JP2680552B2 - 修飾低密度リポ蛋白質に対する結合活性を有するペプチド誘導体 - Google Patents
修飾低密度リポ蛋白質に対する結合活性を有するペプチド誘導体Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアセチル化または酸化さ
れた、低密度リポ蛋白質（以下、ＬＤＬと称する）と特
異的に結合する新規なペプチド誘導体に関する。
れた、低密度リポ蛋白質（以下、ＬＤＬと称する）と特
異的に結合する新規なペプチド誘導体に関する。
【０００２】
【従来技術】血液中のコレステロール値は、循環器系の
疾患、例えば動脈硬化症と正の相関関係があるため、こ
の値を下げるための薬物の開発が盛んに行なわれてき
た。その主なものとして、コレステロールの生体内合成
を阻害する薬物(例えばコンパクチン、メバロチン)およ
び腸管からのコレステロールの吸収を阻害する薬物(例
えばコレスチラミン、コレスチポール)を挙げることが
できる。その他、血中のＬＤＬ値は下げないが、ＬＤＬ
の酸化を抑制することで動脈硬化を防止する薬物(例え
ばプロブコール)も既に実用化されている。
疾患、例えば動脈硬化症と正の相関関係があるため、こ
の値を下げるための薬物の開発が盛んに行なわれてき
た。その主なものとして、コレステロールの生体内合成
を阻害する薬物(例えばコンパクチン、メバロチン)およ
び腸管からのコレステロールの吸収を阻害する薬物(例
えばコレスチラミン、コレスチポール)を挙げることが
できる。その他、血中のＬＤＬ値は下げないが、ＬＤＬ
の酸化を抑制することで動脈硬化を防止する薬物(例え
ばプロブコール)も既に実用化されている。
【０００３】一方、動脈硬化の初期病変では、アセチル
化低密度リポ蛋白質(ＡcＬＤＬ)などの修飾ＬＤＬを取
り込んで泡沫化を起したマクロファージがみられること
から、マクロファージ内のコレステロールの蓄積を防止
する薬物の開発が試みられた。そのような目的にはアシ
ルＣoＡコレステロールアシルトランスフェラーゼの阻
害物質が有用と考えられている［ブラウンら(Ｂrown,
Ｍ．Ｓ．，Ａnn．Ｒev．Ｂiochem．,５２,２２３−２６
１,１９８３)。しかしながら、マクロファージの修飾Ｌ
ＤＬ取り込みを抑制する薬物は全く知られていない。
化低密度リポ蛋白質(ＡcＬＤＬ)などの修飾ＬＤＬを取
り込んで泡沫化を起したマクロファージがみられること
から、マクロファージ内のコレステロールの蓄積を防止
する薬物の開発が試みられた。そのような目的にはアシ
ルＣoＡコレステロールアシルトランスフェラーゼの阻
害物質が有用と考えられている［ブラウンら(Ｂrown,
Ｍ．Ｓ．，Ａnn．Ｒev．Ｂiochem．,５２,２２３−２６
１,１９８３)。しかしながら、マクロファージの修飾Ｌ
ＤＬ取り込みを抑制する薬物は全く知られていない。
【０００４】
【発明が解決すべき課題】マクロファージへの修飾ＬＤ
Ｌの取り込みは、マクロファージ上に存在するスカベン
ジャー受容体に修飾ＬＤＬが結合し、次いで、エンドサ
イトーシスによって細胞内に取り込まれることからな
る。この受容体に対する修飾ＬＤＬの結合を阻害する化
合物は、血中修飾ＬＤＬが関与する疾患特に循環器系の
疾患、例えば、動脈硬化、心筋梗塞、狭心症、脳卒中等
の発症を抑制および／または遅らせ、あるいは発症した
患者の症状を軽減する上で有用と考えられる。また、そ
のような化合物を適当な固相担体に固定化し、その固定
化化合物と血液を接触させることにより、血中の修飾Ｌ
ＤＬを該化合物を介して固相担体に結合させることがで
きる。得られた固定化ペプチドは、それに修飾ＬＤＬ含
有血液を接触させることにより、血中の修飾ＬＤＬ除去
し、血液を洗浄するために、あるいは血中の修飾ＬＤＬ
の濃度を測定するために用いることができる。従って、
関連の種々の疾患、例えば動脈硬化発症の診断および抑
制あるいは治療に有用と考えられる。しかるに、スカベ
ンジャー受容体は分子量７０Ｋの膜蛋白質で、これがさ
らに３量体を形成している巨大分子である(児玉ら、Ｎa
ture,１９９０,３４３,５３１−５３５)。そのため、こ
の受容体分子そのものを合成することは困難であった。
Ｌの取り込みは、マクロファージ上に存在するスカベン
ジャー受容体に修飾ＬＤＬが結合し、次いで、エンドサ
イトーシスによって細胞内に取り込まれることからな
る。この受容体に対する修飾ＬＤＬの結合を阻害する化
合物は、血中修飾ＬＤＬが関与する疾患特に循環器系の
疾患、例えば、動脈硬化、心筋梗塞、狭心症、脳卒中等
の発症を抑制および／または遅らせ、あるいは発症した
患者の症状を軽減する上で有用と考えられる。また、そ
のような化合物を適当な固相担体に固定化し、その固定
化化合物と血液を接触させることにより、血中の修飾Ｌ
ＤＬを該化合物を介して固相担体に結合させることがで
きる。得られた固定化ペプチドは、それに修飾ＬＤＬ含
有血液を接触させることにより、血中の修飾ＬＤＬ除去
し、血液を洗浄するために、あるいは血中の修飾ＬＤＬ
の濃度を測定するために用いることができる。従って、
関連の種々の疾患、例えば動脈硬化発症の診断および抑
制あるいは治療に有用と考えられる。しかるに、スカベ
ンジャー受容体は分子量７０Ｋの膜蛋白質で、これがさ
らに３量体を形成している巨大分子である(児玉ら、Ｎa
ture,１９９０,３４３,５３１−５３５)。そのため、こ
の受容体分子そのものを合成することは困難であった。
【０００５】ところで、スカベンジャー受容体上の修飾
ＬＤＬとの結合部位は、スカベンジャー受容体のカルボ
キシ末端側に存在するトリペプチドの繰り返し配列から
なるコラーゲン構造にあると考えられており、特にこの
コラーゲン構造のカルボキシ末端側２２残基中に修飾Ｌ
ＤＬの結合部位が存在していること、並びに、第３２
７、３３４、３３７、３４０番目のリジン、特に３３７
番目のリジンが重要な役割を果たしていることが指摘さ
れていた(土井ら,Ｊ．Ｂiol,Ｃhem．,１９９３,２６８,
２１２６−２１３３)。従って、該スカベンジャー受容
体の修飾ＬＤＬ結合部位に関与するコラーゲン構造の一
部と同様の結合活性を有するペプチドを合成することが
できれば、上記の目的が達成できると考えられる。しか
しながら、天然のコラーゲン構造はアミノ末端部が束ね
られた複雑な構造をとっており、結合活性を有するペプ
チドの構造を特定し、それを合成することは困難であっ
た。
ＬＤＬとの結合部位は、スカベンジャー受容体のカルボ
キシ末端側に存在するトリペプチドの繰り返し配列から
なるコラーゲン構造にあると考えられており、特にこの
コラーゲン構造のカルボキシ末端側２２残基中に修飾Ｌ
ＤＬの結合部位が存在していること、並びに、第３２
７、３３４、３３７、３４０番目のリジン、特に３３７
番目のリジンが重要な役割を果たしていることが指摘さ
れていた(土井ら,Ｊ．Ｂiol,Ｃhem．,１９９３,２６８,
２１２６−２１３３)。従って、該スカベンジャー受容
体の修飾ＬＤＬ結合部位に関与するコラーゲン構造の一
部と同様の結合活性を有するペプチドを合成することが
できれば、上記の目的が達成できると考えられる。しか
しながら、天然のコラーゲン構造はアミノ末端部が束ね
