JP6989842B2 - 新規トリペプチドを含む骨芽細胞の分化促進および骨形成促進剤 - Google Patents
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Description
3本のポリペプチド鎖からなる三重螺旋構造を構成するコラーゲンは、細胞内でポリペプチド鎖として合成された後、-(Gly-X-Y)-で示される繰り返し構造において、Yに位置するプロリンのほぼ全てが、プロリル-4-ヒドロキシラーゼ(prolyl 4-hydroxylase)によって水酸化され4Hypとなる。それに対し、Xに位置するプロリンは、Yが4Hypの場合に、その一部がプロリル-3-ヒドロキシラーゼ(prolyl 3-hydroxylase)によって水酸化され3Hypとなる(非特許文献9)。ただし、コラーゲンを構成する一次アミノ酸配列-Gly-Pro-Pro-のごく一部が-Gly-3Hyp-4Hyp-に変換されるに過ぎない。例えば、ウシI型コラーゲンα1鎖には、1,000アミノ酸残基当たり約40の-Gly-Pro-Pro-配列が含まれるが、-Gly-3Hyp-4Hyp-に由来する3Hypの含有量は、後記する実施例に示すように、ウシ皮膚由来I型コラーゲンの場合0.1%程度である。しかも、配列の存在が推定されても、トリペプチドGly-3Hyp-4Hypが単離されたことはなく、その作用も解明されていない。
Gly-3Hyp-4Hypやその医学的に許容可能な塩は、骨芽細胞の分化促進剤として使用することができる。
骨組織が形成されることを骨化といい、膜内骨化と軟骨内骨化とに大別される。膜内骨化は頭蓋骨等で観察され、間葉系細胞が直接、骨芽細胞に分化して骨基質を産生する骨形成様式をいう。一方、軟骨内骨化とは、未分化間葉系細胞が軟骨細胞に分化して軟骨原基を形成し、軟骨細胞が肥大軟骨細胞に分化し、周囲の軟骨膜に含まれる細胞が骨芽細胞に分化し、これらによって石灰化した軟骨組織を骨組織に置換する骨形成様式をいう。何れの骨形成過程でも骨芽細胞が関与する点で共通する。
Gly-3Hyp-4Hypやその医学的に許容可能な塩は、骨形成促進剤として使用することができる。上記したように、Gly-3Hyp-4Hypやその医学的に許容可能な塩は、骨芽細胞の分化促進作用があり、この分化促進作用によって骨形成を促進することができる。しかも、後記する実施例に示すように、骨芽細胞による石灰化(リン酸カルシウムの一種であるハイドロキシアパタイトの沈着)を促進する作用を有する。
骨芽細胞の分化促進剤や骨形成促進剤は、経口的、または非経口的に投与することができる。経口投与の場合は、Gly-3Hyp-4Hypやその医学的に許容可能な塩をそのまま散剤、顆粒剤、丸剤としてもよく、表面に糖衣その他で加工したコーティング剤や、カプセルに充填したカプセル剤、適当な溶媒に溶解した経口液剤や懸濁剤、乳化剤によって乳化してなる乳剤などの何れであってもよい。非経口投与の場合は、ローション剤、軟膏剤、貼付剤(パップ剤)、注射剤、坐剤、点鼻剤等がある。
以下の方法により、Gly-3Hyp-4Hypを調製した。
ウシ皮膚由来I型コラーゲン、ウシアキレス腱由来I型コラーゲン、およびウシ水晶体嚢由来IV型コラーゲンを0.05mg/mLとなるように、5mMのCaCl2を含む0.1MのTris-HCl(pH7.6)緩衝液で希釈し、これを60℃で30分間加熱した。この溶液にグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ(和光純薬工業社製)を、コラーゲンに対して質量換算で1/20倍量加え、37℃で16時間反応させた。得られたペプチド溶液を下記LC/MS測定条件で分析し、各組織由来コラーゲン1gあたりのGly-3Hyp-4Hypの生成量を定量した。結果を表1に示す。
高速液体クロマトグラフ:1200Series(Agilent Technologies)、
質量分析装置:3200QTRAP(AB Sciex)、
分析カラム:Ascentis Express F5 5μm, 4.6mmi.d.×250mm(SUPELCO)、
カラム温度:40℃
移動相:A液;0.1%ギ酸、B液;100%アセトニトリル、
グラジエント条件:
0~7.5分:A液100%、
7.5~15分:A液100~10%;B液0~90%、
15~20分:A液10%;B液90%、
20~25分:A液100%、
流速:0.4mL/min、
(2)質量分析条件:
イオン化:ESI、ポジティブ、
