芽細胞MC3T3-E1を用いた。10%FBS含有α-MEMで前培養し、6×103 cells/wellで2日間培養した。細胞がサブコンフルエントになっていることを確認後、培地を分化培地(10%FBS,5mM βグリセロールリン酸,10-10Mデキサメタゾン,100μg/mlアスコルビン酸含有α-MEM)に置換し、ペプチドサンプルを終濃度0.01mMになるように添加し、13日間培養した。コントロールには分化培地のみを同量添加した。1日おきに分化培地交換およびサンプル添加を行った。PBSで洗浄後、新しい分化培地を100μlずつ添加し、さらにWST-1(同仁化学社製)を10μlずつ添加し、37℃で1時間加温した。その後、ただちにプレートリーダーにて450nm波長にて吸光値を測定した。コントロールを100として数値を示す。*、**および***は、paired-t-testにおいて、コントロールに対してそれぞれP<0.05、P<0.01、P<0.001で有意であることを示す。
評価試験1は、変形性関節炎マーカーであるアルカリフォスファターゼ(ALP)を測定するものであり、実施例1〜4のペプチドは高いALP活性の抑制作用を示している(表1参照)。
評価試験2は、前駆軟骨細胞の増殖促進作用を測定するものであり、実施例1〜4のペプチドは高い前駆軟骨細胞の増殖促進作用を示している(表2参照)。
評価試験3および4は、骨芽細胞の分化の促進作用を測定するものであり、実施例1〜4のペプチドは高い骨芽細胞の分化促進作用を示している(表3および4参照)。
評価試験5は、骨芽細胞の増殖促進作用を測定するものであり、実施例1〜4のペプチドは高い骨芽細胞の増殖促進作用を示している(表5参照)。
評価試験2は、前駆軟骨細胞の増殖促進作用を測定するものであり、実施例1〜4のペプチドは高い前駆軟骨細胞の増殖促進作用を示している(表2参照)。
評価試験3および4は、骨芽細胞の分化の促進作用を測定するものであり、実施例1〜4のペプチドは高い骨芽細胞の分化促進作用を示している(表3および4参照)。
評価試験5は、骨芽細胞の増殖促進作用を測定するものであり、実施例1〜4のペプチドは高い骨芽細胞の増殖促進作用を示している(表5参照)。
比較例1および2のペプチドは特許文献4および5に記載されているものであるが、評価試験1〜5のいずれにおいても、実施例1〜4のペプチドの作用が比較例1および2のペプチドよりも有意に高い作用を有している。さらに、実施例1〜4のペプチドの2つの組み合わせはいずれも、評価試験1〜5のいずれでも、優れた相乗効果を示している。
以上より、実施例1〜4のペプチドおよびそれらの組み合わせは、先行文献の方法よりも優れて、変形性関節症および骨粗鬆症を治療または予防することができ、また前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖を促進することができる。
以上より、実施例1〜4のペプチドおよびそれらの組み合わせは、先行文献の方法よりも優れて、変形性関節症および骨粗鬆症を治療または予防することができ、また前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖を促進することができる。
本発明によって、従来技術よりも優れた変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤、および前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤を提供することができる。
Claims (6)
- Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaからなる群から選択される少なくとも1つのペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤。
- Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaからなる群から選択される2つ以上のペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を含有する、請求項1に記載の変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤。
- Glu−Hyp−GlyおよびGlu−Hypの2つのペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を必須成分として含有する、請求項2に記載の変形性関節症または骨粗鬆症の治療剤もしくは予防剤。
- Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaからなる群から選択される少なくとも1つのペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤。
- Glu−Hyp−Gly、Glu−Hyp、Pro−Ala−GlyおよびPro−Alaからなる群から選択される2つ以上のペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を含有する、請求項3に記載の前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤。
- Glu−Hyp−GlyおよびGlu−Hypの2つのペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を必須成分として含有する、請求項5に記載の前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤。
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