られた複雑な構造をとっており、結合活性を有するペプ
チドの構造を特定し、それを合成することは困難であっ
た。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このスカ
ベンジャー受容体分子の、修飾ＬＤＬとの結合に関与し
ている部位を同定し、その知見を基に、修飾ＬＤＬとの
結合活性を維持しているペプチド誘導体を合成すること
に成功し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明
は、式（Ｉ）：
ベンジャー受容体分子の、修飾ＬＤＬとの結合に関与し
ている部位を同定し、その知見を基に、修飾ＬＤＬとの
結合活性を維持しているペプチド誘導体を合成すること
に成功し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明
は、式（Ｉ）：
【化６】 ［式中、bＡlaは、β−アラニン；Ｒ1は、独立して式：
【化７】(Gly-Pro-4Hyp)q-R2-(Gly-Pro-4Hyp)q-R3 （式中、4Ｈypは、４−ヒドロキシプロリン、Ｒ2は、ア
ミノ酸数９〜７２のペプチド残基、Ｒ3は修飾されてい
ても良いグリシン残基、ｑは、０〜１０から独立して選
択される整数を表す）で示されるペプチド残基から選択
される基；ｎは、０〜４の整数；Ｒは、アミノ酸数０〜
５のペプチド残基又は式：
ミノ酸数９〜７２のペプチド残基、Ｒ3は修飾されてい
ても良いグリシン残基、ｑは、０〜１０から独立して選
択される整数を表す）で示されるペプチド残基から選択
される基；ｎは、０〜４の整数；Ｒは、アミノ酸数０〜
５のペプチド残基又は式：
【化８】 で示される基；Ｒ’は修飾されていてもよいチロシン、
トリプトファン残基及びペプチドの定量化に利用可能な
化合物残基から選択される基；Ａcpは、６−アミノカプ
ロン酸を表す］で示される化合物を提供するものであ
る。
トリプトファン残基及びペプチドの定量化に利用可能な
化合物残基から選択される基；Ａcpは、６−アミノカプ
ロン酸を表す］で示される化合物を提供するものであ
る。
【０００７】本発明化合物（Ｉ）は、Ｒ1で示されるペ
プチドを３つ束ねることができ、コラーゲン構造を作る
には有利である。さらにペプチドＲ1において、そのア
ミノおよび／またはカルボキシ末端部位に、数個のＧly
−Ｐro−４Ｈyp（４Hypは、４−ヒドロキシプロリンを
表す）のトリペプチドの繰り返しが存在することによ
り、安定性が向上することが知られている(Ｔhakur,Ｓ
ら、Ｂiopolymers,１９８６,２５,１０８１−１０８
６)。
プチドを３つ束ねることができ、コラーゲン構造を作る
には有利である。さらにペプチドＲ1において、そのア
ミノおよび／またはカルボキシ末端部位に、数個のＧly
−Ｐro−４Ｈyp（４Hypは、４−ヒドロキシプロリンを
表す）のトリペプチドの繰り返しが存在することによ
り、安定性が向上することが知られている(Ｔhakur,Ｓ
ら、Ｂiopolymers,１９８６,２５,１０８１−１０８
６)。
【０００８】従って、本発明化合物の場合も、修飾ＬＤ
Ｌ結合部位と考えられるペプチド（Ｒ2）（これはリジ
ン残基を少なくとも４個含有することが好ましい）のア
ミノおよびカルボキシ末端部にＧly−Ｐro−４Ｈypのト
リペプチドの繰り返し単位を数回、好ましくはアミノ末
端部分に２〜８回、特に好ましくは４回、カルボキシ末
端部に２〜８回、特に好ましくは３回の繰り返し単位を
挿入すると良い。あるいは、該Ｒ2で示されるペプチド
のアミノ酸配列に含まれるリジン以外のアミノ酸を他の
アミノ酸に置き換えＧly−Ｐro−Ｒの配列になるように
置き換えることも可能である。さらには、リガンドとの
結合を強くするため、中性及び酸性アミノ酸をリジンや
他の塩基性アミノ酸、例えばオルニチンに置き換えるこ
とも可能である。このペプチドのアミノ末端部にシステ
イン又はメルカプトプロピル基を持った化合物とし、式
（III）
Ｌ結合部位と考えられるペプチド（Ｒ2）（これはリジ
ン残基を少なくとも４個含有することが好ましい）のア
ミノおよびカルボキシ末端部にＧly−Ｐro−４Ｈypのト
リペプチドの繰り返し単位を数回、好ましくはアミノ末
端部分に２〜８回、特に好ましくは４回、カルボキシ末
端部に２〜８回、特に好ましくは３回の繰り返し単位を
挿入すると良い。あるいは、該Ｒ2で示されるペプチド
のアミノ酸配列に含まれるリジン以外のアミノ酸を他の
アミノ酸に置き換えＧly−Ｐro−Ｒの配列になるように
置き換えることも可能である。さらには、リガンドとの
結合を強くするため、中性及び酸性アミノ酸をリジンや
他の塩基性アミノ酸、例えばオルニチンに置き換えるこ
とも可能である。このペプチドのアミノ末端部にシステ
イン又はメルカプトプロピル基を持った化合物とし、式
（III）
【化９】 （式中、Ｘはハロゲンを表し、Ｒ、Ｒ'、bＡlaおよびｎ
は上記定義に従う）で示される化合物と結合させること
もできる。
は上記定義に従う）で示される化合物と結合させること
もできる。
【０００９】本発明の目的には上記定義に従う式（Ｉ）
の化合物すべてが好ましいが、中でも、ｎが１〜２、Ｒ
2が少なくとも４個のリジンを含むアミノ酸数９〜７２
のペプチド残基、ｑが２〜８である化合物（Ｉ）が好ま
しく、とりわけｎが２、ｑが３または４、Ｒ2が配列表
の配列番号１で示されるペプチド残基である化合物
（Ｉ）が好ましい。Ｒ3の定義における「修飾されてい
ても良いグリシン残基」なる語句は、該グリシン残基の
カルボキシル基が遊離状態であるか、アミド化又はエス
テル化されていてもよいことを意味する。そのようなエ
ステルの例として、メチル、エチル、ブチル、ベンジル
エステルなどを挙げることができる。Ｒ'の定義におけ
る「修飾されていても良いチロシン、トリプトファン残
基及びペプチドの定量化に利用可能な化合物残基」なる
語句は、上記と同様、これらアミノ酸残基のカルボキシ
ル基が遊離状態であるか、アミド化又はエステル化され
ていてもよいことを意味する。そのようなエステルの例
として、メチル、エチル、ブチル、ベンジルエステルな
どを挙げることができる。Ｒ’として上記のアミノ酸残
基が存在することにより、ペプチドの定量が容易とな
る。例えば、チロシン又はトリプトファン残基の存在に
より、２８０nmの吸収を測定することで、ペプチドの定
量を容易に行うことができる。ハロゲンとは、クロロ、
ブロモ、ヨードを意味し、ブロモが好ましい。
の化合物すべてが好ましいが、中でも、ｎが１〜２、Ｒ
2が少なくとも４個のリジンを含むアミノ酸数９〜７２
のペプチド残基、ｑが２〜８である化合物（Ｉ）が好ま
しく、とりわけｎが２、ｑが３または４、Ｒ2が配列表
の配列番号１で示されるペプチド残基である化合物
（Ｉ）が好ましい。Ｒ3の定義における「修飾されてい
ても良いグリシン残基」なる語句は、該グリシン残基の
カルボキシル基が遊離状態であるか、アミド化又はエス
テル化されていてもよいことを意味する。そのようなエ
ステルの例として、メチル、エチル、ブチル、ベンジル
エステルなどを挙げることができる。Ｒ'の定義におけ
る「修飾されていても良いチロシン、トリプトファン残