分析モード:Multiple Reaction Monitoring(MRM)モード、
イオンスプレー電圧:3kV、
イオンソース温度:700℃
同じ一次アミノ酸配列を持つウシアキレス腱I型コラーゲンとウシ皮膚I型コラーゲンで比較すると、ウシアキレス腱I型コラーゲンから約3倍のGly-3Hyp-4Hypを生成することができ、ウシ水晶体嚢IV型コラーゲンからはウシ皮膚I型コラーゲンの約5倍のGly-3Hyp-4Hypを生成することができた。コラーゲン型や由来組織を選択すれば、効率的にGly-3Hyp-4Hypを製造し得ることが判明した。
マウス頭蓋冠由来骨芽細胞株MC3T3-E1細胞を用いて、Gly-3Hyp-4Hypの骨芽細胞分化促進効果について評価を行った。
MC3T3-E1細胞は、10%ウシ胎児血清含有アルファMEM中に5×104細胞/ウェルの条件で24-ウェル細胞培養プレート中に準備した。翌日、細胞がコンフルエントになっていることを確認後、培地を分化培地(10%透析済みウシ胎児血清(Thermo Scientific社製)、100μg/mLアスコルビン酸、10mMグリセロール2-リン酸二ナトリウム含有アルファMEM)で置換し、Anygen社のカスタム合成サービスによりFmoc-3Hyp(AnaSpec社製)を用いて化学合成したGly-3Hyp-4Hypを終濃度200nmol/mLになるように添加した。対照には、蒸留水を添加した。2日おきに分化培地を交換し、終濃度200nmol/mLのGly-3Hyp-4Hypを添加した。6日間培養後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、3.7%ホルムアルデヒドにて固定した。
Gly-3Hyp-4Hypに代えてPro-Hyp(Bachem社製)を使用した以外は実施例2と同様に操作し、ALP活性を算出した。結果を表2に示す。
MC3T3-E1細胞にGly-3Hyp-4HypおよびPro-Hypを添加すると、それぞれALP活性が上昇した。ただし、ALP活性の上昇はPro-Hypでは対照に対して1.4倍で統計的有意差が認められなかったのに対し、Gly-3Hyp-4Hypは対照に対し1.9倍で統計的有意差が検出された。MC3T3-E1細胞は、骨芽細胞へと分化誘導されるとALPを発現するため、Gly-3Hyp-4Hypは、対照と比較して約2倍の骨芽細胞の分化誘導作用を有すると考えられる。
マウス頭蓋冠由来骨芽細胞MC3T3-E1細胞を用いて、Gly-3Hyp-4Hypの骨芽細胞石灰化促進効果について評価を行った。
実施例2と同様に、MC3T3-E1細胞を、10%ウシ胎児血清含有アルファMEM中に5×104細胞/ウェルの条件で24-ウェル細胞培養プレート中に準備した。翌日、細胞がコンフルエントになっていることを確認した後、培地を分化培地(10%透析済みウシ胎児血清(Thermo Scientific社製)、100μg/mLアスコルビン酸、10mMグリセロール2-リン酸二ナトリウム含有アルファMEM)で置換し、Anygen社のカスタム合成サービスによりFmoc-3Hyp(AnaSpec社製)を用いて化学合成したGly-3Hyp-4Hypを終濃度200nmol/mLになるように添加した。対照には、蒸留水を添加した。2日おきに分化培地を交換し、終濃度200nmol/mLのGly-3Hyp-4Hypを添加した。7日間培養後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、4%パラホルムアルデヒドにて10分間固定した。
MC3T3-E1細胞にGly-3Hyp-4HypおよびPro-Hypを添加すると、沈着したカルシウム量の増加が観察された。Gly-3Hyp-4Hypは対照に対し1.9倍で統計的有意差が検出された。一方、Pro-Hypは対照に対し1.7倍の増加が観察されたが統計的有意差は検出されなかった。
Claims (2)
- Gly-3Hyp-4Hypまたはその医学的に許容可能な塩を含有する、骨芽細胞の分化促進剤。
- Gly-3Hyp-4Hypまたはその医学的に許容可能な塩を含有する、骨形成促進剤。
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JP2002255847A (ja) | 2001-02-26 | 2002-09-11 | Miyagi Kagaku Kogyo Kk | コラーゲン産生促進剤、それを含む機能性食品および医薬品 |
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