基及びペプチドの定量化に利用可能な化合物残基」なる
語句は、上記と同様、これらアミノ酸残基のカルボキシ
ル基が遊離状態であるか、アミド化又はエステル化され
ていてもよいことを意味する。そのようなエステルの例
として、メチル、エチル、ブチル、ベンジルエステルな
どを挙げることができる。Ｒ’として上記のアミノ酸残
基が存在することにより、ペプチドの定量が容易とな
る。例えば、チロシン又はトリプトファン残基の存在に
より、２８０nmの吸収を測定することで、ペプチドの定
量を容易に行うことができる。ハロゲンとは、クロロ、
ブロモ、ヨードを意味し、ブロモが好ましい。
【００１０】本発明のペプチド誘導体（Ｉ）は、後述す
る実施例に示すように、ＡｃＬＤＬと特異的に結合し、
修飾ＬＤＬに対する受容体活性を有することが明らかに
なった。従って、本発明化合物（Ｉ）を修飾ＬＤＬが関
与する種々の疾患、例えば動脈硬化症、に罹患する恐れ
のある人、あるいは既に罹患している患者に投与し、修
飾ＬＤＬのマクロファージによる取り込みを阻止あるい
は抑制することにより、動脈硬化等の発症を予防、また
は治療することができる。あるいは、所望により、式
（Ｉ）において、その一部にビオチン部分を有する化合
物を、該ビオチン部分を介して固相担体に固定化するこ
とにより、固定化ペプチドを得、該固定化ペプチドを循
環血液に接触させることにより血中の修飾ＬＤＬを除去
し、上記の疾患の治療および予防を行うことができる。
また、この固定化ペプチドを用いて修飾ＬＤＬの血中濃
度を測定することにより、疾患の診断を行い、治療や予
防に役立てることが可能である。そのような固定化ペプ
チドは、診断および治療を目的としたキットの形で提供
すると好都合である。
る実施例に示すように、ＡｃＬＤＬと特異的に結合し、
修飾ＬＤＬに対する受容体活性を有することが明らかに
なった。従って、本発明化合物（Ｉ）を修飾ＬＤＬが関
与する種々の疾患、例えば動脈硬化症、に罹患する恐れ
のある人、あるいは既に罹患している患者に投与し、修
飾ＬＤＬのマクロファージによる取り込みを阻止あるい
は抑制することにより、動脈硬化等の発症を予防、また
は治療することができる。あるいは、所望により、式
（Ｉ）において、その一部にビオチン部分を有する化合
物を、該ビオチン部分を介して固相担体に固定化するこ
とにより、固定化ペプチドを得、該固定化ペプチドを循
環血液に接触させることにより血中の修飾ＬＤＬを除去
し、上記の疾患の治療および予防を行うことができる。
また、この固定化ペプチドを用いて修飾ＬＤＬの血中濃
度を測定することにより、疾患の診断を行い、治療や予
防に役立てることが可能である。そのような固定化ペプ
チドは、診断および治療を目的としたキットの形で提供
すると好都合である。
【００１１】従って、本発明はまた、化合物（Ｉ）を含
有し、血中の修飾ＬＤＬのマクロファージによる取り込
みを阻害し得る医薬組成物を提供するものである。該医
薬組成物は、修飾ＬＤＬに起因する種々の疾患、例え
ば、動脈硬化の予防又は治療に有用である。さらに、本
発明は、適当な固相担体に化合物（Ｉ）を固定化してな
る修飾低密度リポ蛋白質との結合活性を有する固定化ペ
プチドをも提供するものである。本発明化合物（Ｉ）を
固定化するためには、ペプチド中のアミノ基、カルボキ
シル基、水酸基、スルフヒドリル基と固相担体とを結合
することができるが上記のごとくビオチン部分を含有す
る化合物を用いることが好ましい。そのような化合物
（Ｉ）を、固相担体である樹脂のアビジン部分と結合さ
せ、容易に固定化ペプチドを得ることができる。この場
合、リガンドである低密度リポ蛋白質は分子量が大きい
ため、担体とペプチドとの間に適当な距離が必要とな
る。これは、スペーサーとして機能する、式（Ｉ）のb
Ａlaの数を調整することにより可能である。また、固相
担体としては、医薬分野で通常用いられるものから随意
選択することができ、例えばアガロース、アクリルビー
ズ、セファロース、ダイナビーズ、ラテックス、セルロ
ースを挙げることができる。アビジンと結合した樹脂、
例えば、ストレプトアビジンダイナビーズＭ−２８０
（ダイナル社）が好ましい。
有し、血中の修飾ＬＤＬのマクロファージによる取り込
みを阻害し得る医薬組成物を提供するものである。該医
薬組成物は、修飾ＬＤＬに起因する種々の疾患、例え
ば、動脈硬化の予防又は治療に有用である。さらに、本
発明は、適当な固相担体に化合物（Ｉ）を固定化してな
る修飾低密度リポ蛋白質との結合活性を有する固定化ペ
プチドをも提供するものである。本発明化合物（Ｉ）を
固定化するためには、ペプチド中のアミノ基、カルボキ
シル基、水酸基、スルフヒドリル基と固相担体とを結合
することができるが上記のごとくビオチン部分を含有す
る化合物を用いることが好ましい。そのような化合物
（Ｉ）を、固相担体である樹脂のアビジン部分と結合さ
せ、容易に固定化ペプチドを得ることができる。この場
合、リガンドである低密度リポ蛋白質は分子量が大きい
ため、担体とペプチドとの間に適当な距離が必要とな
る。これは、スペーサーとして機能する、式（Ｉ）のb
Ａlaの数を調整することにより可能である。また、固相
担体としては、医薬分野で通常用いられるものから随意
選択することができ、例えばアガロース、アクリルビー
ズ、セファロース、ダイナビーズ、ラテックス、セルロ
ースを挙げることができる。アビジンと結合した樹脂、
例えば、ストレプトアビジンダイナビーズＭ−２８０
（ダイナル社）が好ましい。
【００１２】本発明の固定化ペプチドは、それを医療分
野で用いられる適当な器具と組み合わせてキットの形で
提供することができる。例えば、カラムに充填し、連続
的に血液を循環させる、血液清浄装置としても用いるこ
とができ、それらも本発明の範囲に包含される。固相担
体への本発明ペプチド誘導体の固定化は、当業者既知の
通常の方法で行うことができ、一般に、ｐＨ７.５付近
の緩衝液中、(III)とＣys−Ｒ1を混合することによって
行うことができる。
野で用いられる適当な器具と組み合わせてキットの形で
提供することができる。例えば、カラムに充填し、連続
的に血液を循環させる、血液清浄装置としても用いるこ
とができ、それらも本発明の範囲に包含される。固相担
体への本発明ペプチド誘導体の固定化は、当業者既知の
通常の方法で行うことができ、一般に、ｐＨ７.５付近
の緩衝液中、(III)とＣys−Ｒ1を混合することによって
行うことができる。
【００１３】本発明の化合物（Ｉ）の製造は、任意の合
成法を用いて行い得るが、以下に例示する方法で好適に
製造することができる。しかしながら、本発明は下記の
方法によって得られた化合物（Ｉ）に限定されるもので
はなく、当業者既知の任意の方法で得られるあらゆる化
合物（Ｉ）を包含するものである。本発明化合物は、式
（II）：
成法を用いて行い得るが、以下に例示する方法で好適に
製造することができる。しかしながら、本発明は下記の
方法によって得られた化合物（Ｉ）に限定されるもので
はなく、当業者既知の任意の方法で得られるあらゆる化
合物（Ｉ）を包含するものである。本発明化合物は、式
（II）：
【化１０】Ｃys−Ｒ1 （式中、Ｒ1は上記定義に従う）で示される化合物と、
上記の式（III）で示される化合物とを反応させること
により、製造される。
上記の式（III）で示される化合物とを反応させること
により、製造される。
【００１４】上記のごとく本発明は、スカベンジャー受
容体の修飾ＬＤＬ結合部位であるコラーゲン構造の一部
を、結合に関与する４つのリジンの全部または一部を残
しつつペプチド合成する方法を提供するものである。既
述のごとく、天然のコラーゲン構造はアミノ末端部が束
ねられていると考えられており、本発明化合物も上記の
式（Ｉ）から明らかなように、３本のペプチドがアミノ
末端部で束ねられた構造を有している。この構造を構築
するために、まず、１本のペプチドＣys−Ｒ1(II)を合
成し、精製した後、３本に枝分かれしたペプチド(III)
と反応させ、それぞれのアミノ末端側を３本に束ねる方
法を用いた。該ペプチド(II)は市販のペプチド自動合成
機を用いて通常の方法で高純度で合成できるので、本発
明方法により高純度の三本鎖ペプチド(I)を高収率で得
ることができる。
容体の修飾ＬＤＬ結合部位であるコラーゲン構造の一部
を、結合に関与する４つのリジンの全部または一部を残
しつつペプチド合成する方法を提供するものである。既
述のごとく、天然のコラーゲン構造はアミノ末端部が束
ねられていると考えられており、本発明化合物も上記の
式（Ｉ）から明らかなように、３本のペプチドがアミノ
末端部で束ねられた構造を有している。この構造を構築
するために、まず、１本のペプチドＣys−Ｒ1(II)を合
成し、精製した後、３本に枝分かれしたペプチド(III)
と反応させ、それぞれのアミノ末端側を３本に束ねる方
法を用いた。該ペプチド(II)は市販のペプチド自動合成
機を用いて通常の方法で高純度で合成できるので、本発
明方法により高純度の三本鎖ペプチド(I)を高収率で得
ることができる。
【００１５】出発物質である、式（II）の化合物はアプ
ライドバイオシステムズ製ペプチド自動合成機モデル４
３０Ａ等を用いて合成することができる。他の出発物質
である、枝分かれペプチド（III）も、ペプチド合成、
有機合成の常法を組み合わせて製造することができる。
化合物（II）及び化合物（III）を、３Ｍグアニジン塩
酸、０.１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液中で６〜１５時
間反応させると、これら化合物が結合する。反応生成物
を高速液体クロマトグラフィー等で精製する。次いで、
得られた化合物(I)を125Ｉで標識し、アセチルＬＤＬと
の結合活性を調べた結果、該化合物(I)はアセチルＬＤ
Ｌとの結合活性を有し、ＣＤスペクトル測定によりコラ
ーゲン構造をとっており、その熱変性の中点は約３０℃
であることが示された（図４および５）。
ライドバイオシステムズ製ペプチド自動合成機モデル４
３０Ａ等を用いて合成することができる。他の出発物質
である、枝分かれペプチド（III）も、ペプチド合成、
有機合成の常法を組み合わせて製造することができる。
化合物（II）及び化合物（III）を、３Ｍグアニジン塩
酸、０.１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液中で６〜１５時
間反応させると、これら化合物が結合する。反応生成物
を高速液体クロマトグラフィー等で精製する。次いで、
得られた化合物(I)を125Ｉで標識し、アセチルＬＤＬと
の結合活性を調べた結果、該化合物(I)はアセチルＬＤ
Ｌとの結合活性を有し、ＣＤスペクトル測定によりコラ
ーゲン構造をとっており、その熱変性の中点は約３０℃
であることが示された（図４および５）。
【００１６】本発明のペプチド誘導体を治療目的で用い
る場合には、式(Ｉ)で示される化合物を修飾ＬＤＬの血
中濃度の低下が必要な患者に、治療有効量を投与する。
投与経路は経口または非経口のいずれでもよいが、非経
口投与が好ましい。そのためには本発明化合物を通常の
製剤担体、希釈剤または賦形剤と混合し、カプセルに充
填するか、錠剤に打錠する。あるいは、粉剤、顆粒剤等
の剤形でもよい。また、非経口投与のためには、皮下注
射、静脈注射、腹腔内注射、筋肉注射等に適した水溶液
または懸濁液とする。あるいは、上記のごとく、適当な
固相担体に結合させ、患者の血液を、速度５０〜７０ml
／分で循環させる。
る場合には、式(Ｉ)で示される化合物を修飾ＬＤＬの血
中濃度の低下が必要な患者に、治療有効量を投与する。
投与経路は経口または非経口のいずれでもよいが、非経
口投与が好ましい。そのためには本発明化合物を通常の
製剤担体、希釈剤または賦形剤と混合し、カプセルに充
填するか、錠剤に打錠する。あるいは、粉剤、顆粒剤等
の剤形でもよい。また、非経口投与のためには、皮下注
射、静脈注射、腹腔内注射、筋肉注射等に適した水溶液
または懸濁液とする。あるいは、上記のごとく、適当な
固相担体に結合させ、患者の血液を、速度５０〜７０ml
／分で循環させる。
【００１７】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳し
く説明する。ただし、これらの実施例は本発明を制限す
るものではない。
く説明する。ただし、これらの実施例は本発明を制限す
るものではない。
【実施例】実施例１ （１） ペプチド４（配列番号２）の合成 ペプチド４の合成はアプライドバイオシステムズ製ペプ
チド自動合成機モデル４３０Ａを用いて、使用説明書に
従いＦmoc法で行なった。リンク樹脂(ノババイオケム
社)０.２mmol、保護したアミノ酸１mmolを用いて合成し
た。合成終了後、ペプチドの結合している樹脂を合成機
よりはずした。ペプチドの付いた樹脂(１００mg)をエタ
ンジチオール(和光純薬)(０.０１２５ml)、アニソール
(和光純薬)(０.０３７５ml)、トリフルオロ酢酸(和光純
薬)(０.９５ml)と室温（約２５℃）で１.５時間反応さ
せた。反応液を冷エーテル(１０ml)に加えてペプチドを
沈澱させた。沈殿したペプチドをさらにエーテル１０ml
で３回洗浄した後、乾燥し、酢酸水(５ml)に溶かし、高
速液体クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥した。精
製後の液体クロマトグラフィーの溶出パターンを図１に
示す。なお高速液体クロマトグラフィーはカラムにＴＯ
ＳＯＨ ＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ１２０を用い、０.１％
トリフルオロ酢酸中アセトニトリルを１０％から３０％
の濃度勾配で３０分で溶出することにより行った。流速
は１ml／分である。この化合物の同定はペプチドシーケ
ンサーでアミノ酸配列が正しいこと、及びアミノ酸分
析、マススペクトルに基づいて行なった。ペプチドシー
ケンサーにはＡpplied Ｂiosystems Ｍodel４７７
Ａ、アミノ酸分析にはＢeckman Ｍode６３００ アミ
ノ酸分析機、マススペクトルはイオンスプレーマスＳＣ
ＩＥＸ ＡＰＩＩＩを用いた。 アミノ酸分析(括弧は理論値)：Ｃys ０.３(１),Ｇly １
４(１４),Ｐro ７.５(８),４Ｈyp ６.６(７),Ｌys ５.
３(５),Ｔhr ０.９(１),Ｌeu ０.９(１),Ａsn／p ０.８
(１),Ｇln／u ２.４(３) イオンマススペクトル：実測値３８４２.７±０.３；理
論値（Ｃ165Ｈ262Ｏ54Ｎ50Ｓとして）３８４２.３
チド自動合成機モデル４３０Ａを用いて、使用説明書に
従いＦmoc法で行なった。リンク樹脂(ノババイオケム
社)０.２mmol、保護したアミノ酸１mmolを用いて合成し
た。合成終了後、ペプチドの結合している樹脂を合成機
よりはずした。ペプチドの付いた樹脂(１００mg)をエタ
ンジチオール(和光純薬)(０.０１２５ml)、アニソール
(和光純薬)(０.０３７５ml)、トリフルオロ酢酸(和光純
薬)(０.９５ml)と室温（約２５℃）で１.５時間反応さ
せた。反応液を冷エーテル(１０ml)に加えてペプチドを
沈澱させた。沈殿したペプチドをさらにエーテル１０ml
で３回洗浄した後、乾燥し、酢酸水(５ml)に溶かし、高
速液体クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥した。精
製後の液体クロマトグラフィーの溶出パターンを図１に
示す。なお高速液体クロマトグラフィーはカラムにＴＯ
ＳＯＨ ＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ１２０を用い、０.１％
トリフルオロ酢酸中アセトニトリルを１０％から３０％
の濃度勾配で３０分で溶出することにより行った。流速
は１ml／分である。この化合物の同定はペプチドシーケ
ンサーでアミノ酸配列が正しいこと、及びアミノ酸分
析、マススペクトルに基づいて行なった。ペプチドシー
ケンサーにはＡpplied Ｂiosystems Ｍodel４７７
Ａ、アミノ酸分析にはＢeckman Ｍode６３００ アミ
ノ酸分析機、マススペクトルはイオンスプレーマスＳＣ
ＩＥＸ ＡＰＩＩＩを用いた。 アミノ酸分析(括弧は理論値)：Ｃys ０.３(１),Ｇly １
４(１４),Ｐro ７.５(８),４Ｈyp ６.６(７),Ｌys ５.
３(５),Ｔhr ０.９(１),Ｌeu ０.９(１),Ａsn／p ０.８
(１),Ｇln／u ２.４(３) イオンマススペクトル：実測値３８４２.７±０.３；理
論値（Ｃ165Ｈ262Ｏ54Ｎ50Ｓとして）３８４２.３
【００１８】（２）枝分かれペプチド１１の合成
【化１１】
【化１２】 １）化合物６の合成 ４−メチルベンツヒドリルアミン樹脂５(ペプチド研究
所)を用い上記反応式に示した方法でペプチドの付いた
樹脂を合成した。合成はアプライドバイオシステムズ製
ペプチド自動合成機モデル４３０Ａを用いて、使用説明
書に従いＦmoc法で行なった。ただし次の操作は樹脂を
合成機からはずし手動でおこなった。
所)を用い上記反応式に示した方法でペプチドの付いた
樹脂を合成した。合成はアプライドバイオシステムズ製
ペプチド自動合成機モデル４３０Ａを用いて、使用説明
書に従いＦmoc法で行なった。ただし次の操作は樹脂を
合成機からはずし手動でおこなった。
【００１９】２）化合物７の合成 化合物６（５００mｇ）とビオチン−Ｎ−ヒドロキシサ
クシニル体（０.５mmol）を用い、Ｎ−メチルモルフォ
リン溶媒（４ml）中室温で１時間反応した。次いで、生
成物を塩化メチレン溶媒中５０％トリフルオロ酢酸と１
５分反応させて脱保護し、化合物７を得た。 ３）化合物８の合成 化合物７をペプチド自動合成機に入れ、Ｆmoc法で化合
物８を合成した。
クシニル体（０.５mmol）を用い、Ｎ−メチルモルフォ
リン溶媒（４ml）中室温で１時間反応した。次いで、生
成物を塩化メチレン溶媒中５０％トリフルオロ酢酸と１
５分反応させて脱保護し、化合物７を得た。 ３）化合物８の合成 化合物７をペプチド自動合成機に入れ、Ｆmoc法で化合
物８を合成した。
【００２０】４）化合物９の合成 化合物８を塩化メチレン溶媒中５０％トリフルオロ酢酸
と１５分反応させて脱保護し、化合物９を得た。 ５）化合物１０の合成 化合物９をペプチド自動合成機に入れ、上記反応式に従
い１０を合成した。
と１５分反応させて脱保護し、化合物９を得た。 ５）化合物１０の合成 化合物９をペプチド自動合成機に入れ、上記反応式に従
い１０を合成した。
【００２１】７）化合物１１の合成と精製 反応終了後、ペプチドの付いた樹脂１０(１００mg)をm
−クレゾール(和光純薬)(０.１ml)、トリフルオロ酢酸
(和光純薬)(０.９ml)、トリフルオロメタンスルホン酸
(アプライドバイオシステムズ社)(０.１ml)で１.５時間
反応させた。反応液を氷で冷やした後、水(２ml)とエー
テル(２ml)で分液し水相を集めた。水相をエーテル２ml
で３回洗浄後、高速液体クロマトグラフィーで精製し凍
結乾燥し、化合物１１を得た。精製後の液体クロマトグ
ラフィーの溶出パターンを図２に示す。なお高速液体ク
ロマトグラフィーはカラムにＴＯＳＯＨ ＴＳＫ−ＧＥ
Ｌ ＯＤＳ１２０を用い、０.１％トリフルオロ酢酸中ア
セトニトリルを１５％から３５％の濃度勾配で３０分で
溶出した。流速は１ml／分である。この化合物の同定
は、マススペクトルで行なった。マススペクトルはＦＡ
Ｂ Ｍass ＪＥＯＬ ＪＭＸ−ＨＸ１００を用いた。 ＦＡＢマススペクトル：実測値(Ｍ＋Ｈ)+＝１８０３.６
１；理論値（Ｃ73Ｈ117Ｏ18Ｎ18ＳＢr3として）１８０
２.６１
−クレゾール(和光純薬)(０.１ml)、トリフルオロ酢酸
(和光純薬)(０.９ml)、トリフルオロメタンスルホン酸
(アプライドバイオシステムズ社)(０.１ml)で１.５時間
反応させた。反応液を氷で冷やした後、水(２ml)とエー
テル(２ml)で分液し水相を集めた。水相をエーテル２ml
で３回洗浄後、高速液体クロマトグラフィーで精製し凍
結乾燥し、化合物１１を得た。精製後の液体クロマトグ
ラフィーの溶出パターンを図２に示す。なお高速液体ク
ロマトグラフィーはカラムにＴＯＳＯＨ ＴＳＫ−ＧＥ
Ｌ ＯＤＳ１２０を用い、０.１％トリフルオロ酢酸中ア
セトニトリルを１５％から３５％の濃度勾配で３０分で
溶出した。流速は１ml／分である。この化合物の同定
は、マススペクトルで行なった。マススペクトルはＦＡ
Ｂ Ｍass ＪＥＯＬ ＪＭＸ−ＨＸ１００を用いた。 ＦＡＢマススペクトル：実測値(Ｍ＋Ｈ)+＝１８０３.６
１；理論値（Ｃ73Ｈ117Ｏ18Ｎ18ＳＢr3として）１８０
２.６１
【００２２】（３） 三本鎖ペプチド（Ｉ）の合成 上記（１）で調製したペプチド４(２.３７μmol)および
（２）で調製した枝分かれペプチド１１(０.５９μmol)
を、３Ｍグアニジン塩酸塩(２ml)に溶かし、次いで１Ｍ
炭酸水素ナトリウム水溶液(０.２ml)を加えた。６時間
後、反応液に１％トリフルオロ酢酸水溶液を加え液性を
酸性にした後、高速液体クロマトグラフィーで精製し凍
結乾燥した。精製後の液体クロマトグラフィーの溶出パ
ターンを図３に示す。なお高速液体クロマトグラフィー
はカラムにＴＯＳＯＨ ＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ１２０を
用い、０.１％トリフルオロ酢酸中アセトニトリルを１
０％から３０％の濃度勾配で３０分で溶出した。流速は
１ml／分である。この化合物の同定は、アミノ酸分析、
マススペクトルで行なった。 アミノ酸分析(括弧は理論値)：Ｓ−カルボキシメチルシ
ステイン２.９(３),Ｇly ４２(４２),Ｐro ２２.４(２
４),４Ｈyp １９.６(２１),Ｌys １８.３(１８),Ｔhr
２.８(３),Ｌeu ３.０(３),Ａsn／p ２.４(３),Ｇln／u
７.６(９),Ｔyr１.２(１),bＡla ５.５(６),Ａcp
(２) イオンマススペクトル：実測値１３０９３.１±１.１
理論値（Ｃ568Ｈ900Ｏ180Ｎ168Ｓ4として）１３０９０.
７
（２）で調製した枝分かれペプチド１１(０.５９μmol)
を、３Ｍグアニジン塩酸塩(２ml)に溶かし、次いで１Ｍ
炭酸水素ナトリウム水溶液(０.２ml)を加えた。６時間
後、反応液に１％トリフルオロ酢酸水溶液を加え液性を
酸性にした後、高速液体クロマトグラフィーで精製し凍
結乾燥した。精製後の液体クロマトグラフィーの溶出パ
ターンを図３に示す。なお高速液体クロマトグラフィー
はカラムにＴＯＳＯＨ ＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ１２０を
用い、０.１％トリフルオロ酢酸中アセトニトリルを１
０％から３０％の濃度勾配で３０分で溶出した。流速は
１ml／分である。この化合物の同定は、アミノ酸分析、
マススペクトルで行なった。 アミノ酸分析(括弧は理論値)：Ｓ−カルボキシメチルシ
ステイン２.９(３),Ｇly ４２(４２),Ｐro ２２.４(２
４),４Ｈyp １９.６(２１),Ｌys １８.３(１８),Ｔhr
２.８(３),Ｌeu ３.０(３),Ａsn／p ２.４(３),Ｇln／u
７.６(９),Ｔyr１.２(１),bＡla ５.５(６),Ａcp
(２) イオンマススペクトル：実測値１３０９３.１±１.１
理論値（Ｃ568Ｈ900Ｏ180Ｎ168Ｓ4として）１３０９０.
７
【００２３】（４） 三本鎖ペプチドのＣＤスペクトル 上記ペプチドを５mＭリン酸緩衝液(pＨ７)に１０μＭの
濃度で溶かしＣＤスペクトルを調べた。このペプチドの
ＣＤスペクトルは２２４nmに正、１９８nmに負のピーク
を示すことからコラーゲン構造をとっていることがわか
る（図４）。また２２４nmの値を測定することより熱に
対する安定性を測定すると変性の中点は約３０℃であっ
た（図５）。ＣＤスペクトルはＪＡＳＣＯ Ｊ−７２０
を用いて測定した。
濃度で溶かしＣＤスペクトルを調べた。このペプチドの
ＣＤスペクトルは２２４nmに正、１９８nmに負のピーク
を示すことからコラーゲン構造をとっていることがわか
る（図４）。また２２４nmの値を測定することより熱に
対する安定性を測定すると変性の中点は約３０℃であっ
た（図５）。ＣＤスペクトルはＪＡＳＣＯ Ｊ−７２０
を用いて測定した。
【００２４】（５） 三本鎖ペプチドの固相担体への固
定化 ストレプトアビジン−ダイナビーズＭ−２８０(ダイナ
ル社)(０.２ml)を１５０mＭ ＮaＣlを含む５mＭリン酸
緩衝液(pＨ７.５)(０.２ml)で２回洗浄した後、ペプチ
ド溶液(ペプチド１nmolを同じリン酸緩衝液０.１mlに溶
解したもの)を加え、室温で３０分反応させた。樹脂を
同じリン酸緩衝液で洗浄した。この操作で約２５０pmol
のペプチドが樹脂に結合した。
定化 ストレプトアビジン−ダイナビーズＭ−２８０(ダイナ
ル社)(０.２ml)を１５０mＭ ＮaＣlを含む５mＭリン酸
緩衝液(pＨ７.５)(０.２ml)で２回洗浄した後、ペプチ
ド溶液(ペプチド１nmolを同じリン酸緩衝液０.１mlに溶
解したもの)を加え、室温で３０分反応させた。樹脂を
同じリン酸緩衝液で洗浄した。この操作で約２５０pmol
のペプチドが樹脂に結合した。
【００２５】（６） 結合活性の測定 ストレプトアビジン−ダイナビーズＭ−２８０溶液３２
μl、又は上記ペプチドのついたダイナビーズ１６μlを
ＰＢＳまたはＤＭＥＭ培地で洗浄した後、樹脂をＤＭＥ
Ｍ培地(１０％ＦＢＳを含む)８０μlにけん濁し、リガ
ンド(125Ｉ−ＡcＬＤＬ)１９μl(１.５μg,〜０.６pmol
アポリポ蛋白質Ｂ−１００)を加え、４℃で２時間イン
キュベートした。氷冷した１５０mＭ ＮaＣl,２mg／ml
ＢＳＡ含む５０mＭ Ｔris ＨＣl(pＨ７.４)液で樹脂を
３回洗浄した後、５０mＭ ＮaＣl,４mg／ml 硫酸デキ
ストラン（Ｄextran Ｓulfate）を含む１０mＭ ＨＥＰ
ＥＳ ＮaＯＨ(pＨ７.４)液１００μlを加え、４℃でイ
ンキュベートした。１.５時間後、上清をあつめ、遊離
したリガンドのカウントを測定した。リガンドの競合的
結合阻害を調べる場合、リガンドを加える時に１２μg
のマレイル化牛血清アルブミンを加えた。
μl、又は上記ペプチドのついたダイナビーズ１６μlを
ＰＢＳまたはＤＭＥＭ培地で洗浄した後、樹脂をＤＭＥ
Ｍ培地(１０％ＦＢＳを含む)８０μlにけん濁し、リガ
ンド(125Ｉ−ＡcＬＤＬ)１９μl(１.５μg,〜０.６pmol
アポリポ蛋白質Ｂ−１００)を加え、４℃で２時間イン
キュベートした。氷冷した１５０mＭ ＮaＣl,２mg／ml
ＢＳＡ含む５０mＭ Ｔris ＨＣl(pＨ７.４)液で樹脂を
３回洗浄した後、５０mＭ ＮaＣl,４mg／ml 硫酸デキ
ストラン（Ｄextran Ｓulfate）を含む１０mＭ ＨＥＰ
ＥＳ ＮaＯＨ(pＨ７.４)液１００μlを加え、４℃でイ
ンキュベートした。１.５時間後、上清をあつめ、遊離
したリガンドのカウントを測定した。リガンドの競合的
結合阻害を調べる場合、リガンドを加える時に１２μg
のマレイル化牛血清アルブミンを加えた。
【００２６】図６に示すようにペプチド樹脂にＡcＬＤ
Ｌが結合した。対照として、ペプチドを結合していない
樹脂及びＡcＬＤＬの拮抗的阻害剤であるマレイル化牛
血清アルブミンを加えた樹脂を用いて同様に行ったコン
トロール実験では、ＡcＬＤＬの結合は認めなかった。
このことはＡcＬＤＬが、本発明の合成ペプチド部分に
結合していることを示すものである。
Ｌが結合した。対照として、ペプチドを結合していない
樹脂及びＡcＬＤＬの拮抗的阻害剤であるマレイル化牛
血清アルブミンを加えた樹脂を用いて同様に行ったコン
トロール実験では、ＡcＬＤＬの結合は認めなかった。
このことはＡcＬＤＬが、本発明の合成ペプチド部分に
結合していることを示すものである。
【００２７】実施例２
【化１３】 上記反応式に従い、実質上、実施例１と同様にして、ビ
オチンと結合していない化合物（Ｉ）を合成した。ただ
し、実施例１の（２）の２）のビオチン化の工程は含ま
ない。 （１）枝分かれペプチド１５の合成 １）化合物１２の合成 ４−メチルベンツヒドリルアミン樹脂５(ペプチド研究
所)を用い、上記反応式に従ってペプチドの付いた樹脂
を合成した。合成はアプライドバイオシステムズ製ペプ
チド自動合成機モデル４３０Ａを用いて、使用説明書に
従いＦｍｏｃ法で行った。
オチンと結合していない化合物（Ｉ）を合成した。ただ
し、実施例１の（２）の２）のビオチン化の工程は含ま
ない。 （１）枝分かれペプチド１５の合成 １）化合物１２の合成 ４−メチルベンツヒドリルアミン樹脂５(ペプチド研究
所)を用い、上記反応式に従ってペプチドの付いた樹脂
を合成した。合成はアプライドバイオシステムズ製ペプ
チド自動合成機モデル４３０Ａを用いて、使用説明書に
従いＦｍｏｃ法で行った。
【００２８】２）化合物１３の合成 化合物１２を合成機からはずし、手動で塩化メチレン溶
媒中５０％トリフルオロ酢酸と１５分反応させて脱保護
し、化合物１３を得た。 ３）化合物１４の合成 化合物１３をペプチド自動合成機に戻し、上記反応式に
示した方法でペプチドの付いた樹脂１４を合成した。
媒中５０％トリフルオロ酢酸と１５分反応させて脱保護
し、化合物１３を得た。 ３）化合物１４の合成 化合物１３をペプチド自動合成機に戻し、上記反応式に
示した方法でペプチドの付いた樹脂１４を合成した。
【００２９】４）化合物１５の合成と精製 ペプチドの付いた樹脂１４(１００mg)を用い、実質上、
実施例１の（２）の７）と同様にして化合物１５を得
た。精製後の液体クロマトグラフィーの溶出パターンを
図７に示す。ただし、溶出は０.１％トリフルオロ酢酸
中アセトニトリルを１０％から３０％の濃度勾配を３０
分で行った。 ＦＡＢマススペクトル：実測値(Ｍ＋Ｈ)+＝１２８０.２
１；理論値（Ｃ47Ｈ72Ｏ14N13Ｂr3として）１２７９.２
９
実施例１の（２）の７）と同様にして化合物１５を得
た。精製後の液体クロマトグラフィーの溶出パターンを
図７に示す。ただし、溶出は０.１％トリフルオロ酢酸
中アセトニトリルを１０％から３０％の濃度勾配を３０
分で行った。 ＦＡＢマススペクトル：実測値(Ｍ＋Ｈ)+＝１２８０.２
１；理論値（Ｃ47Ｈ72Ｏ14N13Ｂr3として）１２７９.２
９
【００３０】（２） 三本鎖ペプチド（Ｉ）の合成 上記実施例１の（１）で調製したペプチド４(２.０μmo
l)および上記の実施例２の（１）で調製した枝分かれペ
プチド１５(０.５μmol)を用い、実質上、実施例１の
（３）に記載の方法と同様にして三本鎖ペプチド（Ｉ）
を得た。精製後の液体クロマトグラフィーの溶出パター
ンを図８に示す。ただし溶出は０.１％トリフルオロ酢
酸中アセトニトリルを１０％から３０％の濃度勾配を３
０分で行った。 イオンマススペクトル：実測値１２５７０.０±０.４；
理論値（Ｃ542Ｈ855Ｏ176Ｎ163Ｓ3として）１２５６６.
９
l)および上記の実施例２の（１）で調製した枝分かれペ
プチド１５(０.５μmol)を用い、実質上、実施例１の
（３）に記載の方法と同様にして三本鎖ペプチド（Ｉ）
を得た。精製後の液体クロマトグラフィーの溶出パター
ンを図８に示す。ただし溶出は０.１％トリフルオロ酢
酸中アセトニトリルを１０％から３０％の濃度勾配を３
０分で行った。 イオンマススペクトル：実測値１２５７０.０±０.４；
理論値（Ｃ542Ｈ855Ｏ176Ｎ163Ｓ3として）１２５６６.
９
【００３１】
【発明の効果】本発明の新規ペプチド誘導体（Ｉ）は血
液中の修飾ＬＤＬと選択的な結合活性を有し、血液中の
修飾ＬＤＬのマクロファージへの取り込みを阻害し、ま
た、血液中の濃度を低下させることができる。このよう
な作用に基づいて、本発明の化合物（Ｉ）は、修飾ＬＤ
Ｌが関与する種々の循環器系疾患、特に動脈硬化症、の
予防および治療に有用である。また、該化合物を樹脂等
の固相担体に固定化し、得られた固定化ペプチドに血液
を接触させすことにより、血液中の修飾ＬＤＬを固相担
体に結合させ、該物質を除去する、あるいはその血中濃
度を測定することができる。このことにより動脈硬化発
症の診断、抑制、予防等が可能になる。また本発明の固
定化ペプチドに様々なアミノ酸配列のペプチド群とを接
触させることにより該ペプチドと強く結合する化合物を
検索することができる。このようにして、マクロファー
ジのスカベンジャー受容体と強く結合するペプチドのス
クリーニングが可能であり、マクロファージの修飾ＬＤ
Ｌの取り込み自体を抑制する薬物の開発に貢献し得る。
液中の修飾ＬＤＬと選択的な結合活性を有し、血液中の
修飾ＬＤＬのマクロファージへの取り込みを阻害し、ま
た、血液中の濃度を低下させることができる。このよう
な作用に基づいて、本発明の化合物（Ｉ）は、修飾ＬＤ
Ｌが関与する種々の循環器系疾患、特に動脈硬化症、の
予防および治療に有用である。また、該化合物を樹脂等
の固相担体に固定化し、得られた固定化ペプチドに血液
を接触させすことにより、血液中の修飾ＬＤＬを固相担
体に結合させ、該物質を除去する、あるいはその血中濃
度を測定することができる。このことにより動脈硬化発
症の診断、抑制、予防等が可能になる。また本発明の固
定化ペプチドに様々なアミノ酸配列のペプチド群とを接
触させることにより該ペプチドと強く結合する化合物を
検索することができる。このようにして、マクロファー
ジのスカベンジャー受容体と強く結合するペプチドのス
クリーニングが可能であり、マクロファージの修飾ＬＤ
Ｌの取り込み自体を抑制する薬物の開発に貢献し得る。
【００３２】
配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ １ ５
１０ １５ Ｇｌｕ Ｌｙｓ 18
Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ １ ５
１０ １５ Ｇｌｕ Ｌｙｓ 18
【００３３】配列番号：２ 配列の長さ：４１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：４Ｈyp 存在位置：4, 7, 10, 13, 34, 37, 40 配列 Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｘａａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｘａａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ｘａａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｘａａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ １ ５
１０ １５ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｘａａ ２０ ２５
３０ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｘａａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｘａａ Ｇｌｙ ３５ ４０ ４１
Ｘａａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｘａａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ １ ５
１０ １５ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｘａａ ２０ ２５
３０ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｘａａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｘａａ Ｇｌｙ ３５ ４０ ４１
【図１】 １本鎖ペプチドの溶出パターンを示す模写
図。
図。
【図２】 ビオチン化枝分かれペプチドの溶出パターン
を示す模写図。
を示す模写図。
【図３】 ３本のペプチドのアミノ末端が束ねられたコ
ラーゲンモデルペプチドの溶出パターンを示す模写図。
ラーゲンモデルペプチドの溶出パターンを示す模写図。
【図４】 三本鎖ペプチドのＣＤスペクトルの模写図。
【図５】 三本鎖ペプチドの熱変性の状態を示すグラ
フ。
フ。
【図６】 ペプチド樹脂に結合したＡｃＬＤＬの量を示
すグラフ。
すグラフ。
【図７】 非ビオチン化枝分かれペプチドの溶出パター
ンを示す模写図。
ンを示す模写図。
【図８】 ビオチン化されていない、３本のペプチドの
アミノ末端が束ねられたコラーゲンモデルペプチドの溶
出パターンを示す模写図。
アミノ末端が束ねられたコラーゲンモデルペプチドの溶
出パターンを示す模写図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 17/10 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＮ
Claims (8)
- 【請求項１】 式（Ｉ）： 【化１】 ［式中、bＡlaは、β−アラニン；Ｒ1は、独立して式： 【化２】 （式中、4Ｈypは、４−ヒドロキシプロリン、Ｒ2は、少
なくとも４個のリジンを含むアミノ酸数９〜７２のペプ
チド残基、Ｒ3は修飾されていても良いグリシン残基、
ｑは、２〜８から独立して選択される整数を表す）で示
されるペプチド残基から選択される基；ｎは、０〜４の
整数；Ｒは、アミノ酸数０〜５のペプチド残基又は式： 【化３】 で示される基；Ｒ’は修飾されていてもよいチロシン、
トリプトファン残基及びペプチドの定量化に利用できる
化合物残基から選択される基；Ａｃpは、６−アミノカ
プロン酸を表す］で示される化合物。 - 【請求項２】 ｎが１又は２、ｑが３又は４である請求
項１記載の化合物。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載の化合物を含有す
る修飾低密度リポ蛋白質のマクロファージへの取り込み
阻害剤。 - 【請求項４】 動脈硬化症の治療に用いられる請求項３
記載の修飾低密度リポ蛋白質のマクロファージへの取り
込み阻害剤。 - 【請求項５】 固相担体に請求項１記載の化合物を固定
化してなる固定化ペプチド。 - 【請求項６】 固相担体がアガロース、アクリルビー
ズ、セファロース、ダイナビーズ、ラテックス、セルロ
ースから選択されるものである請求項５記載の固定化ペ
プチド。 - 【請求項７】 血液中の修飾低密度リポ蛋白質を回収ま
たは除去するために用いられる請求項５又は６記載の固
定化ペプチド。 - 【請求項８】 式（II）： 【化４】 （式中、Ｒ1は、上記定義に従う）で示される化合物
と、式（III）： 【化５】 （式中、Ｘは、ハロゲンを表し、Ｒ、Ｒ'、bＡlaおよび
ｎは上記定義に従う）で示される化合物とを反応させる
ことからなる、請求項１記載の化合物（Ｉ）の製造方
法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6288465A JP2680552B2 (ja) | 1994-11-22 | 1994-11-22 | 修飾低密度リポ蛋白質に対する結合活性を有するペプチド誘導体 |
| US08/395,816 US5747451A (en) | 1994-11-22 | 1995-02-28 | Peptide derivatives having binding activity to modified low density lipoprotein |
| CA002144104A CA2144104C (en) | 1994-11-22 | 1995-03-07 | Peptide derivatives having binding activity to modified low density lipoprotein |
| EP95103661A EP0718308B1 (en) | 1994-11-22 | 1995-03-14 | Peptide derivatives having binding activity to modified low density lipoprotein |
| DE69513788T DE69513788T2 (de) | 1994-11-22 | 1995-03-14 | Peptid Derivate mit bindendes Aktivität zu modifiziertem Lipoprotein mit niedriger Dichte (LDL) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6288465A JP2680552B2 (ja) | 1994-11-22 | 1994-11-22 | 修飾低密度リポ蛋白質に対する結合活性を有するペプチド誘導体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08143591A JPH08143591A (ja) | 1996-06-04 |
| JP2680552B2 true JP2680552B2 (ja) | 1997-11-19 |
Family
ID=17730564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6288465A Expired - Lifetime JP2680552B2 (ja) | 1994-11-22 | 1994-11-22 | 修飾低密度リポ蛋白質に対する結合活性を有するペプチド誘導体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5747451A (ja) |
| EP (1) | EP0718308B1 (ja) |
| JP (1) | JP2680552B2 (ja) |
| CA (1) | CA2144104C (ja) |
| DE (1) | DE69513788T2 (ja) |
Families Citing this family (3)
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|---|---|---|---|---|
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| WO2010053115A1 (ja) * | 2008-11-07 | 2010-05-14 | 大日本住友製薬株式会社 | 新規アフィニティー担体 |
| JP6017194B2 (ja) * | 2012-06-20 | 2016-10-26 | 新田ゼラチン株式会社 | 骨、軟骨または皮膚に関連する疾患の治療もしくは予防剤 |
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- 1994-11-22 JP JP6288465A patent/JP2680552B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-02-28 US US08/395,816 patent/US5747451A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-07 CA CA002144104A patent/CA2144104C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-14 DE DE69513788T patent/DE69513788T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-14 EP EP95103661A patent/EP0718308B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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| CA2144104C (en) | 2001-10-16 |
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| EP0718308A3 (en) | 1997-03-26 |
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| CA2144104A1 (en) | 1996-05-23 |
| US5747451A (en) | 1998-05-05 |
| DE69513788T2 (de) | 2000-06-21 |